JPH022383A - 遺伝子操作による百日ぜきトキシンの無毒化 - Google Patents

遺伝子操作による百日ぜきトキシンの無毒化

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JPH022383A
JPH022383A JP63297152A JP29715288A JPH022383A JP H022383 A JPH022383 A JP H022383A JP 63297152 A JP63297152 A JP 63297152A JP 29715288 A JP29715288 A JP 29715288A JP H022383 A JPH022383 A JP H022383A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、パルタシス毒素の生物学的活性に不可欠の
一種以上のアミノ酸残渣のコーティングのためのＤＮＡ
体節の発生学的な取り扱いによるバルタシス毒素の発生
学的解毒の新規方法に関し解毒された該バルタシス毒を
生産する生物学的に変成されたボルデテラ・パルタシス
・パクテ１ノアの創出用の手順にも関する。
［従来の技術Ｊ 百日咳、即ち、バルタシスはボルデテラ・パルタシスの
空気伝染による幼児と若年児童の激しく、高度に伝染性
の呼吸器系の病気である。
この器官、生命体機構にかかわる多くの病毒性の因子に
起因して、この病気の疾病発主論はまた充分に解明され
ていない。
しかしながら、主要な全身的症状はバルタシス毒（ＰＴ
）に原因していると一般に認識されている。
この物質はリンホシトシス促進因子、ヒスタミン感受性
因子、およびアイリット活性化蛋白質などの別名で呼ば
れており、広妃囲の生物学的な活性を示す。
これらの影響の多くはアデノシンジホスフェート（ＡＯ
Ｐ）−リボシルトランスフェラーセとして、その生化学
的作用を伴う。
ある受容体グワノシン・トリフオスフェート・結合蛋白
質のＡＤＰリポシレージョンは環式アデノシン・モノフ
ォスフェートと、フオスフオリパセＣにより媒介される
種々の代謝経路上においてコントロール喪失へ導く。
蛋白質受容体の不在では、百日咳毒はニコチンアミド・
アデニン・ディニュウクレオタイド（ＮＡＤグリコハイ
ドロラーゼ活性）の加水分解にも触媒作用を及ぼす。
従来の殺滅合胞パルタシス・ワクチンは抗原群の混合物
を含有し、特別の防御的抗原を包含する限定された無脂
ワクチンの生育に対し多くの仕事をした。
ＰＴは最も重要な抗原である。
考慮下の他の抗原はアグルーティノゲシ類とフィラメン
タス・ヘマグルティニン（ＦＨＡ　）である。
正常には、ＰＴと他の抗原は、ホルムアルデヒド、ゲル
タールアルデヒドか、過酸化水素などのような薬品を使
用して化学的に不活性化か変性毒素化される。
このアプローチは、あまりに過多であり、過小な化学的
改修の間に、微妙な均衡を探索しなければならない重大
な不利！ｉを有しでいる。
処理が不充分であれば、ＰＴを含む未変化の病毒性因子
の小部分の残存によりワクチンは残留毒性を保持し得る
。
処理が過剰であれば、その本来の免疫原決定素はマスク
を掛けられるか、破壊されることに原因して、ワクチン
は効能を喪失する。
触媒的サブユニットが比較的にアルデヒド類により不活
性化されることが困難であるから、ＰＴの場合には、こ
の問題は特別の重要性がある。
可能残留毒性、あるいは変性毒素化された合胞パルタシ
ス・ワクチンの逆転（隔世遺伝）は多年疑問視されてき
たし、稀少ケースにおいては、このワクチンが神経学的
損傷の原因となり得るのではないかと示唆されでいる。
現在、使用されでいるか、試用段階にある全てのパルタ
シス・ワクチンは、以上に述べた問題を導入する化学的
手段による抗原の不活′ｉ化に依存している。
もし、変性毒素化法へ不依存の免疫原的・防御的エビト
ウブズの生来の構造を保存して、不活性化ワクチンが設
計されるならば、割増し的等級の安全と効能が付加され
ることは自明である。
これらの理由により、発明者らはＰＴ用の遺伝子コーテ
ィングを発生学的に取り扱い、非毒性のＰ丁同族体８８
！す６バルタシスのストレインを構成した。
それの構造的組繊においで、ＰＴはＡＤＰ−リボシルト
ランスフェラーゼ・バクテリアの毒素の一族に屈し、こ
の−族はジフテリア毒素、ブンイドモナス・アエルギノ
サ、エキソトキシンＡ、クロレラ・トキシン、およびエ
シエリシ？・コリ熱不安定トキシンも包含している。
従って、ＰＴは二つの機能的な部分、その一つのＡ部分
は酵素的活性を担持し、他の８部分はホスト細胞に結合
し、その活動位置へＡ部分の転座させる。
ＰＴ中においで、Ａ部分は分離したサブユニットであり
、通常、Ｓｌと表示される。
Ｏｆｆ分は二つのダイマーとしてアレンジされた五つの
ポリペブタイトの電子対非共有オリゴマであり、サブユ
ニットＳ２◆３４　　とサブユニットＳ３　＋Ｓ４　　
それぞれを含み、結合サブユニットＳ５によりとも支持
されでいる。
Ｓｌ　　サブユニットのアミノ酸の連鎖は利益の数種の
特長を現させる。
一つのイントラチエイン・ジスルフィド・ボンドを形成
する二つのシスティン残渣のみが、存在する。
しかしながら、これら残渣の重要性が示され、酵素活性
のためにその毒素は減少させられるべきであることが知
られている。（モスら、Ｊ、Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、２５８，１１８７２．　　［１９８３］）Ｓ
１の中に二つのトリプトファンがあり、ジフテリア毒素
とＰ、アエルギノサ　エキソトキシンＡのＮＡＤ結合位
百にトリプトファン残渣は近接していると示唆された。
Ｓ１中に保存された二つの部分が、クロレラ毒素とＥ、
コリ熱不安定毒素のアミノ酸の連鎖中にも発見された。
（ロホトとカイス、Ｓｃ　１ｅｎｃｅ　、　２３２１２
５８、　［＋９８６］） 更に加えて、ジフテリア毒素とＰ、アエルキノサエキソ
トキシン＾のＮＡＤ活牲位百は、グルタミン酸残渣を含
むことが示された。（キャロルとコリエール、Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、　、８１
，３３０７゜［１９８４］；　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、　２６２，８７０？、［１９８７］）上述して示した
ように、ＰＴの８部分は、その結合を細胞質のりセブタ
ーへ媒介し、二つのダイマーを含む。
これらのダイマーの各々が結合位置を支持しているか否
かは論争上にある。
しかしながら、　Ｓ２と８３サブユニツトは、アミノ酸
の連鎖中にで同様であり、結合の研究は特殊なＳ３のリ
シンおよび／もしくはチロシン残渣は、毒素とそのリセ
ブクーとの相互作用を絡み合させることを示している。
（ツギモリら、８ｉｏｃｈｅｍ、　、２５．１３５５．
　［１９８６］　；アームストロングとベラブラー、Ｉ
ｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　、　５５．１２９４．　
［１９８７］）ＮＡＤ−相互作用グルタミン酸残基にあ
１するジフテリア毒素とＰ、アエルジノーザ（Ｐ、ａｅ
ｒｕｑｉｎｏｓａ　）　Ａの位置支配突然変異生成は、
ＡＤＰ−リポシルトラスファーセ活性における重大な還
元に導ひいた。
（Ｔｗｅｔｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ、　、　　２６０１０３９２゜［１９８４］、ダグラ
ス、コリア−、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　。
＋６９４９６７、［＋９８７１）、　　ＳｔおよびＳ２
　（７）完全切形の型はＥ、ｃｏｌｉに象徴されでいる
。　（Ｌｏｃｈｔ　ｅｔａｌ、、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉ
ｍｍｕｎ、、５５，２５４６．　［１９８７］）　ＰＴ
オペロンの突然変異は転換挿入により発生し、遺伝子切
断またはリンカ−挿入は、対立遺伝子の交換により、Ｂ
、ベルタシス（３，ｐＢｒｔｕｓｓｉｓ　）の染色体に
導入されでいる（ブラック等、＾ｎｎ、５ｃｌａｖｏ　
、１７５゜［１９８６］；ブラックとファルコウ、　Ｉ
ｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、。
５５．２４６５．［＋９８７］）　、　シかしながら、
十分にアセンブルされた再結合の完全毒素の生物学的及
び免疫保護的な特性が、活性アミノ酸残基の位置支配突
然変異生成により特異的に解毒されることは報告されで
いない、安全で有効なベルタシスワクチンにおける含有
物のためのこのようなＰＴ　ｍ似物の産出がこの発明の
主題である。
保護ワクチンのための候補となりつる物の有効性と毒性
に対する試験において、試みることが有効な多くのｉｎ
　ｖｉｖｏおよびｉｎ　ｖｉｔｒｏがある。効力の標準
試験はマウスプロテクションテストであり、生きた８、
ベルタシスをもつイントラセレブラルチャレンジを含ん
でいる。新規ワクチンテストは、保護抗体の生成の測定
である６通常の毒性試験はＣＨＯ（チャイニーズハムス
ターの卵巣）細胞の集団的検定であり、ＡＤＰ−リボシ
ルトランスフアゼと毒素の結合能力の両方を反映するこ
とである。（バーン等、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、
、５５．２４［＋９８７］）。ＰＴの酵素活性の直接試
験はウシ科トランスデユーシンのＡＤＰ−リポシレージ
ョンである（つオルキンス等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ
ｍ、、　２６０．１３４７８［＋９８５］） ［発明の構成Ｊ 本発明によれば、ＰＴ解毒の新規方法を供給しでおり、
従来技術の化学的方法の欠点に悩むことなく、好ましく
ない位置効果を有することなしにその免疫特性を保つ解
毒されたＰＴを依然として与えでいる０本発明においで
、その機能的な毒素活性にきわめて重大である毒素のア
ミノ酸残基は、確認される。これら残基は分離された毒
素遺伝子の位置支配突然変異生成によりその後除去ある
いは交換される。このような操作から得られる突然変異
した毒素オペロンは次に生体内の本来の遺伝子へＭ換さ
れ、普通の生長条件下で毒′ｌ！を減じた毒素をそれに
よつ生する０本方法において、ＰＴ類似物の三次元構造
とこのような免疫原性は最小に弱められる。実際は、そ
れ自身上の毒素の特有の突然変異形態は、他の要素がそ
れ自身のバクテリア感染に対する抵抗性を確立すること
を必要とするかもしれないにもかかわらず、ベルタシス
のきびしい徴候に対して十分な保護性を与えるかもしれ
ない。
それゆえ、本発明の一局面に従って、ベルタシス毒素の
免疫保護的な遺伝子的に解毒をされた突然変異体を与え
でいる。ここで用いられている［遺伝子的に解毒Ｊとい
う言葉は、本来の毒性の約１χまたはそれ未満、好まし
のは約０．５χ未満の残存毒性をもつペルタシス毒素突
然変異体を意味する。残存毒性はＣＨＯ細胞の群牲検定
およびＡＤＰリポシルトランスフアーゼの活性により決
定される。
本発明の他の局面に従って、ベルタシス毒素またはトキ
ソイドの免疫保護的突然変異体およびそれに代る生理学
的受容キャリアの免疫学的効果■ヲ包含しでいるボルデ
テラ・ペルタシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ−凹工あ」且
■）に対するワクチンを与えでいる。遺伝子的に解毒さ
れたベルタシス毒素もまた、毒素に無関係な抗原デテル
ミナントに対する接合ワクチンを作るためのへブタン、
多糖類またはペプチドのためのキャリア蛋白として使わ
れるかもしれない。
本発明ざらなる局面は、突然変異体の生成方法を与えて
あつ、毒素に毒性を与える毒素の少なくとも１つのアミ
ノ酸残基を確認すること、少なくとも１つのこような残
基を除去または変換するため、および突然変異した毒素
オペロンを生成するための毒素原の位置支配突然変異生
成をもたらすこと、ボルデテラ・ペルタシス有機体中の
本来の遺伝子へ突然変異した毒素オペロンを言損するこ
と、および、免疫保護的、遺伝子的に解毒された毒素を
生成するための変形有機体を生長させることを含んでい
る。
以下の詳述からも明らかとなるように、本発明は更に、
ここで与えられたような突然変異体遺伝子により毒素オ
ペロンが除去され、あるいは交換されることからボルデ
テラ・ベルタシスの新規な菌株を与える。
Ｂび＝相似体が、順々にほぼ同一であることは知られて
いる（Ｎｏｃｏｓｉａ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔ、　Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、、　　　Ｕ、Ｓ、Ａ、　　、８３．　４６３１
．　　［１９８６］　　；　　　Ｌｏｃｈｔ　　＆Ｋｅ
ｉｔｈ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３２１２５８．　［１
９８６］）　。
ＴＯＸ工・ローカス（Ｌｏｃｕｓ）は、５′　−フラン
キングシーフェンス、プロモークーレジオン、全てのＰ
Ｔサブユニットに対するストラクチャルゲンおよび３゛
フランキングシークエンス、をエンコードするＥｃｏＲ
Ｉの裂けた位置にて始まるＤＮＡフラグメントとしで、
ここで定義される。Ｂ、バー　ツ　シス＋０５３６から
のＴＯＸ−ゲンは（それは発明者によって使用されるス
トレインである）、閉じられるか、続けられる。その核
酸シーフェンスは、他のパブリッシュドシークエンスと
高い同一性を示すことが発見され、それはへ−ス１とし
て定義されるＥｃｏＲＩの位置の６からの４つのユニー
クなベスの異なる流れと共にある。完全なヌクレチドと
ストラクチャルゲンの対応するアミノ酸シークエンスと
は第５図に示される。
４．６　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ、　ＢａｍＨＩフラグメント
としてのｐＵｃ８・２の中にクローンされたポーデー−
・パーツ＞２（８ｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｉ
ｓ）１０５３６！含むクローンＪ−１６９−１のプラス
ミドＤＮＡは、１９８８年１１月２４日に米国番号　　
　として、ロヒどル、メリーランド、アメリカ（Ｒｏｃ
ｈｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ、　Ｕ、Ｓ、Ａ）の
アメリカンタイプカルチャーコレクション（＾ＴＣＣ）
に寄託されでいる。
ポジション３１５のＴは、ストレイン＋０５３６に対し
てユニークであり、ポジション７１０．１２００　Ｅよ
び１２０２のＳ１ゲンの中には３つの違いが有り、それ
ぞれマチュア（ｍａｔｕｒｅ）　Ｓｔシークエンスのポ
ジション３４および１９８に、グルタミン酸およびバリ
ン（ｖａｌｉｎｅ）の２つのユニークなアミノ酸に帰着
する。プロモーターレジオンの中の様々な変種のせいで
、日、バーパーツシス（ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）
およびＢ、ブロンヒセブチカ（ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔ
ｉｃａ）のトキシンゲンは明示されない（＾ｒｉｃｏ　
＆　Ｒａｐｐｕｏｌｉ、Ｊ、Ｂａｃｔ−ｅｒｊｏｌ、、
　１６９　２３４９．［１９８７］）　、これは、スク
リーニングの目的のマチュアされたトキシンゲンの表示
ため、ホストとしでＢ、パラパーツシス使用を認める。
発明者は、Ｓ１内、特にＮＡＤハイトロリシス（ポジシ
ョン１２９）の活性位ゴ内、のシングルアミノ酸の言換
が、寅際に、ＰＴの＾ＯＰ−リボシルトランスファラス
の活性をアプリツシュする事を示している。しかし、完
全な安全性を保証するために、ホロトキシン（ｈｏｌｏ
ｔｏｘｉｎ）のいくつかの位Ｍを変える事は望ましいで
あろう、したがって、本発明は、毒性をアポリンシュす
る、トキシンのＡｆｉよび８部の両方又は各々の中の単
独または様々なマチ−ジョン（ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）に
対しで、且つ本ニヱｌうのＴＯＸストレインのゲノムの
中に戻るこれらマチ−ジョンのレインセーション（ｒｅ
ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）に対しで適用する。
多くのストラテジ−（ｓｔｒａｔｅｑｉｅｓ）は、トキ
シンの部位を決めるため、発明者により使用されており
、そしてそれは生物学上の活性と非常に開運しており、
それ故に遺伝学的操作の為のキャンデイディト・サイト
（ｃａｎｄｉｄａｔｅ　５ｉｔｅｓ）　＠含む。
ＰＴは、８．パーツシスの培養のスーパーナタント（Ｓ
ｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ）から得られる（ストレイン＋
０５３６）。クルード（ｃｒｕｄｅ）の２液は、ウルト
ラフィルトレージョンによって濃縮され、フェトウィン
−アガロス・アフィニティ・カラム（ｆｅｔｕｉｎ　−
ａ９ａｒｏｓｅ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃｏｌｕｍｎ）に
通されてＰＴを吸着させる。　ＰＴは、チオシアン酸カ
リウムを用いて洗浄されたカラムから溶出し、リン酸塩
−サイライン（ｓａｌｉｎｅ　）メディウムの中で透析
される。この段階においで、ナトリウム・ドデシル硫酸
塩−ポリアクリルアミドゲル レシス（　ＳＯＳ−ＰＡＧＥ　）分析により測定した純
度は９０〜９５χであった．主な汚染物はＦＨＡであっ
た．更なる精製は、ヒドロキシリン灰石カラムを通すク
ロマトグラフィーにより達成され、９９χを越える純度
の物質が得られた。
Ｓ１サブユニツトのＮＡＤとの相互作用を示す位置は、
ニコチンアミドカルボニル基またはアデニン部のどちら
か一方がラベルされた［　”Ｃ　］　ＮＡ［ｌ　を用い
、単離精製されたＳｌとＮＡＤとを光架橋させることに
より決定される．ラジオラベルは、ニコチンアミド部か
ら、たんば〈貢の中へ、効果的に吸収される．そのたん
ば〈貢は、トリプシンと共にダイジェストされ、ＨＰＬ
Ｃカラムにでクロマトグラフされ、２つのメジャーな放
射性ペプチドを与える．精製の後、その２つのトリブテ
ィ・ンク（　ｔｒｙｐｔｉｃ　）のペプチドは、シーフ
ェンスされ、マチニアＳ１の１１８−１３２の残分に対
応する最初の１５の残分となった．両方のペプチドにお
いて、放射性は、マチニアの３１のホジション１２９に
対応する年回−のアミノ酸に開運してい茫．放射性は、
他のどのポジションにおいても検出されなかった。
これは、ＧＩＵＩ２１１がＮＡＤの光架橋の部位であり
、それ故にニコチンアミドの相互作用部位の重要な要素
であろうということを立証した．重要なことに、ジフテ
リアトキシンおよびＰ．アエルギノサ（　ａｅｒｌｌｇ
ｉｎｏｓａ　）エクントキシン（　ｅｘｏｔｏｘｉｎ　
）のリンケージの位置もまた、グルタミン酸残分および
、他のバクテリアトキシンの類似シーフェンスに非常に
似ているＳｌのＧＬＵ　１２ｇから始まる３つのアミノ
酸シークエンスである。
染色体のＤＮＡは、Ｂ．パーツシス（ストレイン＋０５
３６　）から得られ、且つフラグメントが数百ベースか
ら数千ベースにレンジされて得られるという方法に従い
、酵素ＥｃｏＲＩの制限と共にダイジェストされた，　
ＤＮＡフラグメントは、ＥＣ（ＩＲＩと共にダイジェス
トされ且つジフオスフオリレート（　ｄｅｐｈｏｓｐｈ
ｏｒｙｌａｔｅｄ　）されたλｃ＋ｔｌｌ　ＤＮＡとく
くられた．　ＤＮＡは、ファージ粒子の中に包まれ、９
ｔｌ　１Ｂ．パーツシスジノミツクライブラリ−として
、Ｅ．　ＣｏｌｌＶ　１０９０内に保存された．かわり
としで、Ｂ．パーツシス染色体のＤＮＡは、制限酵素Ｓ
ａｕ　３ＡＩと共にダイジェストされ、λｃｈａｒｏｎ
　３５　ＤＮＡＶ制限するＢａｍ旧と共に〈〈られた一
般的に非常に大きなりＮＡとなった．その［ｌＮＡは、
ファージ粒子の中に包まれ、λｃｈ　３５　Ｂ．パーツ
シスジノミツクライブラリ−としてＥ．ｃｏｌｉ　ＬＥ
　３９２内に保存された．これらのジノミツクライブラ
リ−は、プレートされ且つニトロセルロースフィルター
内にてプラクトランスフｐ　−（　ｐｌａｑｕｅｓ　ｔ
ｒａｎｓｆａｒｒｅｄ　）された。そのフィルターは、
ＰＴ　ＳＪサブユニットに対するオリゴヌクレオチドの
プローブ特′ケヲ用いて、ＤＮＡ雑種形成によりスクリ
ーンされた。ポジティブな班点（　ｐｌａｑｕｅｓ　）
は、ブレーティングおよび雑種形成の２つの付加ラウン
ドにより更に精製された．ファージＤＮＡは、そのポジ
ティブな班点から得られ、酵素のグイジエスションの制
限と、サザンブロット（　Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ
　）分析を必要とする。異なる５′−又は３′−フラン
キング残分と共に、全部の４．６　ｋｂ　ＥｃｏＲＩパ
ーツシストキシン・オペロン（ｏｐｅｒｏｎ　）　（Ｔ
ＯＸ　）またはその一部を含むクローンが特徴が有る。
その−ＴＯＸゲンは、シーフェンスの分析および更なる
遺伝学上操作のために、サブクローンされた。シーフェ
ンスする事はジジオキシ（ｄｉｄｅｏｘｙ　）ｍの停止
方法を使用しで為され、公知のシーフェンスと比べて４
つの新規なベース！　＋０５３６　ＴＯＸゲンの中に示
す結果となる。
Ｍ１３ファージの３１又はＳ３ゲンのサブクーロンは、
１丙で、フォスフオロチオエート（ｐｈｏ　−５ｐｈｏ
ｒｏｔｈｉｏａｔｅ　）手ｅｔ用いで、変異誘発を示す
部位が必要である。これらのクローンからのシングル−
スタンダードＤＮＡ　　は、特にデザインされたオリゴ
ヌクレオチドと共にアニールされ、変化する又は削除す
る１又はそれ以上のアミノ酸となる。その変異誘発は、
市販のソースから得られるキット（ｋｉｔ　）を使用し
て、行なわれる。シングル−スタンダード・ファージＤ
ＮＡ　　のシーフェンシング（５ｅｑｕｅｎｃｉｎｑ　
）によって、変化が証明された。突然変異のサブユニッ
トゲンは、オペロンの残余と再結合し、Ｅ、Ｃｏ１１３
Ｍ＋０９内に保存されるブロード・ホスト・レンジ・プ
ラスミドｐＲに４０４の中の突然変異のハロトキシンゲ
ンを構成した。
ハロトキシン類似物を特徴付ける為に、プラスミドのヘ
ルパーとしてｐｌ’ｌに２０１３を用い、固体表面の上
での投合（ｃｏｎｊｕｑａｔｉｏｎ）によって、それら
のプラスミドを自発的な（Ｓｐｏｎｔａｎｏｕｓ）スト
レブトマイシンーレジスタント・Ｂ、バラパーツシスス
トレインに変換した。そのコロニーはテトラシフライン
を含む、ポルデットーゲンゴウ（Ｂｏｒｄｅｔ−Ｇｅｎ
ｑｏｎ）血小板にで選択された。変化したゲンもまた、
自滅のプラスミドの接合変換 （ｃｏｎｊｕｑａｔｉｖｅ　ｔｖａｎｓｆｅｒ）によっ
て、完全に、８゜パーツシスの染色体となる。
統合完成（ｉｎｔｅｇｒａｔ　１ｏｎ）は、百日咳菌Ｔ
ＯＸオペロンの側面攻撃領域を利用してホモログ再結合
内でランダムか又は方向性を有しでいた０図７は、ラン
ダム再結合用変種を含む自滅プラスミドの構成を示す。
液状培養物（Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）を振盪フラスコ（１０
ｍ１から２し容ｊり又は醗酵器（２叶から５ＯＬ　ｇｊ
ｌ）中にメチル−８−シクロデキストリンを含む修正ス
テーナーショルテ（Ｓｔａｉｎｅｒ−５ｃｈｏｌｔｅ）
媒介のなかで成長させた０表面に浮ぶ培養物中のホ０毒
素アナログの表現レベルを酵素架橋免疫剤分析（ＥＬＩ
ＳＡ）によって測定して突然変異とともに変ることを見
出した。アナログの残留毒性をＣＨＯ細胞クラりタ分析
（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ９ａｓｓａｙ）によって測定した
。
自然の（ｎａｔｉｖｅ）ＰＴについで詳細に記載した方
法によって、百日咳菌種族再結合物からなる２し〜５０
Ｌ容Ｉの培養物から多数のＰ丁アナログを精製した。こ
れらの変種のへ〇Ｐ−リボシル移転酵素活性を［３２Ｐ
］ラベルＮＡＤから牛のトランスドウシン（ｂｏｖｉｎ
ｅ　ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ）への放射能の取込み程度と
して測定した。
以下の表１ａは生したＰＴ変種を示し、表１ｂはそれら
の残留毒性と酵素活性を表示しでいる。
選ばれた精製変ｆ！を、標準はつかねすみ脳内チャレン
ジテストによって、急性毒性、ヒスタミン感作活性及び
効能についでねずみを使ってテストした。これらの結果
を表２に示すが、表２はＰＴアナログの急性毒性及びヒ
スタミン感作活性が顕著に減少し、ねずみの効能テスト
（Ｐｏｔｅｎｃｙ　ｔｅｓｔ）ではこれらは免疫保護性
を有することを示す。
ＰＴアナログの免疫学的性質を、ねずみのエピトープ（
ｅｐｉｔｏｐｅ）地図及び抗体レスポンスの分析によっ
て更に検討た。ＰＴの個々のサブユニット（ｓｕｂｕｎ
ｉｔｓ）やダイマー（ｄｉｍｅｒｓ）について特有の幾
つかのモノクロン抗体（ＭＡｂｓ）！つり、これらの抗
体によって定義された工どトープが突然変異によって影
響されたかどうかをＥＬＩＳＡによって測定するのに使
用した。
ＭＡｂ　ＰＳ２＋によって認められたＳ１工どトープは
、ねずみでは免疫優性であって、この抗体はねずみ脳内
チャレンジテストで受動的保ａｔ与えるので特に重要で
ある。　ＰＴアナログ中のこのエピトープの保存につい
て表１ｂに示す。
これらの精製ＰＴ変種について免疫性研究をねすみで行
なった。　ＰＴ誘導ＣＨＯ細胞クラスクー（表３）を団
害する能力、抗−ＰＴ、抗−８１及び抗−８オリゴマー
・抗体力価について、間接的なＥＬＩＳＡ（表４）によ
って免疫血清をテストした。
ワクチン製造に適する突然変異ＴＯＸを表わす百日咳菌
種属を生成させるために、ＴＯＸ因子座の５′−および
３′−側面攻撃領域を含有するリアの百日咳ｉ１　ＤＮ
Ａのニレトロボレーション（Ｅｌｅ−ｃｔｒｏｐｏｒａ
ｔ　１ｏｎ）を使用して、内因性のＴＯＸオペロン（Ｏ
ｐｅｒｏｎ）をホモログ再結合によって除去した。
次いて、選ばれた変種遺伝子を百日咳菌染色体のＴＯＸ
因子座のなかへ再総合化した。変種化ＴＯＸ遺伝子を含
むクロラン（ｃｌｏｎｅｓ）が生長し、表面に浮ぶ培養
物を、前述したようにＰＴアナログとその残留毒性の表
現レヘルについて分析した。これらの結果を表５に示す
。
ＴＯＸ遺伝子が完全に除去されるが、又はある種のクロ
ランによっで置換されているある種の百日咳菌種属が、
次のように１９８８年１１月２４日にＡＴＣＣに寄託さ
れた。
百日咳菌　２９−９　　　　　ＴＯＸ（欠失）（ＴＯＸ
−） 百日咳菌　Ｓ−２９６２−１−２３１，ＧＬＹ１２９百
日咳菌　Ｓ−３０３６−２３！：ＧＬＬＩ”百日咳菌　
Ｓ−３１２２−３−Ｉ　　ＳＡ：ＡＬＡ　’百日咳菌　
Ｓ−３１２２−２〜３　　Ｓｌ：　ＧＬ’／＋２９Ｓ３
：ＡＳＮｌ１２　ＡＲＧ９３ ＴＯＸ−は百日咳菌かうトキシンオペロンか除去され、
異才型のＤＮＡ　；／）＜存在しない新規なストレイン
であり、抗性物質の不存在下で生長して百日咳トキシン
のない百日咳抗原を生成することが可能である。
転位（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）　シたストレインの各
々は、百日咳菌の一種属であり、百日咳トキシン毒性に
対して関与する少なくとも一つの特定アミノ酸残基の局
所指向的突然変異によって形成される変種遺伝子によっ
てそのトキシンオペロンが置換されている。
ここに示すデータは、発明者らがＣＨＯ細胞クラスター
および酵素活性（ワイルド−タイプ活性の０．１〜１χ
）値が充分減少した一連の百日咳トキシンアナログを製
造したことを現わしでいる。多くのこれらのアナログは
、また、保護的モノクロン抗体によって認められた免疫
優性Ｓ１エピトープをもっている。ざらにある種のこれ
ら変種は、服用に際してはつかねずみを保護することが
みられる。猛毒性の百日咳菌とのチャレンジに対して最
低の毒性を示す。大部分のこれらの結果はバラ百日咳ｉ
Ｍ（８，ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｊｓ）によって分泌し
たＰ丁変種を使用して生成されるか、相応の製品がバラ
百日咳菌それ自体の遺伝操作によって得られることは明
らかである。
従って本発見は、新規な百日咳ワクチンに包含される候
補である多数の脱毒性免疫体、および百日咳菌の中でそ
れらを製造する方法を提供するものである。
［実施例１ 本発明においては十分に記載されていないが使用された
分子遺伝学、蛋白生化学および醗酵やヒドリドマ技術の
方法ならびに実施例などは科学文献に充分に報告されて
おり、当業者が容易に行なえる範囲にあるものである。
実施例１ 本実施例はＰＴの調整と精製を示す。
Ｂ、坦■且二バストレイン＋０５３６）の培養上洛を１
０．０００または２０，０００の分子量をカットする膜
でミリボアベリコンカセットシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅＰｅｌｌｉｃｏｎ　ｃａｓｅｔｔｅ　ｓｙｓｔｅｍ
　＠用いたもので限外ろ過によって２０−５０倍に濃縮
した。トキシンは粗濃縮物から、ＩＭのリン酸カリウム
、Ｉ　ＯｍＭのＮａＣＩでｐＨ７，５に平衡に保ったフ
ェトインーアガロースアフィニティ力ラムを通すことに
よって吸収された。
吸着物の容積は典型的にはトキシン１１１１（ｌ当り１
ｍｌであった。負荷されたカラムは１００ｎ＋Ｍのリン
酸カリウム、ＩＭのＮａＣＩＴ−ｐＨ７，５で洗浄され
た。ついで３！Ｉ４のチオシアン酸カリウムを含む同じ
バッファで、トキシンを肌着させるために溶出された。
プールされた両分はチオシアン酸塩を除くために、５０
ｍＭのトリス−ｊｍ（１（Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ）、１０χ
ｖ／ｖのグリセロールを含む２００ｎ＋ＭのＮａＣＩＴ
：ｐＨ８，０で透析し、ついで５０ｍＭのトリス−塩酸
、５０χＶ／Ｖのグリセロールを含む２００ｍＭのＮａ
Ｃ１でｐＨ８，０で透析し、２００°Ｃでその主成物を
貯蔵した。エリザ（ＥＬＩＳＡ）によって決定された収
率は９０〜９５χであった。
５ＤＡ−ＰＡＧＥ　テ決定すした純度は９Ｏ−９５Ｘ　
テあり、不純物の王なものはＦＨＡ　ｒあった。さらに
精製するために、貯蔵されたトキシンは水で５倍に稀釈
され、トキシンｍｇ当つ　ｌｎｌの容積のヒドロキシア
パタイトのカラムで、Ｉ　ＯｍＭのリン酸カリウムで平
衡に保ったものに負荷した。そのカラムはｐＨ８，０の
３０ｍＭのリン酸カリウムで洗浄され、トキシンを脱着
するために１００または２００ｍＭのリン酸カリウムで
溶出された。プールされた両分はｐＨ８，０で５０χＶ
／Ｖのグリセロールを含む１００ｍＭのリン酸カリウム
で透析された。収率は典型的には９０〜９５χであり、
５ＯＳ−ＰＡＧＥにより示される純度は９９％以上であ
った。
実施例　ＩＩ 本実施例はＰＴのサブユニットＳ１の調製を示す。
ＰＴ、！７＜実施例１に記載のようにフェトイン−アカ
ロースへ吸着され、ついでＣＨＡＰＳバッファー（５０
０ｍＭの尿素、　５０ｍＭのリン酸カリウム、　ｌ００
ｍＭのＮａＣ１と１χｖ／ｖのＣＨＡＰＳ　（３−［（
３−コルアミドプロピル）−ジメチルアモニオ］−１−
プロパンスルホネート）、　ｐＨ７，５）で洗浄する。
このカラム％　５００ｕＭのアデノシントリホスフェイ
ト（Ａ丁Ｐ　）を含む同し媒体で溶出する。Ｓ１サブユ
ツトはそのカラム容積でシャープなと−クとして出現す
る。プールされた分画は残存する８オリゴマーを除くた
めに、ＣＨＡＰＳ／ＡＴＰ媒体で平衡化されたきれいな
フェトイン−アガロースカラを通過させる。ついで−２
００’Ｃで貯蔵するためにｐＨ８，０で５０！Ｖ／Ｖの
グリセロールを含むリン酸カリウム　１００ｍＭで透析
する。Ｓｌはバイダック（Ｖｙｄａｃ　）　Ｃ４カラム
上の逆相ＨＰＬＣによって、ＰＴ長基準それと積分され
たピーク面積を比較することによって定量される。収率
は典型的には僅が２０〜２５χであったか、ＳＯＳ’−
ＰＡＧＥおよび逆相ＨＰＬＣの何れからも明らかなよう
に他のサブユニットを含まなかった。
実施例　Ｉｌｌ 本実施例はＮＡＤの３１サブユニツトへの光交叉牲を示
す。
５０ｕｇ／ｊｉｌのＳｌ、　ｌ０ｍＭのジチオスレイト
ール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ　）および５０ｕ
ＭのＮＡＤ　？　ＣＨＡＰＳバ・ンフア−に含む反応混
合物（１００μ）を、氷で冷した９６−つエルマイクロ
滴定プレートセットのウェル中におき、３０分間プレイ
ンキユヘートし、９Ｗの水銀＊Ｔを５ｃｍの距離におき
３時間まで２５４ｎｍで照射する。試料は残存ＮＡＤグ
リコハイドロラーセ活性についてアッセイする。Ｓｌの
酵素活性は２時間の放射後に全くなくなる、これに反し
てフォトインアクチヘーションの程度は同し条件でＮＡ
Ｄのない場合は、僅か４０χにすぎなかった。
この結果は、ＮＡＤに左右される光化学的事柄がおきた
ことを示す、　Ｎ４０分子のどの部分がその蛋白質と作
用し合ったかおよび交叉性の程度を見出すために８１を
同上条件下で［カルボニル−１４［：］ＮＡＤまたは［
アデニン−”Ｃ］　ＮＡＤと共に照射した。３時間まで
の間隔で一部をとり出し、三塩化酢酸（ＴＣＡ　）で１
０χＷ／Ｖになるよう処理した。沈澱した蛋白を濾過し
て集め、新しいｌＯχＷ／ＶのＴＣＡで洗浄し、シシチ
レーションカウンターでカウントした。この結果は、そ
の放射ラベルはアデニン残基からよりもむしろニコチン
アミド残基から入れられ、そり混入の程度は蛋白１モル
当り０．７５モルララベルあることを示した。
実施例　ＩＶ 本実施例はＳ１サブユニツト上の光交又のサイトを確認
するものである。
１００１１ｇ　／　ｔ＋１のＳｔ、ｌ０ｍＭのジチオス
レイトールおよび５０ｕＭの［カルボニル−”Ｃ］　Ｎ
ＡＤをＣＨＡＰＳバッファーに含む反応混合物（３ｍｌ
）を水中のベトリ皿に入れ、１ｍｍの層とし、静かにマ
グネチックスタラーで撹拌しながら２時間２５４ｎｍで
照射した。溶液は窒素で脱気され、ジチオスレイトール
で還元され４−ビニルピリジンでＳ−アルキル化されチ
オールグループか酸化されるのを防止する。
反応混合物はＩ　ＯｍＭの酢酸でざっと透析し、２０χ
ｗ／ｖＴＣＡで沈澱させた後放射ラベルされた蛋白は集
められた。
沈澱した蛋白（Ｉｍｑ　）は２Ｍの尿素、２００ｍＭの
重炭酸アンモニウム中に再溶解し、５００　Ｌ１９　／
　ｎｊとし、３７℃で２０時間５０ｕ９／ｍｌのトリプ
シンでダイジェストする。混合物は酸性化され、Ｉ　Ｘ
２５ｃｍのＶｙｄａｃ　Ｃ＋ｏ逆相ＨＰＬＣカラム上で
、Ｉ　ＯｍＭのトリフロロ酸Ｍ（ＴＦ＾）中に０−５０
χアセトニトリルのリニセーグラジアントそ用いて分画
した０分画はシンチレーションカウンターでチエツクさ
れ、それからはＡおよび８で示される２つの主なラジオ
アクティブペプチドがあり溶出されたラジオアクティブ
ティの５０χに及ぶことがわかった。
ペプチドブールは親液化（リオフィライズ）され、Ｉ　
ＯｍＭのＴＥＡ　、６Ｍのグアニジナムクロライト中に
再溶解し、Ｉ　ＯｍＭのＦＴＡ中で２０−３０χのアセ
トニトリルグラジェントを用いてＶｙｄａｃ　ＣＩＢカ
ラム上で分離した。
それぞれのベプタイドは更に均質化するためにｐＨ６，
５の２０ｍＭ醋酸アンモニウム液中でアセトニトリルグ
ラジェントの応用によって同一カラム上で精製し、その
液を乾固した。これらの比放射能は分子当り１つのラベ
ル位百でのみ一致した。
２つのペブタイトは自動的に操作されるエドマン（Ｅｄ
ｍａｎ　）崩壊によって反復した０反復流出液の一部は
放射能の探知のために転用した。結果は第１図に示した
。サイクル１５迄、シーフェンスは同一″ｃあり、マチ
ュア−８１の残渣１１８−１３２にあいまいに一致する
ことが認められた０両ペブタイドの放射能は１２サイク
ルで放出された未確認アミノ酸を連想させマチニア−Ｓ
ｌ中の１２９の位百に対応した。サイクル１５では放射
能は認められなかった。かくしてＱｌｌ＋２９は架橋の
サイトであることか確認され、そこでニコチンアミド相
互作用の重要な成分であるらしいことを確認した。
実施例　５ この実施例は８．ベルタシス（８，Ｐｅｒｔｕｓ−ｉＳ
　）クロモーソマルＯＮ＾の調整方法を紹介する。
８、ベルタシス（ストレイン＋０５３６）の２リツタは
それぞれのフラスコ中で飽和培養した４ｍｌの接種材料
を使用する１６ｘ　１２５ｍ１液とした変性ステイナー
　−ショルテ（Ｓｔａｊｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅ）媒質
中で生長させた。この媒質はし一プロリン５９／シ、食
塩２．５９／Ｌ、　　にＨ２ＰＯ４０，５９／Ｌ、　　
ＫＣｌ　０．２９／Ｌ、　Ｍ９Ｃ１２６Ｈ７００，ＩＣ
Ｉ／Ｌ、トリス（Ｔｒｉｓ］、５ｃ＋／Ｌ、カザミノ酸
＋０９／Ｌ　、メチル−８−シクロデキストリン２９／
シ、ＧａＣｌ２・２Ｈ２００，０２９／Ｌ　、グルタミ
ン酸−モノナトリウム＋０９／Ｌ　、　Ｌ−システィン
０．００４Ｘ、　ＦｅＳＯ４・７Ｈ２００，００１Ｚ、
二？　シン０．００４Ｘ、グルタチオン０．０＋５χお
よびアソーどツク（ａｓｏｒｂｉｃ）酸０．０４ｒがら
なり、ｐＨ７，６である。試料は５００ｍ１フラスコ中
、３５〜３６℃の振とう器上、１５０ｒｐｍ、１６．５
時間、ログフェーズで主長させた。セルは４℃で１時間
５０００Ｘ９で５００ｍ１中でスピンした。それぞれの
液は２５ｍ１のＴＥ緩衝液（ｌ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ、ＩｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，５）で洗浄し、それか
ら２０ｍ１　ＴＥ中に再懸濁し、−７０℃で凍結した。
ワンベレ・ントヲ９０ｍ１　ＴＥ中で再懸濁し、ブロナ
ーセを５００Ｌ＋９７ＩＴｌｌになるように加えた。　
ＳＯ３を１ｘになるように加え、試料は３７℃で２１．
５時間、清澄な分解液が生成するまで培養した０分解液
はフェノールを飽和したＴｒｉｓＨＣＩの１容量、ｐＨ
７，５、室温で２時間、ゆるやかに撹拌しながら抽出し
た。相は２８００Ｘ９て１５分間２０℃で遠心分離法で
分離し、水相はフェノールクロロホルムの１１比の１容
量で同様に抽出した。相は２＋００Ｘ（Ｊ　、１０分間
、２０℃で遠心分離法で分離し、水相はクロロホルムで
２時間上記したように抽出した。相は＋６００Ｘ９．５
分間、２０°Ｃで遠心分離法で分離し、水相は４℃でＩ
Ｍ　ＮａＣ１溶液の２リツターに対し、１回の緩衝液の
変更のもとに透析に付し、更に１回の緩衝液の変更で４
８時間２リツターのＴＥに対して透析した。
実施例　に の実施例は８．ベルタシス（Ｂ、　Ｐｅｒｔｕ−ｓｓｉ
ｓ）の生殖１こついて紹介する゛ １）　λ９ｔ　ＩＩ　ＥｃｏＲＩライブラリーＢ、ヘル
タシスＤＮＡ（１０Ｌｉ２）はｌ００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ、ｐＨ７，５，５０ｕＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　Ｍ
９Ｃ１２、１００ＬＩ９／ｍ１ＢＳＡ　、　ｌ　Ｌ１９
／ＩＴＩＩ　ＲＮＡ５ｅ　Ａの存在下に、種々の時間、
部分的に分解されたＤＮＡフラグメントのセットを発生
させるために、ＥｃｏＲ［１０ユニツト）で分解した。
０．２５．０．５　、Ｉ　、　２．４および８時間のそ
れぞれの時間、試料は０℃に保管し、ＥＤ丁Ａ２０ｍＭ
を反応を停止させるために添加した。試料はプールし、
ＴＮＥ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　、　ｐＨ８，０
、５ｍＭＥＤＥＡ、ＩＭ　ＮａＣ１）中、８５．０００
Ｘ９　、２０時間、２０℃で１０〜４０Ｘシユクローズ
グラジエント上で分離した。グラジェントは最初からの
２４画分（０，５ｎ＋Ｉ）　＠分別し、それに１ｍｌの
エタノールをＤＮＡ　％沈Ｆｊさせるために添加した。
試料はドライアイス上で３０分間インキユヘートし、そ
れからｌ　２　、０ＯＯＸ（１，５分間、４°Ｃで遠心
分離した。ベレットは７０χエタノルの７５０ｕｌで洗
浄し、ドライアイス上で５分間保ち、＋２，０００Ｘ９
　、５分間遠心分離したのｔ５乾燥した。それぞれのベ
レットは殺菌水の２５ｕｌ中に再懸濁し、それぞれの交
互のフラクションはフラグメントの大きサソ求めるため
にアガロースゲル電気泳動にかけた。約０．５にｂから
９Ｋｂの大きさの紀囲のＤＮＡ　！含む試料がプールさ
れた。プールされたＥｃｏＲＩ分解Ｂ、ベルタサスＯＮ
＾（０，４Ｌｉ２）はＥｃｏＲＩ−分解物、脱フォスホ
リル化λｇｔｌｌ　ＤＮＡ（０，５Ｌ１９）でリゲート
し、市販のキットを使用してファーヂ粒子中にパックし
た。ファージライブラリーはＥ、コリ住匹１ｕＹ　１０
９０セル中で増殖し、λ９ｔｌｌ　ＤＮＡの約１０１０
プラク−形成単位（ｐｆｕ）／ｕｑにおいで滴定した。
ライブラリーはクローンをスクリーニングするために４
　ｘｌＯｐｆｕ／ｍｌに増殖させた。増殖は０．２ｚマ
ルトースを含む媒体中で１夜セルを生長させることによ
ってプレート上で行ない、セルの０．６ｍｌ当りライブ
ラリーの１０４〜１０５ｐｆｕを添加し、ファージをセ
ルに吸着させるために３７℃で１５分間放回した。試料
は軟質アガーと混合し、プレート化し、３７℃で１夜イ
ンキユベートした。軟質アガー７セル／フアージ層は合
流プレートからこすり取り、４ｍｌのＳＭＧ　緩衝液（
０，４Ｍ　ＮａＣｌ、］ＯｍＭ　　Ｍ９ＳＯ４、５０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　、　　ｐＨ７，５，０゜ＯＩ
χケラチン）で洗浄した。洗浄およびファーヂアガーは
一諸にし、１００μｌのクロロホルムｌｒ　５℃加し、
混合物は１５分間ゆるやかに撹拌しながらインキュベー
トした。試料は清溌液を得るために、４０００Ｘｑ　、
　４℃で１０分間、２回遠心分離した。クロロホルムを
最終濃度０．３χとなるように加え、ライブチ１ノーは
４°Ｃに貯蔵した。
２）　λチャロン（Ｃｈａｒｏｎ）３５　Ｓａｕ　３Ａ
　Ｉライブラリ 日、ベルタシス（Ｂ、　ｐｅｒｔｕｓｉｓ）ＤＮＡ（３
ＸＩ６６　Ｌ１２）はＯｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　
ｐＨ７，５、ｌ００ｍＭ　　ＮａＣ１、ｌ０ｍＭＭ９Ｃ
１２，１００Ｌｌ’９／ｍｌ　ＢＳＡ、の存在下にＳａ
ｕ　３ＡＩ（３Ｘ２２０ユニツト）で、ＤＮＡの非常に
大きなフラグメントを発生させるために、１分間、２分
間または３分間分解した。
各々の反応の後、ＥＤＴＡを２０ｍＭになるように加え
、その後２，５容積の完全なエタノールを加え上記した
ＤＮＡ　！沈５（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）させた、　
ＤＮＡは丁ＮＥに再懸濁され、ＴＮＥ中の１０−３０χ
ショ塘濃度勾配で分離され各ＤＮＡのフラグメントサイ
ズはアガロースゲルの電気泳動により目視された。ラム
ダカロン３５ＤＮＡ（２Ｘ５０ＬＪ９　）はリゲイトさ
れ、スタッファ−フラグメントを取り除くための１５０
ｍＭＮａＣ１，６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−８０１ｐＨ７，９，
６ｍＭ　Ｍ９Ｃ１７，１００ｕｑ／ｍｌ　ＢＳＡの存在
下ＢａｍＨＩ（２ｘ　２０ｕｎｉｔｓ）で消化される前
に、環状のフオームを生成した。ラムダアームは、８−
２０！　（７）酢酸カリウム８５，０００Ｘｑ　（７）
グラジェントで１６時間、３２℃によりベレット化する
ことにより、単Ｍされた。５ａｕ３Ａ　Ｉ　５蝉化ＤＮ
Ａは、ラムダアームにより、６°Ｃ２７２時間でリゲイ
ト（ｌｉｑａｔｅ）され、コマーシャルキットを用いフ
ァージの中へ封入された。ファージライブラリーはＥ、
ｃｏｌｉ　ＬＥ　３９２細胞で増殖され、約１　ｘｌＯ
’　ｐｆｕ／ｕ９のラムダアームと数え（ｔｉｔｒｅｄ
）られた、ライブラリーは上述したようにスリーニング
するため１−２　ＸＩＯ”ｐｆｕ／ｍｌに増巾された。
実施例　ＶＩＩ 本実施例は１匹１藍１ｓライブラリーのスクリーニング
を示すものである。
１）　λ９ｔｌｌゲノミックライブラリー３０ヘースオ
リゴマクレオチド　プローブが、シーンエンコーディン
グＰＴサブユニットＳ４のヌクレオチド配列に従い、合
成された。ＤＮＡは、Ｕ■・発色（ｉｍａｑｉｎｑ）と
ワトマンセルロースＤＥ５２に８けるアニオン交換クロ
マトグラフィーにより尿素／アクリルアミドから単離さ
れた。オリゴヌクレオチドの配列は、成長Ｓ４タンパク
のアミノ酸＋６−２５に対するコードによつ５’　ＧＴ
ＡＧＣＣＡＴＧＡＡＧＣＣＧＴＡＴＧＡＡＧＴＣＡＣＣ
ＣＣＧ　３’であった。第１ノゴヌクレオチドは、５０
ｍＭＴｒｉｓＨＣＩ、ｐＨ９，５、ｌ０ｍＭ　Ｍ９Ｃ１
２，５ｍＭ　ＤＴＴ　、　５Ｘグリセロールの存在下３
７℃、１５分間培養による、１０ｕ９ＤＮＡ　、２５Ｕ
（：ｉ［Ｓ−ｊ２Ｐ］ＡＴＰ、４ユニツトポリヌクレオ
チドキナーセを含有する反応混合物においで、５′と末
端標識化された。ＡＴＰが１．５ｍＭになるように加え
られ、培養は１．７５時間、３７℃で続けられた。　ｌ
０ＬＪ９のｔＲＮＡがキャリアーとして加えられ、標識
化ＤＮＡは、０、ＩＭＩ−リエチルアンモニウムバイカ
ーポネートｐＨ７，６で溶出する、セバデエクス（Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ）Ｇ５０スーパーフアインカラムにおいて
ツリーＡＴＰから分離された。ピーク画分は緒にされ、
凍結乾燥され乾燥された。ベレットは無菌水で洗われ、
再び凍結乾燥され、少約０．１ｕ９／Ｕｌで再懸濁され
た。
λ９ｉ１１　Ｂ、　ｅｒｉＵｓｓｌｓゲノミックライブ
ラリーのアリクイツ（Ａｌｉｑｕｏｔｓ）は０．２χマ
ルトースを含むＮ２ＣＹＭプレートにあけるＹＩ０９０
ローン上にプレート化された。　Ｐｌａｑｕｅ−１ｉｆ
ｔｓは、溶液（１，５Ｍ　ＮａＣ１゜０．５ＭＮａ０Ｈ
）　％　１分間変性させ、溶液（１，５Ｍ　ＮａＣ１゜
０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，０）を５分間中
性化させる処理が順次行なわれるニトロセルロースフィ
ルターに生成ざｎ、　ＤＮＡを固定するため２時間真空
下８０°Ｃで焼成される前に２　ｘｓｓＤＥ（０，３Ｍ
　Ｎａ（：ｌ、２０ｍ１リン酸ナトリウム、ｐＨ７，４
，２ｍＭ　ＥＤＴＡ）で短時間洗われた。ニトロセルロ
ースフィルターは順次、５×５ＳＣ（０，７５Ｍ　Ｎａ
Ｃ１，７５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐ）１７．５）、
５×デンハーデイト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ）混合物
（０，ＩＸ　Ｆｉｃｏｌｌ　　４００．０．１ポリビニ
ルピロリドン、０．１χＢＳＡ）、０．ＨＳＤＳ、１０
０　ｕ９／ｍｉニシン精子ＤＮＡ　！含むプリハイプリ
ディセーション（ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）
バッファーで培養された。プリハイブリディゼーション
バ・ｙファーは取り除かれ、１０７　ｃｐｍの［３２Ｐ
］−標識化オリゴヌクレオチドプローブを含む新しいバ
ッファーが加えられた。バイブリプイセ−ジョンは４５
℃、１６時周行なわれた。ラジオアクティブ溶液は取り
除かれ、結合しでいないプローブを取り除くため５ＸＳ
ＳＣ２０，１χＳＯＳで室温で２回短時間洗われた。フ
ィルターはざらに、５　Ｘ５ＳＣ、０，ｌＸ５ＤＳ　ｒ
−時間、５゜°Ｃで２回洗われた債、空気乾燥され、オ
ートラジオグラフィにかけられた。
プラク含有プレートはそれらのオートラジオグラムと比
較され、ポジティブプラクはプレートにおいでざらに２
回単層された。１つのクローン（入　ｃ＋ｔｌｌ−１５
−４−１）が、サラガンプロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　
ｂｌｏｔ）分析による詳細な分析のために選ばれた。
２）　入　ｃｈａｒｏｎ　３５ゲノミツクテイブラリー
λｃｈａｒｏｎ　３５　Ｂ、匹１皿旦Ｓゲノミックライ
ブラリーのアリクオツッは、０．２χマルトースを含む
ＮＺＣＹＭプレートにおけるＬＥ３９２　　ローン上に
プレート化された。プラク−リフト、バイブリプイセ−
ジョンとプロトロルのン先ン争は記載すれているよう（
こ遂行された。ポジティブプラクはプレート上でざらに
２回単離され、いくつかのクローン、λｃｈ　３５１１
１、＋２１．４１１．４２１及び４３１はサウザンプロ
ット分析により分析された。
実施例　ＶＩＩＩ 本実施例はゲノミッククローンの分析を示すものである
。
１）ファージＤＮＡの生成 ファージカルチャー１リツトル（２Ｘ　５００ｎｌ　）
を用意し７．−、　　ＬＥ３９２又はＹＩ０９０細胞％
０．２Ｚマルトース含有メデイウムで一夜培養した。細
胞（１０１０）は４℃で５ガ間４４００ｘｇで遠心分離
され、ベレットをＩａｌＳＭＧバッファー中に再懸濁さ
せた。ファージストック（１，２ｘ　　ＩＱ８ｐｆｕ　
）は混合物に加えられ、ファージを細胞に吸収させるた
め３７℃で１５分間培養させた。ファージ／細胞混合物
は５００ｆｆｉｊのメディウムで、３７℃で活性的に振
とう培養により、溶解が始まるまで（４〜４．５時間）
培養した。クロロホルム（ｌ０ａｊ　）を加え溶解を完
了させるためにざらに１５分間３７℃で振どうを続けた
。サンプルは！温にまで冷却され、ＤＮａｓｅ■とＤＮ
ａｓｅ−ｆｒｅｅ　ＲＮａｓｅＡ　（各々Ｉｇｇ／＋１
　）ｉ室温で３０分間加えた。細胞の残骸は２０分間、
３５００Ｘ９でベレット化され、その（＆２９．２ｃ＋
　ＮａＣ１と５０９ポリエチレン　り１ノコ一ル（ＰＥ
Ｇ　６０００　）が上ン登５００幻りに加えられた。サ
ンプルは徐々に、固形分を溶かすため室温でゆすられ、
その後０°Ｃ７１〜２時間培養しファージを沈澱させた
。ファージは、　４°Ｃ２０分間、４４００Ｘ９で遠心
分層により収穫され、　８１１ＴＭバッフｐ　−（５０
ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，５，ｌ０ｍＭ　Ｍ
ｑＳＯ４）中に再懸濁させた。８１１クロロホルムのＰ
Ｅ０％取り除くためのエキストラクションは透明な上澄
であり、該上澄は７Ｍバッファー中の５ｚ及び４０ｒグ
リセロールは所定のステ・ｙプグラジエントにより、４
℃で１時間、＋５４．０００Ｘ９で遠心分離された。上
澄は、０．５りＩ　ＴＭバッファーに再懸濁されたファ
ージベレットを残しで、すてられた。
ＤＮａｓｅ　ｒは５ｕｑ／＋ｎ４に加えられ、ＲＮａｓ
ｅ　Ａは５０ｕｑ／ｉｊに加えられ、サンプルは３７℃
で３０分間培養された。ＥＤＴＡは２０ｍＭに、プロナ
ーゼは０．５ｍｇ７　、ｚ、ＳＤＳは０．５χになるよ
うに加えられ、サンプルはざらに３７℃で１時間培養さ
れた。サンプルはゆっくり、フェノール、フェノール：
クロロ２オルムト１及びクロロフォルムでそれぞれ１度
づつ抽出され、ファージＯＮ＾はエタノールで沈澱した
。
２）結果 ＥｃｏＲＩ　ｑｔｌｌライブラリーより得られるクーロ
ン＋５−４−１はサウザンプロット分析により、全■シ
ーンとスモール５″及び３′−フランキングレージョン
とエンコードしている４、６にｂ　ＥｃｏＲ１’＠：含
有しでいることかわかった。
入　ｃｈａｒｏｎ　３５　　／７−ロンがほぼ開イ系し
ていることかわかった。いくつかのクーロンは、全ＴＯ
Ｘ−オペロンとフランキングリージョンをどちらかのオ
リエンテーションにおいて含暮しており、他のものは全
■リージョンを含有していなかった。
クーロン１５−４−１．　ｃｈ　ＩＩｌ、　ｃｈ　１２
１／４１１．　ｃｈ　４３１及びｃｈ　４２１のマツプ
は図２に示されている。
実施例　ＩＸ 本実施例は百日ぜきトキシンオペロン（ＴＱＸ　）を含
有しでいるｐＵｃ−ｂａｓｅｄプラスミドの構造又はそ
の比率を示すものである。
λ９ｔｌｌクーロン＋５−４−１からのファージＤＮＡ
は記載されているように生成され、一般的方法により制
限エンドヌクレアーセＥｃｏＲＩで消化された。ＤＮＡ
は低メルティングポイントのアガロースによるゲル電気
泳動により単離された。エチデイムウブロマイド染色ゲ
ルのＵｖ全発色より４．６にｂバンドが同定され、分層
された。　ＤＮＡは０．３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ７，
０１Ｆｒ用いたフリーズソーテクニックにより抽出され
、エタノールで沈澱した。
ｐＵｃ８：２からのＰＮＡ　、すなわ５８９１　ＩＩ及
びＸｂａ■に対する２つの余分な制限サイトをそのマル
チフルクローニングサイトに含有しでいるｐｌＪｃ１３
の誘導体はＥｃｏＲＩで消化された。
リニアライスされたＤＮＡはカーフ？ルカラインフオス
ファターセを用いて標準的な方法によってデフォスフオ
リレートされ、フェノール抽出され、エタノールで沈澱
されられた。
ｐＵｃ８：２ヘクタＤＮＡと１５−４−１−プライブド
ー匪ＤＮＡは標準的な反応でリゲイトされ、そのリゲイ
ト混合物は標準的な手順ｔこ従って適当なＪＭＩ０９セ
ルを変換するのに用いられた。この結果得られたコロニ
ーは、高速ＤＮＡスクリーニングテクニックにより分析
され、２つのコロニーがプラスミドＤＮＡの大規模な調
製のために選ばれたにれらのクローン、　Ｊ−１６９−
＋およびＪ−１６９−２は、ＴＯＸ−挿入のオリエンテ
ーションにおいてのみ相異しでいた。これらのクローン
の構造を第３図に示す。
実施例　Ｘ この例はＴＯＸオペロンのシーケンシジグについて説明
するものである。
１）使用したクローン クローンＪ−１８９−１か全てのシーケシシングクロー
ンの源として使われた。　ＴＯＸ−才べＯンは５個のほ
とんど同しＤＮＡセグメントに分けられ、ＭＩ３ｍｐ１
８、ＭＩ３ｍｐ１９またはｐＵｃ８　：　２にサブクロ
ーンされた。第４図ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅにこれを示
す。
２）サンプルの調製 Ｍ１３クローンはＪＭＩＯＩ中で培養され、ジ−ケンシ
ンクのためのＤＮＡは均質なプレートの１つのプラーク
から調製された。飽和したＪＭＩＯＩカルチャは、新し
い培養基で稀釈され、１つのプラークで感染させられた
。このカルチャーは３７℃で６時間強く撮とうされて育
成された。セルは遠心分離によって除かれ、その上澄み
液が１７４の体積の２０７、　ＰＥＧ　６００．２．５
Ｍ　Ｎａｃｌで処理されてファージが沈澱させられた。
懸濁液は遠心分離され、ファジヘレットは再びＴＥ中に
懸濁させられ、フェノ−／し、フェノール　りロロフオ
ルム（１１）およびウロＤホルムによってそれぞれ２回
ずつ注意深く抽出された。ファージＤＮＡは酢酸ナトリ
ウムおよびエタノールで沈澱させられ、７０Ｘエタノー
ルで洗浄ののち乾燥させられた。そのＤＮＡは約１／１
Ｌとなるよう無菌水に再び懸濁させられた。
約１７から２０の塩基のシーケンシングブライマーがＡ
ＢＩ　３８０八ＤＮＡシンセサイザー上でフオスフオロ
アミダイトケミストリーを用いて合成され、上記のよう
に精製された。
３）シーケンシング サンガーのジデオキシ鎖ターミネーション法が全てのシ
ーケンシング反応に適用された。クルノーポリメラーセ
またはシーケンスエフ酵素を用いた。
４）結果 上記の全てのＴＯＸオペロンがシーケンスされ、結果か
公開されでいるシーケンスと比較された。
４つ塩基の違いの他は、ミコシアらによって報告された
菌株ＢＰＩ６５のＴＯＸシーケシスとの一数がみられた
。５′−フランキングリージョンにおける３１５の位百
の■はＢ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株＋０５３６にとって独
特のものである。その他３つ置換はＳ１コーデング域の
ボジショシ７＋０．１２００．１２０２にあり、その結
果２つの独特なアミノ酸すなわ５　ＧＬＵ３４およびＶ
ＡＬＩ９８となっている。ヌクレオチドシーケンスおよ
び得られたアミノ酸シーケンスを第５図に示す。
実施例Ｘ１ 本例はＴＯＸ−遺伝子のミュータゲネシスについて説明
するものである。
ｌ）便用したクローン Ｓ１遺伝子における変異のために、クローンＳ−２４０
５−２４０３（（！８／Ｓｔ）が用いられ、Ｓ３遺伝子
における変更のためにクローンＳ−２６６４−５−６（
ＭＩ３ｍｐ１８／５３（Ｃ））か用いられた。これらの
クローンは舅４図に示される。
２）ミュータゲネシス　プロトコル 前記のように、均質プレートの１つのプラークからとっ
たファージストックからジングルストランドＤＮＡを調
製した。適当なシーケンスと長さをもつミュータゲニツ
クブライマーが、へ８１３８０ＡＤＮＡシンセサイザー
で合成された。
エクスタイン（こよって開発された）オスフオロチオエ
ートブロシージャに基〈化学キットか歪ンζｈａミュー
タゲネシスのために使用された。簡単に説明すると、ミ
ータゲニツクオリゴタクレオチドをアニールしてジング
ルストランド（ワイルドタイプ）テンプレート（こし、
基質として）オスフオロチオエートｄＣＴρアナログお
よびナチュラルｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを
用いて、高分子化した。
ダブルストランドＤＮＡをＮａ１ｌで刻み、ネイティブ
ストランドをエクソヌクレアーゼＩＩＩでミューテーヨ
ン点を超えてダイジェストした。コンプリメンタリ−ス
トランドは、フオスフオロチオエート基によってＮｃｉ
ｌによって刻まれることから保護された。そしてこのコ
ンプリメンタリ−ストランドは高分子化の間すぐにテン
プレートとして働き、両ストランドのミューチージョン
とともにダブルスストランドＤＮＡをもたらした。この
ＤＮＡはＥ、ｃｏｌｉ中で増補され、シーケンシングに
よってミューチージョンか確かめられた。
３５のプライマリ−ミコーチージョンか起き、これらの
間にクロスを組むことによってざらに１４のミューチー
ジョンを得た。ミューチージョン９力率は望まれる変化
によって異っていた。１から６の１冨基の変化および１
５までの連続的な除去を行った。その結果のアミノ酸の
変化を表１ａにまとめる。
実施例　ＸＩＩ 本例は８．ｐａｒａ　ｅｒｔｕｓｓｉｓにおける変異し
た月び−の表現のためにプラスミドの構造を示し、作製
されＴ、Ｉ　Ｐ　丁アナログの特徴を示すものである。
１）プラスミドの複製 Ｍ＋３クローンからの複製ＤＮＡを、ｐＲに４０４中の
所望のミューチージョンを有する月す−オペロンを再構
築するために使用した。　ｐＲに４０４は、ｐ−１グル
ブとはコンパチブルでないｐＲに２フアミリーのコンジ
ャゲイテインクブラスミドである９Ｒに２９０がらの派
生１勿である。そのサイズはＩＯ，６ｋｂであり、テト
ラシララインレジスタンスげ担１つ貴伝子をも５、ｐＵ
ｃ　８からのマルチプルクローニングサイトを有する。
ＳｌおよびＳ３ブライマリーミユーテーシヨシを合わせ
てオペロンとするための構築法を第６図に示し、得られ
たクローンを表１３に示す。Ｓｌ中のクロスされたミュ
ーチージョンが、インターナルリストリクジョンサイト
、特にユニークＳａｌ■サイトを使って生成された。Ｓ
ｌ中のクロスされたミューチージョンのための一般的な
方法もまた第６図に示し、得られたクローンも表１３に
示す。
２）スーサイドブラスミド コンジャゲーテイブではあるがレプリカナイフではない
プラスミドが、Ｕ冨−または変異した到りを任意に統合
してＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ種のクロモリームにするため
に開発された。第７図にこれらのクローンの構造を示す
。
上記（１）と（２）のタイプのプラスミドを、コンジャ
ゲーテイブによりＬ匹ｄ邦旦ｓに導入した。
得られた菌株を振とうフラスコまたはフェルメンタ−の
中で育成し、その培養上澄について、ＥＬＩＳＡによっ
てトキシンアナログの濃度を下記のよう（こ分析した。
マイクロタイタープレートを、０．０５Ｍ炭酸カリウム
中、ｐＨ９，６，４°Ｃ１加速環境中で、フェツイン（
２ｕｑ／ｍｌ）でコーティングした。このプレートを、
Ｏ，ＩＸｗ／ｖ　　Ｔｗｅｅｎ−２０％含むＤｅｌｂｅ
ｃｃｏ’　ｓ　　ＰＢＳにより２度洗浄し乾燥した。サ
シプルの上澄またはワイルドタイプＰＴ％順次希釈し、
ウェルに加えた。そしてプレートを室温にで３０分培養
したのち洗浄した。結合したＰＴが、アフィニティ精製
されたペルオキシダーゼ結合抗ＰＴウサキ政体を用いで
横比された。
残った毒性をＣＨＯセル　クラスタリングアッセイによ
り測定され、自然のままのＰＴと比較して毒性を決定し
た。あるＰＴミュータントが、実施例１においで自然の
ＰＴについて説明したのと同じように純化され、ＡＯＰ
−リポシルトランスファラーセ活性について分析された
。これらのデータを表１ｂにまとめる。　ＭＡｂ　ＰＳ
２１により認められたＳ１エピトープの表現か、改良さ
れたインダイレクトＥＬＩＩＳＡによって培養上澄で評
価された。フェツイン結合ＰＴアナログが、第１攻体と
しでＰＳ２１と反応させられ、アフィニティ精製された
酵素結合ヤギアンチマウスＩ９Ｇ　ＩＦｒ腑２攻体とし
て視覚化された。
ＭＡｂ　ＰＳ２１によりＳ１エピトープの有無を調べ、
表１ｂにそれを示した。
実施例　１３ 本例は内因性の（ｅｎｄｏ９ｅｎｏｕｓ）Ｌ匹圓匹１ｓ
　ＴＯＸオペロンの欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）および交
換（ｓｕｂｓｔｉｔｌＪｔｉｏｎ）のためのためのプラ
スミドの構造（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｊｏｎ）を例示して
いる。
１）■の側面に立つ（ｆｌａｎｋｉｎ９）領域（ｒｅｑ
ｉｏｎｓ）ａ）　５″−フランキング（ｆｌａｎｋｊｎ
９）領域（ｒｅｑｉｏｎ）Ｃｈ４２１１）ＮＡはまず８
（１１ＩＩＩこよって消化（ｄｆｅｓｔ）され、次いで
Ｉ　Ｉｋｂフラグメントはアガロースゲル（ａｇａｒｏ
ｓｅ　　ｇｅｌ）電気泳動によって精製された。
８９１　ＩＩフラグメントはＸｍａ　ｒによっで消化（
ｄｉ９ｅｓｔ）され、５ｋｂバンド（ｂａｎｄ）は、あ
らかしめＸｍａ　Ｉによって切断（ｒｅｓｔｒｉｃｔ）
され、かつ脱ホスホリレーションされｒ、：：ｐＵｃ８
：２中にサブクロン化した。　ＪＭＩ０９細胞はライゲ
ーション（Ｉｉｇａｔｉｏｎ）混合１勿１こよって変質
（ｔｒａｎｓｆｏｒｒｎ）されてコロ−（ｃｏｌｏｎｉ
ｅｓ）！生じ（ｇｉｖｅ）、そのコロニーは迅速（ｒａ
ｐｉｄ）ＤＮＡＮタスクリーニング法よって分析された
。クロンＪ−１８３−９は約２．９ｋｂの５′−フラン
キング領域、ＴＯＸ−プロモーターならびにサブユニツ
１−５ｔおよびＳ２のための遺伝子を含んでいることが
わかった。第８ａ図はクロンＪ−１８３−９の派主物（
ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ）’ａ示す。
ｂ）３′−フランキング領域 ｃｈ　ＩＩＩ　ＤＮＡはＳａｔ　Ｉによって消化され、
Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　ＤＮＡの約８ｋｂの２ラグメ
ントはゲル精製された。このＤＮＡフラグメントは、あ
らかじめＳａｌ　Ｉによって消化され、かつ脱ホスホリ
レーションされた１）ＵＣ８：２中（こインサート（１
ｎｓｅｒｔ）された。ＪＭＩ０９　トランスホーマント
はスクリーンされ、クロンＪ−２１９−１１１−３はＳ
１遺伝子部分、残存する（ｒｅｍａｉｎｉｎ９）構造（
ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ）遺伝子のすべで、および約３．
９ｋｂの３′−フランキング領域を含有することが同定
された。第８ｂ図はこのクロンの構造（ｃｏｎｓｔｒｕ
ｃｔｉｏｎ）！示す。
Ｃ）５′−および３″−フランキング領域ヲ有する月び
一遺伝子 ウロンＪ−１８３−９＋よＸｂａ　Ｉによって消化され
、ｐＵｃｓ８：２を含む約７ｋｂのｆｒａｑｍｅｎｔ、
５゛−フランキング領域およびＳ１遺伝子のプロモータ
ー領域はゲル精製および脱ホスホリレーションされた。
Ｊ−２１９−１１１−３ＤＮＡはＸｂａ　Ｉによって消
化され、サブユニットＳ２からＳ５までの構造遺伝子お
よび３′−フランキング領域を含む、約８ｋｂのフラグ
メントはゲル精製された。これらのＤＮＡフラグメント
はライゲート（ｌｉ９ａｔｅ）され、ＪＭ＋０９　トラ
ンスホーマントはスクリーンされでクロンＪ−２２９−
１７をもたらしく９ｉｖｅ）た、このクロンは約２．９
ｋｂの５゛−フランキング　シーフェンス、全ＴＯＸ−
オペロン、および４ｋｂの３″−フランキング　シーフ
ェンスを含んでいる。その構造を第８Ｃ図に示す。
２）　　ＴＯＸ−欠失プラスミド プラスミドＳ−２８３２−５はプラスミドρＲＫ４０４
からのＴｅｔ’遺伝子を含んでおり、その構造は第９図
に示しである。　Ｔｅｔ”　　遺伝子はプラスミドρＮ
ＤＩ５２３中にＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩリストリクジョ
ン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）フラグメントとしてクロ
ン化され、ｐＧ２６２を生しく　ｇｅｎｅｒａｔｅ）た
、プラスミドｐＧＺ６３は５′および３″−フランキン
グ領域を、いかなるＤＮＡも介在させることなしに含ん
でいる。　ｐＧ２６２由来の５Ｉ２−Ｔｅｔ″遺伝子サ
ンドイッチはｐＧ１２６３のフランキング領域の間にク
ロン化されで、プラスミドｐＧＺ６５　！生じた。これ
らのプラスミドの構造は第８ｄ図中に要約しである。
３）　　ＴＯＸ−再導入Ｃｒｅ　ｉｎｔｅｇｒａｔ　１
ｎｑ）プラスミドＢ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのＴＯＸ−株
中の突然変異ＴＯＸ−を表すために、第１０図に示すタ
イプのコンジュガティブスイサイド（ｃｏｎｊｕｑａｔ
ｉｖｅ　５ｕｉｃｉｄｅ）プラスミドが組み立てられた
。これらのプラスミドはＴＯＸ−遺伝子、広範囲の（ｅ
ｘｔｅｎｓｉｖｅ）５’−および３゛−フランキング　
シーフェンスを含んでおり、ＴＯＸ＝遺伝情報指定（ｃ
ｏｄｉｎｃ＋　）領域からの下流部にクロン化された選
択のための膠遺伝子を持っている。
実施例　１４ 本例は、１匹１且旦り染色体からのＴＯＸ−遺伝子の欠
失およびｉｎ　ｖｉｔｒｏ−突然変異遅Ｖ−遺伝子の再
導入を例示するものである。
１）　　モ上虹±ｕｓｓｉｓ−の変質化（ｔｒａｎｓｆ
ｏｒｍａｔｉｏｎ　）Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの株かエ
レクトロポレーションによって変質化された。細胞はモ
ディファイトステイナー−ショルテ（５ｔａｉｎｅｒ−
Ｓｃｈｏｌｔｅ　）媒体（ｍｅｄｉｕｍ　）の１００ｍ
１中でミリリットル当り約１０９個の細胞濃度になるま
で増殖（ｇｒｏｗ　）され、クリニカル遠心分離ｙｉ（
４０００Ｘ９．１５分間。
２０℃）中に収穫され、２５ミリリツトルのエレクトロ
ポレーションバッハ−（０，３Ｍサッカロス、Ｉ＋ｎＭ
塩化マグネシウム、７　ｍＭリン酸カリ、ｐＨ７，２）
中で洗浄し、同バッハー１０ｍＬ中に懸濁させた。その
細胞懸濁液５００μにプラスミドＤＮＡを加え、混合物
を水上で１０分間′１＠養した。この細胞に、０．８ｍ
ｍのギャップを有するキュヘット電極を用いで、ＢＴＸ
　トランスファクタ（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｒ　）　ｔ
ｏｏ　ｌこよる単一２５にＶ／ｃｍ、　４０人の指数減
衰電圧パルスを与えた。媒体３ミリリツトルを加え、細
胞を振動下、３７℃６０分間培養した。その細胞を１２
，０００Ｘ９下、２分間の遠心分離により収穫後、　１
００μの媒体中に再懸濁させ、杭主物質による選択によ
りＢｏｒｃｌＯｔ−Ｇｅｎ９０ｕ板上に拡げ、２乃至５
日間、３７℃で培養した。
ａ）運び一オペロンの削除および形質転換ζユ、パーツ
シス５ｔｒ２９は、ζ二、バーツシ、＜１０５３６の天
然のｒｐｓＬストレプトマイシン耐性誘導体である。プ
ラスミドＰＧＺ６５は、ＴＯＸ−オペロンの５′−およ
び３″−非翻訳頓域間でクローンされたｐＲＫ４０４　
ｒｅｔＲ遺伝子およびＥ、　ｃｏｌｉＳ＋２遺伝子から
なる遺伝子カートリッジで構成されている。このプラス
ミドはヒントＩＩＩにより線状化され、ζ二、へ二又ラ
ス５ｔｒ２９をＴｅｔ’に形質転換するのに使用され、
５ｔｒＳが均質的再結合によりオペロンの削除をもたら
す。
この二の削除された菌株は２９−８と称される。
５Ｉ２−Ｔｅｔ”遺伝子カートリッジを働かすために、
菌株２９−８は、続いて線状ρＧ２６３プラスミドＤＮ
Ａで形質変換された。プラスミドｐＧＺ６３は匝Ｘ　　
５’−および３′−非翻訳領域からなるが、阻止ＤＮＡ
を有ざない。
このプラスミドによる形質変換は、ストレプトマイシン
１牲でＴＯＸ−は削除されているが、到りローカスにお
いでヘテロロガスなＯＮ八が挿入されていない菌株であ
るζ二、パーツシス５ｔｒ２９　＠生成させる。この菌
株は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ変異された遺伝子の表現のため
にホストとして便用された。第１０図に示されたタイプ
のプラスミドば変異された匪遺伝子およびＴｅｔ”遺伝
子からなる遺伝子カートリッジを有しでいる。この遺伝
子カートリッジは、接合または形質転換による菌株中へ
のプラスミドの導入に引き続いて、ζユ、パーツシス２
９−９染色体中にへ組み変えられた。　ＴＯＸ−遺伝子
の表現、Ｐ丁相似体の毒性およびＭＡＢ　ＰＳ２１によ
り認識される工どトープの維持は、前述したようにして
決定される。組み変えにより構成されたζ二、パーツシ
ス遺伝子および分泌されたＰＴ相相似性物性を笑５表に
示した。
実施例　１５ この実施例は、はつかねすみに対するＰＴ相相似性ｉｎ
　ｖｉｖｏ試験について記載する。
培養の上済みおよび実施例１で示した組み変えられたく
二、バラパーツシスからＰＴ相相似性精製した。これら
のプロティンを３つの異なった服用雪ではつかねずみに
注射し、標準操作に従い次のような特性を試験した　正
確な毒性、ヒスタミン増感活件およびはつかねずみの内
部穀物類挑戦試験での効能。
その免疫原性を評価するために、ＰＴ相相似性生後９〜
１１週のメスのＢＡＬＢ／Ｃはつかねずみに２．０．０
．５および０．　＋２５Ｌ１９の量を注射した。
これらはつかねずみは０６目に予備出血された。また、
２３日目に再度出血させられ、同じ免疫剤で免疫増強し
、３７日目に再度出血させられた。血液サシプル（０，
４〜０．５　ｘｒｌ／はつかねずみ）は眼窩溝から出血
させることにより成果し、得られた血清は一２０℃で試
験のために保存した。血清は、ＰＴで誘起されたＣ）１
０細胞群を中和する能力（第３表）および特定の抗原コ
ートに対する抗体反応、周接ＥＬＩＳ＾（第４表）につ
いて分析された。
第３表および第４表から明らかなように、ＰＴ相相似性
、抗原の中和を誘起することができ、反−ＰＴ　、反−
３１および反−Ｂオリゴマ一応答をプールする。
以上の本開示を総括すると、本発明は新規な百日ぜきト
キシンの毒′ｉを示す特定の部位を認知することによっ
て百日ぜきを無毒化させる方法、並びにトキシン遺伝子
の部位指定突然変位によって組み変えへロトキシンを製
造する方法を提供する。
得られたトキシン類似体は、無毒化され、Ｓ１工どトー
プの優性形質を保持し、免疫原性を有し、百日ぜき疾病
に対しての保護を付与する。
なお、本発明の範囲を越えない限りにおいで、各種の変
形が可能である。
譚ロ　　ヘヘヘのへへへへササＣ，）のへΩ〜へへへへ
ヘヘ■へへ寸◇　■Ｃ／）の■■ののφ１コψのののω
ωのψψφりののり１÷　奪 ７）娩 ≠ 昧（Ｏｐ 璃　二に。、。。〜。。−−−−−−−−−−（’−Ｉ
　Ｃ’Ｊ　ＵＮ、尉や アミノ酸のナンバリングは自生１重のサブユニット（ｎ
ａｔｉｖｅ　５ｕｂｕｎｉｔｓ）中のポジションに対応
する（第５図）、全ての突然変異体は、Ｓ３中と特定さ
れでいないならば、サブユニットＳ１中である（Ｓ３）
。
！＋は択一的コトン（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　ｃｏｄ
ｏｎ）　％示す。
△は欠失をひき起こされたレジデユー（ｒｅｓｉｄｕｅ
）を示す。
原生型（Ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ）とは、ビー、バラペルト
ウシス（Ｂ、ａｒａ　ｅｒｔｕｓｓｉｓ）中の突然変異
されないＴＯＸエオベロン（ｏｐｅｒｏｎ）から発現さ
れたＰＴを指す。
Ｉ）　−９ｌ　　ｌ　　ｌ　　−１１１１１１１１１１
１１１１１口７７、へ、。　　　　　　　　　へ ◇　ココ（１）Ｃ／）Ｃ／）ΣコＣ／２ωψψのののΣ
のψのψのψののの　の一つ　　　　　　。；Ｌに≧’
ｃａｂ　；ｍ≠　　　　　　　　　−（Ｃｅ（エ　。
嬬ｎｉｐ、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、
、、、　　。
儲二に麓疋翼；藁藁二＝翼冨麓麓写：；Ｓ：：：’：：
’ｌ；：写　０尉細 世 ′ｉ１９ 敢） ＩＲ口 ！！ト 沁 敢 叫０戸 七Ｘ　二にバ；語≦に、、；、、；　０−ＣＱ　（’Ｐ
）’ｅ　ｎ−〜〜００−〜゛。
尉嘘 尉細 ！：！　　嵯 ← ＼ 細口ＯくロロＱ 残留毒性（ｒｅｓｉｄｕａｌ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ）は、
ＣＨＯセルクラスタリング　アッセイにより決定された
見掛けのＰＴ濃度の、決定されたＰＴ突然変異体のパー
センテージで表わされた実際の濃度に対する比である。
ＡＤＰＲ活性は、ＰＴアナログにより触媒作用を及ぼさ
れたウシ属のトランスドゥクシン（ｂｏｖｉｎｅｔｒａ
ｎｓｄｕｃｉｎ）のパーセンテージで表わされた等濃度
の原生型ＰＴにより触媒作用を及ぼされたそれに関連し
たＡＤＰのリボシル化（ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ）の
程度である。
Ｓ１工どトープとは、原生型ＰＴ（◆・・＋つと比較し
た、特殊モノクロナール抗体ＰＳ２１により認められた
イムノトミナン１−８１エピトープの発現を指す。
ＮＯは決定されなかったことを示す。
ＨＳ活性はヒスタミン感作活性（ｈｉｓｔａｍｉｎｅｓ
ｅｎｓｉｔｉｚｉｎｑ　ａｃｔｉｖｉｌｙ）　′ＪＦ！
：表わす。
Ｍ、　Ｐ、　Ｔ、はマウス大脳内チャレンジ保護試験（
ｍｏｕｓｅ　１ｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ　ｃｈａｌｌ
ｅｎｑｅ　ｔｅｓｔ）　％表わす。
１０５ｏは試験動物の５０％が死ぬ投与量である。
ＥＱ！ｉｏは試験動物の５０％が保護される投与量であ
る。
自生種（ｎａｔｉｖｅ）はＬ肛ｄ旦旺長１０５３６から
のＰＴである。
＠へ ０区 駅１ｒ′Ｘ マウスは０日に予め血を採り（ｐｒｅ−ｂｌｅｄ）免疫
化された。２３日に再度血を採り（ポスト−１ブリード
）、ブースト（ｂｏｏｓｔ）　した、最終血清は３７日
に得られた（ポスト−２ブリーＦ：）。
血清の無効化能は、ＣＨＯ細胞クラスタリングが抑制さ
れる最大の稀鐸で表わされる。
免疫化および採血は表３におけると同様に行われた。
用いられた抗原はＰＴホロトキシ（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ
）、単離されたＳｌす７ユニツトおよび単離されたＢオ
リゴマーであった。
単位は、バックグラウンドの２倍（こ等しいＥＬＩＳＡ
吸収を示す稀鐸ファクターを１０ｏＯで割ったものであ
る。
Ｎ８は、抗原と反応しないことを示す。
姦：昨 ＣＲ
【図面の簡単な説明】
第１図は、放射線ラベルをされたペプチドＡおよびＢの
自動化された配列化により得られたアミノ酸の配列を示
しており、配列は成熟したＳｌから残基を比較している
。 第２図は、染色体ライブラリーから得られた種々のＴＯ
Ｘクローンの構造を示している。 第３図は、遺伝子クローン（んｇｔｌｌ　１５−４−１
　）からのＴＯＸ遺伝子を含んでいるサブクローンの構
成を示しており、ｐ［Ｉｃ８：２の多数のクローン位置
に挿入されている匪遺伝子をもち、Ｂｇｌ　ＴＩおよび
Ｘｂａ　１位置を含んでいる。 第４図は、オペロンの配列化に使われたＴＯＸ遺伝子の
サブクローンの構成を示している。（ａ）において、Ｔ
ＯＸ遺伝子と蛋白質サブユニットの制限地図が示すレテ
オリ、ｐＵｃ８：２／ＴＯＸクロー　：／　Ｊ−１６９
１から誘導されているクローン類、およびＭ１３ｍｐ１
８、Ｍ１３＋ｎｐ１９またはｐＵｃ８：２中へサブクロ
ーン化されているサブユニット遺伝子をもつことを示し
、（６）において、ｐＵｃ８：２の５′領域のクローン
類、閘１３ｍｐ１８　ｆこお１するＳＩＪよびＭＩ３ｍ
ｐ１９１こアＩするＳ）クローン類が記載されている。 （Ｃ）において、ＭＩ３ｍｐ１８中のＳ２およびＭＩ３
ｍｐ１９中のＳ２クローンを示している。（ｄ）におい
でＭＩ３ｍｐ＋８およびＭＩ３ｍｐ１９中のＳ４／Ｓ５
クローンを示す。（ｅ）において、Ｍｌ　３ｍｐ１８お
よびｐＵｃ８・２中のＳ３および３′領域のクローンを
示す。 第５図は、ニュクレオチドシクエンスと８．ｐｅｒｔｕ
ｓｓｉｓ１０５３６ＴＯＸ遭伝子の構成遺伝子転写生成
物を示す。 第６図は、ブロード−ホスト−レインジブラスミド（ｂ
ｒｏａｄ−ｈｏｓｔ−ｒａｎｑｅ　ｐｌａｓｍｉｄ）ｐ
Ｒに４０４中の匪またはハル−のアナログの遺伝の構造
を示す（Ｄｉｔｔａｅｔ　ａｌ、、Ｐｌａｓｍｉｄ、１
３．Ｉ４９．［ｌ９８５］）、　（ａ）および（ｂ）に
は、突然変異遺伝子からのｐＲＫ　４０４中の一次丁Ｏ
Ｘアナログの遺伝子および自生の遺伝子の構造が示され
、また（ｃ）１こは、二つの３１突然変異遺伝子からの
「交差した（ｃｒｏｓｓｅｄ）　Ｊ突然変異体の共形的
構造が示されでいる。 第７図は、「スイサイド（ｓｕｉｃｉｃｌｅ）　Ｊプラ
スミドの生長を示す。一つは非相同の（ｎｏｎ−ｈａｍ
ａｌｏｑｏｕｓ）組換えのためのＩ）Ｒに４０４および
ｐＭに２００４（ｋａｈｎ　ａｔ　ａｌ　、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｑｙ　６８２７８゜［＋
９７９］）に基くコンジュガティブ　トランスフｐ　−
（ｃｏｎｊｕｑａｔｉｖｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）の能力
をもつが、レブリケーション（ｒｅｐＮｃａｔｉｏｎ）
の能力を有せず、最終のプラスミドもまたＴｎ５誘導カ
ナマイシン耐牲遺伝子およびＴＯＸまたはＴＯＸのアナ
ログの遺伝子を含む。 第８図は刈り遺伝子の５′−および３′−フランキング
Ｃｆ１ａｎｋｉｎｑＢｉ域のクローン化を示す。 （ａ）は、λシャロン（ｃｈａｒｏｎ）３５クローンＣ
ｈ　４２１がらのρＵＣ８：２中のＴＯＸ−の５′部分
の構造を示し、（ｂ）はλＣｈｌｌ＋からのｐｕｃ　８
：２中の匪の３部分の構造を示し、（Ｃ）はＵ冨工およ
びその５′および３′−フランキング領域を含むｐＵｃ
　８・２クローンの発生を示す。 第９図ａ）〜Ｃ）は相同の再結合による、８．パーラン
ス（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）染色体からの月び−オペロン
のデイレ−ジョンのプラスミドの構湯ヲ示す。 第１０図は、相同の再結合による、Ｂ、パーツシス・ゲ
ノム（ｑｅｎｏｍｅ）の中の■相似体のレインティグレ
ージョンのプラスミドの構造を示し、最後のプラスミド
は、第７図に示した自滅プラスミドに基づいており、且
つハル−相似体ゲンに対するＩ）Ｒに４０４からのテト
ラサイクライン・レジスタンス・ゲンを含む。 ＦＩＧ、　１ ０シの汀亡グて：°二大更なしン Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ａ ＰｅｐヒュｄｅＢ １１ｅＬｅｕＡｌａＧｌｙＡｌａＬｅｕＡｌａＴｈｒＴ
ｙｒＧｌｕＳｅｒ＊ＴｙｒＬｅｕＡｌａ＋１ｅ　Ｌｅｕ
　　−Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｙ
ｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　　★　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ特
許出曽人 コノート ラボラトリイズ リミテッド ５ｕｂｕｎｉｔ　　５１ ｐ、ｅｓｉｄｕｅ　　Ｎｏ。 １１ｅＬｅｕＡｌａＧｌｙＡｌａＬｅｕＡｌａＴハｒＴ
ｙｒＧｌｕＳｅｒＧｌｕＴｙｒＬｅｕＡｌａ＋２０　　
　　　　　　　　　　１２５　　　　　　　　　　　１
３０責　ｊミロ９之 代 理 人 右 林 中 Ｍ１３ｍｐ　１９／Ｓ Ｍ１３ｍｐ　ｉ８／Ｓ。 ＩＧ４ ｐＵｃ／Ｓ、３′（ｃ） ｐＵｃ／Ｓ、３’（ａ） Ｉ６６ Ｃ） ＦＩＧ、６ 偽　ｔ’Ｐ−許イｉ ＦＩＧ８ ｐｕｃ／＋’ｒ　Ｓ、　ｓよ ＦＩＧ、７ ｌ０８ ｂ） ｐｕｃ／ｓ、ｓ４ｓ、　ＳＪ３’ｔ ＦＩＧ８ ハ’７斗〉ブ：　祠＝　ＪＥ′球”Ｐ：　ｒｏｘ　ｔコ
ート１３ケ員工戒ハーフ４＞７’！れて一＋Ｔｊ・′予
扛Ｑ　、−７ラン痔ン２レーワニシス日Ｇ、９

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １）免疫的防御に用い得る、遺伝子操作により無毒化さ
    れた百日ぜきトキシンミュータント。 ２）前記トキシンのＡ部分（ＳＩサブユニット）または
    前記トキシンのＢ部分、あるいはこれらＡ部分及びＢ部
    分の両方について遺伝的な修飾が加えられている請求項
    １記載のミュータント。 ３）前記百日ぜきトキシンが、天然百日ぜきトキシの１
    アミノ酸が欠失または置換されているものである請求項
    １または２に記載のミュータント。 ４）前記ミュータントが、天然百日ぜきトキシンのＧＬ
    Ｕ＾１＾２＾９が欠失あるいはＧＬＹ＾１＾２＾９に置
    き換わったものであるか、あるいは天然百日ぜきトキシ
    ンのＡＲＧ＾５＾８がＧＬＵ＾５＾８に置き換わったも
    のである請求項３記載のミュータント。 ５）前記ミュータントが、天然百日ぜきトキシンの複数
    のアミノ酸が欠失または置き換えられているもである請
    求項１または２記載のミュータント。 ６）前記ミュータントが、天然百日ゼきトキシンのＧＬ
    Ｕ＾１＾２＾９及びＴＹＲ＾１＾３＾０がＧＬＹ＾１＾
    ２＾９及びＧＬＹ＾１＾２＾９及びＰＨＥ＾１＾３＾０
    に置き換わったものであるか、あるいは天然百日ぜきト
    キシンのＧＬＵ＾１＾２＾９／（Ｓ３）ＴＹＲ＾９＾２
    ＬＹＳ＾９＾３がＧＬＹ＾１＾２＾９／（Ｓ３）ＡＳＮ
    ＾９＾２ＡＲＧ＾９＾３に置き換わったものである請求
    項５記載の ミュータント。 ７）その残存毒性が天然百日ぜきトキシンの約０．５％
    以下である請求項１〜６のいずれかに記載のミュータン
    ト。 ８）天然百日ぜきトキシン遺伝子の部位指定突然変異に
    より生じたものである請求項１〜７のいずれかに記載の
    ミュータント。 ９）減少されたヒスタミン感受性活性を有する請求項１
    〜８のいずれかに記載のミュータント。 １０）請求項１〜９のいずれかに記載のミュータントの
    有効量、あるいは該ミュータントのトキソイドと、生理
    学的に許容され得る担体とを含む￥Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌ
    ａ￥　￥ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ￥に対するワクチン。 １１）ハプテン、多糖類またはポリペプチドに対する抗
    体応答を誘導するために、ハプテン、多糖類またはポリ
    ペプチドに共有結合させた請求項１〜９のいずれかに記
    載のミュータントを含む活性コンジュゲートの有効量を
    含むコンジュゲートワクチン。 １２）百日ぜきトキシンオペロン及び外来遺伝子を有せ
    ず、かつ抗生物質の不在下で生育でき、それにより百日
    ぜきトキシンに対しフリーな￥Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ
    ￥抗源を生産し得ることを特徴とする￥Ｂｏｒｄｅｔｅ
    ｌｌａ￥　￥ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ￥株。 １３）そのトキシンオペロンが、百日ぜきトキシンの毒
    性に関与する少なくとも１アミノ酸が変異するように部
    位指定突然変異を行なった変異遺伝子により置換されて
    いる￥Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ￥　￥ｐｅｒｔｕ−ｓｓｉ
    ｓ￥株。 １４）前記変異遺伝子が、クローンＮｏ．Ｓ−３０３６
    −２、Ｓ−３１２２−３−１、Ｓ−２９６２−１−１、
    Ｓ−２９６２−２−１またはＳ−３１２２−２−３であ
    る請求項１３記載の菌株。 １５）第５図に示すヌクレオチド配列及び構造遺伝子翻
    訳を有する天然￥Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ￥　￥ｐｅｒｔ
    ｕｓｓｉｓ￥１０５３６　￥ＴＯＸ￥オペロン。 １６）下記各工程を含むことを特徴とする免疫的防御に
    用い得る、遺伝子操作により無毒化された百日ぜきトキ
    シンミュータントの生産方法；ａ）百日ぜきトキシンの
    毒性に関与するアミノ酸残基の少なくとも１つを特定す
    る工程； ｂ）該アミノ酸残基が欠失または置換されるように、該
    百日ぜきトキシンの遺伝子に部位指定突然変異を起こさ
    せて、変異トキシンオペロンを作成する工程； ｃ）￥Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ￥　￥ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ
    ￥の天然遺伝子中に前記工程ｂで得た変異トキシンオペ
    ロンを置換する工程；及び ｄ）前記工程ｃで得た変異トキシンオペロンを有する変
    質転換体を増殖させて、免疫防御のために用い得る遺伝
    子操作により無毒化されたトキシンを生産する工程。 １７）前記トキシンのＳ１サブユニット中の１機能活性
    アミノ酸を毒性関与アミノ酸として特定し、該１アミノ
    酸に対応する遺伝子部分に部位指定突然変異を起こさせ
    る、あるいは複数の機能活性アミノ酸を毒性関与アミノ
    酸として特定し、該複数アミノ酸に対応する遺伝子部分
    に部位指定突然変異を起こさせ、百日ぜきトキシンのこ
    れらアミノ酸部位を変異させる請求項１６記載の方法。 １８）前記変異トキシンオペロンの天然遺伝子中への置
    換が、接合（コンジュゲーション）またはエレクトロボ
    レーションによる請求項１６または１７記載の方法。
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