JPH11500013A

JPH11500013A - Ｂｒａｃｏｎｈｅｂｅｔｏｒからの殺虫性トキシン

Info

Publication number: JPH11500013A
Application number: JP8525186A
Authority: JP
Inventors: ジョンソン，ジャニス・エイチ; クラル，ロバート・エム; クラプチョ，カレン
Original assignee: NPS Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Shire NPS Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1995-02-17
Filing date: 1996-02-16
Publication date: 1999-01-06
Also published as: US6156539A; EP0812328A4; US5874298A; EP0812328A1; CA2213444A1; WO1996025429A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ブラコン・ヘベター（Ｂｒａｃｏｎｈｅｂｅｔｏｒ）などのハチの毒液から単離した、有害昆虫に対する神経毒性および低い哺乳動物毒性を特徴とする一群の殺虫効力を示す毒素を精製することに関する。これらの毒素のうち２種類のｃＤＮＡ配列を単離し、全コード配列を提供する。また本発明は、組換え毒素の調製方法、およびこれらの毒素を殺虫剤として利用する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ＢＲＡＣＯＮＨＥＢＥＴＯＲからの殺虫性トキシン発明の分野本発明は、スズメバチ毒液から単離された、殺虫特性を示すトキシンに関する。より詳細には、本発明は、スズメバチＢｒａｃｏｎｈｅｂｅｔｏｒ、およびＢｒａｃｏｎ属の他の種から単離され、特定の害虫に及ぼす神経毒効果を特徴とする、殺虫効果を有するトキシンに関する。発明の背景昆虫は、食料および繊維源についての人類の最も重大な競合者のひとつである。毎年、世界中の農業生産の約３分の１が昆虫損害により失われている。シロアリおよびオオアリ等の昆虫は、毎年数百万ドルの構造物損害を生ずる。多くの深刻なヒトおよび動物の疾患、例えば、マラリア、黄熱病、眠り病、ウイルス性脳炎および疫病は、昆虫により伝播される。害虫を防除（ｃｏｎｔｒｏｌ）する努力は、年商約６０億ドルの世界的殺虫剤産業の発展をもたらしてきた。これらの製品のほとんどは、合成化学神経毒、例えば塩素化炭化水素（例えばＤＤＴ）、カルバメート類（例えばカルバリール）、有機リン酸（例えばマラチオン）、および合成ピレスロイド類（例えばシペルメスリン）である。顕著であるが比較的重要性の低い化学殺虫剤には、昆虫成長制御剤（例えばジフルベンズロンおよびメトプレン）および代謝分裂剤（例えばヒドロキシメチルノン）が含まれる。合成化学殺虫剤は、広範な農業、都会および公衆衛生の状況において害虫を防除するのに有効である。残念ながら、これらの製品の使用には、顕著な、しばしば深刻な副作用が伴う。多くの害虫集団は、事実上すべての化学殺虫剤に対する有意な耐性を発達させてきており、防除の継続のためにはますます高い使用率が必要である。多くの深刻な場合には、高度に耐性の害虫集団が発達し、これは入手可能な製品のいずれによっても防除することができない。化学殺虫剤はまた、非標的生物に対して有害な影響を有することがある。有益な節足動物、例えば補食動物および寄生動物の集団は、化学殺虫剤の適用により時には害虫それ自体よりもより深刻な影響を受ける。通常はそれらの有益な生物により抑制されている主要ではない害虫は、化学殺虫剤の使用によりそれらの天然の束縛が除かれたとき、深刻な害虫になりうる。すなわち、確立された問題を解決する試みにより、新たな害虫問題が発生しうる。化学殺虫剤はまた、脊椎動物に有害な影響を有するかもしれない。ＤＤＴの使用は、主として殺虫剤の高い環境持続性、およびその結果として食肉鳥の組織中に蓄積する傾向があり、このことにより生存可能な卵を産む能力を破壊するため、米国では禁止されてきた。カルボフランの使用は、その鳥類毒性のため厳しく制限されてきており、魚類の多くの種が種々の殺虫剤に対してきわめて感受性であることが知られている。多くの殺虫剤、例えばメチルパラチオンはまた、ヒトおよび他の哺乳動物に非常に毒性であり、事故または誤用により、多くのヒトの中毒の発生をもたらしてきた。明らかに、昆虫防除の分野は、改良された昆虫の選択性および非標的生物への低下した影響を有する殺虫剤の発見により大きな利益を得るであろう。上述の問題、ならびにいくつかの殺虫剤がヒトの発癌物質として作用しうるという可能性を含む他の問題は、より安全な昆虫防除の方法の開発に対する強い要求を生み出してきた。培養および生物学的方法に頼ることにより化学殺虫剤の環境に対する有害な影響を最小限にすることを求める集積害虫防除（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｐｅｓｔｍａｎａｇｅｍｅｎｔ；ＩＰＭ）の実施は、この要求に対する１つの答えである。しかし、ＩＰＭの成功は、化学殺虫剤の有効な生物学的代替物がないため、希望されたものより小さかった。これらの代替物は害虫勃発の頻度および重大性を低下させ、殺虫剤耐性害虫集団の発達を遅延させることができるため、ＩＰＭプログラムの成功にはそれらが入手可能であることが決定的である。昆虫病原体は、潜在的害虫防除薬剤として多くの研究の目的であった。一般に、これらの病原体は昆虫にきわめて選択的であり、多くの場合に、密接に関連したわずかな種の昆虫のみに影響する。多くの昆虫病原体が製品として開発されており、これには、細菌（例えばＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓｐｏｐｉｌｉａｅ）、ウイルス（例えば核多角体病ウイルス群）およびプロトゾア（例えば微胞子虫Ｎｏｓｅｍａｌｏｃｕｓｔａｅ）が含まれる。しかし、これらの製品は、主としてその比較的遅い作用のため、殺虫剤市場の小さい部分を占めるにすぎない。病原体は究極的には害虫集団において高レベルの死亡率を引き起こすが、昆虫が死亡するのには数週間を要し、昆虫はその間のほとんど摂食を続ける。すなわち、防除が達成される前に、許容しえないほど高レベルの作物または産物に損害が与えられるであろう。現在、研究者は昆虫病原体の有効性を改良する方法および他の生物学的防除の道具を活発に探求している。節足動物からの殺虫性トキシンは、過去１０年間、興味が増加してきた対象である。これらの物質は、昆虫における神経および神経筋生理学の詳細な研究に有用であることが証明されている。また、これらは、ある種の昆虫病原体の有効性を増強させるためにも用いられている。サソリであるＡｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓａｕｓｔｒａｌｉｓからの殺虫性トキシンＡａＩＴは、両方の目的に用いられてきた。このトキシンは、ヒトに危険であることが知られている種に由来するものであるにもかかわらず、多くの昆虫に致死的であるが哺乳動物に対しては検出しうる影響を有さないペプチドの群に属する。Ａ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ毒液中の他のトキシンは、哺乳動物に対して致死的であるが、昆虫には影響を有しない。この選択性は、いずれの群のトキシンも電圧感受性ナトリウムチャネルに作用するという観点から特に興味深い。この選択性の分子上の根拠を理解することは、哺乳動物および他の非標的生物に対して低下した影響を有する化学殺虫剤の開発につながるであろう。昆虫病原体の有効性はまた、ＡａＩＴおよび他の昆虫選択性トキシンをコードする遺伝子の使用により増強されてきた。多くの報告は、殺虫性トキシンをコードする遺伝子を含有するようウイルスゲノムを改変することにより、バキュロウイルスファミリーの一員であるＡｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の殺虫特性を増強しうることを示した。この目的のために用いられるトキシンには、ＡａＩＴ、寄生性ダニであるＰｙｅｍｏｔｅｓｔｒｉｔｉｃｉからのＴｘＰ−１、クモであるＤｉｇｕｅｔｉａｃａｎｉｔｉｅｓからのＤＴＸ９．２、およびクモであるＴｅｇｅｎａｒｉａａｇｒｅｓｔｉｓからのＮＰＳ−３２６（現在ではＴａＩＴＸ−１として知られる）が含まれる。これらのトキシンをｐ１０プロモーターもしくはポリヘドリンプロモーターの制御下のＡｃＭＮＰＶゲノム中に挿入した。いずれのプロモーターも、ウイルス閉塞体（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙ）の成分蛋白質をコードする極後期ウイルス遺伝子の高レベル発現を制御する。各場合において、トキシン遺伝子を含む組換えウイルスは、感染した昆虫が死滅するかまたは死滅寸前となるのに必要な時間により測定して、野生型ウイルスより有効であった。バキュロウイルス系は、多くの異なる起源からの生物学的に活性な蛋白質を発現させる高度に有効かつフレキシブルな方法であることがよく知られているため、新たに発見されたトキシンもまたこれらのウイルスの殺虫活性を増強させるのに有用であると予測することは合理的である。しかし、これらのトキシンの使用がバキュロウイルスに限定されるとは予測されない。細菌および真菌を含む多くの他の微生物が、そのような遺伝的操作に感受性であることが知られている。ある種の細菌および真菌は、実際、ヒトおよび他の哺乳動物起源の外因性蛋白質の大量生産に広く用いられている。他の昆虫ウイルスもまた潜在的発現ベクターとして研究されてきた。そのような病原体の例としては、エントモポックスウイルス類、細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｓｃｈｉａｃｏｌｉ、および真菌Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。このような病原体は、トキシン遺伝子を含むように改変することにより、バキュロウイルスの効力がそのような改変により増強されてきたように、害虫防除剤として増強させることができる。すなわち、節足動物からの殺虫性トキシンを用いて、多くの有意な方法において昆虫防除の分野を前進させうることが明らかである。したがって、殺虫性効力および昆虫選択性の所望の特性を有する本発明の新規組成物は、それが殺虫性化合物として直接用いることができるか否かにかかわらず、当該技術分野において有用であることが予測される。本発明のそのような組成物を有用にすることができる手段は当業者によく知られており、上述の段落において提供される例により特徴づけられる（しかしこれに限定されない）。スズメバチＢｒａｃｏｎｈｅｂｅｔｏｒ（文献にはＭｉｃｒｏｂｒａｃｏｎｈｅｂｅｔｏｒおよびＨａｂｒｏｂｒａｃｏｎｈｅｂｅｔｏｒとしても同定される）の毒液は、その顕著な殺虫性効力のため広範囲に研究されてきた。すなわち、本発明は、昆虫の研究および防除に有用な、ＢｒａｃｏｎｈｅｂｅｔｏｒおよびＢｒａｃｏｎ属の他の種の毒液の画分の単離、生成および同定に関する。発明の概要本発明は、スズメバチであるＢｒａｃｏｎｈｅｂｅｔｏｒおよびＢｒａｃｏｎ属の他の種、例えばＢｒａｃｏｎｍｅｌｌｉｔｏｒから単離される、害虫に及ぼすその神経毒効果を特徴とする、殺虫効果を有するトキシンに関する。これらのトキシンは、配列番号１のペプチド（本明細書においては場合により「１６ｋＤａトキシン」とも表される）、配列番号２のペプチド（本明細書においては場合により「３０ｋＤａトキシン」とも表される）、場合により１８−１トキシンおよび１８−２トキシンとも表される２つのトキシン、および「２０ｋＤａトキシン」と表される第５の蛋白質、ならびにそれぞれ配列番号３（「１６ｋＤａトキシンｃＤＮＡ」）および配列番号４（「３０ｋＤａトキシンｃＤＮＡ」）と表される、１６ｋＤａおよび３０ｋＤａ蛋白質のｃＤＮＡ配列として本明細書中に例示される。これらの各トキシンの特徴は以下により完全に記載される。しかし、これらのトキシンを含む高度に精製された毒液分画の少量を、タバコバドウォーム（ｔｏｂａｃｃｏｂｕｄｗｏｒｍ）の幼虫の腹部への注入により投与すると、幼虫は弛緩麻痺により能力を喪失する。この高度に精製された分画、およびこれを得る方法もまた本発明の範囲内である。上述のトキシンの２つまたはそれ以上の組み合わせは、最適な殺虫性効力を得るのに有用であろう。別の観点においては、本発明は、記載されるトキシンを殺虫剤として使用するために改変および改良する方法を教示する。例えば、シグナル配列およびプロペプチド配列は、スズメバチトキシンを有効に分泌させるのに、またはこれらを特定の細胞または細胞中の位置に標的化させるのに有用であろう。したがって、シグナル配列は、長い精製過程を不要とするとともに、スズメバチトキシンの分泌および殺虫性効力を増強させる。最後に、本発明は、害虫と戦うための薬剤としてのこれらのトキシンの使用に関する。既知の組換え技術方法を用いてこれらのトキシンを大量に得ることができる。トキシンを工学処理により発現ベクター中に挿入し、次にこれをＥ．ｃｏｌｉ等の原核生物宿主または昆虫細胞株ＳＦ−９等の真核生物宿主のいずれかに挿入することができる。次に、単離された蛋白質を、害虫からの防御が求められている植物または動物に直接適用することができる。あるいは、トキシンを工学処理により天然の昆虫の病原体、例えばＢａｃｉｌｌｕｓまたはバキュロウイルス中に挿入することができる。組換え病原体を用いてペプチドまたはそのペプチドをコードする核酸を、害虫の中に直接移送することができる。これらの組換えにより工学処理された病原体は、親野生型病原体と比較して著しく増加した殺虫性効力を有するであろう。本発明のこれらのおよび他の目的および利点は、以下の詳細な記載および添付の特許請求の範囲を読むことにより、および添付の図面を参照することにより、明らかとなるであろう。図面の詳細な記載図１は、マトレックスレッド（ＭａｔｒｅｘＲｅｄ）Ａアフィニティーカラムによる染料−リガンドクロマトグラフィーに供したＢｒａｃｏｎｈｅｂｅｔｏｒスズメバチの抽出物のクロマトグラムであり、約１１５−１２９分の間に溶出された生物学的に活性なピークを示す。図２は、図１からのプールした活性画分をＴＳＫキレート（Ｃｈｅｌａｔｅ） −５ＰＷカラムによるクロマトグラフィーに供したクロマトグラムであり、約３１−４５分の間に溶出された生物学的に活性なピークを示す。図３は、図２からのプールした活性画分をフラクトゲル（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）ＥＭＤＴＭＡＥ−６５０カラムによる陰イオン交換クロマトグラフィーに供したクロマトグラムであり、約１４．５−１８分の間に溶出された生物学的に活性なピークを示す。図４は、図３からのプールした活性画分をＴＳＫＧ２０００ＳＷカラムによるサイズ排除クロマトグラフィーに供したクロマトグラムであり、約２４−２９分の間に溶出された生物学的に活性なピークを示す。図５は、図４からのプールした活性画分をフラクトゲル（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）ＥＭＤＴＭＡＥ−６５０カラムによる陰イオン交換クロマトグラフィーに供したクロマトグラムであり、約１５−１９．５分の間に溶出された生物学的に活性なプールされた画分を示す。図６は、図５からのプールされた活性画分をバイダック（Ｖｙｄａｃ）Ｃ４カラムによる逆相クロマトグラフィーに供したクロマトグラムである。画分４、６、７および９に対応する４つの主要なピークは、それぞれ配列番号１、１８−１トキシン、１８−２トキシン、および配列番号２のトキシンを含む。画分９はさらに、本明細書において２０ｋＤａトキシンとして同定される第二の成分を含む。発明の詳細な記載上で議論したように、本発明は、スズメバチ毒液から単離される、殺虫特性を示すトキシンに関する。より詳細には、本発明は、スズメバチＢｒａｃｏｎ属から単離される、選択された害虫に対する神経毒効果を特徴とする、殺虫効果を有する一群のトキシンに関する。本出願の目的のためには、用語「殺虫効果を有する（ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌｌｙｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」とは、本明細書に記載される条件下でタバコバドウォームの幼虫の弛緩麻痺による能力喪失に有効であることと定義される。これらのトキシンは、本明細書において、配列番号１（１６ｋＤａトキシン）、配列番号２（３０ｋＤａトキシン）、１８−１および１８−２トキシン、および２０ｋＤａトキシン、ならびにそれぞれ配列番号３（１６ｋＤａトキシンｃＤＮＡ）、配列番号４（３０ｋＤａトキシンｃＤＮＡ）と表される１６ｋＤａおよび３０ｋＤａトキシンのｃＤＮＡ配列により例示される。本明細書はまた、これらの成分を含む高度に精製された画分、およびこの画分を得る方法を記載する。本明細書はまた、組換えＤＮＡ法によるこれらのトキシンの発現の方法を記載する。さらに、既知の技術により、トキシンｃＤＮＡ配列を含む発現ベクターを宿主細胞または生物中にトランスフォームまたはトランスフェクトすることが可能である。したがって、本発明は、殺虫剤として用いるための天然に生ずるトキシンを提供する。天然に生ずるトキシンを種々の方法で用いて、昆虫を防除するか、またはそのようなトキシンの昆虫に及ぼす影響を研究することができる。実験方法および特性決定本明細書において用いられる主要な実施可能技術および用語は、当該技術分野においてよく知られている。それにもかかわらず、本願発明の全体的範囲の明確な理解を与えるために、発明を実施するために用いることができる以下の実験方法および特性決定技術に言及する。生物学的アッセイＢｒａｃｏｎｈｅｂｅｔｏｒ成体は、実験室で飼育したかまたは商業的供給源より入手した。Ｂｒａｃｏｎｍｅｌｌｉｔｏｒ成体はＵＳＤΛ／ＡＲＳラボラトリ（Ｗｅｓｌａｃｏ，Ｔｅｘａｓ）から入手した。殺虫活性のアッセイは、実験室で飼育した、タバコバドウォームであるＨｅｌｉｏｔｈｉｓｖｉｒｅｓｃｅｎｓ（ＴＢＷ）またはマメアワヨトウ（ｂｅｅｔａｒｍｙｗｏｒｍ）であるＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｅｘｉｇｕａ（ＢＡＷ）の最終虫齢の幼虫で実施した。スズメバチ全体または切開した組織からの抽出物（簡潔のために、これらの抽出物は、以下に場合によって「毒液」と表す）は、膜マイクロ濾過（平均孔径０．２ミクロン）により滅菌したリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ６．５）、第２のリン酸緩衝化食塩水（ｐＨ８．０）、またはホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）中で特徴的に調製した。クロマトグラフィーを開始する前の組織ホモジナイズ、遠心分離、および濾過の全行程は、氷上または４℃の定温下で実施した。毒液分画は特徴的にクロマトグラフィー分離に用いた緩衝液中に適用した。ほとんどの場合において、組織抽出物は、ＰＢＳではなくこれらのクロマトグラフィー緩衝液中で調製した。すべての場合において、対照幼虫を等量の適当な緩衝液で処置した。すべての試料は、幼虫の血液嚢中に注入することにより投与した。注入部位は、第３腹節と第７腹節の間の側面正中線に沿っていた。注入後、幼虫を別々のペトリ皿中に食料とともに保持し、解剖顕微鏡下で定期的に観察した。背または側面を下にして置かれてから３０秒以内に自分で起きることができなかった幼虫を麻痺であると評価した。有意に弱い（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）起立応答（１０秒と３０秒との間）を示した幼虫を部分麻痺であると評価した。Ｂｒａｃｏｎ毒液および毒液画分は、鱗翅類幼虫において特徴的な弛緩麻痺を生ずる。精製画分の効果は、粗毒液の効果と同一である。ＴＢＷおよびＢＡＷ幼虫においては、Ｂ．ｈｅｂｅｔｏｒ毒液もしくは毒液画分の効果とＢ．ｍｅｌｌｉｔｏｒ毒液もしくは毒液画分との間に見かけ上の相違はない。影響を受けた幼虫はまず運動失調となり摂食を停止し、次にそれらの付属器官の制御を失い、体壁筋系において正常状態（ｔｏｎｅ）の欠失を示す。この麻痺はすべての自発運動機能の見かけ上の喪失により特徴づけられる。腸蠕動、鼓動および呼吸収斂を含む非自発運動機能は、幾分正常に継続し、長期間持続しうる。半麻痺（ｓｕｂｐａｒａｌｙｔｉｃ）用量は、運動活性の著しい減少および摂食の休止または深刻な阻害をもたらした。すなわち、他の研究者により以前に指摘されたように、Ｂｒａｃｏｎ毒液は致死的ではないが、「宿主（ｈｏｓｔ）」幼虫をスズメバチによる消費に適した状態に固定化する。雄スズメバチから調製した抽出物は、識別しうる生物学的効果を有さなかった。蛋白質精製Ｂｒａｃｏｎｈｅｂｅｔｏｒスズメバチ毒液からのトキシンは、当該技術分野において知られる方法を用いて単離した。簡単には、スズメバチ全体または切開した毒液腺およびそれに伴う構造をホモジナイズし、生物学的に活性なトキシンを溶解させるために超音波処理した。次に、ホモジネートを遠心分離し、上清をポリエチレングリコールで処理して、活性成分を析出させた。析出物を出発緩衝液に再懸濁し、染料−リガンドクロマトグラフィーに供した。生物学的に活性な画分を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および逆相クロマトグラフィーに供することにより、トキシンをさらに精製した。逆相クロマトグラフィーにより４つの画分（番号４、６、７および９）が得られ、これはそれぞれ配列番号１（１６ｋＤａトキシン）、１８−１トキシン、１８−２トキシン、および配列番号２（３０ｋＤａトキシン）に相当した。約２０ｋＤａの分子量を有する第５の成分が、画分９において３０ｋＤａ成分とともに溶出されるが、これはＳＤＳ− ＰＡＧＥにより分離可能である。Ｂｒａｃｏｎｍｅｌｌｉｔｏｒ抽出物に関して用いられた別の蛋白質精製技術は実施例１８に記載される。抗体本発明の範囲内には、配列番号１（１６ｋＤａトキシン）、配列番号２（３０ｋＤａトキシン）、１８−１トキシンおよび１８−２トキシン、２０ｋＤａトキシン、および拡張により類似のトキシンの各トキシンに対する抗体が含まれる。抗体とは、動物中で生成され、特定の蛋白質を認識またはそれに結合するといわれる蛋白質である。本発明の昆虫トキシンを研究するとき、トキシンの量、局在および他の蛋白質との会合をモニターできることは有用であろう。ウエスタンブロット、免疫沈降アッセイ、および免疫組織化学アッセイ等の技術は、問題とするペプチドを特異的に認識する抗体を用いずに実施することはできない。さらに、当該技術分野においてよく知られる方法により、これらのトキシンが結合する蛋白質を抗体を用いて精製し、続いてクローニングすることができる。これは、例えば発現ライブラリをスクリーニングすることにより行うことができる。あるいは、これらのトキシンは、抗体を固体支持体に固定化して、免疫アフィニティークロマトグラフィーを用いることにより精製することができる。抗体は、当該技術分野において知られる種々の方法により生産することができる。一般的には、抗体は外来動物（典型的にはウサギまたはマウス）を精製蛋白質で免疫感作することにより生成される。スズメバチ毒液全体または組織抽出物から精製した、組換えにより発現させた、または合成した昆虫トキシンは、抗体生産に適しているであろう。蛋白質は動物において免疫応答を誘導し、その蛋白質を認識する多くの抗体が産生される。これらの動物の血清は、蛋白質またはそのフラグメントもしくは誘導体を認識する多くの抗体の混合物であるポリクローナル抗体を含む。あるいは、当該技術分野においてよく知られるハイブリドーマクローニング技術により、モノクローナル抗体と称される単一抗体を生産することができる。Ｋｅｎｎｅｔｔ，Ｒ．Ｈ．ｅｔａｌ．，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：ＡＮｅｗＤｉｍｅｎｓｉｏｎｉｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｎａｌｙｓｅｓ，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８２を参照されたい。簡単には、動物を免疫感作し、その動物の脾臓細胞を単離し、それらを適当なメラノーマ細胞株と融合させることにより不死化する。限定希釈により細胞をクローニングする。適当なモノクローナル抗体を産生する細胞株を保存し、残りの細胞株を破棄する。すなわち、問題とする殺虫性トキシンの使用に関連するさらなる特性決定、研究および開発を容易にするために、本発明のトキシンに対する抗体を生産することが可能である。ｃＤＮＡの単離および特性決定配列番号３（１６ｋＤａトキシンｃＤＮＡ）および配列番号４（３０ｋＤａトキシンｃＤＮＡ）のｃＤＮＡ配列は、当業者によく知られる方法により単離した。一般的には、１６ｋＤａトキシン（配列番号５）および３０ｋＤａトキシン（配列番号６）のＮ−末端配列を化学的配列決定により決定した。遺伝コードおよび入手可能な昆虫のコドン使用のデータに基づいて、この蛋白質のアミノ酸をコードする核酸配列に相補的な縮重オリゴヌクレオチドを合成した。配列番号３（１６ｋＤａトキシンｃＤＮＡ）および配列番号４（３０ｋＤａトキシンｃＤＮＡ）のｃＤＮＡ配列に示されるように、オリゴヌクレオチドを用いてポリメラーゼ連鎖反応技術により配列アミノ酸残基１から始まる成熟トキシンペプチドの選択的増幅を行い、続いてｃＤＮＡライブラリスクリーニングを行った。得られた生成物はＤＮＡ配列決定により確認した。タンパク質修飾タンパク質修飾は、４つの一般的カテゴリーに細分化することができる。即ち、化学的プロセシング、付加、置換及び欠失である。これら一般なグループは、核酸配列及びタンパク質のアミノ酸配列の両方に適用される。タンパク質修飾は自然に起こり得るが、最も頻繁なタンパク質修飾は、そのタンパク質をコードする核酸配列内を故意に操作することにより行われる。部位特異的突然変異誘発法の如きタンパク質修飾技術が当該技術分野で周知であり、多くの場合、使用説明書を全部備えたキットとして、例えば、Amersham and Bethesda Research Labor atories から市販されている。化学的プロセシングは、一般にタンパク質翻訳の後に起こり、アミド化、グリコシル化、パルミトイル化、及び異性化の如き修飾が含まれる。かかるプロセシングは、毒素の安定性及び最適な活性のために必要であり得る（Heckら，Scienc e，266: 1065-1068，1994）。しかしながら、これら事象の必要性及び性質は、化学的配列決定又はｃＤＮＡ配列の翻訳からいつでも予測できる訳ではない。タンパク質修飾は、付加を通して起こることができる。ここで定義される付加とは、その毒素の機能を有意に変えることなく、そのタンパク質の一次アミノ酸配列よりも少なくとも１つ多いアミノ酸を含有するタンパク質を生成するところの核酸又はアミノ酸配列に対してなされる修飾である。タンパク質のコーディング領域における天然に存在する核酸付加は、しばしば、読み取り枠のシフトを起こすことによってそのタンパク質の機能を大きく害する。ヌクレオチド付加の点から、そのアミノ酸配列は、そのタンパク質の一次アミノ酸配列とは全く異なってしまう。しかしながら、そのタンパク質のコーディング領域内でタンパク質の読み取り枠を変化させない付加を持たせることは可能である。遺伝子の５'又は３'非翻訳領域におけるヌクレオチド付加は、通常は、タンパク質の機能に影響しない。上記のように、付加は、通常、タンパク質内で故意に行われる。本発明においては、例えば、成熟タンパク質は、そのタンパク質の効率的翻訳にとって好ましい開始メチオニンを欠いている。かくして、成熟タンパク質のアミノ末端へのメチオニンの付加、並びに他のアミノ酸及び停止コドンやリボソーム結合部位の如きタンパク質の発現を容易にするヌクレオチドの付加は、この発明の範囲内に含まれる。シグナル配列又はシグナルペプチドの付加がこの発明の範囲内に含まれるということも理解される。シグナル配列は、細胞又は生物内の特定の位置へのタンパク質の輸送を指揮する。また、シグナル配列は、タンパク質が分泌されるようにすることができる。全ての公知のシグナルペプチドを比較すると、それらは約１５〜３０残基の長さであることが分かる。シグナルペプチド内には、疎水性領域（ｈ領域）を構成する一続きの７〜１３残基がある。このｈ領域は Ala、Met、Val、Ile、Phe及び Thr が豊富で、場合によっては、Pro、Gly、Ser 又はThe 残基を含有する。von Heijne，G.，J．Mol．Biol.，184，99-105(1983)。この配列相同性は、細菌から高等真核生物にまで共通して所有されており、このことは、定位機構が高度に保存されていることを示唆する。一生物からのタンパク質は、幾つかの他の生物の定位機構によって置き換えられることができそして正確にプロセスされることができる。Muellerら，J．Biol．Chem.，257，11860-11863(1982)。逆に言えば、一生物からのシグナルペプチド及び異なる生物からのタンパク質を含む組換えタンパク質も正しく位置しているのである。Yostら(1983)；Jabbar & Nayak，Mo l．Cell．Biol.，7，1476-1485(1987)。シグナル配列は、その残りのタンパク質配列から独立の機能的配置を形成しているということが研究によって示唆されており、それは、何故にシグナル配列が異なるタンパク質や異なる種の間で容易に交換できるのかを説明するものである。事実、サソリのペプチド、つまりＡａＩＴを用いてバキュウイルス内で行われた研究は、１つの種からのシグナル配列の他の種からの昆虫毒素への付加がうまくいくと期待されることを証明している。このＡａＩＴペプチドは、蚕毒素（bombyxin）、つまり蚕 Bombyx mori からの分泌ペプチドからのシグナル配列と融合し、昆虫に毒性がある機能性ＡａＩＴペプチドを分泌することが示された。McCutchen，B.F．ら，Bio/Technology 9，84 8-852(1991)。最後に、分泌シグナルペプチドも、タンパク質産物を宿主細胞により保持させるというよりむしろ培地中に分泌させることにより、発現系内のペプチドの精製を大きく促進することができる。多くの場合、それらタンパク質は培地内で十分に純粋なので更なる精製は不要である。このことは、広範囲の条件下で安定である小さなタンパク質について特に言えることである。多くの原核細胞、並びに真核細胞及びウイルスについてのシグナルペプチドは、十分に特性決定され、かつ文献に記載されている。かくして、ＰＣＲ又は合成オリゴヌクレオチドの如き基本的組換えＤＮＡテクノロジーを用いて、そのアミノ末端にシグナルペプチドを含有する組換えタンパク質を容易に作ることができる。抗原性エピトープの付加がこの発明の範囲内に含まれるということも理解される。エピトープは小さな通常６〜２０アミノ酸残基の抗原性ペプチドであって、それについて独特かつ特異的な抗体が存在する。かくして、抗原性エピトープを組換え技術で作ることにより、科学者は、その特異的ペプチドを認識する特異的かつ効果的な抗体を保証される。そのような抗原性エピトープの一つは、機能への如何なる有害な作用もなしに、多くのタンパク質内に組換え技術で組み込まれたｃ−ｍｙｃエピトープである。他の幾つかのエピトープが、十分に文献に記載されており、それらを認識する抗体と一緒に市販されている。シグナルペプチドのように、エピトープを含有する組換えタンパク質を、普通の組換えＤＮＡ技術を用いて作ることができる。しかしながら、シグナルペプチドのように、抗原性エピトープは、タンパク質のアミノ末端又はカルボキシ末端において工学的に作ることができる。置換を通して生ずるタンパク質修飾も、本発明の範囲内に含まれる。ここで定義される置換とは、タンパク質の核酸又はアミノ酸配列に成される修飾であって、その毒素の機能を有意に変えることなく、一次タンパク質とは異なるアミノ酸配列を含有するタンパク質を生成する修飾である。付加のように、置換は自然であっても人工的であってもよい。アミノ酸置換がそのタンパク質の機能を有意に変えることなく成され得ることは、当該技術分野で周知である。このことは、その修飾が“保存された”アミノ酸についてのアミノ酸の置換であるときに特に言える。保存されたアミノ酸とは、大きさ、電荷、極性及び配置の故に、そのタンパク質の構造及び機能を有意に影響することなく置換されることができる天然又は合成アミノ酸のことである。頻繁に、多くのアミノ酸が、そのタンパク質の機能を害することなく保存的アミノ酸により置換され得る。どのようなアミノ酸ででも置換できるか、又は保存されたアミノ酸によってのみ置換できるかは、興味の対象である具体的ペプチドを他のハチの毒素と比較することにより決定するのが最もよい。タンパク質ファミリーの全てのメンバーにおいて同一であるアミノ酸を置換することは通常はできない。これは、しばしば、そのタンパク質の第二構造の形成にとって重要であるシステイン残基での場合である。保存されるアミノ酸は、通常、タンパク質の機能に有意に影響することなしに、他の保存されたアミノ酸により置換されることができる。最後に、ファミリー内で保存されていないアミノ酸は、通常、自由に置換することができる。一般に、非極性アミノ酸 Gly、Ala、Val、Ile 及び Leu；非極性芳香族アミノ酸 Phe、Trp 及び Tyr；中性極性アミノ酸 Ser、Thr、Cys、Gln、Asn 及びMet；陰性に荷電したアミノ酸 Lys、Arg 及び His；陽性に荷電したアミノ酸Asp 及び Glu は保存アミノ酸のグループに相当する。この列挙は網羅したものではない。例えば、Ala、Gly、Ser 及びある場合には Cys は、たとえそれらが異なるグループに属していても、互いに置換することができることは周知である。保存的アミノ酸置換は、天然に存在するアミノ酸に限定されず、合成アミノ酸を包含する。普通に用いられる合成アミノ酸は、種々の鎖長のωアミノ酸で、中性非極性類似体であるシクロヘキシルアラニン；中性非極性類似体であるシツリン及びメチオニンスルホキシド；芳香族中性類似体であるフェニルグリシン；陽性に荷電した類似体であるシステイン酸；及び陰性に荷電したアミノ酸類似体であるオルニチンである。天然に存在するアミノ酸のように、この列挙は網羅したものではなく、当該技術分野で周知である置換を単に例示したに過ぎない。最後に、タンパク質修飾は、欠失を通して生じることができる。ここで定義される欠失は、その毒素の機能を有意に変えることなく、そのタンパク質の一次アミノ酸配列よりも少なくとも１つのアミノ酸を少なく含有するタンパク質を生成するところの核酸又はタンパク質のアミノ酸配列に対してなされる修飾である。付加のように、タンパク質のコーディング領域内で自然に生じる欠失は、通常は、タンパク質の機能を大きく害するが、５'及び３'非翻訳領域における欠失はタンパク質の機能に影響しない。しかしながら、故意の欠失は、外来生物内でのタンパク質の発現にとって必要であるか又は有用であり得る。例えば、配列番号：５（１６ｋＤａ毒素ＮＴ）及び配列番号：６（３０ｋＤａ毒素ＮＴ）のｃＤＮＡ配列は、リーダー配列及び成熟タンパク質の両方をコードする。ハチにおいては、前駆体ペプチドが分泌されるときにこのリーダー配列がタンパク質分解により最も除去され易いようである。従って、前駆体タンパク質からリーダー配列を除去する欠失は、そのハチにより分泌されるものと類似の機能性成熟タンパク質を産するであろう。従って、リーダー配列の欠失、並びにその毒素の発現を促進する他の欠失は、本発明の範囲内に含まれる。組換え発現特定の要請に適したタンパク質を発現するようにｃＤＮＡを組換え技術で修飾したら、全ての修飾を包含するそのｃＤＮＡを発現ベクター内にサブクローン化する。一般に、発現ベクターは、プロモーター、終止シグナル及びある場合には選択マーカーを更に含有するプラスミドのようなものである。原核性、真核性又はウイルス性のプロモーター及び終止シグナルを含有するあらゆる発現ベクターが、本発明の範囲内に含まれる。プロモーターは、概してｃＤＮＡに対して５'に工学的に作られた核酸配列であって、ｃＤＮＡを鋳型として用いるＲＮＡの転写を補充しそして指揮する配列である。この転写されたＲＮＡメッセージから、細胞は、翻訳として知られる過程を通して、そのｃＤＮＡによりコードされるタンパク質を組み立てることができる。プロモーターは、一般に、構成的、誘発的、又は組織特異的プロモーターとして分類することができる。構成的プロモーターは、如何なる細胞因子によっても有意な程度にまで調節されることのないプロモーターであって、ＲＮＡの転写を継続的に指揮する。これらプロモーターは、大量のタンパク質が望まれるときに用いられる。サイトメガロウイルスプロモーター及びラウス肉腫ウイルスプロモーターは、構成的真核性プロモーターの例である。バクテリオファージ１のｉｎｔプロモーター及びβ−ラクタマーゼのｂｌａプロモーターは、構成的原核性プロモーターの例である。このグループに含まれるものは、前期（early）又は後期（late）プロモーターとして特徴付けられるプロモーターである。これらプロモーターは、通常は、ウイルスの複製における前期又は後期のいずれかで高いレベルに活性化されるウイルスプロモーターである。バキュロウイルスｐ１０及びポリヘドリンプロモーターは後期プロモーターの例である。誘発的プロモーターは、一定の因子により誘発されるか又は抑制されるプロモーターである。これらプロモーターは、産生されるタンパク質の量及びかかる産生のタイミングの調節を可能にする。誘発的プロモーターの例は、高まったレベルの重金属により誘発される真核性メタロチオニンプロモーター及びイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）に応答して誘発される原核性ｌａｃＺプロモーターである。最後に、組織特異的プロモーターは、特定の細胞型においてのみ機能するプロモーターである。これらプロモーターは、通常、全ての細胞型におけるタンパク質の発現がその生物にとって有害であるときに用いられる。哺乳動物組織特異的プロモーターの例は、骨格筋クレアチンキナーゼプロモーターである。発現ベクターは終止シグナルも必要とする。終止シグナルは、通常は、興味の対象であるタンパク質に対して３'に工学的に作られる。高等真核細胞では、例えば、発現ベクターは、タンパク質に翻訳されるべき転写産物のために、ポリアデニル化シグナルを含有しなければならない。アデノウイルスのポリアデニル化シグナル及びバキュロウイルスのポリヘドリンポリアデニル化シグナルのような終止シグナルを用いることができる。また、ペプチド自体のポリアデニル化シグナルも、効率的終止シグナルとして役立つことができる。殆どの場合において、発現ベクターは、その発現ベクターを積極的に取り込んだ細胞の同定を可能にする選択マーカーも必要とする。これら選択マーカーは、そのタンパク質産物が抗生物質又は他の化学物質に対する耐性を与える遺伝子である。かくして、一定の化学物質の存在下又は不存在下で増殖できる細胞は、その発現ベクターを含有しているということが分かる。選択マーカーの例は、原核細胞にアンピシリンに対する耐性を与えるβ−ラクタマーゼ遺伝子及び真核細胞においてＧ−４１８に対する耐性を与えるネオマイシン遺伝子である。発現ベクターは１つの選択マーカーに限定されないので、事実、殆どの発現ベクターは複数の選択マーカーを含有している。要するに、原核性及び真核性プロモーター、終止シグナル及び選択マーカーの入手可能性及び認識は、当該技術分野において周知である。事実、細菌性、酵母性、哺乳動物性及びウイルス性発現系のために多くのタイプの発現ベクターが市販されている。組換え宿主次いで、ｃＤＮＡを内包する目的の発現ベクターを宿主細胞又は生物の中に形質転換又は形質移入する。形質転換及び形質移入のいずれも、当該技術分野で周知のエレクトロポレーション又はリン酸カルシウム処理の如き方法により、発現ベクターを宿主内に取り込むことをいう。プラスミドのように、発現ベクターはエピゾームのままであることも、宿主ゲノムの一部として取り込まれることもできる。宿主ゲノム内への取り込みは、ランダム組込み又は相同組換えのいずれかにより達成することができる。ランダム組込みは宿主ゲノムの不明な位置内への複数遺伝子の挿入をもたらすが、相同組換えは宿主ゲノムの既知の位置内への１コピーの遺伝子の挿入をもたらす。上記の技術は、この発明の毒素の発現にとって有用であると考えられるので、本発明の範囲内に含まれる。組換え宿主は、達成されるべき目標に基づいて選ばれる。殺虫剤として有効なタンパク質を発現するという目的のために、特に有用な２種の一般的なタイプの宿主がある。即ち、大量の組換えタンパク質を単離するのに有用である宿主、及び害虫に感染する宿主である。細菌、特に大腸菌は、依然として、大量の組換えタンパク質の単離に最も広く用いられる宿主である。従って、昆虫毒素を発現する組換え細菌宿主は、殺虫剤として用いるための本発明の昆虫毒素を単離するのに有用な技術と考えられる。毒素は、上で説明したようにシグナルペプチドと融合されることも、成熟タンパク質として分泌されることもできる。細菌性過剰発現系は、当該技術分野で周知であり市販されている。しかしながら、細菌性過剰発現系内で発現した毒素は、翻訳後修飾を含有しないであろう。従って、バキュロウイルス感染昆虫又は昆虫細胞系が、大量の翻訳後修飾タンパク質を単離するために頻繁に用いられる。多種多様な原核性及び真核性タンパク質が、バキュロウイルス内でうまく発現されてきた。Luckow，V.と Summers，M.，Bio/Technology，6，47-55(1988)；Summers，M．D．と Smith，G ．E.，Texas Agricultural Experimental Station Bulletin，1555，1-56(1987) 。細菌宿主におけるように、組換えバキュロウイルスは、タンパク質を融合体としてでも成熟タンパク質としてでも発現することができる。この系における外来遺伝子の発現は、５００ｍｇ／リッターものタンパク質を産することが知られている。昆虫細胞は真核細胞なので、バキュロウイルス感染昆虫細胞を用いて産生される組換えタンパク質は、その天然のタンパク質に非常に類似している。研究により、バキュロウイルスベクターによって発現される組換えタンパク質は、分泌されることも、核に局在することも、細胞表面に局在することも、ジスルフィド結合することも、タンパク質分解で開裂することも、リン酸化されることも、Ｎ−グリコシル化されることも、Ｏ−グリコシル化されることも、ミリスチル化されることも、パルチミル化されることもできることが示されている。Luckow,V ．と Summers，M.，Bio/Technology，6，47-55(1988)。これら宿主から単離された組換えペプチドは、害虫から保護されることが求められる植物又は動物に直接適用することができる。後で説明するように、組換えウイルス自体を害虫抑制剤として用いることができる。また、この組換えペプチドは、害虫の麻痺をもたらす生理的メカニズムを研究するのに用いられるであろう。他の節足動物毒素の作用のメカニズムが分かっているので、ここで興味の対象である毒素はニューロンの機能を変えることによって作用するようである。部分精製した Bracon venom 成分での研究で、これら物質が神経筋接合部における神経伝達物質放出を阻害することが示唆された。更に、先行技術及びこの明細書中のデータは、これら毒素が害虫について高度に選択的で、無視できる程度の哺乳動物毒性しか示さないことを強く示唆している。このことは、哺乳動物のニューロンは神経伝達物質放出を阻害又は増強する毒素に感受性であることが周知であるという事実にも拘らず真実である。従って、この発明の毒素のような毒素を、昆虫と脊椎動物の間のそれらそれぞれの標的部位の相違を説明しかつ特徴付けるのに役立てるために用いることができる。次いで、この情報を、害虫に高度に選択的である化学殺虫剤を開発することを目的とした化学デザイン研究に用いることができる。昆虫に感染する病原体が、本主題のペプチドを発現するのに有用な組換え宿主の第二の部類に相当する。農業的観点から、病原性真菌もこの目的に使えるかも知れないが、細菌及びバキュロウイルスが最も見込みのある病原体候補である。昆虫にとって病原性である一定の細菌、特にBacillus thuringiensis(B.t.)は、種々の害虫を抑制するのに用いられてきた。不運にも、天然に存在する病原体は、しばしば、送達、毒性及び作用の速度における限界のために、生物学的殺虫剤として限定された利用性しか有さなかった。しかしながら、本研究は、B.t.を操作して野生型B.t．の幾つかの限界を克服する組換え細菌を作り得ることを証明した。最も注目すべきことは、このB.t．δ−菌体内毒素遺伝子を細菌性病原体の中に組み込んで、優れた殺虫特性を発揮するハイブリッド宿主を作れたことである。同様に、この発明の毒素を発現する組換え技術で作られる細菌性又は真菌性病原体の生成は有用であると考えられるので、本発明の範囲内に含まれる。野生型バキュロウイルスも、Heliothis virescens（タバコガ）、Orgyia pseu dotsugata（Douglas fir マイマイガ）及び Laspeyresia pomonella（コドリンガ）を含む多くの異なるタイプの害虫の天然の調節物質である。Groner, A．1986．Specificity and Safety of Baculovirus．Vol I，Biological Proper ties and Molecular Biology；Granados，R．R．と Federici，B．A．編 CRC Pr ess，Inc．Boca Raton，Florida を参照のこと。Autographa californica核多角体病ウイルスの如きバキュロウイルスは、感染後ウイルス子孫、即ち、細胞外ウイルス粒子及び閉塞性ウイルス粒子を生成する。閉塞性ウイルス粒子は、水平及び垂直伝染の手段を提供するので重要である。感染した害虫が死んだ後、数百万のウイルス粒子がウイルス性閉塞によって保護される。かくして、害虫が汚染された植物を食べると、それらはその閉塞物質を消化する。閉塞物質は、昆虫の消化管のアルカリ性環境下で溶解してウイルス粒子を放出し、それが感染してその昆虫の中腸組織の中で複製する。別の宿主内への二次感染は、細胞外の未閉塞ウイルス粒子によって拡がる。不運にも、バキュロウイルスにより感染された昆虫は死ぬのに一週間又はそれ以上かかり、その期間も食べ続けるので、野生型のバキュロウイルスの商業的用途を商業的に実行不可能なものにしてしまう。しかしながら、Autographa calif ornica 核多角体病ウイルスの如きバキュロウイルスを、殺虫性毒素を発現するように組換え技術で操作することができ、かくして、それらの病原作用を加速することができるということが分かった。McCutchen，B.F．ら，Bio/Technology 9 ，848-852(1991)；Tomalskiら，Nature，352，82-85(1991)；Stewartら，Nature ，352，85-88(1991)。ポリヘドリンプロモーターにより駆動するポリヘドリン遺伝子及びｐ１０プロモーターにより駆動するＡａＩＴ昆虫毒素を含有する組換えベクターｐＡｃＵＷ２（Ｂ）.ＡａＩＴを構築した。得られたこの組換えバキュロウイルスは、普通の条件下で経口感染性であった。更に、ＡａＩＴ毒素は感染の途中で分泌され、そしてそのウイルスについての本来の宿主ではない Manduca sexta larvae 及び本来の宿主である Heliothis virescens larvae の両方の麻痺を起こした。当該技術分野で周知の基本的な組換え技術を用いて、広い宿主範囲及び高い毒性を発揮する組換えバキュロウイルスを作るために、本発明の毒素を同じように組換え操作することができる。次いで、この発明の毒素を発現する組換えバキュロウイルスを、現行の殺虫剤のように、害虫から保護されることが求められる作物に投与することができる。環境への組換えバキュロウイルスの放出は、害虫を抑制する安全で効果的な手段であると考えられる。第一に、天然に存在する殺虫性毒素は高度に選択的である。加えて、バキュロウイルスは哺乳動物に感染しないので昆虫群の範囲内で高度に選択的である。従って、バキュロウイルス宿主及び殺虫性ペプチドを注意して選択することによって、標的の害虫に高度に選択的であると同時に、益虫を含む標的ではない生物への衝撃を少なくした組換えバキュロウイルスを工学的に作ることは可能である。第二に、組換えバキュロウイルスは、強い選択的圧力の不存在下では、環境的圧力に曝した短期間後に野生型に戻るようである。かくして、この組換えバキュロウイルスの比較的短い寿命が、標的ではない種へのリスクを更に軽減する。組換えバキュロウイルスを施す量及び頻度は、もちろん、保護される特定の作物、害虫及び気候の如き事柄に依存するであろう。従って、組換えバキュロウイルスを施す量及び頻度は、経験的に決定されるのが最も良い。実施例以下の実施例は、本発明に従って実施されるかまたは実施することができる様々な態様を例示するために示される。これらの実施例は例示のためのみに示されるものであり、以下の実施例は包含的または網羅的なものではないものと理解するべきである。実施例１バイオアッセイ：全スズメバチ、Bracon hebetorからの、または精製の間に得られた生物学的活性画分からの抽出物を、毒分画の間に使用した所望の量のリン酸緩衝食塩水または他の緩衝液に溶解した。試料を、前記のようにして、タバコブドワーム（budworm）、Heliothis virescensの５齢幼虫の腹部に注入により投与した。対照幼虫には、等量の適当な緩衝液を注入した。抽出物または活性画分をH．virescens 幼虫に注入すると、影響を受けた幼虫は最初に運動失調になり、食物摂取を停止し、次いで自身の付属器官の調節を失い、肉体壁筋肉系中の緊張の喪失を示した。この麻痺は、全ての随意運動機能の明白な喪失により特徴付けられた。消化管蠕動、心拍、および呼吸収縮を含む不随意機能は多少なりとも通常通り継続し、多くは何日間も持続した。麻痺性以下の投与量は、運動活性の顕著な減少と、食物摂取の停止または強い阻害を引き起こした。対照幼虫は影響を受けなかった。以下の表は、全スズメバチ抽出物と、精製操作の間に得られた生物学的活性画分との毒性の要約である。毒素の麻痺活性は、酸性条件下で破壊される。従って、最終クロマトグラフィー工程からの画分はバイオアッセイされなかった。実施例２配列番号１（１６ｋＤａ毒素）の精製：スズメバチ抽出物を、Beckman System Gold 126 溶媒デリバリーおよび１６８フォトダイオード配列検出器モジュールを備えた高速液体クロマトグラフィーによって分画した。Bracon 毒素はｐＨ８から９の間で最も安定であり、ｐＨ＜７に露出すると活性の急速な喪失を招く。毒素は、一旦溶液中に存在すると、０℃ よりも４℃の方がより安定である。従って、画分は精製の間冷蔵庫の中で保存した。 Bracon hebetorの全スズメバチを使用するまで−７０℃で凍結保存した。凍結したスズメバチ（１２．８８ｇ；雄と雌のスズメバチの混合物）を、６０ｍｌの冷却（４℃）した５０ｍＭの一リン酸ナトリウム（sodium monophosphate）と混同し、水酸化ナトリウムでｐＨ８．１に調整し、Tissue-Tearor ホモジナイザー（Biospec Products,Inc.）でホモジナイズした。ホモジネートを次いで４℃で２０秒間超音波処理し（VirSonic 475; Virtis）、１９，０００ｒｐｍで２０分間遠心した（Sorvall SS-34 ローター）。生物活性上清を回収した。ペレットを、上記したように、各回３５ｍｌの冷却緩衝液で、さらに２回抽出した。全部で３回の抽出からの上清を合わせて、最後に２０分間１９，０００ｒｐｍで遠心して透明化した。冷却した透明化上清を（１３５ｍｌ）に、等量の６０％ポリエチレングリコール（ｗ／ｖ水中、３３５０平均分子量；Sigma Chemical Co.）を添加した。混合物に渦を巻かせ、４０分間氷上に放置し、生物活性タンパク質を沈殿させた。次いで、混合物を１９，０００ｒｐｍで２０分間遠心した。不活性上清を廃棄し、過剰のポリエチレングリコールを、ペレットを溶解することなく、２ｍｌの水で遠心管からリンスした。次いで、生物活性ペレットを２４ｍｌの出発緩衝液に再懸濁し、懸濁物を１９，０００ｒｐｍで２０分間回転した。生物活性を含有する、曇った上清を複数のAcrodisc PF フィルター（０．８／０．２μ ｍフィルター；Gelman Sciences）で濾過し、濾液を全量２ｍｌの緩衝液でリンスした。ペレットを１０ｍｌの緩衝液に再懸濁した後、上記したように１９，０００ｒｐｍで１５分間遠心し濾過した。合わせた濾液（４０ｍｌ）を、水酸化ナトリウムでｐＨ８．１に調整した５０ｍＭの一リン酸ナトリウム(sodium monophosphate)で平衡化したMatrex Red Aアフィニティーカラム（２．６×１８ｃｍ；Amicon）上での色素−リガンドクロマトグラフィーに付した。試料を１．５ｍｌ／分の流速でカラムに載せ、流出物を２８０ｎｍで監視した。ローディングの後、カラムを〜１００ｍｌの同一緩衝液で３ｍｌ／分の流速でリンスした。次いで、カラムを、１６５ｍｌのリン酸緩衝液中３００ｍＭのＮａＣｌ、次いで１６０ｍｌのリン酸緩衝液中２ＭのＮａＣｌで、４ｍｌ／分の流速で（図１に示すように）、順次溶出させた。生物活性は、クロマトグラム上に示されるように、２ＭのＮａＣｌ洗浄において幅広いピークとして溶出した。これらの画分を、生物活性成分（単数または複数）の安定性を改善するために１．５ｍｌの０．５Ｍのホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．０）を含有する、１５ｍｌのチューブ中に回収した。固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）のための準備として、活性画分をプールして、イミダゾールで１ｍＭに調整した。赤いカラムプール（８０ｍｌ）を連続した２つのＴＳＫＣｈｅｌａｔｅ−５ＰＷカラム（各々７．５×７５ｍｍ；TOSOHAAS）上でクロマトグラフィーにかけた。カラムはＥＤＴＡでストリップしておき、新たにＣｕ⁺²を載せた（Belew，M .,他（1987）Anal．Biochem．164，457-465）。緩衝液Ａは、１ｍＭのイミダゾール、５０ｍＭのホウ酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ９．０であった。緩衝液Ｂは５０ｍＭのイミダゾール、５０ｍＭのホウ酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ９．０であった。試料を流速１ｍｌ／分でカラムに載せ、吸光度（２８０ｎｍ）を基底ラインまで戻しておいた後、カラムを１２ｍｌの５％Ｂ、次いで、５から３０％のＢの直線勾配で１０分間、そして３０から１００％のＢの直線勾配で１０分間展開した（図２に示す通り）。流出物を２８０ｎｍで監視し、画分を回収し、麻痺活性について分析した。３２から４５分の間に溶出する活性画分をプールした。イオン交換クロマトグラフィーのための準備として、プールを濃縮し、２つのCentricon-30 フィルター（30,000 MWCO フィルター；Amicon）中での限外濾過によって、５０ｍＭのホウ酸塩、ｐＨ９．０に変換した。陰イオン交換（ＡＸ）クロマトグラフィーは、Fractogel EMD TMAE-650 カラム（１×７ｃｍ、２５〜４０μｍ粒径；ＥＭ Separation Technology）上で行った。濃縮したＩＭＡＣプール（４ｍｌ）を５０ｍＭのホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．０）で１６ｍｌに希釈し、陰イオン交換カラムに載せた。カラムを１５ｍｌの出発緩衝液でリンスした。２８０ｎｍの吸光度が基底ラインまで戻った後、カラムを５０ｍＭのホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．０）中の０から１ＭのＮａＣｌの３７．５分の直線勾配で展開した。流速は１．５ｍｌ／分であり、流出物は２８０ｎｍで監視し（図３に示される通り）、画分を回収し、生物活性について分析した。１４．５から１７．５分の間に溶出する画分が最も活性であったが、最終ピークも少量の活性を示した。最高の活性の画分（１４．５〜１７．５分）を、Centri con-3 フィルター（３０００ＭＷＣＯフィルター；Amicon）中に〜０．９ｍｌまで濃縮した。次いで試料を、サイズ除去（ＳＥ）クロマトグラフィーのための準備として、９０μｌの０．２Ｍの一リン酸ナトリウム(sodium monophosphate) の添加によってｐＨ７．２に調整した。濃縮した陰イオン交換プール（９９０μｌ）をＴＳＫＧ２０００ＳＷカラム（２１．５×６０ｃｍ、１３μｍ粒径；TOSOHAAS）上でクロマトグラフィーにかけた。カラムは、水酸化ナトリウムでｐＨ７．０に調整した、５０ｍＭの一リン酸ナトリウム（sodium monophosphate）、１５０ｍＭの塩化ナトリウムで展開した。流速は５ｍ１／分で、流出物は２２０ｎｍで監視し、画分はクロマトグラム上に示される通りに回収した（図４）。各々〜１０ｍｌの画分に、１．０ｍｌの０．５Ｍのホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．０）を添加して、毒素の安定性を改良した。最初のピークの物質は〜８０ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥから）のタンパク質を含有する。このタンパク質自体は活性を示さないが、その活性はこの工程以後はより不安定になるため（４℃での貯蔵と、その後のクロマトグラフィー工程との両方に対して）、Bracon 毒素を安定化しているようである。２４から２９分の間に溶出する画分は、明白な活性を示し、活性のピークはピークの後半であった（２６〜２９分）。陰イオン交換クロマトグラフィーによる濃縮のための準備として、活性画分を合わせて（２７ｍｌ）、５０ｍＭのホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．０）で１００ｍｌに希釈した。サイズ除去クロマトグラフィーからの希釈したプールを、流速１．０ｍｌ／分でFractogel EMD TMAE-650 カラム（０．５×５ｃｍ、２５〜４０μｍ粒径）上に載せ、カラムを１０ｍｌの５０ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．０）でリンスした。次いで、カラムを、さらに別の２．５ｍｌの出発緩衝液、次いで５０ｍＭのホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．０）中０〜１ＭのＮａＣｌの３７．５分の直線勾配でリンスした。流速は０．５ｍｌ／分で、流出物は２８０ｎｍで監視した。画分を回収し（図５に示す通り）、麻痺活性について分析した。活性画分を合わせて、逆相クロマトグラフィーに付した。この活性プールは、「Bracon 毒素活性物」と同定される。上記からの活性プール（２ｍｌ）を、ＴＦＡ中０．１％に調整してｐＨを低下させ、水中および一定０．１％ＴＦＡ中の５％アセトニトリルで平衡化した、Vy dac C4カラム（３００Å、４．６×５０ｍｍ；The Separations Group）上に載せた。ローディングの後、カラムを、水中、一定０．１％ＴＦＡ中の２０％アセトニトリルに付し、次いで、水中、一定０．１％ＴＦＡ中の２０〜８０％のアセトニトリルの１５分の直線勾配で展開した。流速は１ｍｌ／分で、流出物は２２０ｎｍで監視し、画分はクロマトグラム上に示される通り回収した。画分４は、配列番号１（１６ｋＤａ毒素）を含むことが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％アクリルアミド）およびＮ−末端配列分析により決定された。画分４の質量スペクトル分析は１６，３７１±０．８５の分子量を示した。約１６μｇの配列番号１が１２．８８ｇの全スズメバチから回収された。実施例３配列番号２（３０ｋＤａ毒素）の精製配列番号２は、実施例２で記載した配列番号１を精製するために使用したのと同一の操作により単離したが、但し配列番号２は最終クロマトグラフィー工程の画分９に溶出した。配列番号２は３０ｋＤａの分子量を有することが、ＳＤＳ− ＰＡＧＥ（１２．５％アクリルアミド）により決定された。約５４μｇの配列番号２が１２．８８ｇの全スズメバチから回収された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはまた、約２０ｋＤａのタンパク質が３０ｋＤａのタンパク質と同時に溶出することを示した。一つのみの配列が、画分９のＮ−末端配列分析により判明し、その配列は３０ｋＤａタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ精製試料を分析することによって得られた配列と一致した。しかしながら、画分９について判明した質量（質量スペクトル分析により測定した場合で、４４，６２６．１３±２．９５）は予測されるものより高く、ゲル上に見られた〜２０ｋＤａと〜３０ｋＤａのバンドはより大きなタンパク質のサブユニットであるかもしれないことを示唆した。この理論は、試料を還元および非還元の両方の条件下で（即ち、ゲル試料緩衝液中にβ−メルカプトエタノールを含む場合と含まない場合で）泳動することによって確認された。還元条件下で泳動した画分９の試料は、〜２０および〜３０ｋＤａにおけるバンドを有する通常のパターンを示した。還元剤なしで泳動した試料は〜４０ｋＤａの単一のバンドを示した。この結果を質量スペクトルデータと組み合わせると、画分９中のタンパク質は、１：１の比率で存在する、２個のサブユニット、「２０ｋＤａ」および「３０ｋＤａ」のタンパク質から構成されていることが示唆される。クローニングされた３０ｋＤａのタンパク質は計算分子量２８，２０３を有し、全体タンパク質は４４，６２６の分子量を有する。従って、「２０ｋＤａ」タンパク質は約１６，４２３の分子量を有するはずである。画分９と相同の試料を、４−ビニルピリジンで還元しアルキル化し（Methods in Enzymology，182，p.599）、得られた２個のアルキル化タンパク質を、一定０．１％ＴＦＡ中の０〜８０％アセトニトリル／水の直線勾配（４％／分）で溶出する、Vydac Ｃ４カラム（４．６×５０ｍｍ）上での逆相クロマトグラフィーによって分離した。還元かつアルキル化されたタンパク質は、２７分（３０ｋＤａタンパク質）および３０分（２０ｋＤａタンパク質）で溶出した。還元かつアルキル化された２０ｋＤａタンパク質の部分アミノ酸配列を得る試みは不成功であった。ＰＶＤＦ（イムモビロン−Ｐ）トランスファー膜への電気トランスファーの後にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからのこのタンパク質の配列を決定する試みもまた不成功であった。配列決定の失敗は、このタンパク質はＮ−末端でブロックされていることを示唆している。実施例４１８−１毒素の精製１８−１毒素は、実施例２に記載した配列番号１（１６ｋＤａ毒素）を精製するために使用したものと同一の方法により単離したが、但し、１８−１毒素は最終クロマトグラフィー工程の画分６に溶出した。１８−１毒素は１８ｋＤａの分子量を有することが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％アクリルアミド）により決定された。画分６の質量スペクトル分析は、１８，６８７．６３±１．６１の分子量を示した。約２８μｇの毒素が１２．８８ｇの全スズメバチから回収された。実施例５１８−２毒素の精製１８−２毒素は、実施例２に記載した配列番号１（１６ｋＤａ毒素）を精製するために使用したものと同一の方法により単離したが、但し、１８−２毒素は最終クロマトグラフィー工程の画分７に溶出した。この毒素は１８ｋＤａの分子量を有することが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％アクリルアミド）により決定された。画分７の質量スペクトル分析は、１８，８４５．６８±０．５０の分子量を示した。約１８μｇの１８−２毒素が１２．８８ｇの全スズメバチから回収された。実施例６配列番号１（１６ｋＤａ毒素）のＮ−末端アミノ酸配列決定配列番号１（１６ｋＤａ毒素）のＮ−末端アミノ酸配列分析は、Ｕｔａｈ州立大学のバイオテクノロジーセンターで行った。Ｎ−末端配列（配列番号５）を以下に示す：式中、Ｘａａは化学的配列決定によって決定されなかった残基を意味する。実施例７配列番号２（３０ｋＤａ毒素）のＮ−末端アミノ酸配列決定配列番号２（３０ｋＤａ毒素）のＮ−末端アミノ酸配列分析は、Ｕｔａｈ州立大学のバイオテクノロジーセンターで行った。Ｎ−末端配列（配列番号６）を以下に示す：実施例８１８−１毒素のＮ−末端アミノ酸配列決定還元かつ誘導体化された１８−１毒素のＮ−末端アミノ酸配列分析は、Ｕｔａｈ州立大学のバイオテクノロジーセンターで行った。Ｎ−末端配列（配列番号７）を以下に示す：各括弧中の２番目のアミノ酸は、配列決定操作中で少量成分として観察された。これはこのタンパク質試料中に若干の異成分が存在することを示しているかもしれない。実施例９１８−２毒素のＮ−末端アミノ酸配列決定１８−２毒素ペプチドのＮ−末端アミノ酸配列分析は、Ｕｔａｈ州立大学のバイオテクノロジーセンターで行った。配列（配列番号８）を以下に示す：式中、Ｘａａは化学的配列決定によって決定されなかった残基を意味する。実施例１０配列番号５（１６ｋＤａ毒素ＮＴ）に相補的な縮重オリゴヌクレオチド遺伝コードおよび入手可能なコドン利用データに基づいて、配列番号５（１６ｋＤａ毒素ＮＴ）をコードする核酸配列に相補的な縮重オリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチド配列（配列番号９）を以下に示す。式中、Ａ＝アデニン、Ｔ＝チミジン、Ｃ＝シトシン、Ｇ＝グアニン、Ｙ＝Ｃ又はＴ、Ｒ＝Ｇ又はＡ、Ｍ＝Ａ又はＣ、そしてＮ＝Ａ又はＧ又はＴ又はＣ実施例１１配列番号６（３０ｋＤａ毒素ＮＴ）を目的とした縮重オリゴヌクレオチド遺伝コードおよび入手可能なコドン利用データに基づいて、配列番号６（３０ｋＤａ毒素ＮＴ）をコードする核酸配列に相補的な２個の縮重オリゴヌクレオチドを合成した。第１の縮重オリゴヌクレオチド配列（配列番号１０）は残基１〜７に相補的になるようにし、第２の縮重オリゴヌクレオチド（配列番号１１）は残基７〜１６に相補的になるようにした。式中、Ａ＝アデニン、Ｔ＝チミジン、Ｃ＝シトシン、Ｇ＝グアニン、Ｉ＝イノシン、Ｙ＝Ｃ又はＴ、Ｍ＝Ａ又はＣ、そしてＮ＝Ａ又はＧ又はＴ又はＣ実施例１２配列番号３（１６ｋＤａ毒素ｃＤＮＡ）の単離全ＲＮＡを、Chomczynski及びSacchi，Analytical Biochemistry 162，156(19 87)の方法によって単離した。簡単に言うと、毒管および付随する組織をグアニジンチオシアネート中でホモジナイズした。ホモジナイズした組織を次いで水平衡化フェノールおよびクロロホルムで、水相と有機相の界面がきれいになるまで抽出した。水相をエタノールで沈殿させ、全ＲＮＡを遠心により回収した。ポリアデニル化ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、Pharmacia から購入したオリゴｄ（Ｔ）セルロースクロマトグラフィーキットを使用して単離した。その後、５０ナノグラムのｍＲＮＡをｃＤＮＡの合成のための鋳型として使用した。１５個のチミジン残基の列を含有し、さらにＮｏｔＩエンドヌクレアーゼ認識シグナルを含有するオリゴヌクレオチド（以下、ｄ（Ｔ）₁₅）をｍＲＮＡとハイブリダイズさせた。ｃＤＮＡを、製造業者Bethesda Research Laboratories （ＢＲＬ）により規定された条件下でモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素によって合成した。配列番号３（１６ｋＤａ毒素ｃＤＮＡ）の選択的増幅は、オリゴヌクレオチドｄ（Ｔ）₁₅および実施例１０に記載した配列番号９を使用して、Frohmanにより記載されたＰＣＲ−ＰＡＣＥ技術によって行った。Frohman，M.A.，PCR protoco ls ，ed．Innis et al.，Academic Press，San Diego，CA，(1990); ＰＣＲ−ＲＡＣＥは、先の工程で得られたｃＤＮＡの１／４；最終２μＭの配列番号５およびｄ（Ｔ）₁₅；最終１００μＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸；および４ユニットのPerkin Elmerから購入したAmpliTaq ＤＮＡポリメラーゼを使用して行った。最初に、２サイクルのポリメラーゼ連鎖反応を実施したが、各サイクルは９４℃で２分間の変性工程と、その後の４０℃で２分間のプライマーアニーリング工程と、７２℃で１分間のプライマー伸長工程とを含む。この後に、９５℃で１分間の変性工程と、その後の５６℃で１分間のプライマーアニーリング工程と、７２℃で１分間のプライマー伸長工程によるサイクルを２８回実施した。固定したＰＣＲ産物を１％NuSieve／０．５％Seakem 複合アガロースゲル（FM C、Rockland、ME）上で視覚化した。得られた増幅されたｃＤＮＡをゲルから切り出し、Geneclean（登録商標）キット（Bio101、Vista，Ca）中に供給されるガラスミルク樹脂を使用して精製した。インサートを制限酵素ＮｏｔＩで切断し、ｐＳＫベクター（Stratagene，La Jolla，Ca）をＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＶで切断した。次いで、ｃＤＮＡをｐＳＫベクター中に連結し、細菌株ＤＨ５αＦ’（ Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD）に形質転換した。確認されたｃＤＮＡサブクローンを使用して、当技術分野で周知の方法を使用してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。完全なｃＤＮＡ配列は配列番号３（１６ｋＤａ毒素ｃＤＮＡ）である。実施例１３配列番号：４（３０ｋＤａ毒素ｃＤＮＡ）の単離：配列番号：４（３０ｋＤａ毒素ｃＤＮＡ）を、実施例１２に配列番号：３（１６ｋＤａ毒素ｃＤＮＡ）につき記載したものと同じプロトコールで単離した。ただしＰＣＲ−ＲＡＣＥに用いた縮重オリゴヌクレオチドは実施例１０に記載したオリゴヌクレオチドではなく、実施例１１に記載した配列番号：１０と配列番号：１１であった。実施例１４配列番号：３（１６ｋＤａ毒素ｃＤＮＡ）を含む組換えバキュロウイルス：配列番号：３（１６ｋＤａ毒素ｃＤＮＡ）またはその修飾配列を含むプラスミドを、このプラスミドからそのｃＤＮＡを放出させるエンドヌクレアーゼで消化する。次いで当技術分野で周知のいくつかの方法のいずれかを用いて、ｃＤＮＡをアガロースゲルに走行させ、それから単離できる。たとえばＡａＩＴトキシンの発現に用いたバキュロウイルス発現ベクターを用いる場合、上記で用いたエンドヌクレアーゼにより残されるオーバーハングに応じて、ｃＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼＩの大型フラグメントまたはＴ４ＤＮＡポリメラーゼで粘着末端にする。次いでＢａｍＨＩリンカーをｃＤＮＡの両端に連結反応させる。次いで発現ベクターｐＡｃＵＷ２（Ｂ）をＢｇｌＩＩエンドヌクレアーゼで消化し、ウシ腸アルカリホスファターゼまたは他のホスファターゼで脱リン酸化する。ＭｃＣｕｔｃｈｅｎ,Ｂ.Ｆ.ら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９,８４８−８５２（１９９１）。次いで精製したこのＢａｍＨＩ結合した配列番号：３（１６ｋＤａ毒素ｃＤＮＡ）とｐＡｃＵＷ２（Ｂ）を連結反応させて、完成した配列番号：３（１６ｋＤａ毒素ｃＤＮＡ）発現ベクターを形成する。上記で用いた方法すべての詳細な説明は、Ｍａｎｉａｔｉｓら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，コールド・スプリング・ハーバー．ラボラトリー，コールド・スプリング・ハーバー（１９８２）、または同様な説明書にみられる。次いでＳｆ−９細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１７１１）をカルシウム沈殿法により、配列番号：３（１６ｋＤａ毒素ｃＤＮＡ）発現ベクターとポリヘドリン陰性のオートグラファ・カリフォルニカ(Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ) 核多面化（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ）ウイルス（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡ、たとえばＲＰ８伝達ベクターとで、同時トランスフェクションする。Ｍａｔｓｕｕｒａら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ６８：１２３３−１２５０（１９８７）。トランスフェクションの５日後に上清を分離し、プラーク精製する。相同組換えされた組換えバキュロウイルスがポリヘドリン陰性プラークを形成する。これをＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈの方法に従って単離し、精製する。Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ.Ｄ.およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．，ＴｅｘａｓＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＳｔａｔｉｏｎＢｕｌｌｅｔｉｎ，１５５５，１ −５６（１９８７）。精製した組換え体プラークを、次いで生物学的活性につき調べる。増殖中のＳｆ−９細胞に組換えバキュロウイルスを、実験により決定した１：１〜１：１００の感染多重度で感染させる。感染後７日目に上清を採集する。ペレット化した細胞を１％ＳＤＳに再懸濁し、５分間、渦撹拌して、多面体を分離する。３回洗浄したのち、ウイルス力価を測定する。約１×１０⁶プラーク形成単位の組換え体を幼虫に注射し、配列番号：３（１６ｋＤａ毒素ｃＤＮＡ）をコードするウイルスの毒性を、同様に処理した野生型バキュロウイルスと対比して測定する。経口感染は、同様な量の組換えおよび野生型バキュロウイルスを幼虫の餌に接種してそれらの相対的作用を観察することによりアッセイする。実施例１５配列番号：４（３０ｋＤａ毒素ｃＤＮＡ）を含む組換えバキュロウイルス：配列番号：４（３０ｋＤａ毒素ｃＤＮＡ）またはその修飾配列を含む組換えバキュロウイルスを、配列番号：３（１６ｋＤａ毒素ｃＤＮＡ）に用いた実施例１４に記載した方法で構築する。実施例１６複数のコマユバチ属（Ｂｒａｃｏｎ）毒成分を含む組換えバキュロウイルス：配列番号：３（１６ｋＤａ毒素ｃＤＮＡ）および配列番号：４（３０ｋＤａ毒素ｃＤＮＡ）を含む組換えバキュロウイルスを、実施例１４に記載した方法で構築する。ただし、インビトローゲンから入手した市販のベクターｐ２Ｂａｃを用いる。実施例１７セリンプロテアーゼ阻害薬で処理することによるコマユバチ毒液画分の麻痺活性の阻害：ペファブロック（Ｐｅｆａｂｌｏｃ（登録商標）ＳＣ）（フッ化ｐ −アミノエチルベンゼンスルホニル）は、トリプシン様およびキモトリプシン様の酵素を選択的に阻害する水溶性の不可逆的セリンプロテアーゼ阻害薬である。３０ｋＤａタンパク質の一次配列（配列番号：２）のいくつかの領域が既知のセリンプロテアーゼの一次配列に類似していたので、プロテアーゼ活性がこの毒素の麻痺作用にとって重要であるか否かを判定するための阻害実験を行った。 “コマユバチ毒素活性物質”（表１）の試料を緩衝液（５０ｍＭホウ酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ９．０）または同一緩衝液中のペファブロックＳＣ２ｍｇ／ｍｌと共に、０℃で４時間インキュベートした。次いでこれらの溶液をヘリオディス・バイレッセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）に注射し（５μｌ）、４８時間後に結果を記録した。対照“コマユバチ毒素活性物質”を注射した幼虫６匹中５匹は麻痺したが、ペファブロックＳＣで処理した“コマユバチ毒素活性物質”を注射した幼虫は影響を受けなかった(８匹中８匹)。緩衝液中のペファブロックＳＣ（試料中に“コマユバチ毒素活性物質”が含まれない）を注射した幼虫も影響を受けなかった（６匹中６匹）。これは、３０ｋＤａ毒素の酵素活性がコマユバチ毒の麻痺作用にとって重要であることを強く示唆する。実施例１８哺乳動物系に対するコマユバチ毒液画分の毒性：７０℃で冷凍することにより殺した雌のコマユバチ属のハチ（ブラコン・ヘベター、Ｂｒａｃｏｎｈｅｂｅｔｏｒ）から毒腺／溜めおよび付随する構造体を切除した。この切除組織試料２４ｍｇをリン酸緩衝−生理的食塩水、ｐＨ６．５（ＰＢＳ）５００μｌに懸濁し、音波処理により破壊した。得られたホモジェネートをミクロ遠心機により１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を０．２μの精密濾過により滅菌した。クロマトグラフィー開始前の組織ホモジナイゼーション、遠心分離および濾過の各工程は、氷上で、または４℃の恒温で実施された。幼虫１匹当たり５μｌの投与量で、この抽出物はタバコバッドワーム（ｔｏｂａｃｃｏｂｕｄｗｏｒｍ，ＴＢＷ、芽を食害する鱗翅目昆虫の幼虫）およびビートアワヨトウガの幼虫を注射後３０分以内に不可逆的に麻痺させた（ｎ＝３；被験幼虫はすべて麻痺したが、５μｌのＰＢＳを注射した対照幼虫は影響を受けなかった）。次いで抽出物を１：５０に希釈し、ラット海馬切片において電気生理学的アッセイ法により試験した。この方法は哺乳動物ニューロンに対する多様な作用の検出が可能である。抽出物希釈液１００μｌはこのアッセイ法では影響を示さない。活性を確認するために、残りの抽出物希釈液をＴＢＷにおいて試験した。幼虫に１５μｌまたは３μｌの抽出物を注射し、対照には１５μｌのＰＢＳを注射した。１５μｌの投与量は２４時間以内に４匹中２匹の幼虫を麻痺させ、一方、３μｌの投与量は２４時間以内に４匹中２匹の幼虫に摂餌阻害を起こした。対照は影響を受けなかった。したがって、約１２匹のＴＢＷ幼虫を麻痺させるのに十分な量の物質がラット海馬脳切片アッセイ法において作用を示さなかった。第２の実験では、切除した毒腺／溜めおよび付随する組織の試料１３０ｍｇを１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ６．５）に懸濁し、前記にしたがって処理した。この抽出物の１：１０希釈液を幼虫１匹当たり１０μｌの投与量で注射したところ、２４時間以内に４匹中２匹のＴＢＷ幼虫を不可逆的に麻痺させた。雄スイス−ウェブスターマウス２匹（それぞれ約２５ｇ）に、希釈していない抽出物をマウス１匹当たり５μｌの量で脳室内注射により投与した。マウスは注射後約１５分間はわずかに不活発に見えたが、聴覚刺激に対して正常に反応した。注射後１時間以内に、マウスは正常な活動水準に戻り、それ以上の影響は認められなかった。したがって、１０匹以上のＴＢＷ幼虫を麻痺させるのに十分な量でコマユバチ毒腺抽出物を脳室内投与しても、マウスには有意の影響がなかった。哺乳動物毒性に関する他の一連の試験で、コマユバチ属のハチ（ブラコン・メリター、Ｂｒａｃｏｎｍｅｌｌｉｔｏｒ）からの高度に精製した毒液画分をＴＢＷで試験し、次いで哺乳動物毒性の可能性につき試験した。これらの画分を以下の順序で調製した。摘出した雌腹部の抽出物を、本明細書の他の箇所にブラコン・ヘベター抽出物の分画につき記載したものと同様な方法で、固定化金属（銅）アフィニティクロマトグラフィーにより分画した。この分離で得た画分４（Ｃ４）（大部分の生物学的活性を含む）を、本明細書の他の箇所にブラコン・ヘベター抽出物の分画につき記載したものと同様な方法で、アニオン交換クロマトグラフィーによりさらに分画した。アニオン交換分離で得た画分４（Ａ４）（大部分の生物学的活性を含む）を、下記に従って疎水性相互作用クロマトグラフィーによりさらに分離した。試料を、１ＭＮａＣｌを含有する５０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム（ｐＨ８．１）中でベーカーＨＩプロピルカラム（４．６×２５０ｍｍ）に装填した。溶離緩衝液“Ａ”はＮａＣｌを追加しない装填緩衝液であり、溶離緩衝液“Ｂ”は２ＭＮａＣｌを含有する緩衝液“Ａ”であった。したがって装填緩衝液は“Ａ”と“Ｂ”の１：１混合物であった。上記の画分を装填したのち、溶離緩衝液中の“Ａ”の割合を５０％から１００％まで２０分かけて高めた。２８０ｎｍでの吸収に基づいて画分を採集した。この分離で得た画分１と３（それぞれＣ４／Ａ４／Ｈ１とＣ４／Ａ４／Ｈ３）は、ＰＢＳ中に１：４希釈したのち幼虫１匹当たり５μｌの投与量で注射した場合、ＴＢＷ幼虫において麻痺性であった。注射後２４時間目にＣ４／Ａ４／Ｈ１は５匹中４匹の幼虫を麻痺させ、一方、Ｃ４／Ａ４／Ｈ３は５匹中３匹の幼虫を麻痺させ、対照は影響を受けなかった。この殺虫活性を確認したのち、これらの画分を哺乳動物毒性につき試験した。各画分の試料（全濃度、１：４希釈液ではない）１００μｌをラット海馬切片において電気生理学的アッセイ法により試験した。影響は認められなかった。ＴＢＷにおける１：４希釈アッセイの結果から判断して、１００μｌの原液は５０〜６０匹の幼虫を麻痺させるのに十分なはずである。これは、ブラコン・メリター画分の有効成分が昆虫に高度の選択性をもつことを示唆する。Ｃ４／Ａ４／Ｈ１については、全細胞電圧固定−心筋細胞においても試験した。未希釈原液（海馬アッセイ法で試験したもの）５０μｌを筋細胞アッセイ（全容量５ｍｌ）に用いた。この量は約３０匹のＴＢＷ幼虫を麻痺させるのに十分なものであったが、筋細胞に影響がなかった。同様にこれはコマユバチ属の殺虫毒素が昆虫に高度の選択性をもつことを示唆する。実施例１９コマユバチ毒液成分をコードするｃＤＮＡ配列を含む組換えバキュロウイルスの構築：実施例１７に、ブラコン・ヘベターから得た高度に精製した毒素画分の麻痺活性が、この画分をセリンプロテアーゼの選択的阻害薬に暴露することにより阻害されることを述べた。この結果は、既知のセリンプロテアーゼと一定の類似性をもつ３０ｋＤａタンパク質がこの画分の麻痺活性に必要であることを示唆する。しかしその麻痺活性を保存した状態で単一成分を精製することはできなかったので、麻痺活性には複数の成分が要求されるという可能性を調べる必要があった。したがってオートグラファ・カリフォルニカ核多面化ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）を用いて２種類の組換えバキュロウイルス構築体を製造した。以下において“ｖＡｃ３０ｋ”と呼ぶ第１のものは、３０ｋＤａｃＤＮＡ（配列番号：４）のみをポリヘドリンプロモーターの制御下に含んでいた。以下において“ｖＡｃ３０ｋ／１６ｋ”と呼ぶ第２のものは、３０ｋＤａｃＤＮＡを同様にポリヘドリンプロモーターの制御下に含み、かつ１６ｋＤａｃＤＮＡ（配列番号：３）をｐ１０プロモーターの制御下に含んでいた。ｐ１０プロモーターはポリヘドリンプロモーターと同様にきわめて遅い、きわめて強力なプロモーターであり、殺虫毒素および他の外因性タンパク質を発現するために用いられている。毒素ｃＤＮＡを二重プロモーターベクターｐ２Ｂａｃ（インビトローゲン）内へクローン化した。３０ｋＤａｃＤＮＡはポリヘドリンプロモーターの後にＥｃｏＲＩ（ＭＢＲ）制限部位を用いてクローン化され、１６ｋＤａｃＤＮＡはｐ１０プロモーターの後にＳｒｆＩ（ストラタジーン）およびＸｂａＩ（ＭＢＲ）制限部位を用いてクローン化された。目的とするこれらの挿入配列の存在および適切な配置を、制限酵素による消化および得られた二本鎖ＤＮＡフラグメントの配列決定により確認した。伝達ベクタープラスミドをＳＦ９細胞内へ、１μｇのＡｃＭＮＰＶウイルス性ＤＮＡおよび２μｇのプラスミドＤＮＡの混合物と共に、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，“バキュロウイルスベクターに用いる方法および昆虫細胞培養法の手引き”，ＴｅｘａｓＡｇ．Ｅｘｐ．Ｂｕｌｌ．，１５５５：１（１９８８）のプロトコールを用いて同時トランスフェクションした。トランスフェクションの４日後に細胞上清の希釈液を、５×１０⁶個の細胞を接種して指示薬としてのブルオガル（Ｂｌｕｏ−ｇａｌ、ＢＲＬ）（β−ガラクトシダーゼ基質）を含有するアガロースで覆った１００ｍｍの平板上にプラーク形成させた。５〜６日以内に組換え体はそれらの淡青色によって検出可能となった。プラークをパスツールピペットで採取し、１ｍｌの培地中へ溶離させた。これらの溶離物を、Ｔ−２５フラスコ中へ接種したＳｆ９細胞の感染に用いた。感染後３日目に１６種類の異なる培養物（ｖＡｃ３０ｋを感染させたもの８種類、およびＡｃ３０ｋ／１６ｋを感染させたもの８種類）から少量の上清を採取して、ウイルスＤＮＡの調製に用いた。ポリヘドリン遺伝子およびｐ１０遺伝子の両方を囲む領域に由来するウイルス特異的プライマーを用いるＰＣＲ増幅により、すべての単離体が適切な大きさの挿入配列を含み、野生型の混入はないことが確認された。挿入したｃＤＮＡ配列に特異的な内部オリゴヌクレオチドとのサザーンハイブリダイゼーションにより、適切な毒素遺伝子の存在が確認された。実施例２０コマユバチ毒液成分をコードするｃＤＮＡ配列を含む組換えウイルスの生物学的活性：最良の組換えウイルスを確実に選択するために、生物学的アッセイ法を用いた。それぞれの組換え試料から得た力価未定のウイルス上清２０μｌを第５齢ＴＢＷ（ｎ＝４）に注射した。対照には等容量の組織培養培地を注射した。個々のペトリ皿に餌（飼育に用いた実験用飼料）と共に幼虫を入れ、定期的に調べた。注射後９６時間目までに、ｖＡｃ３０ｋ／１６ｋで処理した幼虫の９７％およびｖＡｃ３０ｋで処理した幼虫の１９％が麻痺した。これらの幼虫が示す麻痺の徴候はコマユバチ毒液中毒に伴うものときわめて似ていた。麻痺は弛緩型のものであって、随意運動機能（たとえば立ち直り／回避反応）が阻害されたのに対し、不随意機能、たとえば呼吸器収縮および背管（心臓）収縮は影響を受けないように思われた。この時点で進行性ウイルス感染、たとえば全体的変色、吐き戻し、体壁統合性喪失などの有意の徴候はなかった。注射後１２０時間目までには、ｖＡｃ３０ｋ／１６ｋで処理した幼虫のすべて、およびｖＡｃ３０ｋで処理した幼虫の１試料群以外のすべてが麻痺した。ｖＡｃ３０ｋ／１６ｋで処理した幼虫の多くがもはや生命の可視徴候を示さなかったが、進行性ウイルス感染の有意の徴候は依然として示さなかった。対照幼虫は影響を受けなかった。このアッセイおよび同様なアッセイの結果に基づいて、高力価原液の調製用としてそれぞれの構築体の１クローンを選択した。まずｖＡｃ３０ｋ／１６ｋのみが高力価原液として得られた。これをｗｔ−ＡｃＭＮＰＶおよび等容量の組織培養培地と比較して試験した。第５齢ＴＢＷ幼虫（ｎ＝１０）に、ｖＡｃ３０ｋ／１６ｋまたはｗｔ−ＡｃＭＮＰＶを幼虫１匹当たり１０⁵ＰＦＵの投与量で注射した。対照幼虫には等容量の組織培養培地を注射した。注射後９６時間目までに、ｖＡｃ３０ｋ／１６ｋで処理した幼虫の半数が麻痺した。１２０時間目までに、ｖＡｃ３０ｋ／１６ｋで処理した幼虫のすべてが麻痺したのに対し、ｗｔ−ＡｃＭＮＰＶで処理した幼虫のうち１匹が死んだにすぎない。組織培養培地で処理した幼虫は影響を受けなかった。上記のように、ｖＡｃ３０ｋ／１６ｋで処理した幼虫に見られた麻痺はコマユバチ毒液および毒液画分により起こるものときわめて似ており、進行性ウイルス感染の有意の徴候が認められる前に見られた。ｗｔ−ＡｃＭＮＰＶによる死亡率は、注射後１６８時間目まで１００％に達せず、一方、組織培養培地で処理した幼虫はいかなる時点でも影響を受けなかった。これは、ｖＡｃ３０ｋ／１６ｋが匹敵する野生型ウイルスより速やかにＴＢＷ幼虫を不能にすることを明瞭に示す。他のアッセイでは、ｖＡｃ３０ｋおよびｖＡｃ３０ｋ／１６ｋを第５齢ＴＢＷ幼虫において、ｗｔ−ＡｃＭＮＰＶおよびポリヘドリン陰性組換え体（ｐｏｌ− ＡｃＭＮＰＶ）と、幼虫１匹当たり１０⁵ＰＦＵの投与量で比較した。対照には等容量の組織培養培地を注射した。注射後１２０時間目までに、ｖＡｃ３０ｋおよびｖＡｃ３０ｋ／１６ｋはそれぞれ９１．７％および７５％を麻痺させた。これに対し、ｗｔ−ＡｃＭＮＰＶは２５％の死亡率を生じたにすぎず、ｐｏｌ−ＡｃＭＮＰＶはまだ可視作用を生じなかった。注射後１４４時間目までに、ｖＡｃ３０ｋおよびｖＡｃ３０ｋ／１６ｋで処理した幼虫のすべてが麻痺し、一方、ｗｔ−ＡｃＭＮＰＶおよびｐｏｌ−ＡｃＭＮＰＶはそれぞれ９１．７％および１６．７％の死亡率を生じた。注射後１６８時間目までに、ｗｔ−ＡｃＭＮＰＶおよびｐｏｌ−ＡｃＭＮＰＶで処理した幼虫のすべてが死亡または麻痺した。対照昆虫はいかなる時点でも可視的影響を受けず、すべてが注射後１４４時間目まで正常に蛹化した。前記のように、ｖＡｃ３０ｋおよびｖＡｃ３０ｋ／１６ｋで処理した幼虫は麻痺し、進行性ウイルス感染の影響（変色、体液滲出など）を示し始める２４〜４８時間前に典型的な一組の症状（弛緩麻痺など）を示した。これらの実験は、ヘリオディス・バイレッセンスではｖＡｃ３０ｋまたはｖＡｃ３０ｋ／１６ｋへの感染により、コマユバチ毒液または毒液画分の注射に伴う症状といちじるしく似た症状を生じることを明瞭に証明する。ｗｔ−ＡｃＭＮＰＶまたはｐｏｌ−ＡｃＭＮＰＶはいずれもこのような症状を生じることなく、またこれらのウイルスは感染昆虫を上記の組換え体のように速やかに不能にすることはなかった。したがって組換え体で処理した幼虫のこれらの麻痺症状およびより速やかな不能作用の発現は、組換え体において外因性遺伝子が発現したことに起因するにちがいない。これは、少なくとも３０ｋＤａのタンパク質がコマユバチ毒液および毒液画分の注射により起こる麻痺に直接に関係することを強く示す。発現効率、分泌効率、翻訳後プロセシングなどを改良すると組換え体の生物学的活性がさらに高まると期待できる。種々の毒液成分を組み合わせることによっても、改良された生物学的活性をもつ組換え体が得られるであろう。概要本発明は、コマユバチ属のブラコン・ヘベターその他の種のハチから単離した、有害昆虫に対する神経毒性を特色とする殺虫性毒素に関する。殺虫効力を示す少量の、これらの毒素を含有する毒液画分を特定の昆虫に投与すると、昆虫は麻痺するか、または死ぬ。前記のように本発明はまた、常用される組換えＤＮＡ技術を利用してこれらの毒素をクローニングすることに関する。これらの毒素のひとつのアミノ酸配列である配列番号：２（３０ｋＤａ毒素）は、既知のセリンプロテアーゼと相同性をもつ。また本発明は、前記毒素を殺虫剤として用いるために修飾または改良する方法を提供する。さらに本発明は、これらの毒素を有害昆虫駆除のための薬剤として使用する用途に関する。既知の組換え技術による方法を利用して、これらの毒素を大量に得ることができる。これらの毒素を工学的に発現ベクターに挿入し、次いでこれを原核宿主、たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、または真核宿主、たとえば昆虫細胞に挿入することができる。次いで単離したタンパク質を、有害昆虫から保護したい植物や動物に直接に適用できる。別法として前記のように毒素を昆虫の天然病原体、たとえばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌またはバキュロウイルスに工学的に挿入してもよい。この組換え病原体を利用して上記ペプチドを直接に有害昆虫に伝達できる。これらの工学的に処理した病原体はいちじるしく増大した毒性を示す。本発明はその本質的な特徴から逸脱することなく他の具体的態様で実施できる。前記の態様はすべての点で例示であり、限定ではないとみなすべきである。したがって本発明の範囲は以上の記載ではなく請求の範囲の記載により示される。請求の範囲の記載が意味するものおよび範囲に含まれる変更はすべて本発明の範囲に包含される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者クラル，ロバート・エムアメリカ合衆国ユタ州84111，ソルト・レイク・シティ，サウス・デンヴァー・ストリート 1001 (72)発明者クラプチョ，カレンアメリカ合衆国ユタ州84109，ソルト・レイク・シティ，サン・ラファエル・アベニュー 3840

Claims

【特許請求の範囲】１．ヘリオディス・バイレッセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）に対するその神経毒性を特徴とする画分を含む、コマユバチ属ハチの全毒液の画分。２．配列番号：１（１６ｋＤａ毒素）を含む、請求項１記載のハチ毒液画分。３．配列番号：２（３０ｋＤａ毒素）を含む、請求項１記載のハチ毒液画分。４．配列番号：７（１８−１毒素ＮＴ）を含む、請求項１記載のハチ毒液画分。５．配列番号：８（１８−２毒素ＮＴ）を含む、請求項１記載のハチ毒液画分。６．有害昆虫に対するその神経毒性を特徴とする、コマユバチ属ハチ毒液から単離した、実質的に精製された、殺虫効力を示すペプチド。７．配列番号：１を含む、請求項６記載のペプチド。８．配列番号：２を含む、請求項６記載のペプチド。９．配列番号：７を含む、請求項６記載のペプチド。１０．配列番号：８を含む、請求項６記載のペプチド。１１．配列番号：１（１６ｋＤａ毒素）のアミノ酸配列、または昆虫に対して毒性であるその機能性誘導体もしくはフラグメントを含む、昆虫毒素。１２．配列番号：１（１６ｋＤａ毒素）のアミノ酸配列またはその機能性誘導体もしくはフラグメントをコードするヌクレオチドを含む、核酸配列。１３．核酸配列がプラスミド内へサブクローニングされた、請求項１２記載の核酸配列。１４．核酸配列が原核性、真核性またはバキュロウイルス性の発現ベクター内へサブクローニングされた、請求項１２記載の核酸配列。１５．核酸配列が原核性または真核性の宿主内へ安定に、または一時的に取り込まれた、請求項１２記載の核酸配列。１６．核酸配列がバキュロウイルス性宿主内へ安定に、または一時的に取り込まれた、請求項１２記載の核酸配列。１７．配列番号：２（３０ｋＤａ毒素）のアミノ酸配列、または昆虫に対して毒性であるその機能性誘導体もしくはフラグメントを含む、昆虫毒素。１８．配列番号：２（３０ｋＤａ毒素）のアミノ酸配列またはその機能性誘導体もしくはフラグメントをコードするヌクレオチドを含む、核酸配列。１９．核酸配列がプラスミド内へサブクローニングされた、請求項１８記載の核酸配列。２０．核酸配列が原核性、真核性またはバキュロウイルス性の発現ベクター内へサブクローニングされた、請求項１８記載の核酸配列。２１．核酸配列が原核性または真核性の宿主内へ安定に、または一時的に取り込まれた、請求項１８記載の核酸配列。２２．核酸配列がバキュロウイルス性宿主内へ安定に、または一時的に取り込まれた、請求項１８記載の核酸配列。２３．有害昆虫に対するその神経毒性を特徴とし、かつ配列番号：７（１８− １毒素ＮＴ）のＮ末端アミノ酸配列を含む、ブラコン・ヘベター（Ｂｒａｃｏｎｈｅｂｅｔｏｒ）毒液から単離した、実質的に精製された、殺虫効力を示すペプチド。２４．有害昆虫に対するその神経毒性を特徴とし、かつ配列番号：８（１８− ２毒素ＮＴ）のＮ末端アミノ酸配列を含む、ブラコン・ヘベター毒液から単離した、実質的に精製された、殺虫効力を示すペプチド。２５．配列番号：１（１６ｋＤａ毒素）のアミノ酸配列または昆虫に対して毒性であるその機能性誘導体もしくはフラグメントを含む、殺虫効力を示す量のペプチドに、昆虫を暴露することを含む、昆虫の抑制方法。２６．配列番号：１（１６ｋＤａ毒素）のアミノ酸配列または昆虫に対して毒性であるその機能性誘導体もしくはフラグメントをコードする核酸配列を含む組換えバキュロウイルス性宿主に、昆虫を暴露することを含む、有害昆虫の抑制方法。２７．配列番号：２（３０ｋＤａ毒素）のアミノ酸配列または昆虫に対して毒性であるその機能性誘導体もしくはフラグメントを含む、殺虫効力を示す量のペプチドに、昆虫を暴露することを含む、昆虫の抑制方法。２８．配列番号：２（３０ｋＤａ毒素）のアミノ酸配列または昆虫に対して毒性であるその機能性誘導体もしくはフラグメントをコードする核酸配列を含む組換えバキュロウイルス性宿主に、昆虫を暴露することを含む、有害昆虫の抑制方法。２９．ヘリオディス・バイレッセンスに対するその神経毒性および配列番号：７（１８−１毒素ＮＴ）のＮ末端アミノ酸配列を特徴とする、ブラコン・ヘベター毒液から単離した、実質的に精製された、殺虫効力を示す量のペプチドに、昆虫を暴露することを含む、昆虫の抑制方法。３０．ヘリオディス・バイレッセンスに対するその神経毒性および配列番号：８（１８−２毒素ＮＴ）のＮ末端アミノ酸配列を特徴とする、ブラコン・ヘベター毒液から単離した、実質的に精製された、殺虫効力を示す量のペプチドに、昆虫を暴露することを含む、昆虫の抑制方法。