CN107987143B

CN107987143B - 二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT及其应用

Info

Publication number: CN107987143B
Application number: CN201711305075.0A
Authority: CN
Inventors: 叶恭银; 滕子文; 熊时姣; 方琦
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2017-12-11
Filing date: 2017-12-11
Publication date: 2020-04-17
Anticipated expiration: 2037-12-11
Also published as: CN107987143A

Abstract

本发明涉及分子生物学、基因工程以及蛋白工程领域。具体而言，本发明公开了一种二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。本发明还同时公开了编码上述二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所述；或者与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者其核苷酸序列能在40～55℃条件下与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列杂交。本发明的蛋白可以进入水稻重要害虫二化螟幼虫的重要免疫相关细胞——颗粒血细胞中。

Description

二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学、基因工程以及蛋白工程领域。特别是一种在二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT及其编码的核酸序列及应用。

背景技术

农业害虫是农业增产和农产品质量提高的重要制约因素，据统计，我国每年因病虫害损失的粮食近500亿斤，经济作物损失达350多亿斤。长久以来，化学农药的大量不合理使用导致农药残留、害虫抗性以及再猖獗等问题。自20世纪90年代中期以来，抗虫转基因作物培育与应用取得成功，害虫防治迎来新的契机。据统计，全球转基因种植面积由1996年的约170万公顷猛增到2014年的1.8亿公顷(其中抗虫的占43％)，产生了明显的经济与生态效应。然而，长期单一种植Bt基因抗虫作物，靶标害虫的抗性问题也日益浮现。

因此，科研工作者也致力于从微生物、植物和动物中挖掘新型杀虫蛋白/肽基因，通过多基因或融合基因等手段，培育新型抗虫转基因作物，以其解决上述农药和Bt作物带来的问题。寄生蜂是一类重要的天敌昆虫，有着重要的生防价值。寄生蜂携带多种寄生因子，包括毒液(venom)、卵巢分泌蛋白(ovarian fluids)、多分DNA病毒(polydnavirus)、类病毒颗粒(virus-like particle)、畸形细胞(teratocyte)等。这些寄生因子可以调节寄主免疫反应、生长发育等生理活动。对于寄生蜂寄生因子的研究可以服务生产，开辟害虫生物防治的新途径。例如藏红足侧沟茧蜂(Microplitis croceipes)畸形细胞的分泌蛋白基因转入烟草，可提高植株对烟草天蛾(Manduca sexta)的抗性等。

二化螟Chilo suppressalis，属鳞翅目草螟科(Lepidoptera:Crambidae)，是我国水稻上的重要钻蛀性害虫之一，可造成水稻枯心和白穗等。该虫分布广，适应性强。中国稻螟年发生面积1500万公顷以上，总经济损失约115亿元。二化螟盘绒茧蜂(Cotesiachilonis)属膜翅目茧蜂科(Hymenoptera:Braconidae)，主要分布于中国的贵州、江苏、浙江、江西、湖南、四川、福建、广东、广西、云南和台湾等地，也分布于印度尼西亚、日本和朝鲜等亚洲国家。该蜂是二化螟幼虫期优势多寄生性的内寄生蜂，例如在江苏越冬代寄生率可达90％，水稻生长期其寄生率为10％-30％，该寄生蜂的寄生因子包括毒液、卵巢分泌蛋白和畸形细胞，对其寄生因子具体组分的研究和挖掘具有重要的生产实践意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可以进入水稻重要害虫二化螟免疫相关细胞(颗粒血细胞)的二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白基因CcCRT及其编码的蛋白质和用途。

为解决技术问题，本发明提供了一种二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

备注说明：SEQ ID NO：2包含了信号肽，为：M R A L V A I L A I A V I A T V SA。

作为本发明的二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT的改进：该蛋白、其保守性变异蛋白、其活性片段或其活性衍生物。

本发明还同时提供了编码上述二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所述；或者与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者其核苷酸序列能在40～55℃条件下与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列杂交。

作为本发明的基因的改进：序列中包含SEQ ID NO.1中8～66个连续核苷酸。

本发明还同时提供了上述二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT的用途：该蛋白和GFP蛋白融合表达能进入寄主二化螟幼虫颗粒血细胞。

本发明所提供的二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT蛋白及编码它的核酸序列，使其能够应用其氨基酸序列、编码序列及其在开发成有应用价值的抗虫作物和生物农药并应用于农业害虫防治等多个领域。

本发明具体是通过以下技术方案实现的：本发明利用二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢转录组测序获得了钙网蛋白CcCRT基因全部序列，对提取的二化螟盘绒茧蜂毒腺的RNA进行反转录得到cDNA，进行分子克隆、真核表达和非变性条件下纯化，真核表达的EGFP-CcCRT(GFP和CcCRT融合表达)都能够进入农业害虫二化螟幼虫的颗粒血细胞的功能。

本发明所分离出的DNA分子包括：编码具有二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40～55℃条件下与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列杂交。较佳的，所述的序列编码具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO：1中的核苷酸序列。

本发明分离出的二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT包括：具有SEQID NO：2氨基酸序列的蛋白、或其保守性变异蛋白、或其活性片段，或者其活性衍生物。较佳地，该蛋白是具有SEQ ID NO：2序列的蛋白。

本发明DNA分子包含所述的DNA分子中8-66个连续核苷酸。

本发明DNA分子转化的宿主细胞是昆虫细胞。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA片段已经与天然状态下伴随核苷酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT编码的核酸序列指：编码具有二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT活性的蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO：1中的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，SEQ ID NO：1序列中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子取代后产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ IDNO：1所述的序列。

还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。还包括能编码具有天然的二化螟盘绒毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT相同功能的蛋白的SEQ ID NO.1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT蛋白指：具有二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT活性的SEQ ID NO：2序列的蛋白。该术语还包括具有与天然二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT相同功能的SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入/或取代，以及在C末端和/或N端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地以5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT的活性片段和活性衍生物。

在本发明中二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT保守性变异蛋白指：与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成蛋白。

本发明还包括二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT或蛋白的类似物。这些类似物与天然钙网蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可以通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L－氨基酸的残基(如D氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ－氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述列举的代表性的蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT蛋白时，可以将二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT表达载体。

如本发明所述的“可操作地连于”指这样一种情况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与蛋白的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于蛋白DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能够翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中宿主细胞为原核细胞及真核细胞。常用的原核宿主细胞指得是大肠杆菌细胞。常见的真核宿主细胞指的是昆虫细胞系。

还可用Northern印迹法技术或荧光定量PCR分析二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT基因产物的表达，即分析二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

此外，本发明中可用作探针的核酸分子，该分子通常具有二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT核苷酸编码序列的8-66个连续氨基酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT的核酸分子。

本发明涉及检测样品中是否存在二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。

此外，根据本发明的二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT同源基因或同源蛋白。

本发明的二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得到有关序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。利用本发明的二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT，通过各种常规筛选方法，可筛选出二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT发生相互作用的物质，或者受体等。

本发明能够进入水稻重要害虫二化螟幼虫的重要免疫相关细胞——颗粒血细胞中，具有作为载体携带相关作用因子进入寄主血细胞的应用潜能；可参与对二化螟免疫的调控。我国农业害虫危害非常严重，使用化学农药的负面影响很大，本发明的二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT正是针对农业害虫免疫相关的颗粒血细胞的新蛋白，因此，具有很大的应用价值。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为本发明的CcCRT与增强型绿色荧光蛋白在真核系统中融合表达的分离纯化图；

注：M为标准蛋白；

A图为12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，其中1道：Sf9细胞裂解液上清；2道：Sf9细胞裂解液沉淀；3道：含有重组的pBacHTeGFPT-CcCRT质粒的sf9细胞裂解液上清；4道：含有重组的pBacHTeGFPT-CcCRT质粒的sf9细胞裂解液沉淀；5道：含有重组的pBacHTeGFPT-CcCRT质粒的sf9细胞裂解液上清的纯化产物；6道：含有pBacHTeGFPT质粒的sf9细胞裂解液上清；7道：含有pBacHTeGFPT质粒的sf9细胞裂解液沉淀；8道：对含有pBacHTeGFPT质粒的sf9细胞裂解液上清的纯化产物；

B图为免疫印迹试验(Western Blot)，其中9道：纯化的eGFP-CcCRT；10道：纯化的eGFP。所用抗体为兔产抗CcCRT抗体。

图2为真核表达的融合的eGFP-CcCRT进入寄主二化螟幼虫颗粒血细胞的效果图；

注：A和C图表示4龄寄主幼虫的血细胞与eGFP孵育2小时，B和D图表示4龄寄主幼虫的血细胞与融合表达的eGFP-CcCRT孵育2小时。A和B图为荧光视野，C和D图为明场视野。细胞核被DAPI染色成为蓝色。GR：Granulocyte，颗粒血细胞；PL：Plasmatocyte，浆血细胞。

具体实施方式

下面结合实验室具体的试验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、重组的eGFP-CcCRT的表达和纯化

1.1RNA的提取

在Leica MZ 16A显微镜(Leica,Germany)下，将雌蜂用75％酒精消毒并擦拭干净，将其生殖道从腹部末端扯出，浸泡在载玻片上无菌的含1unit/μL RNA酶抑制剂(TOYOBO,Osaka,Japan)的磷酸盐缓冲液(PBS)液滴中，收集毒腺于TRIzol试剂中(Invitrogen,California,USA)，RNA提取方法如下：

1)收集的毒腺，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。

2)向离心管中加入0.2ml氯仿，振荡15s，混合液转入TIANGEN离心管中，静置2min。

3)4℃，12000g离心15min，取上清液，将其转入一新1.5ml的离心管中。

4)向离心管中加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。

5)4℃，12000g离心10min，弃掉上清液。

6)向离心管中加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃，7500g离心5min，弃掉上清液。(此时加入无水乙醇，可于-80℃超低温冰箱中长期保存)。

7)晾干离心管，加入适量的无RNA酶水溶解(65℃促溶)，分光光度计测量OD260/OD280的值，比值在1.8～2.0之间时，进行下一步实验。

1.2cDNA第一链合成

采用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(Transgen,Beijing,China)试剂盒将1μg RNA反转录成单链cDNA模板，体系如下：

总mRNA：1μg

寡聚胸腺嘧啶核苷引物(Oligo(dT)n)：0.5μl

随机引物：0.5μl

2×TS Reaction Mix：10μl

TransScript RT/RI Enzyme Mix:1μl

gDNA Remover:1μl

Rnase-free Water:to 20μl

配好体系之后，25℃孵育10分钟后，在42℃孵育1h，最后85℃加热5分钟。

所得的cDNA的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所述。

1.3重组蛋白的表达和纯化

真核表达通过杆状病毒系统进行，通过Premier primer 5设计真核表达引物(前引物5’-3’：GTTCCGCGTGGATCCGAAGTTTTCTTCGAAGAAAGATTTT；后引物5’-3’：ACCGCATGCCTCGAGTTACAATTCGTCGTGCTCC)。以上述合成的cDNA作为模板，PCR体系如下：

cDNA：1μl

Forward primer(10μM)：2μl

Reverse primer(10μM)：2μl

2×TransStar FastPfu PCR SuperMix：25μl

ddH₂O：20μl

Total volume：50μl

PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸10min。

配制1％琼脂糖凝胶，PCR产物经电泳验证片段大小后，用Axygen Gel ExtractionKit凝胶回收试剂盒进行切胶回收。

通过ClonExpress One Step Cloning Kit(Vazyme,China)将PCR扩增获得的目的片段分别与线性化(酶切位点：BamHI和XhoI)的pET-28a(+)载体(用于原核表达)和pBacHTeGFPT载体(pFastBacTMHTB质粒His标签后接eGFP序列，浙大张传溪教授惠赠，用于真核表达)同源重组。

备注说明：该pBacHTeGFPT载体在《亚非马蜂溶血肽基因与增强型绿色荧光蛋白基因融合在昆虫细胞中的表达》一文中有明确告知，通过该载体表达的重组蛋白即是目的蛋白(CcCRT)与eGFP相融合的蛋白。

同源重组体系为：

5×CE II Buffer：4μl

线性化克隆载体(pET-28a(+)载体或者pBacHTeGFPT载体)：1μl

插入片段扩增产物：2μl

Exnase^TM II：2μl

反应条件为：37℃反应30分钟，待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却15分钟，直接进行转化或者存储于-20℃待用。

原核表达过程：将重组的pET-28a(+)质粒转化进Trans5αChemically CompetentCell(TransGen,Beijing,China)并通过菌落PCR和DNA测序确定阳性菌落，测序由上海博尚生物技术有限公司完成。将阳性克隆转化进大肠杆菌Transetta(DE3)ChemicallyCompetent Cell(TransGen,Beijing,China)中，并测序验证。使用Isopropyl-D-thiogalactoside(IPTG)(0.5mM)在37℃条件下诱导表达5小时。4℃,5000g离心15分钟收集大肠杆菌并通过

Master Mix(Novagen,MA,USA)进行裂解。收集裂解液于4℃下,12,000g离心20分钟。上清通过cOmplete His-Tag Purification Resin(Roche,Indianapolis,IN,USA)和Ni-NTA Buffer Kit(Novagen,MA,USA)进行目的蛋白的纯化。纯化后的目的蛋白CcCRT在4℃条件下，使用

G2Dialysis Device(SpectrumLaboratories,USA)在PBS缓冲液(pH＝7.4)中对纯化后的可溶蛋白进行3次透析。蛋白浓度采用Bradford法通过Bradford Protein Assay Kit Bradford(Sangon Biotech,Shanghai,China)测定。透析后交由金斯瑞生物科技有限公司作为抗原，制作多克隆抗体。首先用生理盐水稀释免疫原，然后与福氏佐剂等量混合，进行兔子皮下多点注射。之后的第8和15天分别注射1ml和2ml，末次注射7天后颈动脉取血，室温过夜析出血清，制成多克隆抗体。抗体应用于真核表达的eGFP-CcCRT的western-blot的检测。

真核表达过程：将重组的pBacHTeGFPT质粒转化进Trans5αChemically CompetentCell(TransGen,Beijing,China)并通过菌落PCR和DNA测序确定阳性菌落，测序由上海博尚生物技术有限公司完成。将阳性克隆转化进DH10Bac^TM E.coli Cells(Invitrogen,California,USA)并通过菌落PCR验证重组的pBacHTeGFPT。抽提重组的pBacHTeGFPT，使用转染试剂

II Reagent(Invitrogen,California,USA)感染sf9细胞。收集3代病毒感染的300ml Sf9细胞(2×106cells/ml)，通过I-PER^TM Insect Cell ProteinExtraction Reagent(Thermo Scientific,Wilmington,DE,USA)进行细胞裂解，12,000×g离心20分钟，收集裂解液的上清，并将沉淀用30μl双蒸水重悬浮，制样，进行SDS-PAGE的检测。两组对照分别是未转染任何Bacmid的sf9细胞和转染了未重组CcCRT的pBacHTeGFPT的sf9细胞，二者均按照上述同样的步骤收集裂解液的上清和沉淀并且制样，进行SDS-PAGE的分析。转染Bacmid的两组sf9细胞的裂解液上清通过cOmplete His-Tag PurificationResin(Roche,Indianapolis,IN,USA)和Ni-NTA Buffer Kit(Novagen,MA,USA)进行蛋白的纯化。纯化后的蛋白进行SDS-PAGE和Western Blot的分析。最后，4℃条件下，使用Float-A-Lyzer○RG2 Dialysis Device(Spectrum Laboratories,USA)在PBS缓冲液(pH＝7.4)中对纯化后的可溶蛋白进行3次透析。蛋白浓度采用Bradford法通过Bradford Protein AssayKit Bradford(Sangon Biotech,Shanghai,China)测定。

所得的二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT，其氨基酸序列为SEQID NO：2所示。

还原型SDS-PAGE采用Mini-ProteinⅢ电泳槽和Model3000Xi变压器(Bio-rad,Hercules,CA,USA)进行，分离胶和浓缩胶浓度分别为5％和12％。Coomassie BrilliantBlue R-250(Bio-rad,Hercules,CA,USA)染色15分钟后用考马斯亮蓝脱色液进行脱色。采用GS-800^TM Calibrated Densitometer校准型密度计(Bio-rad,Hercules,CA,USA)扫描拍照。

Western Blot中，蛋白样品经12％SDS-PAGE后，通过Mini-Protean TetraElectrophoresis System(Bio-rad,Hercules,CA,USA)湿转至硝酸纤维膜(Sigma,St.Louis,MO,USA)。一抗稀释5000倍，二抗采用5000倍稀释的羊抗兔IgG(H+L)(HuaAnBiotechnology,Hangzhou,China)。最后通过TMB Stabilized Substrate for HRP(Promega,Madison,WI,USA)进行显色，GS-800^TM Calibrated Densitometer进行扫描拍照。

所得结果如图1所述，由图1可知，纯化的目的蛋白eGFP-CcCRT条带单一，并且能被其抗体特异性识别，可以用于后续的功能研究。

实施例2：重组的eGFP-CcCRT进入寄主二化螟幼虫颗粒血细胞的测定

将eGFP/eGFP-CcCRT分别与寄主血细胞孵育3小时，用PBS清洗3遍后加DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)，5分钟之后吸走DAPI，再用PBS清洗3遍后，使用Zeiss LSM 780confocal microscope(Carl Zeiss SAS,Jena,Germany)进行拍照，照片的编辑通过ZeissLSM ZEN 2010 software(Carl Zeiss SAS,Jena,Germany)完成。图中可以看出，A和C两图中，寄主二化螟的血细胞和eGFP共同孵育，其形态上没有出现变化，荧光视野下未见绿色荧光，说明eGFP没有进入寄主血细胞中；在B和D图中，血细胞和eGFP-CcCRT共同孵育，虽然其细胞形态也没有发生改变，但是B图中的颗粒血细胞(GR)出现了绿色荧光，说明eGFP-CcCRT进入了寄主颗粒血细胞中，而在浆血细胞(PL)中，并没有出现绿色荧光。孵育实验表明，eGFP-CcCRT可以进入寄主颗粒血细胞中；如图2所述，根据图2可得知重组的eGFP-CcCRT虽然不能进入寄主的浆血细胞中，但是却可以进入颗粒血细胞中。

因此，最终可得知本发明的二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT能可以进入水稻重要害虫二化螟幼虫的重要免疫相关细胞——颗粒血细胞中，可参与对二化螟免疫的调控作用，具有作为载体携带相关作用因子进入寄主血细胞的应用潜能。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1212

<212> DNA

<213> 二化螟盘绒茧蜂(Cotesia chilonis)

<400> 1

atgcgagctc tcgttgctat cctggcaatt gccgtaattg ccaccgtgtc tgctgaagtt 60

ttcttcgaag aaagattttc agacgattca tgggaaaaga actgggtata ctcagagcat 120

cccggcaaag aattcggaaa gttcaagcgg actgctggaa aattctacca cgaagaatta 180

caagacacag gtatccaaac aactgaagat gccaggttct acgctctcag cagaaagttc 240

aagccattca cgaataagga caagccattg gttgtccaat tcaccgtcaa gcatgaacaa 300

atgattgatt gcggtggtgg ctacgtgaaa gtcttcgact gttcattgga ccaaaaggac 360

atgcacggag agacaccata ccttcttatg tttggacctg acatttgtgg acctggaacc 420

aagaaagttc acgtaatctt caactacaag ggaaagaatc tgttgattaa gaaagacatt 480

cgttgcaagg acgatgtata cactcacttg tacactttga tcgtcaaacc agacaacact 540

tacgaggttc ttatcgacaa tgaaaaggta gagtctggag aacttgaagc cgactgggac 600

tttttgccac ccaagaaaat caaggacccg aatgagaaga aacccgaaga ctgggatgac 660

cgtgccacca ttcccgatcc agaagatacc aaacccgaag actgggacaa gcctgagact 720

atccccgacc ccgaagccac caaaccagaa gattgggacg atgaaatgga cggagaatgg 780

gaaccaccaa tgatcgacaa cccagacttc aaaggtgaat ggaagccaaa gcaaattgat 840

aacccagctt acaagggacc atggctccat cctgaaattg acaaccctga gtacgttaag 900

gatgaagaac tctacaagaa agacgaaatc tgttccattg gtttcgatct ttggcaagtc 960

aagtctggaa ccatttttga caatgttctt attactaatg aaccagaagc cgctagcaaa 1020

ttcgccgaag atgtttggaa accaaacttt gaaggtgaaa aaaaaatgaa agaagctcaa 1080

gatgaggctg aaagaaaatc aatggaggcg gagaaaccag aagccccaga agaggatgat 1140

gatgaagatg atgatgatgc ggatgacgaa gacaacaccg taccagaagt tgaggagcac 1200

gacgaattgt aa 1212

<210> 2

<211> 403

<212> PRT

<213> 二化螟盘绒茧蜂(Cotesia chilonis)

<400> 2

Met Arg Ala Leu Val Ala Ile Leu Ala Ile Ala Val Ile Ala Thr Val

1 5 10 15

Ser Ala Glu Val Phe Phe Glu Glu Arg Phe Ser Asp Asp Ser Trp Glu

20 25 30

Lys Asn Trp Val Tyr Ser Glu His Pro Gly Lys Glu Phe Gly Lys Phe

35 40 45

Lys Arg Thr Ala Gly Lys Phe Tyr His Glu Glu Leu Gln Asp Thr Gly

50 55 60

Ile Gln Thr Thr Glu Asp Ala Arg Phe Tyr Ala Leu Ser Arg Lys Phe

65 70 75 80

Lys Pro Phe Thr Asn Lys Asp Lys Pro Leu Val Val Gln Phe Thr Val

85 90 95

Lys His Glu Gln Met Ile Asp Cys Gly Gly Gly Tyr Val Lys Val Phe

100 105 110

Asp Cys Ser Leu Asp Gln Lys Asp Met His Gly Glu Thr Pro Tyr Leu

115 120 125

Leu Met Phe Gly Pro Asp Ile Cys Gly Pro Gly Thr Lys Lys Val His

130 135 140

Val Ile Phe Asn Tyr Lys Gly Lys Asn Leu Leu Ile Lys Lys Asp Ile

145 150 155 160

Arg Cys Lys Asp Asp Val Tyr Thr His Leu Tyr Thr Leu Ile Val Lys

165 170 175

Pro Asp Asn Thr Tyr Glu Val Leu Ile Asp Asn Glu Lys Val Glu Ser

180 185 190

Gly Glu Leu Glu Ala Asp Trp Asp Phe Leu Pro Pro Lys Lys Ile Lys

195 200 205

Asp Pro Asn Glu Lys Lys Pro Glu Asp Trp Asp Asp Arg Ala Thr Ile

210 215 220

Pro Asp Pro Glu Asp Thr Lys Pro Glu Asp Trp Asp Lys Pro Glu Thr

225 230 235 240

Ile Pro Asp Pro Glu Ala Thr Lys Pro Glu Asp Trp Asp Asp Glu Met

245 250 255

Asp Gly Glu Trp Glu Pro Pro Met Ile Asp Asn Pro Asp Phe Lys Gly

260 265 270

Glu Trp Lys Pro Lys Gln Ile Asp Asn Pro Ala Tyr Lys Gly Pro Trp

275 280 285

Leu His Pro Glu Ile Asp Asn Pro Glu Tyr Val Lys Asp Glu Glu Leu

290 295 300

Tyr Lys Lys Asp Glu Ile Cys Ser Ile Gly Phe Asp Leu Trp Gln Val

305 310 315 320

Lys Ser Gly Thr Ile Phe Asp Asn Val Leu Ile Thr Asn Glu Pro Glu

325 330 335

Ala Ala Ser Lys Phe Ala Glu Asp Val Trp Lys Pro Asn Phe Glu Gly

340 345 350

Glu Lys Lys Met Lys Glu Ala Gln Asp Glu Ala Glu Arg Lys Ser Met

355 360 365

Glu Ala Glu Lys Pro Glu Ala Pro Glu Glu Asp Asp Asp Glu Asp Asp

370 375 380

Asp Asp Ala Asp Asp Glu Asp Asn Thr Val Pro Glu Val Glu Glu His

385 390 395 400

Asp Glu Leu

Claims

1.二化螟盘绒茧蜂毒腺和卵巢分泌的钙网蛋白CcCRT的用途，其特征是：所述蛋白能作为进入水稻重要害虫二化螟幼虫的重要免疫相关细胞的载体，所述重要免疫相关细胞为颗粒血细胞，所述钙网蛋白CcCRT的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。