CN1143895C

CN1143895C - 用基因工程方法生产增强其生物活性的红细胞生长因子二联体/三联体融合蛋白

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Publication number: CN1143895C
Application number: CNB011042656A
Authority: CN
Inventors: 李洪兴
Original assignee: 李欣越
Priority date: 2001-02-27
Filing date: 2001-02-27
Publication date: 2004-03-31
Anticipated expiration: 2021-02-27
Also published as: CN1305003A

Abstract

本发明涉及一种用基因工程方法生产增强其生物活性的红细胞生长因子二联体/三联体融合蛋白。该方法把两个/三个相同的能表达红细胞生长因子的基因通过一段/两段多肽连接起来，并接入哺乳动物细胞表达质粒，将其转入哺乳动物细胞后得到了表达。融合蛋白不仅具有红细胞生长因子的生理活性，而且延长了蛋白在生物体内的储留时间，进而增强其生物功效，延长体内半衰期，减少用药次数，极大地提高了红细胞刺激因子的临床实用价值。

Description

用基因工程方法生产增强其生物活性的红细胞生长因子二联体/三联体融合蛋白

本发明涉及一种用基因工程方法制备红细胞生长因子，特别是涉及用基因工程方法生产增强其生物活性的红细胞生长因子二联体/三联体融合蛋白。

红细胞生长因子是红细胞生长分化的重要刺激因子，其功能为调节和促进幼稚红细胞的生长分化，对晚期BFU-E(Burst Forming Units-Erythrocytes)及CFU-E(Colony Forming Units-Erythrocytes)有促进分化作用，并使其合成的血红蛋白变成成熟红细胞。它也能促进网质红细胞的提前释放，并能刺激骨髓巨核细胞。

临床已广泛使用红细胞生长因子治疗肾脏疾病引起的贫血，肿瘤病人化疗后引起的贫血，以及外伤引起的大出血，即可以刺激患者自身的造血功能，弥补各种原因造成的红细胞减少。因红细胞生长因子只是造血因子的一种，另有其它造血因子能刺激血细胞的生长发育(如粒细胞和淋巴细胞等)，因此，世界上已有几种构建复合性刺激因子的例子，如IL3-EPO，EPO-IL3，IL3-GCSF(WO 92/06116，专利)。实验证明，IL3-EPO和EPO-IL3具有刺激BFU-E和CFU-E的作用。复合因子的构建是根据其自身功能，同时又具有双重协同作用。最新一例证明是生产红细胞生长因子/粒细胞集落因子(EPO/GM-CSF)(Antonio M et a1，US Patent5916773)。

根据红细胞生长因子的生长和代谢过程，其二联体及三联体(二联体以下简称EPO-EPO，三联体以下简称EPO-EPO-EPO)也能够促进其生物活性。红细胞生长因子产生于肾脏，作用于骨髓，然而它的分子量较低，由肾脏产生进入血液循环后，可很快由肾脏经尿液排出，而且尿液排出后的红细胞生长因子经提纯仍具有生物活性。尽管利用生物工程技术生产的红细胞生长因子已广泛应用，但仍有同样问题。针对其应用与不足，为提高红细胞生长因子的半衰期，增长其在血液中的停留时间以发挥更长功效，研究人员进行了各方面的实验，如用多聚乙二醇连接蛋白，用化学方法将蛋白连接成二聚及多聚体等，其结果均为增大分子量，增长其体内循环时间。在以前的研究中，有的获得成功，有的没有成功。在这里我们利用基因工程的方法制造出二/三联体的蛋白，经过初步实验证明，其合成药物具有和天然单体一样的生物功效，而且延长了蛋白的生物活性，进而减少了用药次数。

本发明的目的在于：克服已有的用化学方法将蛋白连接成二聚及多聚体，其结果均为大分子量的混合物，且活性低的缺点，为了提高红细胞生长因子的半衰期，增长其在血液中的停留时间以发挥更长功效，而且延长了蛋白的生物活性，进而减少了用药次数；从而提供一种用基因工程方法生产增强其生物活性的红细胞生长因子二联体/三联体融合蛋白。

本发明的目的是这样实现的：本发明提供的一种用基因工程方法生产增强其生物活性的红细胞生长因子二联体/三联体融合蛋白，包括在两单体中间有一段连接片段，或在其三单体中间有两段连接片段；所述的融合蛋白具有红细胞生长因子的蛋白自然顺序，并具有其生物活性，EPO-EPO融合蛋白的生物活性为135,000IU/mg；EPO-EPO-EPO的生物活性为150,000IU/mg；具有延长生物半衰期和高于原蛋白的生物功效，二联体融合蛋白具有如图5所示的序列，三联体融合蛋白具有如图6所示的序列。

所述的融合蛋白其结构如下：包括每一红细胞生长因子的头与另一红细胞生长因子的尾连接，即红细胞生长因子的C端——红细胞生长因子的N端连接；

所述的连接片段是连接肽，其连接肽顺序的一级结构(如图5所示的一种序列)，即连接二联体/三联体的蛋白顺序，是10-20个氨基酸连接顺序，具有这些连接顺序的氨基酸都可以是连接肽，图5所示的一种序列是最佳的。

其中在两单体中间有一段连接片段为二联体融合蛋白：其结构如下：

红细胞生长因子——连接片段——红细胞生长因子

EPO————————Linker——————EPO

其中在两单体中间有两段连接片段为三联体融合蛋白：其结构如下：

红细胞生长因子——连接片段——红细胞生长因子——连接片段——红细胞生长因子

EPO—————Linker—————EPO————Linker————EPO

其中二联体/三联体红细胞生长因子的质粒构建，在构建中使用合成的引物寡聚脱氧核苷酸P1，P2，P3，P4，P5，P6，它们的核苷酸序列是：

P1：5’TGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’

P2：5’TCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGG 3’

P3：5’AAGCTAGGATCCATGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’

P4：5’AGCTAGAATCCACCCGCGGATCCACCTCCTGATCCA

CCTCTGTCCCCTGTCCTGCAG 3’

P5：5’AGCTAGAATCCGGATCCGCGGGTGGTGGATCTGGC

GGAGCCCCACCACGCCTCATC 3’

P6：5’AGCTAAAGCTTTCATCTGTCCCCTGTCCTGCAG 3’

本发明提供的一种用基因工程方法生产增强其生物活性的红细胞生长因子二联体/三联体融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1，获得EPO-EPO及EPO-EPO-EPO的融合基因质粒，首先从细胞中提取信使核糖核酸(mRNA)，利用逆转录酶-DNA聚合酶链反应(RT-PCR)方法制备单链和双链互补脱氧核糖核酸(cDNA)，经过分离纯化，将EPO cDNA克隆到载体上，以此为基础进行融合蛋白的构建(重组质粒的构建如图1所示的)；

2，利用聚合酶链反应(PCR)对EPO cDNA进行了亚克隆和末端改造，然后在末端改造的两/叁个蛋白之间增加了一/两小段连接片段(连接肽Linker，L见图2A，2B，2C)；

3，通过限制性内切酶，构建成了能够表达如图3所示的EPO-EPO及如图4所示的EPO-EPO-EPO的融合蛋白质粒，并将其质粒转化进入细胞株如CHO或COS细胞株。转化后的细胞能分泌EPO-EPO及EPO-EPO-EPO融合蛋白。以下详细描述制备方法：所使用的材料包括：

一.细胞株：包括CHO细胞株，COS细胞株。

菌株：包括菌株DH5α，菌株HB101，

质粒：包括TopoTA连接质粒(3.9Kb，Amp^r)，pBR322，pUC18。

真核细胞表达质粒：包括pBS1(4.6Kb，DHFR^r)，pMCM(5.6Kb，Ampr)。

二.酶类：DNA聚合酶(Clonetech)；限制性内切酶(Promega，Biolab)；T4 DNA连接酶(Life Technologies)；mRNA纯化Kit(Invitrogen)；cDNA合成Kit(Strategen)。

三.主要生化试剂和材料：EPO标准品(Amgen)；dNTP(Perkin Elmer)；琼脂糖(BRL)；氨卞青霉素(Sigma)；蛋白分子量标准(Bio-Rad)；DNA分子量标准(Life Technologies)；EPO ELISA Kit(R&D)。以上所需的材

料均是市场上可以买到的。

四.质粒的制备：

1.质粒筛选

将含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期(OD600约0.6)，将含有相应抗生素的LB培养液(预温到37℃)放入烧瓶内，加入对数晚期培养物，于37℃剧烈振摇培养25小时，所得培养物的OD600值约0.4，于4℃以4000转/分离心15分钟，弃上清；将细菌沉淀重悬于用冰预冷的STE溶液中(STE溶液：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl，pH8.0，1mmol/L EDTA，pH8.0)，离心收集细菌细胞。将收集细菌的细胞重悬于用冰预冷的含10％蔗糖，50mmol/L Tris·Cl，pH8.0的溶液中，加溶菌酶溶液，混匀，在冰上放10分钟，加10％十二烷基硫酸钠(SDS)，混匀，立刻加5mol/L NaCl(终浓度为1mol/L)混匀，在冰上放1小时，离心，将上清用酚：氯仿和氯仿各提一次，将水相于室温加入2倍体积乙醇混匀，于室温放1-2小时，离心，回收质粒。

2.DNA片段的放大

用PCR方法将EPOcDNA(以及其它DNA片段)放大，放置PCR仪中进行扩增：94℃，45秒，55℃，45秒，72℃，1-2分钟，循环35次后，72℃，7-10分钟。(详见实施例)。

3，DNA片段的连接

用相同限制性内切酶切质粒和EPOcDNA(以及其它DNA片段)，37℃，30-60分钟，经琼脂糖电泳纯化后，用T4 DNA连接酶连接，形成重组质粒的构造。(详见实施例)。

4限制性内切酶分析

用限制性内切酶切重组质粒，经琼脂糖电泳纯化后，得到EPOcDNA(以及其它DNA片段)，由此证明连接的正确性。

5，DNA序列分析

用Sanger双脱氧链终止法，将dNTP，DNA模板，Klenow，等量加在4个管中，55℃，30分钟，分别加入ddA，ddG，ddT，ddC，保存于室温15-20分钟，按常规方法处理，用聚丙烯酰胺凝胶电泳测序。

6，SDS-PAGE电泳等常规方法均参照下述文献(Sambrook J et al，ALaboratory Methods-Molecular Cloning，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York，2^nd Edition，1989；Current Protocol of Molecular Biology，John Wiley & Sons)进行电泳检测。

五、细胞培养：从液氮中取出冷冻细胞，置37℃水浴中迅速融化，将细胞悬液移入离心管内，加入培养基，离心10分钟，用含10％小牛血清(LifeTechnologies)的α-MEM(α-Dullbecco’s Modified Eagle Medium，LifeTechnologies)培养基重悬细胞，然后移入培养瓶内，接种量为3×10⁴cells/cm²，将细胞置于CO₂培养箱内，37℃，5％CO₂，活细胞比例＞85％(48-72小时)。

六、样品蛋白含量测定：

1，染色液的配制：100mg考马斯亮兰G-250溶于50ml 95％乙醇中，然后与100ml 85％(w/v)磷酸混合，用水稀释至1000ml；

2，测定方法：若蛋白量为＞0.2mg/ml，取0.1ml样品与5ml染色液均匀混合，静置10-30分钟后测定A600nm；若蛋白量为5-100μg/ml，取0.8ml样品与0.2ml染色液均匀混合后进行测定；

以BSA测得曲线为标准曲线。

本发明的优点在于：本发明为一种利用基因工程技术生产红细胞生长因子(简称EPO)二联体/三联体融合蛋白的亚克隆和末端改造及用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)方法，把两个/三个相同的能表达红细胞生长因子的基因通过一段/两段多肽连接起来，并接入哺乳动物细胞表达质粒，将其转入哺乳动物细胞后得到了表达。融合蛋白不仅具有红细胞生长因子的生理活性，而且延长了蛋白在生物体内的储留时间，进而增强其生物功效。该方法简单，并且得到的二联体/三联体融合蛋白具有天然的红细胞生长因子的生物活性，而且，EPO-EPO具有生物活性为135,000IU/mg，三联体EPO-EPO-EPO具有生物活性为150,000IU/mg；本发明的EPO-EPO/EPO-EPO-EPO通过增强生物效应，延长体内半衰期，减少用药次数，极大地提高了红细胞刺激因子的临床实用价值。

下面结合附图和实施例详细说明本发明

图1是EPO cDNA的合成及重组质粒的构建

图2A，2B，2C是中间连接片段的设计，构造以及通过PCR方法修饰和构建的EPO质粒。cDNA序列的两端都得到了修饰，即末端改造。

图3是构建pTrm-EPO-Linker-EPO质粒的流程图

图4是pMNAD EPO-Linker-EPO-Linker-EPO质粒的构建流程图

图5是Linkers氨基酸序列图例

图6A是二联体融合蛋白的序列，和图6B是三联体融合蛋白的序列

图7A是构建后二联体融合蛋白的示意图，和图7B是三联体融合蛋白的示意图

图8是融合蛋白的纯化图(SDS-PAGE)

实施例1本实施例中所用的连接片段是连接肽，其连接肽顺序的一级结构，即连接二联体/三联体的蛋白顺序，是10-20个氨基酸连接顺序，具有这些连接顺序的氨基酸都可以用，图5所示的一种序列是最佳的。

引物寡聚脱氧核糖核酸的设计与制备：

P1：5’TGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’

P1是从EPO基因起始因子开始，包括信号肽链。

P2：5’TCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGG 3’

P2是互补于3’末端的寡聚脱氧核糖核酸，与P1一起，通过PCR，放大并克隆全长(蛋白编码)EPO cDNA。以后的亚克隆及二联/三联体的构建均用该质粒为基础。

P3：5’AAGCTAGGATCCATGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’

P3的后部分与EPO的起始密码之后的脱氧核糖核酸序列一致。在起始密码之前，我们加了一个BamH I位点。

P4：5’AGCTAGAATCCACCCGCGGATCCACCTCCTGATCCAC

CTCTGTCCCCTGTCCTGCAG 3’

P4是与EPO cDNA终止密码之前的序列互补(不包括终止密码)，并额外加了一段连接肽的核苷酸序列，其中含有一个Sac II位点。在Sac II位点之后又加了一个EcoR I位点。P4与P3一起，通过PCR方法，将EPO基因的3’末端的终止密码去掉，并加上一段连接片段(Linker)。

P5：5’AGCTAGAATCCGGATCCGCGGGTGGTGGATCTGGCGGA

GCCCCACCACGCCTCATC 3’

P5是与EPO成熟蛋白的5’脱氧核糖核酸的起始序列一致(在信号肽下游不包括信号肽)，在上游加了一段连接肽的核苷酸序列，其中包括了Sac II位点，同时在Sac II位点前插入了一个EcoR I位点。P4和P5一起，通过PCR方法，将EPO基因的起始因子和终止因子去掉，并将EPO基因两端各加上一段连接片段(Linker)。

P6：5’AGCTAAAGCTTTCATCTGTCCCCTGTCCTGCAG 3’

P6与EPO cDNA的末端互补(包括终止密码)，并带有一个Hind III

位点。P5和P6一起，通过PCR方法，将EPO基因的5’末端的起始因子去掉，并加上一段连接片段(Linker)。

实施例2 EPO，EPO-EPO和EPO-EPO-EPO融合基因全长核苷酸序列的测定：

为了获得EPO基因，EPO-EPO以及EPO-EPO-EPO融合基因，对cDNA及改造后序列进行了亚克隆和末端改造，并利用常规方法对每一cDNA及改造后的融合基因进行了核苷酸序列测定(详见实施例1，图2，图3，图4)。

实施例3 EPO cDNA的制备：

用1μg mRNA为起始物，将mRNA溶于20μl去离子的水中，加热65℃，10-20分钟，置于冰浴中备用；然后加入cDNA合成缓冲混合液和AMV逆转录酶，其中含有1μg mRNA，50mM Tris·HCl(pH 8.3)，40mM KCl，6mM MgCl2，4mM DTT，0.5mM dNTP，0.1mMpoly(dT)12-18，0.1mg/ml BSA。在37℃反应一小时。从上面的反应液中，取5μl，放入DNA聚合酶链反应(PCR)的试管中，依次加入100pmolP1和P2的上下游引物，(见实施例1)，5μl PCR缓冲液(10X)，2.5mmol/L的dNTP和5单位的DNA聚合酶(Taq DNAPolymerase)，最终体积为50μl；放置PCR仪中进行扩增：94℃，45秒，55℃，45秒，72℃，1-2分钟，循环35次后，72℃，7-10分钟；反应完成后立刻取出，放置冰浴中待用。

实施例4 EPO重组质粒的构建：

按照图1，PCR反应完成后，从试管中取5μl反应液，加入另一试管中，其中含有Topo载体以及T4 DNA连接酶，形成EPO的基本构造，成为以后基因改造的基础。本发明对所有质粒均进行了限制性内切酶的分析以保证序列的正确性。

实施例5 EPO-EPO重组质粒的构建：

参考图3，经过改建和亚克隆后形成EPO-EPO重组质粒。经过对其最后表达质粒的限制性内酶的分析和序列测定后，证明其结构与所设计的结构一致。

实施例6 EPO-EPO-EPO重组质粒的构建：

参考图4，经过改建和亚克隆后形成EPO-EPO重组质粒。经过对其最后表达质粒的限制性内酶的分析和序列测定后，证明其结构与所设计的结构一致。

实施例7 EPO-EPO及EPO-EPO-EPO融合基因在真核细胞中的高效表达：

用于表达EPO-EPO和EPO-EPO-EPO融合蛋白真核细胞株为CHO-dhfr-(CHO，DUKXB1)(Urlaub G，et al，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.77，1216)。利用Lipofectin(Life Technologies)将EPO-EPO和EPO-EPO-EPO融合基因进行转化；转化克隆生长于含有氨甲蝶蛉(Methotrexate，Sigma)的细胞培养液中，其中含有α-MEM+10％小牛血清，在含5％CO₂培养箱中，37℃培养；逐渐增加氨甲蝶蛉浓度以选择出高效表达细胞株。本发明用EPO ELISA Kit(R&D)对融合蛋白的活性进行了测定。

实施例8 EPO-EPO及EPO-EPO-EPO融合蛋白的分离纯化：

经克隆后的细胞株，在无血清细胞培养液中培养(CHO-S-SFM II，LifeTechnologies)，待细胞长到80％充满时(约48-72小时)，收集细胞培养液，将其浓缩，然后进行透析(20mM Tris·HCl，pH6.050mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT)，4℃，24小时。将透析后的溶液上样于已平衡后的DEAE Sepharose柱(柱为5×20cm；用20mMTris·HCl，pH6.0，50mM NaCl缓冲液平衡5-10倍柱体积)。用梯度洗脱方法(0.05-1M NaCl)洗脱融合蛋白。分管收集各洗脱峰，经活性测定后，收集有活性部分，将其浓缩后，用HPLC分离纯化，得到纯化的融合蛋白。

实施例9 EPO，EPO-EPO和EPO-EPO-EPO融合蛋白生物活性的测定：

1.用R&D EPO免疫试剂盒为工具，其中的标准品为标准，进行体外活性测量。对每一个样品用统一的稀释液稀释。稀释液含有细胞培养液α-MEM，5％小牛血清，1％的β-Mercaptoethanol，和抗菌素(青霉素，链霉素及Fungizone)(其结果见表1)。

2.表2中所示的体内活性测量由8-10周的小鼠被麻醉后，从眼眶抽血，测其血沉计数，然后按照小鼠体重，根据表1中所测表达蛋白的活性，以300IU/Kg体重给予一次皮下注射。每三只小鼠为一组，共四组(单体、二联体、三联体、对照组)，在第九天麻醉小鼠，重新从眼眶抽血，测其血沉，其结果如表2所示。

表1 体外活性测量

表达质粒比活(IU/Pmole)

单体 5.0-6.3

二联体融合蛋白 9.8-12.3

三联体融合蛋白 16.5-20.4

EPO分子量按36Kd-45Kd计算

表2 体内活性测量^*

μ表达蛋白注射前注射后

单体 48 49

二联体融合蛋白 47.5 50

三联体融合蛋白 48 52

对照(磷酸缓冲液) 46 45.5

^*根据表1中结果

Claims

1、一种用基因工程方法生产的增强其生物活性的二联体/三联体融合蛋白，其特征在于：该结构包括在两个红细胞生长因子单体中间有一段连接片段为二联体融合蛋白，或在其三个红细胞生长因子单体中间有两段连接片段为三联体融合蛋白；并具有红细胞生长因子的蛋白自然顺序，其二联体融合蛋白的生物活性为135,000IU/mg；三联体融合蛋白的生物活性为150,000IU/mg；二联体融合蛋白具有如下所示的序列：

EPO-L-EPO

MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAK

EAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQ

GLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRL

GAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGA

CRTGDRGGSGGGSAAGGSGGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITT

GCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSE

AVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEA

ISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR

三联体融合蛋白具有如下所示的序列：

EPO-L-EPO-L-EPO

MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAK

EAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQ

GLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRA

LGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGE

ACRTGDRGGSGGGSAAGGSGGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENIT

TGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLS

EAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKE

AISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGD

RGGSGGGSAAGGSGGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEH

CSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRG

QALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDA

ASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR

2、按权利要求1中所述的一种用基因工程方法生产的增强其生物活性的二联体/三联体融合蛋白，其特征在于：所述的连接片段为如下序列：

Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly

3、按权利要求1中所述的一种用基因工程方法生产的增强其生物活性的二联体/三联体融合蛋白，其特征在于：在表达所述的二联体/三联体融合蛋白的质粒构建中，使用设计合成的引物寡聚脱氧核苷酸P1，P2，P3，P4，P5，P6，它们的核苷酸序列是：

P1：5’TGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’

P2：5’TCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGG 3’

P3：5’AAGCTAGGATCCATGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’

P4：5’AGCTAGAATCCACCCGCGGATCCACCTCCTGATCCA

CCTCTGTCCCCTGTCCTGCAG 3’

P5：5’AGCTAGAATCCGGATCCGCGGGTGGTGGATCTGGC

GGAGCCCCACCACGCCTCATC 3’

P6：5’AGCTAAAGCTTTCATCTGTCCCCTGTCCTGCAG 3’

4、一种权利要求1所述的用基因工程方法生产的增强其生物活性二联体/三联体融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1)获得EPO-EPO及EPO-EPO-EPO的融合基因质粒，首先从细胞中提取信使核糖核酸mRNA，利用逆转录酶-DNA聚合酶链反应RT-PCR方法制备单链和双链互补脱氧核糖核酸cDNA，经过分离纯化，将EPO cDNA克隆到载体上，以此为基础进行融合基因的构建；

(2)利用聚合酶链反应PCR，对EPO cDNA进行了亚克隆和末端改造，使得在EPO单体蛋白之间增加了一小段连接片段；

(3)通过限制性内切酶，构建成了能够表达EPO-EPO及EPO-EPO-EPO融合蛋白的质粒，并将其质粒转化进入CHO或COS细胞株，转化后的细胞株能分泌EPO-EPO及EPO-EPO-EPO融合蛋白。