ES2378242T3 - Hexapéptidos antimicrobianos - Google Patents

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Lijuan Zhang
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Abstract

Un hexapéptido antimicrobiano que comprende restos cargados hidrófilos (X) en las posiciones uno y tres; restos hidrófobos (B) en las posiciones dos, cuatro y seis; y una naftilalanina (Nal), un resto alifático o uno aromático (O) en la posición cinco; estando representada la estructura del hexapéptido por la fórmula XBXBOB, y seleccionándose el hexapéptido del grupo que consiste en SEC ID Nº : 1, SEC ID Nº : 55, SEC ID Nº : 56, SEC ID Nº : 62, SEC ID Nº : 63, SEC ID Nº : 70, SEC ID Nº : 72, SEC ID Nº : 77, SEC ID Nº : 78, SEC ID Nº : 79, SEC ID Nº : 80, SEC ID Nº : 81, SEC ID Nº : 83 y SEC ID Nº : 85.

Description

Hexapéptidos antimicrobianos
5 Reivindicación de prioridad
La presente solicitud reivindica beneficio de prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos 60/651.270 presentada el 9 de febrero de 2005 e incorpora por referencia en este documento los contenidos completos de la misma.
Campo de la invención
La invención se refiere a composiciones y métodos que comprenden hexapéptidos antimicrobianos que muestran propiedades biológicas deseables. Más específicamente, los hexapéptidos muestran actividades antifúngicas
15 deseadas y, opcionalmente, antibacterianas. En particular, se describen hexapéptidos que tienen restos cargados (hidrófilos) en las posiciones una y tres; restos hidrófobos en las posiciones dos, cuatro y seis; y una naftilalanina, un resto alifático (tal como prolina) o uno aromático (tal como fenilalanina) en la posición cinco; representados generalmente por la fórmula XBXBOB. La actividad puede potenciarse adicionalmente, particularmente en suero, mediante la adición de un resto lipídico al extremo N terminal de ciertos de estos péptidos. Adicionalmente, la amidación en el extremo C terminal parece aumentar la actividad.
Descripción de técnica relacionada
Los investigadores han desarrollado tratamientos y agentes antimicrobianos durante décadas. Recientemente, ha
25 surgido la necesidad de nuevos agentes antimicrobianos para tratar un número creciente de infecciones bacterianas, virales y fúngicas resistentes a fármacos.
Se han presentado diversos péptidos bioactivos tanto en la bibliografía científica como en patentes expedidas. Los péptidos se han aislado históricamente de fuentes naturales y recientemente han sido el objeto de estudios de relación estructura-función. Adicionalmente, los péptidos naturales han actuado como puntos de partida para el diseño de análogos peptídicos sintéticos.
Se publicó una revisión de antibióticos peptídicos por R. E. W. Hancock en 1997 (Lancet 349: 418-422). Se analizaron la estructura, función y aplicaciones clínicas de diversas clases de péptidos. Una revisión adicional de
35 antibióticos peptídicos catiónicos se publicó en 1998 (Hancock, R. E. W. y Lehrer, R. Trends Biotechnol. 16: 82-88). Los péptidos son típicamente moléculas antipáticas catiónicas de 12 a 45 aminoácidos de longitud. Los péptidos permeabilizan membranas celulares lo que conduce al control de agentes microbianos. El potencial clínico de péptidos catiónicos de defensa del huésped se analizó por R. E. W. Hancock en 1999 (Drugs 57(4): 469-473; Antimicrobial Agents and Chemotherapy 43(6): 1317-1323). Se analizan las propiedades antibacterianas, antifúngicas, antivirales, anticancerosas y de curación de heridas de la clase de péptidos.
También se han publicado revisiones de las características estructurales de péptidos antimicrobianos helicoidales y sus supuestos mecanismos de acción (véase, por ejemplo, Dathe, M. y Wieprecht, T. Biochimica et Biophysica Acta 1462: 71-87 (1999); Epand, R. M. y Vogel H. J. Biochimica et Biophysica Acta 1462: 11 -28 (1999)). Los parámetros
45 estructurales que se cree que son capaces de modular la actividad y selectividad incluyen helicidad, momento hidrófobo, hidrofobicidad, ángulo subtendido por las superficies de hélice hidrófoba/hidrófila, y carga.
Se ha indicado una amplia serie de péptidos alfa helicoidales de origen natural. Se describen en el presente documento varios representantes de las muchas referencias en el campo. Las cecropinas son una familia de péptidos alfa helicoidales aislados de insectos. Las cecropinas se conocen por sus propiedades antibacterianas, como se describe en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.355.104 y 4.520.016. Se descubrió en general que las cecropinas tenían actividad contra ciertas bacterias gram negativas. Se descubrió que las cecropinas no tienen actividad contra células eucariotas (Andreu, et al., Biochemistry 24: 163-188 (1985); Boman, et al., Developmental and Comparative Immunol. 9: 551-558 (1985); Steiner et al., Nature 292: 246-248 (1981)). Las cecropinas de
55 Drosophila y Hyalphora se presentaron como con actividad contra diversas cepas de hongos (Ekengren, S. y Hultmark, D., Insect Biochem. and Molec. Biol. 29: 965-972 (1999)). Se ha notificado que la cecropina A del mosquito Aedes aegypti es diferente de la mayoría de cecropinas de insecto porque carece de triptófano y amidación C terminal (Lowenberger, C. et al., J. Biol. Chem. 274 (29): 20092-20097 (1999)).
Las ranas del género Rana producen una amplia serie de péptidos antimicrobianos en su piel (Goraya, J. et al., Eur.
J. Biochem. 267: 894-900 (2000)). Se presentaron péptidos tan cortos como de 13 aminoácidos y se agruparon en familias estructurales. Las secuencias mostraron poca o ninguna identidad de secuencia con péptidos aislados de ranas de otros géneros, tales como los péptidos magainina y dermaseptina. La magainina es un péptido de 23 aminoácidos α-helicoidal aislado de la piel de la rana Africana Xenopus laevis (Zasloff, M. Proc. Natl. Acad. Sci.
65 U.S.A. 84: 5449-5453 (1987).
La Patente de Estados Unidos Nº 5.962.410 describe la inhibición de patógenos eucariotas y la estimulación de linfocitos y fibroblastos con péptidos líticos tales como cecropinas y sarcotoxinas. Diversos péptidos presentados incluyen Cecropina B, Cecropina SB-37, Cecropina A, Cecropina D, Shiva-1, Lepidopterano, Sarcotoxina 1A, Sarcotoxina 1B y Sarcotoxina 1C.
5 Se presentaron ratones transgénicos que producían el péptido lítico de clase cecropina Shiva-1 por Reed, W. A. et al., Transgenic Res. 6: 337-347 (1997). La infección de los ratones transgénicos con una presentación de Brucella abortus dio como resultado una reducción del número de bacterias en relación con infección de ratones no transgénicos.
Se encuentran péptidos α-helicoidales asociados con catelina de 23 a 38 aminoácidos en las células sanguíneas de ovejas, seres humanos, vacas, cerdos, ratones y conejos (Zanetti, M. et al., FEBS Lett. 374: 1-5 (1995)).
Las actividades antimicrobianas de buforina ll, cecropina P1, indolicidina, magainina II, nisina y ranalexina se
15 notificaron por Giacomette, A. et al. (Peptides 20: 1265-1273 (1999)). Los péptidos mostraron actividades variables contra bacterias y levadura.
Se han preparado y ensayado tanto in vitro como in vivo diversos péptidos sintéticos. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.861.478 describió péptidos líticos sintéticos de aproximadamente 20 a 40 aminoácidos que adoptan una conformación α-helicoidal. Los péptidos son eficaces en el tratamiento de infecciones microbianas, heridas y cáncer. Los péptidos descritos incluyen cecropina B, SB-37*, LSB-37, SB-37, Shiva 1 y 10-12, péptido señal de β-fibrina, Manitou 1 -2, Hecate 1 -3, Anubis 1 -5 y 8 y Vishnu 1-3 y 8.
Hecate se describió como un análogo peptídico sintético de melitina por Baghian, A. et al. (Peptides 18(2): 177-183
25 (1997)). Los péptidos difieren en su distribución de carga, pero no en su conformación α-helicoidal anfipática. Hecate inhibió virus del herpes simple (VHS-1) sin afectar de forma adversa al crecimiento celular y la síntesis proteica.
Los péptidos sintéticos D2A21, D4E1, D2A22, D5C, D5C1, D4E y D4B se describieron en Schwab, U. et al., Antimicrob. Agents and Chemotherapy 43(6): 1435-1440 (1999). Se describieron actividades contra diversas cepas bacterianas.
Se prepararon péptidos híbridos compuestos de péptidos cecropina y melitina y se ensayaron por Juvvadi, P. et al.
(J. Peptide Res. 53:244-251 (1999)). Se sinterizaron híbridos para investigar los efectos de secuencia, dirección de enlace amida (dipolo de hélice), carga, anfipatía e hidrofobicidad en la capacidad de formación de canales y en la
35 actividad antibacteriana. Se ha sugerido que la secuencia y la dirección de enlace amida son requisitos estructurales importantes para la actividad de los híbridos.
Se describió una cecropina de insecto de 26 aminoácidos, híbrido de melitina de abeja, y análogos del mismo, en un estudio de resistencia salina (Friedrich, C. et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 43(7): 1542-1548 (1999)). Se descubrió que un resto de triptófano en la segunda posición era crítico para la actividad. Se descubrió que cambios modestos en la secuencia conducían a cambios sustanciales en las propiedades de los péptidos.
Los efectos de restos de prolina en las propiedades antibacterianas de péptidos α-helicoidales se han publicado (Zhang, L. et al., Biochem. 38: 8102-8111 (1999)). Se ha indicado que la adición de prolinas cambia las propiedades
45 de inserción en membrana y el reemplazo de una prolina sencilla puede cambiar un péptido antimicrobiano a una toxina lítica.
Se preparó una serie de péptidos que tenían entre 18 y 30 aminoácidos para ensayar los efectos de cambios en secuencia y carga en propiedades antibacterianas (Scott, M. G., et al., Infect. Immun. 67(4): 2005-2009 (1999)). No se descubrió correlación significativa entre longitud, carga o hidrofobicidad y la actividad antimicrobiana de los péptidos. Se descubrió una tendencia general de que los péptidos más cortos eran menos activos que los péptidos más largos, aunque se observó que este efecto probablemente dependería de la secuencia.
Se prepararon “modelinas”, un grupo de péptidos sintéticos, y se ensayaron para comparar relaciones de secuencia
55 y estructura (Bessalle, R. et al. J. Med. Chem. 36: 1203-1209 (1993)). Los péptidos de 16 y 17 aminoácidos que tenían caras opuestas hidrófobas e hidrófilas fueron altamente hemolíticos y antibacterianos. Los péptidos más pequeños tendían a tener actividades biológicas más bajas.
Se descubrió que un péptido híbrido de cecropina-melitina y un péptido de platija amidado protegían el salmón de infecciones por Vibrio anguillarum in vivo (Jia, X. et al., Appl. Environ. Microbiol. 66(5): 1928-1932 (2000)). Se usaron bombas osmóticas para suministrar una dosis continua de uno de los péptidos al pez.
Se ha notificado que los péptidos anfipáticos son capaces de potenciar la curación de heridas y estimular el crecimiento de fibroblastos y queratinocitos in vivo (Patentes de Estados Unidos Nº 6.001.805 y 5.561.107). Se ha 65 notificado que se han preparado plantas transgénicas que expresan péptido líticos como una proteína de fusión con
ubiquitina (Patente de Estados Unidos Nº 6.084.156). Se ha notificado que se prepararon péptido líticos ricos en lisina metilada, que presentaban resistencia proteolítica mejorada (Patente de Estados Unidos Nº 5.717.064).
El cesionario Helix BioMedix, Inc. es el propietario de varias patentes expedidas y publicaciones de patente
5 adicionales que enseñan péptidos líticos y procedimientos para su uso. La Patente de Estados Unidos Nº 6.440.935 describe los usos estimulantes y proliferativos de péptidos que tienen de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 aminoácidos dispuestos al menos en parte en una conformación alfa-helicoidal. La Patente de Estados Unidos Nº
6.303.568 describe procedimientos para tratar animales infectados con un hongo o bacterias gram negativas. El tratamiento implica la administración de un péptido tal como Cecropina C-37. La Patente de Estados Unidos Nº
6.255.282 describe procedimientos para matar microbios que implican la administración de diversos péptidos. Los péptidos se definen por sus propiedades conformacionales y de secuencia. La Solicitud de Patente de Estados Unidos Publicada Nº 20020025918 describe el uso de péptidos similares en plantas. La Solicitud de Patente de Estados Unidos Publicada Nº 20030109452 y 20030083243 describen péptidos bioactivos “FLAK” y métodos para su uso.
15 Existen diversas patentes que describen composiciones cosméticas que contienen péptidos cortos. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 6.492.326 sugiere la preparación y uso de composiciones de cuidado de la piel que contienen pentapéptidos y principios activos de cuidado de la piel.
Strom et al. 2003 (Journal of Medicinal Chemistry 46: 1567-1570) describen péptidos antibacterianos cortos centrados principalmente en péptidos muy cortos (dímeros y trímeros) que contienen modificaciones químicas. También se describen ciertos hexapéptidos. Sin embargo, no existen ensayos o análisis de actividad antimicrobiana
o específicamente ninguna antifúngica de estos hexapéptidos.
25 Lopez Garcia et al. (Int. Journal of Food Microbiol. 89: 163-170 (2003) y Applied and Environ. Microbiol. 68: 24532460, (2002)) describen la exploración de una biblioteca combinatoria de péptidos sintéticos que da como resultado la identificación de hexapéptidos antifúngicos con actividad contra los patógenos de cultivo de hongos fitopatógenos. Estos péptidos antifúngicos contenían el motivo de RKT o RKK como los tres primeros restos. No se describen ensayos o análisis de actividad antimicrobiana contra patógenos clínicamente significativos, incluyendo patógenos fúngicos. De forma similar, no hay análisis de la estabilidad de los hexapéptidos o propiedades tóxicas.
Los siguientes documentos describen diversos oligopéptidos antimicrobianos que contienen restos aromáticos y cambiados: documento WO01/98364; documento WO95/19370; Applied and environmental microbiology. Mayo 2002, vol 68, ho.5, p.2453-2460; Journal of Peptide Science, vol. 8, ho.4, Oct 2004, p. 159-169; y el Journal of
35 Peptide Research: Official Journal of the American Peptide Society, vol. 64, ho.4, Oct 2004, p.159-169.
Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar péptidos que tengan un amplio intervalo de actividad antimicrobiana potente contra varios microorganismos, incluyendo bacterias grama negativas, protozoos, virus y similares, y especialmente contra patógenos eucariotas tales como hongos. Puesto que los patógenos fúngicos son eucariotas y por lo tanto relativamente más similares al hospedador humano que a bacterias procariotas, tradicionalmente ha sido más difícil desarrollar terapias eficaces contra patógenos eucariotas que carecen de toxicidad. Este también es el caso con el desarrollo de péptidos antifúngicos.
Además, los péptidos antifúngicos han tendido a ser relativamente largos (>15 aminoácidos) y por lo tanto estar
45 asociados con toxicidad y también muestran alta susceptibilidad a proteasas, baja penetración tisular y alto coste. Adicionalmente, los péptidos antimicrobianos aunque sean buenos candidatos farmacológicos para aplicaciones tópicas, tradicionalmente no son compatibles con la circulación sistémica que acompañaría a la administración sistémica.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona hexapéptidos antimicrobianos que comprenden restos hidrófilos cargados (X), en las posiciones una y tres; restos hidrófobos (B) en las posiciones dos, cuatro y seis; y una naftilalanina, un resto alifático o uno aromático (0) en la posición cinco; en los que la estructura hexapeptídica se representa por la fórmula
55 XBXBOB; y seleccionándose el hexapéptido del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 55, SEC ID Nº: 56, SEC ID Nº: 62, SEC ID Nº: 63, SEC ID Nº: 70, SEC ID Nº: 72, SEC ID Nº: 77, SEC ID Nº: 78, SEC ID Nº: 79, SEC ID Nº: 80, SEC ID Nº: 81, SEC ID Nº: 83 y SEC ID Nº: 85.
En ciertas realizaciones, el hexapéptido comprenderá los siguientes aminoácidos, en los que X se selecciona del grupo que consiste en Arginina (R) y Lisina (K); B se selecciona del grupo que consiste en Fenilalanina (F) y Triptófano (W); y O se selecciona del grupo que consiste en naftilalanina (Nal), Prolina (P) y Fenilalanina (F).
Son hexapéptidos similares a los de la presente invención KFKWPW-NH2 (SEC ID Nº: 1), KWRWPW-NH2 (SEC ID Nº: 2), KWKWFW-NH2 (SEC ID Nº: 3), RWRWPW-NH2 (SEC ID Nº: 4), KFKWFW-NH2 (SEC ID Nº: 6), RFKWFW
65 NH2 (SEC ID Nº: 7), OCTKFKWPW-NH2 (SEC ID Nº: 55), OCT-KWKWFW-NH2 (SEC ID Nº: 56), KWK-WUW-NH2 (SEC ID Nº: 62), y KWKWZW-NH2 (SEC ID Nº: 63).
En ciertas realizaciones el hexapéptido es SEC ID Nº: 1.
En otras realizaciones, el hexapéptido está modificado. Estas modificaciones pueden incluir lipidación o amidación.
5 En otras realizaciones, el hexapéptido está lipidado y el lípido se selecciona del grupo que consiste en ácido heptanoico, ácido nonanoico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido pentadecanoico, ácido undecanoico, ácido tridecanoico o ácido octanoico.
En otras realizaciones más, el hexapéptido se selecciona del grupo que consiste en, Non-KFKWPW-NH2 (SEC ID Nº: 70), Lau-KFKWPWNH2 (SEC ID Nº: 72), Myr-KFKWPW-NH2 (SEC ID Nº: 77), Pen-KFKWPW-NH2 (SEC ID Nº: 78), Und-KFKWPW-NH2 (SEC ID Nº: 79), Tri-KFKWPW-NH2 (SEC ID Nº: 80), Oct-kfkwpw-NH2 (SEC ID Nº: 81), Lau-kfkwpw-NH2 (SEC ID Nº: 83), y Deca-KFKWPW-NH2 (SEC ID Nº: 85).
En otras realizaciones más el hexapéptido es soluble en una solución acuosa.
15 En ciertas realizaciones el hexapéptido está presente en una composición junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones el hexapéptido está presente en las composiciones en una concentración terapéuticamente eficaz. Esta concentración terapéuticamente eficaz puede estar en un intervalo de aproximadamente 0,0002 % a aproximadamente 90 %. En otras realizaciones, la concentración terapéuticamente eficaz está en el intervalo de aproximadamente 0,5 % a aproximadamente 10 %.
En ciertas realizaciones la composición incluye adicionalmente un sistema de suministro subcutáneo. En otras realizaciones el sistema de suministro puede ser un sistema de suministro tópico. El sistema de suministro tópico puede estar en cualquier forma que se selecciona del grupo que consiste en una preparación cosmética, polvo,
25 emulsión, loción, pulverización, pomada, aerosol, crema y espuma.
En otra realización, se usa una cantidad terapéuticamente eficaz del hexapéptido para tratar o prevenir una infección fúngica o bacteriana en un mamífero.
La invención proporciona composiciones útiles para tratar tejido de mamíferos, las composiciones generalmente comprenderán un hexapéptido que comprende restos cargados en las posiciones uno y tres, restos hidrófobos en las posiciones dos, cuatro y seis; y una naftilalanina, un resto alifático o uno aromático en la posición cinco; estando representada la estructura hexapeptídica por la fórmula XBXBOB.
35 En otra realización más, la invención proporciona la composición útil para tratar infecciones microbianas, estando comprendida dicha composición por un hexapéptido seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 55, SEC ID Nº: 56, SEC ID Nº: 62, SEC ID Nº: 63, SEC ID Nº: 70, SEC ID Nº: 77, SEC ID Nº: 78, SEC ID Nº: 79, SEC ID Nº: 80, SEC ID Nº: 81, SEC ID Nº: 83, y SEQ ID 85. Esta composición puede incluir adicionalmente un sistema de suministro farmacéutico.
Los hexapéptidos de la presente invención pueden usarse en el tratamiento o prevención de infecciones microbianas en mamíferos, estando comprendido el método por administrar una concentración terapéuticamente eficaz de al menos uno de los hexapéptidos de la presente invención. Los hexapéptidos que pueden usarse en tales métodos se seleccionan del grupo que consiste en KFKWPW-NH2 (SEC ID Nº: 1), ID, OCTKFKWPW-NH2 (SEC ID Nº: 55), OCT
45 KWKWFW-NH2 (SEC ID Nº: 56), KWK-WUW-NH2 (SEC ID Nº: 62), KWKWZW-NH2 (SEC ID Nº: 63),, Non-KFKWPW-NH2 (SEC ID Nº: 70), Lau-KFKWPW-NH2 (SEC ID Nº: 72), MyrKFKWPW-NH2 (SEC ID Nº: 77), Pen-KFKWPW-NH2 (SEC ID Nº: 78), Und-KFKWPWNH2 (SEC ID Nº: 79), Tri-KFKWPW-NH2 (SEC ID Nº: 80), Octkfkwpw-NH2 (SEC ID Nº: 81), Lau-kfkwpw-NH2 (SEC ID Nº: 83), y DECA-KFKWPW-NH2 (SEC ID Nº: 85).
Estos métodos son útiles cuando la infección microbiana es una infección fúngica. Los métodos también pueden ser útiles cuando la infección microbiana es una infección mixta fúngica bacteriana. Los métodos también pueden ser particularmente útiles cuando la infección fúngica está causada por un hongo seleccionado del grupo que consiste en Candida albicans, Trichophyton rubrum, y Trichopliyton inentagrophytes. Los métodos también pueden ser útiles cuando la infección bacteriana está causada por una bacteria seleccionada del grupo que consiste en P.
55 acuroginosa, E. coil, y S. aureus.
En otra realización más, la presente invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de una célula fúngica que comprende poner en contacto dicha célula fúngica con al menos uno de los hexapéptidos de la presente invención de modo que se inhiba el crecimiento de la célula fúngica. En ciertas realizaciones, la célula fúngica es un patógeno de plantas seleccionado del grupo que consiste en Mycosphaerella brassicicola, Pyrenopezizci brassicae, Peronospora destructoi; y Botrytis squamosa.
La presente invención se refiere a un método para prevenir infecciones microbianas en mamíferos, comprendiendo dicho método administrar una concentración terapéuticamente eficaz de un hexapéptido seleccionado del grupo que
65 consiste en SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 55, SEC ID Nº: 56, SEC ID Nº: 62, SEC ID Nº: 63, SEC ID Nº: 70, SEC ID Nº: 72, SEC ID Nº: 77, SEC ID Nº: 78, SEC ID Nº: 79, SEC ID Nº: 80, SEC ID Nº: 81, SEC ID Nº: 83, y SEC ID Nº: 85.
En otra realización más, la presente invención proporciona la composición farmacéutica que comprende un hexapéptido seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 55, SEC ID Nº: 56, SEC ID Nº: 62, SEC ID Nº: 63, SEC ID Nº: 70, SEC ID Nº: 72, SEC ID Nº: 77, SEC ID Nº: 78, SEC ID Nº: 79, SEC ID Nº: 80, SEC ID
5 Nº: 81, SEC ID Nº: 83, y SEC ID Nº: 85. Descripción de las figuras
Las siguientes figuras forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente
10 ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor por referencia a una o más de estas figuras en combinación con la descripción detallada de las realizaciones específicas presentadas en este documento.
La Figura 1 muestra una representación de dicroismo particular de SEC ID Nº: 1 (P0666) que demuestra un 15 desplazamiento de la estructura tras la interacción del péptido con un ambiente lipídico proporcionado en este caso por liposomas.
La Figura 2 muestra una curva de muerte realizada en estimulante vaginal que demuestra la muerte de bacterias (S. aureus) y levadura (C. albicans) en este ambiente por el péptido SEC ID Nº: 55 (P1032).
20 La Figura 3 muestra una curva de muerte realizada en suero 80 % que demuestra la capacidad de SEC ID Nº: 55 (P1032) para matar S. aureus en este ambiente.
Las Figuras 4A y 4B muestran representaciones gráficas de las estructuras naftilalanina-1 y naftilalanina-2, que 25 demuestran su similitud y su naturaleza aromática.
La Figura 5 muestra una curva de muerte realizada en suero 10 % que demuestra la capacidad aumentada de un péptido lipidado SEC ID Nº: 55 (P1032) para matar bacterias (S. aureus) frente a su precursor no lipidado SEC ID Nº: 1 (P0666) en ese ambiente.
30 La Figura 6 muestra una curva de muestra realizada en suero 10 % que demuestra la actividad de SEC ID Nº: 55 (P1032) en comparación con SEC ID Nº: 56 (P1033) y P50 (un 17-mer activo).
La Figura 7 muestra un ensayo de unión de LTA que demuestra que SEC ID Nº: 72 (P 1148) se une a LTA en el 35 mismo grado que P50 (un 17-mer activo).
La Figura 8 muestra una curva de muerte realizada en suero 10 % que demuestra la actividad de SEC ID Nº: 55 (P1032) en comparación con P64 (un péptido antimicrobiano catiónico tradicional).
40 La Figura 9 representa la estructura de SEC ID Nº: 1 (P0666) como se determina por ET-NMR representándose la carga en negro y la hidrofobicidad en blanco.
La Figura 10 muestra una curva de muerte realizada en ambiente de suero 80 % que demuestra la actividad de SEC ID Nº: 72 (P1148), SEC ID Nº: 83 (P1343), SEC ID Nº: 79 (P1275), y SEC ID Nº: 80 (P1276).
45 La Figura 11 muestra una curva de muerte realizada en un lípido 1 mg/ml y ambiente de suero 10 % que demuestra la actividad de SEC ID Nº: 55 (P1032) en comparación con P64 (un péptido antimicrobiano catiónico tradicional).
Descripción de las listas de secuencias
50 Las siguientes listas de secuencias de aminoácidos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor por referencia a una o más de estas secuencias en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentadas en este documento.
55 TABLA 1
SEC ID Nº:
Nº P Secuencia de aminoácidos
1
P0666 KFKWPW-NH2
2
P0665 KWRWPW-NH2
3
P0736 KWKWFW-NH2
4
P0735 RWRWPW-NH2
5
P0633 RWRWRW-NH2
6
P0734 KFKWFW-NH2
7
P0737 RFKWFW-NH2
8
P0634 RRRWWW-NH2
9
P0635 KFKFKF-NH2
10
P0636 KYKYKY-NH2
11
P0637 FKFKFK-NH2
12
P0661 FKFKPV-NH2
13
P0662 VKVKPV-NH2
14
P0663 FALKKL-NH2
15
P0664 RKTWPW-NH2
16
P0667 FKLAPW-NH2
17
P0668 KWKKPV-NH2
18
P0669 FRHFRW-NH2
19
P0670 VAKLAK-NH2
20
P0671 FAKLAK-NH2
21
P0672 KFKSFK-NH2
22
P0673 KWKKLA-NH2
23
P0699 KWKFKF-NH2
24
P0700 KWKVFK-NH2
25
P0701 VAKKWK-NH2
26
P0671 FAKLAK-NH2
27
P0712 KLAKLL-NH2
28
P0713 LAKLAK-NH2
29
P0714 KPWKFK-NH2
30
P0715 KPVWPW-NH2
31
P0716 IKPVKFK-NH2
32
P0717 KFVWPW-NH2
33
P0718 LLKWPW-NH2
34
P0719 FPWKFK-NH2
35
P0720 KPVWPF-NH2
36
P0721 KFFWPF-NH2
37
P0738 KAKFPF-NH2
38
P0739 KFKPFW-NH2
39
P1030 KUKWPW-NH2
40
P1013 KFKLPW-NH2
41
P1014 KFKWPW-COOH
42
P1016 KWKWPW-COOH
43
P1017 KWKWFW-COOH
44
P1018 KFKWFW-COOH
45
P1020 FAKWPW-COOH
46
P1022 VAKWPW-COOH
47
P1023 KWKWPW-NH2
48
P1024 FAKWPW-NH2
49
P1025 VAKWPW-NH2
50
P1026 KWKFPF-NH2
51
P1027 KWKWGW-NH2
52
P1028 KLKWPW-NH2
53
P1029 KWKLAL-NH2
54
P1031 OCT-FALLKL-NH2
55
P1032 OCT-KFKWPW-NH2
56
P1033 OCT-KWKWFW-NH2
57
P1034 OCT-KFKWFW-NH2
58
P1035 JALLKL-NH2
59
P1036 KJKWPW-NH2
60
P1037 KWKWJW-NH2
61
P1083 KJKWJW-NH2
62
P1085 KWKWUW-NH2
63
P1087 KWKWZW-NH2
64
P1007 KWKWLPW-NH2
65
P1008 KWKWPPW-NH2
66
P1109 KWKWPGW-NH2
67
P1011 KPKWPPW-NH2
68
P1012 KFKWPPW-NH2
69
P1145 Hep-KFKWPW-NH2
70
P1146 Non-KFKWPW-NH2
71
P1147 Cap-KFKWPW-NH2
72
P1148 Lau-KFKWPW-NH2
73
P1149 Pal-KFKWPW-NH2
74
P1150 Ste-KFKWPW-NU2
75
P1151 Ole-KFKWPW-NH2
76
P1258 Aca-KFKWPW-NH2
77
P1273 Myr-KFKWPW-NH2
78
P1274 Pen-KFKWPW-NH2
79
P1275 Und-KFKWPW-NH2
80
P1276 Tri-KFKWPW-NH2
81
P1205 Oct-kfkwpw-HN2
82
P1206 kfkwpw-NH2
83
P1343 Lau-kfkwpw-NH2
84
P1304 Oct-KFKWPw-NH2
85
P1345 Deca-KFKWPW-NH2
86
P153 FALKALKKLKKALKKAL-NH2
87
P55 FAKLLAKALKKLL-NH2
88
P50 VAKKLAKLAKKLAKLAL-NH2
89
P43 FAKLLAKLAKKLL-NH2
90
P64 FAKALKALLKALKAL-NH2
91
P650 FAKALLKALLKALK-NH2
92
P146 KYKKALKKLAKLL-NH2
Clave de elementos de aminoácidos: OCT indica la adición de ácido octanoico mediante un enlace amida al péptido, usando química de péptidos convencional. COOH indica que el extremo C terminal no está amidado; J es el símbolo de una fenilalanina fluorada; U significa 1-Nal-OH y Z significa 2-Nal-OH, siendo Nal naftilalanina, un
5 aminoácido no natural que es un análogo de fenilalanina y alanina. Lípidos enumerados anteriormente con abreviaturas y acoplados de forma similar a OCT:
myr=ácido mirístico, und=ácido undecanoico, pen=ácido pentadecanoico, pal=ácido palmitíco, ste=ácido esteárico, lau=ácido láurico, triácido tridecanoico, cap=ácido caproico, ole=ácido oleico, non=ácido nonanoico,
10 hep=ácido heptanoico, aca=ácido 8-amino-caprílico y deca=ácido decanoico. Las letras en minúsculas para aminoácidos indican restos de forma D.
Descripción detallada de la invención
15 Para que la invención descrita en este documento pueda entenderse más completamente, se expone la siguiente descripción detallada. La invención se refiere generalmente a composiciones y métodos que comprenden hexapéptidos antimicrobianos que muestran propiedades biológicas deseables.
La presente invención se refiere a hexapéptidos con actividad antimicrobiana contra una serie de patógenos
20 antimicrobianos. Estos patógenos pueden incluir bacterias gram positivas o negativas, bacterias ácido resistentes tales como micobacterias, parásitos, dermatofitos o patógenos fúngicos. Los patógenos fúngicos típicos incluyen Candida albicans y los dermatofitos típicos incluyen Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes.
Un ejemplo de un hexapéptido tal es SEC ID Nº: 1 (PO666), que tiene los beneficios útiles y sorprendentes de
25 carecer de toxicidad sistémica, tener susceptibilidad reducida a degradación por proteasas, tener una capacidad aumentada de penetrar en áreas (o regiones) tisulares infectadas y de ser rentable de fabricar.
El término dermatofitos se refiere a un hongo particular pero es una etiqueta abreviada habitual para un grupo de tres géneros de hongos que habitualmente provocan enfermedades de la piel en personas y animales. Estos
30 incluyen los géneros Epidermophyton, Trichophyton, y Microsporum.
Pueden hallarse detalles sobre técnicas para formulación y administración de agentes farmacéuticos en la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co, Easton Pa.). Aunque es deseable el suministro tópico local, existen otros medios de suministro, por ejemplo: administración oral, parenteral, en aerosol,
35 intramuscular, subcutánea, transcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal o intranasal. La presente invención puede formularse en varios vehículos transportadores, por ejemplo, en un pulverizador; un aerosol; una emulsión de tipo acuoso y oleoso; una emulsión de tipo oleoso y acuoso; una crema facial o crema corporal; una loción solar o loción para después del sol u otro vehículo de administración tópica.
40 Como se usa en este documento, el término “terapéutico” significa un agente utilizado para tratar, combatir, aliviar, prevenir o mejorar una enfermedad o afección no deseada de un paciente. La afección que se trata en la presente invención incluye diversas enfermedades fúngicas que habitualmente afectan a mamíferos tales como seres humanos, incluyendo infecciones de levadura típicamente causadas por Candida albicans, e infecciones cutáneas tales como pie de atleta típicamente causado por Trichophyton rubrum, y Trichophyton mentagrophytes.
45 Adicionalmente, los hexapéptidos de la presente invención, y composiciones que los contienen, pueden proporcionar características útiles para inclusión en formulaciones cosméticas y de cuidado de la piel generales, tales como diversos cosméticos cutáneos, cremas cutáneas, lociones, protectores solares y lociones o cremas terapéuticas tales como formulaciones antiacné.
I. Síntesis Peptídica
Todos los hexapéptidos se sintetizaron usando química de Fmoc (9-Fluorenilmetoxicarbonilo) convencional en un Sintetizador de Múltiples Péptidos Advanced ChemTech Apex 396. El Apex 396 está equipado con un bloque de 5 reacción de 40 pocillos para la producción de hasta 40 péptidos simultáneamente a una escala de 0,15 mmol. Los péptidos pueden prepararse como secuencias ácidas libres o amidadas usando aminoácidos convencionales. La resina se lavó primero y se hinchó previamente con N,N-dimetil formamida (DMF). Los tiempos de hinchamiento variaron de 3 minutos a una hora para amida de Rink o resinas Wang. El grupo protector de Fmoc se retiró con piperidina 25 % en DMF durante 25 minutos. La resina se lavó después completamente para retirar rastros de piperidina. Los monómeros de aminoácidos de Fmoc se preactivaron en una solución equimolar de HOAt o HOBt en DMF. Las soluciones fueron de concentración 0,5 M. Los acoplamientos de amida se llevaron a cabo usando HATU PyBop o HBTU como un agente de activación y exceso molar de 2,5-5 veces de aminoácido en condiciones básicas usando una base con impedimento estérico (diisopropiletilamina). Los tiempos de acoplamiento fueron 1-1,5 horas seguido de un lavado y reacoplamiento para conseguir un acoplamiento doble o triple antes de la desprotección y
15 continuación de la cadena peptídica creciente. La eficacia de acoplamiento se controló usando el ensayo de Kaiser convencional. Una vez que se completó la síntesis peptídica en la resina, el grupo Fmoc final se retiró como anteriormente y las secuencias se dejaron como la base libre. Los lípidos se unieron al extremo N terminal o aminas de cadena lateral, como ácidos orgánicos, usando química peptídica convencional como se ha descrito anteriormente.
La escisión del péptido del enlazador lábil ácido se consiguió usando ácido trifluoroacético (TFA) 95 % y agua con los neutralizantes apropiados añadidos. Los tiempos de escisión varían de 30 minutos a una hora. Los péptidos escindidos se retiraron inmediatamente del bloque de escisión y se transfirieron a tubos para la retirada del TFA. El TFA se retira bajo presión reducida. Los péptidos estuvieron entonces listos para purificación y análisis mediante
25 HPLC usando una columna D-18 de fase inversa y Espectrometría de Masas. Se consiguió confirmación de secuencia primaria y purificación preparatoria usando un sistema LC/MS/MS (ABI API2000).
Los hexapéptidos de la invención pueden construirse usando una diversidad de precursores de aminoácidos. Los péptidos pueden ser composiciones homogéneas que contienen solamente aminoácidos D, L o cíclicos (no racémicos). La estructura química de tales aminoácidos (término que se usa en este documento para incluir aminoácidos), independientemente de la configuración estereoisomérica, puede basarse en la de los diecinueve o veinte aminoácidos de origen natural: alanina (Ala; A), arginina (Arg; R), asparagina (Asn; N), aspartato (Asp; D), glutamina (Gln; Q), glutamato (Glu; E), glicina (Gly; G), histidina (His; H), isoleucina (Ile; I), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina (Met; M), prolina (Pro; P), fenilalanina (Phe; F), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptófano (Trp;
35 W), tirosina (Tyr; I), y valina (Val; V). Se excluye cisteína (Cys; C) para evitar problemas de enlace disulfuro en los productos. Las composiciones de la invención también pueden ser no homogéneas, que contienen por ejemplo aminoácidos D, L y/o cíclicos. Las composiciones hexapeptídicas también pueden contener aminoácidos que son distintos de los aminoácidos de origen natural tales como norleucina, homofenilalanina, ornitina, etc. Estos aminoácidos no naturales pueden seleccionarse de compuestos que contienen funcionalidad de aminoácido y ácido carboxílico, pero pueden no ser aminoácidos alfa.
Algunos de los hexapéptidos podrían modificarse con diversos miméticos de aminoácidos o aminoácidos no naturales, que pueden proporcionar hexapéptidos particularmente útiles, puesto que tienden a manifestar estabilidad aumentada in vivo. Más específicamente, los aminoácidos no críticos no necesitan limitarse a los de origen natural 45 en proteínas, tales como L-alfa-aminoácidos o sus D-isómeros, pero pueden incluir también aminoácidos no naturales, tales como miméticos de aminoácidos, por ejemplo D o L-naftilalanina; D o L-fenilglicina; D o L-2tieneilalanina; D o L-1, -2, 3-, o 4-pireneilalanina; D o L-3 tieneilalanina; D o L-(2-piridinil)-alanina; D o L-(3-pirindinil)alanina; D o L-(2-pirazinil)-alanina; D o L-(4-isopropil)-fenilglicina; D-(trifluorometil)-fenilglicina; D-(trifluorometil)fenilalanina; D-rho-fluorofenilalanina; D o L-rho-bifenil-fenilalanina; D o L-rho-metoxibifenilfenilalanina; D o L-2indol(alquil)alaninas; y D o L-alquilalaninas, en los que el grupo alquilo puede ser un metilo, etilo, propilo, hexilo, butilo, pentilo, isopropilo, isobutilo, secisotilo, isopentilo sustituido o no sustituido o un aminoácido no ácido. Los anillos aromáticos de un aminoácido no natural incluyen, por ejemplo, anillos aromáticos de tiazolilo, tiofenilo, pirazolilo, bencimidazolilo, naftilo, furanilo, pirrolilo y piridilo. La estabilidad de los hexapéptidos puede ensayarse de varias maneras. Por ejemplo, se han usado peptidasas y diversos medios biológicos, tales como plasma y suero,
55 para ensayar la estabilidad. Véase, por ejemplo, Verhoef, et al., Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinetics 11: 291 (1986). La semivida de los péptidos puede determinarse convenientemente usando un ensayo de suero 25 % (v/v) típico.
Se reconocerá por los expertos en la materia, que los hexapéptidos de la invención una vez seleccionados pueden modificarse para contener sustituciones de aminoácidos funcionalmente equivalentes y conservan aún las mismas o similares características antifúngicas o antibacterianas. La importancia del índice hidropático de aminoácidos para conferir función biológica en una proteína se ha analizado generalmente por Kyte y Doolittle (1982). Se ha descubierto por estos investigadores y otros que ciertos aminoácidos pueden sustituir a otros aminoácidos que tienen una puntación o índice hidropático similar y conservar aún actividad biológica similar si no idéntica. Como se 65 presenta en la Tabla 2 a continuación, se asigna a los aminoácidos un índice hidropático basándose en sus características de carga e hidrofobicidad. Se cree que el carácter relativo hidropático de los aminoácidos determina
la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con la molécula sustrato. De forma similar, en péptidos cuya estructura secundaria no es un aspecto principal de la interacción del péptido, la posición dentro del péptido y la característica del resto aminoacídico determinan las interacciones que el péptido tiene en un sistema biológico. Se propone que la equivalencia funcional biológica puede mantenerse típicamente cuando los aminoácidos que tienen una diferencia no mayor de +/-1 a 2 en el valor de índice, y más preferiblemente dentro de una diferencia +/-1, se intercambian.
TABLA 2.
�?NDICE HIDROP�?TICO DE AMINO�?CIDOS
Isoleucina 4,5 Valina 4,2
Leucina 3,8 Fenilalanina 2,8 Cisteína/Cistina 2,5
Metionina 1,9 Alanina 1,8 Glicina -0,4
Treonina -0,7
Triptófano -0,9 Serina -0,8 Tirosina -1,3
Prolina -1,6 Histidina -3,2 �?cido Glutámico -3,5 Glutamina -3,5 �?cido Aspártico -3,5
Asparagina -3,5 Lisina -3,9 Arginina -4,5
10 Por lo tanto, por ejemplo, isoleucina, que tiene un índice hidropático de +4,5, puede sustituir a valina (+4,2) o leucina (+3,8) y aún producir una proteína que tenga actividad biológica similar. Como alternativa, en el otro extremo de la escala, lisina (-3,9) puede sustituir a arginina (-4,5) y así sucesivamente.
En consecuencia, estas sustituciones de aminoácidos se basan generalmente en la similitud relativa de
15 sustituyentes del grupo R, por ejemplo, con respecto a tamaño, carácter electrófilo, carga y similares. En general, aunque estas no son las únicas sustituciones tales, las sustituciones preferidas que toman diversas de las características anteriores en consideración incluyen las siguientes:
TABLA 3
Resto Original Sustituciones de Restos Ejemplares Alanina gly; ser Arginina lys Asparagina gln; his Aspartato glu Cisteína ser Glutamato asp Glutamina asn Glicina ala
Histidina asn; gln Isoleucina leu; val Leucina ile; val Lisina arg; gln; glu
Metionina met; leu; tyr Serina thr
Treonina ser Triptófano tyr Tirosina trp; phe Valina ile; leu
A. Estabilización de Modificaciones Peptídicas
Puede realizarse una diversidad de modificaciones a los hexapéptidos siempre que se conserve la actividad
5 antimicrobiana deseada. Pueden usarse algunas modificaciones para aumentar la potencia antimicrobiana intrínseca del hexapéptido. Otras modificaciones pueden facilitar el manejo del hexapéptido. Los grupos funcionales peptídicos que pueden típicamente modificarse incluyen hidroxilo, amino, guanidinio, carboxilo, amida, fenol, anillos de imidazol
o sulfhidrilo. Las reacción típicas de estos grupos incluyen pero sin limitación acetilación de grupos hidroxilo por
alquil haluros. Los grupos carboxilo pueden esterificarse, amidarse o reducirse a alcoholes. Las carbodiimidas u 10 otros catalizadores pueden usarse para catalizar la amidación de grupos carboxilo. Los grupos amida de asparagina
o glutamina pueden desamidarse en condiciones básicas o ácidas. Las reacciones de acilación, alquilación, arilación
o amidación se producen fácilmente con grupos amino tales como el grupo amino primario del péptido o el grupo amino de restos de lisina. El grupo fenólico de tirosina puede halogenarse o nitrarse. Los ejemplos en los que la solubilidad de un péptido podría reducirse incluyen acilar restos de lisina cargados o acetilar los grupos carboxilo de
15 ácidos aspártico y glutámico.
Los hexapéptidos pueden conjugarse con moléculas vehículo solubles o insolubles para modificar sus propiedades de solubilidad según se necesite y para aumentar las concentraciones locales de hexapéptidos en sus áreas diana. Las composiciones de hexapéptidos de la invención también pueden inyectarse en el sistema vascular de una 20 planta. Los ejemplos de moléculas vehículo solubles incluyen polímeros de polietilenglicol y polivinil pirrolidona. Los ejemplos de polímeros insolubles incluyen arena u otros silicatos o poliestireno, celulosa o similares. Los hexapéptidos también pueden microencapsularse para potenciar su estabilidad durante la aplicación a semilla, suelo
o planta. La aplicación en planta puede ser especialmente útil para el tratamiento de diversas enfermedades fúngicas de la planta. Los patógenos fúngicos de planta típicos incluyen ejemplos tales como los patógenos de trigo
25 Stagonospora nodorum y Septoria tritici, y patógenos hemibiotróficos tales como las especies de Colletotrichum y en particular el patógeno de antracnosa de las judías C. lindemuthianum. Otros patógenos fúngicos vegetales habituales incluyen tales como Mycosphaerella brassicicola, Pyresiopeziza brassicae, Peroizospora destructor, y Botrytis squamosa. Típicamente, se usan microesferas de poliéster para encapsular y estabilizar los péptidos.
30 B. Síntesis Peptídica a Gran Escala
La síntesis peptídica a gran escala (hasta 60 kg) en solución o fase sólida se conseguirá una vez que se han seleccionado composiciones peptídicas particulares para usarse en masa. Esta síntesis requiere una selección cuidadosa de grupos protectores y métodos de condensación. Todos los materiales y reactivos de partida pueden 35 obtenerse con buena pureza de proveedores químicos tales como Sigma-Aldrich, Inc. Adicionalmente, pueden obtenerse aminoácidos de proveedores tales como Bachem o Novabiochem®. La racemización de componentes básicos de aminoácidos en condiciones de acoplamiento pueden suprimirse o eliminarse en gran medida mediante el uso de reactivos de nueva generación, es decir HOBt, HOAt, HBTU o HATU. Incluso la metodología de fase sólida está en la actualidad desarrollada de forma adecuada para fabricar péptidos farmacéuticos en múltiplos de al menos
40 10 kg/lote.
C. Síntesis a Gran Escala de Péptidos En Solución
La síntesis de fases de solución permite la planificación sencilla con respecto a estrategia de protección de grupos,
45 selección de fragmentos y métodos de acoplamiento de fragmentos para minimizar la racemización. Los intermedios pueden en ocasiones aislarse simplemente mediante técnicas de cristalización, que pueden eliminar la necesidad de purificación por cromatografía de columna y por lo tanto mejorar el potencial de cambio de escala. La calidad de los fragmentos producidos de forma simultánea puede controlarse fácilmente en cada etapa.
50 D. Síntesis de Fase Sólida a Gran Escala de Péptidos
El coste de los polímeros más avanzados para síntesis de fase sólida es habitualmente alto. Algunos de los soportes no están disponibles a granel. Sin embargo, sus propiedades desempeñan un papel importante en la accesibilidad de péptido anclado y liberación del péptido de la resina en una forma completamente protegida, desprotegida o
55 modificada. La transición de laboratorio a escala de fabricación de síntesis de péptidos de fase sólida (SPPS) es claramente ventajosa debido al hecho de que el proceso sintético completo podría fácilmente automatizarse y la eficacia de las etapas sintéticas podría controlarse y optimizarse. Los procesos de activación de escala de producción se conocen bien y son inocuos para el medio ambiente. Además, SPPS permite la recuperación directa y reciclaje del exceso de componentes básicos de aminoácidos de los filtrados de residuos a escala de producción.
60 Las siguientes referencias se incorporan específicamente por referencia en este documento: Boris Group, "Production of large-scale peptides in solution." Biochem. Soc. Trans., 18(6), 1299-306; Christian Birr, "The transition to solid-phase production of pharmaceutical peptides." Biochem. Soc. Trans., 18(6), 1313-16; y Paul Lloyd-Williams, Fernando Albericio y Ernest Giralt, "Convergent solid-phase peptide synthesis." Tetrahedron 49(48), 11065-11133.
5 Cuando se van a intentar síntesis a gran escala de las composiciones peptídicas de la invención, deberían seguirse los métodos y materiales enumerados en estas referencias.
Por supuesto, cuando se ha determinado que un péptido de L-aminoácidos es suficientemente inhibidor (con o sin estabilización), puede ser posible usar expresión de ADN recombinante de acuerdo con técnicas bien conocidas por los expertos en la materia para producir tales péptidos en cantidades a gran escala. Cuando se producen péptidos recombinantes y cuando se desea estabilidad de tales péptidos, el péptido puede protegerse de ataque en cada extremo ligando covalentemente D-aminoácidos a uno, el otro o ambos extremos usando técnicas conocidas por los expertos en la materia de química peptídica.
15 E. Encapsulación en Microesferas de los Péptidos
Pueden usarse diversos métodos de preparación de microesferas dependiendo de la naturaleza hidrófila o hidrófoba de la composición peptídica a encapsular. Wang, H. T., et al. 1991, "Influence of formulation methods on the in vitro controlled release of protein from poly(ester) microspheres," J. of Controlled Release 17: 23-25 se incorpora específicamente en este documento en la medida en que proporciona métodos y materiales no abordados en este documento.
(1) Método de emulsión de aceite/aceite. Se usará un ensamblaje de titulación TTA-60 (Radiometer, Copenhague, Dinamarca) en este método para agitación eficaz. Se disolverá poli(DL-lactida/glicolida, 50:50, Dupont) (0,5 g) en
25 cloruro de metileno (3,3 ml). Después pueden dispersarse péptidos secados por pulverización (25 mg) en esta solución aplicando sonicación durante 30 segundos en un limpiador de ultrasonidos (Branson 3200, Branson Cleaning Company, Shelton, Conn.). Esta suspensión puede pasarse en gotas a través de una jeringa con una aguja de calibre 220 a una emulsión bien agitada que contiene aceite de silicona (20-30 ml), CH.sub.2 Cl.sub.2 (30-40 ml) y Span 85 (2 ml). Puede después añadirse en gotas éter de petróleo (30 ml) a la dispersión anterior. La agitación puede continuarse después durante 2 horas. Las microesferas producidas de esta manera se filtrarán después, se lavarán con éter de petróleo y se secarán en un vacío durante 72 horas.
(2) Método de emulsión de aceite/agua. Se emulsionará una suspensión a la que se han aplicado ultrasonidos de péptido secado por pulverización (25 mg), poli(DL-lactida/glicolida, 50:50) (Dupont o Birmingham Polymers) (0,5 g) y
35 CH.sub.2 CL.sub.2 (2 ml) con una solución acuosa (50 ml) que contiene oleato sódico (0,2 g) en un ensamblaje de titulación TTA-60 durante 5 minutos. El cloruro de metileno se retirará con un evaporador rotatorio (120 rpm) a 47,88 KPa (1 hora a 22 ºC), 21,28 KPa (0,5 horas a 22 ºC) y 21,28 KPa y 40 ºC (1h). Las microesferas obtenidas se filtrarán, se lavarán con agua y se secarán en vacío a temperatura ambiente.
(3) Método de emulsión de (agua/aceite)/agua. Se emulsionará una solución de péptido (2,6 mg) en agua destilada (100 ml) con solución de cloruro de metileno (0,5 g/2 ml) de poli(DL-lactida/glicolida, 50:50 Henley Chemical, RG503) a través del uso de un sonicador sonda (Branson, Danbury, Conn.) a 125 W y coeficiente de utilización 40 %, modo por pulsos. Esta emulsión (agua/aceite) se emulsionará en una solución acuosa (50 ml, 35 ºC.) que contiene alcohol polivinílico 0,1 % con un homogeneizador (5000 rpm, ESGE Handmixer M122, Biospec Products, Bartlesville, Okla.)
45 durante 5 minutos. El cloruro de metileno se retirará de la emulsión resultante (agua/aceite)/agua en un evaporador rotatorio a 39,90 KPa y 34 ºC (120 rpm) durante 1 hora. Las microesferas obtenidas se filtrarán, lavarán con agua y se secarán al vacío a temperatura ambiente o se liofilizarán (Consol 4.5, Virtis Co., Gardiner, N. Y.).
Los pesos moleculares del polímero pueden determinarse por cromatografía de exclusión molecular. Los tamaños de partículas de las microesferas pueden determinarse por microscopía electrónica de barrido (SEM, Hitachi S-570, Tokio, Japón).
También pueden realizarse estudios de liberación de péptidos in vitro. Las microesferas (200 mg) se suspenderán en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (2,5 ml) pH 7,2 y se agitarán a 37 ºC y 100 rpm en un agitador de
55 incubador ambiental (G-24, New Brunswick Scientific Co., Edison, N. J.). En tiempos de toma de muestras específicos (cada día durante los primeros 4 días y cada dos días durante el resto del estudio) la solución de tampón se retirará completamente y se reemplazará con PBS nuevo. El contenido peptídico del PBS se medirá usando el método de Bradford u otro ensayo cuantitativo adecuado.
Se conocen otros métodos de microencapsulación que pueden hallar utilidad en ciertos casos. Véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4.324.683.
II. Métodos de Uso
65 Una realización adicional de la invención se refiere a métodos para usar los hexapéptidos descritos anteriormente. Los métodos de uso preferiblemente no provocan lesión o matan a células de mamífero no infectadas normales. Los métodos de uso a niveles de dosis terapéuticos preferiblemente no provocan lesión ni matan células de mamífero no infectadas normales. Los métodos de uso pueden implicar el uso de un hexapéptido sencillo o pueden implicar el uso de múltiples hexapéptidos.
5 Para los fines de la presente invención, “principio activo” se refiere al hexapéptido con la capacidad para inhibir el crecimiento de microorganismos diana. Los microorganismos diana incluyen pero sin limitación patógenos de animales y del hombre, tales como los que provocan infecciones de levadura y diversas infecciones cutáneas tales como pie de atleta y otras afecciones dermatofíticas. El microorganismo diana también puede incluir los hongos que provocan podredumbre de la raíz, corrido de la flor, infecciones sistémicas, enfermedades vasculares e infecciones
10 de ciertas áreas superficiales de las plantas.
A. Enfermedades Fúngicas Animales (Pythium, Candida)
Se anticipa que la presente invención también hallará uso en el tratamiento de diversas infecciones de mamíferos.
15 La Tabla 4 a continuación muestra una diversidad de enfermedades fúngicas de mamíferos incluyendo animales y hombres aptas para las composiciones y métodos de la presente invención. Se proporciona una composición farmacéutica útil para tratar infecciones bacterianas y/o fúngicas por la presente invención. Esta composición farmacéutica comprende una cantidad eficaz del agente antimicrobiano y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Ciertos de los organismos enfermos enumerados en este documento se ensayaron con las composiciones de
20 hexapéptidos detalladas en este documento. Se conocen en la técnica y se describen en la Farmacopea de los Estados Unidos y el Formulario Nacional vehículos farmacéuticamente aceptables en los que pueden suministrarse los hexapéptidos de la invención.
TABLA 4
HONGO DIANA
Sistémico:
Blastomyces dermatitidis hombre, perros
Coccidioides immitis hombre, perro, vaca, caballo, gato, ovejas, roedores (se han realizado varios intentos de una vacuna)
Histophasma capsulatum hombre, perro, gato, caballo
Pythium spp. perros, caballos
Zygomycetes spp. cerdos, cabras, vacas, ciervos, caballos, perros, gatos
Rhinosporidum seeberg perros, caballos, hombre
Sporothrix schenckii gato, perro, caballo, hombre
Dermatocitos:
Microsporum canis gato, perro, caballo, hombre
Microsporum distortum perro
Microsporum gypseum mamíferos
Microsporum nanum cerdos
Trichophyton mentagrophytes perro, gato, vaca, caballo, hombre
Trichophyton equinum caballo
Trichophyton verrucosum vaca, hombre (existe una vacuna en Europa)
Trichophyton gallinae Aves
************************* Incidencia de Infecciones Nosocomiales Fúngicas Sistémicas Humanas (casos por año)
Candida spp. 202.000 (Especies enumeradas en frecuencia descendiente de causalidad de infección)
albicans topicalis parapsilosis krusei pseudotropicalis stellatoidea guilliermondii lusitaniae rugosa Aspergillus spp. 43.000
Torulopsis glabrata 18.000
Zygomycetes 7.000
Dependiendo de la aplicación específica contemplada, la composición farmacéutica proporcionada por la invención objeto puede formularse como una solución, suspensión, preparación parenteral, pomada, crema, loción, pulverización, polvo o cápsula comprimida. Las preparaciones parenterales pueden incluir un vehículo tal como agua
5 sin pirógenos especialmente destilada, tampón fosfato o solución salina normal. Las pomadas, cremas, lociones y pulverizaciones pueden incluir un vehículo tal como aceite vegetal o mineral, vaselina blanca o un alcohol de alto peso molecular, es decir, mayor de C12. Las cápsulas o comprimidos pueden incluir diluyentes (por ejemplo, lactosa), aglutinantes, lubricantes (por ejemplo, ácido esteárico) y un disgregante (por ejemplo, almidón de maíz).
10 También se proporciona un método para tratar a un sujeto que tenga una infección fúngica que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz para muerte bacteriana o fúngica de la composición farmacéutica de la presente invención. Los modos de administración se reconocen bien en la técnica para tratamiento o prevención de infecciones bacterianas o fúngicas de la mucosa. Pueden situarse cremas, supositorios o soluciones que contengan el principio activo en contacto con el área infectada. Cuando la infección es externa, puede masajearse una crema
15 en el área infectada y circundante dos veces al día hasta después de que la infección se haya erradicado. Cuando se requiera uso intravaginal, deberían inyectarse aproximadamente 5 gramos de la crema en la parte alta de la bóveda vaginal usando un aplicador convencional. Este tratamiento debería repetirse dos veces al día hasta que se haya erradicado la infección. Como alternativa, pueden insertarse óvulos vaginales en la parte alta de la bóveda vaginal una o dos veces al día y el tratamiento puede continuarse hasta que la infección se haya erradicado.
20 Puede ser deseable formular una pasta adhesiva dental convencional que contenga una cantidad eficaz del hexapéptido de la invención o combinaciones del mismo. Las concentraciones típicas variarán de 0,0125 % a 1,5 % en peso de agente antimicrobiano por 100 gramos de pasta. Se aplican aproximadamente 2 gramos de pasta de una manera convencional a la superficie de contacto de la dentadura antes de su inserción en la boca. Dicha aplicación
25 debe realizarse después de empapado durante una noche en el limpiador de dentadura. Los limpiadores de dentadura pueden formularse mediante la adición de una cantidad eficaz del agente antimicrobiano con un comprimido de aproximadamente 3 a 3,5 gramos. Dicho comprimido se disuelve en agua produciendo una solución antimicrobiana para limpiar dentaduras. En el modo preferido de uso, la dentadura después de la retirada de la boca del paciente, se empapa en este limpiador durante aproximadamente 8 a aproximadamente 12 horas. Si se desea,
30 en lugar de utilizar un cemento de dentadura, puede formularse también un polvo adhesivo de dentadura con los agentes antimicrobianos de la presente invención.
También puede formularse una pulverización bucal que contenga una cantidad eficaz del agente activo con uno o más hexapéptidos de la presente invención. Este material puede pulverizarse como un agente antimicrobiano en
35 alícuotas de 0,25 a 0,5 ml sobre las superficies del diente y la encía de cada cuadrante entre 1 y 3 veces al día. En el caso de personas que usan dentadura postiza, la pulverización puede utilizarse directamente sobre la superficie de la dentadura antes de la inserción diaria de la dentadura postiza. Si se desea, puede proporcionarse una formulación de enjuague bucal que contenga una cantidad eficaz del agente antimicrobiano.
40 Los agentes antimicrobianos pueden emplearse en cantidades eficaces e incluir dosis en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 mg por kilogramo de peso del hospedador, cuando se administran de forma sistémica. Pueden formularse agentes activos en solución salina tamponada con fosfato. También se conocen inhalantes de pulverización de aerosol mediante los que pueden introducirse composiciones de hexapéptidos antimicrobianos de la invención. Pueden encontrarse métodos ejemplares para preparar péptidos antimicrobianos
45 como composiciones farmacéuticas en la Patente de Estados Unidos Nº 5.126.257, incorporada en este documento por referencia en su totalidad.
Una realización de la invención es el uso de uno o más de los hexapéptidos de la invención para inhibir o matar células microbianas (microorganismos). Los microorganismos pueden ser células bacterianas, células fúngicas, 50 protozoos, virus o células eucariotas infectadas con microorganismos patogénicos. El método generalmente se refiere al contacto de microorganismos con uno o más hexapéptidos de la presente invención. La etapa de contacto puede realizarse in vivo, in vitro, por vía tópica, vía oral, vía transdérmica, vía sistémica o por cualquier otro método conocido por los expertos en la materia. La etapa de contacto se realiza preferiblemente a una concentración suficiente para inhibir o matar los microorganismos. La concentración del hexapéptido puede ser al menos 55 aproximadamente 0,1 μM, al menos aproximadamente 0,5 μM, al menos aproximadamente 1 μM, al menos aproximadamente 10 μM, al menos aproximadamente 20 μM, al menos aproximadamente 50 μM o al menos aproximadamente 100 μM. Los métodos de uso pueden dirigirse a la inhibición o muerte de microorganismos tales como bacterias, bacterias gram positivas, bacterias gram negativas, microbacterias, levaduras, hongos, algas, protozoos, virus y organismos intracelulares. Los ejemplos específicos incluyen, pero sin limitación, Staphylococcus, 60 Staphylococcus aureus, Pseudomonas, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Chlamydia, Candida albicans, Saccharomyces, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Trypanosoma cruzi, o Plasmodium falciparum. La etapa de contacto puede realizarse por inyección sistémica, inyección oral, subcutánea, IP, IM, IV o
por aplicación tópica. Para inyección, la dosificación puede estar entre cualquiera de las siguientes concentraciones: aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 75 mg/kg y aproximadamente 100 mg/kg. La etapa de contacto puede realizarse en un mamífero, un gato, un perro, una vaca, un caballo, un cerdo, un pájaro, un pollo, una planta,
5 un pez o un ser humano.
Los hexapéptidos preferidos actualmente para aplicaciones antibacterianas incluyen SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 55, SEC ID Nº: 70; SEC ID Nº: 72, SEC ID Nº: 79 y SEC ID Nº: 80.
10 Los hexapéptidos preferidos actualmente para aplicaciones antifúngicas incluyen SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 55, SEC ID Nº: 70; SEC ID Nº: 72, SEC ID Nº: 79 y SEC ID Nº: 80.
Los hexapéptidos preferidos actualmente para aplicaciones antibacterianas y antifúngicas incluyen SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 55, SEC ID Nº: 70; SEC ID Nº: 72, SEC ID Nº: 79 y SEC ID Nº: 80.
B. Sinergia de Hexapéptidos con Antifúngicos o Antibacterianos
Una realización adicional de la invención se refiere a métodos para la potenciación aditiva o sinérgica de la actividad de un agente terapéutico. El método puede comprender preparar una composición, comprendiendo la composición 20 al menos un hexapéptido de la presente invención y un agente terapéutico (por ejemplo un antibiótico tal como penicilina). Como alternativa, el método puede comprender tratamiento conjunto a la terapia con un hexapéptido (o una combinación de hexapéptidos) usado junto con otros agentes terapéuticos. El hexapéptido o combinación de hexapéptidos puede ser cualquiera de los hexapéptidos enumerados en la Tabla 1. Preferiblemente el método comprende administrar al menos uno de los hexapéptidos de SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº:
25 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 55, SEC ID Nº: 56, SEC ID Nº: 62, SEC ID Nº: 63, SEC ID Nº: 69, SEC ID Nº: 70, SEC ID Nº: 72, SEC ID Nº: 77, SEC ID Nº: 78, SEC ID Nº: 79, SEC ID Nº: 80, SEC ID Nº: 81, SEC ID Nº: 83, y SEC ID Nº: 84.
Por ejemplo, SEC ID Nº: 55 (S35-2) muestra sinergia con el agente terapéutico clotrimazol contra cepas resistentes
30 a azol de cepas de C. albicans, como se describe en los siguientes experimentos. El índice de concentración inhibidora fraccional (FIC) se usó para determinar la sinergia entre agentes antimicrobianos. Se determinaron MIC de los péptidos contra microorganismos de ensayo tres veces en ocasiones separadas. Se ensayaron diluciones seriadas dos veces de ácido nalidíxico o cloranfenicol en presencia de una cantidad constante de péptido, igual a un cuarto de la MIC del péptido. El índice de FIC se calculó como sigue: FIC = 0,25 + MIC (antibiótico en la
35 combinación)/MIC (antibiótico solo), en el que 0,25 es la relación de la MIC del péptido en combinación con la MIC del péptido por sí solo. Se considera que un índice de FIC de menos de 0,5 demuestra sinergia.
TABLA 5
Sinergia de SEC ID Nº: 55 (S35-2) Con Azoles Contra C. albicans, FIC<0,5 Indica Efectos Sinérgicos
Cepa
MIC-SEC ID Nº: 55 MlC-clotrimazol MIC-SEC ID Nº: 55+azol �?ndice de FIC
Nº 185 (CDR1,2)
32 128 16/12,5 0,598
Nº 186 CDR1,2
16 32 2/12,5 0,515
Nº 187 CDR1,2
32 >256 4/25 0,223
Nº 192 CDR1,2,
32 128 4/50 0,515
Nº 196 CDR1,2
32 64 4/50 0,905
Nº 199 CDR1,2
32 64 4/25 0,515
40 Todas las cepas son aislados clínicos resistentes a azol del Profesor Ted White (Seattle Biotechnology Research Institute, Seattle)
TABLA 6
Candida de T.W.
Ketoconazol Clotrimazol Miconazol S35-2 SEC ID Nº: 55 S35-3 SEC ID Nº: 56
Nº 184
64 >256 >256 32 128
Nº 185
8 128 >256 32 128
Nº 186
8 32 >256 16 128
Nº 187
16 >256 >256 32 128
Nº 192
32 128 >256 32 128
Nº 193
8 0.5 >256 32 128
Nº 194
16 >256 >256 32 >128
Nº 195
128 256 >256 64 128
Nº 196
32 64 128 32 128
Nº 197
>256 >256 >256 32 >128
Nº 198
1 >256 128 16 128
Nº 199
16 64 >256 32 128
En otro ejemplo más, SEC ID Nº: 55 (S35-2) muestra sinergia con un agente terapéutico polimixina B (PXB) contra bacterias resistentes a fármacos tales como P. aeruginosa tales como las descritas en la Tabla 7. La Tabla 7 demuestra el potencial de los hexapéptidos para promover la actividad bactericida de antibióticos convencionales tales como polimixina B (PXB) contra bacterias resistentes a fármacos tales como P. aeruginosa. Como se ha demostrado, SEC ID Nº: 55 (S35-2) presentó actividad sinérgica (indicada por un índice de FIC <0,5) en combinación con polimixina B.
TABLA 7 Sinergia de SEC ID Nº: 55 (S35-2) con polimixina B (PXB)
Cepa de P. aeruginosa MIC-1032(μg/ml) MIC-PXB (μg/ml) MIC-Nº:55 MIC-PXB-combinado FIC* combinado (μg/ml) (μg/ml)
H187 32 0,5 8 0,06 0,37 100609 64 0,5 2 0,125 0,28 H401 64 0,25 2 0,0625 0,28 M917 64 1 16 0,25 0,266
Notas:
P. aeruginosa H187-tipo silvestre
P. aeruginosa 100609-resistente a tobromicina
P. aeruginosa H401-aislado clínico mucoide
P. aeruginosa M917-aislado clínico resistente a multifármacos *FIC=(MIC-Nº: 55-combinado)/(MIC-Nº: 55)++(MIC-PXB-combinado)/(MIC-PXB) *FIC<0,5 indica sinergia
10 El agente terapéutico puede en general ser cualquier agente terapéutico y preferiblemente es un antibiótico, un agente antimicrobiano, un factor de crecimiento, un agente quimioterapéutico, un agente antimicrobiano, lisozima, un agente quelante o EDTA. Preferiblemente, la actividad de la composición es mayor que la actividad de la misma composición que contiene el agente terapéutico pero sin el hexapéptido. La composición o terapia conjunta puede
15 usarse en aplicaciones in vitro, in vivo, tópicas, orales, IV, IM, IP y transdérmicas. La potenciación de la actividad de la composición que contiene el agente terapéutico y el hexapéptido es preferiblemente al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 125 %, 150 %, 175 % o 200 % en relación con la actividad del agente terapéutico por sí solo.
20 Generalmente, cualquier hexapéptido que sea activo por sí solo contra una diana se prefiere para su uso para aumentar de forma aditiva o sinérgica la actividad de otro agente terapéutico contra esa diana. Si varios hexapéptidos son candidatos para una aplicación de sinergia dada, entonces los hexapéptidos menos tóxicos se considerarían más favorablemente.
25 Una realización adicional más de la invención se refiere a métodos para el tratamiento de pacientes diagnosticados con Fibrosis Quística, (FQ). FQ provoca, entre otros efectos, inflamación e infección en los pulmones. Los hexapéptidos descritos anteriormente de la presente invención pueden usarse en el tratamiento de tales infecciones pulmonares, que con frecuencia están causadas por Pseudomonas aeruginosa. Los hexapéptidos de la invención pueden poseer propiedades antimicrobianas útiles que los harían eficaces para tratar infecciones pulmonares en
30 pacientes con FQ. El hexapéptido o combinación de hexapéptidos podrían administrarse a un paciente con FQ por cualquier medio aceptable incluyendo inhalación o suministro sistémico. El hexapéptido o combinación de hexapéptidos podrían administrarse en una dosis sencilla, en múltiples dosis o como un suministro continuo.
Una realización adicional de la invención se refiere a métodos para tratar enfermedades de transmisión sexual
35 (ETS). Muchas de las especies fúngicas responsables de ETS probablemente se inhiben o mueren por aplicación de uno o más de los hexapéptidos de la invención de la Tabla 1. Los ejemplos de tales especies incluyen C. albicans, C. glabrata y C. tropicalis. El hexapéptido o hexapéptidos de la invención pueden adicionalmente usarse contra otros agentes responsables de ETS incluyendo virus y bacterias. El hexapéptido o hexapéptidos pueden administrarse a un paciente con ETS por cualquier método aceptable, tal como suministro tópico, oral o sistémico. El hexapéptido o hexapéptidos pueden administrarse en una dosis sencilla, en múltiples dosis o como un suministro continuo. El
5 hexapéptido o hexapéptidos pueden administrarse en cualquier forma aceptable, tal como una crema, gel o líquido. Un indicio de la probabilidad de actividad de los hexapéptidos de la presente invención en el ambiente vaginal se muestra en la Figura 2, en la que se muestra la actividad de SEC ID Nº: 55 en curvas de muerte frente a C. Albicans y S. aureus.
10 Las composiciones de la presente invención también pueden incluir un vehículo farmacéutica o dermatológicamente aceptable. Los ejemplos de vehículos incluyen emulsiones y geles. Las emulsiones con frecuencia son una mezcla de una fase oleosa y una fase acuosa. Las composiciones también pueden comprender materiales abrasivos exfoliantes. Las composiciones también pueden comprender un estabilizador. Las composiciones también pueden comprender un compuesto de control de la espuma.
15 Las composiciones también pueden incluir uno o más componentes activos de cuidado de la piel adicionales. Los ejemplos de componentes activos de cuidado de la piel incluyen sustancias activas desescamantes, sustancias activas antiacné, compuestos de vitamina B3, retinoides (incluyendo retinol, retinal, ésteres de retinol, retinil propionato, ácido retinoico y retinil palmitato), hidroxiácidos, eliminadores de radicales, quelantes, agentes
20 antiinflamatorios, agentes anestésicos tópicos, sustancias activas de bronceado, agentes de aclaramiento de la piel, agentes anticelulíticos, flavonoides, sustancias activas antimicrobianas, agentes de curación de la piel, sustancias activas antifúngicas, farnesol, fitantriol, alantoina, ácido salicílico, niacinamida, dexpantenol, acetato de tocoferol y glucosamina.
25 Las composiciones también pueden incluir compuestos de filtro solar. Los ejemplos de compuestos de filtro solar incluyen compuestos de filtro solar inorgánicos y compuestos de filtro solar orgánicos. Los compuestos de filtro solar inorgánicos pueden incluir óxidos metálicos tales como óxido de cinc, óxido de titano y óxido de hierro. Los compuestos de filtro solar orgánicos pueden incluir octilmetoxicinamato, octil salicilato, ácido tereftaliden dicanfor sulfónico, avobenzona y octocrileno.
30 Una realización adicional de la invención se refiere al uso de uno o más de los hexapéptidos de la Tabla 1 en la promoción de la curación de heridas. En ciertas realizaciones, el hexapéptido tiene una alta potencia contra microorganismos incluyendo bacterias más frecuentemente asociadas con infecciones de heridas: S. aureus, S. pyogenes y P. aeruginosa. Ciertos hexapéptidos también promueven la curación de heridas y reducción de la
35 inflamación. El hexapéptido o hexapéptidos pueden administrarse en cualquier forma aceptable, tal como una crema, gel o líquido. El hexapéptido o hexapéptidos pueden administrarse de cualquier manera aceptable, tal como administración tópica o administración sistémica.
C. Cepas Microbianas
40 La siguiente tabla enumera los diversos microorganismos usados a lo largo de los Ejemplos.
TABLA 8
Microorganismo
Referencia o fuente
Escherichia coli UB1005
D. Clark, FEMS Microb. Lett. 21:189-195, 1984
Salmonella typhimurium 14028S
Fields et al., Science 243:1059-1062, 1989
Staphylococcus aureus SAP0017
Aislado clínico resistente a meticilina del Profesor T. Chow, hospital General de Vancouver
Pseudomonas aeruginosa H187
Angus, et al, AAC 21:299-309, 1982
Candida albicans 105
De la Profesora Barbara Dill (UBC)
Pseudomonas aeruginosa 100609
resistente a tobramicina Universidad de Calgary
Pseudomonas aeruginosa H401
aislado clínico mucoide Universidad de Columbia Británica
Pseudomonas aeruginosa M917
aislado clínico resistente a multifármaco Universidad de Columbia Británica
D. Actividad Antimicrobiana
Las MIC (concentraciones inhibidores mínimas) se determinaron para los hexapéptidos de interés usando una versión ligeramente modificada del método de microdilución de caldo de cultivo de NCCLS (National Committee for 5 Clinical Laboratory Standards) como se ha descrito previamente (Steinberg et al., AAC 41: 1738, 1997). Brevemente, se prepararon agentes antimicrobianos como concentrados 10X en el disolvente más apropiado. Para el hexapéptido, se usó ácido acético 0,01 % que contenía albúmina de suero bovino 0,2 % como una proteína vehículo. Se prepararon inóculos resuspendiendo colonias de una BAP (por favor deletree este término) en medio y ajustando a la suspensión para adecuarse a la de un patrón McFarland 0,5, La suspensión se diluyó en medio nuevo
10 (como se recomienda por NCCLS para el organismo) para proporcionar 2 X 105 a 7 X 105 UFC/ml para bacterias o 2 X 103 a 7 x 103 UFC/ml para Candida. Después de distribuir alícuotas de 100 μl de la suspensión microbiana a cada pocillo de una placa de microtitulación de polipropileno de 96 pocillos, se añadieron 11 μl de compuesto de ensayo. La MIC se definió como la concentración más baja de fármaco que evitaba la turbidez visible después de 16 a 20 horas (bacterias) o 46 a 50 horas (Candida) a 35 ºC.
15 En la Tabla 9, la MIC de hexapéptidos seleccionados contra un panel extendido de S. aureus muestra su actividad eficaz contra cepas clínicas particularmente difíciles.
TABLA 9
MIC De Hexapéptidos Contra Panel Extendido De S. aureus
Cepa bacteriana
Péptido
Nº 82 Nº 84 Nº 86 Nº 88 Nº 89 Nº 92 Nº 93 Nº 13 Nº 12
P1032 SEC ID Nº: 55
32 32 8 32 16 16 16 16 8
P1033 SEC ID Nº: 56
32 32 4 16 16 16 16 32 8
P1037 SEC ID Nº: 60
32 32 >128 16 16 8 16 16 8
P1041
16 32 8 16 16 8 16 16 nd
P1081
16 16 8 16 8 8 8 nd nd
P1087 SEC ID Nº: 63
16 16 2 16 8 4 8 8 4
nd – no determinado/no ensayado Clave de cepas bacterianas: Nº 82: S. aureus, aislado de quemadura Nº 84: MRSA Nº 86: S. ep/cterm/cfeATCC12228 Nº 88: S. aureus, aislado de esputo Nº 89: S. aureus ATCC29213 Nº 92: S. aureus, resistente a trimetoporina Nº 93: S. aureus, aislado clínico Nº 13: S. aureus SAP0017, MRSA Nº 12: S. aureus ATCC25923
20
TABLA 10
Concentraciones Inhibidoras Mínimas (Mic) /mg/ml
SEC ID Nº:
Nº de P Secuencia(N-C) P. aeruginosa cepa S. aureus cepa C. albicans cepa 105
H187
SAP 0017
1
P0666 KFKWPW-NH2 32 16 32
2
P0665 ICWRWPW-NH2 128 64 64
3
P0736 KWKWFW-NH2 128 32-64 64-64
4
P0735 RWRWPW-NH2 >128 64 64-128
5*
P0633 RWRWRW-NH2 128 32 64
6
P0734 KFKWFW-NH2 128 64 64
7
P0737 RFKWFW-NH2 128 64-128 64-1281
8*
P0634 RRRWWW-NH2 >128 >128 >128
9*
P0635 KFKFKF-NH2 128 128 128
10*
P0636 KYKYKY-NH2 >128 >128 >128
11*
P0637 FKFKFK-NH2 128 64 64
12* P0661 FKFKPV-NH2 >128 >128 >128 13* P0662 VKVKPV-NH2 >128 >128 >128 14* P0663 FALKKL-NH2 >128 >128 >128 15* P0664 RKTWPW-NH2 >128 >128 >128 16* P0667 FKLAPW-NH2 >128 >128 >128 17* P0668 KWKKPV-NH2 >128 >128 >128 18* P0669 FRHFRW-NH2 >128 >128 >128 19* P0670 VAKLAK-NH2 >128 >128 >128 20* P0671 FAKLAK-NH2 >128 >128 >128 21* P0672 KFKSFK-NH2 >128 >128 >128 22* P0673 KWKKLA-NH2 >128 >128 >128 23* P0699 KWKFKF-NH2 >128 >128 128 24* P0700 KWKVFK-NH2 >128 >128 >128 25* P0701 VAKKWK-NH2 >128 >128 >128 26* P0671 FAKLAK-NH2 >128 >128 >128 27* P0712 KLAKLL-NH2 >128 >128 >128 28* P0713 LAKLAK-NH2 >128 >128 >128 29* P0714 KPWKFK-NH2 >128 >128 >128 30* P0715 KPVWPW-NH2 >128 >128 >128 31* P0716 KPVKFK-NH2 >128 >128 >128 32* P0717 KFVWPW-NH2 >128 >128 >128 33* P0718 LLKWPW-NH2 >128 >128 >128 34* P0719 FPWKFK-NH2 >128 >128 >128 35* P0720 KPVWPF-NH2 >128 >128 >128 36* P0721 KFFWPF-NH2 >128 >128 >128 37* P0738 KAKFPF-NH2 >128 >128 >128 38* P0739 KFKPFW-NH2 >128 >128 >128 39* P1030 KUKWPW-NH2 128 64 32 40* P1013 KFKLPW-NH2 >128 >128 >128 41 P1014 KFKWPW-COOH >128 >128 >128 42 P1016 KWKWPW-COOH >128 >128 >128 43 P1017 KWKWFW-COOH >128 >128 >128 44 P1018 KFKWFW-COOH >128 >128 >128 45* P1020 FAKWPW-COOH >128 >128 >128 46* P1022 VAKWPW-COOH >128 >128 >128 47 P1023 KWKWPW-NH2 >128 >128 >128 48* P1024 FAKWPW-NH2 >128 >128 >128 49* P1025 VAKWPW-NH2 >128 >128 >128 50 P1026 KWKFPF-NH2 >128 >128 >128 51* P1027 KWKWGW-NH2 >128 >128 >128 52* P1028 KLKWPW-NH2 >128 >128 >128 53* P1029 KWKLAL-NH2 >128 >128 >128 54* P1031 OCT-FALLKL-NH2 >128 >128 >128 55 P1032 OCT-KFKWPW-32 32 32
NH2
56 P1033 OCT-KWKWFW-32 4 16 NH2
57 P1034 OCT-KFKWFW->128 >128 >128 NH2
58* P1035 BALLKL-NH2 >128 >128 >128 59* P1036 KBKWPW-NH2 >128 >128 >128 60* P1037 KWKWBW-NH2 128 32 64 61* P1038 KBKWBW-NH2 >128 128 64
62
P1085 KWKWUW-NH2 16 8 64
63
P1087 KWKWZW-NH2 8 8 64
64*
P1007 KWKWLPW-NH2 128 64 128
65*
P1008 KWKWPPW-NH2 >128 >128 >128
66*
P1109 KWKWPGW-NH2 >128 >128 >128
67*
P1011 KPKWPPW-NH2 >128 >128 >128
68*
P1012 KFKWPPW-NH2 >128 >128 >128
69
P1145 Hep-KFKWPW 128 128 64
NH2
70
P1146 Non-KFKWPW 32-64 16 16
NH2
71
P1147 Cap-KFKWPW >128 128 128
NH2
72
P1148 Lau-KFKWPW-NH2 32 4-8 8
73
P1149 Pal-KFKWPW-NH2 >128 128 32
74
P1150 Ste-KFKWPW-NH2 >128 >128 128
75
P1151 Ole-KFKWPW-NH2 >128 128 128
76
P1258 Aca-KFKWPW-NH2 >128 >128 >128
77
P1273 Myr-KFKWPW-NH2 64-128 8-16 4-8
78
P1274 Pen-KFKWPW-NH2 128 32-64 8
79
P1275 Und-KFKWPW 8-16 4 4-8
NH2
80
P1276 Tri-KFKWPW-NH2 32 2-4 4
81
P1205 Oct-kflcwpw-NH2 32 32 32
82
P1206 kfkwpw-NH2 >128 >128 >128
83
P1343 Lau-kfkwpw-NH2 4 2 2
84
P1304 Oct-KFKWPw-NH2 128 64 64
85
P1345 Deca-KFKWPW- ND ND ND
NH2
*indica hexapéptidos no XBXBOB; ND – no determinado/no ensayado
SEC ID Nº: 5 (RWRWRW) y SEC ID Nº: 8 (RRRWWW) son hexapéptidos no XBXBOB descritos por Strom et al. (2003). Ambos de estos hexapéptidos mostraron menos actividad que los de la familia de hexapéptidos XBXBOB de la presente invención, tales como SEC ID Nº: 1 (P0666). Se cree que la actividad mejorada de la familia de 5 hexapéptidos XBXBOB se debe, al menos en parte, a ciertos atributos estructurales beneficiosos para la actividad antimicrobiana. Los hexapéptidos que no se ajustan a la fórmula XBXBOB, muestran poca o ninguna actividad antimicrobiana. Para actividad óptima dentro de la familia de XBXBOB, los inventores han determinado a partir de estudios de estructura y actividad, que se prefieren una F en posición dos y una P en posición cinco dentro de este modelo. Los inventores han demostrado que la estructura de F en la posición dos puede ser importante sustituyendo
10 con un aminoácido similar tal como W, que prácticamente eliminó la actividad, véanse los datos de MIC en la Tabla 9 para SEC ID Nº: 47, (P1023). La sustitución de un hexapéptido XBXBOB, que tiene una F en la posición dos, con un aminoácido no natural (tal como 1-naftil-L-alanina (indicado en este documento como “U”), es decir 1-Nal, que está más cercano en estructura a F que W), da como resultado actividad intermedia, (véanse datos en la Tabla 10 para SEC ID Nº: 39 (P1030)).
E. Unión Del Componente De Pared Celular Bacteriana �?cido Lipoteicoico
El ácido lipoteicoico (LTA) es un componente de pared celular habitual de bacterias gram positivas incluyendo organismos tales como S. aureus y P. acnes. La liberación de LTA durante la infección puede conducir a la 20 liberación de mediadores de la respuesta inflamatoria del hospedador que a su vez puede dar como resultado sepsis (choque séptico). Por ejemplo, cuando se inyecta a animales, LTA puede inducir muchos de los elementos característicos del choque séptico, incluyendo producción de citocinas, leucocitopenia, insuficiencia circulatoria, síndrome de disfunción de órganos múltiples y mortalidad. Scott et al. (Infect. And Immun. 67: 6445-6453 (1999)) demostraron que la unión de LTA por péptidos catiónicos (26-29 restos de longitud) puede reducir la capacidad de LTA para transformar células en una respuesta inflamatoria. Como se demuestra en la Figura 7, los hexapéptidos 5 pueden dividirse en dos grupos: (1) los péptidos que no se unen a LTA (SEC ID Nº: 55) y (2) los péptidos que se unen a LTA (SEC ID Nº: 72). Usando el ensayo de unión de LTA descrito por Scott et al. (Infect. And Immun. 67: 6445-6453 (1999)) puede demostrarse (Figura 7) que SEC ID Nº: 72 se une a LTA en el mismo grado que un péptido anfipático alfa-helicoidal altamente cargado típico tal como P50 (VAKKLAKLAKKLAKLAL-NH2, SEC ID Nº: 88)). Esto es inesperado para un péptido tan corto y proporciona valor terapéutico potencial para ciertos
10 hexapéptidos. Por el contrario SEC ID Nº: 83 y SEC ID Nº: 55 no se unen a LTA (Figura 7).
F. Actividad Contra P. Acnes
Una aplicación muy prometedora para péptidos bioactivos cortos es para indicaciones dermatológicas tales como
15 acné. Para determinar si la actividad de los lipohexapéptidos era uniforme a lo largo de una serie de cepas de P. acnes y si esa actividad era comparable con los péptidos antimicrobianos más largos tradicionales, se ensayaron diez cepas (cepas ATCC) del organismo contra SEC ID Nº: 72, SEC ID Nº: 55 y SEC ID Nº: 81 y se compararon con P50. Los resultados (Tabla 11) demostraron equivalencia y en algunos caso mejora frente a los péptidos altamente cargados más largos.
TABLE 11
Actividad Contra Panel Extendido De P. Acnes
Péptido ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC 6921 6922 6923 11828 12930 25746 29399 33179 49929 51277
P50 4 8 16 4 2 0,1258 16 0,2516 SEC ID ND1 1 NDND1 2 1 ND1 Nº: 72
SEC ID 4 8 8 8 8 1 16160,125 4 Nº: 55
SEC ID 4 8 8 8 2 0,258 16 0,125 8 Nº: 81
En referencia a la Figura 8, la lipidación no solamente mejora la actividad de hexapéptidos en suero sino que además mejora la actividad en un ambiente lipídico que es un mimético del ambiente de lesión de acné humana. La
25 secreción de la glándula sebácea humana, también llamada sebo, contiene escualeno, colesterol, ésteres de colesterol, ésteres de ceras, y triglicéridos en los que una población folicular grande de P. acnes parece aprovechar este ambiente e hidroliza ciertos lípidos sebáceos. El aumento prepuberal y puberal de la secreción de sebo está casi con toda seguridad implicado en la patogénesis de acné adolescente. La actividad de SEC ID Nº: 55 se estudió en este ambiente en comparación con P64, un péptido antimicrobiano catiónico tradicional. Debido al hecho de que
30 la mayoría de los lípidos son insolubles en agua se usaron liposomas compuestos de fosfatidilcolina, fosfatidilglicerol y colesterol en la relación molar de 7:2:1 en solución salina y se evaluó la cinética de muerte del péptido también en presencia o ausencia de suero. La bacteria usada fue MRSA de S. aureus y en ambas situaciones los péptidos se ensayaron a concentración de 0,5 mg/ml y se mostró que eran eficaces (Figura 8).
35 III. Estructura y Consideraciones de Actividad Antifúngica
A. Hexapéptidos XBXBOB
Los hexapéptidos que muestran actividad antifúngica se adhieren a la fórmula anterior en la que X está cargado
40 (hidrófilo), O puede ser una serie de restos, pero puede preferentemente ser una naftilalanina, un esto alifático (tal como prolina) o un resto aromático (tal como fenilalanina) y B es un resto hidrófobo. Adicionalmente, parece que la amidación en el extremo C terminal mejora la actividad y en algunos casos se requiere para actividad. Los ejemplos representativos de tales hexapéptidos son como sigue:
45 SEC ID Nº: 1: KFKWPW *** más activo SEC ID Nº: 2: KWRWPW ** activo SEC ID Nº: 3: KWKWFW* activo
Resulta evidente a partir de la relación de actividad con la estructura (SAR) que los restos cargados positivamente 50 en las posiciones 1 y 3 se requieren para actividad antimicrobiana deseada. También resulta evidente que la lisina
(K) puede ser mejor que la arginina (R) en la posición 1 y opcionalmente 3. Otras combinaciones de restos no proporcionan el mismo perfil de actividad que se describe en más detalle a continuación.
A partir de los datos presentados en la Tabla 10 anterior, puede verse que la mayoría de los hexapéptidos ensayados muestran poca o ninguna actividad antimicrobiana. Sin embargo, todos los hexapéptidos de la estructura general XBXBOB muestran algún nivel deseado de actividad antimicrobiana. Generalmente, dentro de la familia XBXBOB de hexapéptidos, existen dos subgrupos que muestran actividad deseada.
5 Resulta interesante que ciertos hexapéptidos son especialmente activos y se consideran parte del subgrupo 1 de la familia general XBXBOB. Un hexapéptido especialmente activo representativo es KFKWPW-NH2 (SEC ID Nº: 1). Resulta importante que SEC ID Nº: 1 también es eficaz y activo en suero, como se muestra en la Tabla 12 posteriormente. Para hexapéptidos dentro del subgrupo 1, la actividad se reduce cuando la posición 2 es W, por
10 ejemplo SEC ID Nº: 47 (1023), cuando la posición cinco es F; por ejemplo SEC ID Nº: 6 (0734), o cuando la posición dos está fluorada, por ejemplo SEC ID Nº: 59; o si la posición es W mientras que las posiciones cuatro y seis se cambian a F, por ejemplo SEC ID Nº: 50 (1026). Debería observarse que la letra “J” dentro de la lista de secuencias indica una fenilalanina fluorada.
15 Resulta interesante que añadir un lípido a un miembro representativo del subgrupo 1, tal como SEC ID Nº: 1, no afecta a la MIC pero aumenta significativamente la actividad en ambientes biológicos tales como suero, véase por ejemplo SEC ID Nº: 55 (1032) y Tabla 12. Todos los análogos de hexapéptidos del subgrupo 1 no XBXBOB están principalmente inactivos (véase Tabla 12 posteriormente para ejemplos específicos).
20 Otro subgrupo de la familia del hexapéptido XBXBOB, designado subgrupo 2, es ligeramente menos activo, pero muestra otros rasgos deseables; un miembro representativo de este subgrupo 2 es SEC ID Nº: 3 (KWKWFW-NH2; (0736)). La actividad de miembros del subgrupo 2 se aumenta mediante el aumento de la naturaleza aromática del resto 5 por ejemplo, SEC ID Nº: 62 y 63 se han modificado mediante la adición de 1-Nal-OH (indicado como “U” en la presente lista de secuencias) (1-naftilalanina) o 2-Nal-OH (indicado como “Z” en la presente lista de secuencias)
25 (2-naftilalanina), véase Tabla 10 para actividad. La abreviatura Nal se usa en este documento para indicar 1-Nal-OH
o 2-Nal-OH.
Además, se adquiere actividad moderada en algunos casos lipidando miembros hexapeptídicos del subgrupo 2. Sin embargo, a diferencia de SEC ID Nº: 55 (1032), SEC ID Nº: 56 (1033) no rinde bien en ambientes biológicos.
30 En hexapéptidos del subgrupo 2 la actividad se reduce generalmente por un W en la posición 5, una F en la posición 2, fluoración de F en la posición 5 y cualquier alteración que tome la secuencia fuera de la fórmula XBXBOB. Si la posición 5 es un resto cargado, entonces en la mayoría de los casos el péptido está relativamente inactivo, por ejemplo SEC ID Nº: 9 (KFKFKF-NH2), SEC ID Nº: 10 (KYKYKY-NH2) y SEC ID Nº: 23 (KWKFKF-NH2). Una
35 excepción a esta afirmación es RWRWRW (SEC ID Nº: 5) pero este péptido cuando se compara con las actividades de los péptidos más activos tales como SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 62, SEC ID Nº: 63, muestra actividad muy baja.
Finalmente si un hexapéptido XBXBOB no está amidado, entonces está inactivo, por ejemplo SEC ID Nº: 41-46, en la Tabla 10.
40 TABLA 12A-B Actividad De Péptidos Cortos y Versión Lipidada en Tampón Fosfato-Suero de Oveja 10 % Frente a MRSA
12A
P0666-suero-1 P0666-suero-2 P0666-tampón-2 P1032-suero-0,5 P1032-tampón-1 mg/ml mg/ml mg/ml mg/ml mg/ml
0
68 57 57 68 57
30 minutos
102300 9800 99200 10 100
1 hora
99600 3200 62800 10 100
2 horas
15110 630 99200 10 10
3 horas
12080 250 99200 10 10
4 horas
5020 70 99200 10 10
5 horas
2570 50 99200 10 10
12B
P1032-suero-1
P1032-suero-2 Control de Suero P50-0,5 mg/ml
mg/ml
mg/ml
0
57 68 68 68
30 minutos
3900 1000000 68 38100
1 hora
1100 1000000 68 37800
2 horas 100 1000000 68 13340
3 horas 30 1000000 68 12410
4 horas 20 1000000 68 13920
5 horas 60 1000000 68 11970
Aunque los hexapéptidos XBXBOB generalmente son activos contra una serie de dianas microbianas, no todos los hexapéptidos son igualmente eficaces contra todos los microorganismos. Se observa que SEC ID Nº: 32-33 tuvieron baja actividad contra P. aeruginosa, C. albicans, y S. aureus como se muestra en las Tablas 10 y 13.
5 Resulta interesante que la adición de un lípido a SEC ID Nº: 1 (KFKWPW-NH2), que forma SEC ID Nº: 55 (Oct-KFKWPW-NH2) potenció la actividad del hexapéptido en suero, como se muestra en las Figuras 5-6 y Tablas 9 y 12. Adicionalmente, SEC ID Nº: 55 es eficaz contra una amplia serie de aislados clínicos resistentes a azol tales como
C. albicans, y S. aureus, como se muestra en la Tabla 9, Figuras 2-3 y Figuras 5-6. Resulta interesante que SEC ID
10 Nº: 55 también está activa en ambientes fisiológicos tales como estimulante vaginal y en suero, como se muestra en las Figuras 2-3.
B. Investigación de la Estructura De SEC ID Nº: 1 (P0666)
15 Se registraron los espectros de CD, mostrados en la Figura 1, en un espectropolarímetro modelo J-810 (Jasco) usando una celda de cuarzo con una longitud de camino de 1 mm. Los espectros se midieron a temperatura ambiente entre 190 nm y 250 nm a una velocidad de exploración de 50 nm/minuto y un total de 10 exploraciones por muestra. Los espectros se registraron a una concentración de péptidos de 100 μg/ml en tres ambientes: tampón Tris 10 mM, pH 7,5; TFE en agua 50 %; y en liposomas de POPC:POPG (1:1 p:p, 2 mM). En todos los casos, los
20 espectros de péptidos se obtuvieron restando los espectros de los componentes de la solución en ausencia del péptido.
SEC ID Nº: 1 (P0666) parece experimentar un cambio significativo en la estructura tras la interacción con un ambiente liposomal, como se ilustra en la Figura 1. Esto se diferencia del cambio significativo pequeño observado en
25 el tampón que contiene TFE 50 %. Una estructura específica inducida en un péptido relativamente corto probablemente tenga relación significativa con la actividad.
Se han obtenidos resultados interesantes cuando se sustituye naftilalanina, un mimético de alanina en algunos de los hexapéptidos. Por ejemplo, la sustitución de la F en SEC ID Nº: 1 con 1-Nal-OH (indicado como “U” en las 30 presentes listas de secuencias) (1-naftilalanina) reduce la actividad de SEC ID Nº: 1. De forma similar, la sustitución de la F en SEC ID Nº: 1 con 2-Nal-OH (indicado como “Z” en las presentes listas de secuencias, es el estereoisómero 2-naftilalanina) también reduce la actividad de SEC ID Nº: 1. Sin embargo, la sustitución de la F en SEC ID Nº: 3 con 1-Nal-OH (naftilalanina) da como resultado actividad potenciada y un nuevo hexapéptido SEC ID Nº: 62 (KWKWUW-NH2) en el que la U es 1-Nal-OH. También se obtuvieron resultados similares sustituyendo la F 35 en SEC ID Nº: 3 con 2-Nal-OH (un isómero diferente de naftilalanina), creando SEC ID Nº: 63 (KWKWZW-NH2), en la que Z es 2-Nal-OH. Se ha planteado la hipótesis de que las sustituciones de 1 -Nal-OH y 2-Nal-OH añaden físicamente volumen al hexapéptido en forma de un anillo aromático fusionado extra, que también añade hidrofobicidad y aromaticidad a las estructuras, cuando se compara con la fenilalanina sustituida. Por lo tanto, parece que el volumen y/o hidrofobicidad son importantes en la posición 5 en SEC ID Nº: 3 y las SEC ID Nº: 62 y 63
40 sustituidas, mientras que tiene un efecto adverso en la posición 2 de SEC ID Nº: 1.
La estructura de solución del péptido central KFKWPW-NH2 (SEC ID Nº: 1) se determinó en micelas DPC por 1H-NMR. La estructura con la RMSD (desviación de valor cuadrático medio) menor con respecto a la media se muestra en la Figura 9 representándose la carga en azul y la hidrofobicidad en blanco. Debe observarse que el péptido
45 asume una estructura que consiste en una parte hidrófoba bien ordenada y una región cargada menos ordenada. Esta anfipatía puede tener relación significativa con la actividad del péptido y el mecanismo de acción. La prolina claramente desempeña un papel crítico en el mantenimiento de la estructura en el dominio hidrófobo.
En el proceso de desarrollar y estudiar los hexapéptidos de la presente invención, se identificaron muchos ejemplos
50 de hexapéptidos no XBXBOB, se evaluaron y se descubrió que mostraban poca o ninguna actividad antimicrobiana; estos hexapéptidos se consideraron generalmente “no activos”. Se muestran ejemplos representativos de los hexapéptidos no activos no XBXBOB en la Tabla 13.
TABLA 13
Hexapéptidos No XBXBOB que Muestran Actividad Antimicrobiana Baja o Ausente
Péptido (SEC ID Nº:)
E. coli UB1005 S. typhimurium 14028S P. aeruginosa H374
SEC ID Nº: 12
>128 >128 >128
SEC ID Nº: 13
>128 >128 >128
SEC ID Nº: 14
>128 >128 >128
SEC ID Nº: 15
>128 >128 >128
SEC ID Nº: 16
>128 >128 >128
SEC ID Nº: 17
>128 >128 >128
SEC ID Nº: 18
>128 >128 >128
SEC ID Nº: 19
>128 >128 >128
SEC ID Nº: 20
>128 >128 >128
SEC ID Nº: 21
>128 >128 >128
SEC ID Nº: 22
>128 >128 >128
SEC ID Nº: 23
>128 >128 >128
SEC ID Nº: 24
>128 >128 >128
SEC ID Nº: 25
>128 >128 >128
SEC ID Nº: 26
>128 >128 >128
SEC ID Nº: 27
>128 >128 >128
SEC ID Nº: 28
>128 >128 >128
SEC ID Nº: 29
>128 >128 >128
SEC ID Nº: 30
>128 >128 >128
SEC ID Nº: 31
>128 >128 >128
SEC ID Nº: 32
>128 >128 >128
SEC ID Nº: 33
>128 >128 >128
SEC ID Nº: 34
>128 >128 >128
SEC ID Nº: 35
>128 >128 >128
SEC ID Nº: 36
>128 >128 >128
C. Relación de la Actividad con la Estructura de Acilación
5 Se ha demostrado previamente que la acilación de péptidos antimicrobianos puede mejorar su actividad. Esa mejora de la actividad depende del péptido central, longitud del lípido unido y en algunos caos el tipo de lípido unido como se describe por Radzishevsky et al. (Antimicrob. Agents Chemother. 49: 2412-2420 (2005)). Al tomar el péptido central SEC ID Nº: 1 los inventores unieron una serie de lípidos de 6 carbonos de longitud a 18 incluyendo el ácido aminocaprílico de grupo aminoacilo. Se realizó unión por métodos de química de péptidos convencional. A partir de 10 este trabajo se demostró que la longitud óptima de un lípido unido, en relación con actividad antimicrobiana está entre 8 y 14 carbonos (Tabla 14). Debería observarse que la adición de un grupo de aminoacilo tal como ácido aminocaprílico en el caso de SEC ID Nº: 76 no mejoró la actividad a diferencia de péptidos modificados de esta manera descritos por Radzishevsky et al. (Antimicrob. Agents Chemother. 49: 2412-2420 (2005)).
TABLA 14
SEC ID
Modificación de Lípido Longitud de Lípido P. aeruginosa S. typhimurium MRSA C. albicans
Nº: 1
No lipidado 0 32 Nd 16 32
Nº: 71
Cap-KFKWPW-NH2 6 carbonos >128 128 128 128
Nº: 69
Hep-KFKWPW-NH2 7 carbonos 128 128 128 64
Nº: 55
Oct-KFKWPW-NH2 8 carbonos 32 32 16 32
Nº: 70
Non-KFKWPW-NH2 9 carbonos 32-64 16 16 16
Nº: 79
Und-KFKWPW-NH2 11 carbonos 8-16 8-16 4 4-8
Nº: 72
Lau-KFKWPW-NH2 12 carbonos 32 32 4-8 8
Nº: 80
Tri-KFKWPW-NH2 13 carbonos 32 32-64 2-4 4
Nº: 77
Myr-KFKWPNH2 14 carbonos 64-128 >128 8-16 4-8
Nº: 78
Pen-KFKWPW-NH2 15 carbonos 128 >128 32-64 8
Nº: 73
Pal-KFKWPW-NH2 16 carbonos >128 >128 128 32
Nº: 75
Ole-KFKWPW-NH2 17 carbonos >128 >128 128 128
Nº: 74
Ste-KFKWPW-NH2 18 carbonos >128 >128 >128 128
Debería observarse que además de los datos de MIC, los lipohexapéptidos también pueden distinguirse por su capacidad para matar bacterias en presencia de constituyentes biológicos tales como suero. En estas circunstancias 5 puede verse que tanto SEC ID Nº: 79 (P 1275) como SEC ID Nº: 83 (P1343) rinden muy bien (Figura 10). Esta actividad, un indicador de potencial terapéutico, no es evidente a partir de los datos de MIC solamente.
D. Mecanismo de Acción de Lipohexapéptidos
10 El mecanismo tradicional de acción para péptidos antimicrobianos ha sido su capacidad para romper membranas celulares. La capacidad de los hexapéptidos y lipohexapéptidos para interaccionar con membranas lipídicas compuestas de lípidos que se asemejan a células bacterianas o humanas se evaluó usando los péptidos representativos SEC ID Nº: 1 (P0666) y SEC ID Nº: 55 (P1032) como representantes. En estos ensayos los péptidos antimicrobianos convencionales (15-40 aminoácidos de longitud) confieren muerte mediante la rotura de bicapas de
15 membrana que provoca filtración citoplasmática dando como resultado muerte celular. Para determinar si el hexapéptido P0666 y su análogo lipidado P1032 siguen un mecanismo similar de acción, se sometieron a un ensayo de reactivación de fluorescencia de diSC35. Ensayo de reactivación de fluorescencia de DiSC35. DiSC35 es un colorante sensible a potencial de membrana que se capta por células energizadas de acuerdo con el gradiente de potencial de membrana y se concentra en la membrana celular lo que conduce a interrupción de la fluorescencia del
20 colorante. Cuando el potencial de membrana se interrumpe el colorante se libera y ya no está inactivado y por lo tanto aumenta la fluorescencia. En este caso se usaron células bacterianas S. aureus vivas como el organismo diana. Se midió la capacidad de cada péptido para despolarizar el potencial de membrana citoplasmático dando como resultado pérdida de diSC35 de células al tampón y un aumento correspondiente de la fluorescencia. A diferencia de P50 (VAKKLAK-LAKEXAKLAL-NH2, SEC ID Nº: 88), un péptido de rotura de membrana tradicional, ni
25 P0666 ni P 1032 fue capaz de provocar permeabilización de la membrana celular de S. aureus.
La falta de rotura de membrana observada en S. aureus se correlaciona bien con datos generados de ensayos de liposomas. Los liposomas se construyeron para imitar la composición lipídica de células bacterianas (POPC:POPG, 3:1) o células eucariotas (POPC:colesterol, 3:1). Ni el hexapéptido ni el lipohexapéptido a 4 μg/ml provocaron que el
30 colorante (calceína) se liberara de los liposomas (POPC:POPG, 3:1) a diferencia de P50 a 2 μg/ml. Ninguno de los hexapéptidos provocó cantidad significativa de liberación de calceína incluso a 128 μg/ml de los liposomas (POPC:colesterol, 3:1).
E. Aparición de Resistencia
35 Con un nuevo mecanismo de acción la aparición de resistencia debería ser siempre una preocupación. Se transfirieron de forma seriada MRSA (cepa SAP001 7) y S. aureus (cepa ATCC 21923) diariamente en presencia de concentraciones de media MIC de P 1032 y P1032d. Después de 30 pases en serie los cambios de MIC estaban dentro de dos diluciones 2 de la MIC de partida. Se demostró que dicha resistencia era una adaptación transitoria,
40 puesto que un pase sencillo de cada cepa resistente en ausencia de péptido dio como resultado reversión a MIC original.
Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invención. Debería apreciarse por los expertos en la materia que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por los INVENTORES que actúan bien en la práctica de la invención y por lo tanto puede considerarse que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la materia deberían, a la luz de la
5 presente descripción, apreciar que pueden hacerse muchos cambios en las realizaciones específicas que se describen y aún obtener un resultado similar o parecido sin separarse del alcance de la invención.
F. Evaluación de Concentración Inhibidora Mínima (MIC) de Hexapéptidos Antimicrobianos contra Dermatofitos Trychophyton rubrum y Trychophyton mentagrophytes
10 Para comparar la actividad de diversos péptidos antimicrobianos, incluyendo hexapéptido SEC ID Nº: 1 (P0666), se determinaron las MIC contra los dermatofitos Trychophyton rubrum y Trychophyton mentagrophytes. La concentración de muestras investigadas fueron: 2000, 1000, 500, 250 y 125 μg/ml, respectivamente. El medio usado fue medio de Sabouraud modificado sin agar. Para un medio de Sabouraud modificado de 100 ml: se mezclaron 3 g
15 de caldo de dextrosa de Sabouraud (Difco) en 100 ml de agua desionizada. El pH se ajustó a 7,0 con NaOH 0,1 N. La solución se esterilizó por autoclave durante treinta minutos. Se vertieron 940 μl de medio a tubos de ensayo de 20 ml estériles con tapones de plástico y se permitió que se enfriara.
Se añadieron 50 μl de solución salina a cada tubo de ensayo de 20 ml para obtener la concentración requerida. Se
20 compuso un tubo de control de 50 μl de solución salina sin muestra. Para los experimentos de MIC, se añadieron 10 μl de organismo suspendido en solución salina a cada tubo de ensayo de 20 ml y se agitó en vórtex suavemente. Cada uno de los tubos de ensayo se cubrió con parafilm y se mantuvo en un agitador a 27 ºC a una velocidad de aproximadamente 100 rpm.
25 El crecimiento/inhibición del organismo se observó diariamente. El crecimiento de los organismos se observó el quinto y décimo día y se muestra en la Tabla 12. El experimento de MIC se repitió a 125 ppm, puesto que el crecimiento de la mayoría de los organismos se inhibió el quinto día a 250 ppm, la concentración inhibidora mínima (MIC100) para compuestos F1 a F10 contra los hongos Trychophyton rubrum y Trychophyton mentagrophytes a 10 días.
30 TABLA 15
M1C109 (μg/ml)
Péptido
T. rubrum
T. mentagrophytes
1000
250 P153 FALKALKKLKKALKKAL-NH2 SEC ID Nº: 86
500
500
P55 FAKLLAKALKKLL-NH2 SEC ID Nº: 87
500
500
P50 VAKKLAKLAKKLAKLAL-NH2 SEC ID Nº: 88
500
500
P43 FAKLLAKLAKKLL-NH2 SEC ID Nº: 89
1000
500 P64 FAKALKALLKALKAL-NH2 SEC ID Nº: 90
250
250
P0666 (SEC ID Nº: 1) KFKWPW-NH2
Se descubrió que SEC ID Nº: 1 (P0666 KFKWPW-NH2) era la más activa contra T. rubrum y T. mentagrophytes. Hubo solamente un ligero crecimiento a 125 ppm el día diez.
G. Ensayos de toxicidad
Para evaluar los efectos tóxicos potenciales de la administración sistémica de los hexapéptidos de la presente invención, se introdujo una serie de péptidos que mostraban actividad antifúngica en el sistema sanguíneo de un
40 ratón por inyección en la vena de la cola a una dosificación de 20 mg/kg. Como se ha visto a partir de los datos posteriores en la Tabla 13, SEC ID Nº: 1 (Referencia P0666; KFKWPW-NH2), a diferencia de los otros péptidos ensayados, no indujo toxicidad sistémica.
TABLA 16
SEC ID Nº (nombre de ref)
Dosis Compuesto de Disolven te Vía Resultado
SEC ID Nº: (P0666) KFKWPW-NH2
20 mg/kg Agua IV Sin efectos adversos
SEC ID Nº: 55 (P01032) Oct-KFKWPW-NH2
80 mg/kg Solución Salina IV Sin efectos adversos
SEC ID Nº: 86(P153) FALKALKKLKKALKKAL-N H2
20 mg/kg Agua IV Actividad motora reducida
SEC ID Nº: 91 (P650) FAKALLKALLKALK-NH2
20 mg/kg ringer IV 1/3 muertos, problemas clínicos
SEC ID Nº: 92 (P146) KYKKALKKLAKLL-NH2
20 mg/kg ringer IV 3/3 muertos
H. Estudios de citotoxicidad
5 1. Actividad in vivo de P01032
Se ensayaron muestras de SEC ID Nº: 55 (S35-2) a una concentración de 0,1 mg/ml y a 0,5 mg/ml con respecto a citotoxicidad y se descubrió que no eran citotóxicos en ensayos de 24 y 48 horas, cuando se evaluaron confluencia celular, crenación, vacuolización e histolisis.
10 Estudios previos han documentado que el péptido antimicrobiano P-50 (un 17-mer) proporciona beneficio profiláctico en la reducción de contaminación bacteriana por S. aureus de la superficie de heridas de grosor parcial. SEC ID Nº: 55 (P-1032) también ha demostrado actividad antimicrobiana similar in vitro.
15 Se realizó un estudio para evaluar la actividad antimicrobiana in vivo de SEC ID Nº: 55 (P-1032) en comparación con P-50 con los siguientes parámetros. Todos los agentes de ensayo se proporcionaron por Helix BioMedix, Inc. En este estudio se evaluaron dos grupos de tratamiento:
I. péptido P-50 1 % contenido en una solución de HEC 4 %; y 20 II. péptido de SEC ID Nº: 55 (P-1032) 1 % contenido en un gel de HEC 4 %.
Ambos agentes de ensayo se transfirieron a jeringas de 3 ml usando técnica aséptica. Durante el estudio se distribuyeron 0,5 ml del agente apropiado a cada herida. Esta cantidad cubrió la superficie de la herida completa con una capa fina de solución o gel. Las bacterias de ensayo fueron S. aureus (ATCC 12600). Los resultados de estos
25 estudios se muestran en las Tablas 14-16.
Se anestesiaron doce ratas hembra Sprague-Dawley (250-280 g) y se prepararon para cirugía. En la espalda de cada rata se creó una herida cutánea de grosor parcial de 2,54 cm x 2,54 cm con un Dermatomo Brown. Cada herida se contaminó con 3,1 x 105 / 0,05 ml de S. aureus (LOG 5,49). Se permitió que las heridas se secaran durante
30 30 minutos antes de que los animales se dividieran de forma equitativa en cuatro grupos de tratamiento. Las heridas en cada grupo recibieron 0,5 ml del agente de ensayo apropiado. Cada herida se cubrió con un apósito de película transparente, se cubrió con una almohadilla de gasa y se aseguró con cinta adhesiva.
Veinticuatro horas después del primer tratamiento se anestesió a los animales y se retiraron sus vendajes. La
35 superficie de la herida se limpió suavemente con gasa húmeda y se aplicó una nueva alícuota (0,5 ml) de agente tópico. Se volvió a vendar a los animales como se ha descrito previamente.
Se realizó un cambio de apósito y nueva aplicación del agente tópico de nuevo a las 48 horas. Por lo tanto cada animal recibió 3 tratamientos tópicos.
40 Setenta y dos horas después de la cirugía las ratas se sacrificaron y se obtuvo una biopsia de punzón de 8 mm de grosor completo del centro de la herida. La biopsia se situó en un tubo pesado previamente que contenía 5 ml de solución salina estéril y pesado de nuevo para determinar el peso de la muestra. Usando una picadora de tejido la biopsia se homogeneizó y se diluyó en series y se sembró en placas para determinar el número de bacterias por
45 gramo de tejido.
Dieciocho horas antes de la cirugía, se transfirió una colonia sencilla de S. aureus por un asa estéril de una placa de reserva a caldo de soja de tripticasa. El caldo de cultivo se agitó en un baño de agua de 37 ºC durante 18 horas antes de recoger las bacterias por centrifugación a 3200 rpm durante 10 minutos. El sedimento bacteriano se lavó dos veces en una solución salina 0,9 % estéril y se recogió de nuevo en un sedimento por centrifugación. El sedimento se resuspendió en 2 ml de solución salina estéril y se mezcló minuciosamente para producir una solución madre. Se preparó después una serie de diluciones 1:10, variando de 10-1 a 10-8 a partir de la solución madre. Se usaron técnicas de siembra en placas convencional para cuantificar el número de bacterias en la solución madre y
5 posteriormente cada dilución 1:10. Se calculó que el inóculo usado era 3,1 x 105 UFC/0,05 ml (LOG 5,49). El tubo del inóculo se mantuvo en hielo y se agitó suavemente y se extrajo en una punta de pipeta estéril inmediatamente antes de su uso.
Se usaron doce ratas hembra Sprague-Dawley (250-280 g). Se anestesiaron por vía intramuscular con una mezcla de ketamina (50 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg). El vello dorsal se cortó con esquiladora eléctrica y la piel se depiló con Nair. Se marcó un molde de 2,54 cm x 2,54 cm en el centro de la espalda usando un marcador resistente a alcohol. La piel se preparó después con limpiador de yodóforo, seguido de un alcohol isopropílico 70 %, solución de yodóforo y alcohol 70 %. Se pasó Shur-Clens sobre el área de injerto y dermatoma para lubricación. Después se retiró un injerto de piel de grosor parcial convencional (grosor de 0,04 cm) en el área marcada de 2,54 cm x 2,54 cm, usando
15 un Dermatomo de Brown de aire comprimido.
Después de que se consiguiera la hemostasis con gasa seca, se usó un pipeteador Eppendorf para aplicar exactamente 0,05 ml del inóculo a cada herida. Se permitió que las heridas se secaran durante 30 minutos antes de que cada herida recibiera 0,5 ml de agente tópico. Cada herida se cubrió después con un apósito transparente (Teqaderm, 3M, St. Paul, MN). Se vendó a los animales con gasa estéril y 2 envolturas en circunferencia de cinta de tela de 7,62 cm. Se les proporcionó analgesia de Buprenorfina y se recuperaron de la anestesia y se devolvieron al alojamiento y los cuidados convencionales.
A las 24 y 48 horas después de la cirugía, se volvió a anestesiar a todas las ratas por inhalación de isofluorano y sus
25 vendas se retiraron. Los apósitos se retiraron cuidadosamente y se retiró por transferencia cualquier fluido presente con gasa estéril. Se aplicó después una alícuota de 0,5 ml del gel de tratamiento designado uniformemente a la superficie de herida completa y los animales se vendaron de nuevo y se recuperaron igual que en cirugía.
2. Análisis de Apariencia de las Heridas
Se observó cada herida en cada cambio de apósito y se evaluó la superficie de herida y la reacción del tejido. Hubo 5 parámetros de estado de herida que se comprobaron:
i. Seguridad de Película de la Herida -¿Estaba la película adhesiva usada para cubrir la herida aún 35 completamente adherente a la piel alrededor de la herida?
ii. Superficie de la Herida -¿Cuál era la apariencia visual exacta de la superficie de la herida?
iii. Cantidad de Exudado -¿Cuánto exudado estaba atrapado bajo la película? En muchos casos, el exudado acumulado provoca que la película pierda adherencia y los exudados escapen.
iv.
Gravedad de la Reacción Tisular – Una clasificación subjetiva del alcance de la reacción del tejido en una escala de 1 (mínima), 2 (moderada), 3 (extensiva).
v.
% de Tejido Implicado – En algunas situaciones, la superficie de la herida contenía tejido quebradizo desnaturalizado que podría retirarse con presión aplicada a la gasa. Este ensayo se usó para diferenciar mejor tejido desnaturalizado de exudados viscosos.
45 3. Evaluación de Conteos Bacterianos
A las 72 horas después de la cirugía, las ratas se sacrificaron, sus apósitos se retiraron y se tomó una biopsia de punzón de grosor completo de 8 mm del centro de cada herida y se situó en un tubo pesado previamente que contenía 5 ml de solución salina estéril. Los tubos que contenían las muestras se volvieron a pesar y se determinaron los pesos de la muestra. Las muestras se homogeneizaron y después se diluyeron en serie 4 veces y se sembraron en agar de soja de tripticasa. Las placas se incubaron durante una noche y las colonias se contaron, y los contenidos bacterianos por gramo de tejido se calcularon y convirtieron a logaritmo en base 10. Se calculó la media y la desviación típica de cada grupo y se usó un ANOVA (Análisis de Varianza) para determinar cualquier diferencia significativa entre los tres grupos de tratamiento.
4. Complicaciones Postoperatorias
Todos los animales sobrevivieron al estudio sin complicaciones.
No se detectaron bacterias en 11 de 12 heridas tratadas (Tabla 17-18). En una herida tratada con P-50 1 %, se detectaron varias S. aureus (Tabla 18).
5.
Reacción Tisular
6.
Sumario de los Resultados
65 En general, la reacción tisular al péptido SEC ID Nº: 55 (P-1032) fue suave, mientras que la del P-50 fue de suave a moderada (como se muestra en los resultados de la Tabla 19).
SEC ID Nº: 55 (P-1032) 1 % en HEC 4 % parece proporcionar el mismo nivel de acción antimicrobiana contra S. aureus (ATCC 12600) que P-50 1 % (Tablas 17-18).
TABLA 17
INÓCULO LOG = 5,49 S. aureus (ATCC 12600)
I. P-50 1 % en HEC 4 %
Nº de An LOG/cm2 peso tisular (g) LOG/g 1 1,70 0,1886 2,42 3 1,70 0,1821 2,44 5 1,70 0,1694 2,47 7 1,70 0,2000 2,40 9 2,81 0,1428 3,66 11 1,70 0,1905 2,42 MEDIA 1,89 0,1789 2,64 d.t. 0,45 0,0204 0,50
TABLE 18
II. SEC ID Nº: 55 (P-1032) 1 % en HEC 4 %
Nº de An LOG/cm2 peso tisular (g) LOG/g 2 1,70 0,1493 2,53 4 1,70 0,1859 2,43 6 1,70 0,1889 2,42 8 1,70 0,1956 2,41 10 1,70 0,1905 2,42 12 1,70 0,1422 2,55
1,70 0,1754 2,46 0,00 0,0233 0,06
Nota: todas las muestras excepto la Nº 9 tuvieron conteos logarítmicos que no indican crecimiento visible para esa muestra o el límite mínimo de detección de bacterias. Nº de An = número de animal.
TABLA 19
GRUPO
Nº DE ANIMAL REACCIÓN TISULAR
Película no sellada
Cantidad de exudado Aspecto de la herida Gravedad de la reacción tisular % de tejido retirado
I. P-50 1 %
1 S - - - - P/ a 2/ a 2/ a 2/ a 2 2 - - -
3
- - - P/ a P/ a P/ a 2/ a 2/ a 2/ a 2 2 - - -
5
- - - P/ a P/ a P/ a 2/ a 2/ a 2/ a 2 2 - - -
7
- - - P/ a - P/ a 2/ a 2/ a 2/ a 2 1 - - -
9
- - - - P/ a P/ a 2/ a 2/ a 2/ a 2 2 - - -
11
S - - P/ a P/ a P/ a 1 1 1 - - -
II. SEC ID Nº: 55 (P1032) 1 %
2 - - - - P/ a P/ a 1 1 2/ a - - -
4
S - - - P/ a P/ a 1 1 1 - - -
6
- - - G/ m P/ a P/ a 1 2/ w 2/ a - - -
8
- - - - P/ a P/ a 1 1 2/ a - - -
10
- - - - P/ a P/ a 1 1 1 - - -
12
- - - - P/ a P/ a 1 1 1 - - -
D�?A
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Clave de Observación: Película no sellada: S= sí; -=no
Aspecto de la Herida: 1= normal; 2= algunas áreas muestran reacción tisular; 3= tejido desnaturalizado notable; a=amarillento; r = rojizo; m = marrón
Cantidad de exudado: -=nada; P= pequeña; L= grande
Gravedad de la reacción tisular: 1 = mínima; 2 = media; 3= grande
LISTADO DE SECUENCIAS
5
<110> Falla, Tlmonthy J Zhang, Licuan Harris, Scott M.
10
<120> Hexapéptidos antimicrobianos <130> 11181.0032.NPUS00
15
<140> US 11/350.192 <141> <150> 60/651.270 <151>
<160> 92
<170> Patentln versión 3.5
5 <210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<220>
<221> MOD_RES 15 <222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 1
<210> 2
<211> 6
<212> PRT 25 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
35 <400> 2
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 3
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 4
15 <210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<220>
<221> MOD_RES 25 <222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 5
<210> 6
<211> 6
<212> PRT 35 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
45 <400> 6
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 7
10
<210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
15 20
<220> <223> Sintética <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN <400> 8
25
<210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
30
<220> <223> Sintética
35
<220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN
<400> 9
40
45
<210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
50 55
<220> <223> Sintética <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN <400> 10
5
<210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética
10
<220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN
15
<400> 11
20
<210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
25 30
<220> <223> Sintética <220> <221> MOD_RES 222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN <400> 12
35 40
<210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética
45
<220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN
50
<400> 13
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> <223> Sintética
5
<220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN
10
<400> 14
15
<210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
20 25
<220> <223> Sintética <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN <400> 15
30
<210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
35
<220> <223> Sintética
40
<220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN
<400> 16
45
50
<210> 17 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220> <223> Sintética
55
<220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN
60
<400> 17
5
<210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
10 15
<220> <223> Sintética <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN <400> 18
20
<210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
25
<220> <223> Sintética
30
<220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN
<400> 19
35
40
<210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220> <223> Sintética
45
<220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN
50
<400> 20
<210> 21 55 <211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintética
<220> 5 <221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 21
<210> 22
<211> 6 15 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN 25
<400> 22
<210> 23
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
35 <220>
<223> Sintética
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 23
<210> 24
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<220> 55 <221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 24
5 10
<210> 25 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética
15
<220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN
20
<400> 25
25
<210> 26 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
30 35
<220> <223> Sintética <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN <400> 26
40
<210> 27 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
45
<220> <223> Sintética
50
<220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN
<400> 27
<210> 28
<211> 6
<212> PRT <213> Secuencia artificial
5
<220> <223> Sintética
<220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN
<400> 28
15
<210> 29 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220> <223> Sintética
25
<220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN
<400> 29
35
<210> 30 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220> <223> Sintética
45
<220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN <400> 30
<210> 31 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
55
<220> <223> Sintética
<220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 31
5
10
<210> 32 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220> <223> Sintética
15
<220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN
20
<400> 32
25
<210> 33 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
30
<220> <223> Sintética
35
<220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN
<400> 33
40 45
<210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética
50
<220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN
55
<400> 34
<210> 35
<211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
5
<220> <223> Sintética
<220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN
<400> 35
15
<210> 36 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220> <223> Sintética
25
<220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN
<400> 36
35
<210> 37 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220> <223> Sintética
45
<220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN
<400> 37
55
<210> 38 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética
<220> <221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 38
<210> 39
<211> 6 10 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223>
Sintética 15
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223>
Xaa es 1-Nal-OH, en la que Nal es naftilalanina 20
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223>
AMIDACIÓN 25
<400> 39
30 <210> 40
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
35 <220>
<223> Sintética
<220>
<221> MOD_RES 40 <222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 40
<210> 41
<211> 6
<212> PRT 50 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
55 <400> 41
5
<210> 42 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética
10
<400> 42
15
<210> 43 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
20
<220> <223> Sintética <400> 43
25
<210> 44 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
30
<220> <223> Sintética
<400> 44
35
40
<210> 45 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220> <223> Sintética
45
<400> 45
50
<210> 46 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
55
<220> <223> Sintética
<400> 46
5
<210> 47 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
10 15
<220> <223> Sintética <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN <400> 47
20
<210> 48 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
25
<220> <223> Sintética
30
<220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN
<400> 48
35
40
<210> 49 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220> <223> Sintética
45
<220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN
50
<400> 49
<210> 50 55 <211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sintética
<220> 5 <221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 50
<210> 51
<211> 6 15 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN 25
<400> 51
<210> 52
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
35 <220>
<223> Sintética
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 52
<210> 53
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
55 <220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 53
<210> 54
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 10
<220>
<223> Sintética
<220>
15 <221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> adición de ácido octanoico mediante un enlace amida al péptido
<220>
20 <221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 54 25
<210> 55
<211> 6 30 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223>
Sintética 35
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223>
adición de ácido octanoico mediante un enlace amida al péptido 40
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223>
AMIDACIÓN 45
<400> 55
50 <210> 56
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
55 <220>
<223> Sintética
<220>
<221> MISC_FEATURE 60 <222> (1)..(1)
<223> adición de ácido octanoico mediante un enlace amida al péptido
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 56
<210> 57
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 15
<220>
<223> Sintética
<220>
20 <221> MISC_EEATURE
<222> (1)..(1)
<223> adición de ácido octanoico mediante un enlace amida al péptido
<220>
25 <221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 57 30
<210> 58
<211> 6
35
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
40
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = fenilalalanina fluorada
45
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN
50
<400> 58
55 <210> 59
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
60 <220> <223> Sintética
<220>
<221> MISC_FEATURE 5 <222> (2)..(2)
<223> Xaa = fenilalalanina fluorada
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 59
<210> 60
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
25 <220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = fenilalalanina fluorada
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
35 <400> 60
<210> 61
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 45 <223> Sintética
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = fenilalalanina fluorada
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5) 55 <223> Xaa = fenilalalanina fluorada
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 61
<210> 62 5 <211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 10 <223> Sintética
<220>
<221> MISC_EEATURE
<222>
(5)..(5) 15 <223> Xaa = 1-Nal-OH, en la que Nal es naftilalanina
<220>
<221> MOD_RES
<222>
(6)..(6)20 <223> AMIDACIÓN
<400> 62
<210> 63
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 30
<220>
<223> Sintética
<220>
35 <221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa =2-Nal-OH, en la que Nal es naftilalanina
<220>
40 <221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 63 45 20 <210> 66
<210> 64
<211> 7
50
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
55
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)<223> AMIDACIÓN
60
<400> 64
<210> 65
<211> 7
5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
10
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)<223> AMIDACIÓN
15
<400> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
25 <220>
<223> Sintética
<220>
<221> MOD_RES 30 <222> (7)..(7)
<223> AMIDACIÓN
<400> 66
<210> 67
<211> 7
<212> PRT 40 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
45 <220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> AMIDACIÓN
50 <400> 67
<210> 68 55 <211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> AMIDACIÓN
<400> 68
<210> 69
<211> 6 15 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> adición de ácido heptanoico mediante un enlace amida al péptido. 25
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 69
35 <210> 70
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<220>
<221> MISC_FEATURE 45 <222> (1)..(1)
<223> adición de ácido nonanoico mediante un enlace amida al péptido.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 70
<210> 71
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 5 <223> Sintética
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> adición de ácido caproico mediante un enlace amida al péptido.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)15 <223> AMIDACIÓN
<400> 71
<210> 72
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 25
<220>
<223> Sintética
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> adición de ácido laurico mediante un enlace amida al péptido.
<220> 35 <221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 72
<210> 73
<211> 6 45 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> adición de ácido palmítico mediante un enlace amida al péptido 55
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 73 <210> 74
<211> 6 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223>
Sintética 10
<220>
<221> MISCFEATURE
<222> (1)..(1)
<223>
adición de ácido esteárico mediante un enlace amida al péptido 15
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223>
AMIDACIÓN 20
<400> 74
25 <210> 75
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
30 <220>
<223> Sintética
<220>
<221> MISC_FEATURE 35
<222> (1)..(1)
<223> adición de ácido oleico mediante un enlace amida al péptido
<220> 40 <221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 75 45
<210> 76
<211> .6 50 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223>
Sintética 55
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223>
adición de ácido 8-aminocaprílico mediante un enlace amida al péptido 60
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 76
<210> 77 10 <211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sintética
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222>
(1)..(1) 20 <223> adición de ácido mirístico mediante un enlace amida al péptido
<220>
<221> MOD_RES
<222>
(6)..(6)25 <223> AMIDACIÓN
<400> 77
<210> 78
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Sintética
<220>
40 <221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> adición de ácido pentadecanoico mediante un enlace amida al péptido
<220>
45 <221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 78 50
<210> 79
<211> 6 55 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223>
Sintética 60
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223>
adición de ácido undecanoico mediante un enlace amida al péptido 5
<220>
<221> MOD RES
<222> (6)..(6)
<223>
AMIDACIÓN 10
<400> 79
15 <210> 80
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> Sintética
<220>
<221>
MISC_FEATURE 25 <222> (1)..(1)
<223> adición de ácido tridecanoico mediante un enlace amida al péptido
<220>
<221>
MOD RES 30 <222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 80
<210> 81
<211> 6
<212> PRT 40 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
45 <220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> adición de ácido octanoico mediante un enlace amida al péptido
50 <220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(6)
<223> restos de forma D
55 <220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
60 <400> 81 25 <210> 83
<210> 82
<211> 6
5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
10
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(6)
<223> restos de forma D
15
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)<223> AMIDACIÓN
20
<400> 82
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
30 <220>
<223> Sintética
<220>
<221>
MISC_FEATURE 35 <222> (1)..(1)
<223> adición de ácido laurico mediante un enlace amida al péptido
<220>
<221>
MISC_FEATURE 40 <222> (1)..(6)
<223> restos de forma D
<220>
<221>
MOD_RES 45 <222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 83
<210> 84
<211> 6
<212> PRT 55 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
60 <220> <221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223>
adición de ácido octanoico mediante un enlace amida al péptido 5
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223>
restos de forma D 10
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223>
AMIDACIÓN 15
<400> 84
20 <210> 85
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
25 <220>
<223> Sintética
<220>
<221>
MISC_FEATURE 30 <222> (1)..(1)
<223> Adición de ácido decanoico mediante un enlace amida al péptido
<220>
<221>
MOD_RES 35 <222> (6)..(6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 85
<210> 86
<211> 17
<212> PRT 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
50 <220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> AMIDACIÓN
55 <400> 86
5
<210> 87 <211> 13 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética
<220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13)<223> AMIDACIÓN
15
<400> 87
<210> 88
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> AMIDACIÓN
<400> 88
35 <210> 89
<211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<220>
<221> MOD_RES 45 <222> (13)..(13)
<223> AMIDACIÓN
<400> 89
<210> 90
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> AMIDACIÓN
<400> 90
<210> 91
<211> 14
<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
20 <220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> AMIDACIÓN
25 <400> 91
<210> 92 30 <211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 35 <223> Sintética
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)40 <223> AMIDACIÓN
<400> 92

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un hexapéptido antimicrobiano que comprende restos cargados hidrófilos (X) en las posiciones uno y tres; restos hidrófobos (B) en las posiciones dos, cuatro y seis; y una naftilalanina (Nal), un resto alifático o uno aromático (O) en
    5 la posición cinco; estando representada la estructura del hexapéptido por la fórmula XBXBOB, y seleccionándose el hexapéptido del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 55, SEC ID Nº: 56, SEC ID Nº: 62, SEC ID Nº: 63, SEC ID Nº: 70, SEC ID Nº: 72, SEC ID Nº: 77, SEC ID Nº: 78, SEC ID Nº: 79, SEC ID Nº: 80, SEC ID Nº: 81, SEC ID Nº: 83 y SEC ID Nº: 85.
    10 2. El hexapéptido de la reivindicación 1, en el que O se selecciona del grupo que consiste en 1-Nal-OH, 2-Nal-OH, prolina y fenilalanina; y seleccionándose el hexapéptido del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 55, SEC ID Nº: 56, SEC ID Nº: 62, y SEC ID Nº: 63.
  2. 3. El hexapéptido de la reivindicación 1, siendo el hexapéptido SEC ID Nº: 1. 15
  3. 4.
    El hexapéptido de la reivindicación 1, modificándose dicho hexapéptido con un lípido.
  4. 5.
    El hexapéptido de la reivindicación 4, en el que el lípido se selecciona del grupo que consiste en ácido heptanoico,
    ácido nonanoico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido pentadecanoico, ácido undecanoico, ácido tridecanoico y ácido 20 octanoico.
  5. 6. El hexapéptido de la reivindicación 4, seleccionándose el hexapéptido del grupo que consiste en SEC ID Nº: 70, SEC ID Nº: 72, SEC ID Nº: 77, SEC ID Nº: 78, SEC ID Nº: 79, SEC ID Nº: 80, SEC ID Nº: 81, SEC ID Nº: 83, y SEC ID Nº: 85.
  6. 7.
    El hexapéptido de la reivindicación 1 siendo el hexapéptido SEC ID Nº: 72.
  7. 8.
    El hexapéptido de la reivindicación 1 siendo el hexapéptido SEC ID Nº: 79.
    30 9. El hexapéptido de la reivindicación 1 siendo el hexapéptido SEC ID Nº: 85.
  8. 10. Una composición que comprende el hexapéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 6 a 9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
    35 11. La composición de la reivindicación 10, en la que dicho hexapéptido es soluble en una solución acuosa.
  9. 12. Una composición de acuerdo con la reivindicación 10 para su aplicación a la piel o una herida.
  10. 13. Un hexapéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 6 a 9 para su uso como un 40 medicamento.
  11. 14. Un hexapéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 6 a 9 para el tratamiento o prevención de una infección microbiana, estando causada la infección por bacteria u hongo.
    45 15. El hexapéptido de la reivindicación 14, en el que la infección microbiana está causada por Pseudomonas aeruginosa o Staphylococcus aureus.
  12. 16. El hexapéptido de la reivindicación 14, en el que la infección microbiana está causada por Candida albicans.
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