CN118290726A - 一种pH响应大分子及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于抗菌技术领域，公开了一种pH响应大分子及其制备方法和应用。本发明大分子为带有氨基或胺基和磺酰胺基的缩聚型大分子。在胃液的酸性环境下，本发明大分子带有正电荷，具有抗菌活性，可以杀死胃中的幽门螺旋杆菌；而在肠道的中性环境下，本发明大分子不带电荷或带少量电荷，不具有抗菌活性，因此不会影响肠道的正常菌群，毒副作用更小。同时本发明的大分子具有很好的生物安全性和生物相容性，幽门螺旋杆菌不易对其产生耐药性。

Description

一种pH响应大分子及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于抗菌技术领域，尤其涉及一种pH响应大分子及其制备方法和应用。

背景技术

幽门螺旋杆菌是目前常见的一种寄居在人体胃黏膜的微厌氧革兰氏阴性菌，具有易感染的特点。感染幽门螺旋杆菌常会带来胃部炎症、溃疡、肿瘤甚至癌症等严重的消化系统疾病。国际抗癌组织和世界卫生组织将其列为1类致癌物，1～3％的幽门螺旋杆菌感染者会发展为胃癌。此外，据研究表明，幽门螺旋杆菌感染还会导致如心脏病、缺铁性贫血、阿尔兹海默症、骨质疏松等多种非消化系统疾病。

目前对于幽门螺旋杆菌的治疗，主要采取仍为“四联”治疗法，即质子泵抑制剂+胃黏膜保护剂+两种抗生素。但该方法疗程一般为一周左右，但由于细菌产生了耐药性，目前的疗程为二周左右，未来的疗程可能更长。该疗法存在用药种类多、用药量大的缺陷，易产生严重的毒副作用；易复发，复发后由于耐药性需要更大剂量和更长时间的治疗；且因为抗生素的广谱杀菌的性能，在抗幽门螺旋杆菌的过程中也会对人体正常或有益的肠道菌群产生影响，可能会出现肠道不适、导致肠道菌群失调、导致肝肾功能损伤副作用。据研究肠道菌群对于大脑行为也有巨大影响，包括焦虑、抑郁、自闭症谱系障碍、癫痫、帕金森病都与肠道菌群有着密切的联系。长期服用抗生素还可能导致过敏、血小板下降、贫血等不良后果。

与传统小分子抗生素相比，阳离子抗菌肽和模拟阳离子抗菌肽的抗菌聚合物引起人们极大的关注。阳离子抗菌肽或抗菌聚合物带有大量正电荷，可以与细菌的细胞膜表面的负电荷结合，进而使得细菌的细胞膜破裂。此机理与传统抗生素针对单一位点杀菌机理不同，不会因为单一位点突变产生而丧失耐药性，所以细菌不易对其产生耐药性，同时具有更好的生物安全性和生物相容性。

为了克服抗生素广谱杀菌性能造成的对人体正常或有益的肠道菌群产生影响缺陷，开发胃液酸性环境下可以杀死幽门螺旋杆菌、同时在肠道的中性环境下对正常的肠道菌群不产生影响的抗菌素引发了很多关注。Menghua Xiong等合成了胃液pH-响应性抗菌肽，所合成的抗菌肽在模拟胃液的酸性环境中具有杀菌性能，在pH 3的介质中有很强的杀死幽门螺旋杆菌的活性，在pH＝4的介质中的杀菌性能降低较多，而在模拟肠道的中性环境下(pH 7.4)该抗菌肽没有抗菌活性；JiaxinZhang等组构建了富勒醇纳米粒，其在pH＝2.2的环境下呈现类似过氧化物酶的活性，因而具有杀菌作用，而在pH 3～7的环境下不具有这样的活性；LufengZhang等构建了在由铂和钴组成的纳米粒子上沉积石墨烯的纳米酶，该纳米酶在酸性环境下具有类氧化酶的活性而具有杀菌作用，在pH 3时类氧化酶的活性最高，而在pH＝4以上时活性很低。目前报道的这些胃液pH感应抗菌剂都只能在pH很低(如pH 2～4)的环境下可以杀死幽门螺旋杆菌，在pH值大于4的环境中的抗菌活性往往较低甚至完全没有抗菌活性，这样的pH值感应范围的抗菌剂是针对正常人的肠胃道pH值而设计的。但幽门螺旋杆菌患者的胃液的pH值较正常人的高，如Jihee Sung等报道，正常人胃液的平均pH值为2.46，而幽门螺旋杆菌患者的胃液的平均pH值为4.54。显然上述的几种pH感应抗菌剂是不太适合作为治疗幽门螺旋杆菌的抗菌剂的，而且这些抗菌剂还有制备过程复杂、制备成本高的缺点。

因此，亟待探索出一种pH响应大分子，既不易产生耐药性，同时相较于目前已有pH响应抗菌剂来说杀菌范围更加精准，可以在幽门螺旋杆菌患者的胃液的环境下具有杀菌能力，而在肠道的中性环境下不具有杀菌能力，因而不会影响肠道的正常菌群。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种pH响应大分子，不易产生耐药性，只针对于胃中幽门螺旋杆菌具有杀菌作用，杀菌范围更加精准，可以在幽门螺旋杆菌患者的胃液的环境下具有杀菌能力，而在肠道的中性环境下不具有杀菌能力，不会影响肠道的正常菌群，安全无副作用。

本发明的另一目的在于提供一种大分子的制备方法、抗菌剂及应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种大分子，所述大分子具有如下式I结构：

其中，R₁选自含有胺基或氨基的缩聚型大分子；R₂选自以下任一结构：

优选的，所述含有胺基或氨基的缩聚型大分子中部分胺基或氨基通过酰胺键引入磺酰胺基。

优选的，所述磺酰胺基取代胺基或氨基的数目为10％～80％。

优选的，所述含有胺基或氨基的缩聚型大分子包括侧链带有胺基或氨基的聚氨基酸类、侧链带有胺基或氨基的聚烯烃类或氨基化的超支化聚甘油。

优选的，所述含有胺基或氨基的缩聚型大分子包括线性聚赖氨酸、聚酰胺、超支化聚赖氨酸、超支化聚氨基酸、树枝状聚酰胺-胺、支化聚乙烯亚胺、树枝状聚丙烯亚胺或氨基化的超支化聚甘油。

优选的，所述大分子在pH≥6条件下ζ电位为＜+2mV，在pH＜6条件下ζ电位为≥+2mV。

优选的，所述大分子平均分子量为1500～40000Da。

本发明还提供了一种上述任意一项所述的大分子的制备方法，包括以丁二酸酐为桥梁通过两步酰胺化反应将磺酰胺类化合物与含有胺基或氨基的缩聚型大分子上的胺基或氨基相连，制得最终产物。

本发明还提供了一种抗菌剂，包含上述任意一项所述大分子。

本发明还提供了一种上述任意一项所述的大分子或上述制备方法或上述抗菌剂在制备预防和/或治疗幽门螺旋杆菌感染的产品中的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供的pH响应大分子为带有氨基或胺基和磺酰胺基的缩聚型大分子，通过磺酰胺基在环境pH值大于其pKa值时带负电，环境pH值小于其pKa值时不带电来实现pH响应，且因为酸性条件下大分子表面带有大量正电荷，可以与细菌的细胞膜表面的负电荷结合，进而使得细菌的细胞膜破裂。因此，在胃液的酸性环境下，本发明大分子带有正电荷，具有抗菌活性，可以杀死胃中的幽门螺旋杆菌；而在肠道的中性环境下，本发明大分子不带电荷或带少量电荷，不具有抗菌活性，因此不会影响肠道的正常菌群，毒副作用更小。同时本发明的大分子具有很好的生物安全性和生物相容性，幽门螺旋杆菌不易对所述的大分子抗菌剂产生耐药性。

附图说明

图1为以实施例1为例，产物的化学式及核磁氢谱图；其中图1中的A：超支化聚赖氨酸化学式及核磁氢谱图；B：丁二酸酐修饰磺胺甲噻二唑化学式及核磁氢谱图；C：丁二酸酐修饰磺胺甲噻二唑接枝超支化聚赖氨酸化学式及核磁氢谱图；

图2为大分子在不同pH条件下对幽门螺旋杆菌和大肠杆菌杀菌效果的电镜图；其中图1中的A为pH＝7.4条件下实施例1大分子对幽门螺旋杆菌作用后细胞形态；B为pH＝6条件下实施例1大分子对大肠杆菌作用后细胞形态；C为pH＝5条件下实施例1大分子对幽门螺旋杆菌作用后细胞形态；D为pH＝7.4条件下实施例2大分子对幽门螺旋杆菌作用后细胞形态；E为pH＝6条件下实施例2大分子对大肠杆菌作用后细胞形态；F为pH＝5条件下实施例2大分子对幽门螺旋杆菌作用后细胞形态；标尺为1μm；

图3为小鼠胃部革兰氏染色结果；其中图2中的A为对照组的革兰氏染色小鼠胃切片图；B为三联治疗组的革兰氏染色小鼠胃切片图；C为实施例1大分子治疗组的革兰氏染色小鼠胃切片图；标尺为1μm；

图4为小鼠胃部HE染色结果；其中图3中的A为对照组的HE染色小鼠胃细胞图；B为三联治疗组的HE染色小鼠胃细胞图；C为实施例1大分子治疗组的HE染色小鼠胃细胞图；标尺为1μm；

图5为微生物分类单元数统计图；图中实验组1为实施例1大分子，实验组2为实施例2大分子，实验组3为实施例3大分子；其中横坐标依据样本名排列，纵坐标为门、纲、目、科、属、种六个水平各自含有的分类单元数。

具体实施方式

本发明提供了一种大分子，所述大分子具有如下式I结构：

其中，R₁选自含有胺基或氨基的缩聚型大分子；R₂选自以下任一结构：

在本发明中，所述大分子为缩聚型大分子；优选为缩聚型线性大分子或缩聚型支化大分子。

在本发明中，所述含有胺基或氨基的缩聚型大分子包括含有胺基或氨基的缩聚型线性大分子或含有胺基或氨基的缩聚型支化大分子。作为一种可实施方式，所述含有胺基或氨基的缩聚型大分子中部分胺基或氨基通过酰胺键引入磺酰胺基；所述磺酰胺基取代胺基或氨基的数目为10％～80％；优选为20％～50％。在一些实施例中，所述含有胺基或氨基的缩聚型大分子包括侧链带有胺基或氨基的聚氨基酸类、侧链带有胺基或氨基的聚烯烃类或氨基化的超支化聚甘油；优选的，所述含有胺基或氨基的缩聚型大分子包括线性聚赖氨酸、聚酰胺、超支化聚赖氨酸、超支化聚氨基酸、树枝状聚酰胺-胺、支化聚乙烯亚胺、树枝状聚丙烯亚胺或氨基化的超支化聚甘油等。所述超支化聚氨基酸为赖氨酸与中性氨基酸的超支化共聚物；所述中性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸等。

在本发明中，所述大分子在pH≥6条件下ζ电位＜+2mV，在pH＜6条件下ζ电位为≥+2mV；优选的，所述大分子在pH＝6～7.4条件下ζ电位为＜+2mV，在pH≤5.5条件下ζ电位为≥+2mV；更优选的，所述大分子在pH＝6～7.4条件下ζ电位为-5mV～0mV，在pH≤5.5条件下ζ电位为+2mV～+20mV。由于正常生理条件下，带正电的大分子易被清除，所以在正常生理条件及pH＝7.4条件下，所述大分子为电中性或略带负电荷更优。

在本发明中，对所述大分子的平均分子量没有特殊限定；优选为1500～40000Da；更优选为2400～10000Da。

本发明大分子带有氨基或胺基和磺酰胺基，在幽门螺旋杆菌患者的胃液的环境(pH≤5.5)下，由于氨基或胺基以质子化的形式存在，因而带有正电荷；而磺酰胺基全部或大部分以非电离的形式存在，因而整个大分子带有净正电荷，且非离子化的磺酰胺基具有一定的疏水性，使得带正电荷的大分子能够与幽门螺旋杆菌的细胞膜结合而破坏细胞膜，从而杀死幽门螺旋杆菌。当所述的大分子进入肠道后，由于肠道的环境为中性，在中性环境下，大分子上的氨基或胺基仍然以质子化的形式存在，带正电荷，而大分子上的磺酰胺基发生去质子化的过程而带负电荷，使得大分子整体为电中性或带很少的(正或负)电荷。由于电中性或带少量电荷的大分子不具有杀菌性能，因而本发明大分子对肠道的正常菌群没有影响或影响很小。

本发明大分子pH响应的主要机理是电离基团质子化。磺胺(对氨基苯磺胺衍生物的总称)是一种可电离基团，不同pKa的磺胺种类高达15,000种类。介于此原理，本发明可以选择合适pKa的磺胺，并与阳离子聚合物结合，使其大分子在肠道的中性环境下显中性或微带负电荷而没有杀菌作用；而在胃部由于胃酸的作用使得磺胺基团不带电，从而整个大分子带正电荷具有很好的杀菌作用。

本发明还提供了一种上述任意一项所述的大分子的制备方法，包括以丁二酸酐为桥梁通过两步酰胺化反应将磺酰胺类化合物与含有胺基或氨基的缩聚型大分子上的胺基或氨基相连，制得最终产物。

在本发明中，对所述含有胺基或氨基的缩聚型大分子来源没有特殊限定，可以通过现有方法制备，或稍加改进的方法进行制备，或直接购买获得。作为一种可实施方式，所述超支化聚赖氨酸的制备方法为，L-赖氨酸盐酸盐与氢氧化钾加热一锅法制备(参考文献：M.Scholl,et al.,J.Polym.Sci.APolym.Chem.2007,45,5494-5508)，通过控制反应温度在150-160℃，并且聚合物的分子量大小随反应时间延长而变大，通过控制时间长短来获得所需大小分子量，例如获得2650Da平均分子量的聚合物需要20h。所述赖氨酸与中性氨基酸的超支化共聚物的制备方法为，以赖氨酸和中性氨基酸为原料，加入氢氧化钾，采用一锅法进行制备，通过控制反应温度在150-160℃，并且聚合物的分子量大小随反应时间延长而变大，通过控制时间长短来获得所需大小分子量，例如获得2000Da平均分子量的聚合物需要20h。

在本发明中，所述两步酰胺化反应包括丁二酸酐与磺酰胺类化合物的酰胺化反应，以及被丁二酸酐修饰的磺酰胺类化合物与含有胺基或氨基的缩聚型大分子上的胺基或氨基进行酰胺化反应。

作为一种可实施方式，所述丁二酸酐与磺酰胺类化合物的酰胺化反应，方法为将丁二酸酐与磺酰胺类化合物溶解在DMF中，通过4-二甲氨基吡啶催化，反应结束后在0.1M的NaOH溶液中透析过夜，后用稀盐酸调pH，直到产生沉淀，后将沉淀真空干燥，得到的产物即为被丁二酸酐修饰的磺酰胺类化合物。

作为一种可实施方式，所述被丁二酸酐修饰的磺酰胺类化合物与含有胺基或氨基的缩聚型大分子上的胺基或氨基进行酰胺化反应，是将被丁二酸酐修饰的磺酰胺类化合物与含有胺基或氨基的缩聚型大分子溶解在溶剂中，通过偶联剂制备而成。所述溶剂为去离子水、缓冲溶液或有机溶剂中的一种或几种；所述缓冲溶液包括PBS溶液、NaHCO₃/Na₂CO₃缓冲溶液等；所述有机溶剂包括二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、甲醇、乙醇、乙腈、二甲基亚砜、二氯甲烷、氯仿、甲苯或四氢呋喃等。所述偶联剂包括N-羟基丁二酰亚胺和碳酰二亚胺盐酸盐、二环己基碳二亚胺和2,2-二羟甲基丙酸或卡宾二硼酸和1-氯-2，4-二硝基苯等。所述被丁二酸酐修饰的磺酰胺类化合物与含有胺基或氨基的缩聚型大分子通过偶联剂偶联反应后，经分离、干燥得到产物。所述分离方法包括透析或使用沉淀剂沉淀；所述沉淀剂沉淀方法包括，偶联反应后，除去大部分溶剂或直接溶解于有机溶剂中，加入沉淀剂进行沉淀，分离得到大分子产物；所述除去大部分溶剂方法可选择本领域常规方法，包括旋蒸法或减压浓缩法；所述沉淀剂沉淀方法中的有机溶剂包括甲醇等；所述沉淀剂包括乙酸乙酯或乙醚等。

本发明还提供了一种抗菌剂，包含上述任意一项所述大分子。

在本发明中，所述抗菌剂中所述大分子可以是一种，也可以是多种。所述抗菌剂中所述大分子可以作为唯一有效成分，也可包含其他有效成分。本发明抗菌剂可以制备成各种剂型，抗菌剂中还可包含各剂型可接受的辅料。

本发明还提供了一种上述任意一项所述的大分子或上述制备方法或上述抗菌剂在制备预防和/或治疗幽门螺旋杆菌感染的产品中的应用。

在本发明中，所述产品包括药品。作为一种可实施方式，所述产品中大分子或抗菌剂可以作为预防和/或治疗幽门螺旋杆菌感染的唯一有效成分，也可含有具有预防和/或治疗幽门螺旋杆菌感染的其他活性成分。所述产品可以用于预防和/或治疗幽门螺旋杆菌感染引起的慢性胃炎、消化性溃疡病、甚至胃癌等。所述产品可以单独使用，也可与其他药品、治疗手段共同使用。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

将2.6g丁二酸酐与1.9g磺胺甲噻二唑溶解在50mL DMF中，加入0.23g4-二甲氨基吡啶，反应结束后在500mL浓度为0.1M的NaOH溶液中透析过夜，后用稀盐酸调pH，直到产生沉淀，后将沉淀真空干燥，得到丁二酸酐修饰的磺胺甲噻二唑。

超支化聚赖氨酸(HBPL)制备方法：采用“一锅法”合成HBPL。称取22.12g L-赖氨酸盐酸盐，和6.79g氢氧化钾，转移到500mL的三口烧瓶中，使用配套的搅拌桨以150rpm的转速，搅拌1h，全程通入氩气保护。待药品充分搅拌均匀后会成为粘稠浆状，继续保持通入氩气，并将反应体系开始升温至150℃，当温度到达150℃时开始计时，反应20h，得到平均分子量为2650Da的超支化赖氨酸。反应结束后，将其用500Da透析袋在去离子水透析48h，然后冷冻干燥得到最终产物。

将1g平均分子量为2650Da的超支化聚赖氨酸溶解在50mL去离子水中然后加入溶解在50mL DMF中活化后的1.2g丁二酸酐修饰的磺胺甲噻二唑，0.7gN-羟基丁二酰亚胺和0.8g碳酰二亚胺盐酸盐混合均匀，通入氩气，在37℃下，反应24h，后经过透析，冷冻干燥得到最终产物。

经核磁共振波谱法检测，最终产物为丁二酸酐修饰磺胺甲噻二唑接枝超支化聚赖氨酸大分子，即带有氨基或胺基和磺酰胺基的缩聚型大分子，化学式和核磁氢谱图如图1所示。

实施例2

以2.6g丁二酸酐与1.5g磺胺乙酰胺，采用实施例1相同的方法，制备得到丁二酸酐修饰的磺胺乙酰胺。

超支化赖氨酸-亮氨酸制备方法：采用“一锅法”合成超支化赖氨酸-亮氨酸共聚物。称取L-赖氨酸盐酸盐18g、L-亮氨酸4g和氢氧化钾6.5g，转移到500mL的三口烧瓶中，使用配套的搅拌桨以150rpm的转速，搅拌1h，全程通入氩气保护。待药品充分搅拌均匀后会成为粘稠浆状，继续保持通入氩气，并将反应体系开始升温至150℃，当温度到达150℃时开始计时，反应30h，即得到平均分子量为3000Da的超支化赖氨酸-亮氨酸。反应结束后经过用500Da透析袋在去离子水透析48h，然后冷冻干燥得到最终产物。

将2g平均分子量为3000Da的超支化赖氨酸-亮氨酸(赖氨酸和亮氨酸含量比为6：4)和2.3g丁二酸酐修饰的磺胺乙酰胺溶于水和DMSO的混合溶液，添加1.8g卡宾二硼酸和1.5g 1-氯-2，4-二硝基苯，通入氮气，在80℃下，反应12h，将聚合物用甲醇溶解，后用无水乙醚沉淀，干燥后得到最终产物。

经核磁共振波谱法检测，最终产物为丁二酸酐修饰磺胺乙酰胺接枝超支化赖氨酸-亮氨酸大分子，即带有氨基或胺基和磺酰胺基的缩聚型大分子。

实施例3

以2.6g丁二酸酐与2.1g磺胺氯哒嗪，采用实施例1相同的方法，制备得到丁二酸酐修饰的磺胺氯哒嗪。

超支化聚赖氨酸制备方法同实施例1，反应时间为30h，即得到平均分子量为3000Da的超支化聚赖氨酸。

将1g平均分子量为3000Da的超支化聚赖氨酸和1.2g丁二酸酐修饰的磺胺氯哒嗪溶于N,N-二甲基甲酰胺中，添加0.6g二环己基碳二亚胺和0.4g2,2-二羟甲基丙酸，通入氮气，在室温下，反应24h，后经过透析，冷冻干燥得到产物。

经核磁共振波谱法检测，最终产物为丁二酸酐修饰磺胺氯哒嗪接枝超支化聚赖氨酸大分子，即带有氨基或胺基和磺酰胺基的缩聚型大分子。

实施例4

以2.6g丁二酸酐与1.9g磺胺异恶唑，采用实施例1相同的方法，制备得到丁二酸酐修饰的磺胺异恶唑。

支化聚乙烯亚胺：购自上海阿拉丁生化科技有限公司，CAS编号：9002-98-6。

将1g平均分子量为2000Da的支化聚乙烯亚胺和1.5g丁二酸酐修饰的磺胺异恶唑溶解在水和N,N-二甲基甲酰胺混合溶液中，添加0.7g N-羟基丁二酰亚胺和0.8g碳酰二亚胺盐酸盐，通入氩气，在37℃下，反应18h，后旋蒸去除大部分溶剂，用乙醚沉淀，干燥后得到最终产物。

经核磁共振波谱法检测，最终产物为丁二酸酐修饰磺胺异恶唑接枝支化聚乙烯亚胺大分子，即带有氨基或胺基和磺酰胺基的缩聚型大分子。

实施例5

以2.6g丁二酸酐与2.3g磺胺喹恶啉，采用实施例1相同的方法，制备得到丁二酸酐修饰的磺胺喹恶啉。

聚酰胺-胺树枝状大分子：购自上海凯茵化工，CAS编号：202009-64-1。

将2g平均分子量为5000Da的聚酰胺-胺树枝状大分子和2g丁二酸酐修饰的磺胺喹恶啉在二甲基亚砜溶液中，添加1.2g二环己基碳二亚胺和0.8g2,2-二羟甲基丙酸，通入氩气，在60℃下，反应15h，后减压浓缩去除大部分溶剂，用乙醚沉淀得到最终产物。

经核磁共振波谱法检测，最终产物为丁二酸酐修饰磺胺喹恶啉接枝聚酰胺-胺树枝状大分子，即带有氨基或胺基和磺酰胺基的缩聚型大分子。

实施例6

以2.8g甲基丁二酸酐与1.9g磺胺甲恶唑，采用实施例1相同的方法，制备得到甲基丁二酸酐修饰的磺胺甲恶唑。

聚酰胺-胺树枝状大分子：购自上海凯茵化工，CAS编号：202009-64-1。

将1g平均分子量为3000Da的聚酰胺-胺树枝状大分子和1.2g甲基丁二酸酐修饰的磺胺甲恶唑在N,N-二甲基甲酰胺溶液中，添加0.7g N-羟基丁二酰亚胺和0.8g碳酰二亚胺盐酸盐，通入氮气，在37℃下，反应18h，后减压浓缩去除大部分溶剂，用乙醚沉淀，干燥得到最终产物。

经核磁共振波谱法检测，最终产物为丁二酸酐修饰磺胺甲恶唑接枝聚酰胺-胺树枝状大分子，即带有氨基或胺基和磺酰胺基的缩聚型大分子。

实施例7

以2.6g丁二酸酐与2.3g磺胺均三嗪，采用实施例1相同的方法，制备得到丁二酸酐修饰的磺胺均三嗪。

线性聚赖氨酸：购自上海阿拉丁生化科技有限公司，CAS编号：25104-18-1。

将2g平均分子量为5000Da的线性聚赖氨酸和2g丁二酸酐的磺胺均三嗪在50％甲醇溶液中，添加1.4gN-羟基丁二酰亚胺和1.6g碳酰二亚胺盐酸盐，通入氮气，在37℃下，反应18h，后减压浓缩去除大部分溶剂，用乙酸乙酯沉淀得到产物。

经核磁共振波谱法检测，最终产物为丁二酸酐修饰磺胺均三嗪接枝线性聚赖氨酸大分子，即带有氨基或胺基和磺酰胺基的缩聚型大分子。

实施例8

以2.6g丁二酸酐与1.9g磺胺吡啶，采用实施例1相同的方法，制备得到丁二酸酐修饰的磺胺吡啶。

超支化赖氨酸-丙氨酸制备方法：采用“一锅法”合成超支化赖氨酸-亮氨酸共聚物。称取L-赖氨酸盐酸盐18g、L-丙氨酸4g和氢氧化钾6.5g，转移到500mL的三口烧瓶中，使用配套的搅拌桨以150rpm的转速，搅拌1h，全程通入氩气保护。待药品充分搅拌均匀后会成为粘稠浆状，继续保持通入氩气，并将反应体系开始升温至150℃，当温度到达150℃时开始计时，反应45h，即得到平均分子量为5000Da的超支化赖氨酸-丙氨酸。反应结束后经过用500Da透析袋在去离子水透析48h，然后冷冻干燥得到最终产物。

将1g平均分子量为5000Da的超支化赖氨酸-丙氨酸共聚物与1g丁二酸酐修饰的磺胺吡啶，采用实施例1相同的方法进行缩合得到产物。

经核磁共振波谱法检测，最终产物为丁二酸酐修饰磺胺吡啶接枝超支化赖氨酸-丙氨酸大分子，即带有氨基或胺基和磺酰胺基的缩聚型大分子。

实施例9

以2.6g丁二酸酐与0.9g磺胺乙二唑，采用实施例1相同的方法，制备得到丁二酸酐修饰的磺胺乙二唑。

树枝状聚丙烯亚胺：购自上海梅凯科技有限公司，CAS编号：121263-90-9。

将1g平均分子量为3000Da的树枝状聚丙烯亚胺与0.6g丁二酸酐修饰的磺胺乙二唑，采用实施例1相同的方法进行缩合后得到产物。

经核磁共振波谱法检测，最终产物为丁二酸酐修饰磺胺乙二唑接枝树枝状聚丙烯亚胺大分子，即带有氨基或胺基和磺酰胺基的缩聚型大分子。

实施例10

采用实施例7相同的方法，制备得到丁二酸酐修饰的磺胺均三嗪。

支化聚乙烯亚胺：购自上海阿拉丁生化科技有限公司，CAS编号：9002-98-6。

将1g平均分子量为3500Da的支化聚乙烯亚胺与1g丁二酸酐修饰的磺胺均三嗪，采用实施例1相同的方法进行缩合得到产物。

经核磁共振波谱法检测，最终产物为丁二酸酐修饰磺胺均三嗪接枝支化聚乙烯亚胺大分子，即带有氨基或胺基和磺酰胺基的缩聚型大分子。

实施例11

采用实施例3相同的方法，制备得到丁二酸酐修饰的磺胺氯哒嗪。

线性聚赖氨酸：购自上海阿拉丁生化科技有限公司，CAS编号：25104-18-1。

将2g平均分子量为6000Da的线性聚赖氨酸与1.8g丁二酸酐修饰的磺胺氯哒嗪，采用实施例1相同的方法进行缩合得到产物。

经核磁共振波谱法检测，最终产物为丁二酸酐修饰磺胺氯哒嗪接枝线性聚赖氨酸大分子，即带有氨基或胺基和磺酰胺基的缩聚型大分子。

实施例12

采用实施例6相同的方法，制备得到丁二酸酐修饰的磺胺甲恶唑。

超支化赖氨酸-亮氨酸制备方法，与实施例2相同，反应时间为50h，即得到平均分子量为4500Da的超支化赖氨酸-亮氨酸。

将2g平均分子量为4500Da的超支化赖氨酸-亮氨酸与2g丁二酸酐修饰的磺胺甲恶唑，采用实施例1相同的方法进行缩合得到产物。

经核磁共振波谱法检测，最终产物为丁二酸酐修饰磺胺甲恶唑接枝超支化赖氨酸-亮氨酸大分子，即带有氨基或胺基和磺酰胺基的缩聚型大分子。

实施例13

采用实施例4相同的方法，制备得到丁二酸酐修饰的磺胺异恶唑。

树枝状聚丙烯亚胺：购自上海梅凯科技有限公司，CAS编号：121263-90-9。

将2g平均分子量为5000Da的树枝状聚丙烯亚胺与1.9g丁二酸酐修饰的磺胺异恶唑，采用实施例1相同的方法进行缩合得到产物。

经核磁共振波谱法检测，最终产物为丁二酸酐修饰磺胺异恶唑接枝树枝状聚丙烯亚胺大分子，即带有氨基或胺基和磺酰胺基的缩聚型大分子。

试验例1

将实施例1～13得到的大分子样品分别溶解在0.01M，pH＝7.4、6、5.5、5的PBS溶液中，配制成浓度为1mg/mL的溶液。使用马尔文动态光散射粒度仪进行ζ电位的测定。设置仪器参数，温度为37℃，散射角度90°，扫描次数20次，重复扫描测试3次，得到数据如表1所示。

由表1结果可以看出，在pH＝5或5.5条件下，本发明大分子ζ电位为较大的正值，在pH＝6或7.4条件下，大分子的ζ电位为较小的正值、0或负值，是一种pH响应大分子。

表1不同大分子在不同pH下的ζ电位(mV)

试验例2

所用幽门螺旋杆菌ATCC43504和大肠杆菌ATCC8739菌株来自河南省工业微生物菌种工程技术研究中心。所用菌液浓度均为1×10⁸cfu/ml。

取实施例1～13得到的大分子样品各1mg，分别溶解于pH＝5的0.01M的PBS溶液中，进行如下抗菌测试：

采用最低抑菌浓度(MIC)法进行抗菌性能对比，使用96孔板分别测试在pH＝7.4，pH＝6，pH＝5.5和pH＝5时的抑制细菌90％的最低大分子浓度(MIC)。结果如表2所示。

由表2结果可以看出，在pH≤5.5条件下，本发明大分子对于幽门螺旋杆菌和大肠杆菌均具有良好抑菌作用，且随着pH降低，抑菌作用增强；在pH≥6条件下，不具有抑菌作用。这使得本发明大分子在胃液环境下能够精准杀菌，而进入肠道后不会影响肠道正常菌群。

表2在不同pH值下对于不同细菌的最小抑菌浓度

试验例3

将实施例1～13得到的大分子样品用pH＝7.4的PBS溶液分别制成浓度为6mg/mL的母液，进行溶血实验，来判断其生物相容性。

采用新鲜兔血进行溶血实验。将新鲜兔血离心，去除上层血浆，保留底部血红细胞，并用PBS清洗血红细胞，如上操作进行3～5次后取下层血红细胞悬浮液，加入到PBS溶液中，并使其充分悬浮制成工作溶液备用。取工作溶液、大分子母液和pH＝7.4的PBS溶液，分别配制大分子浓度为0.5mg/mL，1mg/mL，1.5mg/mL，2mg/mL的混合溶液。以工作溶液和PBS溶液组成的混合溶液作为阴性对照组，以工作溶液和去离子水组成的混合溶液作为阳性对照组。将各混合溶液充分震荡。将所有混合溶液在离心机中离心，取上层清液按顺序转移至96孔板，使用酶标仪检测在540nm吸光度下的情况。结果如表3所示。

由表3结果可以看出，本发明的大分子在0.5～2.0mg/mL浓度范围内，溶血率低，具有良好的生物相容性。

表3不同大分子浓度下的溶血率(％)

试验例4

取实施例1和2得到的大分子样品，分别使用pH＝7.4和pH＝5，OD600＝2，浓度为1×10⁸cfu/ml的幽门螺旋杆菌菌液分别配制成1mg/mL的准备液，进行SEM样品测试。取实施例1和2得到的大分子样品，分别使用pH＝6，OD600＝2，浓度为1×10⁸cfu/ml的大肠杆菌菌液分别配制成1mg/mL的准备液，进行SEM样品测试。

将上述准备液恒温培养3h，后离心。去上层清液，保留下层沉淀，用对应pH的PBS溶液清洗3遍后，在对应pH的PBS溶液充分悬浮，加入2mL40％戊二醛固定液，冰箱冷藏2h，后经过离心，清洗后用使用酒精梯度脱水法得到所需样品。使用扫描电子显微镜观察细菌给药抗菌后的形态，结果如图2所示。

由图2可以看出，在pH＝5条件下，实施例1～2的大分子能够破坏幽门螺旋杆菌细胞结构，具有显著的杀菌作用；在pH＝7.4条件下，对幽门螺旋杆菌影响较小，没有杀菌作用。在pH＝6条件下，对大肠杆菌没有影响。表明本发明大分子在胃液的酸性环境(pH≤5.5)下具有抗菌活性，可以杀死胃中的有幽门螺旋杆菌；而在肠道的中性环境下不具有抗菌活性，不会影响肠道的正常菌群。

试验例5

使用MIC法对实施例1～4制备的大分子样品进行耐药性测试，并以阿莫西林和克拉霉素(2：1)的混合抗生素(AML+CLAR)作为对照组。分别测试实施例1～4大分子样品以及混合抗生素在pH＝5时对于幽门螺旋杆菌的MIC值，记作MIC0。然后取各药物分别用pH＝5的PBS配置成1/2MIC0的溶液，并将幽门螺旋杆菌悬浮在各溶液中使其浓度达到1×10⁸CUF/ml，在37℃的恒温摇床中孵育24h，将孵育好的菌液在营养琼脂板上纯化，对培养好的第1代耐药幽门螺旋杆菌进行MIC测量，重复以上步骤20次，对培养好的第20代耐药幽门螺旋杆菌进行MIC测量，记作MIC20。并将MIC20与MIC0对比药物是否使得幽门螺旋杆菌具有耐药性。结果如表4所示。

由表4结果可以看出，实施例1～4制备得到的大分子的MIC20/MIC0为1～2.1，显著低于混合抗生素，表明本发明的大分子不易产生耐药性。

表4不同大分子的耐药性能

试验例6

采用C57BL/6雌鼠进行体外动物实验。分别取实施例1制备的大分子样品(大分子治疗组)、三联(阿莫西林+克拉霉素+奥美拉唑)治疗药物(三联治疗组)和PBS(对照组)对小鼠进行给药治疗，每个组别取六只小鼠进行平行对照。

具体动物实验过程如下：

第一周进行小鼠幽门螺旋杆菌菌液灌胃，菌液浓度为2×10⁹CFU/mL，每只3mL，灌胃时间为每天早上九点。

第二、三周，为幽门螺旋杆菌感染时间，在此期间小鼠正常喂养。

第四周前五天为治疗时间，将对应药物溶解在PBS溶液中，每只小鼠灌胃体积均3mL。其中为对照组灌PBS溶液；三联治疗组灌胃三联药物(其中奥美拉唑剂量为0.9mg/kg，阿莫西林剂量为28.5mg/kg，克拉霉素剂量为14.3mg/kg)；实验组组灌胃实施例1大分子30mg/kg。

治疗结束后，对各组小鼠进行胃部革兰氏染色，观察给药后胃部幽门螺旋杆菌杀菌情况。采取小鼠新鲜胃部进行革兰氏染色，经过涂片，干燥，固定，初染：滴加结晶紫染色液染色，清水冲洗去染色液。媒染：滴加Gram碘液，并覆盖载玻片，室温放置，水洗脱色复染:滴加沙黄染色液染色，水洗，干燥，镜检：置于油镜观察。结果判读：革兰氏阳性菌蓝色至紫色，革兰氏阴性菌红色。结果如图3所示。

分别取对照组、三联治疗组和大分子治疗组进行胃部HE染色实验，来观察药物对于小鼠胃部组织细胞影响。采取小鼠新鲜胃部进行HE染色，经过组织包埋，乙醇脱水，透明，浸蜡，包埋，切片制作，石蜡切片脱蜡至水，浸入苏木素染色，自来水漂洗，1％盐酸酒精分化数秒，自来水漂洗，然后碳酸锂饱和水溶液返蓝，流水冲洗数秒，放入伊红染液中染色数秒，流水漂洗，脱水封片。结果判读细胞核为蓝色，细胞质为红色。结果如图4所示。

由图3和图4结果可以看出，经过实施例1制备的大分子样品治疗的小鼠胃部组织中幽门螺旋杆菌含量低于对照组和三联治疗组；用药后的胃部细胞组织和对照组的细胞组织形态相似，无胃部细胞组织受到破坏。表明本发明大分子能够有效杀灭胃部幽门螺旋杆菌，使用安全，无毒副作用。

试验例7

分别取实施例1～7制备的大分子样品作为大分子治疗组，三联(阿莫西林+克拉霉素+奥美拉唑)治疗药物作为三联治疗组，PBS作为对照组，采用试验例6的方式进行体外动物试验。分别取对照组、三联治疗组和大分子治疗组小鼠胃粘膜充分研磨，加入1mLTRIzol试剂，经过RNA提取，体外反转录，PCR扩增，数据分析，得到小鼠胃部幽门螺旋杆菌浓度(CFU/g)，具体数据见表5。

由表5结果可以看出，经过本发明的大分子样品治疗的小鼠胃粘膜中，幽门螺旋杆菌含量显著低于对照组和三联治疗组，表明本发明大分子样品能够有效杀灭胃部幽门螺旋杆菌。

表5对照组、三联治疗组及药物治疗组的qpcr结果(×10⁴CFU/g)

试验例8

分别取实施例1～3制备的大分子样品作为大分子治疗组，三联(阿莫西林+克拉霉素+奥美拉唑)治疗药物作为三联治疗组，PBS作为对照组，采用试验例6的方式进行体外动物试验。分别取对照组、三联治疗组和大分子治疗组的小鼠粪便进行16S肠道菌群热图测试。经过微生物组总DNA提取，目标片段PCR扩增，扩增产物磁珠纯化回收，扩增产物荧光定量，测序文库制备，上机进行高通量测序，后经过软件分析得到谱图。根据柱状图差异判断大分子治疗后对肠道菌群是否有影响。结果如图5所示。

由图5可以看出，经过实施例1～3制备的大分子样品治疗的小鼠肠道菌群与对照组肠道菌群分布相似，表明本发明的大分子样品不会对肠道菌群造成影响，作为治疗幽门螺旋杆菌感染的药物，能够有效避免传统三联治疗药物对肠道菌群的影响。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种大分子，其特征在于，所述大分子具有如下式I结构：

其中，R₁选自含有胺基或氨基的缩聚型大分子；R₂选自以下任一结构：

2.根据权利要求1所述的大分子，其特征在于，所述含有胺基或氨基的缩聚型大分子中部分胺基或氨基通过酰胺键引入磺酰胺基。

3.根据权利要求2所述的大分子，其特征在于，所述磺酰胺基取代胺基或氨基的数目为10％～80％。

4.根据权利要求1所述的大分子，其特征在于，所述含有胺基或氨基的缩聚型大分子包括侧链带有胺基或氨基的聚氨基酸类、侧链带有胺基或氨基的聚烯烃类或氨基化的超支化聚甘油。

5.根据权利要求4所述的大分子，其特征在于，所述含有胺基或氨基的缩聚型大分子包括线性聚赖氨酸、聚酰胺、超支化聚赖氨酸、超支化聚氨基酸、树枝状聚酰胺-胺、支化聚乙烯亚胺、树枝状聚丙烯亚胺或氨基化的超支化聚甘油。

6.根据权利要求1～5任意一项所述的大分子，其特征在于，所述大分子在pH≥6条件下ζ电位为＜+2mV，在pH＜6条件下ζ电位为≥+2mV。

7.根据权利要求1～5任意一项所述的大分子，其特征在于，所述大分子平均分子量为1500～40000Da。

8.根据权利要求1～7任意一项所述的大分子的制备方法，其特征在于，包括以丁二酸酐为桥梁通过两步酰胺化反应将磺酰胺类化合物与含有胺基或氨基的缩聚型大分子上的胺基或氨基相连，制得最终产物。

9.一种抗菌剂，其特征在于，包含权利要求1～7任意一项所述大分子。

10.权利要求1～7任意一项所述的大分子或权利要求8所述的制备方法或权利要求9所述的抗菌剂在制备预防和/或治疗幽门螺旋杆菌感染的产品中的应用。