JP2023551481A

JP2023551481A - 標的分子の選択的枯渇のための組成物及び方法

Info

Publication number: JP2023551481A
Application number: JP2023532341A
Authority: JP
Inventors: ザッカリークルック，; ジェイムズオルソン，; ローランドケー．ストロング，; ナタリーウィンブレードネアーン，; スティーブンタプスコット，; ケネスグラブスタイン，
Original assignee: フレッドハッチンソンキャンサーセンター; ブレイズバイオサイエンス，インコーポレイテッド
Priority date: 2020-11-30
Filing date: 2021-11-29
Publication date: 2023-12-08
Also published as: IL303152A; EP4251130A1; CA3195315A1; CN117279618A; AU2021386254A1; WO2022115715A1

Abstract

本明細書に記載されるのは、標的のエンドサイトーシス及び細胞分解を誘発するために、再循環可能なＣＤＰ受容体結合媒介複合体を使用して標的分子を選択的に枯渇させるための組成物及び方法である。トランスフェリン受容体に結合するＣＤＰペプチドなどのペプチドを含む例示的な組成物は、標的分子に結合するペプチドに連結させることができる。このような組成物を使用して、組成物及び結合した標的分子のトランスフェリン受容体媒介エンドサイトーシスを介して標的分子をエンドソームに選択的に動員することができる。エンドソーム内に入ると、標的分子に対する組成物のｐＨ依存性結合により、酸性ｐＨが組成物からの標的分子の放出を引き起こし得、トランスフェリン受容体部分は「リロード」のために細胞表面に再循環される。次に、標的分子はリソソームに輸送され得、そこで分解される。【選択図】図１２Ａ

Description

本出願は、２０２０年１１月３０日に出願された「標的分子の選択的枯渇のための組成物及び方法」という名称の米国仮出願第６３／１１９，１９５号の権益を主張し、その出願は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２１年１１月２４日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、１０８４０６－７０２５３１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、６６５，９９５バイトのサイズである。

可溶性タンパク質及び細胞表面タンパク質の蓄積または過剰発現は、神経変性疾患からがんに至るまで、さまざまなヒト疾患で示されている。さらに、多くの疾患は、構成的活性、治療に対する抵抗性、またはドミナントネガティブ活性をもたらす可溶性タンパク質または細胞表面タンパク質の変異に関連している。しかし、これらのタンパク質の多くは、低分子治療薬でそれらを標的とすることが難しいため、「創薬不可能」、「創薬が困難」、または「まだ創薬されていない」標的とみなされてきた。例えば、神経変性アルツハイマー病では、アミロイドタンパク質が蓄積して脳内にプラークを形成し、この疾患の特徴的な態様となるが、神経変性における重要な役割にもかかわらず、このタンパク質を標的とする治療薬がない。疾患に関連する可溶性タンパク質及び細胞表面タンパク質を標的とし、選択的に枯渇させるための組成物及び方法が必要とされている。

さまざまな態様において、本開示は、ペプチド複合体であって、細胞受容体結合ペプチドと、細胞受容体結合ペプチドと複合体形成した標的結合ペプチドとを含み、（ｉ）標的結合ペプチドが、細胞外環境よりもエンドソームにおいてより低い標的に対する親和性を有するように操作されるか、（ｉｉ）細胞受容体結合ペプチドが、細胞外環境よりもエンドソームにおいてより低い細胞受容体に対する親和性を有するように操作されるか、または（ｉ）と（ｉｉ）の両方である、ペプチド複合体を提供する。

いくつかの態様において、標的に対する標的結合ペプチドの親和性、細胞受容体に対する細胞受容体結合ペプチドの親和性、またはその両方は、ｐＨ依存性である。いくつかの態様において、標的に対する標的結合ペプチドの親和性、細胞受容体に対する細胞受容体結合ペプチドの親和性、またはその両方は、イオン強度依存性である。

さまざまな態様において、本開示は、ペプチド複合体であって、細胞受容体結合ペプチドと、細胞受容体結合ペプチドと複合体形成した標的結合ペプチドとを含み、（ｉ）標的に対する標的結合ペプチドの親和性がｐＨ依存性であるか、（ｉｉ）細胞受容体に対する細胞受容体結合ペプチドの親和性がｐＨ依存性であるか、または（ｉ）と（ｉｉ）の両方である、ペプチド複合体を提供する。

いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチドは、トランスフェリン受容体結合ペプチドまたはＰＤ－Ｌ１結合ペプチドである。いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチドは、トランスフェリン受容体結合ペプチドである。いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチドは、ＰＤ－Ｌ１結合ペプチドである。いくつかの態様では、受容体は、トランスフェリン受容体またはＰＤ－Ｌ１である。いくつかの態様では、受容体は、トランスフェリン受容体である。いくつかの態様では、細胞受容体はＰＤ－Ｌ１である。

いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチドは、ｐＨ４．５～ｐＨ７．４、ｐＨ５．５～ｐＨ７．４、またはｐＨ６．５～ｐＨ７．４のｐＨで細胞受容体に結合する。いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチドは、ｐＨ７．４において、１００ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で細胞受容体に結合することができる。いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチドは、ｐＨ５．５において、１００ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で細胞受容体に結合することができる。いくつかの態様では、細胞受容体に対する細胞受容体の親和性は、ｐＨ非依存性である。いくつかの態様では、ｐＨ７．４とｐＨ５．５での細胞受容体に対する細胞受容体結合ペプチドの親和性は、２倍以下、５倍以下、１０倍以下、１５倍以下、２０倍以下、２５倍以下、３０倍以下、４０倍以下、または５０倍以下異なる。

いくつかの態様では、細胞受容体に対する細胞受容体結合ペプチドの親和性は、ｐＨ依存性である。いくつかの態様では、細胞受容体に対する細胞受容体結合ペプチドの親和性は、ｐＨが低下するにつれて低下する。いくつかの態様では、細胞受容体に対する細胞受容体結合ペプチドの親和性は、ｐＨ５．５よりもｐＨ７．４で高い。

いくつかの態様では、標的に対する標的結合ペプチドの親和性は、ｐＨ依存性である。いくつかの態様では、標的に対する標的結合ペプチドの親和性は、ｐＨが低下するにつれて低下する。いくつかの態様では、標的に対する標的結合ペプチドの親和性は、より低いｐＨよりもより高いｐＨでより高い。いくつかの態様では、より高いｐＨは、ｐＨ７．４、ｐＨ７．２、ｐＨ７．０、またはｐＨ６．８である。いくつかの態様では、より低いｐＨは、ｐＨ６．５、ｐＨ６．０、ｐＨ５．５、ｐＨ５．０、またはｐＨ４．５である。いくつかの態様では、標的に対する標的結合ペプチドの親和性は、ｐＨ６．０よりもｐＨ７．４で高い。いくつかの態様では、標的に対する標的結合ペプチドの親和性は、ｐＨ５．５よりもｐＨ７．４で高い。いくつかの態様では、標的結合ペプチドは、ｐＨ７．４において、１００ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で標的分子に結合することができる。いくつかの態様では、標的結合ペプチドは、ｐＨ５．５において、１ｎＭ以上、２ｎＭ以上、５ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、２０ｎＭ以上、５０ｎＭ以上、１００ｎＭ以上、２００ｎＭ以上、または５００ｎＭ以上の解離定数（ＫＤ）で標的分子に結合することができる。いくつかの態様では、ｐＨ７．４での標的に対する標的結合ペプチドの親和性は、ｐＨ５．５での標的に対する標的結合ペプチドの親和性よりも、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、または少なくとも２０倍大きい。いくつかの態様では、標的結合ペプチドは、１つ以上のヒスチジンアミノ酸残基を含む。いくつかの態様では、標的に対する標的結合ペプチドの親和性は、イオン強度が増加するにつれて低下する。いくつかの態様では、標的結合ペプチドは、標的分子との極性相互作用または電荷－電荷相互作用を形成することができる１つ以上の極性アミノ酸残基または荷電アミノ酸残基を含む。

いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチドは、標的結合ペプチドにコンジュゲートされる。いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチドと標的結合ペプチドは、単一のポリペプチド鎖を形成する。いくつかの態様では、ペプチド複合体は、二量体化ドメインを介して二量体化された二量体を含む。いくつかの態様では、二量体化ドメインはＦｃドメインを含む。いくつかの態様では、二量体は、ホモ二量体化ドメインを介して二量体化されたホモ二量体である。いくつかの実施形態では、ホモ二量体化ドメインは、配列番号２４５～配列番号２５９のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの態様では、二量体は、第１のヘテロ二量体化ドメインと第２のヘテロ二量体化ドメインを介して二量体化されたヘテロ二量体である。いくつかの態様では、第１のヘテロ二量体化ドメインは、配列番号２６０、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４、配列番号２７６、配列番号２７８、配列番号２８０、配列番号２８２、配列番号２８４、または配列番号２８６のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの態様では、第２のヘテロ二量体化ドメインは、配列番号２６１、配列番号２６３、配列番号２６５、配列番号２６７、配列番号２６９、配列番号２７１、配列番号２７３、配列番号２７５、配列番号２７７、配列番号２７９、配列番号２８１、配列番号２８３、配列番号２８５、または配列番号２８７のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。

いくつかの態様では、標的結合ペプチドは、ペプチドリンカーを介して二量体化ドメインに連結される。いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチドは、ペプチドリンカーを介して二量体化ドメインに連結される。いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチドは、ペプチドリンカーを介して標的結合ペプチドに連結される。いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、１～５０個のアミノ酸残基、２～４０個のアミノ酸残基、３～２０個のアミノ酸残基、または３～１０個のアミノ酸残基の長さを有する。いくつかの態様では、リンカーは、グリシンアミノ酸及びセリンアミノ酸を含む。いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、６Å以下、８Å以下、１０Å以下、１２Å以下、１５Å以下、２０Å以下、２０Å以下、２５Å以下、３０Å以下、４０Å以下、または５０Å以下の持続長を有する。いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、免疫グロブリンペプチドに由来する。いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、ダブルノット（ｄｏｕｂｌｅ－ｋｎｏｔ）毒素ペプチドに由来する。いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、配列番号１２９～配列番号１４１、配列番号１９５～配列番号２１８、配列番号２２３～配列番号２２７、または配列番号３９１のいずれか１つの配列を含む。

いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチド、標的結合ペプチド、またはその両方は、ミニタンパク質、ナノボディ、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、ＤＡＲＰｉｎ、またはアフィボディを含む。いくつかの態様では、抗体はＩｇＧを含むか、または抗体断片はＦａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ、または（ｓｃＦｖ）２を含む。いくつかの態様では、ミニタンパク質は、シスチン高密度ペプチド、アフィチン、アドネクチン、アビマー、クニッツドメイン、ナノフィチン、フィノマー、二環式ペプチド、ベータヘアピン、またはステープルペプチドを含む。いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合、少なくとも２つのジスルフィド結合、少なくとも３つのジスルフィド結合、または少なくとも４つのジスルフィド結合を含む。

いくつかの態様では、標的結合ペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合、少なくとも２つのジスルフィド結合、少なくとも３つのジスルフィド結合、または少なくとも４つのジスルフィド結合を含む。いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチドは、少なくとも６つのシステイン残基を含む。いくつかの態様では、少なくとも６個のシステイン残基は、細胞受容体結合ペプチドのアミノ酸位置４、８、１８、３２、４２、及び４６に位置する。いくつかの態様では、少なくとも６つのシステイン残基は、少なくとも３つのジスルフィド結合を形成する。

いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチドは、配列番号１４８～配列番号１７７のいずれか１つの配列を含む。いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチドは、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、もしくは配列番号１～配列番号６４のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性、または配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、もしくは配列番号１～配列番号６４のいずれか１つの断片と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞受容体結合ペプチドは、配列番号９６と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性、または配列番号９６の断片と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチドは、配列番号９６の配列を含む。いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチドは、配列番号３９２～配列番号３９９のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞受容体結合ペプチドは、配列番号１８７、配列番号２３３～配列番号２３９、配列番号４００～配列番号４５６、もしくは配列番号２４１のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性、または配列番号１８７、配列番号２３３～配列番号２３９、配列番号４００～配列番号４５６、もしくは配列番号２４１のいずれか１つの断片と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞受容体結合ペプチドは、配列番号１８７、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号４００、もしくは配列番号４０１と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性、または配列番号１８７、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号４００、もしくは配列番号４０１の断片と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチドは、配列番号１８７、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号４００、または配列番号４０１の配列を含む。さらなる実施形態では、断片は、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個、少なくとも３３個、少なくとも３４個、少なくとも３５個、少なくとも３６個、少なくとも３７個、少なくとも３８個、少なくとも３９個、少なくとも４０個、少なくとも４１個、少なくとも４２個、少なくとも４３個、少なくとも４４個、少なくとも４５個、少なくとも４６個、少なくとも４７個、少なくとも４８個、少なくとも４９個、または少なくとも５０個のアミノ酸残基を含む。

いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチドは、細胞受容体結合界面に１つ以上のヒスチジン残基を含む。いくつかの態様では、標的結合ペプチドは、標的結合界面に１つ以上のヒスチジン残基を含む。いくつかの態様では、標的結合ペプチドは、ＰＤ－Ｌ１結合ペプチド、ＥＧＦＲ結合ペプチド、またはＴＮＦα結合ペプチドである。いくつかの態様では、ＰＤ－Ｌ１結合ペプチドは、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号１８７、配列番号２３５～配列番号２３９、配列番号４００～配列番号４５６、または配列番号２４０のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの態様では、ＥＧＦＲ結合ペプチドは、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩまたはチロシンキナーゼ阻害剤耐性ＥＧＦＲに結合する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ペプチドは、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２１９、または配列番号２４２と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの態様では、ＥＧＦＲ結合ペプチドは、配列番号２４２の配列を含む。いくつかの態様では、ＥＧＦＲ結合ペプチドは、配列番号２４３の配列を含む。

いくつかの態様では、標的は、細胞表面分子、増殖因子受容体、分泌ペプチド、分泌タンパク質、循環分子、細胞シグナル伝達分子、細胞外マトリックス巨大分子、神経伝達物質、サイトカイン、増殖因子、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原またはホルモン、チェックポイント阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤、抑制性免疫受容体、抑制性免疫受容体のリガンド、マクロファージ表面タンパク質、リポ多糖、抗体、抑制性免疫受容体、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原、または自己抗体である。いくつかの態様では、標的は、コラーゲン、エラスチン、ミクロフィブリルタンパク質、プロテオグリカン、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３００ｆ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＦｃｇＲｉｉｂ、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－３、ＩＬＴ－４、ＩＬＴ－５、ＬＡＩＲ－１、ＰＥＣＡＭ－１、ＰＩＬＲ－α、ＳＩＲＬ－１、ＳＩＲＰ－α、ＣＬＥＣ４Ａ、Ｌｙ４９Ｑ、ＭＩＣ、ＣＤ３、ＣＤ４７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８９、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２７、ＣＤ３９、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ７４、ＣＤ４０Ｌ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ２、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ４、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＨＬＡ－Ｇ、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ、ＴＣＲ、ＴＮＦ－α、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＴＫＩ耐性ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＥＲＢＢ３、ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＩＧＦＲ１、ＣＴＬＡ４、ＳＴＲＯ１、補体因子Ｃ４、補体因子Ｃ１ｑ、補体因子Ｃ１ｓ、補体因子Ｃ１ｒ、補体因子Ｃ３、補体因子Ｃ３ａ、補体因子Ｃ３ｂ、補体因子Ｃ５、補体因子Ｃ５ａ、ＴＧＦβ、ＰＣＳＫ９、Ｐ２Ｙ６、ＨＥＲ３、ＲＡＮＫ、ｔａｕ、アミロイドβ、ハンチンチン、α－シヌクレイン、グルコセレブロシダーゼ、α－グルコシダーゼ、ＩＬ－１、ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＩＬ－１２、ｐ４０、Ｂ７ファミリーのメンバー、ｃ－Ｍｅｔ、ＳＩＧＬＥＣ、ＭＣＰ－１、ＭＨＣ、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＰＤ－１、またはＰＤ－Ｌ１である。いくつかの態様では、標的は、ＰＤ－Ｌ１、ＥＧＦＲ、またはＴＮＦαである。

いくつかの態様では、ペプチド複合体は、配列番号２８８～配列番号３１３または配列番号３１５～配列番号３４６のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性、または配列番号３４７、配列番号３４８、配列番号３５１、配列番号３５２、配列番号３５５、配列番号３５６、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６０、配列番号３６１、配列番号３６２、配列番号３６３、配列番号３６４、配列番号３６５、配列番号３７１、配列番号３７３、配列番号３７６、配列番号３７８、配列番号３８２、配列番号３８４、配列番号３８７、もしくは配列番号３８９のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの態様では、ペプチド複合体は、配列番号２８８、配列番号２８９、配列番号３０７、配列番号３１３、配列番号３２７、配列番号３２８、配列番号３３２、配列番号３３３、配列番号３３７、配列番号３３８、配列番号３４２、もしくは配列番号３４３；配列番号３０２、配列番号３０５、配列番号３３９、配列番号３４０、配列番号３４４、もしくは配列番号３４５と二量体化された配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号３１０、配列番号３１５、もしくは配列番号３１６；配列番号３０２、配列番号３３９、もしくは配列番号３４４と二量体化された配列番号２９６；配列番号２９８；配列番号３０１と二量体化された配列番号２９９；配列番号３３０もしくは配列番号３３５と二量体化された配列番号３３１もしくは配列番号３３６；または配列番号３２９、配列番号３３０、配列番号３３４、もしくは配列番号３３５と二量体化された配列番号２９２、配列番号３１５、もしくは配列番号３１６の配列を含む。いくつかの態様では、ペプチド複合体は、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号３０８、配列番号３１７、配列番号３１８、配列番号３２２、もしくは配列番号３２３；配列番号３０４、配列番号３０６、配列番号３１９、配列番号３２０、配列番号３２１、配列番号３２４、もしくは配列番号３２５と二量体化された配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号３１５、配列番号３１６；配列番号３０４、配列番号３１９、配列番号３２１、もしくは配列番号３２４と二量体化された配列番号２９５もしくは配列番号２９７；配列番号３０３と二量体化された配列番号２９８もしくは配列番号３００；または配列番号３０６、配列番号３１１、配列番号３２０、もしくは配列番号３２５と二量体化された配列番号３２６の配列を含む。

いくつかの態様では、細胞受容体からの細胞受容体結合ペプチドのオフ速度は、細胞受容体の再循環速度よりも遅い。いくつかの態様では、細胞受容体からの細胞受容体結合ペプチドのオフ速度は、１分以内、２分以内、３分以内、４分以内、５分以内、７分以内、１０分以内、１５分以内、または２０分以内である。いくつかの態様では、ペプチド複合体は、受容体媒介エンドサイトーシスを介してエンドサイトーシスされ得る。いくつかの態様では、受容体媒介エンドサイトーシスは、トランスフェリン受容体媒介エンドサイトーシスである。いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチドは、エンドサイトーシス小胞内で細胞受容体に結合したままである。いくつかの態様では、ペプチド複合体は、細胞受容体結合ペプチドが細胞受容体に結合し、細胞受容体が再循環される場合に再循環される。いくつかの態様では、標的は、ペプチド複合体が受容体媒介エンドサイトーシスを介してエンドサイトーシスされる場合、標的結合ペプチドから放出または解離される。

いくつかの態様では、標的は、細胞外タンパク質、循環タンパク質、または可溶性タンパク質である。いくつかの態様では、標的は細胞表面タンパク質である。いくつかの態様では、標的は膜貫通タンパク質である。いくつかの態様では、ペプチド複合体は、第２の標的結合ペプチドをさらに含む。いくつかの態様では、第２の標的結合ペプチドは、第２の標的に結合する。いくつかの態様では、標的及び第２の標的は、標的結合ペプチド及び第２の標的結合ペプチドに結合すると二量体を形成する。いくつかの態様では、標的及び第２の標的の二量体化は、標的及び第２の標的のエンドサイトーシスの速度を増加させる。いくつかの態様では、第２の標的は標的と同じである。

いくつかの態様では、ペプチド複合体は、細胞受容体結合ペプチド、標的結合ペプチド、またはその両方に結合された半減期改変剤をさらに含む。いくつかの態様では、半減期改変剤は、ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン、ポリビニルアルコール、水溶性ポリマー、双極性イオン水溶性ポリマー、水溶性ポリ（アミノ酸）、プロリン、アラニン及びセリンの水溶性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、及びセリンを含む水溶性ポリマー、Ｆｃ領域、脂肪酸、パルミチン酸、またはアルブミンに結合する分子を含む。いくつかの態様では、アルブミンに結合する分子は、血清アルブミン結合ペプチドである。いくつかの態様では、血清アルブミン結合ペプチドは、配列番号１７８、配列番号１７９、または配列番号１９３のいずれか１つの配列を含む。いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチド、標的結合ペプチド、またはその両方が組換え発現される。

いくつかの態様では、標的結合ペプチドは、ｐＨ６．５、ｐＨ６．０、ｐＨ５．５、ｐＨ５．０、またはｐＨ４．５で標的から解離するように構成されている。いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチドは、ｐＨ６．５、ｐＨ６．０、ｐＨ５．５、ｐＨ５．０、またはｐＨ４．５で細胞受容体から解離するように構成されている。

さまざまな態様では、本開示は、標的分子を選択的に枯渇させる方法であって、この方法が、細胞受容体結合ペプチド、細胞受容体結合ペプチドと複合体形成した標的結合ペプチドを含むペプチド複合体を、細胞受容体を発現する細胞に接触させることと；細胞外条件下で標的結合ペプチドを標的分子に結合させることと；細胞外条件下で細胞受容体結合ペプチドを細胞受容体に結合させることと；ペプチド複合体、標的分子、及び細胞受容体をエンドサイトーシスすることと；エンドソーム条件下で、標的分子から標的結合ペプチドを、細胞受容体から細胞受容体結合ペプチドを、またはその両方を解離させることと；標的分子を分解し、それによって標的分子を枯渇させることと、を含む方法を提供する。

さまざまな態様では、本開示は、標的分子を選択的に枯渇させる方法であって、この方法が、本明細書に記載のペプチド複合体を、細胞受容体を発現する細胞に接触させることと；細胞外条件下で標的結合ペプチドを標的分子に結合させることと；細胞外条件下で細胞受容体結合ペプチドを細胞受容体に結合させることと；ペプチド複合体、標的分子、及び細胞受容体をエンドサイトーシス区画またはリソソーム区画にエンドサイトーシスすることと；エンドソーム条件下で、標的分子から標的結合ペプチドを、細胞受容体から細胞受容体結合ペプチドを、またはその両方を放出させることと；標的分子を分解し、それによって標的分子を枯渇させることと、を含む方法を提供する。

いくつかの態様では、方法は、ペプチド複合体及び細胞受容体を再循環することをさらに含む。いくつかの態様では、細胞受容体はトランスフェリン受容体またはＰＤ－Ｌ１であり、細胞受容体結合ペプチドはトランスフェリン受容体結合ペプチドまたはＰＤ－Ｌ１結合ペプチドである。いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチドは、トランスフェリン受容体結合ペプチドであり、細胞受容体はトランスフェリン受容体である。いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチドはＰＤ－Ｌ１結合ペプチドであり、細胞受容体はＰＤ－Ｌ１である。いくつかの態様では、エンドサイトーシスすることは、受容体媒介エンドサイトーシスを含む。いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチドは、エンドサイトーシス区画またはリソソーム区画において細胞受容体に結合したままである。いくつかの態様では、標的分子は、エンドサイトーシス区画またはリソソーム区画で分解される。いくつかの態様では、受容体媒介エンドサイトーシスは、トランスフェリン受容体媒介エンドサイトーシスである。

いくつかの態様では、標的分子は、細胞外タンパク質、循環タンパク質、または可溶性タンパク質である。いくつかの態様では、標的分子は細胞表面タンパク質である。いくつかの態様では、標的分子は膜貫通タンパク質である。いくつかの態様では、方法は、ペプチド複合体に血液脳関門（ＢＢＢ）を含む細胞層を透過させることを含む。いくつかの態様では、標的分子は中枢神経系で分解される。いくつかの態様では、細胞は、細胞受容体を発現する。

いくつかの態様では、方法は、細胞外条件下で細胞受容体結合ペプチドを細胞受容体に、５０μＭ以下、５μＭ以下、５００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ、または０．１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で結合させることを含む。いくつかの態様では、方法は、エンドソーム条件下で細胞受容体結合ペプチドを細胞受容体に、５０μＭ以下、５μＭ以下、５００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ、または０．１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で結合させることを含む。

いくつかの態様では、標的結合ペプチドは、エンドサイトーシス区画において標的分子に結合したままである。いくつかの態様では、方法は、細胞外条件下で標的結合ペプチドを標的分子に、５０μＭ以下、５μＭ以下、５００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ、または０．１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で結合させることを含む。いくつかの態様では、方法は、エンドソーム条件下で標的結合ペプチドを標的分子に、１ｎＭ以上、２ｎＭ以上、５ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、２０ｎＭ以上、５０ｎＭ以上、１００ｎＭ以上、２００ｎＭ以上、または５００ｎＭ以上の解離定数（ＫＤ）で結合させることを含む。いくつかの態様では、方法は、エンドソーム条件下と比べて細胞外条件下で、２倍以下、５倍以下、１０倍以下、１５倍以下、２０倍以下、２５倍以下、３０倍以下、４０倍以下、または５０倍以下異なる親和性で、細胞受容体結合ペプチドを細胞受容体に結合させることを含む。いくつかの態様では、この方法は、標的結合ペプチドと標的分子との間で１つ以上の極性相互作用または電荷－電荷相互作用を形成することを含む。

いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチドは、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞受容体結合ペプチドは、配列番号９６と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチドは、配列番号９６の配列を含む。いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチドは、配列番号３９２～配列番号３９９のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞受容体結合ペプチドは、配列番号１８７、配列番号２３３～配列番号２３９、配列番号４００～配列番号４５６、もしくは配列番号２４１のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性、または配列番号１８７、配列番号２３３～配列番号２３９、配列番号４００～配列番号４５６、もしくは配列番号２４１のいずれか１つの断片と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞受容体結合ペプチドは、配列番号１８７、配列番号２３５、配列番号２３８、もしくは配列番号２３９と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性、または配列番号１８７、配列番号２３５、配列番号２３８、もしくは配列番号２３９の断片と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの態様では、細胞受容体結合ペプチドは、配列番号１８７、配列番号２３５、配列番号２３８、または配列番号２３９の配列を含む。

いくつかの態様では、方法は、第２の標的分子を第２の標的結合ペプチドと結合させることをさらに含む。いくつかの態様では、標的分子及び第２の標的分子は、標的結合ペプチド及び第２の標的結合ペプチドに結合すると二量体を形成する。いくつかの態様では、方法は、標的分子及び第２の標的分子の二量体化の際に、標的分子及び第２の標的分子のエンドサイトーシスの速度を増加させることを含む。いくつかの態様では、第２の標的分子は、標的分子及び第２の標的分子のエンドサイトーシスにより分解される。いくつかの態様では、第２の標的分子は標的分子と同じである。

さまざまな態様では、本開示は、対象において疾患または状態を治療する方法であって、この方法が、細胞受容体結合ペプチド、細胞受容体結合ペプチドと複合体形成した標的結合ペプチドを含むペプチド複合体を対象に投与することと；細胞外条件下で標的結合ペプチドを標的分子及び細胞受容体を発現している対象の細胞上で疾患または状態と関連している標的分子に結合させることと；細胞外条件下で細胞受容体結合ペプチドを対象の細胞上の細胞受容体に結合させることと；ペプチド複合体、標的分子、及び細胞受容体をエンドサイトーシスすることと；エンドソーム条件下で、標的分子から標的結合ペプチドを、細胞受容体から細胞受容体結合ペプチドを、またはその両方を解離させることと；標的分子を分解し、それによって疾患または状態を治療することと、を含む方法を提供する。

さまざまな態様では、本開示は、対象において疾患または状態を治療する方法であって、この方法が、本明細書に記載のペプチド複合体を対象に投与することと；細胞外条件下で標的結合ペプチドを標的分子及び細胞受容体を発現している対象の細胞上で疾患または状態と関連している標的分子に結合させることと；細胞外条件下で細胞受容体結合ペプチドを対象の細胞上の細胞受容体に結合させることと；ペプチド複合体、標的分子、及び細胞受容体をエンドサイトーシスすることと；エンドソーム条件下で、標的分子から標的結合ペプチドを、細胞受容体から細胞受容体結合ペプチドを、またはその両方を解離させることと；標的分子を分解し、それによって疾患または状態を治療することと、を含む方法を提供する。

いくつかの態様では、標的分子は、細胞表面分子、増殖因子受容体、分泌ペプチド、分泌タンパク質、循環分子、細胞シグナル伝達分子、細胞外マトリックス巨大分子、神経伝達物質、サイトカイン、増殖因子、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原またはホルモン、チェックポイント阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤、抑制性免疫受容体、抑制性免疫受容体のリガンド、マクロファージ表面タンパク質、リポ多糖、抗体、抑制性免疫受容体、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原、または自己抗体である。いくつかの態様では、標的分子は、コラーゲン、エラスチン、ミクロフィブリルタンパク質、プロテオグリカン、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３００ｆ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＦｃｇＲｉｉｂ、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－３、ＩＬＴ－４、ＩＬＴ－５、ＬＡＩＲ－１、ＰＥＣＡＭ－１、ＰＩＬＲ－α、ＳＩＲＬ－１、ＳＩＲＰ－α、ＣＬＥＣ４Ａ、Ｌｙ４９Ｑ、ＭＩＣ、ＣＤ３、ＣＤ４７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８９、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２７、ＣＤ３９、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ７４、ＣＤ４０Ｌ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ２、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ４、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＨＬＡ－Ｇ、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ、ＴＣＲ、ＴＮＦ－α、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＴＫＩ耐性ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＥＲＢＢ３、ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＩＧＦＲ１、ＣＴＬＡ４、ＳＴＲＯ１、補体因子Ｃ４、補体因子Ｃ１ｑ、補体因子Ｃ１ｓ、補体因子Ｃ１ｒ、補体因子Ｃ３、補体因子Ｃ３ａ、補体因子Ｃ３ｂ、補体因子Ｃ５、補体因子Ｃ５ａ、ＴＧＦβ、ＰＣＳＫ９、Ｐ２Ｙ６、ＨＥＲ３、ＲＡＮＫ、ｔａｕ、アミロイドβ、ハンチンチン、α－シヌクレイン、グルコセレブロシダーゼ、α－グルコシダーゼ、ＩＬ－１、ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＩＬ－１２、ｐ４０、Ｂ７ファミリーのメンバー、ｃ－Ｍｅｔ、ＳＩＧＬＥＣ、ＭＣＰ－１、ＭＨＣ、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＰＤ－１、またはＰＤ－Ｌ１である。いくつかの態様では、標的分子は受容体チロシンキナーゼである。いくつかの態様では、受容体チロシンキナーゼは、ＥＧＦ受容体、ＥｒｂＢ、インスリン受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ＣＣＫ受容体、ＮＧＦ受容体、ＨＧＦ受容体、Ｅｐｈ受容体、ＡＸＬ受容体、ＴＩＥ受容体、ＲＹＫ受容体、ＤＤＲ受容体、ＲＥＴ受容体、ＲＯＳ受容体、ＬＴＫ受容体、ＲＯＲ受容体、ＭｕＳＫ受容体、またはＬＭＲ受容体である。いくつかの態様では、標的分子は病原体または病原体表面分子である。

いくつかの態様では、疾患または状態は、がん、神経変性疾患、リソソーム蓄積症、炎症性疾患、自己免疫疾患、神経炎症性疾患、免疫疾患、または疼痛である。いくつかの態様では、がんは、乳癌、肝臓癌、結腸癌、脳癌、白血病、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄腫、血液細胞由来のがん、肺癌、肉腫、胃癌、胃腸癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、非小細胞肺癌、扁平上皮非小細胞肺癌、膵臓癌、卵巣癌、血液癌、皮膚癌、肝臓癌、腎臓癌、または結腸直腸癌である。いくつかの態様では、がんは、ＴＫＩ耐性、セツキシマブ耐性、ネシツムマブ耐性、またはパニツムマブ耐性である。いくつかの態様では、がんは、進行がん、転移がん、中枢神経系の転移がん、転移性乳癌、転移性皮膚癌、難治性がん、ＫＲＡＳ野生型がん、ＫＲＡＳ変異型がん、またはエクソン２０変異型非小細胞肺癌である。いくつかの態様では、標的分子は、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＶＥＧＦ、ＰＤ－１、ＣＤ３８、ＧＤ２、ＳＬＡＭＦ７、ＣＴＬＡ－４、ＣＣＲ４、ＣＤ２０、ＰＤＧＦＲα、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ｂ、ネクチン－４、またはＴＲＯＰ２である。いくつかの態様では、標的分子はＥＧＦＲまたはＰＤ－Ｌ１である。いくつかの態様では、この方法は、追加の治療を対象に施すことをさらに含む。いくつかの態様では、追加の治療は、放射線、化学療法、プラチナ治療、または代謝拮抗治療を含む。いくつかの態様では、追加の治療は、フルオロウラシル、ＦＯＬＦＩＲＩ、イリノテカン、ＦＯＬＦＯＸ、ゲムシタビン、またはシスプラチンを含む。

いくつかの態様では、神経変性疾患は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ運動失調症、ハンチントン病、パーキンソン病、または脊髄性筋萎縮症である。いくつかの態様では、標的分子は、ｔａｕ、アミロイドβ、ハンチンチン、またはα－シヌクレインである。いくつかの態様では、リソソーム蓄積症はゴーシェ病またはポンペ病である。いくつかの態様では、標的分子はグルコセレブロシダーゼまたはα－グルコシダーゼである。いくつかの態様では、炎症性疾患は、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、糸球体腎炎、ループス、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、皮膚血管炎、神経炎症性疾患、炎症関連神経変性、アルツハイマー病、脳卒中、外傷性脳損傷、シェーグレン病、または嚢胞性線維症である。いくつかの態様では、標的分子は、アポリポタンパク質Ｅ４、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、またはＩＬ－２３である。いくつかの態様では、標的分子はＴＮＦ－αである。いくつかの態様では、細胞は、がん細胞、免疫細胞、中枢神経系細胞、神経細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、好中球、樹状細胞、マスト細胞、好塩基球、または好酸球である。

いくつかの態様では、方法は、選択的枯渇複合体、標的分子、及び細胞受容体の間で三元複合体を形成することをさらに含む。いくつかの態様では、三元複合体の形成は、細胞受容体、標的分子、またはその両方の再循環または代謝回転を増加させる。いくつかの態様では、三元複合体の形成は、標的分子の細胞受容体への結合を増加させる。

参照による組み込み
本明細書において引用されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、各々個々の刊行物、特許または特許出願が、参照により本明細書に組み入れられるように具体的かつ個別に示されているかのように、それと同程度まで、参照により本明細書に組み入れられる。

本明細書に記述される新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に特に記載される。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実行形態を説明する以下の詳細な説明、及びその添付の図面を参照することによって得られるであろう。

ヒト可溶性トランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）細胞外ドメインタンパク質をクマシー染色したゲルと、プールされた高多様性ペプチドライブラリに由来する、ｈＴｆＲ細胞外ドメインに結合する細胞の連続的濃縮を示すフローサイトメトリープロットを示す。Ａは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）の精製の成功を示すＴｆＲタンパク質のクマシー染色ゲルを示す。Ｂは、１回のフローソーティング後における、候補であるＴｆＲ結合ペプチドを提示する細胞のフローサイトメトリープロットを示す。細胞は、蛍光ストレプトアビジンで標識されたＴｆＲに結合する能力に基づいて分類された。右上の領域のデータ点は、蛍光ＴｆＲ－ストレプトアビジンの蛍光によって定量化された、ＴｆＲに結合する、ＧＦＰ蛍光によって定量化された候補ペプチドを発現する細胞を表す。Ｃは、１回のフローソーティング後における、候補であるＴｆＲ結合ペプチドを提示する細胞の陰性対照フローサイトメトリープロットを示す。細胞は、蛍光ストレプトアビジンで標識された対照タンパク質に結合する能力に基づいて染色された。右上の領域のデータ点は、蛍光対照タンパク質－ストレプトアビジンの蛍光によって定量化された、陰性対照タンパク質に結合する、ＧＦＰ蛍光によって定量化された候補ペプチドを発現する細胞を表す。Ｄは、Ｂに示される１回目のフローソート後の２回目のフローソート後の候補ＴｆＲ結合ペプチドを提示する細胞のフローサイトメトリープロットを示す。細胞は、蛍光ストレプトアビジンで標識されたＴｆＲに結合する能力に基づいて分類された。右上の領域のデータ点は、蛍光ＴｆＲ－ストレプトアビジンの蛍光によって定量化された、ＴｆＲに結合する、ＧＦＰ蛍光によって定量化された候補ペプチドを発現する細胞を表す。Ｅは、Ｂ及びＣに示される１回目のフローソート後の２回目のフローソート後の候補ＴｆＲ結合ペプチドを提示する細胞の陰性対照フローサイトメトリープロットを示す。細胞は、蛍光ストレプトアビジンで標識された対照タンパク質に結合する能力に基づいて染色された。右上の領域のデータ点は、蛍光対照タンパク質－ストレプトアビジンの蛍光によって定量化された、陰性対照タンパク質に結合する、ＧＦＰ蛍光によって定量化された候補ペプチドを発現する細胞を表す。Ｆは、Ｄに示される２回目のフローソート後の３回目のフローソート後の候補ＴｆＲ結合ペプチドを提示する細胞のフローサイトメトリープロットを示す。細胞は、蛍光ストレプトアビジンで標識されたＴｆＲに結合する能力に基づいて分類された。右上の領域のデータ点は、蛍光ＴｆＲ－ストレプトアビジンの蛍光によって定量化された、ＴｆＲに結合する、ＧＦＰ蛍光によって定量化された候補ペプチドを発現する細胞を表す。ボックスは、ＴｆＲに結合するペプチドを発現する細胞を示す。Ｇは、Ｄ及びＥに示される２回目のフローソート後の３回目のフローソート後の候補ＴｆＲ結合ペプチドを提示する細胞の陰性対照フローサイトメトリープロットを示す。細胞は、蛍光ストレプトアビジンで標識された対照タンパク質に結合する能力に基づいて染色された。右上の領域のデータ点は、蛍光対照タンパク質－ストレプトアビジンの蛍光によって定量化された、陰性対照タンパク質に結合する、ＧＦＰ蛍光によって定量化された候補ペプチドを発現する細胞を表す。ボックスは、陰性対照タンパク質に結合するペプチドを発現する細胞を示す。単一のクローンＴｆＲ結合ペプチドを提示し、ＴｆＲまたは陰性対照タンパク質のいずれかとの結合についてスクリーニングして、図１Ａ～１Ｇで同定されたＴｆＲへのＴｆＲ結合ペプチドの結合を確認した細胞のフローサイトメトリーを示す。結合がストレプトアビジン標識に依存しないことを検証するために、ストレプトアビジンまたは抗Ｈｉｓ抗体のどちらかで標識されたＴｆＲまたは対照タンパク質を使用してフローサイトメトリーを実施した。Ａは、標識された陰性対照タンパク質（ｙ軸、蛍光抗Ｈｉｓ抗体で染色）への結合についてスクリーニングされた配列番号１のＴｆＲ結合ペプチドを発現する細胞（ｘ軸、ＧＦＰ）の陰性対照フローサイトメトリープロットを示す。Ｂは、ＴｆＲ（ｙ軸、蛍光抗Ｈｉｓ抗体で染色）への結合についてスクリーニングされた配列番号１のＴｆＲ結合ペプチドを発現する細胞（ｘ軸、ＧＦＰ）のフローサイトメトリープロットを示す。ボックスは、ＴｆＲ結合ペプチドを発現し、ＴｆＲに結合する細胞を示す。Ｃは、標識された陰性対照タンパク質（ｙ軸、蛍光抗ストレプトアビジンで染色）への結合についてスクリーニングされた配列番号１のＴｆＲ結合ペプチドを発現する細胞（ｘ軸、ＧＦＰ）の陰性対照フローサイトメトリープロットを示す。Ｄは、ＴｆＲへの結合についてスクリーニング（ｙ軸、蛍光抗ストレプトアビジンで染色）された配列番号１のＴｆＲ結合ペプチドを発現する細胞（ｘ軸、ＧＦＰ）のフローサイトメトリープロットを示す。ボックスは、ＴｆＲ結合ペプチドを発現し、ＴｆＲに結合する細胞を示す。部位飽和変異導入（ＳＳＭ）で濃縮されたバリアントを順列することで生じるペプチドバリアントに対するＴｆＲ結合を示す。それぞれのグラフは、完了したＳＳＭのラウンドを表し、該当するグラフ内のそれぞれの影付きバーは、ＳＳＭのラウンドが開始されたそれぞれの参照ペプチド配列と比較した、バーの下に示された特定のバリアントペプチドの変異の数を示す（図３Ａにおける配列番号１、または図３Ｂにおける配列番号２）。データは、ＴｆＲに対する同定されたペプチドの相対的な結合親和性を示しており、採用されたＳＳＭの最後のステップを表し、次世代の分子を示している。Ａは、配列番号１の配列を有するペプチドの親和性成熟のための部位飽和変異導入（ＳＳＭ）から得られた配列番号３～配列番号２３の配列をそれぞれ含むバリアントに対して結合したｈＴｆＲのレベルを示す。Ｂは、配列番号２の配列を有する開始ペプチドの親和性成熟のための部位飽和変異導入（ＳＳＭ）から得られた配列番号２４～配列番号２８及び配列番号３０～配列番号３２の配列をそれぞれ有するペプチドバリアントに対して結合したｈＴｆＲのレベルを示す。ＴｆＲに対する異なる親和性を有するＴｆＲ結合ペプチドバリアントの結合を示す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）曲線を示す。それぞれのペプチドバリアントについて解離動態を定量化した。配列番号１、配列番号２、配列番号４、及び配列番号３２のそれぞれ３００ｎＭを使用して、経時的な表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）トレースを示す。配列番号３２は、ＳＰＲによって評価されるように、ＴｆＲへの最も強い結合を示す。データはそれぞれのトレースの最大応答に正規化された。配列番号２の配列を有するペプチドの濃度を変えた場合のｈＴｆＲ結合を示す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）トレースを示す。このデータに基づいて、配列番号２のペプチドの解離定数（Ｋ_Ｄ）は８．７ｎＭであると決定された。配列番号４の配列を有するペプチドの濃度を変えた場合のｈＴｆＲ結合を示す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）トレースを示す。このデータに基づいて、配列番号４のペプチドの解離定数（Ｋ_Ｄ）は１４．８ｎＭであると決定された。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による、捕捉されたビオチン化ｈＴｆＲに結合する配列番号３２の結合及びシングルサイクルカイネティクスデータを示す。５つの濃度の配列番号３２の配列を有するペプチド（０．０３７ｎＭ、０．１１ｎＭ、０．３３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ）を２つの密度の捕捉ビオチン化（Ｂｔ）－ｈＴｆＲに対して注入し、全体的に解析した。分析パラメーターは、高密度及び低密度の実行で一定に保たれ、両方のチャネルからのデータが同じ分析に含まれていた。このデータに基づいて、配列番号３２のペプチドの解離定数（Ｋ_Ｄ）は２１６ｐＭであると決定され、結合速度（ｋ_ａ）は８．５５×１０^６Ｍ^－１ｓ^－１であると決定され、解離速度（ｋ_ｄ）は１．８５×１０^－３ｓ^－１であると決定された。ＳＰＲによる、捕捉されたビオチン化ｈＴｆＲに結合する配列番号３０の結合及びシングルサイクルカイネティクスデータを示す。５つの濃度の配列番号３０の配列を有するペプチド（０．０３７ｎＭ、０．１１ｎＭ、０．３３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ）を２つの密度の捕捉Ｂｔ－ｈＴｆＲに対して注入し、全体的に解析した。分析パラメーターは、高密度及び低密度の実行で一定に保たれ、両方のチャネルからのデータが同じ分析に含まれていた。このデータに基づいて、配列番号３０のペプチドの解離定数（Ｋ_Ｄ）は４８６ｐＭであると決定され、結合速度（ｋ_ａ）は８．５７×１０^６Ｍ^－１ｓ^－１であると決定され、解離速度（ｋ_ｄ）は４．１６×１０^－３ｓ^－１であると決定された。トランスフェリンに結合するか否かを評価するための、可溶性トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）細胞外ドメインの精製及び試験を示す。Ａは、精製したＴｆＲ外部ドメインに結合するホロトランスフェリンまたはアポトランスフェリン（Ｔｆ）の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）トレースを示す。データは、ホロＴｆは経時的な応答（ＲＵ）の増加をするが、アポＴｆは増加しないことによって示されるように、ホロＴｆはＴｆＲ外部ドメインに結合するが、アポＴｆは結合しないことを示している。このデータは、ＴｆＲ結合ＣＤＰペプチドのスクリーニングで使用される可溶性ＴｆＲが、細胞の表面にＴｆＲの内因性タンパク質構造を含むことを検証し、結合物質が受容体媒介エンドサイトーシスに有用であるというデータを提供する。Ｂは、ペプチドの結合特性についてのスクリーニング及び最適化に使用されるベクター提示足場及び標的結合の模式図を示す。結合物質（例えば、配列番号１、配列番号２、または配列番号３２）のＧＦＰタグ付構築物をコードする表面提示ベクター（ＳＤＧＦ）は、細胞表面上に発現される。蛍光色素（「共染色」）で標識された標的タンパク質（例えば、ＴｆＲ）は、表面に発現される結合物質に結合する。標的タンパク質に対して高い親和性を有するペプチドを発現する細胞は、標的タンパク質に対して低い親和性を有するペプチドを発現する細胞よりも多くの共染色された標的を動員するため、共染色の蛍光強度は、標的に対するペプチド親和性の尺度として使用される。Ｃは、結合したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７－ＴｆＲ（図９Ｂ中の共染色）の量によって測定した、既知のＴｆＲ結合標的である、マチュポウイルス糖たんぱく質に対するＴｆＲ結合の特性を検証するフローサイトメトリーを示す。マチュポウイルス糖タンパク質（ＳＤＧＦ－ＭａＣＶ）をトランスフェクトした細胞は、ビオチン化ＴｆＲとＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐ－６４７）の組み合わせ、ＳＤＧＦ－ＭａＣＶ細胞とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識エラスターゼの組み合わせ、またはＳＤＧＦ－エラフィン細胞とＴｆＲ＋Ｓｔｒｅｐ－６４７の組み合わせで試験される。エラスターゼ及びエラフィンの細胞コンジュゲートは、細胞に結合しない。これらの結果は、ペプチドスクリーニングで使用される可溶性ＴｆＲが内在性タンパク質構造を構成していることを示し、ＴｆＲのその内在性リガンドに対する結合の特異性と、新規ＴｆＲ結合パートナーを同定する手段としてのＳＤＧＦの有用性の両方を示した。フローサイトメトリーを使用して、ＧＦＰと融合したＴｆＲ結合シスチン高密度ペプチド（ＣＤＰ、配列番号３２）の、ストレプトアビジン－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（ｓｔｒｅｐ－６４７）で標識されたＴｆＲへの結合を、生理学的細胞外環境（ｐＨ７．４）またはエンドソーム環境（ｐＨ５．５）を表すｐＨ条件下で同定するデータを示す。Ａは、生理学的細胞外環境を表す、ｐＨ７．４でのＴｆＲへのＴｆＲ結合シスチン高密度ペプチド（ＣＤＰ）（配列番号３２）の結合を測定するための結合アッセイにおけるフローサイトメトリーの結果を示す。配列番号３２を発現する細胞を、ｐＨ７．４で１０ｎＭのＴｆＲ及び１０ｎＭのＳｔｒｅｐ－６４７で染色した。ボックスは、Ｃに示される定量で使用される、「スライス」ゲートを示す。Ｂは、ｐＨ５．５でのＴｆＲへのＴｆＲ結合ＣＤＰ（配列番号３２）の結合を測定するための結合アッセイにおけるフローサイトメトリーの結果を示す。配列番号３２を発現する細胞を、エンドソーム環境を表すｐＨ５．５で１０ｎＭのＴｆＲ及び１０ｎＭのＳｔｒｅｐ－６４７で染色した。ボックスは、Ｃに示される定量で使用される、「スライス」ゲートを示す。Ｃは、Ａで測定されたｐＨ７．４でのＴｆＲ結合ペプチドの標識効率と、Ｂで測定されたｐＨ５．５での標識効率との比較を示す。結果は、ＴｆＲ結合シスチン高密度ペプチド（ＣＤＰ、配列番号３２）の結合が、生理学的細胞外条件及とエンドソーム条件の両方で堅牢であり、匹敵することを示している。標的分子の選択的枯渇のための組成物を開発するためのワークフローを概略的に示す。標的結合ペプチドは、標的結合ペプチド候補を含む発現ライブラリを標識された標的分子で染色することによって同定される。ライブラリからの標的結合ペプチドは、結合した標的分子からのシグナルの蓄積によって識別される。任意選択で、同定された標的結合ペプチドを選択し、例えば点変異スクリーニングを使用して、結合のためにさらに成熟させる。同定された標的結合ペプチドは、例えば、Ｄに示されるようにヒスチジン点変異スキャンを実施することによって、ｐＨ依存性結合のために改変される。得られたｐＨ依存性標的結合ペプチドは、（例えば、融合ペプチドとして）再循環物質（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド）に連結されて、選択的枯渇複合体を形成する。細胞表面または培地などから標的を枯渇させる選択的枯渇複合体の能力のインビトロ検証を概略的に示す。選択的枯渇複合体の表現型スクリーニングを概略的に示す。選択的枯渇複合体は、選択的枯渇複合体を発現する細胞における標的枯渇を試験することによって検証できる。複合体を健康な細胞及び形質転換細胞株でさらに試験して、選択的枯渇複合体の疾患特異的機能を測定することができる。複合体の特異性は、アポトーシス阻害剤の枯渇によるがん特異的な増殖阻害など、標的特異的な細胞機能の変化を試験することによって測定できる。ｐＨ依存性結合親和性を標的結合ペプチドに導入するためのヒスチジン置換スキャンの例を示す。ＰＤ－Ｌ１結合ＣＤＰ（配列番号１８７）のヒスチジン置換スキャンが示されている。ペプチド配列は上と横に提供され、それぞれの黒いボックスは、Ｈｉｓが置換される可能性のある１番目と２番目の部位を表す。左上から右下への対角線に沿って落ちるものは、単一のＨｉｓの置換を表す。同定されたヒスチジン含有ペプチドを含むペプチドライブラリは、例えば、Ａに示されるワークフローを使用して生成及びスクリーニングされ得る。ｐＨ依存性結合を有する標的結合ペプチドと、ｐＨ非依存性結合を有するＴｆＲ結合ペプチドなどのＴｆＲ結合ペプチドとを含む組成物を使用して、可溶性標的分子を選択的に枯渇させるための方法を概略的に示す。組成物は、ＴｆＲ及び可溶性標的分子に結合し、トランスフェリン受容体媒介エンドサイトーシスを介してエンドサイトーシスされる。エンドサイトーシス区画の酸性化により標的分子が放出され、標的分子の一部または全部がリソソーム区画で分解される。ＴｆＲと組成物は細胞表面に再循環される。ｐＨ依存性結合を有する標的結合ペプチドと、ｐＨ非依存性結合を有するＴｆＲ結合ペプチドなどのＴｆＲ結合ペプチドとを含む組成物を使用して、表面標的分子を選択的に枯渇させるための方法を概略的に示す。組成物は、ＴｆＲ及び表面標的分子に結合し、トランスフェリン受容体媒介エンドサイトーシスを介してエンドサイトーシスされる。エンドサイトーシス区画の酸性化により標的分子が放出され、標的分子の一部または全部がリソソーム区画で分解される。ＴｆＲと組成物は細胞表面に再循環される。血清アルブミン結合ペプチド（ＳＡ２１）に融合されたペプチドの産生及び純度を示す。Ａは、配列番号１８１に対応する血清アルブミンペプチド（ＳＡ２１）に融合されたＴｆＲ結合ペプチドの産生及び純度を示す。配列番号１８１のペプチドは、シデロカリン（ＳＣＮ、配列番号１４７）融合体として産生され、次いでＴＥＶによってＳＣＮから切断された。純度は、ＤＴＴ還元（「Ｒ」）または非還元（「ＮＲ」）条件下におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥ（左）及びＲＰ－ＨＰＬＣ（右）によって検証した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、切断していない（「Ｕ」）シデロカリン－ＣＤＰ融合ペプチドでも実施した。このデータは、ＳＣＮに融合された配列番号１８１が首尾よく生成され、次いでＴＥＶ切断によって切断され、配列番号１８１の遊離ＣＤＰ融合物を生じたことを示している。Ｂは、配列番号１８２に対応するＳＡ２１に融合されたペプチドの産生及び純度を示す。配列番号１８２のペプチドは、ＳＣＮ融合体として産生され、次いでＴＥＶによってＳＣＮから切断された。純度は、ＤＴＴ還元（「Ｒ」）または非還元（「ＮＲ」）条件下におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥ（左）及びＲＰ－ＨＰＬＣ（右）によって検証した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、切断していない（「Ｕ」）シデロカリン－ＣＤＰ融合ペプチドでも実施した。このデータは、ＳＣＮに融合された配列番号１８２が首尾よく生成され、次いでＴＥＶ切断によって切断され、配列番号１８１の遊離ＣＤＰ融合物を生じたことを示している。ダブルノット毒素（ＤｋＴｘ）ペプチドリンカー（配列番号１３９、ＫＫＹＫＰＹＶＰＶＴＴＮ）を介してＴｆＲ結合ＣＤＰに連結された標的結合ＣＤＰを含むＣＤＰ－ＣＤＰ二量体を概略的に示す。ポリ－ＧｌｙＳｅｒリンカー（配列番号１３８、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ）を介してＴｆＲ結合ＣＤＰに連結された標的結合ＣＤＰを含むＣＤＰ－ＣＤＰ二量体を概略的に示す。５位にＣｙｓからＳｅｒへの変異を有するヒトＩｇＧリンカー（配列番号１４０、ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴ）を介してＴｆＲ結合ＣＤＰに連結された標的結合ＣＤＰを含むＣＤＰ－ＣＤＰ二量体を概略的に示す。Ｆｃ二重特異性二量体を介して標的結合ペプチドに非共有結合したＴｆＲ結合ペプチドを概略的に示す。標的結合ペプチドとＴｆＲ結合ペプチドとの間にアルブミン結合タンパク質（例えば、配列番号１９２）を含み、ペプチドリンカー（例えば、配列番号１２９～配列番号１４１または配列番号１９５～配列番号２１８のいずれか１つ）によって分離されたＴｆＲ結合ペプチドと標的結合ペプチドの融合体を概略的に示す。ペプチドリンカー（例えば、配列番号１２９～配列番号１４１または配列番号１９５～配列番号２１８のいずれか１つ）によって標的結合ペプチドに融合されたアルブミン結合タンパク質（例えば、配列番号１９２）を含む、ＴｆＲ結合ペプチドと標的結合ペプチドの融合体を概略的に示す。ペプチドリンカー（例えば、配列番号１２９～配列番号１４１または配列番号１９５～配列番号２１８のいずれか１つ）によってＴｆＲ結合ペプチドに融合されたアルブミン結合タンパク質（例えば、配列番号１９２）を含む、ＴｆＲ結合ペプチドと標的結合ペプチドの融合体を概略的に示す。ＤｋＴｘリンカー（配列番号１３９）またはＧＳ３リンカー（配列番号１４１もしくは配列番号１９５～配列番号２１８）のいずれかを介して、イオンチャネル阻害性ＣＤＰ（Ｚ１Ｅ－ＡｎＴｘ、Ｚ１Ｐ－ＡｎＴｘ、ＥＷＳＳ－ＳｈＫ、ＨｓＴｘ、Ｐｒｏ－Ｖｍ２４、またはＶｍ２４）に融合されたＴｆＲ結合ペプチド（配列番号２）を含む、発現されＴＥＶ切断されたＣＤＰ－ＣＤＰ二量体のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。ＴＥＶ切断後の発現産物には、ＳＣＮ－ＣＤＰ二量体、ＳＣＮ、及びＣＤＰ二量体が含まれていた。それぞれのゲルに存在する二量体のバンドは、長方形で示される。これは、ＣＤＰ二量体が首尾よく発現され、ＳＣＮから切断されたことを実証している。それぞれのゲルは、左から右へ、後者の分子量（「Ｌ」）、非還元条件下のペプチド試料（「ＮＲ」）、及び還元条件下のペプチド試料（「Ｒ」）を含んでいた。ＴｆＲ結合ペプチド（配列番号３２、上）、Ｖｍ２４イオンチャネル阻害性ペプチド（中央）、及びＶｍ２５イオンチャネル阻害性ペプチドに融合されたＴｆＲ結合ペプチドを含むＣＤＰ－ＣＤＰ二量体（下）についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ（左）、ＲＰ－ＨＰＬＣ（中央）、及びチャネル阻害アッセイ（右）を示す。「フォールディング」は試料が非還元条件下で分析されたことを示し、「アンフォールディング」は試料が還元条件下で分析されたことを示す。このデータは、標的結合ＣＤＰ（ここでは、ＣＤＰを阻害するイオンチャネル）がＴｆＲ結合ペプチド（配列番号３２など）と二量体化でき、発現、フォールディング、及び精製できること、ならびに標的結合ＣＤＰが、ＴｆＲ結合ＣＤＰとの二量体にある間、その標的結合機能を維持できることを示す（ここに示されている機能はイオンチャネル阻害性である）。ＴｆＲ結合ペプチドが、細胞表面結合アッセイにおいて、マウスＴｆＲ（ｍＴｆＲ）に対して交差反応性があることを示すフロー染色データを示す。表面上にヒトまたはマウスのいずれかのＴｆＲを発現する２９３Ｆ細胞を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７色素で直接標識した可溶性ＴｆＲ結合ペプチドで染色した。これは、ＴｆＲ結合ペプチドがヒト（ｈＴｆＲ、配列番号１９０）とマウスＴｆＲの両方に結合することを示している。Ａは、これらの実験で使用されたＴｆＲ、この事例ではヒトＴｆＲの種特異性を示す。データは、２つのトポグラフィー密度マップとして示され、抗ｈＴｆＲ（ＣＤ７１）抗体で染色されたトランスフェリンのフローサイトメトリーデータを示す。左下から右上に斜めに配置された上の密度マップは、２９３ＳＴ＋ＳＤＧＦ－ｈＴｆＲを示す。水平に配置された下の密度マップは、２９３ＳＴ＋ＳＤＧＦ－ｍＴｆＲを示す。ｙ軸は、ｈＴｆＲ＋ストレプトアビジンを０～１０^７で、１０刻みの対数スケールで示す。ｘ軸は、ＧＦＰを０～１０^６で、１０刻みの対数スケールで示す。Ｂは、これらの実験で使用されたＴｆＲ、この事例ではマウスＴｆＲの種特異性を示す。データは、２つのトポグラフィー密度マップとして示され、抗ｍＴｆＲ（ＣＤ７１）抗体で染色されたトランスフェリンのフローサイトメトリーデータを示す。左下から右上に斜めに配置された上の密度マップは、２９３ＳＴ＋ＳＤＧＦ－ｍＴｆＲを示す。３つの葉を有する下の密度マップは、２９３ＳＴ＋ＳＤＧＦ－ｈＴｆＲを示す。ｙ軸は、ｈＴｆＲ＋ストレプトアビジンを１０^－４～１０^７で、１０刻みの対数スケールで示す。ｘ軸は、ＧＦＰを０～１０^６で、１０刻みの対数スケールで示す。Ｃは、ヒトＴｆＲに対する、配列番号１の配列を有するペプチド、配列番号２の配列を有するペプチド、配列番号３０の配列を有するペプチド、及び配列番号３２の配列を有するペプチドの結合の定量化を示す。データは、４つのトポグラフィー密度マップとして示され、２９３ＳＴ細胞＋ＳＤＧＦ－ｈＴＦＲを使用するフローサイトメトリーデータを示す。３つの密度マップは、ほぼ重ね合わせることができ、４つ目の密度マップの上に配置されている。下の密度マップは、水平に配置され、配列番号１を示す（第１世代）。上の３つの密度マップは、左下から右上に斜めに配置されている。他の２つよりもわずか上にある密度マップは、配列番号３２に対応する（第３世代）。他の２つよりもわずか下にある密度マップは、配列番号２に対応する（第２世代）。３番目の密度マップは、配列番号３０に対応する（第３世代）。このデータは、配列番号１の配列を有するペプチド、配列番号２の配列を有するペプチド、配列番号３０の配列を有するペプチド、及び配列番号３２の配列を有するペプチドがヒトＴｆＲに結合することを示す。配列番号１の配列を有するペプチドは、試験された他の３つのペプチドと比較して結合がより弱い。ｙ軸は、ｈＴｆＲ＋ストレプトアビジンを０～１０^７で、１０刻みの対数スケールで示す。ｘ軸は、ＧＦＰを０～１０^６で、１０刻みの対数スケールで示す。Ｄは、マウスＴｆＲに対する、配列番号１の配列を有するペプチド、配列番号２の配列を有するペプチド、配列番号３０の配列を有するペプチド、及び配列番号３２の配列を有するペプチドの結合の定量化を示す。データは、４つのトポグラフィー密度マップとして示され、２９３ＳＴ細胞＋ＳＤＧＦ－ｍＴＦＲを使用するフローサイトメトリーデータを示す。３つの密度マップは、ほぼ重ね合わせることができ、４つ目の密度マップの上に配置されている。下の密度マップは、水平に配置され、配列番号１を示す（第１世代）。上の３つの密度マップは、左下から右上に斜めに配置されている。他の２つよりもわずか上にある密度マップは、配列番号３２に対応する（第３世代）。他の２つよりもわずか下にある密度マップは、配列番号２に対応する（第２世代）。３番目の密度マップは、配列番号３０に対応する（第３世代）。このデータは、配列番号２の配列を有するペプチド、配列番号３０の配列を有するペプチド、及び配列番号３２の配列を有するペプチドがマウスＴｆＲに結合することを示す。配列番号１の配列を有するペプチドは、試験された条件下でｍＴｆＲへの結合を実証しなかった。ｙ軸は、ｈＴｆＲ＋ストレプトアビジンを０～１０^７で、１０刻みの対数スケールで示す。ｘ軸は、ＧＦＰを０～１０^６で、１０刻みの対数スケールで示す。ＣＲＥ－ルシフェラーゼ（ＣＲＥ－Ｌｕｃ）マウスと哺乳動物細胞の両方でニューロテンシン受容体（ＮＴＳＲ）の下流でＩＰ_１応答を誘導するＣＤＰ－ＮＴペプチド複合体を示す。Ａは、ＣＲＥ－ＬｕｃマウスのＣＲＥ駆動型ルシフェラーゼに影響を及ぼす関連経路を示す。ＰＬＣは、ホスホリパーゼＣを示す。ＡＣは、アデニリルシクラーゼを示す。ＣａＭＫは、カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼを示す。ＣＲＥＢは、ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質を示す。ＰＫＡは、プロテインキナーゼＡを示す。ＰＤＥは、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼを示す。ＦＳは、フォルスコリンを指す。Ｒｏｌは、ロリプラムを指す。ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質共役受容体を指す。Ｂは、インビトロでのニューロテンシン（ＮＴ）受容体結合を示しており、ＮＴＳＲ１を発現するＨＥＫ－２９３細胞において、ＮＴまたはＮＴペプチド複合体に応答する場合にのみＩＰ_１蓄積を示す。ＩＰ_１は、アッセイキット（ＣｉｓＢｉｏ６２ＩＰＡＰＥＢ）を使用してＦＲＥＴ比の読み取りで測定した。ウェル数は、ビヒクルを除くすべてでＮ＝３であり、ビヒクルはＮ＝３６であった。横棒は、試料の平均を示す。ｍＴＦ＝マウストランスフェリン。ベースラインＨＥＫ２９３＝ＮＴＳＲ１を発現していないＨＥＫ２９３細胞（Ｎ＝３６ウェル）の平均アッセイ値が参照として含まれた。ＥＧＦＲ駆動型がん細胞におけるチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）または抗ＥＧＦＲ抗体療法（例えば、セツキシマブ）に対する耐性の機序を概略的に示す。正常なＥＧＦＲを有するＥＧＦＲ駆動型がん細胞（パネル１）は、抗ＥＧＦＲ抗体とチロシンキナーゼ阻害剤の両方に感受性があり、いずれかの治療に応答して下流のＫＲＡＳ及びＭＥＫシグナル伝達が減少する（灰色の破線矢印で示される）。ＴＫＩ結合を妨げるＥＧＦＲの変異（パネル２）はＴＫＩに耐性があり、ＴＫＩ処理に応答して下流のシグナル伝達にほとんどまたはまったく変化を示さない（黒い実線の矢印で示される）。ＴＫＩ耐性ＥＧＦＲ駆動型がん細胞は、抗ＥＧＦＲ抗体に対して依然として感受性であり得る。他の関連する増殖因子受容体（例えば、ＨＥＲ２、ＥＲＢＢ３、またはＭＥＴ）によるヘテロ二量体化及び交差活性化により、二量体化パートナーが過剰発現しているＥＧＦＲ駆動型がん細胞（パネル３）が、抗ＥＧＦＲ抗体とＴＫＩの一方または両方に対して非感受性になる。ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）など、ＥＧＦＲが構成的に活性なＥＧＦＲ駆動型がん細胞（パネル４）は、二量体化によるＥＧＦＲの活性化を防ぐ抗ＥＧＦＲ抗体に対して感受性がない。構成的に活性なＥＧＦＲを有する細胞は、依然としてＴＫＩに対して感受性であり得る。ＥＧＦＲ駆動型がん細胞における耐性機序を克服するための選択的枯渇複合体（ＳＤＣ）の使用を概略的に示す。これは、ＳＤＣが、正常なＥＧＦＲを有するがんまたはがん細胞、及びＴＫＩまたはＥＧＦＲ抗体療法に耐性のあるがんまたはがん細胞を含む、ＥＧＦＲ駆動型がんに対して有効であり得ることを示している。ＥＧＦＲ駆動型がん細胞内の正常なＥＧＦＲを持つＥＧＦＲ駆動型がん細胞（パネル１）は、ＳＤＣによって効果的に枯渇され、その結果、ＳＤＣ治療に応答して下流のＫＲＡＳ及びＭＥＫシグナル伝達が減少する（灰色の破線の矢印で示される）。ＴＫＩ結合を妨げる変異型ＥＧＦＲ（パネル２）は、ＳＤＣによって効果的に枯渇され、ＳＤＣ処理に応答して下流のＫＲＡＳ及びＭＥＫシグナル伝達が減少する。過剰発現した増殖因子受容体（例えば、ＨＥＲ２、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ、パネル３）とヘテロ二量体化され交差活性化されたＥＧＦＲは、ＳＤＣによって効果的に枯渇され、ＳＤＣ処理に応答して下流のＫＲＡＳ及びＭＥＫシグナル伝達が減少する。ヘテロ二量体化ＥＧＦＲの枯渇は、ヘテロ二量体化のパートナー（例えば、ＨＥＲ２、ＥＲＢＢ３、またはＭＥＴ、パネル３）を枯渇させる可能性もある。ＥＧＦＲｖＩＩＩなどの構成的に活性なＥＧＦＲ（パネル４）は、ＳＤＣによって効果的に枯渇され、ＳＤＣ処理に応答して下流のＫＲＡＳ及びＭＥＫシグナル伝達が減少する。ＰＤ－Ｌ１へのｐＨ依存性結合によるペプチドの濃縮を示すフローソーティングデータを示す。このデータは、フローソーティングによってｐＨ依存性結合ペプチドを生成できることを示している。図１１Ｄに記載のように調製された、ＰＤ－Ｌ１結合ペプチド（配列番号１８７）に基づくヒスチジンドープライブラリは、中性ｐＨ（７．４）でより強いＰＤ－Ｌ１結合を示し、酸性ｐＨ（５．５）でより弱い結合を示すペプチドについてスクリーニングされた。入力ライブラリは、最初にｐＨ７．４で高いＰＤ－Ｌ１結合についてスクリーニングされた。スクリーニングの第２ラウンドと第３ラウンド（それぞれ「ソート１」と「ソート２」）は、エンドソームｐＨを模倣するためにｐＨ５．５で実行され、このｐＨでの乏しいＰＤ－Ｌ１結合について濃縮された。スクリーニングの最終ラウンド（「ソート３」）は、ｐＨ７．４で実行された。スクリーニング後、ｐＨ７．４及びｐＨ５．５で異なる結合が観察された（「ソート４」）。それぞれのグラフの５角形で囲まれた領域は、ソーティング中に選択された集団を示す。より暗いトポグラフィー密度マップは、ｐＨ７．４条件下でのＰＤ－Ｌ１による染色を示し、明るいトポグラフィー密度マップは、ｐＨ５．５条件下でのＰＤ－Ｌ１による染色を示す。図２１で同定されたｐＨ依存性ＰＤ－Ｌ１結合ペプチドバリアントについてのｐＨ７．４（左側のバー）及びｐＨ５．５（右側のバー）での結合データを示す。Ｅ２Ｈ、Ｍ１３Ｈ、及びＫ１６Ｈ置換を有する配列番号１８７のバリアントを、個別に及び組み合わせて、ＰＤ－Ｌ１へのｐＨ依存性結合についてスクリーニングした。Ｅ２Ｈ（配列番号２３４）、Ｍ１３Ｈ（配列番号２３５）、Ｋ１６Ｈ（配列番号２３６）、Ｅ２Ｈ及びＭ１３Ｈ（配列番号２３７）、Ｅ２Ｈ及びＫ１６Ｈ（配列番号２３３）、Ｍ１３Ｈ及びＫ１６Ｈ（配列番号２３８）、またはＥ２Ｈ、Ｍ１３Ｈ、及びＫ１６Ｈ（配列番号２３９）に置換を含むペプチドバリアントは、ＰＤ－Ｌ１に対するさまざまな程度のｐＨ依存性結合を示した。「ＵＴＦ」は、トランスフェクトされていない細胞（陰性対照）を示す。親ペプチド（配列番号１８７）は、ＰＤ－Ｌ１に対してある程度のｐＨ依存性結合を示した。配列番号１８７のいくつかのバリアントは、親よりもＰＤ－Ｌ１結合においてより多くのｐＨ依存性を示したが、配列番号１８７のいくつかのバリアントは、親よりもＰＤ－Ｌ１結合においてより少ないｐＨ依存性を示した。配列番号２３４のペプチドは、ｐＨ７．４対ｐＨ５．５での結合において大きな差異を有することが示され、ｐＨ５．５よりもｐＨ７．４でより高い結合を実証した。配列番号２３３のペプチド（黒い矢印）は、ｐＨ７．４対ｐＨ５．５での結合において特に大きな差異を有することが示され、ｐＨ５．５よりもｐＨ７．４でより高い結合をも実証した。このデータは、ｐＨ７．４ではより高いレベルで、ｐＨ５．５ではより低いレベルでＰＤ－Ｌ１に結合するペプチドの生成を示している。図２３Ｂ及び図２３Ｃに示されるアッセイで利用されるものなどの選択的枯渇複合体のドメイン構成を概略的に示す。選択的枯渇複合体は、Ｎ末端からＣ末端まで、標的結合ペプチド、第１のペプチドリンカー（ＧＧＧＧＳ×４、配列番号２２４）、アルブミン結合ペプチド（配列番号２２７）、第２のペプチドリンカー（ＧＧＧＧＳ×４、配列番号２２４）、及びＴｆＲ結合ペプチドを含む。図２３Ａに示されるように配置された２つの精製された選択的枯渇複合体、及びＴｆＲ結合ペプチドがＴｆＲに結合しないペプチドで置換されている２つの陰性対照複合体のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。ペプチド１（配列番号３６７）は、ＥＧＦＲに結合する標的結合ペプチド（配列番号２４４）、及び配列番号２３２に対応するＴｆＲに有意に結合しないペプチドを含んでいた。ペプチド２（配列番号３２８）は、ＥＧＦＲに結合する標的結合ペプチド（配列番号２４４）及び配列番号９６に対応する高親和性ＴｆＲ結合ペプチドを含んでいた。ペプチド３（配列番号３５７）は、ＰＤ－Ｌ１に結合する標的結合ペプチド（配列番号１８７）及び配列番号２３２に対応するＴｆＲに有意に結合しないペプチドを含んでいた。ペプチド４（配列番号３５６）は、ＰＤ－Ｌ１に結合する標的結合ペプチド（配列番号１８７）及び配列番号９６に対応する高親和性ＴｆＲ結合ペプチドを含んでいた。このデータは、これらのペプチドの生産と純度を示している。図２３Ｂに示される４つのペプチド複合体の、ＥＧＦＲ（左）またはＰＤ－Ｌ１（右）を発現する細胞との三元複合体形成を示す。細胞を蛍光標識したＴｆＲで染色し、細胞表面上に発現した標的タンパク質、ペプチド複合体、及びＴｆＲ間の三元複合体形成を検出した。ＥＧＦＲ結合ペプチドと高親和性ＴｆＲ結合ペプチドを含むペプチド２（配列番号３２８）は、ＥＧＦＲ発現細胞と三元複合体を形成したが、ＰＤ－Ｌ１発現細胞とは形成しなかった。ＰＤ－Ｌ１結合ペプチドと高親和性ＴｆＲ結合ペプチドを含むペプチド４（配列番号３５６）は、ＰＤ－Ｌ１発現細胞と三元複合体を形成したが、ＥＧＦＲ発現細胞とは形成しなかった。高親和性ＴｆＲ結合ペプチドを含まないペプチド１及び３は、三元複合体を形成しなかった。このデータは、標的結合ペプチドとＴｆＲ結合ペプチドを含むペプチド複合体が、細胞表面上で標的及びＴｆＲと三元複合体を形成できることを示している。選択的枯渇複合体（ＳＤＣ、標的結合ペプチド、受容体結合ペプチド、及びＨｉｓタグ（配列番号２２８）を含む）と、細胞表面上に発現する標的タンパク質、及び細胞表面上に発現するトランスフェリン受容体との三元複合体の形成を概略的に示す。ＰＤ－Ｌ１に結合する標的結合ペプチド（配列番号１８７、「ＰＤＬ１」）を含む（＋）か、または含まない（－）、及びＴｆＲに結合する受容体結合ペプチド（配列番号９６、「ＴｆＲ」）を含むか、または含まないペプチド複合体の、ＰＤ－Ｌ１（「ＰＤＬ１」）を発現するかまたは発現しないでＴｆＲを発現する細胞に対する結合データを示す。すべてのペプチド複合体は、Ｈｉｓタグ（配列番号２２８）を含んでいた。１^番目のバーは、ペプチド複合体なしのＰＢＳ陰性対照に対応する。２^番目と３^番目のバーは、配列番号３５７のペプチド複合体を使用して測定された。４^番目及び５^番目のバーは、ＰＤ－Ｌ１とＴｆＲの両方に結合することができる配列番号３５６のペプチド複合体を使用して測定された。ＰＤ－Ｌ１結合ペプチドとＴｆＲ結合ペプチドの両方を含むペプチド複合体は、選択的枯渇複合体（ＳＤＣ）であり得る。ペプチド複合体上のＨｉｓタグに結合した蛍光抗Ｈｉｓ抗体を用いて結合を測定した。ＰＤ－Ｌ１とＴｆＲの両方を発現している細胞で、ＰＤ－Ｌ１とＴｆＲの両方に結合するＳＤＣを使用すると、高レベルの結合が観察された。このデータは、細胞が標的と受容体の両方を発現している場合、標的と受容体の両方に結合するペプチドを含むＳＤＣがその細胞に高レベルで結合することを示している（５^番目のバー）。データはまた、ＴｆＲに結合するペプチド複合体がＴｆＲを発現している細胞に結合することも示している（４^番目のバー）が、表面の標的結合物質を追加するとＳＤＣ結合が増加するが（５^番目のバー）、おそらく協同的結合が原因である。協同的な結合は、２つのＴｆＲ結合ペプチドを含むＳＤＣを使用することによっても達成し得る。単一の標的結合部分（この例ではＥＧＦＲ結合ナノボディまたはＰＤ－Ｌ１結合ＣＤＰ）と単一の受容体結合部分（この例ではＴｆＲ結合ＣＤＰまたはｓｃＦｖ）を含む一価の選択的枯渇複合体の例を概略的に示す。これらは、両方の部分がリンカーによって分離されている単一のタンパク質、または１つの単量体がＴｆＲ結合部分を含み、別の単量体が標的結合部分を含む二量体複合体として配置できる。活性触媒分子は、ＴｆＲ結合部分がｐＨ非依存的に結合し、標的結合部分がｐＨ依存的に結合する分子である。活性非触媒分子は、ＴｆＲ結合部分がｐＨ依存的に結合し、標的結合部分がｐＨ非依存的に結合する分子である。活性触媒分子または活性非触媒分子のいずれかが、それらの標的の選択的枯渇を引き起こすと予想される。非触媒分子は標的とともにエンドソーム分解経路を移動し、触媒分子はＴｆＲを追って細胞表面に戻り、別の標的に結合する。代表的な対照分子は、ＴｆＲ結合部分と標的結合部分の両方がｐＨ非依存的に結合するが、活性触媒または活性非活性分子と同じくらい効果的または同程度に標的の選択的枯渇を引き起こすか、または、標的の選択的枯渇をまったくまたは有意な方法で引き起こすとは予想されないものである。他の対照を使用して、活性触媒分子または活性非触媒分子のＴｆＲ依存性を評価することができ、ＴｆＲに結合しない分子の枯渇を比較測定することを含むことができる。その対照は、活性触媒分子または活性非触媒分子と同じくらい効果的または同程度に標的の選択的枯渇を引き起こすか、または、標的の選択的枯渇をまったくまたは有意な方法で引き起こすとは予想されないものである。ＴｆＲ結合及び／または標的結合について異なる原子価を有する選択的枯渇複合体の例を概略的に示す。この図は、ＴｆＲ結合部分（この場合はｐＨ非依存性ＴｆＲ結合ＣＤＰ）が分子内に１回（一価）または分子内に２回（二価）存在し得、標的結合部分（この場合はｐＨ依存性ＥＧＦＲ結合ナノボディ）は、分子内に１回（一価）または分子内に２回（二価）存在し得るＦｃ融合体を示す。２つの単量体が同一でないＦｃ融合体は、ノブインホール（ＫＩＨ）二量体化によって組み立てることができる。多価の選択的枯渇複合体は、単一のポリペプチド鎖として発現することもできる（図示せず）。ＰＤ－Ｌ１に結合またはドッキングした高親和性ＰＤ－Ｌ１結合ＣＤＰ（配列番号１８７、漫画）の共結晶構造を示す（表面、明るい陰影は酸素を示し、暗い陰影は窒素を示す）。図２６Ａの共結晶構造に見られるように、分解された（Ｒ）残基または分解されていない（ＵＲ）残基にアミノ酸置換を含むＰＤ－Ｌ１結合ＣＤＰバリアントの、平均ＳＳＭ富化の絶対値として示される、相対的結合富化を示す。分解された残基での置換は、分解されていない残基での置換よりも結合に対して正または負の大きな影響を及ぼし（＊＊：Ｐ＝０．００５５）、分解された残基が分解されていない残基よりもＰＤ－Ｌ１との相互作用においてより大きな役割を果たしたことを示している。ＰＤ－Ｌ１との結合界面におけるＰＤ－１（メッシュ）と配列番号１８７（漫画）との重ね合わせを示す（表面、明るい陰影は酸素を示し、暗い陰影は窒素を示す）。ＰＤ－１結合部位は配列番号１８７と重複しており、配列番号１８７がＰＤ－Ｌ１への結合についてＰＤ－１と競合すると予想されることを示している。図２６Ａの配列番号１８７のＰＤ－Ｌ１共結晶構造の、２つの異なる角度からの拡大図を示す。Ｋ５、Ｖ９、Ｗ１２、Ｍ１３、Ｋ１６、Ｖ３９、Ｆ４０、Ｌ４３、及びＤ４４を含む、ＰＤ－Ｌ１と相互作用する配列番号１８７の残基は棒として示されている。Ｙ５６、Ｑ６６、Ｒ１１３、Ｍ１１５、Ａ１２１、及びＹ１２３を含む、配列番号１８７と相互作用するＰＤ－Ｌ１の残基も標識される。配列番号１８７（灰色）の選択された残基の単離された側鎖を、親ＣＤＰに対するＰＤ－Ｌ１結合界面で示す（黒色、最小限に衝突する回転異性体）。Ｍ１３、Ｖ３９、Ｆ４０、及びＬ４３を含む配列番号１８７の標識された残基は、ＰＤ－Ｌ１への結合を改善した親ＣＤＰに対する置換に対応する。配列番号１８７（漫画）とＰＤ－Ｌ１（表面）との間の結合界面の拡大図を示す。ＰＤ－Ｌ１表面は、ヒト（Ｈｓ）とマウス（Ｍｍ）の相同性に応じて色分けされている。白は同一の残基に対応し、暗い影は類似の残基に対応し、明るい影は異なる残基に対応する。ヒトＰＤ－Ｌ１とマウスＰＤ－Ｌ１の間の結合界面におけるこれらの差異は、配列番号１８７で見られるマウスのＰＤ－Ｌ１交差反応性の欠如と一致している。配列番号１８７とＰＤ－Ｌ１の共結晶構造を示し、配列番号１８７は、目的の側鎖が太い棒で示されているワイヤー図として示されている（上）。比較のために、ＰＤ－Ｌ１へのＰＤ－１の結合を下に示す。

本明細書に記載されるのは、細胞エンドサイトーシス経路（例えば、トランスフェリン受容体媒介エンドサイトーシス）を使用して標的分子を選択的に枯渇させるための組成物及び方法である。細胞外タンパク質、可溶性タンパク質、及び細胞表面タンパク質は、増殖、細胞死、炎症、代謝など、細胞と器官の間のシグナル伝達を媒介する。このようなタンパク質は、生産、使用、分解を定期的に繰り返しており、それらの分解は典型的には、エンドソーム－リソソーム経路内で行われる。この経路では、細胞外空間から取り込まれた物質を含むエンドサイトーシス小胞及び埋め込まれた膜タンパク質が酸性化され、そのようなタンパク質を分解する酵素を含むリソソームと融合するか、リソソームに入る。リソソームへの選択的送達を介した循環組織または疾患関連組織からの特定の細胞表面タンパク質または可溶性タンパク質の選択的除去は、可溶性タンパク質もしくは細胞表面タンパク質の過剰発現もしくは蓄積に起因する疾患、または可溶性タンパク質もしくは表面タンパク質における変異（例えば、構成的活性、治療に対する耐性、もしくはドミナントネガティブ活性を引き起こす変異）に関連する疾患を治療するのに使用できる。代替的に、または追加的に、本明細書に記載の選択的枯渇複合体を使用して、投与された治療薬をエンドソーム区画またはリソソーム区画に送達し、例えば、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼの欠乏）またはポンペ病（α－グルコシダーゼの欠乏）などのリソソーム蓄積症を治療することができる。治療分子（例えば、酵素補充療法のためのリソソーム酵素）は、治療分子に結合する標的結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体とともに投与することができ、それによって治療分子をエンドソームまたはリソソームに送達する。いくつかの実施形態では、選択的枯渇構築物は、選択的送達複合体として機能し、エンドソームまたはリソソームへの活性酵素の送達を促進することができる。例えば、リソソーム酵素は、選択的枯渇複合体を使用して送達することができ、エンドソームまたはリソソーム内で酵素活性を保持することができる。リソソーム酵素に結合する標的結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体と組み合わせたリソソーム酵素の投与は、リソソーム酵素単独の投与と比較して、投与される酵素の用量あたりの治療応答を増加させることができる。標的タンパク質の選択的枯渇またはリソソームタンパク質の送達のために、リソソーム送達は、既存のタンパク質の取り込みと再循環のメカニズムを利用し、ｐＨ依存性結合ドメインを標的結合分子に操作することによって達成できる。

標的分子の選択的枯渇に使用できるエンドサイトーシス経路の独特な例は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）の細胞内移行と輸送を介したものであり、これは通常、細胞及び組織への鉄の送達のためのトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を介したトランスフェリンの再循環に使用される。トランスフェリンは、レドックス感受性細胞内酵素に向かう鉄イオンの血清シャペロンとして知られている。鉄負荷トランスフェリン（ホロ－トランスフェリン）は、ＴｆＲへの特異的結合を介して鉄を細胞に送達し、鉄負荷トランスフェリンはエンドソームに輸送され、そこでは天然のプロトンポンプによってｐＨが低下している。酸性条件下では、トランスフェリンは鉄結合親和性を失い、細胞内に鉄を放出するが、ＴｆＲ結合親和性は維持する。ＴｆＲ：トランスフェリン複合体は本来細胞表面に再循環され、トランスフェリンを中性ｐＨ条件にさらす。鉄によって結合されていないトランスフェリン（アポ－トランスフェリン）は、細胞表面での中性ｐＨ条件下ではもはやＴｆＲ親和性を有さず、循環に放出されてより多くの鉄を拾い上げ、本質的に細胞への鉄送達の触媒プロセスであるプロセスを繰り返す。

本開示の組成物及び方法は、トランスフェリン受容体エンドサイトーシス及び再循環経路を利用して、標的分子（例えば、可溶性タンパク質または細胞表面タンパク質）をリソソーム分解のためにエンドサイトーシス小胞に送達する。本開示の組成物及び方法は、この経路を介して疾患において過剰発現する特定の標的受容体または可溶性タンパク質を選択的に分解するために使用することができる。標的受容体または可溶性タンパク質のリソソーム分解の結果として、記載されている組成物及び方法は、循環中の細胞表面タンパク質または可溶性タンパク質から標的受容体を効果的に低減、減少、排除、または枯渇させ、これは、本明細書に記載のように医学において多くの用途を有する。本開示の選択的枯渇複合体は、標的結合ペプチド（例えば、標的結合シスチン高密度ペプチド、標的結合抗体、標的結合ナノボディ、標的結合抗体断片、または他の標的化剤）に結合したＴｆＲ結合ペプチド（例えば、ＴｆＲ結合システイン高密度ペプチド）は、ＴｆＲ（ＴｆＲ結合ペプチドを介して）と標的（標的結合を介して）の両方に結合することにより、標的分子をＴｆＲに動員することができる。エンドサイトーシスの際、ＴｆＲは選択的枯渇複合体と標的分子をエンドサイトーシス小胞に運ぶことができる。いくつかの実施形態では、選択的枯渇複合体のＴｆＲ結合ペプチドは、細胞外ｐＨ（約ｐＨ７．４）からエンドソームｐＨ（約ｐＨ５．５）まで（両端を含む）で、ＴｆＲに対して高い親和性を有し得る。ＴｆＲ結合ペプチドは、内部移行時及びエンドソーム区画が酸性化する際に、ＴｆＲに対する親和性を維持できる。選択的枯渇複合体の標的結合ペプチドは、細胞外ｐＨで標的分子に対してより高い親和性を有することができ、より低いエンドソームｐＨで標的分子に対してより低い親和性を有することができる。エンドサイトーシス小胞内で、選択的枯渇複合体はＴｆＲに結合したままになり、エンドソームの酸性化によって標的分子を放出することができる。標的が放出されると、選択的枯渇複合体はＴｆＲに結合したままになり、ＴｆＲは細胞表面に再循環されて別の標的分子が再ロードされる。標的分子はエンドソームに留まったままになり得、そこでリソソームに送達されて分解される。いくつかの実施形態では、選択的枯渇複合体のＴｆＲ結合ペプチドは、細胞外ｐＨでＴｆＲに対してより高い親和性を有することができ、より低いエンドソームｐＨで標的分子に対してより低い親和性を有することができる。エンドサイトーシス小胞の内部では、選択的枯渇複合体がエンドソームの酸性化の際にＴｆＲら放出され得る。

本開示の方法は、細胞（例えば、ＴｆＲを発現する細胞）を選択的枯渇複合体（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド及び標的結合ペプチドを含む分子）と接触させることを含み得る。選択的枯渇複合体は、トランスフェリン受容体を介した（ＴｆＲを介した）エンドサイトーシスを介して、標的分子をエンドサイトーシス小胞に動員できる。標的分子はエンドサイトーシス小胞に放出され得、そこでリソソームに送達されて分解される。選択的枯渇複合体は、ＴｆＲに結合したままにすることができ、ＴｆＲが細胞表面に再循環されるため、ＴｆＲに結合したままにすることができる。そのような方法は、疾患または状態に関連する分子などの標的分子を枯渇させるために使用することができる。例えば、本開示の方法を使用して、過剰発現しているか、疾患関連変異（例えば、構成活性、治療抵抗性、またはドミナントネガティブ活性を引き起こす変異）を含むか、または疾患または状態において蓄積する、可溶性タンパク質または細胞表面タンパク質を選択的に枯渇させることができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の選択的枯渇複合体は、小分子、ペプチド、もしくはタンパク質などの任意の分子タイプの化学コンジュゲーションによって、またはペプチドもしくはタンパク質の組換え融合によってそれぞれ連結される、ペプチドコンジュゲート、ペプチド複合体、ペプチド構築物、融合ペプチド、または融合分子を含み得る（例えば、ペプチド構築物またはペプチド複合体）。「融合ペプチド」及び「ペプチド融合体」という用語は、本明細書中で交換可能に使用される。いくつかの実施形態では、ペプチド構築物またはペプチド複合体は、生物学的または合成的に生成することができる。したがって、場合によっては、選択的枯渇複合体は、小分子、ペプチド、もしくはタンパク質などの別の分子もしくは分子群、またはナノ粒子などの他の巨大分子に連結されたＴｆＲ結合ペプチドドメインを含み得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の選択的枯渇複合体は、１つ以上の標的結合ペプチド、１つ以上の活性剤（例えば、治療剤、検出可能な薬剤、またはそれらの組み合わせ）、またはそれらの組み合わせにコンジュゲート、連結、または融合された、１つ以上の本明細書に記載のＴｆＲ結合ペプチドを含むペプチド複合体であり得る。本明細書に記載の選択的枯渇複合体は、化学コンジュゲート及び組換え融合分子を含み得る。場合によっては、化学コンジュゲートは、別のペプチド（例えば、標的結合ペプチド）、分子、薬剤、またはそれらの組み合わせに化学的にコンジュゲートされるか、または連結された本明細書に記載のＴｆＲ結合ペプチドを含み得る。分子は、小分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または他の巨大分子（例えば、ナノ粒子）及びポリマー（例えば、核酸、ポリリジン、またはポリエチレングリコール）を含み得る。場合によっては、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、リンカーを介して別のペプチドまたは分子にコンジュゲートされる。リンカー部分は、切断可能（例えば、ｐＨ感受性リンカーもしくは酵素に不安定なリンカー）または安定なリンカーを含み得る。いくつかの実施形態では、ペプチド複合体は、組換え発現され得る融合分子（例えば、融合ペプチドまたは融合タンパク質）であり、融合分子は、組換え発現され得る１つ以上の他の分子ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または他の巨大分子に融合された１つ以上のＴｆＲ結合ペプチドを含み得る。

本開示の選択的枯渇複合体（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド及び標的結合ペプチドを含む複合体）は、分解されているが細胞表面に再循環されていないリソソーム送達分子と比較して、より低い用量で治療効果を有するか、またはより長く持続する治療効果を有することができる。本開示の選択的枯渇複合体は、リソソーム内で分解されるのではなく、細胞表面に再循環して標的を「リロード」することができ、これは、本開示の１つの選択的枯渇複合体の可能性が、潜在的な触媒効果によって、複数の標的の分解を促進できることを意味する。細胞表面に再循環されないリソソーム送達分子は、再循環または「リロード」されることなく、それ自体が分解され得るか、リソソームに蓄積し得る。本開示の選択的枯渇複合体（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド及び標的結合ペプチドを含む複合体）は、細胞表面に再循環されないリソソーム送達分子と比較して、より広い治療ウィンドウ（すなわち、それを超えると治療薬力学的応答が観察されるが、それを下回ると毒性が観察される投与量）を有することができる。薬物（例えば、本開示の選択的枯渇複合体）の治療ウィンドウは、薬物が許容できない毒性作用を有さずに有効である用量範囲である。本開示の選択的枯渇複合体（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド及び標的結合ペプチドを含む複合体）は、毒性のリスクがより少なく使用することができる。本開示の選択的枯渇複合体（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド及び標的結合ペプチドを含む複合体）は、細胞表面に再循環されない代替的な療法（例えば、リソソーム送達分子）よりも低いモル投与量で使用することができる。細胞内での本開示の選択的枯渇複合体の選択性及び再循環可能な性質のために、治療剤として、それらは、使用されるにつれて枯渇するリソソームを標的とする再循環不可能な送達組成物ほど急速に枯渇しないという利点がある。さらに、本開示の選択的枯渇複合体の選択性及び再循環の側面のために、治療剤として、非選択的治療剤より毒性が低いという利点がある。これは、治療薬が非選択的で毒性が高くなり得、正常な細胞、器官、及び組織に有害な副作用を示すか、または効果的な治療用量よりも少ない量が必要とされるため、疾患を軽減、治癒、除去する能力が低くなる、がんへの適用に特に有利である。

本開示の選択的枯渇複合体（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド及び標的結合ペプチドを含む複合体）は、糖、グリカン、糖様分子含有ポリマー、または他の誘導体を含む代替的な療法（例えば、リソソーム送達分子）よりも免疫原性が低くなり得る。本開示の選択的枯渇複合体は、マンノース－６－リン酸受容体またはアシアロ糖タンパク質受容体を標的とする代替的な療法（例えば、リソソーム送達分子）よりも免疫原性が低くなり得る。本開示の選択的枯渇複合体は、単一の組換え発現によって製造することができ、マンノース－６－リン酸受容体またはアシアロ糖タンパク質受容体に対するリガンドを生成する多重合成ステップを有する分子よりも、製造歩留まり、純度、コスト、または製造時間が向上し得る。本開示の選択的枯渇複合体は、細胞表面で結合する標的を含めて、ＴｆＲ及び標的に同時に結合する能力が最大になるようにリンカーを設計する能力により、より大きな治療効果またはより低い治療用量を有することができる。本開示のＴｆＲ結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドコンジュゲート、またはＴｆＲ結合融合ペプチドは、ＴｆＲ結合抗体ベースの治療薬と比較して、適応免疫応答を誘発するエピトープがより少ないため、免疫原性が低下し得る。本開示のＴｆＲ結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドコンジュゲート、またはＴｆＲ結合融合ペプチドは、ＴｆＲ結合抗体ベースの治療薬と比較して、活性薬剤のタンパク質融合複合体への組み込みがより容易でより破壊的でないことを示し得る。本開示のＴｆＲ結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドコンジュゲート、またはＴｆＲ結合融合ペプチドは、ＴｆＲ結合抗体ベースの治療薬と比較して、表面積が小さいため、オフターゲット結合のリスクが低くなり得る。本開示のＴｆＲ結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドコンジュゲート、またはＴｆＲ結合融合ペプチドは、分子量がより小さい、流体力学的半径がより小さい、またはモル溶液粘度がより低いため、ＴｆＲ結合抗体ベースの治療薬よりも高いモル濃度で製剤化することができる。

いくつかの実施形態では、本開示のＴｆＲ結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドコンジュゲート、またはＴｆＲ結合融合ペプチドは、対象に同じモル用量または同様の有効用量で投与された場合、抗ＴｆＲ抗体または他の治療剤よりもより低いオンターゲット毒性を示す。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドコンジュゲート、またはＴｆＲ結合融合ペプチドは、対象に同じモル用量または同様の有効用量で投与された場合、抗体または他の治療剤よりもより低いオフターゲット毒性を示す。例えば、本開示のＴｆＲ結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドコンジュゲート、またはＴｆＲ結合融合ペプチドは、抗体よりも約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍高いモル用量で対象に投与され得るが、観察される毒性は同等であるか、または低い。いくつかの実施形態では、本開示のＴｆＲ結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチドコンジュゲート、またはＴｆＲ結合融合ペプチドは、抗ＴｆＲ抗体または他の治療剤と同じ重量用量で対象に投与された場合、抗ＴｆＲ抗体または他の治療剤よりもより高い有効性を示す。本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、半減期延長部分（例えば、Ｆｃ、ＳＡ２１、ＰＥＧ）に融合された場合、活性及び有効性を維持しながら、さらに低用量で送達することができ、したがって、抗ＴｆＲ抗体または他の治療剤の投与よりもはるかに優れている。

いくつかの実施形態では、本開示は、ＴｆＲに結合する、ペプチド（例えば、ＣＤＰ、ノットペプチド、またはヒッチン）、化学コンジュゲート（例えば、１つ以上のＴｆＲ結合ペプチド及び１つ以上の活性剤を含む）、または組換え発現された融合分子（例えば、１つ以上のＴｆＲ結合ペプチド及び１つ以上の活性剤を含む）を提供する。ＴｆＲ結合ペプチドは、システイン高密度ペプチド（ＣＤＰ）であり得る。「ペプチド」、「ミニタンパク質」、「タンパク質」「ＣＤＰ」、「ＴｆＲ結合ペプチド」、「ＴｆＲ結合ＣＤＰ」、「ＴｆＲ結合ペプチド」、及び「操作されたＴｆＲ結合ペプチド」という用語は、本明細書中で交換可能に使用される。本開示に記載のペプチドのＴｆＲへの結合は、選択的枯渇複合体、ペプチド、ペプチド複合体、またはペプチド構築物（例えば、融合タンパク質、または薬剤にコンジュゲート、連結、もしくは融合されたペプチド）の細胞障壁（例えば、ＢＢＢ）を越えたトランスサイトーシスを促進することができる。本開示に記載のペプチドのＴｆＲへの結合は、ＴｆＲを発現する任意の細胞における、またはいくつかのがん細胞、肝細胞、脾臓細胞、及び骨髄細胞における、選択的枯渇複合体、ペプチド、またはペプチド複合体のエンドサイトーシスを促進することができる。また本明細書で開示されるのは、ＣＤＰの多様なライブラリをスクリーニングし、ヒトＴｆＲに特異的に結合するＣＤＰを同定するための哺乳動物表面提示スクリーニングプラットフォームの使用である。そのような同定されたペプチドは、改変してＴｆＲへの結合を改善し、ＴｆＲに結合して細胞表面に再循環されるペプチドまたはペプチド複合体（例えば、図１２Ａ及び図１２Ｂに示されるようなｐＨ非依存性ＴＦＲ結合ＣＤＰ）として、選択的枯渇複合体において使用することができる。また本明細書で開示されるのは、ＣＤＰの多様なライブラリをスクリーニングし、分解することが望まれる標的に特異的に結合するＣＤＰを同定するための哺乳動物表面提示スクリーニングプラットフォームの使用である。そのような同定されたペプチドは、選択された標的への結合について最適化され、そのような選択された標的に結合し、細胞内での分解のためにエンドソーム内で放出されるペプチドまたはペプチド複合体（例えば、図１２Ａ及び図１２Ｂに示されるようなｐＨ依存性標的結合ＣＤＰ）として選択的枯渇複合体で使用することができる。その後、さらなる親和性成熟を実施して、必要に応じてさまざまな親和性を有するＴｆＲ結合ＣＤＰまたは標的結合ＣＤＰのアレルシリーズを得ることができる。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ＣＤＰまたは標的結合ＣＤＰが同定され、結合は結晶学または他の方法によって決定され得る。本開示のペプチドは、種間で交差反応性を有し得る。例えば、本明細書で開示されるペプチドは、場合によっては、ヒトとマウスのＴｆＲに結合する。本明細書で開示されるペプチドは、静脈内投与後、ＣＮＳに蓄積し、ＴｆＲの結合を介してＢＢＢを透過することができる。本明細書で開示されるのは、腫瘍学、自己免疫疾患、急性及び慢性の神経変性、ならびに疼痛管理における治療薬送達剤として使用するためのＴｆＲ結合ＣＤＰである。ＴｆＲ結合ＣＤＰを介した活性剤または医薬品の送達は、製造がより簡単で（ペプチドは生物学的または合成的な手段により製造することができる）、安定性が改善され、治療ウィンドウが改善され、サイズが小さい（カーゴ活性の立体障害の可能性が低い）ことから、従来の抗ＴｆＲ抗体よりも有利であり得る。したがって、本開示の方法及び組成物は、ＣＮＳ（例えば、脳）内にカーゴ分子（例えば、治療用及び／または診断用の小分子、ペプチドまたはタンパク質）を効果的に輸送するという課題に対する解決策を提供することができる。例えば、本開示のペプチドは、脳内に位置する腫瘍への薬物送達を助ける。

本開示のいくつかの実施形態では、ＣＤＰ、ノットペプチド、ヒッチン、またはノットペプチドもしくはヒッチンに由来するペプチドの多様なライブラリは、哺乳動物表面提示スクリーニングプラットフォームと組み合わせて使用することができ、再循環が望まれるヒトＴｆＲまたは分解が望まれる標的に特異的に結合するペプチドを同定するために使用される。（例えば、Ｃｒｏｏｋｅｔａｌ．（２０１７）Ｍａｍｍａｌｉａｎｄｉｓｐｌａｙｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｄｉｖｅｒｓｅｃｙｓｔｉｎｅ－ｄｅｎｓｅｐｅｐｔｉｄｅｓｆｏｒｄｉｆｆｉｃｕｌｔｔｏｄｒｕｇｔａｒｇｅｔｓ．ＮａｔＣｏｍｍｕｎ８：２２４４を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＣＤＰ、ノットペプチド、ヒッチン、またはノットペプチドもしくはヒッチンに由来するペプチドの多様なライブラリは、新規ペプチド配列を得るために内在性ペプチド配列から変異導入される。ＴｆＲ結合ペプチドまたは標的結合ペプチドが同定されたら、親和性成熟（例えば、部位飽和変異導入）を実施して、ＴｆＲまたは標的に対する親和性がさまざまな（例えば、改善された）結合物質のアレルシリーズを得ることができる。これらの技術は、ペプチド－受容体相互作用の性質（例えば、受容体結合などに重要なアミノ酸残基）を同定するために、さまざまな他の分析方法（例えば、結晶学または分光法）と組み合わせて使用することができる。場合によっては、本開示のペプチドを成熟させてヒトＴｆＲに結合させる。

いくつかの実施形態では、本開示の操作されたペプチド（例えば、ヒスチジン含有またはヒスチジンリッチの標的結合ペプチド）は、生理学的な細胞外ｐＨ（例えば、約ｐＨ７．２～約ｐＨ７．５のｐＨ、約ｐＨ６．５～約７．５のｐＨ、または約ｐＨ６．５～約ｐＨ６．９のｐＨ）で高い標的結合親和性を有するが、エンドソームの約６．５、約６．０、または約５．５などの低いｐＨレベルでは、結合親和性が著しく低下し得る。細胞外ｐＨは、例えばｐＨ７．４であり得る。細胞外ｐＨは、ｐＨ７．２、７．０、または６．８など、腫瘍の微小環境を含めてより低くなり得る。いくつかの実施形態では、例えば腫瘍環境において、細胞外ｐＨは、約ｐＨ６．５～約ｐＨ６．９であり得る。エンドサイトーシスの際、エンドソームのｐＨが低下する。エンドソームのｐＨは、プロトンポンプの作用によって、またはｐＨのより低い他の小胞と合体することによって低下し得る。ｐＨは７．０に低下し、次いで６．５に低下し、次いで６．０に低下し、次いで５．５以下に低下し得る。一部のエンドソームは初期エンドソームと呼ばれ、ｐＨ６．５前後になり得る。これらのエンドソームの一部は、再循環エンドソームになる。一部のエンドソームは後期エンドソームと呼ばれ、ｐＨ５．５前後になり得る。一部のエンドソームは、ｐＨが４．５になり得るリソソームになるか、リソソームと合体する。リソソーム内の酵素及びその他の因子は、リソソームの内容物の分解を引き起こし得る。いくつかの実施形態では、標的結合ペプチドは、約ｐＨ７．３、ｐＨ７．２、ｐＨ７．１、ｐＨ７．０、ｐＨ６．９、ｐＨ６．８、ｐＨ６．７、ｐＨ６．６、ｐＨ６．５、ｐＨ６．４、ｐＨ６．３、ｐＨ６．２、ｐＨ６．１、ｐＨ６．０、ｐＨ５．９、ｐＨ５．８、ｐＨ５．７、ｐＨ５．６、ｐＨ５．５、ｐＨ５．４、ｐＨ５．３、ｐＨ５．２、ｐＨ５．１、ｐＨ５．０、ｐＨ４．９、ｐＨ４．８、ｐＨ４．７、ｐＨ４．６、ｐＨ４．５、またはそれ以下でエンドソーム内に放出される。いくつかの実施形態では、標的結合ペプチドは、エンドサイトーシスに続くｐＨの低下により、エンドソーム成熟プロセス中の任意の時点で放出され得る。場合によっては、ヒスチジンスキャン及び比較結合実験を実施して、そのようなペプチドを開発及びスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態では、本開示のペプチド中のアミノ酸残基は、標的またはＴｆＲへのｐＨ依存性結合親和性を変更するために、異なるアミノ酸残基で置換される。アミノ酸置換は、低いｐＨにおける結合親和性を増加させること、高いｐＨにおける結合親和性を増加させること、低いｐＨにおける結合親和性を減少させること、高いｐＨにおける結合親和性を減少させること、またはこれらの組み合わせをなし得る。例えば、ＴｆＲに対して高い親和性を有し、細胞表面への再循環のためにＴｆＲに結合するペプチドまたはペプチド複合体として選択的枯渇複合体において使用されるペプチドは、エンドソーム内で放出されないような、ｐＨ非依存性ＴｆＲ結合ペプチド（例えば、ｐＨ非依存性ＴｆＲ結合ＣＤＰ）であり得る。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ペプチドは、エンドソームの酸性化によりエンドソーム区画のイオン強度が増加するので、ＴｆＲに結合したままであり得る。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ペプチドは、エンドソームｐＨで安定であり、例えば、ｐＨ６．９、ｐＨ６．８、ｐＨ６．７、ｐＨ６．６、ｐＨ６．５、ｐＨ６．４、ｐＨ６．３、ｐＨ６．２、ｐＨ６．１、ｐＨ６．０、ｐＨ５．９、ｐＨ５．８、ｐＨ５．７、ｐＨ５．６、ｐＨ５．５、ｐＨ５．４、ｐＨ５．３、ｐＨ５．２、ｐＨ５．１、ｐＨ５．０、ｐＨ４．９、ｐＨ４．８、ｐＨ４．７、ｐＨ４．６、ｐＨ４．５、またはそれ以下などの酸性条件下ではエンドソーム内で放出しない。逆に、選択された標的に結合するための高い親和性を有し、そのような選択された標的に結合し、細胞内での分解のためにエンドソームで放出されるペプチドまたはペプチド複合体として選択的枯渇複合体で使用されるペプチドは、エンドソーム内で放出されるようなｐＨ依存性標的結合ＣＤＰであり得る。いくつかの実施形態では、標的結合ペプチドは、エンドソームの酸性化によりエンドソーム区画のイオン強度が増加するので、標的を放出することができる。いくつかの実施形態では、標的結合ペプチドは、エンドソームｐＨで安定性が低くなり、例えば、ｐＨ７．３、ｐＨ７．２、ｐＨ７．１、ｐＨ７．０、ｐＨ６．９、ｐＨ６．８、ｐＨ６．７、ｐＨ６．６、ｐＨ６．５、ｐＨ６．４、ｐＨ６．３、ｐＨ６．２、ｐＨ６．１、ｐＨ６．０、ｐＨ５．９、ｐＨ５．８、ｐＨ５．７、ｐＨ５．６、ｐＨ５．５、ｐＨ５．４、ｐＨ５．３、ｐＨ５．２、ｐＨ５．１、ｐＨ５．０、ｐＨ４．９、ｐＨ４．８、ｐＨ４．７、ｐＨ４．６、ｐＨ４．５、またはそれ以下などの酸性条件下でエンドソーム内ですべてまたは一部を放出する。場合によっては、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、高いＴｆＲ結合能力を保持しながら、小胞内（例えば、エンドソーム内）での機能を改善するために最適化され得る。例示的な本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４に示されるアミノ酸配列を含む表１に示される。

本明細書に記載されるのは、いくつかの実施形態では、ＴｆＲなどの目的のタンパク質もしくは分子に結合するか、もしくは枯渇のために標的分子に結合するか、またはその両方のための、ペプチド及びペプチド複合体、ならびにペプチド及びペプチド複合体をスクリーニングする方法である。トランスフェリンなどの野生型または内在性分子と比較して、本明細書に記載の方法及び組成物は、改善されたＴｆＲ結合能力を有するペプチド、もしくはＢＢＢを越える改善された輸送能力を示すペプチド、またはこれらの任意の組み合わせを提供することができる。場合によっては、本明細書中に記載のペプチドは、カーゴ分子（例えば、標的結合分子）を内皮細胞層（例えば、ＢＢＢ）または上皮層を越えて効率的に輸送する。いくつかの実施形態では、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、ＴｆＲに結合し、小胞性トランスサイトーシスを促進する。場合によっては、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、ＴｆＲを過剰発現する細胞（例えば、がん細胞）に結合し、細胞によるペプチドの取り込みを促進する。いくつかの態様では、本明細書に記載のＴｆＲ結合ペプチドまたはペプチド複合体は、がんなどのＴｆＲ過剰発現細胞による小胞性トランスサイトーシス及び取り込み、またはこれらの組み合わせを促進する。場合によっては、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、選択的枯渇複合体及び標的分子のＴｆＲ媒介性エンドサイトーシスを促進する。

本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、ヒト、サル、マウス、及びラットのＴｆＲを含む、異なる種のＴｆＲに結合することができる。場合によっては、ＴｆＲ結合ペプチドのアミノ酸残基のいずれかにおけるバリエーションまたは変異は、交差反応性に影響を及ぼし得る。場合によっては、ＴｆＲの結合部位と相互作用するＴｆＲ結合ペプチドのアミノ酸残基のいずれかにおけるバリエーションまたは変異は、交差反応性に影響を及ぼし得る。

本明細書に記載されるのは、非限定的に、高い親和性で標的タンパク質（例えば、ＴｆＲ）に結合する能力を保持しながら、カーゴ分子を運搬するのに十分な大きさでありながら、細胞凝集体（例えば、固形腫瘍）の中心部など、細胞組織に接近するのに十分な小ささであり得る、設計されたかまたは操作されたペプチド、組換えペプチド、及びシステイン高密度ペプチド（ＣＤＰ）／小ジスルフィド－ノットペプチド（例えば、ノットペプチド、ヒッチン、及びそれらに由来するペプチド）を含む、ペプチドである。場合によっては、本明細書に記載のペプチドは、血管のトランスサイトーシスを介してＢＢＢを越えてＣＮＳ（例えば、実質）にカーゴ分子を運搬する。場合によっては、トランスサイトーシスは、ＴｆＲ媒介性である。

さらに、本明細書に記載されるのは、ペプチド－受容体相互作用の性質を決定（例えば、Ｘ線結晶学を使用する）するため、ならびにＣＮＳ（例えば、脳）または他のり患した器官及び組織内の蓄積を含むインビボにおける薬力学及び薬物動態の特性を決定するための方法及び組成物である。本明細書に記載のペプチドのいくつかは、腫瘍細胞を標的とし、腫瘍細胞内に蓄積する能力を有する。場合によっては、腫瘍細胞は、ＴｆＲを過剰発現している。いくつかの態様において、本開示のペプチドは、高いインビボ安定性、例えば、高いプロテアーゼ安定性、グルタチオン（ＧＳＨ）などの還元剤に対する高い耐性を有し、高温（例えば、９５℃まで）に耐える。

本開示は、いくつかの実施形態では、そのような受容体に結合することが可能なペプチドまたはタンパク質を同定するための、３Ｄタンパク質または受容体構造に基づいたペプチドまたはタンパク質の設計アプローチを提供する。場合によっては、受容体は、トランスフェリン受容体である。

本明細書で使用される場合、天然のＬ－エナンチオマーアミノ酸の略語は、標準的なものであり、次のとおりである：アラニン（Ａ、Ａｌａ）；アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）；アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）；システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）；グルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）；グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）；グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）；ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）；リジン（Ｋ、Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ）；セリン（Ｓ、Ｓｅｒ）；トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｗ、Ｔｒｐ）；チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ）；バリン（Ｖ、Ｖａｌ）。典型的に、Ｘａａは、任意のアミノ酸を示し得る。いくつかの実施形態では、Ｘは、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、またはアルギニン（Ｒ）であり得る。

本開示のいくつかの実施形態は、任意の標準もしくは非標準のアミノ酸またはそれらの類似体のＤ－アミノ酸残基を企図する。アミノ酸配列が一連の三文字または一文字のアミノ酸略語で表される場合、標準的な用法及び慣例に従って、左方向はアミノ末端方向、右方向はカルボキシ末端方向である。

「ペプチド」、「ポリペプチド」、「ミニタンパク質」、「タンパク質」、「ヒッチン」、「システイン高密度ペプチド」、「ノットペプチド」、または「ＣＤＰ」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書中で交換可能に使用され得る。種々の実施形態では、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、そのアルファ炭素がペプチド結合を介して連結されているアミノ酸の鎖であり得る。したがって、鎖の一端（例えば、アミノ末端またはＮ末端）の末端アミノ酸は、遊離アミノ基を有し得、鎖の他端（例えば、カルボキシ末端またはＣ末端）の末端アミノ酸は、遊離カルボキシル基を有し得る。本明細書で使用される場合、「アミノ末端」（例えば、略してＮ末端）という用語は、ペプチドのアミノ末端のアミノ酸上の遊離α－アミノ基、またはペプチド内の任意の他の位置にあるアミノ酸のα－アミノ基（例えば、ペプチド結合に関与する場合のイミノ基）を指し得る。同様に、「カルボキシ末端」という用語は、ペプチドのカルボキシ末端上の遊離カルボキシル基、またはペプチド内の任意の他の位置にあるアミノ酸のカルボキシル基を指し得る。ペプチドはまた、非限定的に、アミド結合に対し、エーテルまたはチオエーテルによって連結されたアミノ酸などのペプチド模倣体を含むがそれらに限定されない、本質的に任意のポリアミノ酸を含む。

本明細書で使用される場合、「ペプチド構築物」という用語は、１つ以上のペプチドまたはカーゴ分子にコンジュゲート、連結、または融合することができる１つ以上の本開示のペプチドを含む分子を指し得る。場合によっては、カーゴ分子は、活性剤である。「活性剤」という用語は、任意の分子、例えば、それぞれのペプチド構築物の局在化、検出、または可視化を可能にし得る生物学的作用及び／または物理的作用（例えば、放射線の放出）を誘発することが可能な任意の分子を指し得る。種々の実施形態では、「活性剤」という用語は、治療剤及び／または診断剤を指す。本開示のペプチド構築物は、本明細書に記載の１つ以上のリンカー部分（例えば、切断可能または安定なリンカー）を介して１つ以上の活性剤に連結されたＴｆＲ結合ペプチドを含み得る。

本明細書で使用される場合、「ペプチド複合体」という用語は、複合体を形成するために融合、連結、コンジュゲート、または接続される本開示の１つ以上のペプチドを指すことができる。場合によっては、１つ以上のペプチドは、ＴｆＲ結合ペプチド、標的結合ペプチド、半減期改変ペプチド、薬力学及び／または薬物動態の特性を改変するペプチド、またはそれらの組み合わせを含み得る。例えば、ＴｆＲ結合ペプチド及び標的結合ペプチドを含むペプチド複合体は、本明細書では選択的枯渇複合体と呼ぶことができる。

本明細書で使用される場合、「含む」及び「有する」という用語は、交換可能に使用され得る。例えば、「配列番号３２のアミノ酸配列を含むペプチド」と「配列番号３２のアミノ酸配列を有するペプチド」という用語は、交換可能に使用され得る。

本明細書で使用される場合、別途の指定がない限り、「ＴｆＲ」または「トランスフェリン受容体」という用語は、本明細書で使用されるタンパク質の一種であり、任意の種に由来するトランスフェリン受容体（例えば、ヒトもしくはマウスのＴｆＲ、または任意のヒトもしくは非ヒト動物のＴｆＲ）を指し得る。場合によっては、本明細書で使用される場合、「ＴｆＲ」または「トランスフェリン受容体」という用語は、ヒトＴｆＲ（ｈＴｆＲ）を指し、ＴｆＲ、またはＴｆＲ１、ＴｆＲ２、可溶性ＴｆＲを含む既知のＴｆＲホモログもしくはオルソログのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせもしくは断片（例えば、細胞外ドメイン）を含み得る。

本明細書で使用される場合、「エンドソーム」、「エンドソームの」、「エンドソーム区画」、または「エンドサイトーシス経路」という用語は、交換可能に使用することができ、細胞内エンドソームネットワークまたはトランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）の任意の１つ以上の構成要素を指し得る。これにより、リソソーム分解及び細胞表面への再循環など、細胞内の異なる膜結合コンパートメント間のペプチドとカーゴの小胞トランスサイトーシスまたは輸送と移動が可能になる。そのような経路は、一般に輸送小胞と呼ばれる小胞の、つまり初期エンドソーム、後期エンドソーム、リソソームまでの成熟及び移行を含み、またエンドソーム区画の酸性度は、成熟プロセス全体でエンドソームの酸性化により増加することが理解される。成熟したエンドサイトーシス経路の最後の小胞として機能するリソソームには、典型的に、後期エンドソームの内容物を消化する加水分解酵素が含まれている。他のエンドソームは、内容物が細胞表面に再循環されるエンドソームの再循環経路に進む。

本明細書で使用される場合、「ｐＨ非依存性」は、分子または部分に関して使用されるとき、エンドソーム区画が酸性化されるにつれて、分子または部分のその標的への結合親和性が、エンドソーム内での標的との解離を可能にするほどには変化しないことを意味する。例えば、参照の分子または部分は、細胞外ｐＨ及びエンドソームｐＨでその標的に対して同じまたは類似の親和性を有する。ｐＨ依存性の分子または部分のその標的に対する結合親和性が、エンドソーム経路に入り、通過するにつれて変化し、エンドソーム内で標的との解離をある程度可能にするか、または参照の分子または部分が細胞外ｐＨとエンドソームｐＨで異なる親和性を持つため、ｐＨ非依存性の分子または部分が、ｐＨ依存性の分子または部分を含まないことも理解される。

「操作された」という用語は、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドがその天然の遺伝子環境から取り出され、そのため、他の無関係なコード配列または望ましくないコード配列を含まず、遺伝子操作されたタンパク質産生系内での使用に好適な形態であることを示す。そのような操作された分子は、その天然環境から分離されたものであり、ｃＤＮＡ及びゲノムクローン（すなわち、異なる生物に由来するＤＮＡの断片を含むベクターを含む原核細胞または真核細胞）を含む。本発明の操作されたＤＮＡ分子は、通常関連する他の遺伝子を含まないが、エンハンサー、プロモーター、及びターミネーターなどの天然または非天然の５’及び３’非翻訳領域は含み得る。

「操作された」ポリペプチドまたはタンパク質は、血液及び動物組織などから離れて、その本来の環境以外の状態で存在するポリペプチドまたはタンパク質である。好ましい形態において、操作されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。ポリペプチドは、高度に精製された形態、例えば、９０％を超える純度、９５％を超える純度、より好ましくは、９８％を超える純度、または９９％を超える純度で提供することが好ましい。本文脈で使用される場合、「操作された」という用語は、二量体、ヘテロ二量体、及び多量体、または代替的にグリコシル化、カボキシル化、修飾、もしくは誘導体化された形態などの代替的な物理的形態で同じポリペプチドが存在することを排除しない。

「操作された」ペプチドまたはタンパク質は、天然に存在するポリペプチドの構造、配列、または組成とは明確に異なるポリペプチドである。操作されたペプチドとしては、非天然ペプチド、人工ペプチド、単離ペプチド、合成ペプチド、設計されたペプチド、修飾されたペプチド、または組換え発現されたペプチドが挙げられる。操作されたＴｆＲ結合ペプチド、そのバリアント、または断片が本明細書で提供される。これらの操作されたＴｆＲ結合ペプチドは、標的結合部分または半減期延長部分にさらに連結することができ、または活性剤または検出可能な薬剤、または前述の任意の組み合わせにさらに連結することができる。

本開示のポリペプチドは、例えば、（１）タンパク質分解に対する感受性を低減すること、（２）酸化に対する感受性を低減すること、（３）タンパク質複合体を形成するために結合親和性を変更すること、（４）結合親和性を変更すること、（５）特定のｐＨ値における結合親和性を変更すること、及び（６）他の物理化学的特性または機能特性を付与または改変することが何らかの方法でなされるように修飾されたポリペプチドを含む。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）は、天然に存在する配列（例えば、分子間接触を形成するドメイン（複数可）以外のポリペプチドの部分）においてなされる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸のポリペプチドにおける、機能的に類似したアミノ酸による置換を指し得る。次の６つの群には、それぞれ互いに保存的置換となり得るアミノ酸が含まれる：ｉ）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、及びトレオニン（Ｔ）；ｉｉ）アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）；ｉｉｉ）アスパラギン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）；ｉｖ）アルギニン（Ｒ）及びリジン（Ｋ）；ｖ）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、及びバリン（Ｖ）；ｖｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）。いくつかの実施形態では、保存的アミノ酸置換は、非天然アミノ酸を含み得る。例えば、同じアミノ酸の非天然誘導体に対するアミノ酸の置換は、保存された置換であり得る。

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド断片」及び「切り詰め型ポリペプチド」という用語は、対応する完全長ペプチドまたはタンパク質と比較して、アミノ末端及び／またはカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドを指し得る。種々の実施形態では、断片は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、または少なくとも１０００のアミノ酸の長さである。種々の実施形態では、断片はまた、例えば、最大１０００、最大９００、最大８００、最大７００、最大６００、最大５００、最大４５０、最大４００、最大３５０、最大３００、最大２５０、最大２００、最大１５０、最大１００、最大５０、最大２５、最大１０、または最大５アミノ酸の長さであり得る。断片は、その末端のいずれかまたは両方に、１つ以上の追加のアミノ酸、例えば、異なる天然に存在するタンパク質に由来するアミノ酸の配列（例えば、Ｆｃもしくはロイシンジッパードメイン）、または人工アミノ酸配列（例えば、人工リンカー配列）をさらに含み得る。

本明細書で使用される場合、「バリアント」「変異体」または「濃縮された変異体」または「順列濃縮された変異体」と関連する「ペプチド」または「ポリペプチド」という用語は、別のポリペプチド配列を基準として、１つ以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列に挿入され、それから欠失され、及び／または置換されたアミノ酸配列を含み得るペプチドまたはポリペプチドを指し得る。種々の実施形態では、挿入、欠失、または置換されるアミノ酸残基の数は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、または少なくとも５００のアミノ酸の長さである。本開示のバリアントは、ペプチドコンジュゲートまたは融合分子（例えば、ペプチド構築物またはペプチド複合体）を含む。

ペプチドまたはポリペプチドの「誘導体」は、化学修飾、例えば、ポリエチレングリコール、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、リン酸化、及びグリコシル化などの別の化学部分への、例えば、コンジュゲーションがなされていてもよいペプチドまたはポリペプチドであり得る。

「配列同一性％」という用語は、「同一性％」と本明細書中で交換可能に使用され得、配列アライメントプログラムを使用して整列させた場合における、２つ以上のペプチド配列間のアミノ酸配列の同一性のレベル、または２つ以上のヌクレオチド配列間のヌクレオチド配列の同一性のレベルを指し得る。例えば、本明細書で使用される場合、８０％の同一性は、定義されたアルゴリズムによって決定された８０％の配列同一性と同じことを意味し、所与の配列が別の長さの別の配列に対して少なくとも８０％同一であることを意味する。さまざまな実施形態では、同一性％は、所定の配列に対する、例えば、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９％、または最大１００％の配列同一性から選択される。種々の実施形態では、同一性％は、例えば、約６０％～約７０％、約７０％～約８０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９０％、約９０％～約９５％、または約９５％～約９９％の範囲内である。

「配列相同性％」または「配列相同性パーセント」または「配列同一性パーセント」という用語は、「相同性％」、「配列同一性％」または「同一性％」という用語と本明細書中で交換可能に使用され得、配列アライメントプログラムを使用して整列させた場合における、２つ以上のペプチド配列間のアミノ酸配列の相同性のレベル、または２つ以上のヌクレオチド配列間のヌクレオチド配列の相同性のレベルを指し得る。例えば、本明細書で使用される場合、８０％の相同性は、定義されたアルゴリズムによって決定された８０％の配列相同性と同じことを意味し、したがって、所与の配列の相同体は、所与の配列の長さにわたって８０％を超える配列相同性を有する。さまざまな実施形態では、相同性％は、所定の配列に対する、例えば、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または最大１００％の配列相同性から選択される。種々の実施形態では、相同性％は、例えば、約６０％～約７０％、約７０％～約８０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９０％、約９０％～約９５％、または約９５％～約９９％の範囲内である。

タンパク質またはポリペプチドは、試料の少なくとも約６０％～７５％が単一種のポリペプチドを示す場合、「実質的に純粋」、「実質的に均一」、または「実質的に精製されている」であり得る。ポリペプチドまたはタンパク質は、単量体または多量体であり得る。実質的に純粋なポリペプチドまたはタンパク質は、典型的に、約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％Ｗ／Ｗのタンパク質試料、より一般的には約９５％のタンパク質試料を含み得、例えば、９８％または９９％を超える純度である。タンパク質の純度または均質性は、タンパク質試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた後、当該技術分野においてよく知られている染色によりゲルを染色して単一ポリペプチドバンドを可視化することなど、当該技術分野においてよく知られている多数の手段によって示すことができる。ある特定の目的のために、高速液体クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）または他の高分解能分析技術（例えば、ＬＣ質量分析）を使用することによって、高分解能が得られる。

本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、一般に、動物（例えば、ヒトまたはマウス）などの対象における薬学的使用に好適な組成物を指し得る。医薬組成物は、薬理学上有効な量の活性剤と、薬学的に許容される担体と、を含み得る。「薬理学上有効な量」という用語は、意図された生物学的または薬理学的な結果をもたらすのに有効な薬剤の量を指し得る。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、標準的な薬学的担体、ビヒクル、緩衝液、及び賦形剤、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、または緩衝生理食塩水、５％デキストロース水溶液、及び油／水または水／油のエマルションなどのエマルション、ならびにさまざまな種類の湿潤剤及び／またはアジュバントのいずれかを指し得る。好適な薬学的担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，２１ｓｔＥｄ．２００５，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ，Ｅａｓｔｏｎに記載されている。「薬学的に許容される塩」は、薬学的使用のための化合物に製剤化することができる塩であり得、例えば、金属塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど）、及びアンモニアまたは有機アミンの塩を含む。

本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、及び「治療」という用語は、生物学的障害及び／またはそれに付随する症状の少なくとも１つを緩和または軽減する方法を指し得る。本明細書で使用される場合、疾患、障害、または状態を「緩和する」ことは、例えば、疾患、障害、または状態の重症度及び／またはその症状の発生頻度を減らすことを意味する。さらに、本明細書における「治療」への言及は、治癒的、緩和的、及び予防的または診断的治療への言及を含み得る。

一般に、本開示の細胞は、真核細胞または原核細胞であり得る。細胞は、上皮細胞であり得る。細胞は、微生物、細菌、酵母、真菌、または藻類の細胞であり得る。細胞は、動物細胞または植物細胞であり得る。動物細胞は、海洋無脊椎動物、魚類、昆虫、両生類、爬虫類、または哺乳動物に由来する細胞を含み得る。哺乳動物細胞は、霊長類、猿人類、ウマ科動物、ウシ亜科の動物、ブタ、イヌ科動物、ネコ科動物、またはげっ歯類から得ることができる。哺乳動物は、霊長類、猿人類、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレットなどであり得る。げっ歯類は、マウス、ラット、ハムスター、アレチネズミ、ハムスター、チンチラ、またはモルモットであり得る。鳥類細胞は、カナリア、インコ、またはオウムに由来し得る。爬虫類細胞は、カメ、トカゲ、またはヘビに由来し得る。魚類細胞は、熱帯魚に由来し得る。例えば、魚類細胞は、ゼブラフィッシュ（例えば、Ｄａｎｉｎｏｒｅｒｉｏ）に由来し得る。蠕虫細胞は、線虫（例えば、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）に由来し得る。両生類細胞は、カエルに由来し得る。節足動物細胞は、タランチュラまたはヤドカリに由来し得る。

哺乳動物細胞は、霊長類（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類）から得られる細胞も含み得る。哺乳動物細胞は、血液細胞、幹細胞、上皮細胞、結合組織細胞、ホルモン分泌細胞、神経細胞、骨格筋細胞、または免疫系細胞を含み得る。

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、一般に、宿主細胞で複製が可能なＤＮＡ分子、及び／または別のＤＮＡセグメントが作動可能に連結され得、それにより、その結合されたセグメントの複製が生じるＤＮＡ分子を指す。プラスミドは、例示的なベクターである。

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、一般に、ヒトまたは別の動物を指す。対象は、任意の年齢であり得、例えば、対象は、乳児、幼児、小児、思春期前の子ども、青年、成人、または高齢者の個体であり得る。

範囲は、本明細書において、１つの特定の「おおよそ（約）」の値から、及び／または別の特定の「おおよそ（約）」の値までを表すことができる。そのような範囲が表される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、及び／または他の特定の値までを含む。同様に、値が「約」という先行詞の使用により近似値で表される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。範囲のそれぞれの端点は、他の端点に対応するものであり、他の端点とは独立していることがさらに理解される。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の使用の範囲内で、指定された数値からプラスマイナス１５％の範囲を指す。例えば、約１０は、８．５～１１．５の範囲を含み得る。

ペプチド
本開示の選択的枯渇複合体は、１つ以上のペプチドを含むことができる。例えば、本開示の選択的枯渇複合体は、ＴｆＲ結合ペプチド及び標的結合ペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、リンカーを介して２つ以上のペプチドを接続することができる。本開示のペプチド（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド、標的結合ペプチド、または標的結合ペプチドに連結されたＴｆＲ結合ペプチドを含むペプチド）は、標的分子を選択的に枯渇させる方法において使用することができる。本開示のペプチド（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド、標的結合ペプチド、または標的結合ペプチドに連結されたＴｆＲ結合ペプチドを含むペプチド）は、エンドサイトーシス後に細胞表面に再循環され得る。

いくつかの例では、本明細書で開示されるペプチドは、リジン残基を１つのみを含むか、またはリジン残基を含有しない。いくつかの例では、ペプチド中の１つ以上またはすべてのリジン残基がアルギニン残基によって置換されている。いくつかの例では、ペプチド中の１つ以上またはすべてのメチオニン残基がロイシンまたはイソロイシンによって置換される。ペプチド中の１つ以上またはすべてのトリプトファン残基がフェニルアラニンまたはチロシンによって置換され得る。いくつかの例では、ペプチド中の１つ以上またはすべてのアスパラギン残基がグルタミンによって置換される。いくつかの実施形態では、１つ以上またはすべてのアスパラギン酸残基がグルタミン酸残基によって置換され得る。いくつかの例では、ペプチド中の１つ以上またはすべてのリジン残基がアラニンまたはアルギニンによって置換され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドのＮ末端は、アセチル基またはｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル基などによって、ブロッキングまたは保護される。代替的にまたは組み合わせで、ペプチドのＣ末端は、アミド基などによって、またはエステルの形成（例えば、ブチルまたはベンジルエステル）などによって、ブロッキングまたは保護され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、遊離アミン上のメチル化によって修飾される。例えば、完全なメチル化は、ホルムアルデヒド及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムによる還元的メチル化の使用を介して達成される。

いくつかの実施形態では、ジペプチドＧＳは、配列番号１～配列番号６４に示されるように、最初の２つのＮ末端アミノ酸として追加することができ、または、そのようなＮ末端ジペプチドＧＳは、配列番号６５～配列番号１２８に示されるようになくてもよく、または任意の他の１つもしくは２つのアミノ酸によって置換されてもよい。いくつかの実施形態では、ジペプチドＧＳは、リンカーとして使用されるか、またはリンカーに結合され、ペプチド構築物またはペプチド複合体などのペプチドコンジュゲートまたは融合分子を形成するために使用される。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｇ_ｘＳ_ｙ（配列番号１３０）ペプチドを含み、式中、ｘ及びｙは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０などの任意の整数であり、Ｇ及びＳ残基は任意の順番で配置される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（ＧＳ）ｘ（配列番号１３１）を含み、式中、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０などの任意の整数であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ＧＧＳＳＧ（配列番号１３２）、ＧＧＧＧＧ（配列番号１３３）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１３４）、ＧＳＧＧ（配列番号１３５）、ＧＧＧＧＳ（配列番号１３６）、ＧＧＧＳ（配列番号１２９）、ＧＧＳ（配列番号１３７）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１３８）、またはそれらのバリアントもしくは断片、またはそれらの任意の数の反復及びそれらの組み合わせを含む。さらに、ＤｋＴｘに由来するＫＫＹＫＰＹＶＰＶＴＴＮ（配列番号１３９）、及びヒトＩｇＧ３に由来するＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴ（配列番号１４０）、またはそれらの任意の数の反復及びそれらの組み合わせは、ペプチドリンカーとして使用され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ＧＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１４１）、またはそのバリアントもしくは断片、またはその任意の数の反復及び組み合わせを含む。前述のリンカーまたはそれらのバリアントもしくは断片のいずれも、それらの任意の数の反復または任意の組み合わせとともに使用できることが理解される。また、当該技術分野における他のペプチドリンカーまたはそれらのバリアントもしくは断片を、それらの任意の数の反復または任意の組み合わせとともに使用できることも理解される。リンカーの長さは、選択的送達複合体のＴｆＲと標的の両方への結合を、立体アクセスを考慮することも含めて同時に最大化するように調整することができる。いくつかの実施形態では、選択的枯渇複合体内のＴｆＲ結合ペプチドと標的結合ペプチドとの間のリンカーは、特に、例えば標的が可溶性タンパク質ではなく、細胞表面タンパク質または細胞受容体タンパク質である場合、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５の残基から最大１００残基まで段階的に増加する。

本開示のいくつかの実施形態では、本明細書に記載のペプチドまたはペプチド複合体は、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。本明細書で開示されるペプチドは、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５残基長である、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか１つの連続断片を含む断片であり得、ペプチド断片は、ペプチドの任意の部分から選択される。いくつかの実施形態では、ペプチド配列は、追加のアミノ酸に隣接する。１つ以上の追加のアミノ酸は、例えば、特定のインビボ電荷、等電点、化学コンジュゲーション部位、安定性、または生理学的特性をペプチドに付与する。

いくつかの例では、ＴｆＲの標的化及び結合が可能な本明細書に記載のペプチドは、８０以下のアミノ酸の長さ、または７０以下、６０以下、４０以下、３５以下、３０以下、２５以下、２０以下、１５以下、もしくは１０以下のアミノ酸の長さを含む。いくつかの例では、標的分子の標的化及び結合が可能な本明細書に記載のペプチドは、８０アミノ酸長以下、または７０以下、６０以下、５０以下、４０以下、３５以下、３０以下、２５以下、２４以下、２３以下、２２以下、２１以下、２０以下、１９以下、１８以下、１７以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、もしくは１０以下のアミノ酸の長さを含む。

他の実施形態では、ペプチドは、目的の細胞または標的細胞に対して標的化機能またはホーミング機能を有する担体または分子にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合され得る。他の実施形態では、ペプチドは、ペプチドの半減期の延長、または薬力学及び／または薬物動態の特性の変更、またはこれらの任意の組み合わせをもたらす分子にコンジュゲートされるか、連結されるか、または融合され得る。

いくつかの例では、ペプチドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０個のＡｒｇもしくはＬｙｓ、またはこれらの任意の組み合わせなどの正電荷残基を含む。いくつかの例では、ペプチド中の１つ以上のリジン残基がアルギニン残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、ペプチドは、１つ以上のＡｒｇパッチを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドにおいて、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、または１０個以上のＡｒｇまたはＬｙｓ残基が、溶媒露出している。いくつかの例では、ペプチドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０個のヒスチジン残基を含む。

本開示のペプチドは、中性アミノ酸残基をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、３５個以下の中性アミノ酸残基を有する。他の実施形態では、ペプチドは、８１個以下の中性アミノ酸残基、７０個以下の中性アミノ酸残基、６０個以下の中性アミノ酸残基、５０個以下の中性アミノ酸残基、４０個以下の中性アミノ酸残基、３６個以下の中性アミノ酸残基、３３個以下の中性アミノ酸残基、３０個以下の中性アミノ酸残基、２５個以下の中性アミノ酸残基、または１０個以下の中性アミノ酸残基を有する。

本開示のペプチドは、負のアミノ酸残基をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、６個以下の負のアミノ酸残基、５個以下の負のアミノ酸残基、４個以下の負のアミノ酸残基、３個以下の負のアミノ酸残基、２個以下の負のアミノ酸残基、または１個以下の負のアミノ酸残基を有する。負のアミノ酸残基は、任意の負荷電アミノ酸残基から選択され得るが、いくつかの実施形態では、負のアミノ酸残基は、ＥもしくはＤのいずれか、またはＥとＤの両方の組み合わせである。

本開示のいくつかの実施形態では、ペプチドの三次元構造または三次構造は、主に、ベータシート及び／またはアルファヘリックス構造から構成される。いくつかの実施形態では、本開示の設計または操作されたＴｆＲ結合ペプチドまたは標的結合は、シスチン及び疎水性コアを形成する鎖内ジスルフィド結合（例えば、システインによって媒介される）によって安定化された小型で緻密なペプチドまたはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、操作されたＴｆＲ結合ペプチドは、アルファヘリックスのそれぞれの間に少なくとも１つのジスルフィド架橋を有するらせん状バンドルを含む構造を有し、それによって、ペプチドが安定化される。他の実施形態では、操作されたＴｆＲ結合ペプチドまたは標的結合ペプチドは、３つのアルファヘリックス及び３つの鎖内ジスルフィド結合を有する構造を含み、鎖内ジスルフィド結合は、アルファヘリックスバンドル中の３つのアルファヘリックスのぞれぞれの間に１つある。

受容体結合ペプチド
受容体（例えば、トランスフェリン受容体またはプログラム死リガンド１）に結合することができる、表１及び表２に列記されるものなどのペプチド配列が本明細書に開示される。受容体に結合することができるペプチドは、受容体結合ペプチドと呼ばれ得る。いくつかの実施形態では、受容体結合ペプチドは、再循環経路を介して再循環を受ける再循環受容体に結合することができる。再循環された受容体は、初期エンドソームにエンドサイトーシスされ、初期エンドソームが後期エンドソームに成熟する前に、再循環エンドソームにパッケージ化され得る。再循環された受容体を含む再循環エンドソームは、細胞膜と融合し、再循環された受容体を細胞表面に戻すことができる。いくつかの実施形態では、本開示の受容体結合ペプチドは、再循環プロセス中に受容体に結合したままであってもよく、それによって受容体結合ペプチドも再循環される。受容体結合ペプチドによって標的とされ得る再循環受容体の例には、トランスフェリン受容体及びプログラム死リガンド１が含まれる。いくつかの実施形態では、本開示の受容体結合ペプチドは、ミニタンパク質、ナノボディ、抗体、ＩｇＧ、抗体断片、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ＤＡＲＰｉｎ、またはアフィボディを含み得る。いくつかの実施形態では、受容体結合ペプチドは、シスチン高密度ペプチド、アフィチン、アドネクチン、アビマー、クニッツドメイン、ナノフィチン、フィノマー、二環式ペプチド、ベータヘアピン、またはステープルペプチドを含み得る。

いくつかの実施形態では、本開示の受容体結合ペプチドは、ｐＨ非依存性の親和性で受容体（例えば、再循環された受容体）に結合することができる。例えば、受容体結合ペプチドは、エンドサイトーシスｐＨ（約ｐＨ５．５または約ｐＨ６．５など）での結合親和性と実質的に同じ親和性で、細胞外ｐＨ（約ｐＨ７．４）で受容体に結合することができる。いくつかの実施形態では、受容体結合ペプチドは、エンドサイトーシスｐＨ（約ｐＨ５．５または約ｐＨ６．５など）での結合親和性よりも低い親和性で、細胞外ｐＨ（約ｐＨ７．４）で受容体に結合することができる。いくつかの実施形態では、受容体結合ペプチドは、エンドサイトーシスｐＨ（約ｐＨ５．５または約ｐＨ６．５など）での結合親和性よりも高い親和性で、細胞外ｐＨ（約ｐＨ７．４）で受容体に結合することができる。いくつかの実施形態では、細胞外ｐＨ（約ｐＨ７．４）での受容体に対する受容体結合ペプチドの結合親和性と、エンドサイトーシスｐＨ（約ｐＨ５．５）での受容体に対する受容体結合ペプチドの結合親和性とは、約１％以下、約２％以下、約３％以下、約４％以下、約５％以下、約６％以下、約７％以下、約８％以下、約９％以下、約１０％以下、約１２％以下、約１５％以下、約１７％以下、約２０％以下、約２５％、約３０％以下、約３５％以下、約４０％以下、約４５％以下、または約５０％以下異なり得る。いくつかの実施形態では、ｐＨ７．４とｐＨ５．５での受容体に対する受容体結合ペプチドの親和性は、２倍以下、５倍以下、１０倍以下、１５倍以下、２０倍以下、２５倍以下、３０倍以下、４０倍以下、または５０倍以下異なり得る。いくつかの実施形態では、受容体結合ペプチド（例えば、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、配列番号１～配列番号６４、配列番号１８７、配列番号２３３～配列番号２３９、配列番号４００～配列番号４５６、または配列番号２４１のいずれか１つ）は、ＴｆＲ結合界面における１つ以上のヒスチジンアミノ酸を除去するように改変することができ、それによって、受容体に対する受容体結合ペプチドの結合親和性のｐＨ依存性を低下させる。いくつかの実施形態では、受容体結合ペプチド（例えば、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、配列番号１～配列番号６４、配列番号１８７、配列番号２３３～配列番号２３９、配列番号４００～配列番号４５６、または配列番号２４１のいずれか１つ）は、受容体結合界面においてヒスチジンアミノ酸を欠いてもよい。

いくつかの実施形態では、ｐＨ非依存性結合を有する受容体結合ペプチドは、細胞外ｐＨ（約ｐＨ７．４）で、５０μＭ未満、５μＭ未満、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、０．３ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、または０．１ｎＭ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）で受容体に結合することができる。いくつかの実施形態では、ｐＨ非依存性結合を有する受容体結合ペプチドは、エンドソームｐＨ（約ｐＨ５．５）で、５０μＭ未満、５μＭ未満、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、０．３ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、または０．１ｎＭ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）で受容体に結合することができる。

いくつかの実施形態では、受容体結合ペプチドは、ｐＨ依存性の親和性で受容体に結合することができる。例えば、受容体結合分子は、細胞外ｐＨ（約ｐＨ７．４）ではより高い親和性で受容体に結合することができ、エンドソームｐＨ（約ｐＨ５．５）ではより低い親和性で受容体に結合することができ、それによって、エンドソーム区画の内在化及び酸性化の際に、受容体から選択的枯渇複合体を放出する。

いくつかの実施形態では、再循環受容体はＴｆＲであってもよい。トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合することのできるペプチドは、ＴｆＲ、もしくはＴｆＲ１、ＴｆＲ２、可溶性ＴｆＲを含む、既知のＴｆＲホモログのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせもしくは断片（例えば、細胞外ドメイン）に結合することができる。トランスフェリン受容体またはＴｆＲホモログに結合することができるペプチドは、本明細書において、トランスフェリン受容体結合ペプチドまたはＴｆＲ結合ペプチドと呼ばれ得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるペプチドは、ＴｆＲを媒介した様式で標的細胞に透過、通過、または侵入することができる。これらの細胞層または細胞は、ＴｆＲ発現の内皮細胞、上皮細胞、ならびに腫瘍細胞、脳細胞、がん性もしくは腫瘍細胞、肝臓細胞（例えば、肝細胞（ＨＣ）、肝星状細胞（ＨＳＣ）、クッパー細胞（ＫＣ）、または肝類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ））、膵細胞、結腸細胞、卵巣細胞、乳房細胞、脾臓細胞、骨髄細胞、及び／または肺細胞、またはこれらの任意の組み合わせなどのさまざまな組織または器官のＴｆＲ発現細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、ミニタンパク質、ナノボディ、抗体、ＩｇＧ、抗体断片、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ＤＡＲＰｉｎ、またはアフィボディを含み得る。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ペプチドは、シスチン高密度ペプチド、アフィチン、アドネクチン、アビマー、クニッツドメイン、ナノフィチン、フィノマー、二環式ペプチド、ベータヘアピン、またはステープルペプチドを含み得る。

いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるペプチドは、例えば、ＴｆＲ媒介性小胞性トランスサイトーシス及びＴｆＲ媒介性エンドサイトーシスをそれぞれ介して、細胞層もしくは障壁（例えば、ＢＢＢ）または細胞膜を通過することができる。ＴｆＲに結合し、トランスサイトーシス及び／またはエンドサイトーシスを促進することに加えて、本開示のペプチドはまた、がん細胞などの細胞上の追加の標的タンパク質にも結合することができる。場合によっては、ペプチドは、追加の標的タンパク質（例えば、受容体または酵素）に対して親和性を有する小分子またはペプチドなどの標的化部分または活性剤（例えば、治療用または診断用薬剤）にコンジュゲート、連結、または融合されたＴｆＲ結合ペプチドを含む、ペプチドまたはペプチド複合体である。場合によっては、ＴｆＲ結合ペプチドは、標的結合ペプチドに連結され、ＢＢＢを越える標的結合ペプチドのＴｆＲ媒介性トランスサイトーシスまたは細胞内へのＴｆＲ媒介性エンドサイトーシスを可能にするか、または促進する。いくつかの例では、トランスサイトーシスの後、ＴｆＲ結合ペプチド及び標的結合ペプチドを含むペプチド複合体は、ＣＮＳ内の特定の細胞または組織を標的とし、当該細胞または組織に到達すると、生物学的作用（例えば、標的タンパク質への結合）を発揮することができる。場合によっては、本開示のペプチド複合体は、ＴｆＲ結合ペプチド、標的結合ペプチド、活性剤、またはこれらの組み合わせによって媒介される生物学的作用を発揮する。場合によっては、１つの標的結合ペプチドを含む本開示のＴｆＲ結合ペプチド複合体は、ＴｆＲを発現する細胞に標的分子を輸送及び／または送達する（例えば、標的分子をエンドソームに送達する）ことができる。場合によっては、ＴｆＲ結合ペプチドは、ＣＮＳの組織に蓄積する。場合によっては、ＣＮＳ特異的蓄積により、オフターゲット効果が減少する。場合によっては、ＴｆＲ結合ペプチドは、ＣＮＳ以外の組織（例えば、肝臓、腎臓、脾臓、または皮膚）に蓄積する。場合によっては、ＴｆＲを発現する細胞は、腫瘍細胞であり、ＴｆＲ結合ペプチド複合体は、これらの腫瘍細胞に抗腫瘍剤を送達する。場合によっては、抗腫瘍剤は、単独では、腫瘍細胞に対する治療効果が全くないか、非常に限られているが、抗腫瘍剤を本開示のＴｆＲ結合ペプチドと、例えば、ペプチド複合体として組み合わせる場合、これらの抗腫瘍薬剤の治療効果が大幅に改善される。

いくつかの実施形態では、本開示のＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、及び配列番号１～配列番号６４）は、生物学的に適切な応答を誘導することができる。例えば、標的結合ペプチドにコンジュゲートしたＴｆＲ結合ペプチドは、可溶性標的分子または細胞表面標的分子を選択的に枯渇させることができる。いくつかの実施形態では、生物学的に適切な応答は、静脈内、皮下、腹腔内、頭蓋内、または筋肉内の投与後に誘発され得、いくつかの実施形態では、単一の静脈内、皮下、腹腔、頭蓋内、または筋肉内の投与後に誘発され得る。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ペプチドは、疼痛、神経障害性疼痛、または神経変性障害、感染症、免疫障害（例えば、自己免疫疾患）などの他の神経障害、またはリソソーム蓄積症を治療及び／または予防するために使用されるさまざまな他のクラスの治療用化合物と組み合わせて使用することができる。本明細書に記載されるペプチド及びペプチド複合体（例えば、ペプチドコンジュゲート、融合ペプチド、または組換え産生されたペプチド複合体）がＴｆＲに結合し、その後、細胞層もしくはＢＢＢなどの障壁を越えて（例えば、ＴｆＲ媒介性小胞性トランスサイトーシスを介して）、または細胞膜を越えて（例えば、ＴｆＲ媒介性エンドサイトーシスを介して）輸送されることは、対象（例えば、ヒト）における、標的分子の過剰発現もしくは蓄積に関連する疾患、状態、もしくは状態（例えば、がん、神経変性、もしくはリソソーム蓄積症）、または可溶性タンパク質または表面タンパク質における変異（例えば、構成的活性、治療に対する耐性、もしくはドミナントネガティブ活性を引き起こす変異）に関連する疾患の多くに影響を及ぼし得る。

本明細書に記載のペプチド及びペプチド複合体（例えば、ペプチドコンジュゲート、融合ペプチド、または組換え産生されたペプチド複合体）がＴｆＲに結合し、その後、細胞層もしくはＢＢＢなどの障壁を越えて（例えば、小胞性トランスサイトーシスを介して）または細胞膜を越えて（例えば、エンドサイトーシスを介して）輸送されることは、神経変性に関連する多数の疾患、状態、または障害に影響を及ぼし得る。本明細書に記載のＴｆＲ結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体によって治療、予防、または診断することができる神経変性疾患としては、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ運動失調症、ハンチントン病、レビー小体病、パーキンソン病、脊髄性筋萎縮症、運動ニューロン疾患、ライム病、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体優性小脳失調症、バッテン病、大脳皮質基底核症候群、クロイツフェルト・ヤコブ病、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群、クフォー・ラケブ症候群、マシャド・ジョセフ病、多発性硬化症、慢性外傷性脳症、または前頭側頭型認知症を挙げることができる。

いくつかの実施形態では、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、ＴｆＲ１、ＴｆＲ２、可溶性ＴｆＲを含む既知のＴｆＲホモログのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせもしくは断片（例えば、細胞外ドメイン）に結合することができる。したがって、本明細書で使用される場合、「ＴｆＲ」は、ＴｆＲ１、ＴｆＲ２、及び可溶性ＴｆＲを含む、任意の既知のホモログ、誘導体、断片、またはＴｆＲファミリーのメンバーを指し得る。他の実施形態では、ペプチドは、１つ、１つ以上、またはすべてのＴｆＲホモログに結合することが可能である。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、ＴｆＲに結合し、小胞性トランスサイトーシスなどの特定の生物学的作用を促進することができる。いくつかの実施形態では、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、及び配列番号２２０～配列番号２２２、及び配列番号１～配列番号６４に示されるアミノ酸配列、ならびにその任意の誘導体またはバリアントを含むペプチド及びペプチド複合体を含む、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、内在性ＴｆＲ結合物質（例えば、トランスフェリンまたはアポトランスフェリンもしくはホロトランスフェリンなどの任意の誘導体）のＴｆＲへの結合を阻止または減少させる。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドまたはペプチド複合体は、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、及び配列番号１～配列番号６４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも４０％の相同性、少なくとも５０％の相同性、少なくとも６０％の相同性、少なくとも７０％の相同性、少なくとも７５％の相同性、少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性、または少なくとも１００％の相同性を有する誘導体及びバリアントを含む。

種々の実施形態では、本開示のＴｆＲ結合ペプチドの界面残基（例えば、受容体結合についてＴｆＲと相互作用するアミノ酸残基）は、ペプチドのうち、主に２つのヘリカルドメインに分けることができる。場合によっては、界面残基は、配列番号３２を基準として、残基５～２５に対応する残基（例えば、Ｇ５、Ａ７、Ｓ８、Ｍ１１、Ｎ１４、Ｌ１７、Ｅ１８、及びＥ２１の対応する残基を含む）、もしくは配列番号３２を基準として、残基３５～５１に対応する残基（例えば、Ｌ３８、Ｌ４１、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｄ４６、Ｈ４７、Ｈ４９、Ｓ５０、及びＱ５１の対応する残基を含む）、または両方を含み得る。例えば、界面残基は、配列番号３２を基準として、残基５～２５に対応する残基（例えば、Ｇ５、Ａ７、Ｓ８、Ｍ１１、Ｎ１４、Ｌ１７、Ｅ１８、及びＥ２１の対応する残基を含む）、または配列番号３２を基準として、残基３５～５１に対応する残基（例えば、Ｌ３８、Ｌ４１、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｄ４６、Ｈ４７、Ｈ４９、Ｓ５０、及びＱ５１の対応する残基を含む）を含み得る。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ペプチドは、本明細書で提供されるペプチドの断片を含み得、断片は、結合のための最小界面残基、例えば、配列番号３２を基準として、残基５～２５に対応する残基（例えば、Ｇ５、Ａ７、Ｓ８、Ｍ１１、Ｎ１４、Ｌ１７、Ｅ１８、及びＥ２１の対応する残基を含む）、または配列番号３２を基準として、残基３５～５１に対応する残基（例えば、Ｌ３８、Ｌ４１、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｄ４６、Ｈ４７、Ｈ４９、Ｓ５０、及びＱ５１の対応する残基を含む）を含む。場合によっては、ＴｆＲ結合ペプチドは、配列番号３２を基準として、ドメインの残基Ｇ５、Ａ７、Ｓ８、Ｍ１１、Ｎ１４、Ｌ１７、Ｅ１８、及びＥ２１に対応するＴｆＲ結合残基、ならびに第２のドメインの残基Ｌ３８、Ｌ４１、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｄ４６、Ｈ４７、Ｈ４９、Ｓ５０、及びＱ５１に対応するＴｆＲ結合残基を含む、配列番号３２に示される配列を有するペプチドである。

いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ペプチドは、内在性分子（例えば、トランスフェリン、ホロトランスフェリン（鉄が結合したトランスフェリン）、アポトランスフェリン（鉄が結合していないトランスフェリン）、もしくは任意の他の内在性ＴｆＲリガンド）または他の外来性分子と比較して、同等、類似、またはより高い親和性（例えば、より低い解離定数Ｋ_Ｄ）でＴｆＲに結合する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、５０μＭ未満、５μＭ未満、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、０．３ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、または０．１ｎＭ未満のＫ_Ｄを有し得る。いくつかの実施形態では、ＴｆＲによるペプチド輸送は、内在性分子と比較して、より低い親和性（例えば、より高い解離定数Ｋ_Ｄ）を有することによって、改善される。いくつかの実施形態では、ＴｆＲによるペプチド輸送は、内在性分子よりも速いオフ速度またはより高いｋ_ｏｆｆを有することによって、改善される。いくつかの実施形態では、オフ速度またはｋ_ｏｆｆは、トランスフェリンと同様である。いくつかの実施形態では、ペプチド輸送は、より速いオン速度またはより高い、任意選択によりトランスフェリンよりも高い、ｋ_ｏｎを有することによって改善される。他の実施形態では、トランスフェリン（Ｔｆ）－ＴｆＲ結合界面にある１つ以上の保存残基は、本明細書に記載のペプチドのアミノ酸配列にも存在する。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ペプチドは、ＴｆＲ結合ペプチドが再循環プロセス中にＴｆＲに結合したままである可能性が高いように、ＴｆＲの再循環速度よりも遅いオフ速度を有する。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ペプチドは、１分以内、２分以内、３分以内、４分以内、５分以内、７分以内、１０分以内、１５分以内、または２０分以内のオフ速度を有し得る。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ペプチドは、約１分～約２０分間、約２分間～約１５分間、約２分間～約１０分間、または約５分間～約１０分間のオフ速度を有し得る。

いくつかの実施形態では、改善されたＴｆＲ受容体結合を示すＴｆＲ結合ペプチドは、改善されたトランスサイトーシス機能、改善されたエンドサイトーシス機能、改善された再循環、またはそれらの組み合わせを示す。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ受容体結合の改善を示すＴｆＲ結合ペプチドは、トランスサイトーシス機能、エンドサイトーシス機能、再循環、またはそれらの組み合わせに変化が全くないか、または小さな変化を示す。いくつかの実施形態では、改善されたＴｆＲ受容体結合を示すＴｆＲ結合ペプチドは、減少したトランスサイトーシス機能、減少したエンドサイトーシス機能、減少した再循環、またはそれらの組み合わせを示す。いくつかの態様において、ＴｆＲ結合ペプチドは、ヒトＴｆＲ１（配列番号１９０、ＭＭＤＱＡＲＳＡＦＳＮＬＦＧＧＥＰＬＳＹＴＲＦＳＬＡＲＱＶＤＧＤＮＳＨＶＥＭＫＬＡＶＤＥＥＥＮＡＤＮＮＴＫＡＮＶＴＫＰＫＲＣＳＧＳＩＣＹＧＴＩＡＶＩＶＦＦＬＩＧＦＭＩＧＹＬＧＹＣＫＧＶＥＰＫＴＥＣＥＲＬＡＧＴＥＳＰＶＲＥＥＰＧＥＤＦＰＡＡＲＲＬＹＷＤＤＬＫＲＫＬＳＥＫＬＤＳＴＤＦＴＧＴＩＫＬＬＮＥＮＳＹＶＰＲＥＡＧＳＱＫＤＥＮＬＡＬＹＶＥＮＱＦＲＥＦＫＬＳＫＶＷＲＤＱＨＦＶＫＩＱＶＫＤＳＡＱＮＳＶＩＩＶＤＫＮＧＲＬＶＹＬＶＥＮＰＧＧＹＶＡＹＳＫＡＡＴＶＴＧＫＬＶＨＡＮＦＧＴＫＫＤＦＥＤＬＹＴＰＶＮＧＳＩＶＩＶＲＡＧＫＩＴＦＡＥＫＶＡＮＡＥＳＬＮＡＩＧＶＬＩＹＭＤＱＴＫＦＰＩＶＮＡＥＬＳＦＦＧＨＡＨＬＧＴＧＤＰＹＴＰＧＦＰＳＦＮＨＴＱＦＰＰＳＲＳＳＧＬＰＮＩＰＶＱＴＩＳＲＡＡＡＥＫＬＦＧＮＭＥＧＤＣＰＳＤＷＫＴＤＳＴＣＲＭＶＴＳＥＳＫＮＶＫＬＴＶＳＮＶＬＫＥＩＫＩＬＮＩＦＧＶＩＫＧＦＶＥＰＤＨＹＶＶＶＧＡＱＲＤＡＷＧＰＧＡＡＫＳＧＶＧＴＡＬＬＬＫＬＡＱＭＦＳＤＭＶＬＫＤＧＦＱＰＳＲＳＩＩＦＡＳＷＳＡＧＤＦＧＳＶＧＡＴＥＷＬＥＧＹＬＳＳＬＨＬＫＡＦＴＹＩＮＬＤＫＡＶＬＧＴＳＮＦＫＶＳＡＳＰＬＬＹＴＬＩＥＫＴＭＱＮＶＫＨＰＶＴＧＱＦＬＹＱＤＳＮＷＡＳＫＶＥＫＬＴＬＤＮＡＡＦＰＦＬＡＹＳＧＩＰＡＶＳＦＣＦＣＥＤＴＤＹＰＹＬＧＴＴＭＤＴＹＫＥＬＩＥＲＩＰＥＬＮＫＶＡＲＡＡＡＥＶＡＧＱＦＶＩＫＬＴＨＤＶＥＬＮＬＤＹＥＲＹＮＳＱＬＬＳＦＶＲＤＬＮＱＹＲＡＤＩＫＥＭＧＬＳＬＱＷＬＹＳＡＲＧＤＦＦＲＡＴＳＲＬＴＴＤＦＧＮＡＥＫＴＤＲＦＶＭＫＫＬＮＤＲＶＭＲＶＥＹＨＦＬＳＰＹＶＳＰＫＥＳＰＦＲＨＶＦＷＧＳＧＳＨＴＬＰＡＬＬＥＮＬＫＬＲＫＱＮＮＧＡＦＮＥＴＬＦＲＮＱＬＡＬＡＴＷＴＩＱＧＡＡＮＡＬＳＧＤＶＷＤＩＤＮＥＦ）の残基５０６～５１０、５２３～５３１、及び６１１～６６２に対応するアミノ酸ドメインの１つ以上、またはすべてを含む、ヒトＴｆＲとマウスＴｆＲの間の高い相動性の部位で結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるペプチドまたはそのバリアントが結合するＴｆＲの領域は、そのようなＴｆＲドメインのすべてまたは一部である。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるペプチドは、ヒトＴｆＲ（配列番号１９０）の残基５０６～５１０、５２３～５３１、及び６１１～６６２に対応するアミノ酸ドメインを含む、高い相同性を示すＴｆＲ領域のいずれか１つ、いずれか２つ、または３つすべてに結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるペプチドは、ヒトＴｆＲの残基６１１～６６２に対応するドメインに少なくとも結合する。

いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ペプチドのＫ_Ａ値及びＫ_Ｄ値を調節及び最適化して（例えば、アミノ酸置換を介して）、ＴｆＲ結合親和性と効率的なトランスサイトーシス機能の最適な比率をもたらすことができる。

いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるペプチドまたはそのバリアントは、ＴｆＲと他の外来性または内在性リガンド（例えば、トランスフェリン（Ｔｆ）、Ｔｆ誘導体、またはＴｆ様ペプチドもしくはタンパク質）との結合界面（例えば、結合ドメインまたは結合ポケット）に見出される残基でＴｆＲに結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴｆＲに結合するペプチドまたはそのバリアントは、結合ポケットを構成する、ＴｆＲの残基に結合する配列に対して、少なくとも７０％の相同性、少なくとも７５％の相同性、少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性、または少なくとも１００％の相同性を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴｆＲに結合するペプチドまたはそのバリアントは、ＴｆＲに結合することが知られている内在性もしくは外来性ポリペプチド、例えば、内在性トランスフェリン、または表１に列挙されるペプチドのいずれか１つに対して、少なくとも７０％の相同性、少なくとも７５％の相同性、少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性、または少なくとも１００％の相同性を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、ＴｆＲ、その断片、ホモログ、またはバリアントに対して、少なくとも７０％の相同性、少なくとも７５％の相同性、少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性、または少なくとも１００％の相同性を含む目的のタンパク質に結合する。

いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるペプチドまたはそのバリアントは、残基５０６～５１０、５２３～５３１、及び６１１～６６２に対応するアミノ酸残基を含むＴｆＲの領域に結合する（これらのアミノ酸残基のナンバリングは、内在性ヒトＴＦＲＣＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０２７８６（配列番号１９０、ＴＦＲ１＿ＨＵＭＡＮ）の参照タンパク質配列に基づく）。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるペプチドまたはそのバリアントが結合するＴｆＲの領域は、Ｔｆ、その断片、ホモログ、またはバリアントのものと重複する。

他の実施形態では、核酸、ベクター、プラスミド、またはドナーＤＮＡは、本開示に記載されるペプチド、ペプチド構築物、ペプチド複合体、またはそのバリアントもしくは機能性断片をコードする配列を含む。さらなる実施形態では、ＴｆＲ結合モチーフ（例えば、保存された結合モチーフ）のある特定の部分または断片は、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか１つの配列を含むペプチドまたはペプチド複合体上にグラフトされ得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＴｆＲの分解を引き起こすか、またはＴｆＲの細胞の核への局在化を阻止するか、またはＴｆＲとトランスフェリンもしくはトランスフェリン様タンパク質との相互作用を阻止することができる。

いくつかの実施形態では、ペプチドは、ある特定のアミノ酸残基またはアミノ酸残基のモチーフに結合する能力に基づいて、さらなる試験または使用のために選択され得る。ＴｆＲ中のある特定のアミノ酸残基またはアミノ酸残基のモチーフは、ＴｆＲのＴｆへの結合に関与するアミノ酸残基またはアミノ酸残基の配列で同定することができる。ある特定のアミノ酸残基またはアミノ酸残基のモチーフは、ＴｆＲ：Ｔｆ複合体の結晶構造から同定することができる。いくつかの実施形態では、ペプチド（例えば、ＣＤＰ）は、熱、プロテアーゼ（ペプシン）、及び還元に対する耐性を示す。

配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４に示されるアミノ酸配列のうちの１つ以上を含む、ペプチド、ペプチド複合体（例えば、ペプチドコンジュゲートまたは融合ペプチド）、及び選択的送達複合体は、目的のタンパク質に結合することができる。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、ＴｆＲである。いくつかの実施形態では、ＴｆＲに結合するペプチド及びペプチド複合体（例えば、ペプチドコンジュゲートまたは融合ペプチド）は、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、本開示のＴｆＲに結合するペプチド、ペプチド複合体（例えば、ペプチドコンジュゲート及び融合分子）は、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の相同性、少なくとも７５％の相同性、少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性、または少なくとも１００％の相同性を有するペプチド誘導体またはバリアントを含む。例えば、本開示のＴｆＲに結合するペプチドまたはペプチド複合体（例えば、ペプチドコンジュゲート及び融合分子）は、配列番号９６に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の相同性、少なくとも７５％の相同性、少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性または少なくとも１００％の相同性を有するペプチド誘導体またはバリアントを含み得る。

表１は、本開示の方法及び組成物による例示的なペプチド配列を列挙する。

いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、ＧＳＲＥＧＣＡＸ_１ＲＣＸ_２ＫＹＸ_４ＤＥＸ_２Ｘ_３ＫＣＸ_３ＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＸ_２ＥＤＸ_２Ｘ_２ＹＣＸ_２Ｘ_３Ｘ_５ＣＸ_５Ｘ_１Ｘ_４（配列番号１４８）またはＲＥＧＣＡＸ_１ＲＣＸ_２ＫＹＸ_４ＤＥＸ_２Ｘ_３ＫＣＸ_３ＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＸ_２ＥＤＸ_２Ｘ_２ＹＣＸ_２Ｘ_３Ｘ_５ＣＸ_５Ｘ_１Ｘ_４（配列番号１６７）を含み、式中、Ｘ_１は、Ｓ、Ｔ、Ｄ、またはＮから独立して選択することができ、Ｘ_２は、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、またはＶから独立して選択することができ、Ｘ_３は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから独立して選択することができ、Ｘ_４は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから独立して選択することができ、Ｘ_５は、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから独立して選択することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、ＧＳＲＥＸ_１ＣＸ_２Ｘ_３ＲＣＸ_４ＫＹＸ_５ＤＥＸ_６Ｘ_７ＫＣＸ_８ＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＬＥＤＬＬＹＣＬＤＨＣＨＳＱ（配列番号１４９）またはＲＥＸ_１ＣＸ_２Ｘ_３ＲＣＸ_４ＫＹＸ_５ＤＥＸ_６Ｘ_７ＫＣＸ_８ＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＬＥＤＬＬＹＣＬＤＨＣＨＳＱ（配列番号１６８）を含み、式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、及びＸ_８は、ＴｆＲ結合界面残基であり、独立して任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、ＧＳＲＥＧＣＡＳＲＣＭＫＹＮＤＥＬＥＫＣＥＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＸ_１ＥＤＸ_２Ｘ_３ＹＣＸ_４Ｘ_５Ｘ_６ＣＸ_７Ｘ_８Ｘ_９（配列番号１５０）またはＲＥＧＣＡＳＲＣＭＫＹＮＤＥＬＥＫＣＥＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＸ_１ＥＤＸ_２Ｘ_３ＹＣＸ_４Ｘ_５Ｘ_６ＣＸ_７Ｘ_８Ｘ_９（配列番号１６９）を含み、式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、及びＸ_９は、ＴｆＲ結合界面残基であり、独立して任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、ＧＳＲＥＸ_１ＣＸ_２Ｘ_３ＲＣＸ_４ＫＹＸ_５ＤＥＸ_６Ｘ_７ＫＣＸ_８ＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＸ_９ＥＤＸ_１０Ｘ_１１ＹＣＸ_１２Ｘ_１３Ｘ_１３ＣＸ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７（配列番号１５１）またはＲＥＸ_１ＣＸ_２Ｘ_３ＲＣＸ_４ＫＹＸ_５ＤＥＸ_６Ｘ_７ＫＣＸ_８ＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＸ_９ＥＤＸ_１０Ｘ_１１ＹＣＸ_１２Ｘ_１３Ｘ_１３ＣＸ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７（配列番号１７０）を含み、式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６、及びＸ_１７は、ＴｆＲ結合界面残基であり、独立して任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、ＧＳＲＥＧＣＡＳＲＣＭＫＹＮＤＥＬＥＫＣＥＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＬＥＤＬＬＹＣＬＤＨＣＨＳＱ（配列番号３２）を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＧＸ_５ＡＳＸ_６Ｘ_７ＭＸ_８Ｘ_９ＮＸ_１０Ｘ_１１ＬＥＸ_１２Ｘ_１３ＥＸ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１Ｘ_２２Ｘ_２３Ｘ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０Ｘ_３１Ｘ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４Ｘ_３５Ｘ_３６Ｘ_３７Ｘ_３８Ｘ_３９Ｘ_４０Ｘ_４１Ｘ_４２Ｘ_４３（配列番号１５２）を含み、式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６、Ｘ_１７、Ｘ_１８、Ｘ_１９、Ｘ_２０、Ｘ_２１、Ｘ_２２、Ｘ_２３、Ｘ_２４、Ｘ_２５、Ｘ_２６、Ｘ_２７、Ｘ_２８、Ｘ_２９、Ｘ_３０、Ｘ_３１、Ｘ_３２、Ｘ_３３、Ｘ_３４、Ｘ_３５、Ｘ_３６、Ｘ_３７、Ｘ_３８、Ｘ_３９、Ｘ_４０、Ｘ_４１、Ｘ_４２、及びＸ_４３は、独立して任意のアミノ酸であり得る。

いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１Ｘ_２２Ｘ_２３Ｘ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０Ｘ_３１Ｘ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４Ｘ_３５Ｘ_３６Ｘ_３７ＬＸ_３８Ｘ_３９ＬＬＸ_４０Ｘ_４１ＬＤＨＸ_４２ＨＳＱ（配列番号１５３）を含み、式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６、Ｘ_１７、Ｘ_１８、Ｘ_１９、Ｘ_２０、Ｘ_２１、Ｘ_２２、Ｘ_２３、Ｘ_２４、Ｘ_２５、Ｘ_２６、Ｘ_２７、Ｘ_２８、Ｘ_２９、Ｘ_３０、Ｘ_３１、Ｘ_３２、Ｘ_３３、Ｘ_３４、Ｘ_３５、Ｘ_３６、Ｘ_３７、Ｘ_３８、Ｘ_３９、Ｘ_４０、Ｘ_４１、及びＸ_４２は、独立して任意のアミノ酸であり得る。

いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＧＸ_５ＡＳＸ_６Ｘ_７ＭＸ_８Ｘ_９ＮＸ_１０Ｘ_１１ＬＥＸ_１２Ｘ_１３ＥＸ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１Ｘ_２２Ｘ_２３Ｘ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９ＬＸ_３０Ｘ_３１ＬＬＸ_３２Ｘ_３３ＬＤＨＸ_３４ＨＳＱ（配列番号１５４）を含み、式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６、Ｘ_１７、Ｘ_１８、Ｘ_１９、Ｘ_２０、Ｘ_２１、Ｘ_２２、Ｘ_２３、Ｘ_２４、Ｘ_２５、Ｘ_２６、Ｘ_２７、Ｘ_２８、Ｘ_２９、Ｘ_３０、Ｘ_３１、Ｘ_３２、Ｘ_３３、及びＸ_３４は、独立して任意のアミノ酸であり得る。

いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドまたはペプチド複合体は、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか１つ、またはその任意のバリアント、ホモログ、もしくは機能性断片に対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドまたはペプチド複合体は、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか１つ、またはその任意のバリアント、ホモログ、もしくは機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、ＴｆＲに結合するペプチドは、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ペプチドは、配列番号３２を基準として、対応する位置５、７、８、１４、１７、１８、２１、３８、４２、４５、４６、４７、５０、５１のいずれか１つまたはこれらの組み合わせに、表面界面残基として標準的なアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ペプチドは、配列番号３２を基準として、対応する位置Ｇ５、Ａ７、Ｓ８、Ｎ１４、Ｌ１７、Ｅ１８、Ｅ２１、Ｌ３８、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｄ４６、Ｈ４７、Ｓ５０、Ｑ５１のいずれか１つまたはこれらの組み合わせに、表面界面残基として標準的なアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドまたはペプチド複合体は、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のこれらの対応する残基の少なくとも１つ以上を含む。したがって、そのようなペプチドは、ＴｆＲへの結合が増大するように操作することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＧＸ_５ＡＳＸ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０ＮＸ_１１Ｘ_１２ＬＥＸ_１３Ｘ_１４ＥＸ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１Ｘ_２２Ｘ_２３Ｘ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０ＬＸ_３１Ｘ_３２Ｘ_３３ＬＸ_３４Ｘ_３５ＬＤＨＸ_３６Ｘ_３７ＳＱ（配列番号１５５）を含み、式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６、Ｘ_１７、Ｘ_１８、Ｘ_１９、Ｘ_２０、Ｘ_２１、Ｘ_２２、Ｘ_２３、Ｘ_２４、Ｘ_２５、Ｘ_２６、Ｘ_２７、Ｘ_２８、Ｘ_２９、Ｘ_３０、Ｘ_３１、Ｘ_３２、Ｘ_３３、Ｘ_３４、Ｘ_３５、Ｘ_３６、及びＸ_３７は、独立して任意のアミノ酸であり得る。

いくつかの実施形態では、ペプチドのアミノ酸配列に存在する表面遠位親水性アミノ酸残基（例えば、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴ）は、ペプチドの可溶性に寄与する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるペプチドは、配列番号３２を基準として、対応する位置３、４、９、１１、１５、１６、１９、２３、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３９、４０のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせに親水性アミノ酸残基を含む。いくつかの例では、本開示のペプチドは、配列番号３２を基準として、次の対応する位置の親水性アミノ酸残基：Ｒ３、Ｅ４、Ｒ９、Ｋ１２、Ｄ１５、Ｅ１６、Ｋ１９、Ｒ２３、Ｓ２６、Ｓ２８、Ｎ２９、Ｔ３０、Ｅ３１、Ｅ３２、Ｄ３３、Ｅ３５、Ｑ３６、Ｅ３７、Ｅ３９、Ｄ４０、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、配列番号３２を基準として、対応する位置Ｒ３、Ｅ４、Ｒ９、Ｋ１２、Ｄ１５、Ｅ１６、Ｋ１９、Ｒ２３、Ｓ２６、Ｓ２８、Ｎ２９、Ｔ３０、Ｅ３１、Ｅ３２、Ｄ３３、Ｅ３５、Ｑ３６、Ｅ３７、Ｅ３９、Ｄ４０のいずれか１つまたは任意の組み合わせは、可溶性またはＴｆＲ結合に大きな影響を及ぼすことなく、別の親水性残基へと変異させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、Ｘ_１Ｘ_２ＲＥＸ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６ＲＸ_７Ｘ_８ＫＸ_９Ｘ_１０ＤＥＸ_１１Ｘ_１２ＫＸ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５ＲＸ_１６Ｘ_１７ＳＸ_１８ＳＮＴＥＥＤＸ_１９ＥＱＥＸ_２０ＥＤＸ_２１Ｘ_２２Ｘ_２３Ｘ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０Ｘ_３１配列番号１５６）を含み、式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６、Ｘ_１７、Ｘ_１８、Ｘ_１９、Ｘ_２０、Ｘ_２１、Ｘ_２２、Ｘ_２３、Ｘ_２４、Ｘ_２５、Ｘ_２６、Ｘ_２７、Ｘ_２８、Ｘ_２９、Ｘ_３０、及びＸ_３１は、独立して任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、ＧＳＸ_１Ｘ_２ＧＣＡＳＸ_３ＣＭＸ_４ＹＮＸ_５Ｘ_６ＬＥＸ_７ＣＥＡＸ_８ＭＭＸ_９ＭＸ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５ＣＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＬＸ_１９Ｘ_２０ＬＬＹＣＬＤＨＣＨＳＱ（配列番号１５７）またはＸ_１Ｘ_２ＧＣＡＳＸ_３ＣＭＸ_４ＹＮＸ_５Ｘ_６ＬＥＸ_７ＣＥＡＸ_８ＭＭＸ_９ＭＸ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５ＣＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＬＸ_１９Ｘ_２０ＬＬＹＣＬＤＨＣＨＳＱ（配列番号１７１）を含み、式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６、Ｘ_１７、Ｘ_１８、Ｘ_１９、及びＸ_２０は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから独立して選択することができる。

いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、配列番号９６を基準として、対応する位置４、８、１８、３２、４２、及び４６にシステインアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、配列番号３２を基準として、対応する位置６、１０、２０、３４、４４、及び４８にシステインアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、配列番号３２を基準として、対応する位置１５、３５、３９、４９、またはこれらの任意の組み合わせに親水性残基（例えば、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴ）を含む。いくつかの例では、本開示のペプチドは、配列番号３２を基準として、次の対応する位置の親水性アミノ酸残基：Ｄ１５、Ｅ３５、Ｅ３９、Ｈ４９、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、配列番号３２を基準として、対応する位置Ｄ１５、Ｅ３５、Ｅ３９、Ｈ４９のいずれか１つまたは任意の組み合わせは、可溶性またはＴｆＲ結合に大きな影響を及ぼすことなく、別の親水性残基へと変異させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４ＤＸ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１Ｘ_２２Ｘ_２３Ｘ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０Ｘ_３１Ｘ_３２Ｘ_３３ＥＸ_３４Ｘ_３５Ｘ_３６ＥＸ_３７Ｘ_３８Ｘ_３９Ｘ_４０Ｘ_４１Ｘ_４２Ｘ_４３Ｘ_４４Ｘ_４５ＨＸ_４６Ｘ_４７（配列番号１５８）を含み、式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６、Ｘ_１７、Ｘ_１８、Ｘ_１９、Ｘ_２０、Ｘ_２１、Ｘ_２２、Ｘ_２３、Ｘ_２４、Ｘ_２５、Ｘ_２６、Ｘ_２７、Ｘ_２８、Ｘ_２９、Ｘ_３０、Ｘ_３１、Ｘ_３２、Ｘ_３３、Ｘ_３４、Ｘ_３５、Ｘ_３６、Ｘ_３７、Ｘ_３８、Ｘ_３９、Ｘ_４０、Ｘ_４１、Ｘ_４２、Ｘ_４３、Ｘ_４４、Ｘ_４５、Ｘ_４６、及びＸ_４７は、独立して任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、ＧＳＲＥＧＣＡＳＲＣＭＫＹＮＸ_１ＥＬＥＫＣＥＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＸ_２ＱＥＬＸ_３ＤＬＬＹＣＬＤＨＣＸ_４ＳＱ（配列番号１５９）またはＲＥＧＣＡＳＲＣＭＫＹＮＸ_１ＥＬＥＫＣＥＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＸ_２ＱＥＬＸ_３ＤＬＬＹＣＬＤＨＣＸ_４ＳＱ（配列番号１７２）を含み、式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、及びＸ_４は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから独立して選択することができる。

いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、配列番号３２を基準として、対応する位置１５、３５、３９、４９、またはこれらの任意の組み合わせに疎水性残基（例えば、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、またはＹ）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、ＧＳＲＥＧＣＡＳＲＣＭＫＹＮＸ_１ＥＬＥＫＣＥＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＸ_２ＱＥＬＸ_３ＤＬＬＹＣＬＤＨＣＸ_４ＳＱ（配列番号１６０）またはＲＥＧＣＡＳＲＣＭＫＹＮＸ_１ＥＬＥＫＣＥＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＸ_２ＱＥＬＸ_３ＤＬＬＹＣＬＤＨＣＸ_４ＳＱ（配列番号１７３）を含み、式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、及びＸ_４は、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、またはＹから独立して選択することができる。いくつかの実施形態では、配列番号３２を基準として、対応する位置１５、３５、３９、及び４９のいずれか１つの親水性アミノ酸残基は、ＴｆＲに対するより高い結合親和性（例えば、標的結合）及びより高い可溶性に関連する。いくつかの実施形態では、配列番号３２を基準として、対応する位置１５、３５、３９、及び４９のいずれか１つのアミノ酸残基の疎水性残基から親水性残基への変異は、ＴｆＲに対するより高い結合親和性（例えば、標的結合）及びより高い可溶性をもたらすことができる。

いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、配列番号３２を基準として、対応する位置１１、２５、２７、またはこれらの任意の組み合わせに疎水性残基（例えば、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、またはＹ）を含む。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、配列番号３２を基準として、対応する位置１１、２５、２７、またはこれらの任意の組み合わせに親水性残基（例えば、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴ）を含む。いくつかの実施形態では、配列番号３２を基準として、対応する位置１１、２５、及び２７のいずれか１つの疎水性アミノ酸残基は、ＴｆＲに対するより高い結合親和性（例えば、標的結合）及びより高い可溶性に関連している。いくつかの実施形態では、配列番号３２を基準として、対応する位置１１、２５、及び２７のいずれか１つのアミノ酸残基の親水性残基から疎水性残基への変異は、ＴｆＲに対するより高い結合親和性（例えば、標的結合）及びより高い可溶性をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、配列番号３２を基準として、対応する位置の疎水性アミノ酸残基：Ｍ１１、Ｍ２５、Ｍ２７、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの例では、ペプチドは、配列番号３２を基準として、対応する位置の疎水性アミノ酸残基Ｍ１１、Ｍ２５、及びＭ２７を含む。いくつかの実施形態では、配列番号３２を基準として、対応する位置Ｍ１１、Ｍ２５、及びＭ２７の任意の組み合わせは、可溶性またはＴｆＲ結合に大きな影響を及ぼすことなく、別の疎水性残基へと変異させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０ＭＸ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１Ｘ_２２Ｘ_２３ＭＸ_２４ＭＸ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０Ｘ_３１Ｘ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４Ｘ_３５Ｘ_３６Ｘ_３７Ｘ_３８Ｘ_３９Ｘ_４０Ｘ_４１Ｘ_４２Ｘ_４３Ｘ_４４Ｘ_４５Ｘ_４６Ｘ_４７Ｘ_４８（配列番号１６１）を含み、式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６、Ｘ_１７、Ｘ_１８、Ｘ_１９、Ｘ_２０、Ｘ_２１、Ｘ_２２、Ｘ_２３、Ｘ_２４、Ｘ_２５、Ｘ_２６、Ｘ_２７、Ｘ_２８、Ｘ_２９、Ｘ_３０、Ｘ_３１、Ｘ_３２、Ｘ_３３、Ｘ_３４、Ｘ_３５、Ｘ_３６、Ｘ_３７、Ｘ_３８、Ｘ_３９、Ｘ_４０、Ｘ_４１、Ｘ_４２、Ｘ_４３、Ｘ_４４、Ｘ_４５、Ｘ_４６、Ｘ_４７、及びＸ_４８は、独立して任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、ＧＳＲＥＧＣＡＳＲＣＸ_１ＫＹＮＤＥＬＥＫＣＥＡＲＭＸ_２ＳＸ_３ＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＬＥＤＬＬＹＣＬＤＨＣＨＳＱ（配列番号１６２）またはＲＥＧＣＡＳＲＣＸ_１ＫＹＮＤＥＬＥＫＣＥＡＲＭＸ_２ＳＸ_３ＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＬＥＤＬＬＹＣＬＤＨＣＨＳＱ（配列番号１７４）を含み、式中、Ｘ_１、Ｘ_２、及びＸ_３は、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、またはＹから独立して選択することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、ＧＳＲＥＧＣＡＳＲＣＸ_１ＫＹＮＤＥＬＥＫＣＥＡＲＭＸ_２ＳＸ_３ＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＬＥＤＬＬＹＣＬＤＨＣＨＳＱ（配列番号１６３）またはＲＥＧＣＡＳＲＣＸ_１ＫＹＮＤＥＬＥＫＣＥＡＲＭＸ_２ＳＸ_３ＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＬＥＤＬＬＹＣＬＤＨＣＨＳＱ（配列番号１７５）を含み、式中、Ｘ_１、Ｘ_２、及びＸ_３は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから独立して選択することができる。

いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、配列番号３２を基準として、対応する位置４５に脂肪族アミノ酸残基（例えば、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、またはＶ）を含む。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、対応する位置４５に芳香族アミノ酸残基（例えば、Ｆ、Ｗ、またはＹ）を含む。いくつかの実施形態では、対応する位置４５の脂肪族アミノ酸残基は、ＴｆＲへのより高い結合親和性に関連する。いくつかの例では、ペプチドは、配列番号３２を基準として、Ｌ４５に対応する脂肪族アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、対応する位置４５のアミノ酸残基の芳香族残基から脂肪族残基への変異は、ＴｆＲに対するより高い結合親和性（例えば、標的結合）及びより高い可溶性をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、対応する位置Ｌ４５を別の脂肪族残基に変異させることは、可溶性またはＴｆＲ結合に大きな影響を及ぼさないようにできる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１Ｘ_２２Ｘ_２３Ｘ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０Ｘ_３１Ｘ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４Ｘ_３５Ｘ_３６Ｘ_３７Ｘ_３８Ｘ_３９Ｘ_４０Ｘ_４１Ｘ_４２Ｘ_４３Ｘ_４４ＬＸ_４５Ｘ_４６Ｘ_４７Ｘ_４８Ｘ_４９Ｘ_５０（配列番号１６４）を含み、式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６、Ｘ_１７、Ｘ_１８、Ｘ_１９、Ｘ_２０、Ｘ_２１、Ｘ_２２、Ｘ_２３、Ｘ_２４、Ｘ_２５、Ｘ_２６、Ｘ_２７、Ｘ_２８、Ｘ_２９、Ｘ_３０、Ｘ_３１、Ｘ_３２、Ｘ_３３、Ｘ_３４、Ｘ_３５、Ｘ_３６、Ｘ_３７、Ｘ_３８、Ｘ_３９、Ｘ_４０、Ｘ_４１、Ｘ_４２、Ｘ_４３、Ｘ_４４、Ｘ_４５、Ｘ_４６、Ｘ_４７、Ｘ_４８、Ｘ_４９、及びＸ_５０は、独立して任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴｆＲ結合ペプチドは、ＧＳＲＥＧＣＡＳＲＣＭＫＹＮＤＥＬＥＫＣＥＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＬＥＤＬＬＹＣＸ_１ＤＨＣＨＳＱ（配列番号１６５）またはＲＥＧＣＡＳＲＣＭＫＹＮＤＥＬＥＫＣＥＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＬＥＤＬＬＹＣＸ_１ＤＨＣＨＳＱ（配列番号１７６）を含み、式中、Ｘ_１は、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、またはＶから独立して選択することができる。

いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、ＧＳＲＥＧＣＡＳＲＣＭＸ_１ＹＮＤＥＬＥＸ_２ＣＥＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＬＥＤＬＬＹＣＬＤＨＣＨＳＱ（配列番号１６６）またはＲＥＧＣＡＳＲＣＭＸ_１ＹＮＤＥＬＥＸ_２ＣＥＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＬＥＤＬＬＹＣＬＤＨＣＨＳＱ（配列番号１７７）を含み、式中、Ｘ_１及びＸ_２は、ＫまたはＲから独立して選択することができる。いくつかの実施形態では、配列番号３２を基準として、対応する位置１２及び１９のこれらの残基は、別の分子（例えば、活性剤または検出可能な剤）への化学コンジュゲーションに使用することができる。いくつかの実施形態では、Ｘ_１とＸ_２は両方ともＲであり、化学コンジュゲーションはペプチドのＮ末端でなされる。

いくつかの実施形態では、受容体結合ペプチドは、抗体または抗体断片に由来し得る。例えば、受容体結合ペプチドは、単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）に由来し得る。本開示の選択的枯渇複合体に組み込むことのできるＴｆＲ結合ペプチドの例としては、配列番号２２０（ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＲＦＴＦＳＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＳＧＹＧＤＹＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＥＬＴＱＤＰＡＶＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩＴＣＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＭＹＧＲＮＥＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＳＧＬＱＰＥＤＥＡＮＹＹＣＡＧＷＤＤＳＬＴＧＰＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧ）、配列番号２２１（ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＲＦＴＦＮＮＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＳＧＹＧＤＹＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＥＬＴＱＤＰＡＶＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩＴＣＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＭＹＧＲＮＥＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＳＧＬＱＰＥＤＥＡＮＹＹＣＡＧＷＤＤＳＬＴＧＰＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧ）、及び配列番号２２２（ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＲＹＰＦＨＨＨＤＨＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＳＧＹＧＤＹＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＥＬＴＱＤＰＡＶＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩＴＣＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＭＹＧＲＮＥＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＳＧＬＱＰＥＤＥＡＮＹＹＣＡＧＷＤＤＳＬＴＧＰＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ペプチドは、配列番号２２０～配列番号２２２のいずれか１つの配列、またはその断片を有し得る。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ペプチドは、配列番号２２０～配列番号２２２のいずれか１つ、またはその断片と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有し得る。いくつかの実施形態では、配列番号２２０または配列番号２２１のペプチドは、ｐＨ非依存性ＴｆＲ結合ペプチドとして機能し得る。いくつかの実施形態では、配列番号２２２のペプチドは、ｐＨ依存性ＴｆＲ結合ペプチドとして機能し得る。

いくつかの実施形態では、本開示のペプチドのアミノ酸残基のうちの任意の１つ以上の変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善することができる。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドのアミノ酸残基の５～８０％における変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドのアミノ酸残基の１～１００％、５～１００％、または５～５０％における変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドのアミノ酸残基の１５～５０％における変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドのアミノ酸残基の１５～３０％における変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドのアミノ酸残基の２５～３０％における変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。例えば、配列番号３２の配列を有するペプチドの５１アミノ酸残基のうちの１４アミノ酸残基（２７．５％）における変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善することができる。

いくつかの実施形態では、本開示のペプチドのアミノ酸残基のうちの任意の１つ以上の変異は、ＴｆＲの結合界面にあり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドに対する変異は、結合親和性を改善することができ、これは、本明細書で開示されるペプチドまたはペプチド複合体の結合及びトランスサイトーシスに有益であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるペプチドは、最適な活性を得るために、多くの変異または少数の変異を有し得、ここで、最適な活性は、ＴｆＲの結合に十分な結合であるが、必ずしもペプチド及び／またはペプチド複合体のトランスサイトーシス後の放出を妨げるほど強い結合である必要はない。したがって、本開示のペプチドは、ペプチドまたはペプチド複合体の最適な結合、機能（例えば、トランスサイトーシス、ＢＢＢ透過、細胞膜透過、生物学的障壁を越えた輸送、エンドサイトーシス、再循環、またはそれらの組み合わせ）、及び放出を得るために、結合親和性及びオフ速度を調整する多数の変異（変異されたアミノ酸残基％とも称される）を含み得る。したがって、最大限の親和性をもたらす変異は、最適な結合及びトランスサイトーシスを有する優れたペプチドと必ずしも相関しない場合がある。

いくつかの実施形態では、本開示のペプチドのアミノ酸残基の１～１００％または５～１００％は、ＴｆＲの結合界面にある。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドのアミノ酸残基の１０～９０％は、ＴｆＲの結合界面にある。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドのアミノ酸残基の２０～８０％は、ＴｆＲの結合界面にある。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドのアミノ酸残基の３０～７０％は、ＴｆＲの結合界面にある。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドのアミノ酸残基の４０～６０％は、ＴｆＲの結合界面にある。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドのアミノ酸残基の３０～３５％は、ＴｆＲの結合界面にある。例えば、配列番号３２の配列を有するペプチドの５１アミノ酸残基のうちの１７アミノ酸残基（３３％）は、ＴｆＲの結合界面にあり得る。

いくつかの実施形態では、ＴｆＲの結合界面にある本開示のペプチドのアミノ酸残基のうちの任意の１つ以上の変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善することができる。いくつかの実施形態では、ＴｆＲの結合界面にある本開示のペプチドのアミノ酸残基の１～１００％または５～１００％の変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態では、ＴｆＲの結合界面にある本開示のペプチドのアミノ酸残基の５～８０％の変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態では、ＴｆＲの結合界面にある本開示のペプチドのアミノ酸残基の１０～７０％の変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態では、ＴｆＲの結合界面にある本開示のペプチドのアミノ酸残基の１５～６０％の変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態では、ＴｆＲの結合界面にある本開示のペプチドのアミノ酸残基の２０～５０％の変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態では、ＴｆＲの結合界面にある本開示のペプチドのアミノ酸残基の２５～３０％の変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。例えば、ＴｆＲの結合界面にある配列番号３２の配列を有するペプチドの１７アミノ酸残基のうちの５アミノ酸残基（２９％）における変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善することができる。

いくつかの実施形態では、本開示のペプチドのアミノ酸残基のうちの任意の１つ以上の変異は、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドのアミノ酸残基の１～１００％または５～１００％は、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドのアミノ酸残基の１０～９０％は、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドのアミノ酸残基の２０～８０％は、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドのアミノ酸残基の３０～７０％は、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドのアミノ酸残基の４０～６０％は、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドのアミノ酸残基の６５～７０％は、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある。例えば、配列番号３２の配列を有するペプチドの５１アミノ酸残基のうちの３４アミノ酸残基（６６％）は、ＴｆＲの結合界面にあり得る。

いくつかの実施形態では、本開示のペプチドのアミノ酸残基のうちの任意の１つ以上の変異は、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にあり、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態では、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある本開示のペプチドのアミノ酸残基の１～１００％または５～１００％の変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態では、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある本開示のペプチドのアミノ酸残基の５～８０％の変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態では、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある本開示のペプチドのアミノ酸残基の１０～７０％の変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態では、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある本開示のペプチドのアミノ酸残基の１５～６０％の変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態では、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある本開示のペプチドのアミノ酸残基の２０～５０％の変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。いくつかの実施形態では、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある本開示のペプチドのアミノ酸残基の２５～３０％の変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善する。例えば、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある１７アミノ酸残基のうちの５アミノ酸残基における変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善することができる。例えば、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にある、配列番号３２の配列を有するペプチドの３４アミノ酸残基のうちの９アミノ酸残基（２６．５％）における変異は、ペプチドのＴｆＲへの結合親和性を改善することができる。いくつかの実施形態では、いかなる理論に拘束されるものではないが、ＴｆＲの結合界面に対して遠位にあるペプチドのアミノ酸残基における１つ以上の変異は、タンパク質のフォールディングを改善することができ、タンパク質の可溶性を向上させることができ、及び／または最適化された界面形状の相補性を介して結合を改善することができる骨格の幾何学的形状を変更することができる。

いくつかの実施形態では、本開示の受容体結合ペプチドは、ＰＤ－Ｌ１結合ペプチドであり得る。ＰＤ－Ｌ１結合ペプチドは、本開示の選択的枯渇複合体に組み込まれて、ＰＤ－Ｌ１媒介エンドサイトーシスによる標的分子の選択的枯渇を促進することができる。いくつかの実施形態では、受容体結合ペプチドであるＰＤ－Ｌ１結合ペプチドは、ｐＨ非依存性の親和性（例えば、細胞外ｐＨ及びエンドソームｐＨで同様の親和性）でＰＤ－Ｌ１に結合し得るか、またはｐＨ依存性の親和性（例えば、細胞外ｐＨでの親和性が高く、エンドソームｐＨでの親和性が低い）でＰＤ－Ｌ１に結合し得る。ＰＤ－Ｌ１結合ペプチドの例を表２に提供する。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＤ－Ｌ１結合ペプチドは、Ｘ^１Ｘ^２Ｘ^３ＣＸ^４Ｘ^５Ｘ^６ＣＸ^７Ｘ^８Ｘ^９Ｘ^１０Ｘ^１１Ｘ^１２Ｘ^１３Ｘ^１４Ｘ^１５ＣＸ^１６Ｘ^１７Ｘ^１８Ｘ^１９Ｘ^２０Ｘ^２１Ｘ^２２Ｘ^２３Ｘ^２４Ｘ^２５Ｘ^２６Ｘ^２７Ｘ^２８ＣＸ^２９Ｘ^３０Ｘ^３１Ｘ^３２Ｘ^３３Ｘ^３４Ｘ^３５Ｘ^３６Ｘ^３７ＣＸ^３８Ｘ^３９Ｘ^４０ＣＸ^４１Ｘ^４２Ｘ^４３（配列番号３９２）の配列を含み、式中、Ｘ^１は、Ｅ、Ｍ、Ｖ、またはＷから独立して選択することができ；Ｘ^２は、Ｇ、Ｅ、Ｌ、またはＦから独立して選択することができ；Ｘ^３は、Ｄ、Ｅ、またはＳから独立して選択することができ；Ｘ^４は、Ｋ、Ｒ、またはＶから独立して選択することができ；Ｘ^５は、Ｅ、Ｑ、Ｓ、Ｍ、Ｌ、またはＶから独立して選択することができ；Ｘ^６は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＹから独立して選択することができ；Ｘ^７は、Ｄ、Ｍ、またはＶから独立して選択することができ；Ｘ^８は、Ａ、Ｋ、Ｒ、Ｑ、Ｓ、またはＴから独立して選択することができ；Ｘ^９は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、またはＷから独立して選択することができ；Ｘ^１０は、Ａ、Ｅ、Ｒ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＰから独立して選択することができ；Ｘ^１１は、Ａ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、またはＷから独立して選択することができ；Ｘ^１２は、Ｇ、Ａ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｔ、またはＹから独立して選択することができ；Ｘ^１３は、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、またはＰから独立して選択することができ；Ｘ^１４は、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｌ、またはＶから独立して選択することができＸ^１５は、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｗ、またはＰから独立して選択することができ；Ｘ^１６は、Ｇ、Ａ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、Ｆ、またはＰから独立して選択することができ；Ｘ^１７は、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、またはＰから独立して選択することができ；Ｘ^１８は、Ｇ、Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹから独立して選択することができ；Ｘ^１９は、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｉ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰから独立して選択することができ；Ｘ^２０は、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｙ、またはＰから独立して選択することができ；Ｘ^２１は、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、またはＰから独立して選択することができ；Ｘ^２２は、Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｉ、Ｖ、Ｙ、またはＰから独立して選択することができ；Ｘ^２３は、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｗ、またはＹから独立して選択することができ；Ｘ^２４は、Ｇ、Ａ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、またはＰから独立して選択することができ；Ｘ^２５は、Ｇ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、またはＰから独立して選択することができ；Ｘ^２６は、Ｇ、Ａ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｉ、Ｙ、またはＰから独立して選択することができ；Ｘ^２７は、Ａ、Ｄ、Ｎ、またはＩから独立して選択することができ；Ｘ^２８は、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｎ、Ｆ、またはＷから独立して選択することができ；Ｘ^２９は、Ｇ、Ａ、Ｅ、Ｎ、Ｓ、Ｙ、またはＰから独立して選択することができ；Ｘ^３０は、Ｇ、Ｍ、またはＬから独立して選択することができ；Ｘ^３１は、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、またはＷから独立して選択することができ；Ｘ^３２は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、またはＰから独立して選択することができ；Ｘ^３３は、Ｇ、Ｅ、Ｑ、またはＦから独立して選択することができ；Ｘ^３４は、ＤまたはＫから独立して選択することができ；Ｘ^３５は、Ｇ、Ｖ、またはＰから独立して選択することができ；Ｘ^３６は、Ｇ、Ｈ、Ｒ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、またはＰから独立して選択することができ；Ｘ^３７は、Ａ、Ｄ、またはＫから独立して選択することができ；Ｘ^３８は、Ｅ、Ｈ、Ｑ、Ｌ、またはＦから独立して選択することができ；Ｘ^３９は、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、またはＦから独立して選択することができ；Ｘ^４０は、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｍ、Ｌ、またはＰから独立して選択することができ；Ｘ^４１は、Ｇ、Ａ、Ｋ、Ｓ、Ｉ、またはＬから独立して選択することができ；Ｘ^４２は、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｑ、Ｔ、またはＦから独立して選択することができ；Ｘ^４３は、Ａ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｆ、またはＰから独立して選択することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される結合ペプチドは、ＥＥＤＣＫＶＸ^１ＣＶＸ^１Ｘ^１Ｘ^１Ｘ^１Ｘ^２Ｘ^３ＫＸ^１ＣＸ^１ＥＸ^１Ｘ^４Ｘ^１Ｘ^１Ｘ^１Ｘ^１Ｘ^１Ｘ^１Ｘ^１ＡＸ^１ＣＸ^１ＧＸ^１Ｘ^５ＦＸ^６ＶＦＸ^６ＣＬＸ^１Ｘ^１ＣＸ^１Ｘ^１Ｘ^１（配列番号３９３）の配列を含み、式中、Ｘ^１は任意の非システインアミノ酸から独立して選択することができ；Ｘ^２は、Ｍ、Ｉ、Ｌ、またはＶから独立して選択することができ；Ｘ^３は、Ｙ、Ａ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから独立して選択することができ；Ｘ^４は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、またはＰから独立して選択することができ；Ｘ^５は、ＫまたはＰから独立して選択することができ；Ｘ^６は、ＤまたはＫから独立して選択することができる。

ＰＤ－Ｌ１結合ペプチドは、ＰＤ－Ｌ１との結合界面の一部または全部を形成するＰＤ－Ｌ１結合モチーフを含み得る。ＰＤ－Ｌ１結合モチーフの１つ以上の残基は、ＰＤ－Ｌ１結合ペプチドとＰＤ－Ｌ１との間の結合界面でＰＤ－Ｌ１の１つ以上の残基と相互作用し得る。いくつかの実施形態では、複数のＰＤ－Ｌ１結合モチーフがＰＤ－Ｌ１結合ペプチドに存在し得る。ＰＤ－Ｌ１結合モチーフは、ＣＸ^１Ｘ^２Ｘ^３ＣＸ^４Ｘ^５Ｘ^６Ｘ^７Ｘ^８Ｘ^９Ｘ^１０Ｘ^１１Ｘ^１２Ｃ（配列番号３９４）の配列を含んでもよく、式中、Ｘ^１は、Ｋ、Ｒ、またはＶから選択することができ；Ｘ^２は、Ｅ、Ｑ、Ｓ、Ｍ、Ｌ、またはＶから選択することができ；Ｘ^３は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＹから選択することができ；Ｘ^４は、Ｄ、Ｍ、またはＶから選択することができ；Ｘ^５は、Ａ、Ｋ、Ｒ、Ｑ、Ｓ、またはＴから選択することができ；Ｘ^６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、またはＷから選択することができ；Ｘ^７は、Ａ、Ｅ、Ｒ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＰから選択することができ；Ｘ^８は、Ａ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、またはＷから選択することができ；Ｘ^９は、Ｇ、Ａ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｔ、またはＹから選択することができ；Ｘ^１０は、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、またはＰから選択することができ；Ｘ^１１は、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｌ、またはＶから選択することができ；Ｘ^１２は、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｗ、またはＰから選択することができる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合モチーフは、ＣＫＶＸ^１ＣＶＸ^１Ｘ^１Ｘ^１Ｘ^１Ｘ^２Ｘ^３ＫＸ^１Ｃ（配列番号３９６）の配列を含んでもよく、式中、Ｘ^１は、任意の非システインアミノ酸から独立して選択することができ；Ｘ^２は、Ｍ、Ｉ、Ｌ、またはＶから独立して選択することができ；Ｘ^３は、Ｙ、Ａ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴから独立して選択することができる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合モチーフは、ＣＫＶＨＣＶＫＥＷＭＡＧＫＡＣ（配列番号３９８）の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合モチーフは、配列番号３９８に対し、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の同一性を含み得る。

ＰＤ－Ｌ１結合モチーフは、Ｘ^１Ｘ^２Ｘ^３Ｘ^４Ｘ^５Ｘ^６ＣＸ^７Ｘ^８Ｘ^９Ｃ（配列番号３９５）の配列を含んでもよく、Ｘ^１は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、またはＰから独立して選択することができ；Ｘ^２は、Ｇ、Ｅ、Ｑ、またはＦから独立して選択することができ；Ｘ^３は、ＤまたはＫから独立して選択することができ；Ｘ^４は、Ｇ、Ｖ、またはＰから独立して選択することができ；Ｘ^５は、Ｇ、Ｈ、Ｒ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、またはＰから独立して選択することができ；Ｘ^６は、Ａ、Ｄ、またはＫから独立して選択することができ；Ｘ^７は、Ｅ、Ｈ、Ｑ、Ｌ、またはＦから独立して選択することができ；Ｘ^８は、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、またはＦから独立して選択することができ；Ｘ^９は、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｍ、Ｌ、またはＰから独立して選択することができる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合モチーフは、Ｘ^１ＦＸ^２ＶＦＸ^２ＣＬＸ^３Ｘ^３Ｃ（配列番号３９７）の配列を含んでもよく、式中、Ｘ^１は、ＫまたはＰから独立して選択することができ；Ｘ^２は、ＤまたはＫから独立して選択することができ；Ｘ^３は、任意の非システインアミノ酸から独立して選択することができる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合モチーフは、ＫＦＤＶＦＫＣＬＤＨＣ（配列番号３９９）の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合モチーフは、配列番号３９９に対し、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の同一性を含み得る。

エンドソームｐＨで高親和性ＰＤ－Ｌ１結合を有するＰＤ－Ｌ１結合ペプチド（例えば、配列番号１８７、配列番号２３３～配列番号２３９、配列番号４００～配列番号４５６、または配列番号２４０のいずれか１つ、またはそれらのｐＨ非依存性バリアント）は、標的分子の選択的枯渇のための選択的枯渇複合体を形成するために、本明細書に記載の標的結合ペプチドと複合体を形成することができる。選択的枯渇複合体は、細胞層または細胞膜を横切って標的分子を選択的に送達するために使用することができる。例えば、選択的枯渇複合体は、ＰＤ－Ｌ１媒介エンドサイトーシスを介して標的分子をエンドサイトーシス区画に選択的に送達するために使用することができる。標的分子は、記載されているように、選択的枯渇複合体の標的結合ペプチドへの結合及びＰＤ－Ｌ１媒介エンドサイトーシスによるエンドサイトーシスにより、選択的に枯渇させることができる。

ＰＤ－Ｌ１を介したエンドサイトーシスを使用する標的分子の選択的枯渇は、ＰＤ－Ｌ１を発現する組織で特異的に標的分子を選択的に枯渇させるために使用することができる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する受容体結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体を使用して、ＰＤ－Ｌ１陽性のがん、肺組織、膵島組織、リンパ組織、胃腸組織、骨髄組織、生殖組織、筋肉組織、脂肪組織、またはその他のＰＤ－Ｌ１陽性組織において、標的分子を選択的に枯渇させることができる。例えば、ＰＤ－Ｌ１結合ペプチド及びＡＣＥ２結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体を使用して、肺組織内のＡＣＥ２を選択的に枯渇させてウイルス感染（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染）を防止することができる。別の例では、ＰＤ－Ｌ１結合ペプチド及びＨＬＡ結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体を使用して、膵島細胞内のＨＬＡを選択的に枯渇させ、Ｉ型糖尿病におけるインスリン発現細胞へのＴ細胞攻撃を防止することができる。

ＰＤ－Ｌ１結合ペプチド（例えば、配列番号１８７、配列番号２３３～配列番号２３９、配列番号４００～配列番号４５６、または配列番号２４０のいずれか）は、選択的枯渇複合体で標的結合ペプチドまたは受容体結合ペプチドとして機能することができる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１を選択的に枯渇させるための選択的枯渇複合体は、ＰＤ－Ｌ１に結合しない受容体結合ペプチド（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド）と、ＰＤ－Ｌ１結合ペプチド（例えば、ｐＨ依存性ＰＤ－Ｌ１結合ペプチド）と、を含み得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１ではない標的を選択的に枯渇させるための選択的枯渇複合体は、標的に結合する標的結合ペプチド（例えば、ＥＧＦＲ結合ペプチド）と、ＰＤ－Ｌ１結合ペプチド（例えば、ｐＨ非依存性ＰＤ－Ｌ１結合ペプチド）と、を含み得る。

標的結合ペプチド
本開示のペプチド、ペプチド複合体、または選択的枯渇複合体は、標的結合ペプチドを含み得る。標的結合ペプチドは、標的分子（例えば、標的タンパク質）に結合することができる。いくつかの実施形態では、標的結合ペプチドは、ｐＨ依存性である親和性で標的分子に結合することができる。例えば、標的結合ペプチドは、エンドソームｐＨ（約ｐＨ５．５など）よりも細胞外ｐＨ（約ｐＨ７．４など）でより高い親和性で標的分子に結合することができる。標的結合ペプチドは、本開示の受容体結合ペプチド（例えば、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、もしくは配列番号１～配列番号６４のいずれか１つのＴｆＲ結合ペプチド、または、配列番号１８７、配列番号２３３配列番号２３９、配列番号４００～配列番号４５６、もしくは配列番号２４１のいずれか１つのＰＤ－Ｌ１結合ペプチド）とコンジュゲートして、選択的枯渇複合体を形成することができる。選択的枯渇複合体は、細胞層または細胞膜（例えば、ＢＢＢまたは細胞膜）を横切って標的分子を選択的に送達するために使用することができる。例えば、選択的枯渇複合体を使用して、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、ＰＤ－Ｌ１媒介エンドサイトーシスまたはＴｆＲ媒介エンドサイトーシス）を介して標的分子をエンドサイトーシス区画に選択的に送達することができる。標的分子は、選択的枯渇複合体の標的結合ペプチドへの結合及び受容体媒介エンドサイトーシスによるエンドサイトーシスにより、選択的に枯渇させることができる。標的分子は、可溶性分子であり得る。例えば、標的分子は、分泌ペプチドもしくは分泌タンパク質、細胞シグナル伝達分子、細胞外マトリックス高分子（例えば、コラーゲン、エラスチン、ミクロフィブリルタンパク質、またはプロテオグリカン）、神経伝達物質、サイトカイン、増殖因子、腫瘍関連抗原、腫瘍特異抗原、またはホルモンであり得る。標的分子は、細胞表面分子であり得る。例えば、標的分子は、膜貫通タンパク質、増殖因子受容体を含む受容体、チェックポイント阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤、抑制性免疫受容体、抑制性免疫受容体のリガンド、マクロファージ表面タンパク質（例えば、ＣＤ１４もしくはＣＤ１６）、リポ多糖、または抗体であり得る。抑制性免疫受容体は、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３００ｆ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＦｃｇＲｉｉｂ、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－３、ＩＬＴ－４、ＩＬＴ－５、ＬＡＩＲ－１、ＰＥＣＡＭ－１、ＰＩＬＲ－α、ＳＩＲＬ－１、及びＳＩＲＰ－α、ＣＬＥＣ４Ａ、Ｌｙ４９Ｑ、ＭＩＣＬであり得る。細胞表面分子に結合する標的結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体を使用する細胞表面分子の選択的枯渇は、細胞表面分子（例えば、表面露出タンパク質）の減少をもたらすことができる。表面露出タンパク質は、疾患または状態に関連し得る。いくつかの実施形態では、本開示の選択的枯渇複合体は、標的分子の二量体化を促進するために、２つ以上の標的結合ペプチドを含むことができる。二量体化の促進は、標的分子の内在化を増加させ、標的分子の選択的枯渇をもたらす。例えば、標的結合ペプチドの２つのコピーを含む選択的枯渇複合体は、標的分子のホモ二量体化を促進することができる。いくつかの実施形態では、本開示の標的結合ペプチドは、ミニタンパク質、ナノボディ、抗体、ＩｇＧ、抗体断片、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ＤＡＲＰｉｎ、またはアフィボディを含み得る。いくつかの実施形態では、標的結合ペプチドは、シスチン高密度ペプチド、アフィチン、アドネクチン、アビマー、クニッツドメイン、ナノフィチン、フィノマー、二環式ペプチド、ベータヘアピン、またはステープルペプチドを含み得る。

いくつかの実施形態では、本開示の標的結合ペプチドは、ｐＨ依存性である親和性で標的分子に結合することができる。例えば、標的結合ペプチドは、エンドサイトーシスｐＨ（約ｐＨ７．０、ｐＨ６．５、ｐＨ６．０、またはｐＨ５．５など）での結合親和性よりも高い親和性で、細胞外ｐＨ（約ｐＨ７．４など）で標的分子に結合することができる。いくつかの実施形態では、細胞外ｐＨ（約ｐＨ７．４）での標的分子に対する標的結合ペプチドの結合親和性は、エンドソームｐＨ（約ｐＨ７．０、ｐＨ６．５、ｐＨ６．０、ｐＨ５．５、またはｐＨ５．０など）での標的分子に対する標的結合ペプチドの結合親和性の、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約１０，０００倍であり得る。いくつかの実施形態では、ｐＨ６．５またはｐＨ５．５での標的に対する標的結合ペプチドの親和性は、ｐＨ７．４での標的に対する標的結合ペプチドの親和性の、約０．１％以下、約０．５％以下、約１％以下、約５％以下、約１０％以下、約２０％以下、約３０％以下、約４０％以下、または約５０％以下である。いくつかの実施形態では、ｐＨ７．４での標的に対する標的結合ペプチドの親和性は、ｐＨ６．５またはｐＨ５．５での標的に対する標的結合ペプチドの親和性よりも、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、または少なくとも２０倍大きい。

いくつかの実施形態では、ｐＨ依存性結合を有する標的結合ペプチドは、細胞外ｐＨ（約ｐＨ７．４など）で、５０μＭ未満、５μＭ未満、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、０．３ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、または０．１ｎＭ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）で標的分子に結合することができる。いくつかの実施形態では、ｐＨ依存性結合を有する標的結合ペプチドは、エンドソームｐＨ（約ｐＨ５．５または約ｐＨ６．５）で、少なくとも１ｎＭ、少なくとも２ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも２０ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも２００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも２μＭ、少なくとも５μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも２０μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも１００μＭ、少なくとも５００μＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも２ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも２００ｍＭ、少なくとも５００ｍＭ、または少なくとも１Ｍの解離定数（Ｋ_Ｄ）で、標的分子に結合することができる。

いくつかの実施形態では、標的結合分子は、エンドソーム区画への内在化及びエンドソームの酸性化の際に標的分子を放出することができる。エンドソームの酸性化の際のそのような標的分子の放出は、約ｐＨ７．３、ｐＨ７．２、ｐＨ７．１、ｐＨ７．０、ｐＨ６．９、ｐＨ６．８、ｐＨ６．７、ｐＨ６．６、ｐＨ６．５、ｐＨ６．４、ｐＨ６．３、ｐＨ６．２、ｐＨ６．１、ｐＨ６．０、ｐＨ５．９、ｐＨ５．８、ｐＨ５．７、ｐＨ５．６、ｐＨ５．５、ｐＨ５．４、ｐＨ５．３、ｐＨ５．２、ｐＨ５．１、ｐＨ５．０、ｐＨ４．９、ｐＨ４．８、ｐＨ４．７、ｐＨ４．６、ｐＨ４．５、またはそれ以下で起こり得る。いくつかの実施形態では、標的分子の放出は、約ｐＨ７．０～約ｐＨ４．５、約ｐＨ６．５～約ｐＨ５．０、または約ｐＨ６．０～約ｐＨ５．５、またはそれ以下のｐＨで起こり得る。

ｐＨ依存性結合親和性を有する標的結合ペプチドは、標的結合界面にヒスチジン（Ｈｉｓ）アミノ酸残基を選択的に組み込むことによって操作できる。いくつかの例では、ｐＨ依存性結合親和性を有する標的結合ペプチドは、標的結合界面に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０個のヒスチジン残基を含む。ヒスチジンの側鎖は、約６．０～約９．２の間のｐＨでは主に非荷電であり、約６．０未満のｐＨでは主に正に荷電しているため、標的結合ペプチドにＨｉｓ残基を選択的に挿入または除去することで、ｐＨ依存性の結合特性を付与することができる。標的結合ペプチド（例えば、ｐＨ依存性結合親和性を有する標的結合ペプチド）は、シスチン高密度ペプチド（ＣＤＰ）、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、センチリン、ナノフィチン、またはアドネクチンを含み得る。標的結合ＣＤＰ、標的結合アフィボディ、標的結合アドネクチンは、低いｐＨ（例えば、エンドソームｐＨ）で安定であり得る。いくつかの実施形態では、標的結合ペプチドは、低いｐＨで安定であり得る、抗体（例えば、ＩｇＧもしくは他の抗体）、抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ２、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、もしくは他の抗体断片）、またはナノボディ（例えば、ラクダまたはサメ由来のＶＨＨドメインナノボディまたはＶＮＡＲドメインナノボディ）を含み得る。

いくつかの実施形態では、エンドソーム区画への内在化時の標的結合ペプチドによる標的分子の放出は、細胞外生理学的環境とエンドソーム細胞区画との間のイオン強度の差によって影響を受ける可能性がある。いくつかの実施形態では、エンドソーム区画のイオン強度は、細胞外生理学的環境のイオン強度よりも高い。塩濃度によって変化するイオン強度は、溶液中のさまざまな電解質、例えば、水素（Ｈ^＋）、水酸化物（ＯＨ^－）、ヒドロニウム（Ｈ_３Ｏ^＋）、ナトリウム（Ｎａ^＋）、カリウム（Ｋ^＋）、カルシウム（Ｃａ^２＋）、マグネシウム（Ｍｇ^２＋）、マンガン（Ｍｎ^２＋）、塩化物（Ｃｌ^－）、炭酸塩（ＣＯ_３ ^２－）、コバルト（Ｃｏ^２＋）、リン酸塩（ＰＯ_４ ^３－）、または硝酸塩（ＮＯ_３ ^－）の濃度に依存し得る。いくつかの実施形態では、塩依存性またはイオン強度依存性の結合親和性を有する標的結合ペプチドは、エンドソームにおける標的結合分子の解離を可能にする、標的結合界面における塩不安定部分（例えば、極性または荷電のアミノ酸側鎖）の選択的組み込みによって操作され得る。例えば、標的結合ペプチドの標的結合界面は、環境のイオン強度が増加するにつれて破壊され得る、標的結合ペプチドとの１つ以上の極性相互作用または電荷－電荷相互作用を形成し得る。

場合によっては、イオン強度に依存する（例えば、水素、水酸化物、ヒドロニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン、塩化物、炭酸塩、コバルト、リン酸塩、及び／または硝酸塩に依存する）結合親和性を有する標的結合ペプチドは、ある範囲のイオン強度、例えば約３０ｍＭから約１Ｍのイオン強度にわたって解離し得る。いくつかの実施形態では、イオン強度に依存する結合親和性を有するイオン強度依存性標的結合ペプチドは、約５０ｍＭ超、約５０ｍＭ～約１Ｍ、約６０ｍＭ～約９５０ｍＭ、約７０ｍＭ～約９００ｍＭ、約８０ｍＭ～約８５０ｍＭ、約９０ｍＭ～約８００ｍＭ、約１００ｍＭ～約７５０ｍＭ、約１１０ｍＭ～約７００ｍＭ、約１２０ｍＭ～約６５０ｍＭ、約１３０ｍＭ～約６００ｍＭ、約１４０ｍＭ～約５５０ｍＭ、約１５０ｍＭ～約５００ｍＭ、約１６０ｍＭ～約４５０ｍＭ、約１７０ｍＭ～約４００ｍＭ、約１８０ｍＭ～約３５０ｍＭ、約１９０ｍＭ～約３００ｍＭ、または約２００ｍＭ～約２５０ｍＭのイオン強度で解離し得る。いくつかの実施形態では、イオン強度依存性標的結合ペプチドは、標的結合界面に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０個の極性相互作用または電荷－電荷相互作用を含む。

本開示の標的結合ペプチドは、臨床的に適切な標的分子などの標的分子に結合することができる。いくつかの実施形態では、標的分子は、可溶性分子、細胞外分子、または細胞表面分子であり得る。いくつかの実施形態では、標的分子は、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物、核酸、またはグリカンである。いくつかの実施形態では、標的分子は、疾患または状態において過剰発現または過剰活性化されるタンパク質であり得る。例えば、標的分子は、発がん性シグナル伝達、免疫抑制、または炎症促進性シグナル伝達に関与する膜貫通タンパク質であり得る。本開示の標的結合ペプチドによって標的化され得る標的分子の例としては、ＣＤ３、ＣＤ４７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８９、ＣＤ１６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２７、ＣＤ３９、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ７４、ＣＤ４０Ｌ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ２、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ４、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＨＬＡ－Ｇ、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ、ＴＣＲ、ＴＮＦ－α、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＴＫＩ耐性ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＥＲＢＢ３、ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＩＧＦＲ１、ＣＴＬＡ４、ＳＴＲＯ１、補体因子Ｃ４、補体因子Ｃ１ｑ、補体因子Ｃ１ｓ、補体因子Ｃ１ｒ、補体因子Ｃ３、補体因子Ｃ３ａ、補体因子Ｃ３ｂ、補体因子Ｃ５、補体因子Ｃ５ａ、ＴＧＦβ、ＰＣＳＫ９、Ｐ２Ｙ６、ＨＥＲ３、ＲＡＮＫ、ｔａｕ、アミロイドβ、ハンチンチン、α－シヌクレイン、グルコセレブロシダーゼ、α－グルコシダーゼ、ＩＬ－１、ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＩＬ－１２、ｐ４０、Ｂ７ファミリーのメンバー、ｃ－Ｍｅｔ、ＳＩＧＬＥＣ、ＭＣＰ－１、ＭＨＣ、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＰＤ－１、及びＰＤ－Ｌ１が挙げられるが、これらに限定されない。標的分子の追加の例としては、マンノース－６－リン酸グリカン、グルコース－６－リン酸、及び糖特異的受容体（例えば、レクチン）が挙げられる。標的分子の追加の例としては、リウマチ因子、抗核抗体、抗好中球細胞質抗体、抗ｄｓＤＮＡ、抗セントロメア抗体、抗ヒストン抗体、環状シトリウリン化ペプチド抗体、抽出可能な核抗原抗体、カルジオリピン抗体、ベータ－２糖タンパク質１抗体、抗リン脂質抗体、ループス抗凝固因子、糖尿病関連自己抗体、抗組織トランスルグタミナーゼ、抗グリアジン抗体、内在性因子抗体、壁細胞抗体、甲状腺自己抗体、平滑筋抗体、抗ミトクロリア抗体、肝腎ミクロソーム１型抗体、抗糸球体基底膜、アセチルコリン受容体抗体などの自己抗体が挙げられる。標的分子（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８９、ＣＤ１６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２７、ＣＤ３９、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ７４、ＣＤ４０Ｌ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ２、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ４、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＨＬＡ－Ｇ、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ、ＴＣＲ、ＴＮＦ－α、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＴＫＩ耐性ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＥＲＢＢ３、ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＩＧＦＲ１、ＣＴＬＡ４、ＳＴＲＯ１、補体因子Ｃ４、補体因子Ｃ１ｑ、補体因子Ｃ１ｓ、補体因子Ｃ１ｒ、補体因子Ｃ３、補体因子Ｃ３ａ、補体因子Ｃ３ｂ、補体因子Ｃ５、補体因子Ｃ５ａ、ＴＧＦβ、ＰＣＳＫ９、Ｐ２Ｙ６、ＨＥＲ３、ＲＡＮＫ、ｔａｕ、アミロイドβ、ハンチンチン、α－シヌクレイン、グルコセレブロシダーゼ、α－グルコシダーゼ、ＩＬ－１、ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＩＬ－１２、ｐ４０、Ｂ７ファミリーのメンバー、ｃ－Ｍｅｔ、ＳＩＧＬＥＣ、ＭＣＰ－１、ＭＨＣ、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＰＤ－１、またはＰＤ－Ｌ１）は、選択的除去複合体の標的結合ペプチドに結合すると、エンドサイトーシスを受けて分解され得る。

いくつかの実施形態では、標的分子は、受容体チロシンキナーゼなどの膜貫通タンパク質であり得る。選択的枯渇複合体を使用して標的とすることができる受容体チロシンキナーゼの例としては、ＥＧＦ受容体、ＥｒｂＢ、インスリン受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ＣＣＫ受容体、ＮＧＦ受容体、ＨＧＦ受容体、Ｅｐｈ受容体、ＡＸＬ受容体、ＴＩＥ受容体、ＲＹＫ受容体、ＤＤＲ受容体、ＲＥＴ受容体、ＲＯＳ受容体、ＬＴＫ受容体、ＲＯＲ受容体、ＭｕＳＫ受容体、及びＬＭＲ受容体が挙げられる。選択的枯渇複合体を使用して膜貫通タンパク質を標的とすることは、膜貫通タンパク質の内在化及び分解をもたらし得る。いくつかの実施形態では、標的分子は、病原体（例えば、ウイルスもしくは細菌）、または病原体表面分子（例えば、タンパク質もしくは糖タンパク質）であり得る。例えば、標的分子は、コロナウイルスのスパイクタンパク質、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン、または単純ヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｍであってもよい。選択的枯渇複合体を使用して病原体または病原体の表面タンパク質を標的とすることは、病原体の細胞内移行及び分解をもたらすことができ、それによって、病原体によって引き起こされる感染症を治療または予防する。

標的分子のエンドサイトーシス及びその後の分解により、標的分子に関連する疾患または状態を治療（例えば、排除、軽減、進行遅延、またはその症状の治療）することができる。いくつかの実施形態では、選択的枯渇複合体による受容体チロシンキナーゼの標的化及び分解は、がんのバリアントを治療するのに有益であり得る。例えば、ＥＧＦＲ結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体によるＥＧＦＲの標的化及び分解は、非小細胞肺癌、原発性非小細胞肺癌、転移性非小細胞癌、肺癌、頭頸部癌、頭頸部扁平上皮癌、神経膠芽腫、脳癌、転移性脳癌、結腸直腸癌、結腸癌、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）耐性がん、セツキシマブ耐性がん、ネシツムマブ耐性がん、パニツムマブ耐性がん、局所がん、局所進行がん、再発がん、転移がん、難治性がん、ＫＲＡＳ野生型がん、ＫＲＡＳ変異がん、またはエクソン２０変異非小細胞肺癌などのがんの治療に有益であり得る。別の例では、ＴＮＦ－α結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体によるＴＮＦ－αの標的化及び分解は、ＣＮＳにおけるものを含む、炎症性または神経学的状態、例えば、神経炎症、神経炎症性疾患、脳卒中、外傷性脳傷害、アルツハイマー病、または神経原線維変化型認知症、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、加齢関連タウアストログリオパチー、前頭側頭型認知症、パーキンソン症候群、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、リチコボーディグ病、神経節膠腫、髄膜血管腫症、または亜急性硬化症全脳炎を含むその他のタウオパシーの治療に有益であり得る。例えば、ＴＮＦ－α結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体によるＴＮＦ－αの標的化及び分解はまた、ＣＮＳに限局していない可能性のある炎症状態（例えば、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、痛風、炎症性関節炎センター、筋炎、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン病、全身性エリテマトーデス（ループス）、血管炎、乾癬、炎症性腸疾患、クローン病、または潰瘍性大腸炎）の治療に有益であり得る。本開示の選択的枯渇複合体は、循環中のものなどの病原性免疫複合体を標的とするために使用することができる。循環する抗原抗体複合体は、自己免疫疾患、炎症性疾患、及び悪性腫瘍に関与し得る。これには、糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス（ループス）、関節リウマチ、及び皮膚血管炎が含まれる。

本開示の選択的枯渇複合体を使用して、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）または統合失調症などの補体介在性疾患における補体経路を標的とすることができる。ＴｆＲは筋肉細胞で高度に発現されているため、そのような選択的枯渇複合体はＦＳＤＨの治療に適していることができ、補体経路成分（複数可）の効率的な分解が期待される。いくつかの実施形態では、ＣＮＳにおける補体因子Ｃ４、または補体経路におけるＣ４の上流の因子（例えば、補体因子Ｃ１ｑ、補体因子Ｃ１ｓ、もしくは補体因子Ｃ１ｒ）、もしくは下流の因子（例えば、補体因子Ｃ３、補体因子Ｃ３ａ、補体因子Ｃ３ｂ、補体因子Ｃ５、もしくは補体因子Ｃ５ａ）を標的化及び分解することは、統合失調症を治療し得る。その後、Ｃ４は、Ｃ４の活性化を調節する、またはこの経路の継続を実行する他の補体成分が、この経路の活性の増加の生物学的結果を調節するという同等の立場を有しているという理解のもとで、この経路の模範として使用される。統合失調症はヒトの約１％が思春期に発症することが最も多いため、統合失調症を治療するための選択的枯渇複合体を含む組成物は有益であろう。補体経路は、統合失調症における一般的な経路として役立つことができ、Ｃ４または下流の補体経路の分解を促進する本開示の選択的枯渇複合体を含む療法は、患者にとって有益であろう。いくつかの実施形態では、本開示の選択的枯渇複合体を使用して、中枢神経系における補体媒介性疾患を標的とすることができる。例えば、１つ以上のＣ４Ａ形態に結合するペプチドを含む選択的枯渇複合体を使用して、本明細書に記載の分解のためにＣ４Ａロング形態（例えば、ＨＥＲＶ取り込みを含む）またはショート形態を標的とすることができる。統合失調症の治療のために選択的枯渇複合体を使用して標的化及び枯渇させることができる追加の標的分子としては、第６染色体上の拡張ＭＨＣ複合体によってコードされる分子、補体Ｃ４遺伝子座によってコードされる分子（例えば、Ｃ４Ａｌｏｎｇ遺伝子座またはｃ４Ａｓｈｏｒｔ遺伝子座によってコードされる分子）、第８染色体上のＣＵＢ及びＳｕｓｈｉｍｕｌｔｉｐｌｅｄｏｍａｉｎ１（ＣＳＭＤ１）遺伝子、補体因子Ｃ４、補体因子Ｃ３、またはＣ３受容体に一塩基多型を含む配列によってコードされる分子が挙げられる。補体因子Ｃ４、補体因子Ｃ３、または補体因子Ｃ４もしくは補体因子Ｃ３の分解を防止する分子の標的化された分解は、統合失調症の治療に有益であり得る。例えば、本開示の選択的枯渇複合体は、Ｃ４、ＣＳＭＤ１、または他の遺伝子の多型によって統合失調症の素因がある患者において、過度のシナプス剪定を減少させ、灰白質の減少を防止し、精神病症状を防止することにより、統合失調症を治療することができる。統合失調症の治療のための選択的枯渇複合体（例えば、補体因子Ｃ４結合ペプチドを含む）は、統合失調症などの慢性疾患に共通する、広範囲の免疫抑制が長期間使用された場合に発生する毒性を防ぐことのできる、狭く正確な形態の免疫抑制を提供することができる。いくつかの実施形態では、統合失調症の治療のための選択的枯渇複合体は、追加の薬物（例えば、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、ステロイド、Ｃ４分解の阻害剤、または抗精神病薬）と組み合わせて投与され得る。さらに、本開示の選択的枯渇複合体は、選択的枯渇複合体が、ＴｆＲ結合を介して、血液脳関門（ＢＢＢ）を貫通し、ＣＮＳにアクセスする能力により、統合失調症などのＣＮＳ関連障害の治療に適していることができる。選択的枯渇複合体（例えば、ＴｆＲ結合ペプチドを含む）は、より高いＢＢＢを促進し得る。

いくつかの実施形態では、標的結合ペプチドを含む本開示の選択的枯渇複合体を使用する標的分子の結合及びその後の枯渇は、疾患または状態を治療するために使用することができ、標的分子は、疾患または状態が関連する細胞ベースまたは可溶性部分であり、疾患組織または細胞で発現または存在する。いくつかの実施形態では、標的分子の枯渇は、細胞型または組織に依存し得る。例えば、標的分子の枯渇は、選択的枯渇複合体の標的結合ペプチドによって標的とされる標的分子と、選択的枯渇複合体の受容体結合ペプチドによって標的とされる細胞表面受容体の両方を発現する細胞または組織に特異的であり得る。選択的枯渇複合体を使用する標的分子の分解及び枯渇は、疾患または状態を予防、治療、または改善できる。

いくつかの実施形態では、標的結合ペプチドは、配列番号１８７、配列番号２１９、配列番号２３３～配列番号２４４、または配列番号４００～配列番号４５６のいずれか１つの配列を含み得る。いくつかの実施形態では、標的結合ペプチドは、配列番号２３３、配列番号１８７、または配列番号２３４～配列番号２４４のいずれか１つ、またはその断片と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み得る。例えば、標的結合ペプチドは、配列番号２３３と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み得るか、または、標的結合ペプチドは、配列番号２３３の配列を含み得る。標的結合ペプチド及びそれらの対応する標的分子の例を表３に提供する。

シスチン高密度ペプチド
いくつかの実施形態では、本開示のＴｆＲ結合ペプチドまたは標的結合ペプチドは、１つ以上のＣｙｓ、または１つ以上のジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ペプチドまたは標的結合ペプチドは、システイン高密度ペプチド（ＣＤＰ）、ノットペプチド、またはヒッチンに由来する。本明細書で使用される場合、「ペプチド」という用語は、「ノットペプチド」、「システイン高密度ペプチド」、「ＣＤＰ」、及び「ヒッチン」という用語と交換可能であるとみなされる。（例えば、Ｃｏｒｒｅｎｔｉｅｔａｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｃｙｓｔｉｎｅ－ｄｅｎｓｅｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＮａｔＳｔｒｕｃｔＭｏｌＢｉｏｌ．２０１８Ｍａｒ；２５（３）：２７０－２７８を参照されたい）。

本開示のＴｆＲ結合ペプチド、またはその誘導体、断片、もしくはバリアントは、ＴｆＲ、またはその誘導体もしくは類似体に対して、親和性及び選択性を有し得る。本開示の標的結合ペプチド、またはその誘導体、断片、もしくはバリアントは、標的分子に対して、親和性及び選択性を有し得る。場合によっては、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、部位飽和変異導入（ＳＳＭ）を使用して操作され、改善されたＴｆＲ結合特性を示すか、またはトランスサイトーシスまたはエンドサイトーシスをより効果的に促進することができる。場合によっては、本開示の標的結合ペプチドは、部位飽和変異導入（ＳＳＭ）を使用して操作され、改善されたＴｆＲ結合特性を示すことができる。場合によっては、本開示のペプチドは、ノットペプチドまたはヒッチン由来ペプチドもしくはノッチン由来ペプチドに関連するシステイン高密度ペプチド（ＣＤＰ）である。ＴｆＲ結合ペプチドは、システイン高密度ペプチド（ＣＤＰ）であり得る。ヒッチンは、ＣＤＰのサブクラスであり得、６個のシステイン残基が接続性［１－４］、２－５、３－６に従ってジスルフィド結合を形成し、これは、１番目のシステイン残基が４番目の残基と、２番目のシステイン残基が５番目の残基と、３番目のシステイン残基が６番目の残基とジスルフィド結合を形成することを示す。この命名法の括弧は、システイン残基がノッチングジスルフィド結合を形成することを示す。（例えば、Ｃｏｒｒｅｎｔｉｅｔａｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｃｙｓｔｉｎｅ－ｄｅｎｓｅｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＮａｔＳｔｒｕｃｔＭｏｌＢｉｏｌ．２０１８Ｍａｒ；２５（３）：２７０－２７８を参照されたい）。ノッチンは、ＣＤＰのサブクラスであり得、６個のシステイン残基は、接続性１－４、２－５、［３－６］に従ってジスルフィド結合を形成する。ノッチンは、通常、約２０～約８０アミノ酸長の範囲のペプチドのクラスであり、多くの場合、コンパクトな構造に折り畳まれる。ノッチンは、多数の分子内ジスルフィド架橋を特徴とし、ベータストランド及び他の二次構造を含み得る、複雑な三次構造に組み立てられる。ジスルフィド結合の存在は、ノッチン及びヒッチンに顕著な環境安定性を付与し、それにより、ノットペプチドは、極端な温度及びｐＨに耐え、血流のタンパク質分解酵素に抵抗することができる。場合によっては、本明細書に記載のペプチドは、ノットペプチドに由来し得る。本明細書で開示されるペプチドのアミノ酸配列は、複数のシステイン残基を含み得る。場合によっては、ペプチドのアミノ酸配列内に存在する複数のシステイン残基の少なくともシステイン残基がジスルフィド結合の形成に関与する。場合によっては、ペプチドのアミノ酸配列内に存在する複数のシステイン残基のすべてのシステイン残基がジスルフィド結合の形成に関与する。本明細書に記載される場合、「ノットペプチド」という用語は、「システイン高密度ペプチド」、「ＣＤＰ」、または「ペプチド」という用語と交換可能に使用され得る。

本明細書で提供されるのは、トランスフェリン受容体に結合し、対象（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）における治療上適切な濃度で生物活性分子としての使用を含む、選択的枯渇複合体において使用することのできるＣＤＰ－ＴｆＲ結合ペプチドの選択、最適化、及び特性評価を可能にする、ＣＤＰの同定、成熟、特性評価、及び利用の方法である。本開示は、現代の創薬戦略への適用の可能性についてスクリーニングすることができる、多様な足場ファミリーとしてのＣＤＰの実用性を実証するものである。ＣＤＰは、既存の生物学的製剤、主に抗体の代替物であり、低い組織透過性、免疫原性、及び毒性が生じた場合に問題となり得る長い血清半減期を含む、免疫グロブリン足場の不利益のいくつかを回避することができる。２０～８０アミノ酸の範囲の本開示のペプチドは、中型であり、抗体の好ましい結合特異性及び親和性の特徴の多くを有しつつも、安定性が改善され、免疫原性が低く、製造方法がより簡単である、医学的に適切な治療薬である。ＣＤＰの分子内ジスルフィド構造により、特に高い安定性指標が付与され、それにより、断片化及び免疫原性が低減し、また、サイズが小さいことで、組織透過または細胞透過が改善し、血清半減期の調整が容易になる。本明細書で開示されるのは、標的分子をエンドサイトーシス区画に送達するためのビヒクルとして機能することができるペプチド候補を表すペプチドである。

いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ペプチドは、操作されたペプチドであり得る。操作されたペプチドは、天然に存在しない、人工、単離、合成、設計、または組換え発現されたペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、本開示のＴｆＲ結合ペプチドは、安定性、タンパク質分解に対する耐性、還元条件に対する耐性、及び／または血液脳関門を通過する能力などのＣＤＰ、ノットペプチド、またはヒッチンの１つ以上の特性を含む。いくつかの実施形態では、本開示の標的結合ペプチドは、安定性、タンパク質分解に対する耐性、または還元条件に対する耐性などのＣＤＰ、ノットペプチド、またはヒッチンの１つ以上の特性を含む。

ＣＤＰは、抗体などの他の分子と比較して、サイズが小さく、組織または細胞への透過が高く、Ｆｃ機能を欠き、血清からのクリアランスが速いという点で、また、小さいペプチドと比較して、プロテアーゼに耐性があるという点（安定性及び免疫原性の低下の両方）で、ＣＮＳへの送達について有利であり得る。いくつかの実施形態では、本開示のＴｆＲ結合ペプチドまたは標的結合ペプチド（例えば、ＣＤＰ、ノットペプチド、またはヒッチン）、選択的枯渇複合体（例えば、１つ以上のＴｆＲ結合ペプチドと１つ以上の標的結合ペプチドを含む）、または操作されたＴｆＲ結合融合ペプチド（例えば、１つ以上のＴｆＲ結合ペプチドと１つ以上のペプチドを含む）は、ＴｆＲ結合抗体または標的結合ペプチドよりも優れた特性を有し得る。例えば、本明細書に記載のペプチド及び複合体は、細胞及び標的組織へのより優れた、より深い、及び／またはより速い組織または細胞透過（例えば、脳実質への透過、固形腫瘍への透過）、ならびに非標的組織及び血清からの速いクリアランスを提供し得る。本開示のＴｆＲ結合ペプチド、標的結合ペプチド、選択的枯渇複合体、またはＴｆＲ結合融合ペプチドは、ＴｆＲ結合抗体または標的結合抗体よりも低い分子量を有し得る。分子量が低いことは、ＴｆＲ結合抗体または標的結合抗体と比較して、本開示のＴｆＲ結合ペプチド、標的結合ペプチド、選択的枯渇複合体、またはＴｆＲ結合融合ペプチドに有利な特性を付与し得る。例えば、本開示のＴｆＲ結合ペプチド、選択的枯渇複合体、またはＴｆＲ結合融合ペプチドは、抗ＴｆＲ抗体よりも容易に細胞または組織に透過し得るか、または抗ＴｆＲ抗体よりも低いモル用量毒性を有し得る。本開示のＴｆＲ結合ペプチド、標的結合ペプチド、選択的枯渇複合体、またはＴｆＲ結合融合ペプチドは、抗体のＦｃ機能を欠くため、有益であり得る。本開示のＴｆＲ結合ペプチド、標的結合ペプチド、選択的枯渇複合体、またはＴｆＲ結合融合ペプチドは、モル基準で、製剤の高い濃度を可能にするため、有利であり得る。

いくつかの実施形態では、操作された天然に存在しないＣＤＰ及び天然に見出されるものを含む、ＣＤＰまたはノットペプチド（例えば、標的結合ペプチド）は、標的分子を細胞のエンドサイトーシス区画に選択的に送達するために、表１に記載されるものなどの本開示のＴｆＲ結合ペプチドにコンジュゲート、連結、または融合され得る。細胞は、がん細胞、膵臓細胞、肝細胞、結腸細胞、卵巣細胞、乳房細胞、肺細胞、脾臓細胞、骨髄細胞またはそれらの任意の組み合わせであり得る。細胞は、ＴｆＲを発現する任意の細胞であり得る。操作されたペプチドは、天然に存在しない、人工、合成、設計、または組換え発現されたペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、本開示のＴｆＲ結合ペプチドまたはＴｆＲ結合ペプチドを含む複合体（例えば、選択的枯渇複合体）は、ＴｆＲ媒介性トランスサイトーシス及び／または細胞エンドサイトーシスを可能にし、ＴｆＲ結合ペプチドにコンジュゲート、連結、または融合される追加のＣＤＰまたはノットペプチドは、疾患または状態に関連する細胞内の分子（例えば、酵素または目的の他のタンパク質）を選択的に標的とすることができる。場合によっては、細胞は、がん細胞である。がんとしては、乳癌、肝癌、結腸癌、脳癌、白血病、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄腫、血球由来がん、脾臓癌、唾液腺の癌、腎癌、筋肉癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、肉腫、膠芽細胞腫、星状細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢癌、正中膠腫、びまん性内在性橋膠腫、肺癌、骨髄細胞癌、または皮膚癌、泌尿生殖器癌、骨肉腫、筋肉由来肉腫、黒色腫、頭頸部癌、神経芽細胞腫、膠芽細胞腫、星状細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢癌、正中膠腫、及びびまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）、またはＣＭＹＣ過剰発現がんが挙げられ得る。場合によっては、他のＣＤＰまたはノットペプチド（例えば、天然に見出されるもの）は、ＴｆＲ結合ペプチドにコンジュゲート、連結、または融合され、血液脳関門を越えてＴｆＲ結合ペプチドを局在化させ、中枢神経系の標的細胞にＴｆＲ結合ペプチドを送達することができる。

ＣＤＰ（例えば、ノットペプチドまたはヒッチン）は、通常、約１１～約８１アミノ酸長の範囲のペプチドのクラスであり、多くの場合、コンパクトな構造に折り畳まれる。ノットペプチドは、多数の分子内ジスルフィド架橋を特徴とし、ベータストランド、アルファヘリックス、及び他の二次構造を含み得る、複雑な三次構造に組み立てられる。ジスルフィド結合の存在は、ノットペプチドに顕著な環境安定性を付与し、それにより、ノットペプチドは、極端な温度及びｐＨに耐え、血流のタンパク質分解酵素に抵抗することができる。ジスルフィドノットの存在は、還元剤による還元に対する耐性を提供し得る。ノットペプチドはまた、その剛直性により、柔軟なペプチドが標的と結合するときに生じる「エントロピーペナルティ」を受けることなく、標的への結合が可能になる。例えば、結合は、ペプチドが標的に結合して複合体を形成するときに生じるエントロピー損失により、悪影響を受ける。したがって、「エントロピーペナルティ」は、結合に対して有害な作用であり、この結合の際に生じるエントロピー損失が大きいほど「エントロピーペナルティ」が大きくなる。さらに、柔軟な非結合分子は、結合して複合体になると柔軟性が失われるため、剛直性構造の分子よりも複合体を形成するときに多くのエントロピーを失う。しかしながら、非結合分子の剛直性はまた、一般に、分子が形成することができる複合体の数を限定することで、特異性を高める。ペプチドは、抗体と同様の親和性、またはナノモルもしくはピコモルの親和性で標的に結合することができる。ノットペプチドの配列構造及び配列同一性または相同性を詳しく調べると、あらゆる種類の動物及び植物において、ノットペプチドが収斂進化によって生じていることがわかる。動物において、ノットペプチドは、多くの場合、毒液、例えば、クモ及びサソリの毒液に見出され、イオンチャネルの調節に関与している。植物のノットタンパク質は、動物のタンパク質分解酵素を阻害するか、または抗菌活性を有し得ることから、ノットペプチドが植物に見出される分子防御系で機能し得ることを示唆している。

本開示のペプチド（例えば、標的結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、または選択的枯渇複合体）は、システインアミノ酸残基を含み得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個のシステインアミノ酸残基を有する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも６個のシステインアミノ酸残基を有する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも８個のシステインアミノ酸残基を有する。他の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１０個のシステインアミノ酸残基、少なくとも１２個のシステインアミノ酸残基、少なくとも１４個のシステインアミノ酸残基、または少なくとも１６個のシステインアミノ酸残基を有する。

ノットペプチドは、ジスルフィド架橋を含み得る。ノットペプチドは、残基の５％以上が分子内ジスルフィド結合を形成するシステインであるペプチドであり得る。ジスルフィド連結ペプチドは、薬物の足場であり得る。いくつかの実施形態では、ジスルフィド架橋は、ノットを形成する。ジスルフィド架橋は、例えば、システイン１と４、２と５、または３と６との間などのシステイン残基間で形成され得る。いくつかの実施形態では、１つのジスルフィド架橋は、他の２つのジスルフィド架橋によって形成されるループを通過して、例えば、ノットを形成する。他の実施形態では、ジスルフィド架橋は、任意の２つのシステイン残基間に形成され得る。

本開示は、ペプチド足場をさらに含み、これは、例えば、追加のペプチドを生成するための出発点として使用することができる。いくつかの実施形態では、これらの足場は、さまざまなノットペプチド（ＣＤＰまたはノットペプチドまたはヒッチンなど）に由来し得る。特定の実施形態では、ＣＤＰ（例えば、ノットペプチドまたはヒッチン）は、多数の分子内ジスルフィド架橋を特徴とし、任意選択によりベータストランド、及びアルファヘリックスなどの他の二次構造を含む、複雑な三次構造に組み立てられる。例えば、ＣＤＰ（例えば、ノットペプチド）は、いくつかの実施形態では、ジスルフィドノットを介したジスルフィドを特徴とする小ジスルフィドリッチタンパク質を含む。このノットは、例えば、１つのジスルフィド架橋が、他の２つのジスルフィド及びその相互接続骨格によって形成される大環状高分子を通過する場合に得ることができる。いくつかの実施形態では、ノットペプチドとしては、増殖因子システインノットまたは阻害因子システインノットが挙げられ得る。他の可能なペプチド構造としては、βシートを含まずに２つのジスルフィド架橋によって連結された２つの平行ヘリックスを有するペプチド（例えば、ヘフトキシン）が挙げられる。

いくつかの本開示のペプチドは、Ｌ立体配置である少なくとも１つのアミノ酸残基を含み得る。ペプチドは、少なくとも１個のＤ立体配置のアミノ酸残基を含み得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、１５～７５アミノ酸残基長である。他の実施形態では、ペプチドは、１１～５５アミノ酸残基長である。さらに他の実施形態では、ペプチドは、１１～６５アミノ酸残基長である。さらなる実施形態では、ペプチドは、少なくとも２０アミノ酸残基長である。

いくつかのＣＤＰ（例えば、ノットペプチド）は、毒素または毒液に存在することまたは関連することが知られているタンパク質のクラスから誘導または単離することができる。場合によっては、ペプチドは、サソリまたはクモに関連する毒素または毒液に由来し得る。ペプチドは、さまざまな属及び種のクモ及びサソリの毒液及び毒素に由来し得る。例えば、ペプチドは、Ｌｅｉｕｒｕｓｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓｈｅｂｒａｅｕｓ、Ｂｕｔｈｕｓｏｃｃｉｔａｎｕｓｔｕｎｅｔａｎｕｓ、Ｈｏｔｔｅｎｔｏｔｔａｊｕｄａｉｃｕｓ、Ｍｅｓｏｂｕｔｈｕｓｅｕｐｅｕｓ、Ｂｕｔｈｕｓｏｃｃｉｔａｎｕｓｉｓｒａｅｌｉｓ、Ｈａｄｒｕｒｕｓｇｅｒｔｓｃｈｉ、Ａｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓａｕｓｔｒａｌｉｓ、Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓｎｏｘｉｕｓ、Ｈｅｔｅｒｏｍｅｔｒｕｓｌａｏｔｉｃｕｓ、Ｏｐｉｓｔｏｐｈｔｈａｌｍｕｓｃａｒｉｎａｔｕｓ、Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａｓｃｈｍｉｄｔｉ、Ｉｓｏｍｅｔｒｕｓｍａｃｕｌａｔｕｓ、Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａｈｕｗｅｎｕｍ、Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａｈａｉｎａｎｕｍ、Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａｓｃｈｍｉｄｔｉ、Ａｇｅｌｅｎｏｐｓｉｓａｐｅｒｔａ、Ｈａｙｄｒｏｎｙｃｈｅｖｅｒｓｕｔａ、Ｓｅｌｅｎｏｃｏｓｍｉａｈｕｗｅｎａ、Ｈｅｔｅｒｏｐｏｄａｖｅｎａｔｏｒｉａ、Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａｒｏｓｅａ、Ｏｒｎｉｔｈｏｃｔｏｎｕｓｈｕｗｅｎａ、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅｖｅｒｓｕｔａ、Ａｔｒａｘｒｏｂｕｓｔｕｓ、Ａｎｇｅｌｅｎｏｐｓｉｓａｐｅｒｔａ、Ｐｓａｌｍｏｐｏｅｕｓｃａｍｂｒｉｄｇｅｉ、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅｉｎｆｅｎｓａ、Ｐａｒａｃｏｅｌｏｔｅｓｌｕｃｔｏｓｕｓ、及びＣｈｉｌｏｂｒａｃｈｙｓｊｉｎｇｚｈａｏｏｒ、別の好適な属または種のサソリまたはクモの毒液または毒素に由来し得る。場合によっては、ペプチドは、ＢｕｔｈｕｓｍａｒｔｅｎｓｉｉＫａｒｓｈ（サソリ）毒素に由来し得る。

いくつかの実施形態では、本開示のペプチド（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド、標的結合ペプチド、または選択的枯渇複合体）は、例えば、配列番号９６を参照して、対応する位置１１、１２、１３、１４、１９、２０、２１、２２、３６、３８、３９、４１のうちの１つ以上にシステイン残基を有する配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、位置１１、１２、１９、２０、３６、３９、またはこれらの任意の組み合わせにＣｙｓを含む。例えば、特定の実施形態では、ペプチドは、対応する位置１１にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ペプチドは、対応する位置１２にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ペプチドは、対応する位置１３にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ペプチドは、対応する位置１４にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ペプチドは、対応する位置１９にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ペプチドは、対応する位置２０にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ペプチドは、対応する位置２１にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ペプチドは、対応する位置２２にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ペプチドは、対応する位置３６にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ペプチドは、対応する位置３８にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ペプチドは、対応する位置３９にシステイン残基を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ペプチドは、対応する位置４１にシステイン残基を有する配列を含み得る。いくつかの実施形態では、配列中の１番目のシステイン残基は、配列中の４番目のシステイン残基とジスルフィド結合することができ、配列中の２番目のシステイン残基は、配列中の５番目のシステイン残基とジスルフィド結合することができ、配列中の３番目のシステイン残基は、配列中の６番目のシステイン残基とジスルフィド結合することができる。任意選択で、ペプチドは、「ツーアンドスルー」構造系としても知られる、他の２つのジスルフィド架橋によって形成される環を通過する１つのジスルフィド架橋を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるペプチドは、セリンに変異された１つ以上のシステインを有し得る。

いくつかの実施形態では、本開示のペプチド（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド、標的結合ペプチド、または選択的枯渇複合体）は、少なくとも１個のシステイン残基を含む。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも２個のシステイン残基を含む。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも３個のシステイン残基を含む。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも４個のシステイン残基を含む。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも５個のシステイン残基を含む。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも６個のシステイン残基を含む。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも１０個のシステイン残基を含む。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、６個のシステイン残基を含む。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、７個のシステイン残基を含む。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、８個のシステイン残基を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のペプチド（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド、標的結合ペプチド、または選択的枯渇複合体）は、例えば、配列番号９６を参照して、１つ以上の位置にシステイン残基を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のシステイン残基は、アミノ酸位置６、１０、２０、３４、４４、４８のいずれか１つ、またはこれらの任意の組み合わせに位置する。本開示のいくつかの態様において、１つ以上のシステイン（Ｃ）残基は、さまざまな対形成パターン（例えばＣ_１０－Ｃ_２０）を有するジスルフィド結合に関与する。いくつかの実施形態では、対応する対形成パターンは、Ｃ_６－Ｃ_４８、Ｃ_１０－Ｃ_４４、及びＣ_２０－Ｃ_３４である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、少なくとも１個、少なくとも２個、または少なくとも３個のジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１個、少なくとも２個、または少なくとも３個のジスルフィド結合は、対応するＣ_６－Ｃ_４８、Ｃ_１０－Ｃ_４４、及びＣ_２０－Ｃ_３４の対形成パターン、またはこれらの組み合わせに従って配置される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、対応する対形成パターンＣ_６－Ｃ_４８、Ｃ_１０－Ｃ_４４、及びＣ_２０－Ｃ_３４を有する３個のジスルフィド結合を含む。

特定の実施形態では、ペプチド（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド、標的結合ペプチド、または選択的枯渇複合体）は、対応する位置６にシステイン残基を有する配列を含む。特定の実施形態では、ペプチドは、対応する位置１０にシステイン残基を有する配列を含む。特定の実施形態では、ペプチドは、対応する位置２０にシステイン残基を有する配列を含む。特定の実施形態では、ペプチドは、対応する位置３４にシステイン残基を有する配列を含む。特定の実施形態では、ペプチドは、対応する位置４４にシステイン残基を有する配列を含む。特定の実施形態では、ペプチドは、対応する位置５０にシステイン残基を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、配列中の１番目のシステイン残基は、配列中の最後のシステイン残基とジスルフィド結合する。いくつかの実施形態では、配列中の２番目のシステイン残基は、配列中の最後から２番目のシステイン残基とジスルフィド結合する。いくつかの実施形態では、配列中の３番目のシステイン残基は、配列中の最後から３番目のシステイン残基とジスルフィド結合するなどである。

いくつかの実施形態では、配列中の１番目のシステイン残基は、配列中の６番目のシステイン残基とジスルフィド結合し、配列中の２番目のシステイン残基は、配列中の５番目のシステイン残基とジスルフィド結合し、配列中の３番目のシステイン残基は、配列中の４番目のシステイン残基とジスルフィド結合する。任意選択で、ペプチドは、「ツーアンドスルー」構造系としても知られる、他の２つのジスルフィド架橋によって形成される環を通過する１つのジスルフィド架橋を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるペプチドは、セリンに変異された１つ以上のシステインを有する。

いくつかの実施形態では、ペプチド（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド、標的結合ペプチド、または選択的枯渇複合体）はシステインまたはジスルフィドを含まない。いくつかの実施形態では、ペプチドは、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、または１５個以上のシステインまたはジスルフィドを含む。他の実施形態では、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上のシステイン残基がセリン残基で置換されている。いくつかの実施形態では、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上のシステイン残基がトレオニン残基で置換されている。

いくつかの実施形態では、ペプチド（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド、標的結合ペプチド、または選択的枯渇複合体）はＣｙｓまたはジスルフィドを含まない。いくつかの実施形態では、ペプチドは、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、または１５個以上のＣｙｓまたはジスルフィドを含む。他の実施形態では、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上のＣｙｓ残基がＳｅｒ残基で置換されている。いくつかの実施形態では、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上のＣｙｓ残基がＴｈｒ残基で置換されている。

いくつかの例では、ペプチド中の１つ以上またはすべてのメチオニン残基がロイシンまたはイソロイシンによって置換される。いくつかの例では、ペプチド中の１つ以上またはすべてのトリプトファン残基がフェニルアラニンまたはチロシンによって置換される。いくつかの例では、ペプチド中の１つ以上またはすべてのアスパラギン残基がグルタミンによって置換される。いくつかの実施形態では、ペプチドのＮ末端は、アセチル基などによってブロックされる。代替として、または組み合わせて、いくつかの例では、ペプチドのＣ末端は、アミド基などによってブロックされる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、遊離アミン上のメチル化によって修飾される。

例えば、完全なメチル化は、ホルムアルデヒド及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムによる還元的メチル化の使用を介して達成され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のペプチドまたはペプチド複合体は、ＴｆＲ発現細胞層もしくは障壁及び／またはＴｆＲ発現細胞の膜を標的及び／または透過する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、細胞の細胞膜を標的化及び／または透過し、当該細胞は、脳などのＣＮＳに位置する。例えば、ＴｆＲ結合ペプチド及び１つ以上の活性剤（例えば、治療用または診断用化合物）を含むペプチド複合体は、細胞障壁（例えば、ＢＢＢ）を小胞性トランスサイトーシスを介して通過し、その後、ＣＮＳ内に位置する細胞の細胞膜を標的化及び／または透過して、当該細胞に当該１つ以上の活性剤を送達する。

さまざまな実施形態では、ＴｆＲ結合ペプチド及び標的結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体は、胃腸管、脾臓、肝臓、腎臓、筋肉、骨髄、脳、または皮膚に位置するＴｆＲ発現細胞に結合する。場合によっては、ＴｆＲ発現細胞は、腫瘍細胞、免疫細胞、赤血球、赤血球前駆細胞、幹細胞、骨髄細胞、または幹細胞である。場合によっては、例えば、細胞がＴｆＲを過剰発現している場合において、ＴｆＲ結合ペプチドは、細胞の標的化に関与する。種々の実施形態では、本明細書に記載のペプチド複合体は、脾臓、脳、肝臓、腎臓、筋肉、骨髄、消化管、または皮膚などのさまざまな器官内に位置する細胞に結合する、標的結合ペプチドにコンジュゲート、連結、または融合されたＴｆＲ結合ペプチドを含む。

場合によっては、標的結合ペプチドは、標的分子のエンドサイトーシスを促進する。いくつかの態様において、本開示のペプチドまたはペプチド複合体（例えば、ペプチドコンジュゲートまたは融合ペプチド）は、ある特定の生物学的（例えば、治療的）効果を発揮するために、標的分子の標的化に使用される。いくつかの態様では、本開示の選択的枯渇複合体（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド及び標的結合ペプチドを含む複合体）を使用して、前記細胞への標的分子のエンドサイトーシスを促進し、特定の生物学的効果（例えば、標的分子の選択的枯渇）を発揮することができる。

ペプチドリンカー
提示された開示のペプチド（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド、標的結合ペプチド、選択的枯渇複合体、またはそれらの組み合わせ）は、多数の方法で二量体化することができる。例えば、ＴｆＲ結合ペプチドは、ペプチドリンカーを介して標的結合ペプチドと二量体化して、選択的枯渇複合体を形成することができる。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ペプチドドメイン（例えば、ＴｆＲ結合ペプチドまたは標的結合ペプチド）の独立したフォールディングを妨害しない。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ペプチド複合体（例えば、選択的枯渇複合体）を介した標的分子とＴｆＲとの間の接触を容易にするために、ペプチド複合体に対して十分な長さを含み得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ペプチド複合体（例えば、選択的枯渇複合体）の製造可能性（合成または組換え）に悪影響を及ぼさない。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ペプチド複合体（例えば、選択的枯渇複合体）の合成後の化学変化（例えば、フルオロフォアまたはアルブミン結合化学基のコンジュゲーション）を損なわない。

いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、第１のペプチド（例えば、標的結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、または半減期改変ペプチド）のＣ末端を、第２のペプチド（例えば、標的結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、または半減期改変ペプチド）のＮ末端に接続することができる。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、第２のペプチド（例えば、標的結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、または半減期改変ペプチド）のＣ末端を、第３のペプチド（例えば、標的結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、または半減期改変ペプチド）のＮ末端に接続することができる。例えば、リンカー（例えば、配列番号１２９～配列番号１４１または配列番号１９５～配列番号２１８のいずれか１つ）は、標的結合ペプチドのＣ末端をＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか１つ）のＮ末端に結合して、選択的枯渇複合体を形成することができる。別の例では、リンカー（例えば、配列番号１２９～配列番号１４１または配列番号１９５～配列番号２１８のいずれか１つ）は、ＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか１つ）のＣ末端を、標的結合ペプチドのＮ末端に接続して、選択的枯渇複合体を形成することができる。別の例において、リンカー（例えば、配列番号１２９～配列番号１４１または配列番号１９５～配列番号２１８のいずれか１つ）は、ＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか１つ）のＣ末端を、半減期延長ペプチド（例えば、配列番号１７８、配列番号１７９、または配列番号１９２）のＮ末端に接続し、半減期延長ペプチドのＣ末端を、標的結合ペプチドのＮ末端に接続し、選択的枯渇複合体を形成することができる。別の例では、リンカー（例えば、配列番号１２９～配列番号１４１または配列番号１９５～配列番号２１８のいずれか１つ）は、標的結合ペプチドのＣ末端を、半減期延長ペプチド（例えば、配列番号１７８、配列番号１７９、または配列番号１９２）のＮ末端に接続することができ、第２のリンカー（例えば、配列番号１２９～配列番号１４１または配列番号１９５～配列番号２１８のいずれか１つ）は、半減期延長ペプチドのＣ末端を、ＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか１つ）のＮ末端に接続することができ、選択的枯渇複合体を形成することができる。別の例では、第１のリンカー（例えば、配列番号１２９～配列番号１４１または配列番号１９５～配列番号２１８のいずれか１つ）は、標的結合ペプチドのＣ末端を、半減期延長ペプチド（例えば、配列番号１７８、配列番号１７９、または配列番号１９２）のＮ末端に接続することができ、第２のリンカー（例えば、配列番号１２９～配列番号１４１または配列番号１９５～配列番号２１８のいずれか１つ）は、半減期延長ペプチドのＣ末端を、ＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか１つ）のＮ末端に接続することができ、選択的枯渇複合体を形成することができる。別の例では、リンカー（例えば、配列番号１２９～配列番号１４１または配列番号１９５～配列番号２１８のいずれか１つ）は、半減期延長ペプチド（例えば、配列番号１７８、配列番号１７９、または配列番号１９２）のＣ末端を、標的結合ペプチドのＮ末端に接続することができ、第２のリンカー（例えば、配列番号１２９～配列番号１４１または配列番号１９５～配列番号２１８のいずれか１つ）は、標的結合ペプチドのＣ末端を、ＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか１つ）のＮ末端に接続することができ、選択的枯渇複合体を形成することができる。

いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａｓｃｈｍｉｄｔｉ由来の天然のノッチン－ノッチン二量体から抽出された、ＤｋＴｘ（ダブルノット毒素）としても知られるＴａｕ－セラフォトキシン－Ｈｓ１ａを含むことができる（例えば、配列番号１３９）。リンカーは、独立して機能するＣＤＰ（例えば、ＴｆＲ結合ＣＤＰ及び標的結合ＣＤＰ）の二量体化を妨げる構造的特徴を欠いていてもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン－セリン（Ｇｌｙ－ＳｅｒまたはＧＳ）リンカー（例えば、配列番号１２９～配列番号１３８または配列番号１４１または配列番号１９５～配列番号：２１８）を含み得る。Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは最小限の化学反応性を有し得、リンカーに柔軟性を与えることができる。セリンは、側鎖のヒドロキシルが親水性であるため、リンカーまたはペプチド複合体の溶解度を高めることができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、ヒト免疫グロブリンＧの重鎖（例えば、配列番号１４０）中のＦｖドメインからＦｃを分離するペプチドに由来し得る。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧの重鎖からのペプチドに由来するリンカーは、天然のＩｇＧペプチドと比較して、システインからセリンへの変異を含み得る。

いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、免疫グロブリン重鎖Ｆｃドメインを使用して二量体化することができる。これらのＦｃドメインは、抗体または他の可溶性機能ドメインのいずれかに基づいて、機能ドメイン（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド及び標的結合ペプチド）を二量体化するために使用することができる。いくつかの実施形態では、二量体化は、Ｆｃ配列が天然である場合、ホモ二量体であり得る。いくつかの実施形態では、二量体化は、Ｆｃドメインを変異させて、一方のＦｃＣＨ３ドメインが他方のＦｃＣＨ３ドメイン上の空洞（穴）に適合するように設計された新規残基（ノブ）を含む「ホールインノブ」フォーマットを生成することによって、ヘテロ二量体であり得る。第１のペプチドドメイン（例えば、ＴｆＲ結合ペプチドまたは標的結合ペプチド）をノブに結合させることができ、第２のペプチドドメイン（例えば、ＴｆＲ結合ペプチドまたは標的結合ペプチド）をホールに結合させることができる。ノブ＋ノブ二量体は、エネルギー的に非常に不利になり得る。精製タグを「ノブ」側に追加して、ホール＋ホールダイマーを除去し、ノブ＋ホールダイマーを選択することができる。

本開示のペプチド（例えば、標的結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、または選択的枯渇複合体）は、別のペプチド（例えば、標的結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、選択的枯渇複合体、または半減期を変更するペプチド）に、Ｎ末端またはＣ末端で連結することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上のペプチドを、ペプチドリンカー（例えば、配列番号１２９～配列番号１４１または配列番号１９５～配列番号２１８のいずれか１つの配列を含むペプチドリンカー）を介して連結または融合することができる。例えば、ＴｆＲ結合ペプチドは、配列番号１２９～配列番号１４１または配列番号１９５～配列番号２１８のいずれか１つのペプチドリンカーを介して標的結合ペプチドに融合することができる。ペプチドリンカー（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド、標的結合ペプチド、半減期改変ペプチド、またはそれらの組み合わせを接続するリンカー）は、約２個、約３個、約４個、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１１個、約１２個、約１３個、約１４個、約１５個、約１６個、約１７個、約１８個、約１９個、約２０個、約２１個、約２２個、約２３個、約２４個、約２５個、約３０個、約３５個、約４０個、約４５個、または約５０個のアミノ酸残基の長さを有し得る。ペプチドリンカー（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド、標的結合ペプチド、半減期改変ペプチド、またはそれらの組み合わせを接続するリンカー）は、約２個～約５個、約２個～約１０個、約２個～約２０個、約３個～約５個、約３個～約１０個、約３個～約１５個、約３個～約２０個、約３個～約２５個、約５個～約１０個、約５個～約１５個、約５個～約２０個、約５個～約２５個、約１０個～約１５個、約１０個～約２０個、約１０個～約２５個、約１５個～約２０個、約１５個～約２５個、約２０個～約２５個、約２０個～約３０個、約２０個～約３５個、約２０個～約４０個、約２０個～約４５個、約２０個～約５０個、約３個～約５０個、約３個～約４０個、約３個～約３０個、約１０個～約４０個、約１０個～約３０個、約５０個～約１００個、約１００個～約２００個、約２００個～約３００個、約３００個～約４００個、約４００個～約５００個、または約５００個～約６００個のアミノ酸残基の長さを有し得る。

いくつかの実施形態では、第１のペプチド（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド）と第２のペプチド（例えば、標的結合ペプチド）は、柔軟なペプチドリンカーによって連結され得る。柔軟なリンカーは、第１のペプチドと第２のペプチドとの間に回転の自由を提供することができ、第１のペプチド及び第２のペプチドがそれぞれの標的（例えば、トランスフェリン受容体及び標的分子）に最小限の歪みで結合することを可能にすることができる。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、６Å以下、７Å以下、８Å以下、９Å以下、１０Å以下、１２Å以下、１５Å以下、２０Å以下、２５Å以下、３０Å以下、４０Å以下、または５０Å以下の持続長を有し得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約４Å～約１００Å、約４Å～約５０Å、約４Å～約２０Å、約４Å～約１０Å、約１０Å～約２０Å、約２０Å～約３０Å、約３０Å～約５０Å、または約５０Å～約１００Åの持続長を有し得る。リンカーの持続長は、ペプチドリンカーの柔軟性の尺度となり得、接線方向の相関が失われるペプチド長として定量化することができる。

いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、所望のリンカー長、流体力学的半径、クロマトグラフィー移動度、翻訳後修飾傾向、またはそれらの組み合わせに基づいて選択することができる。いくつかの実施形態では、ペプチド複合体の２つ以上の機能ドメインを分離する（例えば、ＴｆＲ結合ペプチドと標的結合ペプチドを分離する）リンカーは、例えば、糸球体濾過の傾向を低下させるために、大きな安定した球状ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、ペプチド複合体の２つ以上の機能ドメインを分離する（例えば、ＴｆＲ結合ペプチドと標的結合ペプチドを分離する）リンカーは、高密度コア腫瘍間質のような狭いスペースでの使用のために、例えば複合体の流体力学的半径を減少させるために、小さく柔軟なリンカーを含むことができる。ペプチドリンカーを介して接続された標的結合ペプチドと受容体結合ペプチドを含む単一のポリペプチド鎖から形成される選択的枯渇複合体の例を、図２５Ａ及び図２５Ｂに示す。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、２つ以上の機能ドメインの独立したフォールディングを支持することができ、２つ以上の機能ドメインとそれらの結合標的との間の相互作用（例えば、ＴｆＲ結合ペプチドとＴｆＲとの間、または標的結合ペプチドと標的分子の間）を阻害できない。

いくつかの実施形態では、ペプチドは、本開示の任意のペプチドのＮ末端に、Ｎ末端ＧＳジペプチドの後、かつ、例えば、ＧＧＧＳ（配列番号１２９）スペーサーの前に付加され得る。いくつかの実施形態では、ペプチド（例えば、標的結合ペプチド）は、Ｇ_ｘＳ_ｙ（配列番号１３０）（式中、ｘ及びｙは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０などの任意の整数であり得る）などのペプチドリンカーを使用して、本明細書で開示される任意のペプチド（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに付加され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（ＧＳ）ｘ（配列番号１３１）を含み、式中、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０などの任意の整数であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ＧＧＳＳＧ（配列番号１３２）、ＧＧＧＧＧ（配列番号１３３）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１３４）、ＧＳＧＧ（配列番号１３５）、ＧＧＧＧＳ（配列番号１３６）、ＧＧＧＳ（配列番号１２９）、ＧＧＳ（配列番号１３７）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１３８）、またはそれらのバリアントもしくは断片を含む。さらに、ＤｋＴｘに由来するＫＫＹＫＰＹＶＰＶＴＴＮ（配列番号１３９）、及びヒトＩｇＧ３に由来するＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴ（配列番号１４０）は、ペプチドリンカーとして使用され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーはＧＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１４１）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１９５～配列番号２１８のいずれか１つのリンカーを含む。本開示の標的枯渇複合体と適合するペプチドリンカーの例を表４に提供する。前述のリンカーまたはそれらのバリアントもしくは断片のいずれも、それらの任意の数の反復または任意の組み合わせとともに使用できることが理解される。また、当該技術分野における他のペプチドリンカーまたはそれらのバリアントもしくは断片を、それらの任意の数の反復または任意の組み合わせとともに使用できることも理解される。

いくつかの実施形態では、タグペプチド（例えば、配列番号１４２～配列番号１４７のいずれか１つのペプチド）を任意のアミノ酸残基でペプチド（例えば、標的結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、または選択的枯渇複合体）に付加することができる。さらなる実施形態では、タグペプチド（例えば、配列番号１４２～配列番号１４７のいずれか１つのペプチド）は、ＴｆＲ結合活性、標的結合活性、選択的枯渇活性、またはそれらの組み合わせを妨害することなく、任意のアミノ酸残基でペプチドに付加することができる。いくつかの実施形態では、タグペプチドは、コンジュゲーション、連結、または融合技術を介して付加される。他の実施形態では、ペプチド（例えば、標的結合ペプチド）は、任意のアミノ酸残基で第２のペプチド（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド）に付加することができる。さらなる実施形態では、ペプチド（例えば、標的結合ペプチド）は、ＴｆＲ結合活性、標的結合活性、選択的枯渇活動、またはその組み合わせを妨害することなく、任意のアミノ酸残基で第２のペプチド（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド）に付加することができる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、コンジュゲーション、連結、または融合技術を介して付加される。他の実施形態では、ペプチド（例えば、標的結合ペプチド）は、任意のアミノ酸残基で第２のペプチド（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド）に付加することができる。

いくつかの実施形態では、選択的枯渇複合体は、２つ以上のポリペプチド鎖を含み得る。例えば、標的結合ペプチド及び受容体結合ペプチドは、二量体化ドメインを介して複合体を形成し、選択的枯渇複合体を形成することができる。二量体化ドメインは、ヘテロ二量体化ドメインまたはホモ二量体化ドメインであり得る。二量体化ドメイン（例えば、Ｆｃホモ二量体化ドメインまたはノブインホールヘテロ二量体化ドメイン）を介して接続された標的結合ペプチドと受容体結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体の例を図２５Ａ、図２５Ｂ、及び図２５Ｃに示す。

標的結合ペプチドと受容体結合ペプチドは、ヘテロ二量体化ドメインを介してヘテロ二量体を形成することによって複合体を形成することができる。標的結合ペプチドは、第１のヘテロ二量体化ドメインに連結または融合され得、受容体結合ペプチドは、第２のヘテロ二量体化ドメインに連結または融合され得る。第１のヘテロ二量体化ドメインは、第２のヘテロ二量体化ドメインに結合して、標的結合ペプチドと受容体結合ペプチドを含むヘテロ二量体複合体を形成し得る。例えば、受容体結合ペプチドは、Ｆｃ「ノブ」ペプチド（例えば、配列番号２６０）に連結または融合することができ、免疫細胞標的化剤は、Ｆｃ「ホール」ペプチド（例えば、配列番号２６１）に連結または融合することができる。別の例では、受容体結合ペプチドは、Ｆｃ「ホール」ペプチド（例えば、配列番号２６１）に連結または融合することができ、標的結合は、Ｆｃ「ノブ」ペプチド（例えば、配列番号２６０）に連結または融合することができる。いくつかの実施形態では、受容体結合ペプチド（例えば、配列番号１～配列番号２２２のいずれか１つ）は、表５に提供されるヘテロ二量体化ドメインを介して標的結合ペプチドとヘテロ二量体を形成し得る。例えば、受容体結合ペプチドは、Ｆｃペアの鎖１（例えば、配列番号２６０）に融合され得、標的結合ペプチドは、Ｆｃペアの鎖２（例えば、配列番号２６１）に融合され得る。別の例では、受容体結合ペプチドは、Ｆｃペアの鎖２（例えば、配列番号２６３）に融合され得、標的結合ペプチドは、Ｆｃペアの鎖１（例えば、配列番号２６２）に融合され得る。ヘテロ二量体化ドメインを含む選択的枯渇複合体は、図２５Ｂに示されるように、一価の選択的枯渇複合体を形成し得る。あるいは、ヘテロ二量体化ドメインを含む選択的枯渇複合体は、図２５Ｃに示されるように、多価選択的枯渇複合体を形成し得る。

いくつかの実施形態では、標的結合ペプチドと受容体結合ペプチドは、ホモ二量体化ドメインを介して複合体形成されたホモ二量体を含む選択的枯渇複合体を形成し得る。標的結合ペプチドは、ホモ二量体化ドメインのＮ末端に連結または融合され得、受容体結合ペプチドは、ホモ二量体化ドメインのＣ末端に連結または融合され得る。いくつかの実施形態では、標的結合ペプチドは、ホモ二量体化ドメインのＣ末端に連結または融合され得、受容体結合ペプチドは、ホモ二量体化ドメインのＮ末端に連結または融合され得る。いくつかの実施形態では、標的結合ペプチドと受容体結合ペプチドは、両方ともホモ二量体化ドメインのＮ末端で融合され得るか、または両方がホモ二量体化ドメインのＣ末端で融合され得る。ホモ二量体化ドメインを含む選択的枯渇複合体は、図２５Ｃに示されるように、多価選択的枯渇複合体を形成し得る。標的結合ペプチドを受容体結合ペプチドに連結または融合するために使用できるホモ二量体化ドメインの例を表６に提供する。

ペプチドの修飾
ペプチドは、１つ以上のさまざまな方法で修飾（例えば、化学修飾）することができる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、機能を追加し、機能を削除し、またはインビボ挙動を改変するために変異され得る。ペプチド（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド、標的結合ペプチド、または選択的枯渇複合体）のジスルフィド連結間の１つ以上のループを修飾または置き換えることで、他のペプチドに由来する活性成分を含めることができる（例えば、ＭｏｏｒｅａｎｄＣｏｃｈｒａｎ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，５０３，ｐ．２２３－２５１，２０１２に記載される）。いくつかの実施形態では、本開示のペプチド（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド、標的結合ペプチド、または選択的枯渇複合体）は、さらなる機能ドメインを付加することによって、さらに機能化及び多量体化することができる。例えば、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）は、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａｍａｇｎａｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌのアルブミン結合タンパク質（配列番号１９２、ＭＫＬＮＫＫＬＬＭＡＡＬＡＧＡＩＶＶＧＧＧＶＮＴＦＡＡＤＥＰＧＡＩＫＶＤＫＡＰＥＡＰＳＱＥＬＫＬＴＫＥＥＡＥＫＡＬＫＫＥＫＰＩＡＫＥＲＬＲＲＬＧＩＴＳＥＦＩＬＮＱＩＤＫＡＴＳＲＥＧＬＥＳＬＶＱＴＩＫＱＳＹＬＫＤＨＰＩＫＥＥＫＴＥＥＴＰＫＹＮＮＬＦＤＫＨＥＬＧＧＬＧＫＤＫＧＰＧＲＦＤＥＮＧＷＥＮＮＥＨＧＹＥＴＲＥＮＡＥＫＡＡＶＫＡＬＧＤＫＥＩＮＫＳＹＴＩＳＱＧＶＤＧＲＹＹＹＶＬＳＲＥＥＡＥＴＰＫＫＰＥＥＫＫＰＥＤＫＲＰＫＭＴＩＤＱＷＬＬＫＮＡＫＥＤＡＩＡＥＬＫＫＡＧＩＴＳＤＦＹＦＮＡＩＮＫＡＫＴＶＥＥＶＮＡＬＫＮＥＩＬＫＡＨＡＧＫＥＶＮＰＳＴＰＥＶＴＰＳＶＰＱＮＨＹＨＥＮＤＹＡＮＩＧＡＧＥＧＴＫＥＤＧＫＫＥＮＳＫＥＧＩＫＲＫＴＡＲＥＥＫＰＧＫＥＥＫＰＡＫＥＤＫＫＥＮＫＫＫＥＮＴＤＳＰＮＫＫＫＫＥＫＡＡＬＰＥＡＧＲＲＫＡＥＩＬＴＬＡＡＡＳＬＳＳＶＡＧＡＦＩＳＬＫＫＲＫ）に由来する。例えば、配列番号１９３のアルブミン結合ドメイン（ＬＫＮＡＫＥＤＡＩＡＥＬＫＫＡＧＩＴＳＤＦＹＦＮＡＩＮＫＡＫＴＶＥＥＶＮＡＬＫＮＥＩＬＫＡ）を本開示のペプチドに付加することができる。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、アルブミン親和性の改善、安定性の改善、免疫原性の低減、製造性の改善、またはそれらの組み合わせのために改変されたアルブミン結合ドメインで機能化することができる。例えば、ペプチドは、配列番号１９３のアルブミン結合ドメインと比較して、高い熱安定性及び改善された血清半減期を有する、配列番号１９４（ＬＫＥＡＫＥＫＡＩＥＥＬＫＫＡＧＩＴＳＤＹＹＦＤＬＩＮＫＡＫＴＶＥＧＶＮＡＬＫＤＥＩＬＫＡ）または配列番号２２７（ＬＫＥＡＫＥＫＡＩＥＥＬＫＫＡＧＩＴＳＤＹＹＦＤＬＩＮＫＡＫＡＶＥＧＶＮＡＬＫＤＥＩＬＫＡ）の改変されたアルブミン結合ドメインで機能化され得る。いくつかの実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、アルブミンの所望のオフ速度に基づいて選択され得る。例えば、配列番号２２７のアルブミン結合ペプチドは、配列番号１９４と比較してより速いオフ速度のために選択され得る。アルブミン結合ドメインは、他のペプチドドメイン（例えば、ＣＤＰドメイン）の独立したフォールディングを乱す可能性が低い単純な３ヘリックス構造を含んでいる。いくつかの実施形態では、機能ドメイン（例えば、アルブミン結合ドメイン）は、本開示のペプチドまたはペプチド複合体の血清半減期を増加させることができる。機能ドメイン（例えば、アルブミン結合ドメイン）は、ＴｆＲ結合ペプチドまたは標的結合ペプチドに対して任意の配向で含まれ得る。例えば、機能ドメインは、図１６Ａ～図１６Ｃに示されるように、ＴｆＲ結合ペプチド、標的結合ペプチド、またはＴｆＲ結合ペプチドと標的結合ペプチドとの間に連結することができる。いくつかの実施形態では、アルブミン結合ペプチド（例えば、配列番号１９４または配列番号２２７）を使用して、標的結合ペプチドを受容体結合ペプチドに連結することができる。追加の機能ドメインは、リンカー（例えば、配列番号１２９～配列番号１４１または配列番号１９５～配列番号２１８）を介して、１つ以上のペプチド（例えば、ＴｆＲ結合ペプチドまたは標的結合ペプチド）に連結することができる。

本開示のペプチド（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド、受容体結合ペプチド、標的結合ペプチド、または選択的枯渇複合体）をシグナルペプチドで修飾して、分泌のためにペプチドを標識することができる。例えば、ペプチドは、配列番号２３０（ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ）に対応するシグナルペプチドで改変され得る。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに付加され得る。ペプチドは、翻訳中または分泌中のさらなる安定性のために改変され得る。例えば、ペプチドは、配列番号２２９（ＧＳＱＤＳＴＳＤＬＩＰＡＰＰＬＳＫＶＰＬＱＱＮＦＱＤＮＱＦＱＧＫＷＹＶＶＧＬＡＧＮＡＩＬＲＥＤＫＤＰＱＫＭＹＡＴＩＹＥＬＫＥＤＫＳＹＮＶＴＳＶＬＦＲＫＫＫＣＤＹＷＩＲＴＦＶＰＧＳＱＰＧＥＦＴＬＧＮＩＫＳＹＰＧＬＴＳＹＬＶＲＶＶＳＴＮＹＮＱＨＡＭＶＦＦＫＫＶＳＱＮＲＥＹＦＫＩＴＬＹＧＲＴＫＥＬＴＳＥＬＫＥＮＦＩＲＦＳＫＳＬＧＬＰＥＮＨＩＶＦＰＶＰＩＤＱＣＩＤＧＧＧＳＲＲＲＲＫＲＳＧＳ）に対応するフューリン切断部位を有するシドロカリンで改変され得る。いくつかの実施形態では、フューリン切断部位を有するシドロカリンは、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加され得る。ペプチドをシグナルペプチドで改変して、ペプチドを分泌のために標識し、翻訳または分泌中のさらなる安定性を得ることができる。例えば、ペプチドは、配列番号２３１（ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＧＳＱＤＳＴＳＤＬＩＰＡＰＰＬＳＫＶＰＬＱＱＮＦＱＤＮＱＦＱＧＫＷＹＶＶＧＬＡＧＮＡＩＬＲＥＤＫＤＰＱＫＭＹＡＴＩＹＥＬＫＥＤＫＳＹＮＶＴＳＶＬＦＲＫＫＫＣＤＹＷＩＲＴＦＶＰＧＳＱＰＧＥＦＴＬＧＮＩＫＳＹＰＧＬＴＳＹＬＶＲＶＶＳＴＮＹＮＱＨＡＭＶＦＦＫＫＶＳＱＮＲＥＹＦＫＩＴＬＹＧＲＴＫＥＬＴＳＥＬＫＥＮＦＩＲＦＳＫＳＬＧＬＰＥＮＨＩＶＦＰＶＰＩＤＱＣＩＤＧＧＧＳＲＲＲＲＫＲＳＧＳ）に対応するシグナルペプチドとフューリン切断部位を有するシドロカリンで改変され得る。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドとフューリン切断部位を有するシドロカリンは、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加され得る。

ペプチドまたはペプチド複合体（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド、受容体結合ペプチド、標的結合ペプチド、または選択的枯渇複合体）のアミノ酸はまた、半減期の延長、インビボにおける結合挙動の改変、追加、もしくは喪失、新しい標的化機能の追加、表面電荷及び疎水性の改変、またはコンジュゲーション部位の可能をもたらすために変異がなされ得る。Ｎ－メチル化は、本開示のペプチドになされ得るメチル化の一例である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、遊離アミン上のメチル化によって修飾される。例えば、完全なメチル化は、ホルムアルデヒド及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムによる還元的メチル化の使用を介して達成され得る。

ペプチドは、他のタンパク質またはペプチドに由来するループまたは配列を本開示のペプチド上にグラフトするなど、機能を追加するために修飾され得る。同様に、本開示に由来するドメイン、ループ、または配列は、追加の機能を有する抗体などの他のペプチドまたはタンパク質上にグラフトされ得る。

いくつかの実施形態では、選択的枯渇複合体は、組織標的化ドメインを含むことができ、対象への投与時に標的組織に蓄積することができる。例えば、選択的枯渇複合体は、目的の細胞または当該細胞の表面または内部に位置する標的タンパク質に対するターゲティングまたはホーミング機能を有する分子（例えば、小分子、ペプチド、またはタンパク質）にコンジュゲート、連結、または融合することができる。いくつかの実施形態では、選択的枯渇複合体は、ペプチドの血漿半減期及び／または生物学的半減期の延長、または薬力学（例えば、標的タンパク質への結合の向上）及び／または薬物動態特性（例えば、クリアランスの速度及び様式）の変更、またはこれらの任意の組み合わせをもたらす分子にコンジュゲート、連結、または融合され得る。

化学修飾は、例えば、ペプチドの半減期の延長または生体内分布もしくは薬物動態プロファイルの変更をもたらすことができる。化学修飾は、ポリマー、ポリエーテル、ポリエチレングリコール、バイオポリマー、ポリアミノ酸、脂肪酸、デンドリマー、Ｆｃ領域、パルミチン酸もしくはミリスチン酸などの単純な飽和炭素鎖、またはアルブミンを含み得る。ポリアミノ酸としては、例えば、単一のアミノ酸が反復されるポリアミノ酸配列（例えば、ポリグリシン）、及びあるパターンに従っても従わなくてもよい混合ポリアミノ酸配列（例えば、ｇｌｙ－ａｌａ－ｇｌｙ－ａｌａ；配列番号４５７）または前述の任意の組み合わせを挙げることができる。

本開示のペプチドは、修飾がペプチドの安定性及び／または半減期を増大させるように修飾することができる。Ｎ末端、Ｃ末端、または内部アミノ酸などへの疎水性部分の結合を使用して、本開示のペプチドの半減期を延長することができる。ペプチドはまた、ペプチドの腸透過性または細胞透過性が増加または減少するように改変することができる。場合によっては、本開示のペプチドは、腸の腺細胞に高い蓄積を示すことから、クローン病またはより一般的には炎症性腸疾患などの腸の疾患または状態の治療及び／または予防における適用可能性を実証する。本開示のペプチドは、例えば、血清半減期に影響し得る翻訳後修飾（例えば、メチル化及び／またはアミド化及び／またはグリコシル化）を含み得る。いくつかの実施形態では、単純な炭素鎖（例えば、ミリストイル化及び／またはパルミチル化による）が融合タンパク質またはペプチドにコンジュゲートされ、連結され得る。単純な炭素鎖は、融合タンパク質またはペプチドを非コンジュゲート材料から容易に分離できるようにし得る。例えば、非コンジュゲート材料から融合タンパク質またはペプチドを分離するのに使用することができる方法としては、溶媒抽出及び逆相クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。親油性部分は、血清アルブミンへの可逆的結合により、半減期を延長することができる。コンジュゲート部分は、例えば、血清アルブミンへの可逆的結合により、ペプチドの半減期を延長する親油性部分であり得る。いくつかの実施形態では、親油性部分は、コレステロールまたはコレステロール誘導体であり得、コレステン、コレスタン、コレスタジエン、及びオキシステロールを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ミリスチン酸（テトラデカン酸）またはその誘導体にコンジュゲートされ、連結され得る。他の実施形態では、本開示のペプチドは、半減期改変剤に結合（例えば、コンジュゲート、連結、または融合）され得る。半減期改変剤の例としては、ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン、ポリビニルアルコール、水溶性ポリマー、双極性イオン水溶性ポリマー、水溶性ポリ（アミノ酸）、プロリン、アラニン及びセリンの水溶性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、及びセリンを含む水溶性ポリマー、Ｆｃ領域、脂肪酸、パルミチン酸、またはアルブミンに結合する分子が挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、半減期改変剤は、血清アルブミン結合ペプチド、例えば、ＳＡ２１（配列番号１７８、ＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤ）であり得る。いくつかの実施形態では、ＳＡ２１ペプチドは、本開示のＣＤＰ（例えば、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか）にコンジュゲートまたは融合され得る。ＳＡ２１融合ペプチドは、本明細書で開示されるＳＡ２１ＴｆＲ結合ペプチド複合体（例えば、配列番号１８１または配列番号１８４）を含み得る。ＳＡ２１ペプチドは、１つ以上のペプチドへのコンジュゲーション、またはその間の融合のためのリンカー配列を含み得る（例えば、配列番号１７９、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）。例示的なＳＡ２１ペプチド、融合ペプチド、及びリンカーは、表５に提供される。対照ＳＡ２１融合ペプチドは、ＳＡ２１に融合された対照ペプチド（例えば、配列番号１８０（ＧＳＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＣＬＰＰＧＫＰＣＹＧＡＴＱＫＩＰＣＣＧＶＣＳＨＮＮＣＴ）、配列番号１８３（ＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＣＬＰＰＧＫＰＣＹＧＡＴＱＫＩＰＣＣＧＶＣＳＨＮＮＣＴ）、配列番号１８２（ＧＳＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＲＩＰＶＳＣＫＨＳＧＱＣＬＫＰＣＫＤＡＧＭＲＦＧＫＣＭＮＧＫＣＤＣＴＰＫ）、または配列番号１８５（ＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＲＩＰＶＳＣＫＨＳＧＱＣＬＫＰＣＫＤＡＧＭＲＦＧＫＣＭＮＧＫＣＤＣＴＰＫ））を含み得る。さらに、Ｃｙ５．５などの近赤外色素、またはＡｌｂｕタグなどのアルブミン結合因子へのペプチドのコンジュゲーションは、本明細書に記載の任意のペプチドの血清半減期を延長することができる。いくつかの実施形態では、免疫原性は、最小限の非ヒトタンパク質配列を使用することによって低減され、ペプチドの血清半減期が延長される。

いくつかの実施形態では、配列番号１～配列番号６４の最初の２個のＮ末端アミノ酸（ＧＳ）は、別の分子へのコンジュゲーションまたは融合を促進し、かつこのようなコンジュゲート、連結、または融合された分子からの切断を促進するためのスペーサーまたはリンカーの役割を果たす。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質またはペプチドは、例えば、ペプチドの特性を改変または変化させ得る他の部分にコンジュゲート、連結、または融合され得る。

いくつかの実施形態では、本開示のペプチドまたはペプチド複合体はまた、他の親和性ハンドルにコンジュゲート、連結、または融合され得る。他の親和性ハンドルは、遺伝子融合親和性ハンドルを含み得る。遺伝子融合親和性ハンドルは、６ｘＨｉｓ（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１４２）またはＧＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号２２８）；固定化金属アフィニティーカラム精製が可能）、ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１４３）；抗ＦＬＡＧ免疫沈降）、「短い」ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＥ（配列番号１４４）；抗ＦＬＡＧ免疫沈降）、ヘマグルチニン（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号１４５）；抗ＨＡ免疫沈降）、及びストレプトアビジン結合ペプチド（ＤＶＥＡＷＬＧＡＲ（配列番号１４６）；ストレプトアビジン媒介性沈殿）を含み得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドまたはペプチド複合体はまた、タンパク質発現及び／または精製を改善する発現タグまたは配列にコンジュゲート、連結、または融合され得る。そのような発現タグは、遺伝子融合発現タグを含み得る。遺伝子融合発現タグは、シデロカリン（配列番号１４７、ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤＹＫＤＥＨＨＨＨＨＨＧＧＳＱＤＳＴＳＤＬＩＰＡＰＰＬＳＫＶＰＬＱＱＮＦＱＤＮＱＦＱＧＫＷＹＶＶＧＬＡＧＮＡＩＬＲＥＤＫＤＰＱＫＭＹＡＴＩＹＥＬＫＥＤＫＳＹＮＶＴＳＶＬＦＲＫＫＫＣＤＹＷＩＲＴＦＶＰＧＳＱＰＧＥＦＴＬＧＮＩＫＳＹＰＧＬＴＳＹＬＶＲＶＶＳＴＮＹＮＱＨＡＭＶＦＦＫＫＶＳＱＮＲＥＹＦＫＩＴＬＹＧＲＴＫＥＬＴＳＥＬＫＥＮＦＩＲＦＳＫＳＬＧＬＰＥＮＨＩＶＦＰＶＰＩＤＱＣＩＤＧＧＧＳＥＮＬＹＦＱ）を含み得る。

さらに、１つを超えるペプチド配列（例えば、毒素またはノット毒液タンパク質に由来するペプチド）が特定のペプチドに存在するか、コンジュゲートされるか、連結されるか、または融合され得る。ペプチドは、さまざまな技術によって、生体分子に組み込むことができる。ペプチドは、アミド結合などの共有結合の形成などの化学変換によって組み込むことができる。ペプチドは、例えば、固相または溶液相ペプチド合成によって組み込むことができる。ペプチドは、生体分子をコードする核酸配列を調製することによって組み込むことができ、核酸配列は、ペプチドをコードする部分配列を含む。部分配列は、生体分子をコードする配列に付加されてもよいし、または生体分子をコードする配列の部分配列に代えてもよい。

選択的枯渇複合体
いくつかの実施形態では、本開示の１つ以上のペプチドは、選択的枯渇複合体（ＳＤＣ）を形成することができる。選択的枯渇複合体は、標的分子に結合する標的結合ペプチドと細胞受容体（例えば、細胞表面受容体）に結合する受容体結合ペプチドとを含み得る。いくつかの実施形態では、細胞表面受容体は、エンドサイトーシスされる受容体である（例えば、トランスフェリン受容体またはプログラム死リガンド１）。いくつかの実施形態では、細胞表面受容体は、エンドサイトーシス後に細胞表面に再循環される受容体である。本開示の受容体結合ペプチドは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）結合ペプチドまたはプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合ペプチドであり得る。例えば、選択的枯渇複合体は、ＴｆＲ結合ペプチド及び標的結合ペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、受容体結合ペプチド（例えば、ＴｆＲ結合ペプチドまたはＰＤ－Ｌ１結合ペプチド）と標的結合ペプチドは、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して接続され得る。いくつかの実施形態では、受容体結合ペプチドと標的結合ペプチドは、リンカーなしで直接接続することができる。いくつかの実施形態では、受容体結合ペプチドと標的結合ペプチドは、ヘテロ二量体化ドメインを介して接続することができる。受容体結合ペプチドは、細胞外ｐＨ（約ｐＨ７．４など）とエンドソームｐＨ（約ｐＨ５．５など）の両方で高い親和性で受容体（例えば、ＴｆＲまたはＰＤ－Ｌ１）に結合することができる。いくつかの実施形態では、選択的枯渇複合体の受容体結合ペプチドは、ＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか１つ）であり得る。いくつかの実施形態では、選択的枯渇複合体の受容体結合ペプチドは、ＰＤ－Ｌ１結合ペプチド（例えば、配列番号１８７、配列番号２３３～配列番号２３９、配列番号４００～配列番号４５６、または配列番号１４１のいずれか１つ）であり得る。

標的結合ペプチドは、ｐＨ依存性の親和性で標的分子に結合することができる。例えば、標的結合分子は、細胞外ｐＨ（約ｐＨ７．４）ではより高い親和性で、より低いエンドソームｐＨ（約ｐＨ５．５または約ｐＨ６．５など）ではより低い親和性で標的分子に結合することができる。いくつかの実施形態では、標的結合分子は、エンドソーム区画への内在化及びエンドソームの酸性化の際に標的分子を放出することができる。エンドソームの酸性化の際のそのような標的分子の放出は、約ｐＨ７．３、ｐＨ７．２、ｐＨ７．１、ｐＨ７．０、ｐＨ６．９、ｐＨ６．８、ｐＨ６．７、ｐＨ６．６、ｐＨ６．５、ｐＨ６．４、ｐＨ６．３、ｐＨ６．２、ｐＨ６．１、ｐＨ６．０、ｐＨ５．９、ｐＨ５．８、ｐＨ５．７、ｐＨ５．６、ｐＨ５．５、ｐＨ５．４、ｐＨ５．３、ｐＨ５．２、ｐＨ５．１、ｐＨ５．０、ｐＨ４．９、ｐＨ４．８、ｐＨ４．７、ｐＨ４．６、ｐＨ４．５、またはそれ以下で起こり得る。いくつかの実施形態では、標的分子の放出は、約ｐＨ７．０～約ｐＨ４．５、約ｐＨ６．５～約ｐＨ５．０、または約ｐＨ６．０～約ｐＨ５．５のｐＨで起こり得る。いくつかの実施形態では、受容体結合ペプチドは、ｐＨ非依存性結合（例えば、細胞外ｐＨでの高親和性及びエンドソームｐＨでの高親和性）で、受容体（例えば、再循環を受ける受容体）に結合し、標的結合ペプチドは、ｐＨ依存性結合（例えば、細胞外ｐＨで高親和性、エンドソームｐＨで低親和性）で標的に結合する。ｐＨ非依存性受容体結合ペプチドとｐＨ依存性標的結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体（ＳＤＣ）は、触媒的であり得る（例えば、再使用される）。ＳＤＣは、エンドサイトーシスの複数のラウンドを通じて受容体に結合したままになり得、それぞれのラウンドで別の標的分子を運搬し、分解のためにエンドソーム／リソソームに標的分子を残し得る。したがって、１つの触媒的ＳＤＣ分子が複数の標的分子の分解を引き起こし得る。

いくつかの実施形態では、受容体結合ペプチドは、ｐＨ依存性の親和性で受容体に結合することができる。例えば、受容体結合分子は、細胞外ｐＨ（約ｐＨ７．４など）ではより高い親和性で受容体に結合することができ、より低いエンドソームｐＨ（約ｐＨ５．５またはｐＨ６．５など）ではより低い親和性で受容体に結合することができ、それによって、エンドソーム区画の内在化及び酸性化の際に、受容体から選択的枯渇複合体を放出する。いくつかの実施形態では、受容体結合ペプチドは、ｐＨ依存性の親和性で受容体に結合することができ、標的結合ペプチドは、ｐＨ依存性またはｐＨ非依存性の親和性で標的に結合することができる。選択的枯渇分子を使用して、標的分子（例えば、可溶性タンパク質または細胞表面タンパク質）を選択的に枯渇させることができる。例えば、受容体結合ペプチドと標的結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体は、受容体結合ペプチドを介して受容体に、及び標的分子（例えば、可溶性タンパク質または細胞表面タンパク質）に結合することができる。標的分子は、受容体及び選択的枯渇分子の受容体媒介性エンドサイトーシスを介してエンドサイトーシス区画に送達され得る。エンドサイトーシス区画では、選択的枯渇複合体が受容体に結合したままになり、エンドサイトーシス区画が酸性化するにつれて標的分子が選択的枯渇複合体から放出される。選択的枯渇分子は、受容体とともに細胞表面に再循環される可能性があり、標的分子は分解されるリソソームに進むことができる。いくつかの実施形態では、標的分子は、分解されることなくリソソーム内に留まることができ、その結果、リソソーム内の標的分子が濃縮される。本開示の選択的枯渇複合体は、標的結合抗体と比較して低分子量を有することができ、供給及び流通コールドチェーンを必要とせずに標的を結合及び枯渇させるために使用することができる。

いくつかの実施形態では、受容体結合ペプチド（ＴｆＲ結合ペプチドまたはＰＤ－Ｌ１結合ペプチド）は、５０μＭ未満、５μＭ未満、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、０．３ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、または０．１ｎＭ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）で細胞受容体（例えば、ＴｆＲまたはＰＤ－Ｌ１）に結合することができる。いくつかの実施形態では、受容体結合ペプチドは、受容体結合ペプチドが再循環プロセス中に受容体に結合したままである可能性が高いように、細胞受容体の再循環速度よりも遅いオフ速度を有する。いくつかの実施形態では、受容体結合ペプチドは、１分以内、２分以内、３分以内、４分以内、５分以内、７分以内、１０分以内、１５分以内、または２０分以内のオフ速度を有し得る。いくつかの実施形態では、受容体結合ペプチドは、約１分～約２０分間、約２分間～約１５分間、約２分間～約１０分間、または約５分間～約１０分間のオフ速度を有し得る。

本開示の選択的枯渇複合体は、疾患または状態に関連する標的分子を選択的に枯渇させることによって、疾患または状態を治療するために使用することができる。例えば、選択的枯渇複合体を使用して、蓄積するか、疾患関連変異（例えば、構成的活性、治療に対する抵抗性、またはドミナントネガティブ活性を引き起こす変異）を含むか、または疾患状態で過剰発現される、可溶性タンパク質または細胞表面タンパク質を選択的に枯渇させることができる。いくつかの実施形態では、本開示の選択的枯渇複合体は、非限定的に、てんかん、統合失調症、鬱病、不安、双極性障害、脳発達障害（例えば、自閉症スペクトラム）、または気分障害を含むさまざまな神経疾患の治療及び予防に使用することができる。

本明細書に記載の選択的枯渇複合体（例えば、ペプチドコンジュゲート、融合ペプチド、または組換え産生されたペプチド複合体）がＴｆＲに結合し、その後、細胞層もしくはＢＢＢなどの障壁を越えて（例えば、小胞性トランスサイトーシスを介して）または細胞膜を越えて（例えば、エンドサイトーシスを介して）輸送されることは、神経変性に関連する多数の疾患、状態、または障害に影響を及ぼし得る。本明細書に記載の選択的枯渇複合体によって予防することができる神経変性疾患としては、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ運動失調症、ハンチントン病、レビー小体病、パーキンソン病、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、脊髄性筋萎縮症、運動ニューロン疾患、ライム病、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体優性小脳失調症、バッテン病、大脳皮質基底核症候群、クロイツフェルト・ヤコブ病、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群、クフォー・ラケブ症候群、マシャド・ジョセフ病、多発性硬化症、慢性外傷性脳症、または前頭側頭型認知症を挙げることができる。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ペプチドは、神経変性疾患を治療及び／または予防するために、ＢＡＣＥ阻害薬である、ガランタミン、アマンタジン、ベンザトロピン、ビペリデン、ブロモクリプチン、カルビドパ、ドネペジル、エンタカポン、レボドパ、ペルゴリ、プラミペキソール、プロシクリジン、リバスチグミン、ロピニロール、セレギリン、タクリン、トルカポン、またはトリヘキシフェニジルと組み合わせて使用することができる。例えば、神経変性に関連するタンパク質（例えば、ｔａｕ、アミロイドβ（Ａβ）、ハンチンチン、またはα－シヌクレイン）に結合する標的結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体を使用して、神経変性疾患を治療することができる。

本明細書に記載の選択的枯渇複合体（例えば、ペプチドコンジュゲート、融合ペプチド、または組換え産生されたペプチド複合体）がＴｆＲに結合し、その後、細胞層もしくはＢＢＢなどの障壁を越えて（例えば、小胞性トランスサイトーシスを介して）または細胞膜を越えて（例えば、エンドサイトーシスを介して）輸送されることは、種々のがんに影響を及ぼし得る。本明細書に記載の選択的枯渇複合体によって治療または予防できるがんとしては、乳癌、肝癌、結腸癌、脳癌、白血病、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄腫、血球由来がん、脾臓癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、肉腫、胃癌、食道癌、胃腸（ＧＩ）癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、膀胱癌、唾液腺の癌、腎臓癌、筋肉癌、卵巣癌、膠芽細胞腫、星状細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢癌、正中膠腫、びまん性内在性橋膠腫、肺癌、骨髄細胞癌、または皮膚癌、黒色腫、泌尿生殖器癌、骨肉腫、筋肉由来肉腫、黒色腫、頭頸部癌、神経芽細胞腫、膠芽細胞腫、星状細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢癌、正中膠腫、及びびまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）、またはＣＭＹＣ過剰発現がんが挙げられ得る。例えば、がんに関連するタンパク質（例えば、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＶＥＧＦ、ＰＤ－１、ＣＤ３８、ＧＤ２、ＳＬＡＭＦ７、ＣＴＬＡ－４、ＣＣＲ４、ＣＤ２０、ＰＤＧＦＲα、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ｂ、ネクチン－４、またはＴＲＯＰ２）に結合する標的結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体は、がんの治療に使用できる。いくつかの実施形態では、がんの治療のための選択的枯渇複合体は、細胞増殖、細胞分裂、細胞死の回避、免疫回避、炎症応答の抑制、血管成長の促進、または低酸素症からの保護に関連する細胞外タンパク質、可溶性タンパク質、または細胞表面タンパク質に結合する標的結合ペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示の選択的枯渇複合体を使用して、抗炎症刺激（例えば、Ｎ２分極マクロファージに関連する分子またはミクログリアまたは制御性Ｔ細胞に関連する分子）を枯渇させ、自然免疫と適応免疫システムの能力の腫瘍標的化能力を促進することができる。抗炎症刺激に関連する分子に結合する標的結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体は、そうでなければ免疫疲弊しやすい治療法（電離放射線またはＣＡＲ－Ｔ細胞療法など）を増強することができる。

いくつかの実施形態では、選択的枯渇複合体は、免疫介在性疾患などにおいて、免疫抑制を減少させるか、または炎症誘発性シグナル伝達を抑制するために使用され得る。例えば、選択的枯渇複合体は、免疫抑制または炎症誘発性シグナル伝達に関連するタンパク質（例えば、ＣＤ４７、ＣＤ３９、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ７４、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１、ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－２３、ＩＬ－１２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１）に結合する標的結合ペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、選択的枯渇複合体は、炎症性または神経学的状態（例えば、神経炎症、神経炎症性疾患、脳卒中、外傷性脳傷害、アルツハイマー病、または神経原線維変化型認知症、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、加齢関連タウアストログリオパチー、前頭側頭型認知症、パーキンソン症候群、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、リチコボーディグ病、神経節膠腫、髄膜血管腫症、または亜急性硬化症全脳炎を含むその他のタウオパシー）を治療するために使用され得る。例えば、ＴＮＦ－α結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体を使用して、神経炎症、神経炎症性疾患、脳卒中、外傷性脳損傷、またはアルツハイマー病を治療することができる。

本明細書に記載の選択的枯渇複合体（例えば、ペプチドコンジュゲート、融合ペプチド、または組換え産生されたペプチド複合体）がＴｆＲに結合し、その後、細胞層もしくはＢＢＢなどの障壁を越えて（例えば、小胞性トランスサイトーシスを介して）または細胞膜を越えて（例えば、エンドサイトーシスを介して）輸送されることは、有害な炎症に関連する多数の疾患、状態、または障害に影響を及ぼし得る。本明細書に記載の選択的枯渇複合体で治療または予防できる有害な炎症としては、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、ループス、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、痛風、炎症性関節炎中心、筋炎、強皮症、シェーグレン病、血管炎、炎症腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、移植片対宿主病、サイトカインストーム、嚢胞性線維症、炎症関連神経変性（例えば、加齢関連タウオパシーもしくはアルツハイマー病）、または自己免疫疾患が挙げられ得る。例えば、急性炎症または慢性炎症に関連する標的（例えば、アポリポタンパク質Ｅ４、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、及びＩＬ－２３）に結合する標的結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体は、炎症性のサイトカインまたはケモカインを選択的に枯渇させることができる。いくつかの実施形態では、選択的枯渇複合体は、自己抗体、例えば、糖尿病、甲状腺疾患、炎症性疾患、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥまたはループス）、筋肉機能、皮膚疾患、臓器疾患、腎臓疾患、または関節リウマチなどの疾患に関連する自己抗体を標的とすることができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－６に結合する標的結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体を使用して、コロナウイルス感染（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に関連する炎症を治療することができる。ＩＬ－６除去を選択的に枯渇させる選択的枯渇複合体は、ＩＬ－６シグナル伝達を減少させる可能性がある。アポリポタンパク質Ｅ４は、アルツハイマー病に関連している可能性がある。

本明細書に記載の選択的枯渇複合体（例えば、ペプチドコンジュゲート、融合ペプチド、または組換え産生されたペプチド複合体）がＴｆＲに結合し、その後、細胞層もしくはＢＢＢなどの障壁を越えて（例えば、小胞性トランスサイトーシスを介して）または細胞膜を越えて（例えば、エンドサイトーシスを介して）輸送されることは、種々のリソソーム蓄積症に影響を及ぼし得る。本明細書に記載の選択的枯渇複合体で治療または予防できるリソソーム蓄積症としては、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼの欠乏）またはポンペ病（α－グルコシダーゼの欠乏）が挙げられ得る。リソソーム貯蔵酵素は、血清または他の細胞外液中で利用できるように患者に投与することができる。いくつかの実施形態では、本開示の選択的枯渇複合体を使用して、リソソーム酵素をリソソームに選択的に動員し、それによって、リソソーム酵素の発現低下に関連するリソソーム蓄積症を治療することができる。リソソーム酵素（例えば、グルコセレブロシダーゼまたはα－グルコシダーゼ）に結合する標的結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体は、ＴｆＲ媒介エンドサイトーシスを介してエンドサイトーシス区画にリソソーム酵素を選択的に動員することができる。選択的枯渇複合体は細胞表面に再循環でき、リソソーム酵素標的はリソソームに送達され、それによってリソソーム中のリソソーム酵素が濃縮され、リソソーム蓄積症が治療される。

いくつかの実施形態では、選択的枯渇複合体（例えば、標的結合ペプチドと細胞受容体結合ペプチドを含む）または選択的枯渇複合体成分（例えば、標的結合ペプチドまたは細胞受容体結合ペプチドと二量体化ドメインを含む）は、配列番号：２８８～配列番号３１３、配列番号３１５～配列番号３４８、配列番号３５１、配列番号３５２、配列番号３５５、配列番号３５６、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６０、配列番号３６１、配列番号３６２、配列番号３６３、配列番号３６４、配列番号３６５、配列番号３７１、配列番号３７３、配列番号３７６、配列番号３７８、配列番号３８２、配列番号３８４、配列番号３８７、もしくは配列番号３８９、またはその断片のいずれか１つの配列を含み得る。いくつかの実施形態では、選択的枯渇複合体（例えば、標的結合ペプチドと細胞受容体結合ペプチドを含む）は、配列番号９６と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性、または配列番号２８８～配列番号３１３、配列番号３１５～配列番号３４８、配列番号３５１、配列番号３５２、配列番号３５５、配列番号３５６、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６０、配列番号３６１、配列番号３６２、配列番号３６３、配列番号３６４、配列番号３６５、配列番号３７１、配列番号３７３、配列番号３７６、配列番号３７８、配列番号３８２、配列番号３８４、配列番号３８７、もしくは配列番号３８９、またはその断片のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み得る。選択的枯渇複合体及び選択枯渇複合体成分、ならびにそれらの対応する標的または細胞受容体の例を表８に提供する。

配列同一性及び相同性
配列同一性または相同性のパーセント（％）は、従来の方法によって決定される。（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．（１９８６），Ｂｕｌｌ．Ｍａｔｈ．Ｂｉｏ．４８：６０３（１９８６）、及びＨｅｎｉｋｏｆｆａｎｄＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５を参照されたい）。簡潔に述べると、２つのアミノ酸配列は、ギャップ開始ペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ１、ならびにＨｅｎｉｋｏｆｆａｎｄＨｅｎｉｋｏｆｆ（同上）の「ＢＬＯＳＵＭ６２」スコアリングマトリックスを使用して、アライメントスコアを最適化するように整列させることができる。次いで、配列同一性または相同性を次のように算出する：（［同一マッチ総数］／［長いほうの配列の長さ＋２つの配列を整列させるために長いほうの配列に導入したギャップの数］）（１００）。

２つ以上のペプチド間の相同性を決定するには、ＮＣＢＩＢＬＡＳＴ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＭＡＦＦＴ、ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａ、ＡｌｉｇｎＭｅ、Ｐｒａｌｉｎｅ、または別の好適な方法もしくはアルゴリズムなどのさまざまな方法及びソフトウェアプログラムを使用することができる。ペアワイズ配列アライメントは、２つの生物学的配列（例えば、アミノ酸または核酸配列）間の機能的、構造的、及び／または進化的関係を示すことができる類似性の領域を特定するために使用することができる。加えて、多重配列アライメント（ＭＳＡ）は、３つ以上の生物学的配列のアライメントである。ＭＳＡアプリケーションの結果から、相同性が推定され、配列間の進化的関係を評価することができる。本明細書で使用される場合、「配列相同性」及び「配列同一性」及び「配列同一性パーセント（％）」及び「配列相同性パーセント（％）」は、交換可能に使用され、必要に応じて、参照のポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列に対する配列の関連性またはバリエーションを意味する。

さらに、２つのアミノ酸配列を整列させるには、いくつかの確立されたアルゴリズムが利用可能である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの「ＦＡＳＴＡ」類似性検索アルゴリズムは、本明細書で開示されるペプチドのアミノ酸配列とペプチドバリアントのアミノ酸配列とが共有する配列同一性または相同性のレベルを調べるために好適なタンパク質アライメント法であり得る。ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、例えば、ＰｅａｒｓｏｎａｎｄＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）、及びＰｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３（１９９０）によって記載されている。簡潔に述べると、ＦＡＳＴＡは、まず、保存的アミノ酸置換、挿入、または欠失を考慮せずに、クエリー配列（例えば、配列番号１）と、最も高い密度の一致（ｋｔｕｐ変数が１の場合）または一致のペア（ｋｔｕｐ＝２の場合）のいずれかを有する試験配列とによって共有される領域を同定することによって、配列類似性を特徴付ける。次いで、アミノ酸置換マトリックスを使用して、すべてのペア形成アミノ酸の類似性を比較することによって、最も高い密度の一致を有する１０の領域を再スコアリングし、最も高いスコアに寄与する残基だけを含むように、領域の末端を「トリミング」する。「カットオフ」値（配列の長さ及びｋｔｕｐ値に基づいて予め決定された式により算出される）よりも大きいスコアを有する複数の領域がある場合、トリミングされた初期領域を調べることにより、これらの領域を結合して、ギャップのある近似アライメントを形成することができるかどうかを決定する。最後に、２つのアミノ酸配列の最高スコアリング領域を、アミノ酸の挿入及び欠失を許容するＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ－Ｓｅｌｌｅｒｓアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４（１９７０）；Ｓｅｌｌｅｒｓ，ＳｉａｍＪ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２６：７８７（１９７４））の改変を使用して整列する。例えば、ＦＡＳＴＡ解析の例示的なパラメーターは、ｋｔｕｐ＝１、ギャップ開始ペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝１、及び置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２である。これらのパラメーターは、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３（１９９０）の補遺２に説明されるようにして、スコアリング行列ファイル（「ＳＭＡＴＲＩＸ」）を改変することによりＦＡＳＴＡプログラムに導入され得る。

ＦＡＳＴＡはまた、上に開示されている比を使用して、核酸配列または分子の配列同一性または相同性を決定するために使用することもできる。核酸配列を比較する場合、ｋｔｕｐ値は、１～６の範囲、好ましくは、３～６、最も好ましくは、３であり得、他のパラメーターは本明細書に記載のとおりに設定される。

「保存的アミノ酸置換」である一般的なアミノ酸のいくつかの例は、次の群：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、（３）セリン及びトレオニン、（４）アスパラギン酸及びグルタミン酸、（５）グルタミン及びアスパラギン、ならびに（６）リシン、アルギニン及びヒスチジンのそれぞれのうちのアミノ酸間の置換によって例示される。ＢＬＯＳＵＭ６２テーブルは、タンパク質配列セグメントのおよそ２，０００の局所的な多数のアラインメントから導出された、５００以上の関連タンパク質群の高度に保存された領域を表すアミノ酸置換行列である（ＨｅｎｉｋｏｆｆａｎｄＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５（１９９２））。したがって、ＢＬＯＳＵＭ６２置換頻度を使用して、本発明のアミノ酸配列へ導入することができる保存的アミノ酸置換を定義することができる。化学的特性にのみ基づいてアミノ酸置換を設計することも可能であるが（上述のとおり）、「保存的アミノ酸置換」という言葉は、好ましくは、－１よりも大きいＢＬＯＳＵＭ６２値によって表される置換を指す。例えば、アミノ酸置換は、０、１、２、または３のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられる置換である場合、保存的である。このシステムによれば、好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１、２または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられ、より好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも２（例えば、２または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられる。

構造的完全性の維持に重要な領域またはドメイン内のアミノ酸残基の決定を行うことができる。これらの領域のうち、変化に対してある程度の耐性があり、分子の全体的な三次構造を維持することができる特定の残基を決定することができる。配列構造を分析するための方法としては、アミノ酸またはヌクレオチドの同一性または相同性が高い複数の配列のアラインメント、及び利用可能なソフトウェア（例えば、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ．ＲＴＭビューア及び相同性モデリングツール；ＭＳＩ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を使用するコンピュータ分析、二次構造の傾向、バイナリパターン、相補的充填及び埋没極性相互作用が挙げられるがこれらに限定されない（Ｂａｒｔｏｎ，Ｇ．Ｊ．，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：３７２－６（１９９５）、及びＣｏｒｄｅｓ，Ｍ．Ｈ．ｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：３－１０（１９９６））。一般に、分子に対する改変の設計または特定の断片の同定を行う場合、構造の決定は、典型的に、改変された分子の活性を評価することによって達成することができる。

設計された結合ペプチド
本開示のペプチド（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド、標的結合ペプチド、または選択的枯渇複合体）は、ペプチドの特性を改善または変更するように操作することができる。例えば、結合パートナー（例えば、標的分子またはＴｆＲ）に対するペプチドの親和性を変更するために、ペプチドを改変することができる。いくつかの実施形態では、ペプチドを改変して、ｐＨ依存的に結合親和性を変更することができる。ペプチドは、ペプチド配列に１つ以上のアミノ酸のバリエーションを導入し、ペプチド特性（例えば、結合親和性）に対する変異の効果を試験することによって改変することができる。

いくつかの実施形態では、ペプチドまたはペプチドのライブラリは、ノットペプチドの天然に存在する足場から導き出すのではなく、インシリコで設計される。他の実施形態では、ペプチドまたはペプチドのライブラリは、目的のタンパク質または受容体に結合することが知られている天然に存在するペプチドまたはタンパク質に、適切なタンパク質結合残基、またはタンパク質結合界面に保存された残基をグラフト化する誘導によってインシリコで設計される。いくつかの実施形態では、ペプチド（例えば、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４）は、単純なヘリックス・ターン・ヘリックスである。いくつかの実施形態では、ヘリックス・ターン・ヘリックスは、他の足場上にファーマコフォアを移すために使用することができ、例えば、融合タグを使用して、ヘリックス・ターン・ヘリックス足場上に所望のＴｆＲ結合表面を移植することができる。

いくつかの実施形態では、配列番号１を含むペプチドは、付加、欠失、またはアミノ酸置換を含むさらなる改変のための足場またはベース配列として使用される。いくつかの実施形態では、ＧＳなどのアミノ酸残基の短い配列がペプチドのＮ末端に付加される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、Ｎ末端にＧＳを欠く。いくつかの例では、ペプチドは、１つ以上の翻訳後修飾を受ける。

いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合及び細胞膜を越えたトランスサイトーシスが可能なペプチドは、表１に列挙される例示的なペプチド配列（配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、及び配列番号１～配列番号６４）のいずれか１つまたはその機能性断片と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。２つ以上ペプチドは、ある程度の配列同一性または相同性を共有し得、インビボで同様の特性を有し得る。例えば、ペプチドは、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のペプチドのいずれか１つと、ある程度の配列同一性または相同性を共有し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の本開示のペプチドは、最大約２０％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約２５％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約３０％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約３５％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約４０％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約４５％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約５０％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約５５％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約６０％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約６５％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約７０％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約７５％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約８０％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約８５％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約９０％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約９５％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約９６％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約９７％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約９８％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約９９％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、最大約９９．５％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性、または最大約９９．９％のペアワイズ配列同一性もしくは相同性を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上の本開示のペプチドは、第２のペプチドと、少なくとも約２０％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約２５％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約３０％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約３５％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約４０％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約４５％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約５０％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約５５％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約６０％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約６５％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約７０％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約７５％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約８０％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約８５％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約９０％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約９５％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約９６％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約９７％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約９８％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約９９％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約９９．５％のペアワイズ配列同一性または相同性、少なくとも約９９．９％のペアワイズ配列同一性または相同性を有する。

いくつかの実施形態では、ＴｆＲ受容体結合の改善を示すペプチドは、トランスサイトーシス機能の改善を示す。場合によっては、ＴｆＲ受容体結合の改善を示すペプチドは、トランスサイトーシス機能に変化が全くないか、または小さな変化を示す。場合によっては、ＴｆＲ受容体結合の改善を示すペプチドは、トランスサイトーシス機能の低下を示す。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ペプチドのＫ_Ａ値及びＫ_Ｄ値を調節及び最適化して（例えば、アミノ酸置換を介して）、ＴｆＲ結合親和性と効率的なトランスサイトーシス機能の最適な比率をもたらすことができる。

いくつかの例では、ペプチドまたはペプチド複合体は、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、もしくは配列番号１～配列番号６４のいずれか１つ、またはその機能性断片である。他の実施形態では、本開示のペプチドまたはペプチド複合体は、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、もしくは配列番号１～配列番号６４のいずれか１つまたはその機能性断片に対して、９９％、９５％、９０％、８５％、または８０％の配列同一性または相同性を有するペプチドをさらに含む。

他の例において、ペプチドまたはペプチド複合体は、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、もしくは配列番号１～配列番号６４のいずれか１つまたはその機能性断片に対して相同であるペプチドであり得る。本明細書にさらに記載されるように、「相同」という用語は、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、もしくは配列番号１～配列番号６４のいずれか１つまたはその機能性断片の配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の配列同一性または相同性を有するペプチドまたはペプチド複合体を示すために本明細書で使用され得る。種々の実施形態では、断片は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、または少なくとも１０００のアミノ酸の長さであり得る。種々の実施形態では、断片は、最大１０００、最大９００、最大８００、最大７００、最大６００、最大５００、最大４５０、最大４００、最大３５０、最大３００、最大２５０、最大２００、最大１５０、最大１００、最大５０、最大２５、最大１０、または最大５アミノ酸の長さであり得る。いくつかの実施形態では、断片は、約５～約５０、約１０～約５０、約１０～約４０、約１０～約３０、または約１０～約２０アミノ酸の長さであり得る。

さらに他の例において、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか１つのペプチドまたはペプチド複合体をコードする核酸分子は、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか１つのアミノ酸配列を有するコードされたペプチドアミノ酸配列の配列同一性もしくは相同性の決定によって、または核酸ハイブリダイゼーションアッセイによって、同定することができる。配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか１つのそのようなペプチドバリアントまたはペプチド複合体バリアントは、（１）０．１×－０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０～６５℃に相当する洗浄ストリンジェンシーの高ストリンジェントな洗浄条件下において、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか１つのヌクレオチド配列を有する核酸分子（またはその相補体）とハイブリダイズ状態を維持し、かつ（２）配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の配列同一性または相同性を有するペプチドをコードする、核酸分子として特徴付けることができる。

親和性成熟
本開示のペプチド（例えば、標的結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、または選択的枯渇複合体）は、親和性成熟によって同定または改変することができる。例えば、目的の標的に結合する標的結合ペプチドは、結合ペプチド（例えば、ＣＤＰ、ナノボディ、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、センチリン、ナノフィッチン、アドネクチン、または抗体断片）の親和性成熟によって同定することができる。結合ペプチドは、可能性のあるすべての点変異のライブラリを生成することによって、またはＣＤＰの場合はすべての可能な非システイン点変異のライブラリを生成することにより、親和性成熟を受けることができる。バリアントライブラリは、表面ディスプレイを介して（例えば、酵母または哺乳動物細胞で）発現させ、結合パートナー（例えば、標的分子またはＴｆＲ）への結合についてスクリーニングすることができる。開始のペプチドと比較して、またはバリアントライブラリの他のメンバーと比較して結合親和性が増加したライブラリメンバーは、その後の成熟ラウンドを受けることができる。それぞれのラウンド中に、考えられるすべての非システイン点変異のバリアントライブラリが生成され、スクリーニングされる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、目的の結合パートナー（例えば、標的分子またはＴｆＲ）への結合親和性が改善したペプチドを同定するために、１ラウンド、２ラウンド、３ラウンド、４ラウンド、５ラウンド、６ラウンド、７ラウンド、８ラウンド、９ラウンド、または１０ラウンドの親和性成熟を受け得る。バリアントは、サンガー配列決定、次世代配列決定、またはハイスループット配列決定（例えば、イルミナ配列決定）によって同定できる。

いくつかの実施形態では、ペプチド（例えば、ＴｆＲ結合ペプチドまたは標的結合ペプチド）をｐＨ非依存性結合について選択することができる。例えば、ペプチドは、細胞外ｐＨ（約ｐＨ７．４）とエンドソームｐＨ（約ｐＨ５．５など）の両方で結合パートナー（例えば、標的分子またはＴｆＲ）に高親和性結合するように選択することができる。ｐＨ非依存性結合を有するペプチドは、細胞外ｐＨ（約ｐＨ７．４）で、５０μＭ未満、５μＭ未満、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、０．３ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、または０．１ｎＭ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）で結合パートナーに結合することができる。いくつかの実施形態では、ｐＨ依存性結合を有する標的結合ペプチドは、エンドソームｐＨ（約ｐＨ５．５など）で、５０μＭ未満、５μＭ未満、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、０．３ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、または０．１ｎＭ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）で標的分子に結合することができる。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ペプチドは、エンドソームｐＨで安定であり、例えば、ｐＨ６．９、ｐＨ６．８、ｐＨ６．７、ｐＨ６．６、ｐＨ６．５、ｐＨ６．４、ｐＨ６．３、ｐＨ６．２、ｐＨ６．１、ｐＨ６．０、ｐＨ５．９、ｐＨ５．８、ｐＨ５．７、ｐＨ５．６、ｐＨ５．５、ｐＨ５．４、ｐＨ５．３、ｐＨ５．２、ｐＨ５．１、ｐＨ５．０、ｐＨ４．９、ｐＨ４．８、ｐＨ４．７、ｐＨ４．６、ｐＨ４．５、またはそれ以下などの酸性条件下ではエンドソーム内で放出しない。逆に、選択された標的に結合するための高い親和性を有し、そのような選択された標的に結合し、細胞内での分解のためにエンドソームで放出されるペプチドまたはペプチド複合体として選択的枯渇複合体で使用されるペプチドは、エンドソーム内で放出されるようなｐＨ依存性標的結合ＣＤＰであり得る。いくつかの実施形態では、標的結合ペプチドは、エンドソームｐＨで、例えば、ｐＨ７．３、ｐＨ７．２、ｐＨ７．１、ｐＨ７．０、ｐＨ６．９、ｐＨ６．８、ｐＨ６．７、ｐＨ６．６、ｐＨ６．５、ｐＨ６．４、ｐＨ６．３、ｐＨ６．２、ｐＨ６．１、ｐＨ６．０、ｐＨ５．９、ｐＨ５．８、ｐＨ５．７、ｐＨ５．６、ｐＨ５．５、ｐＨ５．４、ｐＨ５．３、ｐＨ５．２、ｐＨ５．１、ｐＨ５．０、ｐＨ４．９、ｐＨ４．８、ｐＨ４．７、ｐＨ４．６、ｐＨ４．５、またはそれ以下などの酸性条件下のエンドソームで、安定性が低く、全体または一部が放出される。

ｐＨ依存性結合
本開示のペプチド（例えば、標的結合ペプチドまたはＴｆＲ結合ペプチド）は、ｐＨ依存性結合特性のために改変することができる。標的結合ペプチド（例えば、標的結合ＣＤＰ）へのｐＨ依存性結合の付与は、３段階で行うことができる。まず、ヒスチジン（Ｈｉｓ）点変異を含むペプチドバリアントのライブラリを設計できる。ヒスチジンアミノ酸は、Ｈｉｓが中性（ｐＨ７．４）と酸性（ｐＨ＜６）エンドソーム条件の間のｐＫ_ａ値を有する側鎖を持つ唯一の天然アミノ酸であるため、標的結合ペプチドに導入され、ｐＨが変化するにつれてのこの電荷の変化は、直接的（例えば、低ｐＨでの正電荷形成時の電荷－電荷相互作用の変化）に、または間接的（例えば、電荷の変化が標的結合ペプチドの構造に微妙な変化を与え、標的分子と標的結合ペプチド間の界面を破壊する）に、結合を変化させることができる。いくつかの実施形態では、二重Ｈｉｓドープライブラリを生成することによって、標的結合ペプチドのバリアントスクリーニングを実施することができる。例えば、標的結合ＣＤＰの二重Ｈｉｓドープライブラリは、すべての非Ｃｙｓ、非Ｈｉｓ残基が一度に１つまたは２つのＨｉｓアミノ酸で置換されているライブラリを含むことができる。バリアントライブラリは、表面ディスプレイを介して細胞（例えば、酵母細胞または哺乳動物細胞）で発現させることができ、それぞれの標的結合ペプチドバリアントは１個または２個のＨｉｓ置換を含む。中性ｐＨ（約ｐＨ７．４）下での結合の維持、及び低ｐＨ（約ｐＨ６．０または約ｐＨ５．５）下での結合の減少について、標的結合ペプチドバリアントを試験することができる。中性ｐＨと比較して低ｐＨ下で結合親和性の低下を示したバリアントは、ｐＨ依存性結合を有する標的結合ペプチドとして同定できる。

いくつかの実施形態では、本開示の標的結合ペプチド（例えば、ヒスチジン含有またはヒスチジンリッチの標的結合ペプチド）は、生理学的な細胞外ｐＨで高い標的結合親和性を有するが、５．５のエンドソームｐＨなどの低いｐＨレベルでは、結合親和性が著しく低下し得る。場合によっては、本開示の標的結合ペプチドは、高い標的結合能力を保持しながら、小胞内（例えば、エンドソーム内）及び／または細胞内の送達機能を改善するために最適化され得る。場合によっては、ヒスチジンスキャン及び比較結合実験を実施して、そのようなペプチドを開発及びスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態では、本開示のペプチド中のアミノ酸残基は、標的分子へのｐＨ依存性結合親和性を変更するために、異なるアミノ酸残基で置換される。アミノ酸置換は、低いｐＨにおける結合親和性を増加させること、高いｐＨにおける結合親和性を増加させること、低いｐＨにおける結合親和性を減少させること、高いｐＨにおける結合親和性を減少させること、またはこれらの組み合わせをなし得る。

いくつかの実施形態では、ｐＨ依存性結合を有する標的結合ペプチドは、細胞外ｐＨ（約ｐＨ７．４など）で、５０μＭ未満、５μＭ未満、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、０．３ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、または０．１ｎＭ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）で標的分子に結合することができる。いくつかの実施形態では、ｐＨ依存性結合を有する標的結合ペプチドは、エンドソームｐＨ（約ｐＨ５．５など）で、少なくとも１ｎＭ、少なくとも２ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも２０ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも２００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも２μＭ、少なくとも５μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも２０μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも１００μＭ、少なくとも５００μＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも２ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも２００ｍＭ、少なくとも５００ｍＭ、または少なくとも１Ｍの解離定数（Ｋ_Ｄ）で、標的分子に結合することができる。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ペプチドは、エンドソームｐＨで安定であり、例えば、ｐＨ６．９、ｐＨ６．８、ｐＨ６．７、ｐＨ６．６、ｐＨ６．５、ｐＨ６．４、ｐＨ６．３、ｐＨ６．２、ｐＨ６．１、ｐＨ６．０、ｐＨ５．９、ｐＨ５．８、ｐＨ５．７、ｐＨ５．６、ｐＨ５．５、ｐＨ５．４、ｐＨ５．３、ｐＨ５．２、ｐＨ５．１、ｐＨ５．０、ｐＨ４．９、ｐＨ４．８、ｐＨ４．７、ｐＨ４．６、ｐＨ４．５、またはそれ以下などの酸性条件下ではエンドソーム内で放出しない。逆に、選択された標的に結合するための高い親和性を有し、そのような選択された標的に結合し、細胞内での分解のためにエンドソームで放出されるペプチドまたはペプチド複合体として選択的枯渇複合体で使用されるペプチドは、エンドソーム内で放出されるようなｐＨ依存性標的結合ＣＤＰであり得る。いくつかの実施形態では、標的結合ペプチドは、エンドソームｐＨで安定性が低くなり、例えば、ｐＨ７．３、ｐＨ７．２、ｐＨ７．１、ｐＨ７．０、ｐＨ６．９、ｐＨ６．８、ｐＨ６．７、ｐＨ６．６、ｐＨ６．５、ｐＨ６．４、ｐＨ６．３、ｐＨ６．２、ｐＨ６．１、ｐＨ６．０、ｐＨ５．９、ｐＨ５．８、ｐＨ５．７、ｐＨ５．６、ｐＨ５．５、ｐＨ５．４、ｐＨ５．３、ｐＨ５．２、ｐＨ５．１、ｐＨ５．０、ｐＨ４．９、ｐＨ４．８、ｐＨ４．７、ｐＨ４．６、ｐＨ４．５、またはそれ以下などの酸性条件下でエンドソーム内ですべてまたは一部を放出する。

選択的枯渇複合体の使用方法
本開示の選択的枯渇複合体を使用して、細胞、組織、または対象に効果を及ぼすことができる。効果は、治療効果、薬理学的効果、生物学的効果、または生化学的効果であり得る。いくつかの実施形態では、効果は、選択的枯渇複合体が結合する標的分子の選択的枯渇から生じ得る。いくつかの実施形態では、効果は、標的、受容体、及び標的と受容体を結合する選択的枯渇複合体との間の三元複合体形成から生じ得る。

標的分子の選択的枯渇
本明細書に記載されるのは、本開示の組成物（例えば、選択的枯渇複合体）を使用して標的分子を選択的に枯渇させる方法である。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、トランスフェリン受容体媒介エンドサイトーシスを介して分子をエンドサイトーシス区画に選択的に動員することと、リソソーム中の標的分子を濃縮することとを含み得る。選択的枯渇複合（例えば、標的結合ペプチドにコンジュゲートされた受容体結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体）は、受容体結合ペプチドを介して受容体に、及び標的分子（例えば、可溶性タンパク質、細胞外タンパク質、または細胞表面タンパク質）に結合することができる。標的分子は、受容体及び選択的枯渇分子の受容体媒介性エンドサイトーシスを介してエンドサイトーシス区画に送達され得る。エンドサイトーシス区画では、選択的枯渇複合体が受容体に結合したままになり、エンドサイトーシス区画が酸性化するにつれて標的分子が選択的枯渇複合体から放出される。選択的枯渇分子は、受容体とともに細胞表面に再循環される可能性があり、標的分子は分解されるリソソームに進むことができる。いくつかの実施形態では、標的分子は、分解されることなくリソソーム内に留まることができ、その結果、リソソーム蓄積症におけるリソソーム酵素などのリソソーム内の標的分子が濃縮される。

標的分子を選択的に枯渇させるため、またはリソソーム中の標的分子を選択的に濃縮するための本開示の方法は、標的分子に関連する疾患または状態を治療するために使用することができる。例えば、神経変性に関連する標的分子の選択的枯渇を使用して、神経変性疾患を治療することができる。別の例では、がんに関連する標的分子の選択的枯渇を使用して、がんを治療することができる。細胞表面分子が枯渇すると、がん細胞が免疫系の標的となり得、チェックポイント阻害が失われ得、生存シグナル伝達が無効になり得、薬剤耐性ポンプを除去することができる。別の例では、炎症性分子の選択的枯渇を使用して、有害な炎症シグナル伝達を治療することができる。別の例では、リソソーム蓄積症に関連するリソソーム酵素のリソソームにおける選択的濃縮を使用して、リソソーム蓄積症を治療することができる。この例では、リソソーム酵素は、標的枯渇複合体がリソソーム酵素をリソソーム区画に追いやるような、標的枯渇複合体との併用療法で投与することができる。疾患または状態を治療する方法は、細胞（例えば、受容体を発現する細胞）を本開示の選択的枯渇複合体と接触させることを含み得る。いくつかの実施形態では、選択的枯渇複合体は、疾患または状態（例えば、神経変性疾患、がん、有害な炎症、またはリソソーム蓄積症）を有する対象（例えば、ヒト対象）に投与することができる。

すべての哺乳動物細胞は鉄を必要とするため、この構成経路を通じてトランスフェリンを取り込むため、ＴｆＲは遍在するタンパク質である。このメカニズムにより、実質的に任意の標的組織が、ＴｆＲ結合ペプチドを含む本開示の選択的枯渇方法または選択的濃縮方法の影響を受けやすいであろう。腫瘍組織は、ほとんどの腫瘍が、選択的枯渇分子において天然の腫瘍選択性を与えることができるＴｆＲが濃縮されているため、本開示の方法に特に適していることができる。

肝臓組織もＴｆＲが高度に濃縮されていることができるため、選択的枯渇法に適した組織となり得る。いくつかの実施形態では、本開示の選択的枯渇複合体（例えば、ＣＤＰを含む選択的枯渇複合体）は、肝臓において長期間安定であり得る。例えば、本開示の選択的枯渇複合体は、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、または少なくとも約１０時間の肝臓における半減期を有することができる。クラスとしてすでに大部分が肝代謝の対象となっている血清タンパク質は、比較的低用量の選択的枯渇複合体による選択的枯渇の標的となり得る。本開示の選択的枯渇複合体の血清半減期は、例えば血清半減期延長ペプチドの付加により、低頻度の投薬を必要とする分子を作製するために改善され得る。半減期が短い選択的枯渇複合体は、例えば有害な炎症性シグナル伝達を治療するための急性標的除去薬として機能し得る。

選択的枯渇複合体は、対象に全身的または末梢的に投与することができ、高レベルのＴｆＲ発現を有する組織（例えば、腫瘍組織、腎臓組織、脾臓、骨髄、または肝臓組織）に蓄積することができる。いくつかの実施形態では、選択的枯渇複合体は、対象に全身的または末梢的に投与することができ、腎臓組織または肝臓組織に蓄積することができる。いくつかの実施形態では、選択的枯渇複合体は、組織標的化ドメインを含むことができ、対象への投与時に標的組織に蓄積することができる。例えば、選択的枯渇複合体は、目的の細胞または当該細胞の表面または内部に位置する標的タンパク質に対するターゲティングまたはホーミング機能を有する分子（例えば、小分子、ペプチド、またはタンパク質）にコンジュゲート、連結、または融合することができる。いくつかの実施形態では、選択的枯渇複合体は対象に経口投与することができ、消化管に到達することができる。経口投与された選択的枯渇複合体は、消化管内の疾患関連タンパク質のクリアランスに使用できる。

いくつかの実施形態では、本開示の選択的枯渇複合体は、分泌表現型を有する良性細胞に遺伝的にコードされ得る。選択的枯渇複合体は、分泌細胞によって発現され得、局所細胞療法において分泌分子として投与され得る。いくつかの実施形態では、選択的枯渇複合体をコードする遺伝子は、遺伝子療法として、目的の組織（例えば、肝臓、造血、腎臓、皮膚、腫瘍、中枢神経系（ＣＮＳ）、またはニューロン）に送達することができる。

いくつかの実施形態では、選択的枯渇構築物の標的結合ペプチドは、ミニタンパク質、ナノボディ、抗体、ＩｇＧ、抗体断片、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ＤＡＲＰｉｎ、またはアフィボディを含み得る。いくつかの実施形態では、標的結合ペプチドは、シスチン高密度ペプチド、アフィチン、アドネクチン、アビマー、クニッツドメイン、ナノフィチン、フィノマー、二環式ペプチド、ベータヘアピン、またはステープルペプチドを含み得る。例えば、標的結合ペプチドは、ＰＤ－Ｌ１、ＦＧＦＲ－１、ＶＥＧＦ、ＰＤ－１、ＥＧＦＲ、ＣＤ３８、ＧＤ２、ＳＬＡＭＦ７、ＣＴＬＡ－４、ＣＣＲ４、ＣＤ２０、ＰＤＧＦＲα、ＶＥＧＦＲ２、ＨＥＲ２、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ｂ、ネクチン－４、またはＴＲＯＰ２に結合する抗体単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み得、ｐＨ依存性結合のために改変されている。選択的枯渇複合体の標的結合ペプチドは、臨床的関連性を有する標的分子などの標的分子に結合することができる。いくつかの実施形態では、標的分子は、疾患または状態において過剰発現または過剰活性化されるタンパク質であり得る。例えば、標的分子は、発がん性シグナル伝達、免疫抑制、または炎症促進性シグナル伝達に関与する膜貫通タンパク質であり得る。本開示の標的結合ペプチドによって標的化され得る標的分子の例としては、ＣＤ３、ＣＤ４７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８９、ＣＤ１６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２７、ＣＤ３９、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ７４、ＣＤ４０Ｌ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ２、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ４、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＨＬＡ－Ｇ、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ、ＴＣＲ、ＴＮＦ－α、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＴＫＩ耐性ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＥＲＢＢ３、ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＩＧＦＲ１、ＣＴＬＡ４、ＳＴＲＯ１、補体因子Ｃ４、補体因子Ｃ１ｑ、補体因子Ｃ１ｓ、補体因子Ｃ１ｒ、補体因子Ｃ３、補体因子Ｃ３ａ、補体因子Ｃ３ｂ、補体因子Ｃ５、補体因子Ｃ５ａ、ＴＧＦβ、ＰＣＳＫ９、Ｐ２Ｙ６、ＨＥＲ３、ＲＡＮＫ、ｔａｕ、アミロイドβ、ハンチンチン、α－シヌクレイン、グルコセレブロシダーゼ、α－グルコシダーゼ、ＩＬ－１、ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＩＬ－１２、ｐ４０、Ｂ７ファミリーのメンバー、ｃ－Ｍｅｔ、ＳＩＧＬＥＣ、ＭＣＰ－１、ＭＨＣ、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＰＤ－１、及びＰＤ－Ｌ１が挙げられるが、これらに限定されない。

選択的枯渇複合体による標的分子のエンドサイトーシス及び続く分解は、標的分子（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８９、ＣＤ１６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２７、ＣＤ３９、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ７４、ＣＤ４０Ｌ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ２、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ４、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＨＬＡ－Ｇ、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ、ＴＣＲ、ＴＮＦ－α、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＴＫＩ耐性ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＥＲＢＢ３、ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＩＧＦＲ１、ＣＴＬＡ４、ＳＴＲＯ１、補体因子Ｃ４、補体因子Ｃ１ｑ、補体因子Ｃ１ｓ、補体因子Ｃ１ｒ、補体因子Ｃ３、補体因子Ｃ３ａ、補体因子Ｃ３ｂ、補体因子Ｃ５、補体因子Ｃ５ａ、ＴＧＦβ、ＰＣＳＫ９、Ｐ２Ｙ６、ＨＥＲ３、ＲＡＮＫ、ｔａｕ、アミロイドβ、ハンチンチン、α－シヌクレイン、グルコセレブロシダーゼ、α－グルコシダーゼ、ＩＬ－１、ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＩＬ－１２、ｐ４０、Ｂ７ファミリーのメンバー、ｃ－Ｍｅｔ、ＳＩＧＬＥＣ、ＭＣＰ－１、ＭＨＣ、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＰＤ－１、またはＰＤ－Ｌ１）と関連する疾患または状態を治療（例えば、除去する、軽減する、その進行を遅らせる、またはその症状を治療する）することができる。いくつかの実施形態では、標的分子は疾患または状態において過剰発現され、標的分子を枯渇させることにより標的分子のレベルが低下し、それによって疾患または状態が治療される。いくつかの実施形態では、標的分子は疾患または病状において蓄積し、標的分子を枯渇させることで蓄積が解消または減少し、それによって疾患または病状が治療される。いくつかの実施形態では、標的分子は過剰活性化または過剰刺激されており、標的分子を枯渇させると標的分子の活性レベルが低下し、それによって疾患または状態が治療される。選択的枯渇複合体を使用して治療することができる疾患の例としては、がん（例えば、非小細胞肺癌、原発性非小細胞肺癌、転移性非小細胞肺癌、頭頸部癌、頭頸部扁平上皮癌、神経膠芽腫、脳癌、転移性脳癌、結腸直腸癌、結腸癌、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）耐性がん、セツキシマブ耐性がん、ネシツムマブ耐性がん、パニツムマブ耐性がん、局所がん、局所進行がん、再発がん、転移がん、難治性がん、ＫＲＡＳ野生型がん、ＫＲＡＳ変異がん、またはエクソン２０変異非小細胞肺癌）、炎症、炎症状態、神経学的状態（例えば、神経炎症、神経炎症性疾患、脳卒中、外傷性脳損傷、アルツハイマー病、または神経原線維変化型認知症、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、加齢関連タウアストログリオパチー、前頭側頭型認知症、パーキンソン症候群、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、リチコボーディグ病、神経節膠腫、髄膜血管腫症、または亜急性硬化症全脳炎を含むその他のタウオパシー）が挙げられる。

本開示の選択的枯渇複合体の投与は、疾患または状態を治療するための追加の療法と組み合わせることができる。例えば、がんを治療するための選択的枯渇複合体の投与は、放射線療法、化学療法、白金療法、または抗代謝療法の投与と組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、追加の療法は、フルオロウラシル、ＦＯＬＦＩＲＩ、イリノテカン、ＦＯＬＦＯＸ、ゲムシタビン、またはシスプラチンを対象に投与することを含み得る。

三元複合体形成
標的分子、受容体、及び受容体結合ペプチドと標的結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体の間で三元複合体を形成する方法が、本明細書に記載される。三元複合体は、受容体結合ペプチドの受容体への結合及び標的結合ペプチドの標的への結合を通じて形成され得る。標的、受容体、及び選択的枯渇複合体の間の三元複合体形成は、標的及び受容体を発現する細胞、組織、または対象に対して、治療的、薬理学的、生物学的、または生化学的な効果を発揮し得る。いくつかの実施形態では、受容体、標的、及び選択的枯渇複合体の間の三元複合体の形成は、標的分子、受容体、またはその両方の再循環または代謝回転を増加させ得る。標的または受容体の再循環または代謝回転の増加は、標的または受容体の活性を変化させ（例えば、増加させ）、それによって治療的、薬理学的、生物学的、または生化学的な効果を発揮し得る。

三元複合体の形成は、標的分子を受容体に動員することにより、治療、薬理学、生物学、または生化学を発揮し得る。受容体への標的分子の動員は、受容体と標的との間の結合相互作用を促進し得る。いくつかの実施形態では、その後の受容体及び標的の再循環は、治療的、薬理学的、生物学的、または生化学的な効果を促進し得る。いくつかの実施形態では、三元複合体の形成は、標的と受容体との間の相互作用を安定化させ得る。

ペプチドの物理化学的特性
いくつかの実施形態では、本開示のペプチド（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド、標的結合ペプチド、または選択的枯渇複合体）は、分子の大きさ及び構造、ｐＨ、等電点、ならびに全体的な分子正味電荷などの広範囲の物理化学的特性を含み得る。これらのパラメーターは、ＴｆＲに結合する、トランスサイトーシスを促進する、ＢＢＢなどの細胞障壁を越えてカーゴ分子を輸送する、またはそれらの組み合わせのペプチドの能力に影響し得る。

本開示のペプチドは、少なくとも１個のＤ立体配置のアミノ酸残基を含み得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、約５～１００アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、約１０～９０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、約１５～８０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、約１５～７５アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、約１５～７０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、約２０～６５アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、約２０～６０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、約２５～５５アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、約２５～５０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、約２５～４０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、約１１～３５アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、約１０～２５アミノ酸残基長である。

いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも５アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも１５アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも２０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも２５アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも３０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも３５アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも４０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも４５アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも５０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも５５アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも６０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも６５アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも７０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも７５アミノ酸残基長である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個、少なくとも３３個、少なくとも３４個、少なくとも３５個、少なくとも３６個、少なくとも３７個、少なくとも３８個、少なくとも３９個、少なくとも４０個、少なくとも４１個、少なくとも４２個、少なくとも４３個、少なくとも４４個、少なくとも４５個、少なくとも４６個、少なくとも４７個、少なくとも４８個、少なくとも４９個、少なくとも５０個、少なくとも５１個、少なくとも５２個、少なくとも５３個、少なくとも５４個、少なくとも５５個、少なくとも５６個、少なくとも５７個、少なくとも５８残基、少なくとも５９個、少なくとも６０個、少なくとも６１個、少なくとも６２個、少なくとも６３個、少なくとも６４個、少なくとも６５個、少なくとも６６個、少なくとも６７個、少なくとも６８個、少なくとも６９個、少なくとも７０個、少なくとも７１個、少なくとも７２個、少なくとも７３個、少なくとも７４個、少なくとも７５個、少なくとも７６個、少なくとも７７個、少なくとも７８個、少なくとも７９個、少なくとも８０個、または少なくとも８１個のアミノ酸残基を含む。

本開示のいくつかの実施形態では、ペプチドの三次元構造または三次構造は、主に、ベータシート及び／またはアルファヘリックス構造から構成される。いくつかの実施形態では、本開示の設計または操作されたペプチド（例えば、標的結合ペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、または選択的枯渇複合体）は、鎖内ジスルフィド結合（例えば、システインによって媒介される）及び疎水性コアによって安定化された小型で緻密なペプチドまたはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、操作されたペプチドは、アルファヘリックスのそれぞれの間に少なくとも１つのジスルフィド架橋を有するらせん状バンドルを含む構造を有し、それによって、ペプチドが安定化される。他の実施形態では、操作されたＴｆＲ結合ペプチドは、３つのアルファヘリックス及び３つの鎖内ジスルフィド結合を有する構造を含み、鎖内ジスルフィド結合は、アルファヘリックスバンドル中の３つのアルファヘリックスのぞれぞれの間に１つある。

生理学的細胞外ｐＨで、本明細書に記載のペプチドは、例えば、－５、－４、－３、－２、－１、０、＋１、＋２、＋３、＋４、または＋５の全体的な分子正味電荷を有し得る。正味電荷がゼロの場合、ペプチドは、非電荷または双極性イオン性であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、１つ以上のジスルフィド結合を含み、生理学的細胞外ｐＨで正の正味電荷を有し、正味電荷は、＋０．５または＋０．５未満、＋１または＋１未満、＋１．５または＋１．５未満、＋２または＋２未満、＋２．５または＋２．５未満、＋３または＋３未満、＋３．５または＋３．５未満、＋４または＋４未満、＋４．５または＋４．５未満、＋５または＋５未満、＋５．５または＋５．５未満、＋６または＋６未満、＋６．５または＋６．５未満、＋７または＋７未満、＋７．５または＋７．５未満、＋８または＋８未満、＋８．５または＋８．５未満、＋９または＋９．５未満、＋１０または＋１０未満であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、生理学的細胞外ｐＨで負の正味電荷を有し、正味電荷は、－０．５または－０．５未満、－１または－１未満、－１．５または－１．５未満、－２または－２未満、－２．５または－２．５未満、－３または－３未満、－３．５または－３．５未満、－４または－４未満、－４．５または－４．５未満、－５または－５未満、－５．５または－５．５未満、－６または－６未満、－６．５または－６．５未満、－７または－７未満、－７．５または－７．５未満、－８または－８未満、－８．５または－８．５未満、－９または－９．５未満、－１０または－１０未満であり得る。

いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、３～１０の等電点（ｐＩ）値を有し得る。他の実施形態では、本開示のペプチドは、４．３～８．９のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、３～４のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、３～５のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、３～６のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、３～７のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、３～８のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、３～９のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、４～５のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、４～６のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、４～７のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、４～８のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、４～９のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、４～１０のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、５～６のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、５～７のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、５～８のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、５～９のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、５～１０のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、６～７のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、６～８のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、６～９のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、６～１０のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、７～８のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、７～９のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、７～１０のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、８～９のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、８～１０のｐＩ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、９～１０のｐＩ値を有し得る。

場合によっては、本開示のペプチド（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド）内の１つ以上の変異の操作は、生理学的細胞外ｐＨでの等電点、電荷、表面電荷、またはレオロジーが改変されたペプチドをもたらす。サソリまたはクモの複合体に由来し得るペプチドに対するそのような変異の操作により、例えば、正味電荷を１、２、３、４、もしくは５下げるか、または正味電荷を１、２、３、４、または５上げることによって、ペプチドの正味電荷を変えることができる。そのような場合において、操作された変異は、標的タンパク質に結合し、トランスサイトーシスを促進し、細胞、エンドソーム、または核を透過するペプチドの能力を促進することができる。ペプチドのレオロジー及び効力を改善するのに好適なアミノ酸改変は、保存的または非保存的変異を含み得る。

ペプチドは、ペプチドの由来となる毒液または毒素の成分の配列と比較して、最大で１個のアミノ酸変異、最大で２個のアミノ酸変異、最大で３個のアミノ酸変異、最大で４個のアミノ酸変異、最大で５個のアミノ酸変異、最大で６個のアミノ酸変異、最大で７個のアミノ酸変異、最大で８個のアミノ酸変異、最大で９個のアミノ酸変異、最大で１０個のアミノ酸変異、または別の好適な数の変異を含み得る。他の実施形態では、ペプチド、またはその機能性断片は、ペプチドが由来する毒液または毒素成分の配列と比較して、少なくとも１個のアミノ酸変異、少なくとも２個のアミノ酸変異、少なくとも３個のアミノ酸変異、少なくとも４個のアミノ酸変異、少なくとも５個のアミノ酸変異、少なくとも６個のアミノ酸変異、少なくとも７個のアミノ酸変異、少なくとも８個のアミノ酸変異、少なくとも９個のアミノ酸変異、少なくとも１０個のアミノ酸の変異、または別の好適な数の変異を含む。いくつかの実施形態では、ペプチド内で変異の操作を行うことで、生理学的細胞外ｐＨで所望の電荷または安定性を有するペプチドを提供することができる。

一般に、関連する構造ペプチドもしくはタンパク質ホモログの磁気共鳴（ＮＭＲ）分解構造、Ｘ線結晶構造、及び一次構造配列アライメントまたはインシリコ設計を使用して、特定の生物学的機能（例えば、ＴｆＲ親和性／結合）を維持しながら、フォールディング、安定性、及び／または製造可能性を改善することができる変異戦略を生成することができる。ホモログまたはインシリコ設計ペプチドもしくはポリペプチドを生成するための一般的な戦略は、タンパク質の荷電表面パッチまたは保存的残基の同定、重要なアミノ酸の位置及びループの変異、続いて、ペプチドのインビトロ及びインビボ試験を含み得る。全体的なペプチド最適化プロセスは、例えば、インビトロまたはインビボの試験中に得られた情報が次世代のペプチドの設計に使用されるという点で、反復的な性質のものであり得る。したがって、本明細書で開示される方法を使用して、特性が改善されたペプチドを設計すること、またはフォールディング及び製造可能性を困難にする有害な変異を修正することができる。重要なアミノ酸の位置及びループの保持を可能にしながら、ペプチド配列中の他の残基を変異させて、ペプチドの機能、例えば、結合、トランスサイトーシス、または細胞、エンドソーム、もしくは細胞の核に浸透する能力、ホーミング、または別の活性を改善、変更、除去、または他の方法で修正することができる。これらの技術を使用して、構造的に相同な足場群の３Ｄファーマコフォアを予測することができ、また、特性（例えば、結合特性）が改善されたキメラを生成するために、関連タンパク質のグラフト可能領域を予測することができる。例えば、この戦略は、ＴｆＲ受容体結合及びトランスサイトーシス特性、高発現、インビボ高安定性、またはこれらの特性の任意の組み合わせが改善されたペプチドを設計するために使用される重要なアミノ酸位置及びループを同定するために使用される。

本開示はまた、本明細書に記載のさまざまなペプチドの多量体も包含する。多量体の例としては、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体などが挙げられる。多量体は、複数の同一のサブユニットから形成されるホモマーまたは複数の異なるサブユニットから形成されるヘテロマーであり得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも１個の他のペプチド、または２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、もしくはそれ以上の他のペプチドとの多量体構造で配置される。特定の実施形態では、多量体構造のペプチドはそれぞれ同じ配列を有する。他の実施形態では、多量体構造の１つ以上またはすべてのペプチドは、異なる配列を有する。

いくつかの実施形態では、本開示は、より特異的な特性または改善された特性を有する追加の次世代ペプチドを生成するための出発点として使用することができるペプチド足場を提供する。いくつかの実施形態では、これらの足場は、さまざまなＣＤＰまたはノットペプチドに由来する。足場に好適ないくつかのペプチドとしては、クロロトキシン、ブラゼイン、サーキュリン、ステクリスプ、ハナトキシン、ミッドカイン、ヘフトキシン、ジャガイモカルボキシペプチダーゼ阻害薬、バブルタンパク質、アトラクチン、α－ＧＩ、α－ＧＩＤ、μ－ＰＩＩＩＡ、ω－ＭＶＩＩＡ、ω－ＣＶＩＤ、χ－ＭｒＩＡ、ρ－ＴＩＡ、コナントキンＧ、コンツラキンＧ、ＧｓＭＴｘ４、マルガトキシン、ｓｈＫ、毒素Ｋ、キモトリプシン阻害薬（ＣＴＩ）、及びＥＧＦエピレグリンコアを挙げることができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ペプチド配列は、追加のアミノ酸に隣接する。１つ以上の追加のアミノ酸は、所望のインビボ電荷、等電点、化学コンジュゲーション部位、安定性、または生理学的特性をペプチドに付与し得る。

ペプチドの薬物動態
本開示のペプチドのいずれかの薬物動態は、異なる投与経路を介したペプチドの投与後に決定され得る。例えば、本開示のペプチドの薬物動態パラメーターは、静脈内、皮下、筋肉内、直腸、エアロゾル、非経口、眼科、肺、経皮、膣、視神経、鼻腔、経口、舌下、吸入、皮膚、髄腔内、鼻腔内、腹膜、頬部、滑膜、腫瘍内、または局所の投与後に定量化することができる。本開示のペプチドは、放射性標識またはフルオロフォアなどの追跡剤を使用することによって分析され得る。例えば、本開示の放射性標識ペプチドは、さまざまな投与経路を介して投与することができる。血漿、尿、糞便、任意の器官、皮膚、筋肉、及び他の組織などのさまざまな生体試料中のペプチド濃度または用量回収は、ＨＰＬＣ、蛍光検出技術（ＴＥＣＡＮ定量、フローサイトメトリー、ｉＶＩＳ）、または液体シンチレーション計測を含むさまざまな方法を使用して決定され得る。

本明細書に記載の方法及び組成物は、任意の経路を介した対象へのペプチド投与の薬物動態に関する。薬物動態は、例えば、コンパートメントモデルまたはノンコンパートメント方法などの方法及びモデルを使用して記述され得る。コンパートメントモデルとしては、モノコンパートメントモデル、２コンパートメントモデル、マルチコンパートメントモデルなどが挙げられるが、これらに限定されない。モデルは、多くの場合、さまざまなコンパートメントに分割され、対応するスキームによって記述され得る。例えば、１つのスキームは、吸収、分布、代謝、及び排泄（ＡＤＭＥ）スキームである。別の例として、別のスキームは、放出、吸収、分布、代謝、及び排泄（ＬＡＤＭＥ）スキームである。いくつかの態様において、代謝及び排泄は、消失コンパートメントと呼ばれる１つのコンパートメントに分類することができる。例えば、放出は、送達系からの組成物の活性部分の放出を含み、吸収は、対象による組成物の活性部分の吸収を含み、分布は、血漿を介して、異なる組織への組成物の分布を含み、代謝は、組成物の代謝または不活性化を含み、最後に排泄は、組成物または組成物の代謝産物の排泄または消失を含む。対象に静脈内投与された組成物は、多相薬物動態プロファイルに供することができ、これは、組織分布及び代謝／排泄の態様を含み得るが、これらに限定されない。したがって、組成物の血漿濃度または血清濃度の減少は、多くの場合、例えば、アルファ相及びベータ相を含む二相であり、時として、ガンマ、デルタまたは他の相が観察される。

薬物動態は、対象へのペプチドの投与に関連する少なくとも１つのパラメーターを決定することを含む。いくつかの態様において、パラメーターは、少なくとも、用量（Ｄ）、投与間隔（τ）、曲線下面積（ＡＵＣ）、最大濃度（Ｃ_ｍａｘ）、次の用量が投与されるまでに到達する最小濃度（Ｃ_ｍｉｎ）、最小時間（Ｔ_ｍｉｎ）、Ｃ_ｍａｘに到達するまでの最大時間（Ｔ_ｍａｘ）、分布体積（Ｖ_ｄ）、定常状態分布体積（Ｖ_ｓｓ）、０時点での外挿濃度（Ｃ_０）、定常状態濃度（Ｃ_ｓｓ）、消失速度定数（ｋ_ｅ）、注入速度（ｋ_ｉｎ）、クリアランス（ＣＬ）、バイオアベイラビリティ（ｆ）、変動（ＰＴＦ％）、及び消失半減期（ｔ_１／２）を含む。

特定の実施形態では、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれかのペプチドまたはペプチド複合体は、経口投与後に、最適な薬物動態パラメーターを示す。他の実施形態では、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれかのペプチドまたはペプチド複合体は、任意の投与経路、例えば、経口投与、吸入、鼻腔内投与、局所投与、静脈内投与、皮下投与、関節内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、滑液嚢、またはこれらの任意の組み合わせなどの後、最適な薬物動態パラメーターを示す。

いくつかの実施形態では、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれかのペプチドまたはペプチド複合体は、Ｃ_ｍａｘに到達するまでの平均Ｔ_ｍａｘが０．５～１２時間もしくは１～４８時間、経口経路による対象へのペプチド投与後の対象の血清における平均バイオアベイラビリティが０．１％～１０％、消化管への送達の場合における対象への経口投与後の血清の平均バイオアベイラビリティが０．１％未満、非経口投与後の血清における平均バイオアベイラビリティが１０～１００％、対象へのペプチド投与後の対象における平均ｔ_１／２が０．１時間～１６８時間もしくは０．２５時間～４８時間、対象へのペプチド投与後のペプチドの平均クリアランス（ＣＬ）が０．５～１００Ｌ／時間もしくは０．５～５０Ｌ／時間、対象へのペプチドの全身投与後の対象の平均分布体積（Ｖ_ｄ）が２００～２０，０００ｍＬ、または任意選択により全身取り込みなし、これらの任意の組み合わせを示す。

ペプチド安定性
本開示のペプチドは、細胞内、サイトゾル内、細胞核内、もしくはエンドソーム内、または腫瘍内の、生理学的細胞外ｐＨ、エンドソームまたはライソソームのｐＨ、または還元環境などのさまざまな生物学的条件または生理学的条件で安定であり得る。例えば、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれかの任意のペプチドまたはペプチド複合体は、還元剤、プロテアーゼ、酸化条件、または酸性条件に対する耐性を示し得る。

いくつかの場合では、生物学的分子（ペプチド及びタンパク質など）は、治療機能を提供し得るが、そのような治療機能は、インビボ環境によって引き起こされる不安定性によって低下するか、または阻害される（Ｍｏｒｏｚｅｔａｌ．ＡｄｖＤｒｕｇＤｅｌｉｖＲｅｖ１０１：１０８－２１（２０１６），Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉｅｔａｌ．ＮａｔＲｅｖＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ１３（９）：６５５－７２（２０１４），Ｂｒｕｎｏｅｔａｌ．ＴｈｅｒＤｅｌｉｖ（１１）：１４４３－６７（２０１３），Ｓｉｎｈａｅｔａｌ．ＣｒｉｔＲｅｖＴｈｅｒＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔ．２４（１）：６３－９２（２００７），Ｈａｍｍａｎｅｔａｌ．ＢｉｏＤｒｕｇｓ１９（３）：１６５－７７（２００５））。例えば、消化管は、低ｐＨ（例えば、ｐＨ約１）の領域、還元環境、またはペプチド及びタンパク質を分解し得るプロテアーゼの多い環境を含み得る。口、眼、肺、鼻腔内の空洞、関節、皮膚、膣管、粘膜、及び血清などの身体の他の領域のタンパク質分解活性もまた、機能的に活性なペプチド及びポリペプチドの送達の障害となり得る。さらに、血清中におけるペプチドの半減期は、プロテアーゼに部分的に起因して極めて短くなり得、そのため、ペプチドは、妥当な投与レジメンを実施した場合、持続的な治療効果をもたらすにはあまりにも急速に分解され得る。同様に、リソソームなどの細胞内コンパートメント内のタンパク質分解活性ならびにリソソーム及びサイトゾル内の還元活性は、ペプチド及びタンパク質を分解し得るため、細胞内標的に治療機能を提供できないものとなり得る。したがって、還元剤、プロテアーゼ、及び低ｐＨに対して耐性のあるペプチドは、インビボにおいて、共製剤化された、またはコンジュゲート、連結、もしくは融合された活性剤の治療効果の増大を提供するか、または治療効果を増大させることができ得る。

製造方法
本明細書に記載のペプチドの組換え発現には、さまざまな発現ベクター／宿主系が利用され得る。そのような系の非限定的な例としては、本明細書に記載のペプチド、ペプチド複合体、もしくはペプチド融合タンパク質／キメラタンパク質をコードする核酸配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌、上記の核酸配列を含む組換え酵母菌発現ベクターで形質転換された酵母などの微生物、上記の核酸配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系、上述の核酸配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））を感染させるか、もしくは上述の核酸配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系、または安定的に増幅する（例えば、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ、ＣＨＯ／グルタミンシンテターゼ）もしくは二重微小染色体で不安定に増幅する（例えば、マウス細胞株）、上述の核酸配列の複数コピーを含むように操作された細胞株を含む、組換えウイルス発現ベクター（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス）を感染させた動物細胞系が挙げられる。ペプチドのジスルフィド結合形成及びフォールディングは、発現中もしくは発現後またはその両方において生じ得る。

宿主細胞は、本明細書に記載の１つ以上のペプチドを発現するように適応され得る。宿主細胞は、原核生物細胞、真核生物細胞、または昆虫細胞であり得る。場合によっては、宿主細胞は、挿入された配列の発現の調節、または所望の特定の様式での遺伝子もしくはタンパク質産物の修飾及びプロセシングが可能である。例えば、ある特定のプロモーターからの発現は、ある特定の誘導物質（例えば、メタロチオニンプロモーターに対する亜鉛及びカドミウムイオン）の存在下で増加し得る。場合によっては、ペプチド産物の修飾（例えば、リン酸化）及びプロセシング（例えば、切断）は、ペプチドの機能にとって重要であり得る。宿主細胞は、ペプチドの翻訳後プロセシング及び修飾について、特徴的かつ特異的な機序を有し得る。場合によっては、ペプチドを発現するために使用される宿主細胞は、最小限のタンパク質分解酵素を分泌する。

本開示の選択的枯渇複合体は、化学合成または修飾を必要とせずに、単一の組換え発現系によって有利に作製することができる。例えば、選択的枯渇複合体は、ＣＨＯ細胞、酵母、ｐｉｃｈｉａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、または他の生物で発現させることができる。

細胞ベースまたはウイルスベースの試料の場合、精製前に生物を処理して標的ポリペプチドを保存及び／または遊離させることができる。いくつかの実施形態では、細胞は、固定剤を使用して固定される。いくつかの実施形態では、細胞は、溶解される。細胞材料は、細胞の多くの部分が破壊されることなく、細胞材料の表面から、及び／または細胞間の隙間からタンパク質を取り出すような様式で処理され得る。例えば、細胞内空間内及び／または植物細胞壁内に位置するタンパク質を取り出すために、細胞材料は、液体緩衝液中に浸漬され得るか、または、植物材料の場合、真空に供し得る。細胞材料が微生物である場合、タンパク質は、微生物培地から抽出され得る。代替的に、ペプチドは、封入体にパッケージングされ得る。封入体は、培地中の細胞成分からさらに分離され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、破壊されない。インタクトな細胞またはウイルス粒子の結合及び／または精製のために、細胞またはウイルスによって提示される細胞ペプチドまたはウイルスペプチドが使用され得る。組換え系に加えて、ペプチドはまた、タンパク質及びペプチドの合成に採用されるさまざまな既知の技術を使用して、無細胞系で合成された後、抽出され得る。

場合によっては、宿主細胞は、カーゴ分子（例えば、治療薬）の結合点を有するペプチドを産生する。結合点は、リジン残基、Ｎ末端、システイン残基、システインジスルフィド結合、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸残基、Ｃ末端、または非天然アミノ酸を含み得る。ペプチドは、固相ペプチド合成、または溶液相ペプチド合成などによって、合成的に産生され得る。ペプチド合成は、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学またはブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）化学によって実施され得る。ペプチドは、合成中もしくは合成後またはその両方においてフォールディングが生じ得る（ジスルフィド結合の形成）。ペプチド断片は、合成的または組換え的に産生され得る。次いで、ペプチド断片は、酵素的または合成的に互いに接続され得る。

他の態様において、本開示のペプチドは、従来の固相化学合成技術によって、例えば、Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成法にしたがって、調製することができる（“Ｆｍｏｃｓｏｌｉｄｐｈａｓｅｐｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ，” ｅｄｉｔｅｄｂｙＷ．Ｃ．ＣｈａｎａｎｄＰ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，２０００）。

いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、製造中により安定であり得る。例えば、本開示のペプチドは、組換え発現及び精製中により安定であり得、それにより、製造プロセスに存在するプロテアーゼによる分解速度の低下、より高いペプチド純度、より高いペプチド収率、またはこれらの任意の組み合わせがもたらされる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、製造、保存、及び流通中における高温及び低温での分解により安定であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、２５℃で安定であり得る。他の実施形態では、本開示のペプチドは、７０℃または７０℃より高い温度で安定であり得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、１００℃または１００℃より高い温度で安定であり得る。

医薬組成物
本開示の医薬組成物は、本明細書に記載の任意のペプチドと、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁化剤、粘稠化剤、抗酸化剤、溶解剤、緩衝液、オスモライト、塩、界面活性剤、アミノ酸、カプセル化剤、増量剤、凍結保護剤、及び／または賦形剤などの他の化学成分との組み合わせであり得る。医薬組成物は、本明細書に記載のペプチドの生物への投与を容易にする。場合によっては、医薬組成物は、ペプチドの半減期を延長し、及び／またはペプチドが標的細胞を透過するのを助ける因子を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本開示の選択的枯渇複合体を発現及び分泌するように改変された細胞を含む。

医薬組成物は、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、直腸、エアロゾル、非経口、眼科用、肺、経皮、膣、眼、鼻、経口、舌下、吸入、皮膚、髄腔内、腫瘍内、鼻腔内、及び局所投与を含む、さまざまな形態及び経路で、医薬組成物として治療有効量で投与され得る。医薬組成物は、例えば、本明細書に記載のペプチドを直接器官に注射することにより、任意選択でデポ注射で、局所または全身に投与され得る。

非経口注射は、ボーラス注射、注入、または連続注入用に製剤化され得る。医薬組成物は、油性または水性ビヒクル中の無菌懸濁液、溶液または乳剤として、非経口注射に好適な形態であり得、懸濁化剤、安定化剤、及び／または分散剤などの製剤化剤を含み得る。非経口投与用の医薬製剤は、水溶性形態である、本明細書に記載のペプチドの水溶液を含む。本明細書に記載のペプチド抗体複合体の懸濁液は、油性注射懸濁液として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる物質を含有し得る。懸濁液はまた、好適な安定剤、または本明細書に記載のそのようなペプチド抗体複合体の可溶性を高め、及び／または凝集を減少させる薬剤を含み得、これにより、高濃度の溶液の調製が可能となる。

代替的に、本明細書に記載のペプチドは、使用前に、好適なビヒクル、例えば、無菌パイロジェンフリー水で再構成するために、凍結乾燥されるか、または粉末形態であり得る。いくつかの実施形態では、精製ペプチドは、静脈内投与される。本明細書に記載のペプチドは、ＣＮＳ細胞、脳細胞、がん性細胞、または腫瘍にホーミング、標的化、移動、または誘導するために、対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、中枢神経系内または血液脳関門を越えた特定の標的細胞型に対する標的化機能を提供する別のペプチドにコンジュゲート、連結、または融合され得る。例示的な標的細胞としては、ＣＮＳ細胞、赤血球、赤血球前駆細胞、免疫細胞、幹細胞、筋細胞、脳細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、骨髄細胞、虫垂細胞、リンパ節細胞、扁桃腺細胞、脾細胞、筋細胞、肝細胞、胆嚢細胞、膵細胞、消化管の細胞、腺細胞、腎細胞、膀胱細胞、内皮細胞、上皮細胞、脈絡叢上皮細胞、ニューロン、グリア細胞、星状膠細胞、または神経系に関連する細胞が挙げられる。

本開示のペプチドは、外科手術中に脳または脳組織もしくは脳細胞などの器官または器官組織もしくは細胞に直接適用することができる。本明細書に記載の組換えペプチドは、局所投与することができ、溶液、懸濁液、ローション、ゲル、ペースト、薬用スティック、香膏、クリーム、及び軟膏などのさまざまな局所投与可能な組成物に製剤化することができる。そのような医薬組成物は、溶解剤、安定剤、張度増強剤、緩衝液及び保存剤を含み得る。

本明細書で提供される治療または使用の方法において、治療有効量の本明細書に記載のペプチドは、免疫系に影響を及ぼす状態に罹患している対象に医薬組成物中で投与され得る。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトまたは霊長類などの哺乳動物である。治療有効量は、疾患の重症度、対象の年齢及び相対的な健康、使用される化合物の効力、ならびに他の因子に応じて大きく変動し得る。

いくつかの実施形態では、ペプチドは、ウイルス発現ベクターまたは非ウイルス発現ベクターにクローニングされる。そのような発現ベクターは、遺伝子治療の形態で患者に投与される、ウイルス粒子、ビリオン、または非ウイルス性の担体もしくは送達機構にパッケージングされ得る。他の実施形態では、患者の細胞が抽出され、それをＴｆＲに結合することが可能なペプチドを発現するようにエクスビボで改変した後、その改変された細胞を細胞療法の形態で患者に戻し、それにより、その改変された細胞は、患者に移植されると、ペプチドを発現する。

医薬組成物は、活性化合物の薬学的に使用することができる製剤への加工を促進する賦形剤及び助剤を含む、１つ以上の生理学的に許容される担体を使用して製剤化され得る。製剤は、選択される投与経路に応じて、変更され得る。本明細書に記載のペプチドを含む医薬組成物は、例えば、組換え系においてペプチドを発現すること、ペプチドを精製すること、ペプチドを凍結乾燥すること、混合すること、溶解すること、造粒すること、糖衣錠を作製すること、湿式粉砕すること、乳化すること、カプセル化すること、封入すること、または圧縮することのプロセスによって、製造することができる。医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、遊離塩基もしくは薬学的に許容される塩形態である本明細書に記載の化合物とを含み得る。

本明細書に記載の化合物を含む本明細書に記載のペプチドを調製する方法は、本明細書に記載のペプチドと、１つ以上の不活性な薬学的に許容される賦形剤または担体を一緒に製剤化して、固体、半固体、または液体の組成物を形成することを含む。固体組成物としては、例えば、散剤、錠剤、分散性顆粒剤、カプセル剤、カシェ剤、及び坐剤が挙げられる。これらの組成物はまた、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及び他の薬学的に許容される添加剤などの微量の無毒の補助物質を含み得る。

薬学的に許容される賦形剤の非限定的な例は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＮｉｎｅｔｅｅｎｔｈＥｄ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，１９９５）；Ｈｏｏｖｅｒ，ＪｏｈｎＥ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ１９７５；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄＬａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ，ＭａｒｃｅｌＤｅｃｋｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０；及びＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓａｎｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ，ＳｅｖｅｎｔｈＥｄ．（ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＷｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ１９９９）に見出すことができ、これらのそれぞれはその全体が参照により組み込まれる。

医薬組成物はまた、浸透または吸収促進剤を含み得る（Ａｕｎｇｓｔｅｔａｌ．ＡＡＰＳＪ．１４（１）：１０－８．（２０１２）ａｎｄＭｏｒｏｚｅｔａｌ．ＡｄｖＤｒｕｇＤｅｌｉｖＲｅｖ１０１：１０８－２１．（２０１６））。浸透促進剤は、消化管から体循環への分子の取り込みを促進し得る。浸透促進剤としては、中鎖脂肪酸の塩、カプリン酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、Ｎ－（８－［２－ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸（ＳＮＡＣ）、Ｎ－（５－クロロサリチロイル）－８－アミノカプリル酸（５－ＣＮＡＣ）、フェノキシエタノール、ベンジルアルコール、及びフェニルアルコールなどの親水性芳香族アルコール、キトサン、アルキルグリコシド、ドデシル－２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピオン酸（ＤＤＡＩＰＰ）、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、及びクエン酸を含む二価カチオンのキレート剤、アルキル硫酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、デオキシコール酸などのレシチンベースまたは胆汁酸塩由来の薬剤が挙げられ得る。

組成物としてはまた、ダイズトリプシン阻害薬、アプロチニン、グリココール酸ナトリウム、カモスタットメシル酸塩、バシトラシン、またはシクロペンタデカラクトンを含むプロテアーゼ阻害薬が挙げられ得る。

治療におけるペプチドの使用
いくつかの実施形態では、本開示の選択的枯渇複合体を使用して対象を治療する方法は、本明細書に記載の有効量のペプチドを、それを必要とする対象に投与することを含む。

いくつかの実施形態では、本開示の選択的枯渇複合体を使用して対象を治療する方法は、本開示の選択的枯渇複合体を発現及び分泌するように対象の細胞を改変することを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、対象内の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、対象から取り出され、改変後に再導入される細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ウイルスベクター（例えば、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス）を使用して改変される。いくつかの実施形態では、選択的枯渇複合体の発現及び分泌をコードする遺伝子は、ＣＡＲ－Ｔ細胞または他の細胞療法に組み込まれる。

ＴｆＲは、脳、胃、肝臓、胆嚢などのさまざまな組織で発現し得る。したがって、本開示のペプチド（例えば、ＴｆＲ結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体）は、さまざまな組織及び器官に関連する疾患及び状態の診断及び治療に使用することができる。例えば、これらの組織及び器官への薬物送達は、診断用及び／または治療用ペイロードを運搬する本明細書に記載のペプチド及びペプチド複合体を使用することによって、改善され得る。

「有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、治療される疾患または状態の症状のうちの１つ以上をある程度緩和するのに十分な、投与される薬剤または化合物の量を指す。その結果は、疾患の徴候、症状、または病因の減少及び／または軽減、あるいは生物系の任意の他の望ましい変化であり得る。そのような薬剤または化合物を含む組成物は、予防、増強、及び／または治療的処置のために投与され得る。任意の個々の場合における適切な「有効」量は、用量漸増研究などの技術を使用して決定され得る。

本開示の方法、組成物、及びキットは、状態の症状を予防、治療、停止、逆転、または改善するための方法を含み得る。治療は、対象（例えば、疾患または状態に罹患した個体、飼育動物、野生動物、または実験動物）を本開示のペプチドで処置することを含み得る。疾患は、がんまたは腫瘍であり得る。疾患を治療することにおいて、ペプチドは、腫瘍またはがん性細胞と接触し得る。対象は、ヒトであり得る。対象は、ヒト；チンパンジー、ならびに他の猿人類及びサル種などの非ヒト霊長類；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの家畜；ウサギ、イヌ、及びネコなどの飼育動物；ラット、マウス、及びモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物などであり得る。対象は、あらゆる年齢であり得る。対象は、例えば、高齢者、成人、青年、前青年、小児、幼児、乳児、及び子宮内胎児であり得る。

治療は、疾患の臨床的な発症前に対象に提供され得る。治療は、疾患の臨床的な発症後に対象に提供され得る。治療は、疾患の臨床的な発症から１日後、１週間後、６か月後、１２か月後、もしくは２年後、またはそれ以上後に対象に提供され得る。治療は、疾患の臨床的な発症から１日間、１週間、１か月間、６か月間、１２か月間、２年間、またはそれ以上にわたって対象に提供され得る。治療は、疾患の臨床的な発症から１日間、１週間、１か月間、６か月間、１２か月間、または２年未満の間、対象に提供され得る。治療はまた、臨床試験においてヒトを治療することを含み得る。治療は、本開示全体を通して記載される医薬組成物のうちの１つ以上などの医薬組成物を対象に投与することを含み得る。治療は、１日１回の投与を含み得る。治療は、静脈内、皮下、筋肉内、吸入、皮膚、局所、関節内注射、経口、舌下、髄腔内、経皮、鼻腔内、腹膜経路、腫瘍へ直接、例えば、腫瘍への直接注射、脳内へ直接、例えば、脳室内経路、または関節に直接、例えば、関節内局所注射経路のいずれかで、本開示のペプチドを対象に送達することを含み得る。治療は、静脈内、皮下、筋肉内、吸入、関節内注射、皮膚、局所、経口、髄腔内、経皮、鼻腔内、非経口、経口、腹膜経路、経鼻、舌下、またはがん性組織に直接のいずれかで、ペプチド活性剤複合体を対象に投与することを含み得る。

ペプチドキット
一態様において、本明細書に記載のペプチドは、キットとして提供され得る。別の実施形態では、本明細書に記載のペプチド複合体は、キットとして提供され得る。別の実施形態では、キットは、本明細書に記載のペプチドをコードするアミノ酸、ベクター、宿主生物、及び使用説明マニュアルを含む。いくつかの実施形態では、キットは、ペプチドの使用または投与についての使用説明書を含む。

本開示のさらなる態様及び利点は、本開示の例示的な実施形態が示され、記載されている以下の詳細な説明から当業者に明らかになるであろう。認識されるように、本開示は、他の実施形態及び異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、さまざまな点で、すべて本開示を逸脱することなく、改変することが可能である。したがって、図面及び説明は、本質的に例示的なものとしてみなされるべきであり、限定的なものとしてみなされるべきではない。

以下の実施例は、本開示のいくつかの態様をさらに説明するために含まれており、本発明の範囲を限定するために使用されるべきではない。

実施例１
ペプチドの製造
この実施例は、本明細書に記載のペプチド及びペプチド複合体（例えば、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか１つ）の製造について記載する。タンパク質由来のペプチドは、公開されている方法論を使用して、哺乳動物細胞培養で生成した（Ａ．Ｄ．Ｂａｎｄａｒａｎａｙｋｅ，Ｃ．Ｃｏｒｒｅｎｔｉ，Ｂ．Ｙ．Ｒｙｕ，Ｍ．Ｂｒａｕｌｔ，Ｒ．Ｋ．Ｓｔｒｏｎｇ，Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ．２０１１．Ｄａｅｄａｌｕｓ：ａｒｏｂｕｓｔ，ｔｕｒｎｋｅｙｐｌａｔｆｏｒｍｆｏｒｒａｐｉｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｄｅｃｉｇｒａｍｑｕａｎｔｉｔｉｅｓｏｆａｃｔｉｖｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｈｕｍａｎｃｅｌｌｌｉｎｅｓｕｓｉｎｇｎｏｖｅｌｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ．（３９）２１，ｅ１４３）。

標準的な分子生物学技術を使用して、ペプチド配列をＤＮＡに逆翻訳し、合成し、シデロカリンとインフレームでクローニングした（Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，ＪｏｓｅｐｈＳａｍｂｒｏｏｋ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．２０１２ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ）。得られた複合体をレンチウイルスにパッケージングし、ＨＥＫ－２９３細胞に形質導入し、拡大させ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって単離し、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼで切断し、均質になるまで逆相クロマトグラフィーによって精製した。精製後、それぞれのペプチドを凍結乾燥させ、凍結保存した。

実施例２
哺乳動物発現系を使用するペプチド発現
本実施例は、哺乳動物発現系を使用するペプチド及びペプチド複合体の発現について記載する。ペプチドは、Ｂａｎｄａｒａｎａｙａｋｅｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０１１Ｎｏｖ；３９（２１）：ｅ１４３に記載されている方法に従って発現させた。ペプチド（例えば、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか１つ）を、タバコエッチウイルスプロテアーゼを使用してシデロカリンから切断し、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によってアセトニトリルと０．１％ＴＦＡを含む水のグラジエントで精製し、次いで、その後の使用のために等分し、凍結乾燥させた。分子量を質量分析によって検証した。

スクリーニング方法論を最適化及び検証し、ＴｆＲ結合ペプチドを同定するために、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）細胞外ドメイン（「可溶性ＴｆＲ」、配列番号１８８、ＭＲＬＡＶＧＡＬＬＶＣＡＶＬＧＬＣＬＡＤＹＫＤＥＨＨＨＨＨＨＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＧＧＧＳＫＴＶＲＷＣＡＶＳＥＨＥＡＴＫＣＱＳＦＲＤＨＭＫＳＶＩＰＳＤＧＰＳＶＡＣＶＫＫＡＳＹＬＤＣＩＲＡＩＡＡＮＥＡＤＡＶＴＬＤＡＧＬＶＹＤＡＹＬＡＰＮＮＬＫＰＶＶＡＥＦＹＧＳＫＥＤＰＱＴＦＹＹＡＶＡＶＶＫＫＤＳＧＦＱＭＮＱＬＲＧＫＫＳＣＨＴＧＬＧＲＳＡＧＷＮＩＰＩＧＬＬＹＣＤＬＰＥＰＲＫＰＬＥＫＡＶＡＮＦＦＳＧＳＣＡＰＣＡＤＧＴＤＦＰＱＬＣＱＬＣＰＧＣＧＣＳＴＬＮＱＹＦＧＹＳＧＡＦＫＣＬＫＤＧＡＧＤＶＡＦＶＫＨＳＴＩＦＥＮＬＡＮＫＡＤＲＤＱＹＥＬＬＣＬＤＮＴＲＫＰＶＤＥＹＫＤＣＨＬＡＱＶＰＳＨＴＶＶＡＲＳＭＧＧＫＥＤＬＩＷＥＬＬＮＱＡＱＥＨＦＧＫＤＫＳＫＥＦＱＬＦＳＳＰＨＧＫＤＬＬＦＫＤＳＡＨＧＦＬＫＶＰＰＲＭＤＡＫＭＹＬＧＹＥＹＶＴＡＩＲＮＬＲＥＧＴＣＰＥＡＰＴＤＥＣＫＰＶＫＷＣＡＬＳＨＨＥＲＬＫＣＤＥＷＳＶＮＳＶＧＫＩＥＣＶＳＡＥＴＴＥＤＣＩＡＫＩＭＮＧＥＡＤＡＭＳＬＤＧＧＦＶＹＩＡＧＫＣＧＬＶＰＶＬＡＥＮＹＤＫＳＤＮＣＥＤＴＰＥＡＧＹＦＡＶＡＶＶＫＫＳＡＳＤＬＴＷＤＮＬＫＧＫＫＳＣＨＴＡＶＧＲＴＡＧＷＮＩＰＭＧＬＬＹＮＫＩＮＨＣＲＦＤＥＦＦＳＥＧＣＡＰＧＳＫＫＤＳＳＬＣＫＬＣＭＧＳＧＬＮＬＣＥＰＮＮＫＥＧＹＹＧＹＴＧＡＦＲＣＬＶＥＫＧＤＶＡＦＶＫＨＱＴＶＰＱＮＴＧＧＫＮＰＤＰＷＡＫＮＬＮＥＫＤＹＥＬＬＣＬＤＧＴＲＫＰＶＥＥＹＡＮＣＨＬＡＲＡＰＮＨＡＶＶＴＲＫＤＫＥＡＣＶＨＫＩＬＲＱＱＱＨＬＦＧＳＤＶＴＤＣＳＧＮＦＣＬＦＲＳＥＴＫＤＬＬＦＲＤＤＴＶＣＬＡＫＬＨＤＲＮＴＹＥＫＹＬＧＥＥＹＶＫＡＶＧＮＬＲＫＣＳＴＳＳＬＬＥＡＣＴＦＲＲＰ）をＤａｅｄａｌｕｓ可溶性タンパク質産生レンチベクターにクローニングし、タンパク質を増殖培地から精製した（可溶性ＴｆＲのゲルを図１Ａに示す）。同じ戦略を使用して、ヒトアポトランスフェリン（残基２３～６９８、配列番号１８９、ＫＴＶＲＷＣＡＶＳＥＨＥＡＴＫＣＱＳＦＲＤＨＭＫＳＶＩＰＳＤＧＰＳＶＡＣＶＫＫＡＳＹＬＤＣＩＲＡＩＡＡＮＥＡＤＡＶＴＬＤＡＧＬＶＹＤＡＹＬＡＰＮＮＬＫＰＶＶＡＥＦＹＧＳＫＥＤＰＱＴＦＹＹＡＶＡＶＶＫＫＤＳＧＦＱＭＮＱＬＲＧＫＫＳＣＨＴＧＬＧＲＳＡＧＷＮＩＰＩＧＬＬＹＣＤＬＰＥＰＲＫＰＬＥＫＡＶＡＮＦＦＳＧＳＣＡＰＣＡＤＧＴＤＦＰＱＬＣＱＬＣＰＧＣＧＣＳＴＬＮＱＹＦＧＹＳＧＡＦＫＣＬＫＤＧＡＧＤＶＡＦＶＫＨＳＴＩＦＥＮＬＡＮＫＡＤＲＤＱＹＥＬＬＣＬＤＮＴＲＫＰＶＤＥＹＫＤＣＨＬＡＱＶＰＳＨＴＶＶＡＲＳＭＧＧＫＥＤＬＩＷＥＬＬＮＱＡＱＥＨＦＧＫＤＫＳＫＥＦＱＬＦＳＳＰＨＧＫＤＬＬＦＫＤＳＡＨＧＦＬＫＶＰＰＲＭＤＡＫＭＹＬＧＹＥＹＶＴＡＩＲＮＬＲＥＧＴＣＰＥＡＰＴＤＥＣＫＰＶＫＷＣＡＬＳＨＨＥＲＬＫＣＤＥＷＳＶＮＳＶＧＫＩＥＣＶＳＡＥＴＴＥＤＣＩＡＫＩＭＮＧＥＡＤＡＭＳＬＤＧＧＦＶＹＩＡＧＫＣＧＬＶＰＶＬＡＥＮＹＮＫＳＤＮＣＥＤＴＰＥＡＧＹＦＡＩＡＶＶＫＫＳＡＳＤＬＴＷＤＮＬＫＧＫＫＳＣＨＴＡＶＧＲＴＡＧＷＮＩＰＭＧＬＬＹＮＫＩＮＨＣＲＦＤＥＦＦＳＥＧＣＡＰＧＳＫＫＤＳＳＬＣＫＬＣＭＧＳＧＬＮＬＣＥＰＮＮＫＥＧＹＹＧＹＴＧＡＦＲＣＬＶＥＫＧＤＶＡＦＶＫＨＱＴＶＰＱＮＴＧＧＫＮＰＤＰＷＡＫＮＬＮＥＫＤＹＥＬＬＣＬＤＧＴＲＫＰＶＥＥＹＡＮＣＨＬＡＲＡＰＮＨＡＶＶＴＲＫＤＫＥＡＣＶＨＫＩＬＲＱＱＱＨＬＦＧＳＮＶＴＤＣＳＧＮＦＣＬＦＲＳＥＴＫＤＬＬＦＲＤＤＴＶＣＬＡＫＬＨＤＲＮＴＹＥＫＹＬＧＥＥＹＶＫＡＶＧＮＬＲＫＣＳＴＳＳＬＬＥＡＣＴＦＲＲＰ）を生成及び精製し、材料の一部に鉄をロードしてホロトランスフェリンを生成した。可溶性ＴｆＲ細胞外ドメインへの結合について、アポトランスフェリンとホロトランスフェリンの両方を表面プラズモン共鳴を介して試験した（図９Ａ）。ホロトランスフェリンのみが固定化ＴｆＲとの相互作用を示した。

スクリーニングに使用される可溶性ＴｆＲがヒト内在性タンパク質の構造を表すことをさらに検証するために、ＴｆＲを使用して指向性を決定し、細胞進入を媒介するＭａｃｈｕｐｏウイルス糖タンパク質（ＭａＣＶと呼ばれる）との相互作用を試験した。このために、ＭａＣＶを哺乳動物表面提示ベクターＳＤＧＦ（図９Ｂ）にクローニングし、ＳＤＧＦ－ＭａＣＶまたは対照タンパク質（ＳＤＧＦ－Ｅｌａｆｉｎ、いくつかの天然型ＣＤＰに結合することが知られているエラスターゼの阻害剤）を２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（２９３Ｆ）懸濁細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、それぞれ２００ｎＭのビオチン化ＴｆＲ（細胞結合アッセイで使用されるＴｆＲはすべてビオチン化される）及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識ストレプトアビジンで染色し、次いで、フローサイトメトリーによって分析した（図９Ｃ）。ＭａＣＶをトランスフェクトした細胞は、ＴｆＲによる染色に成功したが、ＳＤＧＦ－エラフィン細胞は、染色されなかった。また、２００ｎＭの蛍光エラスターゼとインキュベートしたＳＤＧＦ－ＭａＣＶ細胞は、染色されなかった。これは、スクリーニングで使用された可溶性ＴｆＲが内在性タンパク質構造を構成していることを検証し、ＴｆＲのその内在性リガンドに対する結合の特異性と、新規ＴｆＲ結合パートナーを同定するための手段としてのＳＤＧＦの有用性の両方を示している。

実施例３
ＴｆＲ結合ペプチドの哺乳動物表面提示
本実施例は、配列番号１（配列番号１は配列番号６５にＮ末端ＧＳを付加したものである）、配列番号２（配列番号２は配列番号６６にＮ末端ＧＳを付加したものである）、配列番号３０（配列番号３０は配列番号９４にＮ末端ＧＳを付加したものである）、及び配列番号３２（配列番号３２は配列番号９６にＮ末端ＧＳを付加したものである）を含む本開示のＴｆＲ結合ペプチドの哺乳動物表面提示について記載する。ＴｆＲ結合ペプチドのスクリーニングは、哺乳動物細胞にトランスフェクトまたは形質導入して候補ペプチドを提示させ（図９Ｂ）、続いて、可溶性ヒトトランスフェリン受容体細胞外ドメインに対するスクリーニング（２００ｎＭ、図９Ｃ、図１Ｂ～図１Ｇ）によって実施した。哺乳動物細胞は、ジスルフィド架橋タンパク質のフォールディングにおける改善された忠実度を有していることから、本開示のペプチドの提示に好適な細胞型となっている。

哺乳動物細胞表面提示スクリーニングは、以下のとおりに実施した。スクリーニング戦略は、表面提示ＧＦＰＦａｓＬ（ＳＤＧＦ）ベクターを使用した。ベクターにおいて、ＦａｓＬ－ＴＭは、ＦａｓＬタンパク質の膜貫通ドメインである。より詳細には、設計されたペプチドをプールとしてＳＤＧＦにクローニングし、次いで、それをレンチウイルスにした。このライブラリを用いて、約１の多重感染度で２９３Ｆ細胞に形質導入し、３日間の増殖後、形質導入した細胞のプールをＡｌｅｘａ６４７標識ＴｆＲとともにインキュベートした。これらの実験に関して、蛍光標識は、ＴｆＲを蛍光ストレプトアビジンまたは蛍光抗Ｈｉｓ抗体と共染色することによって実施した。可溶性ＴｆＲは、Ｈｉｓタグとビオチン標識の両方を含んだ。抗体／ストレプトアビジン蛍光には、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７またはｉＦｌｕｏｒ６４７のいずれかを使用した。ＧＦＰ及びＴｆＲ二重陽性細胞から最も高く染色されたＴｆＲ陽性細胞の一部をソーティングし、拡大させた。拡大ごとに細胞の一部を回収し、最後に、濃縮されたペプチドを配列決定によって同定した。フローサイトメトリーを使用してゲーティング基準を評価し、ＳＤＧＦペプチド構築物を介して表面上にタンパク質を発現しているＧＦＰ＋２９３Ｆ細胞を同定した。ゲーティングは、ＦＳＣ－Ｈ対ＳＳＣ－Ｈを使用してデブリをゲートアウトし、ＦＳＣ－Ｈ対ＦＳＣ－Ａを使用してダブレットをゲートアウトし、ＦＳＣ－Ｈ対ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅＨを使用してＤＡＰＩ＋死細胞をゲートアウトし、任意選択でＦＩＴＣ－Ｈヒストグラムを使用してＧＦＰ＋細胞を同定することにより進める。このようにゲーティングしたら、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（標的結合を検出するための共染色）を使用してソーティング及び分析を行った。

スクリーニングは、磁気ソーティングとフローソーティングの組み合わせを使用して実施した。磁気ソーティングは、次のとおりに実施した：２×１０^８の２９３Ｆ細胞にＳＤＧＦＣＤＰライブラリを約１のＭＯＩで形質導入し、形質導入後３日まで拡大させた。最初のスクリーニングでは、磁気セルソーティングを実施した。１×１０^９の形質導入した細胞を、最終体積２５ｍＬの２００ｎＭのビオチン化ＴｆＲ、２ｍＬの抗ビオチンＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（ＵｌｔｒａＰｕｒｅ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ１３０－１０５－６３７）、及び２１ｍＬのＦｌｏｗ緩衝液（ＰＢＳ＋２ｍＭＥＤＴＡ及び０．５％ウシ血清アルブミン）を含む結合緩衝液中に再懸濁した。細胞を氷上で攪拌しながら（２～５分ごとに穏やかに反転）３０分間インキュベートし、次いで、ＦｌｏｗＢｕｆｆｅｒで１０倍に希釈して２５０ｍＬにし、ペレット化し（５００×ｇ、５分間）、ＨｉｇｈＢＳＡＦｌｏｗ緩衝液（２ｍＭのＥＤＴＡ及び３％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で再懸濁して４０ｍＬにした。細胞を４つの１０ｍＬアリコートに分割し、「ｐｏｓｓｅｌｄ」プロトコール及びそれぞれのソート後の「クイックリンス」を使用して、ＭｉｌｔｅｎｙｉａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）ＰｒｏＳｅｐａｒａｔｏｒにかけた。ランニング緩衝液及び洗浄緩衝液はそれぞれＨｉｇｈＢＳＡＦｌｏｗ緩衝液及びＰＢＳ＋２ｍＭのＥＤＴＡであった。溶出した細胞をプールし、ペレット化し、それらのＣＤＰ配列をＰＣＲ増幅した（Ｔｅｒｒａ（商標）ＰＣＲＤｉｒｅｃｔＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＭｉｘ（Ｔａｋａｒａ６３９２７１）、１６サイクル後にＰｈｕｓｉｏｎ）。このサブライブラリを上記のようにＳＤＧＦにクローニングし、レンチウイルスにして、フローソーティングのために、新しいバッチの２９３Ｆ細胞（１×１０^７細胞、ＭＯＩ約１）に形質導入した。

フローソーティングは、次のとおりに実施した：２００ｎＭのＴｆＲ、２００ｎＭのストレプトアビジンＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７コンジュゲート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳ２１３７４）、及び１μｇｍＬ^－１のＤＡＰＩを含む３ｍＬのＦｌｏｗ緩衝液中で染色した２．４×１０^７の細胞を使用してフローソーティングを行った。細胞をＦｌｏｗ緩衝液で４倍に希釈して１２ｍＬにし、ペレット化し（５００×ｇ、５分間）、３．６ｍＬのＦｌｏｗ緩衝液中に再懸濁した。細胞をＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＳｙｓｔｅｍ（ＢＤ）でソーティングし、ＦＳＣ－Ａ（培地）、ＳＳＣ－Ａ（培地）、ＤＡＰＩ－Ａ（陰性）、ＧＦＰ－Ａ（陽性）、及びＡＰＣ－Ａ（ＧＦＰ＋の上位７％）のチャネルに基づいてゲーティングした。それぞれのフローソーティング後、細胞を懸濁２４ウェルプレートのＦｒｅｅＳｔｙｌｅＭｅｄｉａ中で０．５～１ｍＬから培養し、３００ｒｐｍで振盪し、１２５ＲＰＭで振盪する１２５ｍＬのバッフル付きフラスコ中で最終体積３０ｍＬまで拡大した。この時点で、細胞を上記のように再びソーティングした。３回目のフローソーティング後、細胞を拡大し、１．５×１０^６の細胞のペレットで凍結した。ペレットを上記のようにＰＣＲ増幅し（ＴｅｒｒａＤｉｒｅｃｔＰＣＲに続いてＩｎＦｕｓｉｏｎ）、ＣＤＰインサートをＳＤＧＦにサブクローニングし、形質転換し（Ｓｔｅｌｌａｒコンピテント細胞）、クローニングされたＣＤＰのミニプレップ及び配列決定のためにコロニーを採取した。濃縮バリアントは、配列解析において、採取した約１００のコロニーで１回を超えて出現するものとした。すべての部位飽和変異導入（ＳＳＭ）による親和性成熟スクリーニングは、次の変化を加えてすべて上記のように行った：１）染色は連続的に、最初にＴｆＲを用いて、次いで等モル量の色素標識ストレプトアビジンを用いて行った。２）ＴｆＲ／ストレプトアビジン濃度を、最初のＳＳＭ成熟スクリーニングでは２０ｎＭに、２回目のＳＳＭ成熟スクリーニングでは８ｎＭに下げた。それぞれのＳＳＭスクリーニング後、個々の変異のうち１つまたは２つのいずれかを含むバリアントのいずれよりも高いＴｆＲ染色を示す複合変異体（配列番号２または配列番号３２のペプチド）を組み立てるために、濃縮バリアントを調べた。

図１Ｂ～図１Ｇのフローサイトメトリーのプロットは、プールされた高多様性ライブラリからのＴｆＲに結合する細胞の連続濃縮を示す。図１Ａは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）の精製の成功を示すＴｆＲタンパク質のクマシー染色ゲルを示す。図１Ｂは、１回のフローソート後に候補ＴｆＲ結合ペプチドを提示する細胞のフローサイトメトリープロットを示す。細胞は、蛍光ストレプトアビジンで標識されたＴｆＲに結合する能力に基づいて分類された。右上の領域のデータ点は、蛍光ＴｆＲ－ストレプトアビジンの蛍光によって定量化された、ＴｆＲに結合する、ＧＦＰ蛍光によって定量化された候補ペプチドを発現する細胞を表す。図１Ｃは、１回のフローソート後に候補ＴｆＲ結合ペプチドを提示する細胞の陰性対照フローサイトメトリープロットを示す。細胞は、蛍光ストレプトアビジンで標識された対照タンパク質に結合する能力に基づいて分類された。右上の領域のデータ点は、蛍光対照タンパク質－ストレプトアビジンの蛍光によって定量化された、陰性対照タンパク質に結合する、ＧＦＰ蛍光によって定量化された候補ペプチドを発現する細胞を表す。図１Ｄは、図１Ｂに示される１回目のフローソート後の２回目のフローソート後の候補ＴｆＲ結合ペプチドを提示する細胞のフローサイトメトリープロットを示す。細胞は、蛍光ストレプトアビジンで標識されたＴｆＲに結合する能力に基づいて分類された。右上の領域のデータ点は、蛍光ＴｆＲ－ストレプトアビジンの蛍光によって定量化された、ＴｆＲに結合する、ＧＦＰ蛍光によって定量化された候補ペプチドを発現する細胞を表す。図１Ｅは、図１Ｃに示される１回目のフローソート後の２回目のフローソート後の候補ＴｆＲ結合ペプチドを提示する細胞の陰性対照フローサイトメトリープロットを示す。細胞は、蛍光ストレプトアビジンで標識された対照タンパク質に結合する能力に基づいて分類された。右上の領域のデータ点は、蛍光対照タンパク質－ストレプトアビジンの蛍光によって定量化された、陰性対照タンパク質に結合する、ＧＦＰ蛍光によって定量化された候補ペプチドを発現する細胞を表す。図１Ｆは、図１Ｄに示される２回目のフローソート後の３回目のフローソート後の候補ＴｆＲ結合ペプチドを提示する細胞のフローサイトメトリープロットを示す。細胞は、蛍光ストレプトアビジンで標識されたＴｆＲに結合する能力に基づいて分類された。右上の領域のデータ点は、蛍光ＴｆＲ－ストレプトアビジンの蛍光によって定量化された、ＴｆＲに結合する、ＧＦＰ蛍光によって定量化された候補ペプチドを発現する細胞を表す。ボックスは、ＴｆＲに結合するペプチドを発現する細胞を示す。図１Ｇは、図１Ｅに示される２回目のフローソート後の３回目のフローソート後の候補ＴｆＲ結合ペプチドを提示する細胞の陰性対照フローサイトメトリープロットを示す。細胞は、蛍光ストレプトアビジンで標識された対照タンパク質に結合する能力に基づいて分類された。右上の領域のデータ点は、蛍光対照タンパク質－ストレプトアビジンの蛍光によって定量化された、陰性対照タンパク質に結合する、ＧＦＰ蛍光によって定量化された候補ペプチドを発現する細胞を表す。ボックスは、陰性対照タンパク質に結合するペプチドを発現する細胞を示す。

それぞれのフローソーティングは、３０００万細胞を超える細胞のライブラリの増殖、ＴｆＲ結合の染色、及び上位の結合物質のフローソーティングを表す。ソーティングした結合物質は、増殖させてから、次のフローソーティングを実施した。

実施例４
ＴｆＲ結合ペプチドの特定
本実施例は、実施例３に記載されている哺乳動物表面提示系を使用するＴｆＲ結合ペプチドの同定について記載する。

実施例３の哺乳動物表面提示系を使用して、配列番号１の配列（配列番号１は配列番号６５にＮ末端ＧＳを付加したものである）を有する単一クローンペプチドを同定した。１０，０００個のＣＤＰをコードするオリゴヌクレオチドのライブラリを増幅し、変異導入した。ＣＤＰは、４、６、８、または１０個のシステインを含む、１７～５０アミノ酸長であった。ライブラリには、アノテーションのあるノッチンまたはデフェンシンに対してある程度の重み付けがあるが、ライブラリにはあらゆる生物のドメイン／界のＣＤＰが含まれた。このライブラリをＳＤＧＦにクローニングし、レンチウイルスにし、２９３Ｆ懸濁細胞に形質導入した。形質導入した細胞をＴｆＲ（２００ｎＭ）で染色し、１ラウンドの磁気セルソーティング及び３ラウンドのフローソーティングの過程で共染色し、それぞれのラウンドでＴｆＲで染色された細胞が濃縮された。結合は、ビオチン化したものまたはＨｉｓタグを付加したもののいずれかである２００ｎＭの可溶性ＡＦ６４７－ＴｆＲを使用する表面提示アッセイにおいて、ＴｆＲに特異的に結合することを検証した。染色は、四価の標的アビディティの１ステップ染色プロトコールを使用して実施した。最終の濃縮細胞集団のＤＮＡ配列決定によって、単一のＴｆＲ結合ＣＤＰが同定され、配列番号１と指定された。これは、海洋襟鞭毛虫Ｍｏｎｏｓｉｇａｂｒｅｖｉｃｏｌｉｓに由来するシトクロムＢＣ１複合体サブユニット６（ＵｎｉｐｒｏｔＩＤ：Ａ９Ｖ０Ｄ７、ＤＯＩ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｕ９８９）をランダム変異させたバリアントであり、４９アミノ酸の長さ（６つのシステイン）で、予測される分子量は５．６ｋＤａである。次いで、部位飽和変異導入（ＳＳＭ）を使用して、配列番号６５を親和性成熟に供し、可能な限りの非システイン単一アミノ酸置換を含むようにライブラリを作成する（４３個の非Ｃｙｓアミノ酸×１８個の可能な非Ｃｙｓ置換＝７７５個のバリアント、配列番号１を含む）。

図２Ａ～図２Ｄのフローサイトメトリーのプロットは、単一クローンＴｆＲ結合ペプチドを提示し、ＴｆＲまたは陰性対照タンパク質のいずれかとの結合についてスクリーニングされた細胞のフローサイトメトリーを示す。単一のＴｆＲ結合ペプチドのフローサイトメトリーを実行して、同定されたＴｆＲ結合ペプチドが特異的にＴｆＲに結合し、ストレプトアビジン標識には結合しないことを確認した。本実験に使用された対照タンパク質は、配列番号１８６（ＭＲＬＡＶＧＡＬＬＶＣＡＶＬＧＬＣＬＡＤＹＫＤＥＨＨＨＨＨＨＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＧＧＧＳＫＴＶＲＷＣＡＶＳＥＨＥＡＴＫＣＱＳＦＲＤＨＭＫＳＶＩＰＳＤＧＰＳＶＡＣＶＫＫＡＳＹＬＤＣＩＲＡＩＡＡＮＥＡＤＡＶＴＬＤＡＧＬＶＹＤＡＹＬＡＰＮＮＬＫＰＶＶＡＥＦＹＧＳＫＥＤＰＱＴＦＹＹＡＶＡＶＶＫＫＤＳＧＦＱＭＮＱＬＲＧＫＫＳＣＨＴＧＬＧＲＳＡＧＷＮＩＰＩＧＬＬＹＣＤＬＰＥＰＲＫＰＬＥＫＡＶＡＮＦＦＳＧＳＣＡＰＣＡＤＧＴＤＦＰＱＬＣＱＬＣＰＧＣＧＣＳＴＬＮＱＹＦＧＹＳＧＡＦＫＣＬＫＤＧＡＧＤＶＡＦＶＫＨＳＴＩＦＥＮＬＡＮＫＡＤＲＤＱＹＥＬＬＣＬＤＮＴＲＫＰＶＤＥＹＫＤＣＨＬＡＱＶＰＳＨＴＶＶＡＲＳＭＧＧＫＥＤＬＩＷＥＬＬＮＱＡＱＥＨＦＧＫＤＫＳＫＥＦＱＬＦＳＳＰＨＧＫＤＬＬＦＫＤＳＡＨＧＦＬＫＶＰＰＲＭＤＡＫＭＹＬＧＹＥＹＶＴＡＩＲＮＬＲＥＧＴＣＰＥＡＰＴＤＥＣＫＰＶＫＷＣＡＬＳＨＨＥＲＬＫＣＤＥＷＳＶＮＳＶＧＫＩＥＣＶＳＡＥＴＴＥＤＣＩＡＫＩＭＮＧＥＡＤＡＭＳＬＤＧＧＦＶＹＩＡＧＫＣＧＬＶＰＶＬＡＥＮＹＤＫＳＤＮＣＥＤＴＰＥＡＧＹＦＡＶＡＶＶＫＫＳＡＳＤＬＴＷＤＮＬＫＧＫＫＳＣＨＴＡＶＧＲＴＡＧＷＮＩＰＭＧＬＬＹＮＫＩＮＨＣＲＦＤＥＦＦＳＥＧＣＡＰＧＳＫＫＤＳＳＬＣＫＬＣＭＧＳＧＬＮＬＣＥＰＮＮＫＥＧＹＹＧＹＴＧＡＦＲＣＬＶＥＫＧＤＶＡＦＶＫＨＱＴＶＰＱＮＴＧＧＫＮＰＤＰＷＡＫＮＬＮＥＫＤＹＥＬＬＣＬＤＧＴＲＫＰＶＥＥＹＡＮＣＨＬＡＲＡＰＮＨＡＶＶＴＲＫＤＫＥＡＣＶＨＫＩＬＲＱＱＱＨＬＦＧＳＤＶＴＤＣＳＧＮＦＣＬＦＲＳＥＴＫＤＬＬＦＲＤＤＴＶＣＬＡＫＬＨＤＲＮＴＹＥＫＹＬＧＥＥＹＶＫＡＶＧＮＬＲＫＣＳＴＳＳＬＬＥＡＣＴＦＲＲＰＧＳＳＥＬＹＥＮＫＰＲＲＰＹＩＬ）に示されるアミノ酸配列を有する。図２Ａは、標識された陰性対照タンパク質への結合についてスクリーニング（ｙ軸、蛍光抗Ｈｉｓ抗体で染色）された配列番号１のＴｆＲ結合ペプチドを発現する細胞（ｘ軸、ＧＦＰ）の陰性対照フローサイトメトリープロットを示す。図２Ｂは、配列番号１のペプチドを発現する細胞（ｘ軸、ＧＦＰ）及びＴｆＲ（ｙ軸、蛍光抗Ｈｉｓ抗体で染色）のフローサイトメトリープロットを示す。図２Ｃは、標識された陰性対照タンパク質への結合についてスクリーニング（ｙ軸、蛍光抗ストレプトアビジンで染色）された配列番号１のＴｆＲ結合ペプチドを発現する細胞（ｘ軸、ＧＦＰ）の陰性対照フローサイトメトリープロットを示す。図２Ｄは、ＴｆＲへの結合についてスクリーニング（ｙ軸、蛍光抗ストレプトアビジンで染色）された配列番号１のＴｆＲ結合ペプチドを発現する細胞（ｘ軸、ＧＦＰ）のフローサイトメトリープロットを示す。

ＴｆＲ染色は、同定されたクローンを発現する細胞で観察され、対照タンパク質では染色はみられなかった。この染色は、蛍光ストレプトアビジンまたは抗Ｈｉｓ抗体のいずれかが共染色であるときに観察され、これは、結合の性質が共染色ではなくＴｆＲにのみ依存することを示している。二重陽性細胞（右上の四分円）は、ＴｆＲに結合したペプチド発現細胞を示す。

哺乳動物提示スクリーニングを使用する代替の方法を使用して、第２世代及び第３世代の結合物質であるＴｆＲ結合ペプチドを同定及び最適化（「成熟」）した。このライブラリを、低濃度の標的及び共染色（２０ｎＭ）ならびに別個の染色ステップを使用する改変した染色プロトコールでスクリーニングした。後者は、ストレプトアビジンによって付与される四価のアビディティを排除することによって、ストリンジェンシーがさらに高まる。最大４ラウンドのフローソーティング及び濃縮を使用して、ＴｆＲ結合特性が改善したバリアントを同定した。濃縮されたバリアントの順列により最適な変異体（配列番号２（配列番号２は、配列番号６６にＮ末端ＧＳを付加したもの））を同定し、このプロセスを再度繰り返して（８ｎＭのＴｆＲ共染色；それ以外は同一のプロトコール）、配列番号３２（配列番号３２は、配列番号９６にＮ末端ＧＳを付加したもの）を生成した。この２回成熟したバリアントには、元のライブラリメンバー（ＧＳＲＥＧＣＡＳＨＣＴＫＹＫＡＥＬＥＫＣＥＡＲＶＳＳＲＳＮＴＥＥＴＣＶＱＥＬＦＤＦＬＨＣＶＤＨＣＶＳＱ、配列番号１９１）からの１４個の点変異が含まれている。親配列からの４個の点変異が配列番号１に見られるが、配列番号２及び配列番号３２は前世代からのそれぞれ６個及び４個の変異を含んでいる。

配列番号１及びそのバリアント（例えば、配列番号２及び配列番号３２）を可溶性ペプチドとして生成し、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び質量分析によって検証した。約５～６ｋＤａの質量に基づくと、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで移動度が予想よりも遅かったことは、一部のＣＤＰが興味深い電気泳動移動度特性を有することを示している。すべてのバリアントは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥとＲＰ－ＨＰＬＣの両方でＤＴＴ還元（１０ｍＭ）時に極めて異なる移動度を示したことから、ジスルフィド結合の安定化が確認された。ＴｆＲへの結合は、表面プラズモン共鳴（図４）によって検証され、成熟バリアントの親和性の増加も確認された（配列番号３２［Ｋ_Ｄ＝２１６±１ｐＭ］＞配列番号２［Ｋ_Ｄ＝８．７±０．４ｎＭ］＞配列番号１［Ｋ_Ｄは決定されていないが、利用可能なデータは、Ｋ_Ｄと一致する＞１０μＭ］）。すべてのバリアントは、細胞の還元条件（１０ｍＭのグルタチオン）に対して完全または部分的な耐性を示したが、親和性成熟バリアントは、ペプシンに対して部分的な耐性を示した（ただし、すべてトリプシンタンパク質分解には弱かった）。配列番号３２タンパク質のインタクトな非還元ペプチドは、ＤＴＴ還元タンパク質と同程度まで、実質的に改善した熱耐性を示し、一般的な周囲温度をはるかに超える（５０℃超）まで円偏光二色性の特徴には実質的な変化がなく、９５℃まで完全なアンフォールディングが観察されなかった。

実施例５
ペプチドの部位飽和変異導入
本実施例は、有益な変異または有害な変異を同定するための本開示のペプチドの部位飽和変異導入（ＳＳＭ）について例示する。部位飽和変異導入を配列番号１のペプチド（配列番号１は配列番号６５にＮ末端ＧＳを付加したものであり、図３Ａに結果を示す）及び配列番号２のペプチド（配列番号２は配列番号６６にＮ末端ＧＳを付加したものであり、図３Ｂに結果を示す）に対して実施した。

図３Ａ及び図３Ｂは、ペプチド成熟中に同定されたＴｆＲ結合ペプチドバリアントのＴｆＲ結合能力を示す。最初の哺乳動物表面提示実験（例えば、図１Ｂ～図１Ｇ、及び図２Ａ～図２Ｄを参照されたい）で同定された配列番号１の配列を有するペプチドの親和性成熟のために、ＳＳＭを採用した。それぞれの成熟ラウンド中に、可能性のあるすべての非システイン点バリアントのライブラリを構築し、最初のスクリーニングよりも高いストリンジェンシーでＴｆＲに対してスクリーニングした。結合が改善したバリアントを濃縮し、Ｓａｎｇｅｒ配列決定によって同定した。このように濃縮されたバリアント変異をさまざまな順列で互いに組み合わせて（データに示される）、複合的に改善された結合物質を同定した。ＳＳＭの２ラウンドを完了させ、配列番号２及び配列番号３２（配列番号３２は配列番号９６にＮ末端ＧＳを付加したものである）をそれぞれ含む成熟ペプチドを得た。ＳＳＭの最初のラウンドにおけるＴｆＲ濃度は２０ｎＭであり、１ステップ染色を使用してＳＳＭを実施した。ＳＳＭの２回目のラウンドにおけるＴｆＲ濃度は８ｎＭであり、２ステップ染色を使用してＳＳＭを実施した。

ＳＳＭライブラリのペプチドを発現する哺乳動物細胞のＴｆＲ結合は、実施例３及び実施例４に記載されているように実施したが、より高いストリンジェンシープロトコールを用いた。より高いストリンジェンシープロトコールは、より低濃度のＴｆＲ（例えば、２０ｎＭ）を含んだ。

図３Ａは、配列番号１（配列番号１は配列番号６５にＮ末端ＧＳを付加したものである）の最初の部位飽和変異導入スクリーニングの結果を示しており、配列番号４、配列番号５、及び配列番号８の配列（配列番号４、配列番号５、及び配列番号８はそれぞれ配列番号６８、配列番号６９、及び配列番号７２にＮ末端ＧＳを付加したものである）を有するペプチドなどのいくつかのバリアントは、ＴｆＲに対する結合活性の改善を示している。図３Ｂは、第２のバリアント変異中に同定されたバリアントのＴｆＲ結合を示す。

ｘ軸はすべてのバリアントの配列番号を示し、ｙ軸は、フローサイトメトリー実験から推定された相対蛍光単位（ＲＦＵ）でのＴｆＲ結合量を示す。
実施例６
ＳＳＭで生成されたＴｆＲ結合ペプチドバリアントのＴｆＲ結合

本実施例は、実施例５に記載されるようにＳＳＭ中に同定された、部位飽和変異導入（ＳＳＭ）で生成されたＴｆＲ結合ペプチドバリアントのＴｆＲ結合を実証する。

インビボにおけるＢＢＢ透過実験により、ペプチドのＴｆＲ結合能力と小胞性トランスサイトーシスを促進する能力は、必ずしも対応しないことが明らかになった。

配列番号３２を基準として、残基Ｃ６、Ｃ１０、Ｃ２０、Ｃ３４、Ｃ４４、及びＣ４８（配列番号９６を基準にすると、Ｃ４、Ｃ８、Ｃ１８、Ｃ３２、Ｃ４２、及びＣ４６）に対応する６個のシステインは、ジスルフィドに関与し、したがって、ペプチド安定性に寄与する。

配列番号３２を基準として、残基Ｇ５、Ａ７、Ｓ８、Ｎ１４、Ｌ１７、Ｅ１８、Ｅ２１、Ｌ３８、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｄ４６、Ｈ４７、Ｓ５０、Ｑ５１、（配列番号９６を基準にすると、Ｇ３、Ａ５、Ｓ６、Ｎ１２、Ｌ１５、Ｅ１６、Ｅ１９、Ｌ３６、Ｌ４０、Ｌ４３、Ｄ４４、Ｈ４５、Ｓ４８、Ｑ４９）に対応する表面界面残基は、三世代すべてのＴｆＲ結合ペプチドに存在するものであり、ＴｆＲ結合に寄与している可能性が高い。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドまたはペプチド複合体は、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のこれらの対応する残基の少なくとも１つ以上を含む。したがって、そのようなペプチドは、ＴｆＲへの結合が増大するように操作することができる。

配列番号３２を基準として、次のアミノ酸残基Ｒ３、Ｅ４、Ｒ９、Ｋ１２、Ｄ１４、Ｅ１５、Ｋ１９、Ｒ２３、Ｓ２６、Ｓ２８、Ｎ２９、Ｔ３０、Ｅ３１、Ｅ３２、Ｄ３３、Ｅ３５、Ｑ３６、Ｅ３７、Ｅ３９、及びＤ４０（配列番号９６を基準にすると、Ｒ１、Ｅ３、Ｒ７、Ｋ１０、Ｄ１２、Ｅ１３、Ｋ１７、Ｒ２１、Ｓ２４、Ｓ２６、Ｎ２７、Ｔ２８、Ｅ２９、Ｅ３０、Ｄ３１、Ｅ３３、Ｑ３４、Ｅ３５、Ｅ３７、及びＤ３８）に対応する、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴなどの親水性表面遠位残基は、ペプチド可溶性に寄与している可能性が高い。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドまたはペプチド複合体は、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のこれらの対応する残基の少なくとも１つ以上を含む。したがって、そのようなペプチドは、可溶性が増大するように操作することができる。

より高い結合親和性は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴなどの親水性残基の存在と関連しており、これは、配列番号３２を基準として、Ｄ１５、Ｅ３５、Ｅ３９、及びＨ４９（配列番号９６を基準にすると、Ｄ１３、Ｅ３３、Ｅ３７、及びＨ４７）に対応する残基で、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、またはＹなどの非極性残基または疎水性残基ではない変異によって結合が改善することに示されるとおりである。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドまたはペプチド複合体は、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のこれらの対応する残基の少なくとも１つ以上を含む。したがって、そのようなペプチドは、結合親和性が改変するように操作することができる。

ＴｆＲへのより高い結合親和性は、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、またはＹなどの非極性残基または疎水性残基と関連しており、これは、配列番号３２を基準として、Ｍ１１、Ｍ２５、及びＭ２７（配列番号９６を基準にすると、Ｍ９、Ｍ２３、及びＭ２５）に対応するアミノ酸残基で、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴなどの親水性残基ではない変異によって結合が改善することに示されるとおりである。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドまたはペプチド複合体は、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のこれらの対応する残基の少なくとも１つ以上を含む。したがって、そのようなペプチドは、結合親和性が改変するように操作することができる。

より高いＴｆＲ結合親和性は、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、またはＶなどの脂肪族残基と関連しており、これは、配列番号３２を基準として、Ｌ４５（配列番号９６を基準にすると、Ｌ４３）に対応するアミノ酸残基で、Ｆ、Ｗ、またはＹなどの大きな芳香族残基ではない変異によって結合が改善することに示されるとおりである。本開示のペプチド中のいずれか１つ以上のＦ、Ｗ、またはＹを、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、またはＶを含む脂肪族残基に置換を使用して、ペプチドのＴｆＲに対する結合親和性を向上させることができる。

本開示のペプチドまたはペプチド複合体のいずれか（例えば、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか１つ）を、本明細書に記載の対応残基のうちの１つ以上において改変して、安定性の向上及び結合特性の増加（もしくは減少）またはＴｆＲ結合親和性の改変及びトランスサイトーシス特性の増加（もしくは減少）、例えば、ｋ_ａ（会合）及びｋ_ｄ（解離）速度定数の改変を含む、特性が改善されたペプチドバリアントを生成することができる。

特定のＴｆＲ結合ペプチドの配列アライメントを表９に示す。ＴｆＲとの相互作用に関与する特定の残基を太字で示す。表面相互作用残基は、以下に示すものが挙げられるが、これらに限定されない。

実施例７
ペプチド結合相互作用の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析
本実施例は、ＴｆＲとのペプチド結合相互作用の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析について示す。

本開示のさまざまなペプチドをＴｆＲへの結合親和性について解析した。簡潔に述べると、ＳｅｒｉｅｓＳＳＡチップを備えたＢｉａｃｏｒｅＴ１００機器（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）において２５℃で実施された、捕捉されたビオチン化ＴｆＲを使用するＳＰＲ実験によって、結合親和性を解析した。０．１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いる実験において、ＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）をランニング緩衝液として使用した。試験されるＴｆＲ結合ペプチドに応じて濃度範囲を変えた希釈系列を２ｕｇ／ｍｌのＴｆＲとインキュベーションし、ＳＰＲ実験のために約３００共鳴単位（ＲＵ）のタンパク質を捕捉することによって、可溶性ＴｆＲ結合ペプチドの結合を評価した。

最初に、図４に示されるように、さまざまな親和性を有するＴｆＲ結合ペプチドのアレルシリーズをＳＰＲによって確認した。配列番号１、配列番号２、配列番号４、及び配列番号３２の配列（配列番号１、配列番号２、配列番号４、及び配列番号３２はそれぞれ配列番号６５、配列番号６６、配列番号６８、及び配列番号６９にＮ末端ＧＳを付加したものである）を有するペプチドを３００ｎＭの濃度で試験した。データはそれぞれのトレースの最大応答に正規化された。その結果から、親和性成熟の後のラウンドのペプチドバリアントは、ＴｆＲに対して異なる結合親和性を示すことが確認された。すなわち、配列番号３２の配列を有する親和性成熟の最終ラウンドのペプチドは、ＴｆＲに対して最も高い結合親和性を示したのに対し、配列番号１は、ヒトＴｆＲ（ｈＴｆＲ）に対して最も低い結合親和性を示した。

次に、配列番号２、配列番号４、配列番号３０、及び配列番号３２の配列（配列番号２、配列番号４、配列番号３０、及び配列番号３２はそれぞれ配列番号６６、配列番号６８、配列番号９４、及び配列番号９６にＮ末端ＧＳを付加したものである）をそれぞれ有する４つのペプチドの、捕捉されたビオチン化ｈＴｆＲに対する結合を測定した。図５は、配列番号２の配列を有するペプチドの濃度を１００ｐＭ～２００ｎＭまで変えた場合のＴｆＲ結合を示す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）トレースを示す。図６は、配列番号４の配列を有するペプチドの濃度を１００ｐＭ～２００ｎＭまで変えた場合のＴｆＲ結合を示す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）トレースを示す。図７は、ＳＰＲによる、捕捉されたビオチン化（Ｂｔ）ｈＴｆＲに結合する配列番号３２の結合及びシングルサイクルカイネティクスデータを示す。５つの濃度の配列番号３２の配列を有するペプチド（０．０３７ｎＭ、０．１１ｎＭ、０．３３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ）を２つの密度の捕捉Ｂｔ－ｈＴｆＲに対して注入し、全体的に解析した。図８は、ＳＰＲによる、捕捉されたビオチン化ｈＴｆＲに結合する配列番号３０の結合及びシングルサイクルカイネティクスデータを示す。５つの濃度の配列番号３０の配列を有するペプチド（０．０３７ｎＭ、０．１１ｎＭ、０．３３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ）を２つの密度の捕捉Ｂｔ－ｈＴｆＲに対して注入し、全体的に解析した。

配列番号２及び配列番号４の結合は、１００ｐＭ～２００ｎＭ間の連続希釈で測定し、一方、配列番号３０及び配列番号３２は、３７ｐＭ～３ｎＭの連続希釈で試験して、カイネティクスデータを得た。配列番号３０及び配列番号３２のペプチドについては、ペプチドを２つの濃度（図７及び図８に示される）の捕捉されたビオチン化ｈＴｆＲに対して注入することによってカイネティクス試験を実施し、データを全体的に解析した。

以下の表１０は、図５～図８に示されるグラフを解析して得たデータを要約する。配列番号２の配列を有するペプチドについては、Ｋ_Ｄが８．７±４ｎＭ、Ｒ_ｍａｘが２３．１±２ＲＵであると決定した。配列番号４の配列を有するペプチドについては、Ｋ_Ｄが１４．８±６ｎＭ、Ｒ_ｍａｘが２１．２±２ＲＵであると決定した。配列番号３２の配列を有するペプチドについては、Ｋ_Ｄが２１６±１ｐＭであると決定した。配列番号３０の配列を有するペプチドについては、Ｋ_Ｄが４６８±１ｐＭであると決定した。Ｋ_Ｄ値が小さいほど結合親和性が高いことを示す。Ｒｍａｘは、ペプチドのｈＴｆＲに対する最大結合能力を表す。以下の表１０に示されるように、配列番号３２が最低のＫ_Ｄを有し、ｈＴｆＲに対して最も強い結合を示すことが示されている。ＴｆＲ結合親和性の増加は、トランスサイトーシス機能の改善に対応し得る。場合によっては、ＴｆＲ結合親和性の増加は、トランスサイトーシス機能の低下に対応する場合があり、場合によっては、ＴｆＲ結合親和性の増加は、参照ペプチドと比較して、トランスサイトーシス機能の変化に対応しない。いかなる理論に拘束されるものではないが、Ｋ_ａ／Ｋ_ｄの比がペプチドのトランスサイトーシス機能に影響を及ぼし得ることから、Ｋ_ａ及び／またはＫ_ｄの調節を使用することで、最適なＴｆＲ結合親和性及びトランスサイトーシス機能を有するＴｆＲ結合ペプチドを生成することができると考えられる。

実施例８
トランスフェリン受容体結合ペプチドのｐＨ非依存性結合
この実施例では、トランスフェリン受容体結合ペプチドのｐＨ非依存性結合について記載する。トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合し、配列番号３２の配列（Ｎ末端ＧＳが付加された配列番号９６に対応する）を有するＣＤＰを、実施例５に記載の部位飽和変異導入を使用して同定した。次いで、ＴｆＲに対するＴｆＲ結合ペプチドの結合親和性のｐＨ依存性を、例示的な細胞外ｐＨ７．４及び例示的なエンドソームｐＨ５．５で比較した。

配列番号３２のペプチドを発現する細胞を、ストレプトアビジン－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７で標識された１０ｎＭのビオチン化ＴｆＲで染色した。染色は、例示的な細胞外ｐＨ（ｐＨ７．４、図１０Ａ）の緩衝液中、または例示的なエンドソームｐＨ（ｐＨ５．５、図１０Ｂ）の緩衝液中で行った。ＴｆＲ蛍光は、配列番号３２の発現の関数として測定された。所望のペプチド発現レベルに対応するスライスゲートを比較のために選択した。選択されたスライスゲート内のＴｆＲ蛍光レベルは、試験されたｐＨでのＴｆＲに対するペプチドの親和性を示した。結果は、ＴｆＲ結合ペプチドが、生理学的細胞外ｐＨ（ｐＨ７．４、図１０Ｃ）よりもエンドソームｐＨ（ｐＨ５．５）でわずかに高い親和性でＴｆＲに結合し、ｐＨ５．５でわずかに高い親和性を有することを示した。

結果は、配列番号３２のＴｆＲ結合ペプチドが、細胞外ｐＨ及びエンドソームｐＨを含むｐＨの範囲でＴｆＲに結合できること、及びＴｆＲとの結合に対して比較的ｐＨに依存しない親和性を有することを示す。これは、エンドソーム内でＴｆＲに結合したまま、標的分子をエンドソームに動員する方法で使用するためのＴｆＲ結合ペプチドの適合性を実証する。これらの結果は、配列番号３２のＴｆＲ結合ペプチド、及び本開示の同様のＴｆＲ結合ＣＤＰが、ＴｆＲ結合ペプチドに連結されたペプチドとともに、ＴｆＲ媒介エンドサイトーシス後にＴｆＲとともに細胞表面に再循環され得ることを示唆している。

実施例９
ＰＤ－Ｌ１のｐＨ依存性エンドソーム送達のためのＰＤ－Ｌ１結合ペプチド
本実施例は、例えば、エンドソームｐＨ（例えば、ｐＨ５．５）で、ＰＤ－Ｌ１からｐＨ依存的に解離することが可能なＰＤ－Ｌ１結合ペプチドの開発及びインビトロ試験について記載する。

ターゲットエンゲージドメイン（ＣＤＰまたはその他）へのｐＨ依存性結合の付与は、さまざまな方法で行うことができ、その例を本明細書で提供する。ここでは、ヒスチジン置換を含むバリアントのライブラリが設計された。ヒスチジン残基が導入されたのは、すべての天然アミノ酸の中で、Ｈｉｓが中性（例えば、ｐＨ７．４）と酸性（例えば、ｐＨ＜６）のエンドソーム条件の間で電荷が大きく変化する側鎖を持つ唯一のアミノ酸であるためである。この電荷の変化は、例えば、エンドソームが酸性化するにつれて、生理学的細胞外環境からエンドソーム環境へと、ｐＨが変化する際に、結合を直接的に（近くの陽イオン基の電荷反発を引き起こし得る低ｐＨで正電荷を導入する）、または間接的に（電荷の変化がバインダーの構造に微妙な変化を与え、タンパク質間を破壊する）変化させることができる。最も単純な形式では、これは二重Ｈｉｓドープライブラリを生成することで実行でき、ＣＤＰの場合、すべての非Ｃｙｓ、非Ｈｉｓ残基を一度に１つまたは２つのＨｉｓで置換できる。図１１Ｄは、Ｈｉｓ置換マトリックスの上及び横の高親和性ＰＤ－Ｌ１結合ＣＤＰ配列（配列番号１８７、ＥＥＤＣＫＶＨＣＶＫＥＷＭＡＧＫＡＣＡＥＲＱＫＳＹＴＩＧＲＡＨＣＳＧＱＫＦＤＶＦＫＣＬＤＨＣＡＡＰ）を示す。それぞれの黒いボックスは、Ｈｉｓを置換できる１番目と２番目の部位を表す。純粋に左上から右下の対角線に沿ったものは、単一のＨｉｓ置換を表す。それぞれの黒いボックスは、１個または２個の天然からＨｉｓへの置換を有するバリアントを表し、スクリーニングされる８２１個のペプチドバリアントを表す。親配列と、１個または２個の天然からＨｉｓへの置換を有するバリアントを含むバリアントライブラリが生成され、試験された。

得られたヒスチジン濃縮ＴｆＲ結合ペプチドを、そのＴｆＲ結合について、さまざまなｐＨレベルまたは範囲での比較結合実験で評価した。ＰＤ－Ｌ１結合ペプチドのバリアントライブラリは、哺乳動物の表面ディスプレイを介して発現され、それぞれのバリアントは０、１個、または２個のＨｉｓ置換を含む。これらのバリアントは、細胞外ｐＨ（ｐＨ７．４など）下での結合の維持、及びエンドソームｐＨ（ｐＨ５．５など）下での結合の減少について試験された。図２１に示されるように、逐次スクリーニングを行った。入力ライブラリは、最初にｐＨ７．４でＰＤ－Ｌ１結合についてスクリーニングされ、強力な結合物質が選択された（影付きの領域）。スクリーニングの２ラウンド目と３ラウンド目（それぞれ「ソート１」と「ソート２」）は、エンドソームのｐＨを模倣するためにｐＨ５．５で実行され、弱い結合物質が収集された（影付きの領域）。スクリーニングの最終ラウンド（「ソート３」）はｐＨ７．４で実行され、強力な結合物質が選択された。スクリーニング後、ｐＨ７．４及びｐＨ５．５で異なる結合が観察された（「ソート４」）。

Ｅ２Ｈ、Ｍ１３Ｈ、及びＫ１６Ｈアミノ酸位置の１、２、または３箇所にヒスチジン置換を含む配列番号１８７のバリアントは、プールされたスクリーニングでＰＤ－Ｌ１のｐＨ依存性結合物質として同定された。ｐＨ依存性結合は、図２２に示されるように、単一バリアントを発現する細胞表面へのＰＤ－Ｌ１結合をｐＨ７．４及びｐＨ５．５で測定することによって検証された。Ｅ２Ｈ（ＥＨＤＣＫＶＨＣＶＫＥＷＭＡＧＫＡＣＡＥＲＱＫＳＹＴＩＧＲＡＨＣＳＧＱＫＦＤＶＦＫＣＬＤＨＣＡＡＰ、配列番号２３４）、Ｍ１３Ｈ（ＥＥＤＣＫＶＨＣＶＫＥＷＨＡＧＫＡＣＡＥＲＱＫＳＹＴＩＧＲＡＨＣＳＧＱＫＦＤＶＦＫＣＬＤＨＣＡＡＰ、配列番号２３５）、Ｋ１６Ｈ（ＥＥＤＣＫＶＨＣＶＫＥＷＭＡＧＨＡＣＡＥＲＱＫＳＹＴＩＧＲＡＨＣＳＧＱＫＦＤＶＦＫＣＬＤＨＣＡＡＰ、配列番号２３６）、Ｅ２Ｈ及びＭ１３Ｈ（ＥＨＤＣＫＶＨＣＶＫＥＷＨＡＧＫＡＣＡＥＲＱＫＳＹＴＩＧＲＡＨＣＳＧＱＫＦＤＶＦＫＣＬＤＨＣＡＡＰ、配列番号２３７）、Ｅ２Ｈ及びＫ１６Ｈ（ＥＨＤＣＫＶＨＣＶＫＥＷＭＡＧＨＡＣＡＥＲＱＫＳＹＴＩＧＲＡＨＣＳＧＱＫＦＤＶＦＫＣＬＤＨＣＡＡＰ、配列番号２３３）、Ｍ１３Ｈ及びＫ１６Ｈ（ＥＥＤＣＫＶＨＣＶＫＥＷＨＡＧＨＡＣＡＥＲＱＫＳＹＴＩＧＲＡＨＣＳＧＱＫＦＤＶＦＫＣＬＤＨＣＡＡＰ、配列番号２３８）、またはＥ２Ｈ、Ｍ１３Ｈ、及びＫ１６Ｈ（ＥＨＤＣＫＶＨＣＶＫＥＷＨＡＧＨＡＣＡＥＲＱＫＳＹＴＩＧＲＡＨＣＳＧＱＫＦＤＶＦＫＣＬＤＨＣＡＡＰ、配列番号２３９）での置換を含むペプチドは、配列番号１８７と比較された。Ｅ２Ｈ及びＫ１６Ｈでの置換を含む、配列番号２３３に対応するバリアントは、ｐＨ７．４でＰＤ－Ｌ１への強い結合を示し、ｐＨ５．５で結合の実質的な喪失を示した（黒い矢印）。他のバリアントと親ペプチドは、ｐＨ７．４とｐＨ５．５でさまざまなレベルのＰＤ－Ｌ１結合を示し、結合に対するさまざまな程度のｐＨ依存性を示した。

実施例１０
ＰＤ－Ｌ１の選択的枯渇のためのｐＨ依存性ＰＤ－Ｌ１結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体の開発
この実施例は、ＰＤ－Ｌ１の選択的枯渇のためのｐＨ依存性ＰＤ－Ｌ１結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体の開発を記載する。生理学的細胞外ｐＨで高いＰＤ－Ｌ１結合親和性を有するが、エンドソームのｐＨ５．５などの低いｐＨレベルでは著しく低下した結合親和性を有するペプチドを、実施例９に記載されるような、細胞結合、取り込み、及びエンドソーム内または小胞内放出のために選択する。エンドソーム送達能力の高いＴｆＲ結合ペプチドを同定し、特性評価する。生理学的細胞外ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）で高いＰＤ－Ｌ１結合親和性を有し、エンドソームｐＨ（例えば、ｐＨ５．５）で低い結合親和性を有するＰＤ－Ｌ１結合ペプチドを、生理的細胞外ｐＨとエンドソームｐＨで実質的に同じであるＴｆＲ結合親和性を有するＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４）と、任意選択でＰＤ－Ｌ１結合ペプチドとＴｆＲ結合ペプチドとの間に任意のリンカーを有するか、またはリンカーを有しないで、組換え融合するか、単一融合物として化学合成するか、別々に組換え発現させてコンジュゲートするか、または別々に化学合成してコンジュゲートする。

標的結合ＣＤＰのスクリーニングから、ｐＨ依存性結合のためのそのようなＣＤＰの改変、選択的枯渇のための組成物への組み込みまでの進行を示す試料スクリーニングパイプラインを図１１Ａに示す。ＣＤＰのペプチドライブラリは、標的分子に結合する能力についてスクリーニングされる。ライブラリからの標的結合ペプチドは、結合した標的分子からのシグナルの蓄積によって識別される。任意選択で、同定された標的結合ペプチドを選択し、例えば点変異スクリーニングを使用して、結合のためにさらに成熟させる。同定された標的結合ペプチドは、例えば、図１１Ｄに示され、実施例９に記載されるようにヒスチジン点変異スキャンを実施することによって、ｐＨ依存性結合物質に変換される。ｐＨ依存性標的結合ペプチドは、再循環ペプチド（例えば、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれかのＴｆＲ結合ペプチド）に融合または連結されて、選択的枯渇複合体を形成する。任意選択で、選択的枯渇複合体は、図１１Ｂに示されるように、選択的枯渇複合体を発現する細胞における標的枯渇を試験することによって検証される。図１１Ｃに示すように、複合体を健康な細胞及び形質転換細胞株でさらに試験して、選択的枯渇複合体の疾患特異的機能を測定することができる。複合体の特異性は、アポトーシス阻害剤の枯渇によるがん特異的な増殖阻害など、標的特異的な細胞機能の変化を試験することによって測定される。標的特異的な細胞機能は、外因性因子または内因性因子、または外因性因子と内因性因子の組み合わせに依存し得る。標的の分解とがん細胞の選択的障害は、患者に治療ウィンドウが存在することを示唆している。

ＰＤ－Ｌ１結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体によるがん特異的増殖阻害は、Ｔ細胞と共培養した細胞を使用して試験することができる。がん細胞表面から一部のＰＤ－Ｌ１を除去することにより、チェックポイント阻害シグナル伝達が減少し、腫瘍細胞が免疫系によって認識及び攻撃される可能性が高くなり、腫瘍増殖の減少、転移の減少、またはその他の有益な腫瘍応答の増加をもたらす。

実施例１１
ＴｆＲ媒介エンドサイトーシスによる可溶性標的分子の選択的枯渇
この実施例は、ＴｆＲ媒介エンドサイトーシスによる可溶性標的分子の選択的枯渇を記載する。標的結合ペプチドにコンジュゲートされたＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか１つ）を含む組成物を、ＴｆＲを発現する細胞に接触させる。ＴｆＲ結合ペプチドは、生理学的細胞外ｐＨ（ｐＨ７．４など）とエンドソームｐＨ（ｐＨ５．５など）の両方で高親和性でＴｆＲに結合し、標的結合ペプチドは生理的細胞外ｐＨでより高い親和性で、エンドソームｐＨでより低い親和性で可溶性標的分子に結合する。接触すると、ＴｆＲ結合ペプチドは細胞表面上のＴｆＲに結合し、標的結合ペプチドは溶液中の可溶性標的分子に結合する（図１２Ａ、（１））。ＴｆＲ結合ペプチドと標的結合ペプチドを含む組成物は、ＴｆＲ及び結合した標的分子とともに、ＴｆＲ媒介エンドサイトーシスを介してエンドサイトーシスされる（図１２Ａ、（２））。エンドソーム区画が酸性化されると、標的分子が標的結合ペプチドから放出される（図１２Ａ、（３））。次いで、標的分子はリソソーム区画で分解され（図１２Ａ、（４））、複合体はＴｆＲとともに細胞表面に再循環される（図１２Ａ、（５））。

実施例１２
ＴｆＲ媒介エンドサイトーシスによる表面標的分子の選択的枯渇
この実施例は、ＴｆＲ媒介エンドサイトーシスによる表面標的分子の選択的枯渇を記載する。標的結合ペプチドにコンジュゲートされたＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか１つ）を含む組成物を、ＴｆＲを発現する細胞に接触させる。ＴｆＲ結合ペプチドは、生理学的細胞外ｐＨ（ｐＨ７．４など）とエンドソームｐＨ（ｐＨ５．５など）の両方で高い親和性でＴｆＲに結合し、標的結合ペプチドは生理学的ｐＨでより高い親和性で、エンドソームｐＨではより低い親和性で、表面標的分子に結合する。接触すると、ＴｆＲ結合ペプチドは細胞表面のＴｆＲに結合し、標的結合ペプチドは細胞表面上の表面標的分子に結合する（図１２Ｂ、（１））。ＴｆＲ結合ペプチドと標的結合ペプチドを含む組成物は、ＴｆＲ及び結合した標的分子とともに、ＴｆＲ媒介エンドサイトーシスを介してエンドサイトーシスされる（図１２Ｂ、（２））。エンドソーム区画が酸性化されると、標的分子が標的結合ペプチドから放出される（図１２Ｂ、（３））。次いで、標的分子は、リソソーム区画で分解され（図１２Ｂ、（４））、複合体はＴｆＲとともに細胞表面に再循環される（図１２Ｂ、（５））。

実施例１３
血清アルブミン結合ペプチド複合体を使用するペプチド血漿半減期の延長
この実施例は、本明細書で開示される血清アルブミン結合ペプチド複合体を使用して、ペプチドの血清半減期または血漿半減期を延長する方法を実証する。配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか１つの配列を有するペプチドまたはペプチド複合体は、その血漿半減期を延長するために改変される。ペプチドと血清半減期延長部分を、組換え融合するか、単一融合体として化学合成するか、別々に組換え発現させてコンジュゲートするか、または別々に化学合成してコンジュゲートする。ペプチドを血清アルブミン結合ペプチドに融合させると、ペプチド複合体の血清半減期が延長する。ペプチドまたはペプチド複合体をＳＡ２１（配列番号１７８）などの血清アルブミン結合ペプチドにコンジュゲートする。任意選択で、ＳＡ２１に融合されたペプチドは、配列番号１８１または配列番号１８４のいずれか１つの配列を有する。任意選択で、ＳＡ２１に融合されたペプチドは、配列番号１７９の配列を有するペプチドリンカーを介してＳＡ２１に連結する。配列番号１７９に対応する配列を有するリンカーは、２つの別々の機能性ＣＤＰを連結して、血清半減期延長機能をペプチドまたはペプチド複合体に組み込む。配列番号１７９に対応する配列を有するリンカーは、ペプチド複合体のいずれのメンバーからも立体的な障害を受けることなく、ＳＡ２１が環化することを可能にする。代替的に、ＡｌｂｕタグまたはＣ_１４－Ｃ_１８脂肪酸もしくはパルミチン酸などの脂肪酸、などのアルブミン結合物質へのペプチドのコンジュゲーションを使用して血漿半減期を延長する。任意選択で、血漿半減期は、最小限の非ヒトタンパク質配列を使用することによって免疫原性が低下した結果として、延長される。

実施例１４
ＴｆＲ結合血清アルブミン結合ペプチド融合体の精製
この実施例は、血清アルブミン結合ペプチドＳＡ２１に融合されたＴｆＲ結合ペプチドの精製について記載する。図１３Ａ及び図１３Ｂは、ＳＡ２１融合ペプチドの精製を示す。ＳＡ２１をＣＤＰとの融合ペプチドとして組換え発現させ、ＨＰＬＣによって精製した。ペプチドを精製してシデロカリンに融合し（「Ｓｃｎ－ＣＤＰ」）、切断して、切断されたＳＡ２１融合ペプチド（「ＣＤＰ」）及びシデロカリン（「Ｓｃｎ」）を生成した。図１３Ａは、配列番号１８１に対応する血清アルブミンペプチド（ＳＡ２１）に融合されたペプチドＴｆＲ結合ペプチドの精製を示す。純度は、ＤＴＴ還元（「Ｒ」）または非還元（「ＮＲ」）条件下におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥ（左）及びＲＰ－ＨＰＬＣ（右）によって検証した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、切断していない（「Ｕ」）シデロカリン－ＣＤＰ融合ペプチドでも実施した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて、切断していない（「Ｕ」）試料では、シデロカリン－ＣＤＰ融合体（「Ｓｃｎ－ＣＤＰ」）に対応する明確なバンドが見られ、還元（「Ｒ」）及び非還元（「ＮＲ」）試料では、切断されたＳＡ２１融合（「ＣＤＰ」）、シデロカリン単独（「Ｓｃｎ」）、及び切断していない融合体（「Ｓｃｎ－ＣＤＰ」）に対応するバンドが見られた。非還元ＲＰ－ＨＰＬＣトレースで単一ピークが存在することは、純粋な未分解の試料があることを示した。図１３Ｂは、配列番号１８２（ＧＳＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＲＩＰＶＳＣＫＨＳＧＱＣＬＫＰＣＫＤＡＧＭＲＦＧＫＣＭＮＧＫＣＤＣＴＰＫ）に対応するＳＡ２１に融合されたペプチドの精製を示す。純度は、ＤＴＴ還元（「Ｒ」）または非還元（「ＮＲ」）条件下におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥ（左）及びＲＰ－ＨＰＬＣ（右）によって検証した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、切断していない（「Ｕ」）シデロカリン－ＣＤＰ融合ペプチドでも実施した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて、切断していない（「Ｕ」）試料では、シデロカリン－ＣＤＰ融合体（「Ｓｃｎ－ＣＤＰ」）に対応する明確なバンドが見られ、還元（「Ｒ」）及び非還元（「ＮＲ」）試料では、切断されたＳＡ２１融合（「ＣＤＰ」）、シデロカリン単独（「Ｓｃｎ」）、及び切断していない融合体（「Ｓｃｎ－ＣＤＰ」）に対応するバンドが見られた。非還元ＲＰ－ＨＰＬＣトレースで単一ピークが存在することは、純粋な未分解の試料があることを示した。

実施例１５
標的結合ペプチド及びＴｆＲ結合ペプチドのコンジュゲーション及び半減期延長のためのリンカー
この実施例は、標的結合ペプチド及びＴｆＲ結合ペプチドのコンジュゲーション及び任意選択で半減期延長のためのリンカーを記載する。ＴｆＲ結合ペプチド（例えば、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか１つ）は、リンカーを介して標的結合ペプチド（例えば、実施例９に記載のようにｐＨ依存性結合のために選択された標的結合ＣＤＰ）にコンジュゲートされる。標的結合ペプチドは、図１４Ａに示されるように、天然ＣＤＰ二量体由来のＤｋＴｘペプチド（配列番号１３９、ＫＫＹＫＰＹＶＰＶＴＴＮ）を介してＴｆＲ結合ペプチドに融合され得る。ＤｋＴｘペプチドリンカーは、ＨａｐｌｏｐｅｌｍａｓｃｈｍｉｄｔｉのＤｋＴｘ（ダブルノット毒素）としても知られる、Ｔａｕ－セラフォトキシン－Ｈｓ１ａの天然のノッチン－ノッチン二量体に由来する。本来、ＤｋＴｘリンカーは２つの独立したフォールディングＣＤＰドメインを分離し、２つの二量体化ＣＤＰの機能を維持するのに適している。標的結合ペプチドは、図１４Ｂに示されるように、溶解性のためにセリンが介在するさまざまな長さのグリシンを含む（配列番号１３８、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ）などのポリＧｌｙＳｅｒリンカーを介してＴｆＲ結合ペプチドに融合することができる。標的結合ペプチドは、図１４Ｃに示すように、５位にＣｙｓからＳｅｒへの変異を有するヒトＩｇＧリンカー（配列番号１４０、ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴ）を介してＴｆＲ結合ペプチドに融合させて、分泌中の架橋を防止することができる。２つのペプチドを二量体化するためのペプチドリンカーは、任意選択で以下の特性を有する：１）リンカーは、ＴｆＲ結合ドメイン及び標的結合ドメインの独立したフォールディングを妨害しない、２）リンカーは、ＴｆＲ結合ペプチド標的結合ペプチド二量体を介した標的分子とＴｆＲとの接触を促進するために、十分な長さを成熟分子に提供する、３）リンカーは、ＴｆＲ結合ペプチド標的結合ペプチド二量体の製造可能性（合成または組換え）に悪影響を及ぼさない、４）リンカーは、ＴｆＲ結合ペプチド標的結合ペプチド二量体の必要な合成後の化学的変化（例えば、フルオロフォアまたはアルブミン結合化学基のコンジュゲーション）を損なわない。

免疫グロブリン重鎖Ｆｃドメインを使用して、ＣＤＰ（または他のタンパク質ベースの標的結合モダリティ）を二量体化することもできる。これらは、抗体またはその他の可溶性機能ドメインに基づいて機能ドメインを二量体化するために、現代の分子医学で一般的に使用されている。標的結合ペプチドは、図１５に示されるように、ＩｇＧベースのＦｃドメインを介してＴｆＲ結合ペプチドに非共有結合することができる。Ｆｃドメインは、機能ドメインをホモ二量体化またはヘテロ二量体化するために、及び再循環Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）と相互作用するドメインを介して血清半減期延長を付与するために使用することができる。Ｆｃ配列が天然である場合、二量体化はホモ二量体になる可能性があるが、ヘテロ二量体形成を促進したい場合は、Ｆｃを、一方のＦｃＣＨ３が、もう一方のＦｃＣＨ３ドメインの空洞（穴）に適合するように設計された新規残基（ノブ）を含む「ノブインホール」フォーマットに変異させることができる。このプロセスを通じて、ノブ＋ノブ二量体はエネルギー的に非常に不利である。ホール＋ホール二量体を形成する可能性があるが、精製タグを特に「ノブ」側に追加すると、ホール＋ホール二量体を除外して、ノブ＋ホール二量体のみを精製することができる。Ｆｃドメインは、再循環受容体結合ドメインとして個別に使用できるため、二量体化にＦｃを使用すると、ペプチド複合体の再循環または選択的分解複合体の再循環を強化できる。

ＴｆＲ結合及び標的結合ＣＤＰは、第３（またはそれ以上）の機能ドメインを追加することにより、さらに機能化及び多量体化することができる。この実施例では、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａｍａｇｎａｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌアルブミン結合タンパク質（配列番号１９２）由来のアルブミン結合ドメインが示されている。これは、他のＣＤＰドメインの独立したフォールディングを乱す可能性が低い単純な３ヘリックス構造であるためである。そのような付加された機能ドメインは、図１６Ａ～図１６Ｃに示されるように、ＴｆＲ結合ドメイン及び標的結合ドメインに対して任意の配向で含まれ得る。ペプチドの例は、ポリ－ＧｌｙＳｅｒリンカーとともに示されているが、任意の多数のリンカー（例えば、配列番号１２９～配列番号１４１または配列番号１９５～配列番号２１８のいずれか１つ）を使用し得る。アルブミン結合ドメイン（例えば、配列番号１７８または配列番号１９２のペプチド）は、ＴｆＲ結合ペプチド、標的結合ペプチド、またはその両方に融合することができる。アルブミン結合ドメインは、ペプチドリンカー（例えば、配列番号１２９～配列番号１４１または配列番号１９５～配列番号２１８のいずれか１つ）を含むことができる。アルブミン結合ドメインは、図１６Ａに示されるように、標的結合ペプチド及びＴｆＲ結合ペプチドに連結することができる。アルブミン結合ドメインは、図１６Ｂに示されるように、標的結合ペプチドに連結することができる。アルブミン結合ドメインは、図１６Ｃに示されるように、ＴｆＲ結合ペプチドに連結することができる。アルブミン結合ドメインの付加は、ＴｆＲ結合ペプチド及び標的結合ペプチドを含む組成物の血清半減期を増加させることができる。

同様の方法及び設計を、再循環受容体としてＰＤ－Ｌ１が使用される方法において、再循環受容体としてＴｆＲ結合ドメインではなくＰＤ－Ｌ１結合ドメイン（例えば、ＰＤ－Ｌ１結合ペプチド）を含む選択的枯渇複合体に使用することができる。

実施例１６
ＴｆＲ結合ペプチドと標的結合ペプチドを含むＣＤＰ－ＣＤＰ二量体の機能的結合
この実施例は、ＴｆＲ結合ペプチドと標的結合ペプチドを含むＣＤＰ－ＣＤＰ二量体の機能的結合を記載する。配列番号２のＴｆＲ結合ペプチド及びイオンチャネル阻害性ＣＤＰを含むＣＤＰ－ＣＤＰ二量体。ＴｆＲ結合ペプチドは、ＤｋＴｘリンカー（配列番号１３９）またはＧＳ３リンカー（配列番号１４１）のいずれかによって、Ｋｖ１．３電位依存性カリウムチャネルのペプチド阻害因子（Ｚ１Ｅ－ＡｎＴｘ、Ｚ１Ｐ－ＡｎＴｘ、ＥＷＳＳ－ＳｈＫ、ＨｓＴｘ、Ｐｒｏ－Ｖｍ２４、またはＶｍ２４）に連結された。ＣＤＰ－ＣＤＰ二量体ペプチドは、ＴＥＶプロテアーゼで切断されたシデロカリン担体ペプチド（配列番号１４７）との融合物として発現された。精製ペプチドをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにかけ、ペプチド融合物が無傷であることを確認した（図１７Ａ）。それぞれのゲルは、左から右へ、後者の分子量（「Ｌ」）、非還元条件下のペプチド試料（「ＮＲ」）、及び還元条件下のペプチド試料（「Ｒ」）を含んでいた。ペプチド試料レーンの容易に識別可能なバンドは、上から下に、シデロカリンを含む未切断のＣＤＰ－ＣＤＰ二量体、切断されたシデロカリン、及び切断されたＣＤＰ－ＣＤＰ二量体に対応していた。バンド強度によって示されるように、ＣＤＰ－ＣＤＰ二量体複合体のすべてが良好に発現し、ＤＴＴによる還元時のシフトによって示されるように、折り畳まれているように見えた。

第２のアッセイでは、配列番号３２に対応する異なるＴｆＲ結合ＣＤＰを、ポリＧｌｙ－Ｓｅｒリンカー（配列番号１３８）を介してＶｍ２４イオンチャネル阻害因子に融合させた。得られたＣＤＰ－ＣＤＰ二量体を精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにかけた（図１７Ｂ、左下）。ＴｆＲ結合ペプチド（配列番号３２）及びＶｍ２４イオンチャネル阻害性ＣＤＰも個別に精製した（図１７Ｂ、左上及び左中央）。ＴｆＲ結合ペプチド、イオンチャネル阻害性ＣＤＰ、及びＣＤＰ－ＣＤＰ二量体の純度を、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ、図１７Ｂ、中央）を使用して比較した。次いで、Ｋｖ１．３イオンチャネルを阻害するそれぞれの複合体の能力を試験した（図１７Ｂ、右）。ＣＤＰ－ＣＤＰ二量体は、イオンチャネル阻害性ＣＤＰ単独と比較して、イオンチャネルを阻害する能力を保持していた。予想どおり、ＴｆＲ結合ペプチド単独ではＫｖ１．３を阻害しなかった。

実施例１７
ＴｆＲ結合ペプチドのマウスＴｆＲに対する交差反応性
この実施例は、細胞表面結合アッセイにおける本開示のＴｆＲ結合ペプチドのマウスＴｆＲに対する交差反応性を示す。表面上にヒトまたはマウスのいずれかのＴｆＲを発現する２９３Ｆ細胞を、ＮＨＳ－エステルコンジュゲーションによってＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７色素で直接標識した可溶性ＴｆＲ結合ペプチドで染色した。図１８Ａ及び図１８Ｂは、種特異的抗体を使用して、ヒト対マウスのＴｆＲ発現を検証するフローサイトメトリープロットを示す。図１８Ｃ及び図１８Ｄは、ペプチドが両方のホモログに効果的に結合することを示している。同様の実験において、フローサイトメトリーを使用して、配列番号１、配列番号２、配列番号３２、及び抗Ｔｆ抗体（陽性対照）の効果的な結合を実証した。

実施例１８
神経ＣＲＥレポーターマウスの活性化
この実施例は、本明細書に記載の１つ以上のＴｆＲ結合ペプチドを含むペプチド複合体を使用するニューロンＣＲＥトランスポーターマウスの活性化について記載する。この事例において、ＴｆＲ結合ペプチド及びニューロテンシンペプチドを含む融合ペプチドを使用した。配列番号１、配列番号２、及び配列番号３２（配列番号１、配列番号２、及び配列番号３２はそれぞれ配列番号６５、配列番号６６、及び配列番号９６にＮ末端ＧＳを付加したものである）に対応するペプチドを、それぞれのペプチドのＣ末端でニューロテンシンと融合させて、ペプチド－ＮＴ複合体を生成した。ニューロテンシンの下流活性には、細胞内Ｃａ^２＋制御及びｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）駆動型転写プログラム（図１９Ａ）が関与しており、慢性疼痛の抑制のために、その調節が探索されている。ペプチド－ＮＴは、２９３Ｆ細胞で組換え的に発現させ、精製した。精製ペプチドの分子量は、質量分析を使用して検証した。

ニューロテンシン受容体への結合は、ＮＴＳＲ１を発現するＨＥＫ－２９３細胞株で実証された。さまざまなタンパク質に対するニューロテンシン拡張が機能的であることを示すために、ＨＥＫ２９３細胞、またはヒトＮＴＳＲ１を送達するレンチベクターを形質導入したＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３－ＮＴＳＲ１）におけるＮＴＳＲ活性を、ＩＰ－Ｏｎｅ－Ｇｑキットを使用して測定した（ＣｉｓＢｉｏ６２ＩＰＡＰＥＢ、図１９Ｂ）。細胞をＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清中で増殖させ、Ａｃｃｕｔａｓｅを用いてプレートから取り出し、ペレット化し、ハンクス緩衝塩溶液中に１．５×１０^６の細胞／ｍＬの密度で懸濁した。ＨＴＦＲ反応は、ＨＴＦＲ９６ウェル低容量プレート（ＣｉｓＢｉｏ＃６６ＰＬ９６０２５）で製造者の使用説明書に従ってセットアップした。反応液２５μＬにつき１０，０００の細胞（７μＬ）を使用した。プレートを３７℃で６０分間インキュベートした。次いで、３μＬのＩＰ１－ｄ２作業溶液を加え、続いて、３μＬの抗ＩＰ１－Ｃｒｙｐｔａｔｅ作業溶液を加えた。室温で１時間のインキュベーションした後、波長６６５ｎｍ及び６２０ｎｍの励起後の蛍光発光について、プレートをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ２１０４ＥｎＶｉｓｉｏｎＭｕｌｔｉｌａｂｅｌＲｅａｄｅｒでスキャンした。ＦＲＥＴ比は、１０，０００×（６６５ｎｍのシグナル／６２０ｎｍのシグナル）で算出した。哺乳動物のＨＥＫ－２９３細胞において、ニューロテンシン（ＮＴ）受容体の結合は、ＮＴまたはＮＴペプチド複合体（ＮＴにコンジュゲートした配列番号１及びＮＴにコンジュゲートした配列番号３２、ならびにｍＴｆ－ＮＴ及びＮＴ、配列番号１または配列番号３２、ビヒクル、またはｍＴｆについてはなし）に応答する場合にのみＩＰ_１蓄積を示し、ウェル数は、ビヒクルを除くすべてでＮ＝３であり、ビヒクルはＮ＝３６であった（図１９Ｂ）。横棒は、試料の平均を示す。

実施例１９
高親和性及びｐＨ依存性のＥＧＦＲ結合ナノボディの開発
この実施例では、高親和性及びｐＨ依存性のＥＧＦＲ結合ナノボディの開発について記載する。ＥＧＦＲに結合するナノボディ（ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＳＶＱＴＧＧＳＬＲＬＴＣＡＡＳＧＲＴＳＲＳＹＧＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＧＩＳＷＲＧＤＳＴＧＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＡＡＡＧＳＡＷＹＧＴＬＹＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ、配列番号２１９）は、より高い親和性とＥＧＦＲへのｐＨ依存性結合のために改変された。ＥＧＦＲと相互作用することが結晶構造によって示される２つの相補性決定領域のそれぞれの残基にヒスチジン点変異を含むペプチドライブラリを生成した（それぞれＣＤＲ１及びＣＤＲ３を示す配列番号２１９で下線を付した）。ＣＤＲ１には１０個の非ヒスチジン残基が含まれているため、０、１個、または２個のヒスチジンを有する最大５６のバリアントを生成できる。ＣＤＲ３には１７個の非ヒスチジン残基が含まれているため、０、１個、または２個のヒスチジンを有する最大１５４のバリアントを生成できる。ヒスチジン変異体を個別にテストした後、ヒットを組み合わせて単一のＶＨＨバリアントにするか、遺伝子組み換えを行い、５６×１５４＝８，６２４メンバーのバリアントライブラリとして試験した。このライブラリからのヒットは、ｐＨ約７．４で高い細胞染色／親和性を保持し、ｐＨ約６以下で低い細胞染色／親和性を示すスクリーニングによって同定された。

このスクリーニングを使用して、２個のＥＧＦＲ結合ナノボディが同定された。最初のＥＧＦＲ結合ナノボディ（配列番号２４２）は、配列番号２１９よりも高い親和性でＥＧＦＲに結合する高親和性ＥＧＦＲ結合ペプチドとして同定された。第２のＥＧＦＲ結合ナノボディ（配列番号２４３）は、約７．４で高親和性でＥＧＦＲに結合し、約６以下で結合親和性の減少を示したｐＨ依存性ＥＧＦＲ結合ナノボディとして同定された。

実施例２０
ｐＨ依存性標的結合ペプチドを同定するための部位飽和変異導入
この実施例では、ｐＨ依存性標的結合ペプチドを同定するための部位飽和変異導入について記載する。標的分子（例えば、ＰＤ－Ｌ１、ＶＥＧＦ、ＰＤ－１、ＥＧＦＲ、ＣＤ３８、ＧＤ２、ＳＬＡＭＦ７、ＣＴＬＡ－４、ＣＣＲ４、ＣＤ２０、ＰＤＧＦＲα、ＶＥＧＦＲ２、ＨＥＲ２、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ｂ、ネクチン－４、またはＴＲＯＰ２）に結合するペプチド（例えば、ナノボディ）は、実施例５にＴｆＲ結合ペプチドに関して記載されるように、部位飽和変異導入を行うことによって、ｐＨ依存性結合のために改変される。部位飽和変異体ライブラリは、生理学的細胞外ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）及びエンドソームｐＨ（例えば、ｐＨ５．５）での標的分子への結合についてスクリーニングされる。生理学的細胞外ｐＨでより高い結合親和性を示し、エンドソームｐＨで減少した結合親和性を示す変異体が選択され、さらにスクリーニングされる。部位飽和変異導入のその後のラウンドは、ｐＨ依存性結合をさらに改善するために、ヒットに対して実行される。

実施例２１
遺伝子療法または細胞療法を使用する選択的枯渇複合体の送達
この例では、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスを使用する選択的枯渇複合体の送達について記載する。選択的枯渇複合体の発現及び分泌をコードする遺伝子は、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）ベクターを使用して標的細胞に導入される。遺伝子療法の場合、標的細胞は患者内の細胞である。細胞療法の場合、標的細胞は、収集された患者細胞であり、ウイルスベクターで改変した後に患者に再導入される。ｏＨＳＶはがん細胞に感染し、ウイルスによって殺されなかったがん細胞は選択的枯渇複合体を発現して分泌する。残りの細胞は、腫瘍の微小環境を改変して、がん細胞に対する免疫活動を抑制する。選択的枯渇複合体は腫瘍細胞からインサイチュで分泌され、がんに作用し、Ｔ細胞または腫瘍微小環境の免疫抑制因子に向けられる。

代替的に、腫瘍またはＴ細胞の活性を変更する選択的枯渇複合体を、ＣＡＲ－Ｔ細胞または他の細胞療法に組み込むことができる。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍組織を標的とする遺伝子改変によってすでに特殊化されており、発現したキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）によって標的とされる細胞表面マーカーを運ぶ腫瘍細胞を殺傷する。これらの腫瘍に存在する制御性免疫抑制シグナル伝達の抑制などの補助的な活性が必要な場合、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、制御性免疫抑制シグナル伝達を抑制する選択的枯渇複合体も分泌するように操作されている。

実施例２２
選択的枯渇複合体、標的分子、及び受容体の間の三元複合体形成
この実施例では、細胞の表面にある間の選択的枯渇複合体、標的分子、及び受容体の間の三元複合体形成について記載する。標的結合ペプチド、第１のペプチドリンカー（ＧＧＧＧＳ×４、配列番号２２４）、アルブミン結合ペプチド（配列番号２２７）、第２のペプチドリンカー（ＧＧＧＧＳ×４、配列番号２２４）、及びＴｆＲ結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体（ＳＤＣ）は、図２３Ａに示されるように、標的分子及びトランスフェリン受容体に結合するように設計された。ＳＤＣは、ｐＨ依存的に結合する１個の結合末端を含むことができる。好ましくは、ｐＨ依存性結合は、エンドソームｐＨ（例えば、ｐＨ５．５、６．０、６．５、５．０、４．５）での結合と細胞外ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４、７．０）での結合とにおいて有意な差異を有する。しかしながら、エンドソームと細胞外のｐＨ結合の緩やかな違いも効果的であり得る。軽度のｐＨ依存性でＥＧＦＲに結合する標的結合ペプチド（配列番号２４４）と、配列番号２３２に対応するＲＥＧＣＡＳＨＣＴＫＹＫＡＥＬＥＫＣＥＡＲＶＳＳＲＳＮＴＥＥＴＣＶＱＥＬＦＤＦＬＨＣＶＤＨＣＶＳＱの配列を有する低親和性ＴｆＲ結合ペプチド（ペプチド１、配列番号３６７、ＮＳＤＳＥＣＰＬＳＨＤＧＹＣＬＨＧＧＶＣＭＹＩＫＡＶＤＲＹＡＣＮＣＶＶＧＹＩＧＥＲＣＱＹＲＤＬＴＷＷＧＰＲＧＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＫＥＡＫＥＫＡＩＥＥＬＫＫＡＧＩＴＳＤＹＹＦＤＬＩＮＫＡＫＡＶＥＧＶＮＡＬＫＤＥＩＬＫＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＥＧＣＡＳＨＣＴＫＹＫＡＥＬＥＫＣＥＡＲＶＳＳＲＳＮＴＥＥＴＣＶＱＥＬＦＤＦＬＨＣＶＤＨＣＶＳＱ）と、配列番号９６に対応する高親和性ＴｆＲ結合ペプチド（ペプチド２、配列番号３２８）とを含むペプチド複合体；軽度のｐｌｐＨ依存性でＰＤ－Ｌ１に結合する標的結合ペプチド（配列番号１８７）と、配列番号２３２に対応する低親和性ＴｆＲ結合ペプチド（ペプチド３、配列番号３５７、ＥＥＤＣＫＶＨＣＶＫＥＷＭＡＧＫＡＣＡＥＲＱＫＳＹＴＩＧＲＡＨＣＳＧＱＫＦＤＶＦＫＣＬＤＨＣＡＡＰＧＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＫＥＡＫＥＫＡＩＥＥＬＫＫＡＧＩＴＳＤＹＹＦＤＬＩＮＫＡＫＡＶＥＧＶＮＡＬＫＤＥＩＬＫＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＥＧＣＡＳＨＣＴＫＹＫＡＥＬＥＫＣＥＡＲＶＳＳＲＳＮＴＥＥＴＣＶＱＥＬＦＤＦＬＨＣＶＤＨＣＶＳＱ）とを含むペプチド複合体；または、軽度のｐｌｐＨ依存性でＰＤ－Ｌ１に結合する標的結合ペプチド（配列番号１８７）と、配列番号９６に対応する高親和性ＴｆＲ結合ペプチド（ペプチド４、配列番号３５６；ＥＥＤＣＫＶＨＣＶＫＥＷＭＡＧＫＡＣＡＥＲＱＫＳＹＴＩＧＲＡＨＣＳＧＱＫＦＤＶＦＫＣＬＤＨＣＡＡＰＧＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＫＥＡＫＥＫＡＩＥＥＬＫＫＡＧＩＴＳＤＹＹＦＤＬＩＮＫＡＫＡＶＥＧＶＮＡＬＫＤＥＩＬＫＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＥＧＣＡＳＲＣＭＫＹＮＤＥＬＥＫＣＥＡＲＭＭＳＭＳＮＴＥＥＤＣＥＱＥＬＥＤＬＬＹＣＬＤＨＣＨＳＱ）とを含むペプチド複合体は、図２３Ｂに示されるように、発現され、精製された。図２３Ｂは、４つのペプチド複合体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を示し、分子の発現及び精製の成功を確認している。４つのペプチド複合体は、細胞表面に発現した標的分子（ＥＧＦＲまたはＰＤ－Ｌ１）と受容体分子（ストレプトアビジン６４７で蛍光標識された可溶性ＴｆＲ外部ドメイン）の両方に結合することにより、三元複合体を形成する能力についてスクリーニングされた。

ＥＧＦＲまたはＰＤ－Ｌ１のいずれかを発現する細胞は、配列番号３６７（１）、配列番号３２８（２）、配列番号３５７（３）、及び配列番号３５６（４）に対応する４つのペプチド複合体で共染色され、ストレプトアビジン６４７で蛍光標識された可溶性ＴｆＲ外部ドメインで標識され、細胞表面への分子の結合は、図２３Ｃに示されるようにフローサイトメトリーによって評価された。ＥＧＦＲ結合ペプチドと高親和性ＴｆＲ結合ペプチド（ペプチド２、配列番号３２８に対応）を含む選択的枯渇複合体は、ＥＧＦＲを発現する細胞（左）と三元複合体を形成したが、ＰＤ－Ｌ１を発現する細胞（右）とは形成しなかった。逆に、ＰＤ－Ｌ１結合ペプチドと高親和性ＴｆＲ結合ペプチド（ペプチド４、配列番号３５６に対応）を含む選択的除去複合体は、ＰＤ－Ｌ１を発現する細胞（右）と三元複合体を形成したが、ＥＧＦＲを発現する細胞（左）とは形成しなかった。ＴｆＲへの低親和性結合を有する比較ペプチド複合体（ペプチド１及び３、それぞれ配列番号３６７及び配列番号３５７に対応する）は、図２３Ｃの右及び左のパネルにおける蛍光標識の欠如によって見られるように、三元複合体を形成しなかった。まとめると、このデータは、標的結合ペプチドと高親和性受容体結合ペプチドを含む選択的枯渇分子が、細胞表面上で標的（例えば、ＥＧＦＲまたはＰＤ－Ｌ１）及び受容体（例えば、ＴｆＲ）と三元複合体を形成することを実証している。

比較として使用する追加の選択的複合体及び複合体成分を表１１に提供する。

実施例２３
細胞特異的標的化のための選択的枯渇複合体の協同的結合
この実施例では、細胞特異的標的化のための選択的枯渇複合体の協同的結合について記載する。図２４Ａに示されるような、標的結合ペプチド及び受容体結合ペプチドを含み、Ｈｉｓタグ（配列番号２２８）で標識された選択的枯渇複合体（ＳＤＣ）、及び高親和性標的結合部分を含まないが受容体結合部分及びＨｉｓタグを含む対照ペプチドを、細胞表面上の標的分子及び受容体に協同的に結合する能力について試験した。ＴｆＲ（ＰＤＬ１－、ＴｆＲ＋）、またはＰＤ－Ｌ１とＴｆＲ（ＰＤＬ１＋、ＴｆＲ＋）の両方を発現する細胞を、ＰＤ－Ｌ１（ＰＤＬ１＋、ＴｆＲ－）、ＰＤ－Ｌ１とＴｆＲの両方（ＰＤＬ１＋、ＴｆＲ＋）と結合できるか、またはペプチドに結合できない（ＰＢＳ；ＰＤＬ１－、ＴｆＲ－）、蛍光抗Ｈｉｓ抗体で標識されている、ペプチド複合体とともにインキュベートした。細胞へのペプチド複合体の結合を測定するための読み出しとして蛍光を使用した。ＰＤ－Ｌ１とＴｆＲの両方に結合できるＳＤＣ（配列番号３５６）は、図２４Ｂに示される高い蛍光によって示されるように、ＰＤ－Ｌ１とＴｆＲの両方を発現する細胞に協同的に結合した。図２４Ｂに示されるように、同じＳＤＣは、ＴｆＲを発現するがＰＤ－Ｌ１を発現しない細胞に対して有意ではあるが、実質的に低い結合を示した。高親和性でＴｆＲに結合する能力を欠いているが、ＰＤ－Ｌ１結合ドメイン（配列番号３５７）を含むペプチド複合体は、ＴｆＲとＰＤ－Ｌ１を発現する細胞に対して低い結合を示した。まとめると、このデータは、機能的な標的結合ドメイン（例えば、ＰＤ－Ｌ１結合ペプチド）と機能的な受容体結合ドメイン（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド）の両方を含む選択的枯渇複合体が、標的分子と受容体の両方を発現する細胞に協同的に結合することを実証している。このデータはまた、機能的な受容体結合ドメイン（例えば、ＴｆＲ結合ペプチド）と、細胞表面に発現しない標的（可溶性標的など）に結合するドメインとを含むＳＤＣが受容体を発現する細胞に結合することも示している。

実施例２４
選択的枯渇複合体の設計
この実施例では、標的分子に結合して枯渇させるための選択的枯渇複合体の設計について記載する。標的結合ペプチドと受容体結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体は、エンドサイトーシス経路を介して再循環される受容体（例えば、ＴｆＲまたはＰＤ－Ｌ１）に結合し、標的分子（例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＥＧＦＲ）にも結合することによって、標的分子を枯渇させるように設計される。ＳＤＣの結合ペプチドの１つは、ｐＨ依存性結合（すなわち、エンドソーム／リソソームｐＨよりも細胞外ｐＨでより高い標的または受容体への結合）を示す。受容体がｐＨ非依存的に結合し（エンドソームまたはリソソームｐＨと同様の細胞外ｐＨでの結合など）、標的がｐＨ依存性で結合する場合、ＳＤＣは触媒的であり得る。受容体がｐＨ依存性で結合し、標的がｐＨ非依存性で結合する場合、ＳＤＣは非触媒的であり得る。受容体結合ペプチドは、リンカーを介した直接融合により、または二量体化ドメインを介した二量体化により、標的結合ペプチドと複合体を形成する。選択的枯渇複合体及び比較分子の例を、図２５Ａ及び図２５Ｂに示す。選択的枯渇複合体及び複合体成分は、リンカーまたは二量体化ドメインを介して標的結合ペプチドを受容体結合ペプチドに接続することによって組み立てられる。受容体結合ペプチドの例としては、ＴｆＲ結合ＣＤＰ（配列番号９６、「Ｔ」）またはＴｆＲ結合単鎖抗体（配列番号２２１、「Ｎ５」；または配列番号２２２、Ｍ１６」）が挙げられる。配列番号９６及び配列番号２２１は、ｐＨ非依存性でＴｆＲに結合することができ、配列番号２２２は、ｐＨ依存性でＴｆＲに結合することができる。標的結合ペプチドの例としては、ｐＨ依存性が制限されたＥＧＦＲ結合ナノボディ（配列番号２４２、「Ｇ２」）、ｐＨ依存性ＥＧＦＲ結合ナノボディ（配列番号２４３、「Ｐ」）、中程度のｐＨ依存性を有するＰＤ－Ｌ１結合ＣＤＰ（配列番号１８７；濃い黒丸）、または極度のｐＨ依存性を有するＰＤ－Ｌ１結合ＣＤＰ（配列番号２３３；淡い黒丸）が挙げられる。ペプチドリンカー（例えば、配列番号１２９～配列番号１４１、配列番号１９４～配列番号２１８、配列番号２２３～配列番号２２７、もしくは配列番号３９１）または二量体化ドメイン（例えば、配列番号２４５～配列番号２８７）は、図２５Ａで、複合体の１番目の行に見られるように、単一のポリペプチド鎖中で標的結合ペプチドを受容体結合ペプチドに連結するために、または、複合体の２番目の行に見られるように、標的結合ペプチドまたは受容体結合ペプチドを二量体化ドメインに連結するために、使用される。

二量体化ドメインは、Ｆｃホモ二量体化ドメイン（例えば、配列番号２４５～配列番号２５９のいずれか）またはノブインホール（ＫＩＨ）Ｆｃヘテロ二量体化ドメイン（例えば、配列番号２６０～配列番号２８７）であり得る。ヘテロ二量体を形成するために、配列番号２６０は配列番号２６１と二量体化し；配列番号２６２は配列番号２６３と二量体化し；配列番号２６４は配列番号２６５と二量体化し；配列番号２６６は配列番号２６７と二量体化し；配列番号２６８は配列番号２６９と二量体化し；配列番号２７０は配列番号２７１と二量体化し；配列番号２７２は配列番号２７３と二量体化し；配列番号２７４は配列番号２７５と二量体化し；配列番号２７６は配列番号２７７と二量体化し；配列番号２７８は配列番号２７９と二量体化し；配列番号２８０は配列番号２８１と二量体化し；配列番号２８２は配列番号２８３と二量体化し；配列番号２８４は配列番号２８５と二量体化し；配列番号２８６は配列番号２８７と二量体化する。好ましい標的結合、受容体結合、及び原子価特性を生成するために、成分が混合及び適合される。

一価の選択的枯渇複合体の例を、図２５Ａに示す。一価の選択的枯渇複合体は、リンカー（例えば、配列番号１２９～配列番号１４１、配列番号１９４～配列番号２１８、配列番号２２３～配列番号２２７、または配列番号３９１）を介して、受容体結合ペプチド（例えば、配列番号９６、「Ｔ」；配列番号２２１、「Ｎ５」；または配列番号２２２、「Ｍ１６」）に連結された標的結合ペプチド（例えば、配列番号２４２、「Ｇ２」；配列番号２４３、「Ｐ」；配列番号１８７、濃い黒丸；または配列番号２３３、淡い黒丸）を含む、単一のポリペプチド鎖として設計される。代替的に、一価の選択的枯渇複合体は、相補的ヘテロ二量体化ドメインを介して受容体結合ポリペプチドを含むポリペプチドとヘテロ二量体化された標的結合ペプチドを含むポリペプチドとして設計される（例えば、配列番号２６０～配列番号２８７から選択されるＫＩＨヘテロ二量体化ペア）。

標的：ＳＤＣ：受容体複合体はエンドソームに輸送され、そこでｐＨが徐々に低下する（初期エンドソーム、後期エンドソーム、リソソームなど）。低いｐＨでは、ＳＤＣのｐＨ依存性結合末端が標的または受容体に結合しなくなり得る。代表的な触媒活性分子は、ｐＨ非依存的に（例えば、配列番号９６または配列番号２２１を使用して）ＴｆＲに結合し、ｐＨ依存的に（例えば、配列番号２４３、配列番号１８７、配列番号２３３、または配列番号２３４を使用して）標的に結合することができ、したがって、ＴｆＲに結合したままであるが、低ｐＨエンドソーム内で標的を放出する。標的はリソソームに輸送され、分解され得る。ＴｆＲは細胞表面に再循環され、触媒活性のあるＳＤＣ分子が一緒に運ばれる。非触媒活性分子は、ｐＨ依存的に（例えば、配列番号２２２を使用して）ＴｆＲに結合し、ｐＨ非依存的に（例えば、配列番号２４２を使用して）標的に結合することができ、したがって、ＴｆＲから放出され、低ｐＨ条件で標的に結合したままである。次いで、標的とＳＤＣの両方がエンドソーム／リソソーム分解を受け得る。ＴｆＲ（例えば、配列番号９６または配列番号２２１を使用する）と標的（例えば、配列番号２４２を使用する）の両方への結合がｐＨ非依存性であり、低ｐＨエンドソームでこれらの分子が標的を放出することができなく、したがって、標的の分解を促進することのできない、対照分子を設計することができる。

二価の選択的枯渇複合体の例を、図２５Ｂに示す。これらの例は、ＴｆＲ結合部分の一例（配列番号９６）及び標的結合部分の一例（配列番号２４３）のみを示すが、この概念は、任意のＴｆＲ結合部分または任意の標的結合部分に適用することができ、図２５Ａに実証されるように、触媒活性、非触媒活性、または比較複合体について、ｐＨ依存性に基づいて同じ予想を受け得る。二価の選択的枯渇複合体には、１個または２個の標的結合ペプチドと１個または２個の受容体結合ペプチドが含まれている。二価選択的枯渇複合体は、１つ以上のリンカー（例えば配列番号１２９～配列番号１４１、配列番号１９４～配列番号２１８、配列番号２２３～配列番号２２７、もしくは配列番号３９１）、及び／またはホモ二量体化ドメイン（例えば、配列番号２４５～配列番号２５９のいずれか）もしくはヘテロ二量体化ドメインペア（例えば、配列番号２６０～配列番号２８７から選択されるＫＩＨヘテロ二量体化ペア）を介して、１つ以上の受容体結合ペプチド（例えば、配列番号９６、「Ｔ」；または配列番号２２１、または配列番号２２２（示さず））に連結された、１つ以上の標的結合ペプチド（例えば、配列番号２４３、「Ｐ」；または配列番号２４２、配列番号１８７、配列番号２３３、または配列番号２３４（示さず））を含む、ホモ二量体またはヘテロ二量体として設計される。代替的に、二価の選択的枯渇複合体は、リンカーを介して結合された１個または２個の標的結合ペプチド及び１個または２個の受容体結合ペプチドを含む単一のポリペプチド鎖として設計される。より高い価数のＳＤＣも設計できる。二価または多価のＳＤＣは、協同性により結合の増加を示すことができ、標的タンパク質の分解に対する分子の効力または機能を増加させることができる。例えば、受容体結合ペプチドがかなり速いオフ速度を有する場合、受容体に結合するために二価であるＳＤＣは、ＳＤＣが細胞に結合する能力を増加させることができ、細胞表面へと戻る受容体の輸送中の受容体にＳＤＣが結合したままになる能力も増加させることもできる。ＳＤＣは、１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上の標的結合ペプチドと１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上の受容体結合ペプチドを有することができる。ＳＤＣを多量体化するために、ＩｇＭ、ポリマー、または樹状足場を使用することができる。

図２５Ａ及び図２５Ｂでの選択的枯渇複合体は、受容体結合ペプチドが複合体のＮ末端に向かって位置し、標的結合ペプチドがＣ末端に向かって位置するように示されているが、複合体は、標的結合ペプチドがＮ末端に向かって、受容体結合ペプチドがＣ末端に向かってに対して配列されてもよい。さらに、選択的枯渇複合体は、３個以上の標的結合ペプチド及び／または３個以上の受容体結合ペプチドを含む多価複合体として設計され得る。

実施例２５
選択的枯渇複合体を使用するＰＤ－Ｌ１の選択的枯渇
この実施例は、選択的枯渇複合体を使用するＰＤ－Ｌ１の選択的枯渇を記載する。配列番号２３３または配列番号２３４のｐＨ依存性ＰＤ－Ｌ１結合ペプチドと配列番号９６または配列番号２２１のＴｆＲ結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体をＴｆＲとＰＤ－Ｌ１を発現する細胞に接触させる。選択的除去複合体は、ＴｆＲ結合ペプチドを介してＴｆＲに、ＰＤ－Ｌ１結合ペプチドを介してＰＤ－Ｌ１に協同的に結合し、細胞表面に三元複合体を形成する。ＴｆＲは、結合した選択的除去複合体及びＰＤ－Ｌ１とともにエンドサイトーシスされる。エンドソーム／リソソームの成熟中の酸性化の際に、選択的枯渇複合体がＰＤ－Ｌ１を放出し、ＴｆＲに結合したままになる。ＰＤ－Ｌ１はリソソーム内で分解され、それによってＰＤ－Ｌ１が選択的に枯渇する。ＴｆＲと選択的枯渇複合体は、細胞表面に再循環される。

選択的枯渇複合体は、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号３０８、配列番号３１７、配列番号３１８、配列番号３２２、配列番号３２３であるか；または選択的枯渇複合体は、配列番号：３０４、配列番号：３０６、配列番号：３１９、配列番号３２０、配列番号３２１、配列番号３２４、もしくは配列番号３２５とヘテロ二量体化された配列番号：２９２、配列番号：２９４、配列番号：３１５、配列番号：３１６であるか；または、選択的枯渇複合体は、配列番号３０４、配列番号３１９、配列番号３２１、もしくは配列番号３２４とヘテロ二量体化された配列番号２９５もしくは配列番号２９７であるか；または、選択的枯渇複合体は、配列番号３０３とヘテロ二量体化された配列番号２９８もしくは配列番号３００であるか；または、選択的枯渇複合体は、配列番号３０６、配列番号３１１、配列番号３２０、もしくは配列番号３２５とヘテロ二量体化された配列番号３２６である。

実施例２６
ＰＤ－Ｌ１を選択的枯渇することによるがんの治療
この実施例は、ＰＤ－Ｌ１を選択的に枯渇することによるがんの治療を記載する。配列番号２３３または配列番号２３４のｐＨ依存性ＰＤ－Ｌ１結合ペプチドと配列番号９６または配列番号２２１のものなどのＴｆＲ結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体は、ＰＤ－Ｌ１陽性がんを有する対象に投与される。選択的枯渇複合体は、がん細胞の表面でＰＤ－Ｌ１とＴｆＲに結合し、選択的枯渇複合体、ＰＤ－Ｌ１、及びＴｆＲの三元複合体がエンドサイトーシスされる。ＰＤ－Ｌ１はエンドソーム内で酸性化すると放出され、分解されて、それによってＰＤ－Ｌ１が枯渇する。ＴｆＲと選択的枯渇複合体は、細胞表面に再循環される。ＰＤ－Ｌ１の枯渇は、がん細胞による宿主免疫応答の回避を阻害し、がん細胞のアポトーシスを増加させ、それによってがんを治療する。

実施例２７
選択的枯渇複合体を使用するＥＧＦＲの選択的枯渇
この実施例は、選択的枯渇複合体を使用するＥＧＦＲの選択的枯渇を記載する。ＴｆＲ結合価（例えば、一価、二価以上）及びＥＧＦＲ結合価（例えば、一価、二価以上）の任意の組み合わせの、配列番号２４２、配列番号２４３、または配列番号２４４のｐＨ依存性ＥＧＦＲ結合ペプチドと配列番号９６、配列番号２２１、または配列番号２２２のＴｆＲ結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体を、ＴｆＲとＥＧＦＲを発現する細胞に接触させる。選択的除去複合体は、ＴｆＲ結合ペプチドを介してＴｆＲに、ＥＧＦＲ結合ペプチドを介してＥＧＦＲに協同的に結合し、細胞表面に三元複合体を形成する。ＴｆＲは、結合した選択的除去複合体及びＥＧＦＲとともにエンドサイトーシスされる。エンドソームでの酸性化の際に、選択的枯渇複合体はＥＧＦＲを放出し、ＴｆＲに結合したままになる。ＥＧＦＲはエンドソーム／リソソーム内で分解され、それによってＥＧＦＲが選択的に枯渇する。ＴｆＲと選択的枯渇複合体は、細胞表面に再循環される。ＥＧＦＲとＫＲＡＳ及びＭＥＫなどの下流経路の活性化を低下させ得る。細胞表面への結合、エンドソーム取り込み、輸送、分解、経路活性化は、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、組織学、ＩＨＣ、またはその他の方法を使用して検出できる。これらは、ＥＧＦＲ発現細胞のインビトロまたはインビボ曝露後にモニターできる。

選択的枯渇複合体は、配列番号２８８、配列番号２８９、配列番号３０７、配列番号３１３、配列番号３２７、配列番号３２８、配列番号３３２、配列番号３３３、配列番号３３７、配列番号３３８、配列番号３４２、もしくは配列番号３４３であるか；または選択的枯渇複合体は、配列番号３０２、配列番号３０５、配列番号３３９、配列番号３４０とヘテロ二量体化された配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号３１０、配列番号３１５、配列番号３１６；配列番号３４４；配列番号３４５であるか；または、選択的枯渇複合体は、配列番号３０２、配列番号３３９、もしくは配列番号３４４とヘテロ二量体化された配列番号２９６であるか；または、選択的枯渇複合体は、配列番号３０１とヘテロ二量体化された配列番号２９８もしくは配列番号２９９であるか；または、選択的枯渇複合体は、配列番号３３０もしくは配列番号３３５とヘテロ二量体化された配列番号３３１もしくは配列番号３３６であるか；または選択的枯渇複合体は、配列番号３２９、配列番号３３０、配列番号３３４、もしくは配列番号３３５とヘテロ二量体化された配列番号２９２、配列番号３１５、もしくは配列番号３１６である。

同様の方法及び設計を、再循環受容体としてＰＤ－Ｌ１が使用される方法において、再循環受容体としてＴｆＲ結合ドメインではなくＰＤ－Ｌ１結合ドメイン（例えば、ＰＤ－Ｌ１結合ペプチド）を含む選択的枯渇複合体に使用することができる。例えば、ＥＧＦＲは、ＰＤ－Ｌ１結合部分とＥＧＦＲ結合部分を含み、少なくとも１つの部分が細胞外ｐＨよりもエンドソームｐＨでより低い親和性で結合する選択的枯渇複合体の使用によって、記載されるように同様に枯渇させることができる。

実施例２８
ＥＧＦＲを選択的に枯渇することによるがんの治療
この実施例は、ＥＧＦＲを選択的に枯渇することによるがんの治療を記載する。配列番号２４３または配列番号２４４のものなどのｐＨ依存性ＥＧＦＲ結合ペプチド、及び配列番号９６のものなどのＴｆＲ結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体を、ＥＧＦＲ陽性がんを有する対象に投与する。対象は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、または別の種であり得る。選択的枯渇複合体は、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、または別の経路で投与することができる。それは、１回、２回、３回、４回、５回、１０回、またはそれ以上の回数、及び１週間に１回、２回、３回、４回、５回、６回、または７回の頻度で、または隔週または３週ごとに１回、または毎月１回またはそれ以下の頻度で投与され得る。ＥＧＦＲ陽性がんは、非小細胞肺癌、頭頸部癌、神経膠芽腫、転移性脳癌、結腸直腸癌、ＴＫＩ耐性がん、セツキシマブ耐性がん、ネシツムマブ耐性がん、パニツムマブ耐性がんである。選択的枯渇複合体はＥＧＦ陽性がん細胞表面上のＥＧＦＲ及びＴｆＲに結合し、選択的枯渇複合体、ＥＧＦＲ、及びＴｆＲの三元複合体はエンドサイトーシスされる。ＥＧＦＲはエンドソーム内で酸性化すると放出され、分解されて、それによってＥＧＦＲが枯渇する。ＴｆＲと選択的枯渇複合体は、細胞表面に再循環される。ＥＧＦＲの枯渇は、がん細胞の増殖促進シグナル伝達を減少させ、がんの増殖または転移を遅らせ、それによってがんを治療する。任意選択で、選択的枯渇複合体は、ＥＧＦＲとＴｆＲの両方を発現する細胞を標的とするため、選択的複合体によって引き起こされる皮膚毒性は、ＴｆＲ組織を標的とせずにＥＧＦＲを阻害する抗ＥＧＦＲ抗体またはチロシンキナーゼ阻害剤療法によって引き起こされる皮膚毒性よりも少なくなる。

がんも同様に、ＰＤ－Ｌ１とＥＧＦＲの両方に結合する選択的枯渇複合体を使用することにより治療することができる。

実施例２９
選択的枯渇複合体を使用するＴＮＦαの選択的枯渇
この実施例は、選択的枯渇複合体を使用するＴＮＦαの選択的枯渇を記載する。ｐＨ依存性ＴＮＦα結合ペプチドと配列番号９６のものなどのＴｆＲ結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体を、細胞外液、血清、細胞表面、または細胞培養培地などにＴＮＦαが存在するＴｆＲを発現する細胞に接触させる。選択的除去複合体は、ＴｆＲ結合ペプチドを介してＴｆＲに、ＴＮＦα結合ペプチドを介してＴＮＦαに協同的に結合し、細胞表面に三元複合体を形成する。ＴｆＲは、結合した選択的除去複合体及びＴＮＦαとともにエンドサイトーシスされる。エンドソームでの酸性化の際に、選択的枯渇複合体はＴＮＦαを放出し、ＴｆＲに結合したままになる。ＴＮＦαはエンドソーム／リソソーム内で分解され、それによってＴＮＦαが選択的に枯渇する。ＴｆＲと選択的枯渇複合体は、細胞表面に再循環される。

実施例３０
ＴＮＦαを選択的に枯渇させることによるＣＮＳ炎症性障害の治療
この実施例は、ＴＮＦαを選択的に枯渇させることによるＣＮＳ炎症性障害の治療を記載する。ｐＨ依存性ＴＮＦα結合ペプチド及び配列番号９６のＴｆＲ結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体は、炎症を伴うＣＮＳの障害を有する対象に投与される。ＣＮＳ炎症性障害は、任意選択で、神経炎症、脳卒中、外傷性脳損傷、アルツハイマー病、またはタウオパシーである。ＳＤＣはＢＢＢを通過し、それによって対象ＣＮＳ内の細胞及び分子と接触する。ＳＤＣは、結合トランスフェリン及びトランスサイトーシスを受けることによって、ＢＢＢを横切って輸送され得る。選択的枯渇複合体は細胞表面上のＴｆＲに結合し、ＴＮＦαにも結合し、選択的枯渇複合体、ＴＮＦα、及びＴｆＲから形成された三元複合体はエンドサイトーシスされる。ＴＮＦαはエンドソーム内で酸性化すると放出され、分解されて、それによってＴＮＦαが枯渇する。ＴｆＲと選択的枯渇複合体は、細胞表面に再循環される。ＴＮＦαの枯渇は、ＣＮＳにおけるサイトカインシグナル伝達を減少させ、神経炎症を減少させ、それによってＣＮＳ炎症性障害を治療する。

実施例３１
選択的枯渇複合体を使用するＣＤ４７の選択的枯渇
この実施例は、選択的枯渇複合体を使用するＣＤ４７の選択的枯渇を記載する。ＴｆＲ結合ペプチドとＣＤ４７結合ペプチドを含み、結合ペプチドの１つがその結合においてｐＨ依存性であり、他の結合ペプチドがその結合においてｐＨ非依存性である選択的枯渇複合体を、ＴｆＲ及びＣＤ４７を発現する細胞に接触させる。選択的除去複合体は、ＴｆＲ結合ペプチドを介してＴｆＲに、ＣＤ４７結合ペプチドを介してＣＤ４７に協同的に結合し、細胞表面に三元複合体を形成する。ＴｆＲは、結合した選択的除去複合体及びＣＤ４７とともにエンドサイトーシスされる。エンドソームが酸性化すると、選択的枯渇複合体がＣＤ４７を放出してＴｆＲに結合したままになるか、またはＳＤＣがＴｆＲを放出してＣＤ４７に結合したままになる。ＣＤ４７はエンドソーム／リソソーム内で分解され、それによってＣＤ４７が選択的に枯渇する。

実施例３２
ＣＤ４７を選択的に枯渇することによるがんの治療
この実施例は、ＣＤ４７を選択的に枯渇することによるがんの治療を記載する。実施例３１に記載のものなど、ＴｆＲ結合ペプチド及びＣＤ４７結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体を、ＣＤ４７陽性がんを有する対象に投与する。成熟赤血球はＴｆＲを発現しないため、選択的枯渇複合体は成熟赤血球に少量またはまったく結合せず、赤血球と比較してがん細胞に優先的に結合する。選択的枯渇複合体はがん細胞表面上のＣＤ４７及びＴｆＲに結合し、選択的枯渇複合体、ＣＤ４７、及びＴｆＲから形成された三元複合体はエンドサイトーシスされる。ＣＤ４７はエンドソーム／リソソームに輸送されて分解され、それによってＣＤ４７が枯渇する。細胞からＣＤ４７が枯渇し、細胞から免疫抑制シグナルまたは抗アポトーシスシグナルが除去される。ＣＤ４７の枯渇は、がん細胞による宿主免疫応答の回避を阻害し、がん細胞の免疫細胞攻撃またはアポトーシスを増加させるさまざまなアポトーシス促進シグナルへの応答を可能にし、それによってがんを治療する。

ＣＤ４７を標的とし枯渇させる選択的枯渇複合体による第１の対象におけるがんの治療を、ＣＤ４７に結合する抗体を投与することによる第２の対象における癌の治療と比較する。この抗体は、赤血球を含むＣＤ４７を発現するすべての細胞に結合する。抗ＣＤ４７抗体で処理された第２の対象の成熟した赤血球もアポトーシス促進シグナルを示すため、成熟した赤血球の表面からＣＤ４７が枯渇すると、成熟した赤血球は標的にされ、免疫系によって除去され、第２の対象は赤血球が枯渇し、貧血になる。選択的枯渇複合体は赤血球に結合しないため、ＣＤ４７は第１の対照の赤血球では減少しない。したがって、この実施例の選択的枯渇複合体で治療される第１の対象は、貧血を発症しない。

実施例３３
ＣＤ３９を選択的に枯渇することによるがんの治療
この実施例は、ＣＤ３９を選択的に枯渇することによるがんの治療を記載する。ＣＤ３９は、ＡＴＰをＡＭＰに分解する細胞表面外部酵素である。次いで、ＣＤ７３はＡＭＰを免疫抑制性のアデノシンに処理するが、ＡＴＰはマクロファージを活性化して、Ｔ細胞を活性化するＩＬ－１β及びＩＬ－１８を分泌させる。ＴｆＲ結合ペプチド及びＣＤ３９結合ペプチドを含む選択的枯渇複合体（ＳＤＣ）が、ＣＤ３９陽性癌を有する対象に投与される。ＳＤＣは、細胞表面からＣＤ３９を除去する。細胞からＣＤ３９が枯渇し、それによってＡＴＰからＡＭＰへの変換が阻害される。得られた腫瘍微小環境には、ＳＤＣによる治療前の腫瘍微小環境よりも多くのＡＴＰと少ないアデノシンが含まれている。腫瘍の微小環境はより炎症性になり、免疫抑制が少なくなり、免疫系によるがん細胞の標的化とアポトーシスの強化をもたらし、それによってがんが治療される。ＳＤＣは、ＣＤ３９の再生速度よりもはるかに速い速度でＣＤ３９を細胞表面から除去し、ＣＤ３９の長期にわたる枯渇とＡＴＰのアデノシンへの処理の持続的な減少をもたらす。

ＣＤ３９を標的とし枯渇させる選択的枯渇複合体による第１の対象におけるがんの治療を、ＣＤ３９に結合する抗体を投与することによる第２の対象における癌の治療と比較する。第２の対象の循環における抗体の濃度は、ＣＤ３９が常に抗体によって完全に占有されないように、投与間隔にわたって変化する。第２の対象における抗ＣＤ３９抗体によるＣＤ３９の低い占有率は、第２の対象におけるＣＤ３９酵素の一定の活性のために、ＳＤＣで治療された第１の対象と比較して、第２の対象におけるアデノシン枯渇がより少ない結果となる。この抗体は、第２の対象の赤血球のＣＤ３９にも結合し、貧血を引き起こす。成熟赤血球はＴｆＲを発現しないため、ＳＤＣは第１の対象の赤血球からＣＤ３９を枯渇させない。その結果、ＣＤ３９は第１の対象の赤血球では減少しない。したがって、この実施例の選択的枯渇複合体で治療される第１の対象は、貧血を発症しない。

実施例３４
ＰＤ－Ｌ１媒介エンドサイトーシスによる可溶性標的分子の選択的枯渇
この実施例は、ＰＤ－Ｌ１媒介エンドサイトーシスによる可溶性標的分子の選択的枯渇を記載する。標的結合ペプチドにコンジュゲートされ、エンドソームｐＨでＰＤ－Ｌ１と結合するＰＤ－Ｌ１結合ペプチド（例えば、配列番号１８７、配列番号２３６、配列番号４００、または配列番号４０１のいずれか１つ）を含む選択的枯渇複合体（ＳＤＣ）は、ＰＤ－Ｌ１を発現する細胞に接触する。ＰＤ－Ｌ１結合ペプチドは、生理学的細胞外ｐＨ（ｐＨ７．４など）とエンドソームｐＨ（ｐＨ５．５など）の両方でＰＤ－Ｌ１に結合し、標的結合ペプチドは生理学的ｐＨでより高い親和性で、エンドソームｐＨではより低い親和性で、可溶性標的分子に結合する。接触すると、ＰＤ－Ｌ１結合ペプチドは細胞表面のＰＤ－Ｌ１に結合し、標的結合ペプチドは溶液中の可溶性標的分子に結合する。ＰＤ－Ｌ１結合ＳＤＣは、図１２Ａに示されるのと同じ再循環プロセスを受ける。「ＴｆＲ結合ＣＤＰ（ｐＨ非依存性）」及び「ＴｆＲ（再循環）」は、「ＰＤ－Ｌ１結合ＣＤＰ（ｐＨ非依存性）」及び「ＰＤ－Ｌ１（再循環）」にそれぞれ置き換えられる。ＳＤＣは、図１２Ａ（１）に示されるように、可溶性標的分子に結合する。ＳＤＣ、ＰＤ－Ｌ１、及び標的分子から形成された複合体は、図１２Ａ（２）に示されるように、ＰＤ－Ｌ１媒介エンドサイトーシスを介してエンドサイトーシスされる。図１２Ａ（３）に示されるように、エンドソーク区画が酸性化されると、標的分子は標的結合ペプチドから放出される。次いで、標的分子は、図１２Ａ（４）に示されるように、リソソーム区画で分解される。図１２Ａ（５）に示されるように、複合体はＰＤ－Ｌ１とともに細胞表面に再循環される。

実施例３５
ＰＤ－Ｌ１媒介エンドサイトーシスによる表面標的分子の選択的枯渇
この実施例は、ＰＤ－Ｌ１媒介エンドサイトーシスによる表面標的分子の選択的枯渇を記載する。標的結合ペプチドにコンジュゲートされ、エンドソームｐＨでＰＤ－Ｌ１と結合するＰＤ－Ｌ１結合ペプチド（例えば、配列番号１８７、配列番号２３５～配列番号２３９、配列番号４００、もしくは配列番号４０１のいずれか１つ）を含む選択的枯渇複合体（ＳＤＣ）は、ＰＤ－Ｌ１を発現する細胞に接触する。ＰＤ－Ｌ１結合ペプチドは、生理学的細胞外ｐＨ（ｐＨ７．４など）とエンドソームｐＨ（ｐＨ５．５など）の両方でＰＤ－Ｌ１に結合し、標的結合ペプチドは生理学的ｐＨでより高い親和性で、エンドソームｐＨではより低い親和性で、表面標的分子に結合する。接触すると、ＰＤ－Ｌ１結合ペプチドは細胞表面のＰＤ－Ｌ１に結合し、標的結合ペプチドは細胞表面上の標的分子に結合する。ＰＤ－Ｌ１結合ＳＤＣは、図１２Ｂに示されるのと同じ再循環プロセスを受ける。「ＴｆＲ結合ＣＤＰ（ｐＨ非依存性）」及び「ＴｆＲ（再循環）」は、「ＰＤ－Ｌ１結合ＣＤＰ（ｐＨ非依存性）」及び「ＰＤ－Ｌ１（再循環）」にそれぞれ置き換えられる。ＳＤＣは、図１２Ｂ（１）に示されるように、細胞表面標的分子に結合する。ＳＤＣ、ＰＤ－Ｌ１、及び標的分子から形成された複合体は、図１２Ｂ（２）に示されるように、ＰＤ－Ｌ１媒介エンドサイトーシスを介してエンドサイトーシスされる。図１２Ｂ（３）に示されるように、エンドソーク区画が酸性化されると、標的分子は標的結合ペプチドから放出される。次いで、標的分子は、図１２Ｂ（４）に示されるように、リソソーム区画で分解される。図１２Ｂ（５）に示されるように、複合体はＰＤ－Ｌ１とともに細胞表面に再循環される。

実施例３６
ＰＤ－Ｌ１結合選択的枯渇複合体を使用するＨＬＡ－Ｇの選択的枯渇
この実施例は、ＰＤ－Ｌ１に結合する選択的枯渇複合体を使用するＨＬＡ－Ｇの選択的枯渇を記載する。ＰＤ－Ｌ１結合ペプチドとＨＬＡ－Ｇ結合ペプチドとを含む選択的枯渇複合体（ＳＤＣ）が構築される。任意選択で、配列番号１８７、配列番号２３６、配列番号４００、または配列番号４０１のＰＤ－Ｌ１結合ペプチドなどのＰＤ－Ｌ１結合ペプチドは、細胞外ｐＨとエンドソームｐＨの両方でＰＤ－Ｌ１に結合する。ＨＬＡ－Ｇ結合ペプチドは、細胞外ｐＨでは高い親和性で、エンドソームｐＨではより低い親和性でＨＬＡ－Ｇに結合する。代替的に、配列番号２３３または配列番号２３４のＰＤ－Ｌ１結合ペプチドなどのＰＤ－Ｌ１結合ペプチドは、細胞外ｐＨでＰＤ－Ｌ１に結合し、エンドソームｐＨでより低い親和性を有し、ＨＬＡ－Ｇ結合ペプチドは、細胞外ｐＨとエンドソームｐＨの両方で高い親和性でＨＬＡ－Ｇに結合する。この実施例のＳＤＣはがん細胞に接触する。ＳＤＣは、がん細胞の表面に発現するＰＤ－Ｌ１とＨＬＡ－Ｇに結合し、三元複合体を形成する。ＳＤＣは、ＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡ－Ｇと一緒にエンドサイトーシスされる。ＨＬＡ－Ｇ結合ペプチドが細胞外ｐＨでは高い親和性でＨＬＡ－Ｇに結合し、エンドソームｐＨではより低い親和性で結合する場合、ＳＤＣはエンドソームの酸性化の際にＨＬＡ－Ｇを放出し、ＨＬＡ－Ｇは分解のためにエンドソーム／リソソーム系で標的となる。ＰＤ－Ｌ１結合ペプチドが細胞外ｐＨとエンドソームｐＨの両方で高い親和性でＰＤ－Ｌ１に結合すると、ＳＤＣは細胞表面に再循環され、そこで分解のために別のＨＬＡ－Ｇに結合できる。ＰＤ－Ｌ１結合ペプチドが細胞外ｐＨでは高い親和性でＰＤ－Ｌ１に結合し、エンドソームｐＨではより低い親和性で結合する場合、ＳＤＣはエンドソームの酸性化の際にＰＤ－Ｌ１を放出し、ＨＬＡ－ＧとＳＤＣはエンドソーム／リソソーム系に輸送され得る。ＰＤ－Ｌ１は、細胞表面に再循環され得る。

実施例３７
高親和性ＰＤ－Ｌ１結合シスチン高密度ペプチドの構造
この実施例では、高親和性ＰＤ－Ｌ１結合シスチン高密度ペプチドの構造について記載する。図２６Ａに示されるように、ＰＤ－Ｌ１結合ＣＤＰ（配列番号１８７）をＰＤ－Ｌ１と共結晶化して、ＣＤＰ結合部位を確認し、ＰＤ－Ｌ１との表面相互作用を可視化した。親和性成熟中に獲得された標準的なＮ結合グリコサイトを除去したバリアントである配列番号１８７は、実施例１に記載のように可溶性分子として生成され、ＰＤ－Ｌ１と共結晶化された。Ａ１９からＱ３５までのＣＤＰの一部は、２．０Å構造では分解されなかった。濃縮分析を実施して、結晶構造において分解されなかった残基に対する、結晶構造において分解された残基におけるアミノ酸置換の影響を決定した。図２６Ｂに示されるように、分解されなかった残基の平均ＳＳＭ濃縮スコアは、分解された残基で見られるよりも極端ではなく（０からの逸脱が少ない）、分解されなかった残基の特定の側鎖同一性が、高親和性結合にとってあまり重要でないことを示している。分解された部分は、Ｅ１からＣ１８まで、及びＤ３８からＡ４８までのモデルと一致した。Ｋ３６とＦ３７は分解されたが、Ｄ３８－Ａ４８ヘリックスの一部ではなかった。

分解された部分は、ＰＩＳＡ（ＰＤＢｅＰＩＳＡｖ１．５２）によって評価されるとき、６２０Å^２の界面表面積を有し、これは、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の観察された界面表面積（６２２Å^２、ＰＤＢ４ＺＱＫ）に類似していた。ＰＤ－Ｌ１上のＣＤＰの位置は、図２６Ｃに示されるように、ＰＤ－１の占有空間の両方に完全に収まり、インシリコ低解像度ドッキング濃縮がこのヒットの界面を予測するものであることを示している。図２６Ｄ及び図２６Ｇに示されている界面を詳しく見ると、ＣＤＰがＰＤ－１と同じ相互作用部位の多くを利用していることを明らかにした。配列番号１８７のＫ５とＰＤ－１のＫ７８の両方がＰＤ－Ｌ１のＡ１２１骨格酸素と塩橋を形成したが、配列番号１８７のＤ４４とＰＤ－１のＥ１３６の両方が同様にＰＤ－Ｌ１のＹ１２３と塩橋を形成した。配列番号１８７のＦ４０は、ＰＤ－Ｌ１のＹ５６、Ｒ１１３、Ｍ１１５、及びＹ１２３によって形成されたポケットに位置し、疎水性接触（Ｍ１１５）、ヘリンボーンリングスタッキング相互作用（２つのＹ）、及びカチオン－π相互作用（Ｒ１１３）を形成する。このポケットもＰＤ－１のＩ１３４が占めていた。さらに、配列番号１８７のＶ９、Ｗ１２、及びＬ４３はまた、それぞれＰＤ－１のＬ１２８、Ａ１３２、及びＩ１２６によって使用される疎水性相互作用の部位を共有した。配列番号１８７をその親足場から区別した界面隣接変異は、図２６Ｅに示されるように、親側鎖に戻したときに結合を破壊すると予想される。ＰＤ－Ｌ１の表面とのＭ１３とＬ４３の両方の疎水性相互作用は、親のＡ１３とＶ４３では失われる。Ｆ４０が占有するポケットは、親のＷ４０を収容するために変形する必要があり、他の場所で界面を変更する。親のＦ３９は、Ｖ３９のように表面にきちんとフィットしない。最後に、ＰＤ－Ｌ１表面上のヒト／マウス及びヒト／カニクイザル（ｃｙｎｏ）の相同性の分析は、図２６Ｆに示されるように、相互作用部位がヒトとマウスとの間のいくつかの非相同側鎖を含むことを明らかにした。

本明細書においては本発明の好ましい実施形態を示し説明してきたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されていることは当業者には明らかであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、及び置換に想到するであろう。本明細書に記載された本発明の実施形態に対するさまざまな代替物が本発明を実施する際に使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定し、そしてこれらの特許請求の範囲の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの均等物がそれによって包含されることが意図される。

Claims

ペプチド複合体であって、
（ａ）細胞受容体結合ペプチドと
（ｂ）前記細胞受容体結合ペプチドと複合体形成した標的結合ペプチドとを含み、
（ｉ）前記標的結合ペプチドが、細胞外環境よりもエンドソームにおいてより低い標的に対する親和性を有するように操作されるか、（ｉｉ）前記細胞受容体結合ペプチドが、細胞外環境よりもエンドソームにおいてより低い細胞受容体に対する親和性を有するように操作されるか、または（ｉ）と（ｉｉ）の両方である、
前記ペプチド複合体。
前記標的に対する前記標的結合ペプチドの前記親和性、前記細胞受容体に対する前記細胞受容体結合ペプチドの前記親和性、またはその両方が、ｐＨ依存性である、請求項１に記載のペプチド複合体。
前記標的に対する前記標的結合ペプチドの前記親和性、前記細胞受容体に対する前記細胞受容体結合ペプチドの前記親和性、またはその両方が、イオン強度依存性である、請求項１または請求項２に記載のペプチド複合体。
ペプチド複合体であって、
（ａ）細胞受容体結合ペプチドと
（ｂ）前記細胞受容体結合ペプチドと複合体形成した標的結合ペプチドとを含み、
（ｉ）標的に対する前記標的結合ペプチドの親和性がｐＨ依存性であるか、（ｉｉ）細胞受容体に対する前記細胞受容体結合ペプチドの親和性がｐＨ依存性であるか、または（ｉ）と（ｉｉ）の両方である、
前記ペプチド複合体。
前記細胞受容体結合ペプチドが、トランスフェリン受容体結合ペプチドまたはＰＤ－Ｌ１結合ペプチドである、請求項１～４のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体結合ペプチドが、トランスフェリン受容体結合ペプチドである、請求項１～５のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体結合ペプチドが、ＰＤ－Ｌ１結合ペプチドである、請求項１～５のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体がトランスフェリン受容体またはＰＤ－Ｌ１である、請求項１～７のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体がトランスフェリン受容体である、請求項１～８のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体がＰＤ－Ｌ１である、請求項１～８のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体結合ペプチドが、ｐＨ４．５～ｐＨ７．４、ｐＨ５．５～ｐＨ７．４、またはｐＨ６．５～ｐＨ７．４のｐＨで前記細胞受容体に結合する、請求項１～１０のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体結合ペプチドが、ｐＨ７．４において、１００ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）で前記細胞受容体に結合することができる、請求項１～１１のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体結合ペプチドが、ｐＨ５．５において、１００ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）で前記細胞受容体に結合することができる、請求項１～１２のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体に対する前記細胞受容体の前記親和性がｐＨ非依存性である、請求項１～１３のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
ｐＨ７．４とｐＨ５．５での前記細胞受容体に対する前記細胞受容体結合ペプチドの前記親和性が、２倍以下、５倍以下、１０倍以下、１５倍以下、２０倍以下、２５倍以下、３０倍以下、４０倍以下、または５０倍以下異なる、請求項１～１４のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体に対する前記細胞受容体結合ペプチドの前記親和性がｐＨ依存性である、請求項１～１０のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
ｐＨが低下するにつれて、前記細胞受容体に対する前記細胞受容体結合ペプチドの前記親和性が低下する、請求項１６に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体に対する前記細胞受容体結合ペプチドの前記親和性が、ｐＨ５．５よりもｐＨ７．４でより高い、請求項１６または請求項１７に記載のペプチド複合体。
前記標的に対する前記標的結合ペプチドの前記親和性がｐＨ依存性である、請求項１～１８のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
ｐＨが低下するにつれて、前記標的に対する前記標的結合ペプチドの前記親和性が低下する、請求項１～１９のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記標的に対する前記標的結合ペプチドの前記親和性が、より低いｐＨよりも高いｐＨでより高い、請求項１～２０のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記より高いｐＨが、ｐＨ７．４、ｐＨ７．２、ｐＨ７．０、またはｐＨ６．８である、請求項２１に記載のペプチド複合体。
前記より低いｐＨが、ｐＨ６．５、ｐＨ６．０、ｐＨ５．５、ｐＨ５．０、またはｐＨ４．５である、請求項２１または請求項２２に記載のペプチド複合体。
前記標的に対する前記標的結合ペプチドの前記親和性が、ｐＨ６．０よりもｐＨ７．４でより高い、請求項１～２３のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記標的に対する前記標的結合ペプチドの前記親和性が、ｐＨ５．５よりもｐＨ７．４でより高い、請求項１～２４のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記標的結合ペプチドが、ｐＨ７．４において、１００ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）で前記標的分子に結合することができる、請求項１～２５のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記標的結合ペプチドが、ｐＨ５．５において、１ｎＭ以上、２ｎＭ以上、５ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、２０ｎＭ以上、５０ｎＭ以上、１００ｎＭ以上、２００ｎＭ以上、または５００ｎＭ以上の解離定数（Ｋ_Ｄ）で前記標的分子に結合することができる、請求項１～２６のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
ｐＨ７．４での前記標的に対する前記標的結合ペプチドの前記親和性が、ｐＨ５．５での前記標的に対する前記標的結合ペプチドの前記親和性よりも、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、または少なくとも２０倍大きい、請求項１～２７のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記標的結合ペプチドが１つ以上のヒスチジンアミノ酸残基を含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
イオン強度が上昇するにつれて、前記標的に対する前記標的結合ペプチドの前記親和性が低下する、請求項１～２９のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記標的結合ペプチドが、前記標的分子との極性相互作用または電荷－電荷相互作用を形成することができる１つ以上の極性アミノ酸残基または荷電アミノ酸残基を含む、請求項１～３０のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体結合ペプチドが、前記標的結合ペプチドにコンジュゲートされている、請求項１～３１のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体結合ペプチドと前記標的結合ペプチドが単一のポリペプチド鎖を形成する、請求項１～３２のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記ペプチド複合体が、二量体化ドメインを介して二量体化された二量体を含む、請求項１～３２のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記二量体化ドメインがＦｃドメインを含む、請求項３４に記載のペプチド複合体。
前記二量体が、ホモ二量体化ドメインを介して二量体化されたホモ二量体である、請求項３４に記載のペプチド複合体。
前記ホモ二量体化ドメインが、配列番号２４５～配列番号２５９のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項３６に記載のペプチド複合体。
前記二量体が、第１のヘテロ二量体化ドメインと第２のヘテロ二量体化ドメインを介して二量体化されたヘテロ二量体である、請求項３４に記載のペプチド複合体。
前記第１のヘテロ二量体化ドメインが、配列番号２６０、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４、配列番号２７６、配列番号２７８、配列番号２８０、配列番号２８２、配列番号２８４、または配列番号２８６のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項３８に記載のペプチド複合体。
前記第２のヘテロ二量体化ドメインが、配列番号２６１、配列番号２６３、配列番号２６５、配列番号２６７、配列番号２６９、配列番号２７１、配列番号２７３、配列番号２７５、配列番号２７７、配列番号２７９、配列番号２８１、配列番号２８３、配列番号２８５、または配列番号２８７のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項３８または請求項３９に記載のペプチド複合体。
前記標的結合ペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記二量体化ドメインに連結されている、請求項３４～４０のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体結合ペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記二量体化ドメインに連結されている、請求項３４～４１のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体結合ペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記標的結合ペプチドに連結されている、請求項１～４２のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記ペプチドリンカーが、１～５０個のアミノ酸残基、２～４０個のアミノ酸残基、３～２０個のアミノ酸残基、または３～１０個のアミノ酸残基の長さを有する、請求項４３に記載のペプチド複合体。
前記ペプチドリンカーがグリシン及びセリンのアミノ酸を含む、請求項４２～４４のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記ペプチドリンカーが、６Å以下、８Å以下、１０Å以下、１２Å以下、１５Å以下、２０Å以下、２５Å以下、３０Å以下、４０Å以下、または５０Å以下の持続長を有する、請求項４２～４５のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記ペプチドリンカーが免疫グロブリンペプチドに由来する、請求項４２～４６のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記ペプチドリンカーがダブルノット毒素ペプチドに由来する、請求項４２～４６のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記ペプチドリンカーが、配列番号１２９～配列番号１４１、配列番号１９５～配列番号２１８、配列番号２２３～配列番号２２７、または配列番号３９１のいずれか１つの配列を含む、請求項４２～４８のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体結合ペプチド、前記標的結合ペプチド、またはその両方が、ミニタンパク質、ナノボディ、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、ＤＡＲＰｉｎ、またはアフィボディを含む、請求項１～４９のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記抗体がＩｇＧを含むか、または前記抗体断片がＦａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ、または（ｓｃＦｖ）２を含む、請求項５０に記載のペプチド複合体。
前記ミニタンパク質が、シスチン高密度ペプチド、アフィチン、アドネクチン、アビマー、クニッツドメイン、ナノフィチン、フィノマー、二環式ペプチド、ベータヘアピン、またはステープルペプチドを含む、請求項５１に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体結合ペプチドが、少なくとも１つのジスルフィド結合、少なくとも２つのジスルフィド結合、少なくとも３つのジスルフィド結合、または少なくとも４つのジスルフィド結合を含む、請求項１～５２のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記標的結合ペプチドが、少なくとも１つのジスルフィド結合、少なくとも２つのジスルフィド結合、少なくとも３つのジスルフィド結合、または少なくとも４つのジスルフィド結合を含む、請求項１～５３のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体結合ペプチドが少なくとも６個のシステイン残基を含む、請求項１～５４のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記少なくとも６個のシステイン残基が、前記細胞受容体結合ペプチドのアミノ酸位置４、８、１８、３２、４２、及び４６に位置する、請求項５５に記載のペプチド複合体。
前記少なくとも６個のシステイン残基が、少なくとも３つのジスルフィド結合を形成する、請求項５５または請求項５６に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体結合ペプチドが、配列番号１４８～配列番号１７７のいずれか１つの配列を含む、請求項１～５７のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体結合ペプチドが、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性、または配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか１つの断片と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１～５８のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体結合ペプチドが、配列番号９６と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性、または配列番号９６の断片と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１～５９のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体結合ペプチドが、配列番号９６の配列を含む、請求項１～６０のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体結合ペプチドが、配列番号３９２～配列番号３９９のいずれか１つの配列を含む、請求項１～５７のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体結合ペプチドが、配列番号１８７、配列番号２３３～配列番号２３９、配列番号４００～配列番号４５６、または配列番号２４１のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性、または配列番号１８７、配列番号２３３～配列番号２３９、配列番号４００～配列番号４５６、または配列番号２４１のいずれか１つの断片と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１～５７または請求項６２のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体結合ペプチドが、配列番号１８７、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号４００、または配列番号４０１と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性、または配列番号１８７、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号４００、または配列番号４０１の断片と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項６２または請求項６３に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体結合ペプチドが、配列番号１８７、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号４００、または配列番号４０１の配列を含む、請求項６２～６４のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記断片が、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個、少なくとも３３個、少なくとも３４個、少なくとも３５個、少なくとも３６個、少なくとも３７個、少なくとも３８個、少なくとも３９個、少なくとも４０個、少なくとも４１個、少なくとも４２個、少なくとも４３個、少なくとも４４個、少なくとも４５個、少なくとも４６個、少なくとも４７個、少なくとも４８個、少なくとも４９個、または少なくとも５０個のアミノ酸残基を含む、請求項５９～６５のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体結合ペプチドが、細胞受容体結合界面に１つ以上のヒスチジン残基を含む、請求項１～６６のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記標的結合ペプチドが、標的結合界面に１つ以上のヒスチジン残基を含む、請求項１～６７のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記標的結合ペプチドが、ＰＤ－Ｌ１結合ペプチド、ＥＧＦＲ結合ペプチド、またはＴＮＦα結合ペプチドである、請求項１～６８のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記ＰＤ－Ｌ１結合ペプチドが、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号１８７、配列番号２３５～配列番号２３９、配列番号４００～配列番号４５６、または配列番号２４０のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項６９に記載のペプチド複合体。
前記ＥＧＦＲ結合ペプチドが、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩまたはチロシンキナーゼ阻害剤耐性ＥＧＦＲに結合する、請求項６９に記載のペプチド複合体。
前記ＥＧＦＲ結合ペプチドが、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２１９、または配列番号２４２と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項６９または請求項７１に記載のペプチド複合体。
前記ＥＧＦＲ結合ペプチドが配列番号２４２の配列を含む、請求項７２に記載のペプチド複合体。
前記ＥＧＦＲ結合ペプチドが配列番号２４３の配列を含む、請求項７２または請求項７３に記載のペプチド複合体。
前記標的が、細胞表面分子、増殖因子受容体、分泌ペプチド、分泌タンパク質、循環分子、細胞シグナル伝達分子、細胞外マトリックス巨大分子、神経伝達物質、サイトカイン、増殖因子、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原またはホルモン、チェックポイント阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤、抑制性免疫受容体、抑制性免疫受容体のリガンド、マクロファージ表面タンパク質、リポ多糖、抗体、抑制性免疫受容体、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原、または自己抗体である、請求項１～７４のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記標的が、コラーゲン、エラスチン、ミクロフィブリルタンパク質、プロテオグリカン、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３００ｆ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＦｃｇＲｉｉｂ、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－３、ＩＬＴ－４、ＩＬＴ－５、ＬＡＩＲ－１、ＰＥＣＡＭ－１、ＰＩＬＲ－α、ＳＩＲＬ－１、ＳＩＲＰ－α、ＣＬＥＣ４Ａ、Ｌｙ４９Ｑ、ＭＩＣ、ＣＤ３、ＣＤ４７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８９、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２７、ＣＤ３９、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ７４、ＣＤ４０Ｌ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ２、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ４、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＨＬＡ－Ｇ、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ、ＴＣＲ、ＴＮＦ－α、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＴＫＩ耐性ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＥＲＢＢ３、ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＩＧＦＲ１、ＣＴＬＡ４、ＳＴＲＯ１、補体因子Ｃ４、補体因子Ｃ１ｑ、補体因子Ｃ１ｓ、補体因子Ｃ１ｒ、補体因子Ｃ３、補体因子Ｃ３ａ、補体因子Ｃ３ｂ、補体因子Ｃ５、補体因子Ｃ５ａ、ＴＧＦβ、ＰＣＳＫ９、Ｐ２Ｙ６、ＨＥＲ３、ＲＡＮＫ、ｔａｕ、アミロイドβ、ハンチンチン、α－シヌクレイン、グルコセレブロシダーゼ、α－グルコシダーゼ、ＩＬ－１、ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＩＬ－１２、ｐ４０、Ｂ７ファミリーのメンバー、ｃ－Ｍｅｔ、ＳＩＧＬＥＣ、ＭＣＰ－１、ＭＨＣ、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＰＤ－１、またはＰＤ－Ｌ１である、請求項１～７５のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記標的がＰＤ－Ｌ１、ＥＧＦＲ、またはＴＮＦαである、請求項１～７６のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
（ａ）配列番号２８８～配列番号３１３、または配列番号３１５～配列番号３４６のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性、または
（ｂ）配列番号３４７、配列番号３４８、配列番号３５１、配列番号３５２、配列番号３５５、配列番号３５６、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６０、配列番号３６１、配列番号３６２、配列番号３６３、配列番号３６４、配列番号３６５、配列番号３７１、配列番号３７３、配列番号３７６、配列番号３７８、配列番号３８２、配列番号３８４、配列番号３８７、もしくは配列番号３８９のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性、を有する配列を含む、請求項１～７７のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
（ａ）配列番号２８８、配列番号２８９、配列番号３０７、配列番号３１３、配列番号３２７、配列番号３２８、配列番号３３２、配列番号３３３、配列番号３３７、配列番号３３８、配列番号３４２、もしくは配列番号３４３；
（ｂ）配列番号３０２、配列番号３０５、配列番号３３９、配列番号３４０、配列番号３４４、もしくは配列番号３４５とヘテロ二量体化された配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号３１０、配列番号３１５、もしくは配列番号３１６；
（ｃ）配列番号３０２、配列番号３３９、もしくは配列番号３４４とヘテロ二量体化された配列番号２９６；配列番号２９８；
（ｄ）配列番号３０１とヘテロ二量体化された配列番号２９９；
（ｅ）配列番号３３０もしくは配列番号３３５とヘテロ二量体化された配列番号３３１もしくは配列番号３３６；または
（ｆ）配列番号３２９、配列番号３３０、配列番号３３４、もしくは配列番号３３５とヘテロ二量体化された配列番号２９２、配列番号３１５、もしくは配列番号３１６の配列を含む、請求項１～７８のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
（ａ）配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号３０８、配列番号３１７、配列番号３１８、配列番号３２２、もしくは配列番号３２３；
（ｂ）配列番号３０４、配列番号３０６、配列番号３１９、配列番号３２０、配列番号３２１、配列番号３２４、もしくは配列番号３２５とヘテロ二量体化された配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号３１５、配列番号３１６；
（ｃ）配列番号３０４、配列番号３１９、配列番号３２１、もしくは配列番号３２４とヘテロ二量体化された、配列番号２９５もしくは配列番号２９７；
（ｄ）配列番号３０３とヘテロ二量体化された配列番号２９８もしくは配列番号３００；または
（ｅ）配列番号：３０６、配列番号：３１１、配列番号３２０、もしくは配列番号３２５とヘテロ二量体化された配列番号３２６の配列を含む、請求項１～７８のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体からの前記細胞受容体結合ペプチドのオフ速度が、前記細胞受容体の再循環速度よりも遅い、請求項１～８０のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体からの前記細胞受容体結合ペプチドのオフ速度が、１分以内、２分以内、３分以内、４分以内、５分以内、７分以内、１０分以内、１５分以内、または２０分以内である、請求項１～８１のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記ペプチド複合体が、受容体媒介エンドサイトーシスを介してエンドサイトーシスされ得る、請求項１～８２のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記受容体媒介エンドサイトーシスがトランスフェリン受容体媒介エンドサイトーシスである、請求項８３に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体結合ペプチドが、エンドサイトーシス小胞内で前記細胞受容体に結合したままである、請求項１～８４のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記ペプチド複合体が、前記細胞受容体結合ペプチドが前記細胞受容体に結合し、前記細胞受容体が再循環される場合に再循環される、請求項１～８５のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記標的が、前記ペプチド複合体が受容体媒介エンドサイトーシスを介してエンドサイトーシスされる場合、前記標的結合ペプチドから放出または解離される、請求項１～８６のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記標的が細胞外タンパク質、循環タンパク質、または可溶性タンパク質である、請求項１～８７のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記標的が細胞表面タンパク質である、請求項１～８７のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記標的が膜貫通タンパク質である、請求項１～８７のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
第２の標的結合ペプチドをさらに含む、請求項１～９０のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記第２の標的結合ペプチドが第２の標的に結合する、請求項９１に記載のペプチド複合体。
前記標的及び前記第２の標的が、前記標的結合ペプチド及び前記第２の標的結合ペプチドに結合すると二量体を形成する、請求項９２に記載のペプチド複合体。
前記標的及び前記第２の標的の二量体化が、前記標的及び前記第２の標的のエンドサイトーシスの速度を増加させる、請求項９３に記載のペプチド複合体。
前記第２の標的が前記標的と同じである、請求項９２～９４のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体結合ペプチド、前記標的結合ペプチド、またはその両方に結合された半減期改変剤をさらに含む、請求項１～９５のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記半減期改変剤が、ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン、ポリビニルアルコール、水溶性ポリマー、双極性イオン水溶性ポリマー、水溶性ポリ（アミノ酸）、プロリン、アラニン及びセリンの水溶性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、及びセリンを含む水溶性ポリマー、Ｆｃ領域、脂肪酸、パルミチン酸、またはアルブミンに結合する分子を含む、請求項９６に記載のペプチド複合体。
前記アルブミンに結合する分子が血清アルブミン結合ペプチドである、請求項９７に記載のペプチド複合体。
前記血清アルブミン結合ペプチドが、配列番号１７８、配列番号１７９、または配列番号１９３のいずれか１つの配列を含む、請求項９８に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体結合ペプチド、前記標的結合ペプチド、またはその両方が組換え発現される、請求項１～９９のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記標的結合ペプチドが、ｐＨ６．５、ｐＨ６．０、ｐＨ５．５、ｐＨ５．０、またはｐＨ４．５で前記標的から解離するように構成されている、請求項１～１００のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
前記細胞受容体結合ペプチドが、ｐＨ６．５、ｐＨ６．０、ｐＨ５．５、ｐＨ５．０、またはｐＨ４．５で前記細胞受容体から解離するように構成されている、請求項１～１０１のいずれか１項に記載のペプチド複合体。
標的分子を選択的に枯渇させる方法であって、前記方法が、
（ａ）細胞受容体結合ペプチド、及び前記細胞受容体結合ペプチドと複合体形成した標的結合ペプチドを含むペプチド複合体を、細胞受容体を発現する細胞に接触させることと；
（ｂ）細胞外条件下で前記標的結合ペプチドを前記標的分子に結合させることと；
（ｃ）細胞外条件下で前記細胞受容体結合ペプチドを前記細胞受容体に結合させることと；
（ｄ）前記ペプチド複合体、前記標的分子、及び前記細胞受容体をエンドサイトーシスすることと；
（ｅ）エンドソーム条件下で、前記標的分子からの前記標的結合ペプチド、前記細胞受容体からの前記細胞受容体結合ペプチド、またはその両方の結合を解離させることと；
（ｆ）前記標的分子を分解し、それによって前記標的分子を枯渇させることと、
を含む、前記方法。
標的分子を選択的に枯渇させる方法であって、前記方法が、
（ａ）請求項１～１０２のいずれか１項に記載のペプチド複合体を、細胞受容体を発現する細胞に接触させることと；
（ｂ）細胞外条件下で前記標的結合ペプチドを前記標的分子に結合させることと；
（ｃ）細胞外条件下で前記細胞受容体結合ペプチドを前記細胞受容体に結合させることと；
（ｄ）前記ペプチド複合体、前記標的分子、及び前記細胞受容体をエンドサイトーシス区画またはリソソーム区画にエンドサイトーシスすることと；
（ｅ）エンドソーム条件下で、前記標的分子からの前記標的結合ペプチド、前記細胞受容体からの前記細胞受容体結合ペプチド、またはその両方の結合を放出させることと；
（ｆ）前記標的分子を分解し、それによって前記標的分子を枯渇させることと、
を含む、前記方法。
前記ペプチド複合体及び前記細胞受容体を再循環することをさらに含む、請求項１０３または請求項１０４に記載の方法。
前記細胞受容体がトランスフェリン受容体またはＰＤ－Ｌ１であり、前記細胞受容体結合ペプチドがトランスフェリン受容体結合ペプチドまたはＰＤ－Ｌ１結合ペプチドである、請求項１０３～１０５のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞受容体結合ペプチドがトランスフェリン受容体結合ペプチドであり、前記細胞受容体がトランスフェリン受容体である、請求項１０３～１０６のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞受容体結合ペプチドがＰＤ－Ｌ１結合ペプチドであり、前記細胞受容体がＰＤ－Ｌ１である、請求項１０３～１０７のいずれか１項に記載の方法。
前記エンドサイトーシスが受容体媒介エンドサイトーシスを含む、請求項１０３～１０８のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞受容体結合ペプチドが、前記エンドサイトーシス区画または前記リソソーム区画において前記細胞受容体に結合したままである、請求項１０９に記載の方法。
前記標的分子が前記エンドサイトーシス区画または前記リソソーム区画で分解される、請求項１１０に記載の方法。
前記受容体媒介エンドサイトーシスがトランスフェリン受容体媒介エンドサイトーシスである、請求項１１０または請求項１１１に記載の方法。
前記標的分子が細胞外タンパク質、循環タンパク質、または可溶性タンパク質である、請求項１０３～１１２のいずれか１項に記載の方法。
前記標的分子が細胞表面タンパク質である、請求項１０３～１１２のいずれか１項に記載の方法。
前記標的分子が膜貫通タンパク質である、請求項１０３～１１２のいずれか１項に記載の方法。
前記ペプチド複合体に血液脳関門（ＢＢＢ）を含む細胞層を透過させることを含む、請求項１０３～１１５のいずれか１項に記載の方法。
前記標的分子が中枢神経系で分解される、請求項１１６に記載の方法。
前記細胞が前記細胞受容体を発現している、請求項１０３～１１７のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞外条件下で前記細胞受容体結合ペプチドを前記細胞受容体に、５０μＭ以下、５μＭ以下、５００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ、または０．１ｎＭ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）で結合させることを含む、請求項１０３～１１８のいずれか１項に記載の方法。
前記エンドソーム条件下で前記細胞受容体結合ペプチドを前記細胞受容体に、５０μＭ以下、５μＭ以下、５００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ、または０．１ｎＭ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）で結合させることを含む、請求項１０３～１１９のいずれか１項に記載の方法。
前記標的結合ペプチドが、前記エンドサイトーシス区画において前記標的分子に結合したままである、請求項１０３～１２０のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞外条件下で前記標的結合ペプチドを前記標的分子に、５０μＭ以下、５μＭ以下、５００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ、または０．１ｎＭ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）で結合させることを含む、請求項１０３～１２１のいずれか１項に記載の方法。
前記エンドソーム条件下で前記標的結合ペプチドを前記標的分子に、１ｎＭ以上、２ｎＭ以上、５ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、２０ｎＭ以上、５０ｎＭ以上、１００ｎＭ以上、２００ｎＭ以上、または５００ｎＭ以上の解離定数（Ｋ_Ｄ）で結合させることを含む、請求項１０３～１２２のいずれか１項に記載の方法。
前記エンドソーム条件下と比べて前記細胞外条件下で、２倍以下、５倍以下、１０倍以下、１５倍以下、２０倍以下、２５倍以下、３０倍以下、４０倍以下、または５０倍以下異なる親和性で、前記細胞受容体結合ペプチドを前記細胞受容体に結合させることを含む、請求項１０３～１２３のいずれか１項に記載の方法。
前記標的結合ペプチドと前記標的分子との間に１つ以上の極性相互作用または電荷－電荷相互作用を形成することを含む、請求項１０３～１２４のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞受容体結合ペプチドが、配列番号９６、配列番号６５～配列番号９５、配列番号９７～配列番号１２８、配列番号２２０～配列番号２２２、または配列番号１～配列番号６４のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１０３～１２５のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞受容体結合ペプチドが、配列番号９６と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１０３～１２６のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞受容体結合ペプチドが、配列番号９６の配列を含む、請求項１０３～１２７のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞受容体結合ペプチドが、配列番号３９２～配列番号３９９のいずれか１つの配列を含む、請求項１０３～１２８のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞受容体結合ペプチドが、配列番号１８７、配列番号２３３～配列番号２３９、配列番号４００～配列番号４５６、もしくは配列番号２４１のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性、または配列番号１８７、配列番号２３３～配列番号２３９、配列番号４００～配列番号４５６、もしくは配列番号２４１のいずれか１つの断片と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１０３～１２５、または請求項１２９のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞受容体結合ペプチドが、配列番号１８７、配列番号２３５、配列番号２３８、もしくは配列番号２３９と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性、または配列番号１８７、配列番号２３５、配列番号２３８、もしくは配列番号２３９の断片と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１２９または請求項１３０に記載の方法。
前記細胞受容体結合ペプチドが、配列番号１８７、配列番号２３５、配列番号２３８、または配列番号２３９の配列を含む、請求項１２９～１３１のいずれか１項に記載の方法。
第２の標的分子を第２の標的結合ペプチドと結合させることをさらに含む、請求項１０３～１３２のいずれか１項に記載の方法。
前記標的分子及び前記第２の標的分子が、前記標的結合ペプチド及び前記第２の標的結合ペプチドに結合すると二量体を形成する、請求項１３３に記載の方法。
前記標的分子及び前記第２の標的分子の二量体化の際に、前記標的分子及び前記第２の標的分子のエンドサイトーシスの速度を増加させることを含む、請求項１３４に記載の方法。
前記第２の標的分子が、前記標的分子及び前記第２の標的分子のエンドサイトーシスにより分解される、請求項１３３～１３５のいずれか１項に記載の方法。
前記第２の標的分子が前記標的分子と同じである、請求項１３３～１３６のいずれか１項に記載の方法。
対象における疾患または状態を治療する方法であって、前記方法が、
（ａ）細胞受容体結合ペプチド、及び前記細胞受容体結合ペプチドと複合体形成した標的結合ペプチドを含むペプチド複合体を、前記対象に投与することと；
（ｂ）標的分子及び細胞受容体を発現する前記対象の細胞上の、疾患または状態に関連する前記標的分子に、細胞外条件下で前記標的結合ペプチドを結合させることと；
（ｃ）前記対象の前記細胞上の前記細胞受容体に、細胞外条件下で前記細胞受容体結合ペプチドを結合させることと；
（ｄ）前記ペプチド複合体、前記標的分子、及び前記細胞受容体をエンドサイトーシスすることと；
（ｅ）エンドソーム条件下で、前記標的分子からの前記標的結合ペプチド、前記細胞受容体からの前記細胞受容体結合ペプチド、またはその両方の結合を解離させることと；
（ｆ）前記標的分子を分解し、それによって疾患または状態を治療することと、を含む、
前記方法。
対象における疾患または状態を治療する方法であって、前記方法が、
（ａ）請求項１～１０２のいずれか１項に記載のペプチド複合体を前記対象に投与することと；
（ｂ）標的分子及び細胞受容体を発現する前記対象の細胞上の、疾患または状態に関連する前記標的分子に、細胞外条件下で前記標的結合ペプチドを結合させることと；
（ｃ）前記対象の前記細胞上の前記細胞受容体に、細胞外条件下で前記細胞受容体結合ペプチドを結合させることと；
（ｄ）前記ペプチド複合体、前記標的分子、及び前記細胞受容体をエンドサイトーシスすることと；
（ｅ）エンドソーム条件下で、前記標的分子からの前記標的結合ペプチド、前記細胞受容体からの前記細胞受容体結合ペプチド、またはその両方の結合を解離させることと；
（ｆ）前記標的分子を分解し、それによって疾患または状態を治療することと、を含む、
前記方法。
前記標的分子が、細胞表面分子、増殖因子受容体、分泌ペプチド、分泌タンパク質、循環分子、細胞シグナル伝達分子、細胞外マトリックス巨大分子、神経伝達物質、サイトカイン、増殖因子、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原またはホルモン、チェックポイント阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤、抑制性免疫受容体、抑制性免疫受容体のリガンド、マクロファージ表面タンパク質、リポ多糖、抗体、抑制性免疫受容体、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原、または自己抗体である、請求項１３８または請求項１３９に記載の方法。
前記標的分子が、コラーゲン、エラスチン、ミクロフィブリルタンパク質、プロテオグリカン、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３００ｆ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＦｃｇＲｉｉｂ、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－３、ＩＬＴ－４、ＩＬＴ－５、ＬＡＩＲ－１、ＰＥＣＡＭ－１、ＰＩＬＲ－α、ＳＩＲＬ－１、ＳＩＲＰ－α、ＣＬＥＣ４Ａ、Ｌｙ４９Ｑ、ＭＩＣ、ＣＤ３、ＣＤ４７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８９、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２７、ＣＤ３９、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ７４、ＣＤ４０Ｌ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ２、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ４、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＨＬＡ－Ｇ、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ、ＴＣＲ、ＴＮＦ－α、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＴＫＩ耐性ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＥＲＢＢ３、ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＩＧＦＲ１、ＣＴＬＡ４、ＳＴＲＯ１、補体因子Ｃ４、補体因子Ｃ１ｑ、補体因子Ｃ１ｓ、補体因子Ｃ１ｒ、補体因子Ｃ３、補体因子Ｃ３ａ、補体因子Ｃ３ｂ、補体因子Ｃ５、補体因子Ｃ５ａ、ＴＧＦβ、ＰＣＳＫ９、Ｐ２Ｙ６、ＨＥＲ３、ＲＡＮＫ、ｔａｕ、アミロイドβ、ハンチンチン、α－シヌクレイン、グルコセレブロシダーゼ、α－グルコシダーゼ、ＩＬ－１、ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＩＬ－１２、ｐ４０、Ｂ７ファミリーのメンバー、ｃ－Ｍｅｔ、ＳＩＧＬＥＣ、ＭＣＰ－１、ＭＨＣ、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＰＤ－１、またはＰＤ－Ｌ１である、請求項１３８～１４０のいずれか１項に記載の方法。
前記標的分子が受容体チロシンキナーゼである、請求項１３８～１４１のいずれか１項に記載の方法。
前記受容体チロシンキナーゼが、ＥＧＦ受容体、ＥｒｂＢ、インスリン受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ＣＣＫ受容体、ＮＧＦ受容体、ＨＧＦ受容体、Ｅｐｈ受容体、ＡＸＬ受容体、ＴＩＥ受容体、ＲＹＫ受容体、ＤＤＲ受容体、ＲＥＴ受容体、ＲＯＳ受容体、ＬＴＫ受容体、ＲＯＲ受容体、ＭｕＳＫ受容体、またはＬＭＲ受容体である、請求項１４２に記載の方法。
前記標的分子が病原体または病原体表面分子である、請求項１４２または請求項１４３に記載の方法。
前記疾患または状態が、がん、神経変性疾患、リソソーム蓄積症、炎症性疾患、自己免疫疾患、神経炎症性疾患、免疫疾患、または疼痛である、請求項１３８～１４４のいずれか１項に記載の方法。
前記がんが、乳癌、肝臓癌、結腸癌、脳癌、白血病、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄腫、血液細胞由来のがん、肺癌、肉腫、胃癌、胃腸癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、非小細胞肺癌、扁平上皮非小細胞肺癌、膵臓癌、卵巣癌、血液癌、皮膚癌、肝臓癌、腎臓癌、または結腸直腸癌である、請求項１４５に記載の方法。
前記がんが、ＴＫＩ耐性、セツキシマブ耐性、ネシツムマブ耐性、またはパニツムマブ耐性である、請求項１４５または請求項１４６に記載の方法。
前記がんが、進行がん、転移がん、中枢神経系の転移がん、転移性乳癌、転移性皮膚癌、難治性がん、ＫＲＡＳ野生型がん、ＫＲＡＳ変異型がん、またはエクソン２０変異型非小細胞肺癌である、請求項１４５～１４７のいずれか１項に記載の方法。
前記標的分子が、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＶＥＧＦ、ＰＤ－１、ＣＤ３８、ＧＤ２、ＳＬＡＭＦ７、ＣＴＬＡ－４、ＣＣＲ４、ＣＤ２０、ＰＤＧＦＲα、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ｂ、ネクチン－４、またはＴＲＯＰ２である、請求項１４５～１４８のいずれか１項に記載の方法。
前記標的分子がＥＧＦＲまたはＰＤ－Ｌ１である、請求項１４９に記載の方法。
追加の療法を前記対象に施すことをさらに含む、請求項１４５～１５０のいずれか１項に記載の方法。
前記追加の療法が、放射線、化学療法、白金療法、または代謝拮抗療法を含む、請求項１５１に記載の方法。
前記追加の療法が、フルオロウラシル、ＦＯＬＦＩＲＩ、イリノテカン、ＦＯＬＦＯＸ、ゲムシタビン、またはシスプラチンを含む、請求項１５１または請求項１５２に記載の方法。
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ運動失調症、ハンチントン病、パーキンソン病、または脊髄性筋萎縮症である、請求項１４５に記載の方法。
前記標的分子が、ｔａｕ、アミロイドβ、ハンチンチン、またはα－シヌクレインである、請求項１４５または請求項１５４に記載の方法。
前記リソソーム蓄積症がゴーシェ病またはポンペ病である、請求項１５５に記載の方法。
前記標的分子がグルコセレブロシダーゼまたはα－グルコシダーゼである、請求項１４５または請求項１５６に記載の方法。
前記炎症性疾患が、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、糸球体腎炎、ループス、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、皮膚血管炎、神経炎症性疾患、炎症関連神経変性、アルツハイマー病、脳卒中、外傷性脳損傷、シェーグレン病、または嚢胞性線維症である、請求項１４５に記載の方法。
前記標的分子が、アポリポタンパク質Ｅ４、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、またはＩＬ－２３である、請求項１４５または請求項１５８に記載の方法。
前記標的分子がＴＮＦ－αである、請求項１５９に記載の方法。
前記細胞が、がん細胞、免疫細胞、中枢神経系細胞、神経細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、好中球、樹状細胞、マスト細胞、好塩基球、または好酸球である、請求項１０３～１６０のいずれか１項に記載の方法。
前記選択的枯渇複合体、前記標的分子、及び前記細胞受容体の間に三元複合体を形成することをさらに含む、請求項１０３～１６１のいずれか１項に記載の方法。
前記三元複合体の形成が、前記細胞受容体、前記標的分子、またはその両方の再循環または代謝回転を増加させる、請求項１６２に記載の方法。
前記三元複合体の形成が、前記標的分子の前記細胞受容体への結合を増加させる、請求項１６２または請求項１６３に記載の方法。