CN117279618A

CN117279618A - 用于靶标分子的选择性耗竭的组合物和方法

Info

Publication number: CN117279618A
Application number: CN202180089144.7A
Authority: CN
Inventors: Z·克鲁克; J·奥尔森; R·K·斯特朗; N·W·奈恩; S·塔普斯科特; K·肯尼思
Original assignee: Fred Hutchinson Cancer Research Center; Blaze Bioscience Inc
Current assignee: Blaze Bioscience Inc; Fred Hutchinson Cancer Center
Priority date: 2020-11-30
Filing date: 2021-11-29
Publication date: 2023-12-22
Also published as: AU2021386254A1; WO2022115715A1; IL303152A; EP4251130A1; CA3195315A1; JP2023551481A

Abstract

本文描述了使用可再循环的CDP‑受体结合介导的复合物引发靶标的内吞作用和细胞降解来选择性耗竭靶标分子的组合物和方法。含有结合转铁蛋白受体的肽，诸如CDP肽的示例性组合物能够连接至结合靶标分子的肽。此类组合物能够用于经由转铁蛋白受体介导的所述组合物和所结合的靶标分子的内吞作用而将所述靶标分子选择性地募集至内体。一旦在所述内体内部，由于所述组合物对所述靶标分子的pH依赖性结合，酸性pH就能够导致所述靶标分子从所述组合物中释放，并且所述转铁蛋白受体部分再循环回到细胞表面用于“重新负载”。然后，所述靶标分子能够被运输至溶酶体中，在所述溶酶体中所述靶标分子被降解。

Description

用于靶标分子的选择性耗竭的组合物和方法

交叉引用

本申请要求2020年11月30日提交的题为“COMPOSITIONS AND METHODS FORSELECTIVE DEPLETION OF TARGET MOLECULES”的美国临时申请号：63/119,195的权益，所述申请出于所有目的以引用的方式整体并入本文。

序列表

本申请含有已经以电子方式以ASCII格式提交并且特此以引用的方式整体并入的序列表。创建于2021年11月24日的所述ASCII副本被命名为108406-702531_SL.txt并且大小为665,995字节。

背景技术

可溶性和细胞表面蛋白的累积或过度表达在范围从神经变性疾病到癌症的多种人类疾病中有所显示。此外，许多疾病与可溶性或细胞表面蛋白中的突变相关，所述突变导致组成性活性、对治疗的抗性或显性负活性。然而，由于用小分子治疗剂靶向这些蛋白质中的许多的挑战，所述蛋白质一直被认为是“不可用药的”、“难以用药的”或“尚未用药的”靶标。例如，在神经变性阿尔茨海默氏病中，在脑中累积形成斑块作为疾病的显著方面的淀粉样蛋白缺乏靶向所述蛋白质的治疗剂，尽管它在神经变性中起着关键作用。需要靶向并选择性地耗竭与疾病相关的可溶性和细胞表面蛋白的组合物和方法。

发明内容

在各种方面，本公开提供了一种肽复合物，所述肽复合物包含：细胞受体结合肽；和与所述细胞受体结合肽复合的靶标结合肽，其中(i)所述靶标结合肽被工程化为在内体中对靶标具有比在细胞外环境中更低的亲和力，(i i)所述细胞受体结合肽被工程化为在内体中对细胞受体具有比在细胞外环境中更低的亲和力，或(i)和(i i)两者。

在一些方面，所述靶标结合肽对所述靶标的亲和力、所述细胞受体结合肽对所述细胞受体的亲和力或两者是pH依赖性的。在一些方面，所述靶标结合肽对所述靶标的亲和力、所述细胞受体结合肽对所述细胞受体的亲和力或两者是离子强度依赖性的。

在各种方面，本公开提供了一种肽复合物，所述肽复合物包含：细胞受体结合肽；和与所述细胞受体结合肽复合的靶标结合肽，其中(i)所述靶标结合肽对靶标的亲和力是pH依赖性的，(i i)所述细胞受体结合肽对细胞受体的亲和力是pH依赖性的，或(i)和(i i)两者。

在一些方面，所述细胞受体结合肽是转铁蛋白受体结合肽或PD-L1结合肽。在一些方面，所述细胞受体结合肽是转铁蛋白受体结合肽。在一些方面，所述细胞受体结合肽是PD-L1结合肽。在一些方面，所述细胞受体是转铁蛋白受体或PD-L1。在一些方面，所述细胞受体是转铁蛋白受体。在一些方面，所述细胞受体是PD-L1。

在一些方面，所述细胞受体结合肽在pH 4.5至pH 7.4、pH 5.5至pH 7.4或pH 6.5至pH 7.4的pH下与所述细胞受体结合。在一些方面，所述细胞受体结合肽能够在pH 7.4下以不超过100nM、不超过20nM、不超过10nM、不超过5nM、不超过2nM、不超过1nM、不超过0.5nM、不超过0.4nM、不超过0.3nM、不超过0.2nM或不超过0.1nM的解离常数(KD)结合所述细胞受体。在一些方面，所述细胞受体结合肽能够在pH 5.5下以不超过100nM、不超过20nM、不超过10nM、不超过5nM、不超过2nM、不超过1nM、不超过0.5nM、不超过0.4nM、不超过0.3nM、不超过0.2nM或不超过0.1nM的解离常数(KD)结合所述细胞受体。在一些方面，所述细胞受体对所述细胞受体的亲和力是非pH依赖性的。在一些方面，在pH 7.4下和在pH 5.5下所述细胞受体结合肽对所述细胞受体的亲和力相差不超过2倍、不超过5倍、不超过10倍、不超过15倍、不超过20倍、不超过25倍、不超过30倍、不超过40倍或不超过50倍。

在一些方面，所述细胞受体结合肽对所述细胞受体的亲和力是pH依赖性的。在一些方面，所述细胞受体结合肽对所述细胞受体的亲和力随着pH降低而降低。在一些方面，所述细胞受体结合肽对所述细胞受体的亲和力在pH 7.4下比在pH 5.5下更高。

在一些方面，所述靶标结合肽对所述靶标的亲和力是pH依赖性的。在一些方面，所述靶标结合肽对所述靶标的亲和力随着pH降低而降低。在一些方面，所述靶标结合肽对所述靶标的亲和力在较高pH下比在较低pH下更高。在一些方面，所述较高pH是pH 7.4、pH7.2、pH 7.0或pH 6.8。在一些方面，所述较低pH是pH 6.5、pH 6.0、pH 5.5、pH 5.0或pH4.5。在一些方面，所述靶标结合肽对所述靶标的亲和力在pH 7.4下比在pH 6.0下更高。在一些方面，所述靶标结合肽对所述靶标的亲和力在pH 7.4下比在pH 5.5下更高。在一些方面，所述靶标结合肽能够在pH 7.4下以不超过100nM、不超过20nM、不超过10nM、不超过5nM、不超过2nM、不超过1nM、不超过0.5nM、不超过0.4nM、不超过0.3nM、不超过0.2nM、不超过1nM或不超过0.1nM的解离常数(KD)结合所述靶标分子。在一些方面，所述靶标结合肽能够在pH5.5下以不小于1nM、不小于2nM、不小于5nM、不小于10nM、不小于20nM、不小于50nM、不小于100nM、不小于200nM或不小于500nM的解离常数(KD)结合所述靶标分子。在一些方面，所述靶标结合肽在pH 7.4下对所述靶标的亲和力是所述靶标结合肽在pH 5.5下对所述靶标的亲和力的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍或至少20倍。在一些方面，所述靶标结合肽包含一个或多个组氨酸氨基酸残基。在一些方面，所述靶标结合肽对所述靶标的亲和力随着离子强度增加而降低。在一些方面，所述靶标结合肽包含一个或多个能够与所述靶标分子形成极性或电荷-电荷相互作用的极性或带电氨基酸残基。

在一些方面，所述细胞受体结合肽缀合至所述靶标结合肽。在一些方面，所述细胞受体结合肽和所述靶标结合肽形成单一多肽链。在一些方面，所述肽复合物包含经由二聚化结构域二聚化的二聚体。在一些方面，所述二聚化结构域包含Fc结构域。在一些方面，所述二聚体是经由同二聚化结构域二聚化的同二聚体。在一些方面，所述同二聚化结构域包含与SEQ ID NO:245–SEQ ID NO:259中的任一个具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一些方面，所述二聚体是经由第一异二聚化结构域和第二异二聚化结构域二聚化的异二聚体。在一些方面，所述第一异二聚化结构域包含与SEQ ID NO:260、SEQ ID NO:262、SEQID NO:264、SEQ ID NO:266、SEQ ID NO:268、SEQ ID NO:270、SEQ ID NO:272、SEQ ID NO:274、SEQ ID NO:276、SEQ ID NO:278、SEQ ID NO:280、SEQ ID NO:282、SEQ ID NO:284或SEQ ID NO:286中的任一个具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一些方面，所述第二异二聚化结构域包含与SEQ ID NO:261、SEQ ID NO:263、SEQ ID NO:265、SEQ ID NO:267、SEQ ID NO:269、SEQ ID NO:271、SEQ ID NO:273、SEQ ID NO:275、SEQ ID NO:277、SEQ IDNO:279、SEQ ID NO:281、SEQ ID NO:283、SEQ ID NO:285或SEQ ID NO:287中的任一个具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。

在一些实施方案中，所述靶标结合肽经由肽接头连接至所述二聚化结构域。在一些实施方案中，所述细胞受体结合肽经由肽接头连接至所述二聚化结构域。在一些方面，所述细胞受体结合肽经由肽接头连接至所述靶标结合肽。在一些方面，所述肽接头具有1至50个氨基酸残基、2至40个氨基酸残基、3至20个氨基酸残基或3至10个氨基酸残基的长度。在一些方面，所述肽接头包含甘氨酸和丝氨酸氨基酸。在一些方面，所述肽接头具有不超过不超过/>不超过/>不超过/>不超过/>不超过/>不超过/>不超过/>不超过/>或不超过/>的持久长度。在一些方面，所述肽接头源自免疫球蛋白肽。在一些方面，所述肽接头源自双结毒素肽。在一些方面，所述肽接头包含SEQ ID NO:129–SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:195–SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:223–SEQ ID NO:227或SEQ ID NO:391中的任一个的序列。

在一些方面，所述细胞受体结合肽、所述靶标结合肽或两者包含小蛋白(miniprotein)、纳米抗体、抗体、抗体片段、scFv、DARPin或亲和体。在一些方面，所述抗体包含IgG，或者其中所述抗体片段包含Fab、F(ab)2、scFv或(scFv)2。在一些方面，所述小蛋白包含胱氨酸密集肽、affitin、adnectin、avimer、Kunitz结构域、nanofittin、fynomer、双环肽、β-发夹或钉合肽。在一些方面，所述细胞受体结合肽包含至少一个二硫键、至少两个二硫键、至少三个二硫键或至少四个二硫键。

在一些方面，所述靶标结合肽包含至少一个二硫键、至少两个二硫键、至少三个二硫键或至少四个二硫键。在一些方面，所述细胞受体结合肽包含至少六个半胱氨酸残基。在一些方面，所述至少六个半胱氨酸残基位于所述细胞受体结合肽的氨基酸位置4、8、18、32、42和46处。在一些方面，所述至少六个半胱氨酸残基形成至少三个二硫键。

在一些方面，所述细胞受体结合肽包含SEQ ID NO:148–SEQ ID NO:177中的任一个的序列。在一些方面，所述细胞受体结合肽包含与SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ IDNO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQID NO:64中的任一个具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性或与SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ IDNO:1–SEQ ID NO:64中的任一个的片段具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一些方面，所述细胞受体结合肽包含与SEQ ID NO:96具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性或与SEQID NO:96的片段具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一些方面，所述细胞受体结合肽包含SEQ ID NO:96的序列。在一些方面，所述细胞受体结合肽包含SEQ ID NO:392–SEQID NO:399中的任一个的序列。在一些方面，所述细胞受体结合肽包含与SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:233–SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:400–SEQ ID NO:456或SEQ ID NO:241中的任一个具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性或与SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:233–SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:400–SEQ ID NO:456或SEQ ID NO:241中的任一个的片段具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一些方面，所述细胞受体结合肽包含与SEQ ID NO:187、SEQ IDNO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:400或SEQ ID NO:401具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性或与SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:235、SEQ IDNO:236、SEQID NO:238、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:400或SEQ ID NO:401的片段具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一些方面，所述细胞受体结合肽包含SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:400或SEQ ID NO:401的序列。在一些方面，所述片段包含至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49或至少50个氨基酸残基。

在一些方面，所述细胞受体结合肽在细胞受体结合界面处包含一个或多个组氨酸残基。在一些方面，所述靶标结合肽在靶标结合界面处包含一个或多个组氨酸残基。在一些方面，所述靶标结合肽是PD-L1结合肽、EGFR结合肽或TNFα结合肽。在一些方面，所述PD-L1结合肽包含与SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:235–SEQ IDNO:239、SEQ ID NO:400–SEQ ID NO:456或SEQ ID NO:240中的任一个具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一些方面，所述EGFR结合肽结合EGFR变体I I I或酪氨酸激酶抑制剂抗性EGFR。在一些方面，所述EGFR结合肽包含与SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ IDNO:219或SEQ ID NO:242具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一些方面，所述EGFR结合肽包含SEQ ID NO:242的序列。在一些方面，所述EGFR结合肽包含SEQ ID NO:243的序列。

在一些方面，所述靶标是细胞表面分子、生长因子受体、分泌肽、分泌蛋白、循环分子、细胞信号传导分子、细胞外基质大分子、神经递质、细胞因子、生长因子、肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原或激素、检查点抑制剂、免疫检查点抑制剂、抑制性免疫受体、抑制性免疫受体的配体、巨噬细胞表面蛋白、脂多糖、抗体、抑制性免疫受体、肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原或自身抗体。在一些方面，所述靶标是胶原蛋白、弹性蛋白、微原纤维蛋白、蛋白聚糖、CD200R、CD300a、CD300f、CEACAM1、FcgRiib、ILT-2、ILT-3、ILT-4、ILT-5、LAIR-1、PECAM-1、PILR-α、SIRL-1和SIRP-α、CLEC4A、Ly49Q、MIC、CD3、CD47、CD28、CD137、CD89、CD14、CD16、CD29、CD44、CD71、CD73、CD90、CD105、CD166、CD27、CD39、CD24、CD25、CD74、CD40L、MUC1、MUC16、MUC2、MUC5AC、MUC4、OX40、4-1BB、HLA-G、LAG3、Tim3、TIGIT、GITR、TCR、TNF-α、EGFR、EGFRvIII、TKI抗性EGFR、HER2、ERBB3、PDGFR、FGF、VEGF、VEGFR、IGFR1、CTLA4、STRO1、补体因子C4、补体因子C1q、补体因子C1s、补体因子C1r、补体因子C3、补体因子C3a、补体因子C3b、补体因子C5、补体因子C5a、TGFβ、PCSK9、P2Y6、HER3、RANK、tau、淀粉样蛋白β、亨廷顿蛋白、α-突触核蛋白、葡糖脑苷脂酶、α-葡糖苷酶、IL-1、IL-1R、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-10、IL-10R、IL-17、IL-23、IL-12、p40、B7家族的成员、c-Met、SIGLEC、MCP-1、MHC、MHCI、MHCII、PD-1或PD-L1。在一些方面，所述靶标是PD-L1、EGFR或TNFα。

在一些方面，所述肽复合物包含序列，所述序列与SEQ ID NO:288–SEQ ID NO:313或SEQ ID NO:315–SEQ ID NO:346中的任一个具有至少80％、至少90％、至少92％至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；或与SEQID NO:347、SEQ ID NO:348、SEQ ID NO:351、SEQ ID NO:352、SEQ ID NO:355、SEQ ID NO:356、SEQ ID NO:358、SEQ ID NO:359、SEQ ID NO:360、SEQ ID NO:361、SEQ ID NO:362、SEQID NO:363、SEQ ID NO:364、SEQ ID NO:365、SEQ ID NO:371、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:376、SEQ ID NO:378、SEQ ID NO:382、SEQ ID NO:384、SEQ ID NO:387或SEQ ID NO:389中的任一个具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在一些方面，所述肽复合物包含以下各项的序列：SEQ ID NO:288、SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:307、SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:327、SEQID NO:328、SEQ ID NO:332、SEQ ID NO:333、SEQ ID NO:337、SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:342或SEQ ID NO:343；与SEQ ID NO:302、SEQ ID NO:305、SEQ ID NO:339、SEQ ID NO:340、SEQ ID NO:344或SEQ ID NO:345异二聚化的SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:293、SEQ ID NO:310、SEQ ID NO:315或SEQ ID NO:316；与SEQ ID NO:302、SEQ ID NO:339或SEQ ID NO:344异二聚化的SEQ ID NO:296；SEQ ID NO:298；与SEQ ID NO:301异二聚化的SEQ ID NO:299；与SEQ ID NO:330或SEQ ID NO:335异二聚化的SEQ ID NO:331或SEQ ID NO:336；或与SEQID NO:329、SEQ IDNO:330、SEQ ID NO:334或SEQ ID NO:335异二聚化的SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:315或SEQ ID NO:316。在一些方面，所述肽复合物包含以下各项的序列：SEQ IDNO:290、SEQ ID NO:291、SEQ IDNO:308、SEQ ID NO:317、SEQ ID NO:318、SEQ ID NO:322或SEQ ID NO:323；与SEQ ID NO:304、SEQ ID NO:306、SEQ ID NO:319、SEQ ID NO:320、SEQID NO:321、SEQ ID NO:324或SEQ ID NO:325异二聚化的SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:294、SEQ ID NO:315、SEQ ID NO:316；与SEQ ID NO:304、SEQ ID NO:319、SEQ ID NO:321或SEQID NO:324异二聚化的SEQ ID NO:295或SEQ ID NO:297；与SEQ ID NO:303异二聚化的SEQID NO:298或SEQ ID NO:300；或与SEQ ID NO:306、SEQ ID NO:311、SEQ ID NO:320或SEQIDNO:325异二聚化的SEQ ID NO:326。

在一些方面，所述细胞受体结合肽从所述细胞受体的解离速率慢于所述细胞受体的再循环速率。在一些方面，所述细胞受体结合肽从所述细胞受体的解离速率不快于1分钟、不快于2分钟、不快于3分钟、不快于4分钟、不快于5分钟、不快于7分钟、不快于10分钟、不快于15分钟或不快于20分钟。在一些方面，所述肽复合物能够经由受体介导的内吞作用被内吞。在一些方面，所述受体介导的内吞作用是转铁蛋白受体介导的内吞作用。在一些方面，所述细胞受体结合肽在胞吞泡内保持与所述细胞受体结合。在一些方面，当所述细胞受体结合肽与所述细胞受体结合并且使所述细胞受体再循环时，所述肽复合物进行再循环。在一些方面，当所述肽复合物经由受体介导的内吞作用被内吞时，所述靶标从所述靶标结合肽释放或解离。

在一些方面，所述靶标是细胞外蛋白、循环蛋白或可溶性蛋白。在一些方面，所述靶标是细胞表面蛋白。在一些方面，所述靶标是跨膜蛋白。在一些方面，所述肽复合物还包含第二靶标结合肽。在一些方面，所述第二靶标结合肽结合第二靶标。在一些方面，所述靶标和所述第二靶标在与所述靶标结合肽和所述第二靶标结合肽结合时形成二聚体。在一些方面，所述靶标和所述第二靶标的二聚化增加所述靶标和所述第二靶标的内吞作用速率。在一些方面，所述第二靶标与所述靶标相同。

在一些方面，所述肽复合物还包含与所述细胞受体结合肽、所述靶标结合肽或两者偶联的半衰期调节剂。在一些方面，所述半衰期调节剂是聚合物；聚乙二醇(PEG)；羟乙基淀粉；聚乙烯醇；水溶性聚合物；两性离子水溶性聚合物；水溶性聚(氨基酸)；脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸的水溶性聚合物；含有甘氨酸、谷氨酸和丝氨酸的水溶性聚合物；Fc区；脂肪酸；棕榈酸；或结合至白蛋白的分子。在一些方面，所述结合至白蛋白的分子是血清白蛋白结合肽。在一些方面，所述血清白蛋白结合肽包含SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:179或SEQ ID NO:193中的任一个的序列。在一些方面，所述细胞受体结合肽、所述靶标结合肽或两者是重组表达的。

在一些方面，所述靶标结合肽被配置为在pH 6.5、pH 6.0、pH 5.5、pH 5.0或pH4.5下与所述靶标解离。在一些方面，所述细胞受体结合肽被配置为在pH 6.5、pH 6.0、pH5.5、pH 5.0或pH 4.5下与所述细胞受体解离。

在各种方面，本公开提供了一种选择性地耗竭靶标分子的方法，所述方法包括：使包含细胞受体结合肽和与所述细胞受体结合肽复合的靶标结合肽的肽复合物与表达细胞受体的细胞接触；在细胞外条件下使所述靶标结合肽与所述靶标分子结合；在细胞外条件下使所述细胞受体结合肽与所述细胞受体结合；内吞所述肽复合物、所述靶标分子和所述细胞受体；在内体条件下使所述靶标结合肽与所述靶标分子解结合、使所述细胞受体结合肽与所述细胞受体解结合或两者；以及降解所述靶标分子，从而耗竭所述靶标分子。

在各种方面，本公开提供了一种选择性地耗竭靶标分子的方法，所述方法包括：使肽复合物与表达细胞受体的细胞接触；在细胞外条件下使所述靶标结合肽与所述靶标分子结合；在细胞外条件下使所述细胞受体结合肽与所述细胞受体结合；将所述肽复合物、所述靶标分子和所述细胞受体内吞到内吞或溶酶体区室中；在内体条件下从所述靶标分子释放所述靶标结合肽、从所述细胞受体释放所述细胞受体结合肽或两者；以及降解所述靶标分子，从而耗竭所述靶标分子。

在一些方面，所述方法还包括使所述肽复合物和所述细胞受体再循环。在一些方面，所述细胞受体是转铁蛋白受体或PD-L1，并且所述细胞受体结合肽是转铁蛋白受体结合肽或PD-L1结合肽。在一些方面，所述细胞受体结合肽是转铁蛋白受体结合肽，并且所述细胞受体是转铁蛋白受体。在一些方面，所述细胞受体结合肽是PD-L1结合肽，并且所述细胞受体是PD-L1。在一些方面，所述内吞包括受体介导的内吞作用。在一些方面，所述细胞受体结合肽在所述内吞或溶酶体区室中保持与所述细胞受体结合。在一些方面，所述靶标分子在所述内吞或溶酶体区室中降解。在一些方面，所述受体介导的内吞作用是转铁蛋白受体介导的内吞作用。

在一些方面，所述靶标分子是细胞外蛋白、循环蛋白或可溶性蛋白。在一些方面，所述靶标分子是细胞表面蛋白。在一些方面，所述靶标分子是跨膜蛋白。在一些方面，所述方法包括用所述肽复合物穿透包含血脑屏障(BBB)的细胞层。在一些方面，所述靶标分子在中枢神经系统中降解。在一些方面，所述细胞表达所述细胞受体。

在一些方面，所述方法包括在所述细胞外条件下使所述细胞受体结合肽以不超过50μM、不超过5μM、不超过500nM、不超过100nM、不超过40nM、不超过30nM、不超过20nM、不超过10nM、不超过5nM、不超过2nM、不超过1nM、不超过0.5nM、不超过0.4nM、不超过0.3nM、不超过0.2nM或不超过0.1nM的解离常数(KD)结合至所述细胞受体。在一些方面，所述方法包括在所述内体条件下使所述细胞受体结合肽以不超过50μM、不超过5μM、不超过500nM、不超过100nM、不超过40nM、不超过30nM、不超过20nM、不超过10nM、不超过5nM、不超过2nM、不超过1nM、不超过0.5nM、不超过0.4nM、不超过0.3nM、不超过0.2nM或不超过0.1nM的解离常数(KD)结合至所述细胞受体。

在一些方面，所述靶标结合肽在所述内吞区室中保持与所述靶标分子结合。在一些方面，所述方法包括在所述细胞外条件下使所述靶标结合肽以不超过50μM、不超过5μM、不超过500nM、不超过100nM、不超过40nM、不超过30nM、不超过20nM、不超过10nM、不超过5nM、不超过2nM、不超过1nM、不超过0.5nM、不超过0.4nM、不超过0.3nM、不超过0.2nM或不超过0.1nM的解离常数(KD)结合至所述靶标分子。在一些方面，所述方法包括在所述内体条件下使所述靶标结合肽以不小于1nM、不小于2nM、不小于5nM、不小于10nM、不小于20nM、不小于50nM、不小于100nM、不小于200nM或不小于500nM的解离常数(KD)结合至所述靶标分子。在一些方面，所述方法包括与所述内体条件相比，在所述细胞外条件下使所述细胞受体结合肽以相差不超过2倍、不超过5倍、不超过10倍、不超过15倍、不超过20倍、不超过25倍、不超过30倍、不超过40倍或不超过50倍的亲和力结合至所述细胞受体。在一些方面，所述方法包括在所述靶标结合肽与所述靶标分子之间形成一种或多种极性或电荷-电荷相互作用。

在一些方面，所述细胞受体结合肽包含与SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ IDNO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQID NO:64中的任一个具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一些方面，所述细胞受体结合肽包含与SEQ ID NO:96具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一些方面，所述细胞受体结合肽包含SEQ ID NO:96的序列。在一些方面，所述细胞受体结合肽包含SEQ ID NO:392–SEQ ID NO:399中的任一个的序列。在一些方面，所述细胞受体结合肽包含与SEQ IDNO:187、SEQ ID NO:233–SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:400–SEQ ID NO:456或SEQ ID NO:241中的任一个具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性或与SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:233–SEQ IDNO:239、SEQ ID NO:400–SEQ ID NO:456或SEQ ID NO:241中的任一个的片段具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一些方面，所述细胞受体结合肽包含与SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:238或SEQ ID NO:239具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性或与SEQID NO:187、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:238或SEQ ID NO:239的片段具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一些方面，所述细胞受体结合肽包含SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:238或SEQ ID NO:239的序列。

在一些方面，所述方法还包括使第二靶标分子与第二靶标结合肽结合。在一些方面，所述靶标分子和所述第二靶标分子在与所述靶标结合肽和所述第二靶标结合肽结合时二聚化。在一些方面，所述方法包括在所述靶标分子和所述第二靶标分子的二聚化后增加所述靶标分子和所述第二靶标分子的内吞作用速率。在一些方面，所述第二靶标分子在所述靶标分子和所述第二靶标分子的内吞作用后降解。在一些方面，所述第二靶标分子与所述靶标分子相同。

在各种方面，本公开提供了一种治疗受试者的疾病或疾患的方法，所述方法包括：向所述受试者施用肽复合物，所述肽复合物包含细胞受体结合肽和与所述细胞受体结合肽复合的靶标结合肽；在细胞外条件下使所述靶标结合肽与所述受试者的细胞上与所述疾病或疾患相关的靶标分子结合，所述细胞表达所述靶标分子和细胞受体；在细胞外条件下使所述细胞受体结合肽与所述受试者的所述细胞上的所述细胞受体结合；内吞所述肽复合物、所述靶标分子和所述细胞受体；在内体条件下使所述靶标结合肽与所述靶标分子解结合、使所述细胞受体结合肽与所述细胞受体解结合或两者；以及降解所述靶标分子，从而治疗所述疾病或疾患。

在各种方面，本公开提供了一种治疗受试者的疾病或疾患的方法，所述方法包括：向所述受试者施用如本文所述的肽复合物；在细胞外条件下使所述靶标结合肽与所述受试者的细胞上与所述疾病或疾患相关的靶标分子结合，所述细胞表达所述靶标分子和细胞受体；在细胞外条件下使所述细胞受体结合肽与所述受试者的所述细胞上的所述细胞受体结合；内吞所述肽复合物、所述靶标分子和所述细胞受体；在内体条件下使所述靶标结合肽与所述靶标分子解结合、使所述细胞受体结合肽与所述细胞受体解结合或两者；以及降解所述靶标分子，从而治疗所述疾病或疾患。

在一些方面，所述靶标分子是细胞表面分子、生长因子受体、分泌肽、分泌蛋白、循环分子、细胞信号传导分子、细胞外基质大分子、神经递质、细胞因子、生长因子、肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原或激素、检查点抑制剂、免疫检查点抑制剂、抑制性免疫受体、抑制性免疫受体的配体、巨噬细胞表面蛋白、脂多糖、抗体、抑制性免疫受体、肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原或自身抗体。在一些方面，所述靶标分子是胶原蛋白、弹性蛋白、微原纤维蛋白、蛋白聚糖、CD200R、CD300a、CD300f、CEACAM1、FcgRiib、ILT-2、ILT-3、ILT-4、ILT-5、LAIR-1、PECAM-1、PILR-α、SIRL-1和SIRP-α、CLEC4A、Ly49Q、MIC、CD3、CD47、CD28、CD137、CD89、CD14、CD16、CD29、CD44、CD71、CD73、CD90、CD105、CD166、CD27、CD39、CD24、CD25、CD74、CD40L、MUC1、MUC16、MUC2、MUC5AC、MUC4、OX40、4-1BB、HLA-G、LAG3、Tim3、TIGIT、GITR、TCR、TNF-α、EGFR、EGFRvIII、TKI抗性EGFR、HER2、ERBB3、PDGFR、FGF、VEGF、VEGFR、IGFR1、CTLA4、STRO1、补体因子C4、补体因子C1q、补体因子C1s、补体因子C1r、补体因子C3、补体因子C3a、补体因子C3b、补体因子C5、补体因子C5a、TGFβ、PCSK9、P2Y6、HER3、RANK、tau、淀粉样蛋白β、亨廷顿蛋白、α-突触核蛋白、葡糖脑苷脂酶、α-葡糖苷酶、IL-1、IL-1R、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-10、IL-10R、IL-17、IL-23、IL-12、p40、B7家族的成员、c-Met、SIGLEC、MCP-1、MHC、MHCI、MHCII、PD-1或PD-L1。在一些方面，所述靶标分子是受体酪氨酸激酶。在一些方面，所述受体酪氨酸激酶是EGF受体、ErbB、胰岛素受体、PDGF受体、VEGF受体、FGF受体、CCK受体、NGF受体、HGF受体、Eph受体、AXL受体、TIE受体、RYK受体、DDR受体、RET受体、ROS受体、LTK受体、ROR受体、MuSK受体或LMR受体。在一些方面，所述靶标分子是病原体或病原体表面分子。

在一些方面，所述疾病或疾患是癌症、神经变性疾病、溶酶体贮积病、炎症性疾病、自身免疫性疾病、神经炎症性疾病、免疫疾病或疼痛。在一些方面，所述癌症是乳腺癌、肝癌、结肠癌、脑癌、白血病、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤、血细胞源性癌症、肺癌、肉瘤、胃癌、胃肠癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、非小细胞肺癌、鳞状非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、血癌、皮肤癌、肝癌、肾癌或结肠直肠癌。所述癌症是TKI耐药性的、西妥昔单抗耐药性的、耐昔妥珠单抗耐药性的或帕尼单抗耐药性的。在一些方面，所述癌症是晚期癌症、转移性癌症、中枢神经系统中的转移性癌症、转移性乳腺癌、转移性皮肤癌、难治性癌症、KRAS野生型癌症、KRAS突变型癌症或外显子20突变型非小细胞肺癌。在一些方面，所述靶标分子是HER2、EGFR、FGFR-1、PD-L1、VEGF、PD-1、CD38、GD2、SLAMF7、CTLA-4、CCR4、CD20、PDGFRɑ、VEGFR2、CD33、CD30、CD22、CD79B、粘连蛋白-4(Nectin-4)或TROP2。在一些方面，所述靶标分子是EGFR或PD-L1。在一些方面，所述方法还包括向所述受试者施用额外疗法。在一些方面，所述额外疗法包括放射、化学疗法、铂疗法或抗代谢疗法。在一些方面，所述额外疗法包括氟尿嘧啶、FOLFIRI、伊立替康、FOLFOX、吉西他滨或顺铂。

在一些方面，所述神经变性疾病是阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化症、弗里德赖希氏共济失调、亨廷顿氏病、帕金森氏病或脊髓性肌萎缩。在一些方面，所述靶标分子是tau、淀粉样蛋白β、亨廷顿蛋白或α-突触核蛋白。在一些方面，所述溶酶体贮积病是戈谢病或庞贝病。在一些方面，所述靶标分子是葡糖脑苷脂酶或α-葡糖苷酶。在一些方面，所述炎症性疾病是类风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化症、肾小球肾炎、狼疮、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、皮肤血管炎、神经炎症性疾病、炎症相关的神经变性、阿尔茨海默氏病、中风、创伤性脑损伤、斯耶格伦氏病或囊性纤维化。在一些方面，所述靶标分子是载脂蛋白E4、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-7、IL-12或IL-23。在一些方面，所述靶标分子是TNF-α。在一些方面，所述细胞是癌细胞、免疫细胞、中枢神经系统细胞、神经元细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞或嗜酸性粒细胞。

在一些方面，所述方法还包括在所述选择性耗竭复合物、所述靶标分子与所述细胞受体之间形成三元复合物。在一些方面，所述三元复合物的形成增加所述细胞受体、所述靶标分子或两者的再循环或周转。在一些方面，所述三元复合物的形成增加所述靶标分子与所述细胞受体的结合。

以引用的方式并入

本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请都以引用的方式并入本文，所述引用的程度就好像已具体地且单独地指出将每个单独的出版物、专利或专利申请以引用的方式并入一样。

附图说明

本发明的新颖特征具体阐述于随附权利要求书中。通过参考阐述其中利用本发明的原理的说明性实施方案的以下详细说明和附图，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在所述附图中：

图1A–图1G示出人可溶性转铁蛋白受体(hTfR)胞外域蛋白的考马斯染色凝胶，以及显示从高多样性汇合肽文库对结合至hTfR胞外域的细胞的连续富集的流式细胞术图。

图1A示出显示TfR的成功纯化的转铁蛋白受体(TfR)蛋白的考马斯染色凝胶。

图1B示出在一次流动分选后展示候选TfR结合肽的细胞的流式细胞术图。根据结合至用荧光链霉亲和素标记的TfR的能力对细胞进行分选。右上区域中的数据点代表通过荧光TfR-链霉亲和素的荧光定量的结合TfR的表达候选肽(通过GFP荧光定量)的细胞。

图1C示出在一次流动分选后展示候选TfR结合肽的细胞的阴性对照流式细胞术图。根据结合至用荧光链霉亲和素标记的对照蛋白质的能力对细胞进行染色。右上区域中的数据点代表通过荧光对照蛋白质-链霉亲和素的荧光定量的结合至阴性对照蛋白质的表达候选肽(通过GFP荧光定量)的细胞。

图1D示出在图1B中所示的第一细胞分选后，在第二流动分选后展示候选TfR结合肽的细胞的流式细胞术图。根据结合至用荧光链霉亲和素标记的TfR的能力对细胞进行分选。右上区域中的数据点代表通过荧光TfR-链霉亲和素的荧光定量的结合TfR的表达候选肽(通过GFP荧光定量)的细胞。

图1E示出在图1B和图1C中所示的第一细胞分选后，在第二流动分选后展示候选TfR结合肽的细胞的阴性对照流式细胞术图。根据结合至用荧光链霉亲和素标记的对照蛋白质的能力对细胞进行染色。右上区域中的数据点代表通过荧光对照蛋白质-链霉亲和素的荧光定量的结合至阴性对照蛋白质的表达候选肽(通过GFP荧光定量)的细胞。

图1F示出在图1D中所示的第二细胞分选后，在第三流动分选后展示候选TfR结合肽的细胞的流式细胞术图。根据结合至用荧光链霉亲和素标记的TfR的能力对细胞进行分选。右上区域中的数据点代表通过荧光TfR-链霉亲和素的荧光定量的结合TfR的表达候选肽(通过GFP荧光定量)的细胞。方框指示表达结合至TfR的肽的细胞。

图1G示出在图1D和图1E中所示的第二细胞分选后，在第三流动分选后展示候选TfR结合肽的细胞的阴性对照流式细胞术图。根据结合至用荧光链霉亲和素标记的对照蛋白质的能力对细胞进行染色。右上区域中的数据点代表通过荧光对照蛋白质-链霉亲和素的荧光定量的结合至阴性对照蛋白质的表达候选肽(通过GFP荧光定量)的细胞。方框指示表达结合至阴性对照蛋白质的肽的细胞。

图2A–图2D示出对展示单一克隆TfR结合肽并针对与TfR或阴性对照蛋白质的结合进行筛选以确认在图1A–图1G中鉴定的TfR结合肽与TfR的结合的细胞的流式细胞术。使用用链霉亲和素或抗His抗体标记的TfR或对照蛋白质进行流式细胞术，以验证结合不依赖于链霉亲和素标记。

图2A示出针对与标记的阴性对照蛋白质(y轴，用荧光抗His抗体染色)的结合进行筛选的表达SEQ ID NO:1的TfR结合肽(x轴，GFP)的细胞的阴性对照流式细胞术图。

图2B示出针对与TfR(y轴，用荧光抗His抗体染色)的结合进行筛选的表达SEQ IDNO:1的TfR结合肽(x轴，GFP)的细胞的流式细胞术图。方框指示表达TfR结合肽并结合至TfR的细胞。

图2C示出针对与标记的阴性对照蛋白质(y轴，用荧光链霉亲和素染色)的结合进行筛选的表达SEQ ID NO:1的TfR结合肽(x轴，GFP)的细胞的阴性对照流式细胞术图。

图2D示出针对与TfR(y轴，用荧光链霉亲和素染色)的结合进行筛选的表达SEQ IDNO:1的TfR结合肽(x轴，GFP)的细胞的流式细胞术图。方框指示表达TfR结合肽并结合至TfR的细胞。

图3A和图3B示出由排列来自位点饱和诱变(SSM)的富集变体产生的肽变体的TfR结合。每个图代表一轮完成的SSM，并且适用图内的每个阴影条形指示于开始所述轮SSM所采用的相应参考肽序列(图3A中的SEQ ID NO:1或图3B中的SEQ ID NO:2)相比，在条形下方表示的特定变体肽中的突变的数目。数据显示所鉴定的肽与TfR的相对结合亲和力，代表所采用的SSM的最后步骤，显示下一代分子。

图3A示出包含SEQ ID NO:3–SEQ ID NO:23的序列的变体的hTfR结合的水平，所述变体由用于具有SEQ ID NO:1的序列的肽的亲和力成熟的位点饱和诱变(SSM)获得。

图3B示出具有SEQ ID NO:24–SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:30–SEQ ID NO:32的序列的肽变体的hTfR结合的水平，所述变体由用于具有SEQ ID NO:2的序列的起始肽的亲和力成熟的位点饱和诱变(SSM)获得。

图4示出显示具有不同亲和力的TfR结合肽变体与TfR的结合的表面等离子体共振(SPR)曲线。对每种肽变体的解离动力学进行了定量。显示使用各自300nM的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:32与hTfR，随时间推移的表面等离子体共振(SPR)迹线。如通过SPR所评估，SEQ ID NO:32显示与TfR的最强结合。数据被归一化至每个迹线的最大响应。

图5示出显示不同浓度的具有SEQ ID NO:2的序列的肽的hTfR结合的表面等离子体共振(SPR)迹线。基于此数据，SEQ ID NO:2的肽的解离常数(K_D)被确定为8.7nM。

图6示出显示不同浓度的具有SEQ ID NO:4的序列的肽的hTfR结合的表面等离子体共振(SPR)迹线。基于此数据，SEQ ID NO:4的肽的解离常数(K_D)被确定为14.8nM。

图7示出根据表面等离子体共振(SPR)的SEQ ID NO:32与经捕获生物素化hTfR的结合的结合和单循环动力学数据。在2种密度的经捕获生物素化(Bt)-hTfR上注射5种浓度的具有SEQ ID NO:32的序列的肽(0.037nM、0.11nM、0.33nM、1nM、3nM)，并且进行整体分析。高密度和低密度运行的分析参数保持不变，并且来自两个通道的数据包括在同一分析中。基于此数据，SEQ ID NO:32的肽的解离常数(K_D)被确定为216pM，缔合速率(k_a)被确定为8.55x10⁶M^-1s^-1，并且解离速率(k_d)被确定为1.85x10^-3s^-1。

图8示出根据SPR的SEQ ID NO:30与经捕获生物素化hTfR的结合的结合和单循环动力学数据。在2种密度的经捕获Bt-hTfR上注射5种浓度的具有SEQ ID NO:30的序列的肽(0.037nM、0.11nM、0.33nM、1nM、3nM)，并且进行整体分析。高密度和低密度运行的分析参数保持不变，并且来自两个通道的数据包括在同一分析中。基于此数据，SEQ ID NO:30的肽的解离常数(K_D)被确定为486pM，缔合速率(k_a)被确定为8.57x10⁶M^-1s^-1，并且解离速率(k_d)被确定为4.16x10^-3s^-1。

图9A–图9C示出可溶性转铁蛋白受体(TfR)胞外域的纯化和测试以评估其是否将结合至转铁蛋白。

图9A示出全铁转铁蛋白或去铁转铁蛋白(Tf)与经纯化TfR胞外域的结合的表面等离子体共振(SPR)迹线。数据显示，全铁Tf结合TfR胞外域，但去铁Tf不结合，如通过全铁Tf而非去铁Tf随时间推移的响应(RU)增加所示。此数据证实用于筛选TfR结合CDP肽的可溶性TfR在细胞表面上包含TfR的内源性蛋白质结构，提供了结合剂可用于受体介导的内吞作用的数据。

图9B示出用于筛选和优化肽结合性质的载体展示支架和靶标啮合的示意图。在细胞表面上表达编码结合剂(例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:32)的GFP标记的构建体的表面展示载体(SDGF)。用荧光染料(“共染色剂”)标记的靶蛋白(例如TfR)结合至表面表达的结合剂。共染色剂的荧光强度用作肽对靶标的亲和力的量度，因为与表达对靶蛋白具有较低亲和力的肽的细胞相比，表达对靶蛋白具有高亲和力的肽的细胞将募集更多的共染色靶标。

图9C示出用于验证TfR结合对马丘波病毒糖蛋白(一种已知的TfR结合靶标)的特异性的流式细胞术，如通过结合的Alexa Fluor647-TfR(图9B中的共染色剂)的量所测量。用生物素化TfR和Alexa Fluor 647标记的链霉亲和素(Strep-647)、SDGF-MaCV细胞和Alexa Fluor 647标记的弹性蛋白酶、或SDGF-弹性蛋白酶抑制因子细胞和TfR+Strep-647的组合测试用马丘波病毒糖蛋白(SDGF-MaCV)转染的细胞。弹性蛋白酶和弹性蛋白酶抑制因子细胞缀合物未能结合细胞。这些结果表明，用于肽筛选的可溶性TfR包含内源性蛋白质结构，并且证明了TfR与其内源性配体结合的特异性以及SDGF作为鉴定新颖TfR结合配偶体的手段的效用。

图10A–图10C示出使用流式细胞术来鉴定与GFP融合的TfR结合胱氨酸密集肽(CDP，SEQ ID NO:32)与用链霉亲和素-AlexaFluor647(strep-647)标记的TfR在代表生理细胞外环境(pH7.4)或内体环境(pH 5.5)的pH条件下的结合的数据。

图10A示出用于测量TfR结合胱氨酸密集肽(CDP)(SEQ ID NO:32)与TfR在pH 7.4(代表生理细胞外环境)下的结合的结合测定中的流式细胞术结果。在pH 7.4下将表达SEQID NO:32的细胞用10nM TfR和10nM Strep-647染色。方框指示图10C中所示的定量中使用的“切片”门。

图10B示出用于测量TfR结合CDP(SEQ ID NO:32)与TfR在pH5.5下的结合的结合测定中的流式细胞术结果。在pH 5.5(代表内体环境)下将表达SEQ ID NO:32的细胞用10nMTfR和10nM Strep-647染色。方框指示图10C中所示的定量中使用的“切片”门。

图10C示出图10A中测量的TfR结合肽在pH 7.4下的标记效率和在图10B中测量的在pH 5.5下的标记效率的比较。结果表明，TfR结合胱氨酸密集肽(CDP，SEQ ID NO:32)的结合在生理细胞外条件和内体条件两者下均是稳健的和可比较的。

图11A示意性地示出开发用于选择性耗竭靶标分子的组合物的工作流程。通过用标记的靶标分子对含有靶标结合肽候选物的表达文库进行染色来鉴定靶标结合肽。来自文库的靶标结合肽通过来自结合的靶标分子的信号累积来区分。任选地，选择鉴定的靶标结合肽并进一步成熟以用于结合，例如使用点突变筛选。鉴定的靶标结合肽针对pH依赖性结合进行修饰，例如通过进行组氨酸点突变扫描，如图11D中所示。将所得pH依赖性靶标结合肽连接(例如，作为融合肽)至再循环物(recycler)(例如，TfR结合肽)，以形成选择性耗竭复合物。

图11B示意性地示出选择性耗竭复合物耗竭靶标(诸如来自细胞表面或培养基)的能力的体外验证。

图11C示意性地示出选择性耗竭复合物的表型筛选。可通过测试表达选择性耗竭复合物的细胞中的靶标耗竭来验证选择性耗竭复合物。可在健康细胞和在经转化细胞系中进一步测试复合物，以测量选择性耗竭复合物的疾病特异性功能性。可通过测试靶标特异性细胞功能(诸如细胞凋亡抑制剂耗竭后的癌症特异性生长抑制)的变化来测量复合物的特异性。

图11D示出用于将pH依赖性结合亲和力引入靶标结合肽中的组氨酸取代扫描的实例。显示PD-L1结合CDP(SEQ ID NO:187)的组氨酸取代扫描。肽序列在上方和侧面提供，并且每个黑框代表其中His可被取代的第一和第二位点。沿着对角线从左上至右下落下的那些代表单一His取代。可例如使用图11A中所示的工作流程生成并筛选含有鉴定的含组氨酸肽的肽文库。

图12A示意性地示出使用包含具有pH依赖性结合的靶标结合肽和TfR结合肽(诸如具有非pH依赖性结合的TfR结合肽)的组合物来选择性地耗竭可溶性靶标分子的方法。所述组合物结合至TfR和可溶性靶标分子，并经由转铁蛋白受体介导的内吞作用而被内吞。靶标分子在内吞区室酸化后释放，并且一些或全部靶标分子在溶酶体区室中降解。TfR和组合物再循环至细胞表面。

图12B示意性地示出使用包含具有pH依赖性结合的靶标结合肽和TfR结合肽(诸如具有非pH依赖性结合的TfR结合肽)的组合物来选择性地耗竭表面靶标分子的方法。所述组合物结合至TfR和表面靶标分子，并经由转铁蛋白受体介导的内吞作用而被内吞。靶标分子在内吞区室酸化后释放，并且一些或全部靶标分子在溶酶体区室中降解。TfR和组合物再循环至细胞表面。

图13A和图13B示出与血清白蛋白结合肽(SA21)融合的肽的产生和纯度。

图13A示出对应于SEQ ID NO:181的融合至血清白蛋白结合肽(SA21)的TfR结合肽的产生和纯度。SEQ ID NO:181的肽作为噬铁蛋白(SCN，SEQ ID NO:147)融合物产生，然后通过TEV从SCN裂解。在DTT还原性(“R”)或非还原性(“NR”)条件下，通过SDS-PAGE(左侧)和RP-HPLC(右侧)来验证纯度。还对未裂解的(“U”)噬铁蛋白-CDP融合肽运行SDS-PAGE。此数据表明成功产生了融合至SCN的SEQ ID NO:181，然后通过TEV裂解进行裂解，以产生SEQ IDNO:181的游离CDP融合物。

图13B示出对应于SEQ ID NO:182的融合至SA21的肽的产生和纯度。SEQ ID NO:182的肽作为SCN融合物产生，然后通过TEV从SCN裂解。在DTT还原性(“R”)或非还原性(“NR”)条件下，通过SDS-PAGE(左侧)和RP-HPLC(右侧)来验证纯度。还对未裂解的(“U”)噬铁蛋白-CDP融合肽运行SDS-PAGE。此数据表明成功产生了融合至SCN的SEQ ID NO:182，然后通过TEV裂解进行裂解，以产生SEQ ID NO:182的游离CDP融合物。

图14A示意性地示出含有经由双结毒素(DkTx)肽接头(SEQ ID NO:139，KKYKPYVPVTTN)连接至TfR结合CDP的靶标结合CDP的CDP-CDP二聚体。

图14B示意性地示出含有经由poly-GlySer接头(SEQ ID NO:138，GGGSGGGSGGGS)连接至TfR结合CDP的靶标结合CDP的CDP-CDP二聚体。

图14C示意性地示出含有经由在位置5具有Cys至Ser突变的人IgG接头(SEQ IDNO:140，EPKSSDKTHT)连接至TfR结合CDP的靶标结合CDP的CDP-CDP二聚体。

图15示意性地示出经由Fc双特异性二聚体非共价连接至靶标结合肽的TfR结合肽。

图16A示意性地示出TfR结合肽和靶标结合肽融合物，其在靶标结合肽与TfR结合肽之间含有白蛋白结合蛋白(例如，SEQ ID NO:192)并且通过肽接头(例如，SEQ ID NO:129–SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:195–SEQ ID NO:218中的任一个)分隔。

图16B示意性地示出TfR结合肽和靶标结合肽融合物，其含有通过肽接头(例如，SEQ ID NO:129–SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:195–SEQ ID NO:218中的任一个)融合至靶标结合肽的白蛋白结合蛋白(例如，SEQ ID NO:192)。

图16C示意性地示出TfR结合肽和靶标结合肽融合物，其含有通过肽接头(例如，SEQ ID NO:129–SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:195–SEQ ID NO:218中的任一个)融合至TfR结合肽的白蛋白结合蛋白(例如，SEQ ID NO:192)。

图17A示出表达的和TEV裂解的CDP-CDP二聚体的SDS-PAGE凝胶，所述二聚体含有经由DkTx接头(SEQ ID NO:139)或GS3接头(SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:195–SEQ ID NO:218)融合至离子通道抑制性CDP(Z1E-AnTx、Z1P-AnTx、EWSS-ShK、HsTx、Pro-Vm24或Vm24)的TfR结合肽(SEQ ID NO:2)。TEV裂解后的表达产物含有SCN-CDP二聚体、SCN和CDP二聚体。每块凝胶上存在的二聚体的条带用矩形表示。这证明CDP二聚体已成功表达并从SCN裂解。每块凝胶从左至右含有分子量后者(“L”)、非还原条件下的肽样品(“NR”)和还原条件下的肽样品(“R”)。

图17B示出TfR结合肽(SEQ ID NO:32，上)、Vm24离子通道抑制肽(中)以及含有融合至Vm25离子通道抑制肽的TfR结合肽的CDP-CDP二聚体(下)的SDS-PAGE(左)、RP-HPLC(中)和通道抑制测定(右)。“折叠”指示样品是在非还原条件下进行分析的，并且“未折叠”指示样品是在还原条件下进行分析的。此数据表明靶标结合CDP(此处为离子通道抑制CDP)可与TfR结合肽(诸如SEQ ID NO:32)二聚化，可表达、折叠并纯化，并且靶标结合CDP在与TfR结合CDP的二聚体中时可维持其靶标结合功能(此处所示的功能是离子通道抑制)。

图18A–图18D示出流式染色数据，所述数据说明TfR结合肽在细胞表面结合测定中与鼠TfR(mTfR)具有交叉反应性。用经AlexaFluor 647染料直接标记的可溶性TfR结合肽染色从它们的表面表达人或小鼠TfR的293F细胞。这表明TfR结合肽结合人(hTfR，SEQ ID NO:190)和鼠TfR两者。

图18A示出在这些实验中使用的TfR(在这种情况下是人TfR)的物种特异性。数据展示为两个地形密度图，并且指示用抗hTfR(CD71)抗体染色的转铁蛋白的流式细胞术数据。从左下至右上以对角方式定向的上密度图描绘293ST+SDGF-hTfR。水平定向的下密度图描绘293ST+SDGF-mTfR。y轴显示从0至10⁷的hTfR+链霉亲和素，采用根据对数标度的10倍增量。x轴显示从0至10⁶的GFP，采用根据对数标度的10倍增量。

图18B示出在这些实验中使用的TfR(在这种情况下是鼠TfR)的物种特异性。数据展示为两个地形密度图，并且指示用抗mTfR(CD71)抗体染色的转铁蛋白的流式细胞术数据。从左下至右上以对角方式定向的上密度图描绘293ST+SDGF-mTfR。具有三个叶的下密度图描绘293ST+SDGF-hTfR。y轴显示从10^-4至10⁷的hTfR+链霉亲和素，采用根据对数标度的10倍增量。x轴显示从0至10⁶的GFP，采用根据对数标度的10倍增量。

图18C示出具有SEQ ID NO:1的序列的肽、具有SEQ ID NO:2的序列的肽、具有SEQID NO:30的序列的肽、以及具有SEQ ID NO:32的序列的肽与人TfR的结合的定量。数据显示为四个地形密度图，并且指示使用293ST细胞+SDGF-hTFR获得的流式细胞术数据。三个密度图看起来几乎叠加，并且定向在第四密度图的上方。下密度图以水平方式定向，并且描绘SEQ ID NO:1(第1代)。三个上密度图从左下至右上以对角方式定向。略微在其他两个密度图的上方的密度图对应于SEQ ID NO:32(第3代)。略微在其他两个密度图的下方的密度图对应于SEQ ID NO:2(第2代)。第三密度图对应于SEQ ID NO:30(第3代)。此数据说明具有SEQ ID NO:1的序列的肽、具有SEQ ID NO:2的序列的肽、具有SEQ ID NO:30的序列的肽、以及具有SEQ ID NO:32的序列的肽结合人TfR，而具有SEQ ID NO:1的序列的肽相对于所测试的其他三种肽具有较弱结合。y轴显示从0至10⁷的hTfR+链霉亲和素，采用根据对数标度的10倍增量。x轴显示从0至10⁶的GFP，采用根据对数标度的10倍增量。

图18D示出具有SEQ ID NO:1的序列的肽、具有SEQ ID NO:2的序列的肽、具有SEQID NO:30的序列的肽、以及具有SEQ ID NO:32的序列的肽与鼠TfR的结合的定量。数据显示为四个地形密度图，并且指示使用293ST细胞+SDGF-mTFR获得的流式细胞术数据。三个密度图看起来几乎叠加，并且定向在第四密度图的上方。下密度图以水平方式定向，并且描绘SEQ ID NO:1(第1代)。三个上密度图从左下至右上以对角方式定向。略微在其他两个密度图的上方的密度图对应于SEQ ID NO:32(第3代)。略微在其他两个密度图的下方的密度图对应于SEQ ID NO:2(第2代)。第三密度图对应于SEQ ID NO:30(第3代)。此数据说明具有SEQ ID NO:2的序列的肽、具有SEQ ID NO:30的序列的肽、以及具有SEQ ID NO:32的序列的肽结合鼠TfR，而具有SEQ ID NO:1的序列的肽在所测试的条件下未显示与mTfR的结合。y轴显示从0至10⁷的hTfR+链霉亲和素，采用根据对数标度的10倍增量。x轴显示从0至10⁶的GFP，采用根据对数标度的10倍增量。

图19A和图19B示出在CRE-荧光素酶(CRE-Luc)小鼠中以及在哺乳动物细胞两者中均诱导在神经降压素受体(NTSR)下游的I P₁响应的CDP-NT肽复合物。

图19A示出在CRE-Luc小鼠中影响CRE驱动的荧光素酶的相关途径。PLC表示磷脂酶C。AC表示腺苷酰基环化酶。CaMK表示钙调蛋白依赖性蛋白质激酶。CREB表示cAMP响应元件结合蛋白。PKA表示蛋白质激酶A。PDE表示cAMP磷酸二酯酶。FS表示毛喉素。Ro l表示咯利普兰。GPCR表示G蛋白偶联受体。

图19B示出说明体外神经降压素(NT)受体啮合的FRET数据，所述啮合显示在表达NTSR1的HEK-293细胞中仅响应于NT或NT肽复合物的IP₁累积。使用测定试剂盒(CisBio62IPAPEB)，以FRET比率的示值读数来测量IP₁。对于除媒介物之外的所有条件，N＝3个孔，所述媒介物具有N＝36。水平条形指示样品平均值。mTF＝鼠转铁蛋白。基线HEK293＝作为参考包括的不表达NTSR1的HEK293细胞的平均测定值(N＝36个孔)。

图20A示意性地示出在EGFR驱动的癌细胞中对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)或抗EGFR抗体疗法(例如，西妥昔单抗)的抗性机制。具有正常EGFR的EGFR驱动的癌细胞(图1)对抗EGFR抗体和酪氨酸激酶抑制剂两者均敏感，导致响应于任一治疗的下游KRAS和MEK信号传导减少(由灰色虚线箭头指示)。EGFR中阻止TKI结合的突变(图2)对TKI具有抗性，显示响应于TKI治疗的下游信号传导很少或没有变化(通过实心黑色箭头指示)；TKI抗性EGFR驱动的癌细胞可能仍对抗EGFR抗体敏感。与其他相关生长因子受体(例如，HER2、ERBB3或MET)异二聚化并通过其交叉激活导致其中二聚化配偶体过度表达(图3)的EGFR驱动的癌细胞对抗EGFR抗体和TKI中的一者或两者不敏感。其中EGFR具有组成性活性的EGFR驱动的癌细胞(图4)，诸如EGFR变体III(EGFRvIII)对阻止EGFR的二聚化驱动激活的抗EGFR抗体不敏感；具有组成性活性EGFR的细胞可能仍对TKI敏感。

图20B示意性地示出使用选择性耗竭复合物(SDC)来克服EGFR驱动的癌细胞中的抗性机制。这表明SDC可有效对抗EGFR驱动的癌症，包括具有正常EGFR的那些癌症或癌细胞以及对TKI或EGFR抗体疗法具有抗性的那些癌症或癌细胞。EGFR驱动的癌细胞中具有正常EGFR的EGFR驱动的癌细胞(图1)被SDC有效耗竭，导致响应于SDC治疗的下游KRAS和MEK信号传导减少(由灰色虚线箭头指示)。阻止TKI结合的突变型EGFR(图2)被SDC有效耗竭，导致响应于SDC治疗的下游KRAS和MEK信号传导减少。与过度表达的生长因子受体(例如，HER2、ERBB3或MET，图3)异二聚化并被其交叉激活的EGFR被SDC有效耗竭，导致响应于SDC治疗的下游KRAS和MEK信号传导减少。异二聚化EGFR的耗竭也有可能耗竭异二聚化配偶体(例如，HER2、ERBB3或MET，图3)。组成性活性EGFR(图4)，诸如EGFRvIII被SDC有效耗竭，导致响应于SDC治疗的下游KRAS和MEK信号传导减少。

图21示出流动分选数据，其说明具有与PD-L1的pH依赖性结合的肽的富集。此数据表明可通过流动分选生成pH依赖性结合肽。筛选如图11D中所述制备的基于PD-L1结合肽(SEQ ID NO:187)的组氨酸掺杂文库中在中性pH(7.4)下表现出较强PD-L1结合和在酸性pH(5.5)下表现出较弱结合的肽。将输入文库针对在pH 7.4下的高PD-L1结合进行初始筛选。第二轮和第三轮筛选(分别“分选1”和“分选2”)在pH 5.5下进行以模拟内体pH，在此pH下富集较差PD-L1结合。最后一轮筛选(“分选3”)在pH 7.4下进行。筛选后观察到在pH 7.4和pH5.5下的差异结合(“分选4”)。每个图中5边多边形所涵盖的区域表示在分选过程中选择的群体。较暗的地形密度图指示在pH7.4条件下用PD-L1染色，并且较浅的地形密度图表示在pH 5.5条件下用PD-L1染色。

图22示出图21中鉴定的pH依赖性PD-L1结合肽变体在pH 7.4(左侧条)和pH 5.5(右侧条)下的结合数据。针对与PD-L1的pH依赖性结合筛选具有单独的或组合的E2H、M13H和K16H取代的SEQ ID NO:187的变体。在E2H(SEQ ID NO:234)、M13H(SEQ ID NO:235)、K16H(SEQ ID NO:236)、E2H和M13H(SEQ ID NO:237)、E2H和K16H(SEQ ID NO:233)、M13H和K16H(SEQ ID NO:238)或E2H、M13H和K16H(SEQ ID NO:239)处含有取代的肽变体表现出不同程度的与PD-L1的pH依赖性结合。“UTF”指示未转染的细胞(阴性对照)。亲本肽(SEQ ID NO:187)表现出一定程度的与PD-L1的pH依赖性结合。SEQ ID NO:187的一些变体在PD-L1结合中表现出比亲本更大的pH依赖性，而SEQ ID NO:187的一些变体在PD-L1结合中表现出比亲本更小的pH依赖性。SEQ ID NO:234的肽显示在pH 7.4对比pH 5.5下的结合中具有高差异，表明在pH 7.4下的结合比在pH 5.5下的结合更高。SEQ ID NO:233的肽(黑色箭头)显示在pH 7.4对比pH 5.5下的结合中具有特别高的差异，也表明在pH 7.4下的结合比在pH 5.5下的结合更高。此数据说明在pH 7.4下以较高水平结合PD-L1并在pH 5.5下以较低水平结合PD-L1的肽的生成。

图23A示意性地示出选择性耗竭复合物的结构域构型，诸如在图23B和图23C中所示的测定中使用的那些。选择性耗竭复合物从N末端至C末端含有靶标结合肽、第一肽接头(GGGGSx4，SEQ ID NO:224)、白蛋白结合肽(SEQ ID NO:227)、第二肽接头(GGGGSx4，SEQ IDNO:224)和TfR结合肽。

图23B示出如图23A中所示安排的两种纯化的选择性耗竭复合物和两种阴性对照复合物的SDS-PAGE凝胶，其中TfR结合肽被不结合TfR的肽替代。肽1(SEQ ID NO:367)含有结合EGFR的靶标结合肽(SEQ ID NO:244)和对应于SEQ ID NO:232的不显著结合TfR的肽。肽2(SEQ ID NO:328)含有结合EGFR的靶标结合肽(SEQ ID NO:244)和对应于SEQ ID NO:96的高亲和力TfR结合肽。肽3(SEQ ID NO:357)含有结合PD-L1的靶标结合肽(SEQ ID NO:187)和对应于SEQ IDNO:232的不显著结合TfR的肽。肽4(SEQ ID NO:356)含有结合PD-L1的靶标结合肽(SEQ ID NO:187)和对应于SEQ ID NO:96的高亲和力TfR结合肽。此数据指示这些肽的产生和纯度。

图23C示出图23B中所示的四种肽复合物与表达EGFR(左)或PD-L1(右)的细胞的三元复合物形成。用荧光标记的TfR对细胞进行染色，以检测细胞表面上表达的靶蛋白、肽复合物与TfR之间的三元复合物形成。含有EGFR结合肽和高亲和力TfR结合肽的肽2(SEQ IDNO:328)与表达EGFR的细胞形成三元复合物，但不与表达PD-L1的细胞形成三元复合物。含有PD-L1结合肽和高亲和力TfR结合肽的肽4(SEQ ID NO:356)与表达PD-L1的细胞形成三元复合物，但不与表达EGFR的细胞形成三元复合物。不含高亲和力TfR结合肽的肽1和3未形成三元复合物。此数据表明含有靶标结合肽和TfR结合肽的肽复合物可在细胞表面与靶标和TfR形成三元复合物。

图24A示意性地示出选择性耗竭复合物(SDC，含有靶标结合肽、受体结合肽和His标签(SEQ ID NO:228))、在细胞表面上表达的靶蛋白和在细胞表面上表达的转铁蛋白受体之间的三元复合物形成。

图24B示出具有(+)或不具有(-)结合PD-L1的靶标结合肽(SEQ ID NO:187，“PDL1”)和具有或不具有结合TfR的受体结合肽(SEQ ID NO:96，“TfR”)的肽复合物与表达TfR且表达或不表达PD-L1(“PDL1”)的细胞的结合数据。所有肽复合物都含有His标签(SEQID NO:228)。第1条形对应于PBS阴性对照，没有肽复合物。使用SEQ ID NO:357的肽复合物测量第2条形和第3条形。使用能够结合PD-L1和TfR两者的SEQ ID NO:356的肽复合物测量第4条形和第5条形。含有PD-L1结合肽和TfR结合肽两者的肽复合物可以是选择性耗竭复合物(SDC)。使用与肽复合物上的His-标签结合的荧光抗His抗体测量结合。使用结合表达PD-L1和TfR两者的细胞上的PD-L1和TfR两者的SDC观察到了高水平的结合。此数据表明，当细胞表达靶标和受体两者时，含有针对靶标和受体两者的结合肽的SDC将以高水平结合至所述细胞(第5条形)。数据还表明，结合TfR的肽复合物将结合至表达TfR的细胞(第4条形)，即使添加表面靶标结合剂增加SDC结合(第5条形)，这可能是由于协同结合。协同结合也可能通过使用具有两个TfR结合肽的SDC来实现。

图25A示意性地示出含有单个靶标结合部分(在此实例中为EGFR结合纳米抗体或PD-L1结合CDP)和单个受体结合部分(在此实施例中为TfR结合CDP或scFv)的单价选择性耗竭复合物的实例。它们可安排在单一蛋白质中，其中两个部分由接头分隔，或者安排为二聚体复合物，其中一个单体含有TfR结合部分，并且另一个含有靶标结合部分。活性催化分子是TfR结合部分以非pH依赖性方式结合并且靶标结合部分以pH依赖性方式结合的那些分子。活性非催化分子是TfR结合部分以pH依赖性方式结合并且靶标结合部分以非pH依赖性方式结合的那些分子。将预期活性催化分子或活性非催化分子引起其靶标的选择性耗竭；非催化分子将与靶标一起沿着内体降解途径行进，而催化分子将跟随TfR回到细胞表面以结合另一个靶标。代表性对照分子是其中TfR结合部分和靶标结合部分两者均以非pH依赖性方式结合但预期不会如活性催化分子或活性非催化分子一样有效地或相同程度地引起其靶标的选择性耗竭、或者根本不会或不会以显著方式引起靶标的选择性耗竭的那些分子。其他对照可用于评估活性催化分子或活性非催化分子的TfR依赖性，并且可包括比较性地测量不结合TfR的分子的耗竭，预期所述对照不会如活性催化分子或活性非催化分子一样有效地或相同程度地引起其靶标的选择性耗竭、或者根本不会或不会以显著方式引起靶标的选择性耗竭。

图25B示意性地示出对TfR结合和/或靶标结合具有不同价态的选择性耗竭复合物的实例。所述图说明Fc融合物，其中TfR结合部分(在这种情况下为非pH依赖性TfR结合CDP)可在分子中存在一次(单价)或在分子中存在两次(二价)，并且靶标结合部分(在这种情况下为pH依赖性EGFR结合纳米抗体)可在分子中存在一次(单价)或在分子中存在两次(二价)。其中两个单体不相同的Fc融合物可经由孔中钮(knob-i n-ho l es)(KI H)二聚化进行组装。多价选择性耗竭复合物也可表达为单一多肽链(未示出)。

图26A示出结合至PD-L1或与PD-L1(表面，其中浅色阴影表示氧并且深色阴影表示氮)对接的高亲和力PD-L1结合CDP(SEQ ID NO:187，草图)的共晶结构。

图26B示出在解析的(R)残基或未解析的(UR)残基中含有氨基酸取代的PD-L1结合CDP变体的相对结合富集(显示为平均SSM富集的绝对值)，如图26A的共晶结构中所见。与未解析的残基处的取代相比，解析的残基处的取代对结合的影响更大(正面或负面)(**：P＝0.0055)，这表明与未解析的残基相比，解析的残基在与PD-L1的相互作用中发挥更大的作用。

图26C示出PD-1(网格)与SEQ ID NO:187(草图)在与PD-L1(表面，其中浅色阴影表示氧并且深色阴影表示氮)的结合界面处的叠加。PD-1结合位点与SEQ ID NO:187重叠，表明预期SEQ ID NO:187将与PD-1竞争结合至PD-L1。

图26D示出从两个不同角度的图26A的SEQ ID NO:187PD-L1共晶结构的放大视图。与PD-L1相互作用的SEQ ID NO:187的残基(包括K5、V9、W12、M13、K16、V39、F40、L43和D44)显示为棒。还标记了与SEQ ID NO:187相互作用的PD-L1的残基，包括Y56、Q66、R113、M115、A121和Y123。

图26E示出相对于亲本CDP(黑色，最小碰撞旋转异构体)，在PD-L1结合界面处SEQID NO:187(灰色)中所选择残基的分离的侧链。SEQ ID NO:187的标记残基(包括M13、V39、F40和L43)对应于相对于亲本CDP的取代，所述取代改善了与PD-L1的结合。

图26F示出SEQ ID NO:187(草图)与PD-L1(表面)之间的结合界面的放大视图。PD-L1表面针对人(Hs)对比鼠(Mm)同源性进行了颜色编码，其中白色对应于相同残基，深色阴影对应于相似残基，并且浅色阴影对应于不同的残基。人与鼠PD-L1之间的结合界面中的这些差异与在SEQ ID NO:187的情况下所观察到的鼠PD-L1交叉反应性的缺乏一致。

图26G示出SEQ ID NO:187和PD-L1的共晶结构，其中SEQ ID NO:187显示为线图，其中目标侧链用粗棒显示(上图)。PD-1与PD-L1的结合显示在下图以供比较。

具体实施方式

本文描述了使用细胞内吞途径(例如，转铁蛋白受体介导的内吞作用)选择性耗竭靶标分子的组合物和方法。细胞外、可溶性和细胞表面蛋白介导细胞与器官之间的信号传导，包括生长、细胞死亡、炎症、代谢等。此类蛋白质通过产生、使用和降解定期循环，并且它们的降解通常在内体-溶酶体途径内进行。在此途径中，含有从细胞外空间吸收的物质的胞吞泡以及包埋的膜蛋白变得酸化并与含有降解此类蛋白质的酶的溶酶体融合或进入所述溶酶体。经由选择性递送至溶酶体从循环或疾病相关组织中选择性除去某些细胞表面或可溶性蛋白可用于治疗疾病病状，包括由可溶性或细胞表面蛋白的过度表达或累积引起的疾病或与可溶性或表面蛋白中的突变(例如，导致组成性活性、对治疗的抗性或显性负活性的突变)相关的疾病。可替代地或此外，本文所述的选择性耗竭复合物可用于将施用的治疗性药物递送至内体或溶酶体区室，例如以治疗溶酶体贮积病，如戈谢病(葡糖脑苷脂酶缺乏症)或庞贝病(α-葡糖苷酶缺乏症)。治疗性分子(例如，用于酶替代疗法的溶酶体酶)可与包含结合治疗性分子的靶标结合肽的选择性耗竭复合物一起施用，从而将所述治疗性分子递送至内体或溶酶体。在一些实施方案中，选择性耗竭构建体可用作选择性递送复合物并促进活性酶递送至内体或溶酶体。例如，溶酶体酶可使用选择性耗竭复合物递送，并且可在内体或溶酶体中保留酶活性。相对于单独施用溶酶体酶，施用溶酶体酶与包含结合溶酶体酶的靶标结合肽的选择性耗竭复合物的组合可增加每剂量所施用的酶的治疗反应。对于靶蛋白的选择性耗竭或溶酶体蛋白的递送，溶酶体递送可通过利用现有的蛋白质摄取和再循环机制以及将pH依赖性结合结构域工程化为靶标结合分子来实现。

可用于选择性耗竭靶标分子的内吞途径的独特实例是经由转铁蛋白受体(TfR)内化和运输，其通常用于经由转铁蛋白受体(TfR)的转铁蛋白再循环以将铁递送至细胞和组织。转铁蛋白被称为铁离子的血清伴侣，旨在用于氧化还原敏感性细胞内酶。载铁转铁蛋白(全铁转铁蛋白)经由与TfR的特异性结合将铁递送至细胞，铁然后被运输至内体，在内体中通过天然质子泵降低pH。在酸性条件下，转铁蛋白失去其铁结合亲和力，从而将铁释放在细胞内部，但保持其TfR结合亲和力。TfR:转铁蛋白复合物自然再循环回到细胞表面，从而将转铁蛋白暴露于中性pH条件。未与铁结合的转铁蛋白(去铁转铁蛋白)在细胞表面处的中性pH条件下不再具有TfR亲和力，并被释放回到循环中以吸收更多的铁，并重复所述过程，这本质上是铁递送至细胞的催化过程。

本公开的组合物和方法利用转铁蛋白受体内吞和再循环途径将靶标分子(例如，可溶性或细胞表面蛋白)递送至胞吞泡用于溶酶体降解。本公开的组合物和方法可用于选择性地降解经由这种途径在疾病中过度表达的特定靶受体或可溶性蛋白。由于靶受体或可溶性蛋白的溶酶体降解，所述组合物和方法有效地减少、降低、消除或耗竭来自细胞表面的靶受体或循环中的可溶性蛋白，这在如本文所述的医学中具有许多应用。本公开的包含偶联至靶标结合肽(例如，靶标结合胱氨酸密集肽、靶标结合抗体、靶标结合纳米抗体、靶标结合抗体片段或其他靶向剂)的TfR结合肽(例如，TfR结合胱氨酸密集肽)的选择性耗竭复合物可通过结合至TfR(经由TfR结合肽)和靶标(经由靶标结合肽)两者而将靶标分子募集至TfR。在内吞作用下，TfR可将选择性耗竭复合物和靶标分子携带至胞吞泡中。在一些实施方案中，选择性耗竭复合物的TfR结合肽在细胞外pH(约pH 7.4)至内体pH(约pH 5.5)(包括端值)下可对TfR具有高亲和力。TfR结合肽在内化后和内体区室酸化时可保持其对TfR的亲和力。选择性耗竭复合物的靶标结合肽在细胞外pH下可对靶标分子具有较高亲和力，并且在较低内体pH下可对靶标分子具有较低亲和力。在胞吞泡内部，选择性耗竭复合物可保持与TfR结合并在内体酸化后释放靶标分子。一旦靶标被释放，选择性耗竭复合物就可保持与TfR结合，同时TfR再循环至细胞表面以重新负载另一个靶标分子，并且靶标分子可保留在内体中，在内体中靶标分子被递送至溶酶体并且被降解。在一些实施方案中，选择性耗竭复合物的TfR结合肽在细胞外pH下可对TfR具有较高亲和力，并且在较低内体pH下可对靶标分子具有较低亲和力。在胞吞泡内部，选择性耗竭复合物可在内体酸化后从TfR释放。

本公开的方法可包括使细胞(例如，表达TfR的细胞)与选择性耗竭复合物(例如，包含TfR结合肽和靶标结合肽的分子)接触。选择性耗竭复合物可经由转铁蛋白受体介导的(TfR介导的)内吞作用将靶标分子募集至胞吞泡中。靶标分子可释放在胞吞泡中，在胞吞泡中靶标分子被递送至溶酶体并且被降解。选择性耗竭复合物可保持与TfR结合，并且可在TfR再循环至细胞表面时保持与TfR结合。此类方法可用于耗竭靶标分子，诸如与疾病或疾患相关的分子。例如，本公开的方法可用于选择性地耗竭过度表达的、含有疾病相关突变(例如，导致组成性活性、对治疗的抗性或显性负活性的突变)或在疾病或疾患中累积的可溶性蛋白或细胞表面蛋白。

在一些实施方案中，当前描述的选择性耗竭复合物可包括肽缀合物、肽复合物、肽构建体、融合肽或融合分子，诸如分别通过任何分子类型诸如小分子、肽或蛋白质的化学缀合，或通过肽或蛋白质的重组融合来连接(例如肽构建体或肽复合物)。术语“融合肽”和“肽融合物”在本文中可互换使用。在一些实施方案中，肽构建体或肽复合物可以生物方式或以合成方式产生。因此，在一些情况下，选择性耗竭复合物可包含连接至另一分子或另一组分子诸如小分子、肽，或蛋白质或其他大分子诸如纳米颗粒的TfR结合肽结构域。

在一些实施方案中，当前描述的选择性耗竭复合物可以是包含缀合至、连接至或融合至一种或多种靶标结合肽、一种或多种活性剂(例如，治疗剂、可检测剂或其组合)或其组合的一种或多种如本文所述的TfR结合肽的肽复合物。如本文所述的选择性耗竭复合物可包括化学缀合物和重组融合分子。在一些情况下，化学缀合物可包含化学缀合至或连接至另一肽(例如，靶标结合肽)、分子、剂或其组合的如本文所述的TfR结合肽。分子可包括小分子、肽、多肽、蛋白质，或其他大分子(例如纳米颗粒)和聚合物(例如核酸、聚赖氨酸或聚乙二醇)。在一些情况下，本公开的TfR结合肽经由接头缀合至另一肽或分子。接头部分可包括可裂解(例如，pH敏感性或酶不稳定性接头)或稳定接头。在一些实施方案中，肽复合物是可重组表达的融合分子(例如，融合肽或融合蛋白)，并且其中所述融合分子可包含融合至一种或多种其他分子肽、多肽、蛋白质或可重组表达的其他大分子的一个或多个TfR结合肽。

与降解且未再循环至细胞表面的溶酶体递送分子相比，本公开的选择性耗竭复合物(例如，包含TfR结合肽和靶标结合肽的复合物)可在较低剂量下具有治疗作用或具有更持久的治疗作用。本公开的选择性耗竭复合物不是在溶酶体中降解，而是可再循环回到细胞表面以“重新负载”靶标，这意味着本公开的一种选择性耗竭复合物的潜力可以潜在催化作用驱动多个靶标分子的降解。未再循环至细胞表面的溶酶体递送分子本身可被降解或可在溶酶体中累积而不被重新使用或“重新负载”。与未再循环至细胞表面的溶酶体递送分子相比，本公开的选择性耗竭复合物(例如，包含TfR结合肽和靶标结合肽的复合物)可具有更宽的治疗窗(即剂量，高于所述剂量观察到治疗性药效学反应但低于所述剂量观察到毒性)。药物(例如，本公开的选择性耗竭复合物)的治疗窗是药物有效且不具有不可接受的毒性作用的剂量范围。本公开的选择性耗竭复合物(例如，包含TfR结合肽和靶标结合肽的复合物)可以较小的毒性风险使用。与未再循环至细胞表面的替代疗法(例如，溶酶体递送分子)相比，本公开的选择性耗竭复合物(例如，包含TfR结合肽和靶标结合肽的复合物)可以更低的摩尔剂量使用。由于本公开的选择性耗竭复合物在细胞中的选择性和可重复使用性质，所以作为治疗剂，它们有利地不像靶向溶酶体的不可再循环递送组合物(其在使用时耗竭)那样迅速耗竭。此外，由于本公开的选择性耗竭复合物的选择性和再循环方面，所以作为治疗剂，它们有利地比非选择性治疗剂毒性更低。这对于在治疗剂可能是非选择性的和高毒性的并且对正常细胞、器官和组织表现出有害副作用或者需要低于有效治疗剂量且减轻、治愈、消除疾病的能力较低的癌症中的应用特别有利。

与含有糖、聚糖、含糖样分子的聚合物或其他衍生物的替代疗法(例如，溶酶体递送分子)相比，本公开的选择性耗竭复合物(例如，包含TfR结合肽和靶标结合肽的复合物)可具有更低的免疫原性。与靶向甘露糖-6-磷酸受体或去唾液酸糖蛋白受体的替代疗法(例如，溶酶体递送分子)相比，本公开的选择性耗竭复合物可具有更低的免疫原性。本公开的选择性耗竭复合物可通过单一重组表达来制造，并且与具有多个合成步骤来产生甘露糖-6-磷酸受体或去唾液酸糖蛋白受体的配体的分子相比，可具有改进的制造产率、纯度、成本或制造时间。本公开的选择性耗竭复合物可具有更大的治疗作用或更低的治疗剂量，因为能够设计接头以使同时结合TfR和靶标的能力最大化，包括结合在细胞表面中的靶标。相较于基于TfR结合抗体的治疗剂，本公开的TfR结合肽、TfR结合肽缀合物或TfR结合融合肽可具有更少的触发适应性免疫反应的表位，从而导致免疫原性降低。相较于基于TfR结合抗体的治疗剂，本公开的TfR结合肽、TfR结合肽缀合物或TfR结合融合肽可展现活性剂更容易并且以更小破坏性并入至蛋白质融合复合物中。相较于基于TfR结合抗体的治疗剂，本公开的TfR结合肽、TfR结合肽缀合物或TfR结合融合肽可具有更小表面积，从而导致更低的脱靶结合风险。与基于TfR结合抗体的治疗剂相比，本公开的TfR结合肽、TfR结合肽缀合物或TfR结合融合肽由于其较低的分子量、较低的流体动力学半径或较低的摩尔溶液粘度而可以更高的摩尔浓度配制。

在一些实施方案中，当在相同摩尔剂量下或在类似有效剂量下施用至受试者时，与抗TfR抗体或其他治疗剂相比，本公开的TfR结合肽、TfR结合肽缀合物或TfR结合融合肽展现更低中靶毒性。在一些实施方案中，当在相同摩尔剂量或类似有效剂量下施用至受试者时，与抗体或其他治疗剂相比，TfR结合肽、TfR结合肽缀合物或TfR结合融合肽展现更低脱靶毒性。举例来说，与抗体相比，本公开的TfR结合肽、TfR结合肽缀合物或TfR结合融合肽可在约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍高的摩尔剂量下施用至受试者，同时提供类似或更低的观察到的毒性。在一些实施方案中，当在以重量计与抗TfR抗体或其他治疗剂相同的剂量下施用至受试者时，与所述抗TfR抗体或其他治疗剂相比，本公开的TfR结合肽、TfR结合肽缀合物或TfR结合融合肽展现更高功效。本公开的TfR结合肽在融合至半衰期延长部分(例如Fc、SA21、PEG)时可在甚至更低剂量下递送，同时保持活性和功效，并且因此，远远胜过施用抗TfR抗体或其他治疗剂。

在一些实施方案中，本公开提供了结合至TfR的肽(例如CDP、打结肽或套结素)、化学缀合物(例如包含一种或多种TfR结合肽和一种或多种活性剂)、或重组表达的融合分子(例如包含一种或多种TfR结合肽和一种或多种活性剂)。TfR结合肽可以是胱氨酸密集肽(CDP)。术语“肽”、“小蛋白”、“蛋白质”、“CDP”、“TfR结合肽”、“TfR结合CDP”、“TfR结合肽”和“经工程化TfR结合肽”在本文中可互换使用。本公开中所述的肽与TfR的结合可有助于选择性耗竭复合物、肽、肽复合物或肽构建体(例如融合蛋白，或缀合至、连接至或融合至剂的肽)穿过细胞屏障(例如BBB)的胞吞转运。本公开中所述的肽与TfR的结合可促进选择性耗竭复合物、肽或肽复合物在表达TfR的任何细胞中或在表达较高水平的TfR的细胞(包括一些癌细胞、肝细胞、脾细胞和骨髓细胞)中的内吞作用。本文还公开了哺乳动物表面展示筛选平台筛选CDP的多样性文库，并且鉴定特异性结合人TfR的CDP的用途。此类鉴定的肽可进行修饰以改善与TfR的结合并在选择性耗竭复合物中用作结合TfR并再循环到细胞表面的肽或肽复合物(例如，如图12A和图12B中所示的非pH依赖性TFR结合CDP)。本文还公开了哺乳动物表面展示筛选平台用于筛选CDP的多样性文库并且鉴定特异性地结合至期望降解的靶标的CDP的用途。此类鉴定的肽可针对与所选靶标的结合进行优化并在选择性耗竭复合物中用作结合此类所选靶标并释放在内体中以在细胞内降解的肽或肽复合物(例如，如图12A和图12B中所示的pH依赖性靶标结合CDP)。可随后实施进一步亲和力成熟以适当地产生具有不同亲和力的TfR结合CDP或靶标结合CDP的等位基因系列。在一些实施方案中，鉴定TfR结合CDP或靶标结合CDP，并且可通过结晶学或其他方法来确定结合。本公开的肽可具有跨物种交叉反应性。举例来说，在一些情况下，本文公开的肽结合人和鼠TfR。在静脉内施用之后，本文公开的肽可在CNS中累积，并且可经由对TfR的啮合来穿透BBB。本文公开了作为治疗递送剂用于肿瘤学、自身免疫性疾病、急性和慢性神经变性、以及疼痛管理中的TfR结合CDP。由于制造更简单(肽可通过生物或合成手段来制备)、稳定性改善、治疗窗改善以及尺寸更小(运载物活性的空间位阻的潜在性更小)，所以通过TfR结合CDP来递送活性剂或药物剂可优于常规抗TfR抗体。因此，本公开的方法和组合物可提供对有效地将运载物分子(例如治疗性和/或诊断性小分子、肽或蛋白质)转运至CNS(例如脑)中的问题的解决方案。举例来说，本公开的肽有助于药物递送至位于脑中的肿瘤。

在本公开的一些实施方案中，CDP、打结肽、套结素或源于打结肽或套结素的肽的多样性文库可与哺乳动物表面展示筛选平台组合使用，用于鉴定特异性地结合至期望再循环的人TfR或结合至期望降解的靶标的肽。(参见例如Crook等人(2017)Mammalian displayscreening of diverse cystine-dense peptides for difficult to drug targets.NatCommun 8:2244)。在一些实施方案中，CDP、打结肽、套结素，或源于打结肽或套结素的肽的多样性文库从内源性肽序列进行诱变以提供新型肽序列。TfR结合肽或靶标结合肽一经鉴定，即可进行亲和力成熟(例如位点饱和诱变)以产生对TfR或靶标具有不同(例如改善的)亲和力的结合剂的等位基因系列。这些技术可与各种其他分析方法(例如结晶学或光谱法)组合使用以测定肽-受体相互作用的性质(例如对于受体结合是关键的氨基酸残基等)。在一些情况下，本公开的肽被开发用于结合人TfR。

在一些实施方案中，本公开的经工程化肽(例如含组氨酸或组氨酸富集的靶标结合肽)在生理细胞外pH(例如，约pH 7.2至约pH 7.5的pH、约pH 6.5至约7.5的pH或约pH 6.5至约pH 6.9的pH)下可具有高靶标结合亲和力，但在较低pH水平诸如约6.5、约6.0或约5.5的内体pH下具有显著降低的结合亲和力。细胞外pH可以是例如pH 7.4。细胞外pH也可较低，包括在肿瘤微环境中，诸如pH 7.2、7.0或6.8。在一些实施方案中，例如在肿瘤环境中，细胞外pH可以是约pH 6.5至约pH 6.9。内吞作用后，内体经历pH的降低。可通过质子泵的作用或通过与具有较低pH的其他囊泡合并而降低内体pH。pH可降低至7.0，然后降低至6.5，然后降低至6.0，然后降低至5.5或更低。一些内体被称为早期内体并且可具有约6.5的pH。这些内体中的一些成为循环内体。一些内体被称为晚期内体并且可具有约5.5的pH。一些内体变成溶酶体或与溶酶体合并，其中pH可以是4.5。溶酶体中的酶和其他因子可引起溶酶体内容物的降解。在一些实施方案中，靶标结合肽在约pH 7.3、pH 7.2、pH 7.1、pH 7.0、pH 6.9、pH6.8、pH 6.7、pH 6.6、pH 6.5、pH 6.4、pH 6.3、pH 6.2、pH 6.1、pH 6.0、pH 5.9、pH 5.8、pH5.7、pH 5.6、pH 5.5、pH 5.4、pH 5.3、pH 5.2、pH 5.1、pH 5.0、pH 4.9、pH 4.8、pH 4.7、pH4.6、pH 4.5或更低下在内体中释放。在一些实施方案中，靶标结合肽可在内吞作用后在pH降低时在内体成熟过程期间的任何时间点释放。在一些情况下，可进行组氨酸扫描和比较结合实验以开发和筛选此类肽。在一些实施方案中，本公开的肽中的氨基酸残基被不同氨基酸残基取代以改变对靶标或对TfR的pH依赖性结合亲和力。氨基酸取代可增加在低pH下的结合亲和力，增加在高pH下的结合亲和力，降低在低pH下的结合亲和力，降低在高pH下的结合亲和力，或它们的组合。例如，对TfR具有高亲和力并在选择性耗竭复合物中用作结合TfR以再循环到细胞表面的肽或肽复合物的肽可以是非pH依赖性TfR结合肽(例如，非pH依赖性TfR结合CDP)，使得它不会在内体中释放。在一些实施方案中，TfR结合肽可在内体酸化后内体区室的离子强度增加时保持与TfR结合。在一些实施方案中，TfR结合肽在内体pH下是稳定的，并且不会例如在酸性条件(诸如pH 6.9、pH 6.8、pH6.7、pH 6.6、pH 6.5、pH 6.4、pH 6.3、pH6.2、pH 6.1、pH 6.0、pH 5.9、pH 5.8、pH 5.7、pH 5.6、pH 5.5、pH 5.4、pH 5.3、pH 5.2、pH 5.1、pH 5.0、pH 4.9、pH 4.8、pH 4.7、pH 4.6、pH 4.5或更低)下在内体中释放。相反，对结合至所选靶标具有高亲和力并在选择性耗竭复合物中用作结合此类所选靶标并释放在内体中以在细胞内降解的肽或肽复合物的肽可以是pH依赖性靶标结合CDP，使得其在内体中释放。在一些实施方案中，靶标结合肽可在内体酸化后内体区室的离子强度增加时释放靶标。在一些实施方案中，靶标结合肽在内体pH下是不太稳定的，并且例如在酸性条件(诸如pH 7.3、pH 7.2、pH 7.1、pH 7.0、pH 6.9、pH 6.8、pH 6.7、pH 6.6、pH 6.5、pH 6.4、pH 6.3、pH 6.2、pH 6.1、pH 6.0、pH 5.9、pH 5.8、pH 5.7、pH 5.6、pH 5.5、pH 5.4、pH 5.3、pH 5.2、pH 5.1、pH 5.0、pH 4.9、pH 4.8、pH 4.7、pH 4.6、pH 4.5或更低)下在内体中全部或部分释放。在一些情况下，本公开的TfR结合肽可进行优化以获得改善的囊泡内(例如内体内)功能，同时保留高TfR结合能力。本公开的示例性TfR结合肽显示于表1中，具有在SEQID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ IDNO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中阐述的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文描述了肽和肽复合物，以及筛选结合至目标蛋白质或分子诸如TfR或结合至靶标分子以用于耗竭或两者的肽和肽复合物的方法。相较于野生型或内源性分子诸如转铁蛋白，如本文所述的方法和组合物可提供具有改善的TfR结合能力的肽，或展现改善的穿过BBB的转运能力的肽，或它们的任何组合。在一些情况下，当前描述的肽高效地穿过内皮细胞层(例如BBB)或上皮层来转运运载物分子(例如靶标结合分子)。在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽结合TfR，并且促进囊泡胞吞转运。在一些情况下，本公开的TfR结合肽结合过度表达TfR的细胞(例如癌细胞)，并且促进由所述细胞对肽的摄取。在一些方面，如本文所述的TfR结合肽或肽复合物促进囊泡胞吞转运和由TfR过度表达性细胞诸如癌症达成的摄取，或它们的组合。在一些情况下，本公开的TfR结合肽促进选择性耗竭复合物和靶标分子的TfR介导的内吞作用。

本公开的TfR结合肽可结合不同物种的TfR，包括人、猴、小鼠和大鼠TfR。在一些情况下，TfR结合肽的任何氨基酸残基的变异或突变可影响交叉反应性。在一些情况下，TfR结合肽的与TfR的结合位点相互作用的任何氨基酸残基的变异或突变可影响交叉反应性。

本文描述了可足够大以致携带运载物分子，同时保留以高亲和力结合靶蛋白(例如TfR)的能力，但又足够小以致进入细胞组织诸如细胞凝聚物(例如实体肿瘤)的中心的肽，包括但不限于经设计或经工程化肽、重组肽、以及胱氨酸密集肽(CDP)/小型二硫键打结肽(例如打结肽、套结素、以及源于它们的肽)。在一些情况下，如本文所述的肽通过血管胞吞转运来携带运载物分子穿过BBB进入CNS(例如实质)中。在一些情况下，胞吞转运是TfR介导的。

本文还描述了用于测定肽-受体相互作用的性质(例如使用X射线结晶学)以及它们的体内药效动力学和药代动力学性质(包括在CNS(例如脑)或其他受影响器官和组织中的累积)的方法和组合物。本文所述的一些肽具有靶向肿瘤细胞，并且在肿瘤细胞中积累的能力。在一些情况下，肿瘤细胞过度表达TfR。在一些方面，本公开的肽具有高体内稳定性，例如高蛋白酶稳定性，对还原剂诸如谷胱甘肽(GSH)的高可耐受性，并且耐受高温(例如直至95℃)。

在一些实施方案中，本公开提供了一种基于3D蛋白质或受体结构的肽或蛋白质设计方法，所述方法用于鉴定能够结合此受体的肽或蛋白质。在一些情况下，受体是转铁蛋白受体。

如本文所用，天然L-对映异构氨基酸的缩写是常规的，并且如下：丙氨酸(A，Ala)；精氨酸(R，Arg)；天冬酰胺(N，Asn)；天冬氨酸(D，Asp)；半胱氨酸(C，Cys)；谷氨酸(E，Glu)；谷氨酰胺(Q，Gln)；甘氨酸(G，Gly)；组氨酸(H，His)；异亮氨酸(I，Ile)；亮氨酸(L，Leu)；赖氨酸(K，Lys)；甲硫氨酸(M，Met)；苯丙氨酸(F，Phe)；脯氨酸(P，Pro)；丝氨酸(S，Ser)；苏氨酸(T，Thr)；色氨酸(W，Trp)；酪氨酸(Y，Tyr)；缬氨酸(V，Val)。通常，Xaa可指示任何氨基酸。在一些实施方案中，X可以是天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)或精氨酸(R)。

本公开的一些实施方案考虑任何标准或非标准氨基酸的D-氨基酸残基或其类似物。当氨基酸序列表示为一系列三字母或单字母氨基酸缩写时，根据标准用法和惯例，左手方向是氨基末端方向，并且右手方向是羧基末端方向。

术语“肽”、“多肽”、“小蛋白”、“蛋白质”、“套结素”、“胱氨酸密集肽”、“打结肽”或“CDP”在本文中可互换用于指代氨基酸残基的聚合物。在各种实施方案中，“肽”、“多肽”和“蛋白质”可以是α碳通过肽键来连接的氨基酸的链。因此，在链的一端(例如氨基末端或N末端)的末端氨基酸可具有游离氨基，而在链的另一端(例如羧基末端或C末端)的末端氨基酸可具有游离羧基。如本文所用，术语“氨基末端”(例如缩写为N末端)可指在处于肽的氨基末端的氨基酸上的游离α-氨基或在肽内的任何其他位置处的氨基酸的α-氨基(例如当参与肽键时的亚氨基)。类似地，术语“羧基末端”可指肽的羧基末端上的游离羧基或在肽内的任何其他位置处的氨基酸的羧基。肽还包括基本上任何聚氨基酸，包括但不限于肽模拟物，诸如由醚或硫醚而非酰胺键接合的氨基酸。

如本文所用，术语“肽构建体”可指包含可缀合至、连接至或融合至一个或多个肽或运载物分子的一个或多个本公开的肽的分子。在一些情况下，运载物分子是活性剂。术语“活性剂”可指任何分子，例如能够引发生物作用和/或可允许定位、检测或显现相应肽构建体的物理作用(例如辐射的发射)的任何分子。在各种实施方案中，术语“活性剂”是指治疗剂和/或诊断剂。本公开的肽构建体可包含通过一个或多个如本文所述的接头部分(例如可裂解接头或稳定接头)来连接至一个或多个活性剂的TfR结合肽。

如本文所用，术语“肽复合物”可指融合、连接、缀合或以其他方式连接以形成复合物的本公开的一种或多种肽。在一些情况下，一种或多种肽可包括TfR结合肽、靶标结合肽、半衰期调节肽、改进药效学和/或药代动力学性质的肽或其组合。例如，包含TfR结合肽和靶标结合肽的肽复合物在本文中可称为选择性耗竭复合物。

如本文所用，术语“包含”和“具有”可互换使用。举例来说，术语“包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的肽”和“具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的肽”可互换使用。

如本文所用，并且除非另外陈述，否则术语“TfR”或“转铁蛋白受体”是本文所用的一类蛋白质，并且可指来自任何物种的转铁蛋白受体(例如人或鼠TfR或任何人类或非人类动物TfR)。在一些情况下，并且如本文所用，术语“TfR”或“转铁蛋白受体”是指人TfR(hTfR)，并且可包括TfR或任何已知TfR同源物或直系同源物，包括TfR1、TfR2、可溶性TfR，或它们的任何组合或片段(例如胞外域)。

如本文所用，术语“内体”、“内体的”、“内体区室”或“内吞途径”可互换使用并且可指允许肽和运载物在细胞内的不同膜结合区室之间的囊泡胞吞转运或运输和转移(包括溶酶体降解以及再循环至细胞表面)的细胞内内体网络或反面高尔基体网络(TGN)的任何一种或多种组分。应当理解，这种途径涉及并包括通常称为转运囊泡或早期内体的囊泡的成熟和转变至晚期内体再至溶酶体，并且在整个成熟过程中在内体酸化后内体区室酸度增加。充当成熟内吞途径中的最后囊泡的溶酶体通常含有水解酶，所述水解酶消化晚期内体的内容物。其他内体继续至再循环内体的途径，其中内容物再循环回到细胞表面。

如本文所用，“非pH依赖性”当用于提及分子或部分时是指在内体区室被酸化时，分子或部分与其靶标的结合亲和力并未足够改变成使得能够在内体中与靶标解离。例如，参考分子或部分在细胞外pH和内体pH下对其靶标具有相同或相似的亲和力。还应理解，非pH依赖性分子或部分不包括pH依赖性分子或部分，因为pH依赖性分子或部分与其靶标的结合亲和力在其进入和通过内体途径时改变，例如使得能够在内体中在一定程度上与靶标解离，或者参考分子或部分在细胞外pH和内体pH下具有不同的亲和力。

术语“经工程化”在应用于多核苷酸时表示所述多核苷酸已从它的天然遗传环境移除，并且因此不含其他外来或非所要编码序列，并且呈适于在经遗传工程化蛋白质产生系统内使用的形式。此类经工程化分子是从它们的天然环境分离的那些，并且包括cDNA和基因组克隆(即具有含有来自不同生物体的DNA片段的载体的原核或真核细胞)。本发明的经工程化DNA分子不含它们通常与其相伴的其他基因，但可包括天然存在或非天然存在的5'和3'非翻译区，诸如增强子、启动子和终止子。

“经工程化”多肽或蛋白质是见于除它的天然环境以外的条件下，诸如离开血液和动物组织的多肽或蛋白质。在一优选形式的情况下，经工程化多肽基本上不含其他多肽，特别是动物来源的其他多肽。优选的是提供呈高度纯化形式的多肽，例如纯度大于90％、纯度大于95％、更优选纯度大于98％或纯度大于99％。当在此上下文中使用时，术语“经工程化”不排除同一多肽以替代性实体形式存在，所述形式诸如是二聚体、异二聚体和多聚体、异多聚体，或替代地，糖基化、羧化、经修饰或衍生化形式。

“经工程化”肽或蛋白质是不同于天然存在的多肽结构、序列或组成的多肽。经工程化肽包括非天然存在、人工、经分离、合成、经设计、经修饰或重组表达的肽。本文提供了经工程化TfR结合肽、其变体或片段。这些经工程化改造TfR结合肽可进一步连接至靶标结合部分或半衰期延长部分，或者可进一步连接至活性剂或可检测剂，或前述的任何组合。

本公开的多肽包括已以任何方式修饰，例如以：(1)降低对蛋白水解的易感性，(2)降低对氧化的易感性，(3)改变用于形成蛋白质复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，(5)改变在某些pH值下的结合亲和力以及(6)赋予或改进其他物理化学或功能性质的多肽。举例来说，在天然存在的序列中(例如在多肽的处于形成分子间接触的一个或多个结构域的外部的部分中)进行单一或多个氨基酸取代(例如保守性氨基酸取代)。“保守性氨基酸取代”可指在多肽中用功能类似氨基酸取代某一氨基酸。以下六组各自含有可为彼此的保守性取代的氨基酸：i)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)；ii)天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；iii)天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)；iv)精氨酸(R)和赖氨酸(K)；v)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)；vi)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。在一些实施方案中，保守性氨基酸取代可包含非天然氨基酸。例如，用氨基酸取代相同氨基酸的非天然衍生物可以是保守性取代。

如本文所用的术语“多肽片段”和“截短多肽”可指相较于相应全长肽或蛋白质，具有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽。在各种实施方案中，片段的长度是至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900或至少1000个氨基酸。在各种实施方案中，片段的长度还可以是例如至多1000、至多900、至多800、至多700、至多600、至多500、至多450、至多400、至多350、至多300、至多250、至多200、至多150、至多100、至多50、至多45、至多40、至多35、至多30、至多25、至多20、至多15、至多10或至多5个氨基酸。片段还可在它的任一末端或两个末端包含一个或多个额外氨基酸，例如来自不同天然存在蛋白质的氨基酸序列(例如Fc或亮氨酸拉链结构域)或人工氨基酸序列(例如人工接头序列)。

如本文所用，术语“肽”或“多肽”在与“变异”、“突变”或“富集突变”或“排列富集突变”联合时可指可包含以下氨基酸序列的肽或多肽，在所述氨基酸序列中，相对于另一多肽序列，一个或多个氨基酸残基被插入至所述氨基酸序列中，从所述氨基酸序列缺失，和/或取代至所述氨基酸序列中。在各种实施方案中，待插入、缺失或取代的氨基酸残基的数目在长度方面是至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少25、至少50、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少225、至少250、至少275、至少300、至少350、至少400、至少450或至少500个氨基酸。本公开的变体包括肽缀合物或融合分子(例如肽构建体或肽复合物)。

肽或多肽的“衍生物”可以是可已被化学修饰的肽或多肽，例如缀合至另一化学部分诸如像聚乙二醇、白蛋白(例如人血清白蛋白)，磷酸化和糖基化。

术语“序列同一性％”在本文中可与术语“同一性％”互换使用，并且可指当使用序列比对程序进行比对时，在两个或更多个肽序列之间的氨基酸序列同一性水平，或在两个或更多个核苷酸序列之间的核苷酸序列同一性水平。举例来说，如本文所用，80％同一性意指与通过确定算法来确定的80％序列同一性相同的情况，并且意指给定序列与另一序列的另一长度是至少80％同一的。在各种实施方案中，同一性％选自例如与给定序列的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99％或更高直至100％序列同一性。在各种实施方案中，同一性％在例如约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％，或约95％至约99％的范围内。

术语“序列同源性％”或“序列同源性百分比”或“序列同一性百分比”在本文中可与术语“同源性％”、“序列同一性％”或“同一性％”互换使用，并且可指当使用序列比对程序进行比对时，在两个或更多个肽序列之间的氨基酸序列同源性水平或在两个或更多个核苷酸序列之间的核苷酸序列同源性水平。举例来说，如本文所用，80％同源性意指与通过确定算法来确定的80％序列同源性相同的情况，因此意指给定序列的同源物历经所述给定序列的某一长度具有大于80％序列同源性。在各种实施方案中，同源性％选自例如与给定序列的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或更高直至100％序列同源性。在各种实施方案中，同源性％在例如约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％，或约95％至约99％的范围内。

当样品的至少约60％至75％展现单一多肽种类时，蛋白质或多肽可以是“基本上纯的”、“基本上同质的”，或“基本上纯化的”。多肽或蛋白质可以是单体或多聚体。基本上纯的多肽或蛋白质可通常占蛋白质样品的约50％、60％、70％、80％或90％W/W，更通常约95％，并且例如纯度将超过98％或99％。蛋白质纯度或同质性可通过本领域中熟知的许多手段来指示，诸如蛋白质样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，继之以在用本领域中熟知的染色剂对胶凝染色后显现单一多肽条带。出于某些目的，通过使用高压液相色谱法(例如HPLC)或其他高分辨率分析技术(例如LC-质谱测定法)来提供更高分辨率。

如本文所用，术语“药物组合物”可通常是指适于在受试者诸如动物(例如人或小鼠)中进行药物使用的组合物。药物组合物可包含药理学有效量的活性剂以及药学上可接受的载体。术语“药理学有效量”可指剂的有效产生预定生物学或药理学结果的那个量。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”可指任何标准药物载体、媒介物、缓冲剂和赋形剂，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、或缓冲盐水溶液、5％右旋糖水溶液和乳液，诸如油/水或水/油乳液，以及各种类型的湿润剂和/或佐剂。适合药物载体和制剂描述于Remington's Pharmaceutical Sciences,第21版2005,Mack Publishing Co,Easton中。“药学上可接受的盐”可以是可被配制成用于药物用途的化合物的盐，包括例如金属盐(钠、钾、镁、钙等)以及氨或有机胺的盐。

如本文所用，术语“治疗”可指一种缓和或消除生物学病症和/或它的至少一种伴随症状的方法。如本文所用，对于“缓和”疾病、病症或疾患，例如意指降低所述疾病、病症或疾患的症状的严重性和/或发生频率。此外，在本文中提及“治疗”可包括提及治愈性、缓解性和防治性或诊断性治疗。

通常，本公开的细胞可以是真核细胞或原核细胞。细胞可以是上皮细胞。细胞可以是微生物、细菌、酵母、真菌或藻类细胞。细胞可以是动物细胞或植物细胞。动物细胞可包括来自海洋无脊椎动物、鱼、昆虫、两栖动物、爬行动物或哺乳动物的细胞。哺乳动物细胞可从灵长类动物、猿、马科动物、牛科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物或啮齿动物获得。哺乳动物可以是灵长类动物、猿、犬、猫、兔、雪貂等。啮齿动物可以是小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、仓鼠、毛丝鼠或豚鼠。鸟细胞可来自金丝雀、长尾小鹦鹉或鹦鹉。爬行动物细胞可来自龟、蜥蜴或蛇。鱼细胞可来自热带鱼。举例来说，鱼细胞可来自斑马鱼(例如斑马鱼(Daninorerio))。蠕虫细胞可来自线虫(例如秀丽隐杆线虫(C.elegans))。两栖动物细胞可来自蛙。节肢动物细胞可来自狼蛛或寄居蟹。

哺乳动物细胞还可包括从灵长类动物(例如人类或非人灵长类动物)获得的细胞。哺乳动物细胞可包括血细胞、干细胞、上皮细胞、结缔组织细胞、激素分泌性细胞、神经细胞、骨骼肌细胞，或免疫系统细胞。

如本文所用，术语“载体”通常是指能够在宿主细胞中复制和/或另一DNA区段可被操作性地与其连接以便导致所连接区段的复制的DNA分子。质粒是示例性载体。

如本文所用，术语“受试者”通常是指人或另一动物。受试者可处于任何年龄，例如受试者可以是婴儿、学步儿、儿童、青春期前的少年、青少年、成人或年长个体。

范围在本文中可表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一特定值。当表示此种范围时，另一实施方案包括从一个特定值和/或至另一特定值。类似地，当值通过使用先行词“约”来表示为近似值时，应了解特定值形成另一实施方案。还应了解每个范围的端点与另一端点相关，以及独立于另一端点。如本文所用的术语“约”是指从在特定使用的情形内的陈述数值加上或减去15％的范围。举例来说，约10可包括从8.5至11.5的范围。

肽

本公开的选择性耗竭复合物可包含一种或多种肽。例如，本公开的选择性耗竭复合物可包含TfR结合肽和靶标结合肽。在一些实施方案中，两种或更多种肽可经由接头连接。本公开的肽(例如，TfR结合肽、靶标结合肽或包含与靶标结合肽连接的TfR结合肽的肽)可用于选择性耗竭靶标分子的方法中。本公开的肽(例如，TfR结合肽、靶标结合肽或包含与靶标结合肽连接的TfR结合肽的肽)可在内吞作用后再循环至细胞表面。

在一些情况下，如本文公开的肽可仅含有一个赖氨酸残基，或不含有赖氨酸残基。在一些情况下，肽中的赖氨酸残基中的一者或多者或全部被用精氨酸残基替换。在一些情况下，肽中的甲硫氨酸残基中的一者或多者或全部由亮氨酸或异亮氨酸替换。肽中的色氨酸残基中的一者或多者或全部可由苯丙氨酸或酪氨酸替换。在一些情况下，肽中的天冬酰胺残基中的一者或多者或全部由谷氨酰胺替换。在一些实施方案中，天冬氨酸残基中的一者或多者或全部可由谷氨酸残基替换。在一些情况下，肽中的赖氨酸残基中的一者或多者或全部由丙氨酸或精氨酸替换。在一些实施方案中，肽的N末端诸如由乙酰基或叔丁基氧基羰基阻断或保护。可替代地或组合地，肽的C末端可诸如由酰胺基团或通过形成酯(例如丁酯或苯甲酯)来阻断或保护。在一些实施方案中，肽通过在游离胺上的甲基化进行修饰。举例来说，完全甲基化通过使用以甲醛和氰基硼氢化钠进行的还原性甲基化来实现。

在一些实施方案中，二肽GS可作为前两个N末端氨基酸添加，如SEQ ID NO:1–SEQID NO:64中所示，或这种N末端二肽GS可不存在，如SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:128中所示，或者可被任何其他一个或两个氨基酸取代。在一些实施方案中，二肽GS用作接头，或用于偶联至接头以形成肽缀合物或融合分子诸如肽构建体或肽复合物。在一些实施方案中，接头包括G_xS_y(SEQ ID NO:130)肽，其中x和y独立地是任何整数，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，并且G和S残基以任何顺序排列。在一些实施方案中，肽接头包括(GS)x(SEQ ID NO:131)，其中x可以是任何整数，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。在一些实施方案中，肽接头包括GGSSG(SEQ ID NO:132)、GGGGG(SEQ ID NO:133)、GSGSGSGS(SEQ ID NO:134)、GSGG(SEQ ID NO:135)、GGGGS(SEQ ID NO:136)、GGGS(SEQ ID NO:129)、GGS(SEQ ID NO:137)、GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:138)、或它们的变体或片段、或它们的任何数量的重复和组合。另外，来自DkTx的KKYKPYVPVTTN(SEQ ID NO:139)和来自人I gG3的EPKSSDKTHT(SEQ ID NO:140)可用作肽接头或它们的任何数量的重复和组合。在一些实施方案中，肽接头包括GGGSGGSGGGS(SEQID NO:141)或它们的变体或片段、或它们的任何数量的重复和组合。应当理解，任何前述接头或它们的变体或片段可与它们的任何数量的重复或任何组合一起使用。还应理解，本领域的其他肽接头或它们的变体或片段可与它们的任何数量的重复或任何组合一起使用。可调整接头的长度以使选择性递送复合物与TfR和靶标两者的结合最大化，包括考虑空间进入。在一些实施方案中，选择性耗竭复合物内的TfR结合肽与靶标结合肽之间的接头是至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36at least 37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58、至少59、至少60、至少61、至少62、至少63、至少64、至少65个残基递增直至100个残基长，特别是例如在靶标不是可溶性蛋白而是细胞表面蛋白或细胞受体蛋白的情况下。

在本公开的一些实施方案中，如本文所述的肽或肽复合物包含在SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个中阐述的氨基酸序列。如本文公开的肽可以是包含SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个的连续片段的片段，所述片段的长度是至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58、至少59、至少60、至少61、至少62、至少63、至少64、至少65个残基，其中肽片段选自肽的任何部分。在一些实施方案中，肽序列由额外氨基酸侧接。一个或多个额外氨基酸例如对肽赋予特定体内电荷、等电点、化学缀合位点、稳定性或生理性质。

在一些情况下，能够靶向和结合至TfR的如本文所述的肽的长度包括至多80个氨基酸，或长度包括至多70、至多60、至多40、至多35、至多30、至多25、至多20、至多15或至多10个氨基酸。在一些情况下，能够靶向和结合至靶标分子的如本文所述的肽的长度包括至多80个氨基酸，或长度包括至多70、至多60、至多50、至多40、至多35、至多30、至多25、至多24、至多23、至多22、至多21、至多20、至多19、至多18、至多17、至多16、至多15、至多14、至多13、至多12、至多11或至多10个氨基酸。

在其他实施方案中，肽可缀合至、连接至或融合至具有针对目标细胞或靶细胞的靶向或归巢功能的载体或分子。在其他实施方案中，肽可缀合至、连接至或融合至延长肽的半衰期，或改进肽的药效动力学和/或药代动力学性质，或它们的任何组合的分子。

在一些情况下，肽包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个带正电荷残基，诸如Arg或Lys，或它们的任何组合。在一些情况下，肽中的一个或多个赖氨酸残基被用精氨酸残基替换。在一些实施方案中，肽包含一个或多个Arg补丁。在一些实施方案中，肽上的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个，或10个或更多个Arg或Lys残基暴露于溶剂。在一些情况下，肽包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个组氨酸残基。

本公开的肽还可包含中性氨基酸残基。在一些实施方案中，肽具有35个或更少个中性氨基酸残基。在其他实施方案中，肽具有81个或更少个中性氨基酸残基、70个或更少个中性氨基酸残基、60个或更少个中性氨基酸残基、50个或更少个中性氨基酸残基、40个或更少个中性氨基酸残基、36个或更少个中性氨基酸残基、33个或更少个中性氨基酸残基、30个或更少个中性氨基酸残基、25个或更少个中性氨基酸残基，或10个或更少个中性氨基酸残基。

本公开的肽可还包含负性氨基酸残基。在一些实施方案中，肽具有6个或更少个负性氨基酸残基、5个或更少个负性氨基酸残基、4个或更少个负性氨基酸残基、3个或更少个负性氨基酸残基、2个或更少个负性氨基酸残基，或1个或更少个负性氨基酸残基。尽管负性氨基酸残基可选自任何带负电荷氨基酸残基，但在一些实施方案中，负性氨基酸残基是E，或D，或E与D两者的组合。

在本公开的一些实施方案中，肽的三维或三级结构主要包含β-片层和/或α-螺旋结构。在一些实施方案中，本公开的经设计或经工程化TfR结合肽或靶标结合肽是通过用以形成胱氨酸的链内二硫键(例如由半胱氨酸介导)和疏水性核心来稳定的小型紧密肽或多肽。在一些实施方案中，经工程化TfR结合肽具有包含螺旋束的结构，其中在每个α螺旋之间具有至少一个二硫键，由此使肽稳定。在其他实施方案中，经工程化TfR结合肽或靶标结合肽包含具有三个α螺旋和三个链内二硫键的结构，在α螺旋束中的三个α螺旋中的每一者之间具有一个二硫键。

受体结合肽

本文公开了能够结合至受体(例如，转铁蛋白受体或程序性死亡配体1)的肽序列，诸如表1和表2中所列的那些。能够结合受体的肽可被称为受体结合肽。在一些实施方案中，受体结合肽可结合至经由再循环途径经历再循环的再循环受体。在早期内体成熟为晚期内体之前，再循环受体可被内吞到早期内体中并包装到再循环内体中。含有再循环受体的再循环内体可与细胞膜融合并使再循环受体返回到细胞表面。在一些实施方案中，本公开的受体结合肽可在再循环过程期间保持与受体结合，从而也使受体结合肽再循环。可被受体结合肽靶向的再循环受体的实例包括转铁蛋白受体和程序性死亡配体1。在一些实施方案中，本公开的受体结合肽可包含小蛋白、纳米抗体、抗体、IgG、抗体片段、Fab、F(ab)2、scFv、(scFv)2、DARPin或亲和体。在一些实施方案中，受体结合肽可包含胱氨酸密集肽、affitin、adnectin、avimer、Kunitz结构域、nanofittin、fynomer、双环肽、β-发夹或钉合肽。

在一些实施方案中，本公开的受体结合肽可非pH依赖性的亲和力结合至受体(例如，再循环受体)。例如，受体结合肽可在细胞外pH(约pH 7.4)下以与内吞pH(诸如约pH 5.5或约pH 6.5)下的结合亲和力基本相同的亲和力结合受体。在一些实施方案中，受体结合肽可在细胞外pH(约pH 7.4)下以低于内吞pH(诸如约pH 5.5或约pH 6.5)下的结合亲和力的亲和力结合受体。在一些实施方案中，受体结合肽可在细胞外pH(约pH 7.4)下以高于内吞pH(诸如约pH 5.5或约pH 6.5)下的结合亲和力的亲和力结合受体。在一些实施方案中，在细胞外pH(约pH 7.4)下受体结合肽对受体的结合亲和力和在内吞pH(约pH 5.5)下受体结合肽对受体的结合亲和力可相差不超过约1％、不超过约2％、不超过约3％、不超过约4％、不超过约5％、不超过约6％、不超过约7％、不超过约8％、不超过约9％、不超过约10％、不超过约12％、不超过约15％、不超过约17％、不超过约20％、不超过约25％、不超过约30％、不超过约35％、不超过约40％、不超过约45％或不超过约50％。在一些实施方案中，在pH 7.4下和在pH 5.5下受体结合肽对受体的亲和力可相差不超过2倍、不超过5倍、不超过10倍、不超过15倍、不超过20倍、不超过25倍、不超过30倍、不超过40倍或不超过50倍。在一些实施方案中，受体结合肽(例如，SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:233–SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:400–SEQ ID NO:456或SEQ ID NO:241中的任一个)可进行修饰以除去TfR结合界面中的一个或多个组氨酸氨基酸，从而降低受体结合肽对受体的结合亲和力的pH依赖性。在一些实施方案中，受体结合肽(例如，SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:233–SEQ ID NO:239、SEQ IDNO:400–SEQ ID NO:456或SEQ ID NO:241中的任一个)可能在受体结合界面中缺乏组氨酸氨基酸。

在一些实施方案中，具有非pH依赖性结合的受体结合肽可在细胞外pH(约pH 7.4)下以小于50μM、小于5μM、小于500nM、小于100nM、小于40nM、小于30nM、小于20nM、小于10nM、小于5nM、小于2nM、小于1nM、小于0.5nM、小于0.4nM、小于0.3nM、小于0.2nM或小于0.1nM的解离常数(K_D)结合至受体。在一些实施方案中，具有非pH依赖性结合的受体结合肽可在内体pH(约pH 5.5)下以小于50μM、小于5μM、小于500nM、小于100nM、小于40nM、小于30nM、小于20nM、小于10nM、小于5nM、小于2nM、小于1nM、小于0.5nM、小于0.4nM、小于0.3nM、小于0.2nM或小于0.1nM的解离常数(K_D)结合至受体。

在一些实施方案中，受体结合肽可以pH依赖性的亲和力结合至受体。例如，受体结合分子可在细胞外pH(约pH 7.4)下以较高亲和力和在内体pH(约pH 5.5)下以较低亲和力结合至受体，从而在内化和内体区室酸化后从受体释放选择性耗竭复合物。

在一些实施方案中，再循环受体可以是TfR。能够结合转铁蛋白受体(TfR)的肽可结合TfR或任何已知的TfR同源物，包括TfR1、TfR2、可溶性TfR或它们的任何组合或片段(例如，胞外域)。能够结合转铁蛋白受体或TfR同源物的肽在本文中可被称为转铁蛋白受体结合肽或TfR结合肽。在一些实施方案中，本文公开的肽可以TfR介导的方式穿透、穿过或进入靶细胞。这些细胞层或细胞可包括表达TfR的内皮细胞、上皮细胞以及各种组织或器官的表达TfR的细胞，诸如肿瘤细胞、脑细胞、癌性或肿瘤细胞、肝细胞(例如，肝细胞(HC)、肝星状细胞(HSC)、库普弗细胞(KC)或肝窦内皮细胞(LSEC))、胰腺细胞、结肠细胞、卵巢细胞、乳腺细胞、脾细胞、骨髓细胞和/或肺细胞，或它们的任何组合。在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽可包含小蛋白、纳米抗体、抗体、IgG、抗体片段、Fab、F(ab)2、scFv、(scFv)2、DARPin或亲和体。在一些实施方案中，TfR结合肽可包含胱氨酸密集肽、affitin、adnectin、avimer、Kunitz结构域、nanofittin、fynomer、双环肽、β-发夹或钉合肽。

在一些实施方案中，如本文公开的肽可分别通过例如TfR介导的囊泡胞吞转运和TfR介导的内吞作用来穿过细胞层或屏障(例如BBB)或细胞膜。除结合TfR，并且促进胞吞转运和/或内吞作用之外，本公开的肽还可结合细胞诸如癌细胞上的额外靶蛋白。在一些情况下，肽是包含TfR结合肽的肽或肽复合物，所述TfR结合肽缀合至、连接至或融合至对额外靶蛋白(例如受体或酶)具有亲和力的靶向部分或活性剂(例如治疗剂或诊断剂)，诸如小分子或肽。在一些情况下，TfR结合肽连接至靶标结合肽，并且使得能够实现或促进TfR介导的靶标结合肽穿过BBB的胞吞转运，或TfR介导的向细胞中的内吞作用。在一些情况下，并且在胞吞转运之后，包含TfR结合肽和靶标结合肽的肽复合物可靶向CNS中的特定细胞或组织，并且在到达所述细胞或组织后施加生物作用(例如结合靶蛋白)。在一些情况下，本公开的肽复合物施加由TfR结合肽、靶标结合肽、活性剂或它们的组合介导的生物作用。在一些情况下，包含一种靶标结合肽的本公开的TfR结合肽复合物可将靶标分子转运和/或递送至表达TfR的细胞中(例如，将靶标分子递送至内体中)。在一些情况下，TfR结合肽在CNS中的组织中积累。在一些情况下，由于CNS特异性积累，所以脱靶效应降低。在一些情况下，TfR结合肽在处于CNS外部的组织(例如肝、肾、脾或皮肤)中积累。在一些情况下，表达TfR的细胞是肿瘤细胞，并且TfR结合肽复合物将抗肿瘤剂递送至这些肿瘤细胞。在一些情况下，抗肿瘤剂单独不显示或仅显示极其有限的针对肿瘤细胞的治疗功效；然而，当抗肿瘤剂与本公开的TfR结合肽组合成例如肽复合物时，这些抗肿瘤剂的治疗功效显著改善。

在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽(例如SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222和SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64)可诱导生物学相关反应。例如，与靶标结合肽缀合的TfR结合肽可选择性地耗竭可溶性靶标分子或细胞表面靶标分子。在一些实施方案中，生物学相关反应可在静脉内、皮下、腹膜、颅内或肌内给药后诱导，并且在一些实施方案中，在单次静脉内、皮下、腹膜、颅内或肌内给药后诱导。在一些实施方案中，TfR结合肽可与用于治疗和/或预防疼痛、神经病变性疼痛或其他神经病症诸如神经变性病症、感染性疾病、免疫病症(例如自身免疫性疾病)或溶酶体贮积病的各种其他类别的治疗性化合物组合使用。本文所述的肽和肽复合物(例如肽缀合物、融合肽或重组产生的肽复合物)与TfR的结合以及后续穿过细胞层或屏障诸如BBB(例如经由TfR介导的囊泡胞吞转运)或细胞膜(例如经由TfR介导的内吞作用)的转运可在与靶标分子的过度表达或累积相关的许多疾病、疾患或病症(例如，癌症、神经变性或溶酶体贮积病)或与受试者(例如人)中的可溶性或表面蛋白中的突变(例如，引起组成性活性、对治疗的抗性或显性负活性的突变)相关的疾病中具有影响。

本文所述的肽和肽复合物(例如肽缀合物、融合肽或重组产生的肽复合物)与TfR的结合以及后续穿过细胞层或屏障诸如BBB(例如通过囊泡胞吞转运)或细胞膜(例如通过内吞作用)的转运可在与神经变性相关的许多疾病、疾患或病症中具有影响。可用本文所述的包含TfR结合肽的选择性耗竭复合物治疗、预防或诊断的神经变性疾病可包括阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化症、弗里德赖希共济失调、亨廷顿氏病、路易体病、帕金森氏病、脊髓性肌萎缩、运动神经元疾病、莱姆病、共济失调-毛细血管扩张、常染色体显性小脑共济失调、巴登病、皮质基底综合征、克罗伊茨费尔特–雅各布病、X染色体脆折相关震颤/共济失调综合征、库福–拉基布综合征、马查多–约瑟夫病、多发性硬化症、慢性创伤性脑病变或额颞叶痴呆。

在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽可结合至任何已知的TfR同源物，包括TfR1、TfR2、可溶性TfR或它们的任何组合或片段(例如，胞外域)。因此，如本文所用，“TfR”可指TfR家族的任何已知同源物、衍生物、片段或成员，包括TfR1、TfR2和可溶性TfR。在其他实施方案中，肽能够结合一种、一种或多种，或所有TfR同源物。在一些实施方案中，本公开的肽可结合TfR，并且促进特定生物作用，诸如囊泡胞吞转运。在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽，包括具有SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ IDNO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222以及SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中阐述的氨基酸序列的肽和肽复合物以及它们的任何衍生物或变体阻止或降低内源性TfR结合剂(例如转铁蛋白或任何衍生物，诸如去铁转铁蛋白或全铁转铁蛋白)与TfR的结合。在一些实施方案中，本公开的肽或肽复合物包括与SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ IDNO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222以及SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中阐述的氨基酸序列具有至少40％同源性、至少50％同源性、至少60％同源性、至少70％同源性、至少75％同源性、至少80％同源性、至少85％同源性、至少90％同源性、至少91％同源性、至少92％同源性、至少93％同源性、至少94％同源性、至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性或至少99％同源性或至少100％同源性的衍生物和变体。

在各种实施方案中，本公开的TfR结合肽的界面残基(例如与TfR相互作用以进行受体结合的那些氨基酸残基)可在肽的两个主要是螺旋性的结构域之间分配。在一些情况下，界面残基可包含以SEQ ID NO:32为参考，对应于残基5-25(例如并且包含相应残基G5、A7、S8、M11、N14、L17、E18和E21)，或以SEQ ID NO:32为参考，对应于残基35-51(例如并且包含相应残基L38、L41、L42、L45、D46、H47、H49、S50和Q51)，或两者的残基。举例来说，界面残基可包含以SEQ ID NO:32为参考，对应于残基5-25(例如并且包含相应残基G5、A7、S8、M11、N14、L17、E18和E21)，或以SEQ ID NO:32为参考，对应于残基35-51(例如并且包含相应残基L38、L41、L42、L45、D46、H47、H49、S50和Q51)的残基。在一些实施方案中，TfR结合肽可包含本文提供的肽的片段，其中所述片段包含用于结合的最少界面残基，例如以SEQ ID NO:32为参考，对应于残基5-25(例如并且包含相应残基G5、A7、S8、M11、N14、L17、E18和E21)，或以SEQ IDNO:32为参考，对应于残基35-51(例如并且包含相应残基L38、L41、L42、L45、D46、H47、H49、S50和Q51)的残基。在一些情况下，TfR结合肽是具有以SEQ ID NO:32阐述的序列的肽，以SEQ ID NO:32为参考，所述肽包含对应于结构域的残基G5、A7、S8、M11、N14、L17、E18和E21以及对应于第二结构域的残基L38、L41、L42、L45、D46、H47、H49、S50和Q51的TfR结合残基。

在一些实施方案中，相较于内源性分子(例如转铁蛋白、全铁转铁蛋白(铁结合的转铁蛋白)、去铁转铁蛋白(未结合至铁的转铁蛋白)或任何其他内源性TfR配体)或其他外源性分子，TfR结合肽以相等、类似或更大亲和力(例如更低的解离常数K_D)结合至TfR。在一些实施方案中，肽可具有小于50μM、小于5μM、小于500nM、小于100nM、小于40nM、小于30nM、小于20nM、小于10nM、小于5nM、小于2nM、小于1nM、小于0.5nM、小于0.4nM、小于0.3nM、小于0.2nM或小于0.1nM的K_D。在一些实施方案中，由于相较于内源性分子具有更低亲和力(例如更高解离常数K_D)，通过TfR进行的肽转运得到改善。在一些实施方案中，由于相比于内源性分子具有更快的解离速率或更高的k_解离，通过TfR进行的肽转运得到改善。在一些实施方案中，解离速率或k_解离类似于转铁蛋白的解离速率或k_解离。在一些实施方案中，由于具有更快的缔合速率或更高的k_缔合，任选地，诸如高于转铁蛋白的k缔合，肽转运得到改善。在其他实施方案中，在转铁蛋白(Tf)-TfR结合界面处的一个或多个保守残基也存在于本文所述的肽的氨基酸序列中。在一些实施方案中，TfR结合肽具有比TfR的再循环速率更慢的解离速率，使得TfR结合肽可能在再循环过程期间保持与TfR结合。在一些实施方案中，TfR结合肽可具有不快于1分钟、不快于2分钟、不快于3分钟、不快于4分钟、不快于5分钟、不快于7分钟、不快于10分钟、不快于15分钟或不快于20分钟的解离速率。在一些实施方案中，TfR结合肽可具有约1分钟至约20分钟、约2分钟至约15分钟、约2分钟至约10分钟或约5分钟至约10分钟的解离速率。

在一些实施方案中，展现改善的TfR受体结合的TfR结合肽显示改善的胞吞转运功能、改善的内吞作用功能、改善的再循环或它们的组合。在一些实施方案中，展现改善的TfR受体结合的TfR结合肽不显示或显示小幅胞吞转运功能、内吞作用功能、再循环或它们的组合的变化。在一些实施方案中，展现改善的TfR受体结合的TfR结合肽显示降低的胞吞转运功能、降低的内吞作用功能、降低的再循环或它们的组合。在一些实施方案中，TfR结合肽结合在人TfR与鼠TfR之间具有高同源性的位点处，包括对应于人TfR(SEQ ID NO:190，MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLAVDEEENADNNTKANVTKPKRCSGSICYGTIAVIVFFLIGFMIGYLGYCKGVEPKTECERLAGTESPVREEPGEDFPAARRLYWDDLKRKLSEKLDSTDFTGTIKLLNENSYVPREAGSQKDENLALYVENQFREFKLSKVWRDQHFVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGRLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLYTPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVNAELSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSRSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCRMVTSESKNVKLTVSNVLKEIKILNIFGVIKGFVEPDHYVVVGAQRDAWGPGAAKSGVGTALLLKLAQMFSDMVLKDGFQPSRSIIFASWSAGDFGSVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKAVLGTSNFKVSASPLLYTLIEKTMQNVKHPVTGQFLYQDSNWASKVEKLTLDNAAFPFLAYSGIPAVSFCFCEDTDYPYLGTTMDTYKELIERIPELNKVARAAAEVAGQFVIKLTHDVELNLDYERYNSQLLSFVRDLNQYRADIKEMGLSLQWLYSARGDFFRATSRLTTDFGNAEKTDRFVMKKLNDRVMRVEYHFLSPYVSPKESPFRHVFWGSGSHTLPALLENLKLRKQNNGAFNETLFRNQLALATWTIQGAANALSGDVWDIDNEF)的残基506-510、523-531和611-662的氨基酸结构域中的一者或多者或全部。在一些实施方案中，TfR的由本文公开的肽或其变体结合的区域全部或部分属于此类TfR结构域。在一些实施方案中，本文公开的肽结合至包括对应于人TfR(SEQ ID NO:190)的残基506-510、523-531、以及611-662的氨基酸结构域的TfR高同源性区域中的任一者、任何两者或全部三者。在一些实施方案中，本文公开的肽至少结合至对应于人TfR的残基611-662的结构域。

在一些实施方案中，TfR结合肽的K_A和K_D值可进行调节和优化(例如通过氨基酸取代)以提供TfR结合亲和力和高效胞吞转运功能的最优比率。

在一些实施方案中，本文公开的肽或其变体在见于TfR与其他外源性或内源性配体(例如转铁蛋白(Tf)、Tf衍生物，或Tf样肽或蛋白质)的结合界面(例如结合结构域或结合口袋)中的残基处结合TfR。在一些实施方案中，结合TfR的本文公开的肽或其变体包含与结合TfR的组成结合口袋的残基的序列的至少70％同源性、至少75％同源性、至少80％同源性、至少85％同源性、至少90％同源性、至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性，或至少99％同源性或至少100％同源性。在一些实施方案中，结合TfR的本文公开的肽或其变体包含与已知结合TfR的内源性或外源性多肽，例如内源性转铁蛋白或表1中所列的任一肽，的至少70％同源性、至少75％同源性、至少80％同源性、至少85％同源性、至少90％同源性、至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性，或至少99％同源性或至少100％同源性。在其他实施方案中，本文所述的肽结合目标蛋白质，所述目标蛋白质包含与TfR、其片段、同源物或变体的至少70％同源性、至少75％同源性、至少80％同源性、至少85％同源性、至少90％同源性、至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性，或至少99％同源性或至少100％同源性。

在一些实施方案中，本文公开的肽或其变体结合TfR的包含对应于残基506-510、523-531、以及611-662(这些氨基酸残基的编号基于以下内源性人TFRC UniProtKB-P02786Uniprot参考蛋白质序列(SEQ ID NO:190，TFR1_人))的氨基酸残基的区域。在一些实施方案中，TfR的由本文公开的肽或其变体结合的区域与Tf、其片段、同源物或变体结合的区域重叠。

在其他实施方案中，核酸、载体、质粒或供体DNA包含编码如本公开中所述的肽、肽构建体、肽复合物或它们的变体或功能片段的序列。在其他实施方案中，TfR结合基序(例如保守结合基序)的某些部分或片段可被移植到具有SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ IDNO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQID NO:64中的任一个的序列的肽或肽复合物上。在一些实施方案中，肽可导致TfR被降解，阻止TfR定位至细胞的核，或阻止TfR与转铁蛋白或转铁蛋白样蛋白质相互作用。

在一些实施方案中，可基于肽结合至某一氨基酸残基或氨基酸残基基序的能力来选择所述肽进行进一步测试或使用。TfR中的某一氨基酸残基或氨基酸残基基序可从涉及于TfR与Tf的结合中的氨基酸残基或氨基酸残基序列鉴定。某一氨基酸残基或氨基酸残基基序可从TfR:Tf复合物的晶体结构鉴定。在一些实施方案中，肽(例如CDP)显示对热、蛋白酶(胃蛋白酶)和还原的抗性。

包含在SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ IDNO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ IDNO:1–SEQ ID NO:64中阐述的氨基酸序列中的一个或多个的肽、肽复合物(例如肽缀合物或融合肽)和选择性递送复合物可结合至目标蛋白质。在一些实施方案中，目标蛋白质是TfR。在一些实施方案中，结合至TfR的肽和肽复合物(例如肽缀合物或融合肽)包含在SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ IDNO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中阐述的氨基酸序列中的至少一个。在一些实施方案中，结合至TfR的本公开的肽、肽复合物(例如肽缀合物和融合分子)包括与SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ IDNO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ IDNO:64中阐述的氨基酸序列具有至少70％同源性、至少75％同源性、至少80％同源性、至少85％同源性、至少90％同源性、至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性或至少99％同源性或至少100％同源性的肽衍生物或变体。例如，结合至TfR的本公开的肽或肽复合物(例如肽缀合物和融合分子)可包括与SEQ ID NO:96中阐述的氨基酸序列具有至少70％同源性、至少75％同源性、至少80％同源性、至少85％同源性、至少90％同源性、至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性或至少99％同源性或至少100％同源性的肽衍生物或变体。

表1列出根据本公开的方法和组合物的示例性肽序列。

表1–示例性TfR结合肽序列

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在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含GSREGCAX₁RCX₂KYX₄DEX₂X₃KCX₃ARMMSMSNTEEDCEQEX₂EDX₂X₂YCX₂X₃X₅CX₅X₁X₄(SEQ ID NO:148)或REGCAX₁RCX₂KYX₄DEX₂X₃KCX₃ARMMSMSNTEEDCEQEX₂EDX₂X₂YCX₂X₃X₅CX₅X₁X₄(SEQ ID NO:167)，其中X₁可独立地选自S、T、D或N，X₂可独立地选自A、M、I、L或V，X₃可独立地选自D、E、N、Q、S或T，X₄可独立地选自D、E、H、K、R、N、Q、S或T，并且X₅可独立地选自H、K、R、N、Q、S或T。

在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含GSREX₁CX₂X₃RCX₄KYX₅DEX₆X₇KCX₈ARMMSMSNTEEDCEQELEDLLYCLDHCHSQ(SEQ ID NO:149)或REX₁CX₂X₃RCX₄KYX₅DEX₆X₇KCX₈ARMMSMSNTEEDCEQELEDLLYCLDHCHSQ(SEQ ID NO:168)，其中X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇和X₈是TfR结合界面残基，并且可独立地是任何氨基酸。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含GSREGCASRCMKYNDELEKCEARMMSMSNTEEDCEQEX₁EDX₂X₃YCX₄X₅X₆CX₇X₈X₉(SEQ ID NO:150)或REGCASRCMKYNDELEKCEARMMSMSNTEEDCEQEX₁EDX₂X₃YCX₄X₅X₆CX₇X₈X₉(SEQ ID NO:169)，其中X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇、X₈和X₉是TfR结合界面残基，并且可独立地是任何氨基酸。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含GSREX₁CX₂X₃RCX₄KYX₅DEX₆X₇KCX₈ARMMSMSNTEEDCEQEX₉EDX₁₀X₁₁YCX₁₂X₁₃X₁₃CX₁₅X₁₆X₁₇(SEQ ID NO:151)或REX₁CX₂X₃RCX₄KYX₅DEX₆X₇KCX₈ARMMSMSNTEEDCEQEX₉EDX₁₀X₁₁YCX₁₂X₁₃X₁₃CX₁₅X₁₆X₁₇(SEQ ID NO:170)，其中X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀、X₁₁、X₁₂、X₁₃、X₁₄、X₁₅、X₁₆和X₁₇是TfR结合界面残基，并且可独立地是任何氨基酸。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含GSREGCASRCMKYNDELEKCEARMMSMSNTEEDCEQELEDLLYCLDHCHSQ(SEQ ID NO:32)。

在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含X₁X₂X₃X₄GX₅ASX₆X₇MX₈X₉NX₁₀X₁₁LEX₁ ₂X₁₃EX₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂X₂₃X₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃X₃₄X₃₅X₃₆X₃₇X₃₈X₃₉X₄₀X₄₁X₄₂X₄₃(SEQ ID NO 152)，其中X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀、X₁₁、X₁₂、X₁₃、X₁₄、X₁₅、X₁₆、X₁₇、X₁₈、X₁₉、X₂₀、X₂₁、X₂₂、X₂₃、X₂₄、X₂₅、X₂₆、X₂₇、X₂₈、X₂₉、X₃₀、X₃₁、X₃₂、X₃₃、X₃₄、X₃₅、X₃₆、X₃₇、X₃₈、X₃₉、X₄₀、X₄₁、X₄₂和X₄₃可独立地是任何氨基酸。

在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁ ₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂X₂₃X₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃X₃₄X₃₅X₃₆X₃₇LX₃₈X₃₉LLX₄₀X₄₁LDHX₄₂HSQ(SEQID NO:153)，其中X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀、X₁₁、X₁₂、X₁₃、X₁₄、X₁₅、X₁₆、X₁₇、X₁₈、X₁₉、X₂₀、X₂₁、X₂₂、X₂₃、X₂₄、X₂₅、X₂₆、X₂₇、X₂₈、X₂₉、X₃₀、X₃₁、X₃₂、X₃₃、X₃₄、X₃₅、X₃₆、X₃₇、X₃₈、X₃₉、X₄₀、X₄₁和X₄₂可独立地是任何氨基酸。

在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含X₁X₂X₃X₄GX₅ASX₆X₇MX₈X₉NX₁₀X₁₁LEX₁ ₂X₁₃EX₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂X₂₃X₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉LX₃₀X₃₁LLX₃₂X₃₃LDHX₃₄HSQ(SEQ ID NO:154)，其中X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀、X₁₁、X₁₂、X₁₃、X₁₄、X₁₅、X₁₆、X₁₇、X₁₈、X₁₉、X₂₀、X₂₁、X₂₂、X₂₃、X₂₄、X₂₅、X₂₆、X₂₇、X₂₈、X₂₉、X₃₀、X₃₁、X₃₂、X₃₃和X₃₄可独立地是任何氨基酸。

在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽或肽复合物包含与SEQ ID NO:96、SEQID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个或其任何变体、同源物或功能片段的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同源性。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽或肽复合物包含SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个或其任何变体、同源物或功能片段。在一些实施方案中，结合TfR的肽包含以SEQ ID NO:32阐述的氨基酸序列。

在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，TfR结合肽在相应位置5、7、8、14、17、18、21、38、42、45、46、47、50、51中的任一者或它们的组合处包含作为表面界面残基的典型氨基酸残基。在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，TfR结合肽在相应位置G5、A7、S8、N14、L17、E18、E21、L38、L42、L45、D46、H47、S50、Q51中的任一者或它们的组合处包含作为表面界面残基的典型氨基酸残基。在一些实施方案中，本公开的肽或肽复合物在SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID N O:128、SEQ ID NO:220–SEQ IDNO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中包含这些相应残基中的至少一者或多者。因此，此类肽可被工程化来具有增强的与TfR的结合。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含X₁X₂X₃X₄GX₅ASX₆X₇X₈X₉X₁₀NX₁₁X₁₂LEX₁₃X₁₄EX₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂X₂₃X₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉X₃₀LX₃ ₁X₃₂X₃₃LX₃₄X₃₅LDHX₃₆X₃₇SQ(SEQ ID NO:155)，其中X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀、X₁₁、X₁₂、X₁₃、X₁₄、X₁₅、X₁₆、X₁₇、X₁₈、X₁₉、X₂₀、X₂₁、X₂₂、X₂₃、X₂₄、X₂₅、X₂₆、X₂₇、X₂₈、X₂₉、X₃₀、X₃₁、X₃₂、X₃₃、X₃₄、X₃₅、X₃₆和X₃₇可独立地是任何氨基酸。

在一些实施方案中，存在于肽的氨基酸序列中的表面远端亲水性氨基酸残基(例如D、E、H、K、R、N、Q、S或T)促进肽溶解性。在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，如本文公开的肽在相应位置3、4、9、11、15、16、19、23、26、28、29、30、31、32、33、35、36、37、39、40中的任一者或它们的任何组合处包含亲水性氨基酸残基。在一些情况下，以SEQ ID NO:32为参考，本公开的肽在以下相应位置处包含亲水性氨基酸残基：R3、E4、R9、K12、D15、E16、K19、R23、S26、S28、N29、T30、E31、E32、D33、E35、Q36、E37、E39、D40，或它们的任何组合。在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，相应位置R3、E4、R9、K12、D15、E16、K19、R23、S26、S28、N29、T30、E31、E32、D33、E35、Q36、E37、E39、D40中的任一者或任何组合可被突变成另一亲水性残基，而不显著影响溶解性或TfR结合。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含X₁X₂REX₃X₄X₅X₆RX₇X₈KX₉X₁₀DEX₁₁X₁₂KX₁₃X₁₄X₁₅RX₁₆X₁₇SX₁₈SNTEEDX₁₉EQEX₂₀EDX₂₁X₂₂X₂₃X₂₄X₂₅X₂ ₆X₂₇X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁(SEQ ID NO:156)，其中X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀、X₁₁、X₁₂、X₁₃、X₁₄、X₁₅、X₁₆、X₁₇、X₁₈、X₁₉、X₂₀、X₂₁、X₂₂、X₂₃、X₂₄、X₂₅、X₂₆、X₂₇、X₂₈、X₂₉、X₃₀和X₃₁可独立地是任何氨基酸。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含GSX₁X₂GCASX₃CMX₄YNX ₅X₆LEX₇CEAX₈MMX₉MX₁₀X₁ ₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅CX₁₆X₁₇X₁₈LX₁₉X₂₀LLYCLDHCHSQ(SEQ ID NO:157)或X₁X₂GCASX₃CMX₄YNX₅X₆LEX₇CEAX₈MMX₉MX₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅CX₁₆X₁₇X₁₈LX₁₉X₂₀LLYCLDHCHSQ(SEQ ID NO:171)，其中X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀、X₁₁、X₁₂、X₁₃、X₁₄、X₁₅、X₁₆、X₁₇、X₁₈、X₁₉和X₂₀可独立地选自D、E、H、K、R、N、Q、S或T。

在一些实施方案中，以SEQ ID NO:96为参考，本公开的肽在相应位置4、8、18、32、42和46处包含半胱氨酸氨基酸残基。在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，本公开的肽在相应位置6、10、20、34、44和48处包含半胱氨酸氨基酸残基。在一些实施方案中，以SEQID NO:32为参考，本公开的肽在相应位置15、35、39、49或它们的任何组合处包含亲水性残基(例如D、E、H、K、R、N、Q、S或T)。在一些情况下，以SEQ ID NO:32为参考，本公开的肽在以下相应位置处包含亲水性氨基酸残基：D15、E35、E39、H49或它们的任何组合。在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，相应位置D15、E35、E39、H49中的任一者或任何组合可被突变成另一亲水性残基，而不显著影响溶解性或TfR结合。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄DX₁ ₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂X₂₃X₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃EX₃₄X₃₅X₃₆EX₃₇X₃₈X₃₉X₄₀X₄₁X₄₂X₄₃X₄₄X₄₅HX₄ ₆X₄₇(SEQ ID NO:158)，其中X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀、X₁₁、X₁₂、X₁₃、X₁₄、X₁₅、X₁₆、X₁₇、X₁₈、X₁₉、X₂₀、X₂₁、X₂₂、X₂₃、X₂₄、X₂₅、X₂₆、X₂₇、X₂₈、X₂₉、X₃₀、X₃₁、X₃₂、X₃₃、X₃₄、X₃₅、X₃₆、X₃₇、X₃₈、X₃₉、X₄₀、X₄₁、X₄₂、X₄₃、X₄₄、X₄₅、X₄₆和X₄₇可独立地是任何氨基酸。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含GSREGCASRCMKYNX₁ELEKCEARMMSMSNTEEDCX₂QELX₃DLLYCLDHCX₄SQ(SEQ ID NO:159)或REGCASRCMKYNX₁ELEKCEARMMSMSNTEEDCX₂QELX₃DLLYCLDHCX₄SQ(SEQ ID NO:172)，其中X₁、X₂、X₃和X₄可独立地选自D、E、H、K、R、N、Q、S或T。

在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，本公开的肽在相应位置15、35、39、49或它们的任何组合处包含疏水性残基(例如A、M、I、L、V、F、W或Y)。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含GSREGCASRCMKYNX₁ELEKCEARMMSMSNTEEDCX₂QELX₃DLLYCLDHCX₄SQ(SEQID NO:160)或REGCASRCMKYNX₁ELEKCEARMMSMSNTEEDCX₂QELX₃DLLYCLDHCX₄SQ(SEQ ID NO:173)，其中X₁、X₂、X₃和X₄可独立地选自A、M、I、L、V、F、W或Y。在一些实施方案中，以SEQ IDNO:32为参考，在相应位置15、35、39和49中的任一者处的亲水性氨基酸残基与对TfR的较高结合亲和力(例如靶标啮合)和较高溶解性相关联。在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，在相应位置15、35、39和49中的任一者处的氨基酸残基从疏水性残基突变成亲水性残基可导致对TfR的较高结合亲和力(例如靶标啮合)和较高溶解性。

在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，本公开的肽在相应位置11、25、27或它们的任何组合处包含疏水性残基(例如A、M、I、L、V、F、W或Y)。在一些实施方案中，以SEQID NO:32为参考，本公开的肽在相应位置11、25、27或它们的任何组合处包含亲水性残基(例如D、E、H、K、R、N、Q、S或T)。在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，在相应位置11、25和27中的任一者处的疏水性氨基酸残基与对TfR的较高结合亲和力(例如靶标啮合)和较高溶解性相关联。在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，在相应位置11、25和27中的任一者处的氨基酸残基从亲水性残基突变成疏水性残基可导致对TfR的较高结合亲和力(例如靶标啮合)和较高溶解性。在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，本公开的肽在相应位置M11、M25、M27或它们的任何组合处包含疏水性氨基酸残基。在一些情况下，以SEQID NO:32为参考，肽在相应位置M11、M25和M27处包含疏水性氨基酸残基。在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，相应位置M11、M25和M27的任何组合可被突变成另一疏水性残基，而不显著影响溶解性或TfR结合。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀MX₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂X₂₃MX₂₄MX₂₅X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃X₃₄X₃₅X₃ ₆X₃₇X₃₈X₃₉X₄₀X₄₁X₄₂X₄₃X₄₄X₄₅X₄₆X₄₇X₄₈(SEQ ID NO:161)，其中X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀、X₁₁、X₁₂、X₁₃、X₁₄、X₁₅、X₁₆、X₁₇、X₁₈、X₁₉、X₂₀、X₂₁、X₂₂、X₂₃、X₂₄、X₂₅、X₂₆、X₂₇、X₂₈、X₂₉、X₃₀、X₃₁、X₃₂、X₃₃、X₃₄、X₃₅、X₃₆、X₃₇、X₃₈、X₃₉、X₄₀、X₄₁、X₄₂、X₄₃、X₄₄、X₄₅、X₄₆、X₄₇和X₄₈可独立地是任何氨基酸。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含GSREGCASRCX₁KYNDELEKCEARMX₂SX₃SNTEEDCEQELEDLLYCLDHCHSQ(SEQ ID NO:162)或REGCASRCX₁KYNDELEKCEARMX₂SX₃SNTEEDCEQELEDLLYCLDHCHSQ(SEQ ID NO:174)，其中X₁、X₂和X₃可独立地选自A、M、I、L、V、F、W或Y。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含GSREGCASRCX₁KYNDELEKCEARMX₂SX₃SNTEEDCEQELEDLLYCLDHCHSQ(SEQ ID NO:163)或REGCASRCX₁KYNDELEKCEARMX₂SX₃SNTEEDCEQELEDLLYCLDHCHSQ(SEQ IDNO:175)，其中X₁、X₂和X₃可独立地选自D、E、H、K、R、N、Q、S或T。

在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，本公开的肽在相应位置45处包含脂族氨基酸残基(例如A、M、I、L或V)。在一些实施方案中，本公开的肽在相应位置45处包含芳族氨基酸残基(例如F、W或Y)。在一些实施方案中，在相应位置45处的脂族氨基酸残基与对TfR的较高结合亲和力相关联。在一些情况下，以SEQ ID NO:32为参考，肽包含对应于L45的脂族氨基酸残基。在一些实施方案中，在相应位置45处的氨基酸残基从芳族残基突变成脂族残基可导致对TfR的较高结合亲和力(例如靶标啮合)和较高溶解性。在一些实施方案中，使相应位置L45突变成另一脂族残基可不显著影响溶解性或TfR结合。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂X₂₃X₂₄X₂ ₅X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃X₃₄X₃₅X₃₆X₃₇X₃₈X₃₉X₄₀X₄₁X₄₂X₄₃X₄₄LX₄₅X₄₆X₄₇X₄₈X₄₉X₅₀(SEQ ID NO:164)，其中X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀、X₁₁、X₁₂、X₁₃、X₁₄、X₁₅、X₁₆、X₁₇、X₁₈、X₁₉、X₂₀、X₂₁、X₂₂、X₂₃、X₂₄、X₂₅、X₂₆、X₂₇、X₂₈、X₂₉、X₃₀、X₃₁、X₃₂、X₃₃、X₃₄、X₃₅、X₃₆、X₃₇、X₃₈、X₃₉、X₄₀、X₄₁、X₄₂、X₄₃、X₄₄、X₄₅、X₄₆、X₄₇、X₄₈、X₄₉和X₅₀可独立地是任何氨基酸。在一些实施方案中，本文公开的TfR结合肽包含GSREGCASRCMKYNDELEKCEARMMSMSNTEEDCEQELEDLLYCX₁DHCHSQ(SEQ ID NO:165)或REGCASRCMKYNDELEKCEARMMSMSNTEEDCEQELEDLLYCX₁DHCHSQ(SEQ ID NO:176)，其中X₁可独立地选自A、M、I、L或V。

在一些实施方案中，本公开的肽包含GSREGCASRCMX₁YNDELEX₂CEARMMSMSNTEEDCEQELEDLLYCLDHCHSQ(SEQ ID NO:166)或REGCASRCMX₁YNDELEX₂CEARMMSMSNTEEDCEQELEDLLYCLDHCHSQ(SEQ ID NO:177)，其中X₁和X₂可独立地选自K或R。在一些实施方案中，以SEQ ID NO:32为参考，在相应位置12和19处的这些残基可用于化学缀合至另一分子(例如活性剂或可检测剂)。在一些实施方案中，X₁和X₂均是R，并且化学缀合发生在肽的N末端。

在一些实施方案中，受体结合肽可源自抗体或抗体片段。例如，受体结合肽可源自单链抗体片段(scFv)。可并入本公开的选择性耗竭复合物中的TfR结合肽的实例包括SEQID NO:220(QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASRFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLSGYGDYPDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVMYGRNERPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQPEDEANYYCAGWDDSLTGPVFGGGTKLTVLG)、SEQ ID NO:221(QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASRFTFNNYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLSGYGDYPDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVMYGRNERPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQPEDEANYYCAGWDDSLTGPVFGGGTKLTVLG)和SEQ ID NO:222(QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASRYPFHHHDHHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLSGYGDYPDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVMYGRNERPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQPEDEANYYCAGWDDSLTGPVFGGGTKLTVLG)。在一些实施方案中，TfR结合肽可具有SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222中的任一个或其片段的序列。在一些实施方案中，TfR结合肽可具有与SEQ ID NO:220–SEQ IDNO:222中的任一个或其片段具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:220或SEQ ID NO:221的肽可充当非pH依赖性TfR结合肽。在一些实施方案中，SEQ ID NO:222的肽可充当pH依赖性TfR结合肽。

在一些实施方案中，本公开的肽的氨基酸残基中的任何一者或多者的突变可改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的5-80％的氨基酸残基的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的1-100％、5-100％，或5-50％的氨基酸残基的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的15-50％的氨基酸残基的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的15-30％的氨基酸残基的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的25-30％的氨基酸残基的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。举例来说，具有SEQ ID NO:32的序列的肽的51个氨基酸残基中的14个(27.5％)的突变可改善所述肽与TfR的结合亲和力。

在一些实施方案中，本公开的肽的氨基酸残基中的任何一者或多者的突变可处于TfR的结合界面处。在一些实施方案中，肽的突变可改善结合亲和力，这可有益于本文公开的肽或肽复合物的结合和胞吞转运。在一些实施方案中，本文提供的肽可具有许多突变或少许突变以获得最优活性，其中最优活性是足以啮合TfR的结合，但未必是如此强烈以致阻碍在胞吞转运之后肽和/或肽复合物的释放的结合。因此，本公开的肽可包含调谐结合亲和力和解离速率以获得肽或肽复合物的最优结合、功能(例如，胞吞转运、BBB穿透、细胞膜穿透、穿过生物屏障的转运、内吞作用、再循环或它们的组合)和释放的许多突变(也被称为突变氨基酸残基％)。因此，导致最高可能亲和力的突变可能未必与具有最优结合和胞吞转运的优越肽相关联。

在一些实施方案中，本公开的肽的1-100％或5-100％的氨基酸残基处于TfR的结合界面处。在一些实施方案中，本公开的肽的10-90％的氨基酸残基处于TfR的结合界面处。在一些实施方案中，本公开的肽的20-80％的氨基酸残基处于TfR的结合界面处。在一些实施方案中，本公开的肽的30-70％的氨基酸残基处于TfR的结合界面处。在一些实施方案中，本公开的肽的40-60％的氨基酸残基处于TfR的结合界面处。在一些实施方案中，本公开的肽的30-35％的氨基酸残基处于TfR的结合界面处。举例来说，具有SEQ ID NO:32的序列的肽的51个氨基酸残基中的17个(33％)可处于TfR的结合界面处。

在一些实施方案中，本公开的肽的处于TfR的结合界面处的氨基酸残基中的任何一者或多者的突变可改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的处于TfR的结合界面处的氨基酸残基中的1-100％或5-100％的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的处于TfR的结合界面处的氨基酸残基中的5-80％的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的处于TfR的结合界面处的氨基酸残基中的10-70％的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的处于TfR的结合界面处的氨基酸残基中的15-60％的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的处于TfR的结合界面处的氨基酸残基中的20-50％的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的处于TfR的结合界面处的氨基酸残基中的25-30％的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。举例来说，具有SEQ ID NO:32的序列的肽的处于TfR的结合界面处的17个氨基酸残基中的5个(29％)的突变可改善所述肽与TfR的结合亲和力。

在一些实施方案中，本公开的肽的氨基酸残基中的任何一者或多者的突变在TfR的结合界面的远端。在一些实施方案中，本公开的肽的1-100％或5-100％的氨基酸残基在TfR的结合界面的远端。在一些实施方案中，本公开的肽的10-90％的氨基酸残基在TfR的结合界面的远端。在一些实施方案中，本公开的肽的20-80％的氨基酸残基在TfR的结合界面的远端。在一些实施方案中，本公开的肽的30-70％的氨基酸残基在TfR的结合界面的远端。在一些实施方案中，本公开的肽的40-60％的氨基酸残基在TfR的结合界面的远端。在一些实施方案中，本公开的肽的65-70％的氨基酸残基在TfR的结合界面的远端。举例来说，具有SEQ ID NO:32的序列的肽的51个氨基酸残基中的34个(66％)可处于TfR的结合界面处。

在一些实施方案中，本公开的肽的在TfR的结合界面的远端的氨基酸残基中的任何一者或多者的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的在TfR的结合界面的远端的氨基酸残基中的1-100％或5-100％的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的在TfR的结合界面的远端的氨基酸残基中的5-80％的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的在TfR的结合界面的远端的氨基酸残基中的10-70％的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的在TfR的结合界面的远端的氨基酸残基中的15-60％的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的在TfR的结合界面的远端的氨基酸残基中的20-50％的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，本公开的肽的在TfR的结合界面的远端的氨基酸残基中的25-30％的突变改善所述肽与TfR的结合亲和力。举例来说，在TfR的结合界面的远端的17个氨基酸残基中的5个的突变可改善所述肽与TfR的结合亲和力。举例来说，具有SEQ ID NO:32的序列的肽的在TfR的结合界面的远端的34个氨基酸残基中的9个(26.5％)的突变可改善所述肽与TfR的结合亲和力。在一些实施方案中，并且在不束缚于任何理论下，肽的在TfR的结合界面的远端的氨基酸残基的一个或多个突变可改善蛋白质折叠，增强蛋白质溶解性，并且/或者改变主链几何结构，所述主链几何结构可通过优化的界面形状互补性来改善结合。

在一些实施方案中，本公开的受体结合肽可以是PD-L1结合肽。可将PD-L1结合肽并入本公开的选择性耗竭复合物中，以促进经由PD-L1介导的内吞作用选择性耗竭靶标分子。在一些实施方案中，作为受体结合肽的PD-L1结合肽可以非pH依赖性的亲和力结合PD-L1(例如，在细胞外pH和在内体pH下具有相似的亲和力)，或者可以pH依赖性的亲和力(例如，在细胞外pH下较高亲和力和在内体pH下较低亲和力)结合PD-L1。PD-L1结合肽的实例提供在表2中。

表2–示例性PD-L1结合肽

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在一些实施方案中，本文公开的PD-L1结合肽包含X¹X²X³CX⁴X⁵X⁶CX⁷X⁸X⁹X¹⁰X¹¹X¹²X¹³X¹⁴X¹⁵CX¹⁶X¹⁷X¹⁸X¹⁹X²⁰X²¹X²²X²³X²⁴X²⁵X²⁶X²⁷X²⁸CX²⁹X³⁰X³¹X³²X³³X³⁴X³⁵X³⁶X³⁷CX³⁸X³⁹X⁴⁰CX⁴¹X⁴²X⁴³(SEQ ID NO:392)的序列，其中X¹可独立地选自E、M、V或W；X²可独立地选自G、E、L或F；X³可独立地选自D、E或S；X⁴可独立地选自K、R或V；X⁵可独立地选自E、Q、S、M、L或V；X⁶可独立地选自D、E、H、K、R、N、Q、S或Y；X⁷可独立地选自D、M或V；X⁸可独立地选自A、K、R、Q、S或T；X⁹可独立地选自A、D、E、H、Q、S、T、M、I、L、V或W；X¹⁰可独立地选自A、E、R、Q、S、T、W或P；X¹¹可独立地选自A、E、K、R、N、Q、T、M、I、L、V或W；X¹²可独立地选自G、A、E、K、N、T或Y；X¹³可独立地选自G、A、D、E、H、K、R、N、Q、S、T、M、I、L、V、W、Y或P；X¹⁴可独立地选自D、K、R、N、L或V；X¹⁵可独立地选自G、A、D、T、L、W或P；X¹⁶可独立地选自G、A、E、H、K、N、S、F或P；X¹⁷可独立地选自G、A、D、E、N或P；X¹⁸可独立地选自G、D、H、K、R、N、Q、S、T、V或Y；X¹⁹可独立地选自G、D、E、H、K、N、Q、S、T、M、I、F、W、Y或P；X²⁰可独立地选自G、A、D、E、H、K、R、N、Q、S、Y或P；X²¹可独立地选自G、A、D、H、N、Q、S、V、F或P；X²²可独立地选自A、D、H、N、Q、S、T、M、I、V、Y或P；X²³可独立地选自G、A、D、K、R、T、W或Y；X²⁴可独立地选自G、A、E、N、Q、T、I、V或P；X²⁵可独立地选自G、D、N、Q、T、L、V、F或P；X²⁶可独立地选自G、A、E、K、R、N、Q、S、T、I、Y或P；X²⁷可独立地选自A、D、N或I；X²⁸可独立地选自G、D、E、H、N、F或W；X²⁹可独立地选自G、A、E、N、S、Y或P；X³⁰可独立地选自G、M或L；X³¹可独立地选自G、A、D、K、N、Q或W；X³²可独立地选自D、E、H、K、N、Q、S、T、L、V、F、Y或P；X³³可独立地选自G、E、Q或F；X³⁴可独立地选自D或K；X³⁵可独立地选自G、V或P；X³⁶可独立地选自G、H、R、V、F、W或P；X³⁷可独立地选自A、D或K；X³⁸可独立地选自E、H、Q、L或F；X³⁹可独立地选自D、E、R、S、T、M、L或F；X⁴⁰可独立地选自G、A、D、E、H、K、R、M、L或P；X⁴¹可独立地选自G、A、K、S、I或L；X⁴²可独立地选自G、A、D、E、R、Q、T或F；并且X⁴³可独立地选自A、H、N、Q、S、F或P。

在一些实施方案中，本文公开的结合肽包含EEDCKVX¹CVX¹X¹X¹X¹X²X³KX¹CX¹EX¹X⁴X¹X¹X¹X¹X¹X¹X¹AX¹CX¹GX¹X⁵FX⁶VFX⁶CLX¹X¹CX¹X¹X¹(SEQ ID NO:393)的序列，其中X¹可独立地选自任何非半胱氨酸氨基酸；X²可独立地选自M、I、L或V；X³可独立地选自Y、A、H、K、R、N、Q、S或T；X⁴可独立地选自D、E、N、Q或P；X⁵可独立地选自K或P；并且X⁶可独立地选自D或K。

PD-L1结合肽可包含形成与PD-L1的结合界面的部分或全部的PD-L1结合基序。PD-L1结合基序的一个或多个残基可在PD-L1结合肽与PD-L1之间的结合界面处与PD-L1的一个或多个残基相互作用。在一些实施方案中，多个PD-L1结合基序可存在于PD-L1结合肽中。PD-L1结合基序可包含CX¹X²X³CX⁴X⁵X⁶X⁷X⁸X⁹X¹⁰X¹¹X¹²C(SEQ ID NO:394)的序列，其中X¹可独立地选自K、R或V；X²可独立地选自E、Q、S、M、L或V；X³可独立地选自D、E、H、K、R、N、Q、S或Y；X⁴可独立地选自D、M或V；X⁵可独立地选自A、K、R、Q、S或T；X⁶可独立地选自A、D、E、H、Q、S、T、M、I、L、V或W；X⁷可独立地选自A、E、R、Q、S、T、W或P；X⁸可独立地选自A、E、K、R、N、Q、T、M、I、L、V或W；X⁹可独立地选自G、A、E、K、N、T或Y；X¹⁰可独立地选自G、A、D、E、H、K、R、N、Q、S、T、M、I、L、V、W、Y或P；X¹¹可独立地选自D、K、R、N、L或V；并且X¹²可独立地选自G、A、D、T、L、W或P。在一些实施方案中，PD-L1结合基序可包含CKVX¹CVX¹X¹X¹X¹X²X³KX¹C(SEQ ID NO:396)的序列，其中X¹可独立地选自任何非半胱氨酸氨基酸；X²可独立地选自M、I、L或V；并且X³可独立地选自Y、A、H、K、R、N、Q、S或T。在一些实施方案中，PD-L1结合基序可包含CKVHCVKEWMAGKAC(SEQ ID NO:398)的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合基序可包含与SEQ ID NO:398的至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％同一性。

PD-L1结合基序可包含X¹X²X³X⁴X⁵X⁶CX⁷X⁸X⁹C(SEQ ID NO:395)的序列，其中X¹可独立地选自D、E、H、K、N、Q、S、T、L、V、F、Y或P；X²可独立地选自G、E、Q或F；X³可独立地选自D或K；X⁴可独立地选自G、V或P；X⁵可独立地选自G、H、R、V、F、W或P；X⁶可独立地选自A、D或K；X⁷可独立地选自E、H、Q、L或F；X⁸可独立地选自D、E、R、S、T、M、L或F；并且X⁹可独立地选自G、A、D、E、H、K、R、M、L或P。在一些实施方案中，PD-L1结合基序可包含X¹FX²VFX²CLX³X³C(SEQ ID NO:397)的序列，其中X¹可独立地选自K或P；X²可独立地选自D或K；并且X³可独立地选自任何非半胱氨酸氨基酸。在一些实施方案中，PD-L1结合基序可包含KFDVFKCLDHC(SEQ ID NO:399)的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合基序可包含与SEQ ID NO:399的至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％同一性。

在内体pH下具有高亲和力PD-L1结合的PD-L1结合肽(例如，SEQ ID NO:187、SEQID NO:233–SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:400–SEQ ID NO:456或SEQ ID NO:240中的任一个或其非pH依赖性变体)可与如本文所述的靶标结合肽复合以形成用于选择性耗竭靶标分子的选择性耗竭复合物。选择性耗竭复合物可用于选择性地递送靶标分子穿过细胞层或膜。例如，选择性耗竭复合物可用于经由PD-L1介导的内吞作用将靶标分子选择性地递送至内吞区室。靶标分子可在与选择性耗竭复合物的靶标结合肽结合并经由如所描述的PD-L1介导的内吞作用进行内吞作用后被选择性地耗竭。

使用PD-L1介导的内吞作用选择性耗竭靶标分子可用于选择性地耗竭特异性地在表达PD-L1的组织中的靶标分子。在一些实施方案中，包含结合PD-L1的受体结合肽的选择性耗竭复合物可用于选择性地耗竭PD-L1阳性癌症、肺组织、胰岛组织、淋巴组织、胃肠组织、骨髓组织、生殖组织、肌肉组织、脂肪组织或任何其他PD-L1阳性组织中的靶标分子。例如，包含PD-L1结合肽和ACE2结合肽的选择性耗竭复合物可用于选择性地耗竭肺组织中的ACE2，以预防病毒感染(例如SARS-CoV-2感染)。在另一个实例中，包含PD-L1结合肽和HLA结合肽的选择性耗竭复合物可用于选择性地耗竭胰岛细胞中的HLA，以防止I型糖尿病中T细胞对表达胰岛素的细胞的攻击。

PD-L1结合肽(例如，SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:233–SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:400–SEQ ID NO:456或SEQ ID NO:240中的任一个)可充当选择性耗竭复合物中的靶标结合肽或受体结合肽。在一些实施方案中，用于选择性地耗竭PD-L1的选择性耗竭复合物可包含不结合PD-L1的受体结合肽(例如，TfR结合肽)和PD-L1结合肽(例如，pH依赖性PD-L1结合肽)。在一些实施方案中，用于选择性耗竭非PD-L1的靶标的选择性耗竭复合物可包含结合所述靶标的靶标结合肽(例如，EGFR结合肽)和PD-L1结合肽(例如，非pH依赖性PD-L1结合肽)。

靶标结合肽

本公开的肽、肽复合物或选择性耗竭复合物可包含靶标结合肽。靶标结合肽可能能够结合靶标分子(例如，靶蛋白)。在一些实施方案中，靶标结合肽可以pH依赖性的亲和力结合至靶标分子。例如，靶标结合肽可在细胞外pH(诸如约pH 7.4)下以比在内体pH(例如约pH 5.5)下更高的亲和力结合靶标分子。靶标结合肽可缀合至本公开的受体结合肽(例如，SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个的TfR结合肽或SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:233–SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:400–SEQ ID NO:456或SEQ ID NO:241中的任一个的PD-L1结合肽)以形成选择性耗竭复合物。选择性耗竭复合物可用于选择性地递送靶标分子穿过细胞层或膜(例如，BBB或细胞膜)。例如，选择性耗竭复合物可用于经由受体介导的内吞作用(例如，PD-L1介导的内吞作用或TfR介导的内吞作用)将靶标分子选择性地递送至内吞区室。靶标分子可在与选择性耗竭复合物的靶标结合肽结合并经由受体介导的内吞作用进行内吞作用后被选择性地耗竭。靶标分子可以是可溶性分子。例如，靶标分子可以是分泌肽或蛋白质、细胞信号传导分子、细胞外基质大分子(例如，胶原蛋白、弹性蛋白、微原纤维蛋白或蛋白聚糖)、神经递质、细胞因子、生长因子、肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原或激素。靶标分子可以是细胞表面分子。例如，靶标分子可以是跨膜蛋白、受体(包括生长因子受体)、检查点抑制剂、免疫检查点抑制剂、抑制性免疫受体、抑制性免疫受体的配体、巨噬细胞表面蛋白(例如，CD14或CD16)、脂多糖或抗体。抑制性免疫受体可以是CD200R、CD300a、CD300f、CEACAM1、FcgRiib、ILT-2、ILT-3、ILT-4、ILT-5、LAIR-1、PECAM-1、PILR-α、SIRL-1和SIRP-α、CLEC4A、Ly49Q、MICL。使用包含结合至细胞表面分子的靶标结合肽的选择性耗竭复合物选择性耗竭细胞表面分子可导致细胞表面分子(例如，表面暴露蛋白)的减少。表面暴露蛋白可与疾病或疾患相关。在一些实施方案中，本公开的选择性耗竭复合物可包含两个或更多个靶标结合肽以促进靶标分子的二聚化。促进二聚化可增加靶标分子的内化，从而导致靶标分子的选择性耗竭。例如，包含靶标结合肽的两个拷贝的选择性耗竭复合物可促进靶标分子的同二聚化。在一些实施方案中，本公开的靶标结合肽可包含小蛋白、纳米抗体、抗体、IgG、抗体片段、Fab、F(ab)2、scFv、(scFv)2、DARPin或亲和体。在一些实施方案中，靶标结合肽可包含胱氨酸密集肽、affitin、adnectin、avimer、Kunitz结构域、nanofittin、fynomer、双环肽、β-发夹或钉合肽。

在一些实施方案中，本公开的靶标结合肽可以pH依赖性的亲和力结合至靶标分子。例如，靶标结合肽可在细胞外pH(诸如约pH 7.4)下以高于内吞pH(诸如约pH 7.0、pH6.5、pH 6.0或pH 5.5)下的结合亲和力的亲和力结合靶标分子。在一些实施方案中，在细胞外pH(约pH 7.4)下靶标结合肽对靶标分子的结合亲和力可以是在内体pH(诸如约pH 7.0、pH 6.5、pH 6.0、pH 5.5或pH 5.0)下靶标结合肽对靶标分子的结合亲和力的至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约500倍、至少约1000倍、至少约10,000倍。在一些实施方案中，在pH 6.5或pH 5.5下靶标结合肽对靶标的亲和力不大于在pH 7.4下靶标结合肽对靶标的亲和力的约0.1％、约0.5％、约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％或约50％。在一些实施方案中，在pH 7.4下靶标结合肽对靶标的亲和力是在pH 6.5或pH 5.5下靶标结合肽对靶标的亲和力的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍或至少20倍。

在一些实施方案中，具有pH依赖性结合的靶标结合肽可在细胞外pH(诸如约pH7.4)下以小于50μM、小于5μM、小于500nM、小于100nM、小于40nM、小于30nM、小于20nM、小于10nM、小于5nM、小于2nM、小于1nM、小于0.5nM、小于0.4nM、小于0.3nM、小于0.2nM或小于0.1nM的解离常数(K_D)结合靶标分子。在一些实施方案中，具有pH依赖性结合的靶标结合肽可在内体pH(约pH 5.5或约pH 6.5)下以至少1nM、至少2nM、至少5nM、至少10nM、至少20nM、至少50nM、至少100nM、至少200nM、至少500nM、至少1μM、至少2μM、至少5μM、至少10μM、至少20μM、至少50μM、至少100μM、至少500μM、至少1mM、至少2mM、至少5mM、至少10mM、至少20mM、至少50mM、至少100mM、至少200mM、至少500mM或至少1M的解离常数(K_D)结合靶标分子。

在一些实施方案中，靶标结合分子可以在内化到内体区室和内体酸化后释放靶标分子。内体酸化后靶标分子的这种释放可在约pH7.3、pH 7.2、pH 7.1、pH 7.0、pH 6.9、pH6.8、pH 6.7、pH 6.6、pH 6.5、pH 6.4、pH 6.3、pH 6.2、pH 6.1、pH 6.0、pH 5.9、pH 5.8、pH5.7、pH 5.6、pH 5.5、pH 5.4、pH 5.3、pH 5.2、pH 5.1、pH 5.0、pH 4.9、pH 4.8、pH 4.7、pH4.6、pH 4.5或更低下发生。在一些实施方案中，靶标分子的释放可在约pH 7.0至约pH 4.5、约pH 6.5至约pH 5.0、或约pH 6.0至约pH 5.5或更低的pH下发生。

具有pH依赖性结合亲和力的靶标结合肽可通过在靶标结合界面中选择性整合组氨酸(His)氨基酸残基来进行工程化。在一些情况下，具有pH依赖性结合亲和力的靶标结合肽在靶标结合界面中包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个组氨酸残基。由于组氨酸的侧链在介于约6.0与约9.2之间的pH下主要不带电荷并且在低于约6.0的pH下主要带正电荷，因此在靶标结合肽中选择性地插入或除去His残基可赋予pH依赖性结合性质。靶标结合肽(例如，具有pH依赖性结合亲和力的靶标结合肽)可包含胱氨酸密集肽(CDP)、亲和体、DARPin、centyrin、nanofittin或adnectin。靶标结合CDP、靶标结合亲和体、靶标结合adnectin可在低pH(例如，在内体pH)下稳定。在一些实施方案中，靶标结合肽可包含抗体(例如，IgG或其他抗体)、抗体片段(例如，scFv、scFv2、Fab、F(ab)2或其他抗体片段)或纳米抗体(例如，来自骆驼科动物或鲨鱼的VHH结构域纳米抗体或VNAR结构域纳米抗体)，其可在低pH下稳定。

在一些实施方案中，在内化至内体区室后靶标结合肽对靶标分子的释放可受到细胞外生理环境与内体细胞区室之间离子强度的差异的影响。在一些实施方案中，内体区室的离子强度高于细胞外生理环境的离子强度。随盐浓度变化的离子强度可取决于溶液中各种电解质的浓度，例如氢(H⁺)、氢氧化物(OH^-)、水合氢(H₃O⁺)、钠(Na⁺)、钾(K⁺)、钙(Ca²⁺)、镁(Mg²⁺)、锰(Mn²⁺)、氯化物(C l^-)、碳酸盐(CO₃ ^2-)、钴(Co²⁺)、磷酸盐(PO₄ ^3-)或硝酸盐(NO₃ ^-)。在一些实施方案中，具有盐依赖性或离子强度依赖性结合亲和力的靶标结合肽可通过在靶标结合界面中选择性整合盐不稳定部分(例如，极性或带电氨基酸侧链)来进行工程化，这将实现内体中的靶标结合分子的解离。例如，靶标结合肽的靶标结合界面可与靶标结合肽形成一种或多种极性或电荷-电荷相互作用，所述相互作用可随着环境的离子强度增加而被破坏。

在一些情况下，结合亲和力依赖于离子强度(例如，依赖于于氢、氢氧化物、水合氢、钠、钾、钙、镁、锰、氯化物、碳酸盐、钴、磷酸盐和/或硝酸盐)的靶标结合肽可在一定范围的离子强度，例如约30mM至约1M的离子强度下解离。在一些实施方案中，具有依赖于离子强度的结合亲和力的离子强度依赖性靶标结合肽可在约50mM至约、约50mM至约1M、约60mM至约950mM、约70mM至约900mM、约80mM至约850mM、约90mM至约800mM、约100mM至约750mM、约110mM至约700mM、约120mM至约650mM、约130mM至约600mM、约140mM至约550mM、约150mM至约500mM、约160mM至约450mM、约170mM至约400mM、约180mM至约350mM、约190mM至约300mM或约200mM至约250mM的离子强度下解离。在一些实施方案中，离子强度依赖性靶标结合肽在靶标结合界面中包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20种极性或电荷-电荷相互作用。

本公开的靶标结合肽可结合至靶标分子，诸如具有临床相关性的靶标分子。在一些实施方案中，靶标分子可以是可溶性分子、细胞外分子或细胞表面分子。在一些实施方案中，靶标分子是蛋白质、肽、脂质、碳水化合物、核酸或聚糖。在一些实施方案中，靶标分子可以是在疾病或疾患中过度表达或过度激活的蛋白质。例如，靶标分子可以是参与致癌信号传导、免疫抑制或促炎信号传导的跨膜蛋白。可由本公开的靶标结合肽靶向的靶标分子的实例包括但不限于CD3、CD47、CD28、CD137、CD89、CD16、CD29、CD44、CD71、CD73、CD90、CD105、CD166、CD27、CD39、CD24、CD25、CD74、CD40L、MUC1、MUC16、MUC2、MUC5AC、MUC4、OX40、4-1BB、HLA-G、LAG3、Tim3、TIGIT、GITR、TCR、TNF-α、EGFR、EGFRvIII、TKI抗性EGFR、HER2、ERBB3、PDGFR、FGF、VEGF、VEGFR、IGFR1、CTLA4、STRO1、补体因子C4、补体因子C1q、补体因子C1s、补体因子C1r、补体因子C3、补体因子C3a、补体因子C3b、补体因子C5、补体因子C5a、TGFβ、PCSK9、P2Y6、HER3、RANK、tau、淀粉样蛋白β、亨廷顿蛋白、α-突触核蛋白、葡糖脑苷脂酶、α-葡糖苷酶、IL-1、IL-1R、IL-1β、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-10、IL-10R、IL-17、IL-23、IL-12、p40、B7家族的成员、c-Met、SIGLEC、MCP-1、MHC、MHCI、MHCII、PD-1和PD-L1。靶标分子的另外实例包括甘露糖-6-磷酸聚糖、葡萄糖-6-磷酸和糖特异性受体(例如，凝集素)。靶标分子的另外实例包括自身抗体，诸如类风湿因子、抗核抗体、抗嗜中性粒细胞细胞质抗体、抗dsDNA、抗着丝点抗体、抗组蛋白抗体、环瓜氨酸肽抗体、可提取核抗原抗体、心磷脂抗体、β-2糖蛋白1抗体、抗磷脂抗体、狼疮抗凝剂、糖尿病相关自身抗体、抗组织转谷氨酰胺酶、抗醇溶蛋白抗体、内因子抗体、壁细胞抗体、甲状腺自身抗体、平滑肌抗体、抗线粒体抗体、肝肾微粒体1型抗体、抗肾小球基底细胞膜抗体、乙酰胆碱受体抗体。靶标分子(例如，CD3、CD47、CD28、CD137、CD89、CD16、CD29、CD44、CD71、CD73、CD90、CD105、CD166、CD27、CD39、CD24、CD25、CD74、CD40L、MUC1、MUC16、MUC2、MUC5AC、MUC4、OX40、4-1BB、HLA-G、LAG3、Tim3、TIGIT、GITR、TCR、TNF-α、EGFR、EGFRvIII、TKI抗性EGFR、HER2、ERBB3、PDGFR、FGF、VEGF、VEGFR、IGFR1、CTLA4、STRO1、补体因子C4、补体因子C1q、补体因子C1s、补体因子C1r、补体因子C3、补体因子C3a、补体因子C3b、补体因子C5、补体因子C5a、TGFβ、PCSK9、P2Y6、HER3、RANK、tau、淀粉样蛋白β、亨廷顿蛋白、α-突触核蛋白、葡糖脑苷脂酶、α-葡糖苷酶、IL-1、IL-1R、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-10、IL-10R、IL-17、IL-23、IL-12、p40、B7家族的成员、c-Met、SIGLEC、MCP-1、MHC、MHCI、MHCII、PD-1或PD-L1)可在结合至选择性耗竭复合物的靶标结合肽后被内吞和降解。

在一些实施方案中，靶标分子可以是跨膜蛋白，诸如受体酪氨酸激酶。可使用选择性耗竭复合物靶向的受体酪氨酸激酶的实例包括EGF受体、ErbB、胰岛素受体、PDGF受体、VEGF受体、FGF受体、CCK受体、NGF受体、HGF受体、Eph受体、AXL受体、TIE受体、RYK受体、DDR受体、RET受体、ROS受体、LTK受体、ROR受体、MuSK受体和LMR受体。使用选择性耗竭复合物靶向跨膜蛋白可导致跨膜蛋白的内化和降解。在一些实施方案中，靶标分子可以是病原体(例如，病毒或细菌)或病原体表面分子(例如，蛋白质或糖蛋白)。例如，靶标分子可以是冠状病毒刺突蛋白、流感病毒血凝素或单纯疱疹病毒糖蛋白M。使用选择性耗竭复合物靶向病原体或病原体表面蛋白可导致病原体的内化和降解，从而治疗或预防由病原体引起的感染。

靶标分子的内吞作用和随后降解可治疗与靶标分子相关的疾病或疾患(例如，消除、减轻所述疾病或疾患，减缓所述疾病或疾患的进展或治疗所述疾病或疾患的症状)。在一些实施方案中，用选择性耗竭复合物靶向和降解受体酪氨酸激酶可有益于治疗癌症的变体。例如，用包含EGFR结合肽的选择性耗竭复合物靶向和降解EGFR可有益于治疗癌症，诸如非小细胞肺癌、原发性非小细胞肺癌、转移性非小细胞肺癌肺癌、头颈癌、头颈鳞状细胞癌、胶质母细胞瘤、脑癌、转移性脑癌、结肠直肠癌、结肠癌、酪氨酸激酶抑制剂(TKI)耐药性癌症、西妥昔单抗耐药性癌症、耐昔妥珠单抗耐药性癌症、帕尼单抗耐药性癌症、局部癌症、局部晚期癌症、复发性癌症、转移性癌症、难治性癌症、KRAS野生型癌症、KRAS突变型癌症或外显子20突变型非小细胞肺癌。在另一个实例中，用包含TNF-α结合肽的选择性耗竭复合物靶向和降解TNF-α可有益于治疗炎症性疾患或神经疾患，包括CNS中的那些，诸如神经炎症、神经炎症性疾病、中风、创伤性脑损伤、阿尔茨海默氏病或其他tau蛋白病，包括神经原纤维缠结性痴呆、慢性创伤性脑病(CTE)、衰老相关性tau星形胶质细胞病变、额颞叶痴呆、帕金森病、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、利替可-波帝格病(lytico-bodig disease)、神经节神经胶质瘤、脑膜血管瘤病或亚急性硬化性全脑炎。例如，用包含TNF-α结合肽的选择性耗竭复合物靶向和降解TNF-α也可有益于治疗可不定位于CNS的炎症性疾患(例如，强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征、痛风、炎症性关节炎中心、肌炎、类风湿性关节炎、硬皮病、舍格伦氏病、系统性红斑狼疮(狼疮)、血管炎、银屑病、炎症性肠病、克罗恩氏病或溃疡性结肠炎)。本公开的选择性耗竭复合物可用于靶向致病性免疫复合物，诸如循环中的那些。循环抗原-抗体复合物可能参与自身免疫性疾病和炎症性疾病以及恶性肿瘤。这可包括肾小球肾炎、系统性红斑狼疮(狼疮)、类风湿性关节炎和皮肤血管炎。

本公开的选择性耗竭复合物可用于靶向补体介导的疾病中的补体途径，诸如面肩肱型肌营养不良症(FSHD)或精神分裂症。此类选择性耗竭复合物可能非常适合于治疗FSDH，因为TfR在肌肉细胞上高度表达，因此将预期一种或多种补体途径组分的有效降解。在一些实施方案中，靶向和降解CNS中的补体因子C4或补体途径中C4上游的因子(例如，补体因子C1q、补体因子C1s或补体因子C1r)或下游的因子(例如，补体因子C3、补体因子C3a、补体因子C3b、补体因子C5或补体因子C5a)可治疗精神分裂症。C4随后被用作此途径的范例，并理解调控C4的激活或执行此途径的延续的其他补体组分对于调控此途径的活性增加的生物学后果具有同等地位。由于精神分裂症影响近1％的人，最常在青春期发作，因此包含选择性耗竭复合物的组合物用于治疗精神分裂症将是有益的。补体途径可以充当精神分裂症中的共同途径，并且包含促进C4或下游补体途径的降解的本公开的选择性耗竭复合物的疗法将对患者有益。在一些实施方案中，本公开的选择性耗竭复合物可用于靶向中枢神经系统中的补体介导的疾病。例如，包含结合一种或多种C4A形式的肽的选择性耗竭复合物可用于靶向C4A长(例如，包括HERV并入)或短形式以用于如本文所述的降解。可使用选择性耗竭复合物靶向和耗竭以治疗精神分裂症的另外靶标分子包括由染色体6上的延伸MHC复合物编码的分子、由补体C4基因座编码(例如，由C4A长基因座或c4A短基因座编码)的分子、由染色体8上在CUB和Sush i多结构域1(CSMD1)基因中含有单核苷酸多态性的序列编码的分子、补体因子C4、补体因子C3或C3受体。补体因子C4、补体因子C3或阻止补体因子C4或补体因子C3的降解的分子的靶向降解可有益于治疗精神分裂症。例如，本公开的选择性耗竭复合物可通过减少过度突触修剪、防止灰质减少和预防因C4、CSMD1或其他基因中的多态性而易患精神分裂症的患者中的精神病症状来治疗精神分裂症。用于治疗精神分裂症的选择性耗竭复合物(例如，包含补体因子C4结合肽)可提供狭窄而精确形式的免疫抑制，其可预防对于诸如精神分裂症的慢性疾病来说常见的在长时间使用广泛免疫抑制时发生的毒性。在一些实施方案中，用于治疗精神分裂症的选择性耗竭复合物可与另外的药物(例如，米诺环素、强力霉素、类固醇、C4降解抑制剂或抗精神病剂)组合施用。此外，由于选择性耗竭复合物能够穿透血脑屏障(BBB)并经由TfR结合进入CNS，因此本公开的选择性耗竭复合物可能非常适合于治疗CNS相关病症，诸如精神分裂症。选择性耗竭复合物(例如，包含TfR结合肽)可促进较高的BBB

在一些实施方案中，使用包含靶标结合肽的本公开的选择性耗竭复合物结合并随后耗竭靶标分子可用于治疗疾病或疾患，其中靶标分子是与疾病或疾患相关并在患病组织或细胞中表达或存在的基于细胞的或可溶性部分。在一些实施方案中，靶标分子的耗竭可以是细胞类型或组织依赖性的。例如，靶标分子的耗竭可对表达由选择性耗竭复合物的靶标结合肽靶向的靶标分子和由选择性耗竭复合物的受体结合肽靶向的细胞表面受体两者的细胞或组织具有特异性。使用选择性耗竭复合物降解和耗竭靶标分子可预防、治疗或改善疾病或疾患。

在一些实施方案中，靶标结合肽可包含SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:219、SEQ IDNO:233–SEQ ID NO:244或SEQ ID NO:400–SEQ ID NO:456中的任一个的序列。在一些实施方案中，靶标结合肽可包含与SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:187或SEQ ID NO:234–SEQ IDNO:244中的任一个或其片段具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。例如，靶标结合肽可包含与SEQ ID NO:233具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列，或者靶标结合肽可包含SEQ IDNO:233的序列。表3中提供靶标结合肽及其相应靶标分子的实例。

表3–示例性靶标结合肽

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胱氨酸密集肽

在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽或靶标结合肽包含一个或多个Cys或一个或多个二硫键。在一些实施方案中，TfR结合肽或靶标结合肽源自胱氨酸密集肽(CDP)、打结肽或套结素。如本文所用，术语“肽”被视为可与术语“打结肽”、“胱氨酸密集肽”、“CDP”和“套结素”互换。(参见例如Correnti等人Screening,large-scale production,andstructure-based classification for cystine-dense peptides.Nat Struct MolBiol.2018年3月；25(3):270–278)。

本公开的TfR结合肽或其衍生物、片段或变体可对TfR或其衍生物或类似物具有亲和力和选择性。本公开的靶标结合肽或其衍生物、片段或变体可对靶标分子具有亲和力和选择性。在一些情况下，本公开的TfR结合肽可使用位点饱和诱变(SSM)来进行工程化以展现改善的TfR结合性质，或更有效地促进胞吞转运或内吞作用。在一些情况下，本公开的靶标结合肽可使用位点饱和诱变(SSM)来进行工程化以展现改善的靶标结合性质。在一些情况下，本公开的肽是与打结肽或套结素(hitchin)源性肽或打结素(knottin)源性肽相关的胱氨酸密集肽(CDP)。TfR结合肽可以是胱氨酸密集肽(CDP)。套结素可以是CDP的子类，其中六个半胱氨酸残基根据连接性[1-4]、2-5、3-6形成二硫键，所述连接性指示第一半胱氨酸残基与第四残基，第二与第五，并且第三半胱氨酸残基与第六形成二硫键。这个命名法中的括号指示半胱氨酸残基形成打结二硫键。(参见例如Correnti等人Screening,large-scaleproduction,and structure-based classificati on for cystine-dense peptides.NatStruct Mol Biol.2018年3月；25(3):270–278)。打结素可以是CDP的子类，其中六个半胱氨酸残基根据连接性1-4、2-5、[3-6]形成二硫键。打结素是长度通常在约20至约80个氨基酸的范围内的一类肽，所述氨基酸经常折叠成致密结构。打结素通常组装成复杂三级结构，所述结构的特征在于具有许多分子内二硫化物交联，并且可含有β链和其他二级结构。二硫键的存在赋予打结素和显套结素著环境稳定性，从而允许它们耐受极端温度和pH，并且抵抗血流的蛋白水解酶。在一些情况下，本文所述的肽可源于打结肽。如本文公开的肽的氨基酸序列可包含多个半胱氨酸残基。在一些情况下，存在于肽的氨基酸序列内的多个半胱氨酸残基中的至少半胱氨酸残基参与形成二硫键。在一些情况下，存在于肽的氨基酸序列内的多个半胱氨酸残基中的所有半胱氨酸残基都参与形成二硫键。如本文所述，术语“打结肽”可与术语“胱氨酸密集肽”、“CDP”或“肽”互换使用。

本文提供了鉴定、成熟、表征和利用CDP的方法，所述CDP结合转铁蛋白受体并且允许选择、优化和表征CDP-TfR结合肽，所述CDP-TfR结合肽可用于选择性耗竭复合物中，包括用作受试者(人或非人动物)中治疗相关浓度的生物活性分子。本公开证明了CDP作为可针对关于现代药物发现策略的适用性进行筛选的多样性支架家族的效用。CDP包含对主要是抗体的现有生物制剂的替代物，所述替代物可绕过免疫球蛋白支架的一些不利因素，包括不良组织可渗透性、免疫原性、以及如果出现毒性那么可变得有问题的长久血清半衰期。在20-80个氨基酸的范围内的本公开的肽代表在医学上相关的治疗剂，其具有中等大小，具有抗体的许多有利结合特异性和亲和力特征，但稳定性改善，免疫原性降低，并且制造方法更简单。CDP的分子内二硫键构造提供了特别高的稳定性衡量标准，从而降低断裂和免疫原性，同时它们的较小尺寸可改善组织穿透或细胞穿透，并且促成可调谐血清半衰期。本文公开了代表可充当将靶标分子递送至内吞区室的媒介物的候选肽的肽。

在一些实施方案中，TfR结合肽可以是经工程化肽。经工程化肽可以是非天然存在、人工、经分离、合成、经设计或重组表达的肽。在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽包含CDP、打结肽或套结素的一种或多种性质，诸如稳定性、对蛋白水解的抗性、对还原性条件的抗性、和/或穿过血脑屏障的能力。在一些实施方案中，本公开的靶标结合肽包含CDP、打结肽或套结素的一种或多种性质，诸如稳定性、对蛋白水解的抗性或对还原性条件的抗性。

相较于其他分子诸如抗体，由于尺寸更小、组织或细胞穿透更大、缺乏Fc功能以及从血清的清除更快，并且相较于较小肽，由于对蛋白酶的抗性(以获得稳定性和免疫原性降低两者)，所以CDP对于递送至CNS来说可以是有利的。在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽或靶标结合肽(例如CDP、打结肽或套结素)、选择性耗竭复合物(例如，包含一个或多个TfR结合肽和一个或多个靶标结合肽)或经工程化TfR结合融合肽(例如包含一个或多个TfR结合肽和一个或多个肽)可具有优于TfR结合抗体或靶标结合抗体的性质。举例来说，本文所述的肽和复合物可提供优异、更深度和/或更快的对细胞和所靶向组织的组织或细胞穿透(例如脑实质穿透、实体肿瘤穿透)，以及更快的从非所靶向组织和血清的清除。与TfR结合抗体或靶标结合抗体相比，本公开的TfR结合肽、靶标结合肽、选择性耗竭复合物或TfR结合融合肽可具有更低分子量。与TfR结合抗体或靶标结合抗体相比，更低分子量可对本公开的TfR结合肽、靶标结合肽、选择性耗竭复合物或TfR结合融合肽赋予有利性质。举例来说，与抗TfR抗体相比，本公开的TfR结合肽、选择性耗竭复合物或TfR结合融合肽可更易于穿透细胞或组织，或与抗TfR抗体相比可具有更低摩尔剂量毒性。本公开的TfR结合肽、靶标结合肽、选择性耗竭复合物或TfR结合融合肽可有利于缺乏抗体的Fc功能。本公开的TfR结合肽、靶标结合肽、选择性耗竭复合物或TfR结合融合肽可有利于允许使用基于摩尔的较高浓度的制剂。

在一些实施方案中，CDP或打结肽，包括经工程化、非天然存在的CDP以及见于自然界中的那些(例如靶标结合肽)，可缀合至、连接至或融合至本公开的TfR结合肽，诸如表1中所述的那些，以将靶标分子选择性地递送至细胞的内吞区室。细胞可以是癌细胞、胰腺细胞、肝细胞、结肠细胞、卵巢细胞、乳腺细胞、肺细胞、脾细胞、骨髓细胞或它们的任何组合。细胞可以是表达TfR的任何细胞。经工程化肽可以是非天然存在、人工、合成、经设计或重组表达的肽。在一些实施方案中，本公开的TfR结合肽或包含TfR结合肽的复合物(例如，选择性耗竭复合物)使得能够实现TfR介导的胞吞转运和/或细胞内吞作用，并且缀合至、连接至或融合至TfR结合肽的额外CDP或打结肽可选择性地靶向与疾病或疾患相关的细胞中的分子(例如，酶或其他目标蛋白质)。在一些情况下，细胞是癌细胞。癌症可包括乳腺癌、肝癌、结肠癌、脑癌、白血病、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤、血细胞源性癌症、脾癌、唾液腺癌、肾癌、肌肉癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、肉瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛癌、中线神经胶质瘤、弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤、肺癌、骨髓细胞癌或皮肤癌、泌尿生殖系统癌、骨肉瘤、肌肉源性肉瘤、黑素瘤，头颈癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛癌、中线神经胶质瘤以及弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG)或CMYC过度表达性癌。在一些情况下，其他CDP或打结肽(例如见于自然界中的那些)缀合至、连接至或融合至TfR结合肽，并且能够使TfR结合肽穿过血脑屏障进行定位以将TfR结合肽递送至中枢神经系统中的靶细胞。

CDP(例如打结肽或套结素)是长度通常在约11至约81个氨基酸的范围内的一类肽，所述氨基酸经常折叠成致密结构。打结肽通常组装成复杂三级结构，所述结构的特征在于具有许多分子内二硫化物交联，并且可含有β链、α螺旋和其他二级结构。二硫键的存在赋予打结肽显著环境稳定性，从而允许它们耐受极端温度和pH，并且抵抗血流的蛋白水解酶。二硫结的存在可提供对由还原剂进行的还原的抗性。打结肽的刚性还允许它们结合至靶标，而不用受到松驰肽在结合靶标后产生的“熵罚”。举例来说，结合受到在肽结合靶标以形成复合物时发生的熵损失的不利影响。因此，“熵罚”是对结合的不利影响，并且在这个结合后发生的熵损失越大，“熵罚”越大。此外，由于在束缚在复合物中时损失柔性，所以相比于刚性结构化分子，柔性未结合分子在形成复合物时损失更多熵。然而，未结合分子中的刚性还通常通过限制分子可形成的复合物的数目来增加特异性。肽可以抗体样亲和力或以纳体积摩尔浓度或皮体积摩尔浓度亲和力结合靶标。对打结肽的序列结构和序列同一性或同源性的较广泛考查揭示它们已通过趋同进化而在所有种类的动物和植物中出现。在动物中，它们经常见于毒液例如蜘蛛和蝎子的毒液中，并且已牵涉于离子通道的调节中。植物的打结蛋白可抑制动物的蛋白水解酶或具有抗微生物活性，从而表明打结肽可在见于植物中的分子防御系统中起作用。

本公开的肽(例如，靶标结合肽、TfR结合肽或选择性耗竭复合物)可包含半胱氨酸氨基酸残基。在一些实施方案中，肽具有至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个半胱氨酸氨基酸残基。在一些实施方案中，肽具有至少6个半胱氨酸氨基酸残基。在一些实施方案中，肽具有至少8个半胱氨酸氨基酸残基。在其他实施方案中，肽具有至少10个半胱氨酸氨基酸残基、至少12个半胱氨酸氨基酸残基、至少14个半胱氨酸氨基酸残基或至少16个半胱氨酸氨基酸残基。

打结肽可包含二硫键。打结肽可以是其中5％或更多的残基是形成分子内二硫键的半胱氨酸的肽。二硫键连接的肽可以是药物支架。在一些实施方案中，二硫键形成结。二硫键可在半胱氨酸残基之间，例如在半胱氨酸1和4、2和5，或3和6之间形成。在一些实施方案中，一个二硫键穿过由其他两个二硫键形成的环，例如以形成结。在其他实施方案中，二硫键可在任何两个半胱氨酸残基之间形成。

本公开还包括例如可用作用于产生额外肽的起始点的肽支架。在一些实施方案中，这些支架可源于多种打结肽(诸如CDP或打结肽或套结素)。在某些实施方案中，CDP(例如打结肽或套结素)组装成复杂三级结构，所述结构的特征在于具有许多分子内二硫化物交联，并且任选地含有β链和其他二级结构诸如α螺旋。举例来说，在一些实施方案中，CDP(例如打结肽)包括特征在于穿过二硫结的二硫键的小型二硫键富集蛋白质。这个结可例如在一个二硫键穿过由两个其他二硫键和互连主链形成的大环时获得。在一些实施方案中，打结肽可包括生长因子半胱氨酸结或抑制剂半胱氨酸结。其他可能的肽结构包括具有两个由两个二硫键连接的平行螺旋而无β-片层的肽(例如hefutoxi n)。

本公开的一些肽可包含至少一个呈L构型的氨基酸残基。肽可包含至少一个呈D构型的氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是15-75个氨基酸残基。在其他实施方案中，肽的长度是11-55个氨基酸残基。在其他实施方案中，肽的长度是11-65个氨基酸残基。在其他实施方案中，肽的长度是至少20个氨基酸残基。

一些CDP(例如打结肽)可源于或分离自已知存在于毒素或毒液中或与毒素或毒液相关的一类蛋白质。在一些情况下，肽可源于与蝎子或蜘蛛相关的毒素或毒液。肽可源于各个属和种的蜘蛛和蝎子的毒液和毒素。举例来说，肽可源于黑背以色列金蝎(Leiurusquinques triatus hebraeus)、图尼塔尼地中海黄蝎(Buthus occitanus tune tanus)、以色列黑鳄背蝎(Hottentotta judaicus)、条斑钳蝎(Meso buthus eupeus)、以色列地中海黄蝎(Buthus occitanus israelis)、吉氏巨毛蝎(Hadrurus gertschi)、黄肥尾蝎(Androctonus australis)、中美毒蝎(Centruroides noxius)、老挝异蝎(Heterometruslaoticus)、非洲黄爪蝎(Opistophthalmus carinatus)、中国虎纹捕鸟蛛(Haplopelmaschmidti)、双针蝎(Isometrus maculatus)、虎纹捕鸟蛛(Haplopelma huwenum)、海南捕鸟蛛(Haplopelma hainanum)、中国虎纹捕鸟蛛、美洲漏斗网蛛(Agelenopsis aperta)、蓝山漏斗网蜘蛛(Haydronyche versuta)、虎纹捕鸟蛛(Selenocosmia huwena)、白额高脚蛛(Heteropoda venatoria)、智利红玫瑰蜘蛛(Grammostol a rosea)、虎纹捕鸟蛛(Ornithoctonus huwena)、蓝山漏斗网蜘蛛(Hadronyche versuta)、雪梨漏斗网蜘蛛(Atrax robustus)、美洲漏斗网蛛(Angelenopsis aperta)、千里达老虎尾(Psalmopoeuscambridge)、漏斗蛛(Hadronyche infensa)、鲁图斯拟隙蛛(Paracoelotes luctosus)和敬钊缨毛蛛(Chilobrachys jingzhao)或另一适合属或种的蝎子或蜘蛛的毒液或毒素。在一些情况下，肽可源自东亚钳蝎(Buthus martensii Karsh)(蝎子)毒素。

在一些实施方案中，本公开的肽(例如，TfR结合肽、靶标结合肽或选择性耗竭复合物)可包含例如参考SEQ ID NO:96在相应位置11、12、13、14、19、20、21、22、36、38、39、41中的一个或多个处具有半胱氨酸残基的序列。在一些实施方案中，肽在相应位置11、12、19、20、36、39或它们的任何组合处包含Cys。举例来说，在某些实施方案中，肽可包含在相应位置11处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽可包含在相应位置12处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽可包含在相应位置13处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽可包含在相应位置14处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽可包含在相应位置19处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽可包含在相应位置20处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽可包含在相应位置21处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽可包含在相应位置22处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽可包含在相应位置36处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽可包含在相应位置38处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽可包含在相应位置39处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽可包含在相应位置41处具有半胱氨酸残基的序列。在一些实施方案中，序列中的第一半胱氨酸残基可与序列中的第4半胱氨酸残基进行二硫键键合，序列中的第2半胱氨酸残基可与序列中的第5半胱氨酸残基进行二硫键键合，并且序列中的第3半胱氨酸残基可与序列中的第6半胱氨酸残基进行二硫键键合。任选地，肽可包含一个穿过由两个其他二硫键形成的环的二硫键，也被称为“二-并-穿(two-and-through)”结构系统。在一些实施方案中，本文公开的肽具有的一个或多个半胱氨酸可被突变成丝氨酸。

在一些实施方案中，本公开的肽(例如，TfR结合肽、靶标结合肽或选择性耗竭复合物)包含至少一个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，本公开的肽包含至少两个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，本公开的肽包含至少三个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，本公开的肽包含至少四个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，本公开的肽包含至少五个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，本公开的肽包含至少六个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，本公开的肽包含至少十个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，本公开的肽包含六个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，本公开的肽包含七个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，本公开的肽包含八个半胱氨酸残基。

在一些实施方案中，本公开的肽(例如，TfR结合肽、靶标结合肽或选择性耗竭复合物)包含例如参考SEQ ID NO:96在一个或多个位置处具有半胱氨酸残基的氨基酸序列。在一些实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基位于相应氨基酸位置6、10、20、34、44、48中的任一个或它们的任何组合处。在本公开的一些方面，一个或多个半胱氨酸(C)残基以各种配对样式(例如C₁₀-C₂₀)参与二硫键。在一些实施方案中，相应配对样式是C₆-C₄₈、C₁₀-C₄₄和C₂₀-C₃₄。在一些实施方案中，如本文所述的肽包含至少一个、至少两个，或至少三个二硫键。在一些实施方案中，至少一个、至少两个或至少三个二硫键根据相应C₆-C₄₈、C₁₀-C₄₄和C₂₀-C₃₄配对样式或它们的组合进行排列。在一些实施方案中，如本文所述的肽包含具有相应配对样式C₆-C₄₈、C₁₀-C₄₄和C₂₀-C₃₄的三个二硫键。

在某些实施方案中，肽(例如，TfR结合肽、靶标结合肽或选择性耗竭复合物)包含在相应位置6处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽包含在相应位置10处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽包含在相应位置20处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽包含在相应位置34处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽包含在相应位置44处具有半胱氨酸残基的序列。在某些实施方案中，肽包含在相应位置50处具有半胱氨酸残基的序列。在一些实施方案中，序列中的第一半胱氨酸残基与序列中的末个半胱氨酸残基进行二硫键键合。在一些实施方案中，序列中的第二半胱氨酸残基与序列中的第二至末个半胱氨酸残基进行二硫键键合。在一些实施方案中，序列中的第三半胱氨酸残基与序列中的第三至末个半胱氨酸残基进行二硫键键合，以此类推。

在一些实施方案中，序列中的第一半胱氨酸残基与序列中的第6半胱氨酸残基进行二硫键键合，序列中的第2半胱氨酸残基与序列中的第5半胱氨酸残基进行二硫键键合，并且序列中的第3半胱氨酸残基与序列中的第4半胱氨酸残基进行二硫键键合。任选地，肽可包含一个穿过由两个其他二硫键形成的环的二硫键，也被称为“二-并-穿(two-and-through)”结构系统。在一些实施方案中，本文公开的肽具有的一个或多个半胱氨酸被突变成丝氨酸。

在一些实施方案中，肽(例如，TfR结合肽、靶标结合肽或选择性耗竭复合物)不包含半胱氨酸或二硫化物。在一些实施方案中，肽包含1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个，或15个或更多个半胱氨酸或二硫键。在其他实施方案中，1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个半胱氨酸残基已用丝氨酸残基替换。在一些实施方案中，1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个半胱氨酸残基已用苏氨酸残基替换。

在一些实施方案中，肽(例如，TfR结合肽、靶标结合肽或选择性耗竭复合物)不包含Cys或二硫化物。在一些实施方案中，肽包含1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个，或15个或更多个Cys或二硫键。在其他实施方案中，1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个Cys残基已用Ser残基替换。在一些实施方案中，1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个Cys残基已用Thr残基替换。

在一些情况下，肽中的甲硫氨酸残基中的一者或多者或全部由亮氨酸或异亮氨酸替换。在一些情况下，肽中的色氨酸残基中的一者或多者或全部由苯丙氨酸或酪氨酸替换。在一些情况下，肽中的天冬酰胺残基中的一者或多者或全部由谷氨酰胺替换。在一些实施方案中，肽的N末端诸如由乙酰基阻断。替代地或组合地，在一些情况下，肽的C末端诸如由酰胺基团阻断。在一些实施方案中，肽通过在游离胺上的甲基化进行修饰。

举例来说，完全甲基化可通过使用以甲醛和氰基硼氢化钠进行的还原性甲基化来实现。

在一些实施方案中，如本文所述的肽或肽复合物靶向和/或穿透表达TfR的细胞层或屏障和/或表达TfR的细胞的膜。在一些实施方案中，肽靶向和/或穿透细胞的细胞膜，其中所述细胞位于CNS诸如脑中。举例来说，包含TfR结合肽和一种或多种活性剂(例如治疗性或诊断性化合物)的肽复合物通过囊泡胞吞转运来穿过细胞屏障(例如BBB)，并且随后靶向和/或穿透位于CNS内的细胞的细胞膜以将所述一种或多种活性剂递送至所述细胞。

在各种实施方案中，包含TfR结合肽和靶标结合肽的选择性耗竭复合物结合位于胃肠道、脾、肝、肾、肌肉、骨髓、脑或皮肤中的表达TfR的细胞。在一些情况下，表达TfR的细胞是肿瘤细胞、免疫细胞、红细胞、红细胞前体细胞、干细胞、骨髓细胞或干细胞。在一些情况下，TfR结合肽负责靶向细胞，例如在其中细胞过度表达TfR的情况下。在各种实施方案中，包含缀合至、连接至或融合至靶标结合肽的TfR结合肽的如本文所述的肽复合物结合位于各种器官内的细胞，所述器官诸如脾、脑、肝、肾、肌肉、骨髓、胃肠道或皮肤。

在一些情况下，靶标结合肽促进靶标分子的内吞作用。在一些方面，本公开的肽或肽复合物(例如肽缀合物或融合肽)用于靶向靶标分子以发挥某种生物(例如治疗)作用。在一些方面，本公开的选择性耗竭复合物(例如，包含TfR结合肽和靶标结合肽的复合物)用于促进靶标分子内吞到所述细胞中以发挥某种生物作用(例如，靶标分子的选择性耗竭)。

肽接头

本公开在的肽(例如，TfR结合肽、靶标结合肽、选择性耗竭复合物或它们的组合)可以多种方式二聚化。例如，TfR结合肽可通过肽接头与靶标结合肽二聚化以形成选择性耗竭复合物。在一些实施方案中，肽接头不干扰肽结构域(例如，TfR结合肽或靶标结合肽)的独立折叠。在一些实施方案中，肽接头可包含足够长度至肽复合物，以便通过肽复合物(例如，选择性耗竭复合物)促进靶标分子与TfR之间的接触。在一些实施方案中，肽接头不会对肽复合物(例如，选择性耗竭复合物)的可制造性(合成或重组)产生负面影响。在一些实施方案中，肽接头不损害肽复合物(例如，选择性耗竭复合物)的合成后化学改变(例如，荧光团或白蛋白结合化学基团的缀合)。

在一些实施方案中，肽接头可将第一肽(例如，靶标结合肽、TfR结合肽或半衰期调节肽)的C末端连接至第二肽(例如，靶标结合肽、TfR结合肽或半衰期调节肽)的N末端。在一些实施方案中，肽接头可将第二肽(例如，靶标结合肽、TfR结合肽或半衰期调节肽)的C末端连接至第三肽(例如，靶标结合肽、TfR结合肽或半衰期调节肽)的N末端。例如，接头(例如，SEQ ID NO:129–SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:195–SEQ ID NO:218中的任一个)可将靶标结合肽的C末端连接至TfR结合肽(例如，SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ IDNO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个)的N末端以形成选择性耗竭复合物。在另一个实例中，接头(例如，SEQ ID NO:129–SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:195–SEQ ID NO:218中的任一个)可将TfR结合肽(例如，SEQID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个)的C末端连接至靶标结合肽的N末端以形成选择性耗竭复合物。在另一个实例中，接头(例如，SEQ ID NO:129–SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:195–SEQ ID NO:218中的任一个)可将TfR结合肽(例如，SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个)的C末端连接至半衰期延长肽(例如，SEQ IDNO:178、SEQ ID NO:179或SEQ ID NO:192)的N末端并且将所述半衰期延长肽的C末端连接至靶标结合肽的N末端以形成选择性耗竭复合物。在另一个实例中，接头(例如，SEQ ID NO:129–SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:195–SEQ ID NO:218中的任一个)可将靶标结合肽的C末端连接至半衰期延长肽(例如，SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:179或SEQ ID NO:192)的N末端，并且第二接头(例如，SEQ ID NO:129–SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:195–SEQ ID NO:218中的任一个)可将所述半衰期延长肽的C末端连接至TfR结合肽(例如，SEQ ID NO:96、SEQ IDNO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个)的N末端以形成选择性耗竭复合物。在另一个实例中，第一接头(例如，SEQ ID NO:129–SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:195–SEQ ID NO:218中的任一个)可将靶标结合肽的C末端连接至半衰期延长肽(例如，SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:179或SEQ ID NO:192)的N末端，并且第二接头(例如，SEQ ID NO:129–SEQ ID NO:141或SEQID NO:195–SEQ ID NO:218中的任一个)可将所述半衰期延长肽的C末端连接至TfR结合肽(例如，SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个)的N末端以形成选择性耗竭复合物。在另一个实例中，接头(例如，SEQ ID NO:129–SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:195–SEQ ID NO:218中的任一个)可将半衰期延长肽(例如，SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:179或SEQ ID NO:192)的C末端连接至靶标结合肽的N末端，并且第二接头(例如，SEQ ID NO:129–SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:195–SEQ ID NO:218中的任一个)可将所述靶标结合肽的C末端连接至TfR结合肽(例如，SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个)的N末端以形成选择性耗竭复合物。

在一些实施方案中，接头可包含Tau-theraphotoxin-Hs1a，也称为DkTx(双结毒素)，其是从来自中国虎纹捕鸟蛛的天然打结素-打结素二聚体提取的(例如，SEQ ID NO:139)。接头可缺乏将干扰二聚化独立功能性CDP(例如，TfR结合CDP和靶标结合CDP)的结构特征。在一些实施方案中，接头可包含甘氨酸-丝氨酸(Gly-Ser或GS)接头(例如，SEQ IDNO:129–SEQ ID NO:138或SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:195–SEQ ID NO:218)。Gly-Ser接头可具有最小化学反应性并且可赋予接头柔性。丝氨酸可增加接头或肽复合物的溶解度，因为侧链上的羟基是亲水性的。在一些实施方案中，接头可源自将Fc与来自人免疫球蛋白G的重链中的Fv结构域分隔的肽(例如，SEQ ID NO:140)。在一些实施方案中，来自人IgG的重链的肽的接头可包含相对于天然IgG肽的半胱氨酸至丝氨酸突变。

在一些实施方案中，本公开的肽可使用免疫球蛋白重链Fc结构域二聚化。这些Fc结构域可用于使功能结构域二聚化(例如，TfR结合肽和靶标结合肽)，基于抗体或其他另外可溶性功能结构域。在一些实施方案中，如果Fc序列是天然的，则二聚化可以是同二聚体的。在一些实施方案中，二聚化可通过使Fc结构域突变以产生“孔中钮”形式而是异二聚体的，其中一个Fc CH3结构域含有被设计成适合另一Fc CH3结构域上的空腔(孔)的新颖残基(钮)。第一肽结构域(例如，TfR结合肽或靶标结合肽)可与钮偶联，并且第二肽结构域(例如，TfR结合肽或靶标结合肽)可与孔偶联。钮+钮二聚体可以是高度能量上不利的。可将纯化标签添加至“钮”侧以除去孔+孔二聚体并选择钮+孔二聚体。

本公开的肽(例如，靶标结合肽、TfR结合肽或选择性耗竭复合物)可在N末端或C末端连接至另一肽(例如，靶标结合肽、TfR结合肽、选择性耗竭复合物或半衰期调节肽)。在一些实施方案中，一个或多个肽可经由肽接头(例如，包含SEQ ID NO:129–SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:195–SEQ ID NO:218中的任一个的序列的肽接头)连接或融合。例如，TfR结合肽可经由SEQ ID NO:129–SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:195–SEQ ID NO:218中的任一个的肽接头与靶标结合肽融合。肽接头(例如，连接TfR结合肽、靶标结合肽、半衰期调节肽或其组合的接头)可具有约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约30、约35、约40、约45或约50个氨基酸残基的长度。肽接头(例如，连接TfR结合肽、靶标结合肽、半衰期调节肽或其组合的接头)可具有约2至约5、约2至约10、约2至约20、约3至约5、约3至约10、约3至约15、约3至约20、约3至约25、约5至约10、约5至约15、约5至约20、约5至约25、约10至约15、约10至约20、约10至约25、约15至约20、约15至约25、约20至约25、约20至约30、约20至约35、约20至约40、约20至约45、约20至约50、约3至约50、约3至约40、约3至约30、约10至约40、约10至约30、约50至约100、约100至约200、约200至约300、约300至约400、约400至约500或约500至约600个氨基酸残基的长度。

在一些实施方案中，第一肽(例如，TfR结合肽)和第二肽(例如，靶标结合肽)可通过柔性肽接头连接。柔性接头可在第一肽与第二肽之间提供旋转自由度并且可允许第一肽和第二肽以最小应变结合它们各自的靶标(例如，转铁蛋白受体和靶标分子)。在一些实施方案中，肽接头可具有不超过不超过/>不超过/>不超过/>不超过/>不超过/>不超过/>不超过/>不超过/> 不超过/>不超过/>或不超过/>的持久长度。在一些实施方案中，肽接头可具有约/>至约/>约/>至约/>约/>至约/>约/>至约/>约/>至约/>约/>至约/>约/>至约/>或约/>至约/>的持久长度。接头的持久长度可是肽接头的柔性的量度，并且可定量为在切线方向上的相关性丢失的肽长度。

在一些实施方案中，可基于所需的接头长度、流体动力学半径、色谱迁移率、翻译后修饰倾向或其组合来选择肽接头。在一些实施方案中，分隔肽复合物的两个或更多个功能结构域(例如，分隔TfR结合肽和靶标结合肽)的接头可包含大的、稳定的球状结构域，例如以降低肾小球滤过的倾向。在一些实施方案中，分隔肽复合物的两个或更多个功能结构域(例如，分隔TfR结合肽和靶标结合肽)的接头可包含小的柔性接头，例如以减小复合物的流体动力学半径以用于狭窄空间，如致密核肿瘤间质中。由包含通过肽接头连接的靶标结合肽和受体结合肽的单个多肽链形成的选择性耗竭复合物的实例在图25A和图25B中说明。在一些实施方案中，肽接头可支持两个或更多个功能结构域的独立折叠并且可能不抑制两个或更多个功能结构域与其结合靶标之间(例如，TfR结合肽与TfR之间或靶标结合肽与靶标分子之间)的相互作用。

在一些实施方案中，肽可附加于本公开的任何肽的N末端，在N末端GS二肽之后并且在例如GGGS(SEQ ID NO:129)间隔子之前。在一些实施方案中，肽(例如，靶标结合肽)可使用肽接头来附加于本文公开的任何肽(例如，TfR结合肽)的N末端或C末端，所述肽接头诸如G_xS_y(SEQ ID NO:130)肽接头，其中x和y可以是任何整数，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。在一些实施方案中，肽接头包括(GS)x(SEQ ID NO:131)，其中x可以是任何整数，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。在一些实施方案中，肽接头包括GGSSG(SEQ ID NO:132)、GGGGG(SEQID NO:133)、GSGSGSGS(SEQ ID NO:134)、GSGG(SEQ ID NO:135)、GGGGS(SEQ ID NO:136)、GGGS(SEQ ID NO:129)、GGS(SEQ ID NO:137)、GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:138)，或它们的变体或片段。另外，来自DkTx的KKYKPYVPVTTN(SEQ ID NO:139)和来自人I gG3的EPKSSDKTHT(SEQ ID NO:140)可用作肽接头。在一些实施方案中，肽接头包含GGGSGGSGGGS(SEQ ID NO:141)。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:195–SEQ ID NO:218中的任一个的接头。与本公开的靶标耗竭复合物相容的肽接头的实例提供在表4中。应当理解，任何前述接头或其变体或片段可与它们的任何数量的重复或任何组合一起使用。还应理解，本领域的其他肽接头或其变体或片段可与它们的任何数量的重复或任何组合一起使用。

在一些实施方案中，标签肽(例如，SEQ ID NO:142–SEQ ID NO:147中的任一个的肽)可在任何氨基酸残基处附加于肽(例如，靶标结合肽、TfR结合肽或选择性耗竭复合物)。在其他实施方案中，标签肽(例如，SEQ ID NO:142–SEQ ID NO:147中的任一个的肽)可在任何氨基酸残基处附加于肽而不干扰TfR结合活性、靶标结合活性、选择性耗竭活性或它们的组合。在一些实施方案中，标签肽通过缀合、连接或融合技术来附加。在其他实施方案中，肽(例如，靶标结合肽)可在任何氨基酸残基处附加于第二肽(例如，TfR结合肽)。在其他实施方案中，可在不干扰TfR结合活性、靶标结合活性、选择性耗竭活性或它们的组合的情况下在任何氨基酸残基处附加于第二肽(例如，TfR结合肽)。在一些实施方案中，肽通过缀合、连接或融合技术来附加。在其他实施方案中，肽(例如，靶标结合肽)可在任何氨基酸残基处附加于第二肽(例如，TfR结合肽)。

表4–肽接头

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在一些实施方案中，选择性耗竭复合物可包含两个或更多个多肽链。例如，靶标结合肽和受体结合肽可通过二聚化结构域复合以形成选择性耗竭复合物。二聚化结构域可以是异二聚化结构域或同二聚化结构域。包含通过二聚化结构域(例如，Fc同二聚化结构域或孔中钮异二聚化结构域)连接的靶标结合肽和受体结合肽的选择性耗竭复合物的实例在图25A、图25B和图25C中说明。

靶标结合肽和受体结合肽可通过经由异二聚化结构域形成异二聚体而复合。靶标结合肽可连接或融合至第一异二聚化结构域，并且受体结合肽可连接或融合至第二异二聚化结构域。第一异二聚化结构域可结合至第二异二聚化结构域以形成包含靶标结合肽和受体结合肽的异二聚体复合物。例如，受体结合肽可连接或融合至Fc“钮”肽(例如，SEQ IDNO:260)，并且免疫细胞靶向剂可连接或融合至Fc“孔”肽(例如，SEQ ID NO:261)。在另一个实例中，受体结合肽可连接或融合至Fc“孔”肽(例如，SEQ ID NO:261)，并且靶标结合肽可连接或融合至Fc“钮”肽(例如，SEQ ID NO:260)。在一些实施方案中，受体结合肽(例如，SEQID NO:1–SEQ ID NO:222中的任一个)可通过表5中提供的异二聚化结构域与靶标结合肽形成异二聚体。例如，受体结合肽可融合至Fc对的链1(例如，SEQ ID NO:260)，并且靶标结合肽可融合至Fc对的链2(例如，SEQ ID NO:261)。在另一个实例中，受体结合肽可融合至Fc对的链2(例如，SEQ ID NO:263)，并且靶标结合肽可融合至Fc对的链1(例如，SEQ ID NO:262)。包含异二聚化结构域的选择性耗竭复合物可形成单价选择性耗竭复合物，如图25B所示，或者包含异二聚化结构域的选择性耗竭复合物可形成多价选择性耗竭复合物，如图25C所示。

表5–示例性异二聚化结构域

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在一些实施方案中，靶标结合肽和受体结合肽可形成包含通过同二聚化结构域复合的同二聚体的选择性耗竭复合物。靶标结合肽可连接或融合至同二聚化结构域的N末端，并且受体结合肽可连接或融合至同二聚化结构域的C末端。在一些实施方案中，靶标结合肽可连接或融合至同二聚化结构域的C末端，并且受体结合肽可连接或融合至同二聚化结构域的N末端。在一些实施方案中，靶标结合肽和受体结合肽两者均可融合在同二聚化结构域的N末端，或者两者均可融合在同二聚化结构域的C末端。包含同二聚化结构域的选择性耗竭复合物可形成多价选择性耗竭复合物，如图25C所示。可用于将靶标结合肽连接或融合至受体结合肽的同二聚化结构域的实例提供于表6中。

表6–示例性同二聚化结构域

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肽的修饰

肽可以多种方式中的一种或多种进行化学修饰。在一些实施方案中，可使肽突变以增加功能、缺失功能或修饰体内行为。肽(例如，TfR结合肽、靶标结合肽或选择性耗竭复合物)的二硫键联之间的一个或多个环可被修饰或替代以包括来自其他肽的活性元件(诸如描述于Moore和Cochran,Methods in Enzymology,503,第223-251页,2012中)。在一些实施方案中，本公开的肽(例如，TfR结合肽、靶标结合肽或选择性耗竭复合物)可通过添加额外的功能结构域进一步功能化和多聚化。例如，来自大芬戈尔德菌消化链球菌白蛋白结合蛋白(SEQ ID NO:192，MKLNKKLLMAALAGAIVVGGGVNTFAADEPGAIKVDKAPEAPSQELKLTKEEAEKALKKEKPIAKERLRRLGITSEFILNQIDKATSREGLESLVQTIKQSYLKDHPIKEEKTEETPKYNNLFDKHELGGLGKDKGPGRFDENGWENNEHGYETRENAEKAAVKALGDKEINKSYTISQGVDGRYYYVLSREEAETPKKPEEKKPEDKRPKMTIDQWLLKNAKEDAIAELKKAGITSDFYFNAINKAKTVEEVNALKNEILKAHAGKEVNPSTPEVTPSVPQNHYHENDYANIGAGEGTKEDGKKENSKEGIKRKTAREEKPGKEEKPAKEDKKENKKKENTDSPNKKKKEKAALPEAGRRKAEILTLAAASLSSVAGAFISLKKRK)的白蛋白结合结构域(ABD)。例如，可将SEQ ID NO:193(LKNAKEDAIAELKKAGITSDFYFNAINKAKTVEEVNALKNEILKA)的白蛋白结合结构域添加至本公开的肽。在一些实施方案中，本公开的肽可用白蛋白结合结构域功能化，所述白蛋白结合结构域已被修饰以提高白蛋白亲和力、提高稳定性、降低免疫原性、提高可制造性或其组合。例如，肽可用与SEQ ID NO:193的白蛋白结合结构域相比具有高热稳定性和改善的血清半衰期的SEQ ID NO:194(LKEAKEKAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKTVEGVNALKDEILKA)或SEQ ID NO:227(LKEAKEKAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKAVEGVNALKDEILKA)的经修饰白蛋白结合结构域功能化。在一些实施方案中，可基于所需的白蛋白解离速率来选择白蛋白结合肽。例如，可选择SEQ ID NO:227的白蛋白结合肽，因为其相对于SEQ ID NO:194具有更快解离速率。白蛋白结合结构域包含简单的三螺旋结构，所述三螺旋结构不太可能干扰其他肽结构域(例如，CDP结构域)的独立折叠。在一些实施方案中，功能结构域(例如，白蛋白结合结构域)可增加本公开的肽或肽复合物的血清半衰期。功能结构域(例如，白蛋白结合结构域)可相对于TfR结合肽或靶标结合肽以任何取向包括在内。例如，功能结构域可连接至TfR结合肽、靶标结合肽或连接在TfR结合肽与靶标结合肽之间，如图16A–图16C所示。在一些实施方案中，白蛋白结合肽(例如，SEQ ID NO:194或SEQ ID NO:227)可用于将靶标结合肽连接至受体结合肽。额外的功能结构域可通过接头(例如，SEQ ID NO:129–SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:195–SEQ ID NO:218中的任一个)连接至一个或多个肽(例如，TfR结合肽或靶标结合肽)。

本公开的肽(例如，TfR结合肽、受体结合肽、靶标结合肽或选择性耗竭复合物)可用信号肽修饰以标记用于分泌的肽。例如，可用对应于SEQ ID NO:230(METDTLLLWVLLLWVPGSTG)的信号肽修饰肽。在一些实施方案中，信号肽可附加于肽的N末端或C末端。可对肽进行修饰以在翻译或分泌过程中增加稳定性。例如，可用对应于SEQ IDNO:229(GSQDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFQGKWYVVGLAGNAILREDKDPQKMYATIYELKEDKSYNVTSVLFRKKKCDYWIRTFVPGSQPGEFTLGNIKSYPGLTSYLVRVVSTNYNQHAMVFFKKVSQNREYFKITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDGGGSRRRRKRSGS)的具有弗林蛋白酶裂解位点的噬铁蛋白(sidrocalin)修饰肽。在一些实施方案中，可将具有弗林蛋白酶裂解位点的噬铁蛋白附加于肽的N末端或C末端。可用信号肽修饰肽以标记用于分泌的肽以及在翻译或分泌过程中增加稳定性。例如，可用信号肽和对应于SEQ ID NO:231(METDTLLLWVLLLWVPGSTGGSQDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFQGKWYVVGLAGNAILREDKDPQKMYATIYELKEDKSYNVTSVLFRKKKCDYWIRTFVPGSQPGEFTLGNIKSYPGLTSYLVRVVSTNYNQHAMVFFKKVSQNREYFKITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDGGGSRRRRKRSGS)的具有弗林蛋白酶裂解位点的噬铁蛋白修饰肽。在一些实施方案中，可将信号肽和具有弗林蛋白酶裂解位点的噬铁蛋白附加于肽的N末端或C末端。

肽或肽复合物(例如，TfR结合肽、受体结合肽、靶标结合肽或选择性耗竭复合物)的氨基酸还可被突变，诸如以增加半衰期，改进、添加或缺失体内结合行为，添加新的靶向功能，改变表面电荷和疏水性，或允许产生缀合位点。N-甲基化是可存在于本公开的肽中的甲基化的一个实例。在一些实施方案中，肽通过在游离胺上的甲基化进行修饰。举例来说，完全甲基化可通过使用以甲醛和氰基硼氢化钠进行的还原性甲基化来实现。

肽可被修饰以添加功能，诸如以将来自其他蛋白质或肽的环或序列移植至本公开的肽上。同样，来自本公开的结构域、环或序列可被移植至具有额外功能的其他肽或蛋白质诸如抗体上。

在一些实施方案中，选择性耗竭复合物可包含组织靶向结构域并且可在施用于受试者后在靶组织中累积。例如，选择性耗竭复合物可缀合至、连接至或融合至对目标细胞或位于所述细胞表面上或内部的靶蛋白具有靶向或归巢功能的分子(例如，小分子、肽或蛋白质)。在一些实施方案中，选择性耗竭复合物可缀合至、连接至或融合至延长肽的血浆和/或生物半衰期，或改进肽的药效动力学(例如增强的与靶蛋白的结合)和/或药代动力学性质(例如清除的速率和模式)或它们的任何组合的分子。

化学修饰可例如延长肽的半衰期，或改变生物分布或药代动力学概况。化学修饰可包括聚合物、聚醚、聚乙二醇、生物聚合物、聚氨基酸、脂肪酸、树状聚合物、Fc区、简单饱和碳链诸如棕榈酸酯或豆蔻酸酯或白蛋白。聚氨基酸可包括例如具有重复单一氨基酸的聚氨基酸序列(例如聚甘氨酸)，以及具有可或可不遵循某一样式的混合聚氨基酸序列(例如gly-ala-gly-ala；SEQ ID NO:457)的聚氨基酸序列，或前述的任何组合。

本公开的肽可被修饰以致修饰增加肽的稳定性和/或半衰期。疏水性部分诸如连接至N末端、C末端或内部氨基酸可用于延长本公开的肽的半衰期。肽还可被修饰以增加或降低肽的肠道可渗透性或细胞可渗透性。在一些情况下，本公开的肽显示在肠的腺细胞中高度积累，从而显示在治疗和/或预防肠的疾病或疾患方面的可应用性，所述疾病或疾患诸如是克罗恩氏病，或更一般来说，炎症性肠病。本公开的肽可包括可影响例如血清半衰期的翻译后修饰(例如甲基化和/或酰胺化和/或糖基化)。在一些实施方案中，简单碳链(例如通过肉豆蔻酰化和/或棕榈基化)可缀合至、连接至融合蛋白或肽。简单碳链可致使融合蛋白或肽可易于与未缀合物质分离。举例来说，可用于使融合蛋白或肽与未缀合物质分离的方法包括但不限于溶剂提取和反相色谱法。亲脂性部分可通过与血清白蛋白的可逆结合来延长半衰期。缀合的部分可例如是通过与血清白蛋白的可逆结合来延长肽的半衰期的亲脂性部分。在一些实施方案中，亲脂性部分可以是胆固醇或胆固醇衍生物，包括胆甾烯、胆甾烷、胆甾二烯和氧化固醇。在一些实施方案中，肽可缀合至、连接至肉豆蔻酸(十四烷酸)或其衍生物。在其他实施方案中，本公开的肽可偶联(例如缀合、连接或融合)于半衰期调节剂。半衰期调节剂的实例可包括但不限于：聚合物、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉、聚乙烯醇、水溶性聚合物、两性离子水溶性聚合物、水溶性聚(氨基酸)，脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸的水溶性聚合物，含有甘氨酸、谷氨酸和丝氨酸的水溶性聚合物，Fc区、脂肪酸、棕榈酸，或结合白蛋白的分子。在一些实施方案中，半衰期调节剂可以是血清白蛋白结合肽，例如SA21(SEQ IDNO:178，RLIEDICLPRWGC LWEDD)。在一些实施方案中，SA21肽可缀合或融合至本公开的CDP(例如SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ IDNO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个)。SA21融合肽可包括本文公开的SA21 TfR结合肽复合物(例如SEQ ID NO:181或SEQ ID NO:184)。SA21肽可包含用于缀合至一个或多个肽或在一个或多个肽之间融合的接头序列(例如SEQ ID NO:179，GGGGSGGGGSRLIEDICLPRWGCLWEDDGGGGSGGGGS)。示例性SA21肽、融合肽和接头提供于表5中。对照SA21融合肽可包含融合至SA21的对照肽(例如SEQ ID NO 180(GSRLIEDICLPRWGCLWEDDGGGGSGGGGSKCLPPGKPCYGATQKIPCCGVCSHNNCT)、SEQ ID NO:183(RLIEDICLPRWGCLWEDDGGGGSGGGGSKCLPPGKPCYGATQKIPCCGVCSHNNCT)、SEQ ID NO:182(GSRLIEDICLPRWGCLWEDDGGGGSGGGGSVRIPVSCKHSGQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCDCTPK)，或SEQ ID NO:185(RLIEDICLPRWGCLWEDDGGGGSGGGGSVRIPVSCKHSGQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCDCTPK))。另外，肽与近红外染料诸如Cy5.5或与白蛋白结合剂诸如Albu标签的缀合可延长如本文所述的任何肽的血清半衰期。在一些实施方案中，通过使用最小非人蛋白质序列来延长肽的血清半衰期，免疫原性被降低。

表7–包含血清白蛋白结合肽的示例性TfR结合肽复合物

在一些实施方案中，SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64的前两个N末端氨基酸(GS)充当间隔子或接头，以便促进与另一分子的缀合或融合，以及以便促进肽从这样的缀合分子、连接分子或融合分子的裂解。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白或肽可缀合至、连接至或融合至例如可改进肽的性质或实现对肽的性质的改变的其他部分。

在一些实施方案中，本公开的肽或肽复合物还可缀合至、连接至或融合至其他亲和柄。其他亲和柄可包括遗传融合亲和柄。遗传融合亲和柄可包括6xHis(HHHHHH(SEQ IDNO:142)或GGGGSHHHHHH(SEQ ID NO:228)；在固定化金属亲和柱纯化的情况下是可能的)、FLAG(DYKDDDDK(SEQ ID NO:143)；抗FLAG免疫沉淀)、“短”FLAG(DYKDE(SEQ ID NO:144)；抗FLAG免疫沉淀)、血凝素(YPYDVPDYA(SEQ ID NO:145)；抗HA免疫沉淀)以及链霉亲和素结合肽(DVEAWLGAR(SEQ ID NO:146)；链霉亲和素介导的沉淀)。在一些实施方案中，本公开的肽或肽复合物还可缀合至、连接至或融合至表达标签或序列以改善蛋白质表达和/或纯化。此类表达标签可包括遗传融合表达标签。遗传融合表达标签可包括噬铁蛋白(SEQ ID NO:147，METDTLLLWVLLLWVPGSTGDYKDEHHHHHHGGSQDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFQGKWYVVGLAGNAILREDKDPQKMYATIYELKEDKSYNVTSVLFRKKKCDYWIRTFVPGSQPGEFTLGNIKSYPGLTSYLVRVVSTNYNQHAMVFFKKVSQNREYFKITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDGGGSENLYFQ)。

另外，多于一个肽序列(源自毒素或打结毒液蛋白的肽)可存在于特定肽上，缀合至、连接至特定肽，或与特定肽融合。肽可通过各种技术并入至生物分子中。肽可通过化学转化(诸如形成共价键诸如酰胺键)来并入。肽可例如通过固相或溶液相肽合成来并入。肽可通过制备编码生物分子的核酸序列来并入，其中所述核酸序列包括编码所述肽的子序列。子序列可外加于编码生物分子的序列，或者可取代编码生物分子的序列的子序列。

选择性耗竭复合物

在一些实施方案中，本公开的一种或多种肽可形成选择性耗竭复合物(SDC)。选择性耗竭复合物可包含结合靶标分子的靶标结合肽和结合细胞受体(例如细胞表面受体)的受体结合肽。在一些实施方案中，细胞表面受体是被内吞的受体(例如，转铁蛋白受体或程序性死亡配体1)。在一些实施方案中，细胞表面受体是在内吞作用后再循环回到细胞表面的受体。本公开的受体结合肽可以是转铁蛋白受体(TfR)结合肽或程序性死亡配体1(PD-L1)结合肽。例如，选择性耗竭复合物可包含TfR结合肽和靶标结合肽。在一些实施方案中，受体结合肽(例如，TfR结合肽或PD-L1结合肽)和靶标结合肽可通过接头(例如，肽接头)连接。在一些实施方案中，受体结合肽和靶标结合肽可在没有接头的情况下直接连接。在一些实施方案中，受体结合肽和靶标结合肽可通过异二聚化结构域连接。受体结合肽可在细胞外pH(诸如约pH 7.4)和在内体pH(诸如约pH 5.5)下以高亲和力结合受体(例如，TfR或PD-L1)。在一些实施方案中，选择性耗竭复合物的受体结合肽可以是TfR结合肽(例如，SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个)。在一些实施方案中，选择性耗竭复合物的受体结合肽可以是PD-L1结合肽(例如，SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:233–SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:400–SEQ ID NO:456或SEQ ID NO:141中的任一个)。

靶标结合肽可以pH依赖性的亲和力结合靶标分子。例如，靶标结合分子可在细胞外pH(约pH 7.4)下以较高亲和力并且在较低内体pH(诸如约pH 5.5或约pH 6.5)下以较低亲和力结合至靶标分子。在一些实施方案中，靶标结合分子可以在内化到内体区室和内体酸化后释放靶标分子。内体酸化后靶标分子的这种释放可在约pH 7.3、pH 7.2、pH 7.1、pH7.0、pH 6.9、pH 6.8、pH 6.7、pH 6.6、pH 6.5、pH 6.4、pH 6.3、pH 6.2、pH 6.1、pH 6.0、pH5.9、pH 5.8、pH 5.7、pH 5.6、pH 5.5、pH 5.4、pH 5.3、pH 5.2、pH 5.1、pH 5.0、pH 4.9、pH4.8、pH 4.7、pH 4.6、pH 4.5或更低下发生。在一些实施方案中，靶标分子的释放可在约pH7.0至约pH 4.5、约pH 6.5至约pH 5.0、或约pH 6.0至约pH 5.5的pH下发生。在一些实施方案中，受体结合肽以非pH依赖性结合(例如，在细胞外pH下的高亲和力和在内体pH下的高亲和力)结合受体(例如，经历再循环的受体)，并且靶标结合肽以pH依赖性结合(例如，在细胞外pH下的高亲和力和在内体pH下的低亲和力)结合靶标。包含非pH依赖性受体结合肽和pH依赖性靶标结合肽的选择性耗竭复合物(SDC)可以是催化性的(例如，重复使用)。SDC可通过多轮内吞作用保持与受体结合，并且具有在每一轮内携带另一个靶标分子并将所述靶标分子留在内体/溶酶体中进行降解的潜力。因此，一个催化SDC分子可引起多个靶标分子的降解。

在一些实施方案中，受体结合肽可以pH依赖性的亲和力结合至受体。例如，受体结合分子可在细胞外pH(诸如约pH 7.4)下以较高亲和力和在较低内体pH(诸如约pH 5.5或约pH 6.5)下以较低亲和力结合至受体，从而在内化和内体区室酸化后从受体释放选择性耗竭复合物。在一些实施方案中，受体结合肽可以pH依赖性的亲和力结合受体，并且靶标结合肽可pH依赖性或非pH依赖性的亲和力结合靶标。选择性耗竭分子可用于选择性地耗竭靶标分子(例如，可溶性蛋白或细胞表面蛋白)。例如，包含受体结合肽和靶标结合肽的选择性耗竭复合物可通过受体结合肽结合至受体并且结合至靶标分子(例如，可溶性蛋白或细胞表面蛋白)。靶标分子可以通过受体介导的受体和选择性耗竭分子的内吞作用递送至内吞区室。在内吞区室中，选择性耗竭复合物可以保持与受体结合，并且随着内吞区室酸化，靶标分子可以从选择性耗竭复合物中释放出来。选择性耗竭分子可与受体一起再循环至细胞表面，并且靶标分子可继续进入溶酶体，在溶酶体中所述靶标分子被降解。在一些实施方案中，靶标分子可保留在溶酶体中而不被降解，从而导致靶标分子在溶酶体中富集。与靶标结合抗体相比，本公开的选择性耗竭复合物可具有低分子量并且可用于结合并耗竭靶标而不需要供应和分配冷链。

在一些实施方案中，受体结合肽(TfR结合肽或PD-L1结合肽)可以小于50μM、小于5μM、小于500nM、小于100nM、小于40nM、小于30nM、小于20nM、小于10nM、小于5nM、小于2nM、小于1nM、小于0.5nM、小于0.4nM、小于0.3nM、小于0.2nM或小于0.1nM的平衡解离常数(K_D)结合至细胞受体(例如，TfR或PD-L1)。在一些实施方案中，受体结合肽具有比细胞受体的再循环速率更慢的解离速率，使得受体结合肽可能在再循环过程期间保持与受体结合。在一些实施方案中，受体结合肽可具有不快于1分钟、不快于2分钟、不快于3分钟、不快于4分钟、不快于5分钟、不快于7分钟、不快于10分钟、不快于15分钟或不快于20分钟的解离速率。在一些实施方案中，受体结合肽可具有约1分钟至约20分钟、约2分钟至约15分钟、约2分钟至约10分钟或约5分钟至约10分钟的解离速率。

本公开的选择性耗竭复合物可用于通过选择性地耗竭与疾病或疾患相关的靶标分子来治疗疾病或疾患。例如，选择性耗竭复合物可用于选择性地耗竭在疾病状态中累积、含有疾病相关突变(例如，导致组成性活性、对治疗的抗性或显性负活性的突变)或过度表达的可溶性或细胞表面蛋白。在一些实施方案中，本公开的选择性耗竭复合物可用于治疗和预防各种神经疾病，包括但不限于癫痫、精神分裂症、抑郁、焦虑、双相障碍、发育性脑病症(例如自闭症谱系)或情绪障碍。

本文所述的选择性耗竭复合物(例如，肽缀合物、融合肽或重组产生的肽复合物)与TfR的结合以及后续穿过细胞层或屏障诸如BBB(例如通过囊泡胞吞转运)或细胞膜(例如通过内吞作用)的转运可在与神经变性相关的许多疾病、疾患或病症中具有影响。可用本文所述的选择性耗竭复合物治疗或预防的神经变性疾病可包括阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化症、弗里德赖希共济失调、亨廷顿氏病、路易体病、帕金森氏病、脊髓性肌萎缩、运动神经元疾病、莱姆病、共济失调-毛细血管扩张、常染色体显性小脑共济失调、巴登病、皮质基底综合征、克罗伊茨费尔特–雅各布病、X染色体脆折相关震颤/共济失调综合征、库福–拉基布综合征、马查多–约瑟夫病、多发性硬化症、慢性创伤性脑病变或额颞叶痴呆。在一些实施方案中，TfR结合肽可与BACE抑制剂、加兰他敏、金刚烷胺、苯扎托品(benztropine)、比哌立登(biperiden)、溴隐亭、卡比多巴、多奈哌齐(donepezil)、恩他卡朋(entacapone)、左旋多巴、培高利特(pergolie)、普拉克索、丙环定(procyclidine)、利伐斯的明(rivastigmine)、罗匹尼罗、司来吉兰(selegiline)、他克林(tacrine)、托卡朋(tolcapone)或三己芬迪(trihexyphenidyl)组合用于治疗和/或预防神经变性疾病。例如，包含结合与神经变性相关的蛋白质(例如，tau、淀粉样蛋白β(A)、亨廷顿蛋白或α-突触核蛋白)的靶标结合肽的选择性耗竭复合物可用于治疗神经变性疾病。

本文所述的选择性耗竭复合物(例如，肽缀合物、融合肽或重组产生的肽复合物)与TfR的结合以及后续穿过细胞层或屏障诸如BBB(例如通过囊泡胞吞转运)或细胞膜(例如通过内吞作用)的转运可在各种癌症中具有影响。可用本文所述的选择性耗竭复合物治疗或预防的癌症可包括乳腺癌、肝癌、结肠癌、脑癌、白血病、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤、血细胞源性癌症、脾癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、食道癌、胃肠(GI)癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、唾液腺癌、肾癌、肌肉癌、卵巢癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛癌、中线神经胶质瘤、弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤、肺癌、骨髓细胞癌、皮肤癌、黑素瘤、泌尿生殖系统癌、骨肉瘤、肌肉源性肉瘤、黑素瘤、头颈癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛癌、中线神经胶质瘤以及弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG)或CMYC过度表达性癌。例如，包含结合与癌症相关的蛋白质(例如，HER2、EGFR、FGFR-1、PD-L1、VEGF、PD-1、CD38、GD2、SLAMF7、CTLA-4、CCR4、CD20、PDGFRɑ、VEGFR2、CD33、CD30、CD22、CD79B、粘连蛋白-4或TROP2)的靶标结合肽的选择性耗竭复合物可用于治疗癌症。在一些实施方案中，用于治疗癌症的选择性耗竭复合物可包含靶标结合肽，所述靶标结合肽结合与细胞生长、细胞分裂、避免细胞死亡、免疫逃避、抑制炎症反应、促进血管生长或防止缺氧相关的细胞外可溶性或细胞表面蛋白。在一些实施方案中，本公开的选择性耗竭复合物可用于耗竭抗炎刺激物(例如，与N2极化巨噬细胞相关的分子或与小胶质细胞或调控性T细胞相关的分子)并促进先天性和适应性免疫系统肿瘤靶向能力。包含结合与抗炎刺激物相关的分子的靶标结合肽的选择性耗竭复合物可增强否则容易出现免疫衰竭的疗法(例如电离辐射或CAR-T细胞疗法)。

在一些实施方案中，选择性耗竭复合物可用于减少免疫抑制或抑制促炎信号传导，诸如在免疫介导的疾病中。例如，选择性耗竭复合物可包含靶标结合肽，所述靶标结合肽结合与免疫抑制或促炎信号传导相关的蛋白质(例如，CD47、CD39、CD24、CD25、CD74、TNF-α、I L-1、I L-1R、I L-2、I L-2R、I L-6、I L-6R、I L-10、I L-10R、I L-23、I L-12、PD-1、PD-L1)。在一些实施方案中，选择性耗竭复合物可用于治疗炎症性或神经疾患(例如，神经炎症、神经炎症性疾病、中风、创伤性脑损伤、阿尔茨海默氏病或其他tau蛋白病，包括神经原纤维缠结性痴呆、慢性创伤性脑病(CTE)、衰老相关性tau星形胶质细胞病变、额颞叶痴呆、帕金森病、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、利替可-波帝格病、神经节神经胶质瘤、脑膜血管瘤病或亚急性硬化性全脑炎)。例如，包含TNF-α结合肽的选择性耗竭复合物可用于治疗神经炎症、神经炎症性疾病、中风、创伤性脑损伤或阿尔茨海默氏病。

本文所述的选择性耗竭复合物(例如，肽缀合物、融合肽或重组产生的肽复合物)与TfR的结合以及后续穿过细胞层或屏障诸如BBB(例如通过囊泡胞吞转运)或细胞膜(例如通过内吞作用)的转运可在与有害炎症相关的许多疾病、疾患或病症中具有影响。可用本文所述的选择性耗竭复合物治疗或预防的有害炎症可包括类风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化症、狼疮、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征、痛风、炎症性关节炎中心、肌炎、硬皮病、舍格伦氏病、血管炎、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、移植物抗宿主病、细胞因子风暴、囊性纤维化、炎症相关神经变性(例如，年龄相关性tau蛋白病或阿尔茨海默氏病)或自身免疫性病症。例如，包含靶标结合肽的选择性耗竭复合物结合与急性或慢性炎症相关的靶标(例如，载脂蛋白E4、TNF-α、I L-1、I L-6、I L-7、I L-12和I L-23)以选择性地耗竭炎性细胞因子或趋化因子。在一些实施方案中，选择性耗竭复合物可靶向自身抗体，例如与疾病，诸如糖尿病、甲状腺疾病、炎症性疾病、系统性红斑狼疮(SLE或狼疮)、肌肉功能、皮肤病、器官疾病、肾病或类风湿性关节炎相关的自身抗体。在一些实施方案中，包含结合I L-6的靶标结合肽的选择性耗竭复合物可用于治疗与冠状病毒感染(例如SARS-CoV-2)相关的炎症。选择性地耗竭I L-6消除的选择性耗竭复合物可减少I L-6信号传导。载脂蛋白E4可与阿尔茨海默氏病相关。

本文所述的选择性耗竭复合物(例如，肽缀合物、融合肽或重组产生的肽复合物)与TfR的结合以及后续穿过细胞层或屏障诸如BBB(例如通过囊泡胞吞转运)或细胞膜(例如通过内吞作用)的转运可在各种溶酶体贮积病中具有影响。可用本文所述的选择性耗竭复合物治疗或预防的溶酶体贮积病可包括戈谢病(葡糖脑苷脂酶缺乏症)或庞贝病(α-葡糖苷酶缺乏症)。可将溶酶体贮积酶施用于患者，以使得其在血清或其他细胞外液中可用。在一些实施方案中，本公开的选择性耗竭复合物可用于选择性地将溶酶体酶募集至溶酶体，从而治疗与溶酶体酶的表达降低相关的溶酶体贮积病。包含结合溶酶体酶(例如，葡糖脑苷脂酶或α-葡糖苷酶)的靶标结合肽的选择性耗竭复合物可通过TfR介导的内吞作用选择性地将溶酶体酶募集到内吞区室中。选择性耗竭复合物可再循环至细胞表面，并且可将溶酶体酶靶标递送至溶酶体，从而富集溶酶体中的溶酶体酶并治疗溶酶体贮积病。

在一些实施方案中，选择性耗竭复合物(例如，包含靶标结合肽和细胞受体结合肽)或选择性耗竭复合物组分(例如，包含靶标结合肽或细胞受体结合肽和二聚化结构域)可包含SEQ ID NO:288–SEQ IDNO:313、SEQ ID NO:315–SEQ ID NO:348、SEQ ID NO:351、SEQ ID NO:352、SEQ ID NO:355、SEQ ID NO:356、SEQ ID NO:358、SEQ ID NO:359、SEQ IDNO:360、SEQ ID NO:361、SEQ ID NO:362、SEQ ID NO:363、SEQ ID NO:364、SEQ ID NO:365、SEQ ID NO:371、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:376、SEQ ID NO:378、SEQ ID NO:382、SEQ IDNO:384、SEQ ID NO:387或SEQ ID NO:389中的任一个或其片段的序列。在一些实施方案中，选择性耗竭复合物(例如，包含靶标结合肽和细胞受体结合肽)可包含与SEQ ID NO:96具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性或与SEQ ID NO:288–SEQ IDNO:313、SEQ ID NO:315–SEQ IDNO:348、SEQ ID NO:351、SEQ ID NO:352、SEQ ID NO:355、SEQ ID NO:356、SEQ ID NO:358、SEQ ID NO:359、SEQ ID NO:360、SEQ ID NO:361、SEQ ID NO:362、SEQ ID NO:363、SEQ IDNO:364、SEQ ID NO:365、SEQ ID NO:371、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:376、SEQ ID NO:378、SEQ ID NO:382、SEQ ID NO:384、SEQ ID NO:387或SEQ ID NO:389中的任一个或其片段具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。选择性耗竭复合物和选择耗竭复合物组分及其相应靶标或细胞受体的实例提供于表8中。

表8–示例性选择性耗竭复合物和复合物组分

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序列同一性和同源性

通过常规方法来确定序列同一性或同源性百分比(％)。(参见例如Altschul等人(1986),Bull.Math.Bio.48:603(1986)以及Henikoff和Henikoff(1992),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)。简而言之，可使用空位开放罚分10、空位延伸罚分1以及Henikoff和Henikoff(同上)的“BLOSUM62”评分矩阵来比对两个氨基酸序列以优化比对评分。然后将序列同一性或同源性计算为：([相同匹配的总数]/[较长序列的长度加上引入至较长序列中以比对两个序列的空位的数目])(100)。

各种方法和软件程序可用于确定两个或更多个肽之间的同源性，诸如NCBIBLAST、Clustal W、MAFFT、Clustal Omega、AlignMe、Praline，或另一适合方法或算法。成对序列比对可用于鉴定可指示两个生物序列(例如氨基酸或核酸序列)之间的功能、结构和/或进化关系的类似性区域。此外，多重序列比对(MSA)是三个或更多个生物序列的比对。根据MSA应用程序的输出，可暗示同源性，并且评估序列之间的进化关系。如本文所用，“序列同源性”和“序列同一性”和“序列同一性百分比(％)”和“序列同源性百分比(％)”可互换用于意指视情况而定与参考多核苷酸或氨基酸序列的序列相关性或相对于参考多核苷酸或氨基酸序列的变异。

另外，有若干确定算法可用于比对两个氨基酸序列。举例来说，Pearson和Lipman的“FASTA”类似性搜索算法可以是一种适于考查由本文公开的肽的氨基酸序列和肽变体的氨基酸序列共有的序列同一性或同源性的水平的蛋白质比对方法。FASTA算法例如由Pearson和Lipman,Proc.Nat'lAcad.Sci.USA 85:2444(1988)以及由Pearson,Meth.Enzymol.183:63(1990)描述。简而言之，FASTA首先通过鉴定由查询序列(例如SEQ IDNO:1)和测试序列共有的具有最高同一性密度(如果ktup变量是1)或同一性对(如果ktup＝2)的区域，而不考虑保守性氨基酸取代、插入或缺失来表征序列类似性。具有最高同一性密度的十个区域然后通过使用氨基酸取代矩阵比较所有配对氨基酸的类似性来再评分，并且区域的末端被“修剪”以仅包括促成最高评分的那些残基。如果有若干区域具有大于“截断”值(通过基于序列长度和ktup值的预定公式来计算)的评分，那么考查修剪的初始区域以确定所述区域是否可被接合以形成具有空位的近似比对。最后，使用Needleman-Wunsch-Sellers算法(Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:444(1970)；Sellers,SiamJ.Appl.Math.26:787(1974))的修改形式比对两个氨基酸序列的最高评分区域，所述修改形式允许进行氨基酸插入和缺失。举例来说，FASTA分析的说明性参数是：ktup＝1，空位开放罚分＝10，空位延伸罚分＝1，以及取代矩阵＝BLOSUM62。如在Pearson,Meth.Enzymol.183:63(1990)的附录2中解释的，可通过修改评分矩阵文件(“SMATRIX”)将这些参数引入FASTA程序中。

FASTA还可用于使用如上公开的比率来确定核酸序列或分子的序列同一性或同源性。对于核酸序列比较，ktup值可在一至六之间的范围内，优选是三至六，最优选是三，其他参数如本文所述进行设置。

是“保守性氨基酸取代”的常见氨基酸的一些实例由在以下群组中的每一者内的氨基酸之间的取代所说明：(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，(3)丝氨酸和苏氨酸，(4)天冬氨酸和谷氨酸，(5)谷氨酰胺和天冬酰胺，以及(6)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。BLOSUM62表是来源于蛋白质序列区段的约2,000个局部多重对比的氨基酸取代矩阵，表示多于500个组的相关蛋白质的高度保守的区域(Henikoff和Henikoff,Proc.Nat'lAcad.Sci.USA 89:10915(1992))。因此，BLOSUM62取代频率可用于确定可被引入至本发明的氨基酸序列中的保守性氨基酸取代。尽管有可能仅基于化学性质(如上所讨论)来设计氨基酸取代，但措辞“保守性氨基酸取代”优选地指代由大于-1的BLOSUM62值表示的取代。举例来说，如果取代的特征在于BLOSUM62值是0、1、2或3，那么氨基酸取代是保守性的。根据这个系统，优选保守性氨基酸取代的特征在于BLOSUM62值是至少1(例如1、2或3)，而更优选保守性氨基酸取代的特征在于BLOSUM62值是至少2(例如2或3)。

可确定对在对于维持结构完整性是关键的区域或结构域内的氨基酸残基的确定。在这些区域内，可确定可或多或少耐受变化，并且维持分子的总体三级结构的特定残基。用于分析序列结构的方法包括但不限于比对具有高氨基酸或核苷酸同一性或同源性的多个序列以及使用可用软件(例如Insight II.RTM.浏览器和同源性建模工具；MSI,San Diego,Calif.)、二级结构倾向、二元模式、互补性堆积和包埋极性相互作用(Barton,G.J.,Current Opin.Struct.Biol.5:372-6(1995)以及Cordes,M.H.等人,CurrentOpin.Struct.Biol.6:3-10(1996))进行计算机分析。一般来说，当设计对分子的修饰或鉴定特定片段时，对结构的确定可通常伴有评估经修饰分子的活性。

经工程化的结合肽

本公开的肽(例如，TfR结合肽、靶标结合肽或选择性耗竭复合物)可经工程化以改善或改变肽的性质。例如，可修饰肽以改变肽对结合配偶体(例如，靶标分子或TfR)的亲和力。在一些实施方案中，可修饰肽以便以pH依赖性方式改变结合亲和力。可通过将一个或多个氨基酸变异引入肽序列并测试所述变异对肽性质(例如，结合亲和力)的影响来修饰肽。

在一些实施方案中，肽或肽文库以计算机方式设计，而不由打结肽的天然存在的支架衍生。在其他实施方案中，肽或肽文库通过衍生，移植已知会结合目标蛋白质或受体的天然存在的肽或蛋白质的蛋白质结合界面中的相关蛋白质结合残基或保守残基来以计算机方式设计。在一些实施方案中，肽(例如SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64的TfR结合肽)是简单螺旋-转角-螺旋。在一些实施方案中，螺旋-转角-螺旋可用于药效团转移至其他支架上，例如使用融合标签化将所需TfR啮合表面嫁接至螺旋-转角-螺旋支架上。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1的肽作为支架或基础序列用于进一步修饰，包括添加、缺失或氨基酸取代。在一些实施方案中，短氨基酸残基序列诸如GS被添加在肽的N末端。在一些实施方案中，肽在N末端缺乏GS。在一些情况下，肽经受一种或多种翻译后修饰。

在一些实施方案中，能够结合TfR以及穿过细胞膜的胞吞转运的肽包含与表1中所列的示例性肽序列(SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ IDNO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64)中的任一个或其功能片段具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。两种或更多种肽可共有一定程度的序列同一性或同源性，并且共有类似体内性质。举例来说，肽可与SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ IDNO:220–SEQ ID NO:222，或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64的肽中的任一个共有一定程度的序列同一性或同源性。在一些实施方案中，本公开的一种或多种肽具有直至约20％成对序列同一性或同源性、直至约25％成对序列同一性或同源性、直至约30％成对序列同一性或同源性、直至约35％成对序列同一性或同源性、直至约40％成对序列同一性或同源性、直至约45％成对序列同一性或同源性、直至约50％成对序列同一性或同源性、直至约55％成对序列同一性或同源性、直至约60％成对序列同一性或同源性、直至约65％成对序列同一性或同源性、直至约70％成对序列同一性或同源性、直至约75％成对序列同一性或同源性、直至约80％成对序列同一性或同源性、直至约85％成对序列同一性或同源性、直至约90％成对序列同一性或同源性、直至约95％成对序列同一性或同源性、直至约96％成对序列同一性或同源性、直至约97％成对序列同一性或同源性、直至约98％成对序列同一性或同源性、直至约99％成对序列同一性或同源性、直至约99.5％成对序列同一性或同源性，或直至约99.9％成对序列同一性或同源性。在一些实施方案中，本公开的一种或多种肽与第二肽具有至少约20％成对序列同一性或同源性、至少约25％成对序列同一性或同源性、至少约30％成对序列同一性或同源性、至少约35％成对序列同一性或同源性、至少约40％成对序列同一性或同源性、至少约45％成对序列同一性或同源性、至少约50％成对序列同一性或同源性、至少约55％成对序列同一性或同源性、至少约60％成对序列同一性或同源性、至少约65％成对序列同一性或同源性、至少约70％成对序列同一性或同源性、至少约75％成对序列同一性或同源性、至少约80％成对序列同一性或同源性、至少约85％成对序列同一性或同源性、至少约90％成对序列同一性或同源性、至少约95％成对序列同一性或同源性、至少约96％成对序列同一性或同源性、至少约97％成对序列同一性或同源性、至少约98％成对序列同一性或同源性、至少约99％成对序列同一性或同源性、至少约99.5％成对序列同一性或同源性、至少约99.9％成对序列同一性或同源性。

在一些实施方案中，展现改善的TfR受体结合的肽显示改善的胞吞转运功能。在一些情况下，展现改善的TfR受体结合的肽不显示或显示小幅胞吞转运功能变化。在一些情况下，展现改善的TfR受体结合的肽显示降低的胞吞转运功能。在一些实施方案中，TfR结合肽的K_A和K_D值可被调节和优化(例如通过氨基酸取代)以提供TfR结合亲和力和高效胞吞转运功能的最优比率。

在一些情况下，肽或肽复合物是SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ IDNO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个或其功能片段。在其他实施方案中，本公开的肽或肽复合物还包含与SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ IDNO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个或其功能片段具有99％、95％、90％、85％或80％序列同一性或同源性的肽。

在其他情况下，肽或肽复合物可以是与SEQ ID NO:96、SEQ IDNO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ IDNO:64中的任一个或其功能片段同源的肽。如本文进一步所述，术语“同源”在本文中可用于表示肽或肽复合物与SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ IDNO:95、SEQ ID NO:97–SEQ IDNO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个或其功能片段的序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或大于95％序列同一性或同源性。在各种实施方案中，片段的长度可以是至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900或至少1000个氨基酸。在各种实施方案中，片段的长度可以是至多1000、至多900、至多800、至多700、至多600、至多500、至多450、至多400、至多350、至多300、至多250、至多200、至多150、至多100、至多50、至多45、至多40、至多35、至多30、至多25、至多20、至多15、至多10或至多5个氨基酸。在一些实施方案中，片段的长度可以是约5至约50、约10至约50、约10至约40、约10至约30或约10至约20个氨基酸。

在其他情况下，编码SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ IDNO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个的肽或肽复合物的核酸分子可通过确定所编码肽氨基酸序列与SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个的氨基酸序列的序列同一性或同源性或通过核酸杂交测定来鉴定。SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ IDNO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ IDNO:1–SEQ ID NO:64中的任一个的此类肽变体或肽复合物变体可表征为以下核酸分子：(1)保持在高度严格洗涤条件下与具有SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ IDNO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个的核苷酸序列(或其互补序列)的核酸分子杂交，其中洗涤严格性等同于在50℃-65℃下，0.1×-0.2×SSC伴有0.1％ SDS，以及(2)编码与SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或大于95％序列同一性或同源性的肽。

亲和力成熟

可通过亲和力成熟鉴定或修饰本公开的肽(例如，靶标结合肽、TfR结合肽或选择性耗竭复合物)。例如，可通过结合肽(例如，CDP、纳米抗体、亲和体、DARPin、centyrin、nanofittin、adnectin或抗体片段)的亲和力成熟来鉴定结合目标靶标的靶标结合肽。结合肽可通过生成每个可能的点突变或者(在CDP的情况下)每个可能的非半胱氨酸点突变的文库来经历亲和力成熟。变体文库可通过表面展示(例如，在酵母或哺乳动物细胞中)表达，并筛选与结合配偶体(例如，靶标分子或TfR)的结合。相对于初始肽或相对于变体文库的其他成员具有增加的结合亲和力的文库成员可经历后续轮次的成熟。在每一轮中，生成并筛选每个可能的非半胱氨酸点突变的变体文库。在一些实施方案中，肽可经历1、2、3、4、5、6、7、8、9或10轮亲和力成熟，以鉴定与目标结合配偶体(例如，靶标分子或TfR)具有改善的结合亲和力的肽。变体可通过桑格测序、下一代测序或高通量测序(例如，Illumina测序)来鉴定。

在一些实施方案中，可选择肽(例如，TfR结合肽或靶标结合肽)用于非pH依赖性结合。例如，可针对在细胞外pH(约pH 7.4)下和在内体pH(诸如约pH 5.5)下与结合配偶体(例如，靶标分子或TfR)的高亲和力结合来选择肽。具有非pH依赖性结合的肽可在细胞外pH(约pH 7.4)下以小于50μM、小于5μM、小于500nM、小于100nM、小于40nM、小于30nM、小于20nM、小于10nM、小于5nM、小于2nM、小于1nM、小于0.5nM、小于0.4nM、小于0.3nM、小于0.2nM或小于0.1nM的解离常数(K_D)结合至结合配偶体。在一些实施方案中，具有pH依赖性结合的靶标结合肽可在内体pH(诸如约pH 5.5)下以小于50μM、小于5μM、小于500nM、小于100nM、小于40nM、小于30nM、小于20nM、小于10nM、小于5nM、小于2nM、小于1nM、小于0.5nM、小于0.4nM、小于0.3nM、小于0.2nM或小于0.1nM的解离常数(K_D)结合靶标分子。在一些实施方案中，TfR结合肽在内体pH下是稳定的，并且不会例如在酸性条件(诸如pH6.9、pH 6.8、pH 6.7、pH6.6、pH 6.5、pH 6.4、pH 6.3、pH 6.2、pH 6.1、pH 6.0、pH 5.9、pH 5.8、pH 5.7、pH 5.6、pH5.5、pH 5.4、pH 5.3、pH 5.2、pH 5.1、pH 5.0、pH 4.9、pH 4.8、pH 4.7、pH 4.6、pH 4.5或更低)下在内体中释放。相反，对结合至所选靶标具有高亲和力并在选择性耗竭复合物中用作结合此类所选靶标并释放在内体中以在细胞内降解的肽或肽复合物的肽可以是pH依赖性靶标结合CDP，使得其在内体中释放。在一些实施方案中，靶标结合肽在内体pH下不太稳定，并且例如在酸性条件，诸如pH 7.3、pH 7.2、pH 7.1、pH 7.0、pH 6.9、pH 6.8、pH 6.7、pH6.6、pH 6.5、pH 6.4、pH 6.3、pH 6.2、pH 6.1、pH 6.0、pH 5.9、pH 5.8、pH 5.7、pH 5.6、pH5.5、pH 5.4、pH 5.3、pH 5.2、pH 5.1、pH 5.0、pH 4.9、pH 4.8、pH 4.7、pH 4.6、pH 4.5或更低下在内体中全部或部分释放。

pH依赖性结合

本公开的肽(例如，靶标结合肽或TfR结合肽)可针对pH依赖性结合性质进行修饰。赋予与靶标结合肽(例如，靶标结合CDP)的pH依赖性结合可在三个阶段中进行。首先，可设计含有组氨酸(Hi s)点突变的肽变体的文库。将组氨酸氨基酸引入靶标结合肽中，因为His是其侧链的pK_a值介于中性(pH 7.4)与酸性(pH<6)内体条件之间的唯一天然氨基酸，并且随pH改变的这种电荷变化可直接地(例如，在低pH下形成正电荷时改变电荷-电荷相互作用)或间接地(例如，电荷的变化赋予靶标结合肽的结构中的细微变化，从而破坏靶标分子与靶标结合肽之间的界面)。在一些实施方案中，靶标结合肽的变体筛选可通过生成双His掺杂文库来实施。例如，靶标结合CDP的双His掺杂文库可包含其中每个非Cys、非His残基一次一个或两个被His氨基酸取代的文库。变体文库可通过表面展示在细胞(例如，酵母细胞或哺乳动物细胞)中表达，每个靶标结合肽变体含有一个或两个His取代。可测试靶标结合肽变体在中性pH(约pH 7.4)下结合的维持，以及在低pH(约pH 6.0或约pH 5.5)下的减少结合。与中性pH相比，在低pH下表现出降低的结合亲和力的变体可被鉴定为具有pH依赖性结合的靶标结合肽。

在一些实施方案中，本公开的靶标结合肽(例如含有组氨酸或组氨酸富集的靶标结合肽)在生理细胞外pH下可具有高靶标结合亲和力，但在较低pH水平诸如内体pH 5.5下具有显著降低的结合亲和力。在一些情况下，本公开的靶标结合肽可被优化以获得改善的囊泡内(例如内体内)和/或细胞内递送功能，同时保留高靶标结合能力。在一些情况下，可进行组氨酸扫描和比较结合实验以开发和筛选此类肽。在一些实施方案中，本公开的肽中的氨基酸残基被用不同氨基酸残基取代以改变对靶标分子的pH依赖性结合亲和力。氨基酸取代可增加在低pH下的结合亲和力，增加在高pH下的结合亲和力，降低在低pH下的结合亲和力，降低在高pH下的结合亲和力，或它们的组合。

在一些实施方案中，具有pH依赖性结合的靶标结合肽可在细胞外pH(诸如约pH7.4)下以小于50μM、小于5μM、小于500nM、小于100nM、小于40nM、小于30nM、小于20nM、小于10nM、小于5nM、小于2nM、小于1nM、小于0.5nM、小于0.4nM、小于0.3nM、小于0.2nM或小于0.1nM的解离常数(K_D)结合靶标分子。在一些实施方案中，具有pH依赖性结合的靶标结合肽可在内体pH(诸如约pH 5.5)下以至少1nM、至少2nM、至少5nM、至少10nM、至少20nM、至少50nM、至少100nM、至少200nM、至少500nM、至少1μM、至少2μM、至少5μM、至少10μM、至少20μM、至少50μM、至少100μM、至少500μM、至少1mM、至少2mM、至少5mM、至少10mM、至少20mM、至少50mM、至少100mM、至少200mM、至少500mM或至少1M的解离常数(K_D)结合靶标分子。在一些实施方案中，TfR结合肽在内体pH下是稳定的，并且不会例如在酸性条件(诸如pH 6.9、pH6.8、pH 6.7、pH 6.6、pH 6.5、pH 6.4、pH 6.3、pH 6.2、pH 6.1、pH 6.0、pH 5.9、pH 5.8、pH5.7、pH 5.6、pH 5.5、pH 5.4、pH 5.3、pH 5.2、pH 5.1、pH 5.0、pH 4.9、pH 4.8、pH 4.7、pH4.6、pH 4.5或更低)下在内体中释放。相反，对结合至所选靶标具有高亲和力并在选择性耗竭复合物中用作结合此类所选靶标并释放在内体中以在细胞内降解的肽或肽复合物的肽可以是pH依赖性靶标结合CDP，使得其在内体中释放。在一些实施方案中，靶标结合肽在内体pH下是不太稳定的，并且例如在酸性条件(诸如pH 7.3、pH7.2、pH 7.1、pH 7.0、pH 6.9、pH 6.8、pH 6.7、pH 6.6、pH 6.5、pH 6.4、pH 6.3、pH 6.2、pH 6.1、pH 6.0、pH 5.9、pH 5.8、pH 5.7、pH 5.6、pH 5.5、pH 5.4、pH 5.3、pH 5.2、pH 5.1、pH 5.0、pH 4.9、pH 4.8、pH 4.7、pH 4.6、pH 4.5或更低)下在内体中全部或部分释放。

使用选择性耗竭复合物的方法

本公开的选择性耗竭复合物可用于对细胞、组织或受试者发挥作用。所述作用可以是治疗、药理学、生物学或生物化学作用。在一些实施方案中，所述作用可由选择性耗竭复合物所结合的靶标分子的选择性耗竭引起。在一些实施方案中，所述作用可由靶标、受体与结合所述靶标和所述受体的选择性耗竭复合物之间的三元复合物形成引起。

靶标分子的选择性耗竭

本文描述了使用本公开的组合物(例如，选择性耗竭复合物)选择性地耗竭靶标分子的方法。在一些实施方案中，本公开的方法可包括通过转铁蛋白受体介导的内吞作用选择性地将分子募集至内吞区室并在溶酶体中富集靶标分子。选择性耗竭复合物(例如，包含与靶标结合肽缀合的受体结合肽的复合物)可通过受体结合肽结合至受体并且结合至靶标分子(例如，可溶性蛋白、细胞外蛋白或细胞表面蛋白)。靶标分子可以通过受体介导的受体和选择性耗竭分子的内吞作用递送至内吞区室。在内吞区室中，选择性耗竭复合物可以保持与受体结合，并且随着内吞区室酸化，靶标分子可以从选择性耗竭复合物中释放出来。选择性耗竭分子可与受体一起再循环至细胞表面，并且靶标分子可继续进入溶酶体，在溶酶体中所述靶标分子被降解。在一些实施方案中，靶标分子可保留在溶酶体中而不被降解，从而导致靶标分子在溶酶体中富集，诸如溶酶体贮积病中的溶酶体酶。

本公开的用于选择性地耗竭靶标分子或用于在溶酶体中选择性地富集靶标分子的方法可用于治疗与靶标分子相关的疾病或疾患。例如，与神经变性相关的靶标分子的选择性耗竭可用于治疗神经变性疾病。在另一个实例中，与癌症相关的靶标分子的选择性耗竭可用于治疗癌症。细胞表面分子的耗竭可允许癌细胞由免疫系统靶向，丧失检查点抑制，可使存活信号传导失效，或除去耐药泵。在另一个实例中，炎症分子的选择性耗竭可用于治疗有害的炎症性信号传导。在另一个实例中，与溶酶体贮积病相关的溶酶体酶在溶酶体中的选择性富集可用于治疗溶酶体贮积病。在此实例中，溶酶体酶可在与靶标耗竭复合物的联合治疗中施用，使得靶标耗竭复合物将溶酶体酶驱动到溶酶体区室中。治疗疾病或疾患的方法可包括使细胞(例如，表达受体的细胞)与本公开的选择性耗竭复合物接触。在一些实施方案中，选择性耗竭复合物可施用于患有疾病或疾患(例如，神经变性疾病、癌症、有害炎症或溶酶体贮积病)的受试者(例如，人受试者)。

TfR是普遍存在的蛋白质，因为所有哺乳动物细胞都需要铁，并且因此通过这种组成性途径摄取转铁蛋白。通过这种机制，几乎任何靶组织都将适用于包括TfR结合肽的本公开的选择性耗竭方法或选择性富集方法。肿瘤组织可能特别适合于本公开的方法，因为大多数肿瘤富含TfR，其可赋予选择性耗竭分子天然肿瘤选择性。

肝组织也可高度富集TfR，并且因此是用于选择性耗竭方法的有利组织。在一些实施方案中，本公开的选择性耗竭复合物(例如，包含CDP的选择性耗竭复合物)可在肝脏中稳定延长的时间段。例如，本公开的选择性耗竭复合物可在肝中具有至少约1、至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9或至少约10小时的半衰期。可靶向血清蛋白(其作为一类已经在很大程度上受到肝脏代谢的影响)用于以相对低剂量的选择性耗竭复合物进行选择性耗竭。可改进本公开的选择性耗竭复合物的血清半衰期以产生需要不频繁给药的分子，例如通过添加血清半衰期延长肽。具有较短半衰期的选择性耗竭复合物可充当急性靶标消除药物，例如用于治疗有害的炎症信号传导。

选择性耗竭复合物可全身或外周施用至受试者并且可在具有高水平TfR表达的组织(例如，肿瘤组织、肾组织、脾、骨髓或肝组织)中累积。在一些实施方案中，选择性耗竭复合物可全身或外周施用于受试者并且可在肾组织或肝组织中累积。在一些实施方案中，选择性耗竭复合物可包含组织靶向结构域并且可在施用于受试者后在靶组织中累积。例如，选择性耗竭复合物可缀合至、连接至或融合至对目标细胞或位于所述细胞表面上或内部的靶蛋白具有靶向或归巢功能的分子(例如，小分子、肽或蛋白质)。在一些实施方案中，选择性耗竭复合物可口服施用于受试者并且可到达胃肠道。口服施用的选择性耗竭复合物可用于清除胃肠道中的疾病相关蛋白。

在一些实施方案中，本公开的选择性耗竭复合物可被遗传编码到具有分泌表型的良性细胞中。选择性耗竭复合物可由分泌细胞表达，并在局部细胞疗法中作为分泌分子施用。在一些实施方案中，编码选择性耗竭复合物的基因可作为基因疗法递送至目标组织(例如，肝、造血组织、肾、皮肤、肿瘤、中枢神经系统(CNS)或神经元)。

在一些实施方案中，选择性耗竭构建体的靶标结合肽可包含小蛋白、纳米抗体、抗体、I gG、抗体片段、Fab、F(ab)2、scFv、(scFv)2、DARPin或亲和体。在一些实施方案中，靶标结合肽可包含胱氨酸密集肽、affitin、adnectin、avimer、Kunitz结构域、nanofittin、fynomer、双环肽、β-发夹或钉合肽。例如，靶标结合肽可包含结合PD-L1、FGFR-1、VEGF、PD-1、EGFR、CD38、GD2、SLAMF7、CTLA-4、CCR4、CD20、PDGFRɑ、VEGFR2、HER2、CD33、CD30、CD22、CD79B、粘连蛋白-4或TROP2的抗体单链可变片段(scFv)，并针对pH依赖性结合进行了修饰。选择性耗竭复合物的靶标结合肽可结合至靶标分子，诸如具有临床相关性的靶标分子。在一些实施方案中，靶标分子可以是在疾病或疾患中过度表达或过度激活的蛋白质。例如，靶标分子可以是参与致癌信号传导、免疫抑制或促炎信号传导的跨膜蛋白。可由本公开的靶标结合肽靶向的靶标分子的实例包括但不限于CD3、CD47、CD28、CD137、CD89、CD16、CD29、CD44、CD71、CD73、CD90、CD105、CD166、CD27、CD39、CD24、CD25、CD74、CD40L、MUC1、MUC16、MUC2、MUC5AC、MUC4、OX40、4-1BB、HLA-G、LAG3、Tim3、TIGIT、GITR、TCR、TNF-α、EGFR、EGFRvIII、TKI抗性EGFR、HER2、ERBB3、PDGFR、FGF、VEGF、VEGFR、IGFR1、CTLA4、STRO1、补体因子C4、补体因子C1q、补体因子C1s、补体因子C1r、补体因子C3、补体因子C3a、补体因子C3b、补体因子C5、补体因子C5a、TGFβ、PCSK9、P2Y6、HER3、RANK、tau、淀粉样蛋白β、亨廷顿蛋白、α-突触核蛋白、葡糖脑苷脂酶、α-葡糖苷酶、IL-1、IL-1R、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-10、IL-10R、IL-17、IL-23、IL-12、p40、B7家族的成员、c-Met、SIGLEC、MCP-1、MHC、MHCI、MHCII、PD-1和PD-L1。

内吞作用和随后通过选择性耗竭复合物降解靶标分子可治疗与靶标分子(例如，CD3、CD47、CD28、CD137、CD89、CD16、CD29、CD44、CD71、CD73、CD90、CD105、CD166、CD27、CD39、CD24、CD25、CD74、CD40L、MUC1、MUC16、MUC2、MUC5AC、MUC4、OX40、4-1BB、HLA-G、LAG3、Tim3、TIGIT、GITR、TCR、TNF-α、EGFR、EGFRvIII、TKI抗性EGFR、HER2、ERBB3、PDGFR、FGF、VEGF、VEGFR、IGFR1、CTLA4、STRO1、补体因子C4、补体因子C1q、补体因子C1s、补体因子C1r、补体因子C3、补体因子C3a、补体因子C3b、补体因子C5、补体因子C5a、TGFβ、PCSK9、P2Y6、HER3、RANK、tau、淀粉样蛋白β、亨廷顿蛋白、α-突触核蛋白、葡糖脑苷脂酶、α-葡糖苷酶、IL-1、IL-1R、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-10、IL-10R、IL-17、IL-23、IL-12、p40、B7家族的成员、c-Met、SIGLEC、MCP-1、MHC、MHC I、MHC II、PD-1或PD-L1)相关的疾病或疾患(例如，消除、减轻所述疾病或疾患，减缓所述疾病或疾患的进展或治疗所述疾病或疾患的症状)。在一些实施方案中，靶标分子在疾病或疾患中过度表达并且耗竭靶标分子降低靶标分子的水平，从而治疗疾病或疾患。在一些实施方案中，靶标分子在疾病或疾患中累积，并且耗竭靶标分子可清除或减少累积，从而治疗疾病或疾患。在一些实施方案中，靶标分子被过度激活或过度刺激，并且耗竭靶标分子降低靶标分子的活性水平，从而治疗疾病或疾患。可使用选择性耗竭复合物治疗的疾病的实例包括癌症(例如，非小细胞肺癌、原发性非小细胞肺癌、转移性非小细胞肺癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、胶质母细胞瘤、脑癌、转移性脑癌、结肠直肠癌、结肠癌、酪氨酸激酶抑制剂(TKI)耐药性癌症、西妥昔单抗耐药性癌症、耐昔妥珠单抗耐药性癌症、帕尼单抗耐药性癌症、局部癌症、局部晚期癌症、复发性癌症、转移性癌症、难治性癌症、KRAS野生型癌症、KRAS突变型癌症或外显子20突变型非小细胞肺癌)、炎症、炎症性疾患、神经疾患(例如，神经炎症、神经炎症性疾病、中风、创伤性脑损伤、阿尔茨海默氏病或其他tau蛋白病，包括神经原纤维缠结性痴呆、慢性创伤性脑病(CTE)、衰老相关性tau星形胶质细胞病变、额颞叶痴呆、帕金森病、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、利替可-波帝格病、神经节神经胶质瘤、脑膜血管瘤病或亚急性硬化性全脑炎)。

本公开的选择性耗竭复合物的施用可与另外的疗法组合以治疗疾病或疾患。例如，施用选择性耗竭复合物来治疗癌症可与施用放射疗法、化学疗法、铂疗法或抗代谢疗法组合。在一些实施方案中，额外疗法可包括向受试者施用氟尿嘧啶、FOLFIRI、伊立替康、FOLFOX、吉西他滨或顺铂。

三元复合物形成

本文描述了在靶标分子、受体与包含受体结合肽和靶标结合肽的选择性耗竭复合物之间形成三元复合物的方法。三元复合物可通过受体结合肽与受体的结合以及靶标结合肽与靶标的结合而形成。靶标、受体与选择性耗竭复合物之间的三元复合物形成可对表达靶标和受体的细胞、组织或受试者发挥治疗、药理学、生物学或生物化学作用。在一些实施方案中，受体、靶标与选择性耗竭复合物之间的三元复合物的形成可增加靶标分子、受体或两者的再循环或周转。靶标或受体的再循环或周转增加可改变(例如，增加)靶标或受体的活性，从而发挥治疗、药理学、生物学或生物化学作用。

三元复合物的形成可通过将靶标分子募集至受体来发挥治疗、药理学、生物学或生物化学作用。靶标分子募集至受体可促进受体与靶标之间的结合相互作用。在一些实施方案中，受体和靶标的后续再循环可促进治疗、药理学、生物学或生物化学作用。在一些实施方案中，三元复合物的形成可使靶标与受体之间的相互作用稳定。

肽的物理化学性质

在一些实施方案中，本公开的肽(例如，TfR结合肽、靶标结合肽或选择性耗竭复合物)可包含广泛范围的物理化学性质，诸如分子大小和结构、pH、等电点以及总体分子净电荷。这些参数可对肽结合TfR、结合靶标分子、促进胞吞转运、穿过细胞屏障诸如BBB转运运载物分子或其组合的能力具有影响。

本公开的肽可包含至少一个呈D构型的氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是约5-100个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是约10-90个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是约15-80个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是约15-75个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是约15-70个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是约20-65个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是约20-60个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是约25-55个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是约25-50个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是约25-40个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是约11-35个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是约10-25个氨基酸残基。

在一些实施方案中，肽的长度是至少5个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是至少10个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是至少15个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是至少20个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是至少25个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是至少30个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是至少35个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是至少40个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是至少45个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是至少50个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是至少55个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是至少60个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是至少65个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是至少70个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度是至少75个氨基酸残基。

在一些实施方案中，如本文所述的肽的氨基酸序列包含至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58个残基、至少59、至少60、至少61、至少62、至少63、至少64、至少65、至少66、至少67、至少68、至少69、至少70、至少71、至少72、至少73、至少74、至少75、至少76、至少77、至少78、至少79、至少80或至少81个氨基酸残基。

在本公开的一些实施方案中，肽的三维或三级结构主要包含β-片层和/或α-螺旋结构。在一些实施方案中，本公开的经设计或经工程化肽(例如，靶标结合肽、TfR结合肽或选择性耗竭复合物)是通过链内二硫键(例如由半胱氨酸介导)和疏水性核心来稳定的小型紧密肽或多肽。在一些实施方案中，经工程化肽具有包含螺旋束的结构，其中在每个α螺旋之间具有至少一个二硫键，由此使肽稳定。在其他实施方案中，经工程化TfR结合肽包含具有三个α螺旋和三个链内二硫键的结构，在α螺旋束中的三个α螺旋中的每一者之间具有一个二硫键。

在生理细胞外pH下，如本文所述的肽可具有例如-5、-4、-3、-2、-1、0、+1、+2、+3、+4或+5的总体分子净电荷。当净电荷是零时，肽可以是不带电荷的或两性离子性的。在一些实施方案中，肽含有一个或多个二硫键，并且在生理细胞外pH下具有正性净电荷，其中所述净电荷可以是+0.5或小于+0.5、+1或小于+1、+1.5或小于+1.5、+2或小于+2、+2.5或小于+2.5、+3或小于+3、+3.5或小于+3.5、+4或小于+4、+4.5或小于+4.5、+5或小于+5、+5.5或小于+5.5、+6或小于+6、+6.5或小于+6.5、+7或小于+7、+7.5或小于+7.5、+8或小于+8、+8.5或小于+8.5、+9或小于+9.5、+10或小于+10。在一些实施方案中，肽在生理细胞外pH下具有负性净电荷，其中所述净电荷可以是-0.5或小于-0.5、-1或小于-1、-1.5或小于-1.5、-2或小于-2、-2.5或小于-2.5、-3或小于-3、-3.5或小于-3.5、-4或小于-4、-4.5或小于-4.5、-5或小于-5、-5.5或小于-5.5、-6或小于-6、-6.5或小于-6.5、-7或小于-7、-7.5或小于-7.5、-8或小于-8、-8.5或小于-8.5、-9或小于-9.5、-10或小于-10。

在一些实施方案中，本公开的肽可具有3至10的等电点(p I)值。在其他实施方案中，本公开的肽可具有4.3至8.9的p I值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有3-4的p I值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有3-5的p I值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有3-6的p I值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有3-7的p I值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有3-8的p I值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有3-9的p I值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有4-5的p I值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有4-6的pI值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有4-7的p I值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有4-8的p I值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有4-9的p I值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有4-10的p I值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有5-6的p I值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有5-7的p I值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有5-8的p I值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有5-9的p I值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有5-10的p I值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有6-7的p I值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有6-8的p I值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有6-9的p I值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有6-10的p I值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有7-8的p I值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有7-9的p I值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有7-10的p I值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有8-9的p I值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有8-10的p I值。在一些实施方案中，本公开的肽可具有9-10的p I值。

在一些情况下，本公开的肽(例如TfR结合肽)内的一个或多个突变的工程化产生在生理细胞pH下具有改变的等电点、电荷、表面电荷或流变学的肽。对可源于蝎子或蜘蛛复合物的肽的突变的此工程化可例如通过使净电荷降低1、2、3、4或5，或通过使净电荷增加1、2、3、4或5来改变所述肽的净电荷。在此类情况下，工程化突变可有助于肽结合靶蛋白，促进胞吞转运，并且穿透细胞、内体或核的能力。适于改善肽的流变学和效能的氨基酸修饰可包括保守性或非保守性突变。

相较于肽所源于的毒液或毒素组分的序列，所述肽可包含至多1个氨基酸突变、至多2个氨基酸突变、至多3个氨基酸突变、至多4个氨基酸突变、至多5个氨基酸突变、至多6个氨基酸突变、至多7个氨基酸突变、至多8个氨基酸突变、至多9个氨基酸突变、至多10个氨基酸突变，或另一适合数目。在其他实施方案中，相较于肽所源于的毒液或毒素组分的序列，所述肽或其功能片段包含至少1个氨基酸突变、至少2个氨基酸突变、至少3个氨基酸突变、至少4个氨基酸突变、至少5个氨基酸突变、至少6个氨基酸突变、至少7个氨基酸突变、至少8个氨基酸突变、至少9个氨基酸突变、至少10个氨基酸突变，或另一适合数目。在一些实施方案中，突变可被工程化在肽内以提供在生理细胞外pH下具有所需电荷或稳定性的肽。

通常，相关结构肽或蛋白质同源物的核磁共振(NMR)溶液结构、X射线晶体结构、以及一级结构序列比对或计算机设计可用于产生可改善折叠、稳定性和/或可制造性，同时维持特定生物功能(例如TfR亲和力/结合)的突变策略。用于产生同源物或计算机设计的肽或多肽的一般性策略可包括鉴定蛋白质的带电荷表面补丁或保守残基，使关键氨基酸位置和环突变，继之以在体外以及在体内对肽进行测试。总体肽优化过程就例如在体外或体内测试期间获得的信息用于设计下一代肽而言可具有迭代性质。因此，本文公开的方法可用于设计具有改善的性质的肽，或用于修正使折叠和可制造性复杂化的有害突变。关键氨基酸位置和环可被保留，而肽序列中的其他残基可被突变以改善、改变、移除，或以其他方式改进肽的功能，诸如结合、胞吞转运，或穿透细胞、内体或细胞中的核的能力，归巢或另一活性。这些技术可用于预测一组结构同源性支架的3D药效团，以及预测相关蛋白的可能移植区域以创建具有改善的性质(例如结合性质)的嵌合体。举例来说，这个策略用于鉴定用于设计具有改善的TfR受体结合和胞吞转运性质、高表达、高体内稳定性，或这些性质的任何组合的肽的关键氨基酸位置和环。

本公开还涵盖本文所述的各种肽的多聚体。多聚体的实例包括二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体等。多聚体可以是由多个相同的亚基形成的同聚体或由多个不同亚基形成的异聚体。在一些实施方案中，本公开的肽与至少一个其他肽、或两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个其他的肽以多聚体结构排列。在某些实施方案中，多聚结构的肽各自具有相同序列。在其他实施方案中，多聚结构的肽中的一者或多者或全部具有不同序列。

在一些实施方案中，本公开提供了可用作用于产生具有更加特定的或改善的性质的额外下一代肽的起始点的肽支架。在一些实施方案中，这些支架源于多种CDP或打结肽。用于支架的一些适合肽可包括但不限于氯毒素、甜味蛋白(brazzein)、环杆菌素(circulin)、stecrisp、hanatoxin、中期因子、hefutoxin、马铃薯羧基肽酶抑制剂、泡蛋白、引蛋白(attractin)、α-GI、α-GID、μ-PIIIA、ω-MVIIA、ω-CVID、χ-MrIA、ρ-TIA、芋螺睡眠肽G(conantokin G)、芋螺迟缓肽G(contulakin G)、GsMTx4、玛格毒素(margatoxin)、shK、毒素K、胰凝乳蛋白酶抑制剂(CTI)和EGF上皮调节蛋白核心。在一些实施方案中，肽序列由额外氨基酸侧接。一个或多个额外氨基酸可对肽赋予所需体内电荷、等电点、化学缀合位点、稳定性或生理性质。

肽的药代动力学

本公开的任何肽的药代动力学都可在通过不同施用途径来施用肽之后测定。举例来说，本公开的肽的药代动力学参数可在静脉内、皮下、肌内、经直肠、以气雾剂形式、胃肠外、经眼、经肺、经皮、经阴道、经眼部、经鼻、口服、舌下、吸入、经真皮、鞘内、鼻内、经腹膜、经颊、经滑膜、肿瘤内或局部施用之后进行定量。本公开的肽可通过使用追踪剂诸如放射性标记或荧光团来分析。举例来说，本公开的经放射性标记肽可通过各种施用途径来施用。可使用一系列方法来测定在各种生物样品诸如血浆、尿、粪便、任何器官、皮肤、肌肉和其他组织中的肽浓度或剂量回收率，所述方法包括HPLC、荧光检测技术(TECAN定量、流式细胞术、iVIS)或液体闪烁计数。

本文所述的方法和组合物涉及通过任何途径向受试者进行的肽施用的药代动力学。药代动力学可使用例如房室模型或非房室方法的方法和模型来描述。房室模型包括但不限于单房室模型、二房室模型、多房室模型等。模型经常被分成不同房室，并且可通过相应流程来描述。举例来说，一种流程是吸收、分布、代谢和排泄(ADME)流程。再举例来说，另一流程是释放、吸收、分布、代谢和排泄(LADME)流程。在一些方面，代谢和排泄可被分组至被称为消除房室的一个房室中。举例来说，释放包括组合物的活性部分从递送系统的释放，吸收包括组合物的活性部分由受试者吸收，分布包括组合物在血浆之中以及到达不同组织的分布，代谢包括组合物的代谢或失活，并且最后，排泄包括组合物或组合物的代谢产物的排泄或消除。静脉内施用至受试者的组合物可经受多相药代动力学概况，其包括但不限于组织分布和代谢/排泄的方面。因此，组合物的血浆或血清浓度的降低经常是双相的，包括例如α相和β相，偶尔观察到γ相、δ相或其他相。

药代动力学包括测定至少一个与向受试者施用肽相关的参数。在一些方面，参数至少包括剂量(D)、给药间隔(τ)、曲线下面积(AUC)、最大浓度(C_max)、在施用后续剂量之前达到的最小浓度(C_min)、最小时间(T_min)、达到C_max的最大时间(T_max)、分布容积(V_d)、稳态分布容积(V_ss)、在时间0时的回推浓度(C₀)、稳态浓度(C_ss)、消除速率常数(k_e)、输注速率(k_in)、清除率(CL)、生物利用度(f)、波动(％PTF)和消除半衰期(t_1/2)。

在某些实施方案中，在口服施用之后，SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ IDNO:64中的任一个的肽或肽复合物展现最优药代动力学参数。在其他实施方案中，在任何施用途径，诸如口服施用、吸入、鼻内施用、局部施用、静脉内施用、皮下施用、关节内施用、肌内施用、腹膜内施用、滑膜内施用，或它们的任何组合之后，SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ IDNO:1–SEQ ID NO:64中的任一个的肽或肽复合物展现最优药代动力学参数。

在一些实施方案中，SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64的任何肽或肽复合物展现在达到C_max时的平均T_max是0.5–12小时或1-48小时；在通过口服途径来将肽施用至受试者之后，在受试者中平均血清生物利用度是0.1％-10％；在口服施用至受试者以递送至GI道之后，平均血清生物利用度是小于0.1％；在胃肠外施用之后，平均血清生物利用度是10-100％；在将肽施用至受试者之后，平均t_1/2是0.1小时–168小时，或0.25小时–48小时；在将肽施用至受试者之后，肽的平均清除率(CL)是0.5-100升/小时或0.5–50升/小时；在将肽全身性施用至受试者之后，在受试者中的平均分布容积(V_d)是200–20,000mL，或任选地，无全身性摄取；它们的任何组合。

肽稳定性

本公开的肽在各种生物或生理条件下可以是稳定的，所述条件诸如在细胞内部、在胞质液中、在细胞核或内体或肿瘤中的生理细胞外pH、内体或溶酶体pH或还原环境。举例来说，SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ IDNO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64的任何肽或肽复合物可展现对还原剂、蛋白酶、氧化条件或酸性条件的抗性。

在一些情况下，生物分子(诸如肽和蛋白质)可提供治疗功能，但此类治疗功能由于由体内环境引起的不稳定性而降低或受阻碍。(Moroz等人Adv Drug Deliv Rev 101:108-21(2016)；Mi tragotr i等人Nat Rev Drug Discov 13(9):655-72(2014)；Bruno等人Ther Deliv(11):1443-67(2013)；Si nha等人Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.24(1):63-92(2007)；Hamman等人BioDrugs 19(3):165-77(2005))。举例来说，G I道可含有可使肽和蛋白质降解的低pH(例如pH约1)区域、还原环境，或蛋白酶富集环境。在身体的其他区域诸如口、眼、肺、鼻腔内、关节、皮肤、阴道、粘膜和血清中的蛋白水解活性也可以是递送功能活性肽和多肽的障碍。另外，肽在血清中的半衰期可部分地由于蛋白酶而是极其短暂的，以致当施用合理给药方案时，肽可被太快降解而不能具有持续治疗作用。同样，细胞区室诸如溶酶体中的蛋白水解活性以及溶酶体和胞质液中的还原活性可降解肽和蛋白质，以致它们不能提供对细胞内靶标的治疗功能。因此，对还原剂、蛋白酶和低pH具有抗性的肽可能够提供增强的治疗作用，或增强共同配制的或缀合、连接或融合的活性剂的体内治疗功效。

制造方法

各种表达载体/宿主系统可用于重组表达本文所述的肽。此类系统的非限制性实例包括微生物，诸如用含有编码本文所述的肽、肽复合物，或肽融合蛋白/嵌合蛋白的核酸序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌，用含有以上提及的核酸序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用含有以上提及的核酸序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统，用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(CaMV)、烟草花叶病毒(TMV))感染，或用含有以上提及的核酸序列的重组质粒表达载体(例如T i质粒)转化的植物细胞系统，或用重组病毒表达载体(例如腺病毒、痘苗病毒、慢病毒)感染的动物细胞系统，包括被工程化来含有以上提及的核酸序列的多个拷贝的细胞系，所述多个拷贝是稳定扩增的(例如CHO/dhfr、CHO/谷氨酰胺合成酶)，或在双微染色体中不稳定扩增(例如鼠细胞系)。二硫键形成和肽的折叠可在表达期间，或在表达之后，或在表达期间以及在表达之后发生。

宿主细胞可适合于表达本文所述的一种或多种肽。宿主细胞可以是原核、真核或昆虫细胞。在一些情况下，宿主细胞能够调节插入序列的表达，或者以所希望的特定方式修饰和加工基因或蛋白质产物。举例来说，从某些启动子的表达可在某些诱导剂(例如用于金属硫蛋白启动子的锌和镉离子)存在下升高。在一些情况下，肽产物的修饰(例如磷酸化)和加工(例如裂解)对于肽的功能可为重要的。宿主细胞可具有用于肽的翻译后加工和修饰的特征和特定机制。在一些情况下，用于表达肽的宿主细胞分泌最小量的蛋白水解酶。

本公开的选择性耗竭复合物可有利地通过单一重组表达系统制备，无需化学合成或修饰。例如，可在CHO细胞、酵母、毕赤酵母、大肠杆菌或其他生物体中表达选择性耗竭复合物。

在基于细胞或病毒的样品的情况下，可在纯化之前处理生物体以保持和/或释放靶标多肽。在一些实施方案中，使用固定剂固定细胞。在一些实施方案中，使细胞溶解。细胞材料可以不破坏显著比例的细胞，但从细胞材料的表面，和/或从细胞之间的空隙移除蛋白质的方式进行处理。举例来说，细胞材料可被浸渍在液体缓冲液中，或在植物材料的情况下，可经受真空，以移除位于细胞间隙中和/或植物细胞壁中的蛋白质。如果细胞材料是微生物，那么可从微生物培养基提取蛋白质。或者，肽可被包装在包涵体中。包涵体可进一步与培养基中的细胞组分分离。在一些实施方案中，细胞未被破坏。由细胞或病毒呈现的细胞肽或病毒肽可用于完整细胞或病毒颗粒的附着和/或纯化。除重组系统之外，肽还可使用蛋白质和肽合成中采用的多种已知技术来在无细胞系统中合成，随后提取。

在一些情况下，宿主细胞产生具有用于运载物分子(例如治疗剂)的连接点的肽。连接点可包括赖氨酸残基、N末端、半胱氨酸残基、半胱氨酸二硫键、谷氨酸或天冬氨酸残基、C末端，或非天然氨基酸。肽还可以合成方式产生，诸如通过固相肽合成，或溶液相肽合成。肽合成可通过芴基甲基氧基羰基(Fmoc)化学或通过丁基氧基羰基(Boc)化学来进行。肽可在合成期间，或在合成之后，或在合成期间以及在合成之后折叠(形成二硫键)。肽片段可以合成方式或以重组方式产生。肽片段可然后以酶法或以合成方式接合在一起。

在其他方面，本公开的肽可通过常规固相化学合成技术，例如根据Fmoc固相肽合成方法(“Fmocsolid phase peptide synthesis,a practical approach,”由W.C.Chan和P.D.White编著,Oxford University Press,2000)来制备。

在一些实施方案中，本公开的肽可在制造期间更稳定。举例来说，本公开的肽可在重组表达和纯化期间更稳定，从而导致由存在于制造过程中的蛋白酶达成的降解率较低，肽的纯度较高，肽的产率较高，或它们的任何组合。在一些实施方案中，肽还可对在制造、储存和销售期间在高温以及低温下的降解更稳定。举例来说，在一些实施方案中，本公开的肽在25℃下可以是稳定的。在其他实施方案中，本公开的肽在70℃或高于70℃下可以是稳定的。在一些实施方案中，本公开的肽在100℃或高于100℃下可以是稳定的。

药物组合物

本公开的药物组合物可以是如本文所述的任何肽与其他化学组分的组合，所述其他化学组分诸如是载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、增稠剂、抗氧化剂、增溶剂、缓冲剂、渗透剂、盐、表面活性剂、氨基酸、囊封剂、增积剂、低温保护剂和/或赋形剂。药物组合物有助于向生物体施用本文所述的肽。在一些情况下，药物组合物包含延长肽的半衰期并且/或者帮助肽穿透靶细胞的因子。在一些实施方案中，药物组合物包含经修饰以表达和分泌本公开的选择性耗竭复合物的细胞。

药物组合物可通过各种形式和途径以药物组合物形式以治疗有效量施用，所述各种形式和途径包括例如静脉内、皮下、肌内、经直肠、气雾剂、胃肠外、经眼、经肺、经皮、经阴道、经眼部、经鼻、口服、舌下、吸入、经真皮、鞘内、肿瘤内、鼻内和局部施用。药物组合物可以局部或全身方式施用，例如通过将本文所述的肽直接注射至器官中，任选地于储库中。

肠胃外注射可配制用于推注注射、输注或连续输注。药物组合物可呈作为于油性或水性媒介物中的无菌混悬剂、溶液或乳液的适于胃肠外注射的形式，并且可含有配制剂，诸如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。用于胃肠外施用的药物制剂包括呈水溶性形式的本文所述的肽的水溶液。本文所述的肽-抗体复合物的混悬剂可制备成油性注射混悬剂。适合亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油诸如芝麻油，或合成脂肪酸酯诸如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水性注射混悬剂可含有增加混悬剂的粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋糖酐。混悬剂还可含有适合稳定剂或增加本文所述的此类肽-抗体复合物的溶解性并且/或者降低所述复合物的聚集以允许制备高度浓缩溶液的剂。

或者，本文所述的肽可被冻干，或呈用于在使用之前用适合媒介物例如无菌无热原水复原的粉末形式。在一些实施方案中，纯化肽以静脉内方式施用。本文所述的肽可被施用至受试者以归巢至、靶向、迁移至，或定向至CNS细胞、脑细胞、癌细胞，或肿瘤。在一些实施方案中，肽可缀合至、连接至或融合至提供对中枢神经系统中或穿过血脑屏障的特定靶细胞类型的靶向功能的另一肽。示例性靶细胞包括CNS细胞、红细胞、红细胞前体细胞、免疫细胞、干细胞、肌肉细胞、脑细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾上腺细胞、骨髓细胞、阑尾细胞、淋巴结细胞、扁桃体细胞、脾细胞、肌肉细胞、肝细胞、胆囊细胞、胰腺细胞、胃肠道细胞、腺细胞、肾细胞、膀胱细胞、内皮细胞、上皮细胞、脉络丛上皮细胞、神经元、神经胶质细胞、星形细胞，或与神经系统相关的细胞。

本公开的肽可在手术程序期间直接施加至器官，或器官组织或细胞，诸如脑或脑组织或细胞。本文所述的重组肽可局部施用，并且可配制成多种可局部施用的组合物，诸如溶液、混悬剂、洗剂、凝胶剂、糊剂、含药棒、香膏剂、乳膏剂和软膏剂。这样的药物组合物可含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。

在实施本文提供的治疗或使用方法时，治疗有效量的本文所述的肽可以药物组合物形式施用至罹患影响免疫系统的疾患的受试者。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，诸如人或灵长类动物。治疗有效量可以根据疾病的严重程度、受试者的年龄和相对健康状况、所用化合物的效力以及其他因素而广泛地变化。

在一些实施方案中，肽被克隆至病毒或非病毒表达载体中。此表达载体可被包装在以基因疗法形式施用至患者的病毒颗粒、病毒颗粒，或非病毒载体或递送机构中。在其他实施方案中，提取并修饰患者细胞以表达能够离体结合TfR的肽，随后使经修饰细胞以基于细胞的疗法形式返回至患者中，以致一旦移植回患者中，经修饰细胞就将表达所述肽。

可使用一种或多种生理学上可接受的载体(包含赋形剂和助剂)来配制药物组合物，这些赋形剂和助剂有助于将活性化合物加工成可药用的制剂。视所选施用途径而定，配方可进行修改。包含本文所述的肽的药物组合物可例如通过以下方式来制造：在重组系统中表达所述肽，纯化所述肽，将所述肽冻干，混合、溶解、粒化、糖衣片制备、磨细、乳化、囊封、包封或压制工艺。药物组合物可包括至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂以及呈游离碱或药学上可接受的盐形式的本文所述的化合物。

用于制备包含本文所述的化合物的本文所述的肽的方法包括将本文所述的肽与一种或多种惰性药学上可接受的赋形剂或载体一起配制以形成固体、半固体或液体组合物。固体组合物包括例如粉剂、片剂、可分散颗粒剂、胶囊、扁囊剂和栓剂。这些组合物还可以含有少量无毒的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂和其他药学上可接受的添加剂。

药学上可接受的赋形剂的非限制性实例可例如见于以下中：Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,第19版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；Liberman,H.A.和Lachman,L.编,Pharmaceutical DosageForms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980；以及Pharmaceutical Dosage Forms andDrug Delivery Systems,第7版(Lippincott Williams&Wilkins1999)，所述文献中的每一者以引用的方式整体并入。

药物组合物还可包括渗透或吸收增强剂(Aungst等人AAPSJ.14(1):10-8.(2012)以及Moroz等人Adv Drug Deliv Rev 101:108-21.(2016))。渗透增强剂可有助于分子从GI道摄取至体循环中。渗透增强剂可包括中链脂肪酸的盐、癸酸钠、辛酸钠、N-(8-[2-羟基苯甲酰基]氨基)辛酸(SNAC)、N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸(5-CNAC)、亲水性芳族醇诸如苯氧基乙醇、苯甲醇和苯基醇，壳聚糖、烷基糖苷、2-N,N-二甲基氨基丙酸十二酯(DDAIPP)、二价阳离子的螯合剂，包括EDTA、EGTA和柠檬酸，烷基硫酸钠、水杨酸钠、基于卵磷脂的剂或胆汁盐衍生剂诸如脱氧胆酸盐。

组合物还可包括蛋白酶抑制剂，包括大豆胰蛋白酶抑制剂、抑肽酶、甘胆酸钠、甲磺酸卡莫司他(camostat mesilate)、杆菌肽或环十五内酯。

肽在治疗中的用途

在一些实施方案中，使用本公开的选择性耗竭复合物治疗受试者的方法包括向有需要的受试者施用有效量的如本文所述的肽。

在一些实施方案中，使用本公开的选择性耗竭复合物治疗受试者的方法包括修饰受试者的细胞以表达和分泌本公开的选择性耗竭复合物。在一些实施方案中，细胞是受试者中的细胞。在一些实施方案中，细胞是从受试者中取出并在修饰后重新引入的细胞。在一些实施方案中，使用病毒载体(例如，溶瘤单纯疱疹病毒)修饰细胞。在一些实施方案中，编码选择性耗竭复合物的表达和分泌的基因被工程化到CAR-T细胞或其他细胞疗法中。

TfR可在各种组织诸如脑、胃、肝或胆囊中表达。因此，本公开的肽(例如，包含TfR结合肽的选择性耗竭复合物)可用于诊断和治疗与各种组织和器官相关的疾病和疾患中。举例来说，药物向这些组织和器官的递送可通过使用携带诊断和/或治疗有效载荷的本文所述的肽和肽复合物来改善。

如本文所用的术语“有效量”是指所施用的剂或化合物的将在一定程度上减轻所治疗疾病或疾患的症状中的一者或多者的足够量。结果可以是疾病的征象、症状或原因的减轻和/或缓和，或生物系统的任何其他所需改变。含有此类剂或化合物的组合物可被施用以达成防治性、增强性和/或治疗性治疗。在任何单个情况下的适当“有效”量都可使用诸如剂量逐步升高研究的技术来确定。

本公开的方法、组合物和药盒可包括用以预防、治疗、遏止、逆转或改善疾患的症状的方法。治疗可包括用本公开的肽治疗受试者(例如受疾病或疾患折磨的个体、家养动物、野生动物，或实验室动物)。疾病可以是癌症或肿瘤。在治疗疾病时，肽可接触肿瘤或癌细胞。受试者可以是人。受试者可以是人；非人灵长类动物，诸如黑猩猩、以及其他猿和猴物种；农场动物，诸如牛、马、绵羊、山羊、猪；家养动物，诸如兔、犬和猫；实验室动物，包括啮齿动物，诸如大鼠、小鼠和豚鼠，等。受试者可处于任何年龄。受试者可以是例如年长成人、成人、青少年、青春期前的少年、儿童、学步儿(todd l er)、婴儿和在子宫内的胎儿。

治疗可在疾病的临床发作之前向受试者提供。治疗可在疾病的临床发作之后向受试者提供。治疗可在疾病的临床发作之后1天、1周、6个月、12个月或2年或更久后向受试者提供。治疗可在疾病的临床发作之后向受试者提供，持续超过1天、1周、1个月、6个月、12个月、2年或更久。治疗可在疾病的临床发作之后向受试者提供，持续小于1天、1周、1个月、6个月、12个月、2年。治疗还可包括在临床试验中治疗人。治疗可包括向受试者施用药物组合物，诸如遍及本公开所述的药物组合物中的一者或多者。治疗可包括每日一次给药。治疗可包括以静脉内、皮下、肌内、通过吸入、经真皮、局部、通过关节内注射、口服、舌下、鞘内、经皮、鼻内、通过腹膜途径、直接向肿瘤中例如直接注射至肿瘤中、直接向脑中例如通过脑室内途径，或直接向关节上例如通过局部、关节内注射途径的方式将本公开的肽递送至受试者。治疗可包括以静脉内、皮下、肌内、通过吸入、通过关节内注射、经真皮、局部、口服、鞘内、经皮、鼻内、胃肠外、口服、通过腹膜途径、经鼻、舌下，或直接向癌性组织上的方式将肽-活性剂复合物施用至受试者。

肽药盒

在一个方面，本文所述的肽可以药盒形式提供。在另一盒实施方案中，本文所述的肽复合物可以药盒形式提供。在另一实施方案中，药盒包括编码本文所述的肽的氨基酸、载体、宿主生物体和说明手册。在一些实施方案中，药盒包括关于肽的使用或施用的书面说明。

根据以下详细描述，本公开的额外方面和优势将变得为本领域技术人员显而易知，在以下详细描述中，显示和描述了本公开的说明性实施方案。如将认识到，本公开能够具有其他和不同实施方案，并且它的若干细节能够在各个方面进行修改，所有这些都不脱离本公开。因此，附图和描述在性质上应被视为具有说明性而非限制性。

实施例

以下实例被包括在内从而进一步描述本披露的一些方面，并且其不应被用来限制本发明的范围。

实施例1

肽的制造

此实施例描述本文所述的肽和肽复合物(例如，SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个)的制造。使用公开方法来在哺乳动物细胞培养中产生源于蛋白质的肽。(A.D.Bandaranayke,C.Correnti,B.Y.Ryu,M.Brault,R.K.Strong,D.Rawlings.2011.Daedalus:a robust,turnkey platform for rapid production ofdecigram quantities ofactive recombinant proteins in human cell lines usingnovel lentiviral vectors.Nucleic Acids Research.(39)21,e143)。

将肽序列逆翻译成DNA，合成，并且使用标准分子生物学技术(M.R.Green,JosephSambrook.Molecular Cloning.2012ColdSpring Harbor Press)与噬铁蛋白同框克隆。将所得复合物包装至慢病毒中，转导至HEK-293细胞中，扩增，通过固定化金属亲和色谱法(IMAC)来分离，用烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶裂解，并且通过反相色谱法来纯化以获得同质性。在纯化之后，将每种肽冻干，并且冷冻储存。

实施例2

使用哺乳动物表达系统进行的肽表达

此实施例描述使用哺乳动物表达系统来表达肽和肽复合物。根据Bandaranayake等人,Nucleic Acids Res.2011年11月；39(21):e143中所述的方法来表达肽。使用烟草蚀刻病毒蛋白酶来从噬铁蛋白裂解肽(例如SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222，或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个)，并且通过以乙腈和0.1％TFA水溶液的梯度进行反相HPLC(RP-HPLC)来纯化，然后等分和冻干以供稍后使用。通过质谱测定法来验证分子量。

为了优化和验证筛选方法并鉴定TfR结合肽，将转铁蛋白受体(TfR)胞外域(“可溶性TfR”，SEQ ID NO:188，MRLAVGALLVCAVLGLCLADYKDEHHHHHHGLNDIFEAQKIEWHEGGGSKTVRWCAVSEHEATKCQSFRDHMKSVIPSDGPSVACVKKASYLDCIRAIAANEADAVTLDAGLVYDAYLAPNNLKPVVAEFYGSKEDPQTFYYAVAVVKKDSGFQMNQLRGKKSCHTGLGRSAGWNIPIGLLYCDLPEPRKPLEKAVANFFSGSCAPCADGTDFPQLCQLCPGCGCSTLNQYFGYSGAFKCLKDGAGDVAFVKHSTIFENLANKADRDQYELLCLDNTRKPVDEYKDCHLAQVPSHTVVARSMGGKEDLIWELLNQAQEHFGKDKSKEFQLFSSPHGKDLLFKDSAHGFLKVPPRMDAKMYLGYEYVTAIRNLREGTCPEAPTDECKPVKWCALSHHERLKCDEWSVNSVGKIECVSAETTEDCIAKIMNGEADAMSLDGGFVYIAGKCGLVPVLAENYDKSDNCEDTPEAGYFAVAVVKKSASDLTWDNLKGKKSCHTAVGRTAGWNIPMGLLYNKINHCRFDEFFSEGCAPGSKKDSSLCKLCMGSGLNLCEPNNKEGYYGYTGAFRCLVEKGDVAFVKHQTVPQNTGGKNPDPWAKNLNEKDYELLCLDGTRKPVEEYANCHLARAPNHAVVTRKDKEACVHKILRQQQHLFGSDVTDCSGNFCLFRSETKDLLFRDDTVCLAKLHDRNTYEKYLGEEYVKAVGNLRKCSTSSLLEACTFRRP)克隆到Daedalus可溶性蛋白产生慢病毒载体中，并从生长培养基中纯化蛋白质(可溶性TfR的凝胶显示于图1A中)。相同策略用于产生和纯化人去铁转铁蛋白(残基23-698，SEQ ID NO:189，KTVRWCAVSEHEATKCQSFRDHMKSVIPSDGPSVACVKKASYLDCIRAIAANEADAVTLDAGLVYDAYLAPNNLKPVVAEFYGSKEDPQTFYYAVAVVKKDSGFQMNQLRGKKSCHTGLGRSAGWNIPIGLLYCDLPEPRKPLEKAVANFFSGSCAPCADGTDFPQLCQLCPGCGCSTLNQYFGYSGAFKCLKDGAGDVAFVKHSTIFENLANKADRDQYELLCLDNTRKPVDEYKDCHLAQVPSHTVVARSMGGKEDLIWELLNQAQEHFGKDKSKEFQLFSSPHGKDLLFKDSAHGFLKVPPRMDAKMYLGYEYVTAIRNLREGTCPEAPTDECKPVKWCALSHHERLKCDEWSVNSVGKIECVSAETTEDCIAKIMNGEADAMSLDGGFVYIAGKCGLVPVLAENYNKSDNCEDTPEAGYFAIAVVKKSASDLTWDNLKGKKSCHTAVGRTAGWNIPMGLLYNKINHCRFDEFFSEGCAPGSKKDSSLCKLCMGSGLNLCEPNNKEGYYGYTGAFRCLVEKGDVAFVKHQTVPQNTGGKNPDPWAKNLNEKDYELLCLDGTRKPVEEYANCHLARAPNHAVVTRKDKEACVHKILRQQQHLFGSNVTDCSGNFCLFRSETKDLLFRDDTVCLAKLHDRNTYEKYLGEEYVKAVGNLRKCSTSSLLEACTFRRP)，并且对一些物质进行铁负载以产生全铁转铁蛋白。通过表面等离子体共振(图9A)来测试去铁转铁蛋白与全铁转铁蛋白两者与可溶性TfR胞外域的结合，其中仅全铁转铁蛋白显示与固定化TfR的任何相互作用。

作为在筛选中使用的可溶性TfR代表人内源性蛋白质结构的进一步验证，测试了与马丘波病毒(Machupo virus)糖蛋白(被称为MaCV)的相互作用，所述糖蛋白使用TfR来确定嗜性以及介导细胞进入。为此，将MaCV克隆至哺乳动物表面展示载体SDGF(图9B)中，并且用SDGF-MaCV或对照蛋白质(SDGF-弹性蛋白酶抑制因子，即已知结合一些天然CDP的弹性蛋白酶抑制剂)转染悬浮293Freestyle(293F)细胞。将经转染细胞用各自200nM的生物素化TfR(细胞结合测定中使用的所有TfR都是生物素化的)和经Alexa Fluor 647标记链霉亲和素染色，然后通过流式细胞术来分析(图9C)。TfR成功染色了用MaCV转染的细胞，而SDGF-弹性蛋白酶抑制因子细胞并非如此。同时，与200nM荧光弹性蛋白酶一起孵育的SDGF-MaCV细胞未被染色。这验证了用于筛选的可溶性TfR包含内源性蛋白质结构，并且证明了TfR与其内源性配体结合的特异性以及SDGF作为鉴定新颖TfR结合配偶体的手段的效用。

实施例3

TfR结合肽的哺乳动物表面展示

此实施例描述本公开的TfR结合肽的哺乳动物表面展示，所述TfR结合肽包括SEQID NO:1(SEQ ID NO:1是添加了N末端GS的SEQ ID NO:65)、SEQ ID NO:2(SEQ ID NO:2是添加了N末端GS的SEQ ID NO:66)、SEQ ID NO:30(SEQ ID NO:30是添加了N末端GS的SEQ IDNO:94)和SEQ ID NO:32(SEQ ID NO:32是添加了N末端GS的SEQ ID NO:96)。对TfR结合肽的筛选通过以下方式来进行：转染或转导哺乳动物细胞以展示候选肽(图9B)，随后针对可溶性人转铁蛋白受体胞外域(200nM，图9C，图1B–图1G)进行筛选。哺乳动物细胞在折叠二硫键交联的蛋白质方面具有改善的保真度，从而使得它们成为适于展示本公开的肽的细胞类型。

如下进行哺乳动物细胞表面展示筛选。筛选策略使用表面展示GFP FasL(SDGF)载体。在载体中，FasL-TM是FasL蛋白的跨膜结构域。更具体来说，将设计的肽以汇合物形式克隆至SDGF中，然后将所述SDGF制备成慢病毒。将293F细胞用这个文库在约1的感染复数下转导，并且在生长三天之后，使经转导细胞的汇合物与经Alexa647标记TfR一起孵育。对于这些实验，通过用荧光链霉亲和素或荧光抗His抗体共染色TfR来实现荧光标记。可溶性TfR含有His标签与生物素标记两者。Alexa Fluor 647或iFluor 647用于抗体/链霉亲和素荧光。分选一定百分比的来自GFP和TfR双重阳性细胞的最高染色TfR阳性细胞，并且进行扩增。在每次扩增时，收集一部分细胞，并且在最后，通过测序来鉴定富集肽。流式细胞术用于评估用以鉴定通过SDGF肽构建体来在它们的表面上表达蛋白质的GFP+293F细胞的门控准则。门控在使用FSC-H相对于SSC-H来排除碎片；使用FSC-H相对于FSC-A来排除双粘体；使用FSC-H相对于太平洋蓝H(PacificBlueH)来排除DAPI+死细胞；以及使用任选的FITC-H直方图来鉴定GFP+细胞的情况下进行。一旦照此门控，AlexaFluor 647(用于检测靶标结合的共染色剂)即用于分选和分析。

使用磁性分选和流动分选的组合来进行筛选。如下进行磁性分选：将2x10⁸个293F细胞用SDGFCDP文库在约1的MOI下转导，并且扩增直至转导后3天。对于初始筛选，进行磁性细胞分选。将1x10⁹个经转导细胞再悬浮于含有200nM生物素化TfR、2mL抗生物素微珠粒(UltraPure，Miltenyi 130-105-637)和21mL流动缓冲液(PBS+2mMEDTA和0.5％牛血清白蛋白)的结合缓冲液中，最终体积是25mL。在冰上在搅拌下(每2-5分钟温和倒置)孵育细胞30分钟，并且然后用流动缓冲液稀释10倍以达到250mL，沉淀(500xg，5分钟)，并且用高BSA流动缓冲液(含有2mM EDTA和3％BSA的PBS)再悬浮至40mL。将细胞分装成四个10mL等分试样，并且通过Miltenyi Pro分离器，在每次分选之后使用“posseld”方案和“快速冲洗”来操作。运行和洗涤缓冲液分别是高BSA流动缓冲液和PBS+2mM EDTA。将洗脱的细胞汇合，沉淀，并且PCR扩增(Terra^TMPCR直接聚合酶混合物(Takara 639271)，持续16个循环，随后Phusion)它们的CDP序列。如上将这个子文库克隆至SDGF中，制备成慢病毒，并且转导至一批新的293F细胞(1x10⁷个细胞，MOI约1)中以进行流动分选。

如下进行流动分选：使用2.4x10⁷个在3mL流动缓冲液中染色的细胞进行流动分选，所述流动缓冲液具有200nM TfR、200nM链霉亲和素Alexa Fluor 647缀合物(ThermoFisher S21374)和1μg mL^-1DAPI。将细胞用流动缓冲液稀释4倍以达到12mL，沉淀(500xg，5分钟)，并且再悬浮于3.6mL流动缓冲液中。在FACSAria II系统(BD)上分选细胞，基于FSC-A(中)、SSC-A(中)、DAPI-A(阴性)、GFP-A(阳性)和APC-A(GFP+的前7％)通道来门控。在每次流动分选之后，在FreeStyle培养基中培养细胞，在悬浮24孔板中以0.5-1mL起始，在300rpm下振荡，在以125RPM振荡的125mL挡板烧瓶中扩大至30mL的最终体积。此时，如上对细胞进行再分选。在第三次流动分选之后，使细胞扩增，并且以1.5x10⁶个细胞的沉淀物冷冻。如上对沉淀物进行PCR扩增(Terra直接PCR，随后InFusion)，将CDP插入物亚克隆至SDGF中，转化(Stellar感受态细胞)，并且挑选菌落以进行所克隆CDP的小型制备和测序。富集变体是在序列分析中在约100个挑选菌落中出现超过一次的那些。所有位点饱和诱变(SSM)亲和力成熟筛选都如上进行，具有以下变化。1)染色是依序的；首先用TfR，然后用等摩尔量的经染料标记链霉亲和素。2)将TfR/链霉亲和素浓度降低至对于第一SSM成熟来说的20nM以及对于第二SSM成熟筛选来说的8nM。在每次SSM筛选之后，研究富集变体以组装相比于含有单个突变中的1者或2者的任何变体，显示更高TfR染色的复合突变体(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:32的肽)。

图1B–图1G中的流式细胞术图说明从汇合的高度多样性的文库中对与TfR结合的细胞的连续富集。图1A示出转铁蛋白受体(TfR)蛋白质的考马斯染色凝胶，其显示TfR的成功纯化。图1B说明在一次流动分选后展示候选TfR结合肽的细胞的流式细胞术图。根据结合至用荧光链霉亲和素标记的TfR的能力对细胞进行分选。右上区域中的数据点代表通过荧光TfR-链霉亲和素的荧光定量的结合TfR的表达候选肽(通过GFP荧光定量)的细胞。图1C说明在一次流动分选后展示候选TfR结合肽的细胞的阴性对照流式细胞术图。根据与用荧光链霉亲和素标记的对照蛋白结合的能力对细胞进行分选。右上区域中的数据点代表通过荧光对照蛋白-链霉亲和素的荧光定量的结合至阴性对照蛋白的表达候选肽(通过GFP荧光定量)的细胞。图1D说明在图1B中所示的第一细胞分选后，在第二流动分选后展示候选TfR结合肽的细胞的流式细胞术图。根据结合至用荧光链霉亲和素标记的TfR的能力对细胞进行分选。右上区域中的数据点代表通过荧光TfR-链霉亲和素的荧光定量的结合TfR的表达候选肽(通过GFP荧光定量)的细胞。图1E说明在图1C中所示的第一细胞分选后，在第二流动分选后展示候选TfR结合肽的细胞的阴性对照流式细胞术图。根据与用荧光链霉亲和素标记的对照蛋白结合的能力对细胞进行分选。右上区域中的数据点代表通过荧光对照蛋白-链霉亲和素的荧光定量的结合至阴性对照蛋白的表达候选肽(通过GFP荧光定量)的细胞。图1F说明在图1D中所示的第二细胞分选后，在第三流动分选后展示候选TfR结合肽的细胞的流式细胞术图。根据结合至用荧光链霉亲和素标记的TfR的能力对细胞进行分选。右上区域中的数据点代表通过荧光TfR-链霉亲和素的荧光定量的结合TfR的表达候选肽(通过GFP荧光定量)的细胞。方框指示表达结合至TfR的肽的细胞。图1G示出在图1E中所示的第二细胞分选后，在第三流动分选后展示候选TfR结合肽的细胞的阴性对照流式细胞术图。根据与用荧光链霉亲和素标记的对照蛋白结合的能力对细胞进行分选。右上区域中的数据点代表通过荧光对照蛋白质-链霉亲和素的荧光定量的结合至阴性对照蛋白质的表达候选肽(通过GFP荧光定量)的细胞。方框指示表达结合至阴性对照蛋白质的肽的细胞。

每次流动分选代表使细胞文库生长至>3000万个细胞，针对TfR结合进行染色，以及流动分选顶尖结合剂。使分选的结合剂生长，随后进行下次流动分选。

实施例4

TfR结合肽的鉴定

此实施例描述使用如实施例3中所述的哺乳动物表面展示系统来鉴定TfR结合肽。

使用实施例3的哺乳动物表面展示系统，鉴定了具有SEQ ID NO:1(SEQ ID NO:1是添加了N末端GS的SEQ ID NO:65)的序列的单一克隆肽。扩增并诱变编码10,000种CDP的寡核苷酸的文库。CDP在长度方面是17-50个氨基酸，具有4、6、8或10个半胱氨酸。尽管文库朝向经注释打结素或防御素有一定偏重，但文库含有来自生命的每个域/界的CDP。将这个文库克隆至SDGF中，制备成慢病毒，并且转导至悬浮293F细胞中。历经一轮磁性细胞分选和三轮流动分选的过程，使经转导细胞经受用TfR(200nM)和共染色剂的染色，每轮对被TfR染色的细胞进行富集。使用200nM被生物素化或连接至His标签的可溶性AF647-TfR验证在表面展示测定中特异性结合TfR的结合。使用用于达成四价靶标亲合力的一步染色方案进行染色。通过对最终富集细胞群体的DNA测序，鉴定了单一TfR结合CDP，指定为SEQ ID NO:1。它代表来自海洋领鞭毛虫Monosiga brevicolis的细胞色素BC1复合物亚单位6(Uniprot标识符：A9V0D7，DOI：10.1093/nar/gku989)的随机突变变体，在长度方面是49个氨基酸(六个半胱氨酸)，并且具有5.6kDa的预测分子质量。然后使SEQ ID NO:65经受使用位点饱和诱变(SSM)进行的亲和力成熟，其中创建含有每个可能的非半胱氨酸单一氨基酸取代的文库(43个非Cys氨基酸x18种可能的非Cys取代＝775种变体，包括SEQ ID NO:1)。

图2A–图2D中的流式细胞术图说明展示单克隆TfR结合肽并针对与TfR或阴性对照蛋白的结合进行筛选的细胞的流式细胞术。对单一TfR结合肽进行流式细胞术以验证所鉴定的TfR结合肽特异性地结合TfR并且不结合至链霉亲和素标记。这个实验中使用的对照蛋白质具有以SEQ ID NO:186(MRLAVGALLVCAVLGLCLADYKDEHHHHHHGLNDIFEAQKIEWHEGGGSKTVRWCAVSEHEATKCQSFRDHMKSVIPSDGPSVACVKKASYLDCIRAIAANEADAVTLDAGLVYDAYLAPNNLKPVVAEFYGSKEDPQTFYYAVAVVKKDSGFQMNQLRGKKSCHTGLGRSAGWNIPIGLLYCDLPEPRKPLEKAVANFFSGSCAPCADGTDFPQLCQLCPGCGCSTLNQYFGYSGAFKCLKDGAGDVAFVKHSTIFENLANKADRDQYELLCLDNTRKPVDEYKDCHLAQVPSHTVVARSMGGKEDLIWELLNQAQEHFGKDKSKEFQLFSSPHGKDLLFKDSAHGFLKVPPRMDAKMYLGYEYVTAIRNLREGTCPEAPTDECKPVKWCALSHHERLKCDEWSVNSVGKIECVSAETTEDCIAKIMNGEADAMSLDGGFVYIAGKCGLVPVLAENYDKSDNCEDTPEAGYFAVAVVKKSASDLTWDNLKGKKSCHTAVGRTAGWNIPMGLLYNKINHCRFDEFFSEGCAPGSKKDSSLCKLCMGSGLNLCEPNNKEGYYGYTGAFRCLVEKGDVAFVKHQTVPQNTGGKNPDPWAKNLNEKDYELLCLDGTRKPVEEYANCHLARAPNHAVVTRKDKEACVHKILRQQQHLFGSDVTDCSGNFCLFRSETKDLLFRDDTVCLAKLHDRNTYEKYLGEEYVKAVGNLRKCSTSSLLEACTFRRPGSSELYENKPRRPYIL)阐述的氨基酸序列。图2A示出针对与标记的阴性对照蛋白质(y轴，用荧光抗His抗体染色)的结合进行筛选的表达SEQ ID NO:1的TfR结合肽(x轴，GFP)的细胞的阴性对照流式细胞术图。图2B说明表达SEQ ID NO:1的肽(x轴，GFP)的细胞和TfR(y轴，用荧光抗His抗体染色)的流式细胞术图。图2C示出针对与标记的阴性对照蛋白质(y轴，用荧光链霉亲和素染色)的结合进行筛选的表达SEQ ID NO:1的TfR结合肽(x轴，GFP)的细胞的阴性对照流式细胞术图。图2D示出针对与TfR(y轴，用荧光链霉亲和素染色)的结合进行筛选的表达SEQ IDNO:1的TfR结合肽(x轴，GFP)的细胞的流式细胞术图。

在表达所鉴定克隆的细胞的情况下观察到TfR染色，在对照蛋白质的情况下未见染色。当荧光链霉亲和素或抗H i s抗体是共染色剂时观察到这个染色，从而证明结合的性质仅依赖于TfR，而非共染色剂。双重阳性细胞(右上方象限)指示结合至TfR的表达肽的细胞。

替代性方法也用于鉴定和优化(“成熟”)是使用哺乳动物展示筛选获得的第二代和第三代结合剂的TfR结合肽。使用较低浓度的靶标和共染色剂(20nM)以及单独染色步骤，用经修改染色方案筛选这个文库，通过消除由链霉亲和素给予的四价亲合力，所述单独染色步骤进一步增加严格性。直至四轮流动分选和富集用于鉴定具有改善的TfR结合特征的变体。富集变体的排列鉴定了最优突变体(SEQ ID NO:2(SEQ ID NO:2是添加了N末端GS的SEQ ID NO:66))，并且再次重复这个过程(8nM TfR和共染色剂；在其他方面是相同的方案)而产生SEQ ID NO:32(SEQ ID NO:32是添加了N末端GS的SEQ ID NO:96)。此二次成熟变体包含来自原始文库成员的14个点突变(GSREGCASHCTKYKAELEKCEARVSSRSNTEETCVQELFDFLHCVDHCVSQ,SEQ IDNO:191)。在SEQ ID NO:1中发现来自亲本序列的四个点突变，而SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:32分别含有来自前一代的6个和4个突变。

以可溶性肽形式产生SEQ ID NO:1和它的变体(例如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:32)，并且通过反相HPLC(RP-HPLC)、SDS-PAGE和质谱测定法来验证。基于它们的约5-6kDa的质量，它们在SDS-PAGE中慢于预期的迁移性是对一些CDP具有的引起关注的电泳迁移性特征的证明。在SDS-PAGE与RP-HPLC两者中，在DTT还原(10mM)后，所有变体都显示显著不同的迁移性，从而确认二硫键稳定化作用。通过表面等离子体共振验证了它们与TfR的结合(图4)，从而还确认成熟变体的亲和力增加(SEQ ID NO:32[K_D＝216±1pM]>SEQ ID NO:2[K_D＝8.7±0.4nM]>SEQ ID NO:1[K_D未测定，但可用数据与K_D>10μM一致])。所有变体都显示对细胞还原性条件(10mM谷胱甘肽)的完全或部分抗性，而亲和力成熟变体显示对胃蛋白酶的部分抗性(但所有变体都易受胰蛋白酶蛋白水解)。相对于DTT还原的蛋白质的热耐受性，SEQID NO:32蛋白的完整非还原肽显示实质上改善的热耐受性，在圆二色谱特征方面不具有大量变化直至远高于常见环境温度(>50℃)，并且直至95℃未能观察到完全展开。

实施例5

肽的位点饱和诱变

此实施例说明本公开的肽的位点饱和诱变(SSM)以鉴定有益或有害突变。对SEQID NO:1(SEQ ID NO:1是添加了N末端GS的SEQ ID NO:65，结果在图3A中)的肽和SEQ IDNO:2(SEQ ID NO:2是添加了N末端GS的SEQ ID NO:66，结果在图3B中)的肽进行位点饱和诱变。

图3A和图3B显示在肽成熟期间鉴定的TfR结合肽变体的TfR结合能力。SSM用于如在第一哺乳动物表面展示实验(参见例如图1B–图1G和图2A–图2D)中鉴定的具有SEQ IDNO:1的序列的肽的亲和力成熟。在每轮成熟期间，构建每个可能的非半胱氨酸点变体的文库，并且在高于第一筛选的严格性下针对TfR进行筛选。富集具有改善的结合的变体，并且通过桑格尔测序来鉴定。将此类富集变异突变以各种排列(显示于数据中)彼此组合以鉴定复合改善结合剂。完成了两轮SSM，从而分别产生包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:32的成熟肽(SEQ ID NO:32是添加了N末端GS的SEQ ID NO:96)。第一轮SSM中的TfR浓度是20nM，并且使用一步染色进行SSM。第二轮SSM中的TfR浓度是8nM，并且使用两步染色进行SSM。

如实施例3和实施例4中所述进行表达SSM文库的肽的哺乳动物细胞的TfR结合，但采用更高严格性方案。更高严格性方案包括更低TfR浓度(例如20nM)。

图3A说明以SEQ ID NO:1(SEQ ID NO:1是添加了N末端GS的SEQ ID NO:65)进行第一位点饱和诱变筛选的结果，其中一些变体展现改善的与TfR的结合活性，诸如具有SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8(SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8分别是添加了N末端GS的SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69和SEQ IDNO:72)的序列的肽。图3B显示在第二变异突变期间鉴定的变体的TfR结合。

x轴显示所有变体的SEQ ID NO，并且y轴显示从流式细胞术实验外推的以相对荧光单位(RFU)表示的结合的TfR的量。

实施例6

SSM产生的TfR结合肽变体的TfR结合

此实施例显示位点饱和诱变(SSM)产生的TfR结合肽变体的TfR结合，所述变体如在如实施例5中所述的SSM期间所鉴定

体内BBB穿透实验揭示肽的TfR结合能力未必与促进囊泡胞吞转运的能力相对应。

以SEQ ID NO:32为参考，对应于残基C6、C10、C20、C34、C44和C48(以SEQ ID NO:96为参考，C4、C8、C18、C32、C42和C46)的六个半胱氨酸参与二硫键，因此促进肽稳定性。

以SEQ ID NO:32为参考，存在于TfR结合肽的全部三代中的对应于残基G5、A7、S8、N14、L17、E18、E21、L38、L42、L45、D46、H47、S50、Q51(以SEQ ID NO:96为参考，G3、A5、S6、N12、L15、E16、E19、L36、L40、L43、D44、H45、S48、Q49)的表面界面残基可能促进TfR结合。在一些实施方案中，本公开的肽或肽复合物在SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ IDNO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ IDNO:64中包含这些相应残基中的至少一者或多者。因此，此类肽可被工程化来具有增强的与TfR的结合。

亲水性表面远端残基诸如D、E、H、K、R、N、Q、S或T可能促进肽溶解性，以SEQ ID NO:32为参考，对应于以下氨基酸残基R3、E4、R9、K12、D14、E15、K19、R23、S26、S28、N29、T30、E31、E32、D33、E35、Q36、E37、E39和D40(以SEQ ID NO:96为参考，R1、E3、R7、K10、D12、E13、K17、R21、S24、S26、N27、T28、E29、E30、D31、E33、Q34、E35、E37和D38)。在一些实施方案中，本公开的肽或肽复合物在SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中包含这些相应残基中的至少一者或多者。因此，此类肽可被工程化来具有增强的溶解性。

较高结合亲和力与存在亲水性残基诸如D、E、H、K、R、N、Q、S或T相关联，如通过由在以SEQ ID NO:32为参考，对应于D15、E35、E39和H49(以SEQ ID NO:96为参考，D13、E33、E37和H47)的残基处的从非极性或疏水性残基诸如A、M、I、L、V、F、W或Y的突变所致的改善的结合所显示。在一些实施方案中，本公开的肽或肽复合物在SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中包含这些相应残基中的至少一者或多者。因此，此类肽可被工程化来具有改进的结合亲和力。

对TfR的较高结合亲和力与非极性或疏水性残基诸如A、M、I、L、V、F、W或Y相关联，如通过由在以SEQ ID NO:32为参考，对应于M11、M25和M27(以SEQ ID NO:96为参考，M9、M23和M25)的氨基酸残基处的从亲水性残基诸如D、E、H、K、R、N、Q、S或T的突变所致的改善的结合所显示。在一些实施方案中，本公开的肽或肽复合物在SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQID NO:95、SEQ IDNO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ IDNO:1–SEQ ID NO:64中包含这些相应残基中的至少一者或多者。因此，此类肽可被工程化来具有改进的结合亲和力。

较高TfR结合亲和力与脂族残基诸如A、M、I、L或V相关联，如通过由在以SEQ IDNO:32为参考，对应于L45(以SEQ ID NO:96为参考，L43)的氨基酸残基处的从大型芳族残基诸如F、W或Y的突变所致的改善的结合所显示。将本公开的肽中的任何一个或多个F、W或Y取代成包括A、M、I、L或V的脂族残基可用于增强所述肽对TfR的结合亲和力。

本公开的任何肽或肽复合物(例如SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222，或SEQ ID NO:1–SEQ IDNO:64中的任一者)都可在本文所述的相应残基中的一者或多者处进行修饰，以产生具有改善的性质的肽变体，所述改善的性质包括增强的稳定性和增加的(或降低的)结合性质或改进的TfR结合亲和力和增加的(或降低的)胞吞转运性质，包括改性的k_a(缔合)和k_d(解离)速率常数。

某些TfR结合肽的序列比对显示于表9中。涉及于与TfR的相互作用中的某些残基以粗体显示。表面相互作用残基包括但不限于指示的那些。

表9–TfR结合肽中的相应残基

实施例7

肽结合相互作用的表面等离子体共振(SPR)分析

此实施例说明对肽与TfR的结合相互作用的表面等离子体共振(SPR)分析。

分析了本公开的各种肽对TfR的结合亲和力。简而言之，通过使用经捕获生物素化TfR进行的SPR实验来分析结合亲和力，并且所述实验在25℃下用S系列SA芯片在BiacoreT100仪器(GE Healthcare)上进行。HBS-EP+(10mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％表面活性剂P20)作为运行缓冲液与0.1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)一起用于实验中。通过孵育一系列稀释液来评估可溶性TfR结合肽的结合，其中浓度范围视TfR结合肽而变化，所述TfR结合肽用2ug/mlTfR进行测试，从而捕获约300共振单位(RU)的蛋白质用于SPR实验。

首先，通过SPR确认具有不同亲和力的TfR结合肽的等位基因系列，如图4中所示。在300nM的浓度下测试具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:32(SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:32分别是添加了N末端GS的SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:96)的序列的肽。数据被归一化至每个迹线的最大响应。结果确认由稍后轮次的亲和力成熟获得的肽变体展现不同的对TfR的结合亲和力。也就是说，由最近轮次的亲和力成熟获得的具有SEQ ID NO:32的序列的肽显示最高的对TfR的结合亲和力，而SEQ ID NO:1显示最低的对人TfR(hTfR)的结合亲和力。

然后，测量分别具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32(SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32分别是添加了N末端GS的SEQID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:96)的序列的四种肽与经捕获和生物素化hTfR的结合。图5说明显示从100pM至200nM的不同浓度的具有SEQ ID NO:2的序列的肽的TfR结合的表面等离子体共振(SPR)迹线。图6说明显示从100pM至200nM的不同浓度的具有SEQ ID NO:4的序列的肽的TfR结合的表面等离子体共振(SPR)迹线。图7说明根据SPR的SEQ ID NO:32与经捕获生物素化(Bt)hTfR的结合的结合和单循环动力学数据。在2种密度的经捕获Bt-hTfR上注射5种浓度的具有SEQ ID NO:32的序列的肽(0.037nM、0.11nM、0.33nM、1nM、3nM)，并且进行整体分析。图8示出根据SPR的SEQ ID NO:30与经捕获生物素化hTfR的结合的结合和单循环动力学数据。在2种密度的经捕获Bt-hTfR上注射5种浓度的具有SEQ ID NO:30的序列的肽(0.037nM、0.11nM、0.33nM、1nM、3nM)，并且进行整体分析。

在100pM与200nM之间的连续稀释度下测量SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的结合，而在37pM至3nM的连续稀释度下测试SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32，以产生动力学数据。对于SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32的肽，通过在两种密度(在图7和图8中示出)的经捕获和生物素化hTfR上注射肽来进行动力学测试，并且整体分析数据。

下表10概述从对图5–图8中所示的图的分析获得的数据。对于具有SEQ ID NO:2的序列的肽，确定了8.7±4nM的K_D和23.1±2RU的R_最大。对于具有SEQ ID NO:4的序列的肽，确定了14.8±6nM的K_D和21.2±2RU的R_最大。对于具有SEQ ID NO:32的序列的肽，确定了216±1pM的K_D。对于具有SEQ ID NO:30的序列的肽，确定了468±1pM的K_D。较低K_D值指示较高结合亲和力。R最大代表肽与hTfR的最大结合能力。如下表10中所示，SEQ ID NO:32具有最低K_D，从而指示它显示最强烈的与hTfR的结合。增加的TfR结合亲和力可对应于改善的胞吞转运功能。在一些情况下，增加的TfR结合亲和力可对应于降低的胞吞转运功能，其中在一些情况下，相较于参考肽，增加的TfR结合亲和力不对应于胞吞转运功能变化。在不束缚于任何理论下，假定K_a/K_d的比率可影响肽的胞吞转运功能，因此，调节K_a和/或K_d可用于产生具有最优TfR结合亲和力和胞吞转运功能的TfR结合肽。

表10–SPR分析结果

*报告的k_a接近可通过仪器来测量的限值

实施例8

转铁蛋白受体结合肽的pH依赖性结合

此实施例描述转铁蛋白受体结合肽的pH依赖性结合。如实施例5中所述使用位点饱和诱变鉴定了结合至转铁蛋白受体(TfR)并具有SEQ ID NO:32(对应于添加了N末端GS的SEQ ID NO:96)的序列的CDP。然后在7.4的示例性细胞外pH和5.5的示例性内体pH下比较了TfR结合肽对TfR的结合亲和力的pH依赖性。

将表达SEQ ID NO:32的肽的细胞用10nM用链霉亲和素-AlexaFluor 647标记的生物素化TfR染色。染色是在示例性细胞外pH(pH 7.4，图10A)下的缓冲液或在示例性内体pH(pH 5.5，图10B)下的缓冲液中进行的。将TfR荧光测量为SEQ ID NO:32表达的函数。选择对应于所需肽表达水平的切片门用于比较。所选切片门内的TfR荧光水平指示在所测试pH下肽对TfR的亲和力。结果表明，与在生理细胞外pH(pH 7.4，图10C)下相比，在内体pH(pH5.5)下TfR结合肽以略微更高的亲和力结合至TfR，其中在pH 5.5下的亲和力略微更高。

结果表明，SEQ ID NO:32的TfR结合肽可在包括细胞外和内体pH的pH范围内结合TfR，并且它对结合TfR具有相对非pH依赖性亲和力。这证明TfR结合肽适用于将靶标分子募集至内体、同时保持与内体内的TfR结合的方法中。这些结果表明，本公开的SEQ ID NO:32的TfR结合肽和类似的TfR结合CDP连同连接至TfR结合肽的肽在TfR介导的内吞作用之后可再循环回到细胞表面。

实施例9

用于PD-L1的pH依赖性内体递送的PD-L1结合肽

此实施例描述能够例如在内体pH(例如pH 5.5)下以pH依赖性方式从PD-L1解离的PD-L1结合肽的开发和体外测试。

可通过多种方式赋予与靶标啮合结构域(CDP或其他)的pH依赖性结合，此处提供其实例。在此，设计了含有组氨酸取代的变体文库。引入组氨酸残基，因为在所有天然氨基酸中，His是侧链的电荷在中性(例如pH 7.4)与酸性(例如pH<6)内体条件之间显著变化的唯一一种天然氨基酸。随着pH变化，例如随着内体酸化从生理细胞外环境变为内体环境，这种电荷变化可直接改变结合(在可导致附近阳离子基团的电荷排斥的低pH下引入正电荷)或间接改变结合(电荷的变化在结合剂的结构中赋予细微变化，从而破坏蛋白质-蛋白质界面)。在其最简单的形式中，这可通过生成双His掺杂文库来执行，其中对于CDP，每个非Cys、非His残基都可一次一个或两个被His取代。图11D在组氨酸取代矩阵的上方和一侧示出高亲和力PD-L1结合CDP序列(SEQ ID NO:187，EEDCKVHCVKEWMAGKACAERQKSYTIGRAHCSGQKFDVFKCLDHCAAP)。每个黑框代表其中His可被取代的第一和第二位点。纯粹沿着左上至右下对角线的那些位点代表单一His取代。每个黑框代表具有一个或两个天然至His取代的变体，代表待筛选的821个肽变体。生成并测试了含有亲本序列和具有一个或两个天然至His取代的变体的变体文库。

在比较结合实验中在各种pH水平或范围下评估所得组氨酸富集的PD-L1结合肽的PD-L1结合。通过哺乳动物表面展示表达了PD-L1结合肽的变体文库，每个变体含有零个、一个或两个His取代。测试了这些变体在细胞外pH(诸如pH 7.4)下结合的维持，以及在内体pH(诸如pH 5.5)下结合的减少。进行顺序筛选，如图21所示。最初在pH 7.4下筛选输入文库的PD-L1结合，并选择强结合剂(阴影区域)。第二轮和第三轮筛选(分别为“分选1”和“分选2”)在pH 5.5下进行以模拟内体pH，并收集弱结合剂(阴影区域)。最后一轮筛选(“分选3”)在pH7.4下进行，并选择了强结合剂。筛选后观察到在pH 7.4和pH 5.5下的差异结合(“分选4”)。

在E2H、M13H和K16H氨基酸位置中的一个、两个或三个处含有组氨酸取代的SEQ IDNO:187的变体在汇合筛选中被鉴定为PD-L1的pH依赖性结合剂。通过测量在pH 7.4和pH5.5下PD-L1与表达单一变体的细胞表面的结合来验证pH依赖性结合，如图22所示。将在E2H(EHDCKVHCVKEWMAGKACAERQKSYTIGRAHCSGQKFDVFKCLDHCAAP，SEQ ID NO:234)、M13H(EEDCKVHCVKEWHAGKACAERQKSYTIGRAHCSGQKFDVFKCLDHCAAP，SEQ ID NO:235)、K16H(EEDCKVHCVKEWMAGHACAERQKSYTIGRAHCSGQKFDVFKCLDHCAAP，SEQ ID NO:236)、E2H和M13H(EHDCKVHCVKEWHAGKACAERQKSYTIGRAHCSGQKFDVFKCLDHCAAP，SEQ ID NO:237)、E2H和K16H(EHDCKVHCVKEWMAGHACAERQKSYTIGRAHCSGQKFDVFKCLDHCAAP，SEQ ID NO:233)、M13H和K16H(EEDCKVHCVKEWHAGHACAERQKSYTIGRAHCSGQKFDVFKCLDHCAAP，SEQ ID NO:238)或E2H、M13H和K16H(EHDCKVHCVKEWHAGHACAERQKSYTIGRAHCSGQKFDVFKCLDHCAAP，SEQ ID NO:239)处含有取代的肽与SEQID NO:187进行了比较。在E2H和K16H处含有取代的对应于SEQ ID NO:233的变体显示出在pH 7.4下与PD-L1的强结合和在pH 5.5下显著丧失结合(黑色箭头)。其他变体和亲本肽在pH 7.4和pH 5.5下显示出不同水平的PD-L1结合，并且对结合具有不同程度的pH依赖性。

实施例10

用于选择性耗竭PD-L1的含有pH依赖性PD-L1结合肽的选择性耗竭复合物的开发

此实施例描述用于选择性耗竭PD-L1的含有pH依赖性PD-L1结合肽的选择性耗竭复合物的开发选择在生理细胞外pH下具有高PD-L1结合亲和力、但在较低pH水平诸如5.5的内体pH下具有显著降低的结合亲和力的肽用于如实施例9中所述的细胞结合、摄取以及内体内或囊泡内释放。鉴定和表征具有高内体递送能力的PD-L1结合肽。将在生理细胞外pH(例如，pH 7.4)下具有高PD-L1结合亲和力并在内体pH(例如，pH 5.5)下具有降低的结合亲和力的PD-L1结合肽重组融合，化学合成为单一融合物，分别重组表达和缀合，或单独化学合成并缀合至在生理细胞外pH和内体pH下具有基本相同的TfR结合亲和力的TfR结合肽(例如，SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ IDNO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个的TfR结合肽)，任选地在PD-L1结合肽与TfR结合肽之间具有任何接头或没有接头。

显示从筛选靶标结合CDP至修饰此类CDP以进行pH依赖性结合、至并入组合物中以选择性耗竭的进展的样品筛选流水线显示在图11A中。针对与靶标分子结合的能力筛选CDP的肽文库。来自文库的靶标结合肽通过来自结合的靶标分子的信号累积来区分。任选地，选择鉴定的靶标结合肽并进一步成熟以用于结合，例如使用点突变筛选。所鉴定的靶标结合肽例如通过进行组氨酸点突变扫描被转化为pH依赖性结合剂，如图11D中所说明和实施例9中所述。将pH依赖性靶标结合肽融合或连接至再循环肽(例如，SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个的TfR结合肽)，以形成选择性耗竭复合物。任选地，通过测试表达选择性耗竭复合物的细胞中的靶标耗竭来验证选择性耗竭复合物，如图11B中所示。可在健康细胞和在经转化细胞系中进一步测试复合物，以测量选择性耗竭复合物的疾病特异性功能性，如图11C中所示。通过测试靶标特异性细胞功能(诸如细胞凋亡抑制剂耗竭后的癌症特异性生长抑制)的变化来测量复合物的特异性。靶特异性细胞功能可取决于外在或内在因素，或外在因素和内在因素的组合。靶标的降解和癌细胞的选择性损伤表明患者中存在治疗窗口。

可使用与T细胞共培养的细胞来测试包含PD-L1结合肽的选择性耗竭复合物的癌症特异性生长抑制。通过从癌细胞表面除去一些PD-L1，可减少检查点抑制信号传导，并且肿瘤细胞可更容易被免疫系统识别和攻击，从而导致肿瘤生长减少、转移减少或其他有益肿瘤反应增加。

实施例11

通过TfR介导的内吞作用选择性耗竭可溶性靶标分子

此实施例描述通过TfR介导的内吞作用选择性耗竭可溶性靶标分子。将含有缀合至靶标结合肽的TfR结合肽(例如，SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ IDNO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个)的组合物与表达TfR的细胞接触。TfR结合肽在生理细胞外pH(诸如pH 7.4)和内体pH(诸如pH 5.5)下均以高亲和力结合TfR，并且靶标结合肽在生理细胞外pH下以较高亲和力并在内体pH下以较低亲和力结合至可溶性靶标分子。接触后，TfR结合肽结合至细胞表面上的TfR，并且靶标结合肽结合至溶液中的可溶性靶标分子(图12A，(1))。含有TfR结合肽和靶标结合肽的组合物通过TfR介导的内吞作用与TfR和结合的靶标分子一起被内吞(图12A，(2))。随着内体区室酸化，靶标分子从靶标结合肽释放(图12A，(3))。靶标分子然后在溶酶体区室中降解(图12A，(4))，并且复合物与TfR一起再循环至细胞表面(图12A，(5))。

实施例12

通过TfR介导的内吞作用选择性耗竭表面靶标分子

此实施例描述通过TfR介导的内吞作用选择性耗竭表面靶标分子。将含有缀合至靶标结合肽的TfR结合肽(例如，SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个)的组合物与表达TfR的细胞接触。TfR结合肽在生理细胞外pH下(诸如在pH 7.4下)和内体pH下(诸如在pH 5.5下)均以高亲和力结合TfR，并且靶标结合肽在生理细胞外pH下以较高亲和力并在内体pH下以较低亲和力结合至表面靶标分子。接触后，TfR结合肽结合至细胞表面上的TfR，并且靶标结合肽结合至细胞表面上的表面靶标分子(图12B，(1))。含有TfR结合肽和靶标结合肽的组合物通过TfR介导的内吞作用与TfR和结合的靶标分子一起被内吞(图12B，(2))。随着内体区室酸化，靶标分子从靶标结合肽释放(图12B，(3))。靶标分子然后在溶酶体区室中降解(图12B，(4))，并且复合物与TfR一起再循环至细胞表面(图12B，(5))。

实施例13

使用血清白蛋白结合肽复合物来延长肽血浆半衰期

此实施例显示一种使用如本文公开的血清白蛋白结合肽复合物来延长肽的血清或血浆半衰期的方法。修饰具有SEQ ID NO:96、SEQID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ IDNO:220–SEQ ID NO:222，或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个的序列的肽或肽复合物以增加它的血浆半衰期。重组融合，以单一融合物形式化学合成，单独重组表达和缀合，或单独化学合成和缀合肽和血清半衰期延长部分。使肽融合至血清白蛋白结合肽会延长肽复合物的血清半衰期。使肽或肽复合物缀合至血清白蛋白结合肽，诸如SA21(SEQ ID NO:178)。任选地，融合至SA21的肽具有SEQ ID NO:181或SEQ ID NO:184中的任一者的序列。任选地，通过具有SEQ IDNO:179的序列的肽接头来使融合至SA21的肽连接至SA21。具有对应于SEQ ID NO:179的序列的接头使两个单独功能性CDP连接以将血清半衰期延长功能并入至肽或肽复合物中。具有对应于SEQ ID NO:179的序列的接头使得SA21能够在无来自肽复合物的任一成员的空间阻碍的情况下环化。或者，肽与白蛋白结合剂诸如Albu标签或脂肪酸诸如C₁₄-C₁₈脂肪酸或棕榈酸的缀合用于延长血浆半衰期。由于通过使用最小非人蛋白质序列实现的免疫原性降低，血浆半衰期也任选地得到延长。

实施例14

TfR结合血清白蛋白结合肽融合物的纯化

此实施例描述融合至血清白蛋白结合肽SA21的TfR结合肽的纯化。图13A和图13B说明SA21融合肽的纯化。以与CDP的融合肽形式重组表达SA21，并且通过HPLC来纯化。在融合至噬铁蛋白(“Scn-CDP”)以及被裂解以产生经裂解SA21融合肽(“CDP”)和噬铁蛋白(“Scn”)的情况下对肽进行纯化。图13A显示对应于SEQ ID NO:181的融合至血清白蛋白肽(SA21)的肽TfR结合肽的纯化。在DTT还原性(“R”)或非还原性(“NR”)条件下，通过SDS-PAGE(左侧)和RP-HPLC(右侧)来验证纯度。还对未裂解的(“U”)噬铁蛋白-CDP融合肽运行SDS-PAGE。在SDS-PAGE中，观察到在未裂解(“U”)样品中对应于噬铁蛋白-CDP融合物(“Scn-CDP”)的不同条带，以及在还原(“R”)和非还原(“NR”)样品中对应于经裂解SA21融合物(“CDP”)、单独噬铁蛋白(“Scn”)和未裂解融合物(“Scn-CDP”)的条带。在未还原RP-HPLC迹线中存在单一峰指示纯净未降解样品。图13B显示对应于SEQ ID NO:182(GSRLIEDICLPRWGCLWEDDGGGGSGGGGSVRIPVSCKHSGQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCDCTPK)的融合至SA21的肽的纯化。在DTT还原性(“R”)或非还原性(“NR”)条件下，通过SDS-PAGE(左侧)和RP-HPLC(右侧)来验证纯度。还对未裂解的(“U”)噬铁蛋白-CDP融合肽运行SDS-PAGE。在SDS-PAGE中，观察到在未裂解(“U”)样品中对应于噬铁蛋白-CDP融合物(“Scn-CDP”)的不同条带，以及在还原(“R”)和非还原(“NR”)样品中对应于经裂解SA21融合物(“CDP”)、单独噬铁蛋白(“Scn”)和未裂解融合物(“Scn-CDP”)的条带。在未还原RP-HPLC迹线中存在单一峰指示纯净未降解样品。

实施例15

用于靶标结合肽和TfR结合肽的缀合和半衰期延长的接头

此实施例描述用于靶标结合肽和TfR结合肽的缀合和任选地半衰期延长的接头。通过接头将TfR结合肽(例如，SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个)缀合至靶标结合肽(例如，如实施例9中所述选择用于pH依赖性结合的靶标结合CDP)。靶标结合肽可通过来自天然CDP二聚体的DkTx肽(SSEQ ID NO:139，KKYKPYVPVTTN)与TfR结合肽融合，如图14A所示。DkTx肽接头来自中国虎纹捕鸟蛛中的Tau-theraphotoxin-Hs1 a的天然打结素-打结素二聚体，也称为DkTx(双结毒素)。天然地，DkTx接头将两个独立折叠的CDP结构域分隔并且非常适合维持两个二聚化CDP的功能。靶标结合肽可通过含有不同长度的被丝氨酸隔开以提高溶解度的甘氨酸的聚-GlySer接头诸如(SEQ ID NO:138，GGGSGGGSGGGS)融合至TfR结合肽，如图14B所示。靶标结合肽可通过在位置5具有Cys置Ser突变的人IgG接头(SEQ ID NO:140，EPKSSDKTHT)与TfR结合肽融合以防止分泌过程中的交联，如图14C所示。用于使两个肽二聚化的肽接头任选地具有以下性质：1)接头不干扰TfR结合结构域和靶标结合结构域的独立折叠，2)接头为成熟分子提供足够的长度以促进靶标分子与TfR之间通过TfR结合肽靶标结合肽二聚体的接触，3)接头不会对TfR结合肽靶标-结合肽二聚体的可制造性(合成或重组)产生负面影响，以及4)接头不会损害TfR结合肽靶标结合肽二聚体的任何所需的合成后化学改变(例如，荧光团或白蛋白结合化学基团的缀合)。

CDP(或其他基于蛋白质的靶标啮合方式)也可使用免疫球蛋白重链Fc结构域进行二聚化。这些通常用于现代分子医学中，以基于抗体或其他可溶性功能结构域对功能结构域进行二聚化。靶标结合肽可通过基于IgG的Fc结构域非共价连接至TfR结合肽，如图15中所示。Fc结构域可用于同或异二聚化功能结构域，并通过与再循环Fc受体(FcRn)相互作用的结构域来延长血清半衰期。如果Fc序列是天然的，则二聚化可以是同二聚体的，但如果想要驱动异二聚体形成，则可将Fc突变为“孔中钮”形式，其中一个FcCH3含有被设计成适合另一FcCH3结构域上的空腔(孔)的新颖残基(钮)。通过这一过程，钮+钮二聚体是高度能量上不利的。可形成孔+孔二聚体，但是如果在“钮”侧专门添加纯化标签，就可排除孔+孔二聚体，确保只有钮+孔二聚体被纯化。Fc结构域可单独用作再循环受体啮合结构域，因此使用Fc进行二聚化可增强肽复合物再循环或选择性降解复合物。

TfR结合和靶标结合CDP可通过添加第三(或更多)功能结构域进一步功能化和多聚化。在此实施例中，显示了来自大芬戈尔德菌消化链球菌白蛋白结合蛋白(SEQ ID NO:192)的白蛋白结合结构域，因为它是不太可能干扰另一CDP结构域的独立折叠的三螺旋结构。此类添加的功能结构域可相对于TfR和靶标结合结构域以任何取向包括在内，如图16A–图16C所示。示例性肽显示为具有聚GlySer接头，但许多接头中的任一个(例如，SEQ ID NO:129–SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:195–SEQ ID NO:218中的任一个)都可使用。白蛋白结合结构域(例如，SEQ ID NO:178或SEQ ID NO:192的肽)可与TfR结合肽、靶标结合肽或两者融合。白蛋白结合结构域可包括肽接头(例如，SEQ ID NO:129–SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:195–SEQ ID NO:218中的任一个)。白蛋白结合结构域可连接至靶标结合肽和TfR结合肽，如图16A所示。白蛋白结合结构域可连接至靶标结合肽，如图16B所示。白蛋白结合结构域可连接至TfR结合肽，如图16C所示。添加白蛋白结合结构域可增加含有TfR结合肽和靶标结合肽的组合物的血清半衰期。

类似的方法和设计可在PD-L1用作再循环受体的方法中用于含有PD-L1结合结构域(例如，PD-L1结合肽)而不是TfR结合结构域作为再循环受体的选择性耗竭复合物。

实施例16

含有TfR结合肽和靶标结合肽的CDP-CDP二聚体的功能性结合

此实施例描述含有TfR结合肽和靶标结合肽的CDP-CDP二聚体的功能性结合。CDP-CDP二聚体含有SEQ ID NO:2的TfR结合肽和离子通道抑制性CDP。TfR结合肽通过DkTx接头(SEQ ID NO:139)或GS3接头(SEQ ID NO:141)连接至Kv1.3电压门控钾通道的肽抑制剂(Z1E-AnTx、Z1P-AnTx、EWSS-ShK、HsTx、Pro-Vm24或Vm24)。CDP-CDP二聚体肽被表达为与噬铁蛋白载体肽(SEQ ID NO:147)的融合物，其被TEV蛋白酶裂解。将纯化的肽在SDS-PAGE凝胶上运行以验证肽融合物是完整的(图17A)。每块凝胶从左至右含有分子量后者(“L”)、非还原条件下的肽样品(“NR”)和还原条件下的肽样品(“R”)。肽样品泳道中易于区分的条带从上到下对应于具有噬铁蛋白的未裂解的CDP-CDP二聚体、裂解的噬铁蛋白和裂解的CDP-CDP二聚体。所有CDP-CDP二聚体复合物都表达良好，如由条带强度所指示，并且出现折叠，如通过用DTT还原后的位移所示。

在第二测定中，将对应于SEQ ID NO:32的不同TfR结合CDP通过聚Gly-Ser接头(SEQ ID NO:138)融合至Vm24离子通道抑制剂。纯化所得CDP-CDP二聚体并在SDS-PAGE凝胶上运行(图17B，左下)。TfR结合肽(SEQ ID NO:32)和Vm24离子通道抑制性CDP也分别纯化(图17B，左上和左中)。使用反相高压液相色谱法(RP-HPLC，图17B，中间)比较TfR结合肽、离子通道抑制性CDP和CDP-CDP二聚体的纯度。然后测试每种复合物抑制Kv1.3离子通道的能力(图17B，右)。与单独离子通道抑制性CDP相比，CDP-CDP二聚体保留了其抑制离子通道的能力。如所预期，单独TfR结合肽不会抑制Kv1.3。

实施例17

TfR结合肽与鼠TfR的交叉反应性

此实施例说明本公开的TfR结合肽在细胞表面结合测定中与鼠TfR的交叉反应性。用经AlexaFluor 647染料直接标记的可溶性TfR结合肽染色在它们的表面上表达人或小鼠TfR的293F细胞。图18A和图18B显示使用物种特异性抗体来验证人TfR表达相对于小鼠TfR表达的流式细胞术图。图18C和图18D显示肽有效地结合两种同源物。在一类似实验中，流式细胞术用于证明SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:32和抗Tf抗体(阳性对照)的有效结合。

实施例18

神经元CRE报告小鼠的活化

此实施例描述使用包含一种或多种如本文所述的TfR结合肽的肽复合物来使神经元CRE转运体小鼠活化。在这个情况下，使用包含TfR结合肽和神经降压素肽的融合肽。使对应于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:32(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:32分别是添加了N末端GS的SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:96)的肽与神经降压素在每种肽的C末端融合以产生肽-NT复合物。神经降压素的下游活性涉及细胞内Ca²⁺调控和cAMP响应元件(CRE)驱动的转录程序(图19A)，并且已探究它的调节以抑制慢性疼痛。将肽-NT在293F细胞中重组表达并纯化。使用质谱测定法来验证纯化肽的分子量。

用表达NTSR1的HEK-293细胞系证明与神经降压素受体的结合。为证明神经降压素在各种蛋白质上的延伸是功能性的，使用IP-One–Gq试剂盒(CisBio 62IPAPEB，图19B)测量HEK293细胞或用递送人NTSR1的慢病毒载体转导的HEK293细胞(HEK293-NTSR1)中的NTSR活性。使细胞在DMEM+10％胎牛血清中生长，用Accutase从板移除，沉淀，并且在每mL 1.5X10⁶个细胞的密度下悬浮于汉克斯(Hanks)缓冲盐溶液中。根据制造商说明书，在HTFR 96孔低容量板(CisBio#66PL96025)中建立HTFR反应。每25μL反应使用10,000个细胞(7μL)。将板在37℃下孵育60分钟。然后添加3μLIP1-d2工作溶液，随后添加3μL抗IP1穴状化合物工作溶液。在室温下孵育1小时之后，将板在Perkin Elmer 2104 EnVision多标记读取器中扫描以获得在665nm和620nm波长下激发之后的荧光发射。将FRET比率计算为10,000x(信号665nm/信号620nm)。在哺乳动物HEK-293细胞中，神经降压素(NT)受体啮合显示IP₁积累仅响应于NT或NT肽复合物(与NT缀合的SEQ ID NO:1和与NT缀合的SEQ ID NO:32，以及mTf-NT和NT，而非SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:32、媒介物或mTf)，对于除媒介物之外的所有条件，N＝3个孔，媒介物具有N＝36(图19B)。水平条形指示样品平均值。

实施例19

高亲和力和pH依赖性EGFR结合纳米抗体的开发

此实施例描述高亲和力和pH依赖性EGFR结合纳米抗体的开发。将结合EGFR(QVKLEESGGGSVQTGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSAWYGTLYEYDYWGQGTQVTVSS，SEQ ID NO:219)的纳米抗体进行修饰以获得与EGFR的更高亲和力和pH依赖性结合。产生了肽文库，所述肽文库在由晶体结构显示以与EGFR相互作用的两个互补决定区(在SEQ ID NO:219中加下划线，分别显示CDR1和CDR3)中的每个残基处含有组氨酸点突变。由于CDR1含有10个非组氨酸残基，因此可产生多达56个具有0、1或2个组氨酸的变体。由于CDR3含有17个非组氨酸残基，因此可产生多达154个具有0、1或2个组氨酸的变体。对组氨酸突变体进行单独测试，然后将命中组合成单一VHH变体，或者将它们进行遗传重组并作为56x154＝8,624个成员的变体文库进行测试。通过筛选在pH约7.4下保留高细胞染色/亲和力并在pH约6或更低下显示低细胞染色/亲和力来鉴定来自所述文库的命中。

使用这种筛选鉴定了两种EGFR结合纳米抗体。第一EGFR结合纳米抗体(SEQ IDNO:242)被鉴定为高亲和力EGFR结合肽，其结合EGFR的亲和力高于SEQ ID NO:219。第二EGFR结合纳米抗体(SEQ ID NO:243)被鉴定为pH依赖性EGFR结合纳米抗体，其以约7.4的高亲和力结合至EGFR并且显示在约6或更低下结合亲和力降低。

实施例20

位点饱和诱变以鉴定pH依赖性靶标结合肽

此实施例描述用于鉴定pH依赖性靶标结合肽的位点饱和诱变。通过进行位点饱和诱变来对结合至靶标分子(例如，PD-L1、VEGF、PD-1、EGFR、CD38、GD2、SLAMF7、CTLA-4、CCR4、CD20、PDGFRɑ、VEGFR2、HER2、CD33、CD30、CD22、CD79B、粘连蛋白-4或TROP2)的肽(例如，纳米抗体)进行修饰以获得pH依赖性结合，如在实施例5中关于TfR结合肽所描述。针对在生理细胞外pH(例如pH 7.4)下和内体pH(例如pH 5.5)下与靶标分子的结合筛选位点饱和突变体文库。选择并进一步筛选在生理细胞外pH下显示较高结合亲和力和在内体pH下显示降低的结合亲和力的突变体。对命中进行后续轮次的位点饱和诱变，以进一步改善pH依赖性结合。

实施例21

使用基因疗法或细胞疗法递送选择性耗竭复合物

此实施例描述使用溶瘤单纯疱疹病毒递送选择性耗竭复合物。使用溶瘤单纯疱疹病毒(oHSV)载体将编码选择性耗竭复合物的表达和分泌的基因引入靶细胞中。对于基因疗法，靶细胞是患者体内的细胞。对于细胞疗法，靶细胞是已经收集并在用病毒载体修饰后重新引入患者体内的患者细胞。oHSV感染癌细胞，并且未被病毒杀死的癌细胞表达并分泌选择性耗竭复合物。剩余细胞改变肿瘤微环境以抑制针对癌细胞的免疫活性。选择性耗竭复合物从原位肿瘤细胞分泌并且作用于癌症，针对T细胞上或肿瘤微环境中的免疫抑制因子。

可替代地，可将改变肿瘤或T细胞活性的选择性耗竭复合物工程化到CAR-T细胞或其他细胞疗法中。CAR-T细胞已经通过遗传修饰特化以靶向肿瘤组织，杀死携带由表达的嵌合抗原受体(CAR)靶向的细胞表面标记物的肿瘤细胞。如果需要补充活性，诸如抑制这些肿瘤中存在的调控性、免疫抑制性信号传导，则将CAR-T细胞工程化为还分泌抑制调控性、免疫抑制性信号传导的选择性耗竭复合物。

实施例22

选择性耗竭复合物、靶标分子与受体之间的三元复合物形成

此实施例描述在细胞表面上时选择性耗竭复合物、靶标分子与受体之间的三元复合物形成。含有靶标结合肽、第一肽接头(GGGGSx4，SEQ ID NO:224)、白蛋白结合肽(SEQ IDNO:227)、第二肽接头(GGGGSx4，SEQ ID NO:224)和TfR结合肽的选择性耗竭复合物(SDC)被设计为结合靶标分子和转铁蛋白受体，如图23A所示。SDC可含有一个以pH依赖性方式结合的结合端。优选地，pH依赖性结合具有在内体pH(例如，pH 5.5、6.0、6.5、5.0、4.5)下的结合对比在细胞外pH(例如，pH 7.4、7.0)下的结合的显著差异；然而，内体对比细胞外pH结合的轻微差异也可以是有效的。表达并纯化了肽复合物，所述肽复合物含有：以轻度pH依赖性结合EGFR的靶标结合肽(SEQ ID NO:244)和具有对应于SEQ ID NO:232的REGCASHCTKYKAELEKCEARVSSRSNTEETCVQELFDFLHCVDHCVSQ的序列的低亲和力TfR结合肽(肽1，SEQ ID NO:367，NSDSECPLSHDGYCLHGGVCMYIKAVDRYACNCVVGYIGERCQYRDLTWWGPRGTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLKEAKEKAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKAVEGVNALKDEILKAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSREGCASHCTKYKAELEKCEARVSSRSNTEETCVQELFDFLHCVDHCVSQ)；结合EGFR的靶标结合肽(SEQID NO:244)和对应于SEQ ID NO:96的高亲和力TfR结合肽(肽2，SEQ ID NO:328)；以中度pH依赖性结合PD-L1的靶标结合肽和对应于SEQ ID NO:232的低亲和力TfR结合肽(肽3，SEQ ID NO:357，EEDCKVHCVKEWMAGKACAERQKSYTIGRAHCSGQKFDVFKCLDHCAAPGTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLKEAKEKAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKAVEGVNALKDEILKAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSREGCASHCTKYKAELEKCEARVSSRSNTEETCVQELFDFLHCVDHCVSQ)；或以中度pH依赖性结合PD-L1的靶标结合肽(SEQ IDNO:187)和对应于SEQ ID NO:96的高亲和力TfR结合肽(肽4，SEQID NO:356；EEDCKVHCVKEWMAGKACAERQKSYTIGRAHCSGQKFDVFKCLDHCAAPGTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLKEAKEKAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKAVEGVNALKDEILKAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSREGCASRCMKYNDELEKCEARMMSMSNTEEDCEQELEDLLYCLDHCHSQ)，如图23B所示。图23B示出四种肽复合物的SDS-PAGE分析，确认分子的成功表达和纯化。筛选了四种肽复合物的通过结合至细胞表面表达的靶标分子(EGFR或PD-L1)和受体分子(用链霉亲和素-647荧光标记的可溶性TfR胞外域)而形成三元复合物的能力。

将表达EGFR或PD-L1的细胞与对应于SEQ ID NO:367(1)、SEQ ID NO:328(2)、SEQID NO:357(3)和SEQ ID NO:356(4)并用经链霉亲和素-647荧光标记的可溶性TfR胞外域标记的四种肽复合物共染色，并且通过流式细胞术评估分子与细胞表面的结合，如图23C所示。含有EGFR结合肽和高亲和力TfR结合肽的选择性耗竭复合物(肽2，对应于SEQ ID NO:328)与表达EGFR的细胞(左)形成三元复合物，但不与表达PD-L1的细胞(右)形成三元复合物。相反，含有PD-L1结合肽和高亲和力TfR结合肽的选择性耗竭复合物(肽4，对应于SEQ IDNO:356)与表达PD-L1的细胞(右)形成三元复合物，但不与表达EGFR的细胞(左)形成三元复合物。与TfR具有低亲和力结合的比较物肽复合物(肽1和3，分别对应于SEQ ID NO:367和SEQ ID NO:357)没有形成三元复合物，如图23C的右图和左图中缺乏荧光标记所示。总之，此数据表明含有靶标结合肽和高亲和力受体结合肽的选择性耗竭分子与细胞表面上的靶标(例如EGFR或PD-L1)和受体(例如TfR)形成三元复合物。

用作比较物的另外选择性复合物和复合物组分提供于表11中。

表11–比较物肽复合物和复合物组分

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实施例23

用于细胞特异性靶向的选择性耗竭复合物的协同结合

此实施例描述用于细胞特异性靶向的选择性耗竭复合物的协同结合。测试了含有靶标结合肽和受体结合肽并用H i s标签(SEQ ID NO:228)标记的选择性耗竭复合物(SDC)(如图24A所示)以及不含高亲和力靶标结合部分但含有受体结合部分和H i s标签的对照肽的协同结合至细胞表面上的靶标分子和受体的能力。将表达TfR(PDL1-、TfR+)或PD-L1和TfR两者(PDL1+、TfR+)的细胞与能够结合PD-L1(PDL1+、TfR-)、PD-L1和TfR两者(PDL1+、TfR+)或无肽(PBS；PDL1-、TfR-)并用荧光抗His抗体标记的肽复合物一起孵育。荧光被用作测量肽复合物与细胞的结合的示值读数。能够结合PD-L1和TfR两者的SDC(SEQ ID NO:356)协同结合至表达PD-L1和TfR两者的细胞，如由图24B中所示的高荧光所指示。相同的SDC显示出与表达TfR而不表达PD-L1的细胞的显著但大体上较低的结合，如由图24B中所示的中等荧光所指示。缺乏以高亲和力结合TfR的能力但含有PD-L1结合结构域的肽复合物(SEQ IDNO:357)显示与表达TfR和PD-L1两者的细胞的低结合。总之，此数据表明，含有功能性靶标结合结构域(例如，PD-L1结合肽)和功能性受体结合结构域(例如，TfR结合肽)的选择性耗竭复合物协同结合至表达靶标分子和受体两者的细胞。数据还表明，含有功能性受体结合结构域(例如，TfR结合肽)和结合未在细胞表面上表达的靶标(诸如可溶性靶标)的结构域的SDC结合至表达受体的细胞。

实施例24

设计选择性耗竭复合物

此实施例描述设计选择性耗竭复合物以结合至并耗竭靶标分子。含有靶标结合肽和受体结合肽的选择性耗竭复合物被设计为通过结合至经由内吞途径再循环的受体(例如，TfR或PD-L1)并且还结合靶标分子(例如PD-L1或EGFR)来耗竭靶标分子。SDC中的结合肽之一表现出pH依赖性结合(即，与在内体/溶酶体pH下相比，在细胞外pH下与靶标或受体的更高结合)。如果受体非pH依赖性地结合(诸如在细胞外pH下具有与在内体或溶酶体pH下相似的结合)并且靶标以pH依赖性结合，则SDC可以是催化性的。如果受体以pH依赖性结合并且靶标以非pH依赖性结合，则SDC可以是非催化性的。受体结合肽通过经由接头直接融合或通过经由二聚化结构域二聚化而与靶标结合肽复合。选择性耗竭复合物和比较物分子的实例显示在图25A和图25B中。选择性耗竭复合物和复合物组分通过经由接头或二聚化结构域将靶标结合肽连接至受体结合肽来组装。受体结合肽的实例包括TfR结合CDP(SEQ ID NO:96，“T”)或TfR结合单链抗体(SEQ ID NO:221，“N5”；或SEQ ID NO:222，“M16”)。SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:221可以非pH依赖性结合TfR，并且SEQ ID NO:222可以pH依赖性结合TfR。靶标结合肽的实例包括具有有限pH依赖性的EGFR结合纳米抗体(SEQ ID NO:242，“G2”)、pH依赖性EGFR结合纳米抗体(SEQ ID NO:243；“P”)、具有中度pH依赖性的PD-L1结合CDP(SEQID NO:187；实心黑色圆圈)或具有极端pH依赖性的PD-L1结合CDP(SEQ ID NO:233；实心黑色圆圈)。肽接头(例如，SEQ ID NO:129–SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:194–SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:223–SEQ ID NO:227或SEQ ID NO:391)或二聚化结构域(例如，SEQ ID NO:245–SEQ ID NO:287)用于将靶标结合肽连接至单一多肽链中的受体结合肽，如第一行复合物中所示，或用于将靶标结合肽或受体结合肽连接至二聚化结构域，如图25A中第二行复合物所示。

二聚化结构域可以是Fc同二聚化结构域(例如，SEQ ID NO:245–SEQ ID NO:259中的任一个)或孔中钮(KIH)Fc异二聚化结构域(例如，SEQ ID NO:260–SEQ ID NO:287)。为了形成异二聚体，SEQ ID NO:260与SEQ ID NO:261二聚化；SEQ ID NO:262与SEQ ID NO:263二聚化；SEQ ID NO:264与SEQ ID NO:265二聚化；SEQ ID NO:266与SEQ ID NO:267二聚化；SEQ ID NO:268与SEQ ID NO:269二聚化；SEQ ID NO:270与SEQ ID NO:271二聚化；SEQ IDNO:272与SEQ ID NO:273二聚化；SEQ ID NO:274与SEQ ID NO:275二聚化；SEQ ID NO:276与SEQ ID NO:277二聚化；SEQ ID NO:278与SEQ ID NO:279二聚化；SEQ ID NO:280与SEQID NO:281二聚化；SEQ ID NO:282与SEQ ID NO:283二聚化；SEQ ID NO:284与SEQ ID NO:285二聚化；并且SEQ ID NO:286与SEQ ID NO:287二聚化。将组分混合并匹配以产生优选的靶标结合、受体结合和价态性质。

单价选择性耗竭复合物的实例示于图25A中。单价选择性耗竭复合物被设计为含有经由接头(例如，SEQ ID NO:129–SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:194–SEQ ID NO:218、SEQID NO:223–SEQ ID NO:227或SEQ ID NO:391)连接至受体结合肽(例如，SEQ ID NO:96，“T”；SEQ ID NO:221，“N5”；或SEQ ID NO:222，“M16”)的靶标结合肽(例如，SEQ ID NO:242，“G2”；SEQ ID NO:243，“P”；SEQ IDNO:187，实心黑色圆圈；或SEQ ID NO:233，实心浅色圆圈)的单一多肽链。可替代地，单价选择性耗竭复合物被设计为含有经由互补性异二聚化结构域(例如，选自SEQ ID NO:260–SEQ ID NO:287的KI H异二聚化对)与含有受体结合多肽的多肽异二聚化的含有靶标结合肽的多肽。

靶标:SDC:受体复合物被运输至内体，在内体中pH逐渐降低(诸如在早期内体、晚期内体和溶酶体中)。在较低pH下，SDC的pH依赖性结合端可能不再与靶标或受体结合。代表性催化活性分子可以非pH依赖性方式(例如，使用SEQ ID NO:96或SEQ ID NO:221)结合至TfR并以pH依赖性方式(例如，使用SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:233或SEQID NO:234)结合至靶标，并且因此将保持与TfR结合，但在低pH内体中释放靶标。靶标可被运输至溶酶体并被降解。TfR再循环回到细胞表面，带来催化活性SDC分子。非催化活性分子可以pH依赖性方式(例如，使用SEQ ID NO:222)结合至TfR并以非pH依赖性方式(例如，使用SEQ ID NO:242)结合至靶标，并且因此将从TfR释放并在低pH条件下保持与靶标结合。靶标和SDC然后可经受内体/溶酶体降解。可设计对照分子，所述对照分子与TfR(例如，使用SEQID NO:96或SEQ ID NO:221)和靶标(例如，使用SEQ ID NO:242)两者的结合均是非pH依赖性的，并且这些分子在低pH内体中可能不释放靶标，并且因此可能不促进靶标降解。

二价选择性耗竭复合物的实施例显示在图25B中。这些实施例仅显示一个示例性TfR结合部分(SEQ ID NO:96)和一个示例性靶标结合部分(SEQ ID NO:243)，但所述概念可应用于任何TfR结合部分或任何靶标结合部分并且可经由催化活性、非催化活性或基于pH依赖性的比较物复杂行为的相同预期，如图25A中所证明。二价选择性耗竭复合物含有一个或两个靶标结合肽和一个或两个受体结合肽。二价选择性耗竭复合物被设计为含有通过一个或多个接头(例如，SEQ IDNO:129–SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:194–SEQ ID NO:218、SEQID NO:223–SEQ ID NO:227或SEQ ID NO:391)和/或同二聚化结构域(例如，SEQ ID NO:245-SEQ ID NO:259中的任一个)或异二聚化结构域对(例如，选自SEQ ID NO:260-SEQ IDNO:287的KI H异二聚化对)连接至一个或多个受体结合肽(例如，SEQ ID NO:96，“T”；或SEQID NO:221；“或SEQ ID NO:222(未示出))的一个或多个靶标结合肽(例如，SEQ ID NO:243，“P”；或SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:233或SEQ ID NO:234(未示出))。可替代地，二价选择性耗竭复合物被设计为含有经由接头连接的一个或两个靶标结合肽和一个或两个受体结合肽的单一多肽链。也可设计更高价的SDC。由于协同性，二价或多价的SDC可表现出增强的结合，这可增加分子对靶蛋白降解的效力或功能。例如，如果受体结合肽具有相当快的解离速率，则用于结合受体的二价的SDC可增加SDC结合细胞的能力并且也可在受体运输回到细胞表面的过程中增加SDC保持与受体结合的能力。SDC可具有1、2、3、4、5个或更多个靶标结合肽和1、2、3、4、5个或更多个受体结合肽。IgM、聚合物或树突支架可用于使SDC多聚化。

虽然图25A和图25B中的选择性耗竭复合物显示为受体结合肽朝向复合物的N末端定位并且靶标结合肽朝向C末端定位，但是复合物可布置成靶标结合肽朝向N末端并且受体结合肽朝向C末端。此外，选择性耗竭复合物可被设计为含有三个或更多个靶标结合肽和/或三个或更多个受体结合肽的多价复合物。

实施例25

使用选择性耗竭复合物来选择性耗竭PD-L1

此实施例描述使用选择性耗竭复合物来选择性耗竭PD-L1。使含有SEQ ID NO:233或SEQ ID NO:234的pH依赖性PD-L1结合肽和SEQ ID NO:96或SEQ ID NO:221的TfR结合肽的选择性耗竭复合物与表达TfR和PD-L1的细胞接触。选择性耗竭复合物协同地通过TfR结合肽结合至TfR并通过PD-L1结合肽结合至PD-L1，从而在细胞表面上形成三元复合物。TfR与结合的选择性耗竭复合物和PD-L1一起被内吞。在内体/溶酶体成熟期间酸化后，选择性耗竭复合物释放PD-L1并保持与TfR结合。PD-L1在溶酶体中被降解，从而选择性地耗竭PD-L1。TfR和选择性耗竭复合物再循环至细胞表面。

选择性耗竭复合物是SEQ ID NO:290、SEQ ID NO:291、SEQ IDNO:308、SEQ ID NO:317、SEQ ID NO:318、SEQ ID NO:322、SEQ ID NO:323；或者选择性耗竭复合物是与SEQ IDNO:304、SEQ ID NO:306、SEQ ID NO:319、SEQ ID NO:320、SEQ ID NO:321、SEQ ID NO:324或SEQ ID NO:325异二聚化的SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:294、SEQ ID NO:315、SEQ ID NO:316；或者选择性耗竭复合物是与SEQ ID NO:304、SEQ ID NO:319、SEQ ID NO:321或SEQ IDNO:324异二聚化的SEQ ID NO:295或SEQ ID NO:297；或者选择性耗竭复合物是与SEQ IDNO:303异二聚化的SEQ ID NO:298或SEQ ID NO:300；或者选择性耗竭复合物是与SEQ IDNO:306、SEQ ID NO:311、SEQ ID NO:320或SEQ ID NO:325异二聚化的SEQ ID NO:326。

实施例26

通过选择性地耗竭PD-L1来治疗癌症

此实施例描述通过选择性地耗竭PD-L1来治疗癌症。向患有PD-L1阳性癌症的受试者施用选择性耗竭复合物，所述选择性耗竭复合物含有SEQ ID NO:233或SEQ ID NO:234的pH依赖性PD-L1结合肽和TfR结合肽，诸如SEQ ID NO:96或SEQ ID NO:221的TfR结合肽。选择性耗竭复合物结合至癌细胞表面上的PD-L1和TfR，并且选择性耗竭复合物、PD-L1和TfR的三元复合物被内吞。PD-L1在内体中酸化后释放并降解，从而耗竭PD-L1。TfR和选择性耗竭复合物再循环至细胞表面。PD-L1的耗竭抑制癌细胞对宿主免疫反应的逃避，并增加癌细胞的凋亡，从而治疗癌症。

实施例27

使用选择性耗竭复合物来选择性耗竭EGFR

此实施例描述使用选择性耗竭复合物来选择性耗竭EGFR。使含有TfR结合价态(例如单价、二价或更高)和EGFR结合价态(例如单价、二价或更高)的任何组合的SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243或SEQ ID NO:244的pH依赖性EGFR结合肽和SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:221或SEQ ID NO:222的TfR结合肽的选择性耗竭复合物与表达TfR和EGFR的细胞接触。选择性耗竭复合物协同地通过TfR结合肽结合至TfR并通过EGFR结合肽结合至EGFR，从而在细胞表面上形成三元复合物。TfR与结合的选择性耗竭复合物和EGFR一起被内吞。在内体中酸化后，选择性耗竭复合物释放EGFR并保持与TfR结合。EGFR在内体/溶酶体中被降解，从而选择性地耗竭EGFR。TfR和选择性耗竭复合物再循环至细胞表面。EGFR和下游途径如KRAS和MEK的活化可被降低。可使用流式细胞术、荧光显微术、蛋白质印迹、EL I SA、组织学、IHC或其他方法检测与细胞表面的结合、内体摄取、运输、降解和途径活化。这些可在体外或体内暴露表达EGFR的细胞后进行监测。

选择性耗竭复合物是SEQ ID NO:288、SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:307、SEQ IDNO:313、SEQ ID NO:327、SEQ ID NO:328、SEQ ID NO:332、SEQ ID NO:333、SEQ ID NO:337、SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:342或SEQ ID NO:343；或者选择性耗竭复合物是与SEQ ID NO:302、SEQ ID NO:305、SEQ ID NO:339、SEQ ID NO:340、SEQ ID NO:344、SEQ ID NO:345异二聚化的SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:293、SEQ ID NO:310、SEQ ID NO:315、SEQ ID NO:316；或者选择性耗竭复合物是与SEQ ID NO:302、SEQ ID NO:339或SEQ ID NO:344异二聚化的SEQ ID NO:296；或者选择性耗竭复合物是与SEQ ID NO:301异二聚化的SEQ ID NO:298或SEQ ID NO:299；或者选择性耗竭复合物是与SEQ ID NO:330或SEQ ID NO:335异二聚化的SEQ ID NO:331或SEQ ID NO:336；或者选择性耗竭复合物是与SEQ ID NO:329、SEQ ID NO:330、SEQ ID NO:334或SEQ IDNO:335异二聚化的SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:315或SEQ IDNO:316。

类似的方法和设计可在PD-L1用作再循环受体的方法中用于含有PD-L1结合结构域(例如，PD-L1结合肽)而不是TfR结合结构域作为再循环受体的选择性耗竭复合物。例如，通过使用包含PD-L1结合部分和EGFR结合部分的选择性耗竭复合物，可如所描述类似地耗竭EGFR，其中至少一个部分在内体pH下以比在细胞外pH下更低的亲和力结合。

实施例28

通过选择性地耗竭EGFR来治疗癌症

此实施例描述通过选择性地耗竭EGFR来治疗癌症。向患有EGFR阳性癌症的受试者施用选择性耗竭复合物，所述选择性耗竭复合物含有pH依赖性EGFR结合肽，诸如SEQ IDNO:243或SEQ ID NO:244的EGFR结合肽；和TfR结合肽，诸如SEQ ID NO:96的TfR结合肽。受试者可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠或另一物种。可皮下、静脉内、肌肉内、腹膜间或通过另一途径施用选择性耗竭复合物。选择性耗竭复合物可施用1、2、3、4、5、10次或更多次并且以每周1、2、3、4、5、6或7次或每隔一周或每三周或每月一次或更低频率的频率施用。EGFR阳性癌症是非小细胞肺癌、头颈癌、胶质母细胞瘤、转移性脑癌、结肠直肠癌、TK I耐药性癌症、西妥昔单抗耐药性癌症、耐昔妥珠单抗耐药性癌症或帕尼单抗耐药性癌症。选择性耗竭复合物结合至EGFR阳性癌细胞表面上的EGFR和TfR，并且选择性耗竭复合物、EGFR和TfR的三元复合物被内吞。EGFR在内体中酸化后释放并降解，从而耗竭EGFR。TfR和选择性耗竭复合物再循环至细胞表面。EGFR的耗竭减少癌细胞中的促生长信号传导，减缓癌症生长或转移，从而治疗癌症。任选地，因为选择性耗竭复合物靶向表达EGFR和TfR两者的细胞，所以由选择性复合物引起的皮肤毒性小于由抗EGFR抗体或酪氨酸激酶抑制剂疗法(它们抑制EGFR而无TfR组织靶向)引起的皮肤毒性。

也可通过使用结合PD-L1和EGFR两者的选择性耗竭复合物类似地治疗癌症。

实施例29

使用选择性耗竭复合物来选择性耗竭TNFα

此实施例描述使用选择性耗竭复合物来选择性耗竭TNFα。将含有pH依赖性TNFα结合肽和TfR结合肽(诸如SEQ ID NO:96的TfR结合肽)的选择性耗竭复合物与其中存在TNFα的表达TfR的细胞接触，诸如在细胞外液、血清中、细胞表面上或细胞培养基中。选择性耗竭复合物协同地通过TfR结合肽结合至TfR并通过TNFα结合肽结合至TNFα，从而在细胞表面上形成三元复合物。TfR与结合的选择性耗竭复合物和TNFα一起被内吞。在内体中酸化后，选择性耗竭复合物释放TNFα并保持与TfR结合。TNFα在内体/溶酶体中被降解，从而选择性地耗竭TNFα。TfR和选择性耗竭复合物再循环至细胞表面。

实施例30

通过选择性地耗竭TNFα来治疗CNS炎症性病症

此实施例描述通过选择性地耗竭TNFα来治疗CNS炎症性病症。将含有pH依赖性TNFα结合肽和SEQ ID NO:96的TfR结合肽的选择性耗竭复合物施用于患有CNS中涉及炎症的病症的受试者。CNS炎症性病症任选地是神经炎症、中风、创伤性脑损伤、阿尔茨海默氏病或tau蛋白病。SDC穿过BBB，从而接触受试者CNS内的细胞和分子。SDC可通过结合转铁蛋白和经历胞吞转运而穿过BBB转运。选择性耗竭复合物结合至细胞表面上的TfR并且也结合至TNFα，并且选择性耗竭复合物、TNFα和TfR的三元复合物被内吞。TNFα在内体中酸化后释放并降解，从而耗竭TNFα。TfR和选择性耗竭复合物再循环至细胞表面。TNFα的耗竭减少CNS中的细胞因子信号传导，减少神经炎症，从而治疗CNS炎症性病症。

实施例31

使用选择性耗竭复合物来选择性耗竭CD47

此实施例描述使用选择性耗竭复合物来选择性耗竭CD47。将含有TfR结合肽和CD47结合肽的选择性耗竭复合物与表达TfR和CD47的细胞接触，其中结合肽中的一者的结合是pH依赖性的，并且另一结合肽的结合是非pH依赖性的。选择性耗竭复合物协同地通过TfR结合肽结合至TfR并通过CD47结合肽结合至TNFα，从而在细胞表面上形成三元复合物。TfR与结合的选择性耗竭复合物和CD47一起被内吞。在内体中酸化后，选择性耗竭复合物释放CD47并保持与TfR结合，或者SDC释放TfR并保持与CD47结合。CD47在内体/溶酶体中被降解，从而选择性地耗竭CD47。

实施例32

通过选择性地耗竭CD47来治疗癌症

此实施例描述通过选择性地耗竭CD47来治疗癌症。将含有TfR结合肽和CD47结合肽的选择性耗竭复合物(如实施例31中所述)施用于患有CD47阳性癌症的受试者。选择性耗竭复合物与成熟红细胞的结合量较低或没有，因为成熟红细胞不表达TfR，从而导致与红细胞相比优先结合至癌细胞。选择性耗竭复合物结合至癌细胞表面上的CD47和TfR，并且由选择性耗竭复合物、CD47和TfR形成的三元复合物被内吞。CD47被运输至内体/溶酶体并且被降解，从而耗竭CD47。细胞中的CD47被耗竭，从而消除细胞的免疫抑制或抗凋亡信号。CD47的耗竭抑制癌细胞对宿主免疫反应的逃避，并且允许对各种促细胞凋亡信号作出反应，所述促凋亡信号增加免疫细胞对癌细胞的攻击或细胞凋亡，从而治疗癌症。

将使用靶向并耗竭CD47的选择性耗竭复合物治疗第一受试者的癌症与通过施用结合CD47的抗体治疗第二受试者的癌症进行比较。所述抗体结合所有表达CD47的细胞，包括红细胞。用抗CD47抗体治疗的第二受试者中的衰老红细胞也显示促凋亡信号，因此一旦CD47从衰老红细胞表面耗竭，免疫系统就会靶向并除去衰老红细胞，并且第二受试者的红细胞耗竭并变得贫血。由于选择性耗竭复合物不与红细胞结合，因此第一受试者的红细胞上的CD47没有减少。因此，用此实施例的选择性耗竭复合物治疗的第一受试者没有发生贫血。

实施例33

通过选择性地耗竭CD39来治疗癌症

此实施例描述通过选择性地耗竭CD39来治疗癌症。CD39是将ATP降解为AMP的一种细胞表面胞外酶；CD73然后将AMP加工成免疫抑制性的腺苷，而ATP可活化巨噬细胞以分泌IL-1β和I L-18，从而活化T细胞。将含有TfR结合肽和CD39结合肽的选择性耗竭复合物(SDC)施用于患有CD39阳性癌症的受试者。SDC导致从细胞表面除去CD39。细胞中的CD39被耗竭，从而抑制ATP向AMP的转化。与用SDC治疗之前的肿瘤微环境相比，所得的肿瘤微环境含有更多的ATP和更少的腺苷。肿瘤微环境变得更加炎症性和更少免疫抑制，从而导致免疫系统对癌细胞的靶向增强和细胞凋亡，从而治疗癌症。SDC导致CD39从细胞表面除去的速率比CD39的再生速率快得多，导致CD39的耗竭延长和ATP加工成腺苷的持续减少。

将使用靶向并耗竭CD39的选择性耗竭复合物治疗第一受试者的癌症与通过施用结合CD39的抗体治疗第二受试者的癌症进行比较。第二受试者的循环中的抗体浓度随给药间隔而变化，使得CD39不会一直被抗体完全占据。由于第二受试者中CD39酶的恒定活性，所以与用SDC治疗的第一受试者相比，第二受试者中抗CD39抗体对CD39的低占据导致第二个受试者中较少的腺苷耗竭。所述抗体还与第二名受试者的红细胞上的CD39结合，从而导致贫血。SDC不会耗竭第一受试者的红细胞中的CD39，因为成熟红细胞不表达TfR。结果，第一受试者的红细胞上的CD39没有减少。因此，用此实施例的选择性耗竭复合物治疗的第一受试者没有发生贫血。

实施例34

通过PD-L1介导的内吞作用选择性耗竭可溶性靶标分子

此实施例描述通过PD-L1介导的内吞作用选择性耗竭可溶性靶标分子。将含有与靶标结合肽缀合的在内体pH下具有PD-L1结合的PD-L1结合肽(例如，SEQ ID NO:187、SEQID NO:236、SEQ ID NO:400或SEQ ID NO:401中的任一个)的选择性耗竭复合物(SDC)与表达PD-L1的细胞接触。PD-L1结合肽在生理细胞外pH(诸如pH 7.4)和内体pH(诸如pH 5.5)下均结合PD-L1，并且靶标结合肽在生理细胞外pH下以较高亲和力并在内体pH下以较低亲和力结合至可溶性靶标分子。接触后，PD-L1结合肽结合至细胞表面上的PD-L1，并且靶标结合肽结合至溶液中的可溶性靶标分子。PD-L1结合SDC经历与图12A中所示相同的再循环过程，其中“TfR结合CDP(非pH依赖性)”和“TfR(再循环)”分别被“PD-L1结合CDP(非pH依赖性)”和“PD-L1(再循环)”取代。SDC结合至可溶性靶标分子，如图12A(1)中所示。由SDC、PD-L1和靶标分子形成的复合物通过PD-L1介导的内吞作用而被内吞，如图12A(2)中所示。随着内体区室酸化，靶标分子从靶标结合肽释放，如图12A(3)中所示。靶标分子然后在溶酶体区室中降解，如图12A(4)中所示，并且复合物与PD-L1一起再循环至细胞表面，如图12A(5)中所示。

实施例35

通过PD-L1介导的内吞作用选择性耗竭表面靶标分子

此实施例描述通过PD-L1介导的内吞作用选择性耗竭表面靶标分子。将含有与靶标结合肽缀合的在内体pH下具有PD-L1结合的PD-L1结合肽(例如，SEQ ID NO:187、SEQ IDNO:235–SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:400或SEQ ID NO:401中的任一个)的选择性耗竭复合物(SDC)与表达PD-L1的细胞接触。PD-L1结合肽在生理细胞外pH(诸如在pH 7.4)和内体pH(诸如在pH 5.5)下均结合PD-L1，并且靶标结合肽在生理细胞外pH下以较高亲和力并在内体pH下以较低亲和力结合至表面靶标分子。接触后，PD-L1结合肽结合至细胞表面上的PD-L1，并且靶标结合肽结合至细胞表面上的靶标分子。PD-L1结合SDC经历与图12B中所示相同的再循环过程，其中“TfR结合CDP(非pH依赖性)”和“TfR(再循环)”分别被“PD-L1结合CDP(非pH依赖性)”和“PD-L1(再循环)”取代。SDC结合至细胞表面靶标分子，如图12B(1)中所示。由SDC、PD-L1和靶标分子形成的复合物通过PD-L1介导的内吞作用而被内吞，如图12B(2)中所示。随着内体区室酸化，靶标分子从靶标结合肽释放，如图12B(3)中所示。靶标分子然后在溶酶体区室中降解，如图12B(4)中所示，并且复合物与PD-L1一起再循环至细胞表面，如图12B(5)中所示。

实施例36

使用PD-L1结合选择性耗竭复合物选择性耗竭HLA-G

此实施例描述使用结合PD-L1的选择性耗竭复合物来选择性耗竭HLA-G。构建了含有PD-L1结合肽和HLA-G结合肽的选择性耗竭复合物(SDC)。任选地，PD-L1结合肽(诸如SEQID NO:187、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:400或SEQ ID NO:401的PD-L1结合肽)在细胞外和内体pH下均结合PD-L1，并且HLA-G结合肽在细胞外pH下以高亲和力并且在内体pH下以较低亲和力结合HLA-G。可替代地，PD-L1结合肽(诸如SEQ ID NO:233或SEQ ID NO:234的PD-L1结合肽)在细胞外pH下结合PD-L1，并且在内体pH下以较低亲和力结合PD-L1，并且HLA-G结合肽在细胞外和内体pH下均以高亲和力结合HLA-G。将此实施例的SDC与癌细胞接触。SDC结合癌细胞表面上表达的PD-L1和HLA-G，从而形成三元复合物。SDC与PD-L1和HLA-G一起被内吞。如果HLA-G结合肽在细胞外pH下以高亲和力并且在内体pH下以较低亲和力结合HLA-G，则SDC在内体酸化后释放HLA-G，并且使HLA-G靶向内体/溶酶体系统进行降解。如果PD-L1结合肽在细胞外和内体pH下均以高亲和力结合PD-L1，则SDC再循环回到细胞表面，在细胞表面它可结合另一个HLA-G进行降解。如果PD-L1结合肽在细胞外pH下以高亲和力并且在内体pH下以较低亲和力结合PD-L1，则SDC在内体酸化后释放PD-L1，并且HLA-G和SDC可被运输至内体/溶酶体系统。PD-L1可再循环回到细胞表面。

实施例37

高亲和力PD-L1结合胱氨酸密集肽的结构

此实施例描述高亲和力PD-L1结合胱氨酸密集肽的结构。将PD-L1结合CDP(SEQ IDNO:187)与PD-L1共结晶以确认CDP结合位点并可视化与PD-L1的表面相互作用，如图26A所示。SEQ ID NO:187(一种消除在亲和力成熟过程中获得的典型N连接糖苷的变体)如实施例1中所述作为可溶性分子产生，并与PD-L1共结晶。CDP的一部分(从A19到Q35)在结构中未解析。进行富集分析以确定在晶体结构中解析的残基相对于在晶体结构中未解析的残基的氨基酸取代的影响。未解析残基的平均SSM富集得分与所解析残基情况下所见的相比不那么极端(与0偏离更小)，如图26B中所示，显示未解析残基的特定侧链身份对于高亲和力结合不太重要。确实解析的部分与从E1到C18以及从D38到A48的模型相匹配。K36和F37解析但不是D38-A48螺旋的一部分。

如通过P I SA(PDBe P I SA v1.52)所评估，解析部分具有的界面表面积，其与观察到的PD-L1与PD-1的界面表面积(/>PDB 4ZQK)相似。CDP在PD-L1上的位置恰好落在PD-1占用空间内，如图26C中所示，显示计算机低分辨率对接富集预测这种命中的界面。仔细查看图26D和图26G中所示的界面，揭示CDP使用许多与PD-1相同的相互作用位点。SEQ ID NO:187的K5和PD-1的K78两者均与PD-L1的A121主链氧形成盐桥，而SEQ ID NO:187的D44和PD-1的E136两者类似地与PD-L1的Y123形成盐桥。SEQ ID NO:187的F40位于由PD-L1的Y56、R113、M115和Y123形成的口袋中，从而形成疏水接触(M115)、人字环堆积相互作用(两个Y)和阳离子-π相互作用(R113)。这个口袋也被PD-1的I 134占据。此外，SEQ IDNO:187的V9、W12和L43还分别共享PD-1的L128、A132和I 126所使用的疏水相互作用位点。将SEQ ID NO:187与其亲本支架区分开来的界面相邻突变预期将在回复至亲本侧链时破坏结合，如图26E中所示。M13和L43两者与PD-L1表面的疏水相互作用将在亲本A13和V43中丢失；F40所占据的口袋将不得不变形以容纳亲本W40，从而改变其他地方的界面；并且亲本F39不像V39那样整齐地贴合表面。最后，对PD-L1表面上的人/小鼠和人/食蟹猴(cyno)同源性的分析揭示，相互作用位含有人与小鼠之间的若干非同源侧链，如图26F中所示。

尽管本文已显示和描述本发明的优选实施方案，但将为本领域技术人员显而易知的是此类实施方案仅通过举例方式来提供。在不脱离本发明的情况下，众多改变、变化和替代现将为本领域技术人员所想到。应该理解的是，在此说明的本发明的实施例的不同替代方案可以用于实施本发明。意图以下权利要求限定本发明的范围，并且在这些权利要求的范围内的方法和结构以及它们的等同物由所述权利要求涵盖。

Claims

1.一种肽复合物，所述肽复合物包含：

(a)细胞受体结合肽；和

(b)与所述细胞受体结合肽复合的靶标结合肽，其中(i)所述靶标结合肽被工程化为在内体中对靶标具有比在细胞外环境中更低的亲和力，(ii)所述细胞受体结合肽被工程化为在内体中对细胞受体具有比在细胞外环境中更低的亲和力，或(i)和(ii)两者。

2.如权利要求1所述的肽复合物，其中所述靶标结合肽对所述靶标的所述亲和力、所述细胞受体结合肽对所述细胞受体的所述亲和力或两者是pH依赖性的。

3.如权利要求1或权利要求2所述的肽复合物，其中所述靶标结合肽对所述靶标的所述亲和力、所述细胞受体结合肽对所述细胞受体的所述亲和力或两者是离子强度依赖性的。

4.一种肽复合物，所述肽复合物包含：

(a)细胞受体结合肽；和

(b)与所述细胞受体结合肽复合的靶标结合肽，其中(i)所述靶标结合肽对靶标的亲和力是pH依赖性的，(ii)所述细胞受体结合肽对细胞受体的亲和力是pH依赖性的，或(i)和(ii)两者。

5.如权利要求1-4中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽是转铁蛋白受体结合肽或PD-L1结合肽。

6.如权利要求1-5中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽是转铁蛋白受体结合肽。

7.如权利要求1-5中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽是PD-L1结合肽。

8.如权利要求1-7中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体是转铁蛋白受体或PD-L1。

9.如权利要求1-8中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体是转铁蛋白受体。

10.如权利要求1-8中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体是PD-L1。

11.如权利要求1-10中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽在pH 4.5至pH 7.4、pH 5.5至pH 7.4或pH 6.5至pH 7.4的pH下与所述细胞受体结合。

12.如权利要求1-11中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽能够在pH7.4下以不超过100nM、不超过20nM、不超过10nM、不超过5nM、不超过2nM、不超过1nM、不超过0.5nM、不超过0.4nM、不超过0.3nM、不超过0.2nM或不超过0.1nM的解离常数(K_D)结合所述细胞受体。

13.如权利要求1-12中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽能够在pH5.5下以不超过100nM、不超过20nM、不超过10nM、不超过5nM、不超过2nM、不超过1nM、不超过0.5nM、不超过0.4nM、不超过0.3nM、不超过0.2nM或不超过0.1nM的解离常数(K_D)结合所述细胞受体。

14.如权利要求1-13中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体对所述细胞受体的所述亲和力是非pH依赖性的。

15.如权利要求1-14中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽在pH 7.4下和在pH 5.5下对所述细胞受体的所述亲和力相差不超过2倍、不超过5倍、不超过10倍、不超过15倍、不超过20倍、不超过25倍、不超过30倍、不超过40倍或不超过50倍。

16.如权利要求1-10中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽对所述细胞受体的所述亲和力是pH依赖性的。

17.如权利要求16所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽对所述细胞受体的所述亲和力随着pH降低而降低。

18.如权利要求16或权利要求17所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽对所述细胞受体的所述亲和力在pH 7.4下比在pH 5.5下更高。

19.如权利要求1-18中任一项所述的肽复合物，其中所述靶标结合肽对所述靶标的所述亲和力是pH依赖性的。

20.如权利要求1-19中任一项所述的肽复合物，其中所述靶标结合肽对所述靶标的所述亲和力随着pH降低而降低。

21.如权利要求1-20中任一项所述的肽复合物，其中所述靶标结合肽对所述靶标的所述亲和力在较高pH下比在较低pH下更高。

22.如权利要求21所述的肽复合物，其中所述较高pH是pH 7.4、pH 7.2、pH 7.0或pH6.8。

23.如权利要求21或权利要求22所述的肽复合物，其中所述较低pH是pH 6.5、pH 6.0、pH 5.5、pH 5.0或pH 4.5。

24.如权利要求1-23中任一项所述的肽复合物，其中所述靶标结合肽对所述靶标的所述亲和力在pH 7.4下比在pH 6.0下更高。

25.如权利要求1-24中任一项所述的肽复合物，其中所述靶标结合肽对所述靶标的所述亲和力在pH 7.4下比在pH 5.5下更高。

26.如权利要求1-25中任一项所述的肽复合物，其中所述靶标结合肽能够在pH 7.4下以不超过100nM、不超过20nM、不超过10nM、不超过5nM、不超过2nM、不超过1nM、不超过0.5nM、不超过0.4nM、不超过0.3nM、不超过0.2nM、不超过1nM或不超过0.1nM的解离常数(K_D)结合所述靶标分子。

27.如权利要求1-26中任一项所述的肽复合物，其中所述靶标结合肽能够在pH 5.5下以不小于1nM、不小于2nM、不小于5nM、不小于10nM、不小于20nM、不小于50nM、不小于100nM、不小于200nM或不小于500nM的解离常数(K_D)结合所述靶标分子。

28.如权利要求1-27中任一项所述的肽复合物，其中所述靶标结合肽在pH 7.4下对所述靶标的所述亲和力是所述靶标结合肽在pH5.5下对所述靶标的所述亲和力的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍或至少20倍。

29.如权利要求1-28中任一项所述的肽复合物，其中所述靶标结合肽包含一个或多个组氨酸氨基酸残基。

30.如权利要求1-29中任一项所述的肽复合物，其中所述靶标结合肽对所述靶标的所述亲和力随着离子强度增加而降低。

31.如权利要求1-30中任一项所述的肽复合物，其中所述靶标结合肽包含一个或多个能够与所述靶标分子形成极性或电荷-电荷相互作用的极性或带电氨基酸残基。

32.如权利要求1-31中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽缀合至所述靶标结合肽。

33.如权利要求1-32中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽和所述靶标结合肽形成单一多肽链。

34.如权利要求1-32中任一项所述的肽复合物，其中所述肽复合物包含经由二聚化结构域二聚化的二聚体。

35.如权利要求34所述的肽复合物，其中所述二聚化结构域包含Fc结构域。

36.如权利要求34所述的肽复合物，其中所述二聚体是经由同二聚化结构域二聚化的同二聚体。

37.如权利要求36所述的肽复合物，其中所述同二聚化结构域包含与SEQ ID NO:245–SEQ ID NO:259中的任一个具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。

38.如权利要求34所述的肽复合物，其中所述二聚体是经由第一异二聚化结构域和第二异二聚化结构域二聚化的异二聚体。

39.如权利要求38所述的肽复合物，其中所述第一异二聚化结构域包含与SEQ ID NO:260、SEQ ID NO:262、SEQ ID NO:264、SEQ ID NO:266、SEQ ID NO:268、SEQ ID NO:270、SEQID NO:272、SEQ ID NO:274、SEQ ID NO:276、SEQ ID NO:278、SEQ ID NO:280、SEQ ID NO:282、SEQ ID NO:284或SEQ ID NO:286中的任一个具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。

40.如权利要求38或权利要求39所述的肽复合物，其中所述第二异二聚化结构域包含与SEQ ID NO:261、SEQ ID NO:263、SEQ ID NO:265、SEQ ID NO:267、SEQ ID NO:269、SEQID NO:271、SEQ ID NO:273、SEQ ID NO:275、SEQ ID NO:277、SEQ ID NO:279、SEQ ID NO:281、SEQ ID NO:283、SEQ ID NO:285或SEQ ID NO:287中的任一个具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。

41.如权利要求34-40中任一项所述的肽复合物，其中所述靶标结合肽经由肽接头连接至所述二聚化结构域。

42.如权利要求34-41中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽经由肽接头连接至所述二聚化结构域。

43.如权利要求1-42中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽经由肽接头连接至所述靶标结合肽。

44.如权利要求43所述的肽复合物，其中所述肽接头具有1至50个氨基酸残基、2至40个氨基酸残基、3至20个氨基酸残基或3至10个氨基酸残基的长度。

45.如权利要求42-44中任一项所述的肽复合物，其中所述肽接头包含甘氨酸和丝氨酸氨基酸。

46.如权利要求42-45中任一项所述的肽复合物，其中所述肽接头具有不超过不超过/>不超过/>不超过/>不超过/>不超过/>不超过/>不超过不超过/>或不超过/>的持久长度。

47.如权利要求42-46中任一项所述的肽复合物，其中所述肽接头源自免疫球蛋白肽。

48.如权利要求42-46中任一项所述的肽复合物，其中所述肽接头源自双结毒素肽。

49.如权利要求42-48中任一项所述的肽复合物，其中所述肽接头包含SEQ ID NO:129–SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:195–SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:223–SEQ ID NO:227或SEQ IDNO:391中的任一个的序列。

50.如权利要求1-49中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽、所述靶标结合肽或两者包含小蛋白、纳米抗体、抗体、抗体片段、scFv、DARPin或亲和体。

51.如权利要求50所述的肽复合物，其中所述抗体包含IgG，或者其中所述抗体片段包含Fab、F(ab)2、scFv或(scFv)2。

52.如权利要求51所述的肽复合物，其中所述小蛋白包含胱氨酸密集肽、affitin、adnectin、avimer、Kunitz结构域、nanofittin、fynomer、双环肽、β-发夹或钉合肽。

53.如权利要求1-52中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽包含至少一个二硫键、至少两个二硫键、至少三个二硫键或至少四个二硫键。

54.如权利要求1-53中任一项所述的肽复合物，其中所述靶标结合肽包含至少一个二硫键、至少两个二硫键、至少三个二硫键或至少四个二硫键。

55.如权利要求1-54中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽包含至少六个半胱氨酸残基。

56.如权利要求55所述的肽复合物，其中所述至少六个半胱氨酸残基位于所述细胞受体结合肽的氨基酸位置4、8、18、32、42和46处。

57.如权利要求55或权利要求56所述的肽复合物，其中所述至少六个半胱氨酸残基形成至少三个二硫键。

58.如权利要求1-57中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽包含SEQ IDNO:148–SEQ ID NO:177中的任一个的序列。

59.如权利要求1-58中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽包含与SEQID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性或与SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个的片段具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。

60.如权利要求1-59中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽包含与SEQID NO:96具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性或与SEQ ID NO:96的片段具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。

61.如权利要求1-60中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽包含SEQ IDNO:96的序列。

62.如权利要求1-57中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽包含SEQ IDNO:392–SEQ ID NO:399中的任一个的序列。

63.如权利要求1-57或权利要求62中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽包含与SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:233–SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:400–SEQ ID NO:456或SEQ ID NO:241中的任一个具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性或与SEQ ID NO:187、SEQ IDNO:233–SEQ ID NO:239、SEQ IDNO:400–SEQ ID NO:456或SEQ ID NO:241中的任一个的片段具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。

64.如权利要求62或权利要求63所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽包含与SEQID NO:187、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:400或SEQ ID NO:401具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性或与SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:400或SEQ ID NO:401的片段具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。

65.如权利要求62-64中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽包含SEQ IDNO:187、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:400或SEQ ID NO:401的序列。

66.如权利要求59-65中任一项所述的肽复合物，其中所述片段包含至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49或至少50个氨基酸残基。

67.如权利要求1-66中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽在细胞受体结合界面处包含一个或多个组氨酸残基。

68.如权利要求1-67中任一项所述的肽复合物，其中所述靶标结合肽在靶标结合界面处包含一个或多个组氨酸残基。

69.如权利要求1-68中任一项所述的肽复合物，其中所述靶标结合肽是PD-L1结合肽、EGFR结合肽或TNFα结合肽。

70.如权利要求69所述的肽复合物，其中所述PD-L1结合肽包含与SEQ ID NO:233、SEQID NO:234、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:235–SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:400–SEQ ID NO:456或SEQ ID NO:240中的任一个具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。

71.如权利要求69所述的肽复合物，其中所述EGFR结合肽结合EGFR变体I I I或酪氨酸激酶抑制剂抗性EGFR。

72.如权利要求69或权利要求71所述的肽复合物，其中所述EGFR结合肽包含与SEQ IDNO:243、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:219或SEQ ID NO:242具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。

73.如权利要求72所述的肽复合物，其中所述EGFR结合肽包含SEQ ID NO:242的序列。

74.如权利要求72或权利要求73所述的肽复合物，其中所述EGFR结合肽包含SEQ IDNO:243的序列。

75.如权利要求1-74中任一项所述的肽复合物，其中所述靶标是细胞表面分子、生长因子受体、分泌肽、分泌蛋白、循环分子、细胞信号传导分子、细胞外基质大分子、神经递质、细胞因子、生长因子、肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原或激素、检查点抑制剂、免疫检查点抑制剂、抑制性免疫受体、抑制性免疫受体的配体、巨噬细胞表面蛋白、脂多糖、抗体、抑制性免疫受体、肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原或自身抗体。

76.如权利要求1-75中任一项所述的肽复合物，其中所述靶标是胶原蛋白、弹性蛋白、微原纤维蛋白、蛋白聚糖、CD200R、CD300a、CD300f、CEACAM1、FcgRiib、ILT-2、ILT-3、ILT-4、ILT-5、LAIR-1、PECAM-1、PILR-α、SIRL-1和SIRP-α、CLEC4A、Ly49Q、MIC、CD3、CD47、CD28、CD137、CD89、CD14、CD16、CD29、CD44、CD71、CD73、CD90、CD105、CD166、CD27、CD39、CD24、CD25、CD74、CD40L、MUC1、MUC16、MUC2、MUC5AC、MUC4、OX40、4-1BB、HLA-G、LAG3、Tim3、TIGIT、GITR、TCR、TNF-α、EGFR、EGFRvIII、TKI抗性EGFR、HER2、ERBB3、PDGFR、FGF、VEGF、VEGFR、IGFR1、CTLA4、STRO1、补体因子C4、补体因子C1q、补体因子C1s、补体因子C1r、补体因子C3、补体因子C3a、补体因子C3b、补体因子C5、补体因子C5a、TGFβ、PCSK9、P2Y6、HER3、RANK、tau、淀粉样蛋白β、亨廷顿蛋白、α-突触核蛋白、葡糖脑苷脂酶、α-葡糖苷酶、IL-1、IL-1R、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-10、IL-10R、IL-17、IL-23、IL-12、p40、B7家族的成员、c-Met、SIGLEC、MCP-1、MHC、MHC I、MHC II、PD-1或PD-L1。

77.如权利要求1-76中任一项所述的肽复合物，其中所述靶标是PD-L1、EGFR或TNFα。

78.如权利要求1-77中任一项所述的肽复合物，所述肽复合物包含序列，所述序列：

(a)与SEQ ID NO:288–SEQ ID NO:313或SEQ ID NO:315–SEQ ID NO:346中的任一个具有至少80％、至少90％、至少92％至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；或

(b)与SEQ ID NO:347、SEQ ID NO:348、SEQ ID NO:351、SEQ ID NO:352、SEQ ID NO:355、SEQ ID NO:356、SEQ ID NO:358、SEQ ID NO:359、SEQ ID NO:360、SEQ ID NO:361、SEQID NO:362、SEQ ID NO:363、SEQ ID NO:364、SEQ ID NO:365、SEQ ID NO:371、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:376、SEQ ID NO:378、SEQ ID NO:382、SEQ ID NO:384、SEQ ID NO:387或SEQ ID NO:389中的任一个具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。

79.如权利要求1-78中任一项所述的肽复合物，所述肽复合物包含以下各项的序列：

(a)SEQ ID NO:288、SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:307、SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:327、SEQ ID NO:328、SEQ ID NO:332、SEQ ID NO:333、SEQ ID NO:337、SEQ ID NO:338、SEQ IDNO:342或SEQ ID NO:343；

(b)与SEQ ID NO:302、SEQ ID NO:305、SEQ ID NO:339、SEQ ID NO:340、SEQ ID NO:344或SEQ ID NO:345异二聚化的SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:293、SEQ ID NO:310、SEQ IDNO:315或SEQ ID NO:316；

(c)与SEQ ID NO:302、SEQ ID NO:339或SEQ ID NO:344异二聚化的SEQ ID NO:296；SEQ ID NO:298；

(d)与SEQ ID NO:301异二聚化的SEQ ID NO:299；

(e)与SEQ ID NO:330或SEQ ID NO:335异二聚化的SEQ ID NO:331或SEQ ID NO:336；或

(f)与SEQ ID NO:329、SEQ ID NO:330、SEQ ID NO:334或SEQ ID NO:335异二聚化的SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:315或SEQ ID NO:316。

80.如权利要求1-78中任一项所述的肽复合物，所述肽复合物包含以下各项的序列：

(a)SEQ ID NO:290、SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:308、SEQ ID NO:317、SEQ ID NO:318、SEQ ID NO:322或SEQ ID NO:323；

(b)与SEQ ID NO:304、SEQ ID NO:306、SEQ ID NO:319、SEQ ID NO:320、SEQ ID NO:321、SEQ ID NO:324或SEQ ID NO:325异二聚化的SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:294、SEQ IDNO:315、SEQ ID NO:316；

(c)与SEQ ID NO:304、SEQ ID NO:319、SEQ ID NO:321或SEQ ID NO:324异二聚化的SEQ ID NO:295或SEQ ID NO:297；

(d)与SEQ ID NO:303异二聚化的SEQ ID NO:298或SEQ ID NO:300；或

(e)与SEQ ID NO:306、SEQ ID NO:311、SEQ ID NO:320或SEQ ID NO:325异二聚化的SEQ ID NO:326。

81.如权利要求1-80中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽从所述细胞受体的解离速率慢于所述细胞受体的再循环速率。

82.如权利要求1-81中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽从所述细胞受体的解离速率不快于1分钟、不快于2分钟、不快于3分钟、不快于4分钟、不快于5分钟、不快于7分钟、不快于10分钟、不快于15分钟或不快于20分钟。

83.如权利要求1-82中任一项所述的肽复合物，其中所述肽复合物能够经由受体介导的内吞作用被内吞。

84.如权利要求83所述的肽复合物，其中所述受体介导的内吞作用是转铁蛋白受体介导的内吞作用。

85.如权利要求1-84中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽在胞吞泡内保持与所述细胞受体结合。

86.如权利要求1-85中任一项所述的肽复合物，其中当所述细胞受体结合肽与所述细胞受体结合并且使所述细胞受体再循环时，所述肽复合物进行再循环。

87.如权利要求1-86中任一项所述的肽复合物，其中当所述肽复合物经由受体介导的内吞作用被内吞时，所述靶标从所述靶标结合肽释放或解离。

88.如权利要求1-87中任一项所述的肽复合物，其中所述靶标是细胞外蛋白、循环蛋白或可溶性蛋白。

89.如权利要求1-87中任一项所述的肽复合物，其中所述靶标是细胞表面蛋白。

90.如权利要求1-87中任一项所述的肽复合物，其中所述靶标是跨膜蛋白。

91.如权利要求1-90中任一项所述的肽复合物，所述肽复合物还包含第二靶标结合肽。

92.如权利要求91所述的肽复合物，其中所述第二靶标结合肽结合第二靶标。

93.如权利要求92所述的肽复合物，其中所述靶标和所述第二靶标在与所述靶标结合肽和所述第二靶标结合肽结合时形成二聚体。

94.如权利要求93所述的肽复合物，其中所述靶标和所述第二靶标的二聚化增加所述靶标和所述第二靶标的内吞作用速率。

95.如权利要求92-94中任一项所述的肽复合物，其中所述第二靶标与所述靶标相同。

96.如权利要求1-95中任一项所述的肽复合物，所述肽复合物还包含与所述细胞受体结合肽、所述靶标结合肽或两者偶联的半衰期调节剂。

97.如权利要求96所述的肽复合物，其中所述半衰期调节剂是聚合物；聚乙二醇(PEG)；羟乙基淀粉；聚乙烯醇；水溶性聚合物；两性离子水溶性聚合物；水溶性聚(氨基酸)；脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸的水溶性聚合物；含有甘氨酸、谷氨酸和丝氨酸的水溶性聚合物；Fc区；脂肪酸；棕榈酸；或结合至白蛋白的分子。

98.如权利要求97所述的肽复合物，其中所述结合至白蛋白的分子是血清白蛋白结合肽。

99.如权利要求98所述的肽复合物，其中所述血清白蛋白结合肽包含SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:179或SEQ ID NO:193中的任一个的序列。

100.如权利要求1-99中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽、所述靶标结合肽或两者是重组表达的。

101.如权利要求1-100中任一项所述的肽复合物，其中所述靶标结合肽被配置为在pH6.5、pH 6.0、pH 5.5、pH 5.0或pH 4.5下与所述靶标解离。

102.如权利要求1-101中任一项所述的肽复合物，其中所述细胞受体结合肽被配置为在pH 6.5、pH 6.0、pH 5.5、pH 5.0或pH 4.5下与所述细胞受体解离。

103.一种选择性地耗竭靶标分子的方法，所述方法包括：

(a)使包含细胞受体结合肽和与所述细胞受体结合肽复合的靶标结合肽的肽复合物与表达细胞受体的细胞接触；

(b)在细胞外条件下使所述靶标结合肽与所述靶标分子结合；

(c)在细胞外条件下使所述细胞受体结合肽与所述细胞受体结合；

(d)内吞所述肽复合物、所述靶标分子和所述细胞受体；

(e)在内体条件下使所述靶标结合肽与所述靶标分子解结合、使所述细胞受体结合肽与所述细胞受体解结合或两者；以及

(f)降解所述靶标分子，从而耗竭所述靶标分子。

104.一种选择性地耗竭靶标分子的方法，所述方法包括：

(a)使如权利要求1-102中任一项所述的肽复合物与表达细胞受体的细胞接触；

(b)在细胞外条件下使所述靶标结合肽与所述靶标分子结合；

(d)将所述肽复合物、所述靶标分子和所述细胞受体内吞到内吞或溶酶体区室中；

(e)在内体条件下从所述靶标分子释放所述靶标结合肽、从所述细胞受体释放所述细胞受体结合肽或两者；以及

(f)降解所述靶标分子，从而耗竭所述靶标分子。

105.如权利要求103或权利要求104所述的方法，所述方法还包括使所述肽复合物和所述细胞受体再循环。

106.如权利要求103-105中任一项所述的方法，其中所述细胞受体是转铁蛋白受体或PD-L1，并且所述细胞受体结合肽是转铁蛋白受体结合肽或PD-L1结合肽。

107.如权利要求103-106中任一项所述的方法，其中所述细胞受体结合肽是转铁蛋白受体结合肽，并且所述细胞受体是转铁蛋白受体。

108.如权利要求103-107中任一项所述的方法，其中所述细胞受体结合肽是PD-L1结合肽，并且所述细胞受体是PD-L1。

109.如权利要求103-108中任一项所述的方法，其中所述内吞包括受体介导的内吞作用。

110.如权利要求109所述的方法，其中所述细胞受体结合肽在所述内吞或溶酶体区室中保持与所述细胞受体结合。

111.如权利要求110所述的方法，其中所述靶标分子在所述内吞或溶酶体区室中降解。

112.如权利要求110或权利要求111所述的方法，其中所述受体介导的内吞作用是转铁蛋白受体介导的内吞作用。

113.如权利要求103-112中任一项所述的方法，其中所述靶标分子是细胞外蛋白、循环蛋白或可溶性蛋白。

114.如权利要求103-112中任一项所述的方法，其中所述靶标分子是细胞表面蛋白。

115.如权利要求103-112中任一项所述的方法，其中所述靶标分子是跨膜蛋白。

116.如权利要求103-115中任一项所述的方法，所述方法包括用所述肽复合物穿透包含血脑屏障(BBB)的细胞层。

117.如权利要求116所述的方法，其中所述靶标分子在中枢神经系统中降解。

118.如权利要求103-117中任一项所述的方法，其中所述细胞表达所述细胞受体。

119.如权利要求103-118中任一项所述的方法，所述方法包括在所述细胞外条件下使所述细胞受体结合肽以不超过50μM、不超过5μM、不超过500nM、不超过100nM、不超过40nM、不超过30nM、不超过20nM、不超过10nM、不超过5nM、不超过2nM、不超过1nM、不超过0.5nM、不超过0.4nM、不超过0.3nM、不超过0.2nM或不超过0.1nM的解离常数(K_D)结合至所述细胞受体。

120.如权利要求103-119中任一项所述的方法，所述方法包括在所述内体条件下使所述细胞受体结合肽以不超过50μM、不超过5μM、不超过500nM、不超过100nM、不超过40nM、不超过30nM、不超过20nM、不超过10nM、不超过5nM、不超过2nM、不超过1nM、不超过0.5nM、不超过0.4nM、不超过0.3nM、不超过0.2nM或不超过0.1nM的解离常数(K_D)结合至所述细胞受体。

121.如权利要求103-120中任一项所述的方法，其中所述靶标结合肽在所述内吞区室中保持与所述靶标分子结合。

122.如权利要求103-121中任一项所述的方法，所述方法包括在所述细胞外条件下使所述靶标结合肽以不超过50μM、不超过5μM、不超过500nM、不超过100nM、不超过40nM、不超过30nM、不超过20nM、不超过10nM、不超过5nM、不超过2nM、不超过1nM、不超过0.5nM、不超过0.4nM、不超过0.3nM、不超过0.2nM或不超过0.1nM的解离常数(K_D)结合至所述靶标分子。

123.如权利要求103-122中任一项所述的方法，所述方法包括在所述内体条件下使所述靶标结合肽以不小于1nM、不小于2nM、不小于5nM、不小于10nM、不小于20nM、不小于50nM、不小于100nM、不小于200nM或不小于500nM的解离常数(K_D)结合至所述靶标分子。

124.如权利要求103-123中任一项所述的方法，所述方法包括与所述内体条件相比，在所述细胞外条件下使所述细胞受体结合肽以相差不超过2倍、不超过5倍、不超过10倍、不超过15倍、不超过20倍、不超过25倍、不超过30倍、不超过40倍或不超过50倍的亲和力结合至所述细胞受体。

125.如权利要求103-124中任一项所述的方法，所述方法包括在所述靶标结合肽与所述靶标分子之间形成一种或多种极性或电荷-电荷相互作用。

126.如权利要求103-125中任一项所述的方法，其中所述细胞受体结合肽包含与SEQID NO:96、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97–SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:220–SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:64中的任一个具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。

127.如权利要求103-126中任一项所述的方法，其中所述细胞受体结合肽包含与SEQID NO:96具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。

128.如权利要求103-127中任一项所述的方法，其中所述细胞受体结合肽包含SEQ IDNO:96的序列。

129.如权利要求103-128中任一项所述的方法，其中所述细胞受体结合肽包含SEQ IDNO:392–SEQ ID NO:399中的任一个的序列。

130.如权利要求103-125或权利要求129中任一项所述的方法，其中所述细胞受体结合肽包含与SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:233–SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:400–SEQ ID NO:456或SEQ ID NO:241中的任一个具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性或与SEQ ID NO:187、SEQ IDNO:233–SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:400–SEQ ID NO:456或SEQ ID NO:241中的任一个的片段具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。

131.如权利要求129或权利要求130所述的方法，其中所述细胞受体结合肽包含与SEQID NO:187、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:238或SEQ ID NO:239具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性或与SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:238或SEQ ID NO:239的片段具有至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。

132.如权利要求129-131中任一项所述的方法，其中所述细胞受体结合肽包含SEQ IDNO:187、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:238或SEQ ID NO:239的序列。

133.如权利要求103-132中任一项所述的方法，所述方法还包括使第二靶标分子与第二靶标结合肽结合。

134.如权利要求133所述的方法，其中所述靶标分子和所述第二靶标分子在与所述靶标结合肽和所述第二靶标结合肽结合时二聚化。

135.如权利要求134所述的方法，所述方法包括在所述靶标分子和所述第二靶标分子的二聚化后增加所述靶标分子和所述第二靶标分子的内吞作用速率。

136.如权利要求133-135中任一项所述的方法，其中所述第二靶标分子在所述靶标分子和所述第二靶标分子的内吞作用后降解。

137.如权利要求133-136中任一项所述的方法，其中所述第二靶标分子与所述靶标分子相同。

138.一种治疗受试者的疾病或疾患的方法，所述方法包括：

(a)向所述受试者施用肽复合物，所述肽复合物包含细胞受体结合肽和与所述细胞受体结合肽复合的靶标结合肽；

(b)在细胞外条件下使所述靶标结合肽与所述受试者的细胞上与所述疾病或疾患相关的靶标分子结合，所述细胞表达所述靶标分子和细胞受体；

(c)在细胞外条件下使所述细胞受体结合肽与所述受试者的所述细胞上的所述细胞受体结合；

(d)内吞所述肽复合物、所述靶标分子和所述细胞受体；

(f)降解所述靶标分子，从而治疗所述疾病或疾患。

139.一种治疗受试者的疾病或疾患的方法，所述方法包括：

(a)向所述受试者施用如权利要求1-102中任一项所述的肽复合物；

(d)内吞所述肽复合物、所述靶标分子和所述细胞受体；

(f)降解所述靶标分子，从而治疗所述疾病或疾患。

140.如权利要求138或权利要求139所述的方法，其中所述靶标分子是细胞表面分子、生长因子受体、分泌肽、分泌蛋白、循环分子、细胞信号传导分子、细胞外基质大分子、神经递质、细胞因子、生长因子、肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原或激素、检查点抑制剂、免疫检查点抑制剂、抑制性免疫受体、抑制性免疫受体的配体、巨噬细胞表面蛋白、脂多糖、抗体、抑制性免疫受体、肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原或自身抗体。

141.如权利要求138-140中任一项所述的方法，其中所述靶标分子是胶原蛋白、弹性蛋白、微原纤维蛋白、蛋白聚糖、CD200R、CD300a、CD300f、CEACAM1、FcgRiib、ILT-2、ILT-3、ILT-4、ILT-5、LAIR-1、PECAM-1、PILR-α、SIRL-1和SIRP-α、CLEC4A、Ly49Q、MIC、CD3、CD47、CD28、CD137、CD89、CD14、CD16、CD29、CD44、CD71、CD73、CD90、CD105、CD166、CD27、CD39、CD24、CD25、CD74、CD40L、MUC1、MUC16、MUC2、MUC5AC、MUC4、OX40、4-1BB、HLA-G、LAG3、Tim3、TIGIT、GITR、TCR、TNF-α、EGFR、EGFRvI I I、TKI抗性EGFR、HER2、ERBB3、PDGFR、FGF、VEGF、VEGFR、IGFR1、CTLA4、STRO1、补体因子C4、补体因子C1 q、补体因子C1 s、补体因子C1 r、补体因子C3、补体因子C3a、补体因子C3b、补体因子C5、补体因子C5a、TGFβ、PCSK9、P2Y6、HER3、RANK、tau、淀粉样蛋白β、亨廷顿蛋白、α-突触核蛋白、葡糖脑苷脂酶、α-葡糖苷酶、IL-1、IL-1R、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-10、IL-10R、IL-17、IL-23、IL-12、p40、B7家族的成员、c-Met、SIGLEC、MCP-1、MHC、MHC I、MHC II、PD-1或PD-L1。

142.如权利要求138-141中任一项所述的方法，其中所述靶标分子是受体酪氨酸激酶。

143.如权利要求142所述的方法，其中所述受体酪氨酸激酶是EGF受体、ErbB、胰岛素受体、PDGF受体、VEGF受体、FGF受体、CCK受体、NGF受体、HGF受体、Eph受体、AXL受体、TIE受体、RYK受体、DDR受体、RET受体、ROS受体、LTK受体、ROR受体、MuSK受体或LMR受体。

144.如权利要求142或权利要求143所述的方法，其中所述靶标分子是病原体或病原体表面分子。

145.如权利要求138-144中任一项所述的方法，其中所述疾病或疾患是癌症、神经变性疾病、溶酶体贮积病、炎症性疾病、自身免疫性疾病、神经炎症性疾病、免疫疾病或疼痛。

146.如权利要求145所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌、肝癌、结肠癌、脑癌、白血病、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤、血细胞源性癌症、肺癌、肉瘤、胃癌、胃肠癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、非小细胞肺癌、鳞状非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、血癌、皮肤癌、肝癌、肾癌或结肠直肠癌。

147.如权利要求145或权利要求146所述的方法，其中所述癌症是TKI耐药性的、西妥昔单抗耐药性的、耐昔妥珠单抗耐药性的或帕尼单抗耐药性的。

148.如权利要求145-147中任一项所述的方法，其中所述癌症是晚期癌症、转移性癌症、中枢神经系统中的转移性癌症、转移性乳腺癌、转移性皮肤癌、难治性癌症、KRAS野生型癌症、KRAS突变型癌症或外显子20突变型非小细胞肺癌。

149.如权利要求145-148中任一项所述的方法，其中所述靶标分子是HER2、EGFR、FGFR-1、PD-L1、VEGF、PD-1、CD38、GD2、SLAMF7、CTLA-4、CCR4、CD20、PDGFRɑ、VEGFR2、CD33、CD30、CD22、CD79B、粘连蛋白-4或TROP2。

150.如权利要求149所述的方法，其中所述靶标分子是EGFR或PD-L1。

151.如权利要求145-150中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用额外疗法。

152.如权利要求151所述的方法，其中所述额外疗法包括放射、化学疗法、铂疗法或抗代谢疗法。

153.如权利要求151或权利要求152所述的方法，其中所述额外疗法包括氟尿嘧啶、FOLFIRI、伊立替康、FOLFOX、吉西他滨或顺铂。

154.如权利要求145所述的方法，其中所述神经变性疾病是阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化症、弗里德赖希氏共济失调、亨廷顿氏病、帕金森氏病或脊髓性肌萎缩。

155.如权利要求145或权利要求154所述的方法，其中所述靶标分子是tau、淀粉样蛋白β、亨廷顿蛋白或α-突触核蛋白。

156.如权利要求155所述的方法，其中所述溶酶体贮积病是戈谢病或庞贝病。

157.如权利要求145或权利要求156所述的方法，其中所述靶标分子是葡糖脑苷脂酶或α-葡糖苷酶。

158.如权利要求145所述的方法，其中所述炎症性疾病是类风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化症、肾小球肾炎、狼疮、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、皮肤血管炎、神经炎症性疾病、炎症相关的神经变性、阿尔茨海默氏病、中风、创伤性脑损伤、斯耶格伦氏病或囊性纤维化。

159.如权利要求145或权利要求158所述的方法，其中所述靶标分子是载脂蛋白E4、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-7、IL-12或IL-23。

160.如权利要求159所述的方法，其中所述靶标分子是TNF-α。

161.如权利要求103-160中任一项所述的方法，其中所述细胞是癌细胞、免疫细胞、中枢神经系统细胞、神经元细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞或嗜酸性粒细胞。

162.如权利要求103-161中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述选择性耗竭复合物、所述靶标分子与所述细胞受体之间形成三元复合物。

163.如权利要求162所述的方法，其中所述三元复合物的形成增加所述细胞受体、所述靶标分子或两者的再循环或周转。

164.如权利要求162或权利要求163所述的方法，其中所述三元复合物的形成增加所述靶标分子与所述细胞受体的结合。