JPH09512168A

JPH09512168A - 敗血症の治療用ヘパリン結合タンパク質およびその製造方法

Info

Publication number: JPH09512168A
Application number: JP7527282A
Authority: JP
Inventors: ヤコブヘムフロトガールト，ハンス; バートラスムッセン，ポール
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1994-04-21
Filing date: 1995-03-17
Publication date: 1997-12-09
Also published as: ATE239494T1; CA2188395A1; FI964227A0; DE69530689T2; WO1995028949A1; DE69530689D1; CZ289439B6; CZ308296A3; HU9602895D0; AU703963B2; HUT75557A; NO964465D0; PL316935A1; EP0762889B1; FI964227A; AU2303395A; HU221638B1; EP0762889A1; RU2200573C2; CN1146724A

Abstract

(57)【要約】リポ多糖(LPS)により引き起こされるサイトカイニンカスケードの誘発に関連した疾患又は症状を予防又は治療するための医薬組成物であって、該組成物は医薬として許容し得る担体又は希釈剤と共にヘパリン結合タンパク質(HBP)を含んでなり、このヘパリン結合タンパク質はグリコシル化形で、28kDの見掛け分子量（還元条件下SDS-PAGEより測定）を有し、該タンパクが多形核白血球のアズール性顆粒内で生産される。ヘパリン結合タンパク質は、Ｎ末端伸長 HBPをコードするか、又は別のタンパク質をコードする DNAによりそしてこれと融合する HBPをコードする DNA配列を含有する宿主細胞内で生産される。また、培地が硫酸化多糖を含有するプロセスが開示される。

Description

【発明の詳細な説明】敗血症の治療用ヘパリン結合タンパク質およびその製造方法発明の分野本発明は、ヘパリン結合タンパク質を含んでなる医薬組成物、および細菌エンドトキシンによりもたらされる疾患又は症状の治療のためのその使用に関する。発明の背景重大な感染に対する全身性応答から生じる敗血症性ショックは、過去50年にわたって事件を増加せしめておりそして今日米国における集中的医療ユニット(uni ts)において最もありふれた死亡原因となっている。敗血症性ショックのこの増加および高い傾向の理由は、脈管内カテーテルの如き侵襲装置の増加せしめられた使用、細胞毒性および免疫抑制の増加せしめられた使用、敗血症に発展しやすい患者の増加せしめられた寿命および抗生物質耐性生物体により引きおこされる感染の増加にあると信じられている。敗血症に関連した疾患は、陽性血液培養を特徴とする菌血症（また敗血症として知られている）；頻呼吸、頻脈、高熱又は低体温の形で感染に対する全身応答を特徴とする敗血症；敗血症の臨床的証拠がある敗血症症候群並びに異状に増加したラクテートレベル、オリグリア（oliguria）又は急性に衰えた精神状態の形で衰えた器官のかん流の症候；初期敗血症性ショック（ここにおいて敗血症症候並びに１時間未満続きかつ通常の治療に応答する低血圧の臨床的証拠）；および難治性敗血症ショック（ここにおいて敗血症症候群並びに通常の治療にかかわらず１時間以上持続する低血圧の臨床的証拠である）である。敗血症の公知の媒介物は複雑な方法で相互作用し、敗血症、又はサイトカイニン、感染又は傷害の部位（例えば腹腔）で開始したカスケードを形成する。（敗血症の通常の原因であるグラム陰性細菌における）サイトカイニンカスケードのイニシエーターは、感染又は炎症部位（そこでは細菌は腫瘍昏迷因子α(T NFα)、インターロイキン−１、インターロイキン−６、インターロイキン−８およびマクロファージおよび他の細胞からの血小板活性化因子の放出を誘発する）で細菌により放出される内毒素（又はリポ多糖(LPSと略す)として知られている）である。 TNFα、インターロイキン−１および PAFの放出後、アラキドン酸は、代謝されインターロイキン、トロンボキサンＡ₂およびプロスタグランジンを形成する。インターロイキン−１およびインターロイキン−６はＴ細胞を活性化し、インターロイキン−γ、インターロイキン−２、インターロイキン−４および顆粒球 −単球コロニー刺激因子を生成する。好中球白血球は、多くのこれらの媒介物により直接活性化される。かくして、好中球誘発損傷は、感染又は炎症部位で凝集中、酸素遊離ラジカルおよびリソソーム酵素の放出により脱顆粒中に生じ得る。潜在的にサイトカイニンカスケードを起こす可能性があるけれども、感染又は炎症主患部で内毒素又は他の敗血症媒介物の存在は、それ自身において敗血症を導く必要はない、何故ならサイトカイニンカスケードは、サイトカイニンカスケードの未制御活性化に対し一定の固有の保護を有する。従って、プロスタグランジンは、マクロファージからサイトカイニンの放出を阻害し、そしてマクロファージはＴ細胞を抑制することができる。敗血症の臨床的症状は、余りに多くの内毒素又は他の媒介物が放出されるとき又はサイトカイニンカスケードを妨害し得る媒介物が存在しないとき、例えば免疫系が弱化せしめられるとき、生じるように思われる。敗血症性疾患の進行およびそこに含まれる媒介物のより詳しい記載に対しては、R.C.Bone，“The Pathogenesis of Sepsis”，Ann.In t.Med. 115 ，1991，457-469 参照。グラム陰性敗血症に起因する継続した高い死亡率および罹患率は、細菌 LPSを循環せしめる潜在的な致死効果を妨害し得る治療薬に対する広範囲の研究を促進してきた。多数の論文は、高用量の静脈内投与した免疫グロブリンの著るしい治療効果を報告する。しかし、治療は、コア(core)LPSに対し天然の高レベルの抗体に対しスクリーンされるドナーの血漿から由良する IgG又は非常に多量のプールのドナー(＞1000)から由来する IgGを必要とする。菌血症の治療に対し提案された LPSに対するモノクローナル抗体(例えば WO 88／03211)は、殆ど又は全く効果を示さない、これは多分それらが LPSによって誘発されたサイトカイニンカスケードを阻害しないからである。ヒトおよび豚起源の末梢の好中球白血球から単離した２つの密接に関連したタンパク質の共有構造が、近年測定された（注．H.Flodgaard et al.，Eur.J.Bioc hem. 197 ，1991，pp.535-547；J.Pohl et al.，FEBS Lett. 272 ， 1990，p. 200 以降）。両方のタンパク質は、活性セリンおよびヒスチジン57の選択的突然変異のため、好中球エラスターゼに高い類似性を示す(chymotrypsin numbering( B.S.Hartley，“Homologies in Serine Proteinases”，Phil.Trans.Roy.Soc.Se ries 257 ，1970，p.77以降))。該タンパク質はプロテアーゼ活性を欠いている。該タンパク質は、ヘパリンに対するそれらの高い親和性のため、それぞれヒトヘパリン結合タンパク質（ hHBP）および豚ヘパリン結合タンパク質（pHBP）と命名されたSchafer et al．（W.M.Schafer et al.，Infect.Immun．53，1986，p.651 以降）は、その抗生物質活性のため、タンパク質カチオン抗菌タンパク質(CAP37)と命名した。該タンパク質はまた範囲 1.3×10^-9Ｍ−10^-8Ｍにわたって単球に対し走化性であることを示した（H.A.Pereira et al.，J.Clin.Invest．85 ，1990，p.1468以降）、これはFlodgaard et al．（上掲参照）から明白な結果と一致する。更に、HBPは単層培養物内で増殖したそのような細胞に添加されるとき、内皮細胞および線維芽細胞の分離および収縮をもたらすことが示された。HBPはまた、単球生存およびトロンボスポンジン（，J.Leukocyte Biol．51，1992，p.316以降）。アズール性顆粒から、hHBPおよび CAP37と命名されたアズロシジン（azurocid in）のアミノ酸残基と同一の第一の20個のＮ−末端アミノ酸を有するタンパク質が単離され（J.E.Gabay et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，1989，p.5610以降；C.G.Wilde et al.，J.Biol.Chem. 265 ，1990，p.2038以降）そしてその抗菌性が報告された(D.Campanelli et al.，J.Clin.Invest. 85，1990，p.904 以降）。好中球白血球中のhHBPの存在並びに白血球がStaph.aureusを食作用するとき89 ％のCAP37（これはhHBPに同一である）が放出される事実(H.A.Pereira等、上掲）は、以下の内容を示している；すなわちhHBPの機能は炎症過程においてその巻き添えとなりうる；何故ならタンパク質は活性化好中球から明らかに放出されるからである。Pereira et al．（上掲）は、CAP37の機能が炎症部位にあることを提案しており、そこではそれは特に単球を引きつけることができそして第二波の炎症における単球の流入の原因である因子の一つとなり重要であることに加え、HBPは好中球および単球滲出の機構において重要な役割を奏するであろう。 HBPの構造は、WO 89／08666およびH.Flodgaard et al．（上掲）から明らかであり、HBPは一方CAP37(注WO 91／00907)およびアヅロシジン（注、C.G.Wilde et al.，J.Biol.Chem. 265 ，1990，p.2038）と命名された。発明の要約以前以下の内容は提案されていなかった；すなわち HBPは感染および傷害部位で細菌内毒素の存在により引き起こされた疾患又は症状の治療において使用できる。従って、本発明は、リポ多糖(LPS)により引き起こされるサイトカイニンの誘発に関連した疾患又は症状を予防又は治療するための組成物に関し、該組成物は医薬として許容し得る担体又は希釈剤と共にヘパリン結合タンパク質(HBP)を含んでなり、このタンパク質はグリコシル化形で、28kDの見掛け分子量（還元条件下SDS-PAGEより測定）を有し、該タンパク質は多形核白血球のアズール性顆粒内で生産される。 HBPは LPSに結合することが見出された（注、Pereira et al.，Proc.Natl.Aca d.Sci.USA 90，1993，pp.4733-4737）、ここでこの能力はタンパク質の抗菌作用にリンクしている。HBPの抗菌作用はpH７（すなわち生理学的pH）で減少することが報告されている。更に、敗血症性症状はそのままグラム陰性細菌により引き起こされないが、しかし単球に関しCD14レセプターを活性化する死亡細菌細胞から放出される内毒素により引き起こされ、これによりサイトカイニンカスケードを誘発する。従って HBPの抗菌作用は敗血症性症状の治療に重要でないように思われる。この点に関し、以下の内容が注目されるべきである；すなわちそれ自身で結合する LPSは、LPSに対して生ぜしめられた抗体がこの点において殆ど又は全く効果を有しない（注、E.Th.Rietschel and M.S chlaak，Immun.Infect．21，1993，pp.25-36）ことの事実より明らかな如く、内毒素のサイトカイニン誘発効果を中和する能力を暗示しない。敗血症性症状と争う従来の公けにされた努力は敗血症患者の血行内で内毒素を中和することに集中されてきたが（例えば、WO 93／19087 において提案されている如く、このWO 93／19087 においてCAP37(すなわちHBP)は LPSに結合しそして血行から LPSのクリアランスを与えることにより内毒素の治療が提案されている）、大部分のこれらの努力はむだであった、何故なら敗血症患者は循環する内毒素の高められたレベルを一般に有しないからである。しかし、敗血症性徴候がそれ自身現われた後（すなわち後−内毒血症前兆である）、HBPは局所炎症又は感染部位で有効である。今日次のように推定されている；すなわち HBPは特異的に結合しそして脂質Ａ(LPSの毒性部分)に対する高い親和性を有しこれによりサイトカイニンカスケードの連続誘発を阻害するのみならず、傷害および感染に対する体の防御機構の一部として食細胞（例えば好中球、単球、マクロファージ）から酸素遊離基およびサイトカイニンの放出により引き起こされるストレス傷害から生じるアポプトシスから単球を保護することにより、その有利な効果を発現する。単球は傷害又は感染の部位に移行し、その部位で単球は感染微生物および有害物質例えは内毒素を食作用する。HBPはまた、単球の食作用を刺激する。単球を移動させる HBPの能力は、未だ明らかにされていなかった方法で LPSに結合するその能力に依存するように思われる。更に、驚くべきことに、HBPが37−45℃（すなわち常温ないし高体温）で LPS に不可逆的に結合することが確立された。これはまた、HBPにより LPSの中和に対し効果を有する。別の面において、本発明は LPSにより引き起こされるサイトカイニンの誘発に関連した疾患又は症状を予防又は治療するための方法に関し、該方法は有効量のヘパリン結合タンパク質(HBP)をそのような治療を必要とする患者に投与することを含んでなり、該ヘパリン結合タンパクはグリコシル化形で、28kDの見掛け分子量（還元条件下SDS-PAGEより測定）を有し、該タンパク質は多形核白血球のアズール性顆粒内で生産される。別の面において、本発明は LPSにより引き起こされるサイトカイニンカスケードの誘発に関連した疾患又は症状を予防又は治療するための医薬の製造のための、グリコシル化形にあるヘパリン結合タンパク質(HBP)の使用であって、ヘパリン結合タンパク質は28kDの見掛け分子量（還元条件下SDS-PAGEより測定）を有し、該タンパク質は多形核白血球のアズール性顆粒内で生産される。発明の詳細な記載 HBPは、哺乳動物、特にヒト又は豚起源が適当である。特に、HBPは配列番号１として配列表に示されるアミノ酸配列を有するヒト HBP、又は配列番号２として配列表に示されるアミノ酸配列を有する豚 HBP、又は LPSの脂質Ａ部分に結合できるその官能性類似体又はペプチド断片である。そのような官能性類似体の例には、天然タンパク質のＣ末端又はＮ末端の両方又はいずれかに１種又はそれ以上のアミノ酸残基を添加することにより、天然タンパク質の両端又は一方端で又はアミノ酸配列内の１又はそれ以上の部位で１種又はそれ以上のアミノ酸残基で置換することにより、又は天然アミノ酸配列中の１種又はそれ以上の部位で１種又はそれ以上のアミノ酸残基を挿入することにより得られる天然タンパク質の誘導体が含まれる。この語句は、HBPのペプチド断片、特に単核細胞から LPS−誘発サイトカイニンカスケードを減少させるため天然 HBPとて類似の能力を有する断片を含むことが特に意図される。LPSの脂質Ａタンパク質に結合し得るそのような断片の例は、配列番号１のアミノ酸残基20−53、特にアミノ酸残基26−42又は配列番号２のアミノ酸残基20−53を含んでなるペプチド断片である。 HBPをコードする DNA配列は、確立された標準法、例えばS.L.Beaucage and M. H.Caruthers，Tetrahedron Letters 22，1981，pp.1859-1869により記載されたホスホアミダイト（phosphoamidite）法、又はMatthes et al.，EMBO Journal 3 ，1984，pp.801-805により記載される方法により合成的に製造できる。ホスホアミダイト法に従い、オリゴヌクレオチドを例えば自動 DNA合成機内で合成し、精製し、アニールし、連結しそして適当なベクター内でクローン化する。 DNA配列は、例えばゲノム又はcDNAライブラリーを調製しそして標準法(cf．Sa mbrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spr ing Harbor，1989)に従って合成オリゴヌクレオチドプローブを用いハイブリッド形成により全ての又は一部の HBPをコードする DNA配列に対しスクリーニングすることにより得られる、ゲノム又はcDNA起源のものであってよい。DNA配列は、例えば米国特許 4,683,202又はR.K.サイキ等、Science 239 ，1988，pp.487- 491に記載の如く、特定のプライマーを用いポリメラーゼ鎖反応により製造できる。次いで DNA配列を組換え発現ベクター内に挿入し、このベクターは組換え DNA手順に好都合に委ねられる全てのベクターであってよい。ベクターの選択は、それが導入されるべき宿主細胞にしばしば依存するであろう。従って、ベクターは自動複製ベクター、すなわち染色体外部分として存在するベクター例えばプラスミドであってよい、その複製は染色体複製に独立である。択一的に、ベクターは宿主細胞内に導入されるとき、宿主細胞ゲノム内に組込まれそしてそれが組込まれた染色体と共に複製されるものであってよい。ベクター内で、HBPをコードする DNA配列は適当なプロモーター配列に、操作可能に接続されるべきである。プロモーターは、選択宿主細胞内で転写活性を示す全ての DNA配列であってよくそして宿主細胞に相同又は異質タンパク質をコードする遺伝子から誘導される。哺乳動物細胞内で HBPをコードする DNAの翻訳を指示するための好適なプロモーターの例は、SV40プロモーター（Subramani et a l.，Mol.Cell Biol. １，1981，pp.854-864）、MT-1（メタロチオネイン遺伝子）（Palmiter et al.，Science 222 ，1983，pp.809-814）又はアデノウィルス２主要後期プロモーターである。昆虫細胞内で使用のための好適なプロモーターは、ポリヒドリンプロモーターである（Vasuvedan et al.，FEBS Lett．311，19 92，pp.7-11）。酵母宿主細胞中に使用のための好適なプロモーターには、酵母解糖遺伝子(Hitzeman et al.，J.Biol.Chem. 255 ，1980，pp.12073-12080；Al ber and Kawasaki，J.Mol.Appl.Gen．１，1982，pp.419-434）からのプロモーター又はアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(Young et al.，in Genetic Engineer ing of Microorganisms for Chemicals （Hollaender et al.，eds.），Plenum Press，New York，1982)からのプロモーター又はTPI1（米国特許 4,599,311）又はADH2-4c(Russell et al.，Nature 304 ，1983，pp.652-654)プロモーターが含まれる。線状菌類宿主細胞中で使用するための好適なプロモーターは、例えばADH3プロモーター(McKnight et al.，The EMBO J．４，19 85，pp.2093-2099)又はtpiAプロモーターである。 HBPをコードする DNA配列はまた、好適なターミネーター、例えばヒト成長ホルモンターミネーター(Palmiter et al.，上掲)又は（菌類宿主に対し）the TPI 1 （Alber and Kawasaki，上掲）又はADH3(McKnight et al.，上掲)プロモーターである。ベクターは更に要素例えばポリアデニル化シグナル（例えばSV40又はアデノウィルス５ Elb領域から）、翻訳エンハンサー配列（例えば、SV40エンハンサー）および翻訳エンハンサー配列（例えばアデノウィルスVARNASをコードするもの）に操作可能に接続できる。組換え発現ベクターは、対象の宿主細胞中でベクターを複製せしめる DNA配列を更に含んでなる。（宿主細胞が哺乳動物であるとき）そのような配列の例は、複製のSV40開始点である。ベクターはまた選択可能なマーカー、例えば遺伝子を含んでなり、その生成物は宿主細胞内で欠損を相補する、例えばジヒドロフォレートレダクターゼ（DHFR）をコードする遺伝子、薬物、例えばネオマイシン又はヒドロマイシンへの耐性を与えるものを含むことができる。 HBP、プロモーターおよびターミネーターをそれぞれコードする DNA配列を結合するためおよびそれらを複製に必要な情報を含有する適当なベクター内に挿入するために用いられる手順は、当業者に周知である（注、例えば、Sambrook et al.，上掲）。発現ベクターが導入される宿主細胞は、HBPを生産できる全ての細胞であってよくそして好ましくは真核細胞、例えば無脊椎（昆虫）細胞又は脊椎動物細胞、例えばキセノプスレビス（Xenopus laevis）卵母細胞又は哺乳動物である。好適な哺乳動物細胞系の例は、COS(例えばATCC CRL 1650)、BHK(例えばATCC CRL 1 632，ATCC CCL 10)又はCHO(例えばATCC CCL 61)細胞系である。哺乳動物細胞に移入しそして細胞内で導入された DNA配列を発現する方法は、例えば Kaufman a nd Sharp，J.Mol.Biol．159 ，1982，pp.601-621；Southern and Berg．J.Mol.A ppl.Genet ．１，1982，pp.327-341；Loyter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79 ，1982，pp.422-426；Wigler et al.，Cell 14，1978，p.725；Corsaro and Pearson，Somatic Cell Genetics ７，1981，p.603，Graham and van der Eb ，Virology 52，1973，p.456；and Neuman et al.，EMBO J．１，1982，pp.841 -845に記載されている。択一的に、菌類細胞（酵母細胞を含む）は、宿主細胞として用いられる。好適な酵母細胞の例には、サッカロマイセス（Saccharomyces）spp．又はシゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）spp．、特にサッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の細胞が含まれる。他の菌類細胞の例は線状菌類、例えばアスペルギルス（Aspergillus）spp．又はニューロスポラ（Neurospo ra）spp.、特にアスペルギルスオリゼ（Aspergillus oryzae）又はアスペルギルスニガー(Aspergillus niger)菌株の細胞である。細胞を培養するために用いられる培地は、哺乳動物細胞を増殖するために好適な通常の培地、例えば適当な補足物を含有する血清含有又は無血清含有培地、又は昆虫、酵母又は菌類細胞を増殖するための好適な培地であってよい。好適な培地は、商業上の供給者から入手可能であるか、又は公けにされた製法（例えばアメリカンタイプカルチュアーコレクションのカタログ中）に従って入手できる。次いで細胞によって生産される HBPを遠心分離又は濾過により細胞を培地から分離し、そして塩例えば硫酸アンモニウムを用いて培地のタンパク質成分を沈殿させ、次いでイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の如きクロマトグラフィー法による精製を含む周知の手順により培地から回収される。驚くべきことに、以下の内容が見出された；すなわち HBPを pro-HBPとして発現するとき特に高収率の HBPが得られる。従って、特異的態様において、本発明は HBPの生産方法に関しここにおいてＮ末端伸長部により先行される成熟 HBPをコードする DNA配列を含有する宿主細胞を、HBPの発現を許容する条件下適当な培地中で培養し、次いで生成した HBPをＮ末端伸長 HBPとして培地から回収することを含んでなる。Ｎ末端伸長は、約５〜約25個のアミノ酸残基、特に約８〜約15個のアミノ酸残基の配列であってよい。Ｎ末端配列中のアミノ酸残基の性質は重要でないと考えられている。Ｎ末端伸長は好都合にはアミノ酸配列 Gly-Ser-Ser-Pro-Leu-Aspを有する HBPのプロペプチドであってよい。成熟 HBPの生産を促進するため、一般に以下の内容が好ましい；すなわちＮ末端伸長 HBPをコードする DNA配列が、Ｎ末端伸長をコードする DNA配列と成熟 H BPをコードする DNA配列との間に位置するプロテアーゼ切断部位をコードする D NA配列を含む。適当なプロテアーゼ切断部位の例は、アミノ酸配列(Asp)₄-Lysを有するエンテロキナーゼ切断部位又はアミノ酸配列 Ile-Glu-Gly-Argを有する因子Xa切断部位を有する。培地から回収後、Ｎ末端伸長 HBPは好都合には適当なプロテアーゼで切断され成熟（および活性）HBPを生産する。好適な酵素の例はエンテロキナーゼ又は因子Xaである。 HBPを生産するために用いられる宿主細胞は、好ましくは昆虫細胞、例えばレピドプテラ(Lepidoptera)又はドロソフィラ（Drosophila）の細胞である。この場合、細胞は例えば米国特許 4,745,051 又は国際公開(WO)92／01801 に記載される如く、バクロウィルスを用いて好都合に移入できる。培地中に存在するリポ多糖に HBPが結合することを避けるため、ヘパリン又は別の硫酸化多糖の存在下に HBPを生産することが、好都合であることが更に見出された。従って、特異的態様において、本発明は HBPを生産する方法に関し、ここにおいて、HBPをコードする DNA配列を含有する宿主細胞を、HBPの伸長を許容せしめる条件下硫酸化多糖類を含有する適当な培地中で培養し、次いで生成した HBPを培地から回収する。HBPは培地内に存在する硫酸化多糖類に結合するであろうしそして引き続き適当な条件で例えば HBPを塩例えば塩化ナトリウムにより溶出することにより、多糖類から放出されるべきである。他の硫酸化多糖類、例えばヘパリンスルフェート、デキストランスルフェート、デルマタン硫酸、ペントサンポリスルフェート又はプロタミンスルファミンが用いられるけれども、硫酸化多糖類は好ましくはヘパリンである。硫酸化多糖類は、培地から多糖類に結合した HBPの分離を促進するために好ましくは不活性担体上に固定化される。不活性担体は、例えばアガロース（例えばセファロース）である。この態様において、成熟 HBPをコードする DNA配列を含有する宿主細胞は、前記の如くＮ末端伸長部によって先行される。別の態様において、本発明は HBPを生産する方法に関し、ここにおいて、別のタンパク質をコードする DNAにより先行されかつこれと融合した成熟 HBPをコード DNA配列を含有する宿主細胞を、HBPの融合タンパク質および他のタンパク質の発現を許容する条件下、適当な培地中で培養することを含んでなる。他のタンパク質は、例えば因子VIII軽鎖であってよい（ＦVIII軽鎖をコードする DNA配列は、例えばヨーロッパ特許232112に記載される如く得られる）。この態様において、前記の如くＮ末端伸長部と成熟 HBP間に位置するプロテアーゼ切断部位をコードする DNA配列を導入することが有利である。医薬組成物において、HBPは例えばRemington's Pharmaceutical Science，198 5に記載される如く医薬組成物を製剤化するための全ての確立された方法により製剤化できる。組成物は典型的には局所又は全身注射又は温浸法に対し適合した形であってよくそして殺菌水又は等張食塩水又はグルコース溶液を用いそのまゝ製剤化できる。組成物は当業者に周知の通常の滅菌技術により滅菌できる。生成水性溶液は、使用のため包装できるか又は無菌条件下で濾過しそして凍結乾燥され、凍結乾燥調製品は投与前に殺菌水性溶液と組合わせられる。組成物は、適当な生理学的条件に要求される如き医薬として許容し得る補助物質、例えば緩衝剤、浸透圧調節剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等を含有できうる。HBPの濃度は、広範囲に変化でき、例えば数 0.5％未満から例えば１％から15−20重量％だけまで変化できる。組成物の単位用量は、典型的には約10mgないし約１ｇの HBPを含有できる。本発明の医薬組成物は、敗血症、敗血症性ショック、散在性脈管内凝固又はメニンゴコカールメニンギチス（Meningococcal meningitis）の治療の如き治療適用に対して好都合に使用できることが企図される。前記の如く、医薬組成物は、（例えば腹腔内の）炎症又は感染の部位に局所適用するために特に有用である、何故ならそのような部位に移動する単球を保護しそして単球がエンドトキシンおよび感染細菌を内在化できることを確保することが重要である。体重１kg当たり 0.1−100 mgの HBPの日用量は、治療されるべき症状の程度および患者の症状に依存して、今日適当であると考えられている。本発明の組成物は、原因となる細菌感染を治療するために抗菌剤を含んでなる。好適な抗菌剤の例は、β−ラクタム抗生物質（例えばペニシリン）、アミノグリコシド、テトラサイクリン、バシトラシン、ポリミキシン(polymyxin)、スルホアミド、ニトロフラン、ナリジクス酸等である。全身適用に対し、組成物はまたヘパリン又は他の硫酸化グルコサミノグリカンを抗凝固剤として含有でき、何故ならヘパリンが LPSに結合する HBPの能力を阻害しないことが驚くべきことに見出されたからである。抗凝固薬として作用することは別として、ヘパリンの存在はまた HBPのより長いプラズマ半減期に導びくからである、何故ならそれは血管内皮上で HBPがグルコサミノグリカンに結合するのを防止するからである。図面の簡単な説明本発明を、添付の図面を参照しつつ以下の例において更に説明する。図１は、hHBPをコードする、プラスミド pKFN-1783の901bp EcoRＩ−XbaＩの DNA配列および誘導アミノ酸配列を示し；図２は、hHBPをコードする、プラスミドに挿入される772bp BamHＩ−HindIII の DNA配列および誘導アミノ酸配列を示し；図３は、10μｇ／mlの HSAで処理された血液単核細胞中のサイトカイニンレベル又は10ng／ml LPSの存在下 HBPの変化レベルを示すグラフであり；そして図４は、10μｇ／mlの HSAで処理された血液単核細胞中のサイトカイニンレベル又は 100ng／ml LPSの存在下 HBPの変化レベルを示すグラフである。例１酵母株KFN-1775からヒトヘパリン結合タンパク質の生産一般的方法標準 DNA工学を、（Sambrook，J.，Fritch，E.F.，and Maniatis，T.(1989)Mo lecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd edn.，Cold Spring Harbor Labor atory Press，Cold Spring Harbor，NY）に記載の如く行った。合成オリゴヌクレオチドを、商業的に入手可能な試剤を用い、自動 DNA合成機（380B，Applied Biosystems）で製造した。DNA配列決定は、ジデオキシ鎖−停止技術により行った（Sanger,F.，Micklen，S.，and Coulson，A.R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 7 4 （1977）5463-20 5467）。ポリメラーゼ鎖反応(PCR)を、DNA Thermal Cycler（パーキンエルマーセタス）で行った。Ｎ末端アミノ酸配列分析を、アプライドバイオシステム 477Aガス相シーケンサーを用い自動化エドマン(Edman)分解により得た。オンライン逆相HPLCによる分析を、各シーケンサーサイクルから遊離した PTHアミノ酸の検出および定量化に対して行った。１μｌ（10⁶pfu）のヒト骨髄cDNAライブラリー(Clontech，Palo Alto，CA，U. S.A.)をプライマーNOR-3176(GTTGGAATTCAT(A/T/C)CA(A/G)AA(T/C)CA(A/G)GGN(A/ C)G)およびNOR-3174（CA(T/C)TG(A/G)TC(T/C)TCNGGNGT）（ここにおいて、Ｎは全ての４種のヌクレオチドの混合物である）の各々100pmoleを含有する PCR反応において鎖型として用いられた。プライマーNOR-3176の前方５′部分は、EcoRＩ部位を含有しそして３′部分はアミノ酸残基 no.18−23に相当しそして逆プライマーNOR-2174はhHBPのアミノ酸配列中のアミノ酸 no.18−23に相当する omsen，J.，Engels，M.，and Wollmer，A．(1991)Eur.J.Biochem．197，535-547 〕。 PCRは商業上キット（GeneAmp，パーキンエルマーシータス）および次のサイクル：94℃で１分、50℃で２分そして72℃で３分を用い 100μｌ容量で行った。35回サイクル後、最終サイクルを行いここにおいて72℃の工程は10分間維持した。PCR生成物、420bp断片を１％アガロースゲル上電気泳動により単離した。同様にプライマーNOR-3173(ACNCCNGA(A/G)GA(T/C)CA(A/G)TG）およびNOR-3175 （GGTTTCTAGATTATCCCGG(A/G)TT(A/G)TTNA(A/G)NACNCC）を、PCR反応において前記と同じcDNA鋳型と伴に用いた。前方のプライマーNOR-3173はNOR-2174に相補的でありそして逆プライマーNOR-3175は、HBPのアミノ酸配列中のアミノ酸残基 21 5−221 およびこれに続く停止コドンおよび XbaＩ部位に対応する。PCR反応を前記の如く行いそして生成物、232bp断片をアガロースゲル電気泳動により単離した。前記の２種の PCR断片を、末端プライマーとしてNOR-3176およびNOR-3175を用い、オーバーレイイクステンション（overlay extension）PCR〔Horton，R.M. ，Hunt，H.D.，Ho，S.N.，Pullen，J.K.，and Pease，L.R．(1989)Gene 77，61- 68〕により結合した。生成 635bp断片を単離し次いでEcoRＩおよび XbaＩで消化し 621bp断片を得、これをプラスミ pTZ19R からの2.8kb EcoRＩ−XbaＩ断片に結合した(Mead，D.A.，Szczesna-Skorupa，E．and Kemper，B.，Prot，Engin．１（1986）67-74)。結合混合物を用い、アンピシリン耐性に選択したコンピテントＥ．コリー株（ｒ^-，ｍ⁺）を形質転換した。DNA配列は、生成コロニーの１つからのプラスミド pKFN-1726が期待したhHBP_18-221アミノ酸配列をコードしていることを示した。 HPBのＮ末端を、前記と同じcDNA鋳型およびプライマーMHJ-206(GCTGAGAGATTGG AGAAGAGAATCGTTGGCGGCCGGAAGGCGAG)とMHJ-200(CGGCTTCCACCGTGGCGTTCTG)を用い、PCRにより 379bp断片として単離した。MHJ-206の３′部分は、ヒト HBP遺伝子のＮ末端コード部分に同一であり、そして MHJ-206の５′部分は先に述べたハイブリッド酵母リーダー遺伝子のＣ末端に同一である〔Thim，L.，Norris，K. etersen，J．（1993）FEBS Lett．318，345-352〕。ハイブリッドリーダー遺伝子と HBPのＮ末端部分をコードする 379bp PCR断片との枠内融合が、オーバーレイイクステンション PCRにより得られた〔Horton ，R.M.，Hunt，H.D.，Ho，S.N.，Pullen，J.K.，and Pease，L.R．(1989)Gene 7 7，61-68〕。生成物をEcoRＩおよびPstＩで消化次いで 572bp断片として単離した。 572bp EcoRＩ− PstＩ断片および前記 329bp PstＩ− XbaＩ断片を、プラスミドpTZ19Rからの2.8kb EcoRＩ− XbaＩに結合せしめた(Mead，D.A.，Szczesna-Sk orupa，E．and Kemper，B.，Prot，Engin．１（1986）67-74)。結合混合物を用い、アンピシリン耐性に対し選択したコンピテントＥ．コリー株（ｒ^-，ｍ⁺）を形質転換した。得られたコロニーの１つからのプラスミド pKFN-1780を選択し更に用いた。プラスミド pKFN-1780をEcoRＩおよび XbaＩで消化した。生成 901bp断片を、 pMT636からの 9.5kb NcoＩ− XbaＩおよびpMT636からの 1.4kb NcoＩ−EcoRＩ断片に結合した。プラスミドpMT636は、国際公開(WO 89／01968)に記載されている。 pMT636は、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)ポムベ（pombe）TPI （遺伝子）（POT）(Russell，P.R.，Gene 40（1985）125-130)、Ｓ．セレビシエ（cerevisiae）トリオースホスフェートイソメラーゼプロモーターおよびターミネーター、TPI_Pおよび TPI_T(Alber，T .，and Kawasaki，G.J.Mol.Appl．１，(1982)，419-434)を含有するＥ．コリー −Ｓ．セレビシエシャトルベクターである。連結混合物を用い、アンピシリン耐性に対し選択するコンピテントＥ．コリー株（ｒ^-，ｍ⁺）を形質転換した。DNA配列決定は以下の内容を示した；すなわち生成コロニーからのプラスミドは、合成酵母シグナル−リーダー遺伝子に正しく融合したヒト HBPに対する正しい DNA配列を含有していた。１つのプラスミド pKFN-1783を選択し更に用いた。プラスミド pKFN-1783の発現カセットは次の配列を含有する： TPI_P−シグナル−リーダー− HBP− TPI_T pKFN-1783からの901bp EcoRＩ− XbaＩの DNA配列を図１に示す。酵素形質転換：Ｓ．セレビシエ（cerevisiae）株MT663(E2-7B XE11-36 a／α ，ΔtPi ／Δtpi，pep 4-3／pep 4-3)を、YPGaL(１％バクト酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％ガラクトシダーゼ、１％ラクテート)上で600nmで 0.6の光学密度まで増殖した。 100mlの培養物を遠心分離により集め、10ml水で洗い、再遠心分離しそして1.2 Ｍソルビトール、25mM Na₂EDTA pH＝8.0および 6.7mg／mlジチオトレイトールを含有する10mlの溶液中に再懸濁させた。懸濁液を、30℃で15分間インキュベートし、遠心分離し次いで細胞を、1.2Ｍのソルビトール、10mMの Na₂EDTA、 0.1Ｍのクエン酸ナトリウム、pH＝5.8 および２mgのノボザイム（Novozym）(商標)234 を含有する10mlの溶液に再懸濁させた。懸濁液を30℃でインキュベートし、細胞を遠心分離により集め、10mlの 1.2Ｍソルビトールおよび10mlのCAS(1.2Ｍのソルビトール、10mMの CaCl₂、10mMのトリスHCl(トリス＝トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン)pH＝7.5)に懸濁させ次いで２mlの CASに再懸濁させた。形質転換に対し、0.1mlの CAS−再懸濁細胞を、約１μｇのプラスミド pKFN-1783と混合し次いで室温で１時間放置した。(20％ポリエチレングリコール4000、20mM CaCl₂、10mM CaCl₂、10mMトリス HC l、pH＝7.5)の１mlを、加え次いで混合物を遠心分離し次いでペレットを0.1mlの SOS（1.2Ｍのソルビトール、33％ｖ／ｖ YPD、6.7mMのCaCl₂、14μｇ／mlのロイシン）中に再懸濁し次いで30℃で２時間インキュベートした。次いで懸濁液を遠心分離し次いで 1.2Ｍのソルビトール0.5mlに再懸濁した。次いで、1.2Ｍのソルビトールおよび 2.5％寒天を含有する６mlのトップ(top)寒天（the SC medium o f Sherman et al.，(Methods in Yeast Genetics ，Cold Spring Harbor Labora tory(1982))を添加し次いで懸濁液を、同じ寒天固化、ソルビトール含有培地を含有するプレートの頂部に注いだ。形質転換体コロニーを30℃で３日後に選び、再単離し次いで液体培養を開始するために用いた。１個のそのような形質転換体KFN-1775を更に特徴化のために選定した。発酵：酵母株KFN-1775を、YPD培地（１％酵母エキス、２％ペプトン（ディフコラボラトリーから）、および３％グルコース）上で増殖した。株の１ｌ培養物を650nmで光学密度24まで30℃で振とうした。遠心分離後、上澄みを単離した。 HBPを、WO 89／08666 に記載されている如く実質的に上澄みから精製した。残基１−20のアミノ酸配列分析は、配列番号１のＮ末端配列と同一性を示した。例２バキュロウィルス系を用い昆虫細胞中でHBP（プロフォームとして）を発現させるため、次の PCRプライマーを作成した。 MHJ2087は、BamHＩ部位、開始コドンおよびヒトcDNAのプレプロ部分(Morgan， J.G．et al.(1991)，J.Immun.，147(3210-3214))およびこれに引き続きpKFN1780 上の遺伝子の成熟部分の開始から最初の20個のヌクレオチドをコードする。 MHJ2089は、pKFN1780上の HBP遺伝子のコード部分から最後の８個のコドン並びに上記cDNA配列に従った２個の余分のコドンに相補的てある。 PCRを次に従って鋳型として２個のプライマーおよびpKFN1780を用いて行った：３サイクル 95℃60秒、50℃ 120秒、72℃ 120秒 12サイクル 95℃30秒、65℃60秒、72℃90秒 PCR生成物、760bp断片を１％のアガロースゲル上で電気泳動により単離し、Ba mHＩおよびHindIIIで切断し次いで同じ２種の酵素で切断したpSX221に挿入した。（pSX221は pUC19の誘導体である（Yannisch-Perron，C．et al．(1985)GENE 33，103-119）。クローン化 DNAは配列決定により証明されそしてBamHＩ−HindI II断片（図２（示される）を、切断し、単離しそして昆虫細胞内の発現に対しpB lueBacIII（インビトロゲン社）に挿入した。生成プラスミドはpSX556と命名された。 HBPを発現する組換え体バキュロウィルスを構築するため、インビトロゲン社（サンジエゴ，CA）からのMAXBACを用いそして全ての操作を含められたバキュロウィルス発現系マニュアル(バージョン 1.5.5)に従って行った。簡単には、１μｇの線状化AcMNPV DNAおよび３μｇのpS X556を、SF９昆虫細胞（60mm皿内に２×10⁶個の細胞）に共移入した。生成培養上澄みを７日後に集めた。100mmプレート内のSF９細胞の新たな単層を、種々の希釈でウィルス上澄みで感染させ次いで 150μｇ／ml X-galを有する 1.5％アガロース含有完全TNM-FH培地で覆った。８日後、６種の推定組換え体プラークをそれらの青色により同定しそしてSF９細胞を含有する６穴ウェルプレートを感染させるために用いた。５日後、対応するウィルス DNAを精製し次いでウィルス DNA 内の組換え部位に隣接する順方向プライマーおよび逆方向プライマーを用いて P CR反応に委ねた。アガロースゲル上の PCR生成物を評価後、対応する最も純粋な組換え体ウィルスを、最終組換えウィルス株が野生型ウィルスのないことを確保するためもう１回の循環のプラーク精製に委ねた。組換え体 HBPの生成は、無血清 SF900−II培地(Gibco BRL／Life-Technologies)内で増殖に適合した昆虫細胞（SF９およびSF21）内で行った。典型的には、５ｌのスピナー(spinner)培養物又は10ｌの発酵器（両タイプは１×10⁶／mlの細胞密度を有する）を、１のMOIで感染しそして培地を感染後３日目に集めた。HBPの精製は、WO 89／08666 に記載の如く行った。例３プロ領域(proregion)を有しない HBP：オリゴヌクレオチドリンカー（下記参照）を作成しこれは、（73から87、イタリック体）のプロ領域を含む部分を除外する（BamHＩからEagＩまで）図２で示される最初の99bp配列を含んでおり次いでこれをpSX556内でもとのBamHＩ− Eag Ｉで置換しpSX559を生ぜしめた。この構築体は、バキュロウィルス系内で発現されるとき成熟 HBPを生産することが期待される。リンカーは２つの次の二重部分を与えるように対合的にアニールされた４種のオリゴヌクレオチドから成る：例４プロペプチドと成熟 HBP間に位置する牛エンテロキナーゼ切断部位を有する H BP誘導体の発現 HBP（シグナル−プロペプチド−成熟HBP）をコードするバキュロウィルスベクターで感染した昆虫細胞は、プロペプチドを切断することができない。プロペプチドなしのHBP(成熟 HBP配列に直接融合したシグナル配列)をコードするウィルスで感染した細胞は、成熟形を生産するが、極めて低量である。成熟 HBPの収率を増加するため、プロペプチドと成熟 HBP間に挿入された牛エンテロキナーゼ切断部位（Asp₄-Lys）を有する HBP誘導体をコードするバキュロウィルスベクターを構築し、生成した伸長形の HBPをインビトロ加工することにより成熟 HBPを得ることが可能となる：シグナル−Gly-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Asp-Asp₃-Lys−成熟 HBPを、Pfuポリメラーゼおよびプライマー241（CCGGGGATCCGATGACCCGGCTGACAGTCCTGGCCCTGCTGGCTG GTCTGCTGGCGTCCTCGAGGGCCGGCTCCAGCCCCCTTTTGGACGACGACGACAAGATCGTTGGCGGC）およびPBRa246（CCGGGGATCCAACTAGGCTGGCCCCGGTCCCGG）を用いた PCRにより作成した。PCR生成物をBamHＩで消化し次いで pVL1393伝達ベクター（インビトロゲン，サンジエゴ，CA）内にクローン化した。組換えバキュロウィルスの発生およびタンパク質の生産を例２に記載する如く行った（しかしこの場合、推定組換え体プラークは、それらの閉鎖−陰性表現型により同定された）。Ｎ末端伸長形の HBPを生産するため、SF900II無血清培地（ギブコ）内で増殖する４×10⁸SF９細胞を、遠心分離し次いで１のMOI(感染多重性)を与えるウィルスストック(stock)からのサンプル中に再懸濁させた。ウィルスと共に細胞を 0. 5ｌのBellcoスピネルフラスコ(#1965-00500)に移しそして新しいSF900II培地を4 00mlの最終容量に添加した。最後に、1.5ｇのヘパリン−セファロース(CL-6B、ファルマシア)(これは25mlの殺菌 0.9％NaCl中でオートクレーブ処理された)を培養物に添加した。培養物を27℃で３日間インキュベートした。昆虫細胞培養物からヘパリン−セファロースビーズを単離するため、400mlの発酵培地を50mlの管８本に分取し次いでソルバールインストラメントテクノスピンＲ遠心分離内で300rpmで３分間遠心分離した。細胞を有する上澄みを吸引除去し次いでペレット化したヘパリン−セファロースビーズを、各管に加えられた 30mlの殺菌NaCl中で再懸濁し次いで300rpmで遠心分離することにより汚染細胞の残余から分離した。全ての手順を２回くりかえした。最後にビーズを、各管に加えられた20ml殺菌 0.5Ｍ NaCl 中で洗浄した。次いでビーズを 0.5Ｍ殺菌NaClの少量（20−30ml）で１個の50ml管に集め次いで殺菌ガラスフィルター漏斗に移した。ビーズを吸引せしめ次いでrHBPを30mlの３Ｍ NaCl を用いビーズから最後的に溶出せしめた。HBPを、WO 89／08666 に記載される方法に従い３Ｍ NaCl溶出液から精製した。プロ配列(prosequence)と成熟タンパク質間のエンテロキナーゼ切断部位並びにプロ配列を含有する200μｇの精製 HBPを、25mMの CaCl₂を含有する50mMのNa−アセテート緩衝液（pH 5.1）中に溶解した。バイオザイムラボラトリーリミテッド GB バッチ18×２コードEK３からの 400単位エンテロキナーゼを、1.2μｌの容量で加え次いで混合物を37℃で１時間インキュベートした。最後に HBPをWO 89／08666 に記載の方法に従いHPLCによりインキュベーション混合物から精製した。精製 HBPのアリコート（１nmol）を、Ｎ末端配列決定に委ね、この配列決定は主配列が切断が成功したことを示す Ileで開始する正しい成熟 HBPを表わしていた。例５プロペプチドと成熟 HBP間に位置する因子Ｘ_a切断部位を有する HBP誘導体の発現成熟 HBPの作成のための択一的戦略は、生産された物質のインビトロ切断に対する因子Ｘ_aの使用であった。因子Ｘ_a認識／切断部位は Ile-Glu-Gly-Argである。T.J.Gardella et al．(J.Biol.Chem.，26，15854-15859，1990)によれば、因子Ｘ_a認識部位の丁度Ｎ末端の３個の小アミノ酸(Gly-Gly-Ser)の配置は、多分立体障害効果を最少化しそしてこれにより因子Ｘ_a切断の有効性が増加することが見出された。シグナル−プロペプチド−Ile-Glu-Gly-Arg −成熟 HBPおよびシグナル−プロペプチド−Gly-Gly-Ser-Ile-Glu-Gly-Arg −成熟 HBPを作成するため、それぞれ２種のプライマー249（CCGGGGATCCGATGACCCGGCTGACAGTCCTGGCCCTGCTGGCTGGTCTGC TGGCGTCCTCGAGGGCCGGCTCCAGCCCCCTTTTGGACATCGAGGGTAGGATCGTTGGCGGC）およびPB Ra250(CCGGGGATCCGATGACCCGGCTGACAGTCCTGGCCCTGCTGGCTGGTCTGCTGGCGTCCTCGAGGG CCGGCTCCAGCCCCCTTTTGGACGGTGGTTCCATCGAGGGTAGGATCGTTGGCGGC)を合成した。２個の断片をBamHＩで消化し次いで pVL1393に挿入した。組換え体バキュロウィルスの作成およびタンパク質の生産を例４に記載したものと同様にして行った。例６末梢の血液単核細胞（BMNC）を、ライムホプレプ(Lymphoprep)(商標)（Nycome d，オスロ，ノルウェー）上でシトラート抗凝固淡黄コートの遠心分離により健康な成人血液ドナー（血液銀行、Rigshospitalet）から製造した。幾つかの実験において、リポ多糖（LPS）（Ｅ．コリー0.55：Ｂ５；ディフコラボラトリー，デトロイト，MI）、最終濃度１μｇ／ml、又はPHA(ディフコ、最終濃度20μｇ／ml、又はツベルクリンの精製タンパク質誘導体(PPD)(ステートセラムインスチチュート，コペンハーゲン，デンマーク)、最終濃度25μｇ／mlの添加前に、B MNCsを予備インキュベートした。インキュベーションを３％正常ヒト血清(NHS) を含有するRPMI-1640(BRL-Gibco，ロキルデ，デンマーク)中で行い、56℃で30分間加熱失活させ次いで 0.8mMグルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン(BRL -Gibco，デンマーク)20IE／ml（各々）を加えた。インキュベーション後、細胞を集め、次いで上澄みを直ちに−20℃で凍結し；細胞ペレットを液体窒素上で速やかに凍結し次いで RNAを抽出する前に−80℃で１週間以上保った。 IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-6，IFNγ，TNFαおよび TNFβを、精製組換え体サイトカイニンに対する単一特異性ポリクローナル家兎抗体を用い、二本鎖 ELISA により測定した(M.B.Hansen et al.,Immunol.Lett．30，1991，p.156)。イムノ −マキソープ(Immuno-Maxisorp)プレート(Nunc，Roskilde，Denmark)を、タンパク質−Ａアフィニティー精製 IgGでコートした。非結合部位を、ホスフェート緩衝食塩水(PBS)中５％ヒト血清アルブミンを用いてブロックした。サンプルを、２％正常家兎血清（ダコ，グロスツループ，デンマーク）、EDTA 10mM、アプロチニン2,000KIE／mlおよび5mM DL− ジチオトレイトールを加えた PBS中で希釈した。各々のサイトカイニンの国際的標準法を用いて分析を行った（National Institute for Biological Standards and Controls，Potters Bar，Hertfordshire，UK）。ビオチニル化家兎抗体をストレプタビジン（streptavidines）−ペルオキシダーゼと共に検出用抗体として用いた（キルゲガードアンドペリーラボラトリー，ガイスデルベルク，MD ）。１，２−フェニレンジアミンを用いて展開し次いで 492nmで測定した。８pg ／ml〜１ng／mlの濃度範囲に対する変化のインターアッセイ係数は、15％未満であった。これらのELISAsの検出限界は８〜10pg／mlであった。BMNCsを解かし次いでそれぞれ10ng／ml LPSおよび 100ng／ml LPSの存在下、10μｇ／mlおよび10 0μｇ／mlの量のヒト血清アルブミン並びに 0.2μｇ／ml、２μｇ／mlおよび20 μｇ／mlの量の HBPで処理した。結果を図３および図４に示す。図から明らかなように、BMNCsからのサイトカイニンの放出は HBPの存在下で著るしく減少する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年５月２０日【補正内容】請求の範囲１．敗血症、グラム陰性敗血症、敗血症性ショック又は散在性脈管内凝固の予防又は治療のための医薬の製造のための、グリコシル化形にある、ヘパリン結合タンパク質(HBP)の使用であって、このヘパリン結合タンパク質が28kDの見掛け分子量（還元条件下SDS-PAGEより測定）を有し、該タンパク質が多形核白血球のアズール性顆粒内で生産される、前記使用。２．前記医薬が、炎症又は感染の部位に局所適用するために有用である、請求の範囲第１項記載の使用。３．ヘパリン結合タンパク質が、ヒト HBPである、請求の範囲第１又は２項記載の使用。４．HBPが配列番号１として配列表に示されるアミノ酸配列、又は LPSの脂質Ａ部分に結合できるその類似体又はペプチド断片である、請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の使用。５．LPSの脂質Ａ部分に結合できるペプチド断片が、少なくとも配列番号１のアミノ酸残基20−53、特にアミノ酸残基26−42を含んでなるペプチド断片である、請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の使用。６．ヘパリン結合タンパク質が豚 HBPである、請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載の使用。７．HBPが配列番号２として配列表に示されるアミノ酸配列、又は LPSの脂質Ａ部分に結合できるその類似体又はペプチド断片である、請求の範囲第１〜６項のいずれか１項に記載の使用。８．LPSの脂質Ａ部分に結合できるペプチド断片が、少なくとも配列番号２のアミノ酸残基20−53を含んでなるペプチド断片である、請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載の使用。９．医薬が、単位剤形当たり約10mgないし約１ｇの量の HBPを含有する、請求の範囲第１〜８項のいずれか１項に記載の使用。 10．敗血症、グラム陰性敗血症、敗血症性ショック又は散在性脈管内凝固に関連した疾患又は症状を予防又は治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、有効量のグリコシル化形にあるヘパリン結合タンパク質(HBP)を投与することを含んでなり、該ヘパリン結合タンパク質が28kDの見掛け分子量（還元条件下SDS-PAGEより測定）を有し、該タンパク質が多形核白血球のアズール性顆粒内で生産される、前記方法。 11．ヘパリン結合タンパク質が、ヒト HBPである、請求の範囲第10項記載の方法。 12．HBPが配列番号１として配列表に示されるアミノ酸配列、又は LPSの脂質Ａ部分に結合できるその類似体又はペプチド断片である、請求の範囲第12項記載の方法。 13．LPSの脂質Ａ部分に結合できるペプチド断片が、少なくとも配列番号１のアミノ酸残基20−53、特にアミノ酸残基26−42を含んでなるペプチド断片である、請求の範囲第13項記載の方法。 14．ヘパリン結合タンパク質が豚 HBPである、請求の範囲第10項記載の方法。 15．HBPが配列番号２として配列表に示されるアミノ酸配列、又は LPSの脂質Ａ部分に結合できるその類似体又はペプチド断片である、請求の範囲第14項記載の方法。 16．LPSの脂質Ａ部分に結合できるペプチド断片が、少なくとも配列番号２のアミノ酸残基20−53を含んでなるペプチド断片である、請求の範囲第15項記載の方法。 17．有効量の HBPが、体重１kg当たり 0.1−100 mg、好ましくは体重１kg当たり 0.5−50mg、より好ましくは体重１kg当たり１−25 mgの範囲内にある、請求の範囲第10項記載の方法。 18．HBPが、炎症又は感染の部位に局所適用するために用いられる、請求の範囲第10〜17項のいずれか１項に記載の使用。 19．HBPの生産方法であって、HBPをコードする DNA配列を含有する宿主細胞を、HBPの発現を許容せしめる条件下、硫酸化多糖類を含有する適当な培地中で培養し、次いで生成した HBPを培地から回収することを含んでなる、前記方法。 20．硫酸化多糖類がヘパリンである、請求の範囲第19項記載の方法。 21．硫酸化多糖類が、不活性担体上に固定されている、請求の範囲第19項記載の方法。 22．不活性担体かアガロースである、請求の範囲第21項記載の方法。 23．宿主細胞が、Ｎ末端伸長部により先行されている成熟 HBPをコードする D NA配列を含有する、請求の範囲第19項記載の方法。 24．Ｎ末端伸長 HBPをコードする DNA配列が、Ｎ末端伸長部をコードする DNA 配列と成熟 HBPをコードする DNA配列との間に位置するプロテアーゼ切断部位をコードする DNA配列を含む、請求の範囲第23項記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 9356−4ＨＣ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｐ 21/02 9282−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ０７Ｋ 14/47 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＤＺ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．リポ多糖(LPS)により引き起こされるサイトカイニンカスケードの誘発に関連した疾患又は症状を予防又は治療するための組成物であって、該組成物は医薬として許容し得る担体又は希釈剤と共にヘパリン結合タンパク質(HBP)を含んでなり、このヘパリン結合タンパク質はグリコシル化形で、28kDの見掛け分子量（還元条件下SDS-PAGEより測定）を有し、該タンパク質が多形核白血球のアズール性顆粒内で生産される、前記組成物。２．ヘパリン結合タンパク質が、ヒト HBPである、請求の範囲第１項記載の組成物。３．HBPが配列番号１として配列表に示されるアミノ酸配列、又は LPSの脂質Ａ部分に結合できるその類似体又はペプチド断片である、請求の範囲第２項記載の組成物。４．LPSの脂質Ａ部分に結合できるペプチド断片が、少なくとも配列番号１のアミノ酸残基20−53、特にアミノ酸残基26−42を含んでなるペプチド断片である、請求の範囲第３項記載の組成物。５．ヘパリン結合タンパク質が豚 HBPである、請求の範囲第１項記載の組成物。６．HBPが配列番号２として配列表に示されるアミノ酸配列、又は LPSの脂質Ａ部分に結合できるその類似体又はペプチド断片である、請求の範囲第５項記載の組成物。７．LPSの脂質Ａ部分に結合できるペプチド断片が、少なくとも配列番号２のアミノ酸残基20−53を含んでなるペプチド断片である、請求の範囲第６項記載の組成物。８．単位剤形当たり約10mgないし約１ｇの量の HBPを含有する、請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載の組成物。９．LPSにより引き起こされるサイトカイニンの誘発に関連した疾患又は症状を予防又は治療するための方法であって、該方法は有効量のヘパリン結合タンパク質(HBP)をそのような治療を必要とする患者に投与することを含んでなり、該ヘパリン結合タンパク質がグリコシル化形で、28kDの見掛け分子量（還元条件下 SDS-PAGEより測定）を有し、該タンパク質が多形核白血球のアズール性顆粒内で生産される、前記方法。 10．グラム陰性敗血症、敗血症性ショック又は散在性脈管内凝固の予防又は治療のための、請求の範囲第９項記載の方法。 11．メニンゴコカールメニギチス(Meningococcal menigitis)の治療のための、請求の範囲第９項記載の方法。 12．、ヘパリン結合タンパク質がヒト HBPである、請求の範囲第９項記載の方法。 13．HBPが配列番号１として配列表に示されるアミノ酸配列、又は LPSの脂質Ａ部分に結合できるその類似体又はペプチド断片である、請求の範囲第12項記載の方法。 14．LPSの脂質Ａ部分に結合できるペプチド断片が、少なくとも配列番号１のアミノ酸残基20−53、特にアミノ酸残基26−42を含んでなるペプチド断片である、請求の範囲第13項記載の方法。 15．ヘパリン結合タンパク質が豚 HBPである、請求の範囲第９項記載の方法。 16．HBPが配列番号２として配列表に示されるアミノ酸配列、又は LPSの脂質Ａ部分に結合できるその類似体又はペプチド断片である、請求の範囲第15項記載の方法。 17．LPSの脂質Ａ部分に結合できるペプチド断片が、少なくとも配列番号２のアミノ酸残基20−53を含んでなるペプチド断片である、請求の範囲第16項記載の方法。 18．有効量の HBPが、体重１kg当たり 0.1−100 mg、好ましくは体重１kg当たり 0.5−50mg、より好ましくは体重１kg当たり１−25mgの範囲内にある、請求の範囲第９項記載の方法。 19．LPSにより引き起こされるサイトカイニンカスケードの誘発に関連した疾患又は症状を予防又は治療するための医薬の製造のための、グリコシル化形にあるヘパリン結合タンパク質(HBP)の使用であって、このヘパリン結合タンパク質が28kDの見掛け分子量（還元条件下SDS-PAGEより測定）を有し、該タンパク質が多形核白血球のアズール性顆粒内で生産される、前記使用。 20．グラム陰性敗血症、敗血症性ショック又は散在性脈管内凝固の予防又は治療のための、請求の範囲第19項記載の使用。 21．メニンゴコカールメニギチス(Meningococcal menigitis)の治療のための、請求の範囲第19項記載の使用。 22．、ヘパリン結合タンパク質がヒト HBPである、請求の範囲第19項記載の使用。 23．HBPが配列番号１として配列表に示されるアミノ酸配列、又は LPSの脂質Ａ部分に結合できるその類似体又はペプチド断片である、請求の範囲第22項記載の使用。 24．LPSの脂質Ａ部分に結合できるペプチド断片が、少なくとも配列番号１のアミノ酸残基20−53、特にアミノ酸残基26−42を含んでなるペプチド断片である、請求の範囲第23項記載の使用。 25．ヘパリン結合タンパク質が豚 HBPである、請求の範囲第19項記載の使用。 26．HBPが配列番号２として配列表に示されるアミノ酸配列、又は LPSの脂質Ａ部分に結合できるその類似体又はペプチド断片である、請求の範囲第25項記載の使用。 27．LPSの脂質Ａ部分に結合できるペプチド断片が、少なくとも配列番号１のアミノ酸残基20−53を含んでなるペプチド断片である、請求の範囲第26項記載の使用。 28．医薬が、単位剤形当たり約10mgないし１ｇの量の HBPを含有する、請求の範囲第19項記載の使用。 29．HBPの生産方法であって、Ｎ末端伸長部により先行される成熟 HBPをコードする DNA配列を含有する宿主細胞を、HBPの発現を許容する条件下適当な培地中で培養し、次いで生成した HBPをＮ末端伸長 HBPとして培地から回収することを含んでなる、前記方法。 30．Ｎ末端伸長 HBPをコードする DNA配列が、Ｎ末端伸長部をコードする DNA 配列と成熟 HBPをコードする DNA配列との間に位置するプロテアーゼ切断部位をコードする DNA配列を含む、請求の範囲第29項記載の方法。 31．タンパク質切断部位が、アミノ酸配列(Asp)₄-Lysを有するエンテロキナーゼ切断部位である、請求の範囲第30項記載の方法。 32．プロテアーゼ切断部位が、アミノ酸配列 Ile-Glu-Gly-Argを有する因子Xa 切断部位である、請求の範囲第30項記載の方法。 33．Ｎ末端伸長部が、アミノ酸配列 Gly-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Aspを有する H BPのプロペプチドである、請求の範囲第29項記載の方法。 34．宿主細胞が、昆虫細胞である、請求の範囲第29項記載の方法。 35．Ｎ末端伸長 HBPが適当なプロテアーゼで切断され成熟タンパク質を生産する、請求の範囲第30項記載の方法。 36．HBPの生産方法であって、HBPをコードする DNA配列を含有する宿主細胞を、HBPの発現を許容せしめる条件下硫酸化多糖類を含有する適当な培地中で培養し、次いで生成した HBPを培地から回収することを含んでなる、前記方法。 37．硫酸化多糖類がヘパリンである、請求の範囲第36項記載の方法。 38．硫酸化多糖類が、不活性担体上に固定されている、請求の範囲第36項記載の方法。 39．不活性担体がアガロースである、請求の範囲第38項記載の方法。 40．宿主細胞が、Ｎ末端伸長により先行されている成熟 HBPをコードする DNA 配列を含有する、請求の範囲第36項記載の方法。 41．Ｎ末端伸長 HBPをコードする DNA配列が、Ｎ末端伸長部をコードする DNA 配列と成熟 HBPをコードする DNA配列との間に位置するプロテアーゼ切断部位をコードする DNA配列を含む、請求の範囲第40項記載の方法。 42．HBPの生産方法であって、別のタンパク質をコードする DNAにより先行されかつこれと融合した成熟 HBPをコードする DNA配列を含有する宿主細胞を、HB Pの融合タンパク質および他のタンパク質の発現を許容する条件下、適当な培地中で培養することを含んでなる、前記方法。 43．タンパク質切断部位をコードする DNA配列が、別のタンパク質をコードする DNA配列と成熟 HBPをコードする DNA配列との間に位置している、請求の範囲第42項記載の方法。