JP4326470B2 - 糖鎖化ヒト顆粒球コロニー刺激因子同種体 - Google Patents
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Description
精製されたG-CSFは、骨髄細胞から好中球性顆粒球(neutrophilic granulocyte)コロニーの生成を促進し、最終段階への分化を誘導し(Nicola et al., JBC, Vol. 258, No. 14:9017-23, 1983)、白血球細胞株が自ら複製増殖することを抑える(Metcalf and Nicola, Leukemia Research, Vol. 9, 1:35-50, 1985)糖蛋白質であって、単核細胞 (mononuclear cell)、繊維芽細胞(fibroblast)および内皮細胞(endothelial cell)で生成される。また、ヒトの腫瘍細胞株であるCHU-2細胞(Nomura et al., EMBO J., Vol. 5, No. 5:871-76, 1986)と、膀胱癌細胞5637(Welte et al., Proc. Narl. Acad. Sci. U.S.A., 82:1526-30, 1985; Strife et al., Blood, Vol. 69, No. 5:1508-1523, 1987)の培養で好中球性顆粒球コロニー刺激活性を有する物質が存在することを確認し、これから精製されたG-CSFは分子量18,000〜19,000ダルトンであり、等電点 6.1(糖鎖化の度合いによってpI値が5.5〜6.1)であることが明らかになっている(Nomura et al., EMBO J., Vol.5, No. 5:871-76, 1986)。
初期の研究結果より、分離した物質は好中球だけでなく赤血球、巨核球、大食細胞を生成(Welte et al., Proc. Narl. Acad. Sci. U.S.A., 82:1526-30, 1985; Platzer et al., J. Exp Med, 162:1788-1801, 1985; Nicola et al., Nature, 314:625-28, 1985)させ、この物質がヒトの白血病細胞株HL-60とマウスの白血病細胞株WEHI-3B(D+) 細胞の増殖を誘導するなど多能性原始細胞に効果を及ぼすことにより、多能性コロニー刺激因子またはGM-CSFと呼ばれてきたが、骨髄細胞とリンパ細胞を排除した後には、好中球性顆粒球細胞の形成を強く刺激することにより、ヒトの膀胱癌細胞5637から分離した物質がG-CSFであることを確認した(Welte et al., Proc. Narl. Acad. Sci. U.S.A., 82:1526-30, 1985; Metcalf, Science, 229:16-22, 1985; Metcalf, Blood, Vol. 67, No. 2:257-67, 1986; Metcalf, Proc. R. Soc. Lond. B., 230:389-423, 1987; Sachs, Science, 238:1374-79, 1987)。この物質は接着性細胞とT-リンパ球細胞が除去されたヒトの骨髄細胞から分離した混合コロニー前駆体から7日後に好中球性コロニーを形成させる(Welte et al., Proc. Narl. Acad. Sci. U.S.A., 82:1526-30, 1985; Platzer et al., J., Exp. Med., 162:1788-1801, 1985)。その上、この物質はWEHI-3B(D+)細胞の分化を促進させる。
G-CSFの効果は、動物に投与されたG-CSFの量によって調節され、G-CSFの投与を中断すると、血液内の好中球数は正常的な数を維持する。ところが、受容体を持っていない赤血球または単球性細胞およびリンパ細胞には変化がない。
生理活性蛋白質の体内安定性を増大させるために、重合体として国際出願公開WO 9848840号でポリエチレングリコールと接合させたインターフェロンアルファを製造し、あるいは米国特許公報第6,339,103号でヒト成長ホルモンをマイクロカプセル化して医薬品として開発した例がある。ところが、これらの方法は1次に蛋白質を微生物から生産および精製した後、付加反応を行わなければならないという煩わしさを伴う。また、所望しない位置で交差連結(cross-linking)が起こる可能性があり、最終生産物の同質性(homogeneity)に問題点があるおそれがある。
-T1-P10(T1-P-L-G-P-A-S-S-L-P10)、
-Y39-L71(Y39-K-L-C-H-P-E-E-L-V-L-L-G-H-S-L-G-I-P-W-A-P-L-S-S-C-P-S-Q-A-L-Q-L71)、
-L92-L99(L92-E-G-I-S-P-E-L99)、および
-G125-S142(G125-M-A-P-A-L-Q-P-T-Q-G-A-M-P-A-F-A-S142)。
本発明の他の観点によれば、前記特定の部位でAsn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)配列が一つ以上形成され、この部位で糖鎖化が起こるようにアミノ酸変形されたヒト顆粒球コロニー刺激因子同種体をコードする遺伝子を提供する。
本発明の別の観点によれば、前記特定の部位でAsn-X-Ser/Thr(N-X-S/T) 配列が一つ以上形成され、この部位で糖鎖化が起こるようにアミノ酸変形されたヒト顆粒球コロニー刺激因子同種体をコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換または形質感染した宿主細胞を提供する。
本発明の別の観点によれば、前記特定の部位でAsn-X-Ser/Thr(N-X-S/T) 配列が一つ以上形成され、この部位で糖鎖化が起こるようにアミノ酸変形されたヒト顆粒球コロニー刺激因子同種体に付加的な糖鎖化が起こった糖鎖化ヒト顆粒球コロニー刺激因子同種体を提供する。
本発明の別の観点によれば、ヒト顆粒球コロニー刺激因子の蛋白質に糖鎖化部位の生成のためにプライマーとして用いられた合成オリゴデオキシヌクレオチドを提供する。
A:アラニン、B:アスパラギンまたはアスパラギン酸、C:システイン、D:アスパラギン酸、E:グルタミン酸、F:フェニルアラニン、G:グリシン、H:ヒスチジン、I:イソロイシン、L:リジン、L:ロイシン、M:メチオニン、N:アスパラギン、P:プロリン、Q:グルタミン、R:アルギニン、S:セリン、T:トレオニン、V:バリン、W:トリプトファン、Y:チロシン 、Z:グルタミンまたはグルタミン酸。
本願明細書において、糖鎖化部位の生成のために、プライマーは、「(アミノ酸一文字)(アミノ酸位置)(アミノ酸一文字)1または2」で表記されているが、ここで、1は2本鎖鋳型の中でも5’→3’方向に進む1本鎖鋳型に相補的なプライマーであり、2は2本鎖鋳型の中でも3’→5’方向に進む1本鎖鋳型に相補的なプライマーである。
本発明は、蛋白質の体内安定性を増加させるために、Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)配列が少なくとも一つ形成され、この部位で糖鎖化が起こるようにアミノ酸変形されたヒト顆粒球コロニー刺激因子同種体に関するものである。本発明に至り、ヒト顆粒球コロニー刺激因子蛋白質のアミノ酸配列から螺旋状の部位を除いた残り部位のいずれでも、アミノ酸変形により糖鎖化を誘導することができると明らかになった。
-T1-P10(T1-P-L-G-P-A-S-S-L-P10)、
-Y39-L71(Y39-K-L-C-H-P-E-E-L-V-L-L-G-H-S-L-G-I-P-W-A-P-L-S-S-C-P-S-Q-A-L-Q-L71)、
-L92-L99(L92-E-G-I-S-P-E-L99)、および
-G125-S142(G125-M-A-P-A-L-Q-P-T-Q-G-A-M-P-A-F-A-S142)。
より好ましい様態として、本発明は、下記アミノ酸残基位置でAsn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)配列が一つ以上形成され、この部位で糖鎖化が起こるようにアミノ酸変形されたヒト顆粒球コロニー刺激因子同種体を含む。
-Y39-L71(Y39-K-L-C-H-P-E-E-L-V-L-L-G-H-S-L-G-I-P-W-A-P-L-S-S-C-P-S-Q-A-L-Q-L71)、
-L92-L99(L92-E-G-I-S-P-E-L99)、および
-G125-S142(G125-M-A-P-A-L-Q-P-T-Q-G-A-M-P-A-F-A-S142)。
本発明は、まず付加的な糖鎖化部位を持つようにヒト顆粒球コロニー刺激因子をコード するDNA配列上に、N型糖鎖化が起こるように1つ以上のヌクレオチドを変形させた後、そのDNAを、糖鎖化を行う真核細胞に導入して発現させることにより、自然に付加的な糖鎖化が起こるようにする。したがって、本発明に係る付加的な糖鎖化が起こったヒト顆粒球コロニー刺激因子は、Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)配列が増加するようにDNA配列を変形させることにより達成される。
-T1-P10(T1-P-L-G-P-A-S-S-L-P10)、
-Y39-L71(Y39-K-L-C-H-P-E-E-L-V-L-L-G-H-S-L-G-I-P-W-A-P-L-S-S-C-P-S-Q-A-L-Q-L71)、
-L92-L99(L92-E-G-I-S-P-E-L99)、および
-G125-S142(G125-M-A-P-A-L-Q-P-T-Q-G-A-M-P-A-F-A-S142)。
より好ましい様態として、下記アミノ酸残基位置でAsn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)配列が一つ以上形成され、この部位で糖鎖化が起こるようにアミノ酸変形されたヒト顆粒球コロニー刺激因子同種体をコードする遺伝子を含む。
-Y39-L71(Y39-K-L-C-H-P-E-E-L-V-L-L-G-H-S-L-G-I-P-W-A-P-L-S-S-C-P-S-Q-A-L-Q-L71)、
-L92-L99(L92-E-G-I-S-P-E-L99)、および
-G125-S142(G125-M-A-P-A-L-Q-P-T-Q-G-A-M-P-A-F-A-S142)。
本発明の様態において、ヒト顆粒球コロニー刺激因子をコードする遺伝子は、動物細胞発現用ヒト顆粒球コロニー刺激因子の生産菌株によって確保した。通常、遺伝子のクローニングと分離は当業界に公知になっている方法が利用できる。
本発明に係る糖鎖化された同種体は、一般に(a)前記ヒト顆粒球コロニー刺激因子同種体をコードしたDNA配列を、このDNA配列に作動可能に連結されて(operatively linked)その発現を調節する一つまたはそれ以上の発現調節配列(expression control sequence)を含むベクターに挿入させ、(b)これから形成された組み換え発現ベクターで宿主を形質転換または形質感染させ、(c)生成された形質転換または形質感染体をヒト顆粒球コロニー刺激因子同種体DNA配列が発現されるように適切な培地および条件の下に培養して糖鎖化ヒト顆粒球コロニー刺激因子同種体を分離することにより製造する。
勿論、全てのベクターと発現調節配列が本発明のDNA配列の発現に全て同等に機能を発揮するのではないことを理解すべきである。同様に、全ての宿主が同一の発現システムに対して同一に機能を発揮するのではない。ところが、当業者であれば、過度な実験的負担なしに本発明の範囲から外れないままでいろいろのベクター、発現調節配列および宿主の中から適切な選択を行うことができる。例えば、ベクターを選択するに際しては宿主を考慮しなければならないが、これはベクターがその中で複製されなければならないためである。ベクターの複製数、複製数を調節することが可能な能力、および当該ベクターによってコードされた他の蛋白質、例えば抗生剤マーカーの発現も考慮されなければならない。発現調節配列を選定するに際しても、いろいろの因子を考慮しなければならない。例えば、配列の相対的強度、調節可能性および本発明のDNA配列との相溶性など、特に可能性のある二次構造と関連して考慮しなければならない。また、宿主を選定するに際しても、選択されたベクターとの相溶性、ヌクレオチド配列によってコードされた産物の毒性、これらの分泌特性、ポリペプチドを正しくフォールディング(folding)することが可能な能力、発酵または培養必要条件、そしてヌクレオチド配列によってコードされた産物の精製容易性などを考慮しなければならない。
本発明は、前記のような過程によって収得された付加的な糖鎖化が起こった糖鎖化ヒト顆粒球コロニー刺激因子同種体を提供する。本願の明細書において、付加的な糖鎖化が起こった糖鎖化ヒト顆粒球コロニー刺激因子同種体とは、Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)配列が増加するように変形されたヒト顆粒球コロニー刺激因子遺伝子を真核宿主細胞に導入して発現させることにより、自発的に糖鎖化が起こった発現産物であると定義することができる。つまり、ヒト顆粒球コロニー刺激因子同種体の付加的な糖鎖化部位Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)の−NH基に糖残基の共有結合により形成された異型(heterogenous)分子をいう。
適当な担体は、リン酸、クエン酸、およびその他の有機酸などのバッファ、アスコルビン酸(ascorbic acid)を含んだ抗酸化剤、低分子量ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、および免疫グロブリンなどの蛋白質、ポリビニルピロリドン(polyvinylpyrrolidone)などの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含んだ単当類、二糖類、その他の炭水化物、EDTAなどのキレート因子、亜鉛、コバルト、または銅などの金属イオン、マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成カウンタイオン(counterion)、および/またはツイン(Tween)、プルロニック(Pluronic)、またはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤を含む。
治療用糖鎖化ヒト顆粒球コロニー刺激因子同種体組成物は、一般に滅菌接近ポート(sterile access port)を持っている容器、例えば皮下注射針によって貫通できる栓持ちの静脈注射液袋(bag)またはガラス瓶(vial)に保管されるべきである。ヒト顆粒球コロニー刺激因子は、水溶液または凍結乾燥製剤であって、1回分または多数回分容量の容器、例えば密封したガラス瓶またはアンプル(ampoule)に貯蔵される。凍結乾燥製剤の場合、10mlのガラス瓶を5mlの滅菌濾過された1%(w/v)ヒト顆粒球コロニー刺激因子水溶液で充填し、その結果混合物を凍結乾燥させる。注入液は、注射用静菌数(bacteriostatic Water-for-Injection)を用いて、凍結乾燥したヒト顆粒球コロニー刺激因子を溶解(reconsruction)させて製造することができる。
ヒト顆粒球コロニー刺激因子遺伝子の確保
ヒト顆粒球コロニー刺激因子遺伝子は、本出願人保有の動物細胞発現用ヒト顆粒球コロニー刺激因子生産菌株を使用した。ヒト顆粒球コロニー刺激因子遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列は図1に示している。
ヒト顆粒球コロニー刺激因子遺伝子における変形部位の選定
ヒト顆粒球コロニー刺激因子の付加的な糖鎖化部位の選定のために、Boone(J. Biol. Chem., vol.5, 8770, (1992))の構造分析結果を活用した。選定部位の決定に際し、1次にヒト顆粒球コロニー刺激因子蛋白質のアミノ酸配列において螺旋状の部位は除いた(図1)。1次に螺旋状の部位が除かれた配列から、3次元構造で天然型ヒト顆粒球コロニー刺激因子の133番位置のトレオニン残基にO型糖鎖化が存在することを考慮し、2次選定部位を決定した。2次に選定された部位からN型糖鎖化のモーティブへの変換が容易な部位を最終選定した。
ヒト顆粒球コロニー刺激因子同種体の製作
付加的な糖鎖化部位を有するように少なくとも一つのアミノ酸が変形されたヒト顆粒球コロニー刺激因子をコードする遺伝子は、合成オリゴデオキシヌクレオチドをプライマーとして用いてPCRを行えば製作することができた。ここに使用された合成オリゴデオキシヌクレオチドは表1に示した。
図2に示すように、付加的な糖鎖結合部位の添加のために変形を試みた部位は、G51番とG94およびT133とG135であって、51番目のアミノ酸であるグリシンをアスパラギンに変形させ、94番目のアミノ酸であるグリシンをアスパラギンに変形させ、133番目と135番目のアミノ酸であるトレオニンとグリシンをそれぞれアスパラギンとセリンに変形させ、この実験を行うために使用された合成オリゴデオキシヌクレオチドの種類を示した。矢印の方法はそれぞれのオリゴデオキシヌクレオチドの5’→3’方向を意味する。
実施例1で確保されたヒト顆粒球コロニー刺激因子遺伝子をCSF5とG51N2、G51N1とCSF3合成オリゴデオキシヌクレオチドを用いてそれぞれPCRで増幅させてDNA断片を製作した。製作されたそれぞれのDNA断片を精製した後、0.2M NaOH/2mM EDTAで変性(denaturation)させ、その後これらを鋳型としてCSF5、CSF3のプライマー対を用いてさらにPCRを行って51番目のアミノ酸がグリシンからアスパラギンに取り替えられた遺伝子を製作した。結果として、図3に示すように、51番目のアミノ酸位置がグリシンの代わりにアスパラギンに該当するコドンに変形された二つのDNA断片を得ることができた。こうして得た2種のDNA断片を挿入し、CSF5、CSF3をプライマー対として2回目のPCRを行うと、51番目のアミノ酸がアスパラギンに変形されて付加的な糖鎖化が可能なG-CSF-G51Nの変形遺伝子を得ることができた。
実施例1で確保されたヒト顆粒球コロニー刺激因子遺伝子をCSF5とG94N2、G94N1とCSF3合成オリゴデオキシヌクレオチドを用いてそれぞれPCRで増幅させてDNA断片を製作した。製作されたそれぞれのDNA断片を精製した後、0.2M NaOH/2mM EDTAで変性(denaturation)させ、その後これらを鋳型としてCSF5、CSF3のプライマー対を用いてさらにPCRを行って94番目のアミノ酸がグリシンからアスパラギンに取り替えられた遺伝子を製作した。結果として、図4に示すように、94番目のアミノ酸位置がグリシンの代わりにアスパラギンに該当するコドンに変形された二つのDNA断片を得ることができた。こうして得た2種のDNA断片を挿入し、CSF5、CSF3をプライマー対として2回目のPCRを行うと、94番目のアミノ酸がアスパラギンに変形されて付加的な糖鎖化が可能なG-CSF-G94Nの変形遺伝子を得ることができた。
G94N変形ヒト顆粒球コロニー刺激因子同種体を用いてG51N変形ヒト顆粒球コロニー刺激因子同種体を製作する方法と同様に行った。図5ではまず図4のような方法で94番目の位置を変形させた後、これを鋳型として図3のような方法で51番目の位置を変形させた。結果として、2部位が同時に変形されたヒト顆粒球コロニー刺激因子遺伝子を得ることができた。
G51N変形ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製作方法と同様の方法で、ヒト顆粒球コロニー刺激因子遺伝子をCSF5とT133NG135S:2、T133NG135S:1とCSF3合成オリゴデオキシヌクレオチドを用いてそれぞれ重合酵素連鎖反応で増幅させてDNA断片を製作した。
製作されたそれぞれのDNA断片を精製した後、0.2M NaOH/2mM EDTAで変性(denaturation)させ、その後これらを鋳型としてCSF5、CSF3のプライマー対を用いてさらに重合酵素連鎖反応を行って133番目と135番目のアミノ酸がそれぞれトレオニンとグリシンからアスパラギンとセリンに変形されてO型の糖鎖結合部位をN型の糖鎖が結合できるように変形された遺伝子を製作した。
T133NG135S変形ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体を用いてG51N変形ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体を製作する方法と同様に行った。
CHO細胞への形質転換および発現
60mm細胞培養皿でCHO細胞(DG44)を培養して40-80%のコンフルアント(confluent)がなるように、すなわち1-4 X 105細胞/60mm皿を準備した。BM社のスーパーフェクチン試薬(Superfectin reagent)3μlと細胞培養培地(α-MEM培地、無血清、無抗生剤)97μlをよく混合し、準備されたヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体発現ベクターDNA(0.1μg/μl以上、約2μg)とDHFR含有ベクターpLTRdhfr26(ATCC37295、約0.2μg)を添加して室温で5〜10分間反応させた後、準備された前記細胞に添加した。一日経過後、ハイグロマイシン200μg/mlを含んだ培地に交換(α-MEM without media, 10% FBS)して約7〜10日間培養した。ハイグロマイシンが200μg/mlとなるように添加された培地でヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の導入された細胞株を選別し、選別されたそれぞれの細胞株を培養してQuantikine human G-CSF免疫分析法(Catalog No. DCS50, R&D systems)でヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の発現を確認した。
ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の精製
CHO細胞で発現されたヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の精製は、培養液をMilipore社のCentriprep(Mw Cut 10,000)を用いて濃縮した後、Invitrogene社のProBond Purification Systemを用いて金属親和性クロマトグラフィ(Metal Affinity Chromatography)で精製した。
ラットにおける薬物動力学の実験
製造された候補物質の実際生体内における半減期が長くなったか否かを確認するために、薬物動力学的実験をSprague-Dawleyラットを対象として実施した。静脈を通じてヒト顆粒球コロニー刺激因子およびその誘導体を100μg/kg体重の投与量で投与し、各群は4匹ずつ実施した。経時的な血中濃度を確認するために、30分間隔で採血した後、Quantikine human G-CSF免疫分析キット(R&D system)を用いてヒト顆粒球コロニー刺激因子およびその誘導体の血中濃度を測定した。その結果が図9に示されている。薬物動力学的テストで幾つかの誘導体は変形されていないヒト顆粒球コロニー刺激因子より体内持続性が増加することを示した。
Claims (4)
- 下記アミノ酸配列を含むアミノ酸配列において、51番目のグリシンをアスパラギンに変形させ、または133番目および135番目のトレオニンとグリシンをそれぞれアスパラギンとセリンに変形させ、またはこれらを全て変形させ、かつ顆粒球コロニー刺激因子活性を保持する、ヒト顆粒球コロニー刺激因子同種体:
-T1-P10(T1-P-L-G-P-A-S-S-L-P10)、
-Y39-L71(Y39-K-L-C-H-P-E-E-L-V-L-L-G-H-S-L-G-I-P-W-A-P-L-S-S-C-P-S-Q-A-L-Q-L71)、
-L92-L99(L92-E-G-I-S-P-E-L99)、および
-G125-S142(G125-M-A-P-A-L-Q-P-T-Q-G-A-M-P-A-F-A-S142)。 - 請求項1記載のヒト顆粒球コロニー刺激因子同種体をコードする遺伝子。
- 請求項2記載のヒト顆粒球コロニー刺激因子同種体をコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換または形質感染された真核宿主細胞を培養し、その培養物または細胞溶解物(cell lysates)から糖鎖化ヒト顆粒球コロニー刺激因子同種体を分離する過程を含んで糖鎖化ヒト顆粒球コロニー刺激因子同種体を製造する方法。
- 請求項1記載のヒト顆粒球コロニー刺激因子同種体に付加的な糖鎖化が起こった糖鎖化ヒト顆粒球コロニー刺激因子同種体と薬剤学的に許容される担体とを含む薬剤学的組成物。
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