CN116041422B

CN116041422B - 自组装抗菌肽及其组合物、药物载体、载药体系和用途

Info

Publication number: CN116041422B
Application number: CN202310338402.1A
Authority: CN
Inventors: 谭鸿; 王笑; 贺媛媛; 李洁华; 龙禧睿; 罗锋; 李震
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2023-03-31
Filing date: 2023-03-31
Publication date: 2023-06-16
Anticipated expiration: 2043-03-31
Also published as: CN116041422A

Abstract

本发明属于抗菌肽领域，提供了一种自组装抗菌肽及其组合物、药物载体、载药体系和用途。具体的，本发明为拓宽抗菌肽的应用领域，提供了一种具有式一所示特定结构的自组装抗菌肽及其组合物，以及基于前述自组装抗菌肽及其组合物的药物载体与载药体系。本发明特定结构的自组装抗菌肽及其组合物具备较好的抗菌性能，且比抗生素更不易产生耐药性的特点，还有抗生素所不具备的自组装性能，可以作为自组装药物递送平台，应用前景广泛。

Description

自组装抗菌肽及其组合物、药物载体、载药体系和用途

技术领域

本发明属于抗菌肽领域，具体涉及一种自组装抗菌肽及其组合物、药物载体、载药体系和用途。

背景技术

细菌感染是目前临床面临的一大难题，严重威胁人类的健康，给医疗卫生体系和财政带来严重负担。且过去几十年间，随着抗生素的发展，其滥用、不当使用的问题，进而带来了严重的细菌耐药性问题，给临床细菌感染治疗带来了新的困难。

抗菌肽是目前治疗细菌感染重要药物之一，具备抗菌性能较好，相较于抗生素不易产生耐药性，结构设计性强，代谢产物为氨基酸，生物相容性较好等特点，故而有广泛的潜在应用。具备抗菌功能的多肽通过多肽固相合成技术，可以调节多肽的结构、氨基酸序列、氨基酸个数以及其他参数与性质，制备技术不复杂，难度小。然而，传统抗菌肽功能相对单一，临床应用大多仅仅利用了其抗菌功效直接作为抗菌药物使用，或制成医用器械的抗菌涂层。例如经典抗菌肽MP196（精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸）是已知最短的具有有效抗菌活性的抗菌肽，经过改性制备为抗菌涂层，但并未展现出其他更为丰富的功能特性。

自组装肽能够自发聚集形成多种纳米结构，能够模拟自然组织中的微结构与微环境，成为具备生物活性的材料，更高效地发挥作用。以往自组装肽结构复杂，合成难度大，制备周期长，功能相对单一，近年来研究者们更多聚焦于多功能的自组装短肽的研究，但其结构设计始终存在一定困难。

因此，通过对多肽结构进行改造，赋予抗菌肽新的功能如自组装功能，拓宽抗菌肽的应用，仍面临挑战。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有自组装能力的抗菌肽及其组合物、药物载体、载药体系和用途。

为实现上述发明目的，本发明提供的技术方案如下：

本发明提供了一种自组装抗菌肽，具有式一所示结构：

式一

其中，m为4~6的整数，n为2~4的整数。

进一步地，上述的自组装抗菌肽结构如下：

。

本发明还提供了一种自组装抗菌肽组合物，包括上述的自组装抗菌肽。

进一步地，上述的自组装抗菌肽组合物中自组装抗菌肽的含量不低于50wt%。

进一步地，上述的抗菌肽组合物还包括式二所示结构的亲水性多肽：

式二

其中，p为4~6的整数，q为2~4的整数。

更进一步地，上述亲水性多肽的结构如下：

。

本发明还提供了上述的自组装抗菌肽或上述的自组装抗菌肽组合物制备药物载体的用途。

本发明还提供了一种药物载体，由上述的自组装抗菌肽，或上述的自组装抗菌肽组合物自组装而成。

本发明还提供了一种载药体系，由上述的药物载体包载药物构成。

进一步地，上述药物为利福平和/或阿霉素。

本发明的有益效果：

本发明在经典抗菌肽MP196基础上进行改造，引入了复数个3,4-二羟基苯丙氨酸，意外发现其具备自组装能力，能够作为药物载体包载功能性药物，同时发挥优异的抗菌抗感染能力；在此基础上引入改造后的亲水性多肽共组装，可使得包载药物的能力进一步提升，具有作为抗菌功能性的药物递送系统的广泛应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1是本发明（A）亲水性多肽KE、（B）自组装抗菌肽WR、（C）自组装抗菌肽组合物MIX的拟合计算CAC结果图；图中的圆点表示实际检测值，直线为拟合所得结果。

图2 是本发明（A）自组装抗菌肽WR、（B）自组装抗菌肽组合物MIX的自组装粒子形貌的透射电镜图。

图3是本发明（A）自组装抗菌肽WR、（B）自组装抗菌肽组合物MIX包载罗丹明6G的荧光谱图。

图4是（A）不同浓度本发明自组装抗菌肽WR、亲水性多肽KE、自组装抗菌肽组合物MIX对RAW 264.7细胞存活率结果图；（B）不同浓度本发明自组装抗菌肽WR、亲水性多肽KE、自组装抗菌肽组合物MIX和抗菌肽MP196对血红细胞的溶血率结果图。

图5是本发明自组装抗菌肽WR、自组装抗菌肽组合物MIX和对照抗生素诺氟沙星的诱导耐药性测试结果图。

具体实施方式

本发明实施例所用原料、设备均为已知产品，可通过购买市售商品获得。

实施例1、本发明自组装抗菌肽WR的制备

1、芴甲氧羰基（Fmoc）保护的左旋多巴（DOPA）的合成：DOPA与芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺（Fmoc-OSu）在碱性条件下进行反应，DOPA与Fmoc-OSu的摩尔比为1:1，反应温度为室温条件，反应时间为16~18小时。反应结束后，使用2M的盐酸调节体系pH至2，石油醚洗涤3次后，使用二氯甲烷进行萃取，饱和食盐水洗涤有机相，过量无水硫酸镁干燥除水，旋蒸除去二氯甲烷即可得到产物，使用液相质谱与核磁共振氢谱鉴定产物结构：

¹H NMR：（400 MHz, DMSO-d ₆） δ 12.69（s, 1H），8.74（s, 1H），8.69（s, 1H），8.02–7.09（m, 8H），7.03–6.49（m, 3H），4.46（t, 1H），4.23–4.14（d, 2H)）， 4.13–3.97（m, 1H），2.95–2.63（m, 2H）。

LC-MS：实际值：[M+H⁺]/Z=420.14，[M+Na⁺]/Z=442.13；与理论值：[M+H⁺]/Z=420.15，[M+Na⁺]/Z=442.10相符。确认结构如下：

。

2、自组装抗菌肽WR的合成：遵循标准的Fmoc保护的多肽固相合成方法。载体为2-氯三苯甲基氯树脂。树脂使用溶剂溶涨后，加入首位氨基酸（色氨酸）与缩合剂进行偶联，室温条件下反应2小时后，使用溶剂洗净树脂。加入封端剂，封端30分钟，洗净树脂，加入20mL脱保护试剂脱除Fmoc基团，脱保护时间为15分钟，反应温度为室温，溶剂洗净树脂后，加入保护氨基酸与缩合剂进行下一个氨基酸（精氨酸）的偶联，反应于室温下进行，反应时间为2-4小时；缩合结束取少量树脂，洗净后与检验试剂混合，加热煮沸并保持沸腾2分钟，树脂不变蓝则缩合完成。同样，加入20mL脱保护试剂脱除Fmoc基团，脱保护时间为15分钟，反应温度为室温。按照同样的方法依次进行第三个氨基酸（色氨酸）、第四个氨基酸（精氨酸）、第五个氨基酸（色氨酸）、第六个氨基酸（精氨酸）、第七个氨基酸（氨基己酸）、第八个氨基酸（Fomc保护的DOPA）、第九个氨基酸（Fomc保护的DOPA）、第十个氨基酸（Fomc保护的DOPA）、第十一个氨基酸（Fomc保护的DOPA）偶联，反应完成得到的多肽-树脂偶联物，切割液进行切割与脱保护，比例为1g树脂加入10mL切割液，反应温度为室温，反应时间2.5小时；抽滤分离树脂与液体后，使用旋转蒸发仪浓缩除去大部分液体后迅速加入冰乙醚（-20℃）进行三次沉淀纯化；沉淀纯化后，再使用旋转蒸发仪完全除去乙醚，随即将沉淀于37℃条件下真空干燥2小时，使用液相质谱与核磁共振氢谱鉴定目标多肽：

¹H NMR：（400 MHz, DMSO-d6） δ 8.51–6.29（m, 30H），4.92–3.86（m, 12H），3.10（dt, 22H），2.39–1.89（m, 9H），1.80–0.73（m, 39H）.

LC-MS：实际值：[M+3H⁺]/3Z=625.75，[M+2H⁺]/2Z=937.85；与理论值：[M+3H⁺]/3Z=625.62，[M+2H⁺]/2Z=937.94相符。

确认结构如下并命名为WR：

其中，缩合剂配方：苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU）、1-羟基苯并三唑（HOBt）、N,N’-二异丙基乙胺（DIPEA）。

保护氨基酸与缩合剂的摩尔比如下：保护氨基酸：HBTU：HOBt：DIPEA=3: 2.55 :3 :9。

封端试剂配方（体积比）：二氯甲烷：甲醇：N,N’-二异丙基乙胺=24:4.5:1.5

脱保护试剂配方（体积比）：六氢吡啶：N,N’-二甲基甲酰胺=25: 75。

检验试剂配方：茚三酮一水合物4克完全溶解于100毫升无水乙醇。

切割液配方（体积比）：三氟乙酸：二异丙基硅烷：水=95: 2.5: 2.5。

所使用的保护氨基酸有：芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-谷氨酸、Nε-芴甲氧羰基-Nα-叔丁氧羰基-L-赖氨酸、Nα-芴甲氧羰基-Nω-(2,2,4,6,7-五甲基苯并二氢呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸、Nα-芴甲氧羰基-N(in)-叔丁氧羰基-L-色氨酸、芴甲氧羰酰基-6-氨基己酸。

溶剂：N,N’-二甲基甲酰胺、二氯甲烷中的一种。

实施例2、本发明亲水性多肽KE的制备

1、芴甲氧羰基（Fmoc）保护的左旋多巴（DOPA）的合成方法参照实施例1。

2、亲水性多肽KE的合成方法参照实施例1，仅按照如下顺序替换氨基酸进行合成：

第一个氨基酸：赖氨酸、第二个氨基酸：谷氨酸、第三个氨基酸、赖氨酸、第四个氨基酸：谷氨酸、第五个氨基酸：赖氨酸、第六个氨基酸：谷氨酸、第七个氨基酸：赖氨酸、第八个氨基酸：谷氨酸、第九个氨基酸：氨基己酸、第十个氨基酸：Fomc保护的DOPA、第十一个氨基酸：Fomc保护的DOPA、第十二个氨基酸：Fomc保护的DOPA、第十三个氨基酸：Fomc保护的DOPA。

使用液相质谱与核磁共振氢谱鉴定目标多肽：

¹H NMR：（400 MHz, DMSO-d ₆） δ 8.29–7.69（m, 12H），4.32–4.07（m, 20H），3.30–3.10（m, 9H）, 2.96（dt, 7H），2.83–2.65 （m, 20H），2.42–2.06 （m, 29H），1.97–1.83（m,9H），1.81–1.15（m, 18H）.

LC-MS：实际值为：[M+3H⁺]/3Z=626.40，[M+2H⁺]/2Z=937.20；与理论值：[M+3H⁺]/3Z=625.29，[M+2H⁺]/2Z=938.94相符。

确认结构如下并命名为KE：

实施例3、本发明自组装抗菌肽组合物

将实施例1的自组装抗菌肽WR和实施例2的亲水性多肽KE按照质量比1:1的比例混合。

实施例4、本发明基于自组装抗菌肽WR的药物载体的制备

取实施例1制备的自组装抗菌肽WR加入水中（浓度500μg/mL）超声溶解即得。

实施例5、本发明基于自组装抗菌肽WR和亲水性多肽KE的药物载体的制备

取实施例1制备的自组装抗菌肽WR、实施例2制备的亲水性多肽KE加入水中（WR与KE的质量比为1:1，配置后的浓度以WR计，均为500μg/mL），超声即得。

实施例6、本发明基于自组装抗菌肽WR的载药体系的制备

抗生素利福平加入二甲亚砜中溶解至100mg/mL，取10μL加入实施例1制备的2mL自组装抗菌肽WR的水溶液（WR浓度为500μg/mL），超声2小时。随后将溶液转移至截留分子量为1000的透析袋中避光透析过夜。

实施例7、本发明基于自组装抗菌肽WR的载药体系的制备

抗肿瘤药物阿霉素加入二甲亚砜中溶解至100mg/mL，取10μL加入实施例1制备的2mL自组装抗菌肽WR的水溶液（WR浓度为500μg/mL），超声2小时。随后将溶液转移至截留分子量为1000的透析袋中避光透析过夜。

实施例8、本发明基于自组装抗菌肽WR和亲水性多肽KE的共组装体系的制备

抗生素利福平加入二甲亚砜中溶解至100mg/mL，取10μL加入实施例1制备的2mL自组装抗菌肽WR和实施例2制备的亲水性多肽KE的混合水溶液（WR浓度为500μg/mL，KE浓度为500μg/mL），超声2小时。随后将溶液转移至截留分子量为1000的透析袋中避光透析过夜。

实施例9、本发明基于自组装抗菌肽WR和亲水性多肽KE的共组装体系的制备

抗肿瘤药物阿霉素加入二甲亚砜中溶解至100mg/mL，取10μL加入实施例1制备的2mL自组装抗菌肽WR和实施例2制备的亲水性多肽KE的混合水溶液（WR浓度为500μg/mL，KE浓度为500μg/mL），超声2小时。随后将溶液转移至截留分子量为1000的透析袋中避光透析过夜。

实施例10、本发明自组装抗菌肽的制备

2、自组装抗菌肽的合成方法参照实施例1，仅按照如下顺序替换氨基酸进行合成：

第一个氨基酸：色氨酸、第二个氨基酸：精氨酸、第三个氨基酸：色氨酸、第四个氨基酸：精氨酸、第五个氨基酸：色氨酸、第六个氨基酸：精氨酸、第七个氨基酸：氨基戊酸、第八个氨基酸：Fomc保护的DOPA、第九个氨基酸：Fomc保护的DOPA、第十个氨基酸：Fomc保护的DOPA；

制得结构如下的自组装抗菌肽：

。

实施例11、本发明自组装抗菌肽的制备

第一个氨基酸：色氨酸、第二个氨基酸：精氨酸、第三个氨基酸：色氨酸、第四个氨基酸：精氨酸、第五个氨基酸：色氨酸、第六个氨基酸：精氨酸、第七个氨基酸：氨基庚酸、第八个氨基酸：Fomc保护的DOPA、第九个氨基酸：Fomc保护的DOPA、第十个氨基酸：Fomc保护的DOPA、第十一个氨基酸：Fomc保护的DOPA、第十二个氨基酸：Fomc保护的DOPA；

制得结构如下的自组装抗菌肽：

。

实施例12、本发明亲水性多肽的制备

2、亲水性多肽的合成方法参照实施例1，仅按照如下顺序替换氨基酸进行合成：

第一个氨基酸：赖氨酸、第二个氨基酸：谷氨酸、第三个氨基酸：赖氨酸、第四个氨基酸：谷氨酸、第五个氨基酸：赖氨酸、第六个氨基酸：谷氨酸、第七个氨基酸：赖氨酸、第八个氨基酸：谷氨酸、第九个氨基酸：氨基戊酸、第十个氨基酸：Fomc保护的DOPA、第十一个氨基酸：Fomc保护的DOPA、第十二个氨基酸：Fomc保护的DOPA；

制得如下结构的亲水性多肽：

实施例13、本发明亲水性多肽的制备

第一个氨基酸：赖氨酸、第二个氨基酸：谷氨酸、第三个氨基酸：赖氨酸、第四个氨基酸：谷氨酸、第五个氨基酸：赖氨酸、第六个氨基酸：谷氨酸、第七个氨基酸：赖氨酸、第八个氨基酸：谷氨酸、第九个氨基酸：氨基庚酸、第十个氨基酸：Fomc保护的DOPA、第十一个氨基酸：Fomc保护的DOPA、第十二个氨基酸：Fomc保护的DOPA、第十三个氨基酸：Fomc保护的DOPA、第十四个氨基酸：Fomc保护的DOPA；

制得如下结构的亲水性多肽：

以下通过实验例证明本发明的有益效果。

实验例1、本发明自组装抗菌肽自组装性质的验证

1、实验方法

配制三组多肽溶液：

（1）WR组：实施例1的自组装抗菌肽WR加入水中配制浓度为：1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL、15.6μg/mL、7.8μg/mL、3.9μg/mL、1.9μg/mL、0.95μg/mL、0.48μg/mL的溶液；

（2）KE组：实施例2的亲水性多肽KE加入水中配制浓度为：1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL、15.6μg/mL、7.8μg/mL、3.9μg/mL、1.9μg/mL、0.95μg/mL、0.48μg/mL的溶液；

（3）MIX组：实施例3的自组装抗菌肽组合物加入水中，配制多肽浓度为：1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL、15.6μg/mL、7.8μg/mL、3.9μg/mL、1.9μg/mL、0.95μg/mL、0.48μg/mL 的溶液；

使用芘荧光探针法测定三组多肽的临界自组装浓度（CAC）。在1.5mL微量离心管中加入等量的芘，再加入梯度浓度的三组多肽溶液，室温条件下避光超声40分钟，再转移至37℃恒温摇床中避光孵育过夜。使用荧光分光光度计测定溶液的荧光发射光谱，激发波长334nm，激发狭缝2.5nm，发射狭缝2.5nm，扫描速度500nm/min。所得荧光谱图，取其波长λ₁=373nm与波长λ₃=384nm对应的荧光强度I ₁与I ₃的比值I ₁/I ₃作图并进行拟合，得到临界自组装浓度。

自组装体的结构的验证是通过亲水性荧光物质罗丹明6G（R6G）的荧光强度的变化实现的。R6G配置为0.5mg/mL的丙酮溶液，取等体积的R6G丙酮溶液分别滴加至超声中的2mL1mg/mL的多肽溶液，超声2小时后，转移至截留分子量为500的透析袋中，室温避光透析过夜。使用酶标仪获得与样品同浓度的R6G水溶液作为对照。使用荧光分光光度计测定荧光光谱，激发波长为530nm，激发狭缝为2.5nm，发射狭缝为2.5nm，扫描速度为500nm/min，并比较样品与相应对照的荧光强度。

此外，借助透射电子显微镜（TEM）观察了自组装体的结构。使用马尔文粒径仪测定了自组装粒子随时间变化的情况。配置浓度为500μg/mL的WR与MIX水溶液，测定自组装体在0小时、12小时、24小时、48小时与72小时5个时间点下的粒径的变化。

2、实验结果

通过对CAC的测定，我们对荧光强度I ₁与I ₃的比值I ₁/I ₃对浓度的Lg值作图并进行拟合，得到CAC，结果如图1所示，可以看出，多肽KE不存在自组装行为；多肽WR拥有较小的CAC，为9.02μg/mL，说明WR能够在较低浓度水平发生自组装；而将KE、WR混合后，能够发现WR的CAC上升至19.19μg/mL，说明KE的加入改善了WR的自组装行为，提高了其亲水性，表现为CAC的增大。

TEM观测自组装提结构如图2所示，进一步证明了自组装体为典型的囊泡结构，且马尔文粒径仪测试结果可看出有KE的加入，WR的粒径也有所减小（表1）。

R6G作为亲水性荧光染料，可以进入囊泡的亲水夹层，进而发生聚集诱导淬灭现象，表现为荧光强度的明显下降。图3的测试结果，自组装体在波长560nm左右处的荧光强度明显降低，证实了自组装体为囊泡结构，能够作为载药平台包载多种药物。

实验例2、本发明自组装抗菌肽生物相容性的验证

1、实验方法

细胞毒性：基于MTT法测定了多肽对RAW 264.7的细胞毒性。细胞均以10⁵个/孔的密度种植于孔板中。孔板在含有5%CO₂的37℃恒温培养箱中孵育24小时后，加入事先使用完全培养基配置的不同浓度的多肽（实施例1的自组装抗菌肽WR、实施例2的亲水性多肽KE、实施例3的自组装抗菌肽组合物MIX、对照组多肽MP196）溶液，并继续培养24小时。向孔板中加入20μL 5mg/mL的MTT溶液，孵育4小时，弃去上清，加入150μL二甲亚砜，15分钟后，使用酶标仪测定495nm下的吸光度。

溶血活性：取人新鲜静脉血于采血管，经过离心洗涤，收集红细胞，加入生理盐水成为10%红细胞悬液。将样品梯度对半稀释，获得浓度范围为250μg/mL~15.625μg/mL。将样品加入到等体积的红细胞悬液中，于37℃恒温培养箱中孵育1小时。离心，取上清液200μL至96孔板中，使用酶标仪测定于570nm处的吸光度，并计算溶血率。

2、实验结果

使用细胞毒性测试与溶血活性测试表征了各多肽的生物相容性（图4）。多肽在任意测试浓度下，均未表现出明显的细胞毒性（图4）。溶血活性的测试也表明相较于多肽MP196，WR、MIX均表现出明显的溶血率降低。可以认为KE、WR与MIX均具备较好的生物相容性。

实验例3、本发明自组装抗菌肽抗菌活性的验证

1、实验方法

最低抑菌浓度（MIC）的测定：测定了多肽对革兰氏阴性菌—大肠杆菌（ATCC25922）和革兰氏阳性菌—金黄色葡萄球菌(S.aureus ATCC 6538)的最低抑菌浓度。在96孔板中，每孔加入无菌LB液体培养基100μL。在第一行第一孔中加入100μL样品（实施例1的自组装抗菌肽WR、实施例2的亲水性多肽KE、实施例3的自组装抗菌肽组合物MIX、对照组阿莫西林、诺氟沙星、环丙沙星）浓度1mg/mL，混匀后取出100μL液体加入到第一行第二孔中，混匀后再取出100μL液体加入到第一行第三孔中，以此类推，即为梯度稀释，最后弃去100μL多余的液体，得到样品浓度范围为500μg/mL~0.244μg/mL。将细菌浓度调节至~10⁵CFU/mL，向孔中加入100μL菌液，最后总体积为200μL。于37℃恒温培养箱中培养16~18h，取出后向孔中加入10μL含有0.5% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)的水溶液，置于37℃恒温培养箱中，15min后观察完全抑制细菌生长的多肽最低浓度，即为最低抑菌浓度。

多肽诱导耐药性实验：反复以低于最低抑菌浓度的样品（实施例1的自组装抗菌肽WR、实施例2的亲水性多肽KE、实施例3的自组装抗菌肽组合物MIX、对照组阿莫西林、诺氟沙星、环丙沙星）浓度刺激细菌以评价多肽诱导细菌产生耐药性的速度。本实验以金黄色葡萄球菌(ATCC6538)作为实验菌株。将纯化后的细菌悬液调节至~10⁵CFU/mL。按照上述方法得到样品的最低抑菌浓度后，取0.5倍最低抑菌浓度对应菌液进行稀释，继续按照上述方法测试其最低抑菌浓度，重复测试30代（15天）。将细菌代数与最低抑菌浓度变化倍数作图，得到多肽诱导耐药曲线，以评价其诱导耐药性。市售常用抗生素诺氟沙星作为对照。

2、实验结果

最低抑菌浓度的测试是为了验证所得自组装体抗菌性能的重要的基础参数。本实验使用了革兰氏阴性菌—大肠杆菌，与革兰氏阳性菌—金黄色葡萄球菌来测定含有邻苯二酚基团的抗菌肽自组装体的抗菌性能。市售抗生素阿莫西林、诺氟沙星和环丙沙星作为对照样品。测试结果如下：

表2 多肽与市售抗生素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度

从上表可以看出，KE为两性离子多肽，不存在明显的抗菌活性，但是WR及MIX则具备较低的最低抑菌浓度。WR及MIX对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度均低于市售抗生素阿莫西林；WR及MIX对大肠杆菌的最低抑菌浓度低于诺氟沙星，对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度也低于环丙沙星。总的来说，WR及MIX均具备较好的抗菌性能。

由图5可以看出，本发明自组装抗菌肽体系的最低抑菌浓度变化倍数远远小于市售抗生素诺氟沙星。诺氟沙星从第16代开始，最低抑菌浓度大幅上升，说明细菌已经产生对诺氟沙星的耐药性了。而多肽抗菌体系WR与MIX的最低抑菌浓度均保持在较低水平，且变化幅度不大，说明细菌未产生对多肽的耐药性。证明了多肽体系比抗生素更不易诱导细菌发生耐药性。

实验例4、本发明自组装抗菌肽多肽包载药物能力的测定

1、实验方法

鉴于多肽的自组装结构，选用抗生素利福平（50mg/mL的二甲亚砜溶液）与抗肿瘤药物阿霉素（20mg/mL的二甲亚砜溶液）两种药物进行包载以表征其载药能力。将利福平（20μL）与阿霉素（50μL）加入超声中的2mL多肽溶液（WR组中WR浓度为500μg/mL；MIX组中WR与KE浓度均为500μg/mL），超声2小时。随后将多肽溶液转移至截留分子量为1000的透析袋中避光透析48小时。使用酶标仪建立药物浓度与吸光度的标准曲线，并测定多肽溶液中的药物浓度，根据标准曲线计算药物浓度，并计算包载率与载药量。

2、实验结果

已经验证了WR与MIX能够发生自组装，且自组装结构为囊泡，可以作为自组装药物递送平台。我们选取了抗生素利福平与抗肿瘤药物阿霉素作为包载的对象，测试了WR与MIX的载药能力。

表3 WR与MIX的载药能力

通过测定多肽自组装体对两种药物的负载能力，KE的加入，使得包载药物的能力有明显的提升，能够负载更多的药物。多肽自组装体系表现出较好的载药能力，能够有效负载药物进行治疗。

综上所述，本发明自组装抗菌肽WR与自组装抗菌肽组合物MIX具备较好的抗菌性能，且比抗生素更不易产生耐药性的特点，还有抗生素所不具备的自组装性能，说明本体系制备的含邻苯二酚基团的自组装抗菌肽体系不仅是较好性能的抗菌药物体系，更可以作为自组装药物递送平台，应用前景广泛。