CN114381445A

CN114381445A - 具有杀灭疟原虫作用的沙雷氏菌脂肪酶及其编码基因

Info

Publication number: CN114381445A
Application number: CN202011120520.8A
Authority: CN
Inventors: 王四宝; 高涵
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2020-10-19
Filing date: 2020-10-19
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2040-10-19
Also published as: CN114381445B; WO2022083516A1

Abstract

本发明提供了一种具有杀灭疟原虫作用的沙雷氏菌脂肪酶及其编码基因。本发明人从沙雷氏菌中分离到了一种新颖的脂肪水解酶，将之命名为AmLip。该AmLip多肽其具有选择性杀伤能力，其特异性酶解病原体(如疟原虫)的细胞膜，而不对病原体宿主的细胞膜构成影响。本发明为生物防治病原体以及防治病原体介导的疾病提供了有效的途径。

Description

具有杀灭疟原虫作用的沙雷氏菌脂肪酶及其编码基因

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及具有直接杀灭疟原虫作用的沙雷氏菌脂肪酶及其编码基因，主要用于疟疾等寄生虫疾病的防控和治疗。

背景技术

疟疾(Malaria)是感染疟原虫(Plasmodium spp)引发的寄生虫疾病，每年致死约50万人，绝大部分是5岁以下的儿童(World malaria report 2017，ISBN 978-92-4-156552-3)。在全球化的今天，疟疾的传播对包括中国在内的世界各国造成了严峻的公共卫生挑战，中国输入性疟疾持续增长(Epidemiology of Imported Infectious Diseases，China，2005-2016，Emerg Infect Dis.Vol.25，No.1，January 2019)。由于疟疾防治目前尚无高效疫苗，治疗疟疾感染主要依赖青蒿素、氯喹(Chloroquine)、磺胺嘧啶等化合物。然而近年来疟疾耐药问题日益凸显，抗药虫株，甚至是多重抗药虫株呈现出扩散的趋势(Kasturi Haldar et al，Drug resistance in Plasmodium，Nature ReviewsMicrobiology 2018)，因此寻找机制新颖的抗疟活性物质显得尤为重要。疟原虫具有复杂的生活周期，如在红细胞内寄生的无性期(asexual stage)，以及在按蚊体内分化形成的配子发育形成的动合子-卵囊-子孢子时期(有性期，sexual stage)。不同生活阶段的疟原虫在细胞生理、代谢特征上存在本质差异，而目前的抗疟药物大多只能针对某一阶段的疟原虫起作用，如磺胺嘧啶只能杀灭无性期疟原虫，对有性阶段疟原虫没有效果。此外，现有的抗疟药物主要针对疟原虫的特定代谢途径产生作用，需要等到该代谢途径严重影响疟原虫生存才能起效，给了疟原虫一个“喘息”的机会。疟原虫也可以通过代偿代谢途径或者产生基因突变的多种方式来产生抗药性，例如疟原虫K13编码基因的单核苷酸突变直接关系到了青蒿素的耐药性(Ariey F et al，A molecular marker of artemisinin-resistantPlasmodium falciparum malaria.Nature.2014；505:50-55)。因此，新的抗疟活性产物如果能够直接靶向破坏疟原虫的细胞结构，并具有杀伤多发育阶段疟原虫的能力，将在治疗和阻断疟原虫方面具有更大应用价值，并缓解疟疾抗药性扩散的挑战。

疟疾的传播依赖按蚊(Anopheles)作为媒介，而按蚊肠道含有丰富的共生细菌，可以作为疟疾阻断的重要资源。通过挖掘按蚊肠道共生菌进行疟疾阻断的研究近年来受到科研界的极大关注。如通过利用按蚊肠道共生细菌AS1表达抗疟分子起到疟疾阻断的作用(Sibao Wang et al，Driving mosquito refractoriness to Plasmodium falciparumwith engineered symbiotic bacteria，Science 29 Sep 2017:Vol.357，Issue 6358，pp.1399-1402)。本发明人团队近年来发现了按蚊肠道存在多株具有天然抗疟原虫活性的共生菌。因此按蚊肠道共生菌是一个重要的资源宝库，深挖按蚊肠道共生菌资源，分离鉴定共生菌抗疟活性成分将是开发新型抗疟药物的有效途径。沙雷氏菌(Serratia spp)是按蚊肠道的核心共生菌，属于菌界-变形菌门-γ变形菌纲-肠杆菌目-肠杆菌科-沙雷氏菌属。沙雷氏菌属于革兰氏阴性细菌，也是环境中常见的细菌，广泛分布于土壤、水体中。按蚊肠道沙雷氏菌以粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)报道较为多见。多种沙雷氏菌对蚊虫病原体具有抑制作用。本发明人团队最近的结果发现一株粘质沙雷氏菌可以通过激活蚊子免疫拮抗疟原虫(Liang Bai et al，A Gut Symbiotic Bacterium Serratia marcescensRenders Mosquito Resistance to Plasmodium Infection Through Activation ofMosquito Immune Responses，Front.Microbiol.，2019.01580)。

由于按蚊肠道菌群多样，通过筛选出具有天然抗疟能力的菌株，并鉴定其活性产物是获得防控和治疗疟疾等寄生虫疾病，或用于构建生物工程菌阻断媒介传播疟疾等重要途径。然而，迄今尚无直接从按蚊肠道共生菌获得抗疟原虫活性产物的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供具有杀灭疟原虫作用的沙雷氏菌脂肪酶及其编码基因。

在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，所述多肽具有以下特征：为分离自沙雷氏菌的多肽，或其保守性变异多肽或同源物；其序列中包含催化脂肪水解的催化结构域、Helix结构域和β-roll结构域，具有脂肪水解酶活性；特异性靶向于病原体细胞膜，破坏其细胞膜结构。

在一个优选例中，所述催化结构域具有相应于SEQ ID NO:1中第135～217位所示的氨基酸序列；较佳地，所述催化结构域含有GxSxG为基序的催化中心；包含一个Ser，其相应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第207位的丝氨酸(Ser)。

在另一优选例中，所述沙雷氏菌包括(但不限于)：解脲沙雷氏菌(Serratiaureilytica)，粘质沙雷菌(Serratia marcescens)，深红沙雷氏菌(Serratia rubidaea)，液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)，普城沙雷菌(Serratia plymuthica)，无花果沙雷氏菌(Serratiaficaria)，格氏沙雷氏菌(Serratia grimesii)。

在另一优选例中，所述多肽包括选自：(a)SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；(b)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列有至少70％相同性(较佳地75％以上；更佳地80％以上；更佳85％以上，如90％，95％，98％或99％以上)，且具有(a)所限定的多肽的功能(包括脂肪水解功能)的多肽；(c)将(a)所限定的多肽的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)所限定的多肽的功能的多肽；(d)(a)～(c)任一所述多肽的片段，其包含有该多肽的催化结构域、Helix结构域和β-roll结构域，且具有(a)所限定的多肽的功能；(e)(a)～(d)任一所述多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；或，(f)(a)～(e)任一所述多肽经组合构成的多肽复合物。

在另一优选中，所述多肽中，其催化活性中心的氨基酸是保守的，或其催化结构域的氨基酸是保守的。

在另一优选中，所述多肽中，其催化结构域的氨基酸是保守的。

在另一优选中，所述多肽中，其Helix结构域的氨基酸是保守的。

在另一优选中，所述多肽中，其β-roll结构域的氨基酸是保守的。

在另一优选中，所述Helix结构域的氨基酸序列为相应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第31～74位。

在另一优选中，所述β-roll结构域为1或2个β-roll结构域。

在另一优选中，所述β-roll结构域的氨基酸序列为相应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第368～418位和/或第489～564位。

在另一优选中，(d)中，所述“终止于第271～614位中的任一位”包括但不限于终止于：第418位、第480位、第564位，或它们的邻近位点。

在另一优选中，(d)中，所述片段包括催化结构域、Helix结构域以及2个及以上β-roll结构域。

在另一优选中，所述多肽包括选自：具有SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的多肽。

在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，包含选自下组的多核苷酸：(1)编码前面任一所述多肽的多核苷酸；(2)与多核苷酸(1)互补的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种基因工程细胞，它含有所述的载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供制备前面任一所述多肽的方法，包括：(i)培养所述的基因工程细胞；(ii)收集含有所述的多肽的培养物；(iii)从培养物中分离出所述的多肽。

在本发明的另一方面，提供前面所述多肽或编码该多肽的多核苷酸的用途，用于：抑制病原体；制备抑制病原体的组合物；或，制备防治病原体感染相关疾病的组合物。

在一个优选中，所述多肽通过特异性靶向于病原体细胞膜，破坏其细胞膜结构发挥抑制作用；较佳地，所述多肽选择性破坏病原体细胞膜，不损害病原体宿主的细胞膜。

在本发明的另一方面，提供一种分离用于抑制病原体的组合物或单体的方法，包括：(i)培养沙雷氏菌，所述沙雷氏菌包括(但不限于)：解脲沙雷氏菌(Serratiaureilytica)，粘质沙雷菌(Serratia marcescens)，深红沙雷氏菌(Serratia rubidaea)，液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)，普城沙雷菌(Serratia plymuthica)，无花果沙雷氏菌(Serratiaficaria)，格氏沙雷氏菌(Serratia grimesii)；(ii)从(1)的沙雷氏菌培养物中获得菌株代谢产物、培养液、培养上清或裂解物，从中分离分子量大于3KDa的组分，作为抑制病原体的组合物；或从该组合物中进一步分离SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7任一所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异多肽或同源物。

在本发明的另一方面，提供用于抑制病原体的组合物，其包括选自下组的组合物：含有前面任一所述多肽的组合物；含有所述的分离的多核苷酸或所述表达载体的组合物，其能表达前面任一所述多肽；含有所述的基因工程细胞的组合物；或，含有菌株代谢产物、培养液、培养上清或裂解物的组合物，所述菌株包括(但不限于)：解脲沙雷氏菌(Serratiaureilytica)，粘质沙雷菌(Serratia marcescens)，深红沙雷氏菌(Serratia rubidaea)，液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)，普城沙雷菌(Serratia plymuthica)，无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)，格氏沙雷氏菌(Serratia grimesii)；较佳地，所述菌株代谢产物、培养液、培养上清或裂解物中含有来自所述菌株的分子量大于3KDa的组分。

在一个优选中，所述的组合物还包括生物学可接受的载体；较佳地所述生物学可接受的载体包括(但不限于)：溶剂、缓冲液、冻干保护剂、润湿剂、渗透剂、分散剂、乳化剂、稳定剂、粘附剂、充填剂、佐剂、助剂、表面活性剂或控释剂。

在本发明的另一方面，提供一种制备抑制病原体的组合物的方法，包括：将前面任一所述多肽与生物学可接受的载体混合。

在本发明的另一方面，提供一种抑制病原体的方法，包括：利用前面任一所述的多肽或所述的组合物进行抑制。

在一个优选例中，将任一所述的多肽施用于病原体宿主或含有(或潜在含有)病原体的区域(如公共场所)，从而抑制病原体的感染或传播。

在另一优选例中，所述病原体包括：疟原虫，弓形虫或血吸虫。

在另一优选例中，所述的病原体宿主包括：人，蚊虫，啮齿类动物，非人灵长类动物，禽类，鸟类。

在另一优选例中，所述的疟原虫为以人、蚊虫、啮齿类动物、非人灵长类动物、禽类或鸟类为宿主的疟原虫；较佳地包括：恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)，伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)，三日疟原虫(Plasmodium malariae)，卵型疟原虫(Plasmodiumovale)，间日疟原虫(Plasmodium vivax)，巴西疟原虫(Plasmodium brasilianum)，食蟹猴疟原虫(Plasmodium cynomolgi)，诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)，许氏疟原虫(Plasmodium schwetzi)，猿疟原虫(Plasmodium simium)，夏氏疟原虫(Plasmodiumchabaudi)，约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)，鸡疟原虫(Plasmodium gallinaceum)，残疟原虫(Plasmodium relictum)。

在本发明的另一方面，提供一种用于抑制病原体或防治病原体感染相关疾病的试剂盒/药盒，其包含：前面任一所述多肽；所述的分离的多核苷酸或所述表达载体，其能表达所述多肽；所述的基因工程细胞；或，所述的组合物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、解脲沙雷氏菌Su_YN1代谢上清抗疟原虫活性测定，以氯喹(Chloroquine)为阳性对照。A～C，Su_YN1代谢上清处理对恶性疟原虫以及配子体的生长抑制情况；D～E，Su_YN1代谢上清处理对伯氏疟原虫的动合子的抑制作用。

图2、Su_YN1抗疟活性产物的超滤分析和酶解分析。A，滤液和截留液抗疟活性；B，胰酶处理Su_YN1代谢上清后的考马斯亮蓝染色情况；C，Su_YN1代谢上清的抗疟原虫活性可以被胰蛋白酶显著破坏。

图3、抗疟活性AmLip编码基因的敲除筛选。

图4、AmLip蛋白结构和突变以后抗疟活性检测。A，酶突变体的结构域分析示意图；B，Lipase活性蛋黄平板检测实验；C，突变的序列用于回补Su_YN1的AmLip敲除株，测定回补情况。

图5、AmLip蛋白靶向裂解疟原虫细胞膜的免疫荧光检测。A，人疟原虫细胞共孵育实验的免疫荧光图；B，伯氏疟原虫动合子共孵育实验的免疫荧光图。

图6、抗疟活性蛋白AmLip的表达纯化和抗疟活性检测。A，原核表达纯化蛋白的考马斯亮蓝染色；B，Lipase活性蛋黄平板检测实验；C，纯化的AmLip蛋白的抗疟测试。

图7、抗疟活性蛋白AmLip分段表达纯化和抗疟活性检测。A，AmLip蛋白结构和分段示意图；B，AmLip蛋白原核表达纯化的蛋白片段的考马斯亮蓝染色；C，AmLip蛋白分段的Lipase活性蛋黄平板检测实验；D，AmLip蛋白分段的抗疟测试。

图8、AmLip的鼠抗血清的制备和活性阻断实验。A，利用抗血清识别Su_YN1代谢上清中的AmLip蛋白；B，特异性分析；C，AmLip抗血清抑制Su_YN1代谢上清的抗疟活性呈现出剂量依赖效应。

图9、多种沙雷氏菌来源的AmLip蛋白均具有抗疟活性。

具体实施方式

本发明人经过大规模的筛选和深入的研究，从沙雷氏菌中分离到了一种新颖的脂肪水解酶，本发明人将之命名为AmLip，特异性水解病原体细胞膜，但对于病原体宿主细胞膜没有损害。本发明的AmLip在多种沙雷氏菌中均保守性存在。

术语

如本文所用，术语“本发明的多肽”、“本发明的蛋白”、“脂肪水解酶”、“AmLip”可互换使用，指分离自沙雷氏菌的多肽，或其保守性变异多肽或同源物。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的多肽(本发明中为AmLip)”是指所述AmLip基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的多肽纯化技术纯化所述AmLip。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。所述AmLip的纯度能用氨基酸序列分析。

如本文所用，所述“病原体”是对于人、动物、植物或环境具有危害性的微生物。更具体地，“病原体”是指细胞膜能由本发明的AmLip水解/损坏的微生物，所述微生物包括：疟原虫，弓形虫或血吸虫等；较佳地，所述“病原体”具有与其宿主在细胞膜结构和性质上具有显著的不同，当AmLip作用于所述病原体时，其宿主的细胞膜不发生水解/损坏。

本发明中，所述“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

如本文所用，“生物学可接受的载体”是用于将本发明的AmLip传送给需要处理的对象(包括病原体宿主、宿主所在的场所或病原体所载的场所)的，在毒性、副作用方面可控的、环境友好或对人畜无害溶剂、悬浮剂或赋形剂。所述载体可以是液体或固体，较佳的是能够较高程度保持本发明的AmLip的生物活性的载体。

如本发明所用，所述的“病原体宿主”为一种生物体，其能携带微生物，或其被微生物侵染、附着并能与微生物共存，有一些情况下，其还能将所携带的微生物进一步传播。本发明中，所述的“宿主”为病原体如疟原虫的宿主。

如本发明所用，所述的“疟原虫宿主”包括能够被疟原虫附着、感染或能够与疟原虫共存的生物；在一些具体的实施方式中，所述疟原虫宿主例如但不限于：人、蚊虫，啮齿类动物，非人灵长类动物，禽类，鸟类等。

AmLip及其分离或表达

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括所述AmLip的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然AmLip相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“所述AmLip”指分离自沙雷氏菌的多肽或其保守性变异多肽或同源物，其具有脂肪水解酶的活性。在本发明的优选方式中，所述AmLip包括选自SEQ IDNO:1～SEQ ID NO:7任一所示氨基酸序列的多肽。该术语还包括具有与所述AmLip相同功能的、SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7任一所示氨基酸序列的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，更佳地1-10个，最佳地1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变多肽的功能。比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变多肽的功能；又比如，仅表达该蛋白的催化结构域、Helix结构域以及β-roll结构域，而不表达碳水化合物结合结构域也能获得和完整蛋白的催化功能。因此该术语还包括所述AmLip的活性片段和活性衍生物。例如，变异可以发生在SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7任一所示氨基酸序列的多肽的保守功能域之外。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与所述AmLip DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗所述AmLip的抗体获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含所述AmLip或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了所述AmLip的片段。通常，该片段具有所述AmLip序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供所述AmLip蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然所述AmLip的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

在一些优选方式中，“所述保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:1～7任一所示的氨基酸序列相比，有至多30个，较佳地至多20个，更佳地至多10个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

对于AmLip的功能域，本发明人的研究显示(图4A)，其具有脂肪酶催化结构域，较佳地该结构域为以GxSxG为基序的活性中心构成的结构域；较佳地其包含一关键的Ser(相应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第207位)。利用该结构域发挥对于病原体细胞膜的脂肪水解活性。因此，在优选的方式中，在AmLip的保守性变异多肽、片段、衍生物、类似物等中，所述催化结构域中的催化中心是保守的；更优选地，该催化结构域是保守的。并且，本发明的AmLip，还包括Helix结构域以及至少一个(1个或2个)β-roll结构域。

本发明的AmLip的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。

为了使翻译的蛋白分泌表达(如分泌到细胞外)，还可在所述AmLip的氨基酸氨基末端添加宿主适用的信号肽。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。

根据本发明所提供的分离的AmLip信息，本领域人员可以通过蛋白分子改造等手段进一步提高其酶活力、或扩大其适用的PH值范围、温度范围、耐盐性及对于冷、热的稳定性等，因此其应用前景良好。采用这些技术改造本发明所述AmLip后生成的变体、衍生物及其混合制剂也被包含在本发明中。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与AmLip的天然编码序列或与SEQ ID NO:1所示编码序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:1～SEQ IDNO:7任一的多肽，但与AmLip的天然编码序列或SEQ ID NO:1所示编码序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7任一的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严谨条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7任一所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

所述AmLip核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也提供了包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或所述AmLip编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的所述AmLip。一般来说有以下步骤：

(1).用编码所述AmLip的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化多肽。

本发明中，所述AmLip多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含编码所述AmLip的DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子后面，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达多肽。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。在本发明的优选方式中，所述的宿主细胞为原核细胞。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

作为本发明的优选方式，采用大肠杆菌作为宿主细胞来表达所述AmLip。本发明通过构建表达系统，在大肠杆菌中异源表达所述的AmLip。

本发明所述的AmLip，也可通过培养天然沙雷氏菌，从天然菌株的代谢产物、培养液、培养上清或裂解物中分离获得。本发明人发现，AmLip存在于代谢产物、培养液、培养上清或裂解物中分子量大于3KDa的组分内。沙雷氏菌的培养可以是实验室规模的或更大规模的，从而可大量地获得含有活性AmLip的组合物或混合物或单体。

AmLip的应用

本发明获得AmLip酶活性理想，选择性好。其能够适于在大肠杆菌表达的温度条件下被重组表达，有着广泛的应用潜力。根据本发明人的新发现，本发明所述的AmLip的用途包括：抑制病原体，制备抑制病原体的组合物，制备防治病原体感染相关疾病的组合物。

AmLip蛋白对于不同种属的疟原虫，以及疟原虫不同生活阶段均具有优异的杀灭效果。本发明人发现，AmLip蛋白可以进入疟原虫细胞，快速造成疟原虫细胞的破裂死亡。AmLip蛋白抗疟作用依赖于其脂肪水解活性，通过水解破坏疟原虫膜结构，造成细胞膜破裂，同时AmLip蛋白对疟原虫具有选择性，对于宿主红细胞没有明显破坏特性。尤其是本发明人通过表达纯化获得的AmLip蛋白，显示出了优异的杀灭疟原虫的能力(IC0.08～2ug/ml)，这些结果显示AmLip蛋白是一个新的抗疟原虫活性蛋白，在疟原虫感染治疗和传播阻断上具有巨大的应用潜能。

AmLip蛋白可以靶向结合疟原虫细胞膜结构，通过其脂肪酶活性破坏疟原虫细胞膜快速杀死疟原虫。AmLip蛋白在体内和体外实验中均显示出强烈的抗疟原虫效果，并且对不同种属的疟原虫，以及疟原虫发育的多个阶段均具有杀灭效果。寄生虫具有比宿主高的代谢需求，具有旺盛的跨膜转运，将AmLip摄取进入细胞；寄生虫膜具有特殊的脂质组成，而AmLip作为一类特别的亲脂性蛋白，对寄生虫膜的亲和性更强。因此，应理解，本发明的AmLip也能够杀灭疟原虫以外的其它寄生虫。本发明的初步实验已经显示，其也能对其它寄生虫，诸如弓形虫、血吸虫有杀灭效果。

登革热病毒已被证实没有抑制效果，因此现在确定排除在专利保护范围以外。弓形虫和血吸虫与疟原虫同属真核寄生虫，非常有希望具有抑制活性。我建议我们的保护范围限定在真核寄生虫传染病，这样做的另一个好处是，这些寄生虫生理情况相似，在解释药物选择性和作用机制时逻辑更好。

AmLip蛋白的抗疟原虫等寄生虫的机制直接而新颖，不同于现有的抗疟药物作用机制，具有广泛的应用前景。

在获得了本发明的AmLip后，根据本发明的教导，本领域人员可以方便地应用该酶来发挥抑制病原体的作用，其通过特异性靶向于病原体细胞膜，破坏其细胞膜结构发挥抑制作用；较佳地，所述多肽选择性破坏病原体细胞膜，不损害病原体宿主的细胞膜。

在一种方式中，提供了一种抑制病原体的方法，包括：利用本发明所述的AmLip多肽或所述的组合物进行抑制。

在另一种方式中，提供了一种抑制病原体的方法，包括：将编码本发明所述的AmLip多肽的多核苷酸引入到基因工程细胞或工程菌中，所述基因工程细胞或工程菌可大规模地被扩繁，将所述的基因工程细胞或工程菌施用于病原体宿主，从而发挥抑制作用。在一种更具体的方式中，所述病原体为疟原虫，所述的病原体宿主为人、疟原虫宿主蚊虫，啮齿类动物，非人灵长类动物，禽类，鸟类等；将所述的基因工程菌施用于按蚊，使得该工程菌定植于按蚊的肠道中，从而发挥拮抗疟原虫的作用。

在另一种方式中，提供了一种抑制病原体的方法，包括：将编码本发明所述的AmLip多肽与一些具有靶向能力的多肽(如抗体或配体)进行融合，从而促使其在被施用后发挥有效的抑制作用。

应理解，在本发明的教导下，还存在本发明的多肽的多种多样的应用模式，这些均应被涵盖在本发明中。

组合物/制剂/试剂盒

本发明提供了一种组合物，其中含有有效量的AmLip，以及余量的生物学上可接受的载体。

所述组合物的剂型可以是多种多样的，包括但不限于：冻干剂，水溶液，乳液，可喷洒溶液，油性或水性分散系，悬浮剂，粉剂，颗粒剂，可湿粉剂，可乳化浓缩物或微胶囊。

应理解，只要能够将本发明所述的AmLip在保持全部或部分活性的前提递送到所需处理的个体或场所的剂型都是可取的。优选那些易于递送的剂型，作为一些优选的方式，所述组合物可以是冻干剂、液体吸食剂、喷洒剂或喷雾剂。

浓缩型的组合物中活性成分(多肽)的含量较高，如可含有占比10-90％或20-90％的菌含量，而稀释型组合物中活性成分含量较低，例如可以为0.00005-5％。此外，还可以包含其他合适的成分，如前面所列举的各种生物学上可接受的载体。

在一些需要的情况下，本发明组合物中还可以含有其它活性杀生物剂，以实现通过一次使用而将病原体如疟原虫以及其他有害生物进行共同杀灭。

本发明的AmLip、含有该酶的载体或宿主细胞、含有该酶或宿主细胞的组合物，还可被包含在容器或试剂盒中。较佳地，所述的试剂盒中还包括使用说明书等，以便于本领域技术人员应用。

本发明的主要优点在于：

首次从沙雷氏菌中找到了一种具有高效杀灭病原体(如疟原虫)功能的AmLip多肽，为生物防治病原体(如疟原虫)以及防治病原体介导的疾病如疟疾提供了极其有效的途径。本发明所述的AmLip多肽具有选择性杀伤能力，其特异性酶解病原体(如疟原虫)的细胞膜，而不对病原体宿主的细胞膜构成影响。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

(a)鉴定Su_YN1菌株的抗疟活性蛋白时，基因敲除方法，及回补实验

采用Red-et重组法进行靶基因的敲除筛选，通过电击转染法将敲除片段转染至Su_YN1感受态细胞后，通过抗性平板筛选结合PCR检测法确定阳性克隆。每个基因敲除挑选2个独立的克隆进行抗疟活性检测。用于基因敲除的引物见表2。

表2

回补实验采用质粒回补的方法进行。将包含1000bp启动序列的AmLip编码序列克隆到SPC-OVP质粒中，并使C端融合3HA标签。质粒通过环化PCR的方法进行S207A位点突变，回补与突变的引物见表3。

表3

通过电击转染将质粒导入AmLip敲除菌株，筛选出阳性克隆后，通过western blot检测回补蛋白融合HA标签的表达情况，确认回补表达的有效性。

(b)脂肪水解酶Lipase活性蛋黄平板检测

检测Lipase活性采用蛋黄平板法进行。在LB固体培养基中添加1％鲜蛋黄，倒制平板。代谢上清和纯化蛋白按照一定剂量，采用点样的方法点至蛋黄平板后，室温干燥平板至无液痕，将平板用封口膜封闭后，倒置于30℃恒温培养箱，孵育20小时后，观察裂解环并拍照。

(c)无性期人疟原虫细胞培养和抗疟活性检测

红内期的恶性疟原虫(3D7)抑制实验采用基于SYBR Green I的荧光试剂检测恶性疟原虫的抑制效果。正常传代培养的恶性疟原虫用5％的山梨醇进行同步化，使所有的恶性疟原虫均处于环状体时期(Ring stage)。将同步化之后的恶性疟原虫寄生虫血率调整为1％，每个样本有3个孔作为重复，分别分装于96孔板的孔中，每个孔含有90μl同步化处理后的Ring stage，然后吸取过滤后细菌上清或一定浓度的蛋白溶液加入到96孔板中。同时用250nM的氯喹作为阳性对照，用环状体时期的培养基作为阴性对照。37℃培养箱培养72h后用100μl的SYBR Green I的荧光试剂裂解液(Tris[20mM；pH 7.5]，EDTA[5mM]，Saponin[0.008％；w/v]，Triton X-100[0.08％；v/v])加入每个孔中，用移液器上下混合均匀后，黑暗环境中室温孵育1.5h。96孔板用荧光免疫仪器读取吸光值，所用的激发光波长为485nm到535nm。恶性疟原虫抑制的百分比的以阴性对照(0％抑制率)和阳性对照(100％抑制率)为基准进行计算。

(d)体外恶性疟Pf.3D7配子体阶段的诱导和抗配子体检测

恶性疟原虫(Pf 3D7)的配子体培养采用Tragger等建立的方法，整个培养过程采用O型血(4％RCT)，培养基为含有谷氨酰胺的RPMI1640培养基，补充HEPES，NaHCO₃，次黄嘌呤和10％的人血清，保持在37℃蜡烛缸中培养。每天换液至培养约18天左右，检测配子体率和配子体形成状况。在Stage II-III阶段配子体形成时，加入细菌代谢上清或待检测蛋白溶液，共孵育24小时，更换为常规培养基继续培养3天至Stage IV-V阶段，采取部分培养细胞涂片，吉姆萨染色观察配子体，以对照组为100％参照，计算不同处理组配子体抑制效率。

(e)伯氏疟原虫动合子诱导与共孵育实验

伯氏疟原虫Pb.ANKA动合子培养，采用动合子阶段特异表达虫荧光素Luciferase的报告虫株进行。动合子培养液配方为：RPMI Medium 1640，含有25mM HEPES，4mM的NaHCO₃，NaOH调整pH至8.0。心脏采血抗凝以后，按照血液：培养液1:10的比例重悬血液，加入到48孔培养板中，22℃恒温培养箱培养动合子。需要检测的细菌代谢物和蛋白加入到48孔培养体系中并设置3孔重复。共培养20小时后，收集培养板中细胞，加入D-Luciferin检测底物，检测指征动合子发育状态的Luciferase信号，以对照组为100％，计算不同处理组抑制效率。

(f)AmLip的鼠抗血清的制备和活性阻断实验

AmLip的鼠抗血清的制备：使用AmLip全长蛋白作为抗原，制备AmLip鼠抗血清。抗血清制备方法严格按照《精编免疫学实验指南》(Short Protocols in Immunology，J.Coligan，John Wiley&Sons，2005)进行。采用ICR小鼠作为免疫动物，弗氏佐剂乳化抗原以后，按每只小鼠每次注射25ug的剂量，间隔一周分三次注射(一次初免，两次加强)。最后一次免疫注射完成7天后采血，收集抗血清。

AmLip抗血清的活性阻断实验：在动合子体外培养体系中，加入不同量(按照体积比从1％以2倍梯度稀释)的AmLip鼠抗血清，进行AmLip蛋白抗疟活性的阻断实验。

序列信息

下面列举了部分沙雷氏菌中潜在的抗疟AmLip同源的蛋白序列，其用于说明该蛋白及其编码基因的保守性，不应理解为限定本专利的保护范围。所列举的蛋白序列，其核酸编码由于密码子的简并性，可以不同。

(1)Serratia ureilytica Su_YN1菌株AmLip蛋白序列

Serratia ureilytica Su_YN1菌株AmLip蛋白序列(N-C)，614aa

MGIFSYKDLDENASKALFSDALAISTYAYHNIDNGFDEGYHQTGFGLGLPLTLITALIGSTQSQGGLPGLPWNPDSEQAAQDAVNNAGWSVIDAAQLGYAGKTDARGTYYGETAGYTTAQAEVLGKYDSEGNLTAIGISFRGTSGPRESLIGDTIGDVINDLLAGFGPKGYADGYTLKAFGNLLGDVAKFAQAHGLSGEDVVISGHSLGGLAVNSMAAQSDANWGGFYAQSNYVAFASPTQYEAGGKVINIGYENDPVFRALDGTSLTLPSLGVHDAPHTSATNNIVNFNDHYASDAWNLLPFSILNIPTWLSHLPFFYQDGLMRVLNSEFYSLTDKDSTIIVSNLSNVTRGSTWVEDLNRNAETHSGPTFIIGSDGNDLIKGGKGNDYLEGRDGDDIFRDAGGYNLIAGGKGHNIFDTQQALKNTEVAYDGNTLYLRDAKGGITLADDISTLRSKETSWLIFSKEVDHQVTAAGLKSDSGLKAYAAATTGGDGDDVLQARSHDAWLFGNAGNDTLIGHAGGNLTFVGGSGDDILKGVGNGNTFLFSGDFGRDQLYGFNATDKLVFIGTEGASGNIRDYATQQNDDLVLAFGHSQVTLIGVSLDHFNPDQVVLA(SEQ ID NO:1)

(2)Serratia marcescens AS1菌株AmLip蛋白序列

Serratia marcescens AS1菌株AmLip蛋白序列(N-C)，614aa

MGIFSYKDLDENASKTLFSDALAISTYAYHNIDNGFDEGYHQTGFGLGLPLTLITALIGSTQSQGGLPGLPWNPDSEQAAQEAVNNAGWSVISAAQLGYAGKTDARGTYYGETAGYTTAQAEVLGKYDSEGNLTAIGISFRGTSGPRESLIGDTIGDVINDLLAGFGPKGYADGYALNAFGNLLGDVAKFAQAHGLSGEDVVVSGHSLGGLAVNSMAAQSDANWGGFYAQSNYVAFASPTQYEAGGKVINIGYENDPVFRALDGTSLTLPSLGVHDAPHASATNNIVNFNDHYASDAWNLLPFSILNIPTWLSHLPFFYQDGLMRVLNSEFYSLTDKDSTIIVSNLSNVTRGNTWVEDLNRNAETHSGPTFIIGSDGNDLIKGGKGNDYLEGRDGDDIFRDAGGYNLIAGGKGHNTFDTQQALKNTEVAYDGNTLYLRDAKGGITLADDISTLRSKETSWLIFSKEVDHQVTAAGLKSDSGLKAYATATTGGDGDDVLQARSHDAWLFGNAGNDTLIGHAGGNLTFVGGSGDDILKGVGNGNTFLFSGDFGRDQLYGFNATDKLVFIGTEGASGNIRDYATQQNDDLVLAFGHSQVTLIGVSLDHFNTDQVVLA(SEQ ID NO:2；与SEQ ID NO:1同源性94.96％)

3)Serratia plymuthica v4菌株AmLip蛋白序列

Serratia plymuthica V4菌株AmLip蛋白序列(N-C)，614aa

MGIFNYQGLDDAKSKTLFSDALAISTYAYHNIDNGFDEGYHHYGFGLGLPFTLVTALIGSTQSQGGLPGIPWNPDSEKAALDAVNNAGWSLISADQLGYQGKTDARGTYYGESLGYTTAQAEVLGKYDSTGHLISIGIAFRGTSGPRESLITDSIGDLINDLLAGFGPEGYADNYSLKAFGTLLGDVAKFAQAHGLTGDDVTVSGHSLGGLAVNSMAALSDDNWAGFYSQSNYVAFASPTQYETGGKVINIGYENDPVFRALDGTTLTPASLGVHDAPQESATNNIVNFNDHYASAAWNILPFSILNLPTWLSHLPFFYQDGLMRVLNSTFYSLTNKDSTVIVSNLSEVTRGNTWVEDLNRNAEKHSGPTFIIGSEGNDLIKGGTGNDYLEGRAGNDTFRDGGGFNIIVGGEGNNTLDLQQALKKNEVAYDGNTLYLRDAKGGITQANDISTLRSKETTLLIFTKDVDHQVTDAGLKSGSSLNAYAASSNGSDGADILHAGASDSWLFGKGGDDQLFGHSSGNLTFVGGNGNDTLQSAGSSNTFLFSGDFGNDKVYHFGSSDKLVFLGTQGASGNFRDYVSQQDDGLALAFGENKVTLIGVNLEHLNDSQVVLA(SEQ ID NO:3；与SEQ ID NO:1同源性77.13％)

4)Serratia rubidaea NCTC10036菌株AmLip蛋白序列

Serratia rubidaea NCTC10036菌株AmLip蛋白序列(N-C)，608aaMGIFDYRETDAAASKTLFADAMAISHYAYHNIDNGFAVGYQHNGYGLGLPLTLVGGILGSTDSQGALPGIP

WNPDAEKAALEAVTAAGWTRVSAQQLGYQGKTDDRGTYFGESKGYETAQAEVLAKYDDAGRLTEIGIAFRGTSGPRESIISDSIGDVINDLLAGFGPAGYADHYALNAFNTLLGDVARFAQQNGLSGEDVVVSGHSLGGMAVNSMASMSDAHWGGFYSHANYVAFASPTQHQGDDRVLNIGYENDPVFRALDGSTMTAGSLGVHDGVKEHATNNIVNFNDHYASTVWNALPFSILNIPTWLSHLPSAYQDGLTRVLDSAFYALTEQNSTVIVSNLSDVTRGATWVADLNRNAESHSGPTFIIGSDGNDLIKGGQGNDYLEGRAGDDTFRDGGGYNWILGGDGSNTLDIEQSLQQREVAYDGVNLYLRDADGGITLAENIATLRSKESQLIVLNKNVDHQVTADGLLSASGLTAYADSLNGGDGADSLTATQAGGWLFGLAGDDTLNGQFGGHTFVGGAGNDQLQAGGGNNTFLFSGSFGHDRLEGWQASDKLVFIGAGSQVEYHQADNNLTIGLGDNSVTLVGVSQQSLQDGQLIVA(SEQ ID NO:4；与SEQ ID NO:1同源性75.41％)

5)Serratia liquefaciens JL02菌株AmLip蛋白序列

Serratia liquefaciens JL02菌株AmLip蛋白序列(N-C)，605aa

MGIFNYQGLDEAKSKALFTDAMAISTYAYHNIDNGFDEGYHNTGFGLGLPFTLVTALIGSSQSQGGLPGIPWNPDSEKAALAAVNNAGWSLITDARGTYYGETLGYTTAQAEVLGKYDSEGNLTGIGIAFRGTSGPRESLITDTIGDLVNDLLAGFGPNGYADNYSLKAFGILLGDVAKFAQSHGLSGDDITISGHSLGGLAVNSMAALSDGNWGGFYAQSNYVAFASPTQYETGDKVINIGYENDPVFRALDGTTRTSATLGVHDAPQESATNNIVNFNDHYASTAWNILPFSILNVPTWLSHLPFFYQDGLMRVLNSEFYSLTSKDSTVIVSNLSDVTRGNTWVEDLNRNAEQHSGPTFIVGSDGNDLIKGGAGNDYLEGRAGNDTFRDDGGFNIISGGEGHNTLDLQHALKNTEVAYDGNTLYLRDADGGITLANSIGTLKSKESSLLIFTKEVDHQVTDNGLLSTKGLTAYASSANGTATDDVLTAKDSGSWLFGLEGNDQLFGGKGNDVFVGGAGNDVMHSQGGSNTFLFSGDFGQDLIYGYQARDKLVFIGTDGSSTGGNFRDFASEVNDNLVFNFGGNTVTLVGVGFDSLSDGQVVLA(SEQ ID NO:5；与SEQ ID NO:1同源性77.75％)

6)Serratia ficaria NBRC 102596菌株AmLip蛋白序列

Serratia ficaria NBRC 102596菌株AmLip蛋白序列(N-C)，614aa

MGIFNYQDRDEAESKALFSDAMAIATYAYHNIDNGFDQGYHQTGFGLGLPLTLVTALIGSTQSQGGLPGIPWNPDSEQAALAAVNKAGWSVIGAEQLGYGGKTDARGTYYGETLGYTTAQAEVLGKYDGDGNLTAIGISFRGTSGPRESLIADTIGDVINDLLAGFGPDGYADNYTLKAFGNLLGDVATFARANGLGGDDVLISGHSLGGLAVNSMAALSDANWGGFYSQSSYVAFASPTQYETGGKVINIGYENDPVFRALDGTTLTPASLGVHDAPQDSATNNIVNFNDHYASAAWNLLPFSILNVPTWLSHLPFFYQDGLMRVLNSEFYSLTEKDSTIVVSNLSDVTRGNTWVEDLNRNAETHSGPTFIIGSDGNDRIKGGTGNDYLEGRDGNDIFRDGGGYNIVSGGKGDNVLDTRQALKNTEVAYDGDRLYLRDAKGGITLADDIGTLRSKETSWLVLSKEVDHRVTDAGLKSDAGLKAYAASTNGGAGDDLLRAKDGDAWLFGKDGNDQLIGHAGGNLTFVGGSGDDVLSSAGGNNTFLFSGDFGSDRLVNFGASDKLVFIGTEGASSDIGDYVSQRDNDLVLAFGASQVTLVGVALDHFNADQVVLA(SEQ ID NO:6；与SEQ ID NO:1同源性83.77％)

7)Serratia grimesii BXF1菌株AmLip蛋白序列

Serratia grimesii BXF1菌株AmLip蛋白序列(N-C)，615aa

MGIFNYQGLDEAKSKVLFTDAMAISTYAYHNIDNGFDEGYHTTGFGLGLPLTLVTALIGSTQSQGGLPGIPWNPDSEKAALAAVNNAGWSLIGADQLGYQGKTDSRGTYYGETLGYTTAQAEVLGKYDDAGHLTGIGIAFRGTSGPRESLITDTIGDLINDVLAGFGPKGYADNYSLKAFGTLLADVAKFAQAHGLSGDDVTISGHSLGGLAVNSMAALSDSNWGGFYSQSSYVAFASPTQYETGGKVINIGYENDPVFRALDGSTLTPSTLGVHDAPQESATNNIVNFNDHYASAAWNILPFSILNVPTWLSHLPFFYQDALMRVLNSEFYSLTSKDSTVIVSNLSDVTRGNTWVEDLNRNAEKHSGPTFIVGSDGNDLIKGGAGNDYLEGRAGNDTFRDSGGFNIISGGEGNNTLDLQHALKKTEVAYDGNTLYLRDTNGDITLATSINTLKSTESSLLIFTKDVAHQVTDNGLLSDKGLTAYASSEKGGATNDILTAKDTGSWLFGLDGDDQLFGGKGNDVFVGGAGNDIMHSQGGNNTFLFSGNFGQDQIYGYQAQDKLVFMGTPGSSSGGDYRDFVSEVNDNLVFNFGGNTVTLVGLGLNSLSDGQVVLA(SEQ ID NO:7；与SEQ ID NO:1同源性75.62％)

实施例1、肠道菌Su_YN1代谢上清具有强烈的抗多种疟原虫的活性

本发明人在研究中，获得一株从中华按蚊肠道分离获得的肠道共生的解脲沙雷氏菌(Serratia ureilytica)，菌株编号为Su_YN1。本发明人发现，该菌株的代谢上清具有杀灭疟原虫活性，无论是对于恶性疟原虫还是伯氏疟原虫均具有强烈的抑制效果。

Su_YN1的代谢产物具有强烈的体内外抗疟活性，但是具体活性成分未知。对于Su_YN1活性产物进行系统的分离鉴定，本发明人发现了Su_YN1的抗疟活性成分是一种新的分泌型脂肪酶，并命名为AmLip蛋白。

Su_YN1代谢上清处理组恶性疟原虫的生长受到显著抑制(图1A，C)，而且Su_YN1的代谢上清对于恶性疟原虫的配子体具有强烈的抑制活性(图1B，C)，对于伯氏疟原虫的动合子也具有强烈的抑制效果(图1D，E)。细胞的吉姆萨染色结果显示，无性期、配子体和动合子阶段的疟原虫均被Su_YN1代谢上清显著抑制(图1C，E)，说明Su_YN1的代谢上清具有抗多种疟原虫，以及抑制不同发育阶段的疟原虫的活性。

实施例2、发挥抗疟活性的物质的确定

本发明人使用3KDa超滤管，将Su_YN1的代谢上清进行了超滤分离，滤过次级代谢物、小分子多肽，截留大蛋白质类分子。通过测定滤液和截留液抗疟活性，发现3KDa滤液完全没有抗疟活性，而截留液具有强烈的活性(图2A)，说明Su_YN1的抗疟活性成分的分子量大于3KDa，排除了活性成分是小分子次生代谢产物和小肽的可能性。

本发明人进一步对Su_YN1的代谢上清进行了酶解分析。使用胰酶处理Su_YN1代谢上清，造成代谢上清蛋白质大量被降解(图2B)，本发明人发现，Su_YN1代谢上清的抗疟原虫活性可以被胰蛋白酶显著破坏(图2C)，据此确认了抗疟活性产物的性质是分泌蛋白。

实施例3、Su_YN1抗疟活性蛋白AmLip的筛选鉴定

在确定活性产物的蛋白性质以后，本发明人着重于鉴定Su_YN1抗疟的活性蛋白质。为了快速准确的锁定Su_YN1的抗疟活性蛋白，本发明人通过差异分泌蛋白组来确定候选的蛋白，然后进行筛选。本发明人选取了一株没有抗疟活性的解脲沙雷氏菌株Su_JS3进行对比，收集了Su_YN1和Su_JS3的代谢上清，通过对分泌上清中的蛋白进行质谱分析，筛选出在Su_YN1中特异性高表达的蛋白作为候选，共筛选得到下表中的8个候选活性蛋白进行进一步的验证(表4)。

表4、质谱鉴定Su_YN1代谢上清潜在的抗疟活性蛋白

为了鉴定Su_YN1菌株的抗疟活性蛋白，本发明人对上述获得的8个蛋白的编码基因进行了独立的基因敲除，并测试敲除这些基因后菌株代谢上清的体外抗疟原虫活性变化。每个候选基因选取了2个独立的敲除克隆，对这些菌株的代谢上清收集并进行抗疟原虫活性测试。

实验结果显示，只有编码Lipase的基因敲除以后，Su_YN1的抗疟活性完全丧失了，而其余候选基因敲除以后，突变体代谢上清的抗疟活性没有丝毫影响(图3)，说明该Lipase就是Su_YN1分泌的抗疟活性蛋白，并且排除了其他候选蛋白抗疟的可能性。

本发明人将该Lipase蛋白命名为抗疟原虫活性脂肪酶(Anti-malaria Lipase)，简称AmLip。

实施例4、AmLip的抗疟能力依赖于其脂酶活性

本发明人分析发现，AmLip蛋白属于典型的甘油三酯脂肪酶(family1.3)，具有该家族完整的脂肪酶催化活性中心位点，因此推测AmLip蛋白抗疟原虫，可能依赖于其脂肪水解酶的活性。

本发明人对AmLip脂肪酶的氨基酸序列进行突变(将相应位置的氨基酸突变为A)，将酶突变体用于构建突变回补质粒(图4A)。Lipase活性蛋黄平板检测实验证实，S207A突变使AmLip的脂肪水解活性丧失(图4B)。本发明人将突变的序列用于回补Su_YN1的AmLip敲除株，结果显示突变株不能回补抗疟原虫活性(图4C)，证实了AmLip杀灭疟原虫的活性依赖于其水解脂肪的酶活性。

因此，第207位为AmLip蛋白的催化活性位点，且其突变(S207A)导致其抗疟能力的消失。

实施例5、AmLip蛋白靶向疟原虫细胞膜来杀死疟原虫

脂肪酶对于脂类具有强烈的水解活性，由于AmLip蛋白的抗疟活性依赖于其脂肪酶活性，本发明人推测AmLip蛋白抗疟的机制可能是直接靶向疟原虫膜并水解破坏其膜结构。首先本发明人通过免疫荧光分析了AmLip蛋白靶向疟原虫的能力和亚细胞定位情况。

本发明人分析了AmLip蛋白进入无性期恶性疟原虫(Pf3D7)细胞以及伯氏疟原虫(Pb.ANKA)动合子细胞的能力。在与无性期人疟原虫细胞共孵育实验中，发现AmLip蛋白随着时间的积累聚集于疟原虫的外周膜结构上，并最终造成膜降解和疟原虫细胞的破裂和裂解(图5A)。在与伯氏疟原虫动合子共孵育实验中，本发明人发现AmLip蛋白也呈现出随着时间的积累聚集于疟原虫动合子膜结构的特征，并最终造成动合子膜结构损伤和动合子的死亡(GFP信号消失)(图5B)。

综上，上述实验结果说明AmLip蛋白可以水解疟原虫细胞膜进而杀死寄生虫。值得注意的是，本发明人发现AmLip蛋白对宿主红细胞(RBC)细胞膜没有明显的破坏作用，因为未被疟原虫侵染的健康红细胞形态完整(图1C，E)，且没有检测到发生溶血现象，说明AmLip蛋白杀灭疟原虫具有选择性。

实施例6、抗疟活性蛋白AmLip的表达纯化和抗疟活性检测

为了进一步验证AmLip蛋白的功能和性质，本发明人通过pET系统在大肠杆菌BL21细菌中表达纯化了Su_YN1菌株的AmLip蛋白，获得了高纯度的蛋白产物(图6A)。Lipase活性蛋黄平板检测实验证实获得的AmLip蛋白具有Lipase催化活性(图6B)。

本发明人用纯化的AmLip蛋白进行抗疟测试，该蛋白显示出了强烈的直接杀灭疟原虫的能力(图6C)，证实了该蛋白的抗疟性能。本发明人发现，AmLip蛋白对于疟原虫动合子具有强烈的抑制活性，IC50约为0.08ug/ml，而对无性期疟原虫的抑制活性低于动合子阶段的疟原虫，IC50约为2.0ug/ml。本发明人推测动合子阶段疟原虫处于胞外暴露状态，而无性期阶段疟原虫寄生于红细胞内，AmLip蛋白对于暴露于细胞外阶段的疟原虫具有更直接的裂解活性，有可能是造成活性差异的原因。

本发明人将纯化获得的AmLip蛋白进行体外抗恶性疟Pf.3D7(恶性疟原虫3D7株)无性期和配子体阶段的检测，以验证AmLip蛋白裂解各阶段疟原虫细胞的能力。在5ug/mlAmLip蛋白的作用下，无性期和配子体阶段的疟原虫均被显著裂解抑制，从细胞形态上来看，疟原虫细胞均发生裂解，细胞膜破裂，细胞内容物(如疟原虫代谢产生的棕色的疟色素)散落(图6D)。值得注意的是，未感染疟原虫的红细胞没有发生明显的裂解，表明AmLip蛋白对疟原虫膜的裂解作用具有选择性。

实施例7、AmLip不同结构域对脂酶活性和抗疟活性的影响分析

为了进一步研究AmLip蛋白结构与抗疟的特性之间的关系，尤其是考察除Lipase催化结构域以外的蛋白结构的影响，本发明人通过pET系统在大肠杆菌BL21细菌中表达纯化了缺失C端β-roll结构域(Fragment 1)、缺失N端Helix结构域(Fragment 2)、以及Helix和β-roll结构域双缺失(Fragment 3)的蛋白片段(图7A和B)。

Lipase平板实验结果显示，全长(Full length)具有脂肪酶水解活性，缺失Helix和β-roll结构域均造成酶活丧失(图7C)，可见Helix和β-roll结构域是其发挥酶活性所必需。

体外疟原虫动合子培养实验结果也显示，全长的AmLip蛋白具有显著的抑制疟原虫活性，而其各缺失片段均丧失了抗疟活性(图7D)。

这些实验结果表明，除了lipase催化活性结构域以外，AmLip蛋白的Helix和β-roll结构域均对于该蛋白的酶活和抗疟活性是必需的。

实施例8、AmLip的鼠抗血清的制备和活性阻断实验

为了进一步研究AmLip抗疟的特性，本发明人制备了该蛋白鼠抗血清。本发明人获得的抗血清可以识别出Su_YN1代谢上清中的AmLip蛋白(图8A)，并具有优良的检测特异性(图8B)。

为了进一步证实Su_YN1分泌的AmLip蛋白直接起到了杀灭疟原虫的作用，本发明人使用AmLip抗血清对Su_YN1代谢上清进行了中和实验。结果显示AmLip抗血清的加入显著抑制了Su_YN1代谢上清的抗疟活性，并且呈现出剂量依赖效应(图8C)。

这些结果再次说明，Su_YN1分泌的AmLip蛋白确实是直接的抗疟效应蛋白。

实施例9、多种沙雷氏菌来源的AmLip蛋白均具有抗疟活性

不同沙雷氏菌的AmLip具有基因保守性和多态性，通过分析，本发明人发现AmLip的同源基因在多种沙雷氏菌中保守存在，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。表5列举了这些沙雷氏菌及其与Su_YN1来源的AmLip的同源性，用于说明该蛋白及其编码基因的保守性，不应理解为限定本专利的保护范围。

表5、不同沙雷氏菌基因组中潜在的抗疟AmLip编码基因及其保守性

同样地，本发明人也将粘质沙雷氏菌AS1同源的AmLip基因(编码SEQ ID NO:2)用于Su_YN1的AmLip敲除株的回补实验。结果显示，粘质沙雷氏菌来源的AmLip编码基因也可以进行功能回补，提示沙雷氏菌的AmLip蛋白具有普遍的抗疟原虫活性(图9)。

此外，本发明的初步实验能观测到，Su_YN1菌株来源的AmLip蛋白能呈现对弓形虫、血吸虫的一定的杀伤效果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心

<120> 具有杀灭疟原虫作用的沙雷氏菌脂肪酶及其编码基因

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Leu Gly Tyr Gly Gly Lys Thr Asp Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Gly Glu

100 105 110

Thr Leu Gly Tyr Thr Thr Ala Gln Ala Glu Val Leu Gly Lys Tyr Asp

115 120 125

Gly Asp Gly Asn Leu Thr Ala Ile Gly Ile Ser Phe Arg Gly Thr Ser

130 135 140

Gly Pro Arg Glu Ser Leu Ile Ala Asp Thr Ile Gly Asp Val Ile Asn

145 150 155 160

Asp Leu Leu Ala Gly Phe Gly Pro Asp Gly Tyr Ala Asp Asn Tyr Thr

165 170 175

Leu Lys Ala Phe Gly Asn Leu Leu Gly Asp Val Ala Thr Phe Ala Arg

180 185 190

Ala Asn Gly Leu Gly Gly Asp Asp Val Leu Ile Ser Gly His Ser Leu

195 200 205

Gly Gly Leu Ala Val Asn Ser Met Ala Ala Leu Ser Asp Ala Asn Trp

210 215 220

Gly Gly Phe Tyr Ser Gln Ser Ser Tyr Val Ala Phe Ala Ser Pro Thr

225 230 235 240

Gln Tyr Glu Thr Gly Gly Lys Val Ile Asn Ile Gly Tyr Glu Asn Asp

245 250 255

Pro Val Phe Arg Ala Leu Asp Gly Thr Thr Leu Thr Pro Ala Ser Leu

260 265 270

Gly Val His Asp Ala Pro Gln Asp Ser Ala Thr Asn Asn Ile Val Asn

275 280 285

Phe Asn Asp His Tyr Ala Ser Ala Ala Trp Asn Leu Leu Pro Phe Ser

290 295 300

Ile Leu Asn Val Pro Thr Trp Leu Ser His Leu Pro Phe Phe Tyr Gln

305 310 315 320

Asp Gly Leu Met Arg Val Leu Asn Ser Glu Phe Tyr Ser Leu Thr Glu

325 330 335

Lys Asp Ser Thr Ile Val Val Ser Asn Leu Ser Asp Val Thr Arg Gly

340 345 350

Asn Thr Trp Val Glu Asp Leu Asn Arg Asn Ala Glu Thr His Ser Gly

355 360 365

Pro Thr Phe Ile Ile Gly Ser Asp Gly Asn Asp Arg Ile Lys Gly Gly

370 375 380

Thr Gly Asn Asp Tyr Leu Glu Gly Arg Asp Gly Asn Asp Ile Phe Arg

385 390 395 400

Asp Gly Gly Gly Tyr Asn Ile Val Ser Gly Gly Lys Gly Asp Asn Val

405 410 415

Leu Asp Thr Arg Gln Ala Leu Lys Asn Thr Glu Val Ala Tyr Asp Gly

420 425 430

Asp Arg Leu Tyr Leu Arg Asp Ala Lys Gly Gly Ile Thr Leu Ala Asp

435 440 445

Asp Ile Gly Thr Leu Arg Ser Lys Glu Thr Ser Trp Leu Val Leu Ser

450 455 460

Lys Glu Val Asp His Arg Val Thr Asp Ala Gly Leu Lys Ser Asp Ala

465 470 475 480

Gly Leu Lys Ala Tyr Ala Ala Ser Thr Asn Gly Gly Ala Gly Asp Asp

485 490 495

Leu Leu Arg Ala Lys Asp Gly Asp Ala Trp Leu Phe Gly Lys Asp Gly

500 505 510

Asn Asp Gln Leu Ile Gly His Ala Gly Gly Asn Leu Thr Phe Val Gly

515 520 525

Gly Ser Gly Asp Asp Val Leu Ser Ser Ala Gly Gly Asn Asn Thr Phe

530 535 540

Leu Phe Ser Gly Asp Phe Gly Ser Asp Arg Leu Val Asn Phe Gly Ala

545 550 555 560

Ser Asp Lys Leu Val Phe Ile Gly Thr Glu Gly Ala Ser Ser Asp Ile

565 570 575

Gly Asp Tyr Val Ser Gln Arg Asp Asn Asp Leu Val Leu Ala Phe Gly

580 585 590

Ala Ser Gln Val Thr Leu Val Gly Val Ala Leu Asp His Phe Asn Ala

595 600 605

Asp Gln Val Val Leu Ala

610

<210> 7

<211> 615

<212> PRT

<213> 沙雷氏菌(Serratia ureilytica)

<400> 7

Met Gly Ile Phe Asn Tyr Gln Gly Leu Asp Glu Ala Lys Ser Lys Val

1 5 10 15

Leu Phe Thr Asp Ala Met Ala Ile Ser Thr Tyr Ala Tyr His Asn Ile

20 25 30

Asp Asn Gly Phe Asp Glu Gly Tyr His Thr Thr Gly Phe Gly Leu Gly

35 40 45

Leu Pro Leu Thr Leu Val Thr Ala Leu Ile Gly Ser Thr Gln Ser Gln

50 55 60

Gly Gly Leu Pro Gly Ile Pro Trp Asn Pro Asp Ser Glu Lys Ala Ala

65 70 75 80

Leu Ala Ala Val Asn Asn Ala Gly Trp Ser Leu Ile Gly Ala Asp Gln

85 90 95

Leu Gly Tyr Gln Gly Lys Thr Asp Ser Arg Gly Thr Tyr Tyr Gly Glu

100 105 110

Thr Leu Gly Tyr Thr Thr Ala Gln Ala Glu Val Leu Gly Lys Tyr Asp

115 120 125

Asp Ala Gly His Leu Thr Gly Ile Gly Ile Ala Phe Arg Gly Thr Ser

130 135 140

Gly Pro Arg Glu Ser Leu Ile Thr Asp Thr Ile Gly Asp Leu Ile Asn

145 150 155 160

Asp Val Leu Ala Gly Phe Gly Pro Lys Gly Tyr Ala Asp Asn Tyr Ser

165 170 175

Leu Lys Ala Phe Gly Thr Leu Leu Ala Asp Val Ala Lys Phe Ala Gln

180 185 190

Ala His Gly Leu Ser Gly Asp Asp Val Thr Ile Ser Gly His Ser Leu

195 200 205

Gly Gly Leu Ala Val Asn Ser Met Ala Ala Leu Ser Asp Ser Asn Trp

210 215 220

Gly Gly Phe Tyr Ser Gln Ser Ser Tyr Val Ala Phe Ala Ser Pro Thr

225 230 235 240

Gln Tyr Glu Thr Gly Gly Lys Val Ile Asn Ile Gly Tyr Glu Asn Asp

245 250 255

Pro Val Phe Arg Ala Leu Asp Gly Ser Thr Leu Thr Pro Ser Thr Leu

260 265 270

Gly Val His Asp Ala Pro Gln Glu Ser Ala Thr Asn Asn Ile Val Asn

275 280 285

Phe Asn Asp His Tyr Ala Ser Ala Ala Trp Asn Ile Leu Pro Phe Ser

290 295 300

Ile Leu Asn Val Pro Thr Trp Leu Ser His Leu Pro Phe Phe Tyr Gln

305 310 315 320

Asp Ala Leu Met Arg Val Leu Asn Ser Glu Phe Tyr Ser Leu Thr Ser

325 330 335

Lys Asp Ser Thr Val Ile Val Ser Asn Leu Ser Asp Val Thr Arg Gly

340 345 350

Asn Thr Trp Val Glu Asp Leu Asn Arg Asn Ala Glu Lys His Ser Gly

355 360 365

Pro Thr Phe Ile Val Gly Ser Asp Gly Asn Asp Leu Ile Lys Gly Gly

370 375 380

Ala Gly Asn Asp Tyr Leu Glu Gly Arg Ala Gly Asn Asp Thr Phe Arg

385 390 395 400

Asp Ser Gly Gly Phe Asn Ile Ile Ser Gly Gly Glu Gly Asn Asn Thr

405 410 415

Leu Asp Leu Gln His Ala Leu Lys Lys Thr Glu Val Ala Tyr Asp Gly

420 425 430

Asn Thr Leu Tyr Leu Arg Asp Thr Asn Gly Asp Ile Thr Leu Ala Thr

435 440 445

Ser Ile Asn Thr Leu Lys Ser Thr Glu Ser Ser Leu Leu Ile Phe Thr

450 455 460

Lys Asp Val Ala His Gln Val Thr Asp Asn Gly Leu Leu Ser Asp Lys

465 470 475 480

Gly Leu Thr Ala Tyr Ala Ser Ser Glu Lys Gly Gly Ala Thr Asn Asp

485 490 495

Ile Leu Thr Ala Lys Asp Thr Gly Ser Trp Leu Phe Gly Leu Asp Gly

500 505 510

Asp Asp Gln Leu Phe Gly Gly Lys Gly Asn Asp Val Phe Val Gly Gly

515 520 525

Ala Gly Asn Asp Ile Met His Ser Gln Gly Gly Asn Asn Thr Phe Leu

530 535 540

Phe Ser Gly Asn Phe Gly Gln Asp Gln Ile Tyr Gly Tyr Gln Ala Gln

545 550 555 560

Asp Lys Leu Val Phe Met Gly Thr Pro Gly Ser Ser Ser Gly Gly Asp

565 570 575

Tyr Arg Asp Phe Val Ser Glu Val Asn Asp Asn Leu Val Phe Asn Phe

580 585 590

Gly Gly Asn Thr Val Thr Leu Val Gly Leu Gly Leu Asn Ser Leu Ser

595 600 605

Asp Gly Gln Val Val Leu Ala

610 615

<210> 8

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

aaatatgtcg ggcacctcaa tggcggcgcc gcacgtcaca ttccggggat ccgtcgacc 59

<210> 9

<211> 58

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 9

ggcggtgcgc gtgatcccaa ggccgacgtc attgccctgt gtaggctgga gctgcttc 58

<210> 10

<211> 58

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 10

cttcccacgg cggctatctg ctgcagggca aagaactgat gtaggctgga gctgcttc 58

<210> 11

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 11

ttatacaggt cgccgatacc gccctgagaa gccggggtga ttccggggat ccgtcgacc 59

<210> 12

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 12

accgggctga gcaagttcag cgcggaacag cagcagcagg tgtaggctgg agctgcttc 59

<210> 13

<211> 60

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 13

cagcgcatgg ccaatctcat gggtaaacgt ctggcggccg attccgggga tccgtcgacc 60

<210> 14

<211> 58

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 14

cgctctgcgc cgccatgctg ttgaccgcca gcccgccgat gtaggctgga gctgcttc 58

<210> 15

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 15

accgccggtt acaccaccgc tcaggccgag gtgctgggca ttccggggat ccgtcgacc 59

<210> 16

<211> 58

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 16

gtgcgcggca tcgacggttc cggcccgaac gtcggcgcct gtaggctgga gctgcttc 58

<210> 17

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 17

gggccggacg ccatggccgc caactgtgaa gagtgctgga ttccggggat ccgtcgacc 59

<210> 18

<211> 58

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 18

gcgtggtggt caccggcggc gccagcagca gcgacatcat gtaggctgga gctgcttc 58

<210> 19

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 19

agggtggcgt cgccgtgtag cgagcctttc cactcggtga ttccggggat ccgtcgacc 59

<210> 20

<211> 58

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 20

agttgctctg caccagggcg ttggtgttgg tgttctgagt gtaggctgga gctgcttc 58

<210> 21

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 21

caagcaggaa ggcgccacca agcgtaccga tttcagccta ttccggggat ccgtcgacc 59

<210> 22

<211> 58

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 22

gtcagaacgc attgcgttca cgtcgttgct cagctgatct gtaggctgga gctgcttc 58

<210> 23

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 23

aatcctgggt tccactctgc tggctggctg ctctagcaaa ttccggggat ccgtcgacc 59

<210> 24

<211> 33

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 24

agtaagcttg gtaccaccgc cttgccgtcc ttc 33

<210> 25

<211> 34

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 25

agaaccggac catggggcca acaccacctg atcg 34

<210> 26

<211> 43

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 26

agacgtggtg atcagcggtc acgcactcgg cgggctggcg gtc 43

<210> 27

<211> 45

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 27

gctgttgacc gccagcccgc cgagtgcgtg accgctgatc accac 45

Claims

1.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽具有以下特征：

为分离自沙雷氏菌的多肽，或其保守性变异多肽或同源物；

其序列中包含催化脂肪水解的催化结构域、Helix结构域和β-roll结构域，具有脂肪水解酶活性；

特异性靶向于病原体细胞膜，破坏其细胞膜结构。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述催化结构域具有相应于SEQ ID NO:1中第135～217位所示的氨基酸序列；较佳地，所述催化结构域含有GxSxG为基序的催化中心；包含一个Ser，其相应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第207位的丝氨酸或

所述沙雷氏菌包括：解脲沙雷氏菌(Serratia ureilytica)，粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)，深红沙雷氏菌(Serratia rubidaea)，液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)，普城沙雷菌(Serratia plymuthica)，无花果沙雷氏菌(Serratiaficaria)，格氏沙雷氏菌(Serratia grimesii)。

3.如权利要求1或2所述的多肽，其特征在于，所述多肽包括选自：

(a)SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；

(b)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列有至少70％相同性，且具有(a)所限定的多肽的功能的多肽；

(c)将(a)所限定的多肽的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)所限定的多肽的功能的多肽；

(d)(a)～(c)任一所述多肽的片段，其包含有该多肽的催化结构域、Helix结构域和β-roll结构域，且具有(a)所限定的多肽的功能；

(e)(a)～(d)任一所述多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；或

(f)(a)～(e)任一所述多肽经组合构成的多肽复合物。

4.如权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述多肽包括选自：具有SEQ ID NO:2，SEQID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的多肽。

5.分离的多核苷酸，包含选自下组的多核苷酸：

(1)编码如权利要求1～4任一所述多肽的多核苷酸；

(2)与多核苷酸(1)互补的多核苷酸。

6.一种载体，它含有权利要求2所述的多核苷酸。

7.一种基因工程细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体，或其基因组中整合有权利要求5所述的多核苷酸。

8.制备权利要求1～4任一所述多肽的方法，包括：(i)培养权利要求4所述的基因工程细胞；(ii)收集含有权利要求1所述的多肽的培养物；(iii)从培养物中分离出权利要求1所述的多肽。

9.权利要求1～4任一所述多肽或编码该多肽的多核苷酸的用途，用于：

抑制病原体；

制备抑制病原体的组合物；或

制备防治病原体感染相关疾病的组合物。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述多肽通过特异性靶向于病原体细胞膜，破坏其细胞膜结构发挥抑制作用；较佳地，所述多肽选择性破坏病原体细胞膜，不损害病原体宿主的细胞膜。

11.一种分离用于抑制病原体的组合物或单体的方法，包括：

(i)培养沙雷氏菌，所述沙雷氏菌包括：解脲沙雷氏菌(Serratia ureilytica)，粘质沙雷菌(Serratia marcescens)，深红沙雷氏菌(Serratia rubidaea)，液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)，普城沙雷菌(Serratia plymuthica)，无花果沙雷氏菌(Serratiaficaria)，格氏沙雷氏菌(Serratia grimesii)；

(ii)从(1)的沙雷氏菌培养物中获得菌株代谢产物、培养液、培养上清或裂解物，从中分离分子量大于3KDa的组分，作为抑制病原体的组合物；或从该组合物中进一步分离SEQID NO:1～SEQ ID NO:7任一所示氨基酸序列的多肽或其保守性变异多肽或同源物。

12.用于抑制病原体的组合物，其包括选自下组的组合物：

含有权利要求1～4任一所述多肽的组合物；

含有权利要求5所述的分离的多核苷酸或权利要求6所述表达载体的组合物，其能表达权利要求1～4任一所述多肽；

含有权利要求7所述的基因工程细胞的组合物；或

含有菌株代谢产物、培养液、培养上清或裂解物的组合物，所述菌株包括：解脲沙雷氏菌(Serratia ureilytica)，粘质沙雷菌(Serratia marcescens)，深红沙雷氏菌(Serratiarubidaea)，液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)，普城沙雷菌(Serratiaplymuthica)，无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)，格氏沙雷氏菌(Serratia grimesii)；较佳地，所述菌株代谢产物、培养液、培养上清或裂解物中含有来自所述菌株的分子量大于3KDa的组分。

13.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，其还包括生物学可接受的载体；较佳地所述生物学可接受的载体包括：溶剂、缓冲液、冻干保护剂、润湿剂、渗透剂、分散剂、乳化剂、稳定剂、粘附剂、充填剂、佐剂、助剂、表面活性剂或控释剂。

14.一种制备抑制病原体的组合物的方法，包括：将权利要求1～4任一所述多肽与生物学可接受的载体混合。

15.一种抑制病原体的方法，包括：利用权利要求1～4任一所述的多肽或权利要求11或12所述的组合物进行抑制。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，将权利要求1～4任一所述的多肽施用于病原体宿主或含有病原体的区域，从而抑制病原体的感染或传播。

17.如权利要求15或16所述的方法，其特征在于，所述病原体包括：疟原虫，弓形虫或血吸虫。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述的病原体宿主包括：人，蚊虫，啮齿类动物，非人灵长类动物，禽类，鸟类。

19.如权利要求17或18任一所述，其特征在于，所述的疟原虫为以人、蚊虫、啮齿类动物、非人灵长类动物、禽类或鸟类为宿主的疟原虫；较佳地包括：恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)，伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)，三日疟原虫(Plasmodium malariae)，卵型疟原虫(Plasmodium ovale)，间日疟原虫(Plasmodium vivax)，巴西疟原虫(Plasmodiumbrasilianum)，食蟹猴疟原虫(Plasmodium cynomolgi)，诺氏疟原虫(Plasmodiumknowlesi)，许氏疟原虫(Plasmodium schwetzi)，猿疟原虫(Plasmodium simium)，夏氏疟原虫(Plasmodium chabaudi)，约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)，鸡疟原虫(Plasmodiumgallinaceum)，残疟原虫(Plasmodium relictum)。

20.一种用于抑制病原体或防治病原体感染相关疾病的试剂盒/药盒，其包含：

权利要求1～4任一所述多肽；

权利要求5所述的分离的多核苷酸或权利要求6所述表达载体，其能表达权利要求1～4任一所述多肽；

权利要求7所述的基因工程细胞；或

权利要求12所述的组合物。