CN101845099A - 一种长效镇痛肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种长效镇痛肽融合蛋白的制备及其治疗用途，包括编码融合蛋白的基因序列，含有该基因的载体，以及含有所述载体的宿主细胞。本发明的长效镇痛融合蛋白包括序列表中SEQ ID No：1血清白蛋白的第一区和序列表中SEQ ID No：2的第二区。第一区可以位于融合蛋白的N-端，第二区位于融合蛋白的C-端；或者，第二区位于融合蛋白的N-端，第一区位于融合蛋白的C-端；第一区与第二区之间可以设有一个或多个连接肽，也可以不设连接肽。经初步的药理实验证明，本发明所述的长效镇痛融合蛋白既具有虎纹镇痛肽的生物活性，又具有较长的半衰期，这种长效镇痛融合蛋白可用于制备治疗各种疼痛如癌症或晚期艾滋病等引起的疼痛、严重慢性疼痛、术中或术后疼痛等的药物的用途。

Description

一种长效镇痛肽及其应用

技术领域

本发明涉及一种由人血清白蛋白和虎纹镇痛肽组成的融合蛋白及其制备与应用。

技术背景

人血清白蛋白(Human serum albmin，HSA)是含585个氨基酸的非糖基化单链结构分子(A.Dugaiczyk et al，PNAS，198279：71-75)，是人体血清中的主要成分，广泛分布于血管内外，主要由人体肝脏产生，其对维持体内渗透压和血浆体积起着至关重要的作用，肾清除率非常低，体内半衰期长，为14～20d。并且它没有酶或免疫活性，是体内因子和药物转运的天然载体，因此可望作为提高小分子蛋白在血液中的半衰期的载体。相关研究成果表明，很多蛋白药物与人血清白蛋白融合表达后，与先前的蛋白药物相比，药效相似，但体内半衰期大大延长。

虎纹镇痛肽(HWTX-I)最初是从虎纹捕鸟蛛中提取的一种N-型Ca²⁺通道阻断剂，其分子量为3750Da，由33个氨基酸残基组成，二维核磁共振方法解析HWTX-I的空间结构为以三对二硫键和三股反平行的β-折叠为核心的结构模体(梁宋平，生命化学，1997 17：21-23)。HWTX-I硬膜外给药显示良好的镇痛效果，且没有成瘾性，经实验无致突变作用，不会引起过敏反应，没有肌肉震颤副作用。其在解除晚期癌症病人的痛苦方面显示了潜在的应用和开发价值，作为新型镇痛剂具有巨大的开发利用前景。但现在进入三期临床的HWTX-I在体内从血液中清除的速度快，半衰期较短，而在HWTX-I治疗疼痛特别是慢性疼痛的疾病时，治疗的周期往往很长，这种长期大量频繁的用药，不仅增加了病人的痛苦和治疗费用，而且增加了毒副作用。研究结果表明与人血清白蛋白融合形成的融合镇痛肽其半衰期显著延长，增强了治疗效果。并且融合镇痛肽在酵母中表达与现有的HWTX-I表达相比，具有生产成本较低、效率高、易于分离纯化等优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种集血清白蛋白和虎纹镇痛肽的特性为一体的白蛋白-虎纹镇痛肽融合蛋白及其编码基因，解决虎纹镇痛肽在治疗上存在的不足。与现有的虎纹镇痛肽相比，本发明的重组融合蛋白具有以下优点：1)能够在酵母菌中实现胞外高表达，产量高，无需复性，易纯化。2)重组融合蛋白在体内的半衰期延长，且镇痛作用效果强，能减少现有虎纹镇痛肽潜在的毒副作用，发挥最大的治疗作用。3)重组表达生产成本较低、效率高。

本发明的长效镇痛肽融合蛋白，包括与序列表中SEQ ID No：1血清白蛋白氨基酸序列相同的第一区，连接在血清白蛋白C-末端的与序列表中SEQ ID No：2虎纹镇痛肽氨基酸序列相同的第二区，和连接在血清白蛋白N-末端的与序列表中SEQ IDNo：2虎纹镇痛肽氨基酸序列相同的第二区，所述的融合蛋白可以由上述的第一区和第二区连接构成。

在不改变所述长效镇痛肽融合蛋白特性前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或添加得到的蛋白，但这些改变不能明显改变蛋白质的一个或多个有用的配体结合和镇痛活性的能力。特别是，将人血清白蛋白和人血清白蛋白片段中天然发生的多态性变体包括在内，长效镇痛肽融合蛋白中的白蛋白可来自任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物，如：牛、羊、猪、鸡或鲑鱼。此外，虎纹镇痛肽可以由虎纹捕鸟蛛的毒素中提取，也可以通过生物技术和化学合成的方法获得。

可以通过对本发明的长效镇痛肽融合蛋白中个别氨基酸残基进行取代、缺失或插入，得到与正常血清白蛋白或虎纹镇痛肽具有至少85％的序列同源性的变体。相对于正常的血清白蛋白，血清白蛋白变体应至少包含或是有血清白蛋白的一个完整的结构域组成，如结构域1(1-194)，2(195-387)，3(388-585)，或者是三个结构域的不同组合。此外，每个结构域本身由两个不同源亚结构域组成，这些亚结构域范围为1-105，120-194，195-291，316-387，388-492，512-585。优选长效镇痛肽融合蛋白的血清白蛋白部分至少包含一个血清白蛋白的亚结构域，或结构域。相对于正常的虎纹镇痛肽，虎纹镇痛肽突变体具有镇痛活性，包含本领域内所周知的虎纹镇痛肽所有突变体。

当用本领域公认的软件与其他任何具有类似的DNA序列对比分析时，某一特定的序列如与本发明所提出的序列有85％以上的序列同源性，均认为与本发明长效镇痛肽融合蛋白所述的序列相同源。

为了使长效镇痛肽融合蛋白两部分间有较大的间隔，使虎纹镇痛肽部分最大的与其受体结合，在不影响融合蛋白的活性的情况下，在所述的第一区与第二区之间设有连接肽。所述连接肽的通式是[GlyGlyGlyGlySer]_n，n为0-10的整数，优选的是3。既可以是血清白蛋白-连接肽-虎纹镇痛肽，或虎纹镇痛肽-连接肽-血清白蛋白，也可以是血清白蛋白-虎纹镇痛肽或虎纹镇痛肽-血清白蛋白。

本发明重点描述的是血清白蛋白-连接肽-虎纹镇痛肽的制备，其他种类的长效镇痛肽融合蛋白家族成员均能用同样的方法制备。

本发明的另一个目的是提供编码本发明长效镇痛肽融合蛋白的氨基酸序列和基因序列。

本发明的又一个目的是提供携带编码本发明长效镇痛肽融合蛋白基因序列的重组表达载体。重组表达载体包括pPIC9质粒，pPIC3质粒，pPIC9K质粒等。

本发明的再一目的是提供一种表达上述长效镇痛肽融合蛋白的方法。所提供的表达上述长效镇痛肽融合蛋白方法，是将含有上述长效镇痛肽融合蛋白编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到长效镇痛肽融合蛋白。

所述的宿主可为酵母菌，大肠杆菌等，优选为酵母菌，酵母菌更优选巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)，其中，所述的巴氏毕赤酵母优选巴氏毕赤酵母GS115。

本发明的长效镇痛肽融合蛋白，编码血清白蛋白和虎纹镇痛肽的DNA序列可以用PCR，RT-PCR方法、人工合成的方法和构建筛选cDNA文库等本领域所周知的方法获得。其中上述方法所采用的mRNA或cDNA可以来源于任何含有相应mRNA或cDNA的组织(细胞)和文库等。可以用PCR等方法，在编码序列的两侧引入限制性内切酶识别位点，进行编码白蛋白和编码虎纹镇痛肽的融合，通过酶切产生粘性末端用DNA连接酶连接后从而获得编码融合蛋白的基因。

本发明的长效镇痛肽融合蛋白的表达载体和其对应的宿主可以是，酵母表达载体如pPIC9质粒，pPIC3质粒，pPIC9K质粒，pPICZ质粒等，动物细胞表达载体Psvk3质粒，pMSG质粒等。其中优选的质粒为带有His4选择性标记的酵母整合型质粒，如pPIC9质粒，pPIC9K质粒等，通过编码本发明的长效镇痛肽融合蛋白的基因克隆到这些酵母表达载体中。优选的启动子为醇氧化酶AOX1。

本发明的长效镇痛肽融合蛋白表达宿主可以是酵母，细菌，动物细胞或植物细胞以及包含本发明融合蛋白基因序列的转基因动植物等。融合蛋白或多肽的表达可以是胞内，也可以分泌表达至宿主胞外的培养液中。优选的表达方式是分泌至培养液中，形成可溶性蛋白。其中，含血清白蛋白的长效镇痛肽融合蛋白可以有信号肽主导并通过分泌表达途径而得到加工。分泌所用的信号肽，优选的是天然人血清白蛋白的信号肽或酿酒酵母配对因子α或这两种信号肽的类似物。更优选天然人血清白蛋白的信号肽。融合蛋白也可以不用信号肽，而以胞内可溶形式表达。编码融合蛋白的基因，可以插入至宿主染色体，或以游离质粒形式存在。

本发明中的宿主细胞可以利用周知的方法经基因工程技术(转导、转化或转染)将携带本发明融合蛋白基因序列的质粒载体以入侵方式、病毒感染、噬菌体等形式转入宿主中表达。其中转化融合蛋白基因序列至宿主细胞中可用周知的方法，如电穿孔，制备感受态的原生质体，化学转化等。成功转化并含有本发明融合蛋白基因序列的细胞，可通过常用的方法进行鉴定，如提取DNA，然后PCR方法鉴定。或者收集细胞破碎液或胞外培养液中的蛋白，用抗白蛋白抗体进行ELISA检测鉴定。

本发明的长效镇痛肽融合蛋白的生产，可以通过培养含有本发明基因序列的宿主细胞，如重组酵母，细菌，动、植物细胞，转基因动植物等获得。宿主细胞的培养可以是所周知的方法，如摇瓶、生物反应器等，生产时优选生物反应器。

本发明的长效镇痛肽融合蛋白的纯化处理，其中包括盐析、沉淀、超滤、液相层析等技术及这些技术的组合。其中液相层析可以用分子筛、亲和、离子交换、疏水、反相等层析技术。

本发明将人血清白蛋白和虎纹镇痛肽融合所形成的长效镇痛肽融合蛋白既保留了与虎纹镇痛肽受体结合的活性，同时与虎纹镇痛肽相比，其体内半衰期得到了显著延长，降低了给药频率和剂量，是一种长效的镇痛蛋白候选药物。

本发明中的长效镇痛肽融合蛋白可以有各种衍生物，这些衍生物可以是但不局限于其不同形式的盐、修饰产物等，如在多肽的氨基、羧基、羟基、巯基上再进行修饰。

本发明中的长效镇痛肽融合蛋白及其衍生物可单独使用，也可以加入一种或多种药学上可以接受的载体一起组成药物制剂的形式使用。所述的载体包括药学领域常规的典型载体如水、盐水、糖类、醇类、氨基酸等。

本发明的长效镇痛肽融合蛋白可以制成注射剂。该剂型的蛋白可以按照药学领域的常规方法制备。药物制剂可以存在于单一剂量或多剂量的容器中，如密封的安瓶，西林瓶或小管中。冻干制剂是将液体制剂冷冻干燥制备的，使用前加入无菌、无热原的液态载体，如注射用水。

本发明中的长效镇痛肽融合蛋白以及其衍生物或其药物组合物，作为镇痛药物可用于各种疼痛治疗中，如癌症、晚期艾滋病、严重慢性疼痛、术中或术后等病人的治疗。

本发明中的长效镇痛肽融合蛋白及其衍生物可以通过静脉注射，侧脑室注射，硬外膜注射等方法给药。优选的方法是硬外膜注射给药。治疗包括在一段时间内使用单一剂量或复合剂量。

实验证明，本发明的长效镇痛肽融合蛋白稳定性高，半衰期较长，在医学上也有较高的安全性、较好的疗效。且该融合蛋白的表达量高，易纯化，生产周期短，成本低等优点，利于工业大量生产，具有重要应用前景和实际意义。

下面结合具体实例对本发明作进一步的说明。

附图说明

SEQ ID NO：1为人血清白蛋白的基因和氨基酸序列

SEQ ID NO：2为虎纹镇痛肽的基因和氨基酸序列

图1是重组pPIC9K/HSA-[Gly₄Ser]₃-HWTX-I质粒、pPIC9K/HWTX-I-[Gly₄Ser]₃-HSA质粒和pPIC9K/HSA-HWTX-I质粒的构建

图2是发酵液上清中HSA-[Gly₄Ser]₃-HWTX-I融合蛋白、HWTX-I-[Gly₄Ser]₃-HSA融合蛋白和HSA-HWTX-I融合蛋白的SDS-PAGE图

图3是HSA-[Gly₄Ser]₃-HWTX-I融合蛋白、HWTX-I-[Gly₄Ser]₃-HSA融合蛋白和HSA-HWTX-I融合蛋白分离纯化的SDS-PAGE图

图4是HSA-[Gly₄Ser]₃-HWTX-I融合蛋白在小鼠扭体实验中的镇痛作用

图5是HSA-[Gly₄Ser]₃-HWTX-I融合蛋白在小鼠热板实验中的镇痛作用

图6是HSA-[Gly₄Ser]₃-HWTX-I融合蛋白对正常大鼠痛阈的影响

具体的实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：hrh 7DNA、hrh2DNA和hrh3DNA的获得

由本实验室保存的含有HSA序列的pPIC9K质粒(简称H质粒)中获得hrh 7DNA包含HSA基因的3’端DNA片段和编码连接肽([GlyGlyGlyGlySer]₃)及HWTX-I的DNA序列，hrh 2DNA包含HSA基因的5’端DNA片段和编码连接肽([GlyGlyGlyGlySer]₃)及HWTX-I的DNA序列，hrh 3DNA包含HSA基因的3’端DNA片段和HWTX-I的DNA序列。

平板划线法接种含H重组质粒的E.coli菌株，挑取边缘整齐、形状饱满的单菌落，接入含氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃，200r/min振摇过夜。采用碱裂解法抽提质粒，置于-20℃冷冻保存备用。

1.hrh 7DNA的获得

利用H重组质粒作为模板，设计与HSA基因含有相同碱基的上游引物和与HWTX-I基因含有相同碱基的下游引物，进行SOE-PCR(splicing by overlap extension，简称SOE)得到含有酶切位点的HSA基因的3’端DNA片段和编码连接肽([GlyGlyGlyGlySer]₃)及HWTX-I的DNA序列(简称hrh1基因)。

上游引物：(与HSA基因1064-1085位碱基互补)

5’-CCACTCTAGAGAAGTGCTGTGC-3’

下游引物1：(编码连接肽1-13位氨基酸)

5’-ACCGCCACTCCCTCCACCGCCTGATCCACCGCCACCAGATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3’

下游引物2：(HWTX-I的1-11位氨基酸+连接肽)

5’-TGGAGTACAAGCGTCGAAAACACCTTTACAAGCTCCACCACCGCCACTCCCTCCACCGC-3’

下游引物3：(HWTX-I的12-24位氨基酸)

5’-GTCAGAGCAGACTCTGTTTGGACAACACTCGTTCTTACCTGGAGTACAAGCGTCGAAAA-3’

下游引物4：(保护基+酶切位点+终止密码子+HWTX-I的25-33位氨基酸、保护基、酶切位点、终止)

5’-CCCGAATTCTTACAACTTCCACTTACACCACTTGTGCTTGTCAGAGCAGACTCTGTTTG-3’

引物委托上海英俊生物公司合成。PCR方法为：以设计好的上下游引物和H重组质粒，制备hrh1基因，共进行PCR反应四轮，每轮的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，配胶时加入Goldview染色，电泳缓冲液为TAE，电压8V/cm，电泳后用紫外分析仪观察。切下所需DNA片段的凝胶条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收后作为下一轮的模板(以下简称模板1，2，3)，每轮反应体系均为50μl。PCR反应体系1：40.5μl双蒸水，5μl 10×Pfu buffer，1μl4×dNTPmix(10mmol/L)，0.5μl上游引物(50μmol/L)，0.5μl下游引物1(50μmol/L)，2μl模板(H重组质粒)，0.5μl Pfu DNA聚合酶(5U/μl)(dNTP、反应缓冲液、Pfu DNA聚合酶均为上海申能博彩生物科技有限公司产品)，94℃预变性5min，94℃×30S，55℃×30S，72℃×2min，25个循环，72℃×10min。PCR反应体系2：40.5μl双蒸水，5μl 10×Pfu buffer，1μl4×dNTPmix(10mmol/L)，0.5μl上游引物(50μmol/L)，0.5μl下游引物2(50μmol/L)，2μl模板1，0.5μl Pfu DNA聚合酶(5U/μl)，94℃预变性5min，94℃×30S，55℃×30S，72℃×2min，25个循环，72℃×10min。PCR反应体系3：40.5μl双蒸水，5μl 10×Pfu buffer，1μl4×dNTPmix(10mmol/L)，0.5μl上游引物(50μmol/L)，0.5μl下游引物3(50μmol/L)，2μl模板2，0.5μl Pfu DNA聚合酶(5U/μl)，94℃预变性5min，94℃×30S，54℃×50S，72℃×2min，25个循环，72℃×10min。PCR反应体系4：40.5μl双蒸水，5μl 10×Pfu buffer，1μl4×dNTPmix(10mmol/L)，0.5μl上游引物(50μmol/L)，0.5μl下游引物4(50μmol/L)，2μl模板3，0.5μl Pfu DNA聚合酶(5U/μl)，94℃预变性5min，94℃×30S，54℃×50S，68℃×3min，25个循环，68℃×10min。四轮PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，实验结果与理论设计一致。

2.hrh2DNA的获得

利用H重组质粒作为模板，设计与HWTX-I基因含有相同基因的上游引物和与HSA基因含有相同碱基的下游引物，进行SOE-PCR得到含有酶切位点的HSA基因的5’端DNA片段和编码连接肽([GlyGlyGlyGlySer]₃)及HWTX-I的DNA序列(简称hrh2基因)。

上游引物1：(编码连接肽的1-12位氨基酸+HSA基因的1-25)

5’-TGGCGGTGAGGGAGGTGGCGGACTAGGTGGCGGTGGGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’

上游引物2：(HWTX-I的22-33位氨基酸+连接肽(Gly)2)

5’-TGTAGTGATAAACACAAGTGGTGCAAATGGAAGAGGTGGTGGCGGTGAGGGAGGTGGCG-3’

上游引物3：(HWTX-I的9-21位氨基酸)

5’-TGCACACCTGGAAAGAATGAGTGCTGTCCAAACCGTGTTTGTAGTGATAAACACAAGTG-3’

上游引物4：(保护基+酶切位点+起始密码子+HWTX-I的1-8位氨基酸)

5’-CGGGATCCCGAUGGCATGCAAAGGGGTCTTCGATGCATGCACACCTGGAAAGAATGA-3’

下游引物：(HSA基因的1059-1084位碱基互补)

5’-CTTCTCTAGAGTGGTTTCATATGTC-3’

引物委托上海英俊生物公司合成。PCR方法为：以设计好的上下游引物和H重组质粒，制备hrh2基因，共进行PCR反应四轮，每轮的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，配胶时加入Goldview染色，电泳缓冲液为TAE，电压8V/cm，电泳后用紫外分析仪观察。切下所需DNA片段的凝胶条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收后作为下一轮的模板(以下简称模板1，2，3)，每轮反应体系均为50μl。PCR反应体系1：40.5μl双蒸水，5μl 10×Pfu buffer，1μl4×dNTPmix(10mmol/L)，0.5μl上游引物1(50μmol/L)，0.5μl下游引物(50μmol/L)，2μl模板(H重组质粒)，0.5μl Pfu DNA聚合酶(5U/μl)(dNTP、反应缓冲液、Pfu DNA聚合酶均为上海申能博彩生物科技有限公司产品)，94℃预变性5min，94℃×30S，55℃×30S，72℃×3min，25个循环，72℃×10min。PCR反应体系2：40.5μl双蒸水，5μl 10×Pfu buffer，1μl4×dNTPmix(10mmol/L)，0.5μl上游引物2(50μmol/L)，0.5μl下游引物(50μmol/L)，2μl模板1，0.5μl Pfu DNA聚合酶(5U/μl)，94℃预变性5min，94℃×30S，55℃×30S，72℃×3min，25个循环，72℃×10min。PCR反应体系3：40.5μl双蒸水，5μl 10×Pfu buffer，1μl4×dNTPmix(10mmol/L)，0.5μl上游引物3(50μmol/L)，0.5μl下游引物(50μmol/L)，2μl模板2，0.5μl Pfu DNA聚合酶(5U/μl)，94℃预变性5min，94℃×30S，54℃×50S，72℃×2min，25个循环，72℃×10min。PCR反应体系4：40.5μl双蒸水，5μl 10×Pfu buffer，1μl4×dNTPmix(10mmol/L)，0.5μl上游引物4(50μmol/L)，0.5μl下游引物(50μmol/L)，2μl模板3，0.5μl Pfu DNA聚合酶(5U/μl)，94℃预变性5min，94℃×30S，54℃×50S，68℃×3min，25个循环，68℃×10min。四轮PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，实验结果与理论设计一致。

3.hrh 3DNA的获得

利用H重组质粒作为模板，设计与HSA基因含有相同碱基的上游引物和与HWTX-I基因含有相同碱基的下游引物，进行SOE-PCR得到含有酶切位点的HSA基因的3’端DNA片段和HWTX-I的DNA序列(简称hrh3基因)。

上游引物(与HSA基因1064-1085位碱基互补)：

5’-CCACTCTAGAGAAGTGCTGTGC-3’

下游引物1：(HWTX-I的1-11位氨基酸)：

5’-TGGAGTACAAGCGTCGAAAACACCTTTACAAGCTAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3’

下游引物2：(HWTX-I的12-24位氨基酸)：

5’-GTCAGAGCAGACTCTGTTTGGACAACACTCGTTCTTACCTGGAGTACAAGCGTCGAAAA-3’

下游引物3：(保护基+酶切位点+终止密码子+HWTX-I的25-33位氨基酸、保护基、酶切位点、终止)：

5’-CCCGAATTCTTACAACTTCCACTTACACCACTTGTGCTTGTCAGAGCAGACTCTGTTTG-3’

引物委托上海英俊生物公司合成。PCR方法为：以设计好的上下游引物和H重组质粒，制备hrh3基因，共进行PCR反应三轮，每轮的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，配胶时加入Goldview染色，电泳缓冲液为TAE，电压8V/cm，电泳后用紫外分析仪观察。切下所需DNA片段的凝胶条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收后作为下一轮的模板(以下简称模板1，2)，每轮反应体系均为50μl。PCR反应体系1：40.5μl双蒸水，5μl 10×Pfu buffer，1μl4×dNTPmix(10mmol/L)，0.5μl上游引物(50μmol/L)，0.5μl下游引物1(50μmol/L)，2μl模板(H重组质粒)，0.5μl Pfu DNA聚合酶(5U/μl)(dNTP、反应缓冲液、Pfu DNA聚合酶均为上海申能博彩生物科技有限公司产品)，94℃预变性5min，94℃×30S，55℃×30S，72℃×2min，25个循环，72℃×10min。PCR反应体系2：40.5μl双蒸水，5μl 10×Pfu buffer，1μl4×dNTPmix(10mmol/L)，0.5μl上游引物(50μmol/L)，0.5μl下游引物2(50μmol/L)，2μl模板1，0.5μl Pfu DNA聚合酶(5U/μl)，94℃预变性5min，94℃×30S，55℃×30S，72℃×2min，25个循环，72℃×10min。PCR反应体系3：40.5μl双蒸水，5μl 10×Pfu buffer，1μl4×dNTPmix(10mmol/L)，0.5μl上游引物(50μmol/L)，0.5μl下游引物3(50μmol/L)，2μl模板2，0.5μl Pfu DNA聚合酶(5U/μl)，94℃预变性5min，94℃×30S，54℃×50S，68℃×3min，25个循环，68℃×10min。三轮PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，实验结果与理论设计一致。

实施例2：pPIC9K质粒的获得

由本实验室构建的含有pPIC9K/HSA质粒的E.coli中获得。

平板划线法接种含pPIC9K质粒的E.coli菌株，挑取边缘整齐、形状饱满的单菌落，接入含氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃，200r/min振摇过夜。采用前述的碱裂解法抽提pPIC9K质粒，置于-20℃冷冻保存备用。

实施例3：hrh1基因、hrh2基因、hrh3基因、H重组质粒和pPIC9K质粒的酶切

根据实施例1获得的hrh1、hrh2基因和hrh3基因，分别与实施例1提到的H重组质粒，和实施例2中获得的pPIC9K质粒进行酶切，获得重组pPIC9K/HSA-[Gly₄Ser]₃-HWTX-I质粒、pPIC9K/HWTX-I-[Gly₄Ser]₃-HSA质粒和pPIC9K/HSA-HWTX-I质粒的片段。

1.hrh1基因、H重组质粒和pPIC9K质粒的酶切

酶切方法：hrh1基因用Xba I和EcoR I双酶切，H重组质粒用BamH I和Xba I双酶切，pPIC9K质粒用BamH I和EcoR I双酶切(Xba I、EcoR I、BamH I均为MBI Fermentas公司产品)。hrh基因的Xba I和EcoR I双酶切反应体系：8μl 2×Tango buffer，29μl hrh1基因，2μl Xba I(10U/μl)，1μl EcoR I(10U/μl)。H重组质粒的BamH I和Xba I双酶切体系：5μl2×Tango buffer，43μl H重组质粒，1μl Xba I(10U/μl)，1μl BamH I(10U/μl)。pPIC9K质粒的BamH I和EcoR I双酶切体系：10μl 2×Tango buffer，37μl pPIC9K质粒，2μl BamH I(10U/μl)，1μl EcoR I(10U/μl)。上述酶切体系于37℃反应9h，hrh1基因酶切体系用DNA回收纯化试剂盒回收酶切片段；H质粒和pPIC9K质粒酶切体系进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳缓冲液为TAE，电压8V/cm，电泳后用紫外分析仪观察。切下所需DNA片段的凝胶条带，用DNA凝胶回收试剂盒回，收获得hrh1基因酶切产物与H质粒酶切回收的小片段1，pPIC9K质粒酶切回收的大片段。

2.hrh2基因、H重组质粒和pPIC9K质粒的酶切

酶切方法：hrh2基因用Xba I和BamH I双酶切，H重组质粒用Xba I和EcoR I双酶切，pPIC9K质粒用BamH I和EcoR I双酶切(Xba I、EcoR I、BamH I均为MBI Fermentas公司产品)。hrh2基因的Xba I和EcoR I双酶切反应体系：8μl 2×Tango buffer，29μl hrh2基因，2μl Xba I(10U/μl)，1μl EcoR I(10U/μl)。H重组质粒的Xba I和EcoR I双酶切：5μl 2×Tangobuffer，43μl H重组质粒，1μl Xba I(10U/μl)，1μl EcoR I(10U/μl)。pPIC9K质粒的BamH I和EcoR I双酶切体系：10μl 2×Tango buffer，37μl pPIC9K质粒，2μl BamH I(10U/μl)，1μlEcoR I(10U/μl)。上述酶切体系于37℃反应9h，hrh1基因酶切体系用DNA回收纯化试剂盒回收酶切片段；H质粒和pPIC9K质粒酶切体系进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳缓冲液为TAE，电压8V/cm，电泳后用紫外分析仪观察。切下所需DNA片段的凝胶条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收，收获得hrh2基因酶切产物与H质粒酶切回收的小片段2，pPIC9K质粒酶切回收的大片段。

3.hrh3基因、H重组质粒和pPIC9K质粒的酶切

与本实施例中1的方法相同，hrh3基因酶切回收后获得hrh3基因酶切产物，H质粒酶切回收后获得H质粒小片段1，pPIC9K质粒酶切回收后获得pPIC9K质粒大片段。

实施例4：重组pPIC9K/HSA-[Gly₄Ser]₃-HWTX-I质粒、pPIC9K/HWTX-I-[Gly₄Ser]₃-HSA质粒和pPIC9K/HSA-HWTX-I质粒构建及转化

1.重组pPIC9K/HSA-[Gly₄Ser]₃-HWTX-I质粒的构建

以实施例3中获得的hrh1基因酶切产物与H质粒酶切回收的小片段1，pPIC9K质粒酶切回收的大片段进行连接，构建重组pPIC9K/HSA-[Gly₄Ser]₃-HWTX-I质粒。hrh1基因酶切产物与H质粒小片段1，pPIC9K质粒大片段连接体系：2.5μl hrh1基因酶切产物，2.5μl H质粒小片段，3.5μl pPIC9K质粒大片段，1μl 10×T4DNA Ligase buffer，0.5μl T4DNA Ligase(2U/μl)(DNA Ligase buffer、T4DNA Ligase均为MBI Fermentas公司产品)。连接体系于4℃放置24h，用于转化大肠杆菌DH5α。

2.重组pPIC9K/HWTX-I-[Gly₄Ser]₃-HSA质粒的构建

以实施例3中获得的hrh2基因酶切产物与H质粒酶切回收的小片段2，pPIC9K质粒酶切回收的大片段进行连接，构建重组pPIC9K/HWTX-I-[Gly₄Ser]₃-HSA质粒。hrh2基因酶切产物与H质粒小片段2，pPIC9K质粒大片段连接体系：2.5μl hrh2基因酶切产物，2.5μl H质粒小片段，3.5μl pPIC9K质粒大片段，1μl 10×T4DNA Ligase buffer，0.5μl T4DNA Ligase(2U/μl)(DNA Ligase buffer、T4DNA Ligase均为MBI Fermentas公司产品)。连接体系于4℃放置24h，用于转化大肠杆菌DH5α。

3.重组pPIC9K/HSA-HWTX-I质粒的构建

与本实施例中1的方法相同，以实施例三中获得的hrh3基因酶切产物与H质粒酶切回收的小片段1，pPIC9K质粒酶切回收的大片段进行连接，构建重组pPIC9K/HSA-HWTX-I质粒。

将构建的重组pPIC9K/HSA-[Gly₄Ser]₃-HWTX-I质粒、pPIC9K/HWTX-I-[Gly₄Ser]₃-HSA质粒和重组pPIC9K/HSA-HWTX-I质粒分别转化大肠杆菌DH5α后接种于含氨苄青霉素的LB平板，挑选阳性克隆，抽提质粒，酶切鉴定，所得阳性克隆委托上海英骏生物公司测序鉴定，结果表明获得的阳性克隆大肠杆菌pPIC9K/HSA-[Gly₄Ser]₃-HWTX-I、阳性克隆大肠杆菌pPIC9K/HWTX-I-[Gly₄Ser]₃-HSA和阳性克隆大肠杆菌pPIC9K/HSA-HWTX-I与理论设计完全一致。

重组pPIC9K/HSA-[Gly₄Ser]₃-HWTX-I质粒(如图1a)、重组pPIC9K/HWTX-I-[Gly₄Ser]₃-HSA质粒(如图1b)重组和pPIC9K/HSA-HWTX-I质粒(如图1c)的构建过程如图1。

实施例5：毕赤酵母工程菌的构建及工程菌菌株的筛选

将实施例4中构建的阳性克隆大肠杆菌pPIC9K/HSA-[Gly₄Ser]₃-HWTX-I、大肠杆菌pPIC9K/HWTX-I-[Gly₄Ser]₃-HSA和大肠杆菌pPIC9K/HSA-HWTX-I分别培养扩增，分别获得纯化质粒约10μg，经Sal I酶来线性化后分别转化毕赤酵母GS115(Invitrogen Corp.USA公司酵母表达试剂盒提供的方法)，转化后的重组GS115，分别涂布MD培养基平板(2％琼脂，1.34％无氨基酸酵母氮源(YNB，Digco Cotp)，4×10^-5％生物素，2％葡萄糖)，30℃倒置培养2～5天。挑取his⁺克隆。用灭过菌的牙签将每个克隆同时点种于MM、MD(2％琼脂，1.34％无氨基酸酵母氮源(YNB，Digco Cotp)，4×10^-5％生物素，2％甲醇)平板的对应位置上，30℃倒置培养3～5天，只有在MM平板上和MD平板上同时生长的菌落大小相差不多的菌株才是Mut+表型。将获得的his+Mut+转化子分别点种于G418浓度为0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml的G418平板，30℃培养3～5天，挑选能够耐受较高浓度G418生长的转化子。挑取经筛选的单菌落，接种入含50mlYPD(1％酵母浸出粉，2％胰蛋白胨，2％葡萄糖)培养基的250ml摇瓶中，30℃，220r/min培养20h至OD₆₀₀达10～20。按照1％的接菌量将上述菌液转接至BMGY培养基(1.34％无氨基酸酵母氮源(YNB，Digco Cotp)，4×10^-5％生物素，1％酵母浸出粉，2％胰蛋白胨，10％磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1％甲醇)重悬菌体，置于30℃，220r/min摇床上继续生长，每24小时向BMGY培养基中添加甲醇至终浓度0.5％，按时间点分别取菌液样品，取样量为0.5ml，置于EP管中，离心取上清，SDS-PAGE凝胶电泳分析，筛选出表达量高的菌株，以其作为表达融合蛋白的目标菌株。

实施例6：毕赤酵母工程菌的发酵

以实施例4、5获得的表达HSA-[Gly₄Ser]₃-HWTX-I融合蛋白的工程酵母菌发酵和融合蛋白的纯化为例，其他酵母工程菌的发酵和融合蛋白的纯化可用相同或相似的方法。

从实施例5中YPD斜面培养基上挑一环菌至YPD液体培养基(1％酵母浸出粉，2％胰蛋白胨，2％葡萄糖)中，30℃，220r/min培养20小时至OD₆₀₀达10～20；将上述菌液按1％接菌量转接至50ml三角烧瓶的BMGY培养基中(1.34％无氨基酸酵母氮源(YNB，DigcoCotp)，4×10^-5％生物素，1％酵母浸出粉，2％胰蛋白胨，10％磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1％甲醇)，30℃，220r/min培养12小时，补加甲醇至终浓度0.5％，每24小时向培养基补加一次，诱导表达4-7天，8000r/min离心收集上清。

将其上清液进行SDS-PAGE电泳鉴定(如图2)，结果表明毕赤酵母菌pPIC9K/HSA-[Gly₄Ser]₃-HWTX-I表达的HSA-[Gly₄Ser]₃-HWTX-I比毕赤酵母菌pPIC9K/HWTX-I-[Gly₄Ser]₃-HSA、毕赤酵母菌pPIC9K/HSA-HWTX-I表达的HSA-HWTX-I表达量多，均一性好。结果如图2所示，其中：m，marker；1，HSA-[Gly₄Ser]₃-HWTX-I发酵液样品；2，HWTX-I-[Gly₄Ser]₃-HSA发酵液样品；3，HSA-HWTX-I发酵液样品。

实施例7：融合蛋白的纯化

收集发酵液样品，经4℃离心(8000g，10min)得上清，上清经超滤浓缩。浓缩样过Blue-Sepharose(Amershan产品)亲和色谱进行分离，上样缓冲液pH为4.0-6.0缓冲液，上样平衡后用2.0M的NaCl进行洗脱，收集含有目的蛋白的洗脱峰；超滤浓缩后用PhenylSepharose 6F.F(Amershan产品)疏水填料进行层析分离，上样缓冲液pH为6.0-8.0，平衡后用0-1.5M的缓冲液进行梯度洗脱，收集洗脱液；超滤浓缩后用DEAE sepharose(Amershan产品)阴离子交换色谱进行分离，上样缓冲液为pH为6.0-8.0，上样平衡后用0-1.0M的NaCl进行梯度洗脱，收集目的蛋白的洗脱峰，即可获得纯化的融合蛋白，SDS-PAGE分析呈电泳纯为均一条带(如图3)。

图3a为HSA-[Gly₄Ser]₃-HWTX-I融合蛋白分离纯化的SDS-PAGE图，图3b为HWTX-I-[Gly₄Ser]₃-HSA融合蛋白分离纯化的SDS-PAGE图，图3c为HSA-HWTX-I融合蛋白分离纯化的SDS-PAGE图。其中：m，marker；1，发酵液样品；2，浓缩样品；3，Blue-Sepharose亲和层析后的样品；4，Phenyl Sepharose 6F.F疏水层析后的样品；5，DEAE sepharose阴离子交换层析后的样品。

实施例8：长效镇痛肽融合蛋白在小鼠扭体实验中的镇痛作用

小鼠侧脑室给予长效镇痛肽融合蛋白。应用化学刺激剂醋酸注入小鼠腹腔，引起深部大面积持久的疼痛，导致大鼠产生扭体反应。扭体反应表现为腹部收缩、躯体弯曲、后肢伸展及蠕动等。注入镇痛药后使小鼠的扭体次数减少。在扭体实验中，小鼠给予融合蛋白20min后，腹腔注射0.6％醋酸0.4ml，5min后测定15min小鼠扭体次数，并求出各组平均值(如图4)。实验结果表明侧脑室注射长效镇痛肽融合蛋白组与盐水组相比对小鼠扭体有很好的抑制率，也有很好的剂量依赖性，提示长效镇痛肽融合蛋白在小鼠醋酸扭体模型上有很强的镇痛作用。

实施例9：长效镇痛肽融合蛋白在小鼠热板实验中的镇痛作用

小鼠侧脑室和尾静脉分别给予长效镇痛肽融合蛋白。调节热板温度为(55±0.5)℃，置小鼠于热板上，测定各小鼠的正常痛反应。以小鼠舔后足或抬后足并回头为标准，痛阈时间为5～30s为正常，60s为最大值。记录给药后不同时间(0.5，4.0，8.0，12.0，16.0，20.0，24h)的痛阈，计算给药后的可能最大镇痛百分率(PMAP)。根据不同时间的可能最大镇痛百分率(PMAP)作图(如图5)。实验结果表明尾静脉注射的长效镇痛肽融合蛋白组的镇痛作用效果不明显，可能因为长效镇痛肽融合蛋白是肽类物质，很难透过血脑屏障，而其镇痛靶位主要在中枢内的N-型电压依赖性钙通道。侧脑室注射长效镇痛肽融合蛋白组与盐水组相比对小鼠有良好的镇痛作用。提示长效镇痛肽融合蛋白在小鼠55℃热板模型上有很强的镇痛作用，且镇痛的时间与文献中虎纹镇痛肽相比得到明显延长。

实施例11：长效镇痛肽融合蛋白对正常大鼠痛阈的影响

大鼠鞘内给予长效镇痛肽融合蛋白。注射前将大鼠置于测量笼中，待其安静后，对其左足底进行机械(或热)痛阈测量，共3次，每次间隔时间为2min。记录测量数据，以其平均值作为痛阈基础值。取出大鼠，润湿腰部皮毛，按中线将其向两侧分开，以L5～L6间隙为穿刺点，常规消毒，2％利多卡因0.2mL局麻穿刺部位皮肤，同时用针尖破皮。换用微量注射器行鞘内穿刺，以落空感和鼠尾侧摆或后腿抽动为进入鞘内的标志。注射后将大鼠置于测量笼中，待其安静于注射后0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h对其左后足底进行机械(或热)痛阈测量，重复次数和间隔时间与注射前相同(如图6)。

机械痛阈测定使用足底力学感觉测量仪，仪器带有匀速上升的钝性针头，在安静大鼠左后足底加压，直到大鼠逃避性抬腿，仪器自动记录抬腿时施加于大鼠足底的力度(g)，最大碰触力经测试定为50g，运行时间10s，连续3次。热痛阈测定使用足底温觉测量仪，仪器发射红外光照射大鼠左后足底，安静大鼠逃避性抬腿时，仪器自动记录从刺激开始到抬腿时的时间，即对热刺激潜伏期的长度(s)，仪器热源的强度定为75％，测定时间上限30s。如图7实验结果显示，单次鞘内注射生理盐水组中大鼠机械痛阈值和热痛阈值均无明显变化，单次鞘内注射长效镇痛肽融合蛋白能明显提高正常大鼠机械痛阈值和热痛阈值，均提示长效镇痛肽融合蛋白在正常大鼠中有很强的镇痛作用。

SEQ ID NO：1为人血清白蛋白的基因和蛋白质序列

 

1     GAT GCA CAC AAG AGT GAG GTT GCT CAT CGG TTT AAA GAT TTG GGA  45

1     Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly  15

46    GAA GAA AAT TTC AAA GCC TTG GTG TTG ATT GCC TTT GCT CAG TAT  90

16    Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr  30

91    CTT CAG CAG TGT CCA TTT GAA GAT CAT GTA AAA TTA GTG AAT GAA  135

31    Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu  45

136   GTA ACT GAA TTT GCA AAA ACA TGT GTT GCT GAT GAG TCA GCT GAA  180

46    Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu  60

181   AAT TGT GAC AAA TCA CTT CAT ACC CTT TTT GGA GAC AAA TTA TGC  225

61    Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys  75

226   ACA GTT GCA ACT CTT CGT GAA ACC TAT GGT GAA ATG GCT GAC TGC  270

76    Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys  90

271   TGT GCA AAA CAA GAA CCT GAG AGA AAT GAA TGC TTC TTG CAA CAC  315

91    Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His  105

316   AAA GAT GAC AAC CCA AAC CTC CCC CGA TTG GTG AGA CCA GAG GTT  360

106   Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val  120

361   GAT GTG ATG TGC ACT GCT TTT CAT GAC AAT GAA GAG ACA TTT TTG  405

121   Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu  135

406   AAA AAA TAC TTA TAT GAA ATT GCC AGA AG ACAT CCT TAC TTT TAT  450

136   Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr    150

451   GCC CCG GAA CTC CTT TTC TTT GCT AAA AGG TAT AAA GCT GCT TTT    495

151   Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe    165

496   ACA GAA TGT TGC CAA GCT GCT GAT AAA GCT GCC TGC CTG TTG CCA    540

166   Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro    180

541   AAG CTC GAT GAA CTT CGG GAT GAA GGG AAG GCT TCG TCT GCC AAA    585

181   Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys    195

586   CAG AGA CTC AAG TGT GCC AGT CTC CAA AAA TTT GGA GAA AGA GCT    630

196   Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala    210

631   TTC AAA GCA TGG GCA GTA GCT CGC CTG AGC CAG AGA TTT CCC AAA    675

211   Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys    225

676   GCT GAG TTT GCA GAA GTT TCC AAG TTA GTG ACA GAT CTT ACC AAA    720

226   Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys    240

721   GTC CAC ACG GAA TGC TGC CAT GGA GAT CTG CTT GAA TGT GCT GAT    765

241   Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp    255

766   GAC AGG GCG GAC CTT GCC AAG TAT ATC TGT GAA AAT CAA GAT TCG    810

256   Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser    270

811   ATC TCC AGT AAA CTG AAG GAA TGC TGT GAA AAA CCT CTG TTG GAA    855

271   Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu    285

856   AAA TCC CAC TGC ATT GCC GAA GTG GAA AAT GAT GAG ATG CCT GCT    900

286   Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala    300

901   GAC TTG CCT TCA TTA GCT GCT GAT TTT GTT GAA AGT AAG GAT GTT    945

301   Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val    315

946   TGC AAA AAC TAT GCT GAG GCA AAG GAT GTC TTC CTG GGC ATG TTT    990

316   Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe    330

991   TTG TAT GAA TAT GCA AGA AGG CAT CCT GAT TAC TCT GTC GTG CTG    1035

331   Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu    345

1036  CTG CTG AGA CTT GCC AAG ACA TAT GAA ACC ACT CTA GAG AAG TGC    1080

346   Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys    360

1081  TGT GCC GCT GCA GAT CCT CAT GAA TGC TAT GCC AAA GTG TTC GAT    1125

361   Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp    375

1126  GAA TTT AAA CCT CTT GTG GAA GAG CCT CAG AAT TTA ATC AAA CAA    1170

376   Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln    390

1171  AAT TGT GAG CTT TTT GAG CAG CTT GGA GAG TAC AAA TTC CAG AAT    1215

391   Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn    405

1216  GCG CTA TTA GTT CGT TAC ACC AAG AAA GTA CCC CAA GTG TCA ACT    1260

406   Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr    420

1261  CCA ACT CTT GTA GAG GTC TCA AGA AAC CTA GGA AAA GTG GGC AGC    1305

421   Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser    435

1306  AAA TGT TGT AAA CAT CCT GAA GCA AAA AGA ATG CCC TGT GCA GAA    1350

436   Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu    450

1351   GAC TAT CTA TCC GTG GTC CTG AAC CAG TTA TGT GTG TTG CAT GAG  1395

451    Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu  465

1396   AAA ACG CCA GTA AGT GAC AGA GTC ACC AAA TGC TGC ACA GAA TCC  1440

466    Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser  480

1441   TTG GTG AAC AGG CGA CCA TGC TTT TCA GCT CTG GAA GTC GAT GAA  1485

481    Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu  495

1486   ACA TAC GTT CCC AAA GAG TTT AAT GCT GAA ACA TTC ACC TTC CAT  1530

496    Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His  510

1531   GCA GAT ATA TGC ACA CTT TCT GAG AAG GAG AGA CAA ATC AAG AAA  1575

511    Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys  525

1576   CAA ACT GCA CTT GTT GAG CTC GTG AAA CAC AAG CCC AAG GCA ACA  1620

526    Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr  540

1621   AAA GAG CAA CTG AAA GCT GTT ATG GAT GAT TTC GCA GCT TTT GTA  1665

541    Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val  555

1666   GAG AAG TGC TGC AAG GCT GAC GAT AAG GAG ACC TGC TTT GCC GAG  1710

556    Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu  570

1711   GAG GGT AAA AAA CTT GTT GCT GCA AGT CAA GCT GCC TTA GGC TTA  1755

571    Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln AlaAla Leu Gly Leu

 

SEQ ID NO：2为虎纹镇痛肽的基因和氨基酸序列

1      GCA TGC AAA GGG GTC TTC GAT GCA TGC ACA CCT GGA AAG AAT GAG  45

1      Ala Cys Lys Gly Val Phe Asp Ala Cys Thr Pro Gly Lys Asn Glu  15

46   TGC TGT CCA AAC CGT GTT TGT AGT GAT AAA CAC AAG TGG TGC AAA    90

16   Cys Cys Pro Asn Arg Val Cys Ser Asp Lys His Lys Trp Cys Lys    30

91   TGG AAG   96

31   Trp Lys   32

Claims (9)

1.一种长效镇痛肽融合蛋白，它包括序列表中SEQ ID No：1血清白蛋白的第一区，连接在血清白蛋白C-末端的序列表中SEQ ID No：2的第二区；或者序列表中SEQ ID No：1血清白蛋白的第一区，连接在血清白蛋白N-末端的序列表中SEQ ID No：2的第二区，所述的长效镇痛肽融合蛋白由上述第一区和第二区同时连接构成。

2.权利要求1所述的长效镇痛肽融合蛋白，其特征是：所述的长效镇痛肽融合蛋白包括与序列表中SEQ ID No：1血清白蛋白氨基酸序列相同的第一区，连接在血清白蛋白C-末端的与序列表中SEQ ID No：2虎纹镇痛肽氨基酸序列相同的第二区。

3.权利要求1所述的长效镇痛肽融合蛋白，其特征是：所述的长效镇痛肽融合蛋白包括与序列表中SEQ ID No：1血清白蛋白氨基酸序列相同的第一区，连接在血清白蛋白N-末端的与序列表中SEQ ID No：2虎纹镇痛肽氨基酸序列相同的第二区。

4.根据权利要求1所述的长效镇痛肽融合蛋白，其特征是：所述血清白蛋白的第一区与连接在血清白蛋白的C-末端的与序列表中SEQ ID No：2虎纹镇痛肽氨基酸序列相同的第二区，血清白蛋白的第一区与连接在血清白蛋白的N-末端的与序列表中SEQ ID No：2虎纹镇痛肽氨基酸序列相同的第二区之间设有连接肽，所述的连接肽的通式是[GlyGlyGlyGlySer]_n，n为3。

5.根据权利要求1、2、3、或4所述的长效镇痛肽融合蛋白，其特征是：携带融合蛋白基因序列的重组表达载体是pPIC9或pPIC9K。

6.根据权利要求1、2、3、或4所述的长效镇痛肽融合蛋白，其特征是：表达融合蛋白的宿主是细菌、酵母、动物细胞、植物细胞或含有本发明融合蛋白基因序列的转基因动、植物中的任一种。

7.根据权利要求6所述的长效镇痛肽融合蛋白，其特征是：表达融合蛋白的宿主是毕赤酵母。

8.根据权利要求1、2、3、或4中任一项所述的长效镇痛肽融合蛋白用于制备治疗各种疼痛的药物的用途。

9.根据权利要求8所述的长效镇痛肽融合蛋白用于制备治疗各种疼痛的药物的用途，其中的疼痛包括癌症或晚期艾滋病等引起的疼痛、严重慢性疼痛、术中或术后等中的各种疼痛。

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