TR201810352T4 - Hb-egf egfr yolunun aktivasyonununa ilişkin hastalıkların tedavisi için difteri toksininin r alanından türetilmiş hb-egf inhibitörü. - Google Patents
Hb-egf egfr yolunun aktivasyonununa ilişkin hastalıkların tedavisi için difteri toksininin r alanından türetilmiş hb-egf inhibitörü. Download PDFInfo
- Publication number
- TR201810352T4 TR201810352T4 TR2018/10352T TR201810352T TR201810352T4 TR 201810352 T4 TR201810352 T4 TR 201810352T4 TR 2018/10352 T TR2018/10352 T TR 2018/10352T TR 201810352 T TR201810352 T TR 201810352T TR 201810352 T4 TR201810352 T4 TR 201810352T4
- Authority
- TR
- Turkey
- Prior art keywords
- protein
- egf
- sequence
- ser
- val
- Prior art date
Links
- 101800001649 Heparin-binding EGF-like growth factor Proteins 0.000 title claims abstract description 147
- 102000018710 Heparin-binding EGF-like Growth Factor Human genes 0.000 title claims abstract description 146
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 title claims abstract description 43
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 title claims abstract description 43
- 230000004913 activation Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 230000037361 pathway Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims abstract description 18
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims abstract description 18
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title claims description 15
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 title 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 claims abstract description 38
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 38
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 136
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 136
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 47
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 32
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 21
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 11
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 11
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 claims description 5
- 206010051113 Arterial restenosis Diseases 0.000 claims description 4
- 206010007572 Cardiac hypertrophy Diseases 0.000 claims description 4
- 208000006029 Cardiomegaly Diseases 0.000 claims description 4
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims description 4
- 206010018378 Glomerulonephritis rapidly progressive Diseases 0.000 claims description 4
- 201000005637 crescentic glomerulonephritis Diseases 0.000 claims description 4
- 206010052346 Brain contusion Diseases 0.000 claims description 3
- 206010047163 Vasospasm Diseases 0.000 claims description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 3
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000002815 pulmonary hypertension Diseases 0.000 claims description 3
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 101000871708 Homo sapiens Proheparin-binding EGF-like growth factor Proteins 0.000 abstract description 88
- 102100033762 Proheparin-binding EGF-like growth factor Human genes 0.000 abstract description 87
- 239000003446 ligand Substances 0.000 abstract description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 125
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 47
- 108010071134 CRM197 (non-toxic variant of diphtheria toxin) Proteins 0.000 description 38
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 28
- 101150115778 DTR1 gene Proteins 0.000 description 27
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 27
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 27
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 27
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 27
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 108010019832 glycyl-asparaginyl-glycine Proteins 0.000 description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 description 17
- SGIIOQQGLUUMDQ-IHRRRGAJSA-N Leu-His-Val Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N SGIIOQQGLUUMDQ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 16
- MJNWEIMBXKKCSF-XVYDVKMFSA-N His-Ala-Asn Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N MJNWEIMBXKKCSF-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 15
- CWSZWFILCNSNEX-CIUDSAMLSA-N His-Ser-Asn Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N CWSZWFILCNSNEX-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 14
- SWCOXQLDICUYOL-ULQDDVLXSA-N Phe-His-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SWCOXQLDICUYOL-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 14
- CKDXFSPMIDSMGV-GUBZILKMSA-N Ser-Pro-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O CKDXFSPMIDSMGV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 14
- NWEGIYMHTZXVBP-JSGCOSHPSA-N Tyr-Val-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O NWEGIYMHTZXVBP-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 14
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 14
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 14
- XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 13
- AXKJPUBALUNJEO-UBHSHLNASA-N Ser-Trp-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O AXKJPUBALUNJEO-UBHSHLNASA-N 0.000 description 13
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 13
- XVZCXCTYGHPNEM-IHRRRGAJSA-N (2s)-1-[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O XVZCXCTYGHPNEM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 12
- XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N Leu-Leu-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)N1CCCC1C(O)=O XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 108010009962 valyltyrosine Proteins 0.000 description 11
- OOWSBIOUKIUWLO-RCOVLWMOSA-N Asn-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O OOWSBIOUKIUWLO-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 10
- 108010047562 NGR peptide Proteins 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- PCMZJFMUYWIERL-ZKWXMUAHSA-N Ser-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O PCMZJFMUYWIERL-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 9
- JHDZONWZTCKTJR-KJEVXHAQSA-N Tyr-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 JHDZONWZTCKTJR-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 9
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 9
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 9
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 9
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- KFMBRBPXHVMDFN-UWVGGRQHSA-N Gly-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCNC(N)=N KFMBRBPXHVMDFN-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 8
- KPMIQCXJDVKWKO-IFFSRLJSSA-N Thr-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KPMIQCXJDVKWKO-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 8
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 8
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 8
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 8
- SMCGQGDVTPFXKB-XPUUQOCRSA-N Ala-Gly-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N SMCGQGDVTPFXKB-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 7
- DRCOAZZDQRCGGP-GHCJXIJMSA-N Asp-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O DRCOAZZDQRCGGP-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 7
- 102100021277 Beta-secretase 2 Human genes 0.000 description 7
- 101710150190 Beta-secretase 2 Proteins 0.000 description 7
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 7
- LSQHWKPPOFDHHZ-YUMQZZPRSA-N His-Asp-Gly Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)NCC(=O)O)N LSQHWKPPOFDHHZ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 7
- UCDHVOALNXENLC-KBPBESRZSA-N Leu-Gly-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 UCDHVOALNXENLC-KBPBESRZSA-N 0.000 description 7
- UIMCLYYSUCIUJM-UWVGGRQHSA-N Pro-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 UIMCLYYSUCIUJM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 7
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 7
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 7
- OMKZPCPZEFMBIT-SRVKXCTJSA-N Arg-Met-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O OMKZPCPZEFMBIT-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 6
- VOBYAKCXGQQFLR-LSJOCFKGSA-N Ile-Gly-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VOBYAKCXGQQFLR-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 6
- MMAPOBOTRUVNKJ-ZLUOBGJFSA-N Ser-Asp-Ser Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O MMAPOBOTRUVNKJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 6
- ZQGPWORGSNRQLN-NHCYSSNCSA-N Val-Asp-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N ZQGPWORGSNRQLN-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- HYIDEIQUCBKIPL-CQDKDKBSSA-N Ala-Phe-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N HYIDEIQUCBKIPL-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 5
- FRBAHXABMQXSJQ-FXQIFTODSA-N Arg-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FRBAHXABMQXSJQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- SZQCDCKIGWQAQN-FXQIFTODSA-N Cys-Arg-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SZQCDCKIGWQAQN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- CELXWPDNIGWCJN-WDCWCFNPSA-N Gln-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CELXWPDNIGWCJN-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 5
- BKOVCRUIXDIWFV-IXOXFDKPSA-N His-Lys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 BKOVCRUIXDIWFV-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 5
- RHAPJNVNWDBFQI-BQBZGAKWSA-N Ser-Pro-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O RHAPJNVNWDBFQI-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 5
- DXYWRYQRKPIGGU-BPNCWPANSA-N Tyr-Ala-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 DXYWRYQRKPIGGU-BPNCWPANSA-N 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 108010038983 glycyl-histidyl-lysine Proteins 0.000 description 5
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 5
- 108010048397 seryl-lysyl-leucine Proteins 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- UGXYFDQFLVCDFC-CIUDSAMLSA-N Asn-Ser-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O UGXYFDQFLVCDFC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 4
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 4
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 4
- 102100040485 HLA class II histocompatibility antigen, DRB1 beta chain Human genes 0.000 description 4
- 108010039343 HLA-DRB1 Chains Proteins 0.000 description 4
- VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 4
- ZUGVARDEGWMMLK-SRVKXCTJSA-N Lys-Ser-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN ZUGVARDEGWMMLK-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 4
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 4
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 4
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 229940121647 egfr inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 4
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 4
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 4
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 102000007299 Amphiregulin Human genes 0.000 description 3
- 108010033760 Amphiregulin Proteins 0.000 description 3
- KSUALAGYYLQSHJ-RCWTZXSCSA-N Arg-Met-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KSUALAGYYLQSHJ-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 101150039808 Egfr gene Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- GGEJHJIXRBTJPD-BYPYZUCNSA-N Gly-Asn-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O GGEJHJIXRBTJPD-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N L-leucyl-L-phenylalanine Natural products CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N 0.000 description 3
- XOWMDXHFSBCAKQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C XOWMDXHFSBCAKQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- JACAKCWAOHKQBV-UWVGGRQHSA-N Met-Gly-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN JACAKCWAOHKQBV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- HOYQLNNGMHXZDW-KKUMJFAQSA-N Phe-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O HOYQLNNGMHXZDW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- VUVCRYXYUUPGSB-GLLZPBPUSA-N Thr-Gln-Glu Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N)O VUVCRYXYUUPGSB-GLLZPBPUSA-N 0.000 description 3
- DXPURPNJDFCKKO-RHYQMDGZSA-N Thr-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)C(O)=O DXPURPNJDFCKKO-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 3
- ZNGPROMGGGFOAA-JYJNAYRXSA-N Val-Tyr-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 ZNGPROMGGGFOAA-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 3
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 108700021358 erbB-1 Genes Proteins 0.000 description 3
- 230000003631 expected effect Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 108010044056 leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 3
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 description 2
- HJAICMSAKODKRF-GUBZILKMSA-N Arg-Cys-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O HJAICMSAKODKRF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- NPAVRDPEFVKELR-DCAQKATOSA-N Arg-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NPAVRDPEFVKELR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- FVBZXNSRIDVYJS-AVGNSLFASA-N Arg-Pro-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N FVBZXNSRIDVYJS-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- IICZCLFBILYRCU-WHFBIAKZSA-N Asn-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IICZCLFBILYRCU-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- WONGRTVAMHFGBE-WDSKDSINSA-N Asn-Gly-Gln Chemical compound C(CC(=O)N)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)N)N WONGRTVAMHFGBE-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- WUQXMTITJLFXAU-JIOCBJNQSA-N Asn-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O WUQXMTITJLFXAU-JIOCBJNQSA-N 0.000 description 2
- PGUYEUCYVNZGGV-QWRGUYRKSA-N Asp-Gly-Tyr Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PGUYEUCYVNZGGV-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- PLOKOIJSGCISHE-BYULHYEWSA-N Asp-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O PLOKOIJSGCISHE-BYULHYEWSA-N 0.000 description 2
- XFTWUNOVBCHBJR-UHFFFAOYSA-N Aspergillomarasmine A Chemical compound OC(=O)C(N)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O XFTWUNOVBCHBJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 101100512078 Caenorhabditis elegans lys-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 2
- GMXSSZUVDNPRMA-FXQIFTODSA-N Cys-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GMXSSZUVDNPRMA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 2
- NJMYZEJORPYOTO-BQBZGAKWSA-N Gln-Pro Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O NJMYZEJORPYOTO-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- MQJDLNRXBOELJW-KKUMJFAQSA-N Gln-Pro-Phe Chemical compound N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O MQJDLNRXBOELJW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- JRCUFCXYZLPSDZ-ACZMJKKPSA-N Glu-Asp-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JRCUFCXYZLPSDZ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- RFTVTKBHDXCEEX-WDSKDSINSA-N Glu-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O RFTVTKBHDXCEEX-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- VAXIVIPMCTYSHI-YUMQZZPRSA-N Gly-His-Asp Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)CN VAXIVIPMCTYSHI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- YYXJFBMCOUSYSF-RYUDHWBXSA-N Gly-Phe-Gln Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O YYXJFBMCOUSYSF-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- FULZDMOZUZKGQU-ONGXEEELSA-N Gly-Val-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)CN FULZDMOZUZKGQU-ONGXEEELSA-N 0.000 description 2
- KRBMQYPTDYSENE-BQBZGAKWSA-N His-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 KRBMQYPTDYSENE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- KFQDSSNYWKZFOO-LSJOCFKGSA-N His-Val-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KFQDSSNYWKZFOO-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000963974 Hydrophis stokesii Alpha-elapitoxin-Ast2b Proteins 0.000 description 2
- QTUSJASXLGLJSR-OSUNSFLBSA-N Ile-Arg-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N QTUSJASXLGLJSR-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 239000005551 L01XE03 - Erlotinib Substances 0.000 description 2
- YWYQSLOTVIRCFE-SRVKXCTJSA-N Leu-His-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YWYQSLOTVIRCFE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- DIBZLYZXTSVGLN-CIUDSAMLSA-N Lys-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DIBZLYZXTSVGLN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- MDDUIRLQCYVRDO-NHCYSSNCSA-N Lys-Val-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN MDDUIRLQCYVRDO-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- BCRQJDMZQUHQSV-STQMWFEESA-N Met-Gly-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O BCRQJDMZQUHQSV-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- 101000964025 Naja naja Long neurotoxin 3 Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 2
- LLGTYVHITPVGKR-RYUDHWBXSA-N Phe-Gln-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O LLGTYVHITPVGKR-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- RYQWALWYQWBUKN-FHWLQOOXSA-N Phe-Phe-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O RYQWALWYQWBUKN-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- QKQDTEYDEIJPNK-GUBZILKMSA-N Ser-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO QKQDTEYDEIJPNK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- VZQRNAYURWAEFE-KKUMJFAQSA-N Ser-Leu-Phe Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 VZQRNAYURWAEFE-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- XUDRHBPSPAPDJP-SRVKXCTJSA-N Ser-Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CO XUDRHBPSPAPDJP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- PPCZVWHJWJFTFN-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PPCZVWHJWJFTFN-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- OZPDGESCTGGNAD-CIUDSAMLSA-N Ser-Ser-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CO OZPDGESCTGGNAD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- SQHKXWODKJDZRC-LKXGYXEUSA-N Ser-Thr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SQHKXWODKJDZRC-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 2
- XPVIVVLLLOFBRH-XIRDDKMYSA-N Ser-Trp-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)NC(=O)[C@@H](N)CO)C(O)=O XPVIVVLLLOFBRH-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 2
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N Technetium-99 Chemical group [99Tc] GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 2
- FQPQPTHMHZKGFM-XQXXSGGOSA-N Thr-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FQPQPTHMHZKGFM-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 2
- UGFSAPWZBROURT-IXOXFDKPSA-N Thr-Phe-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O UGFSAPWZBROURT-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 2
- AKHDFZHUPGVFEJ-YEPSODPASA-N Thr-Val-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O AKHDFZHUPGVFEJ-YEPSODPASA-N 0.000 description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- UDNYEPLJTRDMEJ-RCOVLWMOSA-N Val-Asn-Gly Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)NCC(=O)O)N UDNYEPLJTRDMEJ-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 2
- GBESYURLQOYWLU-LAEOZQHASA-N Val-Glu-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N GBESYURLQOYWLU-LAEOZQHASA-N 0.000 description 2
- SDHZOOIGIUEPDY-JYJNAYRXSA-N Val-Ser-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 SDHZOOIGIUEPDY-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 2
- -1 betacelluline Proteins 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000004121 copper complexes of chlorophylls and chlorophyllins Substances 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 2
- 229960001433 erlotinib Drugs 0.000 description 2
- AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N erlotinib Chemical compound C=12C=C(OCCOC)C(OCCOC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=CC(C#C)=C1 AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 2
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010020688 glycylhistidine Proteins 0.000 description 2
- 108010040030 histidinoalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 108010083708 leucyl-aspartyl-valine Proteins 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 210000000557 podocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 2
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M (4z)-1-(3-methylbutyl)-4-[[1-(3-methylbutyl)quinolin-1-ium-4-yl]methylidene]quinoline;iodide Chemical compound [I-].C12=CC=CC=C2N(CCC(C)C)C=CC1=CC1=CC=[N+](CCC(C)C)C2=CC=CC=C12 QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical group C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NXSFUECZFORGOG-CIUDSAMLSA-N Ala-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NXSFUECZFORGOG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- HQJKCXHQNUCKMY-GHCJXIJMSA-N Ala-Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N HQJKCXHQNUCKMY-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- CNQAFFMNJIQYGX-DRZSPHRISA-N Ala-Phe-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=CC=C1 CNQAFFMNJIQYGX-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- REWSWYIDQIELBE-FXQIFTODSA-N Ala-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O REWSWYIDQIELBE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101100067974 Arabidopsis thaliana POP2 gene Proteins 0.000 description 1
- JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- UZSQXCMNUPKLCC-FJXKBIBVSA-N Arg-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O UZSQXCMNUPKLCC-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- OPEPUCYIGFEGSW-WDSKDSINSA-N Asn-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OPEPUCYIGFEGSW-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- GWNMUVANAWDZTI-YUMQZZPRSA-N Asn-Gly-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)N)N GWNMUVANAWDZTI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- COWITDLVHMZSIW-CIUDSAMLSA-N Asn-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O COWITDLVHMZSIW-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- BCADFFUQHIMQAA-KKHAAJSZSA-N Asn-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O BCADFFUQHIMQAA-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 1
- CNKAZIGBGQIHLL-GUBZILKMSA-N Asp-Arg-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N CNKAZIGBGQIHLL-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WBDWQKRLTVCDSY-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WBDWQKRLTVCDSY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N Asp-Ser Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 241000731848 Bachia Species 0.000 description 1
- 208000009079 Bronchial Spasm Diseases 0.000 description 1
- 208000014181 Bronchial disease Diseases 0.000 description 1
- 206010006482 Bronchospasm Diseases 0.000 description 1
- 101100505161 Caenorhabditis elegans mel-32 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100298998 Caenorhabditis elegans pbs-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100315624 Caenorhabditis elegans tyr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910021532 Calcite Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000002177 Cataract Diseases 0.000 description 1
- 241000581444 Clinidae Species 0.000 description 1
- 241000186227 Corynebacterium diphtheriae Species 0.000 description 1
- 244000182625 Dictamnus albus Species 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 102100030323 Epigen Human genes 0.000 description 1
- 108010016906 Epigen Proteins 0.000 description 1
- 101800000155 Epiregulin Proteins 0.000 description 1
- 244000166124 Eucalyptus globulus Species 0.000 description 1
- 102000020897 Formins Human genes 0.000 description 1
- 108091022623 Formins Proteins 0.000 description 1
- BVELAHPZLYLZDJ-HGNGGELXSA-N Gln-His-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BVELAHPZLYLZDJ-HGNGGELXSA-N 0.000 description 1
- TWIAMTNJOMRDAK-GUBZILKMSA-N Gln-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O TWIAMTNJOMRDAK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- HPCOBEHVEHWREJ-DCAQKATOSA-N Gln-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HPCOBEHVEHWREJ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- KEBACWCLVOXFNC-DCAQKATOSA-N Glu-Arg-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O KEBACWCLVOXFNC-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LPHGXOWFAXFCPX-KKUMJFAQSA-N Glu-Pro-Phe Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=CC=C2)C(=O)O LPHGXOWFAXFCPX-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- CQGBSALYGOXQPE-HTUGSXCWSA-N Glu-Thr-Phe Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O CQGBSALYGOXQPE-HTUGSXCWSA-N 0.000 description 1
- TZOVVRJYUDETQG-RCOVLWMOSA-N Gly-Asp-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CN TZOVVRJYUDETQG-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- QSVCIFZPGLOZGH-WDSKDSINSA-N Gly-Glu-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O QSVCIFZPGLOZGH-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- MHXKHKWHPNETGG-QWRGUYRKSA-N Gly-Lys-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MHXKHKWHPNETGG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- DHNXGWVNLFPOMQ-KBPBESRZSA-N Gly-Phe-His Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)NC(=O)CN DHNXGWVNLFPOMQ-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- BAYQNCWLXIDLHX-ONGXEEELSA-N Gly-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CN BAYQNCWLXIDLHX-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 208000010496 Heart Arrest Diseases 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- KWBISLAEQZUYIC-UWJYBYFXSA-N His-His-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N KWBISLAEQZUYIC-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- 101100118549 Homo sapiens EGFR gene Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 1
- AKOYRLRUFBZOSP-BJDJZHNGSA-N Ile-Lys-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N AKOYRLRUFBZOSP-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QCSFMCFHVGTLFF-NHCYSSNCSA-N Leu-Asp-Val Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QCSFMCFHVGTLFF-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- IZJGPPIGYTVXLB-FQUUOJAGSA-N Lys-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N IZJGPPIGYTVXLB-FQUUOJAGSA-N 0.000 description 1
- NCZIQZYZPUPMKY-PPCPHDFISA-N Lys-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NCZIQZYZPUPMKY-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N Lys-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- UWHCKWNPWKTMBM-WDCWCFNPSA-N Lys-Thr-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O UWHCKWNPWKTMBM-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- VHTOGMKQXXJOHG-RHYQMDGZSA-N Lys-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VHTOGMKQXXJOHG-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- 241001068914 Melicope knudsenii Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100056816 Methanocaldococcus jannaschii (strain ATCC 43067 / DSM 2661 / JAL-1 / JCM 10045 / NBRC 100440) artE gene Proteins 0.000 description 1
- 102100035971 Molybdopterin molybdenumtransferase Human genes 0.000 description 1
- 101710119577 Molybdopterin molybdenumtransferase Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 102000014413 Neuregulin Human genes 0.000 description 1
- 108050003475 Neuregulin Proteins 0.000 description 1
- 101100068676 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) gln-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- METZZBCMDXHFMK-BZSNNMDCSA-N Phe-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N METZZBCMDXHFMK-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- CXMSESHALPOLRE-MEYUZBJRSA-N Phe-Thr-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)O CXMSESHALPOLRE-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- WHNJMTHJGCEKGA-ULQDDVLXSA-N Pro-Phe-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O WHNJMTHJGCEKGA-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- SPLBRAKYXGOFSO-UNQGMJICSA-N Pro-Phe-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@@H]2CCCN2)O SPLBRAKYXGOFSO-UNQGMJICSA-N 0.000 description 1
- PGSWNLRYYONGPE-JYJNAYRXSA-N Pro-Val-Tyr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O PGSWNLRYYONGPE-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 102100025498 Proepiregulin Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101800001127 Protein prM Proteins 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102100029981 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 Human genes 0.000 description 1
- 101710100963 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 Proteins 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100123851 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HER1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- QTENRWWVYAAPBI-YZTFXSNBSA-N Streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YZTFXSNBSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 102100033130 T-box transcription factor T Human genes 0.000 description 1
- 101710086566 T-box transcription factor T Proteins 0.000 description 1
- IGGFFPOIFHZYKC-PBCZWWQYSA-N Thr-His-Asp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N)O IGGFFPOIFHZYKC-PBCZWWQYSA-N 0.000 description 1
- WBCCCPZIJIJTSD-TUBUOCAGSA-N Thr-His-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N WBCCCPZIJIJTSD-TUBUOCAGSA-N 0.000 description 1
- XSEPSRUDSPHMPX-KATARQTJSA-N Thr-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XSEPSRUDSPHMPX-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- DEGCBBCMYWNJNA-RHYQMDGZSA-N Thr-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O DEGCBBCMYWNJNA-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- MNYNCKZAEIAONY-XGEHTFHBSA-N Thr-Val-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MNYNCKZAEIAONY-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- 102000006747 Transforming Growth Factor alpha Human genes 0.000 description 1
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- BXKWZPXTTSCOMX-AQZXSJQPSA-N Trp-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O BXKWZPXTTSCOMX-AQZXSJQPSA-N 0.000 description 1
- WKQNLTQSCYXKQK-VFAJRCTISA-N Trp-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WKQNLTQSCYXKQK-VFAJRCTISA-N 0.000 description 1
- 208000024780 Urticaria Diseases 0.000 description 1
- NXRAUQGGHPCJIB-RCOVLWMOSA-N Val-Gly-Asn Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NXRAUQGGHPCJIB-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- FEFZWCSXEMVSPO-LSJOCFKGSA-N Val-His-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FEFZWCSXEMVSPO-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000002313 adhesive film Substances 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001484 arginines Chemical class 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 238000004159 blood analysis Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 229940096118 ella Drugs 0.000 description 1
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 210000001061 forehead Anatomy 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001434 glomerular Effects 0.000 description 1
- 108010078144 glutaminyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 235000019410 glycyrrhizin Nutrition 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000010005 growth-factor like effect Effects 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 231100000171 higher toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 108010028295 histidylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000036543 hypotension Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 239000008141 laxative Substances 0.000 description 1
- 229940125722 laxative agent Drugs 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- VKQFCGNPDRICFG-UHFFFAOYSA-N methyl 2-methylpropyl 2,6-dimethyl-4-(2-nitrophenyl)-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylate Chemical compound COC(=O)C1=C(C)NC(C)=C(C(=O)OCC(C)C)C1C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O VKQFCGNPDRICFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 208000004235 neutropenia Diseases 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 229940016590 sarkosyl Drugs 0.000 description 1
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 231100000046 skin rash Toxicity 0.000 description 1
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229940035718 sular Drugs 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 229910052713 technetium Inorganic materials 0.000 description 1
- GKLVYJBZJHMRIY-UHFFFAOYSA-N technetium atom Chemical compound [Tc] GKLVYJBZJHMRIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OOLLAFOLCSJHRE-ZHAKMVSLSA-N ulipristal acetate Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1[C@@H]1C2=C3CCC(=O)C=C3CC[C@H]2[C@H](CC[C@]2(OC(C)=O)C(C)=O)[C@]2(C)C1 OOLLAFOLCSJHRE-ZHAKMVSLSA-N 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/02—Pentosyltransferases (2.4.2)
- C12Y204/02036—NAD(+)--diphthamide ADP-ribosyltransferase (2.4.2.36)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
Abstract
HB-EGF/EGFR yolunun aktivasyonuna ilişkin hastalıkların tedavisi ve teşhisi için kullanılabilen, difteri toksininin R alanından, EtaBeta-EGF'yi (Heparin Bağlayıcı Epidermal Büyüme Faktörü benzeri) inhibe eden bir ligant rekombinant protein.
Description
TARIFNAME
HB-EGF/EGFR YOLUNUN AKTIVASYONUNUNA ILISKIN HASTALIKLARIN
TEDAVISI IÇIN DIFTERI TOKSINININ R ALANINDAN TÜRETILMIS HB-EGF
INHIBITÖRÜ
Mevcut bulus, HB-EGF/EGFR yolunun aktivasyonundan kaynaklanan hastalllZIarlEl tedavisi ve
teshisi için faydalEIolan, difteri toksininin R alanütlan çlJZlan, HB-EGF (Heparin-Binding
Epidermal Growth Factor like) inhibitörü Iigant rekombinant proteini ile ilgilidir.
HB-EGF, difteri toksininin dogal reseptörü olan pro-HB-EGF, bir prekürsör membran proteini
formunda organizmanI hücrelerinin yüzeyinde ekprese edilen bir büyüme faktörüdür.
Difteri toksini (DT), bir fragment (A) (N-terminal) ve bir frament (B)'den (C-terminal) olusan
bir eksotoksinidir. Fragment A katalitik alanEQC
veya DTA/DT-A; kalIar 1 ila 193) içermektedir ve fragment B ise translokasyon alanIE(T;
N-terminal; kalEtllâr 202 ila 378) içermektedir ve hücresel allElýla baglanma alanIEQR veya
DTR; C-terminal, kallEtllâr 379-386 ila 535).
DT, pro-HB-EGF'ye (R) alanIa saglanan baglantEile hücrelerin yüzeyine sabitlenmektedir;
DT'nin fragmentler (A ve B) araleda proteolitik klElIIha ile aktivasyonundan sonra alan (T),
sitoplazma içinde fragment (A)'nI trankslokasyonuna olanak saglamaktadlB Sitoplazma
içinde, katalitik alan fragment (A) tarafIan tas-Hitan sonra, uzama faktörünü (EF2)
inaktive ederek proteik sentezi bloke etmektedir, böylece hücrelerin ölümünü tetiklemektedir.
DT'nin dogal ve sentetik mutantlarII çallgtnasü DT'nin pro-HB-EGF reseptörüne olan
baglant-IEJ, DTR'nin K
döngüsünün kallEtllârüleya kalllî$'in ikame edilmesi ile ve aynlâamanda 4 C-
terminaller kaIlEt-I delesyonu ile y-Ilgllîgöstermektedir (kallEtllâr E532-5535; Shen ve
mutasyonu (G52E)'yi içeren dogal DT mutantül'üksek oranda azaltllüilglkatalitik bir aktiviteye
HB-EGF'ye iliskin inflamatuvar süreçler sEasIda pro-HB-EGF membran proteini bir proteazEl
taraflEdan klElIBiaktadlîl ve HB-EGF ise salgllânmlgl bir protein formunda hücre yüzeyinden
sallEl'naktadlB OrganizmanI tüm dokularIa pratik olarak eksprese edilen, EGF'Ii (EGFR
ailesi veya EGFR) reseptörlerinin ailesinin ErbBl (HER1 veya EGFR) ve ErbB4 (HER4) alt
türleri üzerinde otokrin veya parakrin sekilde gerçeklesmektedir. HB-EGF'ye artülarak en az
on EGFR IigantÇl yani EGF mevcuttur; yani TGF-alfa, amfiregulin, betaselüline, epijen,
epiregulin veya nöregulinler -1, -2, -3 ve -4. Bu IigantlarI biri veya digeri tarafIdan
stimülasyonunu belirleyen lokal baglam budur.
Pro-HB-EGF'nin ekspresyonunun arttlEIIhasIEla ve/veya HB-EGF'nin salIIilEla iliskin olanHB-
EGF/EGFR yolunun aktivasyonu, çok say. patolojiden sorumlu zararlEl bir hücre
proliferasyonunu tahrik etmektedir:
- glomerüler (podositler) renal hücrelerin proliferasyonunun böbregin y-iIEla yol açtlglEl
kademeli hlZlEglomerülonefritler (GNRP - kresentik glomerülonefrit) (Feng ve ark., J.
- yumurtallKl kanseri, endometriyum kanseri, meme kanseri, rahim kanseri (uterus
adenokarsinomu), mesane kanseri, mide kanseri, deri kanseri (malign melanom), beyin
kanseri (glioblastoma) ve akciger kanseri dahil olmak üzere kanserler (Yotsumoto ve
1938),
- kardiyak hipertrofisi (Asakura ve ark., Nat. Med., 2002, 8, 35-40; Hamaoka ve ark., J.
- diyabetik retinopatiler ve
- arteryel restenoz.
Artan say. hastaliIZta yer almaledan dolayÇlHB-EGF terapötik bir hedefi temsil etmektedir.
Güncel olarak EGFR, EGFR inhibitörleri ve HB-EGF inhibitörleri üzerinde HB-EGF'nin etkisini
bloke etmek için iki tip molekül mevcuttur. Bununla birlikte, HB-EGF (HB-EGF/EGFR yolu) ile
EGFR aktivasyonunu içeren patolojik durumlarElledavi etmek için kullanllâbilen bu moleküller,
belirli bir say. önemli dezavantaja sahiptir.
EGFR inh/b/'tör/er/
Iki tip EGFR inhibitörü, EGFR stimülasyonunu HB-EGF ile bloke etmek için teorik olarak
kullanllâbilmektedir: erlotinib gibi EGFR üzerinde etkiyen geri dönüsümlü tirozin kinaz
inhibitörleri ve cetuximab gibi EGFR'ye karslîyönlendirilen antikorlar (Ciardiello and Tortora,
Bununla birlikte, bunu aktive eden liganttan baglislîlolarak stimülasyonunun kökeni her ne
olursa olsun ve bu ligant her ne olursa olsun, EGFR'Nin aktivasyonunu bloke ettikleri göz
önünde bulunduruldugunda, EGFR kniaz tirozini (küçük moleküller) üzerinde ya da EGFR'nin
kendisi (monoklonal antikorlar) üzerinde etki eden bu moleküller HB-EGF/EGFR yolu için
spesifik degildir. Spesifiklik eksikligi nedeniyle, EGFR inhibitörleri önemli yan etkiler
üretimektedir. Örnek olarak, erlotinib ve cetuximab için asagEîbki bildirilen yan etkilere neden
olabilmektedir: nötropeni, trombositopeni, anemi, ödem, mide bulantlîükusma, bas agrlglîl
kaslEtEi/e kas-iskelet agrEElates, titreme, ürtiker, kaslütllâr, deri döküntüsü, hipotansiyon,
bronkospazm, dispne, ödem, konfüzyon, anafilaktik sok ve kalp durmasü
AyrlEla, antikorlar, HB-EGF tarafIan uyarllân EGFR'nin renal glomerüllerindeki podositler
tarafIan eksprese edildigi ve glomerüler filtrasyon esiginin yaklaslKl 68 kDa oldugu göz
önüne alülzügilrîtla, GNRP durumunda hedeflerine ulasmak için çok büyük ( fazladlü
Benzer sekilde, antikorlar. katEliümörlere nüfuzu, büyüklükleri nedeniyle sIIIBlIB
HB-EGF /hh/b/Iör/er/
Farelerde, pro-HB-EGF geninin geçersiz klIlEinaslÇlindüklenen bir GNRP'nin tetiklenmesini
yolunun aktivasyonuna iliskin patolojilerin tedavisi için HB-EGF ve pro-HB-EGF'nin bir ligant
inhibitörünün gelistirilmesine yönelik ilgiyi dogrulmaktadlE
Güncel olarak HB-EGF ile EGFR stimülasyonunu bloke etmek için potansiyel olarak
kullanllâbilen iki tip HB-EGF inhibitörü vardlE'l HB-EGF'ye karsElyönelik antikorlar (WO
EP 1894575).
HB-EGF'ye karsÜ/önlendirilen antikorlar, sadece HB-EGF/EGFR yolunun aktivasyonunu bloke
ettikleri göz önüne alIIIdigla EGFR inhibitörlerinden daha spesifiktir, fakat aslElIboyutlarlEb
bagIIZNarak anti-EGFR antikorlarüle ayn Ülezavantajlara sahiptirler.
CRM197, EGFR'ye baglanmasIEbloke edebilen dogal bir HB-EGF ligant- Güncel olarak
yumurtallKl kanseri ile mücadele etmek için HB-EGF'yi bloke etmek için klinik çalismalarda
Bununla birlikte, CRM197'nin artllZl toksisite, boyut, afinite, immünojenisite ve antijenisite
aç-dan saklitalarülardü
CRM197'nin art[lZl toksisitesi, vahsi tip difteri toksinininkinden 106 kat daha düsüktür
primat hücre kültüründe 5 pM'lik bir ölümcül doz 50 (LDSO) ile son derece güçlü oldugu için
göz ardEbdilebilir degildir. Dolaylâlýla CRM197, mikromolar (uM) dozlaria toksiktir. Bu,
insanlara yüksek dozda uygulandlgllEtla risk olusturabilir (Kageyama ve ark., J. Biochem.,
CRM197, glomerüler filtrasyon esigini zorlukla geçen, 58 kDa'liß bir moleküler aglEll[gB
sahiptir. Bu nedenle, doku penetrasyonunun terapötik etkinlik için önemli bir faktör oldugu
GNPR veya katEliümörler gibi diger patolojik durumlarElledavi etmek için kullan namaz.
CRM197, HB-EGF için ortalama bir afiniteye sahiptir (Kd = 27 nM; Brooke ve ark., Biochem.
daha düsüktür.
CRM ile ayrEIBiaktadlB Bu
nedenle, difteri toksininin tüm T CD4 epitoplarIIithasaktadlElya da eger mutasyon bir T
epitopunu etkiliyor ise bunun neredeyse tümünü taslaktadlB Bununla birlikte batü
popülasyonlarEdifteri toksinine karsüsllânmaktadlü HastalarlIRM197 ile tedavi etmek, bir
aslîjgüçlendirici vermeyi içermektedir. Ilk enjeksiyon kadar erken bir zamanda, CRM197 bellek
T CD4 hücrelerinin yeniden aktivasyonuna neden olabilmektedir ve dolasIidaki antikorlarlEl
üretimini yeniden düzenleyebilmektedir. CRM197'nin ilk uygulamasIan birkaç gün sonra, bu
antikorlar proteini nötralize etmeli ve tedaviyi etkisiz hale getirmelidir.
CRM197, difteri toksininin hemen hemen tüm B epitoplar- sahip oldugu için çok antijeniktir.
Batllopülasyonu difteri toksinine karsßsüândtglljçin, bireylerin önemli bir klîinECRM197'yi
ilk uygulama olarak nötralize edebilen dolasndaki antikorlara sahiptir. Bu, terapötik bir
etkiyi elde etmek için CRM197'nin kitle dozlarII kullanllhiaslüsaglarken, yan etkilerin
(toksisite, anafilaktik sok, vb.) riskini önemli ölçüde arttlElnaktadlEl
Sonuç olarak, daha küçük bir boyuta sahip HB-EGF inhibitörlerine, HB-EGF için daha iyi bir
afiniteye ve CRM197'ye klýlasla azaltllüilgl bir antijenite, immünojenisite ve toksisiteye sahip
olmak için gerçek bir ihtiyaç vardlEl
Simdiye kadar, izole edilmis DTR alanIÇldogrudan, rekombinant formda, yüksek bir verimle
ve dönüstürülmüs hücrelerden rekombinant proteini çllîhrmak için deterjanlar veya kaotropik
veya denatüre edici maddeler kullanmadan üretmek mümkün olmamEtE
Nitekim izole edilmis DTR alanII yap-Elstabilize etmek ve bu alan. dönüstürülmüs
bakterilerden ekstraksiyonunu ve saflastlElBiasIEgelistirmek için, DTR alanIIIbir proteine
(glutatyon-S-transferaz, GST) ya da bir protein alan. (5. aureus protein A'dan türetilmis ZZ
füzyonu kullanllârak üretilmistir; bu DTR mutantlarüpro-HB-EGF reseptörüne baglanamazlar
(Shen ve ark., 1994).
Yukar- belirtilen iki durumda, E. coli'de üretilen rekombinant protein, izole edilmis bir DTR
alanEldegil, bir GST-DTR veya ZZ-DTR füzyon proteinidir. GST-DTR füzyon proteini
durumunda, üretim verimleri vasattlîlve füzyon proteinini transforme bakterilerden çllZlarmak
için bir deterjan (%1 Triton X-100) kullanllüiasßsastlîl AyrlEh, bir terapötik protein üretmek
için füzyon partneri çllZhrllBiallÇl bu nedenle üretim prosesi çok daha karmasllîl hale
gelmektedir ve hatta daha fazla verimi azalmaktadlEl
Bulus sahipleri, füzyon partneri dizileri içermeyen, izole edilmis DTR alanlEllEl mutantlarIIZl
Olusturdular. Izole DTR alan.. bu mutantlarüpro-HB-EGF ve HB-EGF için afinite ile küçük
boyutlu (yaklaslE olarak 17500 Da) bir çözünür rekombinant DTR proteini formunda
dogrudan ve büyük miktarda eksprese edilmektedir. Bu DTR mutantlarÇl CRM197 ile
karsilâst-[glia, sasIEElbir sekilde hem azaltilüilgl bir antijenite hem de immünojenisiteye
ve dikkate deger Ölçüde artan bir afiniteye sahip olan gelistirilmis rekombinant DTR
proteinleri üretmek üzere modifiye edilmistir.
Sonuç olarak mevcut bulus, difteri toksininin R alan. karsima SEKANS KIMLIK NO: 1 olan
amino asitlerin bir sekansII kallEtllârEBSO ila 535'i ile en az %70 oranIa benzerlige sahip
olan bir sekans içeren difteri toksininin izole bir R alanIElçeren bir rekombinant proteini
amaçlamakta olup; söz konusu sekans, Y380K ve L390T ikamelerinin kombinasyonunu
içermektedir ve söz konusu sekans, söz konusu R alan N- veya C-terminali ucunda, difteri
toksininin C alanEl/e T alanElsekansIan ve bir proteinin sekansIan veya söz konusu R
alanII saflastlEIlîhasÜ'eya stabilitesini iyilestirebilen bir protein alanIian yoksundur ve söz
konusu rekombinant protein HB-EGF'nin bir inhibitör IigantIB
Bulus istemlerde belirtildigi sekildedir.
Bulus, asaglki avantajlarüsergileyen pro-HB-EGF ve HB-EGF'nin bir ligant terapötik
rekombinant proteinini saglamaktadlü
- vahsi form (DTRWT)'a göre çok yüksek bir çözünebilirlige sahiptir. Y380K ve L390T
ikamelerinin kombinasyonu, sulu çözeltide protein (DTR)'nin çözünebilirliginin önemli
ölçüde arttlElllßîalela olanak saglamaktadlü DolayElEa bulusa göre rekombinant protein,
konak hücrelerden çekilebilmektedir ve deterjanlar veya kaotropik veya denaturant
maddeler kullanllüîadan saflastlElllâbiImektedir. Karsllâst-Idlgla, aynlZl ekspresyon
sisteminde üretilen dogal tip DTR proteini (DTRWT) çözünmezdir ve terapötik kullanIia
uygun deterjanlar kullanllârak çözülmez. DTRWT proteini, bu konsantrasyonlarda terapötik
kullanIila uyumsuz olan deterjanlar olan %05 sarkosil veya sodyum dodesil sülfat
varllgllda çözündürülmektedir.
- DTRWT'ye göre rekombinant formunda üretilmesi çok daha kolaydlEI R alanllEl stabilitesini
veya saflastlElIIhasIEI gelistirmek için bir füzyon partneri kullanmadan dogrudan
üretilmektedir. E. Çal/de standart fermantasyon prosedürlerine göre, katlanmlgçözünebilir
bir formda ve son saflastlElnadan sonra büyük miktarda (üretilmemis laboratuar
kosullarIa birkaç on mg/L kültür) üretilmektedir.
- HB-EGF ve pro-HB-EGF için, CRM197'den en az 10 kat daha büyük bir afiniteye sahiptir.
SaslElllEDJir sekilde, vahsi tip DTR proteini (DTRWT), CRM197'den 2 kat daha düsük olan
HB-EGF ve pro-HB-EGF için bir afiniteye sahip olmasi ragmen, bulusa göre mutant DTR
proteinleri, HB-EGF ve pro-HB-EGF için CRM197'ninkinden önemli ölçüde daha yüksek
olan bir aûniteye sahiptir; DTR1, DTR3 ve DTR8 olarak adlandlEIllân proteinler slîasMa
aynEIterapötik etki için CRM197'den çok düsük dozlarda kullanüâbildigi anlam.
gelmektedir. Bu nedenle, genel olarak organizmanI diger proteinleri ve ligantlarlîile
düsük bir afinite baglantElElI varllgl- bagIEblan yan etki riskleri böylece CRM197'ye
klîlasla önemli ölçüde azalmaktadlEI Bu etkilesimler, pM cinsinde, düsük dozlarI
kullanüßîaslîle bastlEllBIaktad Eve DTR8 için bu durum geçerlidir.
CRM 197'Ye ve DTRWT'ye göre azalmlglbir Immünojenisiteye sahiptir. DTRWT'de tan lanan
26 T epitopundan onu, 9 immünodominant epitop araleUan 7 tanesi olan, yönlendirilmis
mutajenez ile DTR8 proteinini bastlElnaktadlEl
CRM197'Ye ve DTRWT'Ye göre azalmlgl bir antijenisiteye sahiptir. Difteri toksinine karsEl
asllânan bireylerin serumlarEltercihen bunun katalitik alanIEltanlaktadIE Bu alan
CRM 197 molekülü içinde mevcuttur ve bulusa göre mutasyona ugramlSlDTR proteininden
yoksundur. Öte yandan, bulusa göre mutasyona ugramSJDTR proteini, DTRWT'YI tanülan
asllânmgsüjelerin antikorlarEliarafIan DTRWT'den daha az bilinmektedir.
EGFR'nin (küçük moleküller ve terapötik antikorlar) ticari inhibitörlerinden çok daha fazla
olacak sekilde HB-EFG tarafEUan EGFR'nin (ErbBl ve ErbB4) aktivasyon yolunu bloke
etmektedir, bu nedenle potansiyel olarak daha az yan etki riski sergilemektedir,
küçük bir boya sahiptir; SEKANS KIMLIK NO: 2 ila ve SEKANS KIMLIK NO: 7 ila 9
proteinleri 158 amino asidi sekans- ve yaklaslla olarak 17500 Da'llE bir PM'e sahiptir;
baska bir ifadeyle HB-EGF yolunun bloke edilmesi için klinik protokollerinde güncel olarak
kullanilân anti-HB-EGF antikorlarIlEkinden 8,8 kat daha küçük ve CRM197'ninkinden 3,4
kat daha küçük bir boya sahiptir.
Küçük boyu nedeniyle bulusa göre rekombinant protein, HB-EGF yolunun aktivasyonuna
baglEloIan patolojilerin, özellikle GNRP veya yumurtalllZl kanserinin tedavisinde daha
etkilidir; çünkü dokularda, özellikle de tümörlerde daha kolayca yayllîhaktadlEl ve renal
glomerüllere nüfuz edebilmektedir.
AyrEla, HB-EGF ve pro-HB-EGF için yüksek bir afinite nedeniyle bulusa göre protein aynEl
zamanda, HB-EGF-EGFR yolunun aktivasyonuna iliskin hastal[E|arI teshisi için de
kullanllâbilmektedir.
TanZEilar
Mevcut dokümanda, "DTR” veya “DTR alanlîlile vahsi difteri toksininin amino asitleri
toksininin R alanlîa'snlasllßîaktadlü
saflastlîllBiasIüiyilestirebilen bir protein alanElya da bir proteinin sekansElve difteri
toksininin T alanü/e C alanII sekansII N- veya C-terminali ucundan yoksun olan bir
DTR alanIEilçeren bir rekombinant proteini belirmektedir. AyrlEla bir rekombinant protein
formunda üretildigi göz önünde bulunduruldugunda, R alan saflastlîlmîasßöz konusu
alnI ekstraksiyonu ve saflastirilmaslübermektedir.
Yukarlab belirtildigi üzere en az ikame içeren bulusa göre rekombinant protein, mutant
DTR proteinini, mutasyona ugramlg DTR proteini veya DTRn proteini adElaltlEUa
beliitilmektedir; burada n, bu ikameyi içermeyen vahsi DTR rekombinant proteininin
(DTRWT) aksine bir tam sayIlE
Amino asitler tek harfli kod ile belirtilmektedir.
Bir referans sekans. göre bir amino asitler sekansII benzerligi, iki sekans kendi
aralaria maksimum uyum elde edilecek sekilde hizalandiglü zaman, konservatif
ikamelerden farklEblan ya da bunlar ile özdes olan amino asitlerin kallEtEyüzdesine göre
degerlendirilmektedir. Sadece özdes kallfitllâr hesaba kat-@Elle özdes kaIIEtllârI yüzdesi
belirlendigi zaman, referans sekans. göre amino asitlerin söz konusu sekanslîlile
benzerlikten bahsedilmektedir. Mevcut bulus kapsamlda, bir proteinin amino asit
sekansEUa konservatif ikamesi ile, proteinin biyolojik aktivitesi üzerinde zararIElbir etkiye
sahip olmayan, benzer kimyasal veya fiziksel (boy, yük veya polarite) özellikler sergileyen
dogal ya da sentetik bir baska amino asit ile bir amino asidin ikame edilmesi
anlasllüiaktadlü Bir proteinin iki amino asit sekansübir amino asit ikamesi, söz konusu
proteinin biyolojik aktivitesi üzerinde zararlEtatkiye sahip olmayan pozisyonlarda düsük
saylüh (5'in altIa) bir amino asit veya bir amino asidin delesyonu ve/veya katllîhaslîile
kendi aralarIa farklüildugu zaman benzerdir. Benzerlik veya özdeslik yüzdeleri, örnegin
BLAST yazHJIîIlIa oldugu gibi sekanslarI mantllZSal bir karsllâstlüllîhasllîlkullanarak
teknikte uzman kisiler taraflEdan hesaplanabilmektedir (Altschul ve ark., NAR, 1997, 25,
3389-3402). BLAST programlarÇlSEKANS KIMLIK NO: 1 amino asit sekansII kallEtEBBO
ila 535'ten olusan bir karsllâstlîilna penceresinde, varsayllân parametreleri kullanarak
uygulanmaktadlE
Aksi belirtilmedigi takdirde "HB-EGF” terimi hem membran prekürsörü (pro-HB-EGF) hem
de HB-EGF'nin salgllânmßilformunu belirtmektedir.
HB-EGF'nin Iigant inhibitörünün aktivitesi, pro-HB-EGF ve HB-EGF'ye baglanma
kapasitesine ve asaglflhki sekilde ölçülebilir biyolojik farklEbIgularI ihibisyonuna atlflia
bulunmaktadlEl
- insan hücreleri veya Véro hücreleri gibi maymun hücreleri üzerinde difteri toksininin toksik
etkisinin inhibisyonu,
- EGFR'nin ErbBl ve/veya ErbB4 alt türlerini eksprese eden ve çogalmasEI-lB-EGF'den
bagIislZl olan, EGFR geni ile transfekte olan bir dizi Ba/F3 mürin Ienfoidler hücreleri gibi
hücreler üzerinde HB-EGF'nin proliferant aktivitesinin inhibisyonu.
Bulusa göre rekombinant protein, asagülaki sekanslardan birisinin N- veya C-terminali
ucundan yoksun olan, izole bir DTR alanIÜçermektedir: (1) difteri toksininin C alanlZl/e T
alanII sekans ve (2) 5. aureus (ZZ alanljlnlül A proteninden çlEhn immünoglobülinlerin
baglantElalanlElI sekansEgibi, dönüstürülmüs bakterilerden DTR alanII saflastlîllmasEl/e
ekstraksiyonunu iyilestirebilen veya Glutatyon-S-Transferaz (GST) sekanslîgibi, DTR alanII
stabilitesini iyilestirebilen bir füzyon partnerinin sekansEI
Bulusa göre rekombinant protein genel olarak SEKANS KIMLIK NO: 1 sekanlellEl kallEtllârü
alanIljlçermektedir. Bununla birlikte aynüamanda, C-terminal ucunun SEKANS KIMLIK NO:
daha kisa olan bir izole DTR alanülçerebilmektedir. DTR'nin N-terminal sekansEIB81 veya 382
konumunda oldugu zaman bulusa göre rekombinant protein kallEtEl L390 ikamesini
içermektedir. DTR'nin N-terminal sekanslZl383, 384 veya 385 konumunda oldugu zaman
bulusa göre rekombinant protein kallEtlJL390 ikamesini içermektedir.
Bulusa göre rekombinant protein istege baglüilarak DTR alanII N- ve/veya C-terminalinin
takviye sekanslarIlZlve/veya N-ter ucunda bir metiyonin (M) içermektedir. Nitekim söz
konusu rekombinant proteinin prekürsörü, olgun rekombinant protein bulunmayacak sekilde,
post-ötelenme modifikasyonlarEile kEllâbilen bir N-terminal metiyonini içermektedir.
Terapötik uygulamalar için, bulusa göre protein ardlglKl olarak asaglkilerden olusmaktadB
(1) 1 ila 10 amino asit, tercihen 1 ila 5 amino asit, tercih edilen sekilde 1 veya 2 amino asit
sekansÇlprekürsör sekansü/e istege baglßlarak, örnegin bir sekans (MG) gibi bir metiyonin
(M) ile baslayan olgun protein ve (2) yukarlIIEi belirtildigi üzere mutasyona ugramlgl bir DTR
alanDBu tür bir terapötik protein yaklaslE olarak 145 ila 200 amino asit, tercihen yaklasllZl
olarak 145 ila 175 amino asit, tercih edilen sekilde yaklasik] olarak 160 amino asit civarIa
bir boya sahiptir.
Teshis uygulamalarEliçin, bulusa göre protein özellikle uygun bir sinyalin ölçülmesiyle
saptanabilen bir peptit izleyicisi tarafIan isaretlenmektedir. Peptit izleyici özellikle bir
antikor, bir floresan protein veya en az bir Teknetyum 99 atomuna bagIEblan bir peptit
tarafian tan-n bir etikettir. Isaretleyici proteinin N-ter veya C-teridir; yani' sÜsMa DTR
alanII N-ter veya C-ter ucunda bir peptit aralaylîlgîlaraclIJgllîla veya dogrudan füzyona
ugramaktadlE Bu tür bir protein yaklasllg olarak 145 ila 500 amino asit, tercihen yaklasim
civarIa bir boya sahiptir.
Bulus, bir veya daha fazla amino asit kallEtlîliÇlkallEtilârD] peptid baglJ/eya rekombinant
proteinin uçlarIa herhangi bir modifikasyonun eklenmesiyle, modifiye edilmis rekombinant
proteinleri kapsar; HB-EGF ve pro-HB-EGF'ye göre iyi bir afinite ve bir inhibitör aktivitesini
muhafaza etmektedir. Teknikte uzman kisiler tarafIan bilinen klasik yöntemler ile
proteinlere katliân bu modifikasyonlar klîlfllaylEEblmayacak sekilde sunlarElçermektedir: bir
amino asidin bir sentetik amino asit ile ikame edilmesi (D amino asidi veya amino asit
analogu); özellikle yanal zincir R olmak üzere, bir reaktif fonksiyon düzeyinde kimyasal
grubun eklenmesi (lipid, oligo veya polisakkarit); özellikle retro- retro inverso (-NH-CO-
)türünde bir baglantEl/eya peptit baglant-an farklEbir baglantüle peptit baglant-I (-
CO-NH-) modifikasyonu; siklizasyon; ilgili bir proteine ya da bir peptitte füzyon (genetik
mühendislik ile) veya özellikle bir sinyalin ölçülmesi ile saptanabilir isaretleyici veya isaretleme
maddesi gibi ilgili bir moleküle baglanma (kimyasal baglantm
Söz konusu protein en azIan Y380K ve L390T ikamelerini içermektedir. Örnegin söz konusu
protein asagülaki ikamelerin kombinasyonlarIan birisni içermektedir: Y380K ve L390T;
Tercihen SEKANS KIMLIK NO: 2 ila 5 sekanslarlEdan birisini içeren veya bundan olusan bir
protein söz konusudur.
Daha tercih edilen sekilde söz konusu protein Y380K, Q387E ve L390T ikamelerini
içermektedir. Örnegin söz konusu protein SEKANS KIMLIK NO: 3 ila 5 sekanslarlian birisini,
tercihen SEKANS KIMLIK NO: 3 sekansIEîçermektedir veya bundan olusmaktadlE
Söz konusu proteinin avantajlübir baska yapHândlElna biçimine göre A395T ikamesini
içermektedir. Ikamenin eklenmesi, çözünebilir protein veriminde ekstra bir artElüretmektedir.
Tercihen söz konusu protein SEKANS KIMLIK NO: 7 sekansIIZlçermektedir; DTR1 olarak
proteinin HB-EGF'ye baglanmasII afinitesi, CRM197'ninki ile klýaslanan bir faktör (60) ve
sarkozil deterjan. %0,5 oranlEtla çözünebilen DTRWI proteininki ile külaslanan bir faktör
(130) oranIa artmaktadE
Söz konusu proteinin bir baska avantajlEl/apllândüna biçimine göre, aynlîtamanda F389Y
ve/veya G510A ikamelerinden en az birini içermektedir. Bu ikamelerden birinin eklenmesi
DTR proteininin HB-EGF-baglanma afinitesini arttlElnaktadlE AyrlEla iki ikamenin
kombinasyonu, tek bir ikame ile elde edilen artlgla klýbsla, HB-EGF-baglanma afinitesinde ek
bir artE üretimektedir. Tercihen söz konusu protein SEKANS KIMLIK NO: 8 sekansIEl
G510A ikamelerini içermektedir veya bunlardan olusmaktadlEl DTR3 proteinin HB-EGF için
afinitesi, DTR1 ile karsllâst-Iigla 5 faktör ve CRM197'ninkiyle karsilâst"[gla 300
faktörü ile artmlgtlü
Söz konusu proteinin avantajllIbir baska yapilândülna biçimine göre, ayrEla asaglîlhkilerden
olusan grup içinden seçilmis olan en az bir ikame içermektedir: N399K, V452T, T517E,
ikamelerden en az 3, tercihen en az 5'ini içermektedir.
içermektedir. Bu mutasyonlar DTRWT içinde tanIilanan 26 T CD4 epitopundan 10 tanesinin
bastßlînas- olanak saglamlgtlü Bu 10 epitop arasIa DTRWT'nin immünodominant
epitoplarüolarak bahsedilen 9 epitoptan 7'si bulunmaktadlEl Elde edilen proteinin, CD4
türünde, baska bir ifadeyle antikor üreticisi türünde bir immüniter yanlüindükleme kapasitesi,
DTRWT'ninkine göre önemli ölçüde azalmE olarak bulunmaktadlE Dikkate deger ve
beklenmedik bir sekilde, DTR'nin immünojenisitesini azaltmaylîlamaçlayan altlîmutasyonun
eklenmesi, HB-EGF için afinitesinin artmaleb katk- bulunmustur.
Tercih edilen sekilde söz konusu protein SEKANS KIMLIK NO: 9 sekanslüçermektedir; DTR8
17458 Da oranIa bir moleküler aglEIl[gb sahiptir.
DTR8 proteinin HB-EGF için aHnitesi, DTR3 ile karsüâst-[glia 3 faktör ve CRM197'ninkiyle
karsllâst-Ilgla 1400 faktörü ile artmlgtlE Ek olarak, DTR8 salgHânan HB-EGF'ye baglanma
ve HB-EGF/ EGFR yolunu inhibe etme aç-an CRM197'den en az 300 kat daha etkilidir.
DTR8 proteinin antijenitesi, CRM197'ninkiyle karslßst-[glia büyük ölçüde azaltlEnlSIlE
Gerçekten de, DT'ye karsßsllânmlglyetiskinlerde bulunan antikorlar. çogu (zorunlu asüâma)
DT'nin katalitik alan. yöneliktir. SasIEElve beklenmedik bir sekilde, DTR8 proteininin
antijenitesi DTR1 ve dolaylglýla DTRWT'ninkiyle karsllâst-[glia azalmaktadlEl
Bulusa göre protein, ilave olarak, DTR alanII yüzeyinde yer alan ve özellikle antijenisitesini
daha da azaltmak için ilave kallEtliâr içerebilmektedir.
Söz konusu proteinin avantajlllir baska yapUândlElna biçimine göre, SEKANS KIMLIK NO: 1
Söz konusu proteinin avantajlEbir baska yapilândlElna biçimine göre saptanabilir bir izleyici
tarafIan isaretlenmektedir. Proteinlerin etiketlenmesi için araçlar ve teknikler, teknikte
uzman kisilerce iyi bilinmektedir ve dogrudan veya dolaylElolarak gerçeklestirilebilen
radyoaktif, manyetik veya floresan etiketleme içerimektedir. Dogrudan isaretleme maddeleri
özellikle trityum (3H), iyot (1251) ve teknetyum (ggmTc) gibi radyoaktif izotoplar veya klgBbyIEEI
olmayacak sekilde AIexaFlu0r®, FITC ve Cyanine 3 gibi floroforlar gibi @Bayan bilesikler
(radyo lglElayanlar, kemo ElElayanlar, biyo ISIEIayanlar, floresan veya fosforesanlar) ve GFP
ve bunun türevleri gibi floresan proteinlerdir. Dolaylüsaretleme maddeleri özellikle spesifik
antikorlar tarafIan tanlElan epitopik etiketler ve enzimler içermektedir. Isaretleme özellikle
asag-kiler ile gerçeklestirilmektedir: (1) bir lizin kaIlEt-I reaksiyonel bir amini gibi bir
reaksiyonel grup üzerine bir floroforun asllânmaslZIQ) rekombinant üretim veya kimyasal
sentez ile reaksiyon bir grubun (serbest sistein) katliIhasÇl daha sonra bu grubun bir
floroforun asllânmasEliçin kullanllîhasÇlO) kimyasal sentez ile N veya C-terminalde bir
floroforun dogrudan katilüiasü(4) bir füzyon proteininin üretilmesi ile bir enzim veya bir
floresan proteinin dogrudan katÜBiasElIsaretlenen bu tür proteinler özellikle HB-EGF-EGFR
yolunun aktivasyonuna bagIEhastaliElarI in vitro veya in vivo (görünüleme ile) teshisi için
reaktif olarak ve bu aktivasyon yolunun çallginaslîliçin alet olarak kullanüfnaktadlîl DTR
proteini, teknetyum (99mTc) veya bir floresan izleyicinin kovalent bagüile dogrudan
isaretlenebilmektedir; floresan izleyiciler özellikle DTR proteininin lizin kallEtllârHan birisine
üzerine baglanmaktad [El
Mevcut bulusun rekombinant proteini, bir ekspresyon vektörünün, seçilmis konakta
ekspresyonuna olanak saglayan regülatör elementlere fonksiyonel olarak baglanmlglolan söz
konusu proteini kodlayan bir polinükleotid Içerdigi bir yöntem ile üretilebilmektedir, söz
konusu proteinin ekspresyonuna olanak saglayan kosullarda kültürlenen bir konak hücresine
aktarllB1aktadEI Üretilen protein daha sonra geri kazanllßîakta ve saflastlEIBnaktadlE
Kullanllân saflastlîilna yöntemleri teknikte uzman kisiler taraflEUan bilinmektedir. Elde edilen
rekombinant protein, fraksiyonlara ayrlliia, kromatografi yöntemleri, mono- veya poliklonal
spesifik antikor yardIilýla immüno-afinite teknikleri gibi, ayrEblarak veya birlikte kullanllân
yöntemler ile kültür ortamüküpernatanldan hücrelerden alin ekstraktlardan ve lizatlardan
saflastlEllâbiImektedir. Elde edilen rekombinant protein çözülebilmektedir.
Mevcut bulus aynElzamanda söz konusu rekombinant protein için kodlayan izole bir
polinükleotidi hedeflemektedir. Söz konusu polinükleotid avantajlüolmaslîlaç-an bulus
proteininin üretildigi konak hücreye ekspresyonu için optimize edilmis kodlaylEEbir sekans
içermektedir. Tercihen söz konusu nükleotid, Eco//ye ekspresyonu için optimize edilmis olan
SEKANS KIMLIK NO: 10, 12 veya 14 sekansIlZiçermektedir ve süslîla DTR1, DTR3 ve DTR8
rekombinant proteinini kodlamaktadlEl Bulusun polinükleotidi, teknikte uzman kisiler
tarafli-ndan bilinen moleküler biyoloji veya kimyasal senteze iliskin klasik yöntemler ile
hazlHlanmlgolan bir DNA veya bir RNA'dE
Mevcut bulus aynlîtamanda söz konusu polinükleotidi içeren ekspresyon ve/veya klonlama
rekombinant vektörünü amaçlamaktadIE Tercihen söz konusu vektör, söz konusu proteinin
üretilmesi için kullanllân konak hücreye bulusun proteininin ekspresyonuna olanak saglayan
regülatör sekanslara fonksiyonel olarak baglanmlgl olan söz konusu polinükleotidi içeren bir
ekspresyon vektörüdür (promotör, aktivatör, baslatma kodonu (ATG), durdurma kodonu,
trankripsiyon bitirme sinyali). Replikatif veya integratif vektör, özellikle viral bir vektör veya
plazmid, teknikte uzman kisiler tarafIan bilinen yaygIyöntemlere göre hazlîlbnmaktadlü
Mevcut bulus aynElzamanda yukar- belirtildigi üzere rekombinant bir vektör tarafIan
stabil veya geçici bir sekilde modifiye edilen bir konak hücreyi hedeflemektedir. Bu hücreler,
elektroporasyon gibi teknikte uzman kisiler tarafIan bilinen standart yöntemler ile yukarlZIb
açlEland[g]Eüzere bir rekombinant vektörün prokaryot veya ökaryot bir konak hücresi içine
girisi ile elde edilebilmektedir. Konak hücrelerin örnekleri arasIa özellikle memeli hücreleri,
böcek hücreleri, E. coli ve mayalar gibi bakteriler bulunmaktadlEl
Mevcut bulusun amacüyrlîla, yukari tanIiland[giEgibi en az bir rekombinant protein veya
bir rekombinant ekspresyon vektörü ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir vehikül içeren
farmasötik bir bilesimdir.
Farmasötik kompozisyon, yukarlöia tanilandEgiEgibi HB-EGF/EGFR yolunun aktivasyonuna
iliskin hastalilZIar üzerinde bir terapötik etki elde etmek için etkili bir protein veya vektör
dozunu içermektedir. Genel bir sekilde, yaklasElZl olarak 0,1 mg ila 100 mg, tercihen 10 mg ila
mg arasIa degisen terapötik olarak etkili bir miktar yetiskin insanlara
uygulanabilmektedir. Farmasötik olarak kabul edilebilir vehiküller klasik olarak kullanilânlardE
Bilesim, seçilen bir uygulamaya uygun galenik bir formdadlîl standart protokollere göre
hazlîllanan enjekte edilebilir steril çözelti, toz, tabletler, jel kapsülleri, süspansiyon, surup
veya fitiller. Uygulama subkütan, intramüsküler, intravenöz, intradermal, intraperitonal, oral,
dil altürektal, vajinal, intranazal, inhalasyon veya transdermal uygulama ile olabilmektedir.
Bulusa göre olan farmasötik bilesimlerin uygulama sekilleri, dozaj rejimleri ve galenik
formlarl,`_l teknikte uzman kisilerce allgilEnEI sekilde, özellikle de genel olarak uygun bir
terapötik tedaviyi olusturmak için göz önünde bulundurulan kriterlere göre
belirlenebilmektedir; bu kriterler bir hasta için (genellikle bir insan birey ve istege bagllîrblarak
insan olmayan bir memeli), örnegin; yas, vücut aglEIligllJhastanlEl genel durumunun ciddiyeti,
tedavinin toleransüle gözlenen yan etkiler olabilmektedir.
Mevcut bulusun amacü aynElzamanda, bir ilaç olarak yukarIEIh tanIiIandgügibi bir
rekombinant proteindir.
Mevcut bulus ayrlîla, HB-EGF/EGFR yolunun aktivasyonuna iliskin hastalllZlarI tedavisinde
kullanIi için yukarElEi tanIilandlgilîgibi bir rekombinant protein ile ilgilidir.
Mevcut bulus aynElzamanda, HB-EGF/EGFR yolunun aktivasyonuna iliskin hastalilZIarI
tedavisi için amaçlanan bir ilaci hazlEllanmasülçin yukari tanllandigiügibi bir rekombinant
proteinin kullan [iBiaslâmaçlamaktadlB
Mevcut bulusun amaclZl aynEl zamanda, HB-EGF/EGFR yolunun aktivasyonuna iliskin
hastalllZlarI tedavisi için, yukar- tanIilandiglEIgibi bir farmasötik bilesimin bir bireye
uygulanmasIEilseren bir yöntemdir. Uygulama, uygun bir moda ve yukari tanllandigllîgibi
uygun bir hlîla göre gerçeklestirilmektedir.
Tercihen söz konusu hastalllZIar sunlardan olusan grup içinden seçilmektedir: kresentik
glomerülonefrit (GNRP), kanserler, özellikle yumurta kanseri, endometriyal kanser, meme
kanseri, rahim kanseri (uterin adenokarsinoma), mesane kanseri, cilt kanseri (malin
melanom), beyin kanseri (glioblasyom) ve akciger kanseri, serebral kontüzyonlar ile iliskili
vazospazm, kardiyak hipertrofi, düz kas hücresi hiperplazisi, pulmoner hipertansiyon,
diyabetik retinopatiler ve arteriyel restenoz.
Mevcut bulusun amacÇl HB-EGF/EGFR yolunun aktivasyonuna iliskin bir hastallgl in vitro
veya in vivo tan @Için yukarlElh tan land[g]l]g]ibi etiketli bir proteinin kullanlliiasIlE
Bulus aynüamanda, HB-EGF/EGFR yolunun aktivasyonuna iliskin bir hastaligi in vitro teshisi
için bir yöntem ile ilgilidir; bu yöntem, bir biyolojik numunenin, yukari tanIilandlgllgibi bir
etiketlenmis protein ile temasa sokulmaslül'e söz konusu etiketli protein ve HB-EGF ve/veya
pro-HB-EGF araletla spesifik bir kompleks ve söz konusu etiketli protein/HB-EGF
komplekslerinin uygun herhangi bir yolla tespit edilmesini saglayan kosullar altIa, bir
biyolojik numunenin temasa geçirilmesini içermektedir.
Biyolojik numune özellikle serum veya ürinden bir biyopsi numunesidir (böbrek, tümör, düz
kas, kalp, akciger, damarlar, retina).
Mevcut bulusun amacüaynüamanda, HB-EGF'nin in vitro veya in vivo tespiti için yukar-
tanIilandlglügibi etiketlenmis bir proteinin kullanllîhasIlEl
Mevcut bulusun amacüaynüamanda, en azIan asag lâlaki asamalarEilçeren, HB-EGF'nin in
vitro ve in vivo olarak saptanmaslîçin bir yöntemdir:
- analiz edilecek hücrelerin, yukari belirtildigi üzere etiketli bir protein ile temasa
geçirilmesi, ve
- etiketli hücrelerin ve/veya hücre dlSßrtamI uygun herhangi bir yolla tespit edilmesi.
Bu yöntem, fizyolojik veya patolojik kosullar alt-a veya bir endojen veya ekzojen
uyaranlara tepki olarak HB-EGF'nin doku ekspresyon profilini belirlemeyi mümkün
küBiaktadE Bir memelinin gövdesinde (hücre görüntüleme), özellikle gerçek zamanda HB-
EGF'nin in vivo saptanmasÇl söz konusu proteinin söz konusu memeliye (parenteral
enjeksiyon, oral uygulama) uygulanmasII önceki bir asamasIEiçermektedir. Insanlarda
HB-EGF'nin in vivo tespiti, HB-EGF/EGFR yolunun aktivasyonu ile Iliskili bir hastallgiI
teshisinde kullanüâbilmektedir.
Hücrelerin ve HB-EGF ihtiva eden hücre dlgüartaml etiketlenmesi, özellikle teknikte uzman
kisilerce bilinen herhangi bir teknikle (floresan mikroskobu, akElsitometrisi, gamagrafi,
manyetik rezonans görüntüleme) saptanabilen floresan veya radyoaktif etiketleme veya
manyetik etiketlemedir.
Bulusun amacEhyrlEla, yukarElla açlKlandlgEüzere, daha önce belirtilen gibi etiketlenmis bir
protein içeren teshis veya saptama yöntemlerini gerçeklestirmek için bir kittir.
YukarIki düzenlemelere ek olarak, bulus ayrlEla ekli sekillerden hareketle, mevcut bulusun
amaclElI uygulanmasi iliskin örneklere atllîla bulunan asagülaki açllîlamadan ortaya çikan
baska düzenlemeler de içermektedir:
- sekil 1, DTRWT'den daha çözünebilir olan bir DTR proteininin üretilmesi için R1
kütüphanesinin taranmaslýla seçilen 5 klonun çözünebilir ve çözünemez fraksiyonlarII
mutasyonlarEQA) ve analizini (B) göstermektedir. KlonlarI tümü çözünebilmektedir; en iyi
klon klon 1D6'dlü
- sekil 2, klon 1D6 (burada G1 ile belirtilmistir) tarafIan üretilen DTR proteininin
çözünebilirligi üzerinde A395T ve N399D mutasyonlarII etkisini göstermektedir. En iyi
klon A395T mutasyonunu içermektedir.
- sekil 3, sunlarlîgöstermektedir: (A) artan DTR1 dozlarEile Vero hücreleri üzerinde difteri
toksininin artan dozlarII toksik etkisinin inhibisyonu ve (B) log (EC50 - 1) = Kd log (5)'ye
göre HB-EGF için DTR 1'in Kd'sinin degerlendirilmesine olanak saglayan Schild
regresyonu; burada EC50 %50 oranIa toksisite veren difteri toksininin konsantrasyonu
ve B ise DTR1 inhibitörü konsantrasyonudur.
baslEla Vero hücreleri üzerinde 10'11 M konsantrasyonlarlEUa difteri toksininin toksik
etkisinin inhibisyonunu göstermektedir.
- sekil 5, sunlarlîgöstermektedir: (A) artan DTR8 dozlarEile Vero hücreleri üzerinde difteri
toksininin artan dozlarII toksik etkisinin Inhibisyonu ve (B) log (EC50 - 1) = Kd log (BD'ye
göre HB-EGF için DTR8'in Kd'sinin degerlendirilmesine olanak saglayan Schild regresyonu;
burada EC50 %50 oranIa toksisite veren difteri toksininin konsantrasyonu ve B ise DTR8
inhibitörü konsantrasyonudur.
- sekil 6, artan dozlarda HB-EGF'nin, EGFR'yi eksprese eden ve HB-EGF'ye bagIlEblan,
DTR8 (A) ve CRM dozlarIlîâarttEirak büyümekte olan Ba/F3 hücreleri üzerindeki
proliferatif etkisinin inhibisyonunu göstermektedir.
- Sekil 7, 20 saglIEUonörün serumunda bulunan antikorlar taraflEUan CRM197, difteri
toksinin C alanIZl(C) ve T alanEl(T), DTR1 ve DTR8 proteinlerinin tanlElnasIEl
göstermektedir. Titre, arka plan gürültüsünün çlElarllBiasIan sonra ELISA testinde 5000
rastgele birimin bir floresan sinyali veren serum seyreltmesi ile belirlenmektedir. s 20
degerinde olan bir titre, arka plan gürültüsüne ve dolaylîlîla ölçülebilir antikor
baglanmasII yokluguna karslllKl gelmektedir. 30 degerinde olan bir titre ise ortalama
veya kuwetli yanthrdan düsük antikor yanltIbrII ayrIJB'iasEiçin rastgele bir sekilde
sabitlenmistir.
Örnek 1: Malzemeler ve Yöntemler
1) Genetik sekanslar. klonlanmas ; !DTRM proteininin ve bunun mutantlarII ekspresyonu
ve saflastlîllüiasü
Dogal toksinin Y380-5535 sekansIDkapsayan difteri toksininin DTR alanLElleodlayan genetik
dizi, bu çallglnanl baslanglglnoktaslîtllîlßütün genetik sekanslar, önceden belirlenmis protein
sekanslar. göre, GENEART sirketi tarafian E. coli'de ekspresyon için optimize edildikten
sonra sentezlendi. Bu sekanslar NCOI veSa/I kEflbma bölgelerinde pET28a (+) (NOVAGEN)
vektörüne klonlanmlgtlEl NCOI alanII mevcudiyeti, rekombinant proteinin N-terminal ucuna
karsHIIZl gelen dogal olmayan kodon M ve G'yi üretmektedir. SEKANS KIMLIK NO: 16 sekansü
dogal difteri toksininin kallEtllârD/380 ila SS35'i tkaip eden kallütllâr M ve G'den olusan 158
amino asidin vahsi DTR proteini (DTRWT) için optimize edilmis nükleotidik sekanstlEI DTR
proteininin mutant ve çözünür formlarIEkodlayan optimize edilmis nükleotid dizileri, Tablo
1'de belirtildigi gibi, mutasyona ugramlgl amino asidi kodlayan optimize edilmis bir kodon ile
mutasyona tabi tutulacak her bir kodonun degistirilmesiyle SEKANS KIMLIK NO: 16
sekanleUan türetilmektedir:
Tablo I: DTR mutasyonlarüçin seçilmis olan optimize edilmis kodonlarI listesi
Mutasyon Vahsi kodon Optimize edilmis
mutasyona ugramlSl
Y380K tac aaa
Y380E tac gaa
P382T ccg acg
Q387E cag gag
Q387K cag aag
P388T ccg acg
F389Y ttt tat
L390T ctg acc
L39ON ctg aac
H391K cat aaa
A395T gcg acc
N399D aac gat
N399K aac aaa
V401Q gtg cag
L427Q ctg cag
L427N ctg aac
L427S ctg agc
T436K acc aaa
T436H acc cat
V452T gtg acg
R460T cgt acc
A463T gcg acc
A463S gcg agc
A463E gcg gaa
A463D gcg gat
A463G gcg ggc
Y478T tat acc
V483D gtg gat
V483E gtg gaa
V483H gtg cat
V483Q gtg cag
A490G gcg ggc
H492E cat gaa
S494K agc aaa
S496K agc aaa
E497D gaa gat
G510A ggc gcg
G510M ggc atg
G510Q ggc Câý
GSIOS ggc agc
Q515E cag gaa
T517D acc gat
T517E acc gaa
T521R acc cgc
K522R aaa cgc
DTRWT proteinin ekspresyonu, 37°C'de 50 ug/mL kanamisin varl[g]lEUa Terrific Broth
ortamEUa Escher/th/a co/I' BL21(DE3) bakterisinde gerçeklestirilmektedir. Proteinin
indüksiyonu 1 mM izopropil ß-D-1-tiyogalaktopiranosit (IPTG)'I eklenmesi ile
gerçeklestirilmektedir. Bakteriler 5000 g'da 45 dakika santrifüjleme ile geri kazanüîhlgtlîlve
Cell Disrupter (CONSTANT SYSTEM) ve 20 mM sodyum fosfat, 500 mM NaCl, 0.25 mM
fenilmetilsülfonil florid (PMSF), Iizozim (0,25 mg/ml), pH 8 Içeren bir tamponda, bunlarI
içinden geçirilerek çözülmüstür. Proteini içeren inklüzyon cisimleri, 0.1 M Tris-HCI, pH 8 içinde
8 M üre içeren bir çözelti içerisinde çözündürülmüstür. Protein, 0,1 M Tris-HCI, pH 8'de 8 M
üre ve 0,1 M Tris-HCI, pH 8'de 8 M üre, 1 M NaCI arasina bir tampon gradyan. göre
HiTrapTM SP 5 mL (GE HEALTH CARE LIFE SCIENCES) kolonu üzerinde katyon degistirici
kromatografi ile saflastlElilBiaktadB daha sonra ilk olarak 20 mM Tris-HCI, 50 mM NaCl, 1mM
Cysteine/8mM Sistein, %0,5 Sarkosil, pH 8'de bir tampona karsiÇldaha sonra 20 mM Tris-HCI,
50 mM NaCl, %0,5 Sarkosil, pH 8 tamponuna karsEbImak üzere 2 asamada diyaliz ile
katlanmaktadE
DTR proteininin mutant ve çözünebilir formlarII ekspresyonu, 50 ug / ml kanamisin
mevcudiyetinde 2YT ortamiütla Escherichia coli BL21 (DE3) bakterisinde gerçeklestirilmistir.
37°C'de 2 saaat 20 dakikaliEJ kültürden sonra, proteinin indüksiyonu 1 mM IPTG'nin
eklenmesi ile gerçeklestirilmektedir: ArdIan 30°C'de 4 saat 30 dakika sonra bakteriler, 30
dakika boyunca 5000 g'de santrifüj ile geri kazanilîhlgtiîi ve Cell Disrupter'da (CONSTANT
PMSF, 2 mM MgCI2 tamponunda çözünmüstür. Lizis karlglüliüçinde çözünebilen protein, 20
mM sodyum fosfat pH 7,8 ve 20 mM sodyum fosfat, 1 M NaCI pH arasIa bir
gradyana göre HiTrapTM SP 5mL'Iik kolon üzerinde katyon degisim kromatografisi ile
saflastlîllfhigtiîi ve 20 mM sodyum fosfat, 500 mM NaCl, pH 7,8 tamponunda -20°C'de
depolanmlgtlü
2)Cözünebilen mutantlarIsecilim eleGi
Sentez ile üretilen ve pET28a (+) plazmidinde klonlanan üç DTR sekansElkütüphanesi, E. coli
susu BL21 (DE3) (GENEART) içine transfekte edildi. Her bir kütüphane için klonlar, bir
seçim antibiyotigi ve ekspresyon indükleyicinin (IPTG) varllglia kültür ortamlîiçinde 2 veya 4
adet 96 kuyucuklu plaka halinde alt kültürlenmistir. Çogalmadan sonra bakteriler LysonaseTM
(NOVAGEN) takviyesi ile bir BugbusterTM ( çözeltisi ile çözünmüstür.
4°C'de 2700g'lik 20 dk plakalar. santrifüjünden sonra, inklüzyon cisimlerinin varllgDpelet
boyu ile her bir kuyucuk için iyi bir sekilde degerlendirilmistir ve çözülebilir protein fraksiyonu,
denatüre edici kosullar altIa ve Coomassie mavi boyamaslîla bir poliakrilamid jel üzerinde
lizis süpernatantlarII analizi ile belirlenmistir.
3)Difteri toksininin toksisitesinin inhibisvonu ile DTR Droteinlerinin aktivite testi
Vero hücreleri (ATCC CCL-81 TM), 2 mM glutamin, %1 oranlîitla penisilin/streptomisin
çözeltisi, %1 oranlEUa esas olmayan amino asitler çözeltisi ve %10 oranlElzla fetal buzagEl
serumu ile katkllânmlglolan D-MEM ortam-a (Dulbecco ile modifiye edilen minimum gerekli
Eagle ortamm kuyucuk bas. 50.000 hücrede kamasan zemine sahip olan Cytostar-TTM
(PERKIN ELMER) 96 kuyucuklu plakalarda tohumlanmlgtü Degisken konsantrasyonlarda
difteri toksini (SIGMA) iki kopya halinde eklenmistir. Bu kosullar test edilen antagonistin
varllglülda tekrarlanmlstE DTRWT, mutant DTR veya CRM197 proteini (Sigma). %5 oranIa
COZ içeren atmosferde 37°C'de 22 saat inkübasyondan sonra kültür ortamül uCi/kuyucuk
14[C]-lösin (GE HEALTH CARE LIFE SCIENCES) içeren lösinsiz ortam ile degistirilmistir. %5
oranIa COZ içeren atmosferde 37°C'de 5 saat inkübasyondan sonra hücrelerdeki
radyoaktivite, bir MicroBeta® (WALLAC) aparatElçinde bir yaplgkan film ile kaplanmlgl olan
plakalarlEl yerlestirilmesiyle hesaplanmlgtlü
4)HB-EGF'nin proliferant aktivitesinin inhibisvonu ile DTR proteinlerinin aktivite testi
Test, EGFR geni ile laboratuarda transfekte edilen bir maymun Ienfoid hücre dizisini Ba/F3
HB-EGF veya amfiregülinden bagIislîdB Hücreler, 2 mM glutamin,%1 bir
penisilin/streptomisin çözeltisi, %1 oranIa esas olmayan amino asitler çözeltisi ve %10
oranIa Fetal buzagüserumu ile katküânmlgl olan RPMI (Roswell Park Memorial Institute)
tohumlanmlgIlEl Degisken HB-EGF ya da Amfiregülin konsantrasyonlarEliki kopya halinde
eklenmistir. Bu kosullar test edilen antagonistin varlEgiIa tekrarlandlîlmutant DTR veya
CRM197 proteini. %5 oranIa COz atmosferinde 37°C'de 24 saat inkübasyondan sonra,
kuyucuk basEl] pCi/gözenek 3[H]-timidin (GE HEALTH CARE LIFE SCIENCES) eklendi. %5
oranIa COZ atmosferinde 37°C'de 5 saat inkübe edildikten sonra, hücreler bir TOMTEC®
aparatElkullanilârak cam fiber filtre (filtre matüA, WALLAC) üzerinde aspire edilmistir.
Filtrelerin kurutulmasIan sonra, ikincisi sintilasyon slîlgîlvaruglia kapalübir torbaya
yerlestirildi ve hücrelere dahil edilen radyoaktivite bir MicroBeta® aparatIa (WALLAC)
) DTR proteinin T CD4 epitoplarII tanIilanmaslZl
DTR proteininin T CD4 epitoplarII tannlanmaslîlbeyaz fenotiplerde baskI olan HLA-DRBl
moleküllerine göre klglfllanan, DTR-spesifik T CD4 lenfosit çizgileri tarafIdan tan-n DTR
peptidlerinin analizi ile gerçeklestirilmistir. Kullanllân protokoller, asaglilhki modifikasyonlar
lenfosit sülarüdonörün T CD4 Ienfositlerinin, örtüsen DTR peptidlerin bir havuzu ile yüklü
otolog olgun dendritik hücrelerle birlikte kültürlenmesiyle üretilmektedir ve (2) üretilen
slBilarI spesifikligi, ya DTR için slßnl spesifikliginin dogrulanmasüçin T CD4' Ienfositleri
slBasII üretilmesi için kullanllân peptit havuzu ile ya da her bir sßnl spesifikliginin
belirlenmesi için peptit havuzu, yüklü otolog çevresel kan mononükleer hücreleri (PBMC)
kullanarak bir ELISPOT-IFN-y testi ile analiz edilmektedir.
a)PBMC'den T CD 4 /enfosiI/erin/'n izole adi/mesi
FarklEHLA-DRBI fenotipine ve yasa sahip olan yedi donör, bu donörlerin hepsi kafkasyallîl
fenotipinde halim olan 8 HLA-DRBl molekülünü eksprese edecek sekilde seçilmistir (HLA-
donörün T CD4 Ienfositleri, üretici tarafian tanllanan standart prosedür (MYLTENYI
BIOTECH) uyarlEta, bir anti-CD4 antikoruna baglanmlgl manyetik boncuklar kullanllârak bir
kolon üzerinde manyetik sßlama ile %98'den daha büyük bir safllElderecesi ile periferal kan
mononükleer hücrelerinden (PBMC'Ierden) izole edildi.
b )D TR spesifîk T CD4 /enfos/t sß/arßß Üreti'lmesi i/e karakten'zasyonu
Tüm DTR sekansIEkapsayan 15 amino asitin örtüsen 25 peptiti sentetize edilmistir (INTAVIS
BIOANALYTICAL INSTRUMENTS).
Tablo 11: DTR sekansIEkapsayan ötüsen peptitler (SEKANS KIMLIK NO: 18 ila 42)
Peptit Lokalizasyon Amino asit sekanslZl
1 378-392 M G Y 8 P G H K T 0 P F L H D
2 385-399 K T 0 P F L H D G Y A v 8 w N
3 391-405 H D G Y A v 8 w N T v E D s I
4 397-411 8 W N T v E D s i i R T G F 0
6 409-423 G F 0 G E 3 G H D I K i T A E
7 415-429 G H D I K i T A E N T P L P I
13 451-465 8 v N G R K i R M R C R A i D
14 457-471 i R M R (3 R A I D G D v T F c
453-477 A I D G D v T F C R P K 5 P v
469'433 T F C R P K 8 P v Y v G N G v
18 482496 G Y H A N L H v A F H R s s s
21 5°°'514 H 8 N E I 3 3 D s i G v L G Y
24 518-532 L G Y 0 K T v D H T K v N s K
521-535 v D H T K v N s K L 8 L F F E
Peptitler 3 havuzda toplanmlStB
- Havuz 1: peptitler 1 ila 8
- Havuz 2: peptitler 9 ila 16
HavuzlarI her biri, çallglna için seçilen donörlerden T CD4 Ienfositlerini tekrar tekrar bag Iislîl
olarak duyarlEIhale getirmek için in vitro olarak kullanlIIhaktadB Ortak kültürün minimum 30
kuyucugu peptit havuzu bas. gerçeklestirilmistir. Ilk olarak, T CD4 Ienfosit sßlarlîblarak
adlandlElân, uyarIi süsliha kullanllân peptit havuzunu tanlýlabilen sensitize T CD4
hücreleri, antijen sunan hücreler olarak peptit havuzu ile yüklenmis otolog PBMC'Ieri kullanan
bir ELISPOT-IFN-y testiyle seçilmektedir. Ikinci olarak, ilk analiz süsIa seçilen T CD4
sülarEtarafIan spesifik olarak tan-n peptit(ler), antijen sunan hücreler olarak havuzun
her bir peptidi ile ayrEbyrlZl/üklenmis otolog PBMC'Ieri kullanan bir ELISPOT-IFN-y testiyle
tanIiIanmaktadEI Antijen (izole edilmis peptit veya peptit havuzu) tarima spesifikligi
asaglülakilerle tannlanmaktadlîl (1) antijene (PBMC + peptidler) yanltîlolarak IFN-y üreten T
CD4 Ienfositlerin saylîElarasIa arka plan gürültüsü ile karsllâst-I[g]a 2'den büyük bir
oran yoktur (yani sadece PMBC olan antijenin yoklugu) (2) arkaplan gürültüsü çllZlarIlthan
sonra antijen varllgilda minimum saylEIla 30 nokta.
6) DTR proteinlerinin antiienisitesinin degerlendirilmesi
Her bir asamada inkübasyonlar asaglölaki üç kosullardan biri veya digerinde
gerçeklestirilmektedir: 37°C'de 1 saat veya 20°C'de 2 saat veya 4°C'de 16 saat. Test edilen
proteinler (CRM
96 kuyucuklu plakalar üzerinde absorbe edilmek üzere pH 7,4'de PBS tamponu içinde 1,7x10`
8 M konsantrasyonunda çözünmüstür. Kuyucuklar, PBS %3 oranlütla slgilEI serum albuminî
(BSA) (SIGMA) çözeltisi tarafIdan doymus hale getirilmektedir. %0,05 oranIa Tween 20
içeren bir PBS tamponu çözeltisi ile 4 yllîlamadan sonra, kan donörlerinin serumlarlÇEl/00,2
1/2000.nci seyrelmeden sonra kuyucuklar içinde kopyalanarak inkübe edilmektedir. %0,05
oranIa Tween 20 içeren bir PBS tamponu çözeltisi ile 4 yllZlamadan sonra, alkalin fosfataz
(SIGMA) ile birlestirilmis insan anti-IgG keçi antikoru, %0,2 oranlEtla BSA ve %0,05 Tween
içeren bir PBS çözeltisinde 1/200.ncü seyrelmeden sonra kuyucuklarda inkübe edilmistir.
dakika boyunca 9,8 pH degerinde 1 mM MgCIz, 50 mM karbonat tamponunda seyreltilmis
olan çözeltisi içinde inkübasyon ile
görsellestirilmistir. KuyucuklarI floresansEl(450 nm emisyon), bir 365 nm florimetrede
(WALLAC) uyarma ile ölçüldü.
Test edilmeden önce, serumlar bir gün boyunca 20°C'de beklemeye bEikIÜ/e 10.000 g'de
dakika santrifüj edildi ve daha sonra 4°C'de veya -20°C'de saklanmadan önce %0.003
Örnek 2: DTR proteinin çözünürlügünün iyilestirilmesi
E. coli'de ifade edilen DTRWT proteini, çözünmeyen inklüzyon cisimciklerinde birikmektedir.
Protein, bu konsantrasyonlarda terapötik kullanIila uyumsuz olan deterjanlar olan, sadece
sarkosil veya sodyum dodesil sülfat. °/c›0.5'i varllglia çözündürülebilir ve saflastülâbilir.
Diger çözündürücü moleküllerin kullanilüiaslîbasarßlîl olmustur (Tween-80, sükroz, arginin).
Proteinin çözündürülmesi için üre veya guanidin klorür gibi kaotropik maddelerin kullanllüiasü
ardIan çesitli katlama tamponlar. karsEldiyaliz yapllîhasü aynElzamanda çözünür bir
fonksiyonel proteinin elde edilmesini mümkün klliiamaktadlü DTR kesit alanII tam difteri
kallEtilârEile baslayan DTR formlarÇldeterjan yoklugunda bütünüyle çözünmezdi.
DTR proteininin çözünürlügünü arttlünak için kullanüân strateji, proteinin yüzeyinde mevcut
olan hidrofobik kallEtllârlIibolar veya yüklü hidrofilik kaIlEtUâr ile mutasyona sokmaktlîlBunun
nedeni, bir proteinin yüzeyindeki hidrofobik kallEtilârI düsük çözünürlük ve toplanma egilimi
Için potansiyel olarak sorumlu olmas_ TanlEllâcak mutasyonlar, moleküler modelleme
temelinde belirlenmistir. MutasyonlarI proteinin yaplglîlüzerindeki potansiyel etkisi Tablo
Tablo 111: Seçilen mutasyonlarI beklenen etkisi
Pozisyonlar Mutasyonlar Yaplâlal ve etkilesimsel slIbnI gözlemlenmesi
Y380 - N-ter döngüsünün sonunda esneklik, stabil hidrojen baglantlîlîyok
Y380K E532 ile iyonik baglantEl
P382 - Tip 11 bir dönüste
P382T
Q387 - N-ter döngüsünde, stabil hidrojen baglantlîlîýok
Q387E
Y380K ile iyonik baglantEl
P388 - N-ter dögüsünde, bir beta zincirinden hemen önce,
P388T P388T
L390 - Bir beta zincirinde
L390N Y394 iskeletinin CO grubu için hidrojen baglantüonörü
L390T desteklenen dallanmglbeta kalEtlEl]
A395 - Bir beta zincirinde
A395T desteklenen dallanmLîJbeta kalütlîü
N399 - Bir döngüde, stabil hidrojen baglantlîlgýok
N399D K419 ile iyonik baglantEl
N424 - Bir döngüde, stabil hidrojen baglantlîlîýok
N424D N481K ile iyonik baglantEl
N424E N481K ile iyonik baglanti]
P426 - Bir döngünün ucunda
P426T
L427 - Y394 ile Van der Waals temaslarübir beta zincirinde
iyonik baglanti]
iyonik baglantü
P428 - Bir siskinlikte
P428T
P476 - Bir siskinlikte
P476T
Y478D
Y478N
N481 - Bir döngüde, stabil hidrojen baglantlîlîýok
N481D N424K ile iyonik baglanti]
N481E N424K ile iyonik baglanti]
N481K N424K veya N242D ile iyonik baglantEl
V483 - Bir döngüde
V483T
DTR'nin üç DNA sekansükütüphanesi sentez ile gerçeklestirilmistir (Tablo IV). Her kütüphane,
moleküler modelleme verilerine göre seçilen 4 veya 5 kodon üzerinde mutasyona ugramg
sekanslar içermektedir. Her kütüphane, kodlama sekansII aynübölgesinde mutasyona
ugramElkodonlara karslHEl gelmektedir. Diziler, modelleme verilerine göre olaslîilnutasyonlarlîl
potansiyel olarak kabul edilebilir hidrofilik kallrîtllârla sIlHlamak için mutasyona ugrayacak
kodonlarI klîini dejenerasyonlarIEliçermektedir (pozisyon bas. 1, 2 veya 3 olasEI
mutasyon). Toleranleblarak varsayllân baglle-terminal pozisyonu gerilimli olabilen Y380
hariç olmak üzere, test edilen pozisyonun mutasyona karsEtoleranslEblmamasEdurumunda
(Tablo IV), vahsi kodonun muhafaza edilmesi olasiiig'ilîkorunmaktadlü
Tablo IV: R alanII (R1, R2, R3) çözünebilirliginin arttlîllînaslîliçin üretilmis olan mutant
sekanslarII üç kütüphanesinden her birisi için beklenen olasünutasyonlarl kombinasyonlarEl
Mutasyona ugramISl Mutasyona ugramlSl Olasilalltmir Kütüphane çesitliligi
bölge pozisyonlar
Y380 K/E
P382 P/T
R1 Q387 Q/E/ K 72
P388 P/T
L390 L/T/ N
N424 N/K/D/E
R2 P426 P/T
L427 L/ R/K 48
P428 P/T
P476 P/T
R3 Y478 Y/N/D 48
N481 N/K/D/E
V483 V/T
*Çesitlilik, kütüphanelerin her birisi için olasünutasyonlarl kombinasyonlari. saylîlEEbelirmektedir.
DNA kütüphanelerinin transfeksiyonundan sonra, her biri belirli bir mutasyon
kombinasyonuna karsHJKI gelen elde edilen bakteri kolonileri, DTR proteininin çözünebilir bir
mutant formunu üretme kapasiteleri bakIiIan analiz edildi. Bunun için, beklenen çesitliligin
klon, 96 kuyucuklu plakalarda alt kültürlere ayrIÇlprotein ekspresyonu indüksiyon kosullarEI
altia kültürlendi, santrifüjlendi ve sonra bir lizis çözeltisi içinde çözündü. Santrifüj
isleminden sonra, her klon tarafIan eksprese edilen proteinlerin çözünürlügü, kuyucugun
dibindeki olasElbir inklüzyon cismi topagüçin gözlem yoluyla ve denatüre edici kosullar altIda
ve Coomassie mavi boyamaslýla poliakrilamid jel elektroforezi ile süpernatanI analizi ile
degerlendirildi (Sekil 1).
Kolonilerin analizi, pelet yoklugunda (inklüzyon cisimlerine karsiüKl gelen pelet) veya
indirgenmis boyutta bir pelet ve ayri& liziz süpernatantlütla büyük miktarda protein bulunan
klonlarI seçilmesiyle sonuçlanmlgtlB Sadece R1 kütüphanesi, bes tane çözünür DTR üreten
bu klonlar sßslîda, SEKANS KIMLIK NO: 2 ila 6 proteinler için kodlaylîljliükletoid sekanslarIIZl
içermektedir. Tüm klonlar, örnek 1'de aç[lZlanan yönteme göre saflastlîilnadan sonra
çözünebilmektedir. AynElzamanda G1 olarak da adlandßlân 1D6 klonu, su mutasyonlarü
taslýlan 30°C'de ekspresyondan sonra çözünebilir formda büyük bir miktarda DTR'nin elde
edilmesine olanak saglamaktadlE Y380K/Q387E/L390T.
Modelleme yaklaslü R1 kütüphanesinde gösterilmeyen ek iki mutasyonun sunulmasIEl
saglamaktadlE'l A395T ve N399D. Bu iki mutasyonun her birisi, arttiEIBilSl bir çözünme
etkisinin arastlElüîasElçin 1D6 (veya G1) klonuna girmektedir ve bu A395T mutasyonu için
geçerli olan durumdur (Sekil 2).
Toplamda DTR1 (SEKANS KIMLIK NO: 7) olarak adlandlEIIân daha çözünebilir olan DTR
Bu, DTR mutasyonlarII digerinin E. ::ol/2'de çözünebilirligi ve üretimini iyilestirebilmesini
hariç tutmamaktadE
DTR1 proteininin HB-EGF baglaylEEI aktivitesi, difteri toksini ile Vero hücrelerinin
zehirlenmesini önleme kapasitesi ve dolaylîlîla toksinin pro-HB-EGF'ye baglanmasEyoluyla
degerlendirilmistir. Sonuçlar, DTR1'in, doza bagIiIlZIbir sekilde difteri toksini ile Vero
hücrelerinin zehirlenmesini engelledigini göstermektedir (Sekil 3). DTR1'in inhibe edici etkisi,
1D6 klonu ve %0.5 oranIa sarkosil içinde çözündürülmüs DTRWT'nin CRM197'si ile
karsllâstlîllîhlgtlü Schild regresyonunun üç etkilesim için tahmin ettigi Kd degerleri asagIki
degerleri vermektedir:
Tablo V: HB-EGF için afinite
protein Kd (pM)
DTRWT (+%0,5 sarkosil) ~ 6500
AparatI çipinde HB-EGF'nin hareketsiz hale getirildigi ve DTR1'in bir araya gelme ve ayrlglna
sabitlerinin ölçülmesi için enjekte edildigi Biacore deneyleri, CRM 197 için tahmin edilen Kd'nin
dogrulanmas- ve DTR1 Için daha yüksek bir Kd'nin gösterilmesine olanak saglamlgtlü
Bununla birlikte, ayrlslnanl yavasllglÇl Biacore'da DTR1'In ayrllîha sabitinin kesin bir
ölçümüne izin vermez. Çallginanl geri kalanIa, mutantlarI afinitesi sitotoksisite ve Schild
çocuk regresyonu ile tahmin edilmistir.
Örnek 3: DTR proteininin baglantülanll iyilestirilmesi
HB-EGF (Louie ve ark., Mol. Cell., 1997, 1, 67-78) ile etkilesimde dif'teri toksininin yapEJiki
protein arasIaki ara yüzün analiz edilmesini mümkün kiIIhaktadlEI Bu yaplîlal analiz, silico
moleküler modelleme deneyleri ile birlestiginde, proteinin HB-EGF için afinitesini arttlElnak
amacljîla DTR baglanma bölgesinde 10 mutasyonu seçmeyi mümkün kllüilgtlü Bu
mutasyonlarlEl, hidrojen baglarIlEl, tuz köprülerinin ve/ eya iki protein arasIiaki Van der
Waals temaslarII olusumunu tesvik ederek etkilesimin entalpisini arttlElnasÜmaçlanmlStlE
Seçilen mutasyonlarI proteinin yaplglîüzerindeki potansiyel etkisi Tablo VI'da gösterilmistir.
Tablo VI: DTR protetinin afinitesinin ve mutasyonlarI beklenen etkisinin arttIIIDnasEiçin seçilmis olan
kalItEliir üzerinde yapßhl slîhnl gözlemlenmesi
Pozisyonlar Mutasyonlar Potansiyel yaplýal ve etkilesimler sEhnI
gözlemlenmesi
F389 - Bir beta zincirinde, HB-EGF ile etkilesim bölgesinin kenarlölzia,
yapliândlîllîhlgl arazyüzün bir su molekülünün ve HB-EGF
F389Y Yapllândlîllüilglarayüzün bir su molekülü veya HB-EGF H139
için hidrojen baglantlîlîl
H391 - Bir beta zincirinde, HB-EGF ile etkilesim bölgesinin kenarIa,
HB-EGF E141 için hidrojen baglantlîlîllonörü
H391K HB-EGF E141 ile iyonik baglantEl
G510 - Bir beta zincirinde, HB-EGF ile etkilesim bölgesinin
merkezinde, DTR ve HB-EGF arasIa bir boslugun yania,
HB-EGF C132'nin iskeletinin CO grubunun kars-a
G510A Boslugun doldurulmaslîlve Van der Waals temaslarII
arttlîllîhasliilçin daha konservatif degisim
GSlOM Boslugun doldurulmasü ve Van der Waals temaslar-
arttlEllîîhaslîsnek hidrofobik yanal zincir
GSlOQ HB-EGF C132'nin iskeletinin CO grubu için hidrojen baglantEE
donörü ve/veya Hb-EGF C134'ün iskeletinin NH grubu için
hidrojen H baglantßâkseptörü
65105 Boslugun doldurulmasüie Van der Waals temaslarlElI
arttlîllöîasüçin polar yanal küçük zincir
T521 - Tip II'nin bir psödo omurgasIa, HB-EGF ile etkilesim
bölgesinin kenarIa
T521R HB-EGF K111 iskeletinin CO grubu ve/veya HB-EGF K113
iskeletinin CO grubu için hidrojen baglantlîlîlonörü
Bir beta zincirinde, HB-EGF ile etkilesim bölgesinin kenarlEtla,
HB-EGF L127 iskeletinin CO grubu için hidrojen baglantlîlî
donörü
Q515E
K522R, HB-EGF R128, HB-EGF R128 iskeletinin CO grubu, HB-
EGF L127 iskeletinin CO grubuna iliskin Iyonik ve hidrojenik bir
baglantßgia
Bir beta zincirinde, HB-EGF ile etkilesim bölgesinin kenarIa,
T517 hidrojen baglantlglîlonörü
K522R
Q515E, HB-EGF R128, HB-EGF R128 iskeletini CO grubu, HB-
EGF L127 iskeletinin CO grubu
Mutasyonlar, yönlendirilmis mutajenez ile DTR1 proteini içine girmektedir (Tablo VII).
Tablo VII: Deneysel olarak test edilen ve moleküler modelleme ile tanßilanan DTR'nin HB-EGF'ye
olan baglantlElII afinitesinin iyilestirilmesi için mutasyonlar
F389Y G510Q
H391K GSIOS
F389Y] H391K T521R
G510A Q515E/K522R
Proteinler E. coli'de eksprese edildi. Örnek 1'de tarif edilen sitotoksisite testine göre, difteri
toksininin pro-HB-EGF'ye baglanmasIEIhhibe etme kapasiteleri aç-an test edilmistir. Sekil
4A, her bir mutantI Vero hücreleri üzerindeki difteri toksininin toksisitesini inhibe etme
kapasitesini göstermektedir. Sonuçlar, sadece F389Y ve G510A mutantlarIlEl, difteri
toksininin toksisitesini önemli ölçüde inhibe ettigini göstermektedir. Bu iki mutasyonun
DTRl'e sokulmasERümülatif bir etkiye yol açmaktad lEl(Sekil 4B).
F389Y ve G510A mutasyonlarIEiiaslýlan DTR1 proteinine karsil]lîl gelen en aktif mutant, DTR3
(SEKANS KIMLIK NO: 8) olarak adlandlEilIhaktadB HB-EGF-baglanma afinitesi, Örnek 2'de
tarif edildigi gibi Vero hücreleri üzerindeki artan difteri toksini dozlarII toksik etkisini inhibe
etmek için artan DTR3 dozlarlrîllrî] kapasitesi ile degerlendirildi. Inhibisyon egrilerinin ECSO
degerlerinden Schild regresyonu ile tahmin edilen Kd, Tablo VIII'de verilmistir.
Tablo VIII: HB-EGF için
afinite
Protein Kd (pM)
Bu deger, DTR3'ün CRM197'den en az 300 kat ve DTRl'den 5 kat daha büyük olan HB-EGF
için bir afiniteye sahip oldugunu göstermektedir.
Örnek 4: BasllBa T CD4 epitoplarII bastlEBnasEl ile DTR proteinin
immünojenisitesinin azaltilînasü
Spesiûk T CD4 Ienfositlerini aktive etmek için tüm DTRWT sekansIEkapsayan 25 örtüsen
peptidin kapasitesi, farklEýas ve HLA-DRBl fenotipine sahip olan 7 sagllKlÜionörün kan-an
saflastlEllân dendtrik hücreler ve T CD4 lenfositlerinden in vitro olarak gerçeklestirilen
immünizasyon deneylerinde ELISPOT ile test edilmistir.
Sonuçlar, DTRWT proteinine karsEibaglgKllK] tepkisinin aglflillîlüolarak proteinin %60'IEI
kaplayan ve buna karsilllgdonörlerin en az %71'ini yaniflladigilîibes epitop bölgesine karsiÇlyani
incelenen 7 kisiden 5 donöre yönelik oldugunu göstermektedir (Tablo IX):
- spesifik T CD4 Ienfositlerinin yüksek bir genlik ile incelenen donörlerin tamamEIiçin
- spesifik T CD4 hücrelerinin genel olarak yukarlöh açilZIandlgiEüzere (20 ila 30 araslîitla
spesifik T CD4 lenfositleri, yani %8,5 ila 13) için daha az olan bir genlik ile donörlerin
- spesifik T CD4 hücrelerinin %8 oranIa genlik ile donörlerin %71'i için saptanmEoldugu
Ssoe-Hszo (peptit 22) bölgesi
Tablo IX: Peptit bazIda ve donör bachIa, DTR proteininin spesifik T CD4 lenfositleri sEhlai-II sonuçlarü
HLA-DRBI DR3 DR1 DR13 DR4 DR1 DR8 DR3 YanEEayIEfrekansEl
HLA-DRBI DR3 DR1 DR13 DR4 DR1 DR8 DR3 YanlIIay IEfrekansEl
*230 kEllEhlSJsEIar arasIa bir peptitin spesifik T CD4 lenfositlerinin toplam Sl& numarasEI
Belirlenmis olan 5 epitopik bölge oldugu için, HLA-II moleküllerine olan baglantII azaltllfhasü
amacüla bu epitoplarI mutasyonunun öngörülmesi mümkündür.
http://www.imtech.res.in/raqhava/propred/ProPred sunucusu
http:[[wwwimtech.res.inzraghavamrogredß, DTRWT'nin bu bes bölgesi içinde, popülasyonda
en yaygI olan 8 HLA sIltZlII allellerini baglayabilen sekanslarI tahmin edilmesi için
kullanllfhlgtß (Tablo X). DTRl'in mutasyona ugramlgl sekanslar- uygulanan aynElanaliz,
DTR'nin çözünürlügünü arttlElnak için uygulanan mutasyonlarlEl, proteinin immünojenisitesini
baglandiglEtahmin edilen epitopun kaybolmasEl/e DRBl_0401'in baglanmasElçin öngörülen
epitoplardan birinin esiginde bir artEJ yani HLA molekülü için öngörülen afinitesinde bir
azalma yasanmas-
DRBl_ baglayabilen sekanslarlöngörülmesi. Peptidik sekanslar SEKANS KIMLIK NO: 43 ila 109 sekanslar- karsÜJIZJgeImektedir. Tablonun Ikinci
sütunu incelenen bölgeyi vermektedir. Birinci sütun sIiEllI HLA molekülleri için öngörülen sekanslarl baglant-I inhibe edilmesi için önerilen mutasyonlarEllielirtmektedir. Asag-ki sütunlar,
göz önünde bulundurulan her bir HLA allel için bu HLA molekülünü baglayabilen sekansIvarlmeya yoklugunu belirtmektedir. Her bir sekans, baglant- yogunlunu yanslßn tek bir esik
degerinden önce gelmektedir: 1/2 (güçlü baglantlD 3/4 (ortalama baglantm 5/6 (zayübaglantm Yag kalEIllârÇigöz önünde bulundurulan HLA alIeII için sekanslarl baglant- yilZIJBiasEilgin
önerilen mutasyonlara karsiJJKlgeImektedir.
Varyant
Sekans
(378-403)
DR81_1101
MGYSPGHK-
TQPFLH-
DGYAVSWN
6: FLHDGYAVS
3: FLH DGYAVS
:YAVSWNTVE
MGKSPGHK-
TEPFI'H-
DGYTVSWN
SzFI'HDGYTVS
SIYTVSWNTVE
Varyant
Sekans
(391-411)
HDGYTVSW
NTVEDSI-
4A/SWNTVEDS
SzYTVSWNTVE
6:WNTVEDSII
N399K
H DGYTVSW
KTVEDSI-
:WKTVEDSII
6:VSWKTVEDS
V401Q
HDGYTVSW
NTQEDSI›
:YTVSWNTQE
N399K
V401Q
HDGYTVSW
KTQEDSI-
Varyant
Sekans
(427-441)
DRBi_O4Dl
DR81_0701
DR51_1301
DTRl LPIAGVLLP- - 6A/LLPTIPGK - 3:LLPTIPGKL 3 : LPIAGVLLP 4:LPIAGVLLP - 2:LLPTIPGKL
TIPGKL
(391-411)
TIPGKL
T436K KIPGKL
(451-465)
DTRl SVNGRKIR- - 32IRMRCRAID - - 3:1RMRCRAID 12VNGRKIRMR 4ZIRMRCRAID -
MRCRAID 1:IRMRCRAID
14570 SVNGRK- - - - - - - - -
DRMRCRAID
MRCRAID
V452T STNGRKIR- - 3:1RMRCRAID - - 3:1RMRCRAID 1:IRMRCRAID 4:IRMRCRAID -
MRCRAID
R460T SVNGRKIR- - 3:1RMTCRAID - - 3:1RMTCRAID 3:VNGRKIRMT 6:IRMTCRAID -
MTCRAID 3:IRMTCRAID
A463D SVNGRKIR- - 5:1RMRCRDID - - - 11VNGRKIRMR - -
V452T STNGRKIR- 5:1RMTCRDID
R4BÜT MTCRDID
A463D
Varyant
Sekans
(475-502)
HRSSSEKIH
3:YVGNGVHAN
3:FH RSSSEKI
4:VYVGNGVHA
1:YVGNGVHAN
1:FHRSSSEKI
1:FH RSSSEKI
2 : YVG NGVHAN
: LHVAFH RSS
1:LHVAFHRSS
4:YVGNGVHAN
Y478T
SPVTVGNG
HRSSSEKIH-
3:FH RSSSEKI
1:FHRSSSEKI
1:FH RSSSEKI
:LHVAFHRSS
1:LHVAFHRSS
V483D
VGNGDHAN-
HRSSSEKIH
3:FH RSSSEKI
1:FH RSSSEKI
:YVGNGDHAN
1:FH RSSSEKI
: LHVAFH RSS
1:LHVAFHRSS
V483E
VGNGEHAN-
H RSSSEKIH
3:FH RSSSEKI
1:FHRSSSEKI
1:FH RSSSEKI
: LHVAFH RSS
1:LHVAFHRSS
V483H
SPVYVGNG-
HRSSSEKIH
3:FH RSSSEKI
51WVGNGHHA
1:FHRSSSEKI
1:FH RSSSEKI
:WVGNGHHA
:LHVAFHRSS
1:LHVAFHRSS
6:VYVG NGHHA
V483Q
VGNGQHAN-
HRSSSEKIH
3:FH RSSSEKI
S:WVGNGQHA
62YVGNGQHAN
1:FHRSSSEKI
1:FH RSSSEKI
SzYVGNGQHAN
:LHVAFHRSS
1:LHVAFHRSS
Varyant
Sekans
(475-502)
A490G
HRSSSEKIH
3:YVGNGVHAN
3:FHRSSSEKI
4:VYVGNGVHA
1:YVGNGVHAN
1:FH RSSSEKI
6:VGFHRSSSE
lzFH RSSSEKI
2:YVGNGVHAN
4:YVGNGVHAN
S:LHVGFH RSS
H492E
VAFERSSSE
3:YVGNGVHAN
4:VYVGNGVHA
SZFERSSSEKI
1:YVGNGVHAN
22FERSSSEKI
1: FERSSSEKI
2:YVGNGVHAN
4:YVGNGVHAN
S:LHVAFERSS
S494K
HRKSSEKIH
3ZYVGNGVHAN
41WVGNGVHA
1:YVGNGVHAN
SzFH RKSSEKI
ZZFH RKSSEKI
2:YVGNGVHAN
S:LHVAFH RKS
1 :LHVAFHRKS
4:YVGNGVHAN
4:VAFHRKSSE
S496K
HRSSKEKIH
4ZVYVGNGVHA
4: FH RSSKEKI
1:YVGNGVHAN
1: FH RSSKEKI
2:YVGNGVHAN
S:LHVAFH RSS
S:FHRSSKEKI
1:LHVAFH RSS
4:YVGNGVHAN
Y478T
A490G
H492E
S494K
S496K
SPVTVGNG
VGFERK-
SKEKIHSN
Varyant
Sekans
(506-520)
LGYQ KTVDH
lzLGYQKTVDH
6:LGYQKTVDH
S: LGYQKTVDH
T517D
LGYQKD<
(506-520)
75175 sosiew
LGYQKEVD
SIllîlII HLA moleküllerinin baglanmasüçin söz konusu sekanslarI ankraj kallütllârII tahmin
edilmesi, potansiyel T epitoplarII bastlElIlInasEliçin tasarlanmlgl olan, Tablo X'de kalI
harflerle gösterilen bir dizi mutasyonun önerilmesine olanak saglamaktadlB Mutasyonlar,
proteinin potansiyel olarak destabilizasyonunu önlenecek sekilde seçilmistir ve bu moleküler
modelizasyon ile in silico olarak test edilmistir. HB-EGF'ye baglanma alanIEletkileyen tüm
mutasyon hariç tutulmustur. Önerilen mutasyonlarlEl proteinin yaplgîüzerindeki potansiyel
etkisi Tablo XI'de gösterilmistir.
Tablo XI: DTR protetinin T CD4 epitoplarII bastlIanaslZIve mutasyonlarl beklenen etkisinin
arttlEJInasEiçin seçilmis olan kalltmir üzerinde yaplgl slîhnl gözlemlenmesi
Pozisyonlar Mutasyonlar Potansiyel yaplElal ve etkilesimler slIhnI gözlemlenmesi
N399 - Solvente maruz blßkllîhlg bir döngüde, stabil hidrojen baglantlglj
N399K D417 ile iyonik baglantlîlve N486 iskeletinin CO grubu için
hidrojen baglantlîlîllonörü
V401 - Solvente maruz blEKiIIhlSl tip I omurgada
V401Q K385 için hidrojen baglantElkabul edicisl
L427 - Klglnen gömülü, bir beta zincirinde, Y394 ile Van der Waals
temaslarEl
L427Q D392 iskeleti CO grubu için hidrojen baglantlîlllonörü, Y394 ile
Van der Waals temaslarIERuran hidrokarbonlanmlglyanal zincir
T436 - Klêlnen gömülü, bir döngüde, G466 iskeleti Co grubu için hidrojen
baglantlîlîlonörü, V443 ile Van der Waals temaslarlîl
T436H T469 için hidrojen baglantlîlîkabul edicisi, V443 ila Van der Waals
temaslarlîl
T436K A463D ile iyonik baglanti]
ile Van der Waals temaslarü
grubu, K474 iskeletinin NH grubu
grubu, K747 iskeletinin NH grubu veya V452 iskeletinin NH
zincirin bir metil grubunun Van der Waals temaslarlîl
Waals temaslarü
A463 - Solvente maruz blâkllîhlgl bir beta zincirinde
A463D T436K ile iyonik baglantl]
R460 - Solvente maruz blEliklEhlSJ bir beta zincirinde, bir yamanI parçasEl
plazmik membrana baglEheparan sülfat gruplarEile potansiyel
olarak etkilesimde olan diger argininler içeren bazik, HB-EGF'ye
yaklEl, P473 iskeletinin C0 grubu için hidrojen baglantlsîlîrllonörü
ile Van der Waals temaslarlîl
V483 - Solvente maruz blBikilBwlSJ bir döngüde
V483D
V483E V452T, N453 için hidrojen baglantlîERabul edicisi
V483H Y478 iskeletinin CO grubu için hidrojen baglantEERabul edicisi
V483Q V452T için hidrojen baglantEEkabul edicisi veya donörü, Y478
iskeletinin CO grubu için hidrojen baglantlîllonörü
A490 - Klîmen gömülü, bir beta zincirinde
A490G
H492 - Solvente maruz blEikllBilSl bir beta zincirinde, 5494 için hidrojen
baglantlgERabul edicisi veya donörü
H492E S494K ile iyonik baglantlîl
5494 - Solvente maruz blîaküînlgl bir döngüde, H492 için hidrojen
baglantlâERabul edicisi
S494K H492E ile iyonik baglantEI
5496 - Solvente maruz büküüilgl bir döngüde
S496K Q411 için hidrojen baglantlîlîlonörü
T517 - Solvente maruz büküûilgj bir beta zincirinde, K522 için
hidrojen baglantlgllabul edicisi
T517D K522 ile iyonik baglantEl
T517E K522 ile iyonik baglantlîl
Tablo XII'de belirtilen mutasyonlar modelleme verilerine göre tek tek veya bazen
kombinasyon halinde DTR3 proteininin sekans. sokuldu, daha sonra ne rekombinant
proteinin üretimini ne de biyolojik aktivitesini degistirdiklerinde kademeli olarak birikti.
MutantlarI biyolojik aktivitesi, Vero hücreleri üzerindeki difteri toksininin toksisitesinin
Inhibisyonuyla test edildi.
Tablo XII: T CD4 epitoplarII bastlîlllnaslîiçin DTR3 içine dahil edilen mutasyonlar
V401Q A463E S494K
L427Q A463D S496K
V452T V483 D E497D
R460T V483Q T517E
N399K A463S H492E
A463T A490G
* KaII olan yerler, tutulmamSlolan protein aktivitesi ve ekspresyonu önemli ölçüde etkilemeyen mutasyonlardlü
Bu deneyler, su mutasyonlar. ardlgiE] olarak tutulmaleh olanak saglamlgtlE N399K, V452T,
biriktiren protein DTR8 (SEKANS KIMLIK NO: 9) olarak adlandlElIBiaktadlEj 17458 Da'lllZl bir
PM'e sahiptir. Bu mutasyonlar DTRWT içinde tanIiIanan 26 T CD4 epitopundan 10 tanesinin
bastlElllßîasI olanak saglamlStlEanblo XIII).
Tablo XIII: DTRWT ve DTR8 arasIda T CD4 epitoplarII HLA II'ye olan baglantII kuweti
ve sayisi.. karsühstlîlllnaslîl
DTR HLA II Baglanti] yogunlugunu TCD4 EpitoplarEl
Kuwetli 1 0 O 2 4 1 7
2 0 1 0 1 0 2
Ortalama 3 0 2 2 2 0 6
6 3 5 5 10 3 26
Toplam
Kuwetli Toplam
2 0 1 0 O 0 1
Ortalama 3 0 2 2 1 0 5
6 1 1 0 1 0 3
Toplam 2 5 4 4 0 16
Bu 10 epitop arasIa DTRWT'nin immünodominant epitoplarEblarak bahsedilen 9 epitoptan
7'si bulunmaktadlB Elde edilen protein DTR8'in, CD4 türünde, baska bir ifadeyle antikor
üreticisi türünde bir immüniter yanEindükleme kapasitesi, vahsi formunda DTRWT'ninkine
göre önemli ölçüde azalmlglolarak bulunmaktadlü
DTR8, DTR3'ten altüadet fazla mutasyon içermektedir. Herhangi bir mutasyon veya
mutasyon kombinasyonu bir proteinin fonksiyonunu bozabileceginden, bu ek mutasyonlarI
HB-EGF için DTR baglanma afinitesi üzerindeki etkisini degerlendirmek gerekmektedir. DTR8
proteininin HB-EGF baglaylîlîbktivitesi, difteri toksini ile Vero hücrelerinin zehirlenmesini
önleme kapasitesi ve dolayßýla toksinin pro-HB-EGF'ye baglanmasi: yoluyla
degerlendirilmistir. Sonuçlar (Sekil 5), DTR8'in, Doro hücrelerinin, doz bagIilEbir sekilde
difteri toksini ile zehirlenmesini engelledigini göstermektedir. DTR8'in önleyici etkisi, sarkosil,
DTR3 ve DTRl'in %O.5'inde çözünen CRM. Schild
regresyonunun dört etkilesim için tahmin ettigi Kd degerleri asaglîzlhki degerleri vermektedir
(Tablo XIV):
Tablo XIV: HB-EGF için proteinlerin afinitesi
Protein Kd (pM)
Dikkate deger ve beklenmedik bir sekilde, DTR'nin immünojenisitesini azaltmaylîiamaçlayan
altljlnutasyonun eklenmesi, HB-EGF için afinitesinin artmasi katk- bulunmustur. Toplam
DTR8, CRM197'ye göre HB-EGF için daha yaklas[lZl olarak 1400 kat daha afindir.
DTR8 proteininin HB-EGF baglanma aktivitesi, EGFR geni ile transfekte edilmis ve büyümesi
için HB-EGF'ye bagnllîblan bir Ba / F3 hücre çizgisinde HB-EGF'nin EGFR'ye baglanmasIEl
inhibe etme kapasitesiyle de degerlendirilmistir. Sonuçlar (Sekil 6), DTR8'in HB-EGF'ye
bagnllîlhücrelerin doza bagIiIElbir sekilde çogalmasllîngelledigini göstermektedir. DTR8'in
inhibe edici etkisi CRM197`ninkier karsüâst-IJSekil 6). Sonuçlar, esdeger bir inhibitör etki
elde etmek için CRM197'nin en az 300 kat daha fazla olmasEgerektigini göstermektedir.
Sonuç olarak DTR8, çözeltide HB-EGF'ye baglanmak için CRM197'den en az 300 kat daha
etkilidir.
Sonuç olarak, bu sonuçlar, DTR8 proteininin hücrelerin yüzeyindeki pro-HB-EGF moleküllerine
(Sekil 5) ve solüsyondaki HB-EGF'ye (Sekil 6) ve biyolojik aktivitelerini bloke etme
kapasitesine sahip oldugunu göstermektedir. Etkilesimler için Kd degerlerinin tahmini,
DTR8'in HB-EGF'ye baglanma aç-an CRM197'den 1400 kat daha güçlü oldugunu
göstermektedir.
Örnek 5: DTR1 ve DTR8 proteinlerinin antijenisitesinin degerlendirilmesi
Batüpopülasyonu difteri toksinine karsüasllânmlgtß DTR8 tipi bir terapötik protein ile
tedaviden fayda görebilecek bireyler, bu nedenle, söz konusu proteine karsüeaksiyona
girebilen antikorlara sahip olabilmektedir. Difteri toksinini (mutasyona ugramlgl formu
CRM ve DTR (çözünebilir
mutasyona ugramlgl form DTR1)) tanIiak için 20 saglllZlEldonörden olusan serumlarI
kapasitesi, ELISA ile DTR8 proteini (Sekil 7) ile karsßstlElllBilSIlEl s 20 degerinde olan bir
antikor titresi, arka plan gürültüsüne ve dolaylgüa bir tanIia yokluguna karsllllîlgelmektedir.
ZayiEIya da kuvvetli bir tepki gösteren serumlarüyl etmek için 30 degerinde bir titre esigi
rastgele olarak belirlenmistir.
Sonuçlar (Sekil 7), 16/20 donörün difteri toksine karsüantikorlara sahip oldugunu
göstermektedir. 14/20 donör, orta ila güçlü antikor yaniEESergilemektedir. Bununla birlikte,
ayrElayrEtlüsünülen her serumda bulunan antikorlarI çogunlugu, toksinin C alan. karsEl
yönlendirilir (Sekil 7). Nitekim 12 serum esigin üzerinde bir yaniEl(0rta ila güçlü yanLE) ve 4
serum esigin aItIa bir yaniEl(zay[E| yanlfJ göstermektedir. Serumun R alanII (DTR1)
çözünebilir formuna karsüreaktivitesi düsünülürse 15/20 serum R alanlütaniaktadlîi
Bununla birlikte, sadece 7 serum esigin üstünde bir yanlt] (orta ila güçlü yanlf.)
göstermektedir. Özellikle DTR8 proteini, donörlerin serumlarEtaraflEldan DTRl'den çok daha
az tanlEmaktadE Nitekim sadece 3/20 serum, DTR8'ye karslZyüksek bir ortalama reaktivite
sergilmektedir ve 2 serum zayifîlbir reaktivite sergilemektedir (Sekil 7).
Sonuç olarak, bu sonuçlar DTR 8 proteininin antijenisitesinin CRM197'ninkine göre düsük ve
önemli ölçüde azalmlgloldugunu göstermektedir. Bu antijenisite, DTR1 proteininkine klýbsla,
en düsük mutasyon taslýlan DTR'nin çözünebilir formuna karsHJKl gelen olarak da
azalmaktadlE Baska bir deyisle, HB-EGF için afinitesini arttlEinak ve immünojenikligini
azaltmak için DTR'ye dahil edilen mutasyonlar, antijenitesini önemli ölçüde azaltmaya katk-
bulunmaktadlE]
SEKANS LISTESI
<110> ATOM ENERJISI VE ALTERNATIF ENERJILER BASKANLIGI
<120> HB-EGF yolunun aktivasyonuna iliskin hastalîklarîn tedavisi için
difteri toksininin R alanîndan türerilmis HB-EGF inhibitörü
<130>
<160>
<170>
<210>
<211>
<212>
<213>
<400>
263FR495
PatentIn versiyon 3.5
Corynebacterium diphtheriae
465 470
<210> 2
<211> 158
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<223> sentetik protein
Y38OK/L39OT)
<400> 2
(Klon 1D3 ile kodu kald_r_lm_s DTR degiskeni
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
yapay sekans
kodu kaldrrrlmrs DTR degiskeni Y38OK/Q387E/L39OT)
Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser
115 120
Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr
130 135 140
Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile
145 150 155
<210> 4
<211> 158
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<223> sentetik protein (Klon 2C8 ile kodu kald-
<400> 4
Met Gly Lys Ser Pro Gly His Lys Thr Glu Thr Phe
Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr Val Glu Asp Ser Ile
Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys Ile Thr
Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile
50 55 60
Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn
65 70 75
Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Va1 Thr
Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala
100 105
Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser
115 120
Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr
130 135 140
Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile
r_lm_s DTR degiskeni
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
yapay sekans
sentetik protein
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
yapay sekans
sentetik protein
(Klon 2G5 ile kodu kalerZlmZs DTR degiskeni
(Klon 1H3 ile kodu kald r lmts DTR degiskeni
<400>
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
yapay sekans
sentetik protein
(DTR1 olarak isimlendirilmis DTR degiskeni
Met Gly Lys Ser Pro Gly His Lys Thr G1u Pro Phe Thr His Asp Gly
Tyr Thr Val Ser Trp Asn Thr Val G1u Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
yapay sekans
sentetik protein (DTR3 olarak isimlendirilmis DTR degiskeni
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
yapay sekans
sentetik protein
(DTR8 olarak isimlendirilmis DTR degiskeni
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400>
yapay sekans
sentetik polinükleotit
(1)..(474)
için optimize edilmis kodlama sekansî)
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
yapay sekans
Sentetik Yap_
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400>
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
yapay sekans
sentetik polinükleotit
yapay sekans
Sentetik Yapî
için optimize edilmis kodlama sekansî)
<210> 14
<211> 477
<212> DNA
<213>
<220>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 14
yapay sekans
sentetik polinükleotit
(1)..(474)
için optimize edilmis kodlama sekans
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
yapay sekans
Sentetik Yap_
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400>
yapay sekans
sentetik polinükleotit
(DTRwt için optimize edilmis kodlama sekansi)
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
yapay sekans
Sentetik Yap;
130 135 140
Lys Va1 Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe G1u Ile Lys Ser
145 150 155
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 18
Met Gly Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp
1 5 10 15
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 19
Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn
1 5 10 15
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 20
His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr Va1 G1u Asp Ser Ile
1 5 10 15
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 21
Ser Trp Asn Thr Va1 G1u Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln
1 5 10 15
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 22
Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp
1 5 10 15
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 23
Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu
1 5 10 15
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 24
Gly His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile
1 5 10 15
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 25
Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro
1 5 10 15
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 26
Leu Pro Ile Ala G1y Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro G1y Lys Leu
1 5 10 15
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 27
Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys
1 5 10 15
<210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 28
Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn
1 5 10 15
<210> 29
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 29
Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn G1y Arg Lys Ile Arg Met
1 5 10 15
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 30
Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile Asp
1 5 10 15
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 31
1 5 10 15
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 32
Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val
l 5 10 15
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 33
Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val
1 5 10 15
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 34
Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val
1 5 10 15
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 35
Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser
1 5 10 15
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 36
His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn
1 5 10 15
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 37
Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser
1 5 10 15
<210> 38
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 38
His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr
1 5 10 15
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 39
Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His
l 5 10 15
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 40
Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys
1 5 10 15
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 41
Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu
1 5 10 15
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 42
Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser
1 5 10 15
<210> 43
<211> 26
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 43
Met Gly Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly
1 5 10 15
Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr Val Glu Asp
<210> 44
<211> 26
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 44
Met Gly Lys Ser Pro Gly His Lys Thr Glu Pro Phe Thr His Asp Gly
1 5 10 15
Tyr Thr Val Ser Trp Asn Thr Val Glu Asp
<210> 45
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 45
Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser
<2lO> 46
<2ll> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 46
Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr Val Glu
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 47
Phe Thr His Asp Gly Tyr Thr Val Ser
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 48
Tyr Thr Val Ser Trp Asn Thr Val Glu
<210> 49
<211> 21
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 49
His Asp Gly Tyr Thr Val Ser Trp Asn Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile
1 5 10 15
<210> 50
<211> 21
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 50
His Asp Gly Tyr Thr Val Ser Trp Lys Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile
1 5 10 15
<210> 51
<211> 21
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 51
His Asp Gly Tyr Thr Val Ser Trp Asn Thr Gln Glu Asp Ser Ile Ile
1 5 10 15
<210> 52
<211> 21
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 52
His Asp Gly Tyr Thr Val Ser Trp Lys Thr Gln Glu Asp Ser Ile Ile
l 5 10 15
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 53
Val Ser Trp Asn Thr Val Glu Asp Ser
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 54
Tyr Thr Val Ser Trp Asn Thr Val Glu
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 55
Trp Asn Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 56
Trp Lys Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 57
Val Ser Trp Lys Thr Val Glu Asp Ser
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> Yapay sekans
<220>
<400> 58
Tyr Thr Val Ser Trp Asn Thr Gln Glu
<210> 59
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 59
Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu
1 5 10 15
<210> 60
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 60
Gln Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu
1 5 10 15
<210> 61
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 61
Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Lys Ile Pro Gly Lys Leu
l 5 10 15
<210> 62
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 62
Gln Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Lys Ile Pro Gly Lys Leu
1 5 10 15
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 63
Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 64
Val Leu Leu Pro Lys Ile Pro Gly Lys
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 65
Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu
<210> 66
<21l> 9
<212> PRT
<2l3> yapay sekans
<220>
<400> 66
Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro
<210> 67
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 67
Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile Asp
1 5 10 15
<210> 68
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 68
Ser Val Asn Gly Arg Lys Asp Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile Asp
1 5 10 15
<210> 69
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 69
Ser Val Asn Gly Arg Lys Glu Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile Asp
l 5 10 15
<210> 70
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 70
Ser Thr Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile Asp
1 5 10 15
<210> 71
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 71
Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Thr Cys Arg Ala Ile Asp
1 5 10 15
<210> 72
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 72
Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Asp Ile Asp
l 5 10 15
<210> 73
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 73
Ser Thr Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Thr Cys Arg Asp Ile Asp
l 5 10 15
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 74
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 75
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 76
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 77
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 78
Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg
<210> 79
<211> 9
<2l2> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 79
Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Thr
<210> 80
<2ll> 28
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 80
Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala
l 5 10 15
Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn
<210> 81
<211> 28
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 81
Ser Pro Val Thr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala
l 5 10 15
Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn
<210> 82
<211> 28
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 82
Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Asp His Ala Asn Leu His Val Ala
l 5 10 15
Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn
<210> 83
<211> 28
<212> PRT
<2l3> yapay sekans
<220>
<400> 83
Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Glu His Ala Asn Leu His Val Ala
l 5 10 15
Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn
<210> 84
<211> 28
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 84
Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly His His Ala Asn Leu His Val Ala
1 5 10 15
Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn
<210> 85
<211> 28
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 85
Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Gln His Ala Asn Leu His Val Ala
l 5 lO 15
Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn
<210> 86
<211> 28
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 86
Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Gly
l 5 10 15
Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn
<210> 87
<211> 28
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 87
Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala
l 5 10 15
Phe Glu Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn
<210> 88
<211> 28
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 88
Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala
l 5 10 15
Phe His Arg Lys Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn
<210> 89
<211> 28
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 89
Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala
l 5 10 15
Phe His Arg Ser Ser Lys Glu Lys Ile His Ser Asn
<210> 90
<211> 28
<212> PRT
<213> Yapay sekans
<220>
<400> 90
Ser Pro Val Thr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Gly
1 5 10 15
Phe Glu Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile His Ser Asn
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 91
Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 92
Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 93
Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala
<2lO> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 94
Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 95
Tyr Val Gly Asn Gly Asp His Ala Asn
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 96
Val Tyr Val Gly Asn Gly His His Ala
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 97
Val Tyr Val Gly Asn Gly Gln His Ala
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 98
Tyr Val Gly Asn Gly Gln His Ala Asn
<210> 99
<211> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 99
Leu His Val Gly Phe His Arg Ser Ser
<210> 100
<211> 8
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 100
Phe Glu Arg Ser Ser Ser Glu Lys
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 101
Leu His Val Ala Phe Glu Arg Ser Ser
<210> 102
<211> 9
<2l2> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 102
Phe His Arg Lys Ser Ser Glu Lys Ile
<210> 103
<211> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 103
Leu His Val Ala Phe His Arg Lys Ser
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 104
Val Ala Phe His Arg Lys Ser Ser Glu
<210> 105
<211> 9
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 105
Phe His Arg Ser Ser Lys Glu Lys Ile
<210> 106
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 106
Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His
l 5 10 15
<210> 107
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400> 107
Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Asp Val Asp His
1 5 10 15
<210> 108
<211> 15
<212> PRT
<213> yapay sekans
<220>
<400>
Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Glu Val Asp His
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
Claims (1)
- ISTEMLER SEKANS KIMLIK NO: 1 amino asitleri sekansII kallEtHârlZBBO ila 535 ile en az %70 oranIa benzerlige sahip olan bir amino asitler sekansIülçeren difteri toksisinin bir izole R alanIEIiçeren rekombinant protein olup, söz konusu sekans asagßhki ikamelerin kombinasyonunu içermektedir: - Y380K ve L390T ve söz konusu sekans, söz konusu R alanII N- veya C-terminal ucunda, difteri toksininin C alanÜe T alanlîle bir proteinin sekansÜeya söz konusu R alanII stabilitesi ve saflastlEllIhasIEliyilestirebilen bir protein alanIan yoksundur ve söz konusu rekombinant protein, bir HB-EGF inhibitörü ligantIlEI Üstelik A395T ikamesini içeren, Istem 1 veya Z'ye göre protein. Ayrlaa F389Y ve/veya G510A ikamelerinden en az birisini içeren, Istemler 1 ila 3'ten herhangi birine göre protein. Istemler 1 ila 4'ten herhangi birine göre protein olup, ayrlEla sunlardan olusan grup protein. SEKANS KIMLIK NO: 2 ila 5 ve SEKANS KIMLIK NO: 7 ila 9 amino asitleri sekanslarlEtlan birini Içeren veya bundan olusan, Istemler 1 ila 6'dan herhangi birine göre protein. Saptanabilir bir izleyici ile isaretlenen, Istemler 1 ila 7'den herhangi birine göre protein. Istemler 1 ila 8'den herhangi birine göre bir rekombinant proteini kodlayan izole polinükletoid. Istem 9'a göre bir polinükletoid içeren klonlama ve/veya ekspresyona yönelik rekombinant vektör. Istem 10'a göre bir vektör tarafIan modifiye edilen hücre. Istemler 1 ila 7'den herhangi birine göre en az bir rekombinant protein ve Istem 10'a göre bir ekspresyon rekombinant vektörü ve farmasötik olarak kabul edileiblir bir vehikül içeren farmasötik bilesim. Istemler 1 ila 7'den herhangi birine göre rekombinant protein veya Istem 10'a göre bir ekspresyon rekombinant vektörü olup, sunlardan olusan grup içinden seçilen HB- EGF/EGFR yolunun bir aktivasyonuna iliskin hastallEIarI tedavisinde kullanma yöneliktir: kresentik glomerülonefrit, kanserler, serebral kontüzyonlara iliskin vazospazm, kardiyak hipertrofi, düz kas hücrelerinin hiperplazi, pulmoner hipertansiyon, diyabetik retinopatiler ve arteryel restenoz. Istem 8'e göre isaretlenmis bir proteinin kullanIEblup; sunlardan olusan grup içinden seçilen HB-EGF/EGFR yolunun bir aktivasyonuna baglEbir hastallgll in vitro teshisine yöneliktir: kresentik glomerülonefrit, kanserler, serebral kontüzyonlara iliskin vazospazm, kardiyak hipertrofi, düz kas hücrelerinin hiperplazi, pulmoner hipertansiyon, diyabetik retinopatiler ve arteryel restenoz.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1252497A FR2988393B1 (fr) | 2012-03-20 | 2012-03-20 | Inhibiteur de l'hb-egf derive du domaine r de la toxine diphterique pour le traitement des maladies associees a l'activation de la voie hb-egf/egfr |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TR201810352T4 true TR201810352T4 (tr) | 2018-08-27 |
Family
ID=48237170
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TR2018/10352T TR201810352T4 (tr) | 2012-03-20 | 2013-03-19 | Hb-egf egfr yolunun aktivasyonununa ilişkin hastalıkların tedavisi için difteri toksininin r alanından türetilmiş hb-egf inhibitörü. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9758552B2 (tr) |
| EP (1) | EP2828285B1 (tr) |
| JP (1) | JP6279543B2 (tr) |
| DK (1) | DK2828285T3 (tr) |
| ES (1) | ES2679168T3 (tr) |
| FR (1) | FR2988393B1 (tr) |
| TR (1) | TR201810352T4 (tr) |
| WO (1) | WO2013140335A1 (tr) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2938251C (en) | 2014-01-31 | 2021-01-12 | Fina Biosolutions, Llc | Expression and purification of crm197 and related proteins |
| US11060123B2 (en) | 2014-01-31 | 2021-07-13 | Fina Biosolutions, Llc | Production of soluble recombinant protein without n-terminal methionine |
| JP6369862B2 (ja) * | 2014-08-06 | 2018-08-08 | 原 英彰 | 眼内血管新生抑制剤及びその用途 |
| KR102078714B1 (ko) * | 2018-02-02 | 2020-02-19 | (주)포바이오코리아 | 봉입체로 발현된 불용성 crm197 단백질로부터 활성 crm197 효율적인 회수 및 정제 방법 |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993021769A1 (en) * | 1992-05-06 | 1993-11-11 | President And Fellows Of Harvard College | Diphtheria toxin receptor-binding region |
| US6455673B1 (en) | 1994-06-08 | 2002-09-24 | President And Fellows Of Harvard College | Multi-mutant diphtheria toxin vaccines |
| US5917017A (en) * | 1994-06-08 | 1999-06-29 | President And Fellows Of Harvard College | Diphtheria toxin vaccines bearing a mutated R domain |
| AU6906100A (en) * | 1999-08-16 | 2001-03-13 | Government of The United States of America, as represented by The Secretary Department of Health & Human Services, The National Institutes of Health, The | Receptor-mediated uptake of an extracellular bcl-xl fusion protein inhibits apoptosis |
| JP4203742B2 (ja) * | 2002-10-15 | 2009-01-07 | 財団法人阪大微生物病研究会 | 制癌剤 |
| US20060270600A1 (en) | 2005-05-26 | 2006-11-30 | Eisuke Mekada | Anti-cancer agents |
| JP5052338B2 (ja) | 2005-06-21 | 2012-10-17 | 一般財団法人阪大微生物病研究会 | 癌治療薬 |
| KR20090029227A (ko) | 2006-06-06 | 2009-03-20 | 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 | 헤파린 결합 상피세포 증식 인자 유사 증식 인자에 결합하는 모노클로날 항체 |
| EP2093237B1 (en) | 2006-10-20 | 2015-12-30 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-cancer agent comprising anti-hb-egf antibody as active ingredient |
| JP5378795B2 (ja) | 2006-10-20 | 2013-12-25 | 中外製薬株式会社 | 抗ｈｂ−ｅｇｆ抗体を有効成分として含む医薬組成物 |
| US8198266B2 (en) | 2006-10-31 | 2012-06-12 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Use of an EGFR antagonist for the treatment of glomerolonephritis |
| EP2497783A3 (en) | 2007-09-26 | 2013-04-17 | U3 Pharma GmbH | Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor antigen binding proteins |
| WO2009072628A1 (ja) | 2007-12-05 | 2009-06-11 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | ヘパリン結合上皮細胞増殖因子様増殖因子に結合するモノクローナル抗体 |
| GB0807018D0 (en) | 2008-04-17 | 2008-05-21 | Fusion Antibodies Ltd | Antibodies and treatment |
| FR2940451B1 (fr) | 2008-12-18 | 2014-09-12 | Proteus | Procede d'evaluation de l'immunogenicite des proteines |
| CA2771436A1 (en) | 2009-08-17 | 2011-02-24 | Forerunner Pharma Research Co., Ltd. | Pharmaceutical composition comprising anti-hb-egf antibody as active ingredient |
-
2012
- 2012-03-20 FR FR1252497A patent/FR2988393B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-03-19 TR TR2018/10352T patent/TR201810352T4/tr unknown
- 2013-03-19 JP JP2015501031A patent/JP6279543B2/ja active Active
- 2013-03-19 US US14/386,470 patent/US9758552B2/en active Active
- 2013-03-19 EP EP13720081.2A patent/EP2828285B1/fr active Active
- 2013-03-19 ES ES13720081.2T patent/ES2679168T3/es active Active
- 2013-03-19 WO PCT/IB2013/052173 patent/WO2013140335A1/fr active Application Filing
- 2013-03-19 DK DK13720081.2T patent/DK2828285T3/en active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP6279543B2 (ja) | 2018-02-14 |
| EP2828285A1 (fr) | 2015-01-28 |
| FR2988393A1 (fr) | 2013-09-27 |
| ES2679168T3 (es) | 2018-08-22 |
| FR2988393B1 (fr) | 2014-05-09 |
| DK2828285T3 (en) | 2018-07-30 |
| JP2015512382A (ja) | 2015-04-27 |
| US9758552B2 (en) | 2017-09-12 |
| EP2828285B1 (fr) | 2018-04-25 |
| WO2013140335A1 (fr) | 2013-09-26 |
| US20150051146A1 (en) | 2015-02-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20230151068A1 (en) | Peptide compositions and methods of use thereof for disrupting tead interactions | |
| JP6041799B2 (ja) | Ｔｒａｉｌｒ２特異的多量体足場 | |
| CN104662043B (zh) | 用于预防、治疗和诊断炎性病症的方法和化合物 | |
| CN109414510A (zh) | Mt1-mmp特异性双环肽-毒素缀合物 | |
| US11155603B2 (en) | Mimetic peptides derived from collagen type IV and their use for treating angiogenesis- and lymphangiogenesis- dependent diseases | |
| ES2819825T3 (es) | Antagonistas peptídicos de la familia calcitonina CGRP de hormonas peptídicas y su uso | |
| US20220098260A1 (en) | BH4 Stabilized Peptides And Uses Thereof | |
| CN114945584A (zh) | 重组肽-mhc复合物结合蛋白及其生成和用途 | |
| ES2278755T3 (es) | Regulacion del receptor acoplado a proteinas g de tipo dopamina humano. | |
| TR201810352T4 (tr) | Hb-egf egfr yolunun aktivasyonununa ilişkin hastalıkların tedavisi için difteri toksininin r alanından türetilmiş hb-egf inhibitörü. | |
| KR20160070164A (ko) | 항-vegf darpin으로 눈의 병태를 치료하는 방법 | |
| CN117279618A (zh) | 用于靶标分子的选择性耗竭的组合物和方法 | |
| CN111417401A (zh) | 一种治疗方法 | |
| AU2003288434B2 (en) | Peptides, antibodies thereto, and their use in the treatment of central nervous system damage | |
| JP7380999B2 (ja) | 環状ペプチド | |
| US20160051704A1 (en) | Molecular imaging probes for lung cancer intraoperative guidance | |
| WO2023105224A1 (en) | Fap detection | |
| CN113195704A (zh) | 用于治疗癌症的肽治疗剂及其用途 | |
| WO2019020480A1 (en) | ANTIBODIES AND PEPTIDES FOR TREATING HCMV RELATED DISEASES |