CN117616045A

CN117616045A - 结合cd71的纤连蛋白iii型结构域

Info

Publication number: CN117616045A
Application number: CN202280028641.0A
Authority: CN
Inventors: R·C·阿迪斯; Z·德鲁齐娜; R·V·科拉科夫斯基; S·G·纳德勒; K·T·奥尼尔; 忻尧
Original assignee: Aro Biotherapy
Current assignee: Aro Biotherapy
Priority date: 2021-04-14
Filing date: 2022-04-14
Publication date: 2024-02-27

Abstract

本公开涉及例如可结合CD71的纤连蛋白III型(FN3)结构域的多肽、其缀合物、编码所述分子的经分离核苷酸、载体、宿主细胞以及制备和使用其的方法。在一些实施方案中，所述FN3结构域是经分离的。在一些实施方案中，所述FN3结构域是重组的。在一些实施方案中，所述FN3结构域是非天然存在的。

Description

结合CD71的纤连蛋白III型结构域

相关申请

本申请要求2021年4月14日提交的美国临时专利申请第63/174,752号和2022年3月28日提交的美国临时申请第63/324,431号的优先权，所述申请的全部内容特此通过引用并入。

技术领域

本发明实施方案涉及特异性结合分化簇71(CD71)的纤连蛋白III型结构域(FN3)以及制备和使用所述分子的方法。

背景技术

CD71(也称为转铁蛋白受体1)是跨膜的，其对于细胞中的铁转运至关重要。其在许多肿瘤类型上和血脑屏障处高度表达，并且由此已成为药物递送的重要靶标。在结合至载铁转铁蛋白后，CD71被快速内吞并有效地再循环回到细胞表面。使用CD71抗体药物缀合物的研究表明，靶向CD71可改进药物递送的特异性和选择性并拓宽治疗指数。另外，使用抗CD71单克隆抗体的研究指示，结合亲和力可在实现组织特异性递送(包括平滑肌或骨骼肌递送)和血脑屏障胞吞转运中发挥重要作用。对CD71具有高亲和力的抗体可快速内化并改变正常受体输送，使得受体靶向溶酶体以供降解而非发生再循环。与之相比，对CD71具有低亲和力的抗体容许受体再循环并具有较高脑暴露。

在期望对目标分子具有高亲和力和特异性时，尽管抗体或抗体片段是最广泛使用的治疗蛋白种类，但非抗体蛋白也可经工程化以结合此类靶标。这些“替代架构”蛋白优于传统抗体，这是因为其尺寸小，缺少二硫化键，稳定性高，能够表达于原核宿主中，易于纯化，并且它们易于缀合至药物/毒素、可有效渗透至组织中并易于格式化成多特异性结合剂。

一种此类替代架构是免疫球蛋白(Ig)折叠。这种折叠存在于抗体可变区以及数千种非抗体蛋白中。已证实，一种此类Ig蛋白是来自人类纤连蛋白的第十纤连蛋白III型(FN3)重复，其可耐受表面暴露环中的众多突变并且同时保留整体Ig折叠结构。因此，需要可特异性结合至CD71的FN3结构域；以及使得能够经由受体介导的CD71内化进入细胞内的使用此类分子进行新颖治疗的方法。

发明内容

在一些实施方案中，提供了特异性结合CD71蛋白的FN3结构域(例如多肽)。在一些实施方案中，所述FN3结构域是经分离的。在一些实施方案中，所述FN3结构域是重组的。在一些实施方案中，所述FN3结构域是非天然存在的。

在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306，292-299或304-306，或304-306的氨基酸序列的FN3结构域。在一些实施方案中，所述FN3结构域结合至CD71。在一些实施方案中，所述FN3结构域在人类CD71上不与转铁蛋白竞争结合至CD71的位点处结合至CD71。在一些实施方案中，所述FN3结构域特异性结合至CD71。在一些实施方案中，提供了包含多于一个由接头(例如柔性接头)连结的FN3结构域的多肽。在一些实施方案中，所述多肽包含2、3或4个FN3结构域，所述FN3结构域由结构域之间的一个或多个接头彼此连结。

在一些实施方案中，提供了编码本文所阐述的FN3结构域的经分离多核苷酸。

在一些实施方案中，提供了包含本文所阐述的多核苷酸的载体。

在一些实施方案中，提供了包含本文所阐述的载体的宿主细胞。

在一些实施方案中，提供了产生FN3结构域的方法。在一些实施方案中，所述方法包括培养包含编码或表达FN3结构域的载体的宿主细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括纯化FN3结构域。在一些实施方案中，所述FN3结构域特异性结合CD71。

在一些实施方案中，提供了药物组合物，其包含结合至CD71的FN3结构域和药学上可接受的载剂。

在一些实施方案中，提供了结合FN3结构域(其结合至CD71)的抗独特型抗体。

在一些实施方案中，提供了包含一个或多个FN3结构域的试剂盒。

在一些实施方案中，提供了检测肿瘤组织中的表达CD71的癌细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者获得所述肿瘤组织样品，以及通过使所述肿瘤组织样品与FN3结构域接触并检测CD71蛋白与所述FN3结构域之间的结合来检测CD71蛋白是否在所述肿瘤组织中表达，所述FN3结构域结合包含SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306，或304-306中的一者的氨基酸序列的CD71蛋白。

在一些实施方案中，提供了分离表达CD71的细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者获得样品；使所述样品与FN3结构域接触，所述FN3结构域结合包含SEQID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306，或304-306中的一者的氨基酸序列的CD71蛋白；以及分离结合至所述FN3结构域的细胞。

在一些实施方案中，提供了检测肿瘤组织中的表达CD71的癌细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使FN3结构域缀合至可检测标记以形成缀合物，所述FN3结构域结合包含SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306，或304-306中的一者的氨基酸序列的CD71蛋白；将所述缀合物施用于受试者；以及使所述缀合物所结合的表达CD71的癌细胞可视化。

在一些实施方案中，提供了治疗有需要的受试者的癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用结合至CD71的多肽或药物组合物。在一些实施方案中，所述多肽是结合至CD71的FN3结构域。在一些实施方案中，所述多肽包含例如SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的序列，或如本文所提供连接至或缀合至治疗剂的多肽。

在一些实施方案中，结合至CD71的多肽是针对中枢神经系统。在一些实施方案中，提供了治疗有需要的受试者的神经疾患和/或脑肿瘤的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用结合至CD71的多肽或药物组合物。在一些实施方案中，所述多肽是结合至CD71的FN3结构域。在一些实施方案中，所述多肽包含例如SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的序列，或如本文所提供连接至或缀合至治疗剂的多肽。在一些实施方案中，所述脑肿瘤选自由以下组成的组：非恶性脑肿瘤、良性脑肿瘤和恶性脑肿瘤。在一些实施方案中，所述神经疾患选自由以下组成的组：阿尔茨海默病(Alzheimer'sDisease)、肌萎缩性侧索硬化、帕金森病(Parkinson's Disease)、拉弗拉病(LaforaDisease)、庞贝病(Pompe Disease)、成人葡聚糖体病、中风、脊髓损伤、共济失调、贝尔氏麻痹(Bell's Palsy)、脑动脉瘤、癫痫、抽搐、格林-巴利综合征(Guillain-Barre Syndrome)、多发性硬化、肌营养不良、神经皮肤综合征、偏头痛、脑炎、败血病和重症肌无力。

在一些实施方案中，结合至CD71的多肽是针对肌细胞。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用结合至CD71的多肽或药物组合物。在一些实施方案中，所述多肽是结合至CD71的FN3结构域。在一些实施方案中，所述多肽包含例如SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的序列，或如本文所提供连接至或缀合至治疗剂的多肽。

在一些实施方案中，提供了治疗有需要的受试者的庞贝病(GSD2，酸性α-葡糖苷酶(GAA)缺乏)的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用结合至CD71的多肽或药物组合物。在一些实施方案中，所述多肽是结合至CD71的FN3结构域。在一些实施方案中，所述多肽包含例如SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的序列，或如本文所提供连接至或缀合至治疗剂的多肽。

在一些实施方案中，提供了治疗有需要的受试者的糖原贮积病的方法，所述方法包括施用本文所提供的组合物。在一些实施方案中，所述糖原贮积病选自由以下组成的组：科里病(Cori's disease)或福布斯病(Forbes'disease)(GSD3，糖原脱分支酶(AGL)缺乏)、麦卡德尔病(McArdledisease)(GSD5，肌糖原磷酸化酶(PYGM)缺乏)、II型糖尿病/糖尿病性肾病变、醛醇缩酶A缺乏GSD12、拉弗拉病、低氧症、安德森病(Andersen disease)(GSD4，糖原脱分支酶(GBE1)缺乏)、塔瑞病(Tarui's Disease)(GSD7，肌磷酸果糖激酶(PFKM)缺乏)和成人葡聚糖体病。在一些实施方案中，所述糖原贮积病选自由以下组成的组：糖原合酶(GYS2)缺乏(GSD0)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC/SLC37A4)缺乏(GSD1，冯吉尔克病(vonGierke's disease))、赫尔斯氏病(Hers'disease)(GSD6，肝糖原磷酸化酶(PYGL)或肌磷酸甘油酸变位酶(PGAM2)缺乏)、磷酸化酶激酶(PHKA2/PHKB/PHKG2/PHKA1)缺乏(GSD9)、磷酸甘油酸变位酶(PGAM2)缺乏(GSD10)、肌乳酸脱氢酶(LDHA)缺乏(GSD11)、范可尼-比克尔综合征(Fanconi-Bickel syndrome)(GSD 11，葡萄糖转运蛋白(GLUT2)缺乏)、醛醇缩酶A缺乏(GSD 12)、β-烯醇酶(ENO3)缺乏(GSD13)和肝糖核心蛋白-1(GYG1)缺乏(GSD15)。

在一些实施方案中，所述结合至CD71的多肽是针对免疫细胞。在一些实施方案中，所述结合至CD71的多肽是针对树突状细胞、T细胞、NK细胞或B细胞。在一些实施方案中，提供了治疗有需要的受试者的自身免疫疾病的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用结合至CD71的多肽或药物组合物。在一些实施方案中，所述多肽是结合至CD71的FN3结构域。在一些实施方案中，所述多肽包含例如SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的序列，或如本文所提供连接至或缀合至治疗剂的多肽。在一些实施方案中，所述自身免疫疾病选自由以下组成的组：类风湿性关节炎、桥本氏自身免疫甲状腺炎(Hashimoto's autoimmune thyroiditis)、乳糜泻、1型糖尿病、白癜风、风湿热、恶性贫血/萎缩性胃炎、斑秃和免疫性血小板减少性紫癜。

在一些实施方案中，提供将目标剂递送至CD71阳性细胞中的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使细胞与偶联至结合至CD71的FN3结构域(例如如本文所提供的多肽)的目标剂接触。在一些实施方案中，所述目标剂是化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素、放射性同位素、抗微管蛋白剂、多核苷酸、siRNA分子、反义分子、RNA分子、DNA分子、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷基化剂、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化学疗法敏化剂、拓扑异构酶抑制剂或长春花生物碱。

在一些实施方案中，本文所提供的FN3结构域缀合至多核苷酸、siRNA分子、反义分子、RNA分子或DNA分子。

在一些实施方案中，所述多肽是在不与转铁蛋白竞争结合至CD71或抑制转铁蛋白结合至CD71的位点处结合至CD71的FN3蛋白。

在一些实施方案中，提供了鉴定在不与转铁蛋白竞争结合至CD71或抑制转铁蛋白结合至CD71的位点处结合至CD71的FN3蛋白的方法。

附图说明

图1图解说明在给与FN3多肽(ABX1007)或FN3多肽-siRNA缀合物(ABX1005)后CD-1小鼠的不同组织中的AHA1 mRNA的量化。

图2图解说明在给与FN3-siRNA缀合物(ABX1005)后C57BL6小鼠的不同组织中的AHA1 mRNA的剂量依赖性量化。

图3提供在蛋白质组阵列中使用超过6,000个受体的靶标结合测定的结果，其中数据证实CD71是FN3结构域的唯一结合靶标。

图4提供数据来证实，在给药后2周、4周和8周与mAb缀合物相比CD71 Centyrin缀合物驱动了持续性基因敲低。

图5提供ELISA数据来证实，Centyrin和Centyrin缀合物有效结合人类和食蟹猴CD71。

图6提供数据来证实，Centyrin-siRNA AHA1缀合物能够有效敲低食蟹猴肌肉和心脏中的体内mRNA水平。

具体实施方式

除非上下文另外明确指明，否则如本说明书和所附权利要求书中所使用，单数形式“一(a、an)”和“所述”包括复数个指示物。因此，例如，提及“细胞”包括两个或更多个细胞的组合，等等。

“纤连蛋白III型(FN3)结构域”(FN3结构域)是指通常出现于包括纤连蛋白、腱糖蛋白、细胞内细胞骨架蛋白、细胞因子受体和原核酶在内的蛋白质中的结构域(Bork和Doolittle,Proc Nat Acad Sci USA 89:8990-8994,1992；Meinke等人,J Bacteriol 175:1910-1918,1993；Watanabe等人,J Biol Chem 265:15659-15665,1990)。示例性FN3结构域是存在于人类腱糖蛋白C中的15种不同FN3结构域、存在于人类纤连蛋白(FN)中的15种不同FN3结构域和如例如美国专利第8,278,419号中所阐述的非天然合成FN3结构域。个别FN3结构域是根据结构域编号和蛋白质名称来提及，例如腱糖蛋白第3FN3结构域(TN3)或纤连蛋白第10FN3结构域(FN10)。

术语“捕获剂”是指结合至特定类型的细胞并且使得所述细胞能够与其他细胞分离的物质。示例性捕获剂是磁珠、铁磁流体、囊封试剂、结合特定细胞类型的分子等。

“样品”是指从受试者分离的类似流体、细胞或组织的集合体以及存在于受试者内的流体、细胞或组织。示例性样品是组织活检、细针抽吸液、手术切除的组织、器官培养物、细胞培养物和生物流体，例如血液、血清和浆膜液、血浆、淋巴液、尿液、唾液、囊液、泪滴、粪便、痰液、分泌组织和器官的粘膜分泌物、阴道分泌物、腹水、胸膜、心包膜、腹膜、腹部和其他体腔的流体、通过支气管灌洗收集的流体、滑液、与受试者或生物来源接触的液体溶液(例如细胞和器官培养基，包括细胞或器官条件化培养基)和灌洗液等。

“取代”或“取代的”或“突变”或“突变的”是指改变、缺失或插入多肽或多核苷酸序列中的一个或多个氨基酸或核苷酸以生成所述序列的变体。

“变体”是指与参考多肽或参考多核苷酸因一个或多个修饰(例如取代、插入或缺失)而不同的多肽或多核苷酸。

“特异性结合(specifically bind或specific binding)”是指FN3结构域能够以约1×10^-6M或更小(例如约1×10^-7M或更小、约1×10^-8M或更小、约1×10^-9M或更小、约1×10^-10M或更小、约1×10^-11M或更小、约1×10^-12M或更小、或约1×10^-13M或更小)的解离常数(K_D)结合至其靶标(例如CD71)。或者，“特异性结合”是指在标准溶液ELISA测定中FN3结构域能够以至少5倍于阴性对照的程度结合至其靶标(例如CD71)。也可使用如本文所阐述和图3中所显示的蛋白质组阵列来证实特异性结合。在一些实施方案中，阴性对照是不结合CD71的FN3结构域。在一些实施方案中，特异性结合CD71的FN3结构域可与其他相关抗原(例如与来自其他物种(同系物)，如长尾猴(Macaca Fascicularis)(食蟹猴，cyno)或黑猩猩(Pantroglodytes)(大猩猩)的相同预定抗原)具有交叉反应性。

“文库”是指变体的集合。文库可由多肽或多核苷酸变体构成。

“稳定性”是指分子能够在生理条件下维持折叠状态，使得其保留至少一种其正常功能活性(例如结合至预定抗原如CD71)。

“CD71”是指具有SEQ ID NO:274或275的氨基酸序列的人类CD71蛋白。在一些实施方案中，SEQ ID NO:274是全长人类CD71蛋白。在一些实施方案中，SEQ ID NO:275是人类CD71的细胞外结构域。

SEQ ID NO:274＝人类成熟CD71

MTKEYQDLQHLDNEESDHHQLRKGPPPPQPLLQRLCSGPRLLLLSLGLSLLLLVVVCVIGSQNSQLQEELRGLRETFSNFTASTEAQVKGLSTQGGNVGRKMKSLESQLEKQQKDLSEDHSSLLLHVKQFVSDLRSLSCQMAALQGNGSERTCCPVNWVEHERSCYWFSRSGKAWADADNYCRLEDAHLVVVTSWEEQKFVQHHIGPVNTWMGLHDQNGPWKWVDGTDYETGFKNWRPEQPDDWYGHGLGGGEDCAHFTDDGRWNDDVCQRPYRWVCETELDKASQEPPLL

SEQ ID NO:275＝人类成熟CD71细胞外结构域

QNSQLQEELRGLRETFSNFTASTEAQVKGLSTQGGNVGRKMKSLESQLEKQQKDLSEDHSSLLLHVKQFVSDLRSLSCQMAALQGNGSERTCCPVNWVEHERSCYWFSRSGKAWADADNYCRLEDAHLVVVTSWEEQKFVQHHIGPVNTWMGLHDQNGPWKWVDGTDYETGFKNWRPEQPDDWYGHGLGGGEDCAHFTDDGRWNDDVCQRPYRWVCETELDKASQEPPLL

“Tencon”是指具有SEQ ID NO:274中所示和美国专利公开第2010/0216708号中所阐述的序列的合成纤连蛋白III型(FN3)结构域。

SEQ ID NO:274＝原始Tencon序列

LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGE AINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT

“癌细胞”或“肿瘤细胞”是指在体内、离体和在组织培养物中的癌性、癌前期或转化细胞，其具有未必涉及摄取新基因物质的自发性或经诱导的表型变化。尽管转化可源自感染转化病毒和纳入新基因组核酸或摄取外源核酸，但其也可自发性地或在暴露于致癌物后产生，从而使内源基因发生突变。转化/癌症可示例为例如体外、体内和离体的形态变化、细胞永生化、异常生长控制、病灶形成、增殖、恶性肿瘤、肿瘤特异性标志物水平、侵袭、肿瘤生长或适宜动物宿主(如裸小鼠)中的抑制等(Freshney,Culture of Animal Cells:AManual of Basic Technique(第3版,1994))。

“树突状细胞”是指在适应性免疫系统中发挥重要作用的一类抗原呈递细胞(APC)。树突状细胞的主要功能是呈递抗原。树突状细胞能够诱导非活性或静止初始T淋巴细胞中的初级免疫反应。

“免疫细胞”是指分类为淋巴细胞(T细胞、B细胞和NK细胞)、嗜中性粒细胞或单核细胞/巨噬细胞的免疫系统细胞。这些都是白血病类型。

“载体”是指能够复制于生物系统内或可在此类系统之间移动的多核苷酸。载体多核苷酸通常含有用于促进这些多核苷酸在生物系统中的复制或维持的元件，例如复制起点、多腺苷酸化信号或选择标志物。此类生物系统的实例可包括细胞、病毒、动物、植物和利用能够复制载体的生物组分的重构生物系统。构成载体的多核苷酸可为DNA或RNA分子或这些分子的杂合体。

“表达载体”是指可利用于生物系统或重构生物系统中以指导由存在于表达载体中的多核苷酸序列编码的多肽翻译的载体。

“多核苷酸”是指包含由糖-磷酸酯骨架或其他等效共价化学结构共价连接的核苷酸链的合成分子。cDNA是多核苷酸的典型实例。

“多肽”或“蛋白质”是指包含至少两个由肽键连接以形成多肽的氨基酸残基的分子。具有少于约50个氨基酸的小多肽可称为“肽”。

“化合价”是指在分子中存在指定数量的抗原特异性结合位点。因此，术语“单价”、“二价”、“四价”和“六价”是指在分子中分别存在一个、两个、四个和六个抗原特异性结合位点。

“受试者”包括任何人类或非人类动物。“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人类灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。除非予以指明，否则术语“患者”或“受试者”可互换使用。

“经分离”是指已与分子产生系统中的其他组分(如重组细胞)基本上分离和/或纯化的分子(例如合成多核苷酸或多肽，如FN3结构域)的均质群体；以及已经历至少一个纯化或分离步骤的蛋白质。“经分离FN3结构域”是指基本上不含其他细胞物质和/或化学物质的FN3结构域，并且涵盖分离至较高纯度(例如至80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的纯度)的FN3结构域。

物质组合物

在一些实施方案中，提供了包含含有SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的氨基酸序列的多肽的蛋白质。

在一些实施方案中，包含多肽的蛋白质包含SEQ ID NO:273的氨基酸序列。SEQ IDNO:273是基于SEQ ID NO:288、SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:290和SEQ ID NO:291的序列的共有序列。

SEQ ID NO:273的序列为：

MLPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX₁IX₂YX₃EX₄X₅X₆X₇GEAIX₈LX₉VPGSERSYDLTGLKPGTEYX₁₀VX₁₁IX₁₂X₁₃VKGG X₁₄X₁₅SX₁₆PLX₁₇AX₁₈FTT

其中X₈、X₉、X₁₇和X₁₈各自独立地为除甲硫氨酸或脯氨酸外的任何氨基酸，并且

X₁选自D、F、Y或H，

X₂选自Y、G、A或V，

X₃选自I、T、L、A或H，

X₄选自S、Y或P，

X₅选自Y、G、Q或R，

X₆选自G或P，

X₇选自A、Y、P、D或S，

X₁₀选自W、N、S或E，

X₁₁选自L、Y或G，

X₁₂选自D、Q、H或V，

X₁₃选自G或S，

X₁₄选自R、G、F、L或D，

X₁₅选自W、S、P或L，并且

X₁₆选自T、V、M或S。

在一些实施方案中：

X₁选自D、F、Y或H，

X₂选自G、A或V，

X₃选自T、L、A或H，

X₄选自Y或P，

X₅选自G、Q或R，

X₆选自G或P，

X₇选自Y、P、D或S，

X₁₀选自W、N、S或E，

X₁₁选自L、Y或G，

X₁₂选自Q、H或V，

X₁₃选自G或S，

X₁₄选自G、F、L或D，

X₁₅选自S、P或L，并且

X₁₆选自V、M或S。

在一些实施方案中，X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇、X₁₀、X₁₁、X₁₂、X₁₃、X₁₄、X₁₅和X₁₆是如SEQ IDNO:288的序列中所示。在一些实施方案中，X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇、X₁₀、X₁₁、X₁₂、X₁₃、X₁₄、X₁₅和X₁₆是如SEQ ID NO:289的序列中所示。在一些实施方案中，X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇、X₁₀、X₁₁、X₁₂、X₁₃、X₁₄、X₁₅和X₁₆是如SEQ ID NO:290的序列中所示。在一些实施方案中，X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇、X₁₀、X₁₁、X₁₂、X₁₃、X₁₄、X₁₅和X₁₆是如SEQ ID NO:291的序列中所示。

在一些实施方案中，X8、X9、X17和X18独立地为丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸。在一些实施方案中，X8、X9、X17和X18独立地不为丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸。在一些实施方案中，X8、X9、X17和X18独立地为丙氨酸。在一些实施方案中，X8、X9、X17和X18独立地为精氨酸。在一些实施方案中，X8、X9、X17和X18独立地为天冬酰胺。在一些实施方案中，X8、X9、X17和X18独立地为天冬氨酸。在一些实施方案中，X8、X9、X17和X18独立地为半胱氨酸。在一些实施方案中，X8、X9、X17和X18独立地为谷氨酰胺。在一些实施方案中，X8、X9、X17和X18独立地为谷氨酸。在一些实施方案中，X8、X9、X17和X18独立地为甘氨酸。在一些实施方案中，X8、X9、X17和X18独立地为组氨酸。在一些实施方案中，X8、X9、X17和X18独立地为异亮氨酸。在一些实施方案中，X8、X9、X17和X18独立地为亮氨酸。在一些实施方案中，X8、X9、X17和X18独立地为赖氨酸。在一些实施方案中，X8、X9、X17和X18独立地为苯丙氨酸。在一些实施方案中，X8、X9、X17和X18独立地为丝氨酸。在一些实施方案中，X8、X9、X17和X18独立地为苏氨酸。在一些实施方案中，X8、X9、X17和X18独立地为色氨酸。在一些实施方案中，X8、X9、X17和X18独立地为酪氨酸。在一些实施方案中，X8、X9、X17和X18独立地为缬氨酸。

在一些实施方案中，序列是如SEQ ID NO:288的序列中所示，不同之处在于对应于X8、X9、X17和X18的位置的位置可为任何如上文所陈述的其他氨基酸残基，不同之处在于在一些实施方案中，X8不为V，X9不为T，X17不为S，并且X18不为I。

在一些实施方案中，序列是如SEQ ID NO:289的序列中所示，不同之处在于对应于X8、X9、X17和X18的位置的位置可为任何如上文所陈述的其他氨基酸残基，不同之处在于在一些实施方案中，X8不为V，X9不为T，X17不为S，并且X18不为I。

在一些实施方案中，序列是如SEQ ID NO:290的序列中所示，不同之处在于对应于X8、X9、X17和X18的位置的位置可为任何如上文所陈述的其他氨基酸残基，不同之处在于在一些实施方案中，X8不为V，X9不为T，X17不为S，并且X18不为I。

在一些实施方案中，序列是如SEQ ID NO:291的序列中所示，不同之处在于对应于X8、X9、X17和X18的位置的位置可为任何如上文所陈述的其他氨基酸残基，不同之处在于在一些实施方案中，X8不为V，X9不为T，X17不为S，并且X18不为I。

在一些实施方案中，包含多肽的蛋白质包含与SEQ ID NO:273的序列至少62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述蛋白质与SEQ ID NO:273的序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一。在一些实施方案中，所述蛋白质与SEQ ID NO:273的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一。在一些实施方案中，所述蛋白质与SEQ ID NO:273的序列至少95％、96％、97％、98％或99％同一。在一些实施方案中，所述蛋白质或多肽与SEQ ID NO:273至少70％、75％、80％、85％或90％同一。

可通过使用可经由NCBI网站获得的BlastP并使用默认参数比对两个序列来确定序列同一性。

本文所提供的多肽可为较大多肽的一部分并且可称为结构域。不同多肽中的两个结构域之间的同源性或同一性是基于类似于整个多肽的结构域。例如，如果多肽包含含有FN3结构域(包含SEQ ID NO:1)的多肽并且所述结构域缀合至scFV抗体，则具有与SEQ IDNO:1类似但不同的结构域的另一蛋白质可至少90％同一，即使scFV并无同源性。因此，同一性％可基于结构域或基于多肽全长。测定同一性％的方法提供于本文中或为本领域技术人员所已知。

在一些实施方案中，提供了结合或特异性结合人类CD71蛋白(SEQ ID NO:274或275)的纤连蛋白III型(FN3)结构域。如本文所规定，FN3结构域可结合至CD71蛋白。还规定(即使未明确陈述)，所述结构域也可特异性结合至CD71蛋白。因此，例如，结合至CD71的FN3结构域也涵盖特异性结合至CD71的FN3结构域蛋白。这些分子可用于例如治疗性和诊断性应用以及成像。在一些实施方案中，提供了编码本文所公开的FN3结构域或其互补核酸的多核苷酸、载体、宿主细胞以及其制备和使用方法。

在一些实施方案中，提供了结合或特异性结合CD71的经分离FN3结构域。

在一些实施方案中，所述FN3结构域包含两个由接头连结的FN3结构域。所述接头可为柔性接头。所述接头可为短肽序列，例如本文所阐述的那些。例如，接头可为G/S接头等。

在一些实施方案中，所述FN3结构域包含两个由接头(例如本文所提供的那些)连结的FN3结构域。示例性接头包括但不限于(GS)2(SEQ ID NO:278)、(GGGS)2(SEQ ID NO:279)、(GGGGS)1-5(SEQ ID NO:280)、(AP)1-20、(AP)2(SEQ ID NO:281)、(AP)5(SEQ ID NO:282)、(AP)₁₀(SEQ ID NO:283)、(AP)₂₀(SEQ ID NO:284)、A(EAAAK)₅AAA(SEQ ID NO:285)或(EAAAK)_1-5(SEQ ID NO:307)。在一些实施方案中，接头包含或为以下氨基酸序列：EAAAKEAAAKEAAAKEAAAK(SEQ ID NO:300)；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:301)；APAPAPAPAP(SEQ ID NO:302)；或EAAAK(SEQ ID NO:303)。

在一些实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:292的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:293的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含SEQ IDNO:294的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:295的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:296的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:297的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:298的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:299的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述FN3结构域可以小于约1×10^-7M(例如小于约1×10^-8M、小于约1×10^-9M、小于约1×10^-10M、小于约1×10^-11M、小于约1×10^-12M或小于约1×10^-13M)的解离常数(KD)结合CD71，如本领域技术人员通过表面等离子体共振或Kinexa方法所测定。如果在不同条件(例如渗透度、pH)下测量，则特定FN3结构域-抗原相互作用的测量亲和力可有所变化。因此，使用蛋白质架构和抗原的标准化溶液以及标准化缓冲液(如本文所阐述的缓冲液)来测量亲和力和其他抗原结合参数(例如KD、K缔合、K解离)。

在一些实施方案中，在标准溶液ELISA测定中，FN3结构域可以至少5倍于针对阴性对照所获得信号的信号来结合CD71。

在一些实施方案中，结合或特异性结合CD71的FN3结构域包含连接至分子的N末端的起始甲硫氨酸(Met)。在一些实施方案中，结合或特异性结合CD71的FN3结构域包含连接至FN3结构域的C末端的半胱氨酸(Cys)。添加N末端Met和/或C末端Cys可促进半衰期延长分子的表达和/或缀合。

所述FN3结构域也可含有半胱氨酸取代，如美国专利第10,196,446号(其通过引用整体并入本文)中所阐述的那些。简言之，在一些实施方案中，本文所提供的多肽可在选自由以下组成的组的位置处包含至少一个半胱氨酸取代：FN3结构域的残基6、8、10、11、14、15、16、20、30、34、38、40、41、45、47、48、53、54、59、60、62、64、70、88、89、90、91和93，所述FN3结构域是基于美国专利第10,196,446号的SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:1；和相关FN3结构域中的等效位置。在一些实施方案中，所述取代位于残基6处。在一些实施方案中，所述取代位于残基8处。在一些实施方案中，所述取代位于残基10处。在一些实施方案中，所述取代位于残基11处。在一些实施方案中，所述取代位于残基14处。在一些实施方案中，所述取代位于残基15处。在一些实施方案中，所述取代位于残基16处。在一些实施方案中，所述取代位于残基20处。在一些实施方案中，所述取代位于残基30处。在一些实施方案中，所述取代位于残基34处。在一些实施方案中，所述取代位于残基38处。在一些实施方案中，所述取代位于残基40处。在一些实施方案中，所述取代位于残基41处。在一些实施方案中，所述取代位于残基45处。在一些实施方案中，所述取代位于残基47处。在一些实施方案中，所述取代位于残基48处。在一些实施方案中，所述取代位于残基53处。在一些实施方案中，所述取代位于残基54处。在一些实施方案中，所述取代位于残基59处。在一些实施方案中，所述取代位于残基60处。在一些实施方案中，所述取代位于残基62处。在一些实施方案中，所述取代位于残基64处。在一些实施方案中，所述取代位于残基70处。在一些实施方案中，所述取代位于残基88处。在一些实施方案中，所述取代位于残基89处。在一些实施方案中，所述取代位于残基90处。在一些实施方案中，所述取代位于残基91处。在一些实施方案中，所述取代位于残基93处。

结构域或蛋白质中的某一位置处的半胱氨酸取代包含使用半胱氨酸残基代替现有氨基酸残基。半胱氨酸修饰的其他实例可见于例如美国专利申请公开第20170362301号，所述公开特此通过引用整体并入。可使用BlastP并且使用例如NCBI网站处的默认参数来比对序列。

在一些实施方案中，使结合CD71的FN3结构域内化至细胞中。在一些实施方案中，FN3结构域的内化可有利于将可检测标记或治疗剂递送至细胞中。在一些实施方案中，FN3结构域的内化可有利于将细胞毒性剂递送至细胞中。细胞毒性剂可用作治疗剂。在一些实施方案中，FN3结构域的内化可有利于将本文所公开的任何可检测标记、治疗剂和/或细胞毒性剂递送至细胞中。在一些实施方案中，所述细胞是肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述细胞是肝细胞。在一些实施方案中，所述细胞是肌细胞。在一些实施方案中，所述细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，所述细胞是树突状细胞。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是NK细胞。在一些实施方案中，所述细胞是B细胞。在一些实施方案中，所述细胞是中枢神经系统细胞。

在一些实施方案中，结合CD71的FN3结构域是基于SEQ ID NO:276的Tencon序列或SEQ ID NO:277的Tencon 27序列，并且任选地在残基位置11、14、17、37、46、73或86(残基编号对应于SEQ ID NO:277)处具有取代。

SEQ ID NO:276＝原始Tencon序列

LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT

SEQ ID NO:277＝稳定化Tencon(Tencon27)

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFTT

在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的氨基酸序列。

在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQID NO:14的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ IDNO:28的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ IDNO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ IDNO:56的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ IDNO:70的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ IDNO:84的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ IDNO:98的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQID NO:115的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ IDNO:116的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQID NO:134的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ IDNO:135的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQID NO:153的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ IDNO:154的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:157的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQID NO:172的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ IDNO:173的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:180的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:182的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:183的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:185的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:186的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:189的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:190的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQID NO:191的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ IDNO:192的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:198的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:199的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:201的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:203的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:207的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:208的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQID NO:210的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ IDNO:211的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:215的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:217的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:218的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:219的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:222的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:224的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:226的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:227的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:228的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:229的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQID NO:230的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ IDNO:231的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:232的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:233的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:234的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:235的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:236的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:237的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:238的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:239的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:240的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:241的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:242的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:243的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:244的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:245的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:246的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:247的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:248的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQID NO:249的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ IDNO:250的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:251的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:252的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:253的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:254的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:255的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:256的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:257的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:258的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:259的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:260的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:261的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:262的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:263的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:264的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:265的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:266的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:267的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQID NO:268的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ IDNO:269的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:270的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:271的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:272的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:304的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:305的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含SEQ ID NO:306的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述FN3结构域在人类CD71上不与转铁蛋白竞争结合至CD71的位点处结合至CD71。在一些实施方案中，所述FN3结构域包含SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的序列。

在一些实施方案中，结合CD71的经分离FN3结构域包含连接至分子的N末端的起始甲硫氨酸(Met)。

本公开的结合CD71的FN3结构域的缀合物

在一些实施方案中，提供了与异源分子缀合的结合CD71的经分离FN3结构域。

在一些实施方案中，所述FN3结构域缀合至寡核苷酸。例如，所述寡核苷酸可用于抑制基因或mRNA转录物的表达。所述寡核苷酸可为siRNA、miRNA、反义寡核苷酸等。因此，在一些实施方案中，所述FN3结构域可缀合至多核苷酸，例如但不限于siRNA分子、反义分子、RNA分子或DNA分子。在一些实施方案中，使用如本文所阐述的接头使结合CD71的FN3结构域缀合至siRNA分子。在一些实施方案中，所述接头是化学接头。

在一些实施方案中，提供包含连接至核酸分子的多肽(例如包含FN3结构域的多肽)的组合物。所述核酸分子可为例如siRNA分子。

因此，在一些实施方案中，所述siRNA是能够抑制靶基因的表达的双链RNAi(dsRNA)剂。所述dsRNA剂包含有义链和反义链。在一些实施方案中，所述dsRNA剂的每一条链的长度可在12-40个核苷酸的范围内。例如，每一条链长度可为14-40个核苷酸、长度为17-37个核苷酸、长度为25-37个核苷酸、长度为27-30个核苷酸、长度为17-23个核苷酸、长度为17-21个核苷酸、长度为17-19个核苷酸、长度为19-25个核苷酸、长度为19-23个核苷酸、长度为19-21个核苷酸、长度为21-25个核苷酸或长度为21-23个核苷酸。

在一些实施方案中，所述有义链和反义链通常形成双链dsRNA。dsRNA剂的双链区可长度为12-40个核苷酸对。例如，所述双链区可长度为14-40个核苷酸对、长度为17-30个核苷酸对、长度为25-35个核苷酸对、长度为27-35个核苷酸对、长度为17-23个核苷酸对、长度为17-21个核苷酸对、长度为17-19个核苷酸对、长度为19-25个核苷酸对、长度为19-23个核苷酸对、长度为19-21个核苷酸对、长度为21-25个核苷酸对或长度为21-23个核苷酸对。在另一个实例中，所述双链区的长度选自15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26和27个核苷酸对。

在一些实施方案中，所述dsRNA在一条链的3'-端或5'-端或两端处包含dsRNA剂的一个或多个悬突区和/或封端基团。所述悬突可长度为1-10个核苷酸、长度为1-6个核苷酸、长度为例如2-6个核苷酸、长度为1-5个核苷酸、长度为2-5个核苷酸、长度为1-4个核苷酸、长度为2-4个核苷酸、长度为1-3个核苷酸、长度为2-3个核苷酸或长度为1-2个核苷酸。所述悬突可因为一条链长于另一条链或因为具有相同长度的两条链发生交错。所述悬突可与靶mRNA形成失配或者其可与靶向的基因序列互补或者可为其他序列。第一条链和第二条链也可例如由额外碱基接合以形成发夹，或者由其他非碱基接头接合。

在一些实施方案中，所述dsRNA剂的悬突区中的核苷酸可各自独立地为经修饰或未经修饰的核苷酸，包括但不限于经2'-糖修饰，例如2-F、2'-O甲基、胸苷(T)、2'-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)、2'-O-甲氧基乙基腺苷(Aeo)、2'-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5Ceo)和其任何组合。例如，TT可为任一条链上的任一端的悬突序列。所述悬突可与靶mRNA形成失配或者其可与靶向的基因序列互补或者可为其他序列。

所述dsRNA剂的有义链、反义链或两条链处的5'-或3'-悬突可经磷酸化。在一些实施方案中，悬突区含有两个核苷酸并且在两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯，其中两个核苷酸可相同或不同。在一个实施方案中，所述悬突存在于有义链、反义链或两条链的3'-端处。在一个实施方案中，此3'-悬突存在于反义链中。在一个实施方案中，此3'-悬突存在于有义链中。

所述dsRNA剂可仅包含单一悬突，所述单一悬突可强化dsRNA的干扰活性，而不影响其整体稳定性。例如，单链悬突位于有义链的3'末端处，或替代地位于反义链的3'末端处。所述dsRNA也可具有位于反义链的5'-端(或有义链的3'-端)处或反之亦然的钝端。通常，所述dsRNA的反义链在3'-端处具有核苷酸悬突，并且5'-端是钝端。不受限于理论，反义链的5'-端处的不对称钝端和反义链的3'-端悬突有利于向导链加载至RISC过程中。例如，单一悬突包含至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个核苷酸的长度。

在一些实施方案中，所述dsRNA剂也可在dsRNA双链体的两端处具有两个钝端。

在一些实施方案中，所述dsRNA剂的有义链和反义链中的每个核苷酸都可经修饰。每个核苷酸可经相同或不同修饰进行修饰，所述修饰可包括以下各项中的一者或多者：改变一个或两个非连接性磷酸氧和/或一个或多个连接性磷酸氧；改变核糖的组分，例如改变核糖上的2羟基；使用“去磷酸”接头完全代替磷酸酯部分；修饰或代替天然存在的碱基；和代替或修饰核糖-磷酸酯骨架。

在一些实施方案中，3'或5'悬突中的所有或一些碱基可例如经本文所阐述的修饰进行修饰。修饰可包括例如用于核糖的2'位处的本领域已知修饰，例如使用脱氧核糖核苷酸、2'-脱氧-2'-氟(2'-F)或2'-O-甲基修饰来代替核碱基的核糖，和磷酸基的修饰，例如硫代磷酸酯修饰。悬突未必与靶序列同源。

在一些实施方案中，有义链和反义链的每个残基都独立地经LNA、HNA、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-脱氧或2'-氟修饰。所述链可含有一种以上的修饰。在一个实施方案中，有义链和反义链的每个残基独立地经2'-O-甲基或2'-氟修饰。

在一些实施方案中，至少两种不同修饰通常存在于有义链和反义链上。这两种修饰可为2'-脱氧、2'-O-甲基或2'-氟修饰、非环状核苷酸或其他。

在一个实施方案中，有义链和反义链各自包含两种选自2'-氟、2'-O-甲基或2'-脱氧的不同核苷酸修饰。

所述dsRNA剂还可包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联。硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联修饰可出现于有义链或反义链的任何核苷酸上或出现于两条链的任何位置中。例如，核苷酸间键联修饰可出现于有义链和/或反义链上的每一核苷酸上；每个核苷酸间键联修饰可以交替模式出现于有义链或反义链上；或者有义链或反义链都以交替模式包含核苷酸间键联修饰。有义链上的核苷酸间键联修饰的交替模式可与反义链相同或不同，并且有义链上的核苷酸间键联修饰的交替模式可相对于反义链上的核苷酸间键联修饰的交替模式有所改变。

在一些实施方案中，所述dsRNA剂在悬突区中包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联修饰。例如，悬突区包含两个核苷酸并且在两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联。也可使核苷酸间键联修饰连接悬突核苷酸与双链区内的末端配对核苷酸。例如，至少2、3、4个或所有悬突核苷酸可经由硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联连接，并且任选地，可存在连接悬突核苷酸与紧邻悬突核苷酸的配对核苷酸的额外硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联。例如，可在三个末端核苷酸之间存在至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，其中三个核苷酸中的两者是悬突核苷酸，并且第三者是紧邻悬突核苷酸的配对核苷酸。在一些实施方案中，这三个末端核苷酸可位于反义链的3'-端处。

在一些实施方案中，dsRNA组合物是由经修饰碱基或核苷类似物连接，如美国专利第7,427,672号中所阐述，所述专利通过引用并入本文。

在一些实施方案中，可用于连接如本文所阐述的FN3结构域与有义链的接头具有式I：

在一些实施方案中，可用于连接如本文所阐述的FN3结构域与反义链的接头具有式II：

其中X_AS代表反义链并且F₁代表如本文所阐述的FN3结构域。

在一些实施方案中，所述接头经由F1上存在的半胱氨酸残基共价附接至F1，并且可如下所示：

在一些实施方案中，如本文所阐述的连接的ds RNA和FN3结构域具有式III：

其中C1代表如本文所阐述的相同或不同FN3结构域。

在一些实施方案中，A1-B1具有下式：

其中F₁是包含至少一个FN3结构域的多肽并且缀合至L₁，L₁连接至X_S，其中X_S是双链siRNA分子的5'至3'寡核苷酸有义链并且X_AS是双链siRNA分子的3'至5'寡核苷酸反义链；并且其中X_S和X_AS形成双链siRNA分子。

额外接头的结构如下：

mal-C₂H₄C(O)(NH)-(CH₂)₆-为

(Mal-(PEG)₁₂)(NH)CH₂)₆)为

Mal-NH-(CH₂)₆-(其也可称为氨基己基接头-(CH₂)₆-)为并且

Val-Cit Paba具有结构：

如本文所阐述，在一些实施方案中，可修饰核酸分子以在dsRNA的有义链的5'端处包括接头。在一些实施方案中，可修饰核酸分子以在dsRNA的反义链的5'端处包括乙烯基膦酸酯。在一些实施方案中，可修饰核酸分子以在dsRNA的有义链的3'端处包括接头。在一些实施方案中，可修饰核酸分子以在dsRNA的反义链的3'端处包括乙烯基膦酸酯。可使用接头连接dsRNA与FN3结构域。接头可共价附接至例如FN3结构域上的半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基天然存在或已如本文和例如美国专利第10,196,446号(其特此通过引用整体并入)中所阐述经取代。

在一些实施方案中，肽缀合至脂质纳米颗粒，其可用于例如细胞特异性靶向。

在一些实施方案中，蛋白质缀合至靶向CD71的结合部分或另一蛋白质以供蛋白质降解。例如，蛋白质可缀合至PROTACS(用于E3泛素连接酶的结合部分)并且由此将蛋白质递送至E3连接酶。这些可经由接头(例如甘氨酸-丝氨酸接头等)连接。

结合至CD71的FN3结构域也可缀合或连接至与除CD71外的不同靶标结合的另一个FN3结构域。这使得肽能够具有多特异性(例如双特异性、三特异性等)，使得其结合至CD71和例如另一个蛋白质。在一些实施方案中，CD71 FN3结合结构域连接至结合至由肿瘤细胞表达的抗原(肿瘤抗原)的另一个FN3结构域。

在一些实施方案中，FN3结构域可由接头连接在一起以形成二价FN3结构域。所述接头可为柔性接头。在一些实施方案中，所述接头是G/S接头。在一些实施方案中，所述接头具有1、2、3或4个G/S重复。G/S重复单元是后接一个丝氨酸的4个甘氨酸(例如GGGGS)。在一些实施方案中，FN3结构域包含两个由接头(例如本文所提供的那些)连结的FN3结构域。示例性接头包括但不限于(GS)2(SEQ ID NO:278)、(GGGS)2(SEQ ID NO:279)、(GGGGS)1-5(SEQ ID NO:280)、(AP)1-20、(AP)2(SEQ ID NO:281)、(AP)5(SEQ ID NO:282)、(AP)10(SEQID NO:283)、(AP)20(SEQ ID NO:284)、A(EAAAK)5AAA(SEQ ID NO:285)或(EAAAK)1-5(SEQID NO:307)。在一些实施方案中，所述接头包含或为以下氨基酸序列：EAAAKEAAAKEAAAKEAAAK(SEQ ID NO:300)；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:301)；APAPAPAPAP(SEQ ID NO:302)；或EAAAK(SEQ ID NO:303)。

在一些实施方案中，所述异源分子是可检测标记或治疗剂，例如但不限于细胞毒性剂。

在一些实施方案中，提供了与可检测标记缀合的结合CD71的FN3结构域。可检测标记的非限制性实例提供于本文中。

在一些实施方案中，提供了与治疗剂缀合的结合CD71的FN3结构域。治疗剂的非限制性实例(例如但不限于细胞毒性剂)提供于本文中。

可使用与可检测标记缀合的结合CD71的FN3结构域在体内或体外评价样品如肿瘤组织上的CD71表达。可使用与可检测标记缀合的结合CD71的FN3结构域在体内或体外评价血液、免疫细胞或树突状细胞样品上的CD71表达。

可检测标记包括在缀合至结合CD71的FN3结构域时使得可经由光谱、光化学、生物化学、免疫化学或其他化学方法检测CD71的组合物。

示例性可检测标记包括但不限于放射性同位素、磁珠、金属珠、胶态颗粒、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如如通常用于ELISA中者)、生物素、地高辛(digoxigenin)、半抗原、发光分子、化学发光分子、荧光染料、荧光团、荧光淬灭剂、有色分子、放射性同位素、闪烁体、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素(streptavidin)、蛋白质A、蛋白质G、抗体或其片段、多组氨酸、Ni2+、Flag标签、myc标签、重金属、酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、荧光素酶、电子供体/受体、吖啶鎓酯和比色底物。

可检测标记可自发性地发射信号，例如在可检测标记为放射性同位素时。在一些实施方案中，所述可检测标记因由外部刺激(例如磁场或电场或电磁场)刺激而发射信号。

示例性放射性同位素可为放射性γ发射、俄歇发射(Auger-emitting)、β发射、α发射或正电子发射放射性同位素。示例性放射性同位素包括3H、11C、13C、15N、18F、19F、55Co、57Co、60Co、61Cu、62Cu、64Cu、67Cu、68Ga、72As、75Br、86Y、89Zr、90Sr、94mTc、99mTc、115In、1231、1241、125I、1311、211At、212Bi、213Bi、223Ra、226Ra、225Ac和227Ac。

示例性金属原子是原子数大于20的金属，如钙原子、钪原子、钛原子、钒原子、铬原子、锰原子、铁原子、钴原子、镍原子、铜原子、锌原子、镓原子、锗原子、砷原子、硒原子、溴原子、氪原子、铷原子、锶原子、钇原子、锆原子、铌原子、钼原子、锝原子、钌原子、铑原子、钯原子、银原子、镉原子、铟原子、锡原子、锑原子、碲原子、碘原子、氙原子、铯原子、钡原子、镧原子、铪原子、钽原子、钨原子、铼原子、锇原子、铱原子、铂原子、金原子、汞原子、铊原子、铅原子、铋原子、钫原子、镭原子、锕原子、铈原子、镨原子、钕原子、钷原子、钐原子、铕原子、钆原子、铽原子、镝原子、钬原子、铒原子、铥原子、镱原子、镏原子、钍原子、镤原子、铀原子、镎原子、钚原子、镅原子、锔原子、锫原子、锎原子、锿原子、镄原子、钔原子、锘原子或铹原子。

在一些实施方案中，所述金属原子可为原子数大于20的碱土金属。

在一些实施方案中，所述金属原子可为镧系元素。

在一些实施方案中，所述金属原子可为锕系元素。

在一些实施方案中，所述金属原子可为过渡金属。

在一些实施方案中，所述金属原子可为贫金属。

在一些实施方案中，所述金属原子可为金原子、铋原子、钽原子和钆原子。

在一些实施方案中，所述金属原子可为原子数为53(即碘)至83(即铋)的金属。

在一些实施方案中，所述金属原子可为适用于磁共振成像的原子。

所述金属原子可为呈+1、+2或+3氧化态形式的金属离子，如Ba2+、Bi3+、Cs+、Ca2+、Cr2+、Cr3+、Cr6+、Co2+、Co3+、Cu+、Cu2+、Cu3+、Ga3+、Gd3+、Au+、Au3+、Fe2+、Fe3+、F3+、Pb2+、Mn2+、Mn3+、Mn4+、Mn7+、Hg2+、Ni2+、Ni3+、Ag+、Sr2+、Sn2+、Sn4+和Zn2+。所述金属原子可包含金属氧化物，如氧化铁、氧化锰或氧化钆。

合适的染料包括任何市售染料，例如5(6)-羧基荧光素、IRDye680RD马来酰亚胺或IRDye 800CW、多吡啶钌染料等。

合适的荧光团是荧光素异硫氰酸酯(FITC)、荧光素氨基硫脲、若丹明(rhodamine)、得克萨斯红(Texas Red)、CyDye(例如Cy3、Cy5、Cy5.5)、Alexa Fluor(例如Alexa488、Alexa555、Alexa594、Alexa647)、近红外(NIR)(700-900nm)荧光染料以及羰花青素和氨基苯乙烯基染料。

可使用与可检测标记缀合的特异性结合CD71的FN3结构域作为例如成像剂以评价肿瘤分布，诊断肿瘤细胞的存在和/或肿瘤复发。可使用与可检测标记缀合的特异性结合CD71的FN3结构域作为例如成像剂以评价多种身体组织中的CD71阳性细胞(包括但不限于树突状细胞、T细胞、NK细胞、B细胞免疫细胞、肌细胞和中枢神经系统细胞)的存在。

在一些实施方案中，特异性结合CD71的FN3结构域缀合至治疗剂，例如但不限于细胞毒性剂。

在一些实施方案中，治疗剂是化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物)。

本文所公开的与治疗剂缀合的结合CD71的FN3结构域可用于将治疗剂靶向递送至表达CD71的细胞(例如肿瘤细胞、树突状细胞、T细胞、NK细胞、B细胞免疫细胞、中枢神经系统细胞)并在其中细胞内累积。尽管不受限于任何特定理论，但在全身性施用这些未缀合剂可对正常细胞产生不可接受水平的毒性的情形下，这类递送可为有用的。

在一些实施方案中，治疗剂可通过各种机制来诱发其细胞毒性和/或细胞生长抑制效应，例如但不限于微管蛋白结合、DNA结合、拓扑异构酶抑制、DNA交联、螯合、剪接体抑制、NAMPT抑制和HDAC抑制。

在一些实施方案中，治疗剂是剪接体抑制剂、NAMPT抑制剂或HDAC抑制剂。在一些实施方案中，所述剂是免疫系统激动剂，例如TLR7,8,9、RIG-I(dsRNA)和STING(CpG)激动剂。在一些实施方案中，所述剂是道诺霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、长春地辛(vindesine)、细菌毒素(如白喉毒素)、蓖麻毒蛋白、格尔德霉素(geldanamycin)、类美登素(maytansinoid)或卡奇霉素(calicheamicin)。

在一些实施方案中，所述治疗剂是酶活性毒素，如白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思子素A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-八叠球素(α-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商路(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒素(curcin)、巴豆毒素(crotin)、皂质草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、米托洁林(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素(enomycin)或单端孢霉烯。

在一些实施方案中，所述治疗剂是放射性核素，如212Bi、131I、131In、90Y或186Re。

在一些实施方案中，所述治疗剂是多拉斯他汀(dolastatin)或多拉斯他汀肽类似物和衍生物、奥里斯他汀(auristatin)或单甲基奥里斯他汀苯丙氨酸。示例性分子公开于美国专利第5,635,483号和第5,780,588号中。多拉斯他汀和奥里斯他汀已显示可干扰微管动力学、GTP水解以及核和细胞分裂(Woyke等人(2001)Antimicrob Agents andChemother.45(12):3580-3584)并且具有抗癌和抗真菌活性。多拉斯他汀或奥里斯他汀药物部分可经由肽药物部分的N(氨基)末端或C(羧基)末端(WO 02/088172)或经由工程化至FN3结构域中的任何半胱氨酸附接至FN3结构域。

在一些实施方案中，治疗剂可为例如奥里斯他汀、喜树碱(camptothecin)、多卡米星(duocarmycin)、依托泊苷(etoposide)、美登素(maytansine)和类美登素(maytansinoid)、紫杉烷(taxane)、苯并二氮杂卓或含有苯并二氮杂卓的药物(例如吡咯并[1,4]-苯并二氮杂卓(PBD)、二氢吲哚并苯并二氮杂卓和噁唑烷并苯并二氮杂卓)或长春花生物碱。

可使用已知方法使特异性结合CD71的FN3结构域缀合至可检测标记。

在一些实施方案中，所述可检测标记与螯合剂络合。

在一些实施方案中，所述可检测标记经由如上文所阐述的接头缀合至结合CD71的FN3结构域。

可使用已知方法使可检测标记、治疗性化合物或细胞毒性化合物直接或间接连接至结合CD71的FN3结构域。合适的接头为本领域已知的并且包括例如辅基、非酚类接头(N-琥珀酰亚胺基-苯甲酸酯衍生物；十二硼酸酯)、大环和非环状螯合剂的螯合部分(例如1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10四乙酸(DOTA)衍生物、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)衍生物、S-2-(4-异硫氰基苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)衍生物和1,4,8,11-四氮杂环十二烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)衍生物)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(例如己二酰亚胺二甲酯盐酸盐)、活性酯(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(例如戊二醛)、双-叠氮基化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(例如双-(对重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双-活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)和其他螯合部分。合适的肽接头是众所周知的。

在一些实施方案中，经由肾清除从血液去除结合CD71的FN3结构域。

从基于Tencon序列的文库分离结合CD71的FN3结构域

Tencon(SEQ ID NO:276)是从来自人类腱糖蛋白-C的15个FN3结构域的共有序列设计的非天然存在的纤连蛋白III型(FN3)结构域(Jacobs等人,Protein Engineering,Design,and Selection,25:107-117,2012；美国专利公开第2010/0216708号)。Tencon的晶体结构显示连结FN3结构域的七个特征性β链的六个表面暴露环，所述β链称为A、B、C、D、E、F和G，并且所述环称为AB、BC、CD、DE、EF和FG环(Bork和Doolittle,Proc Natl Acad Sci USA89:8990-8992,1992；美国专利第6,673,901号)。这些环或每个环内的选定残基可随机化以构建可用于选择结合CD71的新颖分子的纤连蛋白III型(FN3)结构域文库。表1显示Tencon(SEQ ID NO:276)中的每个环和β链的位置和序列。

表1.Tencon拓扑结构

基于Tencon序列设计的文库可由此具有随机化FG环或随机化BC和FG环，例如如下文所阐述的文库TCL1或TCL2。Tencon BC环是7个氨基酸长，因此1、2、3、4、5、6或7个氨基酸可随机化于BC环多样化并且基于Tencon序列设计的文库中。Tencon FG环是7个氨基酸长，因此1、2、3、4、5、6或7个氨基酸可随机化于FG环多样化并且基于Tencon序列设计的文库中。可通过在环处插入和/或缺失残基来进一步在Tencon文库中的环处实现多样性。例如，FG和/或BC环可延长1-22个氨基酸，或缩短1-3个氨基酸。Tencon中的FG环是7个氨基酸长，而抗体重链中的相应环在4-28个残基范围内。为提供最大多样性，FG环可在序列以及长度上多样化以对应于4-28个残基的抗体CDR3长度范围。例如，可通过将FG环再延长1、2、3、4或5个氨基酸来进一步使所述环的长度多样化。

基于Tencon序列设计的文库也可具有随机化替代表面，所述表面形成于FN3结构域的一侧并且包含两条或更多条β链和至少一个环。一种此类替代表面是通过C和Fβ链以及CD和FG环中的氨基酸所形成(C-CD-F-FG表面)。基于Tencon替代C-CD-F-FG表面设计的文库阐述于美国专利公开第2013/0226834号中。基于Tencon序列设计的文库也包括基于Tencon变体(例如在残基位置11、14、17、37、46、73或86(残基编号对应于SEQ ID NO:276)处具有取代的Tencon变体)设计的文库，并且所述变体显示改进的热稳定性。示例性Tencon变体阐述于美国专利公开第2011/0274623号中，并且包括与SEQ ID NO:276的Tencon相比具有取代E11R、L17A、N46V和E86I的Tencon27(SEQ ID NO:277)。

可使用随机或指定的氨基酸组使基于Tencon和其他FN3序列的文库在所选残基位置处随机化。例如，可使用编码所有20种天然氨基酸的NNK密码子来生成具有随机取代的文库变体。在其他多样化方案中，可使用DVK密码子来编码氨基酸Ala、Trp、Tyr、Lys、Thr、Asn、Lys、Ser、Arg、Asp、Glu、Gly和Cys。或者，可使用NNS密码子来产生所有20种氨基酸残基并且同时减小终止密码子的频率。可例如使用技术(http:_//www_sloning_com)来合成在待多样化的位置处具有偏向性氨基酸分布的FN3结构域文库。此技术使用用作足以用于数千种基因合成过程的通用结构单元的预制双链三联体的文库。三联体文库代表了构建任何期望DNA分子所需的所有可能序列组合。密码子名称是根据众所周知的IUB代码。

可通过以下方式来分离特异性结合CD71的FN3结构域：使用顺式显示产生FN3文库(如Tencon文库)，所述顺式显示使编码架构蛋白的DNA片段连接至编码RepA的DNA片段以生成在体外翻译后形成的蛋白质-DNA复合物池，其中每个蛋白质与编码其的DNA稳定缔合(美国专利第7,842,476号；Odegrip等人,Proc Natl Acad Sci U S A101,2806-2810,2004)；以及通过本领域已知和实施例中所阐述的任何方法测定所述文库与PSMA的特异性结合。可使用的示例性的众所周知的方法是ELISA、夹心免疫测定以及竞争性与非竞争性测定(例如参见Ausubel等人编辑,1994,Current Protocols in Molecular Biology,第1卷,JohnWiley&Sons,Inc.,New York)。进一步表征所鉴定的特异性结合CD71的FN3结构域的CD71结合、CD71活性调节、内化、稳定性和其他期望特性。

可通过以下方式来生成特异性结合CD71的FN3结构域：使用任何FN3结构域作为模板以生成文库，并且使用本领域提供方法筛选所述文库中特异性结合CD71的分子。可使用的示例性FN3结构域是腱糖蛋白C第3FN3结构域(TN3)、菲波康(Fibcon)和纤连蛋白第10FN3结构域(FN10)。因此，PCT申请WO 2010/051274、WO 2011/137319和WO 2013/049275整体并入本文。使用标准克隆和表达技术将所述文库克隆至载体中或合成文库的双链cDNA盒以在体外表达或翻译所述文库。例如，可使用核糖体展示(Hanes和Pluckthun,Proc Natl AcadSci USA,94,4937-4942,1997)、mRNA展示(Roberts和Szostak,Proc Natl Acad Sci USA,94,12297-12302,1997)或其他无细胞系统(美国专利第5,643,768号)。FN3结构域变体的文库可表达为展示在例如任何合适噬菌体的表面上的融合蛋白。将融合多肽展示于噬菌体的表面上的方法是众所周知的(美国专利公开第2011/0118144号；国际专利公开第WO2009/085462号；美国专利第6,969,108号；美国专利第6,172,197号；美国专利第5,223,409号；美国专利第6,582,915号；美国专利第6,472,147号)。

在一些实施方案中，结合CD71的FN3结构域是基于SEQ ID NO:276的Tencon序列或SEQ ID NO:277的Tencon27序列、SEQ ID NO:276或SEQ ID NO:277，任选地在残基位置11、14、17、37、46、73和/或86处具有取代。

在一些实施方案中，所述FN3蛋白或多肽是在人类CD71上不与转铁蛋白竞争结合至CD71的位点处结合至CD71者。如本文中所使用，CD71上不与转铁蛋白竞争结合至CD71的位点是指CD71中FN3蛋白的结合不与转铁蛋白竞争结合至CD71或抑制转铁蛋白结合至CD71的表位或部分。竞争或其缺乏可为完全或部分的。在一些实施方案中，所述结合也不抑制转铁蛋白经由其与CD71的相互作用内化至细胞中。

在一些实施方案中，提供了鉴定在不与转铁蛋白竞争结合至CD71或抑制转铁蛋白结合至CD71的位点处结合至CD71的FN3蛋白的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使CD71在转铁蛋白或结合至CD71转铁蛋白结合位点的剂存在下与测试FN3蛋白接触；以及鉴定在转铁蛋白或结合至CD71转铁蛋白结合位点的剂存在下结合至CD71的测试FN3蛋白。在一些实施方案中，所述方法包括分离在转铁蛋白或结合至CD71转铁蛋白结合位点的剂存在下结合至CD71的测试FN3蛋白。在一些实施方案中，所述方法包括对在转铁蛋白或结合至CD71转铁蛋白结合位点的剂存在下结合至CD71的测试FN3蛋白进行测序。在一些实施方案中，所述方法包括制备或获得编码在转铁蛋白或结合至CD71转铁蛋白结合位点的剂存在下结合至CD71的测试FN3蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，所述方法包括从核酸序列表达在转铁蛋白或结合至CD71转铁蛋白结合位点的剂存在下结合至CD71的测试FN3蛋白，所述核酸序列编码在转铁蛋白或结合至CD71转铁蛋白结合位点的剂存在下结合至CD71的测试FN3蛋白。在一些实施方案中，所述测试FN3蛋白表达于细胞中。在一些实施方案中，所述方法包括分离和/或纯化所表达的测试FN3蛋白。

在一些实施方案中，提供了FN3蛋白，其中根据本文所提供的任何方法来鉴定所述FN3蛋白。

可修饰特异性结合CD71的FN3结构域以改进其性质，例如改进热稳定性以及热折叠和去折叠的可逆性。已应用若干方法来增加蛋白质和酶的表观热稳定性，包括基于与高度类似的热稳定序列的比较的合理设计、使二硫桥稳定化的设计、用以增加α螺旋倾向的突变、工程化改造盐桥、改变蛋白质的表面电荷、定向进化和布置共有序列(Lehmann和Wyss,Curr.Opin.Biotechnol.,12,371-375,2001)。高热稳定性可增加所表达蛋白质的产率，改进溶解性或活性，降低免疫原性，并最小化制造中的冷链需求。可经取代以改进Tencon(SEQID NO:276)的热稳定性的残基是残基位置11、14、17、37、46、73或86，并且阐述于美国专利公开第2011/0274623号中。可将对应于这些残基的取代纳入本文所公开含有FN3结构域的分子中。

蛋白质稳定性和蛋白质不稳定性的测量可视为蛋白质完整性的相同或不同方面。蛋白质对以下各项敏感或“不稳定”：由热、紫外或电离辐射引起的变性、环境渗透压和pH的变化(如果在液体溶液中)、由小孔径过滤施加的机械剪切力、紫外辐射、电离辐射(例如通过γ辐照)、化学或热脱水，或可引起蛋白质结构破坏的任何其他作用或力。可使用标准方法测定分子稳定性。例如，可通过使用标准方法测量热熔融(“T_m”)温度来确定分子稳定性，所述温度是一半分子去折叠的温度并且以摄氏度(℃)表示。通常，T_m越高，分子越稳定。除热之外，化学环境也改变蛋白质维持特定三维结构的能力。

在一些实施方案中，与工程化之前的相同结构域相比，结合CD71的FN3结构域可表现出稳定性增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多，如通过Tm增加所测量。

同样可通过各种方法测量化学变性。化学变性剂包括胍盐酸盐、胍硫氰酸酯、脲、丙酮、有机溶剂(DMF、苯、乙腈)、盐(硫酸铵、溴化锂、氯化锂、溴化钠、氯化钙、氯化钠)；还原剂(例如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、二硝基硫基苯和氢化物(如硼氢化钠))、非离子和离子洗涤剂、酸(例如盐酸(HCl)、乙酸(CH₃COOH)、卤化乙酸)、疏水性分子(例如磷脂)和靶向变性剂。变性程度的量化可依赖于功能性质(例如结合目标分子的能力)或生理化学性质(例如聚集趋势、先前的溶剂不可及性残基的暴露或二硫键的破坏或形成)的损失。

结合CD71的FN3结构域可生成为单体、二聚体或多聚体(例如作为增加化合价并由此增加目标分子结合的亲合力的方式)，或生成为同时结合两个或更多个不同目标分子的双特异性或多特异性架构。可通过连接单特异性、双特异性或多特异性蛋白质架构来生成二聚体和多聚体，例如通过纳入氨基酸接头(例如含有聚甘氨酸、甘氨酸和丝氨酸或丙氨酸和脯氨酸的接头)。示例性接头包括但不限于GS)2(SEQ ID NO:278)、(GGGS)2(SEQ ID NO:279)、(GGGGS)1-5(SEQ ID NO:280)、(AP)1-20、(AP)2(SEQ ID NO:281)、(AP)5(SEQ ID NO:282)、(AP)10(SEQ ID NO:283)、(AP)20(SEQ ID NO:284)、A(EAAAK)5AAA(SEQ ID NO:285)或(EAAAK)1-5(SEQ ID NO:307)。在一些实施方案中，所述接头是以下氨基酸序列：EAAAKEAAAKEAAAKEAAAK(SEQ ID NO:300)；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:301)；APAPAPAPAP(SEQ ID NO:302)；或EAAAK(SEQ ID NO:303)。

二聚体和多聚体可沿N方向至C方向彼此连接。使用天然存在以及人工肽接头将多肽连结成新连接的融合多肽已在文献中众所周知(Hallewell等人,J Biol Chem 264,5260-5268,1989；Alfthan等人,Protein Eng.8,725-731,1995；Robinson和Sauer,Biochemistry 35,109-116,1996；美国专利第5,856,456号)。

半衰期延长部分

特异性结合CD71的FN3结构域可例如经由共价相互作用纳入其他亚基。在一些实施方案中，特异性结合CD71的FN3结构域还包含半衰期延长部分。示例性的半衰期延长部分是白蛋白、白蛋白变体、白蛋白结合蛋白和/或结构域、转铁蛋白及其片段与类似物和Fc区。人类Fc区的氨基酸序列是众所周知的，并且包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE Fc区。在一些实施方案中，特异性结合CD71的FN3结构域可纳入结合至延长整个分子的半衰期的分子(例如但不限于本文所阐述的任何半衰期延长部分)的第二FN3结构域。在一些实施方案中，第二FN3结构域结合至白蛋白、白蛋白变体、白蛋白结合蛋白和/或结构域以及其片段和类似物。

抗体恒定区的全部或一部分可附接至结合CD71的FN3结构域以赋予抗体样性质，尤其是那些与Fc区相关的性质，例如Fc效应功能如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)下调，并且可通过修饰负责这些活性的Fc残基来进一步修饰(综述可参见Strohl,Curr Opin Biotechnol.20,685-691,2009)。

可将额外部分纳入特异性结合CD71的FN3结构域中以实现期望性质，例如聚乙二醇(PEG)分子(如PEG5000或PEG20,000)、具有不同链长的脂肪酸和脂肪酸酯(例如月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、硬脂酸酯、花生酸酯、山嵛酸酯、油酸酯、花生四烯酸酯、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等)、聚赖氨酸、辛烷、碳水化合物(葡聚糖、纤维素、寡糖或多糖)。这些部分可与蛋白质架构编码序列直接融合并且可通过标准克隆和表达技术生成。或者，可使用众所周知的化学偶联方法将所述部分附接至本文所公开的重组产生的分子。

可例如通过以下方式将PEG部分添加至结合CD71的FN3结构域中：将半胱氨酸残基纳入分子的C末端或将半胱氨酸工程改造至背对分子的CD71结合面的残基位置中，以及使用众所周知的方法将PEG基团附接至半胱氨酸。

可通过若干众所周知的测定比较纳入额外部分的特异性结合CD71的FN3结构域的功能性。例如，可在Fc受体结合测定中使用可溶性受体形式(例如FcγRI、FcγRII、FcγRIII或FcRn受体)或使用基于细胞的众所周知的测定(测量例如ADCC或CDC或在体内模型中评价本文所公开分子的药物动力学性质)来测定因纳入Fc结构域和/或Fc结构域变体而改变的性质。

多核苷酸、载体、宿主细胞

在一些实施方案中，提供了编码特异性结合CD71的FN3结构域的核酸(作为经分离多核苷酸或作为表达载体的部分或作为线性DNA序列(包括用于体外转录/翻译的线性DNA序列)的部分)、与组合物或其定向致突变原的原核、真核或丝状噬菌体表达、分泌和/或显示相容的载体。本文公开某些示例性多核苷酸，然而，考虑到既定表达系统中的基因代码或密码子偏好的简并性编码本文所公开的FN3结构域的其他多核苷酸也在本公开范围内。

在一些实施方案中，经分离多核苷酸编码包含SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的氨基酸序列的特异性结合CD71的FN3结构域。

可通过化学合成(例如固相多核苷酸合成)在自动化多核苷酸合成器上产生本文所公开的多核苷酸并组装成完整单链或双链分子。或者，可通过其他技术(例如PCR和随后的常规克隆)产生本文所公开的多核苷酸。用于产生或获得具有既定已知序列的多核苷酸的技术是本领域中众所周知的。

本文所公开的多核苷酸可包含至少一种非编码序列，例如启动子或增强子序列、内含子、多腺苷酸化信号、促进RepA结合的顺式序列等。多核苷酸序列还可包含编码额外氨基酸的额外序列，所述额外氨基酸编码例如标志物或标签序列(例如组氨酸标签或HA标签，用以促进蛋白质的纯化或检测)、信号序列、融合蛋白伴侣(如RepA)、Fc或噬菌体外壳蛋白(如pIX或pIII)。

在一些实施方案中，提供了包含至少一种本文所公开的多核苷酸的载体。此类载体可为质粒载体、病毒载体、用于杆状病毒表达的载体、基于转座子的载体或适于通过任何方式将本文所公开的多核苷酸引入既定生物体或遗传背景中的任何其他载体。此类载体可为包含可控制、调控、引起或允许通过此种载体编码的多肽的表达的核酸序列元件的表达载体。此类元件可包含转录增强子结合位点、RNA聚合酶起始位点、核糖体结合位点和有利于所编码多肽在既定表达系统中表达的其他位点。此类表达系统可为本领域中众所周知的基于细胞或无细胞的系统。

在一些实施方案中，提供了包含载体的宿主细胞。如本领域众所周知的，可任选地通过细胞系、混合细胞系、永生化细胞或永生化细胞的克隆群体产生特异性结合CD71的FN3结构域。例如参见Ausubel等人编辑,Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,Inc.,NY,NY(1987-2001)；Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratoryManual,第2版,Cold Spring Harbor,NY(1989)；Harlow和Lane,Antibodies,a LaboratoryManual,Cold Spring Harbor,NY(1989)；Colligan等人编辑,Current Protocols inImmunology,John Wiley&Sons,Inc.,NY(1994-2001)；Colligan等人,Current Protocolsin Protein Science,John Wiley&Sons,NY,NY,(1997-2001)。

选择用于表达的宿主细胞可属哺乳动物源或者可选自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、He G2、SP2/0、HeLa、骨髓瘤、淋巴瘤、酵母、昆虫或植物细胞或其任何衍生、永生化或转化细胞。或者，宿主细胞可选自不能糖基化多肽的物种或生物体，例如原核细胞或生物体，如BL21、BL21(DE3)、BL21-GOLD(DE3)、XL1-Blue、JM109、HMS174、HMS174(DE3)，以及天然或工程化大肠杆菌属(E.coli spp)、克雷伯菌属(Klebsiella spp.)或假单胞菌属(Pseudomonas spp)菌株中的任一者。

在一些实施方案中，提供了产生结合CD71的经分离FN3结构域的方法，所述方法包括在使得结合CD71的经分离FN3结构域表达的条件下培养经分离宿主细胞，以及纯化FN3结构域。

可通过众所周知的方法从重组细胞培养物纯化结合CD71的FN3结构域，例如通过蛋白质A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水性相互作用色谱法、亲和色谱法、羟磷灰石色谱法和凝集素色谱法或高效液相色谱法(HPLC)。

在一些实施方案中，特异性结合CD71的FN3结构域包含SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的氨基酸序列，其中已将组氨酸标签附加至多肽的N末端或C末端以便于纯化。在一些实施方案中，组氨酸标签(His标签)包含六个组氨酸残基。在其他实施方案中，通过至少一个甘氨酸残基或约2至约4个甘氨酸残基将His标签连结至FN3结构域。因此，在纯化FN3结构域并从多肽裂解His标签之后，一个或多个甘氨酸可保留于N末端或C末端。在一些实施方案中，如果从N末端去除His标签，则所有甘氨酸均已去除。在一些实施方案中，如果从C末端去除His标签，则一个或多个甘氨酸得以保留。

在一些实施方案中，特异性结合CD71的FN3结构域包含SEQ IDNO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的氨基酸序列，其中N末端甲硫氨酸在纯化FN3结构域之后得以保留。

试剂盒

在一些实施方案中，提供了包含结合CD71的FN3结构域的试剂盒。

所述试剂盒可用于治疗用途以及用作诊断试剂盒。

在一些实施方案中，所述试剂盒包含结合CD71的FN3结构域和用于检测FN3结构域的试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒包含二价FN3结构域。所述试剂盒可包括一种或多种其他要素，包括：使用说明书；其他试剂，例如标记、可用于螯合或以其他方式偶联的剂、放射保护性组合物；用于制备结合CD71的FN3结构域以施用用于成像、诊断或治疗目的的装置或其他材料；药学上可接受的载剂；以及用于施用于受试者的装置或其他材料。

在一些实施方案中，所述试剂盒包含含有SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306中的一者的氨基酸序列的结合CD71的FN3结构域。

结合CD71的FN3结构域的用途

特异性结合CD71的FN3结构域或其缀合物可用于诊断、监测、调节、治疗、缓解、帮助预防发生或减轻细胞、组织、器官、流体或通常宿主中的人类疾病或特定病变的症状。

在一些实施方案中，所述FN3结构域可有利于递送至CD71阳性组织(例如骨骼肌、平滑肌)中以治疗肌肉疾病。

在一些实施方案中，所述FN3结构域可有利于递送至活化淋巴细胞、树突状细胞、T细胞、NK细胞和B细胞或其他免疫细胞中以治疗免疫性疾病。

在一些实施方案中，特异性结合CD71的FN3结构域或其缀合物也可用于使受试者中的CD71阳性肿瘤组织成像。本文所公开的方法可用于属任何种类的动物患者。此类动物的实例包括哺乳动物如人类、啮齿动物、狗、猫和农场动物。

在一些实施方案中，提供了基于癌症组织细胞的CD71表达来诊断患有或可能患上组织癌症的受试者的方法、预测免疫疗法成功的方法、预后方法和治疗方法。

在一些实施方案中，提供了检测肿瘤组织中的表达CD71的癌细胞的方法，所述方法包括：从受试者获得肿瘤组织样品；通过以下方式来检测CD71是否表达于肿瘤组织中：使肿瘤组织样品与包含SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306中的一者的氨基酸序列的结合CD71的FN3结构域接触，以及检测CD71与FN3结构域之间的结合。在一些实施方案中，提供了治疗有需要的受试者的癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用结合至CD71的多肽或药物组合物。在一些实施方案中，所述多肽是结合至CD71的FN3结构域。在一些实施方案中，所述多肽包含例如SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的序列，或如本文所提供连接至或缀合至治疗剂的多肽。

在一些实施方案中，所述CD71细胞是涉及CNS疾病、炎症性/免疫疾病(如MS和感染性脑病)的细胞。在一些实施方案中，结合至CD71的多肽是针对中枢神经系统。在一些实施方案中，提供了治疗有需要的受试者的神经疾患和/或脑肿瘤的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用结合至CD71的多肽或药物组合物。在一些实施方案中，所述多肽是结合至CD71的FN3结构域。在一些实施方案中，所述多肽包含例如SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的序列，或如本文所提供连接至或缀合至治疗剂的多肽。在一些实施方案中，所述脑肿瘤选自由以下组成的组：非恶性脑肿瘤、良性脑肿瘤和恶性脑肿瘤。在一些实施方案中，所述神经疾患选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化、帕金森病、拉弗拉病、庞贝病、成人葡聚糖体病、中风、脊髓损伤、共济失调、贝尔氏麻痹、脑动脉瘤、癫痫、抽搐、格林-巴利综合征、多发性硬化、肌营养不良、神经皮肤综合征、偏头痛、脑炎、败血病和重症肌无力。

在一些实施方案中，结合至CD71的多肽是针对肌细胞。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用结合至CD71的多肽或药物组合物。在一些实施方案中，所述多肽是结合至CD71的FN3结构域。在一些实施方案中，所述多肽包含例如SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的序列，或如本文所提供连接至或缀合至治疗剂的多肽。

在一些实施方案中，提供了治疗有需要的受试者的糖原贮积病的方法，所述方法包括施用本文所提供的组合物。在一些实施方案中，所述糖原贮积病选自由以下组成的组：科里病或福布斯病(GSD3，糖原脱分支酶(AGL)缺乏)、麦卡德尔病(GSD5，肌糖原磷酸化酶(PYGM)缺乏)、II型糖尿病/糖尿病性肾病变、醛醇缩酶A缺乏GSD12、拉弗拉病、低氧症、安德森病(GSD4，糖原脱分支酶(GBE1)缺乏)、塔瑞病(GSD7，肌磷酸果糖激酶(PFKM)缺乏)和成人葡聚糖体病。在一些实施方案中，所述糖原贮积病选自由以下组成的组：糖原合酶(GYS2)缺乏(GSD0)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC/SLC37A4)缺乏(GSD1，冯吉尔克病)、赫尔斯氏病(GSD6，肝糖原磷酸化酶(PYGL)或肌磷酸甘油酸变位酶(PGAM2)缺乏)、磷酸化酶激酶(PHKA2/PHKB/PHKG2/PHKA1)缺乏(GSD9)、磷酸甘油酸变位酶(PGAM2)缺乏(GSD10)、肌乳酸脱氢酶(LDHA)缺乏(GSD11)、范可尼-比克尔综合征(GSD 11，葡萄糖转运蛋白(GLUT2)缺乏)、醛醇缩酶A缺乏(GSD 12)、β-烯醇酶(ENO3)缺乏(GSD13)和肝糖核心蛋白-1(GYG1)缺乏(GSD15)。

在一些实施方案中，结合至CD71的多肽是针对免疫细胞。在一些实施方案中，结合至CD71的多肽是针对树突状细胞、T细胞、NK细胞或B细胞。在一些实施方案中，提供了治疗有需要的受试者的自身免疫疾病的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用结合至CD71的多肽或药物组合物。在一些实施方案中，所述多肽是结合至CD71的FN3结构域。在一些实施方案中，所述多肽包含例如SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的序列，或如本文所提供连接至或缀合至治疗剂的多肽。在一些实施方案中，所述自身免疫疾病选自由以下组成的组：类风湿性关节炎、桥本氏自身免疫甲状腺炎、乳糜泻、1型糖尿病、白癜风、风湿热、恶性贫血/萎缩性胃炎、斑秃和免疫性血小板减少性紫癜。

在一些实施方案中，所述组织可为任何器官或解剖系统中表达CD71的组织。

在一些实施方案中，可使用已知方法(例如免疫组织化学或ELISA)评价CD71表达。

在一些实施方案中，提供了分离表达CD71的细胞的方法，所述方法包括：从受试者获得样品；使所述样品与包含SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306中的一者的氨基酸序列的结合CD71的FN3结构域接触；以及分离结合至FN3结构域的细胞。

在一些实施方案中，提供了检测肿瘤组织中的表达CD71的癌细胞的方法，所述方法包括：使包含SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306中的一者的氨基酸序列的结合CD71的FN3结构域结合至可检测标记以形成缀合物；将所述缀合物施用于受试者；以及使所述缀合物所结合的表达CD71的癌细胞可视化。

在一些实施方案中，提供了治疗有需要的受试者的癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用结合至CD71的多肽或药物组合物。在一些实施方案中，所述多肽是结合至CD71的FN3结构域。在一些实施方案中，所述多肽包含例如SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的序列，或如本文所提供连接至或缀合至治疗剂的多肽。在一些实施方案中，提供了治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用结合CD71的FN3结构域。在一些实施方案中，所述FN3结构域缀合至治疗剂(例如细胞毒性剂、寡核苷酸如siRNA、反义物等、结合至另一靶标的FN3结构域等)。

在一些实施方案中，所述受试者患有实体肿瘤。

在一些实施方案中，所述实体肿瘤是黑色素瘤。

在一些实施方案中，所述实体肿瘤是肺癌。在一些实施方案中，所述实体肿瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施方案中，所述实体肿瘤是鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施方案中，所述实体肿瘤是非鳞状NSCLC。在一些实施方案中，所述实体肿瘤是肺腺癌。

在一些实施方案中，所述实体肿瘤是肾细胞癌(RCC)。

在一些实施方案中，所述实体肿瘤是间皮瘤。

在一些实施方案中，所述实体肿瘤是鼻咽癌(NPC)。

在一些实施方案中，所述实体肿瘤是结肠直肠癌。

在一些实施方案中，所述实体肿瘤是前列腺癌。在一些实施方案中，所述实体肿瘤是去势抵抗性前列腺癌。

在一些实施方案中，所述实体肿瘤是胃癌。

在一些实施方案中，所述实体肿瘤是卵巢癌。

在一些实施方案中，所述实体肿瘤是胃癌。

在一些实施方案中，所述实体肿瘤是肝癌。

在一些实施方案中，所述实体肿瘤是胰腺癌。

在一些实施方案中，所述实体肿瘤是甲状腺癌。

在一些实施方案中，所述实体肿瘤是头颈部鳞状细胞癌。

在一些实施方案中，所述实体肿瘤是食道癌或胃肠道癌。

在一些实施方案中，所述实体肿瘤是乳腺癌。

在一些实施方案中，所述实体肿瘤是输卵管癌。

在一些实施方案中，所述实体肿瘤是脑癌。

在一些实施方案中，所述实体肿瘤是尿道癌。

在一些实施方案中，所述实体肿瘤是泌尿生殖道癌。

在一些实施方案中，所述实体肿瘤是子宫内膜异位症。

在一些实施方案中，所述实体肿瘤是宫颈癌。

在一些实施方案中，所述实体肿瘤是转移性癌症病灶。

在一些实施方案中，所述受试者患有血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，所述血液恶性肿瘤是淋巴瘤、骨髓瘤或白血病。在一些实施方案中，所述血液恶性肿瘤是B细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，所述血液恶性肿瘤是伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)。在一些实施方案中，所述血液恶性肿瘤是霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)。在一些实施方案中，所述血液恶性肿瘤是非霍奇金淋巴瘤。

在一些实施方案中，所述血液恶性肿瘤是骨髓发育不良综合征。

在一些实施方案中，所述血液恶性肿瘤是急性髓系白血病(AML)。在一些实施方案中，所述血液恶性肿瘤是慢性髓系白血病(CML)。在一些实施方案中，所述血液恶性肿瘤是慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)。

在一些实施方案中，所述血液恶性肿瘤是多发性骨髓瘤(MM)。

在一些实施方案中，所述血液恶性肿瘤是浆细胞瘤。

在一些实施方案中，本文所提供的组合物或药物组合物可单独施用，或与其他治疗剂组合(即同时或依序)施用。在一些实施方案中，其他或额外治疗剂是其他抗肿瘤剂或治疗剂。不同肿瘤类型和肿瘤阶段可能需要使用各种可用于治疗癌症的辅助化合物。例如，本文所提供的组合物可与各种化学治疗剂组合使用，例如尤其是紫杉醇(taxol)、酪氨酸激酶抑制剂、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、伊立替康(irinotecan)、磷酸酶抑制剂、MEK抑制剂。所述组合物也可与调节肿瘤免疫反应的药物(例如尤其是抗PD-1或抗CTLA-4)组合使用。额外治疗可为调节免疫系统的剂，例如靶向PD-1或PD-L1的抗体。

在一些实施方案中，结合至CD71的多肽是针对中枢神经系统。在一些实施方案中，提供了治疗有需要的受试者的神经疾患和/或脑肿瘤的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用结合至CD71的多肽或药物组合物。在一些实施方案中，所述多肽是结合至CD71的FN3结构域。在一些实施方案中，所述多肽包含例如SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的序列，或包含如本文所提供连接至或缀合至治疗剂的多肽。在一些实施方案中，所述脑肿瘤选自由以下组成的组：非恶性脑肿瘤、良性脑肿瘤和恶性脑肿瘤。在一些实施方案中，所述神经疾患选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化、帕金森病、拉弗拉病、庞贝病、成人葡聚糖体病、中风、脊髓损伤、共济失调、贝尔氏麻痹、脑动脉瘤、癫痫、抽搐、格林-巴利综合征、多发性硬化、肌营养不良、神经皮肤综合征、偏头痛、脑炎、败血病和重症肌无力。在一些实施方案中，提供了治疗受试者的神经疾患和/或脑肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用结合CD71的FN3结构域并且所述FN3结构域缀合至治疗剂(例如细胞毒性剂、寡核苷酸如siRNA、反义物等、结合至另一靶标的FN3结构域等)。

在一些实施方案中，提供了治疗有需要的受试者的庞贝病(GSD2，酸性α-葡糖苷酶(GAA)缺乏)的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用结合至CD71的多肽或药物组合物。在一些实施方案中，所述多肽是结合至CD71的FN3结构域。在一些实施方案中，所述多肽包含例如SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的序列，或如本文所提供连接至或缀合至治疗剂的多肽。在一些实施方案中，提供了治疗受试者的庞贝病(GSD2，酸性α-葡糖苷酶(GAA)缺乏)的方法，所述方法包括向所述受试者施用结合CD71的FN3结构域并且所述FN3结构域缀合至治疗剂(例如细胞毒性剂、寡核苷酸如siRNA、反义物等、结合至另一靶标的FN3结构域等)。

在一些实施方案中，结合至CD71的多肽是针对免疫细胞。在一些实施方案中，结合至CD71的多肽是针对树突状细胞。在一些实施方案中，提供了治疗有需要的受试者的自身免疫疾病的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用结合至CD71的多肽或药物组合物。在一些实施方案中，所述多肽是结合至CD71的FN3结构域。在一些实施方案中，所述多肽包含例如SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的序列，或如本文所提供连接至或缀合至治疗剂的多肽。在一些实施方案中，所述自身免疫疾病选自由以下组成的组：类风湿性关节炎、桥本氏自身免疫甲状腺炎、乳糜泻、1型糖尿病、白癜风、风湿热、恶性贫血/萎缩性胃炎、斑秃和免疫性血小板减少性紫癜。在一些实施方案中，提供了治疗受试者的自身免疫疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用结合CD71的FN3结构域并且所述FN3结构域缀合至治疗剂(例如细胞毒性剂、寡核苷酸如siRNA、反义物等、结合至另一靶标的FN3结构域等)。

在一些实施方案中，特异性结合CD71的FN3结构域或其缀合物可用于诊断、监测、调节、治疗、缓解、帮助预防发生或减轻细胞、组织、器官、流体或通常宿主中的人类疾病或特定病变的症状，并且也表现出能够跨越血脑屏障的性质。血脑屏障(BBB)可防止大部分大分子(例如DNA、RNA和多肽)和许多小分子进入脑中。BBB主要由具有高度限制性紧密连接的特殊内皮细胞构成，因此，通过BBB来控制大小物质从血液进入中枢神经系统的通道。此结构使得神经疾病和病症(例如脑癌)患者难以治疗和管控，这是因为许多治疗剂不能以期望效率递送穿过BBB。涉及BBB干扰的其他疾患包括：中风、糖尿病、癫痫、高血压性脑病、获得性免疫缺陷综合征、创伤性脑损伤、多发性硬化、帕金森病(PD)和阿尔茨海默病。这种能力尤其可用于治疗脑癌，包括例如：星形细胞瘤、髓母细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤(松果体瘤)、多形性胶质母细胞瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤和先天性肿瘤；或脊髓癌，例如神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤和肉瘤。在某些实施方案中，包含SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306中的一者的氨基酸序列的特异性结合CD71的FN3结构域或其缀合物可用于将治疗剂或细胞毒性剂递送例如穿过血脑屏障。

在一些实施方案中，可有利于治疗剂转运穿过BBB的多肽是包含SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的序列的蛋白质。

“治疗(treat或treatment)”是指治疗性治疗和预防性措施，其中目的是预防或减缓(减轻)不期望生理变化或病症(如癌症的发生或扩散)。在一些实施方案中，有益或期望的临床结果包括但不限于缓解症状、减小疾病范围、稳定疾病状态(即不恶化)、延迟或减缓疾病进展、改善或缓和疾病状态和可检测或不可检测地缓解病情(部分或全部)。“治疗”也可意味着与未接受治疗的预期存活期相比延长存活期。需要治疗者包括已患有疾患或病症者以及倾向于患有所述疾患或病症者或待预防所述疾患或病症者。

“治疗有效量”是指可在所需时间段内以所需剂量有效地实现期望治疗结果的量。特异性结合CD71的FN3结构域的治疗有效量可根据例如以下因素而变化：个体的疾病状态、年龄、性别和体重。有效的结合CD71的FN3结构域的示例性指标为患者幸福感改善、肿瘤大小降低或收缩、肿瘤生长受阻止或减缓和/或不存在癌细胞向身体其他位置的转移。

施用/药物组合物

在一些实施方案中，提供了特异性结合CD71的FN3结构域和药学上可接受的载剂的药物组合物，所述结构域任选地缀合至本文所公开的可检测标记、治疗剂或细胞毒性剂。对于治疗性用途而言，特异性结合CD71的FN3结构域可制备为含有有效量的在药学上可接受的载剂中的结构域或分子作为活性成分的药物组合物。“载剂”是指与活性化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类媒介物可为液体，例如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。例如，可使用0.4％盐水和0.3％甘氨酸。这些溶液无菌并且通常不含微粒物质。它们可通过常规、众所周知的灭菌技术(例如过滤)来灭菌。所述组合物可视需要含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，如pH调节和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。此药物制剂中的本文所公开分子的浓度可广泛变化(即从小于约0.5重量％、通常至少约1重量％至多达15或20重量％)并且主要基于所需剂量、流体体积、粘度等根据所选特定施用模式来进行选择。合适的媒介物和制剂(包括其他人类蛋白，例如人类血清白蛋白)阐述于例如Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第21版,Troy,D.B.编辑,Lipincott Williams and Wilkins,Philadelphia,PA 2006,第5部分,Pharmaceutical Manufacturing第691--1092页，尤其参见第958-989页。

本文所公开FN3结构域的治疗用途的施用模式可为任何将药剂递送至宿主中的合适途径，例如肠胃外施用，例如皮内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下、经肺；经粘膜(口服、鼻内、阴道内、经直肠)，其使用呈片剂、胶囊、溶液、散剂、凝胶、颗粒形式的制剂；和含于注射器、植入装置、渗透泵、滤筒、微型泵中；或本领域技术人员所了解的其他方式，如本领域中众所周知的。位点特异性施用可通过例如以下方式来实现：关节内、支气管内、腹内、荚膜内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑心室内、结肠内、颈管内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、血管内、膀胱内、病灶内、经阴道、经直肠、经颊、舌下、鼻内或透皮递送。

药物组合物可供应为包含含有如本文所阐述药物组合物的容器的试剂盒。药物组合物可提供为例如用于单一或多个剂量的可注射溶液形式，或提供为在注射之前重构的无菌散剂。或者，此种试剂盒可包括干粉分配器、液体气雾剂生成器或用于施用药物组合物的喷雾器。此种试剂盒还可包含关于药物组合物的适应症和用法的书面信息。

实施例

下列实施例阐释本文所公开的实施方案。这些实施例仅提供用于阐释目的并且实施方案决不应解释为限制这些实施例，而应解释为涵盖由于本文所提供的教导内容而变得显而易见的任何和所有变化。本领域技术人员将容易地识别各种非关键参数，可对所述参数进行改变或修改以得到基本上类似的结果。

实施例1.具有随机环的Tencon文库的构建

Tencon(SEQ ID NO:276)是从来自人类腱糖蛋白-C的15个FN3结构域的共有序列设计的免疫球蛋白样架构，纤连蛋白III型(FN3)结构域(Jacobs等人,ProteinEngineering,Design,and Selection,25:107-117,2012；美国专利第8,278,419号)。Tencon的晶体结构显示连结七条β链的六个表面暴露环。所述环或每个环内的选定残基可随机化以构建可用于选择结合至特定靶标的新颖分子的纤连蛋白III型(FN3)结构域文库。

使用Tencon架构和各种设计策略来生成各种文库。一般来说，文库TCL1和TCL2产生良好结合剂。TCL1和TCL2文库的生成详细阐述于国际专利公开第WO/2014081944A2号中。

实施例2：具有替代结合表面的Tencon文库的生成

随机化于特定文库设计中的残基的选择决定了所产生相互作用表面的整体形状。BC、DE和FG环随机化的文库中所选结合麦芽糖结合蛋白(MBP)的含有FN3结构域的架构蛋白的X射线晶体学分析表明，所述架构蛋白具有适合MBP的活性位点的大多弯曲的界面(Koide等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104:6632-6637,2007)。与之相比，发现所选结合至MBP的锚蛋白重复架构蛋白具有极平坦的相互作用表面并结合至远离活性位点的MBP外表面(Binz等人,Nat.Biotechnol.22:575-582,2004)。这些结果表明，架构分子的结合表面的形状(弯曲对平坦)可决定能够由所述架构有效结合的靶蛋白或所述靶蛋白上的特定表位。关于工程化含有FN3结构域的蛋白质架构以供蛋白质结合的公开尝试依赖于工程化毗邻环以供靶标结合，由此产生弯曲的结合表面。这种方式可限制可由此类架构接近的靶标和表位的数量。

Tencon和其他FN3结构域含有两组位于分子相对面上的CDR样环，第一组由BC、DE和FG环形成，并且第二组由AB、CD和EF环形成。两组环由形成FN3结构的中心的β链隔开。如果将Tencon的图像旋转90度，则可看到替代表面。此略微凹陷的表面是由CD与FG环和两条反向平行的β链(C和Fβ链)形成，并且在本文中称为C-CD-F-FG表面。可使用C-CD-F-FG表面作为模板以通过将形成所述表面的残基子组随机化来设计蛋白质架构相互作用表面的文库。β链具有重复结构，其中每一其他残基的侧链暴露于蛋白质的表面。因此，可通过将一些或所有表面暴露的残基随机化于β链中来制备文库。通过选择β链中的适当残基，Tencon架构的固有稳定性应最小程度地受损，并且同时提供用于与其他蛋白质相互作用的独特架构表面。

用于构建此文库的方法的完整说明阐述于美国专利公开第2013/0226834号中。

形成Tencon27中的C-CD-F-FG表面的两条β链具有总共9个可随机化的表面暴露残基，即C链：S30、L32、Q34、Q36；F链：E66、T68、S70、Y72和V74，而CD环具有以下6个潜在残基：S38、E39、K40、V41、G42和E43并且FG环具有以下7个潜在残基：K75、G76、G77、H78、R79、S80和N81。如果所有22个残基均随机化，则选择将选定残基纳入TCL14设计中，这是因为文库的理论大小较大。

选择Tencon中的以下13个位置进行随机化：C链中的L32、Q34和Q36；CD环中的S38、E39、K40和V41；F链中的T68、S70和Y72；FG环中的H78、R79和N81。在C和F链中，S30和E66未经随机化，这是因为它们恰好位于CD和FG环之外并且看起来显然不为C-CD-F-FG表面的一部分。对于CD环而言，G42和E43并不随机，这是因为提供柔性的甘氨酸可能在环区中有价值，并且E43位于表面的接点处。FG环不包括K75、G76、G77和S80。甘氨酸是出于上述原因而被排除，而对晶体结构的小心检查则揭示，S80与核心进行关键接触以帮助形成稳定FG环。K75背对C-CD-F-FG表面并且是用于随机化的不太吸引人的候选者。尽管上文所提及残基未随机化于原始TCL14设计中，但其可包括于后续文库设计中以提供用于重新选择或例如用于选定TCL14靶特异性命中上的亲和力成熟文库的额外多样性。

在产生TCL14后，产生3种具有类似设计的额外Tencon文库。这两种文库TCL19、TCL21和TCL23在与TCL14(见上文)相同的位置处随机化，然而，出现在这些位置处的氨基酸的分布有所改变。TCL19和TCL21经设计以包括18种天然氨基酸在每一位置处的平均分布(各5.55％)，仅排除半胱氨酸和甲硫氨酸。TCL23经设计以使得每个随机化位置近似于发现于功能抗体的HCDR3环中的氨基酸分布(Birtalan等人,J.Mol.Biol.377:1518-1528,2008)。如同TCL21文库，排除半胱氨酸和甲硫氨酸。

构建第三额外文库以扩展其他文库的潜在靶标结合表面。在此文库TCL24中，与文库TCL14、TCL19、TCL21和TCL23相比，4个额外Tencon位置经随机化。这些位置包括D链的N46和T48以及G链的S84和I86。选择位置46、48、84和86的特殊原因在于，这些残基的侧链从β链D和G表面暴露并且在结构上毗邻C和F链的随机部分，由此增加了可用于结合至靶蛋白的表面积。TCL24的每个位置处所用的氨基酸分布与针对TCL19和TCL21所阐述者相同。

TCL21、TCL23和TCL24文库的生成

使用Colibra文库技术(Isogenica)生成TCL21文库以控制氨基酸分布。使用Slonomics技术(Morphosys)生成TCL19、TCL23和TCL24基因片段以控制氨基酸分布。如上文针对环文库所阐述，在初始合成后使用PCR扩增每个文库，随后连接至RepA基因以用于使用CIS显示系统的选择中(Odegrip等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:2806-2810,2004)。

实施例3：结合CD71的纤连蛋白III型(FN3)结构域的选择

淘选和生物化学筛选

经由CIS显示(Odegrip等人,2004)使用具有N末端6His标签的重组生物素化CD71细胞外结构域(Sino Biologics)来选择人类CD71的特异性FN3结构域。对于体外转录与翻译(ITT)而言，使用3μg来自FN3结构域文库TCL18、TCL19、TCL21、TCL23和TCL24的DNA，并且通过洗涤去除未结合的文库成员。通过加热从靶蛋白洗脱DNA并通过PCR使用KOD聚合酶来扩增以用于其他轮的淘选。通过在每一轮期间将靶CD71的浓度从400nM连续降至100nM并增加洗涤严格度来分离高亲和力结合剂。对来自第五轮淘选的输出进行额外四轮解离速率选择。生物素化靶抗原浓度从第6和7轮的25nM降至第8和9轮中的2.5nM。

在淘选后，通过PCR扩增编码选定FN3结构域的基因，亚克隆至经修饰以包括连接酶独立克隆位点的pET载体中，并使用标准分子生物学技术转化成BL21(DE3)(Stratagene)细胞以可溶性表达于大肠杆菌中。将编码C末端多组氨酸标签的基因序列添加至每个FN3结构域中以使得能够进行纯化和检测。

为筛选特异性结合CD71的FN3结构域，将经抗生蛋白链菌素包被的Maxisorp板(Nunc目录号436110)在Starting Block T20(Pierce)中封闭1小时并且然后使用生物素化CD71(使用与淘选中相同的抗原)或阴性对照(无关Fc融合性重组蛋白和人类血清白蛋白)包被1小时。使用TBST冲洗板，并且将经稀释溶解物施加至板中并保持1小时。在额外冲洗后，使用与HRP缀合的抗V5标签抗体(Abcam,ab1325)将孔处理1小时并且然后使用POD(Roche,11582950001)进行测定。对FN3结构域溶解物中ELISA信号至少10倍于抗生蛋白链菌素对照的信号的DNA进行测序，从而获得从第9轮筛选中分离的23个独特、可读FN3结构域序列。

尺寸排阻色谱分析

使用尺寸排阻色谱法测定抗CD71 FN3结构域的聚集状态。将每个纯化FN3结构域的等分试样(10μL)以0.3mL/min的流速使用PBS(pH 7.4)的流动相注于Superdex 75 5/150柱(GE Healthcare)上。通过280nm下的吸光度监测柱洗脱液。在每次运行中包括Tencon蛋白作为对照。使用Agilent ChemStation软件分析洗脱特征。

高通量表达和缀合

使所鉴定克隆在24孔深封闭板中以重复5mL培养物形式生长。简言之，使用150μL过夜培养物对5mL/孔的补充有50μg/mL卡那霉素(Kanamycin)的TB培养基加晶种并在37℃、振荡和220rpm下生长约3小时(OD600～1)。使用IPTG(最终浓度为1mM)将培养物在37℃、220rpm下再诱导4小时。通过在2250xg下离心15分钟来回收细菌团粒。将600μL/孔的补充有0.2mg/mL溶菌酶(Sigma)的BugBuster HT(Novagen)添加至每个孔中；通过移液管解离团粒并且然后在平台振荡器上剧烈振荡约30分钟直至团粒溶解为止。将板在2250xg下旋转15分钟以净化溶解物并且合并每个样品的2 600-μL等分试样。根据制造商说明书在His Trap板(GE)上来纯化加His标签的FN3结构域，随后使用Zeba Spin 7K脱盐板(ThermoScientific)将缓冲液更换为TBS。通过Nanodrop评估蛋白质浓度。为缀合至GlyGly-VC-MMAF，使FN3结构域(30μM)与150μMGlyGlyVC-MMAF(Concortis)和1μM分选酶A混合并且总体积为200μL。在室温下进行缀合1.5小时并根据制造商说明书使用来自GE Healthcare的96孔His Multitrap HP板再次纯化。使用Zeba脱盐板将缓冲液更换成PBS，随后使用Multiscreen HTS GV板(Durapore)无菌过滤并在3000xg下离心2min。通过Nanodrop评估浓度。

CD71介导的SK-BR3细胞杀伤测定。

通过测量在暴露于半胱氨酸变体-细胞毒素缀合物后过度表达CD71的人类肿瘤细胞系H1573 w/SKBR3的存活率来评估细胞杀伤。将细胞以7000个/孔平铺于黑孔、透明底、经组织培养物处理的板(Falcon 353219)中的100μL/孔含有5％胎牛血清(Gibco)的无酚红RPMI培养基(Gibco11835-030)中。使细胞在37℃下于加湿5％ CO2气氛中附着过夜。从96孔板抽吸培养基并且使用50uL新鲜培养基和50uL配制于新鲜培养基中的2X抑制剂处理细胞。通过终点测定使用Cell TiterGlo(Promega)在70小时时测定细胞存活率。通过使用GraphPad Prism 5(GraphPad软件)将数据拟合至具有可变斜率的S形剂量反应方程式来确定IC50值。

通过剂量-反应ELISA分析选定克隆的结合

通过ELISA分析选定克隆以确定结合的EC50值。简言之，使用5μg/ml抗生蛋白链菌素将Maxisorb板在4C下包被过夜。然后使用StartingBlock(ThermoFisher)在室温下将板封闭1小时并且然后使用TBS-Tween洗涤。将生物素化CD71(2μg/ml)捕获于抗生蛋白链菌素板上并且将连续稀释的FN3蛋白添加至适当孔中，并在室温下保持1小时。在洗涤后，使用缀合至HRP和POD底物的抗V5标签抗体和发光读板仪检测结合的FN3蛋白。绘制发光值随浓度而变化的曲线并使用PRISM拟合至剂量反应以确定结合的EC50值。

经由毒素缀合物鉴定内化FN3结构域。使用针对NEM缀合所阐述的方法经由酶可裂解性Val-Cit接头或非裂解性PEG4接头(VC-MMAF)使FN3结构域缀合至细胞毒性微管蛋白抑制剂单甲基奥里斯他汀F(MMAF)。通过测量在暴露于半胱氨酸变体-细胞毒素缀合物后SKBR-3细胞的存活率来评估细胞杀伤。将细胞以3000个/孔平铺于白孔、不透明底、经组织培养物处理的板(Fisher,PI15042)中的50μL/孔含有10％胎牛血清(Gibco)的酚红RPMI培养基(Gibco,11875093)中。使细胞在37°下于加湿5％ CO2气氛中附着过夜。使用25uL新鲜培养基和25uL配制于新鲜培养基中的4×抑制剂处理细胞。通过终点测定使用CellTiterGlo(Promega)在72小时时测定细胞存活率。通过使用GraphPad Prism(GraphPad软件)将数据拟合至具有可变斜率的S形剂量反应方程式来确定IC50值。

二价FN3蛋白

使用由4个重复G/S接头或其他适当多肽接头连结的两个FN3结构域来产生二价FN3蛋白。使二价FN3蛋白缀合至所阐述VC-MMAF并在SK-BR3细胞中评估细胞毒性。通常发现，二价分子的IC50值优于单价形式。

转铁蛋白结合竞争和内化

使用上述细胞毒性测定针对与人类转铁蛋白的竞争来筛选FN3结构域vcMMAF缀合物。在不存在或存在0.6uM全人类转铁蛋白(T0665-100MG)下筛选FN3结构域。

pHrodo-Tf测定

评价靶向CD71的Centyrin与转铁蛋白竞争结合至转铁蛋白受体的能力。使用直接缀合至pHrodo-Red的转铁蛋白处理细胞，所述pHrodo-Red是在酸性腔室中发荧光并且因此在细胞摄取至胞内体和溶酶体腔室中后可见的染料。在Incucyte上使pHrodo-转铁蛋白(pHrodo-Tf)成像，其中容许实时测量Tf摄取。在将细胞与pHrodo-Tf和与Tf竞争CD71结合的分子一起培育时，pHrodo信号有所减少或消除。不与Tf竞争CD71结合的Centyrin对pHrodo信号并无影响。

实施例4：结合CD71并且不与转铁蛋白竞争的纤连蛋白III型(FN3)结构域的选择

为了鉴定不与转铁蛋白竞争或竞争性最小的结合CD71的FN3结构域，设计了偏向性CIS显示策略。简言之，使用在对人类CD71的ECD淘选5轮之后恢复的输出(实施例3)，如实施例3中所阐述再实施几轮解离速率选择，并且增加以下步骤：1)洗涤步骤，在最终洗脱步骤之前使用人类全转铁蛋白洗脱与转铁蛋白结合于相同位点的FN3结构域，或2)使用单克隆抗体OKT9洗脱FN3结构域结合剂。如先前所阐述(实施例3)，对从转铁蛋白洗涤策略和OKT9洗脱策略回收的FN3结构域实施PCR扩增并克隆至pET载体中。通过溶液ELISA证实，228个特异性结合huCD71的FN3结构域结合至huCD71ECD。通过SEC分析独特结合剂的子组，使其缀合至MMAF并经由细胞存活率测定在含有/不含全人类转铁蛋白的SKBR-3细胞中评估内化。发现多肽由受体内化。Integral分子实施膜蛋白质组阵列(MPA)测定以描述ABX1198(SEQ ID NO:209)、ABX1142(SEQ ID NO:209+His标签)和ABX1100(SEQ ID NO:209+具有接头的siRNA对)针对人类膜蛋白文库的特异性。MPA文库含有6000多种人类膜蛋白，包括94％的所有单通、多通和GPI锚定蛋白质(包括GPCR、离子通道和转运蛋白)，其中每个膜蛋白独特表达于禽类QT6细胞背景中。使用流式细胞术直接检测结合至个别地表达于未固定细胞中的膜蛋白的配体(FN3结构域)。

在具有最佳信号/背景噪声比的浓度(分别为1.25ug/ml、1.25ug/ml和0.31ug/ml)下针对MPA来筛选ABX1198(SEQ ID NO:209)、ABX1142(SEQ ID NO:209+His标签)和ABX1100(SEQ ID NO:209+具有接头的siRNA对)。在验证程序中使用配体连续稀释液和经所鉴定靶标个别转染的细胞来追踪在筛选中鉴定的膜蛋白靶标。

实施例5.使用CD71 FN3结构域-寡核苷酸缀合物敲低肌细胞中的mRNA。

使用马来酰亚胺化学经由独特工程化至FN3结构域中的半胱氨酸使结合muCD71的FN3结构域缀合至siRNA寡核苷酸或反义寡核苷酸(ASO)。半胱氨酸取代可为例如提供于本文中以及提供于美国专利申请公开第20150104808号(其特此通过引用整体并入)中者。使用标准化学修饰来修饰siRNA或ASO并且证实此能够敲低体外靶向mRNA。以最高10mg/kg寡核苷酸有效负载的剂量向小鼠经静脉内给与FN3结构域-寡核苷酸缀合物。在给药后的不同时间点下，将小鼠处死；回收骨骼肌、心肌和各种其他组织并储存于RNAlater^TM(SigmaAldrich)中直至需要时。使用标准qPCRΔΔC_T方法以及靶基因和对照基因的特异性引物来评估靶基因敲低。发现肌肉中的靶基因已被敲低并且此敲低可通过使siRNA或ASO缀合至CD71 FN3结合结构域而增强。

实施例6.亲和力成熟淘选：

展示选择性CD71顶端结构域结合的4个序列(A、B、C和D)是亲和力成熟文库的基础。在每个序列中，作为扩展表文库的一部分的4个氨基酸(双下划线)随机化至18个氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸，不包括脯氨酸、甲硫氨酸)中。对新文库进行以下4轮选择：a)转铁蛋白洗涤；b)OKT9洗脱；c)顶端结构域选择；d)顶端结构域、CD71_ECD选择。参见下文的序列SEQ ID NOL 288-291。

表2.顶端结构域淘选：主要溶液Elisa筛选的筛选命中的汇总

/>

表3.亲和力成熟淘选：针对CD71和顶端结构域的主要溶液Elisa筛选的筛选命中的汇总

/>

表4.顶端结构域淘选的命中的尺寸排阻色谱分析的汇总

/>

表5.亲和力成熟淘选的命中的尺寸排阻色谱分析的汇总

/>

顶端结构域淘选的命中的序列

/>

亲和力成熟淘选的命中的序列

/>

实施例7：FN3-siRNA缀合和纯化

使用经马来酰亚胺修饰的siRNA通过经由半胱氨酸特异性化学使经半胱氨酸修饰的FN3 CD71-49(SEQ ID:272)缀合至ABX0214(表6)来制备ABX1005。对于半胱氨酸-马来酰亚胺缀合而言，使用10mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)在室温下还原于PBS中的50-200μM含有半胱氨酸的FN3结构域(30min)以产生游离硫醇。为去除TCEP，使用饱和硫酸铵溶液使FN3蛋白沉淀并且然后与刚溶于水中的经马来酰亚胺修饰的siRNA双链体以约1.5:1FN3蛋白:siRNA的摩尔比率混合。在室温或37℃下培育1小时后，使用N-乙基马来酰亚胺(反应混合物中的最终NEM浓度为1mM)淬灭反应。

表6：AHA1 siRNA设计

缩写注释：(n/N＝任何核苷酸)mN＝2'-O-甲基残基，fN＝2'-F残基，*＝硫代磷酸酯并且(idt)＝倒转DT，(VP)2'-O甲基乙烯基膦酸酯尿苷。

以两个步骤来纯化FN3-siRNA缀合物：使用IMAC色谱法(HisTrap HP)去除未反应siRNA接头，和使用阴离子交换色谱法-Capto-DEAE去除未反应FN3蛋白。通过PAGE、分析型尺寸排阻色谱法和LC/MS表征FN3蛋白-siRNA缀合物。基于缀合物溶液在260下的吸光度使用Nanodrop来计算缀合物浓度。

小鼠中的FN3-siRNA体内活性

使用一个或三个静脉内剂量的ABX1005(缀合至siRNA的CD71FN3结构域)在10mpksiRNA或ABX1007(仅FN3对照)和等摩尔剂量下来治疗雄性CD-1小鼠。在最终剂量之后两周收集组织并进行处理以通过定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)进行AHA-1敲低分析。使用18S核糖体RNA作为RT-PCR内源对照基因。将敲低水平与经媒介物处理的小鼠进行比较。在此研究中所分析的所有肌肉组(腓肠肌、四头肌、心脏)中均观察到siRNA介导的AHA-1敲低(图1)。

使用单一静脉内剂量的ABX1005在10mpk、3mpk或1mpk siRNA下来治疗雄性C57/BL6小鼠。在单一剂量之后两周收集组织并进行处理以通过定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)进行AHA-1敲低分析。使用18S核糖体RNA作为RT-PCR内源对照基因。将敲低水平与经媒介物处理的小鼠进行比较。在此研究中所分析的所有肌肉组(腓肠肌、四头肌、横膈膜、心脏)中均观察到AHA-1的剂量依赖性敲低(图2)。

这些实施例证实，缀合至FN3结构域(例如本文所提供结合至CD71的FN3结构域)的siRNA分子可用于将siRNA分子以及其他活性部分递送至特定组织并调控特定靶标的表达。

实施例8：CD71 FN3结构域siRNA缀合物的结合特异性。

Integral Molecular(www.integralmolecular.com)实施其专属膜蛋白质组阵列(MPA)测定以描述CD71 FN3结构域和CD71 FN3结构域siRNA缀合物针对人类膜蛋白文库的特异性(图3)。MPA含有6000多种人类膜蛋白，涵盖94％的所有单通、多通和GPI锚定蛋白质(包括GPCR、离子通道和转运蛋白)，其中每个膜蛋白独特表达于禽类QT6细胞背景中。使用流式细胞术直接检测结合至个别地表达于未固定细胞中的膜蛋白的FN3结构域。

在具有最佳信号/背景噪声比的浓度(分别为1.25ug/ml或0.31ug/ml)下针对MPA来筛选FN3结构域和FN3结构域-siRNA缀合物。使用配体连续稀释液在独特表达所鉴定靶标的细胞上验证在筛选中鉴定的膜蛋白靶标。

实施例9：CD71 Centyrin缀合物和CD71单克隆抗体缀合物的体内比较。

此研究的目的在于确定与AHA1 siRNA缀合的工具Centyrin-AHA1缀合物与单克隆抗体R17相比的药效学活性的持续时间。在C57BL6/J雄性小鼠中，施用含有10mg AHA1siRNA的17.9mg工具centyrin-AHA1 siRNA缀合物或含有10mg AHA1 siRNA的120mg单克隆抗体R17(与AHA1 siRNA缀合)的单一静脉内团注。在给药后2周、4周和8周的时间点下(N＝3/时间点)于RNA later中收集在任何方向不超过0.5cm的腓肠肌组织以确保RNA later的良好渗透并在4C下储存24小时，然后将其储存于-80C下。使用Qiagen's RNeasy纤维组织试剂盒从腓肠肌分离总RNA。使用实时定量PCR，测量靶AHA1和内源对照Pgk1的表达水平。使用ΔΔCT方法分析数据，并相对于仅给与媒介物的对照动物进行归一化。相对于3种媒介物对照的平均值呈现治疗组中每个动物的AHA1和Pgk1的基因表达水平。通过将剩余AHA1 mRNA水平百分比减去100来测量工具AHA1-siRNA缀合物治疗组和与AHA1 siRNA缀合的单克隆抗体R17治疗组中的AHA1 mRNA的敲低百分比。

CD71 Centyrin缀合物在小部分mAb缀合物剂量下即可驱动持续基因敲低。C57/B6小鼠接受单一剂量(10mg/kg siRNA)的测试缀合物。在给药后2周、给药后4周和给药后8周测量腓肠肌中的AHA1的相对RNA表达。图4和表7呈现数据来证实，肌肉中的mRNA敲低活性是等效的，然而，CD71 Centyrin缀合物需要极小的缀合物剂量。

表7

实施例10：Centyrin-siRNA缀合物在食蟹猴(长尾猴(Macaca fascicularis))骨骼肌和心脏中具有活性

使用PBS-Tween(0.05％)洗涤经中性抗生物素蛋白(NeutrAvidin)包被的96孔板(Pierce,15116)，并使用封闭缓冲液(Starting Block T20,ThermoFisher 37539)封闭30分钟。以20nM的浓度将生物素化抗原(人类CD71-ECD[Acro Biosystems TFR-H8243]或食蟹猴CD71-ECD[Acro Biosystems TFR-C8249])固定于封闭板上，在室温下培育1小时。在封闭缓冲液中稀释Centyrin样品，从1000nM滴定至0.0169nM，并在室温下培育2小时。使用PBS-Tween洗涤板。将以1:2500在封闭缓冲液中制得的抗Centyrin抗体添加至板中，并培育1小时。使用PBS-Tween洗涤板。以1:2500在封闭缓冲液中制备抗兔HRP抗体，添加至板中，并培育1小时。洗涤板并使用ELISA底物(Roche,11582950001)在SpectraMax Paradigm上读出。图5和表8呈现数据来证实，CD71 Centyrin以及CD71 Centyrin缀合物有效结合人类和食蟹猴CD71并且siRNA缀合物不干扰CD71 Centyrin结合。

表8

本研究的目的在于确定centyrin-AHA1 siRNA缀合物在食蟹猴模型中的药效学(PD)活性。使用含有10mpk AHA1 siRNA的17.12mpk centyrin-AHA1 siRNA缀合物(N＝2)或媒介物(N＝2)经由IV团注(每周一次，在右隐静脉上)来治疗两只雄性食蟹猴并持续三周。在最后剂量后4周，收获骨骼肌组织(左右腓肠肌、左右四头肌、横膈膜、左右二头肌、比目鱼肌)、平滑肌组织(空肠)、左右心脏和非骨骼肌组织(皮肤、肝脏和肾脏)并储存于RNA later中以确保RNA later的良好渗透，并且在4C下储存24小时。使用Qiagen's RNeasy纤维组织试剂盒从这些组织分离总RNA。通过实时定量PCR测量靶AHA1和内源对照(ARL1、ARFGAP2、HPRT1、GAPDH和Gys1)的表达水平。使用ΔΔCt方法分析数据，并相对于仅给与媒介物的对照动物进行归一化。获取2个样品(每一侧组织1个活检)或1个样品(1个活检)的平均值以供分析。通过将剩余AHA1 mRNA水平百分比减去100来测量centyrin-AHA1 siRNA缀合物治疗组和媒介物组中的AHA1 mRNA的百分比敲低。在每个组织中，以从最高至最低AHA1敲低量的顺序显示AHA1敲低的百分比。

Centyrin-siRNA AHA1缀合物有效敲低食蟹猴肌肉和心脏中的体内mRNA水平，参见图6。每周向猴给与10mg/kg siRNA 3次。在三个剂量后第28天评估mRNA水平。

一般方法

分子生物学中的标准方法阐述于以下文献中：Sambrook,Fritsch和Maniatis(1982和1989年第2版，2001年第3版)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY；Wu(1993)Recombinant DNA，第217卷，Academic Press,San Diego,CA)。标准方法也出现于以下文献中：Ausbel等人(2001)Current Protocols in Molecular Biology，第1-4卷，John Wiley and Sons,Inc.New York,NY，其阐述在细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)、哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)、糖缀合物和蛋白质表达(第3卷)和生物信息学(第4卷)。

阐述了包括免疫沉淀、色谱法、电泳、离心和结晶的蛋白质纯化的方法(Coligan等人(2000)Current Protocols in Protein Science，第1卷，John Wiley and Sons,Inc.,New York)。阐述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生、蛋白质的糖基化(例如参见Coligan等人(2000)Current Protocols in Protein Science，第2卷，John Wileyand Sons,Inc.,New York；Ausubel等人(2001)Current Protocols in MolecularBiology，第3卷，John Wiley and Sons,Inc.,NY,NY，第16.0.5-16.22.17页；Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,MO；第45-89页；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.,第384-391页)。阐述了多克隆和单克隆抗体的产生、纯化和片段化(Coligan等人(2001)Current Protocolsin Immunology，第1卷，John Wiley and Sons,Inc.,New York；Harlow和Lane(1999)UsingAntibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Harlow和Lane，同上)。可利用表征配体/受体相互作用的标准技术(例如参见Coligan等人(2001)Current Protocols in Immunology，第4卷，John Wiley,Inc.,New York)。

本文所引用的所有参考文献都通过引用并入，其并入程度如同每一个别出版物、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利都特别地且个别地指示通过引用并入一般。申请人意欲依照37C.F.R.§1.57(b)(1)使通过引用并入的此声明涉及每一和所有个别出版物、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利(其中每一者都按照37C.F.R.§1.57(b)(2)明确鉴定)，即使此引用未紧随通过引用并入的专用声明。通过引用并入的专用声明(如果存在)包括在说明书内并不以任一方式减弱通过引用并入的此一般声明。本文参考文献的引用并不旨在承认参考文献是相关先前技术，其也不构成对这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。

本发明实施方案在范围上并不受限于本文所阐述的特定实施方案。实际上，根据前述说明，除本文所阐述的修改之外，所述实施方案的各种修改对于本领域技术人员而言也将变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。

认为上述书面说明足以使得本领域技术人员能够实践所述实施方案。根据前述说明，除本文所示和阐述的修改之外，所述实施方案的各种修改对于本领域技术人员而言也将变得显而易见并且落入所附权利要求的范围内。

Claims

1.一种多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:273的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％或90％同一的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306。

3.如权利要求2所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306中的两者。

4.一种多肽，所述多肽在人类CD71上的不与转铁蛋白竞争结合至CD71的位点处结合至CD71。

5.如权利要求4所述的多肽，其中所述多肽包含与具有SEQ ID NO:273的序列的多肽至少70％、75％、80％、85％或90％同一的氨基酸序列。

6.如权利要求4所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的序列。

7.如权利要求1-6中任一项所述的多肽，其中所述多肽缀合至可检测标记、寡核苷酸、治疗剂或其任何组合。

8.如权利要求7所述的多肽，其中所述可检测标记是放射性同位素、磁珠、金属珠、胶态颗粒、荧光染料、电子致密试剂、酶、生物素、地高辛或半抗原。

9.如权利要求7或8所述的多肽，其中所述可检测标记是奥里斯他汀、单甲基奥里斯他汀苯丙氨酸、多拉斯他汀、化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素或放射性同位素。

10.如权利要求7所述的多肽，其中所述治疗剂是化学治疗剂、药物、抗体、生长抑制剂、毒素、放射性同位素、抗微管蛋白剂、多核苷酸、siRNA分子或其有义或反义链、反义分子或其链、RNA分子、DNA分子、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷基化剂、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化学疗法敏化剂、拓扑异构酶抑制剂或长春花生物碱。

11.如权利要求7所述的多肽，其中所述治疗剂可通过调节基因表达、RNA表达或水平、微管蛋白结合、DNA结合、拓扑异构酶抑制、DNA交联、螯合、剪接体抑制、NAMPT抑制或HDAC抑制来诱发一种或多种细胞毒性效应。

12.如权利要求1-11中任一项所述的多肽，所述多肽进一步在所述多肽的N末端处包含甲硫氨酸。

13.如权利要求1-12中任一项所述的多肽，其中所述多肽偶联至半衰期延长部分。

14.如权利要求13所述的多肽，其中所述半衰期延长部分是白蛋白结合分子、聚乙二醇(PEG)、白蛋白、白蛋白变体、免疫球蛋白的Fc区的至少一部分。

15.如权利要求14所述的多肽，其中所述白蛋白结合分子是结合白蛋白或白蛋白变体的第二多肽。

16.一种经分离多核苷酸，所述经分离多核苷酸编码权利要求1-15中任一项所述的多肽。

17.一种载体，所述载体包含权利要求16所述的多核苷酸。

18.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求17所述的载体。

19.一种产生结合CD71的多肽的方法，所述方法包括在表达所述多肽的条件下培养权利要求18所述的经分离宿主细胞，以及纯化所述多肽。

20.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-15中任一项所述的多肽和药学上可接受的载剂。

21.一种抗独特型抗体，所述抗独特型抗体结合权利要求1-15中任一项所述的多肽。

22.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-15中任一项所述的多肽。

23.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所提供的多肽，例如SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306与治疗剂。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述癌症是脑癌。

25.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用与抗病毒剂、免疫系统调节剂或核酸分子缀合的本文所阐述的多肽，例如SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述癌症疾病是胶质母细胞瘤。

27.一种检测肿瘤组织中的表达CD71的癌细胞的方法，所述方法包括

a)从受试者获得所述肿瘤组织样品；以及

b)通过以下检测CD71是否表达于所述肿瘤组织中：使所述肿瘤组织的所述样品与包含SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306中的一者的氨基酸序列的多肽接触，以及检测CD71与所述多肽之间的结合。

28.一种分离表达CD71的细胞的方法，所述方法包括

a)从受试者获得样品；

b)使所述样品与包含SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306中的一者的氨基酸序列的多肽接触，以及

c)分离结合至所述多肽的细胞。

29.一种检测肿瘤组织中的表达CD71的癌细胞的方法，所述方法包括

a)使包含SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306中的一者的氨基酸序列的肽缀合至可检测标记以形成缀合物；

b)将所述缀合物施用于受试者；以及

c)使所述缀合物所结合的所述表达CD71的癌细胞可视化。

30.一种治疗神经疾患和/或脑肿瘤的方法，所述方法包括向受试者施用权利要求20所述的药物组合物。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述脑肿瘤选自由以下组成的组：非恶性脑肿瘤、良性脑肿瘤和恶性脑肿瘤。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述恶性脑肿瘤选自由以下组成的组：星形细胞瘤、髓母细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤(松果体瘤)、多形性胶质母细胞瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤，或脊髓癌，例如神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤和肉瘤。

33.如权利要求31所述的方法，其中所述脑肿瘤是先天性肿瘤。

34.如权利要求30所述的方法，其中所述神经疾患选自由以下组成的组：中风、糖尿病、癫痫、高血压性脑病、获得性免疫缺陷综合征、创伤性脑损伤、多发性硬化、帕金森病(PD)和阿尔茨海默病。

35.一种将目标剂递送至CD71阳性细胞的方法，所述方法包括使细胞与所述目标剂接触，所述目标剂偶联至结合至CD71的FN3结构域，例如权利要求1-15中任一项所述的多肽。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述目标剂经由CD71介导的相互作用内化至所述细胞中。

37.如权利要求35所述的方法，其中所述FN3结构域不与转铁蛋白竞争结合至CD71。

38.如权利要求33-37中任一项所述的方法，其中所述目标剂是化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素、放射性同位素、抗微管蛋白剂、多核苷酸、siRNA分子、反义分子、RNA分子、DNA分子、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷基化剂、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化学疗法敏化剂、拓扑异构酶抑制剂或长春花生物碱。

39.如权利要求35-38中任一项所述的方法，其中所述FN3结构域包含SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的序列。

40.如权利要求35-39中任一项所述的方法，其中所述细胞是肌细胞。

41.如权利要求35-39中任一项所述的方法，其中所述细胞是脑细胞或血脑屏障内部的细胞。

42.一种鉴定在不与转铁蛋白竞争结合至CD71或抑制转铁蛋白结合至CD71的位点处结合至CD71的FN3蛋白的方法，所述方法包括：

使CD71在转铁蛋白或结合至CD71转铁蛋白结合位点的剂存在下与测试FN3蛋白接触；以及

鉴定在转铁蛋白或结合至所述CD71转铁蛋白结合位点的剂存在下结合至CD71的测试FN3蛋白。

43.如权利要求42所述的方法，所述方法还包括分离在转铁蛋白或结合至所述CD71转铁蛋白结合位点的剂存在下结合至CD71的所述测试FN3蛋白。

44.如权利要求42或43所述的方法，所述方法还包括对在转铁蛋白或结合至所述CD71转铁蛋白结合位点的剂存在下结合至CD71的所述测试FN3蛋白进行测序。

45.如权利要求42-44中任一项所述的方法，所述方法还包括制备或获得编码在转铁蛋白或结合至所述CD71转铁蛋白结合位点的剂存在下结合至CD71的所述测试FN3蛋白的核酸序列。

46.如权利要求42-45中任一项所述的方法，所述方法还包括从核酸序列表达在转铁蛋白或结合至所述CD71转铁蛋白结合位点的剂存在下结合至CD71的所述测试FN3蛋白，所述核酸序列编码在转铁蛋白或结合至所述CD71转铁蛋白结合位点的剂存在下结合至CD71的所述测试FN3蛋白。

47.如权利要求46所述的方法，其中所述测试FN3蛋白表达于细胞中。

48.如权利要求46所述的方法，所述方法还包括分离和/或纯化所述所表达的测试FN3蛋白。

49.一种FN3蛋白，所述FN3蛋白是根据权利要求42-48中的任一项鉴定。

50.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求49所述的FN3蛋白。

51.一种经分离多核苷酸，所述经分离多核苷酸编码权利要求49所述的多肽。

52.一种载体，所述载体包含权利要求51所述的多核苷酸。

53.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求52所述的载体。