CN101029081A - 重组的降糖肽及其生产菌株的构建和培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种降血糖多肽，其含有多个Exendin－4多肽或其类似物。本发明还公开了编码所述降血糖多肽的基因，含有该基因的载体，以及含有所述载体或基因组中整合有所述基因的宿主细胞。本发明所述的降血糖多肽具有比Exendin－4单体显著更好的稳定性，并且表达量大大提高。

Description

重组的降糖肽及其生产菌株的构建和培养方法

技术领域

本发明属于生物技术工程领域，更具体的，本发明涉及一种由多个Exendin-4多肽或其类似物串联而成的重组蛋白，编码该重组蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程技术制备该重组蛋白的方法，以及该重组蛋白在制备预防或治疗糖尿病的药物中的应用。

背景技术

促胰岛素分泌肽(Exendin-4)和GLP-1具有较高的同源性，它们是目前用于治疗II型糖尿病的新型药物，在功能上其具有葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌作用，不会产生低血糖效应，能够抑制胰高血糖素分泌，降低胃排空的速率，促进饱食感，另外，研究表明Exendin-4能增加胰岛β细胞的新生和繁殖，抑制β细胞凋亡，调节外周组织葡萄糖浓度，阻止糖尿病人的病情恶化。由于Exendin-4具有优越的降血糖特性，是目前国内外重点开发的治疗II型糖尿病的药物。

Amylin公司的开发的名为Exenatide的Exendin-4药物作为一种新型的治疗II型糖尿病的药物，2005年在美国上市，每天注射两次，可改善血浆葡萄糖水平，抗体反应不明显，还可降低体重。对于单独口服糖尿病药物二甲双胍，磺酰尿或两者联合用药均无法达到理想血糖水平的II型糖尿病患者，经Exenatide治疗后，一半以上的患者达到糖尿病协会推荐的或更低的目标血糖水平，且不会引起低血糖，患者体重平均也有显著减少。Exendin-4作为近十年来治疗糖尿病的新药，市场需求巨大，预计2007年销售额将达到3.16亿美元，到2010年将达到7.3亿美元。

Exendin-4的制备方法主要有化学合成法和基因工程菌发酵生产法。目前，国外Amylin等公司一般采用化学合成的方法生产Exendin-4或其类似物，由于化学合成方法成本高，导致产品价格昂贵，所以此类药物的开发都转向基因工程菌生产，以实现低成本和大规模生产。

国内，上海复兴医药研究有限公司利用基因工程手段，将Exendin-4的基因克隆至表达质粒并转入大肠杆菌和毕赤酵母中，构建基因工程菌进行发酵培养生产Exendin-4，该项技术目前已申请了专利(专利号CN1455001A)。

上海华谊技术有限公司利用大肠杆菌表达系统表达了Exendin-4的类似物并申请了专利(专利号CN 1363559A)。

然而，目前采用基因工程手段生产的Exendin-4及其功能类似物GLP-1均具有表达量低的问题，并且，稳定性也较差，不符合工业化生产的要求。因此，本领域迫切需要在保留Exendin-4活性的基础上对其进行结构改造或修饰、或改进Exendin-4的生产工艺，以期实现规模化低成本生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种降血糖多肽，其具有高的表达量以及稳定性。

本发明的目的还在于提供编码所述降血糖多肽的基因，含有该基因的载体，以及含有所述载体或基因组中整合有所述基因的宿主细胞。

本发明的目的还在于提供所述降血糖多肽的生产方法。

在本发明的第一方面，提供一种重组蛋白，所述的重组蛋白含有式I所示的结构：

                (X-Y)_n-X                                I

其中，X是Exendin-4多肽或其类似物；

Y是连接肽，长度为1-15个氨基酸；

n＝1-9；优选地，n＝2-6；更优选的，n＝2-4。

在本发明的另一优选例中，所述的连接肽具有选自下组的氨基酸序列：

(a)(Asp₄LysGluSerAsp₄Lys)_m，其中m＝1-3；优选地，m＝1；

(b)(Met)_t，其中，t＝1-5；优选地，t＝1-3；最优选的，t＝1；

(c)多克隆位点的氨基酸序列；或

(d)由(a)、(b)或(c)组合形成的氨基酸序列。

在本发明的另一优选例中，在所述的重组蛋白的氨基端还包含糖基化位点或肠激酶识别序列。

在本发明的另一优选例中，所述的糖基化位点的氨基酸序列是：Asn-Thr-Thr。

在本发明的另一优选例中，所述的肠激酶识别序列的氨基酸序列是：Asp-Asp-Asp-Asp-Lys。

在本发明的另一优选例中，所述的Exendin-4多肽或其类似物具有SEQ IDNO：3(EXA)，或SEQ ID NO：1(天然Exendin-4多肽)所示的序列。

在本发明的第二方面，提供一种多核苷酸，该多核苷酸选自下组：

(i)编码所述的重组蛋白的多核苷酸；或

(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。

在本发明的另一优选例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

在本发明的第三方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一优选例中，所述的载体来源于甲醇营养型重组酵母表达载体。

在本发明的第四方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体；或

它的基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的另一优选例中，所述的宿主细胞是甲醇营养型酵母。

在本发明的另一优选例中，所述的甲醇营养型酵母包括(但不限于)：毕赤酵母(Pichia)、汉逊酵母(Hansenula)、假丝酵母(Candida)、或球拟酵母(Torulopsis)。最优选的，所述的甲醇营养型重组酵母为毕赤酵母(Pichia)。

在本发明的第五方面，提供所述的重组蛋白的用途，用于制备预防或治疗糖尿病的组合物。

在本发明的第六方面，提供一种组合物，所述的组合物含有有效量(如0.0001-10wt％)的所述的重组蛋白，以及药学上可接受的载体。

在本发明的第七方面，提供一种生产所述的重组蛋白的方法，包括步骤：

(1)在适合表达所述重组蛋白的条件下，培养所述的宿主细胞，获得培养物，和

(2)从培养物中分离出所述的重组蛋白。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1A显示了PCR扩增得到2-exa，3-exa，5-exa基因串联体的琼脂糖电泳结果。

图1B显示了PCR扩增得到1-exa基因的琼脂糖电泳结果，其中，泳道1为marker，泳道2为阴性对照，泳道3为1-exa基因。

图2A显示了含有5拷贝exa基因的表达载体pEXA5的图谱。

图2B显示了含有1拷贝exa基因的表达载体pEXA1的图谱。

图2C显示了含有4拷贝exa基因的表达载体pEXA4的图谱，该表达载体上4-exa基因的5’端带有分泌信号序列α-MF和糖基化位点。

图2D显示了含有4拷贝exa基因的表达载体，该表达载体上4-exa基因的5’端带有分泌信号序列α-MF，无糖基化位点。

图3A显示了由GS115/pEXA5表达5-EXA后，获取上清进行蛋白电泳的结果；其中，泳道1为GS115/pPIC9K诱导48hr后的蛋白电泳结果；泳道2为Marker；泳道3GS115/pEXA5诱导48hr后的蛋白电泳结果；泳道4GS115/pEXA5诱导36hr后的蛋白电泳结果；泳道5GS115/pEXA5诱导24hr后的蛋白电泳结果；泳道6GS115/pEXA5未进行诱导的蛋白电泳结果。

图3B显示了GS115/pEXA3表达3-EXA后，获取上清进行蛋白电泳的结果；其中，泳道1为GS115/pEXA3诱导0hr后的蛋白电泳结果；泳道2为GS115/pEXA3诱导12hr后的蛋白电泳结果；泳道3为GS115/pEXA3诱导24hr后的蛋白电泳结果；泳道4为GS115/pEXA3诱导36hr后的蛋白电泳结果；泳道5为GS115/pEXA3诱导48hr后的蛋白电泳结果；泳道6为GS115/pEXA3诱导55hr后的蛋白电泳结果；上样量16μl。

图3C显示了GS115/pEXA2表达2-EXA后，获取上清进行蛋白电泳的结果；其中，泳道1为GS115/pEXA2诱导0hr后的蛋白电泳结果；泳道2为GS115/pEXA2诱导24hr后的蛋白电泳结果；泳道3为GS115/pEXA2诱导36hr后的蛋白电泳结果；泳道4为GS115/pEXA2诱导48hr后的蛋白电泳结果；上样量12μl。

图3D显示了GS115/pEXA1表达1-EXA后，获取上清进行蛋白电泳的结果；其中，泳道1为Marker；泳道2为GS115/pEXA1诱导48hr后的蛋白电泳结果；泳道3为GS115/pEXA1诱导36hr后的蛋白电泳结果；泳道4为GS115/pEXA1诱导24hr后的蛋白电泳结果；泳道5为GS115/pEXA1诱导12hr后的蛋白电泳结果；泳道6为GS115/pEXA1未诱导的蛋白电泳结果；上样量16μl。

图4A显示了软件分析5-EXA所占上清总蛋白百分含量的结果，由分析结果可知，5-EXA占上清总蛋白含量的88.8％。

图4B显示了软件分析3-EXA所占上清总蛋白百分含量的结果，由分析结果可知，3-EXA占上清总蛋白含量的69.0％。

图4C显示了软件分析2-EXA所占上清总蛋白百分含量的结果，由分析结果可知，2-EXA占上清总蛋白含量的65.4％。

图4D显示了软件分析1-EXA所占上清总蛋白百分含量的结果，由分析结果可知，1-EXA占上清总蛋白含量的39.1％。

图5A显示了GS115/pEXA5表达产物蛋白免疫印迹。其中，泳道1为GS115/pEXA5未进行诱导的免疫印迹结果；泳道2-泳道4为GS115/pEXA5经诱导表达的5-EXA的免疫印迹结果。

图5B显示了GS115/pEXA3、GS115/pEXA2表达产物蛋白免疫印迹。其中，泳道1为GS115/pEXA3经诱导表达后的免疫印迹结果；泳道2为GS115/pEXA2经诱导表达后的免疫印迹结果。

图6A显示了GS115/pEXA4表达4-EXA后，获取上清进行蛋白电泳的结果；其中，泳道1为GS115/pEXA4诱导0hr后的电泳结果；泳道2为GS115/pEXA4诱导0hr+endo H处理后的电泳结果；泳道3为GS115/pEXA4诱导48hr+endo H处理后的电泳结果；泳道4为GS115/pEXA4诱导48hr后的电泳结果；泳道5-7为GS115/pEXA4诱导48hr+endo H处理后的电泳结果；泳道8为GS115/pPIC9K诱导48hr+endo H处理后的电泳结果；上样量为12μl。

图6B显示了GS115/pEXA4C表达4-EXA后，获取上清进行蛋白电泳的结果；其中，泳道1为GS115/pEXA4C诱导0hr后的电泳结果；泳道2为GS115/pEXA4C诱导24hr后的电泳结果；泳道3为GS115/pEXA4C诱导48hr后的电泳结果；泳道4为GS115/pEXA4C诱导72hr后的电泳结果；上样量为16μl。

图7显示了GS115/pEXA4表达产物的蛋白免疫印记。其中泳道1为GS115/pEXA4经诱导表达后的免疫印记结果，泳道2为GS115/pEXA4诱导表达后产物经endo H处理后的免疫印记结果。

图8A显示5-EXA血清降解情况。纯化后的5-EXA放置在人血清中，经过不同时间，取样进行电泳，分析它的降解程度。其中泳道1为阴性对照，泳道2为37℃放置0hr，泳道3为37℃放置2hr，泳道4为37℃放置4hr，泳道5为37℃放置6hr。

图8B显示GLP-1血清降解情况。其中泳道1为37℃放置6hr，泳道2为37℃放置4hr，泳道3为37℃放置2hr，泳道4为37℃放置0hr。

图8C显示EXA血清降解情况。其中泳道1为37℃放置4hr，泳道2为37℃放置2hr，泳道3为37℃放置0hr，泳道4为阴性对照。

图9显示了5-EXA，EXA，GLP-1促鼠胰岛细胞胰岛素释放。其中1为采用细胞培养液的空白对照，2为EXA，3为5-EXA，4为GLP-1。

具体实施方式

针对现有技术中Exendin-4或其类似物GLP-1蛋白表达量低且稳定性差的问题，本发明人经过长期而深入的研究和试验，首次发现：由多个EXA或Exendin-4多肽串联而成的重组多肽在保持与Exendin-4或GLP-1相当的活性的基础上，具有比Exendin-4单体显著更好的稳定性，并且表达量大大提高。基于此完成了本发明。

促胰岛素分泌肽

促胰岛素分泌肽(Exendin-4)是一种最初发现于Heloderma suspectum(Gila畸形突变体)唾液分泌物中的多肽，其与哺乳动物胰高血糖素样肽家族的一些成员相似，与GLP-1的在氨基酸序列上具有53％的同源性。所述的Exendin-4多肽具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

如本发明所用，“Exendin-4多肽类似物”是指经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的多肽。Exendin-4多肽类似物也包括在本发明中。比如，所述的Exendin-4多肽类似物的序列是对Exendin-4多肽的一个或多个保守氨基酸进行替代所形成的，所述经氨基酸替换后形成的序列并不影响其活性或保留了其大部分的活性。适当替换氨基酸是本领域的公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变一个或多个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224。

作为本发明的一个实例，提供了一种Exendin-4多肽的类似物，本发明人将之称为EXA多肽。所述的EXA多肽具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，其编码基因具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

重组蛋白及其编码基因

本发明提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白是由Exendin-4多肽或其类似物串联而成的，其含有式I所示的结构：

               (X-Y)_n-X                           I

式I中，X是Exendin-4多肽，或Exendin-4多肽类似物；

Y是连接肽，长度为1-15个氨基酸；

n＝1-9。

在构建本发明的重组蛋白时，本发明人发现，尽管多拷贝能够显著提高多肽的稳定性，然而当重组蛋白的序列过长时，会导致其分泌表达难度大大增加，甚至导致表达量发生显著降低，说明重组蛋白中Exendin-4多肽或其类似物的拷贝数也不宜太多。因此，本发明所述的重组蛋白含有2-10个重复串联的Exendin-4多肽或其类似物。作为本发明的优选方式，所述的重组蛋白含有3-7个重复串联的Exendin-4多肽或其类似物；作为本发明的最优选的方式，所述的重组蛋白含有3-5个重复串联的Exendin-4多肽或其类似物。

在进行串联连接时，通常，Exendin-4多肽或其类似物按照“NH₂-Exendin-4多肽或其类似物-COOH”→------→“NH₂-Exendin-4多肽或其类似物-COOH”的次序同向连接。

作为本发明的更优选的方式，在所述的重组蛋白的氨基端还包含糖基化位点或肠激酶识别序列。更优选的所述的糖基化位点的氨基酸序列是：Asn-Thr-Thr；所述的肠激酶识别序列氨基酸序列是：Asp-Asp-Asp-Asp-Lys。所述的糖基化位点或肠激酶识别序列便于提高蛋白分泌表达的表达量。

此外，在所述的重组蛋白的氨基端或羧基端还可添加其它基本上不影响本发明所述的重组蛋白的活性、表达量和稳定性的氨基酸序列。较佳地，这些添加的氨基酸序列有利于表达(如信号肽)，有利于纯化(如6×His序列、酿酒酵母α-因子信号肽切割位点(Glu-Lys-Arg))，或其它可促进所述的重组蛋白的活性、表达量或稳定性的序列。

本发明还包括编码本发明的重组蛋白的DNA分子。所述的DNA分子可以全部人工合成，也可用PCR扩增的方法获得。

为了进一步提高宿主细胞的表达量，可以对本发明的重组蛋白的编码序列进行改造，例如采用宿主细胞偏好的密码子，消除不利于基因转录及翻译的序列。例如，采用了酵母偏好的密码子，并采用计算机DNA软件对本发明的重组蛋白基因进行检测，排除在基因中不利于基因转录及翻译的序列，包括内含子剪切位点，转录终止序列等。

重组蛋白的表达

在获得了编码本发明新重组蛋白的DNA序列之后，将其克隆入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的重组蛋白。

如本文所用，术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新重组蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。

如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，更佳地是酵母细胞。

作为本发明的优选方式，选择甲醇营养型重组酵母作为本发明的重组蛋白的表达系统，其能够高效地生产本发明的重组蛋白，且具有成本低廉、适于大规模生产等特点。

作为本发明的更优选的方式，本发明适用的菌株为采用醇氧化酶启动子PAOX1、PAOX2甲醇营养型酵母，如毕赤酵母(Pichia)、汉逊酵母(Hansenula)、假丝酵母(Candida)或球拟酵母(Torulopsis)等。在重组酵母构建时可采用不同的表达载体(如pPIC9K等)，而且载体在酵母内可有不同存在方式(如附加型、整合型等)，所述的重组酵母可具备不同的表型(Mut⁺，Mut^s等)。

在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明重组蛋白的条件下培养该细胞，从而表达出重组蛋白；然后再分离出表达的重组蛋白。

在本发明的优选实例中，(1)构建了能高效表达exa基因的表达质粒：根据毕赤酵母密码子偏爱性合成exa基因，将exa基因克隆到载体pPIC9K上，并通过PCR技术在载体pPIC9K分泌信号序列3’端和exa基因5’端之间引入糖基化位点序列或肠激酶识别位点序列，构建表达载体。(2)构建了基因工程重组毕赤酵母：将表达质粒经过SacI线性化以后，电转化毕赤酵母GS115，通过His⁺以及G418来筛选所需要的重组酵母。(3)培养所述的重组毕赤酵母使之表达重组蛋白：将能抗G4181.0mg/mL以上的基因工程重组酵母接入摇瓶中，进行摇瓶发酵，从发酵上清中获取目的重组蛋白。

在本发明的优选实例中，采用甲醇营养型重组酵母菌株(优选毕赤酵母)生产EXA的方法为：

(1)菌种培养：将单个新鲜菌落接种于培养液中。培养24小时。

(2)摇瓶培养：将上述菌种按适当的比例(如2％-15％)接入含有培养液的摇瓶中，培养24小时后，用甲醇诱导2-3天，每天补加甲醇终浓度至1-2.5％。

当进行上述培养时，优选的菌种培养的培养液是YPD或者是BMGY培养液；优选的摇瓶培养的培养液是BSM或者是BMMY培养液。

当进行上述培养时，优选的培养温度为25-35℃。

连接肽

如本文所用，术语“连接肽”(linker)指位于各Exendin-4多肽或其类似物之间的、起连接作用的短肽。连接肽的长度没有特别限制。连接肽的长度也可为0，此时各Exendin-4多肽或其类似物直接相连。通常，连接肽不影响或不显著影响各Exendin-4多肽或其类似物的串联体的氨基酸序列形成正确的折叠和空间构象。一些连接肽的例子包括(但并不限于)：

(a)(Asp₄LysGluSerAsp₄Lys)_m，其中m＝1-3(优选地，m＝1)；

(b)(Met)_t，其中，t＝1-5(优选地，t＝1-3；最优选的，t＝1)；

(c)多克隆位点所编码的氨基酸序列，该序列通常为2-20个，较佳地2-10个氨基酸；或

(d)由(a)、(b)、或(c)组合形成的氨基酸序列。

最优选地，本发明所述的重组蛋白含有(Asp₄LysGluSerAsp₄Lys)_m。

重组蛋白的用途及其组合物

本发明提供了所述重组蛋白的用途，其可被用于制备预防或治疗糖尿病的组合物。

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.0001-10wt％)的所述的重组蛋白，以及药学上可接受的载体。

本发明的组合物可直接用于糖尿病的预防或治疗。此外，还可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。

通常，可将本发明的重组蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

本发明的组合物含有安全有效量的所述的重组蛋白以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

本发明的主要优点在于：

本发明的重组蛋白是由多Exendin-4多肽或其类似物串联而成的，其在保持与Exendin-4或GLP-1(一种Exendin-4类似物)相当的活性的基础上，具有比Exendin-4单体或GLP-1单体更好的稳定性、且表达量大大提高。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

具体实施方式

实施例1携带含有肠激酶识别位点的不同拷贝exa基因的表达质粒的构建

采用化学合成的方法，合成Exendin-4类似物的基因(命名为exa基因)，该基因的序列(SEQ ID NO：2)如下：

CACGGTGAGGGTACTTTCACTTCCGACTTGTCCAAGCAAGTTGAGGAGGAGGCTGTTAGATTGTTCATT

GAGTGGTTGAAGAACGGTGGTCCATCTTCCGGTGCTCCACCACCATCC

其对应的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)如下：

HGEGTFTSDLSKQVEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS

以上述全合成的exa基因为模板，利用引物进行PCR扩增，在exa基因两端都引入肠激酶识别序列，并且肠激酶识别序列外侧带有限制性内切酶HinfI位点，HinfI酶切后的基因序列带有非镜像粘端，保证扩增出来的exa基因单体能按照正确方向一一首尾相连，成为多拷贝基因串联体。其中，所用的引物如下(其中，下划线部分为限制性内切酶HinfI位点；斜体部分为肠激酶识别序列)：

正向引物1(SEQ ID NO：4)：

5’TTT GAGTCCGACGACGACGACAAGCACGGTGAGGGTACTTTCACTTC 3’

反向引物1(SEQ ID NO：5)：

5’AAA GACTCTTTATCATCATCATCGGATGGTGGTGGAGC ACCGGAA 3’

将PCR得到的基因单体用HinfI酶切后，回收酶切产物进行连接反应，反应体系20μL，其中10×连接酶缓冲液2μL，T4连接酶1μL，16℃连接4hr。再以连接产物为模板，采用以下引物(其中，下划线部分为限制性内切酶EcoR I、NotI位点)：

正向引物2(SEQ ID NO：6)：

5’AA GAATTCGACGACGACGACAAGCACGGTGAGGGTACT 3’；

反向引物2(SEQ ID NO：7)：

5’CT GCGGCCGCTTATTTATCATCATCATCGGA 3’；

进行PCR反应，扩增得到不同拷贝数的exa基因串连体(每个单体片段约140bp)，并在基因串联体两端引入限制性内切酶位点EcoR I，Not I。将获得的具有多拷贝的exa基因串连体进行琼脂糖电泳，结果见图1A和图1B。

回收2、3、5拷贝exa基因串连体，即为2-exa、3-exa、5-exa。以exa为模板，由正向引物2，反向引物3(5’CT GCGGCCGCTTAGGATGGTGGTGG 3’(SEQ IDNO：8)，下划线部分为限制性内切酶Not I位点)扩增得到1-exa。

分别用EcoR I、Not I双酶切1-exa，2-exa、3-exa、5-exa，插入载体pPIC9K的EcoR I、Not I位点中，得到表达载体pEXA1(图2B)、pEXA2、pEXA3、pEXA5(图2A)。其中，以含有1拷贝exa基因的表达载体pEXA1作为对照。

实施例2基因工程重组毕赤酵母的构建

将所构建的重组质粒pEXA1至pEXA5用限制性内切酶Sac I进行线性化，经苯酚-氯仿抽提后，用乙醇沉淀回收线性化质粒片段。纯化回收后的线性化质粒片段按照Invitrogen公司的Multi-copy Pichia Expression Kit说明书上的电转化方法电转毕赤酵母GS115(购自invitrogen公司)，电转的条件按照Bio-RAD公司的MicroPulser电转仪所预设的Pichia pastors程序进行。

电转得到的菌液涂布在MD(含有1.34％酵母基础氮源，4×10^-5生物素，2％葡萄糖)平板上于30℃培养3-4天，筛选基因型His⁺的重组子，得到的重组子再按照Invitrogen公司的Multi-copy Pichia Expression Kit说明书上的G418筛选方法筛选得到高基因剂量的重组子GS 115/pEXA1，GS 115/pEXA2，GS115/pEXA3，GS115/pEXA5，其中以GS115/pEXA1作为对照菌。

实施例3EXA的摇瓶表达

将能抗G4181.0-1.5mg/ml的基因工程重组毕赤酵母单克隆接入含5mLYPD培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)的试管中进行培养，培养温度30℃，转速220rpm。24小时以后按照2-10％的接种量接入至含25mL BSM培养基((NH₄)₂SO₄6g/L，CaSO₄ 0.46g/L，K₂SO₄ 9.1g/L，MgSO₄·7H₂O 7.5g/L，Glycerol 20g/L，12mL/L微量元素PTM₁的溶液。用0.2M的K₂HPO₄/KH₂PO₄缓冲液配制，pH5.0)的250ml摇瓶中进行培养，培养24小时后，开始补加甲醇2天，诱导EXA的分泌表达。每天用5M KOH控制pH4.0-6.0范围，并且补加1-2.5％的甲醇。诱导2天后，取发酵液，4℃，12000rpm离心5min，取上清，用常规的考马斯亮兰法测定上清总蛋白。

结果测得，GS115/pEXA5、GS115/pEXA3、GS115/pEXA2发酵液上清总蛋白浓度分别达到0.32g/L，0.2g/L和0.11g/L，而对照GS115/pEXA1上清总蛋白浓度0.085g/L。

分别取GS115/pEXA5、GS115/pEXA3、GS115/pEXA2、GS115/pEXA1发酵液上清液进行胶浓度15％的蛋白电泳，结果见图3A-D；并使用计算机扫描软件bandscan4.5(Glyko)确定表达的EXA占上清总蛋白的百分含量，结果见图4A-D。

GS115/pEXA5、GS115/pEXA3、GS115/pEXA2菌株EXA产量分别是0.27g/L、0.138g/L和0.07g/L，而对照1拷贝EXA产量只有0.03g/L，可见串联融合的EXA的表达量显著高于同样条件下培养的1拷贝EXA的表达量。

实施例4EXA的蛋白免疫印迹

将含有5拷贝、3拷贝、2拷贝EXA蛋白的发酵液上清总蛋白进行凝胶电泳后，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，采用抗GLP-1抗体(购自北京博奥森生物技术有限公司；由于GLP-1与exendin-4是功能类似物，其N端活性区域同源性高达70％，所以GLP-1具有与exendin-4同样的抗原决定簇，可采用抗GLP-1抗体进行检测)与发酵液上清总蛋白进行蛋白免疫杂交，并用GS115/pEXA5诱导前的发酵液上清总蛋白作为对照。

结果见图5A-B，诱导后的上清总蛋白中相应位置出现明显的杂交条带，而诱导前的对照没有，证明诱导表达后产生的目的条带是EXA蛋白的条带。并且，还说明，本发明获得的5拷贝、3拷贝、2拷贝EXA蛋白保留了Exendin-4多肽的免疫活性。

实施例5糖基化4拷贝EXA表达载体的构建

根据实施例1所述的方法，全基因合成4拷贝exa基因，各exa基因单元之间以甲硫氨酸密码子ATG进行连接，并在4-exa基因两端引入限制性内切酶位点EcoR I，Not I。利用限制性内切酶位点EcoR I，Not I将4-exa基因插入pPIC9K，得到载体pEXA4C，见图2D。采用以下引物：

正向引物3(SEQ ID NO：9)：

5’-GC GGATCCAAACGATGAGA-3’；

反向引物4(SEQ ID NO：10)：

5’- GAATTCAGTAGTGTTTACGTAAGCTTCAGC-3’；

进行PCR反应，扩增pPIC9K中的分泌信号序列α-MF，从而在α-MF 3’端引入糖基化位点NTT的核苷酸编码序列，并且改造的α-MF序列两端含有限制性内切酶位点BamH I，EcoR I。

利用限制性内切酶位点BamH I，EcoR I，将改造的α-MF序列替换载体pPIC9K/4-exa中原有的α-MF，得到表达载体pEXA4(图2C)。

实施例6糖基化4-EXA的摇瓶表达

将实施例5中的载体pEXA4及pEXA4C按照实施例2所述的方法转化毕赤酵母，得到转化子GS115/pEXA4和GS115/pEXA4C，并按照实施例3所述的方法进行摇瓶表达。

诱导2-3天后，取发酵液，4℃，12000rpm离心5min，取上清，用考马斯亮兰法测定上清总蛋白。GS115/pEXA4上清蛋白浓度0.1g/L，GS115/pEXA4C上清蛋白浓度0.12g/L。

将各菌发酵液上清进行蛋白电泳，并且用去糖基化酶endo H对糖基化修饰的4-EXA蛋白进行去糖基化处理，以确定糖基化修饰的发生。

蛋白浓度分析表明，GS115/pEXAG4表达的糖基化4-EXA约48mg/L，见图6A；而对照菌表达的4-EXA较少，见图6B。可见糖基化修饰能明显提高分泌表达。

实施例7糖基化4-EXA的蛋白免疫印迹

将含有糖基化4-EXA的发酵液上清和经过去糖基化酶处理的发酵液上清总蛋白进行凝胶电泳后，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，采用抗GLP-1抗体与发酵液上清总蛋白进行蛋白免疫杂交。

免疫印迹结果表明，糖基化以及去糖基化的4-EXA蛋白都表现出阳性反应，见图7。

实施例8串连体蛋白与单体稳定性对比

GLP-1(0.1mg/mL)，EXA(0.05mg/mL)，5-EXA(0.1mg/mL)各100μL，装于两离心管中，各加入25μL血清，混匀，37摄氏度放置，考察蛋白在存在多种蛋白酶的体系中的稳定性。每2小时分别取样20μL。以只加入血清，没有加入蛋白样品放置0hr的一组为阴性对照。

样品进行蛋白电泳后，进行蛋白免疫印迹Western Blotting，观察是否有降解片段，以分析稳定性。5-EXA串连体蛋白(泳道1阴性对照，泳道20hr，泳道32hr，泳道44hr，泳道56hr)在6hr仍无明显降解；而GLP-1(泳道40hr，泳道32hr，泳道24hr，泳道16hr)在2hr时已经出现降解片段；同样EXA(泳道4阴性对照，泳道3 0hr，泳道2 2hr，泳道1 4hr)在2hr也出现较明显降解。结果见图8A，B，C，可见串连体蛋白的稳定性高。

实施例9串联体的生物活性

取8周龄Wastor鼠胰腺的胰岛细胞，用30％新生牛血清RMPI1640进行原代培养，培养6天，2天换液一次。

将培养好的胰岛细胞分种于24孔板中，每孔1×10⁶个细胞，每孔加入10mmol的葡萄糖。实验组为EXA和5-EXA，浓度为10^-6、10^-7、10^-8mol，对照组加细胞培养液，阳性对照组加入浓度为10^-6、10^-7、10^-8mol的GLP-1。置5％的CO₂培养箱中37℃孵育培养48h后，收集上清，测定胰岛素含量(酶联免疫法，胰岛素测定试剂盒购自中国原子能研究院同位素研究所)，做三个平行，取均值。

结果见图9。由图9可见，EXA，5-EXA与GLP-1一样具有显著促胰岛素释放能力，从而能起到降血糖功效。

实施例10药物组合物

按以下表1配方，用常规方法制备药物组合物：

                        表1

	组分	药学上可接受的载体
			组合物1	5-EXA 5-10mg	0.9％NaCl；20mM磷酸盐缓冲液pH6-7
组合物2	3-EXA 5-10mg	0.9％NaCl；20mM磷酸盐缓冲液pH6-7

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                                    序列表

<110>上海国佳生化工程技术研究中心有限公司

<120>重组的降糖肽及其生产菌株的构建和培养方法

<130>067103

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>39

<212>PRT

<213>Heloderma suspectum

<400>1

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1               5                   10                  15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

            20                  25                  30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

        35

<210>2

<211>117

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>多肽

<220>

<221>misc_feature

<223>多核苷酸

<400>2

cacggtgagg gtactttcac ttccgacttg tccaagcaag ttgaggagga ggctgttaga    60

ttgttcattg agtggttgaa gaacggtggt ccatcttccg gtgctccacc accatcc      117

<210>3

<211>39

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>多肽

<400>3

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Val Glu Glu

1               5                   10                  15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

            20                  25              30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

        35

<210>4

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

tttgagtccg acgacgacga caagcacggt gagggtactt tcacttc              47

<210>5

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

 aaagactctt tatcatcatc atcggatggt ggtggagcac cggaa               45

<210>6

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

aagaattcga cgacgacgac aagcacggtg agggtact                        38

<210>7

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

ctgcggccgc ttatttatca tcatcatcgg a                               31

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

ctgcggccgc ttaggatggt ggtgg                                      25

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>9

gcggatccaa acgatgaga                                             19

<210>10

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>10

gaattcagta gtgtttacgt aagcttcagc                               30

Claims (10)

1.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白含有式I所示的结构：

                (X-Y)_n-X         I

其中，X是Exendin-4多肽或其类似物；

Y是连接肽，长度为1-15个氨基酸；

n＝1-9。

2.如权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述的连接肽具有选自下组的氨基酸序列：

(a)(Asp₄LysGluSerAsp₄Lys)_m，其中m＝1-3；

(b)(Met)_t，其中，t＝1-5；

(c)多克隆位点的氨基酸序列；或

(d)由(a)、(b)或(c)组合形成的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，在所述的重组蛋白的氨基端还包含糖基化位点或肠激酶识别序列。

4.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的Exendin-4多肽或其类似物具有SEQ ID NO：3，或SEQ ID NO：1所示的序列。

5.一种多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸选自下组：

(i)编码权利要求1所述的重组蛋白的多核苷酸；或

(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求5所述的多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，

它含有权利要求6所述的载体；或

它的基因组中整合有权利要求5所述的多核苷酸。

8.权利要求1所述的重组蛋白的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗糖尿病的组合物。

9.一种组合物，其特征在于，所述的组合物含有有效量的权利要求1所述的重组蛋白，以及药学上可接受的载体。

10.一种生产权利要求1所述的重组蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)在适合表达权利要求1所述重组蛋白的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞，获得培养物，和

(2)从培养物中分离出权利要求1所述的重组蛋白。

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