JP2024517610A - Ｃｄ７１に結合するフィブロネクチンｉｉｉ型ドメイン - Google Patents

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Abstract

本開示は、ＣＤ７１に結合しうる、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインなどのポリペプチド、それらのコンジュゲート、分子をコードする単離ヌクレオチド、ベクター、宿主細胞のほか、これらを作製および使用する方法に関する。【選択図】図３

Description

関連出願
本出願は、参照によってそれらの全体を本明細書に組み入れる、２０２１年４月１４日に出願された、米国特許仮出願第６３／１７４，７５２号、および２０２２年３月２８日に出願された、米国特許仮出願第６３／３２４，４３１号に対する優先権を主張する。
分野
本実施形態は、ＣＤ７１（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ７１）に特異的に結合する、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）、ならびに分子を作製および使用する方法に関する。
トランスフェリン受容体１としてもまた公知のＣＤ７１は、細胞への鉄輸送に不可欠な膜貫通受容体である。ＣＤ７１は、多くの種類の腫瘍上、および血液脳関門において、高度に発現され、このため、薬物送達のための、重要な標的となっている。鉄がロードされたトランスフェリンへの結合の後、ＣＤ７１は、急速にエンドサイトーシスされ、細胞表面へと、効率的にリサイクルされる。ＣＤ７１抗体薬物コンジュゲートによる研究は、ＣＤ７１のターゲティングが、薬物送達の特異性および選択性を改善し、治療指数を拡大しうることを示唆する。加えて、抗ＣＤ７１モノクローナル抗体を使用する研究は、結合アフィニティーが、平滑筋または骨格筋への送達、および血液脳関門におけるトランスサイトーシスを含む組織特異的送達を可能とするのに、重要な役割を果たしうることを指し示す。ＣＤ７１に対するアフィニティーが大きな抗体は、急速に内部化され、受容体が、リサイクリングではなく、分解のために、リソソームへとターゲティングされるように、通常の受容体トラフィッキングを変更する。これに対し、ＣＤ７１に対するアフィニティーが小さな抗体は、受容体のリサイクリング、および脳の高度の曝露を可能とする。
抗体または抗体断片は、標的分子に対する、高アフィニティーおよび高特異性が所望される場合に、治療用タンパク質のうちで、最も広く使用されるクラスであるが、このような標的に結合するように、抗体以外のタンパク質もまた操作される。これらの「代替的足場」タンパク質は、それらのサイズが小さいこと、ジスルフィド結合の欠如、高安定性、原核生物宿主内で発現される能力、精製の容易さのために、従来の抗体を上回る利点を有し、薬物／毒素へと、容易にコンジュゲートされ、組織へと効率的に浸透し、多特異性結合剤へと、たやすくフォーマットされる。
このような代替的足場のうちの１つは、免疫グロブリン（Ｉｇ）フォールドである。このフォールドは、抗体の可変領域内のほか、数千に及ぶ、抗体以外のタンパク質内で見出される。このようなＩｇタンパク質の１つである、ヒトフィブロネクチンに由来する、第１０のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）リピートは、全体的なＩｇフォールド構造を保持しながら、表面露出ループ内の多数の突然変異を許容しうることが示されている。したがって、ＣＤ７１に特異的に結合しうるＦＮ３ドメイン、および受容体に媒介される、ＣＤ７１の内部化を介する細胞内へのアクセスを可能とする、新規の治療剤のために、このような分子を使用する方法が必要とされている。
一部の実施形態では、ＣＤ７１タンパク質に特異的に結合するＦＮ３ドメイン（例えば、ポリペプチド）が提供される。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、単離ＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、組換えＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、天然に存在しないＦＮ３ドメインである。
一部の実施形態では、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、もしくは３０４～３０６、２９２～２９９もしくは３０４～３０６、または３０４～３０６のアミノ酸配列を含むＦＮ３ドメインが提供される。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、ＣＤ７１に結合する。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、トランスフェリンの、ＣＤ７１への結合と競合しない、ＣＤ７１上の部位において、ヒトＣＤ７１に結合する。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、ＣＤ７１に特異的に結合する。一部の実施形態では、可撓性リンカーなどのリンカーにより接続された、１つを超えるＦＮ３ドメインを含むポリペプチドが提供される。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ドメイン間の１つまたはそれ以上のリンカーにより互いと接続された、２つ、３つ、または４つのＦＮ３ドメインを含む。
一部の実施形態では、本明細書で記載される、ＦＮ３ドメインをコードする単離ポリヌクレオチドが提供される。
一部の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
一部の実施形態では、本明細書で記載されるベクターを含む宿主細胞が提供される。
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインを作製する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、ＦＮ３ドメインをコードするか、またはこれを発現させるベクターを含む宿主細胞を培養する工程を含む。一部の実施形態では、方法は、ＦＮ３ドメインを精製する工程をさらに含む。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、ＣＤ７１に特異的に結合する。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインに結合する、抗イディオタイプ抗体が提供される。
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインのうちの１つまたはそれ以上を含むキットが提供される。
一部の実施形態では、腫瘍組織内のＣＤ７１発現がん細胞を検出する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象から、腫瘍組織の試料を得る工程；および腫瘍組織の試料を、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のうちの１つのアミノ酸配列を含む、ＣＤ７１タンパク質に結合するＦＮ３ドメインと接触させ、ＣＤ７１タンパク質と、ＦＮ３ドメインとの結合を検出することにより、ＣＤ７１タンパク質が、腫瘍組織内で発現されるのかどうかを検出する工程を含む。
一部の実施形態では、ＣＤ７１発現細胞を分離する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象から、試料を得る工程；試料を、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のうちの１つのアミノ酸配列を含む、ＣＤ７１タンパク質に結合するＦＮ３ドメインと接触させる工程；およびＦＮ３ドメインに結合した細胞を分離する工程を含む。
一部の実施形態では、腫瘍組織内のＣＤ７１発現がん細胞を検出する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のうちの１つのアミノ酸配列を含む、ＣＤ７１タンパク質に結合するＦＮ３ドメインを、検出用標識とコンジュゲートして、コンジュゲートを形成する工程；コンジュゲートを、対象へと投与する工程；およびコンジュゲートが結合したＣＤ７１発現がん細胞を視覚化する工程を含む。
一部の実施形態では、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象へと、ＣＤ７１に結合するポリペプチドまたは医薬組成物を投与する工程を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６などの配列、または治療剤へと連結されるか、もしくはこれとコンジュゲートされた、本明細書で提示されるポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するポリペプチドは、中枢神経系へと方向付けられる。一部の実施形態では、それを必要とする対象における神経学的状態および／または脳腫瘍を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象へと、ＣＤ７１に結合するポリペプチドまたは医薬組成物を投与する工程を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６などの配列、または治療剤へと連結されるか、もしくはこれとコンジュゲートされた、本明細書で提示されるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、脳腫瘍は、非悪性脳腫瘍、良性脳腫瘍、および悪性脳腫瘍からなる群から選択される。一部の実施形態では、神経学的状態は、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症、パーキンソン病、ラフォラ病、ポンペ病、成人ポリグルコサン小体病、脳卒中、脊髄損傷、運動失調、ベル麻痺、脳動脈瘤、てんかん、発作、ギラン－バレー症候群、多発性硬化症、筋ジストロフィー、神経皮膚症候群、偏頭痛、脳炎、敗血症、および重症筋無力症からなる群から選択される。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するポリペプチドは、筋細胞へと方向付けられる。一部の実施形態では、方法は、対象へと、ＣＤ７１に結合するポリペプチドまたは医薬組成物を投与する工程を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６などの配列、または治療剤へと連結されるか、もしくはこれとコンジュゲートされた、本明細書で提示されるポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、それを必要とする対象におけるポンペ病（ＧＳＤ２；酸性アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）欠損症）を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象へと、ＣＤ７１に結合するポリペプチドまたは医薬組成物を投与する工程を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６などの配列、または治療剤へと連結されるか、もしくはこれとコンジュゲートされた、本明細書で提示されるポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、それを必要とする対象における糖原病を処置する方法であって、本明細書で提示される組成物を投与する工程を含む方法が提供される。一部の実施形態では、糖原病は、コーリー病またはフォーブズ病（ＧＳＤ３；グリコーゲン脱分枝酵素（ＡＧＬ）欠損症）、マッカードル病（ＧＳＤ５；筋グリコーゲンホスホリラーゼ（ＰＹＧＭ）欠損症）、ＩＩ型糖尿病／糖尿病性腎症、ＧＳＤ１２であるアルドラーゼＡ欠損症、ラフォラ病、低酸素症、アンデルセン病（ＧＳＤ４；グリコーゲン脱分枝酵素（ＧＢＥ１）欠損症）、タルイ病（ＧＳＤ７；筋ホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫＭ）欠損症）、および成人ポリグルコサン小体病からなる群から選択される。一部の実施形態では、糖原病は、グリコーゲンシンターゼ（ＧＹＳ２）欠損症（ＧＳＤ０）、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ／ＳＬＣ３７Ａ４）欠損症（ＧＳＤ１；フォンギールケ病）、ハース病（ＧＳＤ６；肝グリコーゲンホスホリラーゼ（ＰＹＧＬ）欠損症または筋ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＡＭ２）欠損症）、ホスホリラーゼキナーゼ（ＰＨＫＡ２／ＰＨＫＢ／ＰＨＫＧ２／ＰＨＫＡ１）欠損症（ＧＳＤ９）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＡＭ２）欠損症（ＧＳＤ１０）、筋乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨＡ）欠損症（ＧＳＤ１１）、ファンコーニ－ビッケル症候群（ＧＳＤ１１；グルコース輸送体（ＧＬＵＴ２）欠損症）、アルドラーゼＡ欠損症（ＧＳＤ１２）、β－エノラーゼ（ＥＮＯ３）欠損症（ＧＳＤ１３）、およびグリコゲニン－１（ＧＹＧ１）欠損症（ＧＳＤ１５）からなる群から選択される。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するポリペプチドは、免疫細胞へと方向付けられる。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するポリペプチドは、樹状細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＢ細胞へと方向付けられる。一部の実施形態では、それを必要とする対象における自己免疫疾患を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象へと、ＣＤ７１に結合するポリペプチドまたは医薬組成物を投与する工程を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６などの配列、または治療剤へと連結されるか、もしくはこれとコンジュゲートされた、本明細書で提示されるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、関節リウマチ、橋本自己免疫性甲状腺炎、セリアック病、１型糖尿病、白斑、リウマチ熱、悪性貧血／萎縮性胃炎、円形脱毛症、および免疫性血小板減少性紫斑病からなる群から選択される。
一部の実施形態では、目的の薬剤を、ＣＤ７１陽性細胞へと送達する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、細胞を、本明細書で提示されるポリペプチドなど、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインとカップリングされた、目的の薬剤と接触させる工程を含む。一部の実施形態では、目的の薬剤は、化学療法剤、薬物、増殖阻害剤、毒素、放射性同位体、抗チューブリン剤、ポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ分子、アンチセンス分子、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤、抗生剤、抗葉酸剤、代謝拮抗剤、化学療法増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤、またはビンカアルカロイドである。
一部の実施形態では、本明細書で提示されるＦＮ３ドメインは、ポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ分子、アンチセンス分子、ＲＮＡ分子、またはＤＮＡ分子へとコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、トランスフェリンの、ＣＤ７１への結合と競合したり、これを阻害したりしない部位において、ＣＤ７１に結合するＦＮ３タンパク質である。
一部の実施形態では、トランスフェリンの、ＣＤ７１への結合と競合したり、これを阻害したりしない部位において、ＣＤ７１に結合するＦＮ３タンパク質を同定する方法が提供される。
ＦＮ３ポリペプチド（ＡＢＸ１００７）、またはＦＮ３ポリペプチド－ｓｉＲＮＡコンジュゲート（ＡＢＸ１００５）の投与後の、ＣＤ－１マウスの多様な組織内における、ＡＨＡ１ ｍＲＮＡの定量を例示する図である。 ＦＮ３－ｓｉＲＮＡコンジュゲート（ＡＢＸ１００５）の投与後の、Ｃ５７ＢＬ６マウスの多様な組織内における、ＡＨＡ１ ｍＲＮＡの用量依存的定量を例示する図である。 プロテオームアレイにおいて、６，０００を超える受容体を使用する、標的結合アッセイの結果を提示する図であり、この場合、データは、ＣＤ７１が、ＦＮ３ドメインの排他的結合標的であることを裏付ける。 ＣＤ７１センチリンコンジュゲートが、投与の２週間、４週間、および８週間後において、ｍＡｂコンジュゲートと比較して、遺伝子ノックダウンの維持を駆動することを裏付けるデータを提示する図である。 センチリンおよびセンチリンコンジュゲートが、ヒトＣＤ７１およびカニクイザルＣＤ７１に、強く結合することを裏付けるＥＬＩＳＡデータを提示する図である。 センチリン－ＡＨＡ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートが、カニクイザルのｉｎ ｖｉｖｏの筋内および心内におけるｍＲＮＡレベルを、効果的にノックダウンする能力を裏付けるデータを提示する図である。
内容が、そうでないことを、明らかに指示しない限りにおいて、本明細書および付属の特許請求の範囲で使用される、単数形の「ある（ａ）」「ある（ａｎ）」、および「その」は、複数形の指示対象を含む。したがって、例えば、「ある細胞」への言及は、２つまたはこれを超える細胞の組合せなどを含む。
「フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン」（ＦＮ３ドメイン）とは、フィブロネクチン、テネイシン、細胞内細胞骨格タンパク質、サイトカイン受容体、および原核生物酵素を含むタンパク質内において、高頻度で生じるドメインを指す（ＢｏｒｋおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８９：８９９０～８９９４、１９９２；Ｍｅｉｎｋｅら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７５：１９１０～１９１８、１９９３；Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２６５：１５６５９～１５６６５、１９９０）。例示的ＦＮ３ドメインは、ヒトテネイシンＣ内に存在する、１５の異なるＦＮ３ドメイン、ヒトフィブロネクチン（ＦＮ）内に存在する、１５の異なるＦＮ３ドメイン、および、例えば、米国特許第８，２７８，４１９号において記載されている、非天然の合成ＦＮ３ドメインである。個々のＦＮ３ドメインは、ドメイン番号およびタンパク質名、例えば、テネイシンの第３のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）、またはフィブロネクチンの第１０のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）により言及される。
「捕捉剤」という用語は、特定の種類の細胞に結合し、他の細胞からの、この細胞の分離を可能とする物質を指す。例示的捕捉剤は、磁気ビーズ、強磁性流体、封入試薬、特定の細胞型に結合する分子などである。
「試料」とは、対象から分離された、同様の体液、細胞、または組織のほか、対象内に存在する、体液、細胞、または組織の回収物を指す。例示的試料は、組織生検、細針吸引、手術切除組織、臓器培養物、細胞培養物、ならびに血液、血清および漿液、血漿、リンパ、尿、唾液、嚢胞液、涙液、糞便、痰、分泌性組織／臓器の粘液性分泌物、膣分泌物、腹水、胸水、心膜腔液、腹膜腔液、腹腔液、および他の体腔液、気管支洗浄により回収された体液、滑液、対象または生物学的供給源と接触した液体、例えば、細胞馴致培地または臓器馴致培地を含む細胞／臓器培養培地、および洗浄液などの体液である。
「～を置換すること」または「置換された」または「～を突然変異させること」または「突然変異させられた」とは、ポリペプチド配列内またはポリヌクレオチド配列内の１つまたはそれ以上のアミノ酸またはヌクレオチドを、この配列の変異体を作出するように変更するか、欠失させるか、または挿入することを指す。
「変異体」とは、１つまたはそれ以上の修飾、例えば、置換、挿入、または欠失により、参照ポリペプチドまたは参照ポリヌクレオチドと異なるポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す。
「～に特異的に結合する」または「～に特異的結合すること」とは、ＦＮ３ドメインが、約１×１０－６Ｍもしくはこれ未満、例えば、約１×１０－７Ｍもしくはこれ未満、約１×１０－８Ｍもしくはこれ未満、約１×１０－９Ｍもしくはこれ未満、約１×１０－１０Ｍもしくはこれ未満、約１×１０－１１Ｍもしくはこれ未満、約１×１０－１２Ｍもしくはこれ未満、または約１×１０－１３Ｍもしくはこれ未満の解離定数（ＫＤ）で、ＣＤ７１など、その標的に結合する能力を指す。代替的に、「～に特異的結合すること」とは、標準溶液ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＦＮ３ドメインが、その標的（例えば、ＣＤ７１）に、陰性対照の、少なくとも５倍の強さで結合する能力を指す。特異的結合はまた、本明細書で記載され、図３に示された、プロテオームアレイを使用しても裏付けられる。一部の実施形態では、陰性対照は、ＣＤ７１に結合しないＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、他の類縁の抗原、例えば、Ｍａｃａｃａ Ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）またはＰａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー）など、他の種（相同体）に由来する、同じ所定の抗原に対する交差反応性を有しうる。
「ライブラリー」とは、変異体のコレクションを指す。ライブラリーは、ポリペプチド変異体またはポリヌクレオチド変異体から構成される。
「安定性」とは、それが、その通常の機能活性のうちの少なくとも１つ、例えば、ＣＤ７１など、所定の抗原への結合を保持するように、分子が、生理学的条件下で、フォールディング状態を維持する能力を指す。
「ＣＤ７１」とは、配列番号２７４または２７５のアミノ酸配列を有する、ヒトＣＤ７１タンパク質を指す。一部の実施形態では、配列番号２７４は、全長ヒトＣＤ７１タンパク質である。一部の実施形態では、配列番号２７５は、ヒトＣＤ７１の細胞外ドメインである。
配列番号２７４＝ヒト成熟ＣＤ７１
ＭＴＫＥＹＱＤＬＱＨＬＤＮＥＥＳＤＨＨＱＬＲＫＧＰＰＰＰＱＰＬＬＱＲＬＣＳＧＰＲＬＬＬＬＳＬＧＬＳＬＬＬＬＶＶＶＣＶＩＧＳＱＮＳＱＬＱＥＥＬＲＧＬＲＥＴＦＳＮＦＴＡＳＴＥＡＱＶＫＧＬＳＴＱＧＧＮＶＧＲＫＭＫＳＬＥＳＱＬＥＫＱＱＫＤＬＳＥＤＨＳＳＬＬＬＨＶＫＱＦＶＳＤＬＲＳＬＳＣＱＭＡＡＬＱＧＮＧＳＥＲＴＣＣＰＶＮＷＶＥＨＥＲＳＣＹＷＦＳＲＳＧＫＡＷＡＤＡＤＮＹＣＲＬＥＤＡＨＬＶＶＶＴＳＷＥＥＱＫＦＶＱＨＨＩＧＰＶＮＴＷＭＧＬＨＤＱＮＧＰＷＫＷＶＤＧＴＤＹＥＴＧＦＫＮＷＲＰＥＱＰＤＤＷＹＧＨＧＬＧＧＧＥＤＣＡＨＦＴＤＤＧＲＷＮＤＤＶＣＱＲＰＹＲＷＶＣＥＴＥＬＤＫＡＳＱＥＰＰＬＬ
配列番号２７５＝ヒト成熟ＣＤ７１細胞外ドメイン
ＱＮＳＱＬＱＥＥＬＲＧＬＲＥＴＦＳＮＦＴＡＳＴＥＡＱＶＫＧＬＳＴＱＧＧＮＶＧＲＫＭＫＳＬＥＳＱＬＥＫＱＱＫＤＬＳＥＤＨＳＳＬＬＬＨＶＫＱＦＶＳＤＬＲＳＬＳＣＱＭＡＡＬＱＧＮＧＳＥＲＴＣＣＰＶＮＷＶＥＨＥＲＳＣＹＷＦＳＲＳＧＫＡＷＡＤＡＤＮＹＣＲＬＥＤＡＨＬＶＶＶＴＳＷＥＥＱＫＦＶＱＨＨＩＧＰＶＮＴＷＭＧＬＨＤＱＮＧＰＷＫＷＶＤＧＴＤＹＥＴＧＦＫＮＷＲＰＥＱＰＤＤＷＹＧＨＧＬＧＧＧＥＤＣＡＨＦＴＤＤＧＲＷＮＤＤＶＣＱＲＰＹＲＷＶＣＥＴＥＬＤＫＡＳＱＥＰＰＬＬ
「Ｔｅｎｃｏｎ」とは、配列番号２７４に示され、米国特許公開第２０１０／０２１６７０８号において記載されている配列を有する、合成フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを指す。
配列番号２７４＝元のＴｅｎｃｏｎ配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＥＦＴＴ
「がん細胞」または「腫瘍細胞」とは、新たな遺伝物質の取込みを必ずしも伴わない、自発性または誘導性の表現型変化を有する、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏにおける、がん性細胞、前がん性細胞、または形質転換細胞、および組織培養物中のこれらの細胞を指す。形質転換は、形質転換ウイルスによる感染、および新たなゲノム核酸の組込み、または外因性核酸の取込みから生じうるが、形質転換はまた、自発的に、または発がん物質への曝露後に生じる場合もあり、これにより、内因性遺伝子を突然変異させる場合もある。形質転換／がんは、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、およびｅｘ ｖｉｖｏなど、ヌードマウスなどの適切な動物宿主における、形状変化、細胞の不死化、増殖制御の異常、病巣形成、増殖、悪性腫瘍、腫瘍特異的マーカーレベル、浸潤性、腫瘍の増殖または抑制により例示される（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」（３版、１９９４））。
「樹状細胞」とは、適応免疫系において、重要な役割を果たす抗原提示細胞（ＡＰＣ）の種類を指す。樹状細胞の主要な機能は、抗原を提示することである。樹状細胞は、不活性Ｔリンパ球内、または休眠ナイーブＴリンパ球内において、一次免疫応答を誘導する能力を有する。
「免疫細胞」とは、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞）、好中球、または単球／マクロファージとして類別される、免疫系の細胞を指す。これらは、全ての種類の白血球である。
「ベクター」とは、生体系内の複製が可能であるか、またはこのような系の間で移動されるポリヌクレオチドを指す。ベクターのポリヌクレオチドは、典型的に、生体系内のこれらのポリヌクレオチドの複製または維持を容易とするように機能する、複製起点、ポリアデニル化シグナル、または選択マーカーなどのエレメントを含有する。このような生体系の例は、細胞、ウイルス、動物、植物、およびベクターを複製することが可能な、生物学的構成要素を利用する、再構成された生体系を含みうる。ベクターを含むポリヌクレオチドは、ＤＮＡの場合もあり、ＲＮＡ分子の場合もあり、これらのハイブリッド体の場合もある。
「発現ベクター」とは、生体系内、または発現ベクター内に存在するポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの翻訳を方向付けるように再構成された生体系内において利用されるベクターを指す。
「ポリヌクレオチド」とは、糖リン酸骨格または他の同等の共有結合的化学反応により、共有結合的に連結されたヌクレオチド鎖を含む合成分子を指す。ｃＤＮＡは、ポリヌクレオチドの典型例である。
「ポリペプチド」または「タンパク質」とは、ポリペプチドを形成するように、ペプチド結合により連結された、少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を指す。約５０アミノ酸未満の小型のポリペプチドは、「ペプチド」と称される。
「～価」とは、分子内の抗原に特異的な、一定数の結合性部位の存在を指す。このように、「一価」、「二価」、「四価」、および「六価」とは、それぞれ、分子内の抗原に特異的な、１つ、２つ、４つ、および６つの結合性部位の存在を指す。
「対象」は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」は、非ヒト霊長動物、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両性類、爬虫類など、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物を含む。注記される場合を除き、「患者」または「対象」という用語は、互換的に使用される。
「単離された」とは、組換え細胞など、分子がその中で産生される系の他の構成要素から、実質的に分離および／または精製された分子（ＦＮ３ドメインなどの合成ポリヌクレオチドまたはポリペプチドなど）のほか、少なくとも１つの精製工程または単離工程にかけられたタンパク質の均質集団を指す。「単離ＦＮ３ドメイン」とは、他の細胞素材および／または化学物質を実質的に含まないＦＮ３ドメインを指し、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の純度までなどの高純度まで単離されたＦＮ３ドメインを包含する。
組成物
一部の実施形態では、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むタンパク質が提供される。
一部の実施形態では、タンパク質は、配列番号２７３のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。配列番号２７３は、配列番号２８８、配列番号２８９、配列番号２９０、および配列番号２９１の配列に基づくコンセンサス配列である。
配列番号２７３の配列は、
ＭＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ１ＩＸ２ＹＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＧＥＡＩＸ８ＬＸ９ＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ１０ＶＸ１１ＩＸ１２Ｘ１３ＶＫＧＧＸ１４Ｘ１５ＳＸ１６ＰＬＸ１７ＡＸ１８ＦＴＴ
［式中、
Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、各々独立に、メチオニンまたはプロリン以外の任意のアミノ酸であり、
Ｘ１は、Ｄ、Ｆ、Ｙ、またはＨから選択され；
Ｘ２は、Ｙ、Ｇ、Ａ、またはＶから選択され；
Ｘ３は、Ｉ、Ｔ、Ｌ、Ａ、またはＨから選択され；
Ｘ４は、Ｓ、Ｙ、またはＰから選択され；
Ｘ５は、Ｙ、Ｇ、Ｑ、またはＲから選択され；
Ｘ６は、ＧまたはＰから選択され；
Ｘ７は、Ａ、Ｙ、Ｐ、Ｄ、またはＳから選択され；
Ｘ１０は、Ｗ、Ｎ、Ｓ、またはＥから選択され；
Ｘ１１は、Ｌ、Ｙ、またはＧから選択され；
Ｘ１２は、Ｄ、Ｑ、Ｈ、またはＶから選択され；
Ｘ１３は、ＧまたはＳから選択され；
Ｘ１４は、Ｒ、Ｇ、Ｆ、Ｌ、またはＤから選択され；
Ｘ１５は、Ｗ、Ｓ、Ｐ、またはＬから選択され；
Ｘ１６は、Ｔ、Ｖ、Ｍ、またはＳから選択される］
である。
一部の実施形態では：
Ｘ１は、Ｄ、Ｆ、Ｙ、またはＨから選択され；
Ｘ２は、Ｇ、Ａ、またはＶから選択され；
Ｘ３は、Ｔ、Ｌ、Ａ、またはＨから選択され；
Ｘ４は、ＹまたはＰから選択され；
Ｘ５は、Ｇ、Ｑ、またはＲから選択され；
Ｘ６は、ＧまたはＰから選択され；
Ｘ７は、Ｙ、Ｐ、Ｄ、またはＳから選択され；
Ｘ１０は、Ｗ、Ｎ、Ｓ、またはＥから選択され；
Ｘ１１は、Ｌ、Ｙ、またはＧから選択され；
Ｘ１２は、Ｑ、Ｈ、またはＶから選択され；
Ｘ１３は、ＧまたはＳから選択され；
Ｘ１４は、Ｇ、Ｆ、Ｌ、またはＤから選択され；
Ｘ１５は、Ｓ、Ｐ、またはＬから選択され；
Ｘ１６は、Ｖ、Ｍ、またはＳから選択される。
一部の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、およびＸ１６は、配列番号２８８の配列において示される通りである。一部の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、およびＸ１６は、配列番号２８９の配列において示される通りである。一部の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、およびＸ１６は、配列番号２９０の配列において示される通りである。一部の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、およびＸ１６は、配列番号２９１の配列において示される通りである。
一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンではない。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、アラニンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、アルギニンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、アスパラギンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、システインである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、グルタミンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、グルタミン酸である。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、グリシンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、ヒスチジンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、イソロイシンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、ロイシンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、リシンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、フェニルアラニンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、セリンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、トレオニンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、トリプトファンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、チロシンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、バリンである。
一部の実施形態では、配列は、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８の位置に対応する位置が、上記に明示されたアミノ酸残基以外の、任意のアミノ酸残基でありうることを除き、一部の実施形態では、Ｘ８が、Ｖではなく、Ｘ９が、Ｔではなく、Ｘ１７が、Ｓではなく、Ｘ１８が、Ｉではないことを除き、配列番号２８８の配列に示される通りに明示される。
一部の実施形態では、配列は、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８の位置に対応する位置が、上記に明示されたアミノ酸残基以外の、任意のアミノ酸残基でありうることを除き、一部の実施形態では、Ｘ８が、Ｖではなく、Ｘ９が、Ｔではなく、Ｘ１７が、Ｓではなく、Ｘ１８が、Ｉではないことを除き、配列番号２８９の配列に示される通りに明示される。
一部の実施形態では、配列は、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８の位置に対応する位置が、上記に明示されたアミノ酸残基以外の、任意のアミノ酸残基でありうることを除き、一部の実施形態では、Ｘ８が、Ｖではなく、Ｘ９が、Ｔではなく、Ｘ１７が、Ｓではなく、Ｘ１８が、Ｉではないことを除き、配列番号２９０の配列に示される通りに明示される。
一部の実施形態では、配列は、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８の位置に対応する位置が、上記に明示されたアミノ酸残基以外の、任意のアミノ酸残基でありうることを除き、一部の実施形態では、Ｘ８が、Ｖではなく、Ｘ９が、Ｔではなく、Ｘ１７が、Ｓではなく、Ｘ１８が、Ｉではないことを除き、配列番号２９１の配列に示される通りに明示される。
一部の実施形態では、タンパク質は、配列番号２７３の配列と、少なくとも６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。一部の実施形態では、タンパク質は、配列番号２７３の配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。一部の実施形態では、タンパク質は、配列番号２７３の配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。一部の実施形態では、タンパク質は、配列番号２７３の配列と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。一部の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドは、配列番号２７３と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一である。
同一性パーセントは、ＮＣＢＩウェブサイトを介して利用可能である、ＢｌａｓｔＰを使用して、２つ配列をアライメントするのに、デフォルトパラメータを使用して決定される。
本明細書で提示されるポリペプチドは、大型のポリペプチドの一部であることが可能であり、ドメインと称される。異なるポリペプチド内の、２つのドメインの間の相同性または同一性は、ポリペプチド全体に照らして、同様のドメインに基づく。例えば、ポリペプチドが、配列番号１を含むＦＮ３ドメインを含むポリペプチドを含み、前記ドメインが、ｓｃＦＶ抗体へとコンジュゲートされる場合、配列番号１と同様であるが、同一ではないドメインを有する、別のタンパク質は、ｓｃＦＶが、相同性を共有しない場合であってもなお、少なくとも９０％同一でありうる。したがって、同一性％は、ポリペプチドのドメインに基づく場合もあり、全長に基づく場合もある。同一性％を決定する方法は、本明細書で提示されるか、または当業者に公知である。
一部の実施形態では、ヒトＣＤ７１タンパク質（配列番号２７４または２７５）に結合するか、またはこれに特異的に結合する、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインが提供される。本明細書で提示される通り、ＦＮ３ドメインは、ＣＤ７１タンパク質に結合しうる。ドメインはまた、ＣＤ７１タンパク質にも特異的に結合しうることも、明示的に言明されないとしても、提示される。したがって、例えば、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインはまた、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインタンパク質も包含するであろう。これらの分子は、例えば、治療適用および診断適用ならびにイメージングにおいて使用される。一部の実施形態では、本明細書で開示される、ＦＮ３ドメインをコードするポリヌクレオチド、またはその相補性核酸、ベクター、宿主細胞、およびこれらを作製および使用する方法が提供される。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するか、またはこれに特異的に結合する、単離ＦＮ３ドメインが提供される。
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、リンカーにより接続された、２つのＦＮ３ドメインを含む。リンカーは、可撓性リンカーでありうる。リンカーは、本明細書で記載される、短鎖ペプチド配列などの短鎖ペプチド配列でありうる。例えば、リンカーは、Ｇ／Ｓリンカーなどでありうる。
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、本明細書で提示されるリンカーなどのリンカーにより接続された、２つのＦＮ３ドメインを含む。例示的リンカーは、（ＧＳ）２、（配列番号２７８）、（ＧＧＧＳ）２（配列番号２７９）、（ＧＧＧＧＳ）１－５（配列番号２８０）、（ＡＰ）１－２０；（ＡＰ）２（配列番号２８１）、（ＡＰ）５（配列番号２８２）、（ＡＰ）１０（配列番号２８３）、（ＡＰ）２０（配列番号２８４）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）５ＡＡＡ（配列番号２８５）、または（ＥＡＡＡＫ）１－５（配列番号３０７）を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、リンカーは、ＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（配列番号３００）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３０１）；ＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰ（配列番号３０２）；またはＥＡＡＡＫ（配列番号３０３）のアミノ酸配列を含むか、またはこれらのアミノ酸配列である。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９９のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、当業者により実施され、表面プラズモン共鳴法またはＫｉｎｅｘａ法により決定される通り、約１×１０－７Ｍ未満、例えば、約１×１０－８Ｍ未満、約１×１０－９Ｍ未満、約１×１０－１０Ｍ未満、約１×１０－１１Ｍ未満、約１×１０－１２Ｍ未満、または約１×１０－１３Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）で、ＣＤ７１に結合しうる。測定された、特定のＦＮ３ドメイン－抗原間相互作用のアフィニティーは、異なる条件（例えば、オスモル濃度、ｐＨ）下で測定された場合に変動しうる。したがって、アフィニティー、および他の抗原結合性パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の測定は、タンパク質足場および抗原の正規化溶液、ならびに本明細書で記載される緩衝液などの正規化緩衝液によりなされる。
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、ＣＤ７１に、標準溶液ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、陰性対照について得られるシグナルを、少なくとも５倍上回る強さで結合しうる。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するか、またはこれに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、分子のＮ末端へと連結された、イニシエーターメチオニン（Ｍｅｔ）を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するか、またはこれに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、ＦＮ３ドメインのＣ末端へと連結された、システイン（Ｃｙｓ）を含む。Ｎ末端Ｍｅｔおよび／またはＣ末端Ｃｙｓの付加は、半減期延長分子の発現および／またはコンジュゲーションを容易としうる。
ＦＮ３ドメインはまた、例えば、参照によってその全体を本明細書に組み入れる、米国特許第１０，１９６，４４６号において記載されたシステイン置換などのシステイン置換も含有しうる。略述すると、一部の実施形態では、本明細書で提示されるポリペプチドは、米国特許第１０，１９６，４４６号の、配列番号６または配列番号１に基づくＦＮ３ドメインの、残基６、８、１０、１１、１４、１５、１６、２０、３０、３４、３８、４０、４１、４５、４７、４８、５３、５４、５９、６０、６２、６４、７０、８８、８９、９０、９１、および９３からなる群から選択される位置、ならびに類縁のＦＮ３ドメイン内の、同等の位置において、少なくとも１つのシステイン置換を含みうる。一部の実施形態では、置換は、残基６にある。一部の実施形態では、置換は、残基８にある。一部の実施形態では、置換は、残基１０にある。一部の実施形態では、置換は、残基１１にある。一部の実施形態では、置換は、残基１４にある。一部の実施形態では、置換は、残基１５にある。一部の実施形態では、置換は、残基１６にある。一部の実施形態では、置換は、残基２０にある。一部の実施形態では、置換は、残基３０にある。一部の実施形態では、置換は、残基３４にある。一部の実施形態では、置換は、残基３８にある。一部の実施形態では、置換は、残基４０にある。一部の実施形態では、置換は、残基４１にある。一部の実施形態では、置換は、残基４５にある。一部の実施形態では、置換は、残基４７にある。一部の実施形態では、置換は、残基４８にある。一部の実施形態では、置換は、残基５３にある。一部の実施形態では、置換は、残基５４にある。一部の実施形態では、置換は、残基５９にある。一部の実施形態では、置換は、残基６０にある。一部の実施形態では、置換は、残基６２にある。一部の実施形態では、置換は、残基６４にある。一部の実施形態では、置換は、残基７０にある。一部の実施形態では、置換は、残基８８にある。一部の実施形態では、置換は、残基８９にある。一部の実施形態では、置換は、残基９０にある。一部の実施形態では、置換は、残基９１にある。一部の実施形態では、置換は、残基９３にある。
ドメイン内またはタンパク質内の位置におけるシステイン置換は、既存のアミノ酸残基の、システイン残基による置きかえを含む。システイン修飾の他の例は、例えば、参照によってその全体を本明細書に組み入れる、米国特許出願公開第２０１７０３６２３０１号において見出される。配列のアライメントは、例えば、ＮＣＢＩウェブサイトにおいて、デフォルトパラメータを使用するＢｌａｓｔＰを使用して実施される。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、細胞へと内部化される。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインの内部化は、検出用標識または治療剤の、細胞への送達を容易としうる。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインの内部化は、細胞傷害剤の、細胞への送達を容易としうる。細胞傷害剤は、治療剤として作用しうる。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインの内部化は、本明細書で開示される、任意の検出用標識、治療的、および／または細胞傷害剤の、細胞への送達を容易としうる。一部の実施形態では、細胞は、腫瘍細胞である。一部の実施形態では、細胞は、肝細胞である。一部の実施形態では、細胞は、筋細胞である。一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞である。一部の実施形態では、細胞は、樹状細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＮＫ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｂ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、中枢神経系細胞である。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、場合により、残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、または８６（残基の番号付けは、配列番号２７７に対応する）において、置換を有する、配列番号２７６のＴｅｎｃｏｎ配列、または配列番号２７７のＴｅｎｃｏｎ ２７配列に基づく。
配列番号２７６＝元のＴｅｎｃｏｎ配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＥＦＴＴ
配列番号２７７＝安定化Ｔｅｎｃｏｎ（Ｔｅｎｃｏｎ２７）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号３８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号４５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号４６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号４７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号４８のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号５５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号５６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号５７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号６０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号６１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号６２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号６４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号６５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号６６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号６７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号６８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号７０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号７４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号７５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号７６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号７７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号７８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号７９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号８０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号８１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号８２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号８３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号８４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号８５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号８６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号８７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号８８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号８９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号９０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号９１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号９２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号９３のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号９４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号９５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号９６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号９７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号９８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号９９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１００のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１０２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１０３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１０９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１１０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１１１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１１２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１１６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１１７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１２１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１２２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１２３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１２６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１２７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１２８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１２９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１３０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１３１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１３２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１３３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１３４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１３５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１３６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１３８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１３９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１４０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１４１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１４２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１４３のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１４４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１４５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１４６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１４７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１４８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１４９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１５０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１５１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１５２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１５３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１５４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１５５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１５６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１５７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１５９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１６１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１６３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１６４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１６５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１６６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１６７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１６８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１６９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１７０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１７４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１７５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１７６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１７７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１７９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１８０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１８１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１８３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１８４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１８５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１８６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１８７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１８８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１８９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１９０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１９１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１９２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１９３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１９４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１９６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１９８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１９９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２００のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２０１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２０２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２０３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２０４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２０５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２０６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２０７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２０８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２０９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２１０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２１１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２１２のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２１３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２１４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２１５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２１６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２１７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２１９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２２１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２２２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２２３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２２４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２２５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２２６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２２７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２２８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２２９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２３０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２３１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２３２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２３３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２３４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２３５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２３６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２３７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２３８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２３９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２４０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２４１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２４２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２４３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２４４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２４５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２４６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２４７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２４８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２４９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２５０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２５１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２５２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２５３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２５４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２５５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２５６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２５７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２５８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２５９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２６０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２６１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２６２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２６３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２６４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２６５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２６６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２６７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２６８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２６９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２７０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号３０４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号３０５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号３０６のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、トランスフェリンの、ＣＤ７１への結合と競合しない、ＣＤ７１上の部位において、ヒトＣＤ７１に結合する。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６の配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、分子のＮ末端へと連結された、イニシエーターメチオニン（Ｍｅｔ）を含む。
本開示のＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインのコンジュゲート
一部の実施形態では、異種分子（複数可）へとコンジュゲートされた、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインが提供される。
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、オリゴヌクレオチドへとコンジュゲートされる。例えば、オリゴヌクレオチドは、遺伝子またはｍＲＮＡ転写物の発現を阻害するために使用される。オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどでありうる。したがって、一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、ｓｉＲＮＡ分子、アンチセンス分子、ＲＮＡ分子、またはＤＮＡ分子などであるがこれらに限定されないポリヌクレオチドへとコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、本明細書で記載されるリンカーを使用して、ｓｉＲＮＡ分子へとコンジュゲートされる。一部の実施形態では、リンカーは、化学リンカーである。
一部の実施形態では、核酸分子へと連結された、ＦＮ３ドメインを含むポリペプチドなどのポリペプチドを含む組成物が提供される。核酸分子は、例えば、ｓｉＲＮＡ分子でありうる。
したがって、一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ（ｄｓＲＮＡ）剤である。ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤の各鎖は、１２～４０ヌクレオチドの長さの範囲でありうる。例えば、各鎖は、１４～４０ヌクレオチドの長さ、１７～３７ヌクレオチドの長さ、２５～３７ヌクレオチドの長さ、２７～３０ヌクレオチドの長さ、１７～２３ヌクレオチドの長さ、１７～２１ヌクレオチドの長さ、１７～１９ヌクレオチドの長さ、１９～２５ヌクレオチドの長さ、１９～２３ヌクレオチドの長さ、１９～２１ヌクレオチドの長さ、２１～２５ヌクレオチドの長さ、または２１～２３ヌクレオチドの長さでありうる。
一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、典型的に、二重鎖ｄｓＲＮＡを形成する。ｄｓＲＮＡ剤の二重鎖領域は、１２～４０ヌクレオチド対の長さでありうる。例えば、二重鎖領域は、１４～４０ヌクレオチド対の長さ、１７～３０ヌクレオチド対の長さ、２５～３５ヌクレオチドの長さ、２７～３５ヌクレオチド対の長さ、１７～２３ヌクレオチド対の長さ、１７～２１ヌクレオチド対の長さ、１７～１９ヌクレオチド対の長さ、１９～２５ヌクレオチド対の長さ、１９～２３ヌクレオチド対の長さ、１９～２１ヌクレオチド対の長さ、２１～２５ヌクレオチド対の長さ、または２１～２３ヌクレオチド対の長さでありうる。別の例では、二重鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、および２７ヌクレオチド対の長さから選択される。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、鎖の３’末端もしくは５’末端またはこれらの両末端において、ｄｓＲＮＡ剤の、１つまたはそれ以上の突出領域および／またはキャッピング基を含む。突出は、１～１０ヌクレオチドの長さ、１～６ヌクレオチドの長さ、例えば、２～６ヌクレオチドの長さ、１～５ヌクレオチドの長さ、２～５ヌクレオチドの長さ、１～４ヌクレオチドの長さ、２～４ヌクレオチドの長さ、１～３ヌクレオチドの長さ、２～３ヌクレオチドの長さ、または１～２ヌクレオチドの長さでありうる。突出は、一方の鎖が、他方の鎖より長いことの結果である場合もあり、同じ長さの２つの鎖が、ずらされていることの結果である場合もある。突出は、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成する場合もあり、ターゲティングされる遺伝子配列と相補性である場合もあり、他の配列である場合もある。第１の鎖と、第２の鎖とはまた、例えば、ヘアピンを形成するように、さらなる塩基により接合される場合もあり、他の非塩基リンカーにより接合される場合もある。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤内の突出領域内のヌクレオチドは、各々、独立に、２’－Ｆ／２’－Ｏ－メチルチミジン（Ｔ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、およびこれらの任意の組合せなどの２’－糖修飾を含むがこれらに限定されない、修飾ヌクレオチドまたは非修飾ヌクレオチドでありうる。例えば、ＴＴは、いずれかの鎖上のいずれかの末端について、突出配列でありうる。突出は、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成する場合もあり、ターゲティングされる遺伝子配列と相補性である場合もあり、他の配列である場合もある。
ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖、またはこれらの両方の鎖における、５’突出または３’突出は、リン酸化される場合がある。一部の実施形態では、突出領域は、２つのヌクレオチドの間に、ホスホロチオエートを有する、２つのヌクレオチドを含有し、この場合、２つのヌクレオチドは、同じ場合もあり、異なる場合もある。一実施形態では、突出は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはこれらの両方の鎖の３’末端に存在する。一実施形態では、この３’突出は、アンチセンス鎖内に存在する。一実施形態では、この３’突出は、センス鎖内に存在する。
ｄｓＲＮＡ剤は、その全体的安定性に影響を及ぼさずに、ｄｓＲＮＡの干渉活性を強化しうる、単一の突出だけを含みうる。例えば、一本鎖突出は、センス鎖の３’末端に、または、代替的に、アンチセンス鎖の３’末端に配置される。ｄｓＲＮＡはまた、アンチセンス鎖の５’末端（またはセンス鎖の３’末端）に配置された平滑末端を有する場合もあり、この逆の場合もある。一般に、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端において、ヌクレオチド突出を有し、５’末端は、平滑末端である。理論に束縛されずに述べると、アンチセンス鎖の５’末端における非対称平滑末端およびアンチセンス鎖の３’末端突出は、ＲＩＳＣへの、ガイド鎖のローディング過程に好適である。例えば、単一突出は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長を含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤はまた、ｄｓＲＮＡ二重鎖の両末端において、２つの平滑末端を有する場合もある。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖内およびアンチセンス鎖剤内のあらゆるヌクレオチドは、修飾される場合がある。各ヌクレオチドは、非連結型リン酸酸素の一方もしくは両方、および／または連結型リン酸酸素のうちの１つもしくはそれ以上の、１つまたはそれ以上の変更を含みうる、同じであるか、または異なる修飾；リボース糖の構成要素、例えば、リボース糖上の２つのヒドロキシルの変更；リン酸部分の、「脱リン酸化」リンカーによる全面的置きかえ；天然に存在する塩基の修飾または置きかえ；ならびにリボース－リン酸骨格の置きかえまたは修飾により修飾される。
一部の実施形態では、３’突出内または５’突出内の塩基の全部または一部は、例えば、本明細書で記載される修飾により修飾される。修飾は、例えば、リボース糖の２’位における、当技術分野で公知の修飾による修飾の使用、例えば、ヌクレオ塩基のリボ糖に代えた、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾デオキシリボヌクレオチド、または２’－Ｏ－メチル修飾デオキシリボヌクレオチドの使用、およびリン酸基内の修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾を含みうる。突出は、標的配列と相同である必要はない。
一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、または２’－フルオロにより、独立に修飾される。鎖は、１つを超える修飾を含有しうる。一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロにより、独立に修飾される。
一部の実施形態では、少なくとも２つの異なる修飾は、典型的に、センス鎖上およびアンチセンス鎖上に存在する。これらの２つの修飾は、２’－デオキシ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾、もしくは２’－フルオロ修飾、非環状ヌクレオチド、または他の修飾でありうる。
一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、各々、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、または２’－デオキシから選択される、異なる形で修飾された、２つのヌクレオチドを含む。
ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸によるヌクレオチド間連結をさらに含みうる。ホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸によるヌクレオチド間連結の修飾は、鎖の任意の位置における、センス鎖もしくはアンチセンス鎖、またはこれらの両方の、任意のヌクレオチド上で生じうる。例えば、ヌクレオチド間連結の修飾は、センス鎖上および／またはアンチセンス鎖上の、あらゆるヌクレオチド上で生じる場合もあり；各ヌクレオチド間連結修飾は、センス鎖上またはアンチセンス鎖上において、交互パターンで生じる場合もあり；センス鎖またはアンチセンス鎖は、いずれもが、ヌクレオチド間連結の修飾を、交互パターンで含む。センス鎖上のヌクレオチド間連結の修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じ場合もあり、異なる場合もあり、センス鎖上のヌクレオチド間連結の修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上のヌクレオチド間連結の修飾の交互パターンと比べて、シフトを有する場合もある。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、突出領域内に、ホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸によるヌクレオチド間連結の修飾を含む。例えば、突出領域は、２つのヌクレオチド間に、ホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸によるヌクレオチド間連結を有する、２つのヌクレオチドを含む。ヌクレオチド間連結修飾はまた、二重鎖領域内の末端対合ヌクレオチドで、突出ヌクレオチドを連結するようにも施される。例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、または全ての突出ヌクレオチドは、ホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸によるヌクレオチド間連結を介して連結されるが、場合により、突出ヌクレオチドを、突出ヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドと連結する、さらなるホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸によるヌクレオチド間連結も存在しうる。例えば、３つの末端ヌクレオチドの間に、少なくとも２つのホスホロチオエートによるヌクレオチド間連結が存在する場合があり、この場合、３つのヌクレオチドのうちの２つは、突出ヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドは、突出ヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。一部の実施形態では、これらの３つの末端ヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端にある場合がある。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ組成物は、参照によって本明細書に組み入れる、米国特許第７，４２７，６７２号に記載された、修飾塩基またはヌクレオシド類似体により連結される。
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＦＮ３ドメインを、センス鎖へと連結するのに使用されるリンカーは、Ｉの式：
Figure 2024517610000002
 を有する。
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＦＮ３ドメインを、アンチセンス鎖へと連結するのに使用されるリンカーは、ＩＩの式：
Figure 2024517610000003
 ［式中、ＸＡＳは、アンチセンス鎖を表し、Ｆ１は、本明細書で記載されるＦＮ３ドメインを表す］
を有する。
一部の実施形態では、リンカーは、以下：
Figure 2024517610000004
 の通りに例示されるＦ１上に存在するシステイン残基を介して、Ｆ１へと共有結合的に接合される。
一部の実施形態では、連結されたｄｓＲＮＡと、本明細書で記載されるＦＮ３ドメインとは、ＩＩＩの式：
Figure 2024517610000005
 ［式中、Ｃ１は、同じであるか、または異なる、本明細書で記載されるＦＮ３ドメインを表す］
を有する。
一部の実施形態では、Ａ１－Ｂ１は：
Figure 2024517610000006
 ［式中、Ｆ１は、少なくとも１つのＦＮ３ドメインを含むポリペプチドであり、Ｌ１へとコンジュゲートされ；Ｌ１は、ＸＳへと連結され、ＸＳは、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖である５’－３’オリゴヌクレオチドであり；ＸＡＳは、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖である３’－５’オリゴヌクレオチドであり；ＸＳおよびＸＡＳは、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を形成する］
の式を有する。
さらなるリンカーの構造は、以下の通りである：
ｍａｌ－Ｃ２Ｈ４Ｃ（Ｏ）（ＮＨ）－（ＣＨ２）６－は、
Figure 2024517610000007
 であり；
（Ｍａｌ－（ＰＥＧ）１２）（ＮＨ）ＣＨ２）６）は、
Figure 2024517610000008
 であり；
－（ＣＨ２）６－である、アミノヘキシルリンカーともまた称される、Ｍａｌ－ＮＨ－（ＣＨ２）６－は、
Figure 2024517610000009
 であり；
Ｖａｌ－Ｃｉｔ Ｐａｂａは、構造：
Figure 2024517610000010
 を有する。
本明細書で記載される通り、一部の実施形態では、核酸分子は、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の５’末端において、リンカーを含むように修飾される。一部の実施形態では、核酸分子は、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端において、ビニルホスホン酸を含むように修飾される。一部の実施形態では、核酸分子は、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の３’末端において、リンカーを含むように修飾される。一部の実施形態では、核酸分子は、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端において、ビニルホスホン酸を含むように修飾される。リンカーは、ｄｓＲＮＡを、ＦＮ３ドメインへと連結するのに使用される。リンカーは、例えば、天然で存在するか、または本明細書で記載され、例えば、参照によってその全体を本明細書に組み入れる、米国特許第１０，１９６，４４６号において記載された通りに置換された、ＦＮ３ドメイン上のシステイン残基に、共有結合的に接合しうる。
一部の実施形態では、ペプチドは、例えば、細胞特異的ターゲティングのために使用される脂質ナノ粒子へとコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、タンパク質は、ＣＤ７１または別のタンパク質を、タンパク質分解のためにターゲティングする結合性部分へとコンジュゲートされる。例えば、タンパク質は、ＰＲＯＴＡＣＳ（Ｅ３ユビキチンリガーゼのための結合性部分）へとコンジュゲートされ、これにより、タンパク質を、Ｅ３リガーゼへと送達する。これらは、グリシン－セリンリンカーなどのリンカーを介して連結される。
ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインはまた、ＣＤ７１以外の、異なる標的に結合する、別のＦＮ３ドメインへもコンジュゲートされるか、または連結される。これは、ペプチドが、ＣＤ７１と、別の、例えば、タンパク質とに結合するように、多特異的（例えば、二特異的、三特異的など）となることを可能とするであろう。一部の実施形態では、ＣＤ７１ ＦＮ３結合性ドメインは、腫瘍細胞により発現される抗原（腫瘍抗原）に結合する、別のＦＮ３ドメインへと連結される。
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、二価ＦＮ３ドメインを形成するように、リンカーにより、一体に連結される。リンカーは、可撓性リンカーでありうる。一部の実施形態では、リンカーは、Ｇ／Ｓリンカーである。一部の実施形態では、リンカーは、１つ、２つ、３つ、または４つのＧ／Ｓリピートを有する。Ｇ／Ｓリピート単位は、４つのグリシンに続くセリン、例えば、ＧＧＧＧＳである。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、本明細書で提示されるリンカーなどのリンカーにより接続された、２つのＦＮ３ドメインを含む。例示的リンカーは、（ＧＳ）２、（配列番号２７８）、（ＧＧＧＳ）２（配列番号２７９）、（ＧＧＧＧＳ）１－５（配列番号２８０）、（ＡＰ）１－２０；（ＡＰ）２（配列番号２８１）、（ＡＰ）５（配列番号２８２）、（ＡＰ）１０（配列番号２８３）、（ＡＰ）２０（配列番号２８４）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）５ＡＡＡ（配列番号２８５）、または（ＥＡＡＡＫ）１－５（配列番号３０７）を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、リンカーは、ＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（配列番号３００）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３０１）；ＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰ（配列番号３０２）；またはＥＡＡＡＫ（配列番号３０３）のアミノ酸配列を含むか、またはこれらのアミノ酸配列である。
一部の実施形態では、異種分子は、検出用標識、または細胞傷害剤などであるがこれらに限定されない治療剤である。
一部の実施形態では、検出用標識へとコンジュゲートされた、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインが提供される。本明細書では、検出用標識の非限定例が提示される。
一部の実施形態では、治療剤へとコンジュゲートされた、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインが提供される。本明細書では、細胞傷害剤などであるがこれらに限定されない、治療剤の非限定例が提示される。
検出用標識へとコンジュゲートされた、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、腫瘍組織などの試料上における、ＣＤ７１の発現について査定するのに使用される。検出用標識へとコンジュゲートされた、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、試料である、血液、免疫細胞、または樹状細胞上における、ＣＤ７１の発現について査定するのに使用される。
検出用標識は、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインへとコンジュゲートされた場合に、分光光度法、光化学法、生化学法、免疫化学法、または他の化学的方法を介して、ＣＤ７１を検出可能とする組成物を含む。
例示的検出用標識は、放射性同位体、磁気ビーズ、金属製ビーズ、コロイド状粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、一般に、ＥＬＩＳＡにおいて使用される）、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、発光分子、化学発光分子、フルオロ色素、フルオロフォア、蛍光消光剤、有色分子、放射性同位体、シンチレーション剤、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体またはその断片、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、重金属、酵素、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、電子供与体／受容体、アクリジニウムエステル、および比色基質を含むがこれらに限定されない。
検出用標識は、放射性同位体である場合などに、シグナルを、自発的に発しうる。一部の実施形態では、検出用標識は、磁界もしくは電界、または電磁界など、外部刺激により刺激される結果として、シグナルを発する。
例示的放射性同位体は、γ粒子放出放射性同位体、オージェ電子放出放射性同位体、β粒子放出放射性同位体、アルファ粒子放出放射性同位体、または陽電子放出放射性同位体でありうる。例示的放射性同位体は、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、１９Ｆ、５５Ｃｏ、５７Ｃｏ、６０Ｃｏ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９０Ｓｒ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、１１５Ｉｎ、１２３１、１２４１、１２５Ｉ、１３１１、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、２２６Ｒａ、２２５Ａｃおよび２２７Ａｃを含む。
例示的金属原子は、カルシウム原子、スカンジウム原子、チタン原子、バナジウム原子、クロム原子、マンガン原子、鉄原子、コバルト原子、ニッケル原子、銅原子、亜鉛原子、ガリウム原子、ゲルマニウム原子、ヒ素原子、セレニウム原子、臭素原子、クリプトン原子、ルビジウム原子、ストロンチウム原子、イットリウム原子、ジルコニウム原子、ニオビウム原子、モリブデン原子、テクネシウム原子、ルテニウム原子、ロジウム原子、パラジウム原子、銀原子、カドミウム原子、インジウム原子、スズ原子、アンチモニー原子、テルル原子、ヨウ素原子、キセノン原子、セシウム原子、バリウム原子、ランタン原子、ハフニウム原子、タンタル原子、タングステン原子、レニウム原子、オスミウム原子、イリジウム原子、白金原子、金原子、水銀原子、タリウム原子、鉛原子、ビスマス原子、フランシウム原子、ラジウム原子、アクチニウム原子、セリウム原子、プラセオジウム原子、ネオジム原子、プロメチウム原子、サマリウム原子、ユーロピウム原子、ガドリニウム原子、テルビウム原子、ジスプロシウム原子、ホルミウム原子、エルビウム原子、ツリウム原子、イッテルビウム原子、ルテチウム原子、トリウム原子、プロトアクチニウム原子、ウラニウム原子、ネプツニウム原子、プルトニウム原子、アメリシウム原子、キュリウム原子、バークリウム原子、カリフォルニウム原子、アインスタイニウム原子、フェルミウム原子、メンデレビウム原子、ノーベリウム原子、またはローレンシウム原子など、原子数が２０より大きい金属である。
一部の実施形態では、金属原子は、原子数が２０より大きい、アルカリ土類金属でありうる。
一部の実施形態では、金属原子は、ランタニドでありうる。
一部の実施形態では、金属原子は、アクチニドでありうる。
一部の実施形態では、金属原子は、遷移金属でありうる。
一部の実施形態では、金属原子は、卑金属でありうる。
一部の実施形態では、金属原子は、金原子、ビスマス原子、タンタル原子、およびガドリニウム原子でありうる。
一部の実施形態では、金属原子は、原子数が５３（すなわち、ヨウ素）～８３（すなわち、ビスマス）である金属でありうる。
一部の実施形態では、金属原子は、磁気共鳴イメージングに適する原子でありうる。
金属原子は、Ｂａ２＋、Ｂｉ３＋、Ｃｓ＋、Ｃａ２＋、Ｃｒ２＋、Ｃｒ３＋、Ｃｒ６＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋、Ｃｕ３＋、Ｇａ３＋、Ｇｄ３＋、Ａｕ＋、Ａｕ３＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｆ３＋、Ｐｂ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｎ３＋、Ｍｎ４＋、Ｍｎ７＋、Ｈｇ２＋、Ｎｉ２＋、Ｎｉ３＋、Ａｇ＋、Ｓｒ２＋、Ｓｎ２＋、Ｓｎ４＋、およびＺｎ２＋など、酸化状態が、＋１、＋２、または＋３の形態にある、金属イオンでありうる。金属原子は、酸化鉄、酸化マンガン、または酸化ガドリニウムなどの金属酸化物を含みうる。
適切な色素は、例えば、５（６）－カルボキシフルオレセイン、ＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤマレイミド、またはＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ、ポリピリジルルテニウム色素など、任意の市販の色素を含む。
適切なフルオロフォアは、フルオレセインイソチオシアン酸（ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオセミカルバジド、ローダミン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＣｙＤｙｅ（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｓ（例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ５９４；Ａｌｅｘａ６４７）、近赤外（ＮＩＲ）（７００～９００ｎｍ）蛍光色素、ならびにカルボシアニン色素およびアミノスチリル色素である。
検出用標識へとコンジュゲートされた、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、例えば、腫瘍の分布、腫瘍細胞の存在、および／または腫瘍の再発についての診断について査定するイメージング剤として使用される。検出用標識へとコンジュゲートされた、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、例えば、樹状細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞免疫細胞、筋細胞、および中枢神経系細胞を含むがこれらに限定されない、体内の様々な組織内における、ＣＤ７１陽性細胞の存在について査定するイメージング剤として使用される。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、細胞傷害剤などであるがこれらに限定されない治療剤へとコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、治療剤は、化学療法剤、薬物、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌由来、真菌由来、植物由来、もしくは動物由来の酵素活性毒素、またはこれらの断片）、または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）である。
治療剤へとコンジュゲートされた、本明細書で開示されるＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、ＣＤ７１発現細胞（例えば、腫瘍細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞免疫細胞、中枢神経系細胞）への、治療剤のターゲティング送達、およびこれらにおける細胞内蓄積において使用される。いかなる特定の理論にも束縛されずに述べると、この種類の送達は、これらの非コンジュゲート剤の全身投与が、正常細胞へと、許容不可能なレベルの毒性を結果としてもたらしうる場合に有用でありうる。
一部の実施形態では、治療剤は、チューブリンへの結合、ＤＮＡへの結合、トポイソメラーゼの阻害、ＤＮＡ架橋、キレート化、スプライセオソームの阻害、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）の阻害、およびヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の阻害などであるがこれらに限定されない機構により、それらの細胞傷害性効果、および／または細胞増殖抑制性効果を誘発しうる。
一部の実施形態では、治療剤は、スプライセオソーム阻害剤、ＮＡＭＰＴ阻害剤、またはＨＤＡＣ阻害剤である。一部の実施形態では、薬剤は、免疫系アゴニスト、例えば、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＲＩＧ－Ｉ（ｄｓＲＮＡ）、およびＳＴＩＮＧ（ＣｐＧ）アゴニストである。一部の実施形態では、薬剤は、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、ビンデシン、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシン、ゲルダナマイシン、メイタンシノイド、またはカリケアミシンである。
一部の実施形態では、治療剤は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに由来する）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ－サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、またはトリコテセンなどの酵素活性毒素である。
一部の実施形態では、治療剤は、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、または１８６Ｒｅなどの放射性核種である。
一部の実施形態では、治療剤は、ドラスタチンまたはドロスタチンペプチドの類似体および誘導体、アウリスタチンまたはモノメチルアウリスタチンフェニルアラニンである。例示的分子は、米国特許第５，６３５，４８３号および同第５，７８０，５８８号において開示されている。ドラスタチンおよびアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解、ならびに核分裂および細胞分裂に干渉し（Ｗｏｙｋｅら（２００１）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４５（１２）：３５８０～３５８４）、抗がん活性および抗真菌活性を及ぼすことが示されている。ドラスタチンまたはアウリスタチンによる薬物部分は、ペプチド薬物部分のＮ（アミノ）末端またはＣ（カルボキシル）末端を介して（ＷＯ０２／０８８１７２）、またはＦＮ３ドメインへと操作された、任意のシステインを介して、ＦＮ３ドメインへと接合される。
一部の実施形態では、治療剤は、例えば、アウリスタチン、カンプトテシン、デュオカルマイシン、エトポシド、メイタンシンおよびメイタンシノイド、タキサン、ベンゾジアゼピンもしくはベンゾジアゼピンを含有する薬物（例えば、ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、インドリノベンゾジアゼピン、およびオキサゾリジノベンゾジアゼピン）、またはビンカアルカロイドでありうる。
ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、公知の方法を使用して、検出用標識へとコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、検出用標識は、キレート剤と複合体化させられる。
一部の実施形態では、検出用標識は、上記で記載されたリンカーを介して、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインへとコンジュゲートされる。
検出用標識、治療用化合物、または細胞傷害性化合物は、公知の方法を使用して、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインへと、直接的に連結される場合もあり、間接的に連結される場合もある。当技術分野では、適切なリンカーが公知であり例えば、補欠分子族、非フェノール性リンカー（Ｎ－スクシンイミジルベンゾエート；ドデカボレートの誘導体）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）の誘導体、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体、Ｓ－２－（４－イソチオシアナトベンジル）－１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）の誘導体、および１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－１，４，８，１１－四酢酸（ＴＥＴＡ）の誘導体など、大環状剤および非環状キレート剤の両方のキレート化部分、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジポイミド酸ジメチルＨＣｌなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス－アジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミンなど）、ジイソシアン酸（トルエン２，６－ジイソシアン酸など）、および活性ビスフッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンなど）、および他のキレート化部分を含む。適切なペプチドリンカーは、周知である。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、腎クリアランスを介して、血液から除去される。
Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づくライブラリーからの、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインの単離
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号２７６）は、ヒトテネイシンＣに由来する、１５のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列からデザインされた、天然に存在しないフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである（Ｊａｃｏｂｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、２５：１０７～１１７、２０１２；米国特許公開第２０１０／０２１６７０８号）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、ＦＮ３ドメインに特徴的である、７つのベータ鎖である、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧと称されるベータ鎖を接続する、６つの表面露出ループである、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループと称されるループを示す（ＢｏｒｋおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８９：８９９０～８９９２、１９９２；米国特許第６，６７３，９０１号）。これらのループ、または各ループ内で選択された残基は、ＣＤ７１に結合する新規の分子を選択するのに使用される、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリーを構築するためにランダム化される。表１は、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号２７６）内の、各ループおよび各ベータ鎖の位置および配列を示す。
Figure 2024517610000011
こうして、下記で記載されるライブラリーである、ＴＣＬ１またはＴＣＬ２など、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づきデザインされたライブラリーは、ランダム化ループＦＧを有する場合もあり、ランダム化ループＢＣおよびランダム化ループＦＧを有する場合もある。ＴｅｎｃｏｎループＢＣは、７アミノ酸長であり、こうして、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つのアミノ酸が、ループＢＣにおいて多様化され、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づきデザインされたライブラリー内でランダム化される。ＴｅｎｃｏｎループＦＧは、７アミノ酸長であり、こうして、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つのアミノ酸が、ループＦＧにおいて多様化され、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づきデザインされたライブラリー内でランダム化される。Ｔｅｎｃｏｎライブラリー内のループにおける、さらなる多様性は、ループにおける残基の挿入および／または欠失により達成される。例えば、ループＦＧおよび／またはＢＣは、１～２２アミノ酸延長される場合もあり、１～３アミノ酸短縮される場合もある。Ｔｅｎｃｏｎ内のループＦＧが、７アミノ酸長であるのに対し、抗体重鎖内の対応するループは、４～２８残基の範囲である。最大の多様性をもたらすために、ループＦＧは、配列のほか、抗体のＣＤＲ３の、４～２８残基の長さの範囲に対応するように、長さにおいても多様化される。例えば、ループＦＧは、ループを、さらに１、２、３、４、または５アミノ酸延長することより、長さにおいてもさらに多様化される。
Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づきデザインされたライブラリーはまた、ＦＮ３ドメイン側に形成される、代替的なランダム化表面も有する場合があり、２つまたはこれを超えるベータ鎖と、少なくとも１つのループとを含みうる。１つのこのような代替的表面は、Ｃベータ鎖およびＦベータ鎖内、ならびにループＣＤ内およびＦＧ内（表面Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ内）のアミノ酸により形成される。代替的Ｔｅｎｃｏｎ表面であるＣ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧに基づくライブラリーデザインについては、米国特許公開第２０１３／０２２６８３４号において記載されている。Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づきデザインされたライブラリーはまた、残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、または８６（残基の番号付けは、配列番号２７６に対応する）において置換を有し、熱安定性の改善を提示するＴｅｎｃｏｎ変異体などのＴｅｎｃｏｎ変異体に基づきデザインされたライブラリーも含む。例示的Ｔｅｎｃｏｎ変異体については、米国特許公開第２０１１／０２７４６２３号において記載されており、配列番号２７６のＴｅｎｃｏｎと比較した場合に、置換である、Ｅ１１Ｒ、Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、およびＥ８６Ｉを有する、Ｔｅｎｃｏｎ２７（配列番号２７７）を含む。
Ｔｅｎｃｏｎ、および他のＦＮ３配列ベースのライブラリーは、アミノ酸のランダムセットまたは規定セットを使用して選び出された残基位置においてランダム化される。例えば、ランダム置換を有する、ライブラリー内の変異体は、２０の天然に存在するアミノ酸全てをコードする、ＮＮＫコドンを使用して作出される。他の多様化スキームでは、アミノ酸である、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、およびＣｙｓをコードするのに、ＤＶＫコドンが使用される。代替的に、ＮＮＳコドンは、２０のアミノ酸残基全てをもたらし、同時に、終止コドンの頻度を低減するのに使用される。例えば、Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ（登録商標）技術（ｈｔｔｐ：＿／／ｗｗｗ＿ｓｌｏｎｉｎｇ＿ｃｏｍ）を使用して、多様化される位置において、アミノ酸分布のバイアスを伴うＦＮ３ドメインのライブラリーが合成される。この技術は、数千に及ぶ遺伝子合成過程に十分である、ユニバーサルの構成要素として作用する、あらかじめ作製された二本鎖トリプレットのライブラリーを使用する。トリプレットライブラリーは、任意の所望のＤＮＡ分子を構築するのに必要である、全ての可能な配列の組合せを表す。コドンの表記は、周知のＩＵＢコードに従う。
ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、足場タンパク質をコードするＤＮＡ断片を、ＲｅｐＡをコードするＤＮＡ断片へとライゲーションして、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける翻訳の後で形成される、タンパク質－ＤＮＡ複合体であって、各タンパク質が、これをコードするＤＮＡと安定的に会合したタンパク質－ＤＮＡ複合体のプールを作出し（米国特許第７，８４２，４７６号；Ｏｄｅｇｒｉｐら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ、１０１、２８０６～２８１０、２００４）、当技術分野で公知であり、実施例において記載される、任意の方法により、ライブラリーを、ＰＳＭＡへの特異的結合についてアッセイするＣＩＳディスプレイを使用して、ＴｅｎｃｏｎライブラリーなどのＦＮ３ライブラリーを作製することにより単離される。使用される、周知の例示的方法は、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、ならびに競合的アッセイおよび非競合的アッセイである（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。同定されたＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、それらのＣＤ７１への結合、ＣＤ７１の活性のモジュレーション、内部化、安定性、および他の所望の特徴について、さらに特徴づけられる。
ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、本明細書で提示される方法を使用して、任意のＦＮ３ドメインを、ライブラリーを作出するための鋳型として使用し、ライブラリーを、ＣＤ７１に特異的に結合する分子についてスクリーニングして作出される。使用される、例示的ＦＮ３ドメインは、テネイシンＣの第３のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）、フィブコン、およびフィブロネクチンの第１０のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）である。こうして、ＰＣＴ出願第ＷＯ２０１０／０５１２７４号、同第ＷＯ２０１１／１３７３１９号、および同第ＷＯ２０１３／０４９２７５号が、それらの全体を本明細書に組み入れる。ライブラリーをベクターへとクローニングするか、またはライブラリーの二本鎖ｃＤＮＡカセットを合成して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ライブラリーを発現させるか、またはこれを翻訳するのに、標準的なクローニング法および発現法が使用される。例えば、リボソームディスプレイ（ＨａｎｅｓおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９４、４９３７～４９４２、１９９７）、ｍＲＮＡディスプレイ（ＲｏｂｅｒｔｓおよびＳｚｏｓｔａｋ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９４、１２２９７～１２３０２、１９９７）、または他の無細胞系（米国特許第５，６４３，７６８号）が使用される。ＦＮ３ドメイン変異体のライブラリーは、例えば、任意の適切なバクテリオファージの表面上に提示される融合タンパク質として発現される。融合ポリペプチドを、バクテリオファージの表面上に提示する方法は周知である（米国特許公開第２０１１／０１１８１４４号；国際特許公開第ＷＯ２００９／０８５４６２号；米国特許第６，９６９，１０８号；米国特許第６，１７２，１９７号；米国特許第５，２２３，４０９号；米国特許第６，５８２，９１５号；米国特許第６，４７２，１４７号）。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、場合により、残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、および／または８６において、置換を有する、配列番号２７６のＴｅｎｃｏｎ配列、または配列番号２７７のＴｅｎｃｏｎ２７配列である、配列番号２７６または配列番号２７７に基づく。
一部の実施形態では、ＦＮ３タンパク質またはポリペプチドは、トランスフェリンの、ＣＤ７１への結合と競合しない、ＣＤ７１上の部位において、ヒトＣＤ７１に結合する、ＦＮ３タンパク質またはポリペプチドである。本明細書で使用される、トランスフェリンの、ＣＤ７１への結合と競合しない、ＣＤ７１上の部位とは、ＦＮ３タンパク質の結合が、トランスフェリンの、ＣＤ７１への結合と競合したり、これを阻害したりしない、ＣＤ７１のエピトープまたは部分を指す。競合またはその欠如は、全面的な場合もあり、部分的な場合もある。一部の実施形態では、結合はまた、ＣＤ７１とのその相互作用を介する、トランスフェリンの、細胞への内部化も阻害しない。
一部の実施形態では、トランスフェリンの、ＣＤ７１への結合と競合したり、これを阻害したりしない部位において、ＣＤ７１に結合するＦＮ３タンパク質を同定するための方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、トランスフェリン、またはＣＤ７１のトランスフェリン結合性部位に結合する薬剤の存在下で、ＣＤ７１を、被験ＦＮ３タンパク質と接触させる工程；およびトランスフェリン、またはＣＤ７１のトランスフェリン結合性部位に結合する薬剤の存在下で、ＣＤ７１に結合する被験ＦＮ３タンパク質を同定する工程を含む。一部の実施形態では、方法は、トランスフェリン、またはＣＤ７１のトランスフェリン結合性部位に結合する薬剤の存在下で、ＣＤ７１に結合する被験ＦＮ３タンパク質を分離する工程を含む。一部の実施形態では、方法は、トランスフェリン、またはＣＤ７１のトランスフェリン結合性部位に結合する薬剤の存在下で、ＣＤ７１に結合する被験ＦＮ３タンパク質をシーケンシングする工程を含む。一部の実施形態では、方法は、トランスフェリン、またはＣＤ７１のトランスフェリン結合性部位に結合する薬剤の存在下で、ＣＤ７１に結合する被験ＦＮ３タンパク質をコードする核酸配列を調製するか、または得る工程を含む。一部の実施形態では、方法は、トランスフェリン、またはＣＤ７１のトランスフェリン結合性部位に結合する薬剤の存在下で、ＣＤ７１に結合する被験ＦＮ３タンパク質を、トランスフェリン、またはＣＤ７１のトランスフェリン結合性部位に結合する薬剤の存在下で、ＣＤ７１に結合する被験ＦＮ３タンパク質をコードする核酸配列から発現させる工程を含む。一部の実施形態では、被験ＦＮ３タンパク質は、細胞内で発現される。一部の実施形態では、方法は、発現された被験ＦＮ３タンパク質を分離および／または精製する工程を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提示される、任意の方法に従い同定されるＦＮ３タンパク質が提供される。
ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、熱安定性、ならびに熱によるフォールディングおよびアンフォールディングの可逆性を改善するなど、それらの特性を改善するように修飾される。タンパク質および酵素の熱安定性を、明らかに増大させるように、高度に類似する熱安定性配列との比較に基づく合理的デザイン、ジスルフィド架橋を安定化させるデザイン、アルファ－ヘリックス形成傾向を増大させる突然変異、塩架橋の操作、タンパク質の表面電荷の変更、指向性進化、およびコンセンサス配列の組成を含む、いくつかの方法が適用されている（ＬｅｈｍａｎｎおよびＷｙｓｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１２、３７１～３７５、２００１）。高度の熱安定性は、タンパク質の発現収量を増大させ、可溶性または活性を改善し、免疫原性を低下させ、製造におけるコールドチェーンの必要を最小化しうる。Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号２７６）の熱安定性を改善するのに置換される残基は、残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、または８６であり、米国特許公開第２０１１／０２７４６２３号において記載されている。これらの残基に対応する置換は、本明細書で開示される分子を含有するＦＮ３ドメインへと組み込まれる。
タンパク質安定性およびタンパク質不安定性の測定は、タンパク質の完全性の、同じ側面または異なる側面として見ることができる。タンパク質は、熱、紫外線もしくはイオン化放射線、溶液中にある場合における、周囲オスモル濃度およびｐＨの変化、小孔サイズの濾過により付与される機械的せん断力、紫外線、ガンマ照射などによるイオン化放射線、化学的脱水もしくは熱的脱水、またはタンパク質構造の破壊を引き起こしうる、他の任意の作用もしくは力により引き起こされる変性に対して、感受性または「不安定」である。分子の安定性は、標準法を使用して決定される。例えば、分子の安定性は、標準法を使用して、分子のうちの半数が、アンフォールディングするときの、摂氏°（℃）による温度である、融点（「Ｔｍ」）を測定することにより決定される。典型的に、Ｔｍが高いほど、分子の安定性は増大する。熱に加えて、化学的環境もまた、タンパク質が、特定の三次元構造を維持する能力を変化させる。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、Ｔｍの上昇により測定される、操作の前における同じドメインと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％、またはこれを超える安定性の増大を呈しうる。
化学変性も同様に、様々な方法により測定される。化学変性剤は、塩酸グアニジウム、チオシアン酸グアニジウム、尿素、アセトン、有機溶媒（ＤＭＦ、ベンゼン、アセトニトリル）、塩（硫酸アンモニウム、臭化リチウム、塩化リチウム、臭化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム）；還元剤（例えば、ジチオトレイトール、ベータ－メルカプトエタノール、ジニトロチオベンゼン、およびホウ化水素ナトリウムなどの水素化物）、非イオン性デタージェントおよびイオン性デタージェント、酸（例えば、塩酸（ＨＣｌ）、酢酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）、ハロゲン化酢酸）、疎水性分子（例えば、リン脂質）、およびターゲティング変性剤を含む。変性度の定量は、標的分子に結合する能力など、機能的特性の喪失に依拠する場合もあり、または凝集傾向など、変性前に溶媒にアクセス不能であった残基の露出、またはジスルフィド結合の破壊もしく形成など、物理化学的特性に依拠する場合もある。
ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、単量体、二量体、または多量体として、例えば、標的分子への結合価数を増大させ、これにより、標的分子への結合アビディティーを増大させるか、または２つもしくはこれを超える、異なる標的分子に同時に結合する、二特異的足場もしくは多特異的足場を作出する手段として作出される。二量体および多量体は、単一特異的タンパク質足場、二特異的タンパク質足場、または多特異的タンパク質足場を連結することにより、例えば、アミノ酸リンカー、例えば、ポリグリシン、グリシンおよびセリン、またはアラニンおよびプロリンを含有するリンカーを組み入れることにより作出される。例示的リンカーは、（ＧＳ）２、（配列番号２７８）、（ＧＧＧＳ）２（配列番号２７９）、（ＧＧＧＧＳ）１－５（配列番号２８０）、（ＡＰ）１－２０；（ＡＰ）２（配列番号２８１）、（ＡＰ）５（配列番号２８２）、（ＡＰ）１０（配列番号２８３）、（ＡＰ）２０（配列番号２８４）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）５ＡＡＡ（配列番号２８５）、または（ＥＡＡＡＫ）１－５（配列番号３０７）を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、リンカーは、ＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（配列番号３００）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３０１）；ＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰ（配列番号３０２）；またはＥＡＡＡＫ（配列番号３０３）のアミノ酸配列である。
二量体および多量体は、Ｎ－Ｃ方向において、互いと連結される。ポリペプチドを、新規に連結された融合ポリペプチドと接続する、天然に存在するペプチドリンカーならびに人工ペプチドリンカーの使用は、文献（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２６４、５２６０～５２６８、１９８９；Ａｌｆｔｈａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、８、７２５～７３１、１９９５；ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＳａｕｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５、１０９～１１６、１９９６；米国特許第５，８５６，４５６号）において周知である。
半減期延長部分
ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、例えば、共有結合的相互作用を介して、他のサブユニットを組み込みうる。一部の実施形態では、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、半減期延長部分をさらに含む。例示的半減期延長部分は、アルブミン、アルブミン変異体、アルブミン結合性タンパク質および／または結合性タンパク質ドメイン、トランスフェリンならびにその断片および類似体、ならびにＦｃ領域である。ヒトＦｃ領域のアミノ酸配列は、周知であり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＥのＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、本明細書で記載される半減期延長部分のうちのいずれかなどであるがこれらに限定されない、分子全体の半減期を延長する分子に結合する、第２のＦＮ３ドメインを組み込みうる。一部の実施形態では、第２のＦＮ３ドメインは、アルブミン、アルブミン変異体、アルブミン結合性タンパク質および／またはアルブミン結合性ドメイン、ならびにこれらの断片および類似体に結合する。
抗体様特性、とりわけ、Ｃ１ｑへの結合、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体への結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方調節など、Ｆｃエフェクター機能など、Ｆｃ領域と関連する特性を付与するように、抗体定常領域の全部または一部が、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインへと接合され、これらの活性の一因となる、Ｆｃ内の残基を修飾することにより、さらに修飾される場合がある（総説については、Ｓｔｒｏｈｌ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０、６８５～６９１、２００９を参照されたい）。
所望の特性のために、ＰＥＧ５０００またはＰＥＧ２０，０００などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、異なる鎖長の脂肪酸および脂肪酸エステル、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、オレイン酸、アラキドン酸、オクタンジオン酸、テトラデカンジオン酸、オクタデカンジオン酸、ドコサンジオン酸など、ポリリシン、オクタン、炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ糖、または多糖）など、さらなる部分も、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインへと組み込まれる。これらの部分は、タンパク質足場のコード配列との、直接的な融合体であり、標準的なクローニング法および発現法により作出される場合がある。代替的に、周知の化学的カップリング法は、部分を、本明細書で開示される、組換え作製分子へと接合するのに使用される。
ＰＥＧ部分は、例えば、システイン残基を、分子のＣ末端へと組み込むことにより、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインへと付加される場合もあり、システインを、分子のＣＤ７１結合面から隔たった残基位置へと操作し、周知の方法を使用して、ＰＥＧ基を、システインへと接合させることにより付加される場合もある。
ＣＤ７１に特異的に結合するさらなる部分を組み込むＦＮ３ドメインは、いくつかの周知のアッセイにより、機能性について比較される。例えば、Ｆｃドメインおよび／またはＦｃドメイン変異体の組込みにより変更される特性については、ＦｃγＲＩ受容体、ＦｃγＲＩＩ受容体、ＦｃγＲＩＩＩ受容体、またはＦｃＲｎ受容体などの受容体の可溶性形態を使用する、Ｆｃ受容体結合アッセイにおいてアッセイされる場合もあり、例えば、ＡＤＣＣもしくはＣＤＣを測定するか、またはｉｎ ｖｉｖｏモデルにおける、本明細書で開示される分子の薬物動態特性について査定する、周知の細胞ベースのアッセイを使用してアッセイされる場合もある。
ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞
一部の実施形態では、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインを、単離ポリヌクレオチドとして、または発現ベクターの部分として、または直鎖状ＤＮＡ配列の部分としてコードする核酸であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳のために使用される直鎖状ＤＮＡ配列、その組成物もしくは指向性突然変異原の、原核生物、真核生物、もしくは繊維状ファージによる、発現、分泌、および／もしくは提示と適合性であるベクターを含む核酸が提供される。本明細書では、ある特定の例示的なポリヌクレオチドが開示されるが、所与の発現系における遺伝子コードの縮重またはコドン優先性を踏まえ、本明細書で開示されるＦＮ３ドメインをコードする、他のポリヌクレオチドもまた、本開示の範囲内にある。
一部の実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のアミノ酸配列を含む、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインをコードする。
本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、自動式ポリヌクレオチド合成器上の固相ポリヌクレオチド合成などの化学合成により作製され、完全な一本鎖分子または二本鎖分子へとアセンブルされる。代替的に、本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、ＰＣＲに続く、規定のクローニングなど、他の技法によっても作製される。当技術分野では、所与の公知の配列を有するポリヌクレオチドを作製するか、またはこれを得るための技法が周知である。
本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、プロモーター配列またはエンハンサー配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル、ＲｅｐＡへの結合を容易とするシス配列など、少なくとも１つの非コード配列を含みうる。ポリヌクレオチド配列はまた、例えば、タンパク質の精製または検出を容易とする、ヒスチジンタグもしくはＨＡタグなどのマーカー配列もしくはタグ配列、シグナル配列、ＲｅｐＡなどの融合タンパク質パートナー、Ｆｃ、またはｐＩＸもしくはｐＩＩＩなどのバクテリオファージコートタンパク質をコードするさらなるアミノ酸をコードする、さらなる配列も含みうる。
一部の実施形態では、少なくとも１つの、本明細書で開示されるポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。このようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現のためのベクター、トランスポゾンベースのベクター、または、任意の手段による、本明細書で開示されるポリヌクレオチドの、所与の生物もしくは遺伝子バックグラウンドへの導入に適する、他の任意のベクターでありうる。このようなベクターは、このようなベクターによりコードされるポリペプチドの発現を、制御する場合もあり、調節する場合もあり、これを引き起こす場合もあり、これを許容する場合もある、核酸配列エレメントを含む発現ベクターでありうる。このようなエレメントは、転写エンハンサー結合性部位、ＲＮＡポリメラーゼ誘発部位、リボソーム結合性部位、および所与の発現系内の、コードされるポリペプチドの発現を容易とする他の部位を含みうる。このような発現系は、当技術分野で周知である、細胞ベースの発現系の場合もあり、無細胞系の場合もある。
一部の実施形態では、ベクターを含む宿主細胞が提供される。ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、場合により、当技術分野で周知である細胞系、混合細胞系、不死化細胞、または不死化細胞のクローン集団により作製される。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹ、ＮＹ（１９８７～２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹ（１９９４～２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ、ＮＹ（１９９７～２００１）を参照されたい。
発現のために選び出される宿主細胞は、哺乳動物由来の場合もあり、ＣＯＳ－１細胞、ＣＯＳ－７細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＳＣ－１細胞、ＨｅＧ２細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞、リンパ腫細胞、酵母細胞、昆虫細胞もしくは植物細胞、またはこれらの任意の派生細胞、不死化細胞、もしくは形質転換細胞から選択される場合もある。代替的に、宿主細胞は、ポリペプチドをグリコシル化することが不可能な種または生物、例えば、ＢＬ２１株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、ＢＬ２１－ＧＯＬＤ（ＤＥ３）株、ＸＬ１－Ｂｌｕｅ株、ＪＭ１０９株、ＨＭＳ１７４株、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株、および天然のＥ．ｃｏｌｉ種株、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属種株、もしくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属種株、またはこれらの操作株のうちのいずれかなど、原核細胞または原核生物から選択される。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインを作製する方法であって、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインが発現されるような条件下で、単離宿主細胞を培養する工程と、ＦＮ３ドメインを精製する工程とを含む方法が提供される。
ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、例えば、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウム、もしくはエタノール沈殿、酸抽出、アニオン交換クロマトグラフィーもしくはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を介する、周知の方法により、組換え細胞培養物から精製される。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のアミノ酸配列を含み、この場合、ヒスチジンタグが、精製を容易とするために、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端へと付属させられている。一部の実施形態では、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）は、６つのヒスチジン残基を含む。さらなる実施形態では、Ｈｉｓタグは、少なくとも１つのグリシン残基、または約２つ～約４つのグリシン残基により、ＦＮ３ドメインへと接続される。したがって、ＦＮ３ドメインの精製、およびポリペプチドからのＨｉｓタグの切断の後、１つまたはそれ以上のグリシンが、Ｎ末端上またはＣ末端上に残される場合がある。一部の実施形態では、Ｈｉｓタグが、Ｎ末端から除去される場合、全てのグリシンが除去される。一部の実施形態では、Ｈｉｓタグが、Ｃ末端から除去される場合、グリシンのうちの１つまたはそれ以上が保持される。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のアミノ酸配列を含み、この場合、Ｎ末端メチオニンは、ＦＮ３ドメインの精製の後で保持される。
キット
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインを含むキットが提供される。
キットは、治療的使用のために使用され、診断用キットとして使用される。
一部の実施形態では、キットは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインと、ＦＮ３ドメインを検出するための試薬とを含む。一部の実施形態では、キットは、二価ＦＮ３ドメインを含む。キットは、使用のための指示書；他の試薬、例えば、標識、キレート化または他の形のカップリングに有用な薬剤、放射線保護組成物；イメージング、診断、または治療を目的とする投与のための、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインを調製するための、デバイスまたは他の材料；薬学的に許容される担体；および対象への投与のためのデバイスまたは他の材料を含む、１つまたはそれ以上の他の要素を含みうる。
一部の実施形態では、キットは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のうちの１つのアミノ酸配列を含む、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインを含む。
ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインの使用
ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメイン、またはそのコンジュゲートは、細胞、組織、臓器、体液、または、一般に、宿主における、ヒト疾患の症状、または特異的病態を診断するか、モニタリングするか、モジュレートするか、処置するか、緩和するか、これらの発生を防止するか、またはこれらを軽減するのに使用される。
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、筋疾患の処置のために、ＣＤ７１陽性組織（例えば、骨格筋、平滑筋）への送達を容易としうる。
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、免疫疾患の処置のために、活性化リンパ球、活性化樹状細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＢ細胞、または他の活性化免疫細胞への送達を容易としうる。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメイン、またはそのコンジュゲートはまた、対象における、ＣＤ７１陽性腫瘍組織のイメージングにおいても使用される。本明細書で開示される方法は、任意の分類に属する動物患者と共に使用される。このような動物の例は、ヒト、齧歯動物、イヌ、ネコ、および農場動物などの哺乳動物を含む。
一部の実施形態では、がん組織の細胞による、ＣＤ７１の発現に基づき、組織のがんを有するか、またはこれを発症する可能性が高い対象を診断する方法、免疫療法の奏効を予測する方法、予後診断法、および処置法が提供される。
一部の実施形態では、腫瘍組織内のＣＤ７１発現がん細胞を検出する方法であって、対象から、腫瘍組織の試料を得る工程；腫瘍組織の試料を、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のうちの１つのアミノ酸配列を含む、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインと接触させ、ＣＤ７１と、ＦＮ３ドメインとの結合を検出することにより、ＣＤ７１が、腫瘍組織内で発現されるのかどうかを検出する工程を含む方法が提供される。一部の実施形態では、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象へと、ＣＤ７１に結合するポリペプチドまたは医薬組成物を投与する工程を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、もしくは３０４～３０６などの配列、または治療剤へと連結されるか、もしくはこれとコンジュゲートされた、本明細書で提示されるポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、ＣＤ７１細胞は、多発性硬化症（ＭＳ）および脳の感染性疾患など、ＣＮＳ疾患、炎症性疾患／免疫疾患に関与する細胞である。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するポリペプチドは、中枢神経系へと方向付けられる。一部の実施形態では、それを必要とする対象における神経学的状態および／または脳腫瘍を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象へと、ＣＤ７１に結合するポリペプチドまたは医薬組成物を投与する工程を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、もしくは３０４～３０６などの配列、または治療剤へと連結されるか、もしくはこれとコンジュゲートされた、本明細書で提示されるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、脳腫瘍は、非悪性脳腫瘍、良性脳腫瘍、および悪性脳腫瘍からなる群から選択される。一部の実施形態では、神経学的状態は、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症、パーキンソン病、ラフォラ病、ポンペ病、成人ポリグルコサン小体病、脳卒中、脊髄損傷、運動失調、ベル麻痺、脳動脈瘤、てんかん、発作、ギラン－バレー症候群、多発性硬化症、筋ジストロフィー、神経皮膚症候群、偏頭痛、脳炎、敗血症、および重症筋無力症からなる群から選択される。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するポリペプチドは、筋細胞へと方向付けられる。一部の実施形態では、方法は、対象へと、ＣＤ７１に結合するポリペプチドまたは医薬組成物を投与する工程を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、もしくは３０４～３０６などの配列、または治療剤へと連結されるか、もしくはこれとコンジュゲートされた、本明細書で提示されるポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、それを必要とする対象におけるポンペ病（ＧＳＤ２；酸性アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）欠損症）を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象へと、ＣＤ７１に結合するポリペプチドまたは医薬組成物を投与する工程を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６などの配列、または治療剤へと連結されるか、もしくはこれとコンジュゲートされた、本明細書で提示されるポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、それを必要とする対象における糖原病を処置する方法であって、本明細書で提示される組成物を投与する工程を含む方法が提供される。一部の実施形態では、糖原病は、コーリー病またはフォーブズ病（ＧＳＤ３；グリコーゲン脱分枝酵素（ＡＧＬ）欠損症）、マッカードル病（ＧＳＤ５；筋グリコーゲンホスホリラーゼ（ＰＹＧＭ）欠損症）、ＩＩ型糖尿病／糖尿病性腎症、ＧＳＤ１２であるアルドラーゼＡ欠損症、ラフォラ病、低酸素症、アンデルセン病（ＧＳＤ４；グリコーゲン脱分枝酵素（ＧＢＥ１）欠損症）、タルイ病（ＧＳＤ７；筋ホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫＭ）欠損症）、および成人ポリグルコサン小体病からなる群から選択される。一部の実施形態では、糖原病は、グリコーゲンシンターゼ（ＧＹＳ２）欠損症（ＧＳＤ０）、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ／ＳＬＣ３７Ａ４）欠損症（ＧＳＤ１；フォンギールケ病）、ハース病（ＧＳＤ６；肝グリコーゲンホスホリラーゼ（ＰＹＧＬ）欠損症または筋ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＡＭ２）欠損症）、ホスホリラーゼキナーゼ（ＰＨＫＡ２／ＰＨＫＢ／ＰＨＫＧ２／ＰＨＫＡ１）欠損症（ＧＳＤ９）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＡＭ２）欠損症（ＧＳＤ１０）、筋乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨＡ）欠損症（ＧＳＤ１１）、ファンコーニ－ビッケル症候群（ＧＳＤ１１；グルコース輸送体（ＧＬＵＴ２）欠損症）、アルドラーゼＡ欠損症（ＧＳＤ１２）、β－エノラーゼ（ＥＮＯ３）欠損症（ＧＳＤ１３）、およびグリコゲニン－１（ＧＹＧ１）欠損症（ＧＳＤ１５）からなる群から選択される。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するポリペプチドは、免疫細胞へと方向付けられる。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するポリペプチドは、樹状細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＢ細胞へと方向付けられる。一部の実施形態では、それを必要とする対象における自己免疫疾患を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象へと、ＣＤ７１に結合するポリペプチドまたは医薬組成物を投与する工程を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６などの配列、または治療剤へと連結されるか、もしくはこれとコンジュゲートされた、本明細書で提示されるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、関節リウマチ、橋本自己免疫性甲状腺炎、セリアック病、１型糖尿病、白斑、リウマチ熱、悪性貧血／萎縮性胃炎、円形脱毛症、および免疫性血小板減少性紫斑病からなる群から選択される。
一部の実施形態では、組織は、ＣＤ７１を発現する、任意の臓器または解剖学的系の組織でありうる。
一部の実施形態では、ＣＤ７１の発現は、免疫組織化学反応またはＥＬＩＳＡなど、公知の方法を使用して査定される。
一部の実施形態では、ＣＤ７１発現細胞を分離する方法であって、対象から、試料を得る工程；試料を、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のうちの１つのアミノ酸配列を含む、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインと接触させる工程；およびＦＮ３ドメインに結合した細胞を分離する工程を含む方法が提供される。
一部の実施形態では、腫瘍組織内のＣＤ７１発現がん細胞を検出する方法であって、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のうちの１つのアミノ酸配列を含む、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインを、検出用標識とコンジュゲートして、コンジュゲートを形成する工程；コンジュゲートを、対象へと投与する工程；およびコンジュゲートが結合したＣＤ７１発現がん細胞を視覚化する工程を含む方法が提供される。
一部の実施形態では、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象へと、ＣＤ７１に結合するポリペプチドまたは医薬組成物を投与する工程を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６などの配列、または治療剤へと連結されるか、もしくはこれとコンジュゲートされた、本明細書で提示されるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、がんを有する対象を処置する方法であって、対象へと、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインを投与する工程を含む方法が提供される。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、治療剤（例えば、細胞傷害剤、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスなどのオリゴヌクレオチド、別の標的に結合するＦＮ３ドメインなど）へとコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、対象は、充実性腫瘍を有する。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、黒色腫である。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、肺がんである。一部の実施形態では、充実性腫瘍は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。一部の実施形態では、充実性腫瘍は、扁平上皮非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。一部の実施形態では、充実性腫瘍は、非扁平上皮ＮＳＣＬＣである。一部の実施形態では、充実性腫瘍は、肺腺癌である。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、腎細胞癌（ＲＣＣ）である。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、中皮腫である。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）である。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、結腸直腸がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、前立腺がんである。一部の実施形態では、充実性腫瘍は、去勢抵抗性前立腺がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、胃がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、卵巣がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、胃がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、肝がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、膵がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、甲状腺がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、頭頸部扁平上皮がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、食道癌または消化器癌である。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、乳がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、卵管がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、脳がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、尿道がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、泌尿生殖器がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、子宮内膜症である。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、子宮頸がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、がんの転移性病変である。
一部の実施形態では、対象は、血液悪性腫瘍を有する。一部の実施形態では、血液悪性腫瘍は、リンパ腫、骨髄腫、または白血病である。一部の実施形態では、血液悪性腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫である。一部の実施形態では、血液悪性腫瘍は、バーキットリンパ腫である。一部の実施形態では、血液悪性腫瘍は、ホジキンリンパ腫である。一部の実施形態では、血液悪性腫瘍は、非ホジキンリンパ腫である。
一部の実施形態では、血液悪性腫瘍は、骨髄異形成症候群である。
一部の実施形態では、血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。一部の実施形態では、血液悪性腫瘍は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である。一部の実施形態では、血液悪性腫瘍は、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）である。
一部の実施形態では、血液悪性腫瘍は、多発性骨髄腫（ＭＭ）である。
一部の実施形態では、血液悪性腫瘍は、形質細胞腫である。
一部の実施形態では、本明細書で提示される組成物または医薬組成物は、単独で、または他の治療剤と組み合わせて、すなわち、同時に、または逐次的に投与される。一部の実施形態では、他の治療剤、またはさらなる治療剤は、他の抗腫瘍剤、または治療剤である。異なる腫瘍の種類および腫瘍の病期は、がんの処置に有用な、多様な補助的化合物の使用を要求しうる。例えば、本明細書で提示される組成物は、とりわけ、タキソール、チロシンキナーゼ阻害剤、ロイコボリン、フルオロウラシル、イリノテカン、ホスファターゼ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤など、多様な化学療法剤と組み合わせて使用される。組成物はまた、とりわけ、抗ＰＤ－１または抗ＣＴＬＡ－４など、腫瘍に対する免疫応答をモジュレートする薬物と組み合わせても使用される。さらなる処置は、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１をターゲティングする抗体、免疫系をモジュレートする薬剤でありうる。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するポリペプチドは、中枢神経系へと方向付けられる。一部の実施形態では、それを必要とする対象における神経学的状態および／または脳腫瘍を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象へと、ＣＤ７１に結合するポリペプチドまたは医薬組成物を投与する工程を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６などの配列、または治療剤へと連結されるか、もしくはこれとコンジュゲートされた、本明細書で提示されるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、脳腫瘍は、非悪性脳腫瘍、良性脳腫瘍、および悪性脳腫瘍からなる群から選択される。一部の実施形態では、神経学的状態は、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症、パーキンソン病、ラフォラ病、ポンペ病、成人ポリグルコサン小体病、脳卒中、脊髄損傷、運動失調、ベル麻痺、脳動脈瘤、てんかん、発作、ギラン－バレー症候群、多発性硬化症、筋ジストロフィー、神経皮膚症候群、偏頭痛、脳炎、敗血症、および重症筋無力症からなる群から選択される。一部の実施形態では、対象における、神経学的状態および／または脳腫瘍を処置する方法であって、対象へと、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインを投与する工程を含み、ＦＮ３ドメインが、治療剤（例えば、細胞傷害剤、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスなどのオリゴヌクレオチド、別の標的に結合するＦＮ３ドメインなど）へとコンジュゲートされている方法が提供される。
一部の実施形態では、それを必要とする対象におけるポンペ病（ＧＳＤ２；酸性アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）欠損症）を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象へと、ＣＤ７１に結合するポリペプチドまたは医薬組成物を投与する工程を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６などの配列、または治療剤へと連結されるか、もしくはこれとコンジュゲートされた、本明細書で提示されるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、対象における、ポンペ病（ＧＳＤ２；酸性アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）欠損症）を処置する方法であって、対象へと、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインを投与する工程を含み、ＦＮ３ドメインが、治療剤（例えば、細胞傷害剤、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスなどのオリゴヌクレオチド、別の標的に結合するＦＮ３ドメインなど）へとコンジュゲートされている方法が提供される。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するポリペプチドは、免疫細胞へと方向付けられる。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するポリペプチドは、樹状細胞へと方向付けられる。一部の実施形態では、それを必要とする対象における自己免疫疾患を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象へと、ＣＤ７１に結合するポリペプチドまたは医薬組成物を投与する工程を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６などの配列、または治療剤へと連結されるか、もしくはこれとコンジュゲートされた、本明細書で提示されるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、関節リウマチ、橋本自己免疫性甲状腺炎、セリアック病、１型糖尿病、白斑、リウマチ熱、悪性貧血／萎縮性胃炎、円形脱毛症、および免疫性血小板減少性紫斑病からなる群から選択される。一部の実施形態では、対象における、自己免疫疾患を処置する方法であって、対象へと、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインを投与する工程を含み、ＦＮ３ドメインが、治療剤（例えば、細胞傷害剤、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスなどのオリゴヌクレオチド、別の標的に結合するＦＮ３ドメインなど）へとコンジュゲートされている方法が提供される。
一部の実施形態では、細胞、組織、臓器、体液、または、一般に、宿主における、ヒト疾患の症状、または特異的病態を診断するか、モニタリングするか、モジュレートするか、処置するか、緩和するか、これらの発生を防止するか、またはこれらを軽減するのに使用される、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメイン、またはそのコンジュゲートはまた、血液脳関門を越えることが可能な特性も呈する。血液脳関門（ＢＢＢ）は、大半の高分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびポリペプチド）、および多くの低分子が、脳に侵入することを防止する。ＢＢＢは、主に、高度に制限的な密着結合を伴う、特化した内皮細胞から構成され、この結果、小型の物質および大型の物質の、血液から、中枢神経系への通過は、ＢＢＢにより制御される。多くの治療剤が、所望の効率で、ＢＢＢを越えて送達されないので、この構造は、神経疾患および神経障害（例えば、脳がん）を伴う患者の処置および管理を困難とする。ＢＢＢの破壊を伴う、さらなる状態は、脳卒中、糖尿病、発作、高血圧性脳症、後天性免疫不全症候群、外傷性脳傷害、多発性硬化症、パーキンソン病（ＰＤ）、およびアルツハイマー病を含む。この能力は、とりわけ、例えば、星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫（松果体腫）、多形性神経膠芽腫、希突起神経膠腫、神経鞘腫、網膜芽細胞腫、および先天性腫瘍を含む脳がん；または脊髄がん、例えば、神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、および肉腫を処置するために有用である。ある特定の実施形態では、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のうちの１つのアミノ酸配列を含む、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメイン、またはそのコンジュゲートは、治療剤または細胞傷害剤を、例えば、血液脳関門を越えて送達するのに有用である。
一部の実施形態では、ＢＢＢを越える、治療剤の輸送を容易としうるポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６の配列を含むタンパク質である。
「～を処置する」または「処置」とは、目的が、がんの発症または拡散など、所望されない生理学的変化または障害を防止するか、または緩徐化する（低下させる）ことである、治療的処置および予防的措置を指す。一部の実施形態では、有益な臨床的結果、または所望の臨床的結果は、検出可能であれ、検出不能であれ、症状の緩和、疾患の程度の減殺、疾患の状態の安定化（すなわち、非増悪）、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の改善または軽減、および寛解（部分的であれ、全面的であれ）を含むがこれらに限定されない。「処置」はまた、処置を施されない場合の平均余命と比較して、生存を延長することも意味しうる。処置を必要とする患者は、状態もしくは障害を既に伴う患者のほか、状態もしくは障害を有しやすい患者、または状態もしくは障害が防止されるべきである患者を含む。
「治療有効量」とは、所望の治療的結果を達成するのに必要な投与量で、必要な期間にわたり有効な量を指す。ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインの治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重などの因子に従い変動しうる。ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインの有効量についての例示的指標は、患者の福利の改善、腫瘍のサイズの減少もしくは退縮、腫瘍の増殖の停止もしくは緩徐化、および／またはがん細胞の、体内の他の位置への転移の非存在である。
投与／医薬組成物
一部の実施形態では、場合により、検出用標識、治療的、または細胞傷害剤へとコンジュゲートされた、本明細書で開示される、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインと、薬学的に許容される担体とによる医薬組成物が提供される。治療的使用のために、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、薬学的に許容される担体中に、有効成分としてのドメインまたは分子の有効量を含有する医薬組成物として調製される。「担体」とは、それと共に活性化合物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または媒体を指す。このような媒体は、水、および石油由来の油、動物由来の油、植物由来の油、またはラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ごま油など、合成由来の油を含む油などの液体でありうる。例えば、０．４％の生理食塩液および０．３％のグリシンが使用される。これらの溶液は、滅菌であり、一般に、粒子状物質を含まない。これらの溶液は、常套的な周知の滅菌法（例えば、濾過）により滅菌される。組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、安定化剤、増粘剤、滑沢剤、および着色剤など、生理学的条件を近似するのに要求される、薬学的に許容される補助物質を含有しうる。本明細書で開示される分子の、このような医薬製剤中濃度は、広範に、すなわち、体重の約０．５％未満、通例、少なくとも約１％～最大１５または２０％で変動する場合があり、主に、選択される特定の投与方式に従い要求される用量、流体の体積、粘度などに基づき選択されるであろう。他のヒトタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンを含む、適切な媒体および製剤については、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」、２１版、Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．編、Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ ２００６、５部、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ」、６９１～１０９２頁（とりわけ、９５８～９８９を参照されたい）において記載されている。
本明細書で開示されるＦＮ３ドメインの治療的使用のための投与方式は、錠剤、カプセル、溶液、粉末、ゲル、粒子による製剤を使用する、非経口投与、例えば、皮内投与、筋内投与、腹腔内投与、静脈内投与または皮下投与、肺内投与；経粘膜（経口、鼻腔内、膣内、直腸内）投与など、薬剤を、宿主へと送達する、任意の適切な経路であることが可能であり、シリンジ、植込み式デバイス、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ；または当技術分野で周知の、当業者により理解される、他の手段の中に含有される。部位特異的投与は、例えば、関節内送達、気管支内送達、腹腔内送達、関節包内送達、軟骨内送達、体腔内送達、腔内送達、小脳内送達、脳室内送達、結腸内送達、子宮頸部内送達、胃内送達、肝内送達、心内送達、骨内送達、骨盤内送達、心膜内送達、腹腔内送達、胸膜内送達、前立腺内送達、肺内送達、直腸内（ｉｎｔｒａｒｅｃｔａｌ）送達、腎内送達、網膜内送達、脊髄内送達、滑膜内送達、胸内送達、子宮内送達、血管内送達、膀胱内送達、病変内送達、膣内送達、直腸内（ｒｅｃｔａｌ）送達、口腔内送達、舌下送達、鼻腔内送達、または経皮送達により達成される。
医薬組成物は、本明細書で記載される医薬組成物を含む容器を含むキットとして供給される。医薬組成物は、例えば、単回投与もしくは複数回投与のための注射用溶液の形態で提供される場合もあり、注射の前に復元される滅菌粉末として提供される場合もある。代替的に、このようなキットは、医薬組成物の投与のための、乾燥粉末分散器、液体エアゾール発生器、または噴霧器を含みうる。このようなキットは、医薬組成物の適応および用法についての、書面による情報をさらに含みうる。
実施例
以下の実施例は、本明細書で開示される実施形態を例示する。これらの実施例は、例示だけを目的として提示され、実施形態は、いかなる形であれ、これらの実施例に限定されるものと見なされるべきではなく、本明細書で提示される教示の結果としての証拠となる、任意の変化形および全ての変化形を包含すると見なされるべきである。当業者は、本質的に同様の結果をもたらすように変化させられるか、または改変される、それほど重要でない、様々なパラメータをたやすく認識するであろう。
ランダム化ループを伴う、Ｔｅｎｃｏｎライブラリーの構築
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号２７６）は、ヒトテネイシンＣに由来する、１５のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列からデザインされた、免疫グロブリン様足場であるフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである（Ｊａｃｏｂｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、２５：１０７～１１７、２０１２；米国特許第８，２７８，４１９号）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、７つのベータ鎖を接続する、６つの表面露出ループを示す。これらのループ、または各ループ内で選択された残基は、特異的標的に結合する新規の分子を選択するのに使用される、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリーを構築するためにランダム化される。
Ｔｅｎｃｏｎ足場および多様なデザイン戦略を使用して、多様なライブラリーを作出した。一般に、ライブラリーである、ＴＣＬ１およびＴＣＬ２は、良好な結合剤をもたらした。ライブラリーＴＣＬ１およびＴＣＬ２の作出については、国際特許公開第ＷＯ／２０１４０８１９４４Ａ２号において、詳細に記載されている。
代替的結合面を有する、Ｔｅｎｃｏｎライブラリーの作出
特定のライブラリーデザイン内でランダム化される残基の選出しは、創出される相互作用表面の全体的形状を統御する。Ｘ線結晶構造解析は、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）に結合するように、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧがランダム化されたライブラリーから選択された、ＦＮ３ドメインを含有する足場タンパク質が、ＭＢＰの活性部位にはまる、大きく湾曲した界面を有することを示した（Ｋｏｉｄｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０４：６６３２～６６３７、２００７）。これに対し、ＭＢＰに結合するように選択された、アンキリンリピート足場タンパク質は、はるかに平面性が大きな相互作用表面を有し、活性表面から隔たった、ＭＢＰの外側表面に結合することが見出された（Ｂｉｎｚら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２２：５７５～５８２、２００４）。これらの結果は、足場分子の結合面の形状（曲面対平面）が、これらの標的タンパク質上の、どのような標的タンパク質または特異的エピトープが、足場による、効果的な結合が可能であるのかを指定しうることを示唆する。ＦＮ３ドメインを含有するタンパク質足場を、タンパク質への結合のために操作することに関する、公表された取組みは、隣接するループを、標的への結合のために操作し、これにより、湾曲した結合面を作製することに依拠してきた。この手法は、このような足場の標的の数、およびエピトープへのアクセス可能性を限定する場合がある。
Ｔｅｎｃｏｎ、および他のＦＮ３ドメインは、分子の対向面上に位置する、ＣＤＲ様ループの２つセットである、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧにより形成される第１のセット、ならびにループＡＢ、ＣＤ、およびＥＦにより形成される第２のセットを含有する。ループの２つのセットは、ＦＮ３構造の中心を形成する、ベータ鎖により隔てられている。Ｔｅｎｃｏｎについての画像を、９０度回転させると、代替的表面を視覚化することができる。このわずかな凹面は、ループＣＤおよびＦＧ、ならびに２つのアンチパラレルのベータ鎖であるベータ鎖ＣおよびＦにより形成され、本明細書では、表面Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧと呼ばれる。表面Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧは、表面を形成する残基のサブセットをランダム化することにより、タンパク質足場の相互作用表面についてのライブラリーをデザインするための鋳型として使用される。ベータ鎖は、タンパク質の表面へと露出された、他のあらゆる残基の側鎖による反復構造を有する。したがって、ライブラリーは、ベータ鎖内の、一部または全部の表面露出残基をランダム化することにより作製される。ベータ鎖内の適切な残基を選び出すことにより、他のタンパク質との相互作用のための、固有の足場表面をもたらす一方で、Ｔｅｎｃｏｎ足場の固有の安定性が損なわれる程度は、最小限となるはずである。
このライブラリーを構築するのに使用される方法についての完全な記載は、米国特許公開第２０１３／０２２６８３４号において記載されている。
Ｔｅｎｃｏｎ２７内の表面Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧを形成する、２つのベータ鎖が、ランダム化される、合計９つの表面露出残基；Ｃ鎖：Ｓ３０、Ｌ３２、Ｑ３４、Ｑ３６；Ｆ鎖：Ｅ６６、Ｔ６８、Ｓ７０、Ｙ７２、およびＶ７４を有する一方、ループＣＤは、６つの潜在的残基：Ｓ３８、Ｅ３９、Ｋ４０、Ｖ４１、Ｇ４２、およびＥ４３を有し、ループＦＧは、７つの潜在的残基：Ｋ７５、Ｇ７６、Ｇ７７、Ｈ７８、Ｒ７９、Ｓ８０、およびＮ８１を有する。２２の残基全てをランダム化すると、ライブラリーの理論サイズが大型となるため、ＴＣＬ１４デザインへの組入れのために、選り抜きの残基を選び出した。
Ｔｅｎｃｏｎ内の、１３の位置：鎖Ｃ内のＬ３２、Ｑ３４、およびＱ３６、ループＣＤ内のＳ３８、Ｅ３９、Ｋ４０、およびＶ４１、鎖Ｆ内のＴ６８、Ｓ７０、およびＹ７２、ループＦＧ内のＨ７８、Ｒ７９、およびＮ８１を、ランダム化のために選び出した。鎖Ｃ内およびＦ内の、Ｓ３０およびＥ６６は、ループＣＤおよびＦＧから、わずかに外れた位置にあり、明らかに、表面Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧの一部としては現れないので、ランダム化しなかった。ループＣＤについて、グリシンは可撓性をもたらし、ループ領域内において、重要であり、Ｅ４３は表面の接合部に位置するので、Ｇ４２およびＥ４３はランダム化しなかった。ループＦＧは、Ｋ７５、Ｇ７６、Ｇ７７、およびＳ８０を除外した。上記の理由で、グリシンを除外しない一方、結晶構造の精査は、Ｓ８０が、安定的なループＦＧを形成する一助となるのに、コアとの鍵となる接点をもたらすことを明らかにした。Ｋ７５は、表面Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧから隔たり、ランダム化のための候補残基としての魅力に乏しかった。上述の残基は、元のＴＣＬ１４デザインではランダム化されなかったが、デノボの選択のために、または、例えば、選り抜きのＴＣＬ１４標的特異的ヒットによる、アフィニティー成熟ライブラリーのために、さらなる多様性をもたらすように、後続のライブラリーデザインに組み入れられた。
ＴＣＬ１４の作製に続き、同様のデザインによる、３つのさらなるＴｅｎｃｏｎライブラリーを作製した。これら３つのライブラリーＴＣＬ１９、ＴＣＬ２１、およびＴＣＬ２３は、ＴＣＬ１４と同じ位置（上記を参照されたい）においてランダム化したが、これらの位置において生じるアミノ酸の分布は変更した。ＴＣＬ１９と、ＴＣＬ２１とは、システインおよびメチオニンだけは除外し、１８の天然アミノ酸の、同等の分布を、あらゆる位置（各々、５．５５％ずつ）に組み入れるようにデザインした。ＴＣＬ２３は、ランダム化された各位置が、機能的抗体のＨＣＤＲ３ループにおいて見出されるアミノ酸分布を近似するようにデザインした（Ｂｉｒｔａｌａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３７７：１５１８～１５２８、２００８）。ライブラリーＴＣＬ２１と同様に、システインおよびメチオニンは除外した。
他のライブラリーの、潜在的な標的結合面を拡張するように、第４のさらなるライブラリーを構築した。このライブラリーＴＣＬ２４では、４つのさらなるＴｅｎｃｏｎ位置を、ライブラリーＴＣＬ１４、ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２１、およびＴＣＬ２３と比較してランダム化した。これらの位置は、Ｄ鎖に由来するＮ４６およびＴ４８、ならびにＧ鎖に由来するＳ８４およびＩ８６を含む。特に、これらの残基の側鎖は、ベータ鎖ＤおよびＧから、表面に露出され、構造的に、鎖ＣおよびＦのランダム化部分に隣接し、これにより、標的タンパク質への結合のためにアクセス可能な表面積を増大させるので、位置４６、４８、８４、および８６を選び出した。ＴＣＬ２４のために、各位置において使用されたアミノ酸分布は、ＴＣＬ１９およびＴＣＬ２１について記載されたアミノ酸分布と同一である。
ライブラリーＴＣＬ２１、ＴＣＬ２３、およびＴＣＬ２４の作出
アミノ酸分布を制御するために、Ｃｏｌｉｂｒａライブラリー技術（Ｉｓｏｇｅｎｉｃａ）を使用して、ライブラリーＴＣＬ２１を作出した。アミノ酸分布を制御するために、Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ技術（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）を使用して、遺伝子断片ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２３、およびＴＣＬ２４を作出した。初期合成の後に、ＰＣＲを使用して、各ライブラリーを増幅するのに続き、ループライブラリーのために、上記で記載されたＣＩＳディスプレイ系（Ｏｄｅｇｒｉｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１：２８０６～２８１０、２００４）を使用する選択において使用するために、ＲｅｐＡの遺伝子へのライゲーションを行った。
ＣＤ７１に結合する、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの選択
パニングおよび生化学スクリーニング
ヒトＣＤ７１に特異的なＦＮ３ドメインは、Ｎ末端の６Ｈｉｓタグを伴う、組換えビオチニル化ＣＤ７１細胞外ドメイン（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を使用するＣＩＳディスプレイ（Ｏｄｅｇｒｉｐら、２００４）を介して選択した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳（ＩＴＴ）のために、ＦＮ３ドメインライブラリーＴＣＬ１８、ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２１、ＴＣＬ２３、およびＴＣＬ２４に由来する、３μｇのＤＮＡを使用し、結合しなかったライブラリーメンバーは、洗浄により除去した。加熱することにより、ＤＮＡを、標的タンパク質から溶出させ、さらなるラウンドにわたるパニングのために、ＫＯＤポリメラーゼを使用するＰＣＲにより増幅した。各ラウンドにおける標的ＣＤ７１の濃度を、４００ｎＭから、１００ｎＭへと、逐次的に低下させ、洗浄の厳密性を増大させることにより、高アフィニティーの結合剤を単離した。第５ラウンドのパニングからのアウトプットを、さらに４ラウンドにわたるオフ速度選択にかけた。ビオチニル化標的抗原濃度を、ラウンド６および７における２５ｎＭから、ラウンド８および９における２．５ｎＭへと低減した。
パニングの後、選択されたＦＮ３ドメインをコードする遺伝子を、ＰＣＲにより増幅し、リガーゼ非依存的クローニング部位を組み入れるように修飾されたｐＥＴベクターへとサブクローニングし、標準的な分子生物学法を使用する、Ｅ．ｃｏｌｉ内の可溶性発現のために、これらの遺伝子により、ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）細胞を形質転換した。精製および検出を可能とするように、Ｃ末端のポリヒスチジンタグをコードする遺伝子配列を、各ＦＮ３ドメインへと付加した。
ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインについてスクリーニングするために、ストレプトアビジンコーティングＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ；型番：４３６１１０）を、Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ Ｔ２０（Ｐｉｅｒｃｅ）中で、１時間にわたりブロッキングし、次いで、１時間にわたり、ビオチニル化ＣＤ７１（パニング法における抗原と同じ抗原を使用する）、または陰性対照（非類縁Ｆｃ融合組換えタンパク質およびヒト血清アルブミン）によりコーティングした。プレートを、ＴＢＳＴですすぎ、希釈された溶解物を、プレートへと、１時間にわたり適用した。さらなるすすぎに続き、ウェルを、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｖ５ｔａｇ抗体（Ａｂｃａｍ；ａｂ１３２５）で、１時間にわたり処理し、次いで、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）（Ｒｏｃｈｅ；１１５８２９５０００１）でアッセイした。シグナルが、ストレプトアビジン対照のＥＬＩＳＡシグナルの少なくとも１０倍である、ＦＮ３ドメイン溶解物に由来するＤＮＡを、シーケンシングする結果として、ラウンド９のスクリーニングから単離された、２３の固有の読み取り可能なＦＮ３ドメイン配列をもたらした。
サイズ除外クロマトグラフィー解析
サイズ除外クロマトグラフィーを使用して、抗ＣＤ７１ ＦＮ３ドメインの凝集状態を決定した。各精製ＦＮ３ドメインのアリコート（１０μＬ）を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ５／１５０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）へと、ｐＨ７．４のＰＢＳによる移動相中の流量を、１分間当たり０．３ｍＬとして注入した。カラムからの溶出は、２８０ｎｍにおける吸光度によりモニタリングした。Ｔｅｎｃｏｎタンパク質を、対照として、各試行に組み入れた。Ａｇｉｌｅｎｔ製のＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、溶出プロファイルを解析した。
ハイスループットの発現およびコンジュゲーション
同定されたクローンを、２４ウェル深底ブロックプレート内の５ｍＬの培養物中、二連で増殖させた。略述すると、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを補充された、ウェル１つ当たり５ｍＬのＴＢ培地に、一晩にわたる培養物１５０μＬを播種し、２２０ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で、約３時間にわたり増殖させた（ＯＤ６００≒１）。培養物を、３７℃、２２０ｒｐｍで、さらに４時間にわたり、ＩＰＴＧにより、１ｍＭの最終濃度へと誘導した。２２５０×ｇで、１５分間にわたる遠心分離により、細菌ペレットを回収した。０．２ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ）を補充された、ウェル１つ当たり６００μＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ ＨＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、各ウェルへと添加し；ピペットにより、ペレットを解離させ、次いで、ペレットが溶解するまで、プラットフォームシェーカー上で、約３０分間にわたり、強く振盪した。プレートを、２２５０×ｇで、１５分間にわたりスピンして、溶解物を清澄化させ、各試料について、２６００μＬずつのアリコートを組み合わせた。製造元の指示書に従い、Ｈｉｓタグ付けＦＮ３ドメインを、Ｈｉｓ Ｔｒａｐプレート（ＧＥ）上で精製するのに続き、Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ ７Ｋ脱塩プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＴＢＳへの緩衝液交換を行った。Ｎａｎｏｄｒｏｐにより、タンパク質濃度を評価した。ＧｌｙＧｌｙ－ＶＣ－ＭＭＡＦとのコンジュゲーションのために、ＦＮ３ドメイン（３０μＭ）を、２００μＬの総容量中に、１５０μＭのＧｌｙＧｌｙＶＣ－ＭＭＡＦ（Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ）、および１μＭのソルターゼＡと共に混合した。室温で、１．５時間にわたり、コンジュゲーションを進行させ、製造元の指示書に従い、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製の、９６ウェルＨｉｓ Ｍｕｌｔｉｔｒａｐ ＨＰプレートを使用して、再度精製した。Ｚｅｂａ脱塩プレートを使用して、ＰＢＳとの緩衝液交換を達成するのに続き、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ ＨＴＳ ＧＶプレート（Ｄｕｒａｐｏｒｅ）を使用し、３０００×ｇで、２分間にわたる遠心分離を伴う滅菌濾過を行った。Ｎａｎｏｄｒｏｐにより、濃度を評価した。
ＣＤ７１媒介ＳＫ－ＢＲ３細胞殺滅アッセイ
細胞殺滅は、システイン変異体－細胞毒素コンジュゲートへの曝露の後における、ＣＤ７１過剰発現ヒト腫瘍細胞系である、Ｈ１５７３の生存率を、ＳＫＢＲ３と共に測定することにより評価した。細胞を、黒色透明底ウェル組織培養物処理プレート（Ｆａｌｃｏｎ：３５３２１９）内、５％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）を伴う、ウェル１つ当たり１００μＬのフェノールレッド非含有ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ：１１８３５－０３０）中に、ウェル１つ当たり７０００個で播種した。加湿５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で、一晩にわたり、細胞を付着させた。培地を、９６ウェルプレートから吸引し、細胞を、５０ｕＬの新鮮培地、および新鮮培地中で作製された、５０ｕＬの２倍濃度阻害剤で処理した。細胞生存率は、７０時間後において、Ｃｅｌｌ ＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を伴うエンドポイントアッセイにより決定した。ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、データを、傾きを可変とするＳ字型用量反応曲線についての式へと当てはめることにより決定した。
用量反応ＥＬＩＳＡによる、選択されたクローンの結合
選択されたクローンを、ＥＬＩＳＡにより解析して、結合についてのＥＣ５０値を決定した。略述すると、Ｍａｘｉｓｏｒｂプレートを、５μｇ／ｍｌのストレプトアビジンにより、４℃で、一晩にわたりコーティングした。次いで、プレートを、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により、室温で、１時間にわたりブロッキングし、次いで、ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄した。ビオチニル化ＣＤ７１（２μｇ／ｍｌ）を、ストレプトアビジンプレートへと捕捉し、系列希釈されたＦＮ３タンパク質を、適切なウェルへと、室温で、１時間にわたり添加した。洗浄の後、結合したＦＮ３タンパク質を、ＨＲＰへとコンジュゲートされた、抗Ｖ５タグ抗体、およびペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）基質、ならびに発光プレートリーダーにより検出した。発光値を、濃度の関数としてプロットし、ＰＲＩＳＭを使用して、用量反応曲線へと当てはめて、結合についてのＥＣ５０値を決定した。
毒素コンジュゲートを介する、内部化ＦＮ３ドメインの同定：ＮＥＭコンジュゲーションについて記載された方法を使用して、酵素切断型Ｖａｌ－Ｃｉｔリンカーまたは非切断型ＰＥＧ４リンカーを介して、ＦＮ３ドメインを、細胞傷害性チューブリン阻害剤である、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）へとコンジュゲートした（ＶＣ－ＭＭＡＦ）。細胞殺滅は、システイン変異体－細胞毒素コンジュゲートへの曝露の後における、ＳＫＢＲ－３細胞の生存率を測定することにより評価した。細胞を、白色不透明底ウェル組織培養物処理プレート（Ｆｉｓｈｅｒ：ＰＩ１５０４２）内、１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）を伴う、ウェル１つ当たり５０μＬのフェノールレッドＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ：１１８７５０９３）中に、ウェル１つ当たり３０００個で播種した。加湿５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で、一晩にわたり、細胞を付着させた。細胞を、２５ｕＬの新鮮培地、および新鮮培地中で作製された、２５ｕＬの４倍濃度阻害剤で処理した。細胞生存率は、７２時間後において、Ｃｅｌｌ ＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を伴うエンドポイントアッセイにより決定した。ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、データを、傾きを可変とするＳ字型用量反応曲線についての式へと当てはめることにより決定した。
二価ＦＮ３タンパク質
反復４回のＧ／Ｓリンカー、または他の適切なポリペプチドリンカーにより接続された、２つのＦＮ３ドメインを使用して、二価ＦＮ３タンパク質を作製した。記載される通りに、二価ＦＮ３タンパク質を、ＶＣ－ＭＭＡＦへとコンジュゲートし、ＳＫ－ＢＲ３細胞内の細胞傷害作用について評価した。二価分子についてのＩＣ５０値は、しばしば、一価形より良好であることが見出された。
トランスフェリンへの結合および内部化についての競合
上記で記載された細胞傷害作用アッセイを使用して、ＦＮ３ドメインｖｃＭＭＡＦコンジュゲートを、ヒトトランスフェリンとの競合についてスクリーニングした。ＦＮ３ドメインを、０．６ｕＭのヒトホロトランスフェリン（Ｔ０６６５－１００ＭＧ）の非存在下または存在下においてスクリーニングした。
ｐＨｒｏｄｏ－Ｔｆアッセイ
ＣＤ７１ターゲティングセンチリンを、トランスフェリン受容体への結合についてトランスフェリンと競合する、それらの能力について査定した。細胞を、酸性コンパートメント内で蛍光発光するので、細胞内のエンドソームコンパートメントおよびリソソームコンパートメントへの取込み時に目視可能な色素である、ｐＨｒｏｄｏ－Ｒｅｄへと直接コンジュゲートされたトランスフェリンで処理した。ｐＨｒｏｄｏ－トランスフェリン（ｐＨｒｏｄｏ－Ｔｆ）のイメージングは、Ｔｆの取込みについての、リアルタイムの測定を可能とする、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ上で実施した。細胞を、ｐＨｒｏｄｏ－Ｔｆ、およびＣＤ７１への結合についてＴｆと競合する分子と共にインキュベートすると、ｐＨｒｏｄｏシグナルは、低減されるか、または消失する。ＣＤ７１への結合についてＴｆと競合しないセンチリンは、ｐＨｒｏｄｏシグナルに対して、影響を及ぼさない。
ＣＤ７１に結合するが、トランスフェリンと競合的ではない、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの選択
トランスフェリンと競合的ではないか、または競合が最小限である、ＣＤ７１結合性ＦＮ３ドメインを同定するために、バイアスＣＩＳディスプレイ戦略をデザインした。略述すると、ヒトＣＤ７１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）についての、５ラウンドにわたるパニングの後で回収されたアウトプットを使用し（実施例３）、さらなるラウンドにわたるオフ速度選択も、実施例３に記載される通りに実施したが、１）最終的な溶出工程の前に、トランスフェリンと同じ部位に結合したＦＮ３タンパク質を溶出させる、ヒトホロトランスフェリンによる洗浄工程；または２）モノクローナル抗体であるＯＫＴ９による、ＦＮ３ドメイン結合剤の溶出を追加した。トランスフェリン洗浄戦略およびＯＫＴ９溶出戦略から回収されたＦＮ３ドメインを、既に記載されている通りに、ＰＣＲ増幅し、ｐＥＴベクターへとクローニングした（実施例３）。ｈｕＣＤ７１に、特異的に結合した、２２８のＦＮ３ドメインを、溶液ＥＬＩＳＡにより、ｈｕＣＤ７１ ＥＣＤへの結合について確認した。固有の結合剤のサブセットは、ＳＥＣにより解析し、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）へとコンジュゲートし、ヒトホロトランスフェリンを伴う／伴わないＳＫＢＲ－３細胞内における細胞生存率アッセイを介して、内部化について評価した。ポリペプチドは、受容体により内部化されることが見出された。Ｉｎｔｅｇｒａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社が、メンブレンプロテオームアレイ（ＭＰＡ）アッセイを実施して、ＡＢＸ１１９８（配列番号２０９）、ＡＢＸ１１４２（配列番号２０９＋Ｈｉｓタグ）、およびＡＢＸ１１００（配列番号２０９＋リンカーを伴うｓｉＲＮＡ対）の特異性を、ヒト膜タンパク質のライブラリーに対してプロファイリングした。ＭＰＡライブラリーは、全ての１回膜貫通型タンパク質、複数回膜貫通型タンパク質、およびＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を含む、ＧＰＩアンカータンパク質、イオンチャネル、および輸送体のうちの９４％を含み、各膜タンパク質が、ニワトリＱＴ６細胞バックグラウンド内で固有に発現された、６０００を超えるヒト膜タンパク質を含有した。フローサイトメトリーを使用して、非固定細胞内で、個別に発現された膜タンパク質に結合するリガンド（ＦＮ３ドメイン）を直接検出した。
ＡＢＸ１１９８（配列番号２０９）、ＡＢＸ１１４２（配列番号２０９＋Ｈｉｓタグ）およびＡＢＸ１１００（配列番号２０９＋リンカーを伴うｓｉＲＮＡ対）は、それぞれ、最適のシグナル／バックグラウンドノイズ比、１．２５ｕｇ／ｍｌ、１．２５ｕｇ／ｍｌ、および０．３１ｕｇ／ｍｌを伴う濃度で、ＭＰＡに対してスクリーニングした。スクリーニングで同定された膜タンパク質標的は、リガンドの系列希釈液、および同定された標的を個別にトランスフェクトされた細胞を使用する、検証手順において追跡した。
ＣＤ７１ ＦＮ３ドメイン－オリゴヌクレオチドコンジュゲートを使用する、筋細胞内のｍＲＮＡのノックダウン
ＦＮ３ドメインへと固有に操作されたシステインを介する、マレイミド化学反応を使用して、ｍｕＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインを、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）へとコンジュゲートする。システイン置換は、本明細書で提示され、また、参照によってその全体を本明細書に組み入れる、米国特許出願公開第２０１５０１０４８０８号においても提示されているシステイン置換などのシステイン置換でありうる。ｓｉＲＮＡまたは ＡＳＯは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、標準的な化学修飾で修飾され、標的ｍＲＮＡのノックダウンを可能とすることを確認される。ＦＮ３ドメイン－オリゴヌクレオチドコンジュゲートを、マウスへと、オリゴヌクレオチドペイロードの最大用量を１０ｍｇ／ｋｇとして、静脈内投与した。投与後の多様な時点において、マウスを屠殺し、骨格筋、心臓筋肉、および他の多様な組織を回収し、必要となるまで、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中で保管した。標準的なｑＰＣＲΔΔＣＴ法、ならびに標的遺伝子および対照遺伝子に特異的なプライマーを使用して、標的遺伝子のノックダウンを評価した。標的遺伝子は、筋内でノックダウンされることが見出され、このようなノックダウンは、ｓｉＲＮＡまたは ＡＳＯを、ＦＮ３のＣＤ７１結合性ドメインとコンジュゲートすることにより増強された。
アフィニティー成熟パニング：
ＣＤ７１頂端ドメインへの選択的結合を裏付けた、４つの配列（Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）を、アフィニティー成熟ライブラリーの基盤とした。各配列内で、拡張シートライブラリーの一部である、４つのアミノ酸（二重下線を付された）を、１８のアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンであり、プロリン、メチオニンを含まない）へとランダム化した。新たなライブラリーは、４ラウンドに対する選択：ａ）トランスフェリンの洗浄；ｂ）ＯＫＴ９による溶出；ｃ）頂端ドメインによる選択；ｄ）頂端ドメインである、ＣＤ７１＿ＥＣＤによる選択を経た。下記の配列番号２８８～２９１の配列を参照されたい。
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ＦＮ３－ｓｉＲＮＡのコンジュゲーションおよび精製
マレイミド修飾ｓｉＲＮＡを使用する、システイン特異的化学反応を介して、システイン修飾ＣＤ７１ ＦＮ３－４９（配列番号２７２）の、ＡＢＸ０２１４（表６）へのコンジュゲーションにより、ＡＢＸ１００５を調製した。システイン-マレイミドコンジュゲーションのために、ＰＢＳ中に５０～２００μＭの、システイン含有ＦＮ３ドメインを、１０ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）により、室温で（３０分間）還元して、遊離チオールをもたらした。ＴＣＥＰを除去するために、ＦＮ３タンパク質を、飽和硫酸アンモニウム溶液により沈殿させ、次いで、直前に水中で溶解させたマレイミド修飾ｓｉＲＮＡ二重鎖と、ＦＮ３－タンパク質：ｓｉＲＮＡのモル比を、約１．５：１として、混合した。室温または３７℃で、１時間にわたるインキュベーションの後、反応を、Ｎ－エチルマレイミド（反応混合物の最終ＮＥＭ濃度を１ｍＭとする）でクエンチした。
Figure 2024517610000039
ＦＮ３－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、反応しなかったｓｉＲＮＡリンカーを除去する、ＩＭＡＣクロマトグラフィー（ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ）と、反応しなかったＦＮ３タンパク質を除去する、アニオン交換クロマトグラフィー－Ｃａｐｔｏ－ＤＥＡＥとを使用する、２工程で精製した。ＦＮ３タンパク質－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、ＰＡＧＥ、解析用サイズ除外クロマトグラフィー、およびＬＣ／ＭＳにより特徴づけた。コンジュゲートの濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用して、Ａ２６０におけるコンジュゲート溶液の吸光度に基づき計算した。
マウスにおける、ＦＮ３－ｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ活性
雄ＣＤ－１マウスを、ｓｉＲＮＡを１０ｍｇ／ｋｇとする、ＡＢＸ１００５（ｓｉＲＮＡへとコンジュゲートされたＣＤ７１ ＦＮ３ドメイン）、または等モル用量のＡＢＸ１００７（ＦＮ３だけの対照）の、１または３回の静脈内投与で処置した。組織は、最終回投与の２週間後に回収し、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）による、ＡＨＡ－１ノックダウン解析のために加工した。１８ＳリボソームＲＮＡを、ＲＴ－ＰＣＲ内因性対照遺伝子として使用した。ノックダウンレベルを、媒体処置マウスと比較した。ＡＨＡ－１の、ｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンは、本研究で解析された、全ての筋肉群において観察された（腓腹筋、大腿四頭筋、心臓）（図１）。
雄Ｃ５７／ＢＬ６マウスを、ｓｉＲＮＡを１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇとする、ＡＢＸ１００５の、単回静脈内投与で処置した。組織は、単回投与の２週間後に回収し、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）による、ＡＨＡ－１ノックダウン解析のために加工した。１８ＳリボソームＲＮＡを、ＲＴ－ＰＣＲ内因性対照遺伝子として使用した。ノックダウンレベルを、媒体処置マウスと比較した。ＡＨＡ－１の、用量依存的ノックダウンは、本研究で解析された、全ての筋肉群において観察された（腓腹筋、大腿四頭筋、横隔膜、心臓）（図２）。
これらの実施例は、本明細書で提示される、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインなどのＦＮ３ドメインへとコンジュゲートされたｓｉＲＮＡ分子が、ｓｉＲＮＡ分子のほか、他の活性部分を、特異的組織へと送達し、特異的標的の発現を調節するのに使用されることを裏付ける。
ＣＤ７１ ＦＮ３ドメイン－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの結合特異性
Ｉｎｔｅｇｒａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（ｗｗｗ．ｉｎｔｅｇｒａｌｍｏｌｅｃｕｌａｒ．ｃｏｍ）が、同社に特許権のあるメンブレンプロテオームアレイ（ＭＰＡ）アッセイを実施して、ＣＤ７１ ＦＮ３ドメインおよびＣＤ７１ ＦＮ３ドメイン－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの特異性を、ヒト膜タンパク質のライブラリーに対してプロファイリングした（図３）。ＭＰＡは、全ての１回膜貫通型タンパク質、複数回膜貫通型タンパク質、およびＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を含む、ＧＰＩアンカータンパク質、イオンチャネル、および輸送体のうちの９４％に及び、各膜タンパク質が、ニワトリＱＴ６細胞バックグラウンド内で固有に発現された、６０００を超えるヒト膜タンパク質を含有した。フローサイトメトリーを使用して、非固定細胞内で、個別に発現された膜タンパク質に結合するＦＮ３ドメインを直接検出した。
ＦＮ３ドメイン、およびＦＮ３ドメイン－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、それぞれ、最適のシグナル／バックグラウンドノイズ比を伴う、１．２５ｕｇ／ｍｌまたは０．３１ｕｇ／ｍｌの濃度で、ＭＰＡに対してスクリーニングした。スクリーニングで同定された膜タンパク質標的は、リガンドの系列希釈液を、同定された標的を固有に発現する細胞上で使用して検証した。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ＣＤ７１センチリンコンジュゲートと、ＣＤ７１モノクローナル抗体コンジュゲートとの比較
本研究における、本発明者らの目的は、ツールであるセンチリン－ＡＨＡ１コンジュゲートの薬力学活性の持続時間を、ＡＨＡ１ ｓｉＲＮＡとコンジュゲートされたモノクローナル抗体であるＲ１７と比較して決定することであった。雄Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスに、１０ｍｇのＡＨＡ１ ｓｉＲＮＡを含有する、１７．９ｍｇのツールであるセンチリン－ＡＨＡ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲート、または１０ｍｇのＡＨＡ１ ｓｉＲＮＡを含有する、１２０ｍｇの、ＡＨＡ１ ｓｉＲＮＡとコンジュゲートされたモノクローナル抗体であるＲ１７の、単回静脈内ボーラスを投与した。いずれの方向においても、０．５ｃｍを越えない、腓腹筋組織を、投与の２、４、および８週間後の時点（時点１つあたりのＮ＝３である）において、ＲＮＡｌａｔｅｒ中に回収して、ＲＮＡｌａｔｅｒの良好な浸透を確保し、４℃で、２４時間にわたり保管してから、－８０℃で保管した。Ｑｉａｇｅｎ製のＲＮｅａｓｙ Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｔｉｓｓｕｅキットを使用して、腓腹筋から、全ＲＮＡを単離した。リアルタイム定量的ＰＣＲを使用して、標的ＡＨＡ１および内因性対照であるＰｇｋ１の発現レベルを測定した。データは、媒体単独を投与された対照動物に対して正規化されたΔΔＣｔ法を使用して解析した。処置群内の各動物についての、ＡＨＡ１およびＰｇｋ１の遺伝子発現レベルを、３つの媒体対照の平均と比べて提示した。ツールであるＡＨＡ１－ｓｉＲＮＡコンジュゲート処置群内、およびＡＨＡ１ ｓｉＲＮＡとコンジュゲートされたモノクローナル抗体であるＲ１７処置群内の、ＡＨＡ１ ｍＲＮＡのノックダウン百分率は、残りのＡＨＡ１ ｍＲＮＡレベルの百分率を、１００から減算することにより測定した。
ＣＤ７１センチリンコンジュゲートは、わずかなｍＡｂコンジュゲート用量で、遺伝子ノックダウンの維持を駆動する。Ｃ５７／Ｂ６マウスに、単回投与用量（１０ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ）の被験コンジュゲートを施した。ＡＨＡ１の相対ＲＮＡ発現を、投与の２週間後、投与の４週間後、および投与の８週間後において、腓腹筋内で測定した。図４および表７は、筋内のｍＲＮＡノックダウンについて、同等の活性を裏付けるデータを提示するが、ＣＤ７１センチリンコンジュゲートが要求するコンジュゲート用量は、はるかに少量である。
Figure 2024517610000040
センチリン－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の骨格筋内および心内で活性である
ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎでコーティングされた９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ：１５１１６）を、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で洗浄し、ブロッキング緩衝液（Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ Ｔ２０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ：３７５３９）により、３０分間にわたりブロッキングした。ビオチニル化抗原（ヒトＣＤ７１－ＥＣＤ［Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：ＴＦＲ－Ｈ８２４３］、またはカニクイザルＣＤ７１－ＥＣＤ［Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：ＴＦＲ－Ｃ８２４９］）を、２０ｎＭの濃度で、ブロッキングされたプレート上に固定化し、室温で、１時間にわたりインキュベートした。センチリン試料を、ブロッキング緩衝液中で希釈し、１０００ｎＭ～０．０１６９ｎＭにおいて滴定し、室温で、２時間にわたりインキュベートした。プレートを、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄した。抗センチリン抗体を、ブロッキング緩衝液中に１：２５００で調製し、プレートへと添加し、１時間にわたりインキュベートした。プレートを、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄した。抗ウサギＨＲＰ抗体を、ブロッキング緩衝液中に１：２５００で調製し、プレートへと添加し、１時間にわたりインキュベートした。プレートを、洗浄し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐａｒａｄｉｇｍ上のＥＬＩＳＡ基質（Ｒｏｃｈｅ：１１５８２９５０００１）により読み取った。図５および表８は、ＣＤ７１センチリンならびにＣＤ７１センチリンコンジュゲートが、ヒトＣＤ７１およびカニクイザルＣＤ７１の両方に効果的に結合し、ｓｉＲＮＡコンジュゲートが、ＣＤ７１センチリンの結合に干渉しないことを裏付けるデータを提示する。
Figure 2024517610000041
本研究の目的は、センチリン－ＡＨＡ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートの薬力学（ＰＤ）活性を、カニクイザルモデルにおいて決定することであった。毎週１回、右伏在静脈におけるＩＶボーラスを介して、３週間にわたり、２匹の雄カニクイザルを、１０ｍｇ／ｋｇのＡＨＡ１ ｓｉＲＮＡ（Ｎ＝２）を含有する、１７．１２ｍｇ／ｋｇのセンチリン－ＡＨＡ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲート、または媒体（Ｎ＝２）で処置した。最終回投与の４週間後、骨格筋組織（左および右の腓腹筋、左および右の大腿四頭筋、横隔膜、左および右の大腿二頭筋、ヒラメ筋）、平滑筋組織（空腸）、左および右の心臓組織、ならびに非骨格筋組織（皮膚、肝臓、および腎臓）を採取し、ＲＮＡｌａｔｅｒ中で保管して、ＲＮＡｌａｔｅｒの良好な浸透を確保し、４℃で、２４時間にわたり保管した。Ｑｉａｇｅｎ製のＲＮｅａｓｙ Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｔｉｓｓｕｅキットを使用して、これらの組織から、全ＲＮＡを単離した。標的ＡＨＡ１、および内因性対照（ＡＲＬ１、ＡＲＦＧＡＰ２、ＨＰＲＴ１、ＧＡＰＤＨ、およびＧｙｓ１）の発現レベルは、リアルタイム、定量的ＰＣＲにより測定した。データは、媒体単独を投与された対照動物に対して正規化されたΔΔＣｔ法を使用して解析した。平均２例の試料（組織の各側に由来する１例の生検）、または１例の試料（１例の生検）を、解析のために採取した。センチリン－ＡＨＡ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲート処置群内、および媒体群内の、ＡＨＡ１ ｍＲＮＡのノックダウン百分率は、残りのＡＨＡ１ ｍＲＮＡレベルの百分率を、１００から減算することにより測定した。各組織内で、ＡＨＡ１ノックダウンの百分率を、ＡＨＡ１ノックダウンの最大量から、最小量への順に示す。
センチリン－ＡＨＡ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、カニクイザルのｉｎ ｖｉｖｏの筋内および心内におけるｍＲＮＡレベルを、効果的にノックダウンした（図６を参照されたい）。カニクイザルには、１０ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡで、毎週３回投与した。ｍＲＮＡレベルは、３回の投与後である、２８日目に評価した。
一般的方法
分子生物学における標準的方法については記載されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓ（１９８２および１９８９、２版；２００１、３版）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；Ｗｕ（１９９３）、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」、２１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。標準的方法はまた、細菌細胞におけるクローニングおよびＤＮＡの突然変異誘発（１巻）、哺乳動物細胞および酵母におけるクローニング（２巻）、糖コンジュゲートおよびタンパク質の発現（３巻）、ならびにバイオインフォマティクス（４巻）について記載する、Ａｕｓｂｅｌら（２００１）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１～４巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹにおいても見られる。
免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、および結晶化を含む、タンパク質精製のための方法について記載されている（Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ」、１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。タンパク質の化学解析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の作製、グリコシル化について記載されている（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ」、２巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００１）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、３巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹ、１６．０．５～１６．２２．１７頁；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏ．（２００１）、「Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、４５～８９頁；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１）、「ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ」、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．、３８４～３９１頁を参照されたい）。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の作製、精製、および断片化について記載されている（Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９９９）、「Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出）。リガンド／受容体相互作用を特徴付けるための標準的技法は利用可能である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、４巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。
本明細書で引用される、全ての参考文献を、各個別の刊行物、データベース登録番号（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅ ＩＤ登録番号）、特許出願、または特許を、参照によって組み入れることが、具体的に、かつ、個別に指し示された場合と同じ程度に、参照によって組み入れる。参照による組み入れについてのこの言明は、このような引用が、参照による組み入れについての専一的な言明に近接してなされていない場合であってもなお、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（１）に従い、本出願者らにより、それらの各々が、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（２）に準拠して、明らかに同定される、各個別の刊行物、データベース登録番号（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅ ＩＤ登録番号）、特許出願、または特許、およびあらゆる個別のこれらの引用物に関することが意図される。存在する場合、本明細書内における、参照による組み入れについての専一的な言明の組入れは、いかなる形でも、参照による組み入れについてのこの一般的な言明を無化しない。本明細書における参考文献の引用は、参考文献が、関連する先行技術であることの容認として意図されず、これらの刊行物または文献の内容または刊行年月日についてのいかなる容認も構成しない。
本実施形態は、本明細書で記載される、具体的実施形態による範囲内に限定されないものとする。実際、当業者には、前出の記載から、本明細書で記載される実施形態に加えた、実施形態の多様な改変が明らかとなろう。このような改変は、付属の特許請求の範囲内に収まることが意図される。
前出の明細書は、当業者が、実施形態を実施することを可能とするのに十分であると考えられる。当業者には、前出の記載から、本明細書で示され、記載される実施形態に加えた、実施形態の多様な改変が明らかとなり、付属の特許請求の範囲内に収まる。
関連出願
本出願は、参照によってそれらの全体を本明細書に組み入れる、２０２１年４月１４日に出願された、米国特許仮出願第６３／１７４，７５２号、および２０２２年３月２８日に出願された、米国特許仮出願第６３／３２４，４３１号に対する優先権を主張する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によってその全体を本明細書に組み入れる配列表を含有する。２０２２年５月１７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、１４５９６５＿００２００２＿ＳＬ．ｔｘｔと称され、２８３，２０４バイトのサイズである。
分野
本実施形態は、ＣＤ７１（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ７１）に特異的に結合する、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）、ならびに分子を作製および使用する方法に関する。
トランスフェリン受容体１としてもまた公知のＣＤ７１は、細胞への鉄輸送に不可欠な膜貫通受容体である。ＣＤ７１は、多くの種類の腫瘍上、および血液脳関門において、高度に発現され、このため、薬物送達のための、重要な標的となっている。鉄がロードされたトランスフェリンへの結合の後、ＣＤ７１は、急速にエンドサイトーシスされ、細胞表面へと、効率的にリサイクルされる。ＣＤ７１抗体薬物コンジュゲートによる研究は、ＣＤ７１のターゲティングが、薬物送達の特異性および選択性を改善し、治療指数を拡大しうることを示唆する。加えて、抗ＣＤ７１モノクローナル抗体を使用する研究は、結合アフィニティーが、平滑筋または骨格筋への送達、および血液脳関門におけるトランスサイトーシスを含む組織特異的送達を可能とするのに、重要な役割を果たしうることを指し示す。ＣＤ７１に対するアフィニティーが大きな抗体は、急速に内部化され、受容体が、リサイクリングではなく、分解のために、リソソームへとターゲティングされるように、通常の受容体トラフィッキングを変更する。これに対し、ＣＤ７１に対するアフィニティーが小さな抗体は、受容体のリサイクリング、および脳の高度の曝露を可能とする。
抗体または抗体断片は、標的分子に対する、高アフィニティーおよび高特異性が所望される場合に、治療用タンパク質のうちで、最も広く使用されるクラスであるが、このような標的に結合するように、抗体以外のタンパク質もまた操作される。これらの「代替的足場」タンパク質は、それらのサイズが小さいこと、ジスルフィド結合の欠如、高安定性、原核生物宿主内で発現される能力、精製の容易さのために、従来の抗体を上回る利点を有し、薬物／毒素へと、容易にコンジュゲートされ、組織へと効率的に浸透し、多特異性結合剤へと、たやすくフォーマットされる。
このような代替的足場のうちの１つは、免疫グロブリン（Ｉｇ）フォールドである。このフォールドは、抗体の可変領域内のほか、数千に及ぶ、抗体以外のタンパク質内で見出される。このようなＩｇタンパク質の１つである、ヒトフィブロネクチンに由来する、第１０のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）リピートは、全体的なＩｇフォールド構造を保持しながら、表面露出ループ内の多数の突然変異を許容しうることが示されている。したがって、ＣＤ７１に特異的に結合しうるＦＮ３ドメイン、および受容体に媒介される、ＣＤ７１の内部化を介する細胞内へのアクセスを可能とする、新規の治療剤のために、このような分子を使用する方法が必要とされている。
一部の実施形態では、ＣＤ７１タンパク質に特異的に結合するＦＮ３ドメイン（例えば、ポリペプチド）が提供される。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、単離ＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、組換えＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、天然に存在しないＦＮ３ドメインである。
一部の実施形態では、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、もしくは３０４～３０６、２９２～２９９もしくは３０４～３０６、または３０４～３０６のアミノ酸配列を含むＦＮ３ドメインが提供される。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、ＣＤ７１に結合する。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、トランスフェリンの、ＣＤ７１への結合と競合しない、ＣＤ７１上の部位において、ヒトＣＤ７１に結合する。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、ＣＤ７１に特異的に結合する。一部の実施形態では、可撓性リンカーなどのリンカーにより接続された、１つを超えるＦＮ３ドメインを含むポリペプチドが提供される。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ドメイン間の１つまたはそれ以上のリンカーにより互いと接続された、２つ、３つ、または４つのＦＮ３ドメインを含む。
一部の実施形態では、本明細書で記載される、ＦＮ３ドメインをコードする単離ポリヌクレオチドが提供される。
一部の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
一部の実施形態では、本明細書で記載されるベクターを含む宿主細胞が提供される。
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインを作製する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、ＦＮ３ドメインをコードするか、またはこれを発現させるベクターを含む宿主細胞を培養する工程を含む。一部の実施形態では、方法は、ＦＮ３ドメインを精製する工程をさらに含む。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、ＣＤ７１に特異的に結合する。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインに結合する、抗イディオタイプ抗体が提供される。
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインのうちの１つまたはそれ以上を含むキットが提供される。
一部の実施形態では、腫瘍組織内のＣＤ７１発現がん細胞を検出する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象から、腫瘍組織の試料を得る工程；および腫瘍組織の試料を、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のうちの１つのアミノ酸配列を含む、ＣＤ７１タンパク質に結合するＦＮ３ドメインと接触させ、ＣＤ７１タンパク質と、ＦＮ３ドメインとの結合を検出することにより、ＣＤ７１タンパク質が、腫瘍組織内で発現されるのかどうかを検出する工程を含む。
一部の実施形態では、ＣＤ７１発現細胞を分離する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象から、試料を得る工程；試料を、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のうちの１つのアミノ酸配列を含む、ＣＤ７１タンパク質に結合するＦＮ３ドメインと接触させる工程；およびＦＮ３ドメインに結合した細胞を分離する工程を含む。
一部の実施形態では、腫瘍組織内のＣＤ７１発現がん細胞を検出する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のうちの１つのアミノ酸配列を含む、ＣＤ７１タンパク質に結合するＦＮ３ドメインを、検出用標識とコンジュゲートして、コンジュゲートを形成する工程；コンジュゲートを、対象へと投与する工程；およびコンジュゲートが結合したＣＤ７１発現がん細胞を視覚化する工程を含む。
一部の実施形態では、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象へと、ＣＤ７１に結合するポリペプチドまたは医薬組成物を投与する工程を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６などの配列、または治療剤へと連結されるか、もしくはこれとコンジュゲートされた、本明細書で提示されるポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するポリペプチドは、中枢神経系へと方向付けられる。一部の実施形態では、それを必要とする対象における神経学的状態および／または脳腫瘍を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象へと、ＣＤ７１に結合するポリペプチドまたは医薬組成物を投与する工程を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６などの配列、または治療剤へと連結されるか、もしくはこれとコンジュゲートされた、本明細書で提示されるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、脳腫瘍は、非悪性脳腫瘍、良性脳腫瘍、および悪性脳腫瘍からなる群から選択される。一部の実施形態では、神経学的状態は、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症、パーキンソン病、ラフォラ病、ポンペ病、成人ポリグルコサン小体病、脳卒中、脊髄損傷、運動失調、ベル麻痺、脳動脈瘤、てんかん、発作、ギラン－バレー症候群、多発性硬化症、筋ジストロフィー、神経皮膚症候群、偏頭痛、脳炎、敗血症、および重症筋無力症からなる群から選択される。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するポリペプチドは、筋細胞へと方向付けられる。一部の実施形態では、方法は、対象へと、ＣＤ７１に結合するポリペプチドまたは医薬組成物を投与する工程を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６などの配列、または治療剤へと連結されるか、もしくはこれとコンジュゲートされた、本明細書で提示されるポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、それを必要とする対象におけるポンペ病（ＧＳＤ２；酸性アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）欠損症）を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象へと、ＣＤ７１に結合するポリペプチドまたは医薬組成物を投与する工程を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６などの配列、または治療剤へと連結されるか、もしくはこれとコンジュゲートされた、本明細書で提示されるポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、それを必要とする対象における糖原病を処置する方法であって、本明細書で提示される組成物を投与する工程を含む方法が提供される。一部の実施形態では、糖原病は、コーリー病またはフォーブズ病（ＧＳＤ３；グリコーゲン脱分枝酵素（ＡＧＬ）欠損症）、マッカードル病（ＧＳＤ５；筋グリコーゲンホスホリラーゼ（ＰＹＧＭ）欠損症）、ＩＩ型糖尿病／糖尿病性腎症、ＧＳＤ１２であるアルドラーゼＡ欠損症、ラフォラ病、低酸素症、アンデルセン病（ＧＳＤ４；グリコーゲン脱分枝酵素（ＧＢＥ１）欠損症）、タルイ病（ＧＳＤ７；筋ホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫＭ）欠損症）、および成人ポリグルコサン小体病からなる群から選択される。一部の実施形態では、糖原病は、グリコーゲンシンターゼ（ＧＹＳ２）欠損症（ＧＳＤ０）、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ／ＳＬＣ３７Ａ４）欠損症（ＧＳＤ１；フォンギールケ病）、ハース病（ＧＳＤ６；肝グリコーゲンホスホリラーゼ（ＰＹＧＬ）欠損症または筋ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＡＭ２）欠損症）、ホスホリラーゼキナーゼ（ＰＨＫＡ２／ＰＨＫＢ／ＰＨＫＧ２／ＰＨＫＡ１）欠損症（ＧＳＤ９）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＡＭ２）欠損症（ＧＳＤ１０）、筋乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨＡ）欠損症（ＧＳＤ１１）、ファンコーニ－ビッケル症候群（ＧＳＤ１１；グルコース輸送体（ＧＬＵＴ２）欠損症）、アルドラーゼＡ欠損症（ＧＳＤ１２）、β－エノラーゼ（ＥＮＯ３）欠損症（ＧＳＤ１３）、およびグリコゲニン－１（ＧＹＧ１）欠損症（ＧＳＤ１５）からなる群から選択される。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するポリペプチドは、免疫細胞へと方向付けられる。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するポリペプチドは、樹状細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＢ細胞へと方向付けられる。一部の実施形態では、それを必要とする対象における自己免疫疾患を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象へと、ＣＤ７１に結合するポリペプチドまたは医薬組成物を投与する工程を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６などの配列、または治療剤へと連結されるか、もしくはこれとコンジュゲートされた、本明細書で提示されるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、関節リウマチ、橋本自己免疫性甲状腺炎、セリアック病、１型糖尿病、白斑、リウマチ熱、悪性貧血／萎縮性胃炎、円形脱毛症、および免疫性血小板減少性紫斑病からなる群から選択される。
一部の実施形態では、目的の薬剤を、ＣＤ７１陽性細胞へと送達する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、細胞を、本明細書で提示されるポリペプチドなど、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインとカップリングされた、目的の薬剤と接触させる工程を含む。一部の実施形態では、目的の薬剤は、化学療法剤、薬物、増殖阻害剤、毒素、放射性同位体、抗チューブリン剤、ポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ分子、アンチセンス分子、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤、抗生剤、抗葉酸剤、代謝拮抗剤、化学療法増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤、またはビンカアルカロイドである。
一部の実施形態では、本明細書で提示されるＦＮ３ドメインは、ポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ分子、アンチセンス分子、ＲＮＡ分子、またはＤＮＡ分子へとコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、トランスフェリンの、ＣＤ７１への結合と競合したり、これを阻害したりしない部位において、ＣＤ７１に結合するＦＮ３タンパク質である。
一部の実施形態では、トランスフェリンの、ＣＤ７１への結合と競合したり、これを阻害したりしない部位において、ＣＤ７１に結合するＦＮ３タンパク質を同定する方法が提供される。
ＦＮ３ポリペプチド（ＡＢＸ１００７）、またはＦＮ３ポリペプチド－ｓｉＲＮＡコンジュゲート（ＡＢＸ１００５）の投与後の、ＣＤ－１マウスの多様な組織内における、ＡＨＡ１ ｍＲＮＡの定量を例示する図である。 ＦＮ３－ｓｉＲＮＡコンジュゲート（ＡＢＸ１００５）の投与後の、Ｃ５７ＢＬ６マウスの多様な組織内における、ＡＨＡ１ ｍＲＮＡの用量依存的定量を例示する図である。 プロテオームアレイにおいて、６，０００を超える受容体を使用する、標的結合アッセイの結果を提示する図であり、この場合、データは、ＣＤ７１が、ＦＮ３ドメインの排他的結合標的であることを裏付ける。 ＣＤ７１センチリンコンジュゲートが、投与の２週間、４週間、および８週間後において、ｍＡｂコンジュゲートと比較して、遺伝子ノックダウンの維持を駆動することを裏付けるデータを提示する図である。 センチリンおよびセンチリンコンジュゲートが、ヒトＣＤ７１およびカニクイザルＣＤ７１に、強く結合することを裏付けるＥＬＩＳＡデータを提示する図である。 センチリン－ＡＨＡ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートが、カニクイザルのｉｎ ｖｉｖｏの筋内および心内におけるｍＲＮＡレベルを、効果的にノックダウンする能力を裏付けるデータを提示する図である。
内容が、そうでないことを、明らかに指示しない限りにおいて、本明細書および付属の特許請求の範囲で使用される、単数形の「ある（ａ）」「ある（ａｎ）」、および「その」は、複数形の指示対象を含む。したがって、例えば、「ある細胞」への言及は、２つまたはこれを超える細胞の組合せなどを含む。
「フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン」（ＦＮ３ドメイン）とは、フィブロネクチン、テネイシン、細胞内細胞骨格タンパク質、サイトカイン受容体、および原核生物酵素を含むタンパク質内において、高頻度で生じるドメインを指す（ＢｏｒｋおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８９：８９９０～８９９４、１９９２；Ｍｅｉｎｋｅら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７５：１９１０～１９１８、１９９３；Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２６５：１５６５９～１５６６５、１９９０）。例示的ＦＮ３ドメインは、ヒトテネイシンＣ内に存在する、１５の異なるＦＮ３ドメイン、ヒトフィブロネクチン（ＦＮ）内に存在する、１５の異なるＦＮ３ドメイン、および、例えば、米国特許第８，２７８，４１９号において記載されている、非天然の合成ＦＮ３ドメインである。個々のＦＮ３ドメインは、ドメイン番号およびタンパク質名、例えば、テネイシンの第３のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）、またはフィブロネクチンの第１０のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）により言及される。
「捕捉剤」という用語は、特定の種類の細胞に結合し、他の細胞からの、この細胞の分離を可能とする物質を指す。例示的捕捉剤は、磁気ビーズ、強磁性流体、封入試薬、特定の細胞型に結合する分子などである。
「試料」とは、対象から分離された、同様の体液、細胞、または組織のほか、対象内に存在する、体液、細胞、または組織の回収物を指す。例示的試料は、組織生検、細針吸引、手術切除組織、臓器培養物、細胞培養物、ならびに血液、血清および漿液、血漿、リンパ、尿、唾液、嚢胞液、涙液、糞便、痰、分泌性組織／臓器の粘液性分泌物、膣分泌物、腹水、胸水、心膜腔液、腹膜腔液、腹腔液、および他の体腔液、気管支洗浄により回収された体液、滑液、対象または生物学的供給源と接触した液体、例えば、細胞馴致培地または臓器馴致培地を含む細胞／臓器培養培地、および洗浄液などの体液である。
「～を置換すること」または「置換された」または「～を突然変異させること」または「突然変異させられた」とは、ポリペプチド配列内またはポリヌクレオチド配列内の１つまたはそれ以上のアミノ酸またはヌクレオチドを、この配列の変異体を作出するように変更するか、欠失させるか、または挿入することを指す。
「変異体」とは、１つまたはそれ以上の修飾、例えば、置換、挿入、または欠失により、参照ポリペプチドまたは参照ポリヌクレオチドと異なるポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す。
「～に特異的に結合する」または「～に特異的結合すること」とは、ＦＮ３ドメインが、約１×１０－６Ｍもしくはこれ未満、例えば、約１×１０－７Ｍもしくはこれ未満、約１×１０－８Ｍもしくはこれ未満、約１×１０－９Ｍもしくはこれ未満、約１×１０－１０Ｍもしくはこれ未満、約１×１０－１１Ｍもしくはこれ未満、約１×１０－１２Ｍもしくはこれ未満、または約１×１０－１３Ｍもしくはこれ未満の解離定数（ＫＤ）で、ＣＤ７１など、その標的に結合する能力を指す。代替的に、「～に特異的結合すること」とは、標準溶液ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＦＮ３ドメインが、その標的（例えば、ＣＤ７１）に、陰性対照の、少なくとも５倍の強さで結合する能力を指す。特異的結合はまた、本明細書で記載され、図３に示された、プロテオームアレイを使用しても裏付けられる。一部の実施形態では、陰性対照は、ＣＤ７１に結合しないＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、他の類縁の抗原、例えば、Ｍａｃａｃａ Ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）またはＰａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー）など、他の種（相同体）に由来する、同じ所定の抗原に対する交差反応性を有しうる。
「ライブラリー」とは、変異体のコレクションを指す。ライブラリーは、ポリペプチド変異体またはポリヌクレオチド変異体から構成される。
「安定性」とは、それが、その通常の機能活性のうちの少なくとも１つ、例えば、ＣＤ７１など、所定の抗原への結合を保持するように、分子が、生理学的条件下で、フォールディング状態を維持する能力を指す。
「ＣＤ７１」とは、配列番号２７４または２７５のアミノ酸配列を有する、ヒトＣＤ７１タンパク質を指す。一部の実施形態では、配列番号２７４は、全長ヒトＣＤ７１タンパク質である。一部の実施形態では、配列番号２７５は、ヒトＣＤ７１の細胞外ドメインである。
配列番号２７４＝ヒト成熟ＣＤ７１
ＭＴＫＥＹＱＤＬＱＨＬＤＮＥＥＳＤＨＨＱＬＲＫＧＰＰＰＰＱＰＬＬＱＲＬＣＳＧＰＲＬＬＬＬＳＬＧＬＳＬＬＬＬＶＶＶＣＶＩＧＳＱＮＳＱＬＱＥＥＬＲＧＬＲＥＴＦＳＮＦＴＡＳＴＥＡＱＶＫＧＬＳＴＱＧＧＮＶＧＲＫＭＫＳＬＥＳＱＬＥＫＱＱＫＤＬＳＥＤＨＳＳＬＬＬＨＶＫＱＦＶＳＤＬＲＳＬＳＣＱＭＡＡＬＱＧＮＧＳＥＲＴＣＣＰＶＮＷＶＥＨＥＲＳＣＹＷＦＳＲＳＧＫＡＷＡＤＡＤＮＹＣＲＬＥＤＡＨＬＶＶＶＴＳＷＥＥＱＫＦＶＱＨＨＩＧＰＶＮＴＷＭＧＬＨＤＱＮＧＰＷＫＷＶＤＧＴＤＹＥＴＧＦＫＮＷＲＰＥＱＰＤＤＷＹＧＨＧＬＧＧＧＥＤＣＡＨＦＴＤＤＧＲＷＮＤＤＶＣＱＲＰＹＲＷＶＣＥＴＥＬＤＫＡＳＱＥＰＰＬＬ
配列番号２７５＝ヒト成熟ＣＤ７１細胞外ドメイン
ＱＮＳＱＬＱＥＥＬＲＧＬＲＥＴＦＳＮＦＴＡＳＴＥＡＱＶＫＧＬＳＴＱＧＧＮＶＧＲＫＭＫＳＬＥＳＱＬＥＫＱＱＫＤＬＳＥＤＨＳＳＬＬＬＨＶＫＱＦＶＳＤＬＲＳＬＳＣＱＭＡＡＬＱＧＮＧＳＥＲＴＣＣＰＶＮＷＶＥＨＥＲＳＣＹＷＦＳＲＳＧＫＡＷＡＤＡＤＮＹＣＲＬＥＤＡＨＬＶＶＶＴＳＷＥＥＱＫＦＶＱＨＨＩＧＰＶＮＴＷＭＧＬＨＤＱＮＧＰＷＫＷＶＤＧＴＤＹＥＴＧＦＫＮＷＲＰＥＱＰＤＤＷＹＧＨＧＬＧＧＧＥＤＣＡＨＦＴＤＤＧＲＷＮＤＤＶＣＱＲＰＹＲＷＶＣＥＴＥＬＤＫＡＳＱＥＰＰＬＬ
「Ｔｅｎｃｏｎ」とは、配列番号２７６に示され、米国特許公開第２０１０／０２１６７０８号において記載されている配列を有する、合成フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを指す。
配列番号２７６＝元のＴｅｎｃｏｎ配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＥＦＴＴ
「がん細胞」または「腫瘍細胞」とは、新たな遺伝物質の取込みを必ずしも伴わない、自発性または誘導性の表現型変化を有する、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏにおける、がん性細胞、前がん性細胞、または形質転換細胞、および組織培養物中のこれらの細胞を指す。形質転換は、形質転換ウイルスによる感染、および新たなゲノム核酸の組込み、または外因性核酸の取込みから生じうるが、形質転換はまた、自発的に、または発がん物質への曝露後に生じる場合もあり、これにより、内因性遺伝子を突然変異させる場合もある。形質転換／がんは、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、およびｅｘ ｖｉｖｏなど、ヌードマウスなどの適切な動物宿主における、形状変化、細胞の不死化、増殖制御の異常、病巣形成、増殖、悪性腫瘍、腫瘍特異的マーカーレベル、浸潤性、腫瘍の増殖または抑制により例示される（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」（３版、１９９４））。
「樹状細胞」とは、適応免疫系において、重要な役割を果たす抗原提示細胞（ＡＰＣ）の種類を指す。樹状細胞の主要な機能は、抗原を提示することである。樹状細胞は、不活性Ｔリンパ球内、または休眠ナイーブＴリンパ球内において、一次免疫応答を誘導する能力を有する。
「免疫細胞」とは、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞）、好中球、または単球／マクロファージとして類別される、免疫系の細胞を指す。これらは、全ての種類の白血球である。
「ベクター」とは、生体系内の複製が可能であるか、またはこのような系の間で移動されるポリヌクレオチドを指す。ベクターのポリヌクレオチドは、典型的に、生体系内のこれらのポリヌクレオチドの複製または維持を容易とするように機能する、複製起点、ポリアデニル化シグナル、または選択マーカーなどのエレメントを含有する。このような生体系の例は、細胞、ウイルス、動物、植物、およびベクターを複製することが可能な、生物学的構成要素を利用する、再構成された生体系を含みうる。ベクターを含むポリヌクレオチドは、ＤＮＡの場合もあり、ＲＮＡ分子の場合もあり、これらのハイブリッド体の場合もある。
「発現ベクター」とは、生体系内、または発現ベクター内に存在するポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの翻訳を方向付けるように再構成された生体系内において利用されるベクターを指す。
「ポリヌクレオチド」とは、糖リン酸骨格または他の同等の共有結合的化学反応により、共有結合的に連結されたヌクレオチド鎖を含む合成分子を指す。ｃＤＮＡは、ポリヌクレオチドの典型例である。
「ポリペプチド」または「タンパク質」とは、ポリペプチドを形成するように、ペプチド結合により連結された、少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を指す。約５０アミノ酸未満の小型のポリペプチドは、「ペプチド」と称される。
「～価」とは、分子内の抗原に特異的な、一定数の結合性部位の存在を指す。このように、「一価」、「二価」、「四価」、および「六価」とは、それぞれ、分子内の抗原に特異的な、１つ、２つ、４つ、および６つの結合性部位の存在を指す。
「対象」は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」は、非ヒト霊長動物、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両性類、爬虫類など、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物を含む。注記される場合を除き、「患者」または「対象」という用語は、互換的に使用される。
「単離された」とは、組換え細胞など、分子がその中で産生される系の他の構成要素から、実質的に分離および／または精製された分子（ＦＮ３ドメインなどの合成ポリヌクレオチドまたはポリペプチドなど）のほか、少なくとも１つの精製工程または単離工程にかけられたタンパク質の均質集団を指す。「単離ＦＮ３ドメイン」とは、他の細胞素材および／または化学物質を実質的に含まないＦＮ３ドメインを指し、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の純度までなどの高純度まで単離されたＦＮ３ドメインを包含する。
組成物
一部の実施形態では、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むタンパク質が提供される。
一部の実施形態では、タンパク質は、配列番号２７３のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。配列番号２７３は、配列番号２８８、配列番号２８９、配列番号２９０、および配列番号２９１の配列に基づくコンセンサス配列である。
配列番号２７３の配列は、
ＭＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ１ＩＸ２ＹＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＧＥＡＩＸ８ＬＸ９ＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ１０ＶＸ１１ＩＸ１２Ｘ１３ＶＫＧＧＸ１４Ｘ１５ＳＸ１６ＰＬＸ１７ＡＸ１８ＦＴＴ
［式中、
Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、各々独立に、メチオニンまたはプロリン以外の任意のアミノ酸であり、
Ｘ１は、Ｄ、Ｆ、Ｙ、またはＨから選択され；
Ｘ２は、Ｙ、Ｇ、Ａ、またはＶから選択され；
Ｘ３は、Ｉ、Ｔ、Ｌ、Ａ、またはＨから選択され；
Ｘ４は、Ｓ、Ｙ、またはＰから選択され；
Ｘ５は、Ｙ、Ｇ、Ｑ、またはＲから選択され；
Ｘ６は、ＧまたはＰから選択され；
Ｘ７は、Ａ、Ｙ、Ｐ、Ｄ、またはＳから選択され；
Ｘ１０は、Ｗ、Ｎ、Ｓ、またはＥから選択され；
Ｘ１１は、Ｌ、Ｙ、またはＧから選択され；
Ｘ１２は、Ｄ、Ｑ、Ｈ、またはＶから選択され；
Ｘ１３は、ＧまたはＳから選択され；
Ｘ１４は、Ｒ、Ｇ、Ｆ、Ｌ、またはＤから選択され；
Ｘ１５は、Ｗ、Ｓ、Ｐ、またはＬから選択され；
Ｘ１６は、Ｔ、Ｖ、Ｍ、またはＳから選択される］
である。
一部の実施形態では：
Ｘ１は、Ｄ、Ｆ、Ｙ、またはＨから選択され；
Ｘ２は、Ｇ、Ａ、またはＶから選択され；
Ｘ３は、Ｔ、Ｌ、Ａ、またはＨから選択され；
Ｘ４は、ＹまたはＰから選択され；
Ｘ５は、Ｇ、Ｑ、またはＲから選択され；
Ｘ６は、ＧまたはＰから選択され；
Ｘ７は、Ｙ、Ｐ、Ｄ、またはＳから選択され；
Ｘ１０は、Ｗ、Ｎ、Ｓ、またはＥから選択され；
Ｘ１１は、Ｌ、Ｙ、またはＧから選択され；
Ｘ１２は、Ｑ、Ｈ、またはＶから選択され；
Ｘ１３は、ＧまたはＳから選択され；
Ｘ１４は、Ｇ、Ｆ、Ｌ、またはＤから選択され；
Ｘ１５は、Ｓ、Ｐ、またはＬから選択され；
Ｘ１６は、Ｖ、Ｍ、またはＳから選択される。
一部の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、およびＸ１６は、配列番号２８８の配列において示される通りである。一部の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、およびＸ１６は、配列番号２８９の配列において示される通りである。一部の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、およびＸ１６は、配列番号２９０の配列において示される通りである。一部の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、およびＸ１６は、配列番号２９１の配列において示される通りである。
一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンではない。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、アラニンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、アルギニンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、アスパラギンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、システインである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、グルタミンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、グルタミン酸である。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、グリシンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、ヒスチジンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、イソロイシンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、ロイシンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、リシンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、フェニルアラニンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、セリンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、トレオニンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、トリプトファンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、チロシンである。一部の実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、独立に、バリンである。
一部の実施形態では、配列は、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８の位置に対応する位置が、上記に明示されたアミノ酸残基以外の、任意のアミノ酸残基でありうることを除き、一部の実施形態では、Ｘ８が、Ｖではなく、Ｘ９が、Ｔではなく、Ｘ１７が、Ｓではなく、Ｘ１８が、Ｉではないことを除き、配列番号２８８の配列に示される通りに明示される。
一部の実施形態では、配列は、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８の位置に対応する位置が、上記に明示されたアミノ酸残基以外の、任意のアミノ酸残基でありうることを除き、一部の実施形態では、Ｘ８が、Ｖではなく、Ｘ９が、Ｔではなく、Ｘ１７が、Ｓではなく、Ｘ１８が、Ｉではないことを除き、配列番号２８９の配列に示される通りに明示される。
一部の実施形態では、配列は、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８の位置に対応する位置が、上記に明示されたアミノ酸残基以外の、任意のアミノ酸残基でありうることを除き、一部の実施形態では、Ｘ８が、Ｖではなく、Ｘ９が、Ｔではなく、Ｘ１７が、Ｓではなく、Ｘ１８が、Ｉではないことを除き、配列番号２９０の配列に示される通りに明示される。
一部の実施形態では、配列は、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８の位置に対応する位置が、上記に明示されたアミノ酸残基以外の、任意のアミノ酸残基でありうることを除き、一部の実施形態では、Ｘ８が、Ｖではなく、Ｘ９が、Ｔではなく、Ｘ１７が、Ｓではなく、Ｘ１８が、Ｉではないことを除き、配列番号２９１の配列に示される通りに明示される。
一部の実施形態では、タンパク質は、配列番号２７３の配列と、少なくとも６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。一部の実施形態では、タンパク質は、配列番号２７３の配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。一部の実施形態では、タンパク質は、配列番号２７３の配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。一部の実施形態では、タンパク質は、配列番号２７３の配列と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。一部の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドは、配列番号２７３と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一である。
同一性パーセントは、ＮＣＢＩウェブサイトを介して利用可能である、ＢｌａｓｔＰを使用して、２つ配列をアライメントするのに、デフォルトパラメータを使用して決定される。
本明細書で提示されるポリペプチドは、大型のポリペプチドの一部であることが可能であり、ドメインと称される。異なるポリペプチド内の、２つのドメインの間の相同性または同一性は、ポリペプチド全体に照らして、同様のドメインに基づく。例えば、ポリペプチドが、配列番号１を含むＦＮ３ドメインを含むポリペプチドを含み、前記ドメインが、ｓｃＦＶ抗体へとコンジュゲートされる場合、配列番号１と同様であるが、同一ではないドメインを有する、別のタンパク質は、ｓｃＦＶが、相同性を共有しない場合であってもなお、少なくとも９０％同一でありうる。したがって、同一性％は、ポリペプチドのドメインに基づく場合もあり、全長に基づく場合もある。同一性％を決定する方法は、本明細書で提示されるか、または当業者に公知である。
一部の実施形態では、ヒトＣＤ７１タンパク質（配列番号２７４または２７５）に結合するか、またはこれに特異的に結合する、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインが提供される。本明細書で提示される通り、ＦＮ３ドメインは、ＣＤ７１タンパク質に結合しうる。ドメインはまた、ＣＤ７１タンパク質にも特異的に結合しうることも、明示的に言明されないとしても、提示される。したがって、例えば、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインはまた、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインタンパク質も包含するであろう。これらの分子は、例えば、治療適用および診断適用ならびにイメージングにおいて使用される。一部の実施形態では、本明細書で開示される、ＦＮ３ドメインをコードするポリヌクレオチド、またはその相補性核酸、ベクター、宿主細胞、およびこれらを作製および使用する方法が提供される。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するか、またはこれに特異的に結合する、単離ＦＮ３ドメインが提供される。
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、リンカーにより接続された、２つのＦＮ３ドメインを含む。リンカーは、可撓性リンカーでありうる。リンカーは、本明細書で記載される、短鎖ペプチド配列などの短鎖ペプチド配列でありうる。例えば、リンカーは、Ｇ／Ｓリンカーなどでありうる。
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、本明細書で提示されるリンカーなどのリンカーにより接続された、２つのＦＮ３ドメインを含む。例示的リンカーは、（ＧＳ）２、（配列番号２７８）、（ＧＧＧＳ）２（配列番号２７９）、（ＧＧＧＧＳ）１－５（配列番号２８０）、（ＡＰ）１－２０ （配列番号３１１）；（ＡＰ）２（配列番号２８１）、（ＡＰ）５（配列番号２８２）、（ＡＰ）１０（配列番号２８３）、（ＡＰ）２０（配列番号２８４）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）５ＡＡＡ（配列番号２８５）、または（ＥＡＡＡＫ）１－５（配列番号３０７）を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、リンカーは、ＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（配列番号３００）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３０１）；ＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰ（配列番号３０２）；またはＥＡＡＡＫ（配列番号３０３）のアミノ酸配列を含むか、またはこれらのアミノ酸配列である。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９９のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、当業者により実施され、表面プラズモン共鳴法またはＫｉｎｅｘａ法により決定される通り、約１×１０－７Ｍ未満、例えば、約１×１０－８Ｍ未満、約１×１０－９Ｍ未満、約１×１０－１０Ｍ未満、約１×１０－１１Ｍ未満、約１×１０－１２Ｍ未満、または約１×１０－１３Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）で、ＣＤ７１に結合しうる。測定された、特定のＦＮ３ドメイン－抗原間相互作用のアフィニティーは、異なる条件（例えば、オスモル濃度、ｐＨ）下で測定された場合に変動しうる。したがって、アフィニティー、および他の抗原結合性パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の測定は、タンパク質足場および抗原の正規化溶液、ならびに本明細書で記載される緩衝液などの正規化緩衝液によりなされる。
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、ＣＤ７１に、標準溶液ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、陰性対照について得られるシグナルを、少なくとも５倍上回る強さで結合しうる。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するか、またはこれに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、分子のＮ末端へと連結された、イニシエーターメチオニン（Ｍｅｔ）を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するか、またはこれに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、ＦＮ３ドメインのＣ末端へと連結された、システイン（Ｃｙｓ）を含む。Ｎ末端Ｍｅｔおよび／またはＣ末端Ｃｙｓの付加は、半減期延長分子の発現および／またはコンジュゲーションを容易としうる。
ＦＮ３ドメインはまた、例えば、参照によってその全体を本明細書に組み入れる、米国特許第１０，１９６，４４６号において記載されたシステイン置換などのシステイン置換も含有しうる。略述すると、一部の実施形態では、本明細書で提示されるポリペプチドは、米国特許第１０，１９６，４４６号の、配列番号６または配列番号１に基づくＦＮ３ドメインの、残基６、８、１０、１１、１４、１５、１６、２０、３０、３４、３８、４０、４１、４５、４７、４８、５３、５４、５９、６０、６２、６４、７０、８８、８９、９０、９１、および９３からなる群から選択される位置、ならびに類縁のＦＮ３ドメイン内の、同等の位置において、少なくとも１つのシステイン置換を含みうる。一部の実施形態では、置換は、残基６にある。一部の実施形態では、置換は、残基８にある。一部の実施形態では、置換は、残基１０にある。一部の実施形態では、置換は、残基１１にある。一部の実施形態では、置換は、残基１４にある。一部の実施形態では、置換は、残基１５にある。一部の実施形態では、置換は、残基１６にある。一部の実施形態では、置換は、残基２０にある。一部の実施形態では、置換は、残基３０にある。一部の実施形態では、置換は、残基３４にある。一部の実施形態では、置換は、残基３８にある。一部の実施形態では、置換は、残基４０にある。一部の実施形態では、置換は、残基４１にある。一部の実施形態では、置換は、残基４５にある。一部の実施形態では、置換は、残基４７にある。一部の実施形態では、置換は、残基４８にある。一部の実施形態では、置換は、残基５３にある。一部の実施形態では、置換は、残基５４にある。一部の実施形態では、置換は、残基５９にある。一部の実施形態では、置換は、残基６０にある。一部の実施形態では、置換は、残基６２にある。一部の実施形態では、置換は、残基６４にある。一部の実施形態では、置換は、残基７０にある。一部の実施形態では、置換は、残基８８にある。一部の実施形態では、置換は、残基８９にある。一部の実施形態では、置換は、残基９０にある。一部の実施形態では、置換は、残基９１にある。一部の実施形態では、置換は、残基９３にある。
ドメイン内またはタンパク質内の位置におけるシステイン置換は、既存のアミノ酸残基の、システイン残基による置きかえを含む。システイン修飾の他の例は、例えば、参照によってその全体を本明細書に組み入れる、米国特許出願公開第２０１７０３６２３０１号において見出される。配列のアライメントは、例えば、ＮＣＢＩウェブサイトにおいて、デフォルトパラメータを使用するＢｌａｓｔＰを使用して実施される。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、細胞へと内部化される。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインの内部化は、検出用標識または治療剤の、細胞への送達を容易としうる。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインの内部化は、細胞傷害剤の、細胞への送達を容易としうる。細胞傷害剤は、治療剤として作用しうる。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインの内部化は、本明細書で開示される、任意の検出用標識、治療的、および／または細胞傷害剤の、細胞への送達を容易としうる。一部の実施形態では、細胞は、腫瘍細胞である。一部の実施形態では、細胞は、肝細胞である。一部の実施形態では、細胞は、筋細胞である。一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞である。一部の実施形態では、細胞は、樹状細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＮＫ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｂ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、中枢神経系細胞である。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、場合により、残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、または８６（残基の番号付けは、配列番号２７７に対応する）において、置換を有する、配列番号２７６のＴｅｎｃｏｎ配列、または配列番号２７７のＴｅｎｃｏｎ ２７配列に基づく。
配列番号２７６＝元のＴｅｎｃｏｎ配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＥＦＴＴ
配列番号２７７＝安定化Ｔｅｎｃｏｎ（Ｔｅｎｃｏｎ２７）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号３８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号４５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号４６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号４７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号４８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号５５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号５６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号５７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号６０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号６１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号６２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号６４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号６５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号６６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号６７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号６８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号７０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号７４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号７５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号７６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号７７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号７８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号７９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号８０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号８１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号８２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号８３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号８４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号８５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号８６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号８７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号８８のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号８９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号９０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号９１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号９２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号９３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号９４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号９５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号９６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号９７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号９８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号９９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１００のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１０２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１０３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１０９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１１０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１１１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１１２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１１６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１１７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１２１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１２２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１２３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１２６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１２７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１２８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１２９のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１３０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１３１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１３２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１３３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１３４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１３５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１３６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１３８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１３９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１４０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１４１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１４２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１４３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１４４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１４５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１４６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１４７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１４８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１４９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１５０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１５１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１５２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１５３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１５４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１５５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１５６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１５７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１５９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１６１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１６３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１６４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１６５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１６６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１６７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１６８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１６９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１７０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１７４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１７５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１７６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１７７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１７９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１８０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１８１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１８３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１８４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１８５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１８６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１８７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１８８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１８９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１９０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１９１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１９２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１９３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１９４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１９６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１９８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１９９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２００のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２０１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２０２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２０３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２０４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２０５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２０６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２０７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２０８のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２０９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２１０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２１１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２１２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２１３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２１４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２１５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２１６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２１７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２１９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２２１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２２２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２２３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２２４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２２５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２２６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２２７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２２８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２２９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２３０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２３１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２３２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２３３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２３４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２３５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２３６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２３７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２３８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２３９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２４０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２４１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２４２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２４３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２４４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２４５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２４６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２４７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２４８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２４９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２５０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２５１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２５２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２５３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２５４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２５５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２５６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２５７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２５８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２５９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２６０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２６１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２６２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２６３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２６４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２６５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２６６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２６７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２６８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２６９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２７０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号２７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号３０４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号３０５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号３０６のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、トランスフェリンの、ＣＤ７１への結合と競合しない、ＣＤ７１上の部位において、ヒトＣＤ７１に結合する。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６の配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインは、分子のＮ末端へと連結された、イニシエーターメチオニン（Ｍｅｔ）を含む。
本開示のＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインのコンジュゲート
一部の実施形態では、異種分子（複数可）へとコンジュゲートされた、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインが提供される。
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、オリゴヌクレオチドへとコンジュゲートされる。例えば、オリゴヌクレオチドは、遺伝子またはｍＲＮＡ転写物の発現を阻害するために使用される。オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどでありうる。したがって、一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、ｓｉＲＮＡ分子、アンチセンス分子、ＲＮＡ分子、またはＤＮＡ分子などであるがこれらに限定されないポリヌクレオチドへとコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、本明細書で記載されるリンカーを使用して、ｓｉＲＮＡ分子へとコンジュゲートされる。一部の実施形態では、リンカーは、化学リンカーである。
一部の実施形態では、核酸分子へと連結された、ＦＮ３ドメインを含むポリペプチドなどのポリペプチドを含む組成物が提供される。核酸分子は、例えば、ｓｉＲＮＡ分子でありうる。
したがって、一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ（ｄｓＲＮＡ）剤である。ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤の各鎖は、１２～４０ヌクレオチドの長さの範囲でありうる。例えば、各鎖は、１４～４０ヌクレオチドの長さ、１７～３７ヌクレオチドの長さ、２５～３７ヌクレオチドの長さ、２７～３０ヌクレオチドの長さ、１７～２３ヌクレオチドの長さ、１７～２１ヌクレオチドの長さ、１７～１９ヌクレオチドの長さ、１９～２５ヌクレオチドの長さ、１９～２３ヌクレオチドの長さ、１９～２１ヌクレオチドの長さ、２１～２５ヌクレオチドの長さ、または２１～２３ヌクレオチドの長さでありうる。
一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、典型的に、二重鎖ｄｓＲＮＡを形成する。ｄｓＲＮＡ剤の二重鎖領域は、１２～４０ヌクレオチド対の長さでありうる。例えば、二重鎖領域は、１４～４０ヌクレオチド対の長さ、１７～３０ヌクレオチド対の長さ、２５～３５ヌクレオチドの長さ、２７～３５ヌクレオチド対の長さ、１７～２３ヌクレオチド対の長さ、１７～２１ヌクレオチド対の長さ、１７～１９ヌクレオチド対の長さ、１９～２５ヌクレオチド対の長さ、１９～２３ヌクレオチド対の長さ、１９～２１ヌクレオチド対の長さ、２１～２５ヌクレオチド対の長さ、または２１～２３ヌクレオチド対の長さでありうる。別の例では、二重鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、および２７ヌクレオチド対の長さから選択される。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、鎖の３’末端もしくは５’末端またはこれらの両末端において、ｄｓＲＮＡ剤の、１つまたはそれ以上の突出領域および／またはキャッピング基を含む。突出は、１～１０ヌクレオチドの長さ、１～６ヌクレオチドの長さ、例えば、２～６ヌクレオチドの長さ、１～５ヌクレオチドの長さ、２～５ヌクレオチドの長さ、１～４ヌクレオチドの長さ、２～４ヌクレオチドの長さ、１～３ヌクレオチドの長さ、２～３ヌクレオチドの長さ、または１～２ヌクレオチドの長さでありうる。突出は、一方の鎖が、他方の鎖より長いことの結果である場合もあり、同じ長さの２つの鎖が、ずらされていることの結果である場合もある。突出は、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成する場合もあり、ターゲティングされる遺伝子配列と相補性である場合もあり、他の配列である場合もある。第１の鎖と、第２の鎖とはまた、例えば、ヘアピンを形成するように、さらなる塩基により接合される場合もあり、他の非塩基リンカーにより接合される場合もある。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤内の突出領域内のヌクレオチドは、各々、独立に、２’－Ｆ／２’－Ｏ－メチルチミジン（Ｔ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、およびこれらの任意の組合せなどの２’－糖修飾を含むがこれらに限定されない、修飾ヌクレオチドまたは非修飾ヌクレオチドでありうる。例えば、ＴＴは、いずれかの鎖上のいずれかの末端について、突出配列でありうる。突出は、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成する場合もあり、ターゲティングされる遺伝子配列と相補性である場合もあり、他の配列である場合もある。
ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖、またはこれらの両方の鎖における、５’突出または３’突出は、リン酸化される場合がある。一部の実施形態では、突出領域は、２つのヌクレオチドの間に、ホスホロチオエートを有する、２つのヌクレオチドを含有し、この場合、２つのヌクレオチドは、同じ場合もあり、異なる場合もある。一実施形態では、突出は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはこれらの両方の鎖の３’末端に存在する。一実施形態では、この３’突出は、アンチセンス鎖内に存在する。一実施形態では、この３’突出は、センス鎖内に存在する。
ｄｓＲＮＡ剤は、その全体的安定性に影響を及ぼさずに、ｄｓＲＮＡの干渉活性を強化しうる、単一の突出だけを含みうる。例えば、一本鎖突出は、センス鎖の３’末端に、または、代替的に、アンチセンス鎖の３’末端に配置される。ｄｓＲＮＡはまた、アンチセンス鎖の５’末端（またはセンス鎖の３’末端）に配置された平滑末端を有する場合もあり、この逆の場合もある。一般に、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端において、ヌクレオチド突出を有し、５’末端は、平滑末端である。理論に束縛されずに述べると、アンチセンス鎖の５’末端における非対称平滑末端およびアンチセンス鎖の３’末端突出は、ＲＩＳＣへの、ガイド鎖のローディング過程に好適である。例えば、単一突出は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長を含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤はまた、ｄｓＲＮＡ二重鎖の両末端において、２つの平滑末端を有する場合もある。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖内およびアンチセンス鎖剤内のあらゆるヌクレオチドは、修飾される場合がある。各ヌクレオチドは、非連結型リン酸酸素の一方もしくは両方、および／または連結型リン酸酸素のうちの１つもしくはそれ以上の、１つまたはそれ以上の変更を含みうる、同じであるか、または異なる修飾；リボース糖の構成要素、例えば、リボース糖上の２つのヒドロキシルの変更；リン酸部分の、「脱リン酸化」リンカーによる全面的置きかえ；天然に存在する塩基の修飾または置きかえ；ならびにリボース－リン酸骨格の置きかえまたは修飾により修飾される。
一部の実施形態では、３’突出内または５’突出内の塩基の全部または一部は、例えば、本明細書で記載される修飾により修飾される。修飾は、例えば、リボース糖の２’位における、当技術分野で公知の修飾による修飾の使用、例えば、ヌクレオ塩基のリボ糖に代えた、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾デオキシリボヌクレオチド、または２’－Ｏ－メチル修飾デオキシリボヌクレオチドの使用、およびリン酸基内の修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾を含みうる。突出は、標的配列と相同である必要はない。
一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、または２’－フルオロにより、独立に修飾される。鎖は、１つを超える修飾を含有しうる。一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロにより、独立に修飾される。
一部の実施形態では、少なくとも２つの異なる修飾は、典型的に、センス鎖上およびアンチセンス鎖上に存在する。これらの２つの修飾は、２’－デオキシ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾、もしくは２’－フルオロ修飾、非環状ヌクレオチド、または他の修飾でありうる。
一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、各々、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、または２’－デオキシから選択される、異なる形で修飾された、２つのヌクレオチドを含む。
ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸によるヌクレオチド間連結をさらに含みうる。ホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸によるヌクレオチド間連結の修飾は、鎖の任意の位置における、センス鎖もしくはアンチセンス鎖、またはこれらの両方の、任意のヌクレオチド上で生じうる。例えば、ヌクレオチド間連結の修飾は、センス鎖上および／またはアンチセンス鎖上の、あらゆるヌクレオチド上で生じる場合もあり；各ヌクレオチド間連結修飾は、センス鎖上またはアンチセンス鎖上において、交互パターンで生じる場合もあり；センス鎖またはアンチセンス鎖は、いずれもが、ヌクレオチド間連結の修飾を、交互パターンで含む。センス鎖上のヌクレオチド間連結の修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じ場合もあり、異なる場合もあり、センス鎖上のヌクレオチド間連結の修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上のヌクレオチド間連結の修飾の交互パターンと比べて、シフトを有する場合もある。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、突出領域内に、ホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸によるヌクレオチド間連結の修飾を含む。例えば、突出領域は、２つのヌクレオチド間に、ホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸によるヌクレオチド間連結を有する、２つのヌクレオチドを含む。ヌクレオチド間連結修飾はまた、二重鎖領域内の末端対合ヌクレオチドで、突出ヌクレオチドを連結するようにも施される。例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、または全ての突出ヌクレオチドは、ホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸によるヌクレオチド間連結を介して連結されるが、場合により、突出ヌクレオチドを、突出ヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドと連結する、さらなるホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸によるヌクレオチド間連結も存在しうる。例えば、３つの末端ヌクレオチドの間に、少なくとも２つのホスホロチオエートによるヌクレオチド間連結が存在する場合があり、この場合、３つのヌクレオチドのうちの２つは、突出ヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドは、突出ヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。一部の実施形態では、これらの３つの末端ヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端にある場合がある。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ組成物は、参照によって本明細書に組み入れる、米国特許第７，４２７，６７２号に記載された、修飾塩基またはヌクレオシド類似体により連結される。
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＦＮ３ドメインを、センス鎖へと連結するのに使用されるリンカーは、Ｉの式：
Figure 2024517610000048
 を有する。
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＦＮ３ドメインを、アンチセンス鎖へと連結するのに使用されるリンカーは、ＩＩの式：
Figure 2024517610000049
 ［式中、ＸＡＳは、アンチセンス鎖を表し、Ｆ１は、本明細書で記載されるＦＮ３ドメインを表す］
を有する。
一部の実施形態では、リンカーは、以下：
Figure 2024517610000050
 の通りに例示されるＦ１上に存在するシステイン残基を介して、Ｆ１へと共有結合的に接合される。
一部の実施形態では、連結されたｄｓＲＮＡと、本明細書で記載されるＦＮ３ドメインとは、ＩＩＩの式：
Figure 2024517610000051
 ［式中、Ｃ１は、同じであるか、または異なる、本明細書で記載されるＦＮ３ドメインを表す］
を有する。
一部の実施形態では、Ａ１－Ｂ１は：
Figure 2024517610000052
 ［式中、Ｆ１は、少なくとも１つのＦＮ３ドメインを含むポリペプチドであり、Ｌ１へとコンジュゲートされ；Ｌ１は、ＸＳへと連結され、ＸＳは、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖である５’－３’オリゴヌクレオチドであり；ＸＡＳは、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖である３’－５’オリゴヌクレオチドであり；ＸＳおよびＸＡＳは、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を形成する］
の式を有する。
さらなるリンカーの構造は、以下の通りである：
ｍａｌ－Ｃ２Ｈ４Ｃ（Ｏ）（ＮＨ）－（ＣＨ２）６－は、
Figure 2024517610000053
 であり；
（Ｍａｌ－（ＰＥＧ）１２）（ＮＨ）ＣＨ２）６）は、
Figure 2024517610000054
 であり；
－（ＣＨ２）６－である、アミノヘキシルリンカーともまた称される、Ｍａｌ－ＮＨ－（ＣＨ２）６－は、
Figure 2024517610000055
 であり；
Ｖａｌ－Ｃｉｔ Ｐａｂａは、構造：
Figure 2024517610000056
 を有する。
本明細書で記載される通り、一部の実施形態では、核酸分子は、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の５’末端において、リンカーを含むように修飾される。一部の実施形態では、核酸分子は、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端において、ビニルホスホン酸を含むように修飾される。一部の実施形態では、核酸分子は、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の３’末端において、リンカーを含むように修飾される。一部の実施形態では、核酸分子は、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端において、ビニルホスホン酸を含むように修飾される。リンカーは、ｄｓＲＮＡを、ＦＮ３ドメインへと連結するのに使用される。リンカーは、例えば、天然で存在するか、または本明細書で記載され、例えば、参照によってその全体を本明細書に組み入れる、米国特許第１０，１９６，４４６号において記載された通りに置換された、ＦＮ３ドメイン上のシステイン残基に、共有結合的に接合しうる。
一部の実施形態では、ペプチドは、例えば、細胞特異的ターゲティングのために使用される脂質ナノ粒子へとコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、タンパク質は、ＣＤ７１または別のタンパク質を、タンパク質分解のためにターゲティングする結合性部分へとコンジュゲートされる。例えば、タンパク質は、ＰＲＯＴＡＣＳ（Ｅ３ユビキチンリガーゼのための結合性部分）へとコンジュゲートされ、これにより、タンパク質を、Ｅ３リガーゼへと送達する。これらは、グリシン－セリンリンカーなどのリンカーを介して連結される。
ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインはまた、ＣＤ７１以外の、異なる標的に結合する、別のＦＮ３ドメインへもコンジュゲートされるか、または連結される。これは、ペプチドが、ＣＤ７１と、別の、例えば、タンパク質とに結合するように、多特異的（例えば、二特異的、三特異的など）となることを可能とするであろう。一部の実施形態では、ＣＤ７１ ＦＮ３結合性ドメインは、腫瘍細胞により発現される抗原（腫瘍抗原）に結合する、別のＦＮ３ドメインへと連結される。
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、二価ＦＮ３ドメインを形成するように、リンカーにより、一体に連結される。リンカーは、可撓性リンカーでありうる。一部の実施形態では、リンカーは、Ｇ／Ｓリンカーである。一部の実施形態では、リンカーは、１つ、２つ、３つ、または４つのＧ／Ｓリピートを有する。Ｇ／Ｓリピート単位は、４つのグリシンに続くセリン、例えば、ＧＧＧＧＳ（配列番号３０８）である。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、本明細書で提示されるリンカーなどのリンカーにより接続された、２つのＦＮ３ドメインを含む。例示的リンカーは、（ＧＳ）２、（配列番号２７８）、（ＧＧＧＳ）２（配列番号２７９）、（ＧＧＧＧＳ）１－５（配列番号２８０）、（ＡＰ）１－２０ （配列番号３１１）；（ＡＰ）２（配列番号２８１）、（ＡＰ）５（配列番号２８２）、（ＡＰ）１０（配列番号２８３）、（ＡＰ）２０（配列番号２８４）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）５ＡＡＡ（配列番号２８５）、または（ＥＡＡＡＫ）１－５（配列番号３０７）を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、リンカーは、ＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（配列番号３００）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３０１）；ＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰ（配列番号３０２）；またはＥＡＡＡＫ（配列番号３０３）のアミノ酸配列を含むか、またはこれらのアミノ酸配列である。
一部の実施形態では、異種分子は、検出用標識、または細胞傷害剤などであるがこれらに限定されない治療剤である。
一部の実施形態では、検出用標識へとコンジュゲートされた、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインが提供される。本明細書では、検出用標識の非限定例が提示される。
一部の実施形態では、治療剤へとコンジュゲートされた、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインが提供される。本明細書では、細胞傷害剤などであるがこれらに限定されない、治療剤の非限定例が提示される。
検出用標識へとコンジュゲートされた、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、腫瘍組織などの試料上における、ＣＤ７１の発現について査定するのに使用される。検出用標識へとコンジュゲートされた、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、試料である、血液、免疫細胞、または樹状細胞上における、ＣＤ７１の発現について査定するのに使用される。
検出用標識は、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインへとコンジュゲートされた場合に、分光光度法、光化学法、生化学法、免疫化学法、または他の化学的方法を介して、ＣＤ７１を検出可能とする組成物を含む。
例示的検出用標識は、放射性同位体、磁気ビーズ、金属製ビーズ、コロイド状粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、一般に、ＥＬＩＳＡにおいて使用される）、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、発光分子、化学発光分子、フルオロ色素、フルオロフォア、蛍光消光剤、有色分子、放射性同位体、シンチレーション剤、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体またはその断片、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、重金属、酵素、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、電子供与体／受容体、アクリジニウムエステル、および比色基質を含むがこれらに限定されない。
検出用標識は、放射性同位体である場合などに、シグナルを、自発的に発しうる。一部の実施形態では、検出用標識は、磁界もしくは電界、または電磁界など、外部刺激により刺激される結果として、シグナルを発する。
例示的放射性同位体は、γ粒子放出放射性同位体、オージェ電子放出放射性同位体、β粒子放出放射性同位体、アルファ粒子放出放射性同位体、または陽電子放出放射性同位体でありうる。例示的放射性同位体は、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、１９Ｆ、５５Ｃｏ、５７Ｃｏ、６０Ｃｏ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９０Ｓｒ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、１１５Ｉｎ、１２３１、１２４１、１２５Ｉ、１３１１、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、２２６Ｒａ、２２５Ａｃおよび２２７Ａｃを含む。
例示的金属原子は、カルシウム原子、スカンジウム原子、チタン原子、バナジウム原子、クロム原子、マンガン原子、鉄原子、コバルト原子、ニッケル原子、銅原子、亜鉛原子、ガリウム原子、ゲルマニウム原子、ヒ素原子、セレニウム原子、臭素原子、クリプトン原子、ルビジウム原子、ストロンチウム原子、イットリウム原子、ジルコニウム原子、ニオビウム原子、モリブデン原子、テクネシウム原子、ルテニウム原子、ロジウム原子、パラジウム原子、銀原子、カドミウム原子、インジウム原子、スズ原子、アンチモニー原子、テルル原子、ヨウ素原子、キセノン原子、セシウム原子、バリウム原子、ランタン原子、ハフニウム原子、タンタル原子、タングステン原子、レニウム原子、オスミウム原子、イリジウム原子、白金原子、金原子、水銀原子、タリウム原子、鉛原子、ビスマス原子、フランシウム原子、ラジウム原子、アクチニウム原子、セリウム原子、プラセオジウム原子、ネオジム原子、プロメチウム原子、サマリウム原子、ユーロピウム原子、ガドリニウム原子、テルビウム原子、ジスプロシウム原子、ホルミウム原子、エルビウム原子、ツリウム原子、イッテルビウム原子、ルテチウム原子、トリウム原子、プロトアクチニウム原子、ウラニウム原子、ネプツニウム原子、プルトニウム原子、アメリシウム原子、キュリウム原子、バークリウム原子、カリフォルニウム原子、アインスタイニウム原子、フェルミウム原子、メンデレビウム原子、ノーベリウム原子、またはローレンシウム原子など、原子数が２０より大きい金属である。
一部の実施形態では、金属原子は、原子数が２０より大きい、アルカリ土類金属でありうる。
一部の実施形態では、金属原子は、ランタニドでありうる。
一部の実施形態では、金属原子は、アクチニドでありうる。
一部の実施形態では、金属原子は、遷移金属でありうる。
一部の実施形態では、金属原子は、卑金属でありうる。
一部の実施形態では、金属原子は、金原子、ビスマス原子、タンタル原子、およびガドリニウム原子でありうる。
一部の実施形態では、金属原子は、原子数が５３（すなわち、ヨウ素）～８３（すなわち、ビスマス）である金属でありうる。
一部の実施形態では、金属原子は、磁気共鳴イメージングに適する原子でありうる。
金属原子は、Ｂａ２＋、Ｂｉ３＋、Ｃｓ＋、Ｃａ２＋、Ｃｒ２＋、Ｃｒ３＋、Ｃｒ６＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋、Ｃｕ３＋、Ｇａ３＋、Ｇｄ３＋、Ａｕ＋、Ａｕ３＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｆ３＋、Ｐｂ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｎ３＋、Ｍｎ４＋、Ｍｎ７＋、Ｈｇ２＋、Ｎｉ２＋、Ｎｉ３＋、Ａｇ＋、Ｓｒ２＋、Ｓｎ２＋、Ｓｎ４＋、およびＺｎ２＋など、酸化状態が、＋１、＋２、または＋３の形態にある、金属イオンでありうる。金属原子は、酸化鉄、酸化マンガン、または酸化ガドリニウムなどの金属酸化物を含みうる。
適切な色素は、例えば、５（６）－カルボキシフルオレセイン、ＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤマレイミド、またはＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ、ポリピリジルルテニウム色素など、任意の市販の色素を含む。
適切なフルオロフォアは、フルオレセインイソチオシアン酸（ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオセミカルバジド、ローダミン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＣｙＤｙｅ（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｓ（例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ５９４；Ａｌｅｘａ６４７）、近赤外（ＮＩＲ）（７００～９００ｎｍ）蛍光色素、ならびにカルボシアニン色素およびアミノスチリル色素である。
検出用標識へとコンジュゲートされた、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、例えば、腫瘍の分布、腫瘍細胞の存在、および／または腫瘍の再発についての診断について査定するイメージング剤として使用される。検出用標識へとコンジュゲートされた、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、例えば、樹状細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞免疫細胞、筋細胞、および中枢神経系細胞を含むがこれらに限定されない、体内の様々な組織内における、ＣＤ７１陽性細胞の存在について査定するイメージング剤として使用される。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、細胞傷害剤などであるがこれらに限定されない治療剤へとコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、治療剤は、化学療法剤、薬物、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌由来、真菌由来、植物由来、もしくは動物由来の酵素活性毒素、またはこれらの断片）、または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）である。
治療剤へとコンジュゲートされた、本明細書で開示されるＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、ＣＤ７１発現細胞（例えば、腫瘍細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞免疫細胞、中枢神経系細胞）への、治療剤のターゲティング送達、およびこれらにおける細胞内蓄積において使用される。いかなる特定の理論にも束縛されずに述べると、この種類の送達は、これらの非コンジュゲート剤の全身投与が、正常細胞へと、許容不可能なレベルの毒性を結果としてもたらしうる場合に有用でありうる。
一部の実施形態では、治療剤は、チューブリンへの結合、ＤＮＡへの結合、トポイソメラーゼの阻害、ＤＮＡ架橋、キレート化、スプライセオソームの阻害、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）の阻害、およびヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の阻害などであるがこれらに限定されない機構により、それらの細胞傷害性効果、および／または細胞増殖抑制性効果を誘発しうる。
一部の実施形態では、治療剤は、スプライセオソーム阻害剤、ＮＡＭＰＴ阻害剤、またはＨＤＡＣ阻害剤である。一部の実施形態では、薬剤は、免疫系アゴニスト、例えば、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＲＩＧ－Ｉ（ｄｓＲＮＡ）、およびＳＴＩＮＧ（ＣｐＧ）アゴニストである。一部の実施形態では、薬剤は、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、ビンデシン、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシン、ゲルダナマイシン、メイタンシノイド、またはカリケアミシンである。
一部の実施形態では、治療剤は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに由来する）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ－サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、またはトリコテセンなどの酵素活性毒素である。
一部の実施形態では、治療剤は、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、または１８６Ｒｅなどの放射性核種である。
一部の実施形態では、治療剤は、ドラスタチンまたはドロスタチンペプチドの類似体および誘導体、アウリスタチンまたはモノメチルアウリスタチンフェニルアラニンである。例示的分子は、米国特許第５，６３５，４８３号および同第５，７８０，５８８号において開示されている。ドラスタチンおよびアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解、ならびに核分裂および細胞分裂に干渉し（Ｗｏｙｋｅら（２００１）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４５（１２）：３５８０～３５８４）、抗がん活性および抗真菌活性を及ぼすことが示されている。ドラスタチンまたはアウリスタチンによる薬物部分は、ペプチド薬物部分のＮ（アミノ）末端またはＣ（カルボキシル）末端を介して（ＷＯ０２／０８８１７２）、またはＦＮ３ドメインへと操作された、任意のシステインを介して、ＦＮ３ドメインへと接合される。
一部の実施形態では、治療剤は、例えば、アウリスタチン、カンプトテシン、デュオカルマイシン、エトポシド、メイタンシンおよびメイタンシノイド、タキサン、ベンゾジアゼピンもしくはベンゾジアゼピンを含有する薬物（例えば、ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、インドリノベンゾジアゼピン、およびオキサゾリジノベンゾジアゼピン）、またはビンカアルカロイドでありうる。
ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、公知の方法を使用して、検出用標識へとコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、検出用標識は、キレート剤と複合体化させられる。
一部の実施形態では、検出用標識は、上記で記載されたリンカーを介して、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインへとコンジュゲートされる。
検出用標識、治療用化合物、または細胞傷害性化合物は、公知の方法を使用して、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインへと、直接的に連結される場合もあり、間接的に連結される場合もある。当技術分野では、適切なリンカーが公知であり例えば、補欠分子族、非フェノール性リンカー（Ｎ－スクシンイミジルベンゾエート；ドデカボレートの誘導体）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）の誘導体、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体、Ｓ－２－（４－イソチオシアナトベンジル）－１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）の誘導体、および１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－１，４，８，１１－四酢酸（ＴＥＴＡ）の誘導体など、大環状剤および非環状キレート剤の両方のキレート化部分、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジポイミド酸ジメチルＨＣｌなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス－アジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミンなど）、ジイソシアン酸（トルエン２，６－ジイソシアン酸など）、および活性ビスフッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンなど）、および他のキレート化部分を含む。適切なペプチドリンカーは、周知である。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、腎クリアランスを介して、血液から除去される。
Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づくライブラリーからの、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインの単離
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号２７６）は、ヒトテネイシンＣに由来する、１５のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列からデザインされた、天然に存在しないフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである（Ｊａｃｏｂｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、２５：１０７～１１７、２０１２；米国特許公開第２０１０／０２１６７０８号）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、ＦＮ３ドメインに特徴的である、７つのベータ鎖である、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧと称されるベータ鎖を接続する、６つの表面露出ループである、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループと称されるループを示す（ＢｏｒｋおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８９：８９９０～８９９２、１９９２；米国特許第６，６７３，９０１号）。これらのループ、または各ループ内で選択された残基は、ＣＤ７１に結合する新規の分子を選択するのに使用される、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリーを構築するためにランダム化される。表１は、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号２７６）内の、各ループおよび各ベータ鎖の位置および配列を示す。
Figure 2024517610000057
こうして、下記で記載されるライブラリーである、ＴＣＬ１またはＴＣＬ２など、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づきデザインされたライブラリーは、ランダム化ループＦＧを有する場合もあり、ランダム化ループＢＣおよびランダム化ループＦＧを有する場合もある。ＴｅｎｃｏｎループＢＣは、７アミノ酸長であり、こうして、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つのアミノ酸が、ループＢＣにおいて多様化され、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づきデザインされたライブラリー内でランダム化される。ＴｅｎｃｏｎループＦＧは、７アミノ酸長であり、こうして、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つのアミノ酸が、ループＦＧにおいて多様化され、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づきデザインされたライブラリー内でランダム化される。Ｔｅｎｃｏｎライブラリー内のループにおける、さらなる多様性は、ループにおける残基の挿入および／または欠失により達成される。例えば、ループＦＧおよび／またはＢＣは、１～２２アミノ酸延長される場合もあり、１～３アミノ酸短縮される場合もある。Ｔｅｎｃｏｎ内のループＦＧが、７アミノ酸長であるのに対し、抗体重鎖内の対応するループは、４～２８残基の範囲である。最大の多様性をもたらすために、ループＦＧは、配列のほか、抗体のＣＤＲ３の、４～２８残基の長さの範囲に対応するように、長さにおいても多様化される。例えば、ループＦＧは、ループを、さらに１、２、３、４、または５アミノ酸延長することより、長さにおいてもさらに多様化される。
Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づきデザインされたライブラリーはまた、ＦＮ３ドメイン側に形成される、代替的なランダム化表面も有する場合があり、２つまたはこれを超えるベータ鎖と、少なくとも１つのループとを含みうる。１つのこのような代替的表面は、Ｃベータ鎖およびＦベータ鎖内、ならびにループＣＤ内およびＦＧ内（表面Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ内）のアミノ酸により形成される。代替的Ｔｅｎｃｏｎ表面であるＣ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧに基づくライブラリーデザインについては、米国特許公開第２０１３／０２２６８３４号において記載されている。Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づきデザインされたライブラリーはまた、残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、または８６（残基の番号付けは、配列番号２７６に対応する）において置換を有し、熱安定性の改善を提示するＴｅｎｃｏｎ変異体などのＴｅｎｃｏｎ変異体に基づきデザインされたライブラリーも含む。例示的Ｔｅｎｃｏｎ変異体については、米国特許公開第２０１１／０２７４６２３号において記載されており、配列番号２７６のＴｅｎｃｏｎと比較した場合に、置換である、Ｅ１１Ｒ、Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、およびＥ８６Ｉを有する、Ｔｅｎｃｏｎ２７（配列番号２７７）を含む。
Ｔｅｎｃｏｎ、および他のＦＮ３配列ベースのライブラリーは、アミノ酸のランダムセットまたは規定セットを使用して選び出された残基位置においてランダム化される。例えば、ランダム置換を有する、ライブラリー内の変異体は、２０の天然に存在するアミノ酸全てをコードする、ＮＮＫコドンを使用して作出される。他の多様化スキームでは、アミノ酸である、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、およびＣｙｓをコードするのに、ＤＶＫコドンが使用される。代替的に、ＮＮＳコドンは、２０のアミノ酸残基全てをもたらし、同時に、終止コドンの頻度を低減するのに使用される。例えば、Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ（登録商標）技術（ｈｔｔｐ：＿／／ｗｗｗ＿ｓｌｏｎｉｎｇ＿ｃｏｍ）を使用して、多様化される位置において、アミノ酸分布のバイアスを伴うＦＮ３ドメインのライブラリーが合成される。この技術は、数千に及ぶ遺伝子合成過程に十分である、ユニバーサルの構成要素として作用する、あらかじめ作製された二本鎖トリプレットのライブラリーを使用する。トリプレットライブラリーは、任意の所望のＤＮＡ分子を構築するのに必要である、全ての可能な配列の組合せを表す。コドンの表記は、周知のＩＵＢコードに従う。
ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、足場タンパク質をコードするＤＮＡ断片を、ＲｅｐＡをコードするＤＮＡ断片へとライゲーションして、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける翻訳の後で形成される、タンパク質－ＤＮＡ複合体であって、各タンパク質が、これをコードするＤＮＡと安定的に会合したタンパク質－ＤＮＡ複合体のプールを作出し（米国特許第７，８４２，４７６号；Ｏｄｅｇｒｉｐら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ、１０１、２８０６～２８１０、２００４）、当技術分野で公知であり、実施例において記載される、任意の方法により、ライブラリーを、ＰＳＭＡへの特異的結合についてアッセイするＣＩＳディスプレイを使用して、ＴｅｎｃｏｎライブラリーなどのＦＮ３ライブラリーを作製することにより単離される。使用される、周知の例示的方法は、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、ならびに競合的アッセイおよび非競合的アッセイである（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。同定されたＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、それらのＣＤ７１への結合、ＣＤ７１の活性のモジュレーション、内部化、安定性、および他の所望の特徴について、さらに特徴づけられる。
ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、本明細書で提示される方法を使用して、任意のＦＮ３ドメインを、ライブラリーを作出するための鋳型として使用し、ライブラリーを、ＣＤ７１に特異的に結合する分子についてスクリーニングして作出される。使用される、例示的ＦＮ３ドメインは、テネイシンＣの第３のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）、フィブコン、およびフィブロネクチンの第１０のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）である。こうして、ＰＣＴ出願第ＷＯ２０１０／０５１２７４号、同第ＷＯ２０１１／１３７３１９号、および同第ＷＯ２０１３／０４９２７５号が、それらの全体を本明細書に組み入れる。ライブラリーをベクターへとクローニングするか、またはライブラリーの二本鎖ｃＤＮＡカセットを合成して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ライブラリーを発現させるか、またはこれを翻訳するのに、標準的なクローニング法および発現法が使用される。例えば、リボソームディスプレイ（ＨａｎｅｓおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９４、４９３７～４９４２、１９９７）、ｍＲＮＡディスプレイ（ＲｏｂｅｒｔｓおよびＳｚｏｓｔａｋ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９４、１２２９７～１２３０２、１９９７）、または他の無細胞系（米国特許第５，６４３，７６８号）が使用される。ＦＮ３ドメイン変異体のライブラリーは、例えば、任意の適切なバクテリオファージの表面上に提示される融合タンパク質として発現される。融合ポリペプチドを、バクテリオファージの表面上に提示する方法は周知である（米国特許公開第２０１１／０１１８１４４号；国際特許公開第ＷＯ２００９／０８５４６２号；米国特許第６，９６９，１０８号；米国特許第６，１７２，１９７号；米国特許第５，２２３，４０９号；米国特許第６，５８２，９１５号；米国特許第６，４７２，１４７号）。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、場合により、残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、および／または８６において、置換を有する、配列番号２７６のＴｅｎｃｏｎ配列、または配列番号２７７のＴｅｎｃｏｎ２７配列である、配列番号２７６または配列番号２７７に基づく。
一部の実施形態では、ＦＮ３タンパク質またはポリペプチドは、トランスフェリンの、ＣＤ７１への結合と競合しない、ＣＤ７１上の部位において、ヒトＣＤ７１に結合する、ＦＮ３タンパク質またはポリペプチドである。本明細書で使用される、トランスフェリンの、ＣＤ７１への結合と競合しない、ＣＤ７１上の部位とは、ＦＮ３タンパク質の結合が、トランスフェリンの、ＣＤ７１への結合と競合したり、これを阻害したりしない、ＣＤ７１のエピトープまたは部分を指す。競合またはその欠如は、全面的な場合もあり、部分的な場合もある。一部の実施形態では、結合はまた、ＣＤ７１とのその相互作用を介する、トランスフェリンの、細胞への内部化も阻害しない。
一部の実施形態では、トランスフェリンの、ＣＤ７１への結合と競合したり、これを阻害したりしない部位において、ＣＤ７１に結合するＦＮ３タンパク質を同定するための方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、トランスフェリン、またはＣＤ７１のトランスフェリン結合性部位に結合する薬剤の存在下で、ＣＤ７１を、被験ＦＮ３タンパク質と接触させる工程；およびトランスフェリン、またはＣＤ７１のトランスフェリン結合性部位に結合する薬剤の存在下で、ＣＤ７１に結合する被験ＦＮ３タンパク質を同定する工程を含む。一部の実施形態では、方法は、トランスフェリン、またはＣＤ７１のトランスフェリン結合性部位に結合する薬剤の存在下で、ＣＤ７１に結合する被験ＦＮ３タンパク質を分離する工程を含む。一部の実施形態では、方法は、トランスフェリン、またはＣＤ７１のトランスフェリン結合性部位に結合する薬剤の存在下で、ＣＤ７１に結合する被験ＦＮ３タンパク質をシーケンシングする工程を含む。一部の実施形態では、方法は、トランスフェリン、またはＣＤ７１のトランスフェリン結合性部位に結合する薬剤の存在下で、ＣＤ７１に結合する被験ＦＮ３タンパク質をコードする核酸配列を調製するか、または得る工程を含む。一部の実施形態では、方法は、トランスフェリン、またはＣＤ７１のトランスフェリン結合性部位に結合する薬剤の存在下で、ＣＤ７１に結合する被験ＦＮ３タンパク質を、トランスフェリン、またはＣＤ７１のトランスフェリン結合性部位に結合する薬剤の存在下で、ＣＤ７１に結合する被験ＦＮ３タンパク質をコードする核酸配列から発現させる工程を含む。一部の実施形態では、被験ＦＮ３タンパク質は、細胞内で発現される。一部の実施形態では、方法は、発現された被験ＦＮ３タンパク質を分離および／または精製する工程を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提示される、任意の方法に従い同定されるＦＮ３タンパク質が提供される。
ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、熱安定性、ならびに熱によるフォールディングおよびアンフォールディングの可逆性を改善するなど、それらの特性を改善するように修飾される。タンパク質および酵素の熱安定性を、明らかに増大させるように、高度に類似する熱安定性配列との比較に基づく合理的デザイン、ジスルフィド架橋を安定化させるデザイン、アルファ－ヘリックス形成傾向を増大させる突然変異、塩架橋の操作、タンパク質の表面電荷の変更、指向性進化、およびコンセンサス配列の組成を含む、いくつかの方法が適用されている（ＬｅｈｍａｎｎおよびＷｙｓｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１２、３７１～３７５、２００１）。高度の熱安定性は、タンパク質の発現収量を増大させ、可溶性または活性を改善し、免疫原性を低下させ、製造におけるコールドチェーンの必要を最小化しうる。Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号２７６）の熱安定性を改善するのに置換される残基は、残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、または８６であり、米国特許公開第２０１１／０２７４６２３号において記載されている。これらの残基に対応する置換は、本明細書で開示される分子を含有するＦＮ３ドメインへと組み込まれる。
タンパク質安定性およびタンパク質不安定性の測定は、タンパク質の完全性の、同じ側面または異なる側面として見ることができる。タンパク質は、熱、紫外線もしくはイオン化放射線、溶液中にある場合における、周囲オスモル濃度およびｐＨの変化、小孔サイズの濾過により付与される機械的せん断力、紫外線、ガンマ照射などによるイオン化放射線、化学的脱水もしくは熱的脱水、またはタンパク質構造の破壊を引き起こしうる、他の任意の作用もしくは力により引き起こされる変性に対して、感受性または「不安定」である。分子の安定性は、標準法を使用して決定される。例えば、分子の安定性は、標準法を使用して、分子のうちの半数が、アンフォールディングするときの、摂氏°（℃）による温度である、融点（「Ｔｍ」）を測定することにより決定される。典型的に、Ｔｍが高いほど、分子の安定性は増大する。熱に加えて、化学的環境もまた、タンパク質が、特定の三次元構造を維持する能力を変化させる。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、Ｔｍの上昇により測定される、操作の前における同じドメインと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％、またはこれを超える安定性の増大を呈しうる。
化学変性も同様に、様々な方法により測定される。化学変性剤は、塩酸グアニジウム、チオシアン酸グアニジウム、尿素、アセトン、有機溶媒（ＤＭＦ、ベンゼン、アセトニトリル）、塩（硫酸アンモニウム、臭化リチウム、塩化リチウム、臭化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム）；還元剤（例えば、ジチオトレイトール、ベータ－メルカプトエタノール、ジニトロチオベンゼン、およびホウ化水素ナトリウムなどの水素化物）、非イオン性デタージェントおよびイオン性デタージェント、酸（例えば、塩酸（ＨＣｌ）、酢酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）、ハロゲン化酢酸）、疎水性分子（例えば、リン脂質）、およびターゲティング変性剤を含む。変性度の定量は、標的分子に結合する能力など、機能的特性の喪失に依拠する場合もあり、または凝集傾向など、変性前に溶媒にアクセス不能であった残基の露出、またはジスルフィド結合の破壊もしく形成など、物理化学的特性に依拠する場合もある。
ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、単量体、二量体、または多量体として、例えば、標的分子への結合価数を増大させ、これにより、標的分子への結合アビディティーを増大させるか、または２つもしくはこれを超える、異なる標的分子に同時に結合する、二特異的足場もしくは多特異的足場を作出する手段として作出される。二量体および多量体は、単一特異的タンパク質足場、二特異的タンパク質足場、または多特異的タンパク質足場を連結することにより、例えば、アミノ酸リンカー、例えば、ポリグリシン、グリシンおよびセリン、またはアラニンおよびプロリンを含有するリンカーを組み入れることにより作出される。例示的リンカーは、（ＧＳ）２、（配列番号２７８）、（ＧＧＧＳ）２（配列番号２７９）、（ＧＧＧＧＳ）１－５（配列番号２８０）、（ＡＰ）１－２０ （配列番号３１１）；（ＡＰ）２（配列番号２８１）、（ＡＰ）５（配列番号２８２）、（ＡＰ）１０（配列番号２８３）、（ＡＰ）２０（配列番号２８４）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）５ＡＡＡ（配列番号２８５）、または（ＥＡＡＡＫ）１－５（配列番号３０７）を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、リンカーは、ＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（配列番号３００）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３０１）；ＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰ（配列番号３０２）；またはＥＡＡＡＫ（配列番号３０３）のアミノ酸配列である。
二量体および多量体は、Ｎ－Ｃ方向において、互いと連結される。ポリペプチドを、新規に連結された融合ポリペプチドと接続する、天然に存在するペプチドリンカーならびに人工ペプチドリンカーの使用は、文献（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２６４、５２６０～５２６８、１９８９；Ａｌｆｔｈａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、８、７２５～７３１、１９９５；ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＳａｕｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５、１０９～１１６、１９９６；米国特許第５，８５６，４５６号）において周知である。
半減期延長部分
ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、例えば、共有結合的相互作用を介して、他のサブユニットを組み込みうる。一部の実施形態では、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、半減期延長部分をさらに含む。例示的半減期延長部分は、アルブミン、アルブミン変異体、アルブミン結合性タンパク質および／または結合性タンパク質ドメイン、トランスフェリンならびにその断片および類似体、ならびにＦｃ領域である。ヒトＦｃ領域のアミノ酸配列は、周知であり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＥのＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、本明細書で記載される半減期延長部分のうちのいずれかなどであるがこれらに限定されない、分子全体の半減期を延長する分子に結合する、第２のＦＮ３ドメインを組み込みうる。一部の実施形態では、第２のＦＮ３ドメインは、アルブミン、アルブミン変異体、アルブミン結合性タンパク質および／またはアルブミン結合性ドメイン、ならびにこれらの断片および類似体に結合する。
抗体様特性、とりわけ、Ｃ１ｑへの結合、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体への結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方調節など、Ｆｃエフェクター機能など、Ｆｃ領域と関連する特性を付与するように、抗体定常領域の全部または一部が、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインへと接合され、これらの活性の一因となる、Ｆｃ内の残基を修飾することにより、さらに修飾される場合がある（総説については、Ｓｔｒｏｈｌ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０、６８５～６９１、２００９を参照されたい）。
所望の特性のために、ＰＥＧ５０００またはＰＥＧ２０，０００などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、異なる鎖長の脂肪酸および脂肪酸エステル、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、オレイン酸、アラキドン酸、オクタンジオン酸、テトラデカンジオン酸、オクタデカンジオン酸、ドコサンジオン酸など、ポリリシン、オクタン、炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ糖、または多糖）など、さらなる部分も、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインへと組み込まれる。これらの部分は、タンパク質足場のコード配列との、直接的な融合体であり、標準的なクローニング法および発現法により作出される場合がある。代替的に、周知の化学的カップリング法は、部分を、本明細書で開示される、組換え作製分子へと接合するのに使用される。
ＰＥＧ部分は、例えば、システイン残基を、分子のＣ末端へと組み込むことにより、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインへと付加される場合もあり、システインを、分子のＣＤ７１結合面から隔たった残基位置へと操作し、周知の方法を使用して、ＰＥＧ基を、システインへと接合させることにより付加される場合もある。
ＣＤ７１に特異的に結合するさらなる部分を組み込むＦＮ３ドメインは、いくつかの周知のアッセイにより、機能性について比較される。例えば、Ｆｃドメインおよび／またはＦｃドメイン変異体の組込みにより変更される特性については、ＦｃγＲＩ受容体、ＦｃγＲＩＩ受容体、ＦｃγＲＩＩＩ受容体、またはＦｃＲｎ受容体などの受容体の可溶性形態を使用する、Ｆｃ受容体結合アッセイにおいてアッセイされる場合もあり、例えば、ＡＤＣＣもしくはＣＤＣを測定するか、またはｉｎ ｖｉｖｏモデルにおける、本明細書で開示される分子の薬物動態特性について査定する、周知の細胞ベースのアッセイを使用してアッセイされる場合もある。
ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞
一部の実施形態では、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインを、単離ポリヌクレオチドとして、または発現ベクターの部分として、または直鎖状ＤＮＡ配列の部分としてコードする核酸であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳のために使用される直鎖状ＤＮＡ配列、その組成物もしくは指向性突然変異原の、原核生物、真核生物、もしくは繊維状ファージによる、発現、分泌、および／もしくは提示と適合性であるベクターを含む核酸が提供される。本明細書では、ある特定の例示的なポリヌクレオチドが開示されるが、所与の発現系における遺伝子コードの縮重またはコドン優先性を踏まえ、本明細書で開示されるＦＮ３ドメインをコードする、他のポリヌクレオチドもまた、本開示の範囲内にある。
一部の実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のアミノ酸配列を含む、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインをコードする。
本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、自動式ポリヌクレオチド合成器上の固相ポリヌクレオチド合成などの化学合成により作製され、完全な一本鎖分子または二本鎖分子へとアセンブルされる。代替的に、本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、ＰＣＲに続く、規定のクローニングなど、他の技法によっても作製される。当技術分野では、所与の公知の配列を有するポリヌクレオチドを作製するか、またはこれを得るための技法が周知である。
本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、プロモーター配列またはエンハンサー配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル、ＲｅｐＡへの結合を容易とするシス配列など、少なくとも１つの非コード配列を含みうる。ポリヌクレオチド配列はまた、例えば、タンパク質の精製または検出を容易とする、ヒスチジンタグもしくはＨＡタグなどのマーカー配列もしくはタグ配列、シグナル配列、ＲｅｐＡなどの融合タンパク質パートナー、Ｆｃ、またはｐＩＸもしくはｐＩＩＩなどのバクテリオファージコートタンパク質をコードするさらなるアミノ酸をコードする、さらなる配列も含みうる。
一部の実施形態では、少なくとも１つの、本明細書で開示されるポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。このようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現のためのベクター、トランスポゾンベースのベクター、または、任意の手段による、本明細書で開示されるポリヌクレオチドの、所与の生物もしくは遺伝子バックグラウンドへの導入に適する、他の任意のベクターでありうる。このようなベクターは、このようなベクターによりコードされるポリペプチドの発現を、制御する場合もあり、調節する場合もあり、これを引き起こす場合もあり、これを許容する場合もある、核酸配列エレメントを含む発現ベクターでありうる。このようなエレメントは、転写エンハンサー結合性部位、ＲＮＡポリメラーゼ誘発部位、リボソーム結合性部位、および所与の発現系内の、コードされるポリペプチドの発現を容易とする他の部位を含みうる。このような発現系は、当技術分野で周知である、細胞ベースの発現系の場合もあり、無細胞系の場合もある。
一部の実施形態では、ベクターを含む宿主細胞が提供される。ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、場合により、当技術分野で周知である細胞系、混合細胞系、不死化細胞、または不死化細胞のクローン集団により作製される。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹ、ＮＹ（１９８７～２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹ（１９９４～２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ、ＮＹ（１９９７～２００１）を参照されたい。
発現のために選び出される宿主細胞は、哺乳動物由来の場合もあり、ＣＯＳ－１細胞、ＣＯＳ－７細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＳＣ－１細胞、ＨｅＧ２細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞、リンパ腫細胞、酵母細胞、昆虫細胞もしくは植物細胞、またはこれらの任意の派生細胞、不死化細胞、もしくは形質転換細胞から選択される場合もある。代替的に、宿主細胞は、ポリペプチドをグリコシル化することが不可能な種または生物、例えば、ＢＬ２１株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、ＢＬ２１－ＧＯＬＤ（ＤＥ３）株、ＸＬ１－Ｂｌｕｅ株、ＪＭ１０９株、ＨＭＳ１７４株、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株、および天然のＥ．ｃｏｌｉ種株、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属種株、もしくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属種株、またはこれらの操作株のうちのいずれかなど、原核細胞または原核生物から選択される。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインを作製する方法であって、ＣＤ７１に結合する単離ＦＮ３ドメインが発現されるような条件下で、単離宿主細胞を培養する工程と、ＦＮ３ドメインを精製する工程とを含む方法が提供される。
ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、例えば、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウム、もしくはエタノール沈殿、酸抽出、アニオン交換クロマトグラフィーもしくはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を介する、周知の方法により、組換え細胞培養物から精製される。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のアミノ酸配列を含み、この場合、ヒスチジンタグが、精製を容易とするために、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端へと付属させられている。一部の実施形態では、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）は、６つのヒスチジン残基（配列番号３０９）を含む。さらなる実施形態では、Ｈｉｓタグは、少なくとも１つのグリシン残基、または約２つ～約４つのグリシン残基により、ＦＮ３ドメインへと接続される。したがって、ＦＮ３ドメインの精製、およびポリペプチドからのＨｉｓタグの切断の後、１つまたはそれ以上のグリシンが、Ｎ末端上またはＣ末端上に残される場合がある。一部の実施形態では、Ｈｉｓタグが、Ｎ末端から除去される場合、全てのグリシンが除去される。一部の実施形態では、Ｈｉｓタグが、Ｃ末端から除去される場合、グリシンのうちの１つまたはそれ以上が保持される。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のアミノ酸配列を含み、この場合、Ｎ末端メチオニンは、ＦＮ３ドメインの精製の後で保持される。
キット
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインを含むキットが提供される。
キットは、治療的使用のために使用され、診断用キットとして使用される。
一部の実施形態では、キットは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインと、ＦＮ３ドメインを検出するための試薬とを含む。一部の実施形態では、キットは、二価ＦＮ３ドメインを含む。キットは、使用のための指示書；他の試薬、例えば、標識、キレート化または他の形のカップリングに有用な薬剤、放射線保護組成物；イメージング、診断、または治療を目的とする投与のための、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインを調製するための、デバイスまたは他の材料；薬学的に許容される担体；および対象への投与のためのデバイスまたは他の材料を含む、１つまたはそれ以上の他の要素を含みうる。
一部の実施形態では、キットは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のうちの１つのアミノ酸配列を含む、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインを含む。
ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインの使用
ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメイン、またはそのコンジュゲートは、細胞、組織、臓器、体液、または、一般に、宿主における、ヒト疾患の症状、または特異的病態を診断するか、モニタリングするか、モジュレートするか、処置するか、緩和するか、これらの発生を防止するか、またはこれらを軽減するのに使用される。
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、筋疾患の処置のために、ＣＤ７１陽性組織（例えば、骨格筋、平滑筋）への送達を容易としうる。
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、免疫疾患の処置のために、活性化リンパ球、活性化樹状細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＢ細胞、または他の活性化免疫細胞への送達を容易としうる。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメイン、またはそのコンジュゲートはまた、対象における、ＣＤ７１陽性腫瘍組織のイメージングにおいても使用される。本明細書で開示される方法は、任意の分類に属する動物患者と共に使用される。このような動物の例は、ヒト、齧歯動物、イヌ、ネコ、および農場動物などの哺乳動物を含む。
一部の実施形態では、がん組織の細胞による、ＣＤ７１の発現に基づき、組織のがんを有するか、またはこれを発症する可能性が高い対象を診断する方法、免疫療法の奏効を予測する方法、予後診断法、および処置法が提供される。
一部の実施形態では、腫瘍組織内のＣＤ７１発現がん細胞を検出する方法であって、対象から、腫瘍組織の試料を得る工程；腫瘍組織の試料を、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のうちの１つのアミノ酸配列を含む、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインと接触させ、ＣＤ７１と、ＦＮ３ドメインとの結合を検出することにより、ＣＤ７１が、腫瘍組織内で発現されるのかどうかを検出する工程を含む方法が提供される。一部の実施形態では、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象へと、ＣＤ７１に結合するポリペプチドまたは医薬組成物を投与する工程を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、もしくは３０４～３０６などの配列、または治療剤へと連結されるか、もしくはこれとコンジュゲートされた、本明細書で提示されるポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、ＣＤ７１細胞は、多発性硬化症（ＭＳ）および脳の感染性疾患など、ＣＮＳ疾患、炎症性疾患／免疫疾患に関与する細胞である。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するポリペプチドは、中枢神経系へと方向付けられる。一部の実施形態では、それを必要とする対象における神経学的状態および／または脳腫瘍を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象へと、ＣＤ７１に結合するポリペプチドまたは医薬組成物を投与する工程を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、もしくは３０４～３０６などの配列、または治療剤へと連結されるか、もしくはこれとコンジュゲートされた、本明細書で提示されるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、脳腫瘍は、非悪性脳腫瘍、良性脳腫瘍、および悪性脳腫瘍からなる群から選択される。一部の実施形態では、神経学的状態は、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症、パーキンソン病、ラフォラ病、ポンペ病、成人ポリグルコサン小体病、脳卒中、脊髄損傷、運動失調、ベル麻痺、脳動脈瘤、てんかん、発作、ギラン－バレー症候群、多発性硬化症、筋ジストロフィー、神経皮膚症候群、偏頭痛、脳炎、敗血症、および重症筋無力症からなる群から選択される。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するポリペプチドは、筋細胞へと方向付けられる。一部の実施形態では、方法は、対象へと、ＣＤ７１に結合するポリペプチドまたは医薬組成物を投与する工程を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、もしくは３０４～３０６などの配列、または治療剤へと連結されるか、もしくはこれとコンジュゲートされた、本明細書で提示されるポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、それを必要とする対象におけるポンペ病（ＧＳＤ２；酸性アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）欠損症）を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象へと、ＣＤ７１に結合するポリペプチドまたは医薬組成物を投与する工程を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６などの配列、または治療剤へと連結されるか、もしくはこれとコンジュゲートされた、本明細書で提示されるポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、それを必要とする対象における糖原病を処置する方法であって、本明細書で提示される組成物を投与する工程を含む方法が提供される。一部の実施形態では、糖原病は、コーリー病またはフォーブズ病（ＧＳＤ３；グリコーゲン脱分枝酵素（ＡＧＬ）欠損症）、マッカードル病（ＧＳＤ５；筋グリコーゲンホスホリラーゼ（ＰＹＧＭ）欠損症）、ＩＩ型糖尿病／糖尿病性腎症、ＧＳＤ１２であるアルドラーゼＡ欠損症、ラフォラ病、低酸素症、アンデルセン病（ＧＳＤ４；グリコーゲン脱分枝酵素（ＧＢＥ１）欠損症）、タルイ病（ＧＳＤ７；筋ホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫＭ）欠損症）、および成人ポリグルコサン小体病からなる群から選択される。一部の実施形態では、糖原病は、グリコーゲンシンターゼ（ＧＹＳ２）欠損症（ＧＳＤ０）、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ／ＳＬＣ３７Ａ４）欠損症（ＧＳＤ１；フォンギールケ病）、ハース病（ＧＳＤ６；肝グリコーゲンホスホリラーゼ（ＰＹＧＬ）欠損症または筋ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＡＭ２）欠損症）、ホスホリラーゼキナーゼ（ＰＨＫＡ２／ＰＨＫＢ／ＰＨＫＧ２／ＰＨＫＡ１）欠損症（ＧＳＤ９）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＡＭ２）欠損症（ＧＳＤ１０）、筋乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨＡ）欠損症（ＧＳＤ１１）、ファンコーニ－ビッケル症候群（ＧＳＤ１１；グルコース輸送体（ＧＬＵＴ２）欠損症）、アルドラーゼＡ欠損症（ＧＳＤ１２）、β－エノラーゼ（ＥＮＯ３）欠損症（ＧＳＤ１３）、およびグリコゲニン－１（ＧＹＧ１）欠損症（ＧＳＤ１５）からなる群から選択される。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するポリペプチドは、免疫細胞へと方向付けられる。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するポリペプチドは、樹状細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＢ細胞へと方向付けられる。一部の実施形態では、それを必要とする対象における自己免疫疾患を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象へと、ＣＤ７１に結合するポリペプチドまたは医薬組成物を投与する工程を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６などの配列、または治療剤へと連結されるか、もしくはこれとコンジュゲートされた、本明細書で提示されるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、関節リウマチ、橋本自己免疫性甲状腺炎、セリアック病、１型糖尿病、白斑、リウマチ熱、悪性貧血／萎縮性胃炎、円形脱毛症、および免疫性血小板減少性紫斑病からなる群から選択される。
一部の実施形態では、組織は、ＣＤ７１を発現する、任意の臓器または解剖学的系の組織でありうる。
一部の実施形態では、ＣＤ７１の発現は、免疫組織化学反応またはＥＬＩＳＡなど、公知の方法を使用して査定される。
一部の実施形態では、ＣＤ７１発現細胞を分離する方法であって、対象から、試料を得る工程；試料を、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のうちの１つのアミノ酸配列を含む、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインと接触させる工程；およびＦＮ３ドメインに結合した細胞を分離する工程を含む方法が提供される。
一部の実施形態では、腫瘍組織内のＣＤ７１発現がん細胞を検出する方法であって、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のうちの１つのアミノ酸配列を含む、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインを、検出用標識とコンジュゲートして、コンジュゲートを形成する工程；コンジュゲートを、対象へと投与する工程；およびコンジュゲートが結合したＣＤ７１発現がん細胞を視覚化する工程を含む方法が提供される。
一部の実施形態では、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象へと、ＣＤ７１に結合するポリペプチドまたは医薬組成物を投与する工程を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６などの配列、または治療剤へと連結されるか、もしくはこれとコンジュゲートされた、本明細書で提示されるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、がんを有する対象を処置する方法であって、対象へと、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインを投与する工程を含む方法が提供される。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、治療剤（例えば、細胞傷害剤、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスなどのオリゴヌクレオチド、別の標的に結合するＦＮ３ドメインなど）へとコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、対象は、充実性腫瘍を有する。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、黒色腫である。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、肺がんである。一部の実施形態では、充実性腫瘍は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。一部の実施形態では、充実性腫瘍は、扁平上皮非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。一部の実施形態では、充実性腫瘍は、非扁平上皮ＮＳＣＬＣである。一部の実施形態では、充実性腫瘍は、肺腺癌である。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、腎細胞癌（ＲＣＣ）である。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、中皮腫である。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）である。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、結腸直腸がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、前立腺がんである。一部の実施形態では、充実性腫瘍は、去勢抵抗性前立腺がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、胃がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、卵巣がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、胃がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、肝がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、膵がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、甲状腺がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、頭頸部扁平上皮がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、食道癌または消化器癌である。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、乳がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、卵管がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、脳がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、尿道がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、泌尿生殖器がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、子宮内膜症である。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、子宮頸がんである。
一部の実施形態では、充実性腫瘍は、がんの転移性病変である。
一部の実施形態では、対象は、血液悪性腫瘍を有する。一部の実施形態では、血液悪性腫瘍は、リンパ腫、骨髄腫、または白血病である。一部の実施形態では、血液悪性腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫である。一部の実施形態では、血液悪性腫瘍は、バーキットリンパ腫である。一部の実施形態では、血液悪性腫瘍は、ホジキンリンパ腫である。一部の実施形態では、血液悪性腫瘍は、非ホジキンリンパ腫である。
一部の実施形態では、血液悪性腫瘍は、骨髄異形成症候群である。
一部の実施形態では、血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。一部の実施形態では、血液悪性腫瘍は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である。一部の実施形態では、血液悪性腫瘍は、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）である。
一部の実施形態では、血液悪性腫瘍は、多発性骨髄腫（ＭＭ）である。
一部の実施形態では、血液悪性腫瘍は、形質細胞腫である。
一部の実施形態では、本明細書で提示される組成物または医薬組成物は、単独で、または他の治療剤と組み合わせて、すなわち、同時に、または逐次的に投与される。一部の実施形態では、他の治療剤、またはさらなる治療剤は、他の抗腫瘍剤、または治療剤である。異なる腫瘍の種類および腫瘍の病期は、がんの処置に有用な、多様な補助的化合物の使用を要求しうる。例えば、本明細書で提示される組成物は、とりわけ、タキソール、チロシンキナーゼ阻害剤、ロイコボリン、フルオロウラシル、イリノテカン、ホスファターゼ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤など、多様な化学療法剤と組み合わせて使用される。組成物はまた、とりわけ、抗ＰＤ－１または抗ＣＴＬＡ－４など、腫瘍に対する免疫応答をモジュレートする薬物と組み合わせても使用される。さらなる処置は、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１をターゲティングする抗体、免疫系をモジュレートする薬剤でありうる。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するポリペプチドは、中枢神経系へと方向付けられる。一部の実施形態では、それを必要とする対象における神経学的状態および／または脳腫瘍を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象へと、ＣＤ７１に結合するポリペプチドまたは医薬組成物を投与する工程を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６などの配列、または治療剤へと連結されるか、もしくはこれとコンジュゲートされた、本明細書で提示されるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、脳腫瘍は、非悪性脳腫瘍、良性脳腫瘍、および悪性脳腫瘍からなる群から選択される。一部の実施形態では、神経学的状態は、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症、パーキンソン病、ラフォラ病、ポンペ病、成人ポリグルコサン小体病、脳卒中、脊髄損傷、運動失調、ベル麻痺、脳動脈瘤、てんかん、発作、ギラン－バレー症候群、多発性硬化症、筋ジストロフィー、神経皮膚症候群、偏頭痛、脳炎、敗血症、および重症筋無力症からなる群から選択される。一部の実施形態では、対象における、神経学的状態および／または脳腫瘍を処置する方法であって、対象へと、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインを投与する工程を含み、ＦＮ３ドメインが、治療剤（例えば、細胞傷害剤、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスなどのオリゴヌクレオチド、別の標的に結合するＦＮ３ドメインなど）へとコンジュゲートされている方法が提供される。
一部の実施形態では、それを必要とする対象におけるポンペ病（ＧＳＤ２；酸性アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）欠損症）を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象へと、ＣＤ７１に結合するポリペプチドまたは医薬組成物を投与する工程を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６などの配列、または治療剤へと連結されるか、もしくはこれとコンジュゲートされた、本明細書で提示されるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、対象における、ポンペ病（ＧＳＤ２；酸性アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）欠損症）を処置する方法であって、対象へと、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインを投与する工程を含み、ＦＮ３ドメインが、治療剤（例えば、細胞傷害剤、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスなどのオリゴヌクレオチド、別の標的に結合するＦＮ３ドメインなど）へとコンジュゲートされている方法が提供される。
一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するポリペプチドは、免疫細胞へと方向付けられる。一部の実施形態では、ＣＤ７１に結合するポリペプチドは、樹状細胞へと方向付けられる。一部の実施形態では、それを必要とする対象における自己免疫疾患を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、対象へと、ＣＤ７１に結合するポリペプチドまたは医薬組成物を投与する工程を含む。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６などの配列、または治療剤へと連結されるか、もしくはこれとコンジュゲートされた、本明細書で提示されるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、関節リウマチ、橋本自己免疫性甲状腺炎、セリアック病、１型糖尿病、白斑、リウマチ熱、悪性貧血／萎縮性胃炎、円形脱毛症、および免疫性血小板減少性紫斑病からなる群から選択される。一部の実施形態では、対象における、自己免疫疾患を処置する方法であって、対象へと、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインを投与する工程を含み、ＦＮ３ドメインが、治療剤（例えば、細胞傷害剤、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスなどのオリゴヌクレオチド、別の標的に結合するＦＮ３ドメインなど）へとコンジュゲートされている方法が提供される。
一部の実施形態では、細胞、組織、臓器、体液、または、一般に、宿主における、ヒト疾患の症状、または特異的病態を診断するか、モニタリングするか、モジュレートするか、処置するか、緩和するか、これらの発生を防止するか、またはこれらを軽減するのに使用される、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメイン、またはそのコンジュゲートはまた、血液脳関門を越えることが可能な特性も呈する。血液脳関門（ＢＢＢ）は、大半の高分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびポリペプチド）、および多くの低分子が、脳に侵入することを防止する。ＢＢＢは、主に、高度に制限的な密着結合を伴う、特化した内皮細胞から構成され、この結果、小型の物質および大型の物質の、血液から、中枢神経系への通過は、ＢＢＢにより制御される。多くの治療剤が、所望の効率で、ＢＢＢを越えて送達されないので、この構造は、神経疾患および神経障害（例えば、脳がん）を伴う患者の処置および管理を困難とする。ＢＢＢの破壊を伴う、さらなる状態は、脳卒中、糖尿病、発作、高血圧性脳症、後天性免疫不全症候群、外傷性脳傷害、多発性硬化症、パーキンソン病（ＰＤ）、およびアルツハイマー病を含む。この能力は、とりわけ、例えば、星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫（松果体腫）、多形性神経膠芽腫、希突起神経膠腫、神経鞘腫、網膜芽細胞腫、および先天性腫瘍を含む脳がん；または脊髄がん、例えば、神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、および肉腫を処置するために有用である。ある特定の実施形態では、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のうちの１つのアミノ酸配列を含む、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメイン、またはそのコンジュゲートは、治療剤または細胞傷害剤を、例えば、血液脳関門を越えて送達するのに有用である。
一部の実施形態では、ＢＢＢを越える、治療剤の輸送を容易としうるポリペプチドは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６の配列を含むタンパク質である。
「～を処置する」または「処置」とは、目的が、がんの発症または拡散など、所望されない生理学的変化または障害を防止するか、または緩徐化する（低下させる）ことである、治療的処置および予防的措置を指す。一部の実施形態では、有益な臨床的結果、または所望の臨床的結果は、検出可能であれ、検出不能であれ、症状の緩和、疾患の程度の減殺、疾患の状態の安定化（すなわち、非増悪）、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の改善または軽減、および寛解（部分的であれ、全面的であれ）を含むがこれらに限定されない。「処置」はまた、処置を施されない場合の平均余命と比較して、生存を延長することも意味しうる。処置を必要とする患者は、状態もしくは障害を既に伴う患者のほか、状態もしくは障害を有しやすい患者、または状態もしくは障害が防止されるべきである患者を含む。
「治療有効量」とは、所望の治療的結果を達成するのに必要な投与量で、必要な期間にわたり有効な量を指す。ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインの治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重などの因子に従い変動しうる。ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインの有効量についての例示的指標は、患者の福利の改善、腫瘍のサイズの減少もしくは退縮、腫瘍の増殖の停止もしくは緩徐化、および／またはがん細胞の、体内の他の位置への転移の非存在である。
投与／医薬組成物
一部の実施形態では、場合により、検出用標識、治療的、または細胞傷害剤へとコンジュゲートされた、本明細書で開示される、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインと、薬学的に許容される担体とによる医薬組成物が提供される。治療的使用のために、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、薬学的に許容される担体中に、有効成分としてのドメインまたは分子の有効量を含有する医薬組成物として調製される。「担体」とは、それと共に活性化合物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または媒体を指す。このような媒体は、水、および石油由来の油、動物由来の油、植物由来の油、またはラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ごま油など、合成由来の油を含む油などの液体でありうる。例えば、０．４％の生理食塩液および０．３％のグリシンが使用される。これらの溶液は、滅菌であり、一般に、粒子状物質を含まない。これらの溶液は、常套的な周知の滅菌法（例えば、濾過）により滅菌される。組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、安定化剤、増粘剤、滑沢剤、および着色剤など、生理学的条件を近似するのに要求される、薬学的に許容される補助物質を含有しうる。本明細書で開示される分子の、このような医薬製剤中濃度は、広範に、すなわち、体重の約０．５％未満、通例、少なくとも約１％～最大１５または２０％で変動する場合があり、主に、選択される特定の投与方式に従い要求される用量、流体の体積、粘度などに基づき選択されるであろう。他のヒトタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンを含む、適切な媒体および製剤については、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」、２１版、Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．編、Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ ２００６、５部、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ」、６９１～１０９２頁（とりわけ、９５８～９８９を参照されたい）において記載されている。
本明細書で開示されるＦＮ３ドメインの治療的使用のための投与方式は、錠剤、カプセル、溶液、粉末、ゲル、粒子による製剤を使用する、非経口投与、例えば、皮内投与、筋内投与、腹腔内投与、静脈内投与または皮下投与、肺内投与；経粘膜（経口、鼻腔内、膣内、直腸内）投与など、薬剤を、宿主へと送達する、任意の適切な経路であることが可能であり、シリンジ、植込み式デバイス、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ；または当技術分野で周知の、当業者により理解される、他の手段の中に含有される。部位特異的投与は、例えば、関節内送達、気管支内送達、腹腔内送達、関節包内送達、軟骨内送達、体腔内送達、腔内送達、小脳内送達、脳室内送達、結腸内送達、子宮頸部内送達、胃内送達、肝内送達、心内送達、骨内送達、骨盤内送達、心膜内送達、腹腔内送達、胸膜内送達、前立腺内送達、肺内送達、直腸内（ｉｎｔｒａｒｅｃｔａｌ）送達、腎内送達、網膜内送達、脊髄内送達、滑膜内送達、胸内送達、子宮内送達、血管内送達、膀胱内送達、病変内送達、膣内送達、直腸内（ｒｅｃｔａｌ）送達、口腔内送達、舌下送達、鼻腔内送達、または経皮送達により達成される。
医薬組成物は、本明細書で記載される医薬組成物を含む容器を含むキットとして供給される。医薬組成物は、例えば、単回投与もしくは複数回投与のための注射用溶液の形態で提供される場合もあり、注射の前に復元される滅菌粉末として提供される場合もある。代替的に、このようなキットは、医薬組成物の投与のための、乾燥粉末分散器、液体エアゾール発生器、または噴霧器を含みうる。このようなキットは、医薬組成物の適応および用法についての、書面による情報をさらに含みうる。
実施例
以下の実施例は、本明細書で開示される実施形態を例示する。これらの実施例は、例示だけを目的として提示され、実施形態は、いかなる形であれ、これらの実施例に限定されるものと見なされるべきではなく、本明細書で提示される教示の結果としての証拠となる、任意の変化形および全ての変化形を包含すると見なされるべきである。当業者は、本質的に同様の結果をもたらすように変化させられるか、または改変される、それほど重要でない、様々なパラメータをたやすく認識するであろう。
ランダム化ループを伴う、Ｔｅｎｃｏｎライブラリーの構築
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号２７６）は、ヒトテネイシンＣに由来する、１５のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列からデザインされた、免疫グロブリン様足場であるフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである（Ｊａｃｏｂｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、２５：１０７～１１７、２０１２；米国特許第８，２７８，４１９号）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、７つのベータ鎖を接続する、６つの表面露出ループを示す。これらのループ、または各ループ内で選択された残基は、特異的標的に結合する新規の分子を選択するのに使用される、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリーを構築するためにランダム化される。
Ｔｅｎｃｏｎ足場および多様なデザイン戦略を使用して、多様なライブラリーを作出した。一般に、ライブラリーである、ＴＣＬ１およびＴＣＬ２は、良好な結合剤をもたらした。ライブラリーＴＣＬ１およびＴＣＬ２の作出については、国際特許公開第ＷＯ／２０１４０８１９４４Ａ２号において、詳細に記載されている。
代替的結合面を有する、Ｔｅｎｃｏｎライブラリーの作出
特定のライブラリーデザイン内でランダム化される残基の選出しは、創出される相互作用表面の全体的形状を統御する。Ｘ線結晶構造解析は、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）に結合するように、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧがランダム化されたライブラリーから選択された、ＦＮ３ドメインを含有する足場タンパク質が、ＭＢＰの活性部位にはまる、大きく湾曲した界面を有することを示した（Ｋｏｉｄｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０４：６６３２～６６３７、２００７）。これに対し、ＭＢＰに結合するように選択された、アンキリンリピート足場タンパク質は、はるかに平面性が大きな相互作用表面を有し、活性表面から隔たった、ＭＢＰの外側表面に結合することが見出された（Ｂｉｎｚら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２２：５７５～５８２、２００４）。これらの結果は、足場分子の結合面の形状（曲面対平面）が、これらの標的タンパク質上の、どのような標的タンパク質または特異的エピトープが、足場による、効果的な結合が可能であるのかを指定しうることを示唆する。ＦＮ３ドメインを含有するタンパク質足場を、タンパク質への結合のために操作することに関する、公表された取組みは、隣接するループを、標的への結合のために操作し、これにより、湾曲した結合面を作製することに依拠してきた。この手法は、このような足場の標的の数、およびエピトープへのアクセス可能性を限定する場合がある。
Ｔｅｎｃｏｎ、および他のＦＮ３ドメインは、分子の対向面上に位置する、ＣＤＲ様ループの２つセットである、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧにより形成される第１のセット、ならびにループＡＢ、ＣＤ、およびＥＦにより形成される第２のセットを含有する。ループの２つのセットは、ＦＮ３構造の中心を形成する、ベータ鎖により隔てられている。Ｔｅｎｃｏｎについての画像を、９０度回転させると、代替的表面を視覚化することができる。このわずかな凹面は、ループＣＤおよびＦＧ、ならびに２つのアンチパラレルのベータ鎖であるベータ鎖ＣおよびＦにより形成され、本明細書では、表面Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧと呼ばれる。表面Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧは、表面を形成する残基のサブセットをランダム化することにより、タンパク質足場の相互作用表面についてのライブラリーをデザインするための鋳型として使用される。ベータ鎖は、タンパク質の表面へと露出された、他のあらゆる残基の側鎖による反復構造を有する。したがって、ライブラリーは、ベータ鎖内の、一部または全部の表面露出残基をランダム化することにより作製される。ベータ鎖内の適切な残基を選び出すことにより、他のタンパク質との相互作用のための、固有の足場表面をもたらす一方で、Ｔｅｎｃｏｎ足場の固有の安定性が損なわれる程度は、最小限となるはずである。
このライブラリーを構築するのに使用される方法についての完全な記載は、米国特許公開第２０１３／０２２６８３４号において記載されている。
Ｔｅｎｃｏｎ２７内の表面Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧを形成する、２つのベータ鎖が、ランダム化される、合計９つの表面露出残基；Ｃ鎖：Ｓ３０、Ｌ３２、Ｑ３４、Ｑ３６；Ｆ鎖：Ｅ６６、Ｔ６８、Ｓ７０、Ｙ７２、およびＶ７４を有する一方、ループＣＤは、６つの潜在的残基：Ｓ３８、Ｅ３９、Ｋ４０、Ｖ４１、Ｇ４２、およびＥ４３を有し、ループＦＧは、７つの潜在的残基：Ｋ７５、Ｇ７６、Ｇ７７、Ｈ７８、Ｒ７９、Ｓ８０、およびＮ８１を有する。２２の残基全てをランダム化すると、ライブラリーの理論サイズが大型となるため、ＴＣＬ１４デザインへの組入れのために、選り抜きの残基を選び出した。
Ｔｅｎｃｏｎ内の、１３の位置：鎖Ｃ内のＬ３２、Ｑ３４、およびＱ３６、ループＣＤ内のＳ３８、Ｅ３９、Ｋ４０、およびＶ４１、鎖Ｆ内のＴ６８、Ｓ７０、およびＹ７２、ループＦＧ内のＨ７８、Ｒ７９、およびＮ８１を、ランダム化のために選び出した。鎖Ｃ内およびＦ内の、Ｓ３０およびＥ６６は、ループＣＤおよびＦＧから、わずかに外れた位置にあり、明らかに、表面Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧの一部としては現れないので、ランダム化しなかった。ループＣＤについて、グリシンは可撓性をもたらし、ループ領域内において、重要であり、Ｅ４３は表面の接合部に位置するので、Ｇ４２およびＥ４３はランダム化しなかった。ループＦＧは、Ｋ７５、Ｇ７６、Ｇ７７、およびＳ８０を除外した。上記の理由で、グリシンを除外しない一方、結晶構造の精査は、Ｓ８０が、安定的なループＦＧを形成する一助となるのに、コアとの鍵となる接点をもたらすことを明らかにした。Ｋ７５は、表面Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧから隔たり、ランダム化のための候補残基としての魅力に乏しかった。上述の残基は、元のＴＣＬ１４デザインではランダム化されなかったが、デノボの選択のために、または、例えば、選り抜きのＴＣＬ１４標的特異的ヒットによる、アフィニティー成熟ライブラリーのために、さらなる多様性をもたらすように、後続のライブラリーデザインに組み入れられた。
ＴＣＬ１４の作製に続き、同様のデザインによる、３つのさらなるＴｅｎｃｏｎライブラリーを作製した。これら３つのライブラリーＴＣＬ１９、ＴＣＬ２１、およびＴＣＬ２３は、ＴＣＬ１４と同じ位置（上記を参照されたい）においてランダム化したが、これらの位置において生じるアミノ酸の分布は変更した。ＴＣＬ１９と、ＴＣＬ２１とは、システインおよびメチオニンだけは除外し、１８の天然アミノ酸の、同等の分布を、あらゆる位置（各々、５．５５％ずつ）に組み入れるようにデザインした。ＴＣＬ２３は、ランダム化された各位置が、機能的抗体のＨＣＤＲ３ループにおいて見出されるアミノ酸分布を近似するようにデザインした（Ｂｉｒｔａｌａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３７７：１５１８～１５２８、２００８）。ライブラリーＴＣＬ２１と同様に、システインおよびメチオニンは除外した。
他のライブラリーの、潜在的な標的結合面を拡張するように、第４のさらなるライブラリーを構築した。このライブラリーＴＣＬ２４では、４つのさらなるＴｅｎｃｏｎ位置を、ライブラリーＴＣＬ１４、ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２１、およびＴＣＬ２３と比較してランダム化した。これらの位置は、Ｄ鎖に由来するＮ４６およびＴ４８、ならびにＧ鎖に由来するＳ８４およびＩ８６を含む。特に、これらの残基の側鎖は、ベータ鎖ＤおよびＧから、表面に露出され、構造的に、鎖ＣおよびＦのランダム化部分に隣接し、これにより、標的タンパク質への結合のためにアクセス可能な表面積を増大させるので、位置４６、４８、８４、および８６を選び出した。ＴＣＬ２４のために、各位置において使用されたアミノ酸分布は、ＴＣＬ１９およびＴＣＬ２１について記載されたアミノ酸分布と同一である。
ライブラリーＴＣＬ２１、ＴＣＬ２３、およびＴＣＬ２４の作出
アミノ酸分布を制御するために、Ｃｏｌｉｂｒａライブラリー技術（Ｉｓｏｇｅｎｉｃａ）を使用して、ライブラリーＴＣＬ２１を作出した。アミノ酸分布を制御するために、Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ技術（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）を使用して、遺伝子断片ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２３、およびＴＣＬ２４を作出した。初期合成の後に、ＰＣＲを使用して、各ライブラリーを増幅するのに続き、ループライブラリーのために、上記で記載されたＣＩＳディスプレイ系（Ｏｄｅｇｒｉｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１：２８０６～２８１０、２００４）を使用する選択において使用するために、ＲｅｐＡの遺伝子へのライゲーションを行った。
ＣＤ７１に結合する、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの選択
パニングおよび生化学スクリーニング
ヒトＣＤ７１に特異的なＦＮ３ドメインは、Ｎ末端の６Ｈｉｓタグ（配列番号３０９）を伴う、組換えビオチニル化ＣＤ７１細胞外ドメイン（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を使用するＣＩＳディスプレイ（Ｏｄｅｇｒｉｐら、２００４）を介して選択した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳（ＩＴＴ）のために、ＦＮ３ドメインライブラリーＴＣＬ１８、ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２１、ＴＣＬ２３、およびＴＣＬ２４に由来する、３μｇのＤＮＡを使用し、結合しなかったライブラリーメンバーは、洗浄により除去した。加熱することにより、ＤＮＡを、標的タンパク質から溶出させ、さらなるラウンドにわたるパニングのために、ＫＯＤポリメラーゼを使用するＰＣＲにより増幅した。各ラウンドにおける標的ＣＤ７１の濃度を、４００ｎＭから、１００ｎＭへと、逐次的に低下させ、洗浄の厳密性を増大させることにより、高アフィニティーの結合剤を単離した。第５ラウンドのパニングからのアウトプットを、さらに４ラウンドにわたるオフ速度選択にかけた。ビオチニル化標的抗原濃度を、ラウンド６および７における２５ｎＭから、ラウンド８および９における２．５ｎＭへと低減した。
パニングの後、選択されたＦＮ３ドメインをコードする遺伝子を、ＰＣＲにより増幅し、リガーゼ非依存的クローニング部位を組み入れるように修飾されたｐＥＴベクターへとサブクローニングし、標準的な分子生物学法を使用する、Ｅ．ｃｏｌｉ内の可溶性発現のために、これらの遺伝子により、ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）細胞を形質転換した。精製および検出を可能とするように、Ｃ末端のポリヒスチジンタグをコードする遺伝子配列を、各ＦＮ３ドメインへと付加した。
ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインについてスクリーニングするために、ストレプトアビジンコーティングＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ；型番：４３６１１０）を、Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ Ｔ２０（Ｐｉｅｒｃｅ）中で、１時間にわたりブロッキングし、次いで、１時間にわたり、ビオチニル化ＣＤ７１（パニング法における抗原と同じ抗原を使用する）、または陰性対照（非類縁Ｆｃ融合組換えタンパク質およびヒト血清アルブミン）によりコーティングした。プレートを、ＴＢＳＴですすぎ、希釈された溶解物を、プレートへと、１時間にわたり適用した。さらなるすすぎに続き、ウェルを、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｖ５ｔａｇ抗体（Ａｂｃａｍ；ａｂ１３２５）で、１時間にわたり処理し、次いで、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）（Ｒｏｃｈｅ；１１５８２９５０００１）でアッセイした。シグナルが、ストレプトアビジン対照のＥＬＩＳＡシグナルの少なくとも１０倍である、ＦＮ３ドメイン溶解物に由来するＤＮＡを、シーケンシングする結果として、ラウンド９のスクリーニングから単離された、２３の固有の読み取り可能なＦＮ３ドメイン配列をもたらした。
サイズ除外クロマトグラフィー解析
サイズ除外クロマトグラフィーを使用して、抗ＣＤ７１ ＦＮ３ドメインの凝集状態を決定した。各精製ＦＮ３ドメインのアリコート（１０μＬ）を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ５／１５０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）へと、ｐＨ７．４のＰＢＳによる移動相中の流量を、１分間当たり０．３ｍＬとして注入した。カラムからの溶出は、２８０ｎｍにおける吸光度によりモニタリングした。Ｔｅｎｃｏｎタンパク質を、対照として、各試行に組み入れた。Ａｇｉｌｅｎｔ製のＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、溶出プロファイルを解析した。
ハイスループットの発現およびコンジュゲーション
同定されたクローンを、２４ウェル深底ブロックプレート内の５ｍＬの培養物中、二連で増殖させた。略述すると、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを補充された、ウェル１つ当たり５ｍＬのＴＢ培地に、一晩にわたる培養物１５０μＬを播種し、２２０ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で、約３時間にわたり増殖させた（ＯＤ６００≒１）。培養物を、３７℃、２２０ｒｐｍで、さらに４時間にわたり、ＩＰＴＧにより、１ｍＭの最終濃度へと誘導した。２２５０×ｇで、１５分間にわたる遠心分離により、細菌ペレットを回収した。０．２ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ）を補充された、ウェル１つ当たり６００μＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ ＨＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、各ウェルへと添加し；ピペットにより、ペレットを解離させ、次いで、ペレットが溶解するまで、プラットフォームシェーカー上で、約３０分間にわたり、強く振盪した。プレートを、２２５０×ｇで、１５分間にわたりスピンして、溶解物を清澄化させ、各試料について、２６００μＬずつのアリコートを組み合わせた。製造元の指示書に従い、Ｈｉｓタグ付けＦＮ３ドメインを、Ｈｉｓ Ｔｒａｐプレート（ＧＥ）上で精製するのに続き、Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ ７Ｋ脱塩プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＴＢＳへの緩衝液交換を行った。Ｎａｎｏｄｒｏｐにより、タンパク質濃度を評価した。ＧｌｙＧｌｙ－ＶＣ－ＭＭＡＦ（配列番号３１０）とのコンジュゲーションのために、ＦＮ３ドメイン（３０μＭ）を、２００μＬの総容量中に、１５０μＭのＧｌｙＧｌｙＶＣ－ＭＭＡＦ（配列番号３１０）（Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ）、および１μＭのソルターゼＡと共に混合した。室温で、１．５時間にわたり、コンジュゲーションを進行させ、製造元の指示書に従い、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製の、９６ウェルＨｉｓ Ｍｕｌｔｉｔｒａｐ ＨＰプレートを使用して、再度精製した。Ｚｅｂａ脱塩プレートを使用して、ＰＢＳとの緩衝液交換を達成するのに続き、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ ＨＴＳ ＧＶプレート（Ｄｕｒａｐｏｒｅ）を使用し、３０００×ｇで、２分間にわたる遠心分離を伴う滅菌濾過を行った。Ｎａｎｏｄｒｏｐにより、濃度を評価した。
ＣＤ７１媒介ＳＫ－ＢＲ３細胞殺滅アッセイ
細胞殺滅は、システイン変異体－細胞毒素コンジュゲートへの曝露の後における、ＣＤ７１過剰発現ヒト腫瘍細胞系である、Ｈ１５７３の生存率を、ＳＫＢＲ３と共に測定することにより評価した。細胞を、黒色透明底ウェル組織培養物処理プレート（Ｆａｌｃｏｎ：３５３２１９）内、５％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）を伴う、ウェル１つ当たり１００μＬのフェノールレッド非含有ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ：１１８３５－０３０）中に、ウェル１つ当たり７０００個で播種した。加湿５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で、一晩にわたり、細胞を付着させた。培地を、９６ウェルプレートから吸引し、細胞を、５０ｕＬの新鮮培地、および新鮮培地中で作製された、５０ｕＬの２倍濃度阻害剤で処理した。細胞生存率は、７０時間後において、Ｃｅｌｌ ＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を伴うエンドポイントアッセイにより決定した。ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、データを、傾きを可変とするＳ字型用量反応曲線についての式へと当てはめることにより決定した。
用量反応ＥＬＩＳＡによる、選択されたクローンの結合
選択されたクローンを、ＥＬＩＳＡにより解析して、結合についてのＥＣ５０値を決定した。略述すると、Ｍａｘｉｓｏｒｂプレートを、５μｇ／ｍｌのストレプトアビジンにより、４℃で、一晩にわたりコーティングした。次いで、プレートを、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により、室温で、１時間にわたりブロッキングし、次いで、ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄した。ビオチニル化ＣＤ７１（２μｇ／ｍｌ）を、ストレプトアビジンプレートへと捕捉し、系列希釈されたＦＮ３タンパク質を、適切なウェルへと、室温で、１時間にわたり添加した。洗浄の後、結合したＦＮ３タンパク質を、ＨＲＰへとコンジュゲートされた、抗Ｖ５タグ抗体、およびペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）基質、ならびに発光プレートリーダーにより検出した。発光値を、濃度の関数としてプロットし、ＰＲＩＳＭを使用して、用量反応曲線へと当てはめて、結合についてのＥＣ５０値を決定した。
毒素コンジュゲートを介する、内部化ＦＮ３ドメインの同定：ＮＥＭコンジュゲーションについて記載された方法を使用して、酵素切断型Ｖａｌ－Ｃｉｔリンカーまたは非切断型ＰＥＧ４リンカーを介して、ＦＮ３ドメインを、細胞傷害性チューブリン阻害剤である、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）へとコンジュゲートした（ＶＣ－ＭＭＡＦ）。細胞殺滅は、システイン変異体－細胞毒素コンジュゲートへの曝露の後における、ＳＫＢＲ－３細胞の生存率を測定することにより評価した。細胞を、白色不透明底ウェル組織培養物処理プレート（Ｆｉｓｈｅｒ：ＰＩ１５０４２）内、１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）を伴う、ウェル１つ当たり５０μＬのフェノールレッドＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ：１１８７５０９３）中に、ウェル１つ当たり３０００個で播種した。加湿５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で、一晩にわたり、細胞を付着させた。細胞を、２５ｕＬの新鮮培地、および新鮮培地中で作製された、２５ｕＬの４倍濃度阻害剤で処理した。細胞生存率は、７２時間後において、Ｃｅｌｌ ＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を伴うエンドポイントアッセイにより決定した。ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、データを、傾きを可変とするＳ字型用量反応曲線についての式へと当てはめることにより決定した。
二価ＦＮ３タンパク質
反復４回のＧ／Ｓリンカー、または他の適切なポリペプチドリンカーにより接続された、２つのＦＮ３ドメインを使用して、二価ＦＮ３タンパク質を作製した。記載される通りに、二価ＦＮ３タンパク質を、ＶＣ－ＭＭＡＦへとコンジュゲートし、ＳＫ－ＢＲ３細胞内の細胞傷害作用について評価した。二価分子についてのＩＣ５０値は、しばしば、一価形より良好であることが見出された。
トランスフェリンへの結合および内部化についての競合
上記で記載された細胞傷害作用アッセイを使用して、ＦＮ３ドメインｖｃＭＭＡＦコンジュゲートを、ヒトトランスフェリンとの競合についてスクリーニングした。ＦＮ３ドメインを、０．６ｕＭのヒトホロトランスフェリン（Ｔ０６６５－１００ＭＧ）の非存在下または存在下においてスクリーニングした。
ｐＨｒｏｄｏ－Ｔｆアッセイ
ＣＤ７１ターゲティングセンチリンを、トランスフェリン受容体への結合についてトランスフェリンと競合する、それらの能力について査定した。細胞を、酸性コンパートメント内で蛍光発光するので、細胞内のエンドソームコンパートメントおよびリソソームコンパートメントへの取込み時に目視可能な色素である、ｐＨｒｏｄｏ－Ｒｅｄへと直接コンジュゲートされたトランスフェリンで処理した。ｐＨｒｏｄｏ－トランスフェリン（ｐＨｒｏｄｏ－Ｔｆ）のイメージングは、Ｔｆの取込みについての、リアルタイムの測定を可能とする、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ上で実施した。細胞を、ｐＨｒｏｄｏ－Ｔｆ、およびＣＤ７１への結合についてＴｆと競合する分子と共にインキュベートすると、ｐＨｒｏｄｏシグナルは、低減されるか、または消失する。ＣＤ７１への結合についてＴｆと競合しないセンチリンは、ｐＨｒｏｄｏシグナルに対して、影響を及ぼさない。
ＣＤ７１に結合するが、トランスフェリンと競合的ではない、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの選択
トランスフェリンと競合的ではないか、または競合が最小限である、ＣＤ７１結合性ＦＮ３ドメインを同定するために、バイアスＣＩＳディスプレイ戦略をデザインした。略述すると、ヒトＣＤ７１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）についての、５ラウンドにわたるパニングの後で回収されたアウトプットを使用し（実施例３）、さらなるラウンドにわたるオフ速度選択も、実施例３に記載される通りに実施したが、１）最終的な溶出工程の前に、トランスフェリンと同じ部位に結合したＦＮ３タンパク質を溶出させる、ヒトホロトランスフェリンによる洗浄工程；または２）モノクローナル抗体であるＯＫＴ９による、ＦＮ３ドメイン結合剤の溶出を追加した。トランスフェリン洗浄戦略およびＯＫＴ９溶出戦略から回収されたＦＮ３ドメインを、既に記載されている通りに、ＰＣＲ増幅し、ｐＥＴベクターへとクローニングした（実施例３）。ｈｕＣＤ７１に、特異的に結合した、２２８のＦＮ３ドメインを、溶液ＥＬＩＳＡにより、ｈｕＣＤ７１ ＥＣＤへの結合について確認した。固有の結合剤のサブセットは、ＳＥＣにより解析し、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）へとコンジュゲートし、ヒトホロトランスフェリンを伴う／伴わないＳＫＢＲ－３細胞内における細胞生存率アッセイを介して、内部化について評価した。ポリペプチドは、受容体により内部化されることが見出された。Ｉｎｔｅｇｒａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社が、メンブレンプロテオームアレイ（ＭＰＡ）アッセイを実施して、ＡＢＸ１１９８（配列番号２０９）、ＡＢＸ１１４２（配列番号２０９＋Ｈｉｓタグ）、およびＡＢＸ１１００（配列番号２０９＋リンカーを伴うｓｉＲＮＡ対）の特異性を、ヒト膜タンパク質のライブラリーに対してプロファイリングした。ＭＰＡライブラリーは、全ての１回膜貫通型タンパク質、複数回膜貫通型タンパク質、およびＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を含む、ＧＰＩアンカータンパク質、イオンチャネル、および輸送体のうちの９４％を含み、各膜タンパク質が、ニワトリＱＴ６細胞バックグラウンド内で固有に発現された、６０００を超えるヒト膜タンパク質を含有した。フローサイトメトリーを使用して、非固定細胞内で、個別に発現された膜タンパク質に結合するリガンド（ＦＮ３ドメイン）を直接検出した。
ＡＢＸ１１９８（配列番号２０９）、ＡＢＸ１１４２（配列番号２０９＋Ｈｉｓタグ）およびＡＢＸ１１００（配列番号２０９＋リンカーを伴うｓｉＲＮＡ対）は、それぞれ、最適のシグナル／バックグラウンドノイズ比、１．２５ｕｇ／ｍｌ、１．２５ｕｇ／ｍｌ、および０．３１ｕｇ／ｍｌを伴う濃度で、ＭＰＡに対してスクリーニングした。スクリーニングで同定された膜タンパク質標的は、リガンドの系列希釈液、および同定された標的を個別にトランスフェクトされた細胞を使用する、検証手順において追跡した。
ＣＤ７１ ＦＮ３ドメイン－オリゴヌクレオチドコンジュゲートを使用する、筋細胞内のｍＲＮＡのノックダウン
ＦＮ３ドメインへと固有に操作されたシステインを介する、マレイミド化学反応を使用して、ｍｕＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインを、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）へとコンジュゲートする。システイン置換は、本明細書で提示され、また、参照によってその全体を本明細書に組み入れる、米国特許出願公開第２０１５０１０４８０８号においても提示されているシステイン置換などのシステイン置換でありうる。ｓｉＲＮＡまたは ＡＳＯは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、標準的な化学修飾で修飾され、標的ｍＲＮＡのノックダウンを可能とすることを確認される。ＦＮ３ドメイン－オリゴヌクレオチドコンジュゲートを、マウスへと、オリゴヌクレオチドペイロードの最大用量を１０ｍｇ／ｋｇとして、静脈内投与した。投与後の多様な時点において、マウスを屠殺し、骨格筋、心臓筋肉、および他の多様な組織を回収し、必要となるまで、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中で保管した。標準的なｑＰＣＲΔΔＣＴ法、ならびに標的遺伝子および対照遺伝子に特異的なプライマーを使用して、標的遺伝子のノックダウンを評価した。標的遺伝子は、筋内でノックダウンされることが見出され、このようなノックダウンは、ｓｉＲＮＡまたは ＡＳＯを、ＦＮ３のＣＤ７１結合性ドメインとコンジュゲートすることにより増強された。
アフィニティー成熟パニング：
ＣＤ７１頂端ドメインへの選択的結合を裏付けた、４つの配列（Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）を、アフィニティー成熟ライブラリーの基盤とした。各配列内で、拡張シートライブラリーの一部である、４つのアミノ酸（二重下線を付された）を、１８のアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンであり、プロリン、メチオニンを含まない）へとランダム化した。新たなライブラリーは、４ラウンドに対する選択：ａ）トランスフェリンの洗浄；ｂ）ＯＫＴ９による溶出；ｃ）頂端ドメインによる選択；ｄ）頂端ドメインである、ＣＤ７１＿ＥＣＤによる選択を経た。下記の配列番号２８８～２９１の配列を参照されたい。
Figure 2024517610000058
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ＦＮ３－ｓｉＲＮＡのコンジュゲーションおよび精製
マレイミド修飾ｓｉＲＮＡを使用する、システイン特異的化学反応を介して、システイン修飾ＣＤ７１ ＦＮ３－４９（配列番号２７２）の、ＡＢＸ０２１４（表６）へのコンジュゲーションにより、ＡＢＸ１００５を調製した。システイン-マレイミドコンジュゲーションのために、ＰＢＳ中に５０～２００μＭの、システイン含有ＦＮ３ドメインを、１０ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）により、室温で（３０分間）還元して、遊離チオールをもたらした。ＴＣＥＰを除去するために、ＦＮ３タンパク質を、飽和硫酸アンモニウム溶液により沈殿させ、次いで、直前に水中で溶解させたマレイミド修飾ｓｉＲＮＡ二重鎖と、ＦＮ３－タンパク質：ｓｉＲＮＡのモル比を、約１．５：１として、混合した。室温または３７℃で、１時間にわたるインキュベーションの後、反応を、Ｎ－エチルマレイミド（反応混合物の最終ＮＥＭ濃度を１ｍＭとする）でクエンチした。
Figure 2024517610000085
ＦＮ３－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、反応しなかったｓｉＲＮＡリンカーを除去する、ＩＭＡＣクロマトグラフィー（ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ）と、反応しなかったＦＮ３タンパク質を除去する、アニオン交換クロマトグラフィー－Ｃａｐｔｏ－ＤＥＡＥとを使用する、２工程で精製した。ＦＮ３タンパク質－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、ＰＡＧＥ、解析用サイズ除外クロマトグラフィー、およびＬＣ／ＭＳにより特徴づけた。コンジュゲートの濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用して、Ａ２６０におけるコンジュゲート溶液の吸光度に基づき計算した。
マウスにおける、ＦＮ３－ｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ活性
雄ＣＤ－１マウスを、ｓｉＲＮＡを１０ｍｇ／ｋｇとする、ＡＢＸ１００５（ｓｉＲＮＡへとコンジュゲートされたＣＤ７１ ＦＮ３ドメイン）、または等モル用量のＡＢＸ１００７（ＦＮ３だけの対照）の、１または３回の静脈内投与で処置した。組織は、最終回投与の２週間後に回収し、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）による、ＡＨＡ－１ノックダウン解析のために加工した。１８ＳリボソームＲＮＡを、ＲＴ－ＰＣＲ内因性対照遺伝子として使用した。ノックダウンレベルを、媒体処置マウスと比較した。ＡＨＡ－１の、ｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンは、本研究で解析された、全ての筋肉群において観察された（腓腹筋、大腿四頭筋、心臓）（図１）。
雄Ｃ５７／ＢＬ６マウスを、ｓｉＲＮＡを１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇとする、ＡＢＸ１００５の、単回静脈内投与で処置した。組織は、単回投与の２週間後に回収し、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）による、ＡＨＡ－１ノックダウン解析のために加工した。１８ＳリボソームＲＮＡを、ＲＴ－ＰＣＲ内因性対照遺伝子として使用した。ノックダウンレベルを、媒体処置マウスと比較した。ＡＨＡ－１の、用量依存的ノックダウンは、本研究で解析された、全ての筋肉群において観察された（腓腹筋、大腿四頭筋、横隔膜、心臓）（図２）。
これらの実施例は、本明細書で提示される、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインなどのＦＮ３ドメインへとコンジュゲートされたｓｉＲＮＡ分子が、ｓｉＲＮＡ分子のほか、他の活性部分を、特異的組織へと送達し、特異的標的の発現を調節するのに使用されることを裏付ける。
ＣＤ７１ ＦＮ３ドメイン－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの結合特異性
Ｉｎｔｅｇｒａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（ｗｗｗ．ｉｎｔｅｇｒａｌｍｏｌｅｃｕｌａｒ．ｃｏｍ）が、同社に特許権のあるメンブレンプロテオームアレイ（ＭＰＡ）アッセイを実施して、ＣＤ７１ ＦＮ３ドメインおよびＣＤ７１ ＦＮ３ドメイン－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの特異性を、ヒト膜タンパク質のライブラリーに対してプロファイリングした（図３）。ＭＰＡは、全ての１回膜貫通型タンパク質、複数回膜貫通型タンパク質、およびＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を含む、ＧＰＩアンカータンパク質、イオンチャネル、および輸送体のうちの９４％に及び、各膜タンパク質が、ニワトリＱＴ６細胞バックグラウンド内で固有に発現された、６０００を超えるヒト膜タンパク質を含有した。フローサイトメトリーを使用して、非固定細胞内で、個別に発現された膜タンパク質に結合するＦＮ３ドメインを直接検出した。
ＦＮ３ドメイン、およびＦＮ３ドメイン－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、それぞれ、最適のシグナル／バックグラウンドノイズ比を伴う、１．２５ｕｇ／ｍｌまたは０．３１ｕｇ／ｍｌの濃度で、ＭＰＡに対してスクリーニングした。スクリーニングで同定された膜タンパク質標的は、リガンドの系列希釈液を、同定された標的を固有に発現する細胞上で使用して検証した。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ＣＤ７１センチリンコンジュゲートと、ＣＤ７１モノクローナル抗体コンジュゲートとの比較
本研究における、本発明者らの目的は、ツールであるセンチリン－ＡＨＡ１コンジュゲートの薬力学活性の持続時間を、ＡＨＡ１ ｓｉＲＮＡとコンジュゲートされたモノクローナル抗体であるＲ１７と比較して決定することであった。雄Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスに、１０ｍｇのＡＨＡ１ ｓｉＲＮＡを含有する、１７．９ｍｇのツールであるセンチリン－ＡＨＡ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲート、または１０ｍｇのＡＨＡ１ ｓｉＲＮＡを含有する、１２０ｍｇの、ＡＨＡ１ ｓｉＲＮＡとコンジュゲートされたモノクローナル抗体であるＲ１７の、単回静脈内ボーラスを投与した。いずれの方向においても、０．５ｃｍを越えない、腓腹筋組織を、投与の２、４、および８週間後の時点（時点１つあたりのＮ＝３である）において、ＲＮＡｌａｔｅｒ中に回収して、ＲＮＡｌａｔｅｒの良好な浸透を確保し、４℃で、２４時間にわたり保管してから、－８０℃で保管した。Ｑｉａｇｅｎ製のＲＮｅａｓｙ Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｔｉｓｓｕｅキットを使用して、腓腹筋から、全ＲＮＡを単離した。リアルタイム定量的ＰＣＲを使用して、標的ＡＨＡ１および内因性対照であるＰｇｋ１の発現レベルを測定した。データは、媒体単独を投与された対照動物に対して正規化されたΔΔＣｔ法を使用して解析した。処置群内の各動物についての、ＡＨＡ１およびＰｇｋ１の遺伝子発現レベルを、３つの媒体対照の平均と比べて提示した。ツールであるＡＨＡ１－ｓｉＲＮＡコンジュゲート処置群内、およびＡＨＡ１ ｓｉＲＮＡとコンジュゲートされたモノクローナル抗体であるＲ１７処置群内の、ＡＨＡ１ ｍＲＮＡのノックダウン百分率は、残りのＡＨＡ１ ｍＲＮＡレベルの百分率を、１００から減算することにより測定した。
ＣＤ７１センチリンコンジュゲートは、わずかなｍＡｂコンジュゲート用量で、遺伝子ノックダウンの維持を駆動する。Ｃ５７／Ｂ６マウスに、単回投与用量（１０ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ）の被験コンジュゲートを施した。ＡＨＡ１の相対ＲＮＡ発現を、投与の２週間後、投与の４週間後、および投与の８週間後において、腓腹筋内で測定した。図４および表７は、筋内のｍＲＮＡノックダウンについて、同等の活性を裏付けるデータを提示するが、ＣＤ７１センチリンコンジュゲートが要求するコンジュゲート用量は、はるかに少量である。
Figure 2024517610000086
センチリン－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の骨格筋内および心内で活性である
ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎでコーティングされた９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ：１５１１６）を、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で洗浄し、ブロッキング緩衝液（Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ Ｔ２０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ：３７５３９）により、３０分間にわたりブロッキングした。ビオチニル化抗原（ヒトＣＤ７１－ＥＣＤ［Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：ＴＦＲ－Ｈ８２４３］、またはカニクイザルＣＤ７１－ＥＣＤ［Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：ＴＦＲ－Ｃ８２４９］）を、２０ｎＭの濃度で、ブロッキングされたプレート上に固定化し、室温で、１時間にわたりインキュベートした。センチリン試料を、ブロッキング緩衝液中で希釈し、１０００ｎＭ～０．０１６９ｎＭにおいて滴定し、室温で、２時間にわたりインキュベートした。プレートを、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄した。抗センチリン抗体を、ブロッキング緩衝液中に１：２５００で調製し、プレートへと添加し、１時間にわたりインキュベートした。プレートを、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄した。抗ウサギＨＲＰ抗体を、ブロッキング緩衝液中に１：２５００で調製し、プレートへと添加し、１時間にわたりインキュベートした。プレートを、洗浄し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐａｒａｄｉｇｍ上のＥＬＩＳＡ基質（Ｒｏｃｈｅ：１１５８２９５０００１）により読み取った。図５および表８は、ＣＤ７１センチリンならびにＣＤ７１センチリンコンジュゲートが、ヒトＣＤ７１およびカニクイザルＣＤ７１の両方に効果的に結合し、ｓｉＲＮＡコンジュゲートが、ＣＤ７１センチリンの結合に干渉しないことを裏付けるデータを提示する。
Figure 2024517610000087
本研究の目的は、センチリン－ＡＨＡ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートの薬力学（ＰＤ）活性を、カニクイザルモデルにおいて決定することであった。毎週１回、右伏在静脈におけるＩＶボーラスを介して、３週間にわたり、２匹の雄カニクイザルを、１０ｍｇ／ｋｇのＡＨＡ１ ｓｉＲＮＡ（Ｎ＝２）を含有する、１７．１２ｍｇ／ｋｇのセンチリン－ＡＨＡ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲート、または媒体（Ｎ＝２）で処置した。最終回投与の４週間後、骨格筋組織（左および右の腓腹筋、左および右の大腿四頭筋、横隔膜、左および右の大腿二頭筋、ヒラメ筋）、平滑筋組織（空腸）、左および右の心臓組織、ならびに非骨格筋組織（皮膚、肝臓、および腎臓）を採取し、ＲＮＡｌａｔｅｒ中で保管して、ＲＮＡｌａｔｅｒの良好な浸透を確保し、４℃で、２４時間にわたり保管した。Ｑｉａｇｅｎ製のＲＮｅａｓｙ Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｔｉｓｓｕｅキットを使用して、これらの組織から、全ＲＮＡを単離した。標的ＡＨＡ１、および内因性対照（ＡＲＬ１、ＡＲＦＧＡＰ２、ＨＰＲＴ１、ＧＡＰＤＨ、およびＧｙｓ１）の発現レベルは、リアルタイム、定量的ＰＣＲにより測定した。データは、媒体単独を投与された対照動物に対して正規化されたΔΔＣｔ法を使用して解析した。平均２例の試料（組織の各側に由来する１例の生検）、または１例の試料（１例の生検）を、解析のために採取した。センチリン－ＡＨＡ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲート処置群内、および媒体群内の、ＡＨＡ１ ｍＲＮＡのノックダウン百分率は、残りのＡＨＡ１ ｍＲＮＡレベルの百分率を、１００から減算することにより測定した。各組織内で、ＡＨＡ１ノックダウンの百分率を、ＡＨＡ１ノックダウンの最大量から、最小量への順に示す。
センチリン－ＡＨＡ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、カニクイザルのｉｎ ｖｉｖｏの筋内および心内におけるｍＲＮＡレベルを、効果的にノックダウンした（図６を参照されたい）。カニクイザルには、１０ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡで、毎週３回投与した。ｍＲＮＡレベルは、３回の投与後である、２８日目に評価した。
一般的方法
分子生物学における標準的方法については記載されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓ（１９８２および１９８９、２版；２００１、３版）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；Ｗｕ（１９９３）、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」、２１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。標準的方法はまた、細菌細胞におけるクローニングおよびＤＮＡの突然変異誘発（１巻）、哺乳動物細胞および酵母におけるクローニング（２巻）、糖コンジュゲートおよびタンパク質の発現（３巻）、ならびにバイオインフォマティクス（４巻）について記載する、Ａｕｓｂｅｌら（２００１）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１～４巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹにおいても見られる。
免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、および結晶化を含む、タンパク質精製のための方法について記載されている（Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ」、１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。タンパク質の化学解析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の作製、グリコシル化について記載されている（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ」、２巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００１）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、３巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹ、１６．０．５～１６．２２．１７頁；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏ．（２００１）、「Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、４５～８９頁；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１）、「ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ」、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．、３８４～３９１頁を参照されたい）。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の作製、精製、および断片化について記載されている（Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９９９）、「Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出）。リガンド／受容体相互作用を特徴付けるための標準的技法は利用可能である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、４巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。
本明細書で引用される、全ての参考文献を、各個別の刊行物、データベース登録番号（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅ ＩＤ登録番号）、特許出願、または特許を、参照によって組み入れることが、具体的に、かつ、個別に指し示された場合と同じ程度に、参照によって組み入れる。参照による組み入れについてのこの言明は、このような引用が、参照による組み入れについての専一的な言明に近接してなされていない場合であってもなお、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（１）に従い、本出願者らにより、それらの各々が、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（２）に準拠して、明らかに同定される、各個別の刊行物、データベース登録番号（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅ ＩＤ登録番号）、特許出願、または特許、およびあらゆる個別のこれらの引用物に関することが意図される。存在する場合、本明細書内における、参照による組み入れについての専一的な言明の組入れは、いかなる形でも、参照による組み入れについてのこの一般的な言明を無化しない。本明細書における参考文献の引用は、参考文献が、関連する先行技術であることの容認として意図されず、これらの刊行物または文献の内容または刊行年月日についてのいかなる容認も構成しない。
本実施形態は、本明細書で記載される、具体的実施形態による範囲内に限定されないものとする。実際、当業者には、前出の記載から、本明細書で記載される実施形態に加えた、実施形態の多様な改変が明らかとなろう。このような改変は、付属の特許請求の範囲内に収まることが意図される。
前出の明細書は、当業者が、実施形態を実施することを可能とするのに十分であると考えられる。当業者には、前出の記載から、本明細書で示され、記載される実施形態に加えた、実施形態の多様な改変が明らかとなり、付属の特許請求の範囲内に収まる。

Claims (53)

  1. ポリペプチドであって、配列番号２７３のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
  2. 配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のうちの２つを含む、請求項２に記載のポリペプチド。
  4. トランスフェリンの、ＣＤ７１への結合と競合しない、ＣＤ７１上の部位において、ヒトＣＤ７１に結合するポリペプチド。
  5. 配列番号２７３の配列を有するポリペプチドと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のポリペプチド。
  6. 配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６の配列を含む、請求項４に記載のポリペプチド。
  7. 検出用標識、オリゴヌクレオチド、治療剤、またはこれらの任意の組合せへとコンジュゲートされた、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  8. 検出用標識は、放射性同位体、磁気ビーズ、金属製ビーズ、コロイド状粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンである、請求項７に記載のポリペプチド。
  9. 検出用標識は、アウリスタチン、モノメチルアウリスタチンフェニルアラニン、ドロスタチン、化学療法剤、薬物、増殖阻害剤、毒素、または放射性同位体である、請求項７または８に記載のポリペプチド。
  10. 治療剤は、化学療法剤、薬物、抗体、増殖阻害剤、毒素、放射性同位体、抗チューブリン薬剤、ポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ分子またはそのセンス鎖もしくはアンチセンス鎖、アンチセンス分子またはその鎖、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤、抗生剤、抗葉酸剤、代謝拮抗剤、化学療法増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤、またはビンカアルカロイドである、請求項７に記載のポリペプチド。
  11. 治療剤は、遺伝子の発現、ＲＮＡの発現またはＲＮＡレベル、チューブリンへの結合、ＤＮＡへの結合、トポイソメラーゼの阻害、ＤＮＡの架橋、キレート化、スプライセオソームの阻害、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）の阻害、またはヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の阻害をモジュレートすることにより、１つまたはそれ以上の細胞傷害効果を誘発しうる、請求項７に記載のポリペプチド。
  12. ポリペプチドのＮ末端において、メチオニンをさらに含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  13. 半減期延長部分とカップリングされた、請求項１～１２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  14. 半減期延長部分は、アルブミン結合性分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン、アルブミン変異体、免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部である、請求項１３に記載のポリペプチド。
  15. アルブミン結合性分子は、アルブミンまたはアルブミン変異体に結合する、第２のポリペプチドである、請求項１４に記載のポリペプチド。
  16. 請求項１～１５のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
  17. ベクターであって、請求項１６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  18. 宿主細胞であって、請求項１７に記載のベクターを含む宿主細胞。
  19. ＣＤ７１に結合するポリペプチドを作製する方法であって、請求項１８に記載の、分離された宿主細胞を、ポリペプチドが発現される条件下で培養する工程と、ポリペプチドを精製する工程とを含む方法。
  20. 医薬組成物であって、請求項１～１５のいずれか１項に記載のポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  21. 請求項１～１５のいずれか１項に記載のポリペプチドに結合する抗イディオタイプ抗体。
  22. キットであって、請求項１～１５のいずれか１項に記載のポリペプチドを含むキット。
  23. それを必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、対象へと、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６など、本明細書で提示されるポリペプチドを、治療剤と共に投与する工程を含む方法。
  24. がんは、脳がんである、請求項２３に記載の方法。
  25. それを必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、対象へと、抗ウイルス剤、免疫系調節剤、または核酸分子とコンジュゲートされた、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６など、本明細書に記載されるポリペプチドを投与する工程を含む方法。
  26. がん性疾患は、神経膠芽腫である、請求項２５に記載の方法。
  27. 腫瘍組織内のＣＤ７１発現がん細胞を検出する方法であって、
    ａ）対象から、腫瘍組織の試料を得る工程；および
    ｂ）腫瘍組織の試料を、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のうちの１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させ、ＣＤ７１と、ポリペプチドとの結合を検出することにより、ＣＤ７１が、腫瘍組織内で発現されるのかどうかを検出する工程
    を含む方法。
  28. ＣＤ７１発現細胞を分離する方法であって、
    ａ）対象から、試料を得る工程；
    ｂ）試料を、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のうちの１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させる工程；および
    ｃ）ポリペプチドに結合した細胞を分離する工程
    を含む方法。
  29. 腫瘍組織内のＣＤ７１発現がん細胞を検出する方法であって、
    ａ）配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６のうちの１つのアミノ酸配列を含むペプチドを、検出用標識とコンジュゲートして、コンジュゲートを形成する工程；
    ｂ）コンジュゲートを、対象へと投与する工程；および
    ｃ）コンジュゲートが結合したＣＤ７１発現がん細胞を視覚化する工程
    を含む方法。
  30. 神経学的状態および／または脳腫瘍を処置する方法であって、対象へと、請求項２０に記載の医薬組成物を投与する工程を含む方法。
  31. 脳腫瘍は、非悪性脳腫瘍、良性脳腫瘍、および悪性脳腫瘍からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
  32. 悪性脳腫瘍は、星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫（松果体腫）、多形性神経膠芽腫、希突起神経膠腫、神経鞘腫、網膜芽細胞腫、または脊髄がん、例えば、神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、および肉腫からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
  33. 脳腫瘍は、先天性腫瘍である、請求項３１に記載の方法。
  34. 神経学的状態は、脳卒中、糖尿病、発作、高血圧性脳症、後天性免疫不全症候群、外傷性脳傷害、多発性硬化症、パーキンソン病（ＰＤ）、およびアルツハイマー病からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
  35. 目的の薬剤を、ＣＤ７１陽性細胞へと送達する方法であって、細胞を、請求項１～１５のいずれか１項に記載のポリペプチドなど、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインとカップリングされた、目的の薬剤と接触させる工程を含む方法。
  36. 目的の薬剤は、ＣＤ７１により媒介される相互作用を介して、細胞へと内部化される、請求項３５に記載の方法。
  37. ＦＮ３ドメインは、トランスフェリンの、ＣＤ７１への結合と競合しない、請求項３５に記載の方法。
  38. 目的の薬剤は、化学療法剤、薬物、増殖阻害剤、毒素、放射性同位体、抗チューブリン剤、ポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ分子、アンチセンス分子、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤、抗生剤、抗葉酸剤、代謝拮抗剤、化学療法増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤、またはビンカアルカロイドである、請求項３３～３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. ＦＮ３ドメインは、配列番号１～７、１０、１２～２１９、２２１～２７２、２９２～２９９、または３０４～３０６の配列を含む、請求項３５～３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 細胞は、筋細胞である、請求項３５～３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 細胞は、脳細胞、または血液脳関門の内部の細胞である、請求項３５～３９のいずれか１項に記載の方法。
  42. トランスフェリンの、ＣＤ７１への結合と競合したり、これを阻害したりしない部位において、ＣＤ７１に結合するＦＮ３タンパク質を同定する方法であって、
    トランスフェリン、またはＣＤ７１のトランスフェリン結合性部位に結合する薬剤の存在下で、ＣＤ７１を、被験ＦＮ３タンパク質と接触させる工程；および
    トランスフェリン、またはＣＤ７１のトランスフェリン結合性部位に結合する薬剤の存在下で、ＣＤ７１に結合する被験ＦＮ３タンパク質を同定する工程
    を含む方法。
  43. トランスフェリン、またはＣＤ７１のトランスフェリン結合性部位に結合する薬剤の存在下で、ＣＤ７１に結合する被験ＦＮ３タンパク質を分離する工程をさらに含む、請求項４２に記載の方法。
  44. トランスフェリン、またはＣＤ７１のトランスフェリン結合性部位に結合する薬剤の存在下で、ＣＤ７１に結合する被験ＦＮ３タンパク質をシーケンシングする工程をさらに含む、請求項４２または４３に記載の方法。
  45. トランスフェリン、またはＣＤ７１のトランスフェリン結合性部位に結合する薬剤の存在下で、ＣＤ７１に結合する被験ＦＮ３タンパク質をコードする核酸配列を調製するか、または得る工程をさらに含む、請求項４２～４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. トランスフェリン、またはＣＤ７１のトランスフェリン結合性部位に結合する薬剤の存在下で、ＣＤ７１に結合する被験ＦＮ３タンパク質を、トランスフェリン、またはＣＤ７１のトランスフェリン結合性部位に結合する薬剤の存在下で、ＣＤ７１に結合する被験ＦＮ３タンパク質をコードする核酸配列から発現させる工程をさらに含む、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 被験ＦＮ３タンパク質は、細胞内で発現される、請求項４６に記載の方法。
  48. 発現された被験ＦＮ３タンパク質を分離および／または精製する工程をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
  49. 請求項４２～４８のいずれか１項に記載の方法に従い同定されるＦＮ３タンパク質。
  50. 医薬組成物であって、請求項４９に記載のＦＮ３タンパク質を含む医薬組成物。
  51. 請求項４９に記載のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
  52. ベクターであって、請求項５１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  53. 宿主細胞であって、請求項５２に記載のベクターを含む宿主細胞。
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