KR100657749B1 - 인간 과립구 콜로니 형성인자 동종체 및 그 조성물 - Google Patents

인간 과립구 콜로니 형성인자 동종체 및 그 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 특정 부위의 아미노산 서열을 변형함으로써 생체내 지속성을 갖는, 아미노산 서열이 변형된 인간 과립구 콜로니 형성인자 동종체, 특히, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 인간 과립구 콜로니 형성 인자에 있어서, Lys40, His43, Glu45, Glu46, Val48, Leu49 및 Phe144 중 어느 한 부위의 아미노산이 변형된 인간 과립구 콜로니 형성 인자 동종체, 이를 포함하는 약제학적 조성물, 상기 동종체를 코딩한 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현 벡터, 인간 과립구 콜로니 형성 인자의 아미노산 서열을 변형하기 위해 프라이머로 사용되는 올리고데옥시뉴클레오타이드에 관한 것이다.
hG-CSF, isoform, 인간 과립구 콜로니 형성인자 동종체, 인간 과립구 콜로니 형성인자 수용체, 생체내 안정성

Description

인간 과립구 콜로니 형성인자 동종체 및 그 조성물{Human Granulocyte-Colony Stimulating Factor Isoform and Composition thereof}
도 1은 인간 과립구 콜로니 형성인자 유전자 및 아미노산의 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 인간 과립구 콜로니 형성인자의 아미노산 서열에 있어서, 본 발명에 따른 아미노산 변형위치를 도시한 것이다.
도 3은 발현벡터pCJKM-GCSF isoform 의 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 인간 과립구 콜로니 형성인자 동종체의 형질전환체의 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 정제된 인간 과립구 콜로니 형성인자의 전기영동 결과를 나타내는 것이다.
도 6은 인간 과립구 콜로니 형성인자의 분석 세포주내에서의 영향을 조사한 것이다.
본 발명은 아미노산이 하나이상 변형된 인간 과립구 콜로니 형성인자 동종체에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 단백질의 생체내 안정성을 증가시키기 위해서 인간 과립구 콜로니 형성인자의 그 수용체와 결합하는 부위에 대한 아미노산 서열을 변형시킴으로써, 인간 과립구 콜로니 형성인자 수용체의 면역글로불린 유사 부위와 결합에 관련하거나 그에 인접한 부위 존재하는 아미노산으로 알려진 특정 부위의 아미노산 서열을 다른 아미노산으로 변형시킨 인간 과립구 콜로니 형성인자 동종체를 제작함으로써 생체내 지속성이 증대된 인간 과립구 콜로니 형성인자에 관한 것이다.
니콜라등(J. Biol. Chem., 1983, 258, 9017-9023)은 과립구 콜로니 형성인자(Granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF)는 조혈세포의 증식, 분화 및 활성화에 작용하는 당단백질군으로서, 골수 밖에서 호중구 전구세포의 증식 및 분화를 촉진시켜 백혈구의 70%이상을 차지하는 호중구 방출을 증가시키는 작용을 한다고 보고하였다.
과립구 콜로니 형성인자에 의해 호중구의 수가 정상 수준 이상으로 생성되어 존재하게 되면, 여분의 과립구 콜로니 형성인자는 호중구에 존재하는 과립구 콜로니 형성인자 수용체와 결합하여 제거되는 기작을 가짐으로써, 혈액내의 호중구의 수를 조절한다.
저크먼등(Eeu.J.Haematol., 2002, 69, 265-274)의 보고에 따르면, 생체내에서 생리활성 단백질의 안정성은 단백질 분해효소, 당쇄분해효소에 의해 분해된 당 단백질이 간에서 분해되는, 간세포의 갈락토스 수용체의 결합에 의한 흡수(Hepatocytic galactose receptor-mediated uptake)나 신장에서 사구체 여과를 통한 신장여과(renal filtration), 수용체의 결합에 의한 흡수(receptor-mediated uptake)등에 의해 영향을 받는다. 그러나, 대장균으로부터 생성된 과립구 콜로니 형성인자의 경우에는 당쇄의 결합이 없기 때문에 당쇄분해효소나 간에서의 당단백질 분해는 고려하지 않아도 되는 반면, 신장에서의 여과가 과립구 콜로니 형성인자 제거(clearance)의 중요한 요인이 되고 있다. 또한 혈액 내에서 호중구가 많이 존재하는 상황에서 상대적으로 낮은 농도의 과립구 콜로니 형성인자는 호중구에 의한 수용체-매개 흡수도 인간 과립구 콜로니 형성인자의 생체내 지속성에 중요한 요소로 작용하고 있다.
과립구 콜로니 형성인자와 수용체의 구조는, N-말단에 존재하는 면역글로불린 유사부위(Ig-like domain), 사이토카인 수용체 상동부위(CRH: Cytokine Receptor Homology), 3개의 피브로넥틴 유형 3 부위(Fibronectin type III domain), 세포막 통과 부위(Transmembrane domain), 그리고 C-말단 부위에 존재하는 세포질 내부 부위(Cytoplasmic domain)의 구조로 되어 있음을 푸쿠나가 등(Proc. Naltl. Acad. Sci. U.S.A., 1990, 87, 8702-8706; Cell, 1990, 61, 341-350)이 밝혔다.
면역글로불린 유사부위(Ig-like domain)의 기능은 과립구 콜로니 형성인자가 그의 수용체와 접촉 후, 2:2 또는 그 이상의 과립구 콜로니 형성인자와 수용체간의 중합체를 형성하여, 신호 전달을 촉진시키는 것으로 알려져 있으며, 사이토카인 수 용체 상동부위(CRH: Cytokine Receptor Homology)에는 보존된 시스테인 부위와 WSXWS 서열을 갖고 있으며 과립구 콜로니 형성인자의 신호 전달에 관여하는 것으로 알려져 있다.
라이드할-올슨 등(Biochemistry, 1996, 35, 9034-9041)은 인간 과립구 콜로니 형성인자의 아미노산 서열 중에서 Lys40, Val48, Leu49, Phe144의 아미노산이 인간 과립구 콜로니 형성인자 수용체와 결합에 관여한다고 보고하였으며, 레이톤 등의(J. Biol. Chem., 2001, 276, 36779-36787) 보고에 의하면 Glu46, Leu49, Phe144는 인간 과립구 콜로니 형성인자(hG-CSF) 수용체의 면역글로불린 유사부위(Ig-like domain)와 접촉하지만, Lys40과 Val49는 주변에 위치함으로써 수용체와 접촉 여부는 명확하지 않다고 하였다. 한편, 아리토미 등(Nature, 1999, 401, 713-717)은 인간 과립구 콜로니 형성인자와 그 수용체의 BN-BC 부위(CRH domain)의 복합체의 X-선 구조에서 인간 과립구 콜로니 형성인자 단백질의 Gly4, Pro5, Ala6, Ser7, Ser8, Leu9, Pro10, Gln11, Ser12, Leu15, Lys16, Glu19, Gln20, Leu108, Asp109, Asp112, Thr115, Thr116, Gln119, Glu122, Glu123, 그리고 Leu124가 경계면에 있음을 확인하였으며, 레이톤 등(J. Biol. Chem., 1999, 274, 17445-17451)은, 인간 과립구 콜로니 형성인자의 Glu19는 수용체의 Arg288과 상호작용하여 인간 과립구 콜로니 형성인자의 신호를 전달하는데 기능을 한다고 밝혔다.
사카 등(Nature Biotechnology, 2002, 20, 908-913)은 인간 과립구 콜로니 형성인자의 세포 내부에 있는 엔도솜에서의 수용체와 결합 친화도를 감소시키기 위해 인간 과립구 콜로니 형성인자의 D110 위치와 D113 위치의 아스파르트산 아미노 산을 히스티딘으로 교체하여 인간 과립구 콜로니 형성인자가 엔도솜에서 방출되어 재사용이 가능하여 지속성을 증가시켰다고 보고하였다.
비숍 등(J. Biol. Chem., 2001, 276, 33465-33470)은 Gly26, Gly28, Gly149, Gly150을 알라닌으로 교체하였을 때, 안정성이 증대됨을 보여주었다.
미합중국특허 Nos. 5,214,132; 5,399,345; 5,790,421; 5,581,476; 4,999,291; 4,810,643; 4,833,127; 5,218,092; 5,362,853; 5,830,705; 5,580,755; 5,399,345; 5,416,195; 6,627,186; 6,790,628; 미합중국특허공개 20030171559 등에는 hG-CSF의 활성 또는 체외 지속성(half-life)을 증가시키기 위한 G-CSF의 변이체(variants)가 기재되어 있다. 또한, 미합중국특허 Nos. 6,831,158; 6,790628; 6,646,110; 6,555,660 등에는 하나 이상의 폴리펩티드와 하나 이상의 비-폴리펩티드 부분이 공유결합에 의하여 형성된 G-CSF의 컨쥬게이트(conjugates)가 기재되어 있다.
상기에서와 같이 hG-CSF의 활성이나 생체외 안정성을 증대시키기 위하여 다양한 노력이 있어 왔으나, 생체내 지속성이 증대된 구체적인 연구성과는 아직 없다.
과립구 콜로니 형성인자 유전자는 인간의 방광암세포 5637에서 클로닝 되었다. 이들 cDNA를 이용하여 재조합 인간 G-CSF를 대장균과 동물세포에서 생산하고자 하는 연구가 활발히 진행되어 왔으며, 대장균에서 생산된 과립구 콜로니 형성인자 는 천연형 또는 동물세포로부터 생산된 인간 과립구 콜로니 형성인자와 활성에 있어서는 동등하였다. 그러나, 시판되고 있는 인간 과립구 콜로니 형성인자는 대부분 생체내 안정성이 낮기 때문에 호중구 생성을 자극하는데 요구되는 기저수준의 인간 과립구 콜로니 형성인자를 유지하기 위해서는 과량 및 빈번한 투여를 받아야만 한다. 이로 인해 환자의 고통과 불편함을 초래하고 있어 이를 경감시킬 수 있는 생체내 안정성을 증대시킨 인간 과립구 콜로니 형성인자 제작이 활발히 진행되어왔다.
최근 미국에서 N-말단에 폴리에틸렌글리콜과 인간 과립구 콜로니 형성인자를 연결시킨 의약품이 승인되었다. 그러나 이러한 방법은 1차로 단백질을 미생물로부터 생산 및 정제한 후, 부가반응을 수행하여야 하는 번거로움을 수반하게 되며, 원하지 않는 위치에서 교차연결이 일어날 수 있어 최종 생산물의 동질성에 문제점이 있을 수 있다. 또한 당쇄화를 이용하는 방법이 있으나, 진핵세포에 의해 생산되는 단백질들은 생산과정에서 당쇄의 수식이 쉽게 제거되어 당쇄화 단백질의 생산 효율이 떨어지는 단점을 가지고 있다.
따라서, 본 발명은 그 생산과정이 복잡하지 않으면서 생체내 지속성이 우수한 G-CSF의 제공함을 목적으로 한다. 구체적으로는, 본 발명에서는 사랍 과립구 콜로니 형성인자가 그의 수용체와 결합함에 있어서, 신호 전달에는 관여하지 않고 단지 신호 전달에 효율성을 제공하는 임뮤노글로불린 유사 부위에 결합하거나 또는 그 인접 부위에 존재하는 아미노산 서열을 변형시킴으로써 수용체와의 친화성을 낮춤으로써 생체내 지속성을 증대시킴을 목적으로 하고 있다. 더욱 구체적으로는 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 인간 과립구 콜로니 형성 인자에 있어서, Lys40, His43, Glu45, Glu46, Val48, Leu49, 및 Phe144 중 어느 한 부위의 아미노산이 변형된 인간 과립구 콜로니 형성 인자 동종체를 제공한다. 상기 서열에서 -1위치의 N 말단에 Met잔기가 존재할 수도 있다. 바람직하게는, 상기 변형은 K40R, H43L, E45D, E46D, E46Q, E46G, V48L, L49I, L49V, 및 F144Y 중 어느 하나이며, 더욱더 바람직하게는 상기 변형은 H43L 또는 E46G이다.
다른 관점으로서, 본 발명은 상기 특정 부위에 수용체와 작용을 가지면서 신호전달에는 영향을 미치지 않는, 인간 과립구 콜로니 형성인자의 아미노산 서열 부위가 변형된 인간 과립구 콜로니 형성인자 동종체와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 상기 특정 부위에 수용체와 작용을 가지면서 신호전달에는 영향을 미치지 않는, 인간 과립구 콜로니 형성인자의 아미노산 서열 부위가 변형된 인간 과립구 콜로니 형성인자 동종체를 코딩(암호화)하는 유전자를 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 상기 특정 부위에 수용체와 작용을 가지면서 신호전달에는 영향을 미치지 않는, 인간 과립구 콜로니 형성인자의 아미노산 서열 부위가 변형된 인간 과립구 콜로니 형성인자 동종체를 코딩하는 유전자 생성을 위해서 프라이머로 사용되는 올리고데옥시뉴클레오타이드를 제공한다. 바람직하게는, 상기 올리고데옥시뉴클레오타이드는 서열번호 2 내지 21로 표시되는 올리고데옥시뉴클레오타이드이다.
본 발명에서 사용된 용어 인간 과립구 콜로니 형성인자의 동종체(isoform)는 천연형 인간 과립구 콜로니 형성인자의 고유 아미노산 서열 잔기의 적어도 하나에서 다른 아미노산 잔기로 변형이 이루어졌으나 그의 고유한 활성을 그대로 유지하는 유사체(analog) 또는 변이체(variant)를 의미한다.
본원 명세서에 사용된 아미노산의 삼문자(일문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다:
Ala(A): 알라닌; Asx(B): 아스파라긴 또는 아스파르트산; Cys(C): 시스테인;
Asp(D): 아스파르트산; Glu(E): 글루탐산; Phe(F): 페닐알라닌;
Gly(G): 글라이신; His(H): 히스티딘; IIe(I): 이소류신; Lys(K): 라이신;
Leu(L): 류신; Met(M): 메티오닌; Asn(N): 아스파라긴; Pro(P): 프롤린;
ln(Q): 글루타민; Arg(R): 아르기닌; Ser(S): 세린; Thr(T): 쓰레오닌;
Val(V): 발린; Trp(W): 트립토판; Tyr(Y): 티로신; Glx(Z): 글루타민
또는 글루탐산.
본원 명세서에 표기되는 "(아미노산일문자)(아미노산위치)(아미노산일문자)"는 인간 과립구 콜로니 형성인자의 해당 아미노산 위치에서 선행 표기된 아미노산이 후행 표기된 아미노산으로 치환된다는 것을 의미한다. 예를 들면, K40R은 천연형 인간 과립구 콜로니 형성인자의 40번에 해당하는 라이신이 아르기닌으로 치환된다는 것을 가리킨다.
본원 명세서에 해당 아미노산의 치환을 위해서 프라이머는 "(아미노산일문자)(아미노산위치)(아미노산일문자)1 또는 2"로 표기되어 있는데 여기서 1은 이중 가닥 주형 중에서 5'→3'방향으로 진행되는 단일 가닥 주형에 상보적인 프라이머이고 2는 이중 가닥 중에서 3'→5'방향으로 진행되는 단일 가닥 주형에 상보적인 프라이머를 말한다.
본 발명의 실시양태에서, 인간 과립구 콜로니 형성 인자 유전자를 코딩하는 유전자는 상기 인용문헌 등에서 기재된 바와 같이 동물세포 발현용 인간 과립구 형성인자 생산균주를 통해서 확보할 수 있다. 통상 유전자의 클로닝과 분리는 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 인간 과립구 콜로니 형성 인자 또는 그 동족체를 코딩하는 DNA 서열은 본 분야에 공지된 표준방법에 의해, 예를 들면 자동 DNA 합성기(예, 바이오서치, 어플라이드 바이오시스템TM )를 사용하여 합성할 수도 있다.
상기 과정을 통해서 확보된 인간 과립구 콜로니 형성 인자 유전자는 하나 이상 선택된 코돈에서 변형될 수 있다. 본 발명의 명세서에서 변형이란 인간 과립구 콜로니 형성 인자를 코딩하는 유전자상의 하나 또는 그 이상의 코돈을 치환함으로써 인간 과립구 콜로니 형성 인자의 아미노산 서열상에서 변화를 일어나게 하는 것이라고 정의할 수 있다. 보다 구체적으로는, 인간 과립구 콜로니 형성 인자 아미노산 서열상에 K40, H43, E45, E46, V48, L49, F144 서열의 변형을 위해 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 말한다.
본 발명의 실시예를 예로 들면, K40R은 천연형 인간 과립구 콜로니 형성인자의 40번에 해당하는 라이신이 아르기닌으로 치환된다는 것을 나타낸다. 본 발명의 양태로서, 인간 과립구 콜로니 형성 인자에서 목적한 아미노산 변형을 코딩하는 코돈(codon)을 포함하는 합성 올리고뉴클레오타이드를 제작한다. 일반적으로 길이면에서 약 27-32개 뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드가 사용된다. 더 짧은 올리고뉴클레오타이드가 도입될 수도 있지만 최적의 올리고뉴클레오타이드는 변형을 코딩한 뉴클레오타이드의 양쪽으로 주형에 상보적인 12개 내지 15개의 뉴클레오타이드를 가지는 것이다. 이러한 올리고뉴클레오타이드가 주형 DNA에 충분히 혼성화될 수 있다. 본 발명에서 아미노산 변형의 생성을 위해서 사용한 합성 올리고뉴클레오타이드는 표 1에 기재되어 있다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 기술에 의해서 합성될 수 있다.
본 발명의 양태로서, 하나의 아미노산이 변형된 인간 과립구 콜로니 형성 인자 동종체 DNA를 제공한다. 인간 과립구 콜로니 형성 인자 DNA를 주형으로 하고, 변형을 코딩한 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머(primer)로 사용하여 PCR을 수행한다. PCR의 가열(heating) 단계에서 이중 가닥 주형이 분리되면 각각의 단일 가닥 주형에 상보적인 프라이머가 혼성화(hybridzation)된다. DNA 합성효소(DNA polymerase)는 변형을 코딩한 프라이머의 -OH기로부터 주형에 상보적인 뉴클레오타이드를 5′→ 3′ 방향으로 연결시켜 나간다. 결과적으로, 두 번째 가닥은 변형을 코딩한 프라이머를 포함하게 되므로 유전자 상에서 목적한 변형을 코딩하게 되는 것이다. 상기 두 번째 가닥은 PCR의 반복되는 복제 단계에서 주형 DNA로 작용하게 되므로 변형을 코딩한 유전자는 계속 증폭될 것이다.
예를 들어서, 본 발명의 실시예에서는 K40R은 천연형 인간 과립구 콜로니 형 성인자의 40번에 해당하는 라이신을 아르기닌으로 치환하기 위해서 천연형의 과립구 콜로니 형성 인자 DNA를 주형으로 하여 프라이머 N-term seq와 K40R2 그리고 K40R1과 C-term seq를 각각 쌍으로 하여 PCR을 수행했다. 결과적으로 40번째 아미노산 위치에 라이신 대신 아르기닌에 해당하는 코돈으로 변형된 두 개의 DNA 단편을 얻을 수 있었다. 이렇게 하여 얻은 두 가지의 DNA 단편을 넣어주고 N-term seq, C-term seq를 프라이머 쌍으로 하여 두 번째 PCR을 수행하면 40번째 아미노산 위치에 라이신 대신 아르기닌으로 변형된 인간 과립구 콜로니 형성인자 동종체 K40R의 변형 유전자를 얻을 수 있었다.
본 발명에 따른 동종체는 일반적으로 ⒜ 상기 인간 과립구 콜로니 형성 인자 동종체를 코딩한 DNA 서열을 이 DNA 서열에 작동 가능하게 연결되어(operatively linked) 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, ⒝ 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환 또는 형질감염시키며, ⒞ 생성된 형질전환 또는 형질감염체를 인간 과립구 콜로니 형성 인자 동종체 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건하에 배양하여 인간 과립구 콜로니 형성 인자 동종체를 분리함으로써 제조한다.
배양 및 정제된 인간 과립구 콜로니 형성인자 동종체의 수용체와 친화성 및 이들 결과로 생체내 지속성의 여부를 조사하였다. 인간 과립구 콜로니 형성인자의 분석 세포주(M-NFS60)의 배양액에 인간 과립구 콜로니 형성인자의 동종체를 첨가하여 성장곡선을 아미노산 서열에서 변형을 일으키지 않은 재조합 인간 과립구 콜로 니 형성인자의 성장곡선과 비교하였다. 이 때, 수용체와의 친화성이 낮은 동종체들은 세포 내로 흡수, 분해 즉, 수용체 결합에 의한 단백질의 분해(receptor mediated degradation)의 효율이 저하되게 되어, 배양액 중에 상대적으로 오랜 기간 동안 잔류하게 된다.
연관된 관점으로서, 본 발명은 인간 과립구 콜로니 형성 인자 동종체를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이러한 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를 제공한다.
물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담 없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩된 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성 있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 또한 숙주를 선정함에 있어서도, 선택된 벡터와의 상용성, 뉴클레오타이드 서열에 의해서 코딩된 산물의 독성, 이들의 분비 특성, 폴리펩타이드를 올바르게 폴딩(folding)할 수 있는 능력, 발효 또는 배양 필요조건, 그리고 뉴클레오타이드 서열에 의해서 코딩된 산물의 정제 용이성 등을 고려하여야 한다.
본원 명세서에 사용된 "벡터"란 용어는 외래 유전자를 숙주 세포 내로 안정적으로 운반할 수 있는 운반체로서의 DNA 분자를 말한다. 유용한 벡터가 되기 위해서는 복제될 수 있어야 하며, 숙주 세포 내로 유입할 수 있는 방안을 갖추어야 하고, 자신의 존재를 검출 할 수 있는 수단을 구비하고 있어야 한다. 또한 "재조합 발현 벡터"라는 용어는 일반적으로 외래 유전자가 숙주 세포에서 발현될 수 있도록 벡터에 작동적으로 연결되어 형성된 환상의 DNA 분자를 말한다. 재조합 발현 벡터는 수 개의 카피 및 그의 삽입된 이종의 DNA가 생성될 수 있다. 당업계에 주지된 바와 같이, 숙주 세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동적으로 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자를 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵 세포인 경우에는 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 세포 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
인간 과립구 콜로니 형성 인자 동종체를 코딩한 유전자뿐만 아니라 상기의 구성 성분들(즉, 조절서열)을 포함하는 적합한 벡터의 제작은 기본적인 재조합 DNA기술을 사용해서 제작할 수 있다. 목적한 벡터를 형성하기 위해서 분리된 각각의 DNA 단편들이 결합되려면 먼저 제한 효소로 절단한 다음 특정한 순서(order)와 방향(orientation)을 고려하여 연결되어야 한다.
DNA는 적절한 완충액(buffer)내에서 특정한 제한 효소를 사용해서 절단될 수 있다. 일반적으로 약 0.2∼1ug의 플라스미드 또는 DNA 단편은 대략 20μl의 버퍼용액에 해당 제한 효소 약 1∼2 단위와 함께 사용된다. 적절한 버퍼, DNA농도, 배양 시간과 온도는 제한 효소의 제조업체에 의해서 특정된다. 일반적으로, 37℃에서 약 1 2 시간 정도 배양하는 것이 적당하지만 일부 효소들은 더 높은 온도를 필요로 한다. 배양 후에, 효소와 다른 불순물들은 페놀과 클로로포름의 혼합물로 상기 소화용액을 추출함에 의해서 제거되어지고 DNA는 에탄올로 침전시켜 수용액 층으로부터 회수할 수 있다. 이때 DNA 단편들이 기능성 벡터를 형성할 수 있도록 연결되기 위해서는 DNA 단편의 말단이 서로 상용성이 있어야만 한다.
절단된 DNA 단편들은 전기영동(electrophoresis)을 이용해서 크기별로 분류되고 선택되어야 한다. DNA는 아가로스나 폴리아크릴아미드 매트릭스(matrix)를 통해서 전기영동될 수 있다. 매트릭스의 선택은 분리되어질 DNA 단편의 크기에 따라 결정된다. 전기 영동 후에 DNA는 전기용출(electroelution)에 의해서 매트릭스로부터 추출되거나, 매트릭스로부터 추출되거나, 저용융 아가로스가 사용되어졌다면 아가로스를 용융시키고 그로부터 DNA를 추출한다.
연결되어야 할 DNA 단편들은 동일한 몰양으로 용액에 첨가되어야 한다. 그 용액은 ATP, 연결 효소(ligase) 완충액, DNA 0.5ug당 약 10 단위의 T4 연결효소(ligase)와 같은 연결효소를 포함하고 있다. DNA 단편이 벡터에 연결되려면, 먼저 벡터는 적합한 제한효소에 의해서 절단되어 선형화되어야 한다. 선형화된 벡터는 알칼리성 인산 가수분해 효소 또는 소 내장의 가수분해 효소로 처리되어야 한다. 이러한 인산 가수분해 효소 처리는 연결 단계 동안에 벡터의 자가 연결(self-ligation)을 방지한다. 이와 같은 방법을 통해서 제작된 재조합 발현 벡터로 이제 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시킨다.
폴리뉴클레오타이드는 문헌(Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology(1986)) 및 문헌(Sambrook, J., et al. (1989) "Molecular Cloning" A Laboratory Manual 2nd edition)과 같은 기본적인 실험 지침서에 기술된 방법에 의해서 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포로 도입하는데 바람직한 방법은 예를 들어서, 칼슘 포스페이트 형질전환(calcium phosphate transfection), DEAE-덱스트란 매개 형질전환(DAEA-dextran mediated transfection), 이환(transvection), 미세주입(microinjection), 양이온 지질-매개 형질전환(cationic lipid-mediated transfection), 전기천공(electroporation), 형질도입(transduction), 스크래프 로딩(scrape loading), 총알식 도입(ballistic introduction) 또는 감염(infection)등을 포함한다.
본 발명의 생산 방법에서, 숙주 세포들은 공지된 기술을 이용해서 폴리펩타이드의 생산에 적합한 영양 배지에서 배양된다. 예를 들어서, 세포들은 적당한 배지와 폴리펩타이드가 발현 및/또는 분비되는 것을 허용하는 조건 하에, 실시된 실험실 또는 산업용 발효기에서 소규모 또는 대규모 발효, 셰이크 플라스크 배양에 의해서 배양될 수 있다. 배양은 공지된 기술을 사용해서, 탄소, 질소 공급원 및 무기염을 포함하는 적절한 영양배지에서 일어난다. 배지는 당업자에게 잘 알려져 있으며 시판되고 있는 것을 사용하거나 직접 제조하여 사용할 수 있다. 폴리펩타 이드가 영양배지로 직접 분비된다면 폴리펩타이드는 배지로부터 직접 분리될 수 있다. 폴리펩타이드가 분비되지 않는다면, 그것은 세포의 여액(lysate)으로부터 분리될 수 있다.
폴리펩타이드는 당업계에 공지된 방법에 의해서 분리될 수 있다. 예를 들어서, 이로서 제한되는 것은 아니지만, 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발, 또는 침전을 포함하는 전통적인 방법에 의해서 영양 배지로부터 분리될 수 있다. 더 나아가 폴리펩타이드는 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, 분별용해도(예를 들면, 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하여 일반에 공지된 다양한 방법을 통해서 정제될 수 있다.
약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정제는 도입된 투여용량과 농도에서 투여자에게 독성이 없어야 하고 그 제제의 다른 구성성분들과 상용성이 있어야 한다. 예를 들어서 당해 제제는 폴리펩타이드에 해로운 것으로 알려진 산화제 또는 기타 물질들을 포함해서는 안된다.
적합한 담체는 인산, 시트르산, 및 그 외 유기산과 같은 버퍼; 아스코르브산(ascorbic acid)을 포함한 항산화제; 저분자량 폴리펩타이드; 혈장 알부민, 젤라틴, 및 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone)과 같은 친수성 폴리머; 글라이신, 글루타민, 아르기닌, 또는 라이신과 같은 아미노산; 글루코오스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함한 단당류, 이당류, 그 외 탄수화물; EDTA같은 킬레이트 인자; 아연, 코발트, 또는 구리와 같은 금속 이온; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당알코올; 나트륨과 같은 염-형성 카운터이온(counterion); 및/또는 트윈(Tween), 플루로닉(Pluronic), 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
인간 과립구 콜로니 형성 인자 동종체가 치료를 위한 투여용으로 사용되려면 멸균되어야만 한다. 멸균은 멸균 여과 막(sterile filtration membrane)을 통한 여과를 통해서 쉽게 달성될 수 있다.
치료용 인간 과립구 콜로니 형성 인자 동종체 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트(sterile access port)를 가지고 있는 용기 예를 들면, 피하주사 바늘에 의해서 관통될 수 있는 마개를 가지고 있는 정맥 주사액 백(bag) 또는 바이알(vial)에 보관되어야 한다.
본 발명에 따른 인간 과립구 형성인자 동종체는 비경구 투여를 포함한, 적절한 기술에 의해서 동물에게 직접적으로 투여되고, 국소적 또는 전신으로 투여될 수 있다. 특정적인 투여 경로는 예를 들어서, 인간 과립구 형성인자를 이용해서 인지되었거나 예상되는 부작용을 포함한 환자의 병력에 따라서 결정될 것이다. 비경구 투여의 예는 피하조직, 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 투여를 포함한다. 가장 바람직하게, 투여는 지속적인 주입 (예를 들면 삼투압 펌프와 같은 미니 펌프) 또는 주사 예를 들면, 정맥내 또는 피하조직내 경로를 통하는 것이다. 인간 과립구 형성인자 동종체의 경우에 바람직한 투여 방식은 피하조직내이다.
본 발명의 인간 과립구 형성인자 동종체는 환자에게 치료에 효과적인 양으로 투여될 것이다. "치료에 효과적인"이란 주어진 상태와 투여 방식에서 목적한 치료 효과를 나타내는데 충분한 양이라고 정의할 수 있다. 치료에 사용될 인간 과립구 형성인자 조성물은 치료되어질 특정한 상태, 개개 환자의 임상 조건(특히, 인간 과립구 형성인자 단독 처리시의 부작용), 인간 과립구 형성인자 동종체 조성물의 전달 장소, 투여 방법, 투여 스케줄, 당업자에게 숙지된 다른 요건들을 고려해서 바람직한 의료 업무(practice)와 일관되게 제조되고 복용되어야 한다. 인간 과립구 형성인자 동종체의 치료에 효과적인 양이란 그러한 사항들의 고려에 의해서 결정된다. 본 발명의 인간 과립구 형성인자 동종체의 일일 투여량은 일반적으로 약 1㎍/kg 내지 100㎍/kg 이며, 바람직하게는 1㎍/kg 내지 10㎍/kg 이다.
본 발명은 하기 실시예로 보다 구체적으로 예시될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 단지 본 발명의 구현예이며 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
<실시예 1>
인간 과립구 형성인자 유전자의 확보
천연형 인간 과립구 콜로니 형성 인자 동종체의 제작을 위해 주형으로 사용된 인간 과립구 콜로니 형성 인자의 유전자를 자동 DNA 합성기(바이오서치, 어플라이드 바이오시스템TM)를 사용하여 합성하였다. 합성 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열은 도 1에 도시되어 있다. 도 1에 도시된 아미노산 서열은 서열번호 1에 표시된 아미노산 서열과 1-위치에 Met를 가지는 것 이외에는 동일하다.
<실시예 2>
인간 과립구 콜로니 형성 인자 유전자에서 변형부위의 선정
인간 과립구 콜로니 형성인자의 아미노산을 변형시킬 부위를 선정하기 위해 본등(J. Biol. Chem., 1992, 5, 8770)의 구조분석 결과를 활용하였다. 변형부위는 인간 과립구 콜로니 형성인자의 수용체와 결합하는 46번 위치의 글루탐산 잔기를 고려하여 결정하였다. 변형부위는 도 2에 도시되어 있다.
<실시예 3>
인간 과립구 콜로니 형성 인자 동종체의 제작
하나 이상의 아미노산이 변형된 인간 과립구 형성인자를 코딩하는 유전자는 합성 올리고데옥시뉴클레오타이들를 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하면 제작될 수 있었다. 여기에 사용된 합성 올리고데옥시뉴클레오타이드는 표 1에 나타내었다. 표 1에 기재된 K40R 내지 F144Y의 올리고데옥시뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2 내지 21의 올리고데옥시뉴클레오타이드 서열에 각각 대응한다.
1) K40R의 제작
본 실시예에서는 K40R은 천연형 인간 과립구 콜로니 형성인자의 40번에 해당하는 라이신을 아르기닌으로 치환하기 위해서 천연형의 과립구 콜로니 형성 인자 DNA를 주형으로 하여 프라이머 N-term seq와 K40R2 그리고 K40R1과 C-term seq를 각각 쌍으로 하여 PCR을 수행했다. 결과적으로 40번째 아미노산 위치에 라이신 대 신 아르기닌에 해당하는 코돈으로 변형된 두 개의 DNA 단편을 얻을 수 있었다. 이렇게 하여 얻은 두 가지의 DNA 단편을 넣어주고 N-term seq, C-term seq를 프라이머 쌍으로 하여 두 번째 PCR을 수행하면 40번째 아미노산 위치에 라이신 대신 아르기닌으로 변형된 인간 과립구 콜로니 형성인자 동종체 K40R의 변형 유전자를 얻을 수 있었다.
2) H43L의 제작
본 실시예에서는 H43L은 천연형 인간 과립구 콜로니 형성인자의 43번에 해당하는 히스티딘을 류신으로 치환하기 위해서 천연형의 과립구 콜로니 형성 인자 DNA를 주형으로 하여 프라이머 N-term seq와 H43L2 그리고 H43L1과 C-term seq를 각각 쌍으로 하여 PCR을 수행했다. 결과적으로 43번째 아미노산 위치에 히스티딘 대신 류신에 해당하는 코돈으로 변형된 두 개의 DNA 단편을 얻을 수 있었다. 이렇게 하여 얻은 두 가지의 DNA 단편을 넣어주고 N-term seq, C-term seq를 프라이머 쌍으로 하여 두 번째 PCR을 수행하면 43번째 아미노산 위치에 히스티딘 대신 류신으로 변형된 인간 과립구 콜로니 형성인자 동종체 H43L의 변형 유전자를 얻을 수 있었다.
3) E45D의 제작
본 실시예에서는 E45D는 천연형 인간 과립구 콜로니 형성인자의 45번에 해당하는 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하기 위해서 천연형의 과립구 콜로니 형성 인자 DNA를 주형으로 하여 프라이머 N-term seq와 E45D2 그리고 E45D1과 C-term seq를 각각 쌍으로 하여 PCR을 수행했다. 결과적으로 45번째 아미노산 위치에 글 루탐산 대신 아스파르트산에 해당하는 코돈으로 변형된 두 개의 DNA 단편을 얻을 수 있었다. 이렇게 하여 얻은 두 가지의 DNA 단편을 넣어주고 N-term seq, C-term seq를 프라이머 쌍으로 하여 두 번째 PCR을 수행하면 45번째 아미노산 위치에 글루탐산 대신 아스파르트산으로 변형된 인간 과립구 콜로니 형성인자 동종체 E45D의 변형 유전자를 얻을 수 있었다.
4) E46D의 제작
본 실시예에서는 E46D는 천연형 인간 과립구 콜로니 형성인자의 46번에 해당하는 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하기 위해서 천연형의 과립구 콜로니 형성 인자 DNA를 주형으로 하여 프라이머 N-term seq와 E46D2 그리고 E46D1과 C-term seq를 각각 쌍으로 하여 PCR을 수행했다. 결과적으로 46번째 아미노산 위치에 글루탐산 대신 아스파르트산에 해당하는 코돈으로 변형된 두 개의 DNA 단편을 얻을 수 있었다. 이렇게 하여 얻은 두 가지의 DNA 단편을 넣어주고 N-term seq, C-term seq를 프라이머 쌍으로 하여 두 번째 PCR을 수행하면 46번째 아미노산 위치에 글루탐산 대신 아스파르트산으로 변형된 인간 과립구 콜로니 형성인자 동종체 E46D의 변형 유전자를 얻을 수 있었다.
5) E46G의 제작
본 실시예에서는 E46G는 천연형 인간 과립구 콜로니 형성인자의 46번에 해당하는 글루탐산이 글라이신으로 치환시키기 위해서 천연형의 과립구 콜로니 형성 인자 DNA를 주형으로 하여 프라이머 N-term seq와 E46G2 그리고 E46G1과 C-term seq를 각각 쌍으로 하여 PCR을 수행했다. 결과적으로 46번째 아미노산 위치에 글루탐 산 대신 글라이신에 해당하는 코돈으로 변형된 두 개의 DNA 단편을 얻을 수 있었다. 이렇게 하여 얻은 두 가지의 DNA 단편을 넣어주고 N-term seq, C-term seq를 프라이머 쌍으로 하여 두 번째 PCR을 수행하면 46번째 아미노산 위치에 글루탐산 대신 글라이신으로 변형된 인간 과립구 콜로니 형성인자 동종체 E46G의 변형 유전자를 얻을 수 있었다.
6) E46Q의 제작
본 실시예에서는 E46Q는 천연형 인간 과립구 콜로니 형성인자의 46번에 해당하는 글루탐산을 글루타민으로 치환하기 위해서 천연형의 과립구 콜로니 형성 인자 DNA를 주형으로 하여 프라이머 N-term seq와 E46Q2 그리고 E46Q1과 C-term seq를 각각 쌍으로 하여 PCR을 수행했다. 결과적으로 46번째 아미노산 위치에 글루탐산 대신 글루타민에 해당하는 코돈으로 변형된 두 개의 DNA 단편을 얻을 수 있었다. 이렇게 하여 얻은 두 가지의 DNA 단편을 넣어주고 N-term seq, C-term seq를 프라이머 쌍으로 하여 두 번째 PCR을 수행하면 46번째 아미노산 위치에 글루탐산 대신 글루타민으로 변형된 인간 과립구 콜로니 형성인자 동종체 E46Q의 변형 유전자를 얻을 수 있었다.
7) V48L의 제작
본 실시예에서는 V48L은 천연형 인간 과립구 콜로니 형성인자의 48번에 해당하는 발린을 류신으로 치환하기 위해서 천연형의 과립구 콜로니 형성 인자 DNA를 주형으로 하여 프라이머 N-term seq와 V48L2 그리고 V48L1과 C-term seq를 각각 쌍으로 하여 PCR을 수행했다. 결과적으로 48번째 아미노산 위치에 발린 대신 류신에 해당하는 코돈으로 변형된 두 개의 DNA 단편을 얻을 수 있었다. 이렇게 하여 얻은 두 가지의 DNA 단편을 넣어주고 N-term seq, C-term seq를 프라이머 쌍으로 하여 두 번째 PCR을 수행하면 48번째 아미노산 위치에 발린 대신 류신으로 변형된 인간 과립구 콜로니 형성인자 동종체 V48L의 변형 유전자를 얻을 수 있었다.
8) L49I의 제작
본 실시예에서는 L49I는 천연형 인간 과립구 콜로니 형성인자의 49번에 해당하는 류신을 이소류신으로 치환하기 위해서 천연형의 과립구 콜로니 형성 인자 DNA를 주형으로 하여 프라이머 N-term seq와 L49I2 그리고 L49I1과 C-term seq를 각각 쌍으로 하여 PCR을 수행했다. 결과적으로 43번째 아미노산 위치에 류신 대신 이소류신에 해당하는 코돈으로 변형된 두 개의 DNA 단편을 얻을 수 있었다. 이렇게 하여 얻은 두 가지의 DNA 단편을 넣어주고 N-term seq, C-term seq를 프라이머 쌍으로 하여 두 번째 PCR을 수행하면 49번째 아미노산 위치에 류신 대신 이소류신으로 변형된 인간 과립구 콜로니 형성인자 동종체 L49I의 변형 유전자를 얻을 수 있었다.
9) L49V의 제작
본 실시예에서는 L49V는 천연형 인간 과립구 콜로니 형성인자의 49번에 해당하는 류신을 발린으로 치환시키기 위해서 천연형의 과립구 콜로니 형성 인자 DNA를 주형으로 하여 프라이머 N-term seq와 L49V2 그리고 L49V1과 C-term seq를 각각 쌍으로 하여 PCR을 수행했다. 결과적으로 49번째 아미노산 위치에 류신 대신 발린에 해당하는 코돈으로 변형된 두 개의 DNA 단편을 얻을 수 있었다. 이렇게 하여 얻은 두 가지의 DNA 단편을 넣어주고 N-term seq, C-term seq를 프라이머 쌍으로 하여 두 번째 PCR을 수행하면 49번째 아미노산 위치에 류신 대신 발린으로 변형된 인간 과립구 콜로니 형성인자 동종체 L49V의 변형 유전자를 얻을 수 있었다.
10) F144Y의 제작
본 실시예에서는 F144Y는 천연형 인간 과립구 콜로니 형성인자의 144번에 해당하는 페닐알라닌을 티로신으로 치환하기 위해서 천연형의 과립구 콜로니 형성 인자 DNA를 주형으로 하여 프라이머 N-term seq와 F144Y2 그리고 F144Y1과 C-term seq를 각각 쌍으로 하여 PCR을 수행했다. 결과적으로 43번째 아미노산 위치에 페닐알라닌 대신 티로신에 해당하는 코돈으로 변형된 두 개의 DNA 단편을 얻을 수 있었다. 이렇게 하여 얻은 두 가지의 DNA 단편을 넣어주고 N-term seq, C-term seq를 프라이머 쌍으로 하여 두 번째 PCR을 수행하면 144번째 아미노산 위치에 페닐알라닌 대신 티로신으로 변형된 인간 과립구 콜로니 형성인자 동종체 F144Y의 변형 유전자를 얻을 수 있었다.
합성 올리고데옥시뉴클레오타이드
프라이머 명칭 프라이머 서열
K40R1(서열번호2) 5'TGCGCTACTT ACCGTCTGTG CCATCCG3'
K40R2(서열번호3) 5'CGGATGGCAC AGACGGTAAG TAGCGCA3'
H43L1(서열번호4) 5'TACAAACTGT GCCTGCCGGA AGAGCTG3'
H43L2(서열번호5) 5'CAGCTCTTCC GGCAGGCACA GTTTGTA3'
E45D1(서열번호6) 5'CTGTGCCATC CGGACGAGCT GGTACTG3'
E45D2(서열번호7) 5'CAGTACCAGC TCGTCCGGAT GGCACAG3'
E46D1(서열번호8) 5'TGCCATCCGG AAGACCTGGT ACTGCTG3'
E46D2(서열번호9) 5'CAGCAGTACC AGGTCTTCCG GATGGCA3'
E46Q1(서열번호10) 5'TGCCATCCGG AACAACTGGT ACTGCTG3'
E46Q2(서열번호11) 5'CAGCAGTACC AGTTGTTCCG GATGGCA3'
E46G1(서열번호12) 5'TGCCATCCGG AAGGTCTGGT ACTGCTG3'
E46G2(서열번호13) 5'CAGCAGTACC AGACCTTCCG GATGGCA3'
V48L1(서열번호14) 5'CCGGAAGAGC TGCTGCTGCT GGGTCAT3'
V48L2(서열번호15) 5'ATGACCCAGC AGCAGCAGCT CTTCCGG3'
L49I1(서열번호16) 5'GAAGAGCTGG TAATCCTGGG TCATTCT3'
L49I2(서열번호17) 5'AGAATGACCC AGGATTACCA GCTCTTC3'
L49V1(서열번호18) 5'GAAGAGCTGG TAGTACTGGG TCATTCT3'
L49V2(서열번호19) 5'AGAATGACCC AGTACTACCA GCTCTTC3'
F144Y1(서열번호20) 5'TTCGCTTCTG CATACCAGCG TCGTGCA3'
F144Y2(서열번호21) 5'TGCACGACGC TGGTATGCAG AAGCGAA3'
N-Term seq 5'TGCTCTAGAA AAAACCAAGG AGGTAATAAA TA3'
C-Term seq 5'TTACTGGACC GGATCCGAAT TCTATTA3'
<실시예 4>
인간 과립구 콜로니 형성 인자 동종체의 플라스미드 제조 및 대장균 형질전환체 제작
도3에 도시된 pCJKM 플라스미드 벡터를 제한효소 XbaI과 BamHI으로 절단하고, 실시예 3에서 제작된 인간 과립구 콜로니 형성 인자 동종체 유전자를 동일한 제한효소로 절단하여 T4 DNA 리가제를 이용하여 삽입시킴으로써 발현벡터를 완성하였다. 발현벡터 pCJKM-isoform의 모식도는 도3에 나타내었다.
완성된 재조합 플라스미드를 대장균 pop2136(ATCC Cat.47049, Nucleic Acids Res. 17 (1989)) 에 형질전환시켜 형질전환체를 제조하였다.
<실시예 5>
인간 과립구 콜로니 형성 인자 동종체의 발현 및 정제
실시예 4에서 제조된 대장균 형질전환체를 20ug/ml 가나마이신이 포함된 2X YT배지에 접종하여 30℃에서 2시간 동안 배양하다가 42℃에서 6시간을 배양함으로써 G-CSF의 발현을 유도하였다. 이를 확인하기 위해서 배양액을 일부 파쇄하여 SDS-PAGE로 발현된 단백질이 G-CSF임을 확인하였다. (도4)
배양액으로부터 G-CSF를 정제하기 위하여 우선, 배양된 균체를 원심분리(10,000g, 30분)한 다음 호모게나이저로 균체를 파쇄하고 파쇄 액을 원심 분리하여 상등 액을 제거함으로써 봉입체(inclusion body)를 회수하였다. 회수한 봉입체를 증류수에 현탁한 후, 원심 분리하여 침전물을 회수함으로써 깨끗이 세척하였다. 봉입체를 8M 요소(urea)와 50mM 글리신 완충용액(pH11)에 완전히 용해시킨 후, 원심 분리하여 상등 액을 취한다. 요소의 농도가 2M이 되도록 봉입체 용해 액에 50mM의 글리신 용액을 첨가한 다음 수산화나트륨 용액으로 pH를 9.0이 되도록 조정하였다. pH가 조정된 용해 액을 상온에서 15시간 동안 서서히 교반시켜 단백질을 재구성(refolding)을 수행하였다. 단백질 재구성이 완료된 용액을 pH5.5로 조정한 다음, 원심분리를 하여 침전물을 제거하였다. 상등 액을 취하여 염산으로 pH를 3.0으로 조정한 후, 분자량 10kD를 분획하는 필터를 사용하여 단백질 농도가 1~5mg/ml이 되게 농축하였다. 농축된 용액을 양이온 교환수지를 이용하여 정제하였다. 용출된 단백질은 역상 HPLC를 사용하여 하나의 시료로 모은 다음 염산을 이용하여 pH3.0으로 조정하였다.
이온교환수지로 정제된 단백질은 역상 HPLC를 사용하여 정제를 수행하였다. 분획한 단백질은 역상 HPLC로 분석한 다음 하나의 시료로 모아 분자량 10kD를 분획하는 필터를 사용하여 최종 단백질 농도가 5~10mg/ml 되게 농축하였다. 농축된 단백질은 겔여과 크로마토그래피로 최종 정제하였다. 정제된 최종 단백질은 역상 HPLC와 흡광분석기로 단백질 정량(280nm에서의 흡광도)을 하였다. (도5)
<실시예 6>
인간 과립구 콜로니 형성 인자 동종체의 분석 세포주 내에서 영향 조사
공지된 G-CSF 의존성 세포주인 M-NFS60(Biochem. J. 253(1988) 213-218. Exp. Hematol. 17(1989))를 1ng/ml G-CSF가 첨가된 배지 (RPMI 1640, 10% FBS)에서 계대를 한다. 다음날 배양액에 첨가한 G-CSF를 제거하기 위하여, 배양액을 원심분리(600rpm, 10분)하여 상등액을 제거한 후, PBS로 현탁하여 다시 원심분리한다. 이를 2회 반복하여 수행한 후, 1×104cells/ml로 세포현탁액을 만들어 T75 플라스크에 분주한다. 이때, serum에 의한 단백질 분해효소 작용을 최소화하기 위해 배지에 첨가한 FBS는 5%로 낮추고, 0.1X protease inhibitor(protease inhibitor cocktail tablet, EDTA-free: Roche)를 넣은 배지를 이용한다. 실시예 5에서 정제된 각각의 G-CSF 동종체와 천연(wt) G-CSF 단백질(CJ㈜사제의 류코카인) 2.5ng/ml 농도로 첨가한 후, 37℃ CO2 incubator에서 배양하고, 24시간 마다 세포 수를 cell viability analyzer(Beckman coulter)를 이용하여 측정한다.
그 결과는 도6에 도시된 바와 같이, 천연(wt) G-CSF 단백질을 첨가한 배지는 초기에 증식한 세포수는 많으나 10일 이후부터는 세포증식이 일어나지 않음에 반하여, 본 발명에 따른 실시예 5에서 정제된 각각의 G-CSF 동종체를 첨가한 배지는 세포의 증식 속도는 느리지만 오랫동안 세포증식이 유도되어 생체내 지속성이 증가되었음을 알 수 있다. 특히, H43L과 E46G와 생체내 지속성은 크게 증가되었음을 알 수 있다.
이와 같은 생체내 지속성의 증대효과는 본 발명에서 최초로 발견한 것이다. 선행기술에서의 유사체의 경우, G-CSF의 생물학적활성에 대한 결과만 알려져 있는 경우가 대부분이다. 예를 들면, 상기 기재한 US20030171559, US6555660, US6358505등에서는 유사체의 활성이 천연 G-CSF 단백질과 비교할 경우 거의 관찰되지 않거나, 그 보다 낮거나, 활성의 유무만 관찰된 경우가 대부분이다.
본 발명에 따른 인간 과립구 콜로니 형성인자 동종체는 제조방법이 간단하면서도 세포 수용체의 친화도를 낮춤으로써 생체내 반감기를 증가시켜 결과적으로 임상에서 적용용량 및 투여 횟수를 낮출 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 인간 과립구 콜로니 형성 인자에 있어서,
    His43 및 Glu46 부위의 아미노산이 변형되고, 상기 변형은 H43L 또는 E46G인 것을 특징으로 하는 인간 과립구 콜로니 형성 인자 동종체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 기재된 인간 과립구 콜로니 형성 인자 동종체와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  5. 청구항 1에 기재된 인간 과립구 콜로니 형성 인자 동종체를 코딩하는 유전자.
  6. 삭제
  7. 청구항 1에 기재된 인간 과립구 콜로니 형성 인자 동종체로, 인간 과립구 콜로니 형성 인자의 아미노산 서열을 변형하기 위한 프라이머로 사용되는 서열번호 4, 5, 12, 및 13인 것을 특징으로 하는 올리고데옥시뉴클레오타이드.
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