CN103641889B - 一种降糖肽及其药物用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种降糖肽，具有如SEQ？ID？NO：1所示的氨基酸序列。本发明还提供了所述降糖肽的修饰肽，在降糖肽的N端、C端或中间残基上连接化学基团、氨基酸、多肽、蛋白质或PEG。本发明所述降糖肽能改善KK-Ay小鼠的糖耐量并且增强KK-Ay小鼠的血糖利用能力，显著地改善KK-Ay小鼠的空腹血糖和糖耐量，显著地降低血清总胆固醇和血清总甘油三酯，显著地改善SOD水平并降低MDA水平，保护机体细胞对抗氧自由基的氧化，具有降糖和降脂功能，可以抗代谢综合症。可用于制备治疗和/或预防糖尿病或高血脂症的药物或保健品。

Description

一种降糖肽及其药物用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种降糖肽及其药物用途。

背景技术

糖尿病（Diabetesmellitus，DM）是以胰岛素相对或绝对不足为特征、高糖血症的主要症状的代谢性疾病，胰岛素相对或绝对不足引发高血糖，进而导致三大营养物质代谢紊乱，最终影响患者正常生理功能并且引起并发症。糖尿病有多种分型，以Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病最常见。传统抗糖尿病药物各有缺点。胰岛素给药不便，而且容易引发低血糖；磺酰脲类、瑞格列奈和纳格列奈等胰岛素促分泌剂可以口服，但是依赖残余胰岛β细胞的存在，而且容易引发低血糖，此外还常会出现继发性失效；二甲双胍类不良反应严重；α-葡萄糖苷酶抑制剂和噻唑烷二酮类药物不能从根本上降低血糖。而最新上市的胰高血糖素样肽-1（glucose-likepeptide-1，GLP-1）类似物对传统降糖药疗效不佳的Ⅱ型糖尿病效果优异，但是性质不稳定、保存要求高、作用时间短、需要注射给药。肽类是生物药物中的一大类别，药用肽类具有明显优点。首先，肽类均直接或间接来自自然界，符合从天然产物筛选新药的潮流。其次，肽类的特异性远强于小分子，抗原性远低于蛋白质，摒弃了小分子和蛋白质药物的缺点。第三，肽分子，尤其是寡肽分子，往往能规避胃肠道消化，克服蛋白质分子被消化酶破坏从而不能口服的弊端。最后，肽分子可能既不在肝脏代谢又不在脂肪组织累积，避免了肝脏毒性和累积毒性。因此开发具有降糖作用的肽类药物成为各国医药研发人员的研究热点。

发明内容

本发明针对现有降糖药物的不足，采用人工合成的方法筛选得到一种全新降糖肽。

本发明具体技术方案如下：

一种降糖肽，具有如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。

SEQIDNO：1ProProProGlyPro。

可采用现有技术领域常规方法对降糖肽进行修饰。

对于蛋白质和肽类药物，在多数情况下，机体内的氨肽酶及羧肽酶很容易从常见的直链肽的两端进行逐步的切割分解，使直链肽被降解。多肽修饰是改变肽链主链结构和侧链基团的重要手段，已有大量文献表明经过修饰后的多肽药物可以显著降低免疫原性、减少毒副作用、增加水溶性、延长体内作用时间、改变其生物分布状况等等，明显改善药物的疗效。

多肽类药物常用修饰方法包括主链末端的修饰、中间残基的修饰、环化、氨基酸替换、糖基化修饰及PEG修饰等。

多肽类药物常用的主链末端修饰方法是N端的乙酰化作用和C端的酰胺化作用，分别对肽链两端氨基和羧基进行保护，使多肽不会很快地被相应的多肽蛋白酶降解。目前这一技术已经广泛应用于多肽的化学合成中。N端乙酰化通常是在固相合成多肽反应的整个肽链组合完毕后，加入乙酸酐使其乙酰化。C端的酰胺化则是通过选择裂解产物为酰胺的树脂或者选择不同裂解方式来完成。主链末端连接不同长度的脂肪酸、主链C端或N端的PEG修饰及糖基化修饰，其基本原理都是增加多肽分子的相对分子量和空间位阻，提高其对多肽水解酶的稳定性，减少肾小球的滤过作用。替换肽链中的某几个氨基酸是另一种推迟酶降解使多肽药物的半衰期延长的方式，替换对象通常为肽链中的易酶解的氨基酸。此外，将L型氨基酸替换为D型非天然氨基酸也是氨基酸替换的一种常规方法。

本发明提供了一种降糖肽的修饰肽，其特征在于对降糖肽进行修饰，在降糖肽的N端、C端或中间残基上连接化学基团、氨基酸、多肽、蛋白质或PEG。

本发明所述降糖肽的修饰肽具体优选为：

对降糖肽的N端进行甲酰化或乙酰化，或者在N端连接脂肪酸、肼基烟酰胺、二乙烯三胺五乙酸、肉豆蔻酸、十六酸或琥珀酰胺或PEG；

或者对降糖肽C端进行酰胺化、或在C端连有p-硝基苯胺、7-氨基-4-甲基香豆素；

或者对降糖肽中间残基进行糖基化、磷酸化、甲基化、乙酰化、硝基化、磺酸化或者连接PEG修饰或者降糖肽中间残基偶联蛋白质，其中：糖基化修饰最常用的为N-糖基化和O-糖基化。

甲基化修饰肽包括侧链甲基化修饰肽和N端甲基化修饰肽。

N端甲基化优选在降糖肽氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的N端甲基化。

PEG修饰优选PEG分子量为2000-10000。

本发明还提供了一种降糖肽的修饰肽，通过降糖肽的N端和C端首尾连接成环。

本发明还提供了一种降糖肽的修饰肽，降糖肽或上述修饰肽氨基酸序列中的一种或多种氨基酸替换成相应的氨基酸衍生物或特殊氨基酸。

本发明还提供了一种降糖肽的修饰肽，降糖肽或上述修饰肽氨基酸序列中的一种或多种氨基酸替换成相应的D型氨基酸。

本发明所述的降糖肽，国内外尚无相关报道。作为一种寡肽，完全不同于已经上市的三大抗糖尿病肽类药物——普兰林肽、艾塞那肽和利拉鲁肽。降糖肽分子短小，可口服给药，规避消化。本发明选用自发型Ⅱ型糖尿病及代谢紊乱小鼠模型KK-Ay小鼠研究降糖肽连续给药对KK-Ay小鼠的影响，观察降糖肽对KK-Ay小鼠的体重、空腹血糖、血脂、葡萄糖耐量、肝超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）和肝丙二醛（malonaldehyde，MDA）的影响。

KK-Ay小鼠是在一种糖尿病模型小鼠——KK小鼠的基础上转入突变毛色基因(ay)而成，呈黄色。该基因不仅影响小鼠的毛色而且可引起代谢紊乱，出现肥胖、高血糖、脂质代谢紊乱和高胰岛素血症等代谢异常综合征，其发病是在遗传易感的基础上加环境因素而诱发。与人类Ⅱ型糖尿病表现极为相似，该动物对胰岛素不敏感，对葡萄糖耐量小，糖尿病发病率高，并会出现肥胖、高血糖、脂质代谢紊乱和高胰岛素血症等代谢异常综合征，其发病是在遗传易感的基础上加环境因素而诱发。与人类T2DM表现极为相似。

口服葡萄糖耐量试验（Oralglucosetolerancetest，OGTT）是糖尿病实验室检查和糖尿病诊断的重要标准，可以根据OGTT的结果计算相应的血糖曲线下面积（AUC）值。血糖AUC值越低，说明实验动物对血糖的利用程度越高。本发明对KK-Ay小鼠进行了OGTT，结果提示本发明所述降糖肽能部分地改善KK-Ay小鼠的糖耐量并且部分地增强KK-Ay小鼠的血糖利用能力。降糖肽能显著地改善KK-Ay小鼠的空腹血糖和糖耐量，显著地降低血清总胆固醇和血清总甘油三酯，显著地改善SOD水平并降低MDA水平，保护机体细胞对抗氧自由基的氧化，说明降糖肽具有降糖和降脂功能，可以抗代谢综合症。

本发明所述的降糖肽作为一种结构清楚的寡肽药物，其氨基酸序列决定了它不仅可以规避胃肠道消化，而且易于穿过生物膜，从而有助于胃肠道吸收，有助于开展较为充分的药效学研究，有利于开发成口服药物。

本发明提供了上述降糖肽在制备治疗和/或预防糖尿病或高血脂症药物或保健品中的应用。特别是在在制备治疗和/或预防Ⅱ型糖尿病或高血脂症药物或保健品中的应用。

本发明提供了上述降糖肽的修饰肽在制备治疗和/或预防糖尿病或高血脂症药物或保健品中的应用。特别是在在制备治疗和/或预防Ⅱ型糖尿病或高血脂症药物或保健品中的应用。

本发明所述的药物，可以包含降糖肽或降糖肽的修饰肽以及一种或多种可药用的稀释剂或载体。

本发明所述式降糖肽或降糖肽的修饰肽可以以单一药物的形式被给药或可以与其它药物联合给药。

本发明的降糖肽或降糖肽的修饰肽可以成盐，包括与各种无机或有机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、扁桃酸盐和草酸盐；各种无机或有机碱盐如氢氧化钠、三羟甲基氨基甲烷和N-甲基-葡萄糖胺成盐。

本发明的降糖肽或降糖肽的修饰肽可以单独使用或以药物组合物的形式使用。药物组合物包括作为活性成分的本发明的降糖肽或降糖肽的修饰肽或其可药用盐及可药用载体。较佳的，本发明的药物组合物有0.1-99.9%重量百分比的作为活性成分的降糖肽或降糖肽的修饰肽或其可药用盐。“可药用载体”不会破坏本发明的化合物或其可药用盐的药学活性，同时其有效用量，即能够其药物载体作用是的用量对人体无毒。

“可药用载体”包括但不限于：离子交换材料、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、自乳化药物传递系统（SEDDS）如d-维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯、吐温或其他类似聚合介质等药物制剂用的表面活性剂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸部分甘油酯混合、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅胶、硅酸镁等。聚乙烯吡咯酮、纤维素物质、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、乙烯-聚氧乙烯-嵌段聚合物和羊毛脂、环糊精如α-、β-、γ-环糊精或其经化学修饰的衍生物如2-和3-羟丙基-β-环糊精等羟烷基环糊精或其他可溶性衍生物等均可用于促进本发明的化合物、其药用盐或前药的药物传递。

其他可药用辅料如填充剂（如无水乳糖、淀粉、乳糖珠粒和葡萄糖）、粘合剂（如微晶纤维素）、崩解剂（如交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素和交联PVP）、润滑剂（如硬脂酸镁）、吸收促进剂、香味剂、甜味剂、稀释剂、赋形剂、润湿剂、溶剂、增溶剂和着色剂等也可加入本发明的药物组合物中。

上述本发明的降糖肽或降糖肽的修饰肽或其可药用盐以及药物组合物可通过肠道或者非肠道途径给药。非肠道给药制剂包括注射剂、霜剂、软膏剂、贴剂、喷雾剂等。给药途径包括皮下、皮内、动脉内、静脉内、肌内、关节内、滑液内、胸骨内、鞘内、病灶内、颅内注射或输注，或者，口服、局部、直肠、经鼻、经颊、阴道、舌下、皮内、粘膜、气管、尿道给药，或者通过吸入气雾或植入蓄积或者针刺方式给药。

上述本发明的降糖肽或降糖肽的修饰肽或其可药用盐以及药物组合物的治疗有效量为0.001-100mg/kg/d之间，可用于相关疾病的单一用药或联合用药治疗，为本领域技术人员能够理解的范围。

附图说明

图1为降糖肽HPLC色谱图。

图2为降糖肽HPLC色谱图。

图3为降糖肽对KK-Ay小鼠体重的影响。

图4为降糖肽对KK-Ay小鼠空腹血糖的影响。

图5为降糖肽对KK-Ay小鼠口服葡萄糖耐量试验。

图6为降糖肽对KK-Ay小鼠血脂的影响。

图7为降糖肽对KK-Ay小鼠肝SOD的影响。

图8为降糖肽对KK-Ay鼠肝MDA含量的影响。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实验动物

KK-AyⅡ型糖尿病模型小鼠（以下简称KK-Ay小鼠），清洁级，雌雄各半，体重为40～45g，购于北京市华阜康公司，合格证号SCXK（京）2009—0004。

ICR小鼠，清洁级，雌雄各半，体重为20～24g，购于南京市江宁区青龙山实验动物中心，合格证号SCXK（苏）2007—0001。

饲养条件为空调房间，温度18～24℃，相对温度70%。

实验材料

罗格列酮片，成都恒瑞制药有限公司，批号111001，临用前用生理盐水稀释至所需浓度。

试剂

氯化钠：南京化学试剂有限公司，AR。生理盐水：用以上氯化钠自行配制。游离脂肪酸测定试剂盒：南京建成生物工程研究所。甘油三酯测定试剂盒：南京建成生物工程研究所。总胆固醇测定试剂盒：南京建成生物工程研究所。总超氧化物歧化酶测定试剂盒：南京建成生物工程研究所。丙二醛测定试剂盒：南京建成生物工程研究所。碳酸钠：南京化学试剂有限公司，AR。氢氧化钠：南京化学试剂有限公司，AR。五水硫酸铜：南京化学试剂有限公司，AR。酒石酸钾：南京化学试剂有限公司，AR。Lowry试剂甲：用以上碳酸钠、氢氧化钠、五水硫酸铜、酒石酸钾自行配制。Lowry试剂乙：美国Sigma公司，批号063K3618。牛血清白蛋白V：瑞士Roche公司。冰醋酸：南京化学试剂有限公司，AR。其他试剂均为分析纯。

仪器与设备

Costar359996孔板：美国Corning公司。1500型酶标仪，美国ThermoElectron公司。5D-1型血糖仪及试条：北京怡成生物电子技术有限公司。Kf10001型电子天平：浙江凯丰集团有限公司。硬膜外麻醉针及其针套：南京建成生物工程研究所。722光栅分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。752紫外光栅分光光度计：上海第三分析仪器厂。TGL-16G台式高速离心机：上海医用分析仪器厂。JA12002型上皿电子天平：上海天平仪器厂。WH-1微型旋涡混合器：上海沪西分析仪器厂。W-201B数显恒温水浴锅：上海申腾生物技术有限公司。

实施例1降糖肽的合成

由吉尔生化（上海）有限公司多肽固相合成法用多肽合成仪合成本发明所述降糖肽。多肽合成起始于H-Pro-2-ChlorotritylchlorideResin,利用HOBt/DCC作为活化剂，依次接上Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Pro-OH.每个氨基酸反应上去后，经DMF充分清洗，piperidine脱Fmnoc保护，DMF再次充分清洗后再接下一个氨基酸。全部合成结束后，利用TFA:H₂O:EDT=95:2.5:2.5（v/v）把降糖肽从树脂上切割下来，冰乙醚沉淀后清洗干净，利用C18柱进行RP-HPLC纯化。色谱条件：XbrigeBEH130C18(4.6×250mm，5μm)，试剂A:0.1%三氟乙酸的乙腈溶液；试剂B:0.1%三氟乙酸的水溶液。流速1.0ml/min，检测波长220nm。洗脱梯度：

收集出峰时间为10.105min的组分（纯度98.5%），色谱图见图1，将组分进行冷冻干燥，样品最后通过ESI-MS验证分子量，质谱图见图2。

实施例2动物实验分组与给药

取30只KK-Ay小鼠，雌雄各半，雌鼠血糖不低于7.8mmol/L，雄鼠血糖不低于11.1mmol/L，用SPSS11.0软件随机均衡分为5组，每组6只，使各组血糖无显著差异，分别为：B组（模型对照组）、C组（阳性对照组）、D组（降糖肽低剂量组）、E组（降糖肽中剂量组）、F组（降糖肽高剂量组）。另取6只正常ICR小鼠作为A组（正常参照组）。C组给予罗格列酮8mg/kg，D、E、F组分别给予降糖肽3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg。A、B组均给予等体积生理盐水。各组均灌胃给药，连续给药2周。

实施例3降糖肽对KK-Ay小鼠体重的影响

实施例2所述各组KK-Ay鼠每日称重一次，每7天统计一次，各组体重与给药前比较，A、

C、D、E四组的体重分别与B组和C组比较，观察体重变化趋势。

给药期间，降糖肽对KK-Ay小鼠体重的影响如表1和图3所示。

表1降糖肽对KK-Ay小鼠体重的影响

N=6,*P<0.05,**P<0.01.GroupA,C,D,EarecomparedwithGroupB,respectively.

从表格及图表可以看出，各给药组（C、D、E、F）的体重均高于B（模型组），给药后期出现D组体重>E组体重>F组体重的趋势，但是各组均无显著性差异。这说明降糖肽不能显著降低KK-Ay小鼠的体重，其体重控制能力与罗格列酮相仿。

实施例4降糖肽对KK-Ay小鼠空腹血糖的影响

首次给药后24h内血糖变化

分别在首次给药前、首次给药后4h、8h、12h、24h用采血针刺破尾静脉取血，用血糖仪及其试条测定血糖值，观测一天（24h）内血糖的动态变化。

实施例2所述各组KK-Ay鼠每隔7天测定空腹血糖一次。测定前禁食8h。禁食结束后，用采血针刺破尾静脉，用血糖仪及其试条测定其血糖。血糖测定结束后恢复给食。

降糖肽对KK-Ay小鼠空腹血糖的影响如表2和图4所示。

表2降糖肽对KK-Ay鼠空腹血糖的影响

N=6,*P<0.05,**P<0.01.GroupA,C,D,EarecomparedwithGroupB,respectively.

可以看出，A（正常对照）组的血糖保持低位，B（模型对照）组的血糖较高。在给药后第2周，E（中剂量）组的空腹血糖值较B（模型对照）组有显著降低，F（高剂量）组的空腹血糖值较B组有极显著降低，D组的空腹血糖值与B组也有差距，但不具统计学意义。这说明降糖肽能有效地降低KK-Ay小鼠的空腹血糖。

实施例5降糖肽对KK-Ay小鼠的口服葡萄糖耐量试验

首次给药后第29天KK-Ay鼠禁食8h，灌胃给予葡萄糖2g/kg，在灌糖前、灌糖后30min、60min、120min尾尖取血测定血糖值。根据血糖值按照如下公式计算血糖线下面积（Areaundercurve，AUC）：

$\mathrm{AUC}=0.5\&times;\frac{{\mathrm{BG}}_0+{\mathrm{BG}}_{30}}{2}+0.5\&times;\frac{{\mathrm{BG}}_{30}+{\mathrm{BG}}_{60}}{2}+1\&times;\frac{{\mathrm{BG}}_{60}+{\mathrm{BG}}_{120}}{2}.$

KK-Ay小鼠的口服葡萄糖耐量试验结果如表3和图5所示。

表3口服葡萄糖耐量试验

N=6,*P<0.05,**P<0.01.GroupA,C,D,EarecomparedwithGroupB,respectively.

在120min时，E（低剂量）组、F（高剂量）组的血糖组显著低于B（模型对照）组，差异有统计学意义。F组的AUC与B组差异也较大，但不具统计学意义。这说明降糖肽能一定程度上改善KK-Ay小鼠的糖耐量，增加KK-Ay小鼠利用血糖的能力。

实施例6降糖肽对KK-Ay小鼠血脂的影响

1.总甘油三酯的测定

给药结束后，将KK-Ay鼠以剪断颈部的方式处死，分离血清，依照总甘油三酯（Totaltriglyceride，TG）试剂盒说明书测定血清TG。该试剂盒仅有一种试剂。

测定吸光度具体步骤如表4所示。

表4操作步骤及试剂用量

	空白管	标准管	测定管
				双蒸水(μL)	30	—	—
血清(μL)	—	—	30
				标准品(μL)	—	30	—
试剂(mL)	3	3	3

混匀，置37℃水浴5min，以空白管校零，在546nm波长下比色读取各管吸光度值。

计算TG的含量每管TG的含量按如下公式计算：

单位为mmol/L，其中A_T代表测定管（Tubefordetermination）的吸光度，A_S代表标准管（Standardsubstancetube）的吸光度，C_S为标准品含量。

2.血清总胆固醇的测定

给药结束后，将KK-Ay鼠以剪断颈部的方式处死，分离血清，依照总胆固醇（Totalcholesterol，T-CHO）试剂盒说明书测定血清T-CHO。

测定吸光度具体步骤如表5所示。

表5操作步骤及试剂用量

	空白管	标准管	测定管
				双蒸水(μL)	30	—	—
血清(μL)	—	—	30
				标准品(μL)	—	30	—
试剂(mL)	3	3	3

混匀，置37℃水浴5min，以空白管校零，在546nm波长下比色读取各管吸光度值。

计算T-CHO的含量每管T-CHO的含量按如下公式计算：

单位为mmol/L，其中A_T代表测定管（Tubefordetermination）的吸光度，A_S代表标准管（Standardsubstancetube）的吸光度，C_S为标准品含量。

3.血清游离脂肪酸的测定

给药结束后，将KK-Ay鼠以剪断颈部的方式处死，分离血清，依照游离脂肪酸（Non-esterifiedfattyacid，NEFA）试剂盒说明书测定血清游离脂肪酸。

配制试剂将试剂三的甲液、乙液、丙液按10：9：1混合配成铜试剂；试剂四包含2瓶10mL稀释液和2支粉剂，用前者溶解后者得到显色剂；试剂五为标准品包含一瓶50mL溶剂和2支粉剂，用少量前者溶解后者后定容到20mL，混匀。试剂一、试剂二、试剂六不作处理。

测定吸光度按照表6添加试剂和待测物。

各管加入试剂一之后，用保鲜薄膜封口，充分混匀抽提2分钟，再3500RPM离心10min。之后，吸取上层液体及凝固层弃之，用硬膜外麻醉针套接上注射器吸取2mL下层抽提液，转移到另一试管。向转移出的下层抽提液中加入0.25mL显色剂，混匀，室温放置2min，以空白管调零，在波长400nm处用1cm光径比色杯测定各管的吸光度A₄₀₀。

表6操作步骤及试剂用量

	空白管	标准管	测定管
				双蒸水(mL)	0.2	0.2
标准物(mL)		0.2
				样品(mL)			0.2
试剂2(mL)	0.5	0.5	0,5
				试剂3(铜试剂)(mL)	1.0	1.0	1.0
试剂1(mL)	4.0	3.8	4.0

计算血清NEFA含量按如下公式计算血清NEFA含量。

单位为μmol/L。

实验结果

降糖肽对KK-Ay小鼠血脂的影响如表7和图6所示。

表7降糖肽对KK-Ay小鼠血脂的影响

N=6,*P<0.05,**P<0.01.GroupA,C,D,EarecomparedwithGroupB,respectively.

KK-Ay小鼠除了具备典型的糖尿病特征外，还具高血脂症。血脂包含三个指标：总甘油三酯（TG）、总胆固醇（TCHO）和血清游离脂肪酸（NEFA）。B（模型对照）组的这三项指标均高于其他各组。F（高剂量）组的TG、TCHO和NEFA均极显著（P<0.01）地低于B组，E（中剂量）组的TG和TCHO也是极显著地（P<0.01）低于B组，这说明降糖肽可以有效地改善KK-Ay小鼠的血脂。

实施例7降糖肽对KK-Ay小鼠肝总SOD的影响

1.肝组织蛋白含量测定

给药结束后，将KK-Ay鼠以剪断颈部的方式处死，取肝脏，在冰冷的生理盐水中漂洗除去血液，卫生纸吸干表面液体，称重。之后切割出一块质量为0.3g的肝组织块，加入预冷的生理盐水2.7mL，用匀浆器冰浴条件下匀浆，配制成10%的肝组织匀浆，4℃保藏。

本文用Lowry法测定肝匀浆肝脏组织中的蛋白含量。

配制试剂首先，配制0.1mol/L的NaOH溶液50mL和1%酒石酸钾溶液100mL。先取前者50mL溶解1gNa₂CO₃，得到溶液①；再取后者100mL溶解0.5gCuSO₄·5H₂O，得到溶液②。取50mL溶液①和1mL溶液②混合（混合后1日内有效），得到Folin-酚试剂A。其次，再将Folin-酚试剂B稀释1倍。第三，称取2.5g牛血清白蛋白标准品，用蒸馏水溶解并定容到10mL，得到250μg/mL的标准牛血清白蛋白溶液。

绘制标准曲线取7支试管，编号，按照表8依次加入各试剂。

在加入Folin-酚试剂B之后室温放置30min，以1号管为对照管，用1cm光径比色杯测定各管在500nm处的吸光度A500，绘制吸光度—牛血清白蛋白标准曲线并得出线性回归方程。

表8操作步骤及试剂用量

测定样品将10%肝脏组织匀浆稀释400倍，准确吸取1mL稀释后的匀浆，其他操作与“绘制标准曲线”步骤相同。最后通过回归方程求算出样品含蛋白质的浓度。

2.肝组织总SOD活力测定

配制试剂按照总超氧化物歧化酶（Totalsuperoxidedismutase，T-SOD）测定试剂盒说明书的要求，配制所用试剂：将5mL试剂一贮备液加蒸馏水稀释到50mL，得到试剂一；将试剂四的贮备液和稀释液按1：14稀释，得到试剂四；将试剂五用70～80℃热双蒸水37.5mL溶解，如果加热过程中双蒸水减少，需要用双蒸水补充到37.5mL；将试剂六用37.5mL蒸馏水溶解；将试剂五、试剂六、冰醋酸按3：3：2的体积混合，制得显色剂（Chromogenicagent）。试剂二、试剂三不作处理。

测定吸光度把10%肝组织匀浆稀释成1%组织匀浆。按照表9依次加入各试剂。在加入显色剂后，混匀各个试管；用蒸馏水调零，在波长550nm处以1cm光径比色杯测定各管的吸光度。

计算SOD活力本文对SOD活力的定义是：每毫克组织蛋白（mgprot）在1mL反应液中SOD抑制率达50%所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。计算公式为：

单位为U/mgprot，其中mgprot代表毫克蛋白。

表9操作步骤及试剂用量

降糖肽对KK-Ay小鼠肝总SOD活力的影响如表10和图7所示。

表10降糖肽对KK-Ay鼠肝总SOD活力的影响

N=6,*P<0.05,**P<0.01.GroupA,C,D,EarecomparedwithGroupB,respectively.

各组KK-Ay小鼠的肝SOD活力均高于B（模型对照）组。其中三个给药组的肝SOD活力均高于B（模型对照）组和C（阳性对照）组，而且F（高剂量）组和E（中剂量）组与B组相比，分别存在极显著（P<0.01）和显著（P<0.05）差异。这说明降糖肽能有效地改善SOD活力，提高抗氧化应激能力。

实施例8降糖肽对KK-Ay小鼠肝总MDA含量的影响。

配制试剂按照丙二醛（Malonaldehyde，MDA）测定试剂盒说明书的要求，配制所用试剂：水浴加温试剂一使之溶解；向试剂二中加入170mL双蒸水并混匀；试剂三用90～100℃的热双蒸水30mL溶解，在充分溶解后用双蒸水补足到30mL再加冰醋酸30mL，混匀。肝组织蛋白含量参照实施例7肝组织蛋白含量的结果。

测定吸光度按照表11，依次加入待测物和各种试剂。

表11操作步骤及试剂用量

加入试剂三之后，用旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴40min，取出后流水冷却。之后4000转离心10分钟，用移液器取上清0.2mL，在波长532nm处用1cm光径比色杯测定各管的吸光度。

计算丙二醛含量按照如下公式计算丙二醛含量：

单位为nmol/mgprot，其中mgprot为毫克蛋白。

降糖肽对KK-Ay小鼠肝总MDA含量的影响如表12和图8所示。

B（模型对照）组的肝MDA含量高于其他各组，C组（阳性对照）组的肝MDA含量仅次于B组，三个给药组D（低剂量）、E（中剂量）、F（高剂量）的肝MDA含量均极显著（P<0.01）地低于B、C组。这说明极低剂量的降糖肽就能够较好地保护细胞免遭氧自由基的破坏。已知MDA是细胞膜脂质氧化产物，实验结果提示降糖肽能保护细胞免遭氧自由基的破坏，这可能是降糖肽能降低血糖、抵抗糖尿病的机制之一。

表12降糖肽对KK-Ay鼠肝总MDA含量的影响

N=6,*P<0.05,**P<0.01.GroupA,C,D,EarecomparedwithGroupB,respectively.

Claims (3)

1.一种降糖肽，氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。

2.如权利要求1所述降糖肽在制备治疗和/或预防糖尿病或高血脂症药物或保健品中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的药物中含如权利要求1所述的降糖肽以及药学上可以接受的载体。