KR20240034160A - Cd71 결합 피브로넥틴 3형 도메인 - Google Patents

Cd71 결합 피브로넥틴 3형 도메인 Download PDF

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러셀 씨. 아디스
자나 드루지나
로버트 브이. 코라코프스키
스티븐 지. 나들러
카린 티. 오넬
야오 신
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에이알오 바이오테라퓨틱스 컴패니
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Abstract

본 개시내용은 CD71에 결합할 수 있는 파이브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인과 같은 폴리펩타이드, 이의 접합체, 분자를 암호화하는 단리된 뉴클레오타이드, 벡터, 숙주-세포뿐만 아니라 이를 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

CD71 결합 파이브로넥틴 유형 III 도메인
관련 출원
본 출원은 2021년 4월 14일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/174,752호 및 2022년 3월 28일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/324,431호에 대한 우선권을 주장하며, 이들 기초출원은 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되고 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 서열 목록을 포함한다. 2022년 5월 17일자로 생성된 상기 ASCII 복사본은 이름이 145965_002002_SL.txt이고, 크기가 283,204 바이트이다.
기술 분야
본 실시형태는 분화 클러스터 71(cluster of differentiation 71: CD71)에 특이적으로 결합하는 파이브로넥틴 유형 III 도메인(fibronectin type III domain: FN3) 및 해당 분자를 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.
트랜스페린 수용체 1로도 알려진 CD71은 철을 세포로 수송하는 데 필수적인 막횡단이다. 이는 많은 종양 유형 및 혈액 뇌 장벽에서 고도로 발현되므로, 약물 전달의 중요한 표적이 되었다. 철이 함유된 트랜스페린에 결합한 후, CD71은 빠르게 세포내 이입되고(endocytosed) 세포 표면으로 다시 효율적으로 재활용된다. CD71 항체 약물 접합체에 대한 연구는 CD71을 표적으로 하는 것이 약물 전달의 특이성 및 선택성을 개선하고 치료 지수를 넓힐 수 있음을 시사한다. 또한, 항-CD71 단일클론 항체를 사용한 연구는 결합 친화성이 평활근 또는 골격근 전달 및 혈액 뇌 장벽 통과세포외배출(transcytosis)을 포함한 조직 특이적 전달을 가능하게 하는 데 중요한 역할을 할 수 있음을 나타낸다. CD71에 대한 고친화성을 갖는 항체는 빠르게 내재화되고, 정상적인 수용체 수송을 변경하여 재활용 대신 수용체가 분해를 위해 라이소솜을 표적으로 하게 된다. 대조적으로, CD71에 대한 친화성이 낮은 항체는 수용체 재활용 및 더 높은 뇌 노출을 허용한다.
표적 분자에 대한 고친화성 및 특이성이 요구되는 경우 항체 또는 항체 단편이 가장 널리 사용되는 치료적 단백질의 클래스인 반면, 비항체 단백질도 이러한 표적에 결합하도록 조작될 수 있다. 이러한 "대안적인 스캐폴드" 단백질은 작은 크기, 이황화 결합의 결여, 높은 안정성, 원핵생물 숙주에서 발현되는 능력, 쉬운 정제로 인해 전통적인 항체에 비해 장점이 있으며, 이들은 약물/독소에 쉽게 접합되고, 조직에 효율적으로 침투하며, 다중특이성 결합제로 쉽게 형식화된다.
이러한 대안적인 스캐폴드 중 하나는 면역글로불린(Ig) 접힘이다. 이러한 접힘은 항체의 가변 영역뿐만 아니라 수천 개의 비항체 단백질에서도 발견된다. 인간 파이브로넥틴의 10번째 파이브로넥틴 유형 III(FN3) 반복인 이러한 Ig 단백질 중 하나는 전체 Ig-접힘 구조를 유지하면서 표면 노출된 루프에 있는 다수의 돌연변이를 견딜 수 있는 것으로 나타났다. 따라서, 필요한 것은 CD71에 특이적으로 결합할 수 있는 FN3 도메인 및 CD71의 수용체 매개성 내재화를 통해 세포내 접근을 가능하게 하는 신규한 치료법을 위해 이러한 분자를 사용하는 방법이다.
일부 실시형태에서, CD71 단백질에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인(예를 들어, 폴리펩타이드)이 제공된다. 일부 실시형태에서, FN3 도메인은 단리된다. 일부 실시형태에서, FN3 도메인은 재조합이다. 일부 실시형태에서, FN3 도메인은 비자연 발생적이다.
일부 실시형태에서, 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299, 또는 304 내지 306, 292 내지 299, 또는 304 내지 306 또는 304 내지 306의 아미노산 서열을 포함하는 FN3 도메인이 제공된다. 일부 실시형태에서, FN3 도메인은 CD71에 결합한다. 일부 실시형태에서, FN3 도메인은 CD71에 대한 트랜스페린 결합과 경쟁하지 않는 CD71의 부위에서 인간 CD71에 결합한다. 일부 실시형태에서, FN3 도메인은 CD71에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 가요성 링커와 같은 링커에 의해 연결된 하나 초과의 FN3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 도메인 사이의 하나 이상의 링커에 의해 서로 연결된 2개, 3개 또는 4개의 FN3 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 FN3 도메인을 암호화하는 단리된 폴리펩타이드가 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
일부 실시형태에서, FN3 도메인을 생산하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 FN3 도메인을 암호화하거나 또는 발현하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 FN3 도메인을 정제하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, FN3 도메인은 CD71에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 FN3 도메인 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 FN3 도메인에 결합하는 항-이디오타입 항체가 제공된다.
일부 실시형태에서, FN3 도메인 중 하나 이상을 포함하는 키트가 제공된다.
일부 실시형태에서, 종양 조직에서 CD71-발현 암세포를 검출하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 대상체로부터 종양 조직의 샘플을 얻는 단계, 및 종양 조직의 샘플을 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306 또는 304 내지 306 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CD71 단백질에 결합하는 FN3 도메인과 접촉시킴으로써 종양 조직에서 CD71 단백질이 발현되는지 여부를 검출하는 단계 및 CD71 단백질과 FN3 도메인 사이의 결합을 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, CD71 발현 세포를 단리하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 대상체로부터 샘플을 얻는 단계; 샘플을 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306 또는 304 내지 306 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CD71 단백질에 결합하는 FN3 도메인과 접촉시키는 단계 및 FN3 도메인에 결합된 세포를 단리하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 종양 조직에서 CD71-발현 암세포를 검출하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306 또는 304 내지 306 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CD71 단백질에 결합하는 FN3 도메인을 검출 가능한 표지에 접합시켜 접합체를 형성하는 단계; 접합체를 대상체에게 투여하는 단계; 및 접합체가 결합된 CD71 발현 암세포를 시각화하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 CD71에 결합하는 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 해당 폴리펩타이드는 CD71에 결합하는 FN3 도메인이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306과 같은 서열, 또는 치료제에 연결되거나 또는 접합된 본 명세서에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 폴리펩타이드는 중추 신경계에 대해 지시된다. 일부 실시형태에서, 신경학적 병태 및/또는 뇌종양의 치료를 필요로 하는 대상체에서 신경학적 병태 및/또는 뇌종양을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 CD71에 결합하는 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 해당 폴리펩타이드는 CD71에 결합하는 FN3 도메인이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306과 같은 서열, 또는 치료제에 연결되거나 또는 접합된 본 명세서에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 뇌종양은 비악성, 양성 및 악성 뇌종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 신경학적 병태는 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병, 라포라병, 폼페병, 성인 폴리글루코산 소체병, 뇌졸중, 척수 손상, 운동 실조, 벨 마비, 뇌동맥류, 간질, 발작, 길랑-바레 증후군, 다발성 경화증, 근이영양증, 신경피부 증후군, 편두통, 뇌염, 패혈증 및 중증 근무력증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 폴리펩타이드는 근육 세포에 대해 지시된다. 일부 실시형태에서, 방법은 CD71에 결합하는 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 해당 폴리펩타이드는 CD71에 결합하는 FN3 도메인이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306과 같은 서열, 또는 치료제에 연결되거나 또는 접합된 본 명세서에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 폼페병(GSD2, 산 알파-글리코시데이스(GAA) 결핍)의 치료를 필요로 하는 대상체에서 폼페병을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 CD71에 결합하는 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 해당 폴리펩타이드는 CD71에 결합하는 FN3 도메인이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306과 같은 서열, 또는 치료제에 연결되거나 또는 접합된 본 명세서에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 글리코겐 축적 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 글리코겐 축적 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 글리코겐 축적 질환은 코리병 또는 포르브스병(GSD3, 글리코겐 탈분지 효소(AGL) 결핍), 맥아들병(GSD5, 근육 글리코겐 포스포릴레이스(PYGM) 결핍), II형 당뇨병/당뇨병성 신장증, 알돌레이스 A 결핍 GSD12, 라포라병, 저산소증, 안데르센병(GSD4, 글리코겐 탈분지 효소(GBE1) 결핍), 타루이병(GSD7, 근육 포스포프럭토카이네이스(PFKM) 결핍) 및 성인 폴리글루코산 소체병으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 글리코겐 축적 질환은 글리코겐 합성효소(GYS2) 결핍(GSD0), 글루코스-6-포스파테이스(G6PC/SLC37A4) 결핍(GSD1, 폰기르케병), 허스병(GSD6, 간 글리코겐 포스포릴레이스(PYGL) 또는 근육 포스포글리세레이트 뮤테이스(PGAM2) 결핍), 포스포릴레이스 카이네이스(PHKA2/PHKB/PHKG2/PHKA1) 결핍(GSD9), 포스포글리세레이트 뮤테이스(PGAM2) 결핍(GSD10), 근육 락테이트 데하이드로게네이스(LDHA) 결핍(GSD11), 판코니-비켈 증후군(GSD 11, 글루코스 수송체(GLUT2) 결핍, 알돌레이스 A 결핍(GSD 12), β-에놀레이스(ENO3) 결핍(GSD13) 및 글리코게닌-1(GYG1) 결핍(GSD15)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 폴리펩타이드는 면역 세포에 대해 지시된다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 폴리펩타이드는 수지상 세포, T-세포, NK 세포 또는 B-세포에 대해 지시된다. 일부 실시형태에서, 자가면역 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 CD71에 결합하는 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 해당 폴리펩타이드는 CD71에 결합하는 FN3 도메인이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306과 같은 서열, 또는 치료제에 연결되거나 또는 접합된 본 명세서에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 자가면역 질환은 류마티스성 관절염, 하시모토 자가면역성 갑상선염, 셀리악병, 제1형 당뇨병, 백반증, 류마티스성 열, 악성 빈혈/위축성 위염, 원형 탈모증 및 면역성 혈소판감소성 자반증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 관심 작용제를 CD71 양성 세포에 전달하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 세포를 본 명세서에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드와 같은 CD71에 결합하는 FN3 도메인에 커플링된 관심 작용제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 관심 작용제는 화학치료제, 약물, 성장 저해제, 독소, 방사성 동위원소, 항-튜불린제, 폴리뉴클레오타이드, siRNA 분자, 안티센스 분자, RNA 분자, DNA 분자, DNA 마이너 그루브 결합제, DNA 복제 저해제, 알킬화제, 항생제, 항엽산제, 항대사제, 화학요법 증감제, 토포아이소머레이스 저해제 또는 빈카 알칼로이드이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 FN3 도메인은 폴리뉴클레오타이드, siRNA 분자, 안티센스 분자, RNA 분자 또는 DNA 분자에 접합된다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 CD71에 대한 트랜스페린 결합과 경쟁하거나 또는 이를 저해하지 않는 부위에서 CD71에 결합하는 FN3 단백질이다.
일부 실시형태에서, CD71에 대한 트랜스페린 결합과 경쟁하거나 또는 이를 저해하지 않는 부위에서 CD71에 결합하는 FN3 단백질을 확인하는 방법이 제공된다.
도 1은 FN3 폴리펩타이드(ABX1007) 또는 FN3 폴리펩타이드-siRNA 접합체(ABX1005)의 투여 후 CD-1 마우스의 다양한 조직에서 AHA1 mRNA의 정량화를 예시한다.
도 2는 FN3-siRNA 접합체(ABX1005)의 투여 후 C57BL6 마우스의 다양한 조직에서 AHA1 mRNA의 용량 의존적 정량화를 예시한다.
도 3은 프로테옴 어레이에서 6,000개 이상의 수용체를 사용한 표적 결합 검정의 결과를 제공하되, 데이터는 CD71이 FN3 도메인의 독점적인 결합 표적임을 보여준다.
도 4는 CD71 센티린 접합체가 투여 후 2주, 4주 및 8주에 mAb 접합체와 비교하여 지속적인 유전자 넉다운을 유도한다는 것을 보여주는 데이터를 제공한다.
도 5는 센티린 및 센티린 접합체가 인간 및 사이노몰구스 원숭이 CD71에 능동적으로 결합한다는 것을 보여주는 ELISA 데이터를 제공한다.
도 6은 사이노몰구스 원숭이 근육 및 심장에서 생체내 mRNA 수준을 효과적으로 넉다운시키는 센티린-siRNA AHA1 접합체의 능력을 보여주는 데이터를 제공한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, "단수 형태"는 내용이 달리 명확히 명시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 2개 이상의 세포의 조합 등을 포함한다.
"파이브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인"(FN3 도메인)은 파이브로넥틴, 테나신, 세포내 세포골격 단백질, 사이토카인 수용체 및 원핵생물 효소를 비롯한 단백질에서 자주 발생하는 도메인을 지칭한다(Bork and Doolittle, Proc Nat Acad Sci USA 89:8990-8994, 1992; Meinke et al., J Bacteriol 175:1910-1918, 1993; Watanabe et al., J Biol Chem 265:15659-15665, 1990). 예시적인 FN3 도메인은 인간 테나신 C에 존재하는 15개의 상이한 FN3 도메인, 인간 파이브로넥틴(FN)에 존재하는 15개의 상이한 FN3 도메인 및, 예를 들어, 미국 특허 제8,278,419호에 기술되어 있는 바와 같은 비천연 합성 FN3 도메인이다. 개별 FN3 도메인은 도메인 번호와 단백질 이름, 예를 들어, 테나신의 3번째 FN3 도메인(TN3) 또는 파이브로넥틴의 10번째 FN3 도메인(FN10)으로 지칭된다.
용어 "포획제"는 특정 유형의 세포에 결합하여 해당 세포를 다른 세포로부터 단리할 수 있게 하는 물질을 지칭한다. 예시적인 포획제는 자성 비드, 자성유체, 캡슐화 시약, 특정 세포 유형에 결합하는 분자 등이다.
"샘플"은 대상체로부터 단리된 유사한 체액, 세포 또는 조직뿐만 아니라 대상체 내에 존재하는 체액, 세포 또는 조직의 모음을 지칭한다. 예시적인 샘플은 조직 생검, 미세 바늘 흡인, 외과적으로 절제된 조직, 기관 배양물, 세포 배양물 및 생물학적 유체, 예컨대, 혈액, 혈청 및 장액, 혈장, 림프, 소변, 타액, 낭액, 눈물 방울, 대변, 가래, 분비 조직 및 기관의 점액성 분비물, 질 분비물, 복수액, 흉수액, 심막, 복막, 복부 및 다른 체강, 기관지 세척에 의해 수집된 체액, 관절 낭액, 대상체 또는 생물학적 공급원, 예를 들어, 세포 또는 기관 조정 배지 및 세척액 등을 포함하는 세포 및 기관 배양 배지와 접촉된 액체 용액이다.
"치환하는" 또는 "치환된" 또는 "돌연변이시키는" 또는 "돌연변이된"은 서열의 변이체를 생성하기 위해 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열에서 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오타이드를 변경하거나, 결실시키거나 삽입하는 것을 지칭한다.
"변이체"는 하나 이상의 변형, 예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실에 의해 참조 폴리펩타이드 또는 참조 폴리뉴클레오타이드와 다른 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다.
"특이적으로 결합하다" 또는 "특이적 결합"은 약 1×10-6M 이하, 예를 들어, 약 1×10-7M 이하, 약 1×10-8M 이하, 약 1×10-9M 이하, 약 1×10-10M 이하, 약 1×10-11M 이하, 약 1×10-12M 이하 또는 약 1×10-13M 이하의 해리 상수(dissociation constant: KD)로 CD71과 같은 표적에 결합하는 FN3 도메인의 능력을 지칭한다. 대안적으로, "특이적 결합"은 표준 용액 ELISA 검정에서 음성 대조군보다 적어도 5-배 이상으로 더 높은 표적(예를 들어, CD71)에 결합하는 FN3 도메인의 능력을 지칭한다. 특이적 결합은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 프로테옴 어레이를 사용하여 입증될 수 있으며, 도 3에 도시되어 있다. 일부 실시형태에서, 음성 대조군은 CD71에 결합하지 않는 FN3 도메인이다. 일부 실시형태에서, CD71에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 다른 관련 항원, 예를 들어, 마카카 파시쿨라리스(마카카 파스시쿨라리스)(사이노몰구스 원숭이, 사이노) 또는 판 트로글로디테스(Pan troglodytes)(침팬지)와 같은 다른 종(상동체)으로부터의 동일한 미리 결정된 항원에 대해 교차-반응성을 가질 수 있다.
"라이브러리"는 변이체의 모음을 지칭한다. 라이브러리는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 변이체로 구성될 수 있다.
"안정성"은 정상적인 기능적 활성 중 적어도 하나, 예를 들어, CD71과 같은 미리 결정된 항원에 대한 결합을 유지하도록 생리학적 조건하에서 접힌 상태를 유지하는 분자의 능력을 지칭한다.
"CD71"은 서열번호 274 또는 275의 아미노산 서열을 갖는 인간 CD71 단백질을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 서열번호 274는 전장 인간 CD71 단백질이다. 일부 실시형태에서, 서열번호 275는 인간 CD71의 세포외 도메인이다.
서열번호 274 = 인간 성숙 CD71
서열번호 275 = 인간 성숙 CD71 세포외 도메인
"텐콘(tencon)"은 서열번호 276에 표시된 서열을 갖는 합성 파이브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인을 지칭하며, 미국 공개 제2010/0216708호에 기술되어 있다.
서열번호 276 = 원래의 텐콘 서열
"암세포" 또는 "종양 세포"는 새로운 유전 물질의 흡수를 반드시 수반하는 것은 아닌 자발적이거나 또는 유도된 표현형 변화를 갖는 생체내, 생체외 및 조직 배양에서의 암성, 전암성 또는 형질전환된 세포를 지칭한다. 형질전환 바이러스에 의한 감염 및 새로운 게놈 핵산의 통합 또는 외인성 핵산의 흡수로 인해 형질전환이 발생할 수 있지만, 자발적으로 또는 발암 물질에 노출된 후에 발생하여 내인성 유전자에 돌연변이가 생길 수도 있다. 형질전환/암은, 예를 들어, 시험관내, 생체내 및 생체외에서의 형태학적 변화, 세포의 불멸화, 이상 성장 제어, 병소 형성, 증식, 악성 종양, 종양 특이적 마커 수준, 침입성, 누드 마우스와 같은 적합한 동물 숙주에서의 종양 성장 또는 억제 등으로 예시된다(Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)).
"수지상 세포"는 적응 면역계에서 중요한 역할을 형성하는 일종의 항원-제시 세포(antigen-presenting cell: APC)를 지칭한다. 수지상 세포의 주요 기능은 항원을 제시하는 것이다. 수지상 세포는 비활성 또는 휴면 상태의 미경험 T 림프구에서 1차 면역 반응을 유도하는 능력을 갖고 있다.
"면역 세포"는 림프구(T-세포, B-세포 및 NK 세포), 호중구 또는 단핵구/대식세포로 분류되는 면역계의 세포를 지칭한다. 이들은 모든 유형의 백혈구이다.
"벡터"는 생물학적 시스템 내에서 복제될 수 있거나 또는 이러한 시스템 사이에서 이동할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 벡터 폴리뉴클레오타이드는 전형적으로 생물학적 시스템에서 이러한 폴리뉴클레오타이드의 복제 또는 유지를 용이하게 하는 기능을 하는 복제 기점, 폴리아데닐화 신호 또는 선별 마커와 같은 요소를 포함한다. 이러한 생물학적 시스템의 예는 세포, 바이러스, 동물, 식물 및 벡터를 복제할 수 있는 생물학적 구성요소를 활용하는 재구성된 생물학적 시스템을 포함할 수 있다. 벡터를 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA 분자 또는 이들의 하이브리드일 수 있다.
"발현 벡터"는 발현 벡터에 존재하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 번역을 지시하기 위해 생물학적 시스템 또는 재구성된 생물학적 시스템에서 활용될 수 있는 벡터를 지칭한다.
"폴리뉴클레오타이드"는 당-포스페이트 백본 또는 다른 동등한 공유 화학에 의해 공유적으로 연결된 뉴클레오타이드의 사슬을 포함하는 합성 분자를 지칭한다. cDNA는 폴리뉴클레오타이드의 전형적인 예이다.
"폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 폴리펩타이드를 형성하기 위해 펩타이드 결합에 의해 연결된 적어도 2개의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 지칭한다. 약 50개 미만의 아미노산으로 구성된 작은 폴리펩타이드는 "펩타이드"로 지칭될 수 있다.
"원자가"는 분자 내 항원에 특이적인 결합 부위가 지정된 수만큼 존재함을 지칭한다. 이와 같이, 용어 "1가", "2가", "4가" 및 "6가"는 분자 내 항원에 특이적인 결합 부위가 각각 1개, 2개, 4개 및 6개 존재함을 지칭한다.
"대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물, 및 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등과 같은 비포유동물을 포함한다. 언급된 경우를 제외하고, 용어 "환자" 또는 "대상체"는 상호교환적으로 사용된다.
"단리된"은 재조합 세포와 같이 분자가 생산되는 시스템의 다른 성분으로부터 실질적으로 분리된 및/또는 정제된 분자(예컨대, 합성 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 예컨대, FN3 도메인)뿐만 아니라 적어도 하나의 정제 또는 단리 단계를 거친 단백질의 균질한 집단을 지칭한다. "단리된 FN3 도메인"은 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없으며 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 순도와 같은 더 높은 순도로 단리된 FN3 도메인을 포함하는 FN3 도메인을 지칭한다.
물질의 조성
일부 실시형태에서, 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 단백질이 제공된다.
일부 실시형태에서, 단백질은 서열번호 273의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 서열번호 273은 서열번호 288, 서열번호 289, 서열번호 290 및 서열번호 291의 서열에 기초한 컨센서스 서열이다.
서열번호 273의 서열은:
이되, X8, X9, X17 및 X18은 각각 독립적으로 메티오닌 또는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이고, 그리고
X1은 D, F, Y 또는 H로부터 선택되고,
X2는 Y, G, A 또는 V로부터 선택되고,
X3은 I, T, L, A 또는 H로부터 선택되고,
X4는 S, Y 또는 P로부터 선택되고,
X5는 Y, G, Q 또는 R로부터 선택되고,
X6은 G 또는 P로부터 선택되고,
X7은 A, Y, P, D 또는 S로부터 선택되고,
X10은 W, N, S 또는 E로부터 선택되고,
X11은 L, Y 또는 G로부터 선택되고,
X12는 D, Q, H 또는 V로부터 선택되고,
X13은 G 또는 S로부터 선택되고,
X14는 R, G, F, L 또는 D로부터 선택되고,
X15는 W, S, P 또는 L로부터 선택되고, 그리고
X16은 T, V,M 또는 S로부터 선택된다.
일부 실시형태에서:
X1은 D, F, Y 또는 H로부터 선택되고,
X2는 G, A 또는 V로부터 선택되고,
X3은 T, L, A 또는 H로부터 선택되고,
X4는 Y 또는 P로부터 선택되고,
X5는 G, Q 또는 R로부터 선택되고,
X6은 G 또는 P로부터 선택되고,
X7은 Y, P, D 또는 S로부터 선택되고,
X10은 W, N, S 또는 E로부터 선택되고,
X11은 L, Y 또는 G로부터 선택되고,
X12는 Q, H 또는 V로부터 선택되고,
X13은 G 또는 S로부터 선택되고,
X14는 G, F, L 또는 D로부터 선택되고,
X15는 S, P 또는 L로부터 선택되고, 그리고
X16은 V,M 또는 S로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X10, X11, X12, X13, X14, X15 및 X16은 서열번호 288의 서열에 나타낸 바와 같다. 일부 실시형태에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X10, X11, X12, X13, X14, X15 및 X16은 서열번호 289의 서열에 나타낸 바와 같다. 일부 실시형태에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X10, X11, X12, X13, X14, X15 및 X16은 서열번호 290의 서열에 나타낸 바와 같다. 일부 실시형태에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X10, X11, X12, X13, X14, X15 및 X16은 서열번호 291의 서열에 나타낸 바와 같다.
일부 실시형태에서, X8, X9, X17 및 X18는 독립적으로 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 라이신, 페닐알라닌, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 또는 발린이다. 일부 실시형태에서, X8, X9, X17 및 X18는 독립적으로 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 라이신, 페닐알라닌, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 또는 발린이 아니다. 일부 실시형태에서, X8, X9, X17 및 X18는 독립적으로 알라닌이다. 일부 실시형태에서, X8, X9, X17 및 X18은 독립적으로 아르기닌이다. 일부 실시형태에서, X8, X9, X17 및 X18은 독립적으로 아스파라긴이다. 일부 실시형태에서, X8, X9, X17 및 X18은 독립적으로 아스파르트산이다. 일부 실시형태에서, X8, X9, X17 및 X18은 독립적으로 시스테인이다. 일부 실시형태에서, X8, X9, X17 및 X18은 독립적으로 글루타민이다. 일부 실시형태에서, X8, X9, X17 및 X18은 독립적으로 글루탐산이다. 일부 실시형태에서, X8, X9, X17 및 X18은 독립적으로 글리신이다. 일부 실시형태에서, X8, X9, X17 및 X18은 독립적으로 히스티딘이다. 일부 실시형태에서, X8, X9, X17 및 X18은 독립적으로 아이소류신이다. 일부 실시형태에서, X8, X9, X17 및 X18은 독립적으로 류신이다. 일부 실시형태에서, X8, X9, X17 및 X18은 독립적으로 라이신이다. 일부 실시형태에서, X8, X9, X17 및 X18은 독립적으로 페닐알라닌이다. 일부 실시형태에서, X8, X9, X17 및 X18은 독립적으로 세린이다. 일부 실시형태에서, X8, X9, X17 및 X18은 독립적으로 트레오닌이다. 일부 실시형태에서, X8, X9, X17 및 X18은 독립적으로 트립토판이다. 일부 실시형태에서, X8, X9, X17 및 X18은 독립적으로 타이로신이다. 일부 실시형태에서, X8, X9, X17 및 X18은 독립적으로 발린이다.
일부 실시형태에서, 서열은 X8, X9, X17 및 X18의 위치에 상응하는 위치가 위에 제시된 바와 같은 임의의 다른 아미노산 잔기일 수 있다는 점을 제외하고, 일부 실시형태에서, X8은 V가 아니고, X9는 T가 아니고, X17은 S가 아니고, X18은 I가 아니라는 점을 제외하고는 서열번호 288의 서열에 나타낸 바와 같이 제시된다.
일부 실시형태에서, 서열은 X8, X9, X17 및 X18의 위치에 상응하는 위치가 위에 제시된 바와 같은 임의의 다른 아미노산 잔기일 수 있다는 점을 제외하고, 일부 실시형태에서, X8은 V가 아니고, X9는 T가 아니고, X17은 S가 아니고, X18은 I가 아니라는 점을 제외하고는 서열번호 289의 서열에 나타낸 바와 같이 제시된다.
일부 실시형태에서, 서열은 X8, X9, X17 및 X18의 위치에 상응하는 위치가 위에 제시된 바와 같은 임의의 다른 아미노산 잔기일 수 있다는 점을 제외하고, 일부 실시형태에서, X8은 V가 아니고, X9는 T가 아니고, X17은 S가 아니고, X18은 I가 아니라는 점을 제외하고는 서열번호 290의 서열에 나타낸 바와 같이 제시된다.
일부 실시형태에서, 서열은 X8, X9, X17 및 X18의 위치에 상응하는 위치가 위에 제시된 바와 같은 임의의 다른 아미노산 잔기일 수 있다는 점을 제외하고, 일부 실시형태에서, X8은 V가 아니고, X9는 T가 아니고, X17은 S가 아니고, X18은 I가 아니라는 점을 제외하고는 서열번호 291의 서열에 나타낸 바와 같이 제시된다.
일부 실시형태에서, 단백질은 서열번호 273의 서열과 적어도 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질은 서열번호 273의 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. 일부 실시형태에서, 단백질은 서열번호 273의 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. 일부 실시형태에서, 단백질은 서열번호 273의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. 일부 실시형태에서, 단백질 또는 폴리펩타이드는 서열번호 273과 적어도 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 동일하다.
동일성 퍼센트는 NCBI 웹사이트를 통해 이용 가능한 B마지막P를 사용하여 두 서열을 정렬하기 위해 기본 매개변수를 사용하여 결정될 수 있다.
본 명세서에 제공된 폴리펩타이드는 더 큰 폴리펩타이드의 일부일 수 있으며, 도메인으로서 지칭될 수 있다. 상이한 폴리펩타이드의 두 도메인 사이의 상동성 또는 동일성은 전체 폴리펩타이드와는 대조적으로 유사한 도메인을 기반으로 한다. 예를 들어, 폴리펩타이드가 서열번호 1을 포함하는 FN3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하고 상기 도메인이 scFV 항체에 접합된 경우, 서열번호 1과 유사하지만 동일하지 않은 도메인을 갖는 또 다른 단백질은 scFV가 상동성을 공유하지 않더라도 적어도 90% 동일할 수 있다. 따라서, 동일성 %는 도메인 또는 폴리펩타이드의 전체 길이에 기초할 수 있다. 동일성 %를 결정하는 방법은 본 명세서에 제공되거나 또는 당업자에게 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, 인간 CD71 단백질(서열번호 274 또는 275)에 결합하거나 또는 특이적으로 결합하는 파이브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인이 제공된다. 본 명세서에 제공된 바와 같이, FN3 도메인은 CD71 단백질에 결합할 수 있다. 또한, 명시적으로 언급되지 않더라도, 도메인은 CD71 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 예를 들어, CD71에 결합하는 FN3 도메인은 CD71에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인 단백질도 포함할 것이다. 이러한 분자는, 예를 들어, 치료 및 진단 응용 분야와 이미징에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 FN3 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적인 핵산, 벡터, 숙주 세포 및 이들을 제조하고 사용하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, CD71에 결합하거나 또는 특이적으로 결합하는 단리된 FN3 도메인이 제공된다.
일부 실시형태에서, FN3 도메인은 링커에 의해 연결된 2개의 FN3 도메인을 포함한다. 링커는 가요성 링커일 수 있다. 링커는 본 명세서에 기재된 것과 같은 짧은 펩타이드 서열일 수 있다. 예를 들어, 링커는 G/S 링커 등일 수 있다.
일부 실시형태에서, FN3 도메인은 본 명세서에 제공된 것과 같은 링커에 의해 연결된 2개의 FN3 도메인을 포함한다. 예시적인 링커는 (GS)2(서열번호 278), (GGGS)2(서열번호 279), (GGGGS)1-5(서열번호 280), (AP)1-20(서열번호 311); (AP)2(서열번호 281), (AP)5(서열번호 282), (AP)10(서열번호 283), (AP)20(서열번호 284), A(EAAAK)5AAA(서열번호 285) 또는 (EAAAK)1-5(서열번호 307)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 링커는 EAAAKEAAAKEAAAKEAAAK(서열번호 300); GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 301); APAPAPAPAP(서열번호 302); 또는 EAAAK(서열번호 303)를 포함하거나 또는 이의 아미노산 서열이다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 292의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 293의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 294의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 295의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 296의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 297의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 298의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 299의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, FN3 도메인은 당업자에 의해 실시되는 표면 플라스몬 공명 또는 Kinexa 방법에 의해 결정되는 경우, 약 1×10-7M 미만, 예를 들어, 약 1×10-8M 미만, 약 1×10-9M 미만, 약 1×10-10M 미만, 약 1×10-11M 미만, 약 1×10-12M 미만 또는 약 1×10-13M 미만의 해리 상수(KD)로 CD71에 결합할 수 있다. 특정 FN3 도메인-항원 상호작용의 측정된 친화성은 다양한 조건(예를 들어, 삼투압 농도, pH)하에 측정되는 경우 달라질 수 있다. 따라서, 친화성 및 기타 항원-결합 매개변수(예를 들어, KD, Kon, Koff)의 측정은 단백질 스캐폴드 및 항원의 표준화된 용액, 및 본 명세서에 기재된 완충액과 같은 표준화된 완충액으로 이루어진다.
일부 실시형태에서, FN3 도메인은 표준 용액 ELISA 검정에서 음성 대조군에 대해 얻은 신호보다 적어도 5-배 이상으로 CD71에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, CD71에 결합하거나 또는 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 분자의 N-말단에 연결된 개시자 메티오닌(Met)을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하거나 또는 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 FN3 도메인의 C-말단에 연결된 시스테인(Cys)을 포함한다. N-말단 Met 및/또는 C-말단 Cys의 첨가는 반감기 연장 분자의 발현 및/또는 접합을 촉진할 수 있다.
FN3 도메인은 또한 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 미국 특허 제10,196,446호에 기술되어 있는 것들과 같은 시스테인 치환을 포함할 수 있다. 간략하게는, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 폴리펩타이드는 미국 특허 제10,196,446호의 서열번호 6 또는 서열번호 1에 기초한 FN3 도메인의 6번, 8번, 10번, 11번, 14번, 15번, 16번, 20번, 30번, 34번, 38번, 40번, 41번, 45번, 47번, 48번, 53번, 54번, 59번, 60번, 62번, 64번, 70번, 88번, 89번, 90번, 91번 및 93번 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된 위치 및 관련 FN3 도메인의 동등한 위치에 적어도 하나의 시스테인 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 6번 잔기에 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 8번 잔기에 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 10번 잔기에 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 11번 잔기에 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 14번 잔기에 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 15번 잔기에 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 16번 잔기에 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 20번 잔기에 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 30번 잔기에 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 34번 잔기에 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 38번 잔기에 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 40번 잔기에 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 41번 잔기에 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 45번 잔기에 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 47번 잔기에 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 48번 잔기에 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 53번 잔기에 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 54번 잔기에 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 59번 잔기에 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 60번 잔기에 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 62번 잔기에 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 64번 잔기에 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 70번 잔기에 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 88번 잔기에 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 89번 잔기에 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 90번 잔기에 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 91번 잔기에 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 93번 잔기에 있다.
도메인 또는 단백질 내의 위치에 있는 시스테인 치환은 기존의 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 대체하는 것을 포함한다. 시스테인 변형의 다른 예는, 예를 들어, 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 미국 공개 제20170362301호에서 찾을 수 있다. 서열의 정렬은, 예를 들어, NCBI 웹사이트에서 기본 매개변수를 사용하여 B마지막P를 사용하여 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 FN3 도메인은 세포 내로 내재화된다. 일부 실시형태에서, FN3 도메인의 내재화는 검출 가능한 표지 또는 치료제의 세포 내로의 전달을 촉진할 수 있다. 일부 실시형태에서, FN3 도메인의 내재화는 세포독성제의 세포 내로의 전달을 촉진할 수 있다. 세포독성제는 치료제로서 작용할 수 있다. 일부 실시형태에서, FN3 도메인의 내재화는 본 명세서에 개시된 임의의 검출 가능한 표지, 치료제 및/또는 세포독성제의 세포 내로의 전달을 촉진할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 종양 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 간 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 근육 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 면역 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 수지상 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 T-세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 B-세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 중추 신경계의 세포이다.
일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 FN3 도메인은 서열번호 276의 텐콘 서열 또는 서열번호 277의 텐콘 27 서열을 기반으로 하며, 선택적으로 11번, 14번, 17번, 37번, 46번, 73번 또는 86번 잔기 위치(서열번호 277에 상응하는 잔기 넘버링)에 치환을 갖는다.
서열번호 276 = 원래의 텐콘 서열
서열번호 277 = 안정화된 텐콘(텐콘27)
일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 95의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 98의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 99의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 103의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 106의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 111의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 127의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 128의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 131의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 132의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 133의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 134의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 135의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 137의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 140의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 141의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 142의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 143의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 145의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 146의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 147의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 148의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 149의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 150의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 151의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 152의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 153의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 154의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 155의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 156의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 157의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 158의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 159의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 160의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 161의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 162의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 163의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 164의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 165의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 166의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 167의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 168의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 169의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 170의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 172의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 175의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 176의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 177의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 178의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 179의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 180의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 181의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 182의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 183의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 184의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 186의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 187의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 188의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 189의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 190의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 191의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 192의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 193의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 194의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 195의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 196의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 197의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 198의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 199의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 200의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 201의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 203의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 204의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 205의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 206의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 207의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 208의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 209의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 210의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 211의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 212의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 213의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 214의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 215의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 216의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 217의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 218의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 219의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 221의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 222의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 223의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 224의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 225의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 226의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 227의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 228의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 229의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 230의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 231의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 232의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 233의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 234의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 235의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 236의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 237의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 238의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 239의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 240의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 241의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 242의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 243의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 244의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 245의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 246의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 247의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 248의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 249의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 250의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 251의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 252의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 253의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 254의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 255의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 256의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 257의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 258의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 259의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 260의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 261의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 262의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 263의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 264의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 265의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 266의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 267의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 268의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 269의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 270의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 271의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 272의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 304의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 305의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열번호 306의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, FN3 도메인은 CD71에 대한 트랜스페린 결합과 경쟁하지 않는 CD71의 부위에서 인간 CD71에 결합한다. 일부 실시형태에서, FN3 도메인은 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인은 분자의 N-말단에 연결된 개시자 메티오닌(Met)을 포함한다.
본 개시내용의 CD71에 결합하는 FN3 도메인의 접합체
일부 실시형태에서, 이종 분자(들)에 접합된 CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인이 제공된다.
일부 실시형태에서, FN3 도메인은 올리고뉴클레오타이드에 접합된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 유전자 또는 mRNA 전사체의 발현을 저해하는 데 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 siRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 등일 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, FN3 도메인은 siRNA 분자, 안티센스 분자, RNA 분자 또는 DNA 분자와 같지만 이에 제한되지 않는 폴리뉴클레오타이드에 접합될 수 있다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 FN3 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 링커를 사용하여 siRNA 분자에 접합된다. 일부 실시형태에서, 링커는 화학적 링커이다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자에 연결된 FN3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드와 같은 폴리펩타이드를 포함하는 조성물이 제공된다. 핵산 분자는, 예를 들어, siRNA 분자일 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, siRNA는 표적 유전자의 발현을 저해할 수 있는 이중-가닥 RNAi(dsRNA) 작용제이다. dsRNA 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시형태에서, dsRNA 작용제의 각 가닥은 12개 내지 40개의 뉴클레오타이드 길이 범위일 수 있다. 예를 들어, 각 가닥은 14개 내지 40개의 뉴클레오타이드 길이, 17개 내지 37개의 뉴클레오타이드 길이, 25개 내지 37개의 뉴클레오타이드 길이, 27개 내지 30개의 뉴클레오타이드 길이, 17개 내지 23개의 뉴클레오타이드 길이, 17개 내지 21개의 뉴클레오타이드 길이, 17개 내지 19개의 뉴클레오타이드 길이, 19개 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이, 19개 내지 23개의 뉴클레오타이드 길이, 19개 내지 21개의 뉴클레오타이드 길이, 21개 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이 또는 21개 내지 23개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
일부 실시형태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 전형적으로 이중체 dsRNA를 형성한다. dsRNA 작용제의 이중체 영역은 12개 내지 40개의 뉴클레오타이드 쌍 길이일 수 있다. 예를 들어, 이중체 영역은 14개 내지 40개의 뉴클레오타이드 쌍 길이, 17개 내지 30개의 뉴클레오타이드 쌍 길이, 25개 내지 35개의 뉴클레오타이드 길이, 27개 내지 35개의 뉴클레오타이드 쌍 길이, 17개 내지 23개의 뉴클레오타이드 쌍 길이, 17개 내지 21개의 뉴클레오타이드 쌍 길이, 17개 내지 19개의 뉴클레오타이드 쌍 길이, 19개 내지 25개의 뉴클레오타이드 쌍 길이, 19개 내지 23개의 뉴클레오타이드 쌍 길이, 19개 내지 21개의 뉴클레오타이드 쌍 길이, 21개 내지 25개의 뉴클레오타이드 쌍 길이 또는 21개 내지 23개의 뉴클레오타이드 쌍 길이일 수 있다. 또 다른 예에서, 이중체 영역은 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개 및 27개의 뉴클레오타이드 쌍 길이로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, dsRNA는 가닥의 3'-말단 또는 5'-말단 또는 양쪽 말단에 dsRNA 작용제의 하나 이상의 오버행 영역 및/또는 캡핑 그룹을 포함한다. 오버행은 1개 내지 10개의 뉴클레오타이드 길이, 1개 내지 6개의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 2개 내지 6개의 뉴클레오타이드 길이, 1개 내지 5개의 뉴클레오타이드 길이, 2개 내지 5개의 뉴클레오타이드 길이, 1개 내지 4개의 뉴클레오타이드 길이, 2개 내지 4개의 뉴클레오타이드 길이, 1개 내지 3개의 뉴클레오타이드 길이, 2개 내지 3개의 뉴클레오타이드 길이 또는 1개 내지 2개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 오버행은 한 가닥이 다른 가닥보다 더 길거나 또는 동일한 길이의 2개의 가닥이 엇갈리게 되어 발생할 수 있다. 오버행은 표적 mRNA와 미스매치를 형성할 수 있거나, 또는 표적화되는 유전자 서열과 상보적일 수 있거나 또는 다른 서열일 수 있다. 첫 번째 및 두 번째 가닥은 또한, 예를 들어, 헤어핀을 형성하기 위해 추가적인 염기에 의해, 또는 다른 비염기 링커에 의해 연결될 수 있다.
일부 실시형태에서, dsRNA 작용제의 오버행 영역에 있는 뉴클레오타이드는 각각 독립적으로 2-F 2'-O메틸, 티미딘(T), 2'-O-메톡시에틸-5-메틸우리딘(Teo), 2'-O-메톡시에틸아데노신(Aeo), 2'-O-메톡시에틸-5-메틸사이티딘(m5Ceo) 및 이들의 임의의 조합과 같이 2'-당 변형을 포함하지만 이에 제한되지 않는 변형 또는 비변형된 뉴클레오타이드일 수 있다. 예를 들어, TT는 양쪽 가닥의 양쪽 끝에 대한 오버행 서열일 수 있다. 오버행은 표적 mRNA와 미스매치를 형성할 수 있거나, 또는 표적화되는 유전자 서열과 상보적일 수 있거나 또는 다른 서열일 수 있다.
dsRNA 작용제의 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 두 가닥 모두의 5'-오버행 또는 3'-오버행은 인산화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 오버행 영역은 2개의 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트를 갖는 2개의 뉴클레오타이드를 포함하되, 2개의 뉴클레오타이드는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 일 실시형태에서, 오버행은 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 두 가닥 모두의 3'-말단에 존재한다. 일 실시형태에서, 이 3'-오버행은 안티센스 가닥에 존재한다. 일 실시형태에서, 이 3'-오버행은 센스 가닥에 존재한다.
dsRNA 작용제는 전체 안정성에 영향을 미치지 않으면서 dsRNA의 간섭 활성을 강화할 수 있는 단일 오버행만을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일-가닥 오버행은 센스 가닥의 3'-말단 또는 대안적으로 안티센스 가닥의 3'-말단에 위치한다. dsRNA는 안티센스 가닥의 5'-말단(또는 센스 가닥의 3'-말단)에 위치하는 평활 말단을 가질 수 있거나 또는 그 반대일 수도 있다. 일반적으로, dsRNA의 안티센스 가닥은 3'-말단에 뉴클레오타이드 오버행을 갖고, 5'-말단은 평활이다. 이론에 얽매이지 않고, 안티센스 가닥의 5'-말단에 있는 비대칭 평활 말단 및 안티센스 가닥의 3'-말단 오버행은 RISC 프로세스에 로딩되는 가이드 가닥을 선호한다. 예를 들어, 단일 오버행은 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 뉴클레오타이드 길이를 포함한다.
일부 실시형태에서, dsRNA 작용제는 또한 dsRNA 이중체의 양쪽 말단에 2개의 평활 말단을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, dsRNA 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드는 변형될 수 있다. 각각의 뉴클레오타이드는 비연결 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 모두 및/또는 연결 포스페이트 산소 중 하나 이상의 하나 이상의 변경; 리보스 당의 구성 성분, 예를 들어, 리보스 당 상의 2개의 하이드록실의 변경; 다수의 포스페이트 모이어티의 "데포스포" 링커로의 대체; 자연 발생적 염기의 변형 또는 대체; 및 리보스-포스페이트 백본의 대체 또는 변형을 포함할 수 있는 동일하거나 또는 상이한 변형으로 변형될 수 있다.
일부 실시형태에서, 3' 또는 5' 오버행의 염기 중 전부 또는 일부는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 변형으로 변형될 수 있다. 변형은, 예를 들어, 당업계에 공지된 변형, 예를 들어, 핵염기의 리보당 대신에 변형된 데옥시리보뉴클레오타이드, 2'-데옥시-2'-플루오로(2'-F) 또는 2'-O-메틸의 사용과 함께 리보스 당의 2' 위치에서의 변형의 사용, 및 포스페이트기의 변형, 예를 들어, 포스포로티오에이트 변형을 포함할 수 있다. 오버행은 표적 서열과 상동성일 필요는 없다.
일부 실시형태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각 잔기는 독립적으로 LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-데옥시 또는 2'-플루오로로 변형된다. 가닥은 하나 초과의 변형을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각 잔기는 독립적으로 변형된 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로로 변형된다.
일부 실시형태에서, 적어도 2개의 상이한 변형이 전형적으로 센스 가닥 및 안티센스 가닥에 존재한다. 이들 두 가지 변형은 2'-데옥시, 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형, 비환식 뉴클레오타이드 등일 수 있다.
일 실시형태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 2'-플루오로, 2'-O-메틸 또는 2'-데옥시로부터 선택된 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
dsRNA 작용제는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 추가로 포함할 수 있다. 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 임의의 뉴클레오타이드 또는 해당 가닥의 임의의 위치 둘 다에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드간 연결 변형은 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드에서 발생할 수 있고; 각각의 뉴클레오타이드간 연결 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에서 교호 패턴으로 발생할 수 있고; 또는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 교호 패턴의 뉴클레오타이드간 연결 변형을 모두 포함한다. 센스 가닥의 뉴클레오타이드간 연결 변형의 교호 패턴은 안티센스 가닥과 동일하거나 또는 상이할 수 있고, 센스 가닥의 뉴클레오타이드간 연결 변형의 교호 패턴은 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드간 연결 변형의 교호 패턴에 비해 변화(shift)를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, dsRNA 작용제는 오버행 영역에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결 변형을 포함한다. 예를 들어, 오버행 영역은 2개의 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 갖는 2개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 이중체 영역 내에서 오버행 뉴클레오타이드를 쌍을 이룬 말단 뉴클레오타이드와 연결하기 위해 뉴클레오타이드간 연결 변형이 또한 이루어질 수도 있다. 예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개 또는 모든 오버행 뉴클레오타이드가 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 통해 연결될 수 있고, 선택적으로, 오버행 뉴클레오타이드를 오버행 뉴클레오타이드의 옆에 있는 쌍을 이룬 뉴클레오타이드와 연결하는 추가적인 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결이 있을 수 있다. 예를 들어, 말단의 3개의 뉴클레오타이드 사이에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결이 있을 수 있으며, 여기에서 3개의 뉴클레오타이드 중 2개는 오버행 뉴클레오타이드이고, 세 번째는 오버행 뉴클레오타이드 옆에 쌍을 이룬 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 이러한 말단의 3개의 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 3'-말단에 있을 수 있다.
일부 실시형태에서, dsRNA 조성물은 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 미국 특허 제7,427,672호에 기술되어 있는 바와 같은 변형된 염기 또는 뉴클레오사이드 유사체에 의해 연결된다.
일부 실시형태에서, 링커는 본 명세서에 기재된 바와 같은 FN3 도메인을 하기 화학식 I을 갖는 센스 가닥에 연결하는 데 사용될 수 있다:
.
일부 실시형태에서, 링커는 본 명세서에 기재된 바와 같은 FN3 도메인을 하기 화학식 II를 갖는 안티센스 가닥에 연결하는 데 사용될 수 있다:
식 중, XAS는 안티센스 가닥을 나타내고, F1은 본 명세서에 기재된 바와 같은 FN3 도메인을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 링커는 F1에 존재하는 시스테인 잔기를 통해 F1에 공유적으로 부착되며, 이는 다음과 같이 예시될 수 있다:
.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 연결된 ds RNA 및 FN3 도메인은 하기 화학식 III을 갖는다:
식 중, C1은 본 명세서에 기재된 바와 같이 동일하거나 또는 상이한 FN3 도메인을 나타낸다.
일부 실시형태에서, A1-B1은 하기 화학식을 갖는다:
식 중, F1은 적어도 하나의 FN3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드이고, L1에 접합되어 있고, L1은 XS에 연결되어 있다, XS는 이중 가닥 siRNA 분자의 5'에서 3' 올리고뉴클레오타이드 센스 가닥이고, XAS는 이중 가닥 siRNA 분자의 3'에서 5' 올리고뉴클레오타이드 안티센스 가닥이고; XS와 XAS는 이중 가닥 siRNA 분자를 형성한다.
추가적인 링커의 구조는 다음과 같다:
mal-C2H4C(O)(NH)-(CH2)6-는 이고;
(Mal-(PEG)12)(NH)CH2)6)는
이고;
아미노헥실 링커-(CH2)6-로도 지칭될 수 있는 Mal-NH-(CH2)6-는 이고; 그리고
Val-Cit Paba는 구조를 갖는다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 dsRNA의 센스 가닥의 5' 말단에 링커를 포함하도록 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 dsRNA의 안티센스 가닥의 5' 말단에 바이닐 포스포네이트를 포함하도록 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 dsRNA의 센스 가닥의 3' 말단에 링커를 포함하도록 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 dsRNA의 안티센스 가닥의 3' 말단에 바이닐 포스포네이트를 포함하도록 변형될 수 있다. 링커는 dsRNA를 FN3 도메인에 연결하는 데 사용될 수 있다. 링커는, 예를 들어, 자연적으로 존재하거나 또는 본 명세서 및, 예를 들어, 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 미국 특허 제10,196,446호에 기재된 바와 같이 치환된 FN3 도메인 상의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착될 수 있다.
일부 실시형태에서, 펩타이드는, 예를 들어, 세포-특이적 표적화에 사용될 수 있는 지질 나노입자에 접합된다.
일부 실시형태에서, 단백질은 CD71 또는 단백질 분해를 위한 또 다른 단백질을 표적으로 하는 결합 모이어티에 접합된다. 예를 들어, 단백질은 PROTACS(E3 유비퀴틴 라이게이스에 대한 결합 모이어티)에 접합될 수 있으므로 단백질을 E3 라이게이스에 전달할 수 있다. 이들은 글리신-세린 링커 등과 같은 링커를 통해 연결될 수 있다.
CD71에 결합하는 FN3 도메인은 또한 CD71 이외의 상이한 표적에 결합하는 또 다른 FN3 도메인에 접합되거나 또는 연결될 수 있다. 이는 펩타이드가 다중특이성(예를 들어, 이중특이성, 삼중특이성 등)이 되어 CD71 및 또 다른, 예를 들어, 단백질에 결합하도록 할 수 있다. 일부 실시형태에서, CD71 FN3 결합 도메인은 종양 세포에 의해 발현된 항원(종양 항원)에 결합하는 또 다른 FN3 도메인에 연결된다.
일부 실시형태에서, FN3 도메인은 링커에 의해 함께 연결되어 2가 FN3 도메인을 형성할 수 있다. 링커는 가요성 링커일 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 G/S 링커이다. 일부 실시형태에서, 링커는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 G/S 반복을 갖는다. G/S 반복 단위는 4개의 글리신 뒤에 세린, 예를 들어, GGGGS(서열번호 308)이다. 일부 실시형태에서, 2개의 FN3 도메인을 포함하는 FN3 도메인은 본 명세서에 제공된 것과 같은 링커에 의해 연결된다. 예시적인 링커는 (GS)2(서열번호 278), (GGGS)2(서열번호 279), (GGGGS)1-5(서열번호 280), (AP)1-20(서열번호 311); (AP)2(서열번호 281), (AP)5(서열번호 282), (AP)10(서열번호 283), (AP)20(서열번호 284), A(EAAAK)5AAA(서열번호 285) 또는 (EAAAK)1-5(서열번호 307)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 링커는 EAAAKEAAAKEAAAKEAAAK(서열번호 300); GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 301); APAPAPAPAP(서열번호 302); 또는 EAAAK(서열번호 303)의 아미노산 서열이거나 또는 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 이종 분자는 세포독성제와 같지만 이에 제한되지 않는 검출 가능한 표지 또는 치료제이다.
일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지에 접합된 CD71에 결합하는 FN3 도메인이 제공된다. 표지의 비제한적인 예는 본 명세서에 제공되어 있다.
일부 실시형태에서, 치료제에 접합된 CD71에 결합하는 FN3 도메인이 제공된다. 세포독성제와 같지만 이에 제한되지 않는 치료제의 비제한적인 예는 본 명세서에 제공되어 있다.
검출 가능한 표지에 접합된 CD71에 결합하는 FN3 도메인은 생체내 또는 시험관내 종양 조직과 같은 샘플에서 CD71의 발현을 평가하는 데 사용될 수 있다. 검출 가능한 표지에 접합된 CD71에 결합된 FN3 도메인은 생체내 또는 시험관내 샘플 혈액, 면역 세포 또는 수지상 세포에서 CD71의 발현을 평가하는 데 사용될 수 있다.
검출 가능한 표지는 CD71에 결합하는 FN3 도메인에 접합될 때 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 다른 화학적 방법을 통해 CD71을 검출 가능하게 만드는 조성물을 포함한다.
예시적인 검출 가능한 표지는 방사성 동위원소, 자성 비드, 금속 비드, 콜로이드 입자, 형광 염료, 전자-밀집 시약, 효소(예를 들어, 일반적으로 ELISA에 사용됨), 바이오틴, 다이곡시게닌, 합텐, 발광 분자, 화학발광 분자, 형광색소, 형광단, 형광 소광제, 유색 분자, 방사성 동위원소, 신틸런트, 아비딘, 스트렙타비딘, 단백질 A, 단백질 G, 항체 또는 이의 단편, 폴리히스티딘, Ni2+, 프래그 태그, myc 태그, 중금속, 효소, 알칼리 포스파테이스, 퍼옥시데이스, 루시퍼레이스, 전자 공여체/수용체, 아크리디늄 에스터 및 비색 기질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
검출 가능한 표지가 방사성 동위원소인 경우와 같이 검출 가능한 표지는 자발적으로 신호를 방출할 수 있다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 자기장 또는 전기장과 같은 외부 자극에 의해 자극된 결과로서 신호를 방출한다.
예시적인 방사성 동위원소는 γ-방출, 오제-방출, β-방출, 알파-방출 또는 양전자-방출 방사성 동위원소일 수 있다. 예시적인 방사성 동위원소는 3H, 11C, 13C, 15N, 18F, 19F, 55Co, 57Co, 60Co, 61Cu, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 68Ga, 72As, 75Br, 86Y, 89Zr, 90Sr, 94mTc, 99mTc, 115In, 1231, 1241, 125I, 1311, 211At, 212Bi, 213Bi, 223Ra, 226Ra, 225Ac 및 227Ac를 포함한다.
예시적인 금속 원자는 칼슘 원자, 스칸듐 원자, 티타늄 원자, 바나듐 원자, 크로뮴 원자, 망가니즈 원자, 철 원자, 코발트 원자, 니켈 원자, 구리 원자, 아연 원자, 갈륨 원자, 저마늄 원자, 비소 원자, 셀레늄 원자, 브로민 원자, 크립톤 원자, 루비듐 원자, 스트론튬 원자, 이트륨 원자, 지르코늄 원자, 니오븀 원자, 몰리브덴 원자, 테크네튬 원자, 루테늄 원자, 로듐 원자, 팔라듐 원자, 은 원자, 카드뮴 원자, 인듐 원자, 주석 원자, 안티몬 원자, 텔루륨 원자, 아이오다인 원자, 제논 원자, 세슘 원자, 바륨 원자, 란타늄 원자, 하프늄 원자, 탄탈륨 원자, 텅스텐 원자, 레늄 원자, 오스뮴 원자, 이리듐 원자, 플라티늄 원자, 금 원자, 수은 원자, 탈륨 원자, 납 원자, 비스무트 원자, 프란슘 원자, 라듐 원자, 악티늄 원자, 세륨 원자, 프라세오디뮴 원자, 네오디뮴 원자, 프로메튬 원자, 사마륨 원자, 유로퓸 원자, 가돌리늄 원자, 테르븀 원자, 디스프로슘 원자, 홀뮴 원자, 에르븀 원자, 톨륨 원자, 이테르븀 원자, 류테튬 원자, 토륨 원자, 프로트악티늄 원자, 우라늄 원자, 넵투늄 원자, 플루토늄 원자, 아메리슘 원자, 퀴륨 원자, 버클륨 원자, 칼리포르늄 원자, 아인시타이늄 원자, 페르뮴 원자, 멘델레븀 원자, 노벨륨 원자 또는 로렌슘 원자와 같은 원자 번호 20보다 큰 금속이다.
일부 실시형태에서, 금속 원자는 원자 번호 20보다 큰 알칼리 토금속일 수 있다.
일부 실시형태에서, 금속 원자는 란탄족일 수 있다.
일부 실시형태에서, 금속 원자는 악티나이드일 수 있다.
일부 실시형태에서, 금속 원자는 전이 금속일 수 있다.
일부 실시형태에서, 금속 원자는 전이 후 금속(poor metal)일 수 있다.
일부 실시형태에서, 금속 원자는 금 원자, 비스무트 원자, 탄탈륨 원자 및 가돌리늄 원자일 수 있다.
일부 실시형태에서, 금속 원자는 원자 번호 53(즉,　아이오다인) 내지 83(즉, 비스무트)의 금속일 수 있다.
일부 실시형태에서, 금속 원자는 자기 공명 영상에 적합한 원자일 수 있다.
금속 원자는 Ba2+, Bi3+, Cs+, Ca2+, Cr2+, Cr3+, Cr6+, Co2+, Co3+, Cu+, Cu2+, Cu3+, Ga3+, Gd3+, Au+, Au3+, Fe2+, Fe3+, F3+, Pb2+, Mn2+, Mn3+, Mn4+, Mn7+, Hg2+, Ni2+, Ni3+, Ag+, Sr2+, Sn2+, Sn4+ 및 Zn2+와 같은 +1, +2 또는 +3 산화 상태 형태의 금속 이온일 수 있다. 금속 원자는 산화철, 산화망간 또는 산화가돌리늄과 같은 금속 산화물을 포함할 수 있다.
적합한 염료는, 예를 들어, 5(6)-카복시플루오레세인, IRDye 680RD 말레이미드 또는 IRDye 800CW, 루테늄 폴리피리딜 염료 등과 같은 임의의 상업적으로 입수 가능한 염료를 포함한다.
적합한 형광단은 플루오레세인 아이소티오사이아네이트(FITC), 플루오레세인 티오세미카바자이드, 로다민, Texas Red, CyDye(예를 들어, Cy3, Cy5, Cy5.5), Alexa Fluor(예를 들어, Alexa488, Alexa555, Alexa594; Alexa647), 근적외선(NIR)(700㎚ 내지 900㎚) 형광 염료 및 카보사이아닌 및 아미노스티릴 염료이다.
검출 가능한 표지에 접합된 CD71에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은, 예를 들어, 종양 분포, 종양 세포의 존재에 대한 진단 및/또는 종양의 재발을 평가하기 위한 이미징제로서 사용될 수 있다. 검출 가능한 표지에 접합된 CD71에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은, 예를 들어, 수지상 세포, T-세포, NK 세포, B-세포 면역 세포, 근육 세포 및 중추 신경계의 세포를 포함하여 신체의 다양한 조직에서 CD71 양성 세포의 존재를 평가하기 위한 이미징제로서 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, CD71에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 세포독성제와 같지만 이에 제한되지 않는 치료제에 접합된다.
일부 실시형태에서, 치료제는 화학치료제, 약물, 성장 저해제, 독소(예를 들어, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소 또는 이들의 단편) 또는 방사성 동위원소(즉, 방사접합체)이다.
본 명세서에 개시된 치료제에 접합된 CD71에 결합하는 FN3 도메인은 CD71 발현 세포(예를 들어, 종양 세포, 수지상 세포, T-세포, NK 세포, B-세포 면역 세포, 중추 신경계의 세포)에 대한 치료제의 표적화된 전달 및 그 세포내 축적에 사용될 수 있다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 이러한 유형의 전달은 이러한 비접합 작용제의 전신 투여가 정상적인 세포에 허용할 수 없는 수준의 독성을 초래할 수 있는 경우에 도움이 될 수 있다.
일부 실시형태에서, 치료제는 튜불린 결합, DNA 결합, 토포아이소머레이스 저해, DNA 가교, 킬레이트화, 스플라이소솜 저해, NAMPT 저해 및 HDAC 저해와 같지만 이에 제한되지 않는 메커니즘에 의해 세포독성 및/또는 세포증식억제 효과를 유발할 수 있다.
일부 실시형태에서, 치료제는 스플라이소솜 저해제, NAMPT 저해제 또는 HDAC 저해제이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 면역계 효능제, 예를 들어, TLR7,8,9, RIG-I(dsRNA) 및 STING(CpG) 효능제이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 빈데신, 디프테리아 독소와 같은 세균 독소, 리신, 겔다나마이신, 메이탄시노이드 또는 칼리키아미신이다.
일부 실시형태에서, 치료제는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬(슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 저해제, 커신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 저해제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 또는 트리코테센과 같은 효소적으로 활성인 독소이다.
일부 실시형태에서, 치료제는 212Bi, 131I, 131In, 90Y 또는 186Re와 같은 방사성 동위원소이다.
일부 실시형태에서, 치료제는 돌라스타틴 또는 돌로스타틴 펩타이드 유사체 및 유도체, 아우리스타틴 또는 모노메틸 아우리스타틴 페닐알라닌이다. 예시적인 분자는 미국 특허 제5,635,483호 및 제5,780,588호에 개시되어 있다. 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 미세소관 동역학, GTP 가수분해, 및 핵 및 세포 분열(5,780,588)을 방해하고 항암 및 항진균 활성을 갖는 것으로 나타났다. 돌라스타틴 또는 아우리스타틴 약물 모이어티는 펩타이드 약물 모이어티의 N(아미노) 말단 또는 C(카복실) 말단을 통해 (WO 02/088172) 또는 FN3 도메인으로 조작된 임의의 시스테인을 통해 FN3 도메인에 부착될 수 있다.
일부 실시형태에서, 치료제는, 예를 들어, 아우리스타틴, 캄프토테신, 듀오카마이신, 에토포시드, 메이탄신 및 메이탄시노이드, 탁세인, 벤조다이아제핀 또는 벤조다이아제핀 함유 약물(예를 들어, 피롤로[1,41-벤조다이아제핀(PBD), 인돌리노벤조다이아제핀 및 옥사졸리다이노벤조다이아제핀) 또는 빈카 알칼로이드일 수 있다.
CD71에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 공지의 방법을 사용하여 검출 가능한 표지에 접합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 킬레이트제와 복합체화된다.
일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 링커 위에 기재된 바와 같은 링커를 통해 CD71에 결합하는 FN3 도메인에 접합된다.
검출 가능한 표지, 치료적 화합물 또는 세포독성 화합물은 공지의 방법을 사용하여 CD71에 결합하는 FN3 도메인에 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 적합한 링커는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 보결 원자단, 비페놀성 링커(N-석신이미딜-벤조에이트; 도데카보레이트의 유도체), 대환식 및 비환식 킬레이트제 모두의 킬레이팅 모이어티, 예컨대, 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데케인-1,4,7,10,테트라아세트산(DOTA)의 유도체, 다이에틸렌트라이아민펜타아세트산(DTPA)의 유도체, S-2-(4-아이소티오사이아나토벤질)-1,4,7-트라이아자사이클로노네인-1,4,7-트라이아세트산(NOTA)의 유도체 및 1,4,8,11-테트라아자사이클로도세단-1,4,8,11-테트라아세트산(TETA)의 유도체, N-석신이미딜-3-(2-피리딜다이티올) 프로피오네이트(SPDP), 이미노티올레인(IT), 이미도에스터(예컨대, 다이메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스터(예컨대, 다이석신이미딜 수베레이트)의 이작용성 유도체, 알데하이드(예컨대, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스(p-아지도벤조일)헥세인다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예컨대, 비스(p-다이아조늄벤조일)에틸렌다이아민), 다이아이소사이아네이트(예컨대, 톨루엔 2,6-다이아이소사이아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물(예컨대, 1,5-다이플루오로-2,4-다이나이트로벤젠) 및 다른 킬레이팅 모이어티를 포함한다. 적합한 펩타이드 링커는 잘 알려져 있다.
일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 FN3 도메인은 신장 제거를 통해 혈액으로부터 제거된다.
텐콘 서열에 기초한 라이브러리로부터 CD71 결합 FN3 도메인의 단리
텐콘(서열번호 276)은 인간 테나신-C로부터의 15개의 FN3 도메인의 컨센서스 서열로부터 설계된 비자연 발생적 파이브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인이다(Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012; 미국 공개 제2010/0216708호). 텐콘의 결정 구조는 FN3 도메인의 특징인 7개의 베타-가닥을 연결하는 6개의 표면-노출된 루프를 보여주며, 베타-가닥은 A, B, C, D, E, F 및 G로 지칭되고, 루프는 AB, BC, CD, DE, EF 및 FG 루프로 지칭된다(Bork and Doolittle, Proc Natl Acad Sci USA 89:8990-8992, 1992; 미국 특허 제6,673,901호). 각 루프 내의 이러한 루프 또는 선택된 잔기는 CD71에 결합하는 신규한 분자를 선택하는 데 사용될 수 있는 파이브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인의 라이브러리를 구축하기 위해 무작위화될 수 있다. 표 1은 텐콘(서열번호 276)의 각 루프 및 베타-가닥의 위치 및 서열을 보여준다.
따라서, 텐콘 서열에 기초하여 설계된 라이브러리는 무작위화된 FG 루프 또는 무작위화된 BC 및 FG 루프, 예컨대, 아래 기재된 바와 같은 라이브러리 TCL1 또는 TCL2를 가질 수 있다. 텐콘 BC 루프는 7개의 아미노산 길이이므로, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개의 아미노산은 BC 루프에서 다양화된 라이브러리에서 무작위화되고 텐콘 서열에 기초하여 설계될 수 있다. 텐콘 FG 루프는 7개의 아미노산 길이이므로, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개의 아미노산은 FG 루프에서 다양화된 라이브러리에서 무작위화되고 텐콘 서열에 기초하여 설계될 수 있다. 텐콘 라이브러리에 있는 루프에서의 추가 다양성은 루프에서 잔기의 삽입 및/또는 결실에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, FG 및/또는 BC 루프는 1개 내지 22개의 아미노산만큼 연장되거나 또는 1개 내지 3개의 아미노산만큼 감소될 수 있다. 텐콘의 FG 루프는 7개의 아미노산 길이인 반면, 항체 중쇄의 상응하는 루프는 4개 내지 28개 잔기의 범위이다. 최대 다양성을 제공하기 위해, FG 루프는 4개 내지 28개 잔기의 항체 CDR3 길이 범위에 상응하도록 서열뿐만 아니라 길이도 다양화될 수 있다. 예를 들어, FG 루프는 루프를 추가로 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산만큼 연장시킴으로써 길이를 더욱 다양화될 수 있다.
텐콘 서열에 기초하여 설계된 라이브러리는 또한 FN3 도메인의 측면에 형성되고 2개 이상의 베타 가닥 및 적어도 하나의 루프를 포함하는 무작위화된 대체 표면을 가질 수 있다. 이러한 대체 표면 중 하나는 C 및 F 베타-가닥과 CD 및 FG 루프의 아미노산에 의해 형성된다(C-CD-F-FG 표면). 텐콘 대체 C-CD-F-FG 표면에 기초하여 설계된 라이브러리는 미국 공개 제2013/0226834호에 기술되어 있다. 텐콘 서열에 기초하여 설계된 라이브러리는 또한 11번, 14번, 17번, 37번, 46번, 73번 또는 86번 잔기 위치(서열번호 276에 해당하는 잔기 넘버링)에 치환이 있는 텐콘 변이체와 같은 텐콘 변이체에 기초하여 설계된 라이브러리를 포함하며, 이 변이체는 열 안정성을 개선하는 것으로 나타나 있다. 예시적인 텐콘 변이체는 미국 공개 제2011/0274623호에 기술되어 있으며, 서열번호 276의 텐콘과 비교할 때 치환 E11R, L17A, N46V 및 E86I를 갖는 텐콘27(서열번호 277)을 포함한다.
텐콘 및 다른 FN3 서열 기반 라이브러리는 무작위 또는 정의된 아미노산 세트를 사용하여 선택된 잔기 위치에서 무작위화될 수 있다. 예를 들어, 무작위 치환을 갖는 라이브러리에서 변이체는 20개의 모든 자연 발생적 아미노산을 암호화하는 NNK 코돈을 사용하여 생성될 수 있다. 다른 다양한 계획에서, DVK 코돈은 아미노산 Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly 및 Cys를 암호화하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, NNS 코돈은 20개의 아미노산 잔기를 모두 발생시키고 동시에 정지 코돈의 빈도를 감소시키는 데 사용될 수 있다. 다양화될 위치에서 편향된 아미노산 분포를 갖는 FN3 도메인의 라이브러리는, 예를 들어, Slonomics® 기술(http://www_sloning_com)을 사용하여 합성될 수 있다. 이 기술은 수천 개의 유전자 합성 과정 동안 충분한 보편적인 빌딩 블록의 역할을 하는 미리 만들어진 이중 가닥 삼중항 라이브러리를 사용한다. 삼중항 라이브러리는 임의의 목적하는 DNA 분자를 구축하는 데 필요한 모든 가능한 서열 조합을 나타낸다. 코돈 지정은 잘 알려진 IUB 코드를 따른다.
CD71에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 스캐폴드 단백질을 암호화하는 DNA 단편을 RepA를 암호화하는 DNA 단편에 결찰시키기 위해 시스 디스플레이를 사용하는 텐콘 라이브러리와 같은 FN3 라이브러리를 생성하여 시험관내 번역 후 형성된 단백질-DNA 복합체의 풀을 생성하고(여기서, 각 단백질은 이를 암호화하는 DNA와 안정적으로 회합되어 있음(미국 특허 제7,842,476호; Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101, 2806-2810, 2004)), 당업계에 공지되고 실시예에 기재된 임의의 방법에 의해 PSMA에 대한 특이적 결합에 대해 라이브러리를 검정함으로써 단리될 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 잘 알려진 방법은 ELISA, 샌드위치 면역검정 및 경쟁 및 비경쟁 검정이다(예를 들어, 문헌[Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York] 참조). CD71에 특이적으로 결합하는 확인된 FN3 도메인은 CD71에 대한 결합, CD71 활성의 조절, 내재화, 안정성 및 다른 목적하는 특성에 대해 추가로 특성화된다.
CD71에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 임의의 FN3 도메인을 주형으로 사용하여 라이브러리를 생성하고 내부에 제공된 방법을 사용하여 CD71에 특이적으로 결합하는 분자에 대한 라이브러리를 스크리닝하여 생성될 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 FN3 도메인 테나신 C(TN3)의 3번째 FN3 도메인, Fibcon 및 파이브로넥틴(FN10)의 10번째 FN3 도메인이다. 따라서, PCT 출원 WO 2010/051274, WO 2011/137319 및 WO 2013/049275는 전체가 본 명세서에 원용된다. 표준 클로닝 및 발현 기법은 클론 라이브러리를 벡터로 클로닝하거나 또는 라이브러리의 이중 가닥 cDNA 카세트를 합성하고, 시험관내에서 라이브러리를 발현 또는 번역시키는 데 사용된다. 예를 들어 리보솜 디스플레이(Hanes and Pluckthun, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 4937-4942, 1997), mRNA 디스플레이(Roberts and Szostak, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 12297-12302, 1997) 또는 다른 무세포 시스템(미국 특허 제5,643,768호)이 사용될 수 있다. FN3 도메인 변이체의 라이브러리는, 예를 들어, 임의의 적합한 박테리오파지의 표면에 디스플레이된 융합 단백질로 발현될 수 있다. 박테리오파지의 표면에서 융합 폴리펩타이드를 디스플레이하는 방법은 잘 알려져 있다(미국 공개 제2011/0118144호; 국제 공개 제WO2009/085462호; 미국 특허 제6,969,108호; 미국 특허 제6,172,197호; 미국 특허 제5,223,409호; 미국 특허 제6,582,915호; 미국 특허 제6,472,147호).
일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 FN3 도메인은 선택적으로 11번, 14번, 17번, 37번, 46번, 73번 및/또는 86번 위치의 잔기에 치환을 갖는, 서열번호 276의 텐콘 서열 또는 서열번호 277의 텐콘27 서열, 서열번호 276 또는 서열번호 277을 기반으로 한다.
일부 실시형태에서, FN3 단백질 또는 폴리펩타이드는 CD71에 대한 트랜스페린 결합과 경쟁하지 않는 CD71의 부위에서 인간 CD71에 결합하는 것이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, CD71에 대한 트랜스페린 결합과 경쟁하지 않는 CD71의 부위는 FN3 단백질의 결합이 CD71에 대한 트랜스페린의 결합과 경쟁하거나 또는 이를 저해하지 않는 CD71의 에피토프 또는 일부를 지칭한다. 경쟁 또는 이의 부족은 완전할 수 있거나 또는 부분적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 결합은 또한 CD71과의 상호작용을 통해 트랜스페린의 세포로의 내재화를 저해하지 않는다.
일부 실시형태에서, CD71에 대한 트랜스페린 결합과 경쟁하거나 또는 이를 저해하지 않는 부위에서 CD71에 결합하는 FN3 단백질을 확인하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 트랜스페린 또는 CD71 트랜스페린 결합 부위에 결합하는 작용제의 존재하에 CD71을 테스트 FN3 단백질과 접촉시키는 단계; 및 테스트 트랜스페린 또는 CD71 트랜스페린 결합 부위에 결합하는 작용제의 존재하에 CD71에 결합하는 테스트 FN3 단백질을 확인하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 트랜스페린 또는 CD71 트랜스페린 결합 부위에 결합하는 작용제의 존재하에 CD71에 결합하는 테스트 FN3 단백질을 단리하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 트랜스페린 또는 CD71 트랜스페린 결합 부위에 결합하는 작용제의 존재하에 CD71에 결합하는 테스트 FN3 단백질을 시퀀싱하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 트랜스페린 또는 CD71 트랜스페린 결합 부위에 결합하는 작용제의 존재하에 CD71에 결합하는 테스트 FN3 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 제조하거나 또는 얻는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 트랜스페린 또는 CD71 트랜스페린 결합 부위에 결합하는 작용제의 존재하에 CD71에 결합하는 테스트 FN3 단백질을 암호화하는 핵산 서열로부터 트랜스페린 또는 CD71 트랜스페린 결합 부위에 결합하는 작용제의 존재하에 CD71에 결합하는 테스트 FN3 단백질을 발현시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 테스트 FN3 단백질은 세포에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 방법은 발현된 테스트 FN3 단백질을 단리 및/또는 정제하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, FN3 단백질이 제공되되, FN3 단백질은 본 명세서에 제공된 임의의 방법에 따라 확인된다.
CD71에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 열 접힘 및 풀림의 열 안정성 및 가역성을 개선하는 것과 같은 특성을 개선하도록 변형될 수 있다. 단백질 및 효소의 겉보기 열 안정성을 증가시키기 위해, 매우 유사한 열안정성 서열, 다이설파이드 브리지를 안정화하는 디자인, 알파-나선 성향을 증가시키는 돌연변이, 염 브리지의 조작, 단백질의 표면 전하의 변경, 유도 진화 및 컨센서스 서열의 구성과의 비교를 기반으로 한 합리적인 설계를 포함하는 여러 방법이 적용되었다(Lehmann and Wyss, Curr. Opin. Biotechnol., 12, 371-375, 2001). 높은 열 안정성은 발현된 단백질의 수율을 증가시키고, 용해도 또는 활성을 개선하고, 면역원성을 감소시키고 및 제조 시 저온 유통의 필요성을 최소화할 수 있다. 텐콘(서열번호 276)의 열 안정성을 개선하기 위해 치환될 수 있는 잔기는 11번, 14번, 17번, 37번, 46번, 73번 또는 86번 잔기 위치이며, 이는 미국 공개 제2011/0274623호에 기술되어 있다. 이들 잔기에 상응하는 치환은 본 명세서에 개시된 분자를 포함하는 FN3 도메인에 혼입될 수 있다.
단백질 안정성 및 단백질 불안정성의 측정은 단백질 무결성의 동일하거나 또는 상이한 양상으로 볼 수 있다. 단백질은 열, 자외선 또는 전리 방사선, 주위 삼투압 및 액체 용액의 경우 pH의 변화, 작은 기공-크기 여과로 인한 기계적 전단력, 자외선 방사선, 감마 조사에 의한 것과 같은 전리 방사선, 화학적 또는 열 탈수 또는 단백질 구조 파괴를 일으킬 수 있는 임의의 기타 작용 또는 힘에 의해 발생된 변성에 민감하거나 또는 "불안정"하다. 분자의 안정성은 표준 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 분자의 안정성은 열 용융("Tm") 온도, 즉, 분자의 절반이 펼쳐지는 온도(℃)를 표준 방법을 사용하여 측정함으로써 결정될 수 있다. 전형적으로, Tm이 높을수록 분자가 더 안정적이다. 열 외에도, 화학적 환경도 특정 3차원 구조를 유지하는 단백질의 능력을 변화시킨다.
일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 FN3 도메인은 Tm의 증가로 측정되는 조작 전의 동일한 도메인에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상만큼 증가된 안정성을 나타낼 수 있다.
화학적 변성은 마찬가지로 다양한 방법에 의해 측정될 수 있다. 화학적 변성제는 구아니디늄 하이드로클로라이드, 구아니디늄 티오사이아네이트, 우레아, 아세톤, 유기 용매(DMF, 벤젠, 아세토나이트릴), 염(암모늄 설페이트, 리튬 브로마이드, 리튬 클로라이드, 소듐 브로마이드, 칼슘 클로라이드, 소듐 클로라이드); 환원제(예를 들어, 다이티오트레이톨, 베타-머캅토에탄올, 다이나이트로티오벤젠 및 하이드라이드, 예컨대, 소듐 보로하이드라이드), 비이온성 및 이온성 세제, 산(예를 들어, 염산(HCl), 아세트산(CH3COOH), 할로겐화된 아세트산), 소수성 분자(예를 들어, 인지질) 및 표적화된 변성제를 포함한다. 변성 정도의 정량화는 표적 분자에 결합하는 능력과 같은 기능적 특성의 손실 또는 응집의 경향, 이전에 용매에 접근하기 어려웠던 잔기의 노출 또는 다이설파이드 결합의 파괴 또는 형성과 같은 물리화학적 특성에 따라 달라질 수 있다.
CD71에 결합하는 FN3 도메인은 2개 이상의 상이한 표적 분자를 동시에 결합시키는 이중- 또는 다중특이성 스캐폴드를 생성하기 위해, 예를 들어, 표적 분자 결합의 원자가를 증가시키고 따라서 결합력을 증가시키기 위한 수단으로서 단량체, 이량체 또는 다량체로서 생성될 수 있다. 이량체 및 다량체는 단일특이성, 이중- 또는 다중특이성 단백질 스캐폴드를 연결함으로써, 예를 들어, 아미노산 링커, 예를 들어, 폴리-글리신, 글리신 및 세린 또는 알라닌 및 프롤린을 포함하는 링커를 포함시킴으로써 생성될 수 있다. 예시적인 링커는 (GS)2(서열번호 278), (GGGS)2(서열번호 279), (GGGGS)1-5(서열번호 280), (AP)1-20(서열번호 311); (AP)2(서열번호 281), (AP)5(서열번호 282), (AP)10(서열번호 283), (AP)20(서열번호 284), A(EAAAK)5AAA(서열번호 285) 또는 (EAAAK)1-5(서열번호 307)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 링커는 EAAAKEAAAKEAAAKEAAAK(서열번호 300); GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 301); APAPAPAPAP(서열번호 302); 또는 EAAAK(서열번호 303)의 아미노산 서열이다.
이량체 및 다량체는 N에서 C 방향으로 서로 연결될 수 있다. 폴리펩타이드를 신규한 연결된 융합 폴리펩타이드로 연결시키기 위한 자연 발생적 링커뿐만 아니라 인공 펩타이드 링커는 문헌에 잘 알려져 있다(Hallewell et al., J Biol Chem 264, 5260-5268, 1989; Alfthan et al., Protein Eng. 8, 725-731, 1995; Robinson & Sauer, Biochemistry 35, 109-116, 1996; 미국 특허 제5,856,456호).
반감기 연장 모이어티
CD71에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은, 예를 들어, 공유적 상호작용을 통해 다른 서브유닛을 혼입시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, CD71에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 반감기 연장 모이어티를 추가로 포함한다. 예시적인 반감기 연장 모이어티는 알부민, 알부민 변이체, 알부민-결합 단백질 및/또는 도메인, 트랜스페린, 및 이들의 단편과 유사체 및 Fc 영역이다. 인간 Fc 영역의 아미노산 서열은 잘 알려져 있고, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA 및 IgE Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD71에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 본 명세서에 기재된 임의의 반감기 연장 모이어티와 같지만 이에 제한되지 않는 전체 분자의 반감기를 연장하는 분자에 결합하는 제2 FN3 도메인을 혼입시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 FN3 도메인은 알부민, 알부민 변이체, 알부민-결합 단백질 및/또는 도메인 및 이들의 단편과 유사체에 결합한다.
항체 불변 영역의 전부 또는 일부는 항체-유사 특성, 특히 C1q 결합, 보체 의존적 세포독성(complement dependent cytotoxicity: CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존적 세포-매개성 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC), 식세포 작용, 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절과 같은 Fc 효과기 기능과 같은 Fc 영역과 관련된 특성을 부여하기 위해 CD71에 결합하는 FN3 도메인에 부착될 수 있으며, 이러한 활성을 담당하는 Fc 잔기를 변형시킴으로써 추가로 변형될 수 있다(리뷰를 위해; 문헌[Strohl, Curr Opin Biotechnol. 20, 685-691, 2009] 참조).
목적하는 특성을 위해 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자, 예컨대, PEG5000 또는 PEG20,000, 다양한 사슬 길이의 지방산 및 지방산 에스터, 예를 들어, 라우레이트, 미리스테이트, 스테아레이트, 아라키데이트, 베헤네이트, 올리에이트, 아라키도네이트, 옥테인다이오산, 테트라데케인다이오산, 옥타데케인다이오산, 도코세인다이오산 등, 폴리라이신, 옥테인, 탄수화물(덱스트란, 셀룰로스, 올리고- 또는 다당류)와 같은 추가적인 모이어티가 CD71에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인에 혼입될 수 있다. 이러한 모이어티는 단백질 스캐폴드 코딩 서열과 직접 융합될 수 있고, 표준 클로닝 및 발현 기법에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 잘 알려진 화학적 커플링 방법이 본 명세서에 개시된 재조합적으로 생산된 분자에 모이어티를 부착시키는 데 사용될 수 있다.
페길 모이어티는, 예를 들어, 시스테인 잔기를 분자의 C-말단에 혼입시키거나 또는 시스테인을 분자의 결합면에서 먼 쪽을 향하는 잔기 위치로 조작하고, 잘 알려진 방법을 사용하여 페길기를 시스테인에 부착함으로써 CD71에 결합하는 FN3 도메인에 첨가될 수 있다.
추가적인 모이어티를 혼입시키는 CD71에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 몇몇 잘 알려진 검정에 의해 기능성에 대해 비교될 수 있다. 예를 들어, Fc 도메인 및/또는 Fc 도메인 변이체의 혼입으로 인해 변경된 특성은 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 또는 FcRn 수용체와 같은 가용성 형태의 수용체를 사용하거나 또는, 예를 들어, ADCC 또는 CDC를 측정하거나 또는 생체내 모델에서 본 명세서에 개시된 분자의 약동학적 특성을 평가하는 잘 알려진 세포-기반 검정을 사용하여 Fc 수용체 결합 검정에서 검정될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드, 벡터, 숙주 세포
일부 실시형태에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 벡터의 일부 또는 시험관내 전사/번역에 사용되는 선형 DNA 서열을 포함하는 선형 DNA 서열의 일부로서 CD71에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인을 암호화하는 핵산, 원핵생물, 진핵생물 또는 사상성 파지 발현, 분비 및/또는 이의 조성물 또는 지시된 돌연변이 유발 요인의 디스플레이와 상용성인 벡터가 제공된다. 소정의 예시적인 폴리뉴클레오타이드가 본 명세서에 개시되어 있지만, 주어진 발현 시스템에서 유전자 코드 또는 코돈 선호도의 축퇴성을 고려할 때, 본 명세서에 개시된 FN3 도메인을 암호화하는 다른 폴리뉴클레오타이드도 본 개시내용의 범위 내에 있다.
일부 실시형태에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306의 아미노산 서열을 포함하는 CD71과 특이적으로 결합하는 FN3 도메인을 암호화한다.
본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드는 자동화된 폴리뉴클레오타이드 합성기에서 고체상 폴리뉴클레오타이드 합성과 같은 화학적 합성에 의해 생산되고, 완전한 단일 또는 이중 가닥 분자로 조립될 수 있다. 대안적으로, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드는 PCR에 이어 일상적인 클로닝과 같은 다른 기법에 의해 생산될 수 있다. 주어진 알려진 서열의 폴리뉴클레오타이드를 생산하거나 또는 얻는 기법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 논코딩 서열, 예컨대, 프로모터 또는 인핸서 서열, 인트론, 폴리아데닐화 신호, RepA 결합을 용이하게 하는 시스 서열 등을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 서열은 또한, 예를 들어, 단백질의 정제 또는 검출을 용이하게 하기 위한 마커 또는 히스티딘 태그 또는 HA 태그와 같은 태그 서열을 암호화하는 추가적인 아미노산을 암호화하는 추가적인 서열, 신호 서열, RepA, Fc와 같은 융합 단백질 파트너 또는 pIX 또는 pIII와 같은 박테리오파지 코팅 단백질을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 제공된다. 이러한 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 바큘로바이러스 발현을 위한 벡터, 트랜스포존 기반 벡터 또는 임의의 수단에 의해 주어진 유기체 또는 유전적 배경에 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드를 도입하기에 적합한 임의의 다른 벡터일 수 있다. 이러한 벡터는 이러한 벡터에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 제어, 조절, 유발 또는 허용할 수 있는 핵산 서열 요소를 포함하는 발현 벡터일 수 있다. 이러한 요소는 전사 인핸서 결합 부위, RNA 폴리머레이스 개시 부위, 리보솜 결합 부위 및 주어진 발현 시스템에서 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 용이하게 하는 기타 부위를 포함할 수 있다. 이러한 발현 시스템은 당업계에 잘 알려진 세포-기반 또는 무세포 시스템일 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. CD71에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 선택적으로 당업계에 잘 알려진 바와 같은 세포주, 혼합된 세포주, 불멸화된 세포 또는 불멸화된 세포의 클론 집단에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001)]을 참조한다.
발현을 위해 선택된 숙주 세포는 포유동물 기원일 수 있거나 또는 COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, He G2, SP2/0, HeLa, 골수종, 림프종, 효모, 곤충 또는 식물 세포 또는 이들의 임의의 파생물, 불멸화된 또는 형질전환된 세포로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 폴리펩타이드를 글리코실화할 수 없는 종 또는 유기체, 예를 들어, BL21, BL21(DE3), BL21-GOLD(DE3), XL1-Blue, JM109, HMS174, HMS174(DE3)와 같은 원핵생물 세포 또는 유기체 및 임의의 천연 또는 조작된 대장균 종, 클렙시엘라 종 또는 슈도모나스 종 균주로부터 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인을 생산하는 방법은 CD71에 결합하는 단리된 FN3 도메인이 발현되도록 하는 조건하에 단리된 숙주 세포를 배양하는 단계 및 FN3 도메인을 정제하는 단계를 포함한다.
CD71에 결합하는 FN3 도메인은 잘 알려진 방법, 예를 들어, 단백질 A 정제, 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 재조합 세포 배양물로부터 정제될 수 있다.
일부 실시형태에서, CD71에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306의 아미노산 서열을 포함하되, 히스티딘 태그는 정제의 용이성을 위해 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 부착되었다. 일부 실시형태에서, 히스티딘 태그(His-태그)는 6개의 히스티딘 잔기(서열번호 309)를 포함한다. 추가 실시형태에서, His-태그는 적어도 하나의 글리신 잔기 또는 약 2개 내지 약 4개의 글리신 잔기에 의해 FN3 도메인에 연결된다. 따라서, FN3 도메인의 정제 및 폴리펩타이드로부터 His-태그의 절단 후, 하나 이상의 글리신이 N-말단 또는 C-말단에 남을 수 있다. 일부 실시형태에서, His-태그가 N-말단으로부터 제거되면, 모든 글리신이 제거된다. 일부 실시형태에서, His-태그가 C-말단에서 제거되면, 글리신 중 하나 이상이 유지된다.
일부 실시형태에서, CD71에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306의 아미노산 서열을 포함하되, N-말단 메티오닌은 FN3 도메인의 정제 후에도 유지된다.
키트
일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 FN3 도메인을 포함하는 키트가 제공된다.
키트는 치료적 용도 및 진단 키트로서 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 CD71에 결합하는 FN3 도메인 및 FN3 도메인을 검출하기 위한 시약을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 2가의 FN3 도메인을 포함한다. 키트는 사용 지침; 다른 시약, 예를 들어, 방사선 보호 조성물을 킬레이트화하거나 또는 그렇지 않으면 커플링하는 데 유용한 표지, 작용제; 이미징, 진단 또는 치료적 목적을 위한 투여를 위해 CD71에 결합하는 FN3 도메인을 제조하기 위한 장치 또는 기타 물질; 약제학적으로 허용 가능한 담체; 및 대상체에게 투여하기 위한 장치 또는 기타 물질을 포함하는 하나 이상의 다른 요소를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CD71에 결합하는 FN3 도메인을 포함한다.
CD71 결합 FN3 도메인의 용도
CD71에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인 또는 이의 접합체는 세포, 조직, 기관, 유체 또는 일반적으로 숙주에서 인간 질환 또는 특정 병리의 증상의 발병을 진단, 모니터링, 조절, 치료, 완화, 예방을 돕거나 또는 이의 증상을 감소시키는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, FN3 도메인은 근육 질환의 치료를 위해 CD71 양성 조직(예를 들어, 골격근, 평활근)으로의 전달을 용이하게 할 수 있다.
일부 실시형태에서, FN3 도메인은 면역학적 질환의 치료를 위해 활성화된 림프구, 수지상 세포, T-세포, NK 세포 및 B-세포 또는 다른 면역 세포로의 전달을 용이하게 할 수 있다.
일부 실시형태에서, CD71에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인 또는 이의 접합체는 또한 대상체에서 CD71 양성 종양 조직을 이미징하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법은 임의의 분류에 속하는 동물 환자에게 사용될 수 있다. 이러한 동물의 예는 인간, 설치류, 개, 고양이 및 농장 동물과 같은 포유동물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 암 조직의 세포에 의한 CD71의 발현에 기초하여 조직의 암이 있거나 또는 암이 발생할 가능성이 있는 대상체를 진단하는 방법, 면역요법의 성공을 예측하는 방법, 예후를 예측하는 방법 및 치료 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 종양 조직에서 CD71-발현 암세포를 검출하는 방법이 제공되며, 해당 방법은 대상체로부터 종양 조직의 샘플을 얻는 단계; 종양 조직의 작은(toe) 샘플을 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CD71에 결합하는 FN3 도메인과 접촉시킴으로써 CD71이 종양 조직에서 발현되는지 여부를 검출하는 단계 및 CD71과 FN3 도메인 사이의 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 CD71에 결합하는 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 해당 폴리펩타이드는 CD71에 결합하는 FN3 도메인이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306과 같은 서열, 또는 치료제에 연결되거나 또는 접합된 본 명세서에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, CD71 세포는 CNS 질환, MS 및 뇌의 감염성 질환과 같은 염증성/면역 질환과 관련된 세포이다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 폴리펩타이드는 중추 신경계에 대해 지시된다. 일부 실시형태에서, 신경학적 병태 및/또는 뇌종양의 치료를 필요로 하는 대상체에서 신경학적 병태 및/또는 뇌종양을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 CD71에 결합하는 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 해당 폴리펩타이드는 CD71에 결합하는 FN3 도메인이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306과 같은 서열, 또는 치료제에 연결되거나 또는 접합된 본 명세서에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 뇌종양은 비악성, 양성 및 악성 뇌종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 신경학적 병태 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병, 라포라병, 폼페병, 성인 폴리글루코산 소체병, 뇌졸중, 척수 손상, 운동 실조, 벨 마비, 뇌동맥류, 간질, 발작, 길랑-바레 증후군, 다발성 경화증, 근이영양증, 신경피부 증후군, 편두통, 뇌염, 패혈증 및 중증 근무력증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 폴리펩타이드는 근육 세포에 대해 지시된다. 일부 실시형태에서, 방법은 CD71에 결합하는 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 해당 폴리펩타이드는 CD71에 결합하는 FN3 도메인이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306과 같은 서열, 또는 치료제에 연결되거나 또는 접합된 본 명세서에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 폼페병(GSD2, 산 알파-글리코시데이스(GAA) 결핍)의 치료를 필요로 하는 대상체에서 폼페병을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 CD71에 결합하는 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 해당 폴리펩타이드는 CD71에 결합하는 FN3 도메인이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306과 같은 서열, 또는 치료제에 연결되거나 또는 접합된 본 명세서에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 글리코겐 축적 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 글리코겐 축적 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 글리코겐 축적 질환은 코리병 또는 포르브스병(GSD3, 글리코겐 탈분지 효소(AGL) 결핍), 맥아들병(GSD5, 근육 글리코겐 포스포릴레이스(PYGM) 결핍), II형 당뇨병/당뇨병성 신장증, 알돌레이스 A 결핍 GSD12, 라포라병, 저산소증, 안데르센병(GSD4, 글리코겐 탈분지 효소(GBE1) 결핍), 타루이병(GSD7, 근육 포스포프럭토카이네이스(PFKM) 결핍) 및 성인 폴리글루코산 소체병으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 글리코겐 축적 질환은 글리코겐 합성효소(GYS2) 결핍(GSD0), 글루코스-6-포스파테이스(G6PC/SLC37A4) 결핍(GSD1, 폰기르케병), 허스병(GSD6, 간 글리코겐 포스포릴레이스(PYGL) 또는 근육 포스포글리세레이트 뮤테이스(PGAM2) 결핍), 포스포릴레이스 카이네이스(PHKA2/PHKB/PHKG2/PHKA1) 결핍(GSD9), 포스포글리세레이트 뮤테이스(PGAM2) 결핍(GSD10), 근육 락테이트 데하이드로게네이스(LDHA) 결핍(GSD11), 판코니-비켈 증후군(GSD 11, 글루코스 수송체(GLUT2) 결핍, 알돌레이스 A 결핍(GSD 12), β-에놀레이스(ENO3) 결핍(GSD13) 및 글리코게닌-1(GYG1) 결핍(GSD15)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 폴리펩타이드는 면역 세포에 대해 지시된다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 폴리펩타이드는 수지상 세포, T-세포, NK 세포 또는 B-세포에 대해 지시된다. 일부 실시형태에서, 자가면역 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 CD71에 결합하는 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 해당 폴리펩타이드는 CD71에 결합하는 FN3 도메인이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306과 같은 서열, 또는 치료제에 연결되거나 또는 접합된 본 명세서에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 자가면역 질환은 류마티스성 관절염, 하시모토 자가면역성 갑상선염, 셀리악병, 제1형 당뇨병, 백반증, 류마티스성 열, 악성 빈혈/위축성 위염, 원형 탈모증 및 면역성 혈소판감소성 자반증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 조직은 CD71을 발현하는 임의의 기관 또는 해부학적 시스템의 조직일 수 있다.
일부 실시형태에서, CD71 발현은 면역조직화학 또는 ELISA와 같은 공지의 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
일부 실시형태에서, CD71 발현 세포를 단리하는 방법이 제공되며, 해당 방법은 대상체로부터 샘플을 얻는 단계; 샘플을 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CD71에 결합하는 FN3 도메인과 접촉시키는 단계 및 FN3 도메인에 결합된 세포를 단리하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 종양 조직에서 CD71-발현 암세포를 검출하는 방법이 제공되며, 해당 방법은 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CD71에 결합하는 FN3 도메인을 검출 가능한 표지에 접합시켜 접합체를 형성하는 단계; 접합체를 대상체에게 투여하는 단계; 및 접합체가 결합된 CD71 발현 암세포를 시각화하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 CD71에 결합하는 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 해당 폴리펩타이드는 CD71에 결합하는 FN3 도메인이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306과 같은 서열, 또는 치료제에 연결되거나 또는 접합된 본 명세서에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 암이 있는 대상체를 치료하는 방법이 제공되며, 해당 방법은 CD71에 결합하는 FN3 도메인을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, FN3 도메인은 치료제(예를 들어, 세포독성제, 올리고뉴클레오타이드, 예컨대, siRNA, 안티센스 등, 또 다른 표적에 결합하는 FN3 도메인 등)에 접합된다.
일부 실시형태에서, 대상체는 고형 종양을 갖는다.
일부 실시형태에서, 고형 종양은 흑색종이다.
일부 실시형태에서, 고형 종양은 폐암이다. 일부 실시형태에서, 고형 종양은 비소세포 폐암(NSCLC)이다. 일부 실시형태에서, 고형 종양은 편평 비소세포 폐암(NSCLC)이다. 일부 실시형태에서, 고형 종양은 비편평 NSCLC이다. 일부 실시형태에서, 고형 종양은 폐 선암종이다.
일부 실시형태에서, 고형 종양은 신세포 암종(RCC)이다.
일부 실시형태에서, 고형 종양은 중피종이다.
일부 실시형태에서, 고형 종양은 비인두 암종(nasopharyngeal carcinoma: NPC)이다.
일부 실시형태에서, 고형 종양은 결장직장암이다.
일부 실시형태에서, 고형 종양은 전립선암이다. 일부 실시형태에서, 고형 종양은 거세-저항성 전립선암이다.
일부 실시형태에서, 고형 종양은 위암(stomach cancer)이다.
일부 실시형태에서, 고형 종양은 난소암이다.
일부 실시형태에서, 고형 종양은 위암(gastric cancer)이다.
일부 실시형태에서, 고형 종양은 간암이다.
일부 실시형태에서, 고형 종양은 췌장암이다.
일부 실시형태에서, 고형 종양은 갑상선암이다.
일부 실시형태에서, 고형 종양은 두경부의 편평 세포 암종이다.
일부 실시형태에서, 고형 종양은 식도 또는 위장관의 암종이다.
일부 실시형태에서, 고형 종양은 유방암이다.
일부 실시형태에서, 고형 종양은 나팔관암이다.
일부 실시형태에서, 고형 종양은 뇌암이다.
일부 실시형태에서, 고형 종양은 요도암이다.
일부 실시형태에서, 고형 종양은 비뇨생식기암이다.
일부 실시형태에서, 고형 종양은 자궁내막증이다.
일부 실시형태에서, 고형 종양은 자궁경부암이다.
일부 실시형태에서, 고형 종양은 암의 전이성 병변이다.
일부 실시형태에서, 대상체는 혈액학적 악성 종양을 갖는다. 일부 실시형태에서, 혈액학적 악성 종양은 림프종, 골수종 또는 백혈병이다. 일부 실시형태에서, 혈액학적 악성 종양은 B 세포 림프종이다. 일부 실시형태에서, 혈액학적 악성 종양은 버킷 림프종이다. 일부 실시형태에서, 혈액학적 악성 종양은 호지킨 림프종이다. 일부 실시형태에서, 혈액학적 악성 종양은 비호지킨 림프종이다.
일부 실시형태에서, 혈액학적 악성 종양은 골수이형성 증후군이다.
일부 실시형태에서, 혈액학적 악성 종양은 급성 골수성 백혈병(AML)이다. 일부 실시형태에서, 혈액학적 악성 종양은 만성 골수성 백혈병(CML)이다. 일부 실시형태에서, 혈액학적 악성 종양은 만성 골수단핵구성 백혈병(CMML)이다.
일부 실시형태에서, 혈액학적 악성 종양은 다발성 골수종(MM)이다.
일부 실시형태에서, 혈액학적 악성 종양은 형질세포종이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물 또는 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여, 즉, 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 다른 또는 추가적인 치료제는 다른 항종양제 또는 치료제이다. 다양한 종양 유형 및 종양의 병기는 암의 치료에 유용한 다양한 보조적 화합물의 사용을 필요로 한다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 조성물은 특히 다양한 화학치료제, 예컨대, 탁솔, 타이로신 카이네이스 저해제, 류코보린, 플루오로우라실, 이리노테칸, 포스파테이스 저해제, MEK 저해제와 조합하여 사용될 수 있다. 조성물은 또한 특히 항-PD-1 또는 항-CTLA-4와 같은 종양에 대한 면역 반응을 조절하는 약물과 조합하여 사용될 수 있다. 추가적인 치료제는 PD-1 또는 PD-L1을 표적으로 하는 항체와 같이 면역계를 조절하는 작용제일 수 있다.
일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 폴리펩타이드는 중추신경계에 대해 지시된다. 일부 실시형태에서, 신경학적 병태 및/또는 뇌종양의 치료를 필요로 하는 대상체에서 신경학적 병태 및/또는 뇌종양을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 해당 방법은 CD71에 결합하는 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 해당 폴리펩타이드는 CD71에 결합하는 FN3 도메인이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306과 같은 서열, 또는 치료제에 연결되거나 또는 접합된 본 명세서에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 뇌종양은 비악성, 양성 및 악성 뇌종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 신경학적 병태는 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병, 라포라병, 폼페병, 성인 폴리글루코산 소체병, 뇌졸중, 척수 손상, 운동 실조, 벨 마비, 뇌동맥류, 간질, 발작, 길랑-바레 증후군, 다발성 경화증, 근이영양증, 신경피부 증후군, 편두통, 뇌염, 패혈증 및 중증 근무력증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 대상체에서 신경학적 병태 및/또는 뇌종양을 치료하는 방법으로서, 해당 방법은 CD71에 결합하는 FN3 도메인을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, FN3 도메인은 치료제(예를 들어, 세포독성제, 올리고뉴클레오타이드, 예컨대, siRNA, 안티센스 등, 또 다른 표적에 결합하는 FN3 도메인 등)에 접합된다.
일부 실시형태에서, 폼페병(GSD2, 산 알파-글리코시데이스(GAA) 결핍)의 치료를 필요로 하는 대상체에서 폼페병을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 CD71에 결합하는 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 해당 폴리펩타이드는 CD71에 결합하는 FN3 도메인이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306과 같은 서열, 또는 치료제에 연결되거나 또는 접합된 본 명세서에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체에서 폼페병(GSD2, 산 알파-글리코시데이스(GAA) 결핍)을 치료하는 방법은 CD71에 결합하는 FN3 도메인을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, FN3 도메인은 치료제(예를 들어, 세포독성제, 올리고뉴클레오타이드, 예컨대, siRNA, 안티센스 등, 또 다른 표적에 결합하는 FN3 도메인 등)에 접합된다.
일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 폴리펩타이드는 면역 세포에 대해 지시된다. 일부 실시형태에서, CD71에 결합하는 폴리펩타이드는 수지상 세포에 대해 지시된다. 일부 실시형태에서, 자가면역 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 CD71에 결합하는 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 해당 폴리펩타이드는 CD71에 결합하는 FN3 도메인이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306과 같은 서열, 또는 치료제에 연결되거나 또는 접합된 본 명세서에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 자가면역 질환은 류마티스성 관절염, 하시모토 자가면역성 갑상선염, 셀리악병, 제1형 당뇨병, 백반증, 류마티스성 열, 악성 빈혈/위축성 위염, 원형 탈모증 및 면역성 혈소판감소성 자반증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 대상체에서 자가면역 질환을 치료하는 방법은 CD71에 결합하는 FN3 도메인을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, FN3 도메인은 치료제(예를 들어, 세포독성제, 올리고뉴클레오타이드, 예컨대, siRNA, 안티센스 등, 또 다른 표적에 결합하는 FN3 도메인 등)에 접합된다.
일부 실시형태에서, CD71에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인 또는 이의 접합체는 세포, 조직, 기관, 체액 또는 일반적으로 숙주에서 인간 질환 또는 특정 병리의 증상을 진단, 모니터링, 조절, 치료, 완화, 발병의 예방을 돕거나 또는 감소시키는 데 사용될 수 있고, 또한 혈액 뇌 장벽을 통과할 수 있는 특성을 나타낸다. 혈액-뇌 장벽(BBB)은 대부분의 거대분자(예를 들어, DNA, RNA 및 폴리펩타이드) 및 많은 소분자가 뇌로 들어가는 것을 방지한다. BBB는 주로 매우 제한적인 밀착 연접을 갖는 특수한 내피 세포로 구성되어 있으며, 결과적으로, 혈액에서 중추신경계로의 크고 작은 물질의 통과가 BBB에 의해 제어된다. 이 구조는 많은 치료제가 BBB를 통해 바람직한 효율성으로 전달될 수 없기 때문에 신경학적 질환 및 장애(예를 들어, 뇌암)가 있는 환자의 치료 및 관리를 어렵게 만든다. BBB의 파괴와 관련된 추가적인 병태는 뇌졸중, 당뇨병, 발작, 고혈압성 뇌병증, 후천성 면역결핍 증후군, 외상성 뇌 손상, 다발성 경화증, 파킨슨병(PD) 및 알츠하이머병을 포함한다. 이 능력은 예를 들어: 성상세포종, 수아종, 신경교종, 뇌실막종, 배아종(송과선종), 다형성 교모세포종, 희소돌기아교종, 신경초종, 망막아세포종 및 선천성 종양; 또는 척수암, 예를 들어 신경섬유종, 수막종, 신경교종 및 육종을 포함하는 뇌암을 치료하는 데 특히 유용하다. 소정의 실시형태에서, 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306 중 하나의 아미노산 서열 또는 이의 접합체를 포함하는 CD71에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은, 예를 들어, 혈액 뇌 장벽을 통해 치료제 또는 세포독성제를 전달하는 데 유용하다.
일부 실시형태에서, BBB를 통해 치료제의 수송을 용이하게 할 수 있는 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306의 서열을 포함하는 단백질이다.
"치료하다" 또는 "치료"는 치료적 치료 및 예방적 조치를 지칭하되, 목적은 암의 발생 또는 확산과 같은 바람직하지 않은 생리학적 변화 또는 장애를 예방하거나 또는 늦추는(완화시키는) 것이다. 일부 실시형태에서, 유익한 또는 목적하는 임상 결과는 검출 가능하거나 또는 검출 가능하지 않은지 여부에 관계없이 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선 또는 경감 및 관해(부분적이든 또는 전체적이든)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않을 경우 예상되는 생존 기간과 비교하여 생존 기간을 연장하는 것을 의미할 수도 있다. 치료가 필요한 사람에는 이미 해당 병태나 장애가 있는 사람뿐만 아니라 해당 병태나 장애를 가지기 쉬운 사람 또는 해당 병태나 장애를 예방해야 하는 사람도 포함된다.
"치료학적 유효량"은 목적하는 치료적 결과를 달성하는 데 필요한 투여량 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. CD71에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인의 치료학적 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 유효한 CD71에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인의 예시적인 지표는 환자 웰빙의 개선, 종양 크기의 감소 또는 축소, 종양 성장의 정지 또는 둔화 및/또는 신체 다른 위치로의 암세포 전이의 부재이다.
투여/약제학적 조성물
일부 실시형태에서, CD71에 특이적으로 결합하며 선택적으로 본 명세서에 개시된 검출 가능한 표지, 치료제 또는 세포독성제에 접합된 FN3 도메인 및 약제학적으로 허용 가능한 담체의 약제학적 조성물이 제공된다. 치료 용도를 위해, CD71에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 약제학적으로 허용 가능한 담체에 활성 성분으로서 유효량의 도메인 또는 분자를 포함하는 약제학적 조성물로 제조될 수 있다. "담체"는 활성 화합물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 비히클은 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등과 같은 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것들을 포함하는 물 및 오일과 같은 액체일 수 있다. 예를 들어, 0.4% 식염수 및 0.3% 글리신이 사용될 수 있다. 이러한 용액은 멸균이며, 일반적으로 미립자 물질이 없다. 이들은 기존의 잘 알려진 멸균 기법(예를 들어, 여과)에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조절제 및 완충제, 안정화제, 증점제, 윤활제 및 착색제 등과 같은 생리학적 조건을 근사화하는 데 필요한 약제학적으로 허용 가능한 보조 물질을 포함할 수 있다. 이러한 약제학적 제형 내 본 명세서에 개시된 분자의 농도는 광범위하게, 즉, 약 0.5중량% 미만, 대체로 적어도 약 1중량% 내지 최대 15중량% 또는 20중량%까지 다양할 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식에 따라 필요한 용량, 액체 부피, 점도 등에 기초하여 선택될 것이다. 다른 인간 단백질, 예를 들어, 인간 혈청 알부민을 포함하는 적합한 비히클 및 제형은, 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092, 특히 pp. 958-989 참조]에 기술되어 있다.
본 명세서에 개시된 FN3 도메인의 치료 용도를 위한 투여 방식은 비경구 투여, 예를 들어, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내 또는 피하, 폐; 경점막(경구, 비강내, 질내, 직장), 정제, 캡슐, 용액, 분말, 겔, 입자 형태의 제형; 주사기, 이식 장치, 삼투압 펌프, 카트리지, 마이크로펌프; 또는 당업계에 잘 알려진 바와 같이 당업자가 인정하는 다른 수단에 포함된 제형을 사용하는 것과 같이 작용제를 숙주에게 전달하는 임의의 적합한 경로일 수 있다. 부위 특이적 투여는 예를 들어, 관절내, 기관지내, 복부내, 피막내, 연골내, 강내, 복내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 자궁경관내, 위내, 간내, 심장내, 골내, 골반내, 심낭내, 복강내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 윤활막내, 흉부내, 자궁내, 혈관내, 방광내, 병변내, 질, 직장, 협측, 설하, 비강내 또는 경피 전달에 의해 달성될 수 있다.
약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 포함하는 용기를 포함하는 키트로서 공급될 수 있다. 약제학적 조성물은, 예를 들어, 단일 또는 다중 용량을 위한 주사 가능한 용액의 형태로 또는 주사 전에 재구성될 멸균 분말로 제공될 수 있다. 대안적으로, 이러한 키트는 약제학적 조성물의 투여를 위한 건조 분말 분산기, 액체 에어로졸 발생기 또는 분무기를 포함할 수 있다. 이러한 키트는 약제학적 조성물의 적응증 및 사용법에 대한 서면 정보를 추가로 포함할 수 있다.
실시예
다음 예는 본 명세서에 개시된 실시형태를 예시한다. 이러한 예는 단지 설명의 목적으로 제공되고, 실시형태는 결코 이러한 예에 제한되는 것으로 해석되어서는 안 되며, 오히려 본 명세서에 제공된 교시의 결과로 증거가 되는 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 당업자는 본질적으로 유사한 결과를 산출하기 위해 변경되거나 수정될 수 있는 다양한 중요하지 않은 매개변수를 쉽게 인식할 것이다.
실시예 1. 무작위화된 루프를 갖는 텐콘 라이브러리의 구축
텐콘(서열번호 276)은 인간 테나신-C(Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012; 미국 특허 제8,278,419호)으로부터의 15개의 FN3 도메인의 컨센서스 서열로부터 설계된 면역글로불린-유사 스캐폴드인 파이브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인이다. 텐콘의 결정 구조는 7개의 베타-가닥을 연결하는 6개의 표면-노출된 루프를 보여준다. 각 루프 내의 이러한 루프 또는 선택된 잔기는 특정 표적에 결합하는 신규한 분자를 선택하는 데 사용될 수 있는 파이브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인의 라이브러리를 구축하기 위해 무작위화될 수 있다.
텐콘 스캐폴드 및 다양한 설계 전략을 사용하여 다양한 라이브러리를 생성하였다. 일반적으로, 라이브러리 TCL1 및 TCL2는 좋은 결합제를 생성하였다. TCL1 및 TCL2 라이브러리의 생성은 국제 공개 제WO/2014081944A2호에 상세히 기술되어 있다.
실시예 2: 대안적인 결합 표면을 갖는 텐콘 라이브러리의 생성
특정 라이브러리 설계에서 무작위화할 잔기의 선택은 생성된 상호작용 표면의 전체 모양을 좌우한다. BC, DE 및 FG 루프가 무작위화된 라이브러리로부터의 말토스 결합 단백질(MBP)에 결합하도록 선택된 스캐폴드 단백질을 포함하는 FN3 도메인의 X-선 결정학 분석은 MBP의 활성 부위에 맞는 크게 구부러진 경계면을 갖는 것으로 나타났다(Koide et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104: 6632-6637, 2007). 대조적으로, MBP에 결합하도록 선택된 안키린 반복 스캐폴드 단백질은 훨씬 더 평면적인 상호작용 표면을 갖고 활성 단백질로부터 떨어진 MBP의 외부 표면에 결합하는 것으로 밝혀졌다(Binz et al., Nat. Biotechnol. 22: 575-582, 2004). 이러한 결과는 스캐폴드 분자의 결합 표면의 모양(곡선 대 평면)이 스캐폴드에 의해 효과적으로 결합될 수 있는 표적 단백질 또는 표적 단백질 상의 특정 에피토프를 지시할 수 있음을 시사한다. 단백질 결합을 위한 FN3 도메인을 포함하는 단백질 스캐폴드를 조작하는 것에 관한 발표된 노력은 표적 결합을 위한 인접 루프를 조작하는 것에 의존하여 곡선형 결합 표면을 생성하였다. 이러한 접근법은 이러한 스캐폴드가 접근할 수 있는 표적 및 에피토프의 수를 제한할 수 있다.
텐콘 및 다른 FN3 도메인은 분자의 반대편에 있는 2세트의 CDR-유사 루프를 포함하며, 첫 번째 세트는 BC, DE 및 FG 루프에 의해 형성되고, 두 번째 세트는 AB, CD 및 EF 루프에 의해 형성된다. 2세트의 루프는 FN3 구조의 중심을 형성하는 베타-가닥에 의해 분리된다. 텐콘의 이미지를 90도로 회전시키면, 대체 표면을 시각화할 수 있다. 이러한 약간 오목한 표면은 CD 및 FG 루프 및 2개의 역평행 베타-가닥, C 및 F 베타-가닥에 의해 형성되며, 이는 본 명세서에서 C-CD-F-FG 표면이라고 한다. C-CD-F-FG 표면은 표면을 형성하는 잔기의 서브세트를 무작위화함으로써 단백질 스캐폴드 상호작용 표면의 라이브러리를 설계하기 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 베타-가닥은 단백질의 표면에 노출된 다른 모든 잔기의 측쇄와 반복 구조를 갖는다. 따라서, 라이브러리는 베타 가닥의 표면 노출된 잔기 일부 또는 전부를 무작위화함으로써 만들어질 수 있다. 베타-가닥에서 적절한 잔기를 선택함으로써, 텐콘 스캐폴드의 자체 고유성은 최소한으로 손상되는 동시에 다른 단백질과의 상호작용을 위한 고유한 스캐폴드 표면을 제공하여야 한다.
이러한 라이브러리를 구축하는 데 사용되는 방법에 대한 전체 설명은 미국 공개 제2013/0226834호에 기술되어 있다.
텐콘27에서 C-CD-F-FG 표면을 형성하는 2개의 베타 가닥은 무작위화될 수 있는 총 9개의 표면 노출된 잔기; C-가닥: S30, L32, Q34, Q36; F-가닥: E66, T68, S70, Y72 및 V74를 갖는 반면, CD 루프는 6개의 잠재적인 잔기: S38, E39, K40, V41, G42 및 E43을 갖고, FG 루프는 7개의 잠재적인 잔기: K75, G76, G77, H78, R79, S80 및 N81을 갖는다. 22개의 잔기가 모두 무작위화된 경우 라이브러리의 이론적인 크기가 더 크기 때문에, TCL14 설계에 포함하기 위해 선택된 잔기를 선택하였다.
텐콘에서 13개의 위치를 무작위화를 위해 선택하였다: C-가닥에서 L32, Q34 및 CD-루프에서 Q36, S38, E39, K40 및 F-가닥에서 V41, T68, S70 및 Y72, FG-루프에서 H78, R79 및 N81. C 및 F 가닥에서, S30 및 E66는 CD 및 FG 루프 바로 너머에 있고 분명히 C-CD-F-FG 표면의 일부인 것으로 보이지 않으므로 무작위화하지 않았다. CD 루프의 경우, G42 및 E43은 글리신으로 무작위화하지 않아 유연성을 제공하고, 루프 영역에서 유용할 수 있으며, E43은 표면의 교차점에 있다. FG 루프에는 K75, G76, G77 및 S80을 제외하였다. 위와 같은 이유로 글리신을 제외하였으며, 결정 구조를 면밀히 조사한 결과 S80은 코어와 주요 접촉을 형성하여 안정적인 FG 루프 형성을 돕는 것으로 나타났다. K75는 C-CD-F-FG 표면의 표면과 마주하고 있지 않으며, 무작위화에 덜 매력적인 후보였다. 위에 언급된 잔기는 원래 TCL14 설계에서 무작위화되지 않았지만, 이들은 새로운 선택을 위한 추가적인 다양성을 제공하거나 또는, 예를 들어, 선택된 TCL14 표적 특이적 히트(hit)에 대한 친화도 성숙 라이브러리를 위해 후속 라이브러리 디자인에 포함될 수 있다.
TCL14의 생산 이후, 유사한 디자인의 3개의 추가적인 텐콘 라이브러리를 생산하였다. 이들 2개의 라이브러리 TCL19, TCL21 및 TCL23를 TCL14(상기 참조)와 동일한 위치에서 무작위화하였지만, 이들 위치에서 발생하는 아미노산의 분포는 변경되었다. TCL19 및 TCL21을 시스테인 및 메티오닌만을 제외하고 모든 위치(각각 5.55%)에서 18개의 천연 아미노산이 동일하게 분포되도록 설계하였다. TCL23은 각각 무작위화된 위치가 기능적 항체의 HCDR3 루프에서 발견되는 아미노산 분포와 유사하도록 설계하였다(Birtalan et al., J. Mol. Biol. 377: 1518-1528, 2008). TCL21 라이브러리와 마찬가지로, 시스테인 및 메티오닌은 제외하였다.
다른 라이브러리의 잠재적인 표적 결합 표면을 확장하기 위해 세 번째 추가적인 라이브러리를 구축하였다. 이 라이브러리 TCL24에서, 라이브러리 TCL14, TCL19, TCL21 및 TCL23과 비교하여 4개의 추가적인 텐콘 위치를 무작위화하였다. 이들 위치는 D 가닥으로부터의 N46 및 T48 및 G 가닥으로부터의 S84 및 I86을 포함한다. 46번, 48번, 84번 및 86번 위치는 이들 잔기의 측쇄가 베타-가닥 D 및 G로부터 표면 노출되고 C 및 F 가닥의 무작위화된 부분에 인접하여 표적 단백질에 결합하기 위해 접근 가능한 표면적이 증가하기 때문에 특별히 선택되었다. TCL24에 대한 각 위치에서 사용된 아미노산 분포는 TCL19 및 TCL21에 대해 설명된 것과 동일하다.
TCL21, TCL23 및 TCL24 라이브러리의 생성
아미노산 분포를 제어하기 위해 Colibra 라이브러리 기술(Isogenica)을 사용하여 TCL21 라이브러리를 생성하였다. 아미노산 분포를 제어하기 위해 Slonomics 기술(Morphosys)을 사용하여 TCL19, TCL23 및 TCL24 유전자 단편을 생성하였다. 루프 라이브러리에 대해 위에 기재된 바와 같이 CIS-디스플레이 시스템(Odegrip et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 2806-2810, 2004)을 사용한 선택에 사용하기 위해 PCR을 사용하여 초기 합성 후 각 라이브러리를 증폭시킨 다음 RepA에 대한 유전자에 결찰시켰다.
실시예 3: CD71에 결합하는 파이브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인의 선택
패닝 및 생화학적 스크리닝
N-말단 6His 태그(서열번호 309)를 갖는 재조합 바이오티닐화된 CD71 세포외 도메인(Sino Biologics)을 사용하여 CIS-디스플레이(Odegrip et al 2004)를 통해 인간 CD71에 특이적인 FN3 도메인을 선택하였다. 시험관내 전사 및 번역(ITT)을 위해, FN3 도메인 라이브러리 TCL18, TCL19, TCL21, TCL23 및 TCL24로부터의 DNA 3㎍을 사용하였으며, 비결합된 라이브러리 구성원은 세척하여 제거하였다. 가열에 의해 표적 단백질로부터 DNA를 용리하고, 추가 라운드의 패닝을 위해 KOD 폴리머레이스를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 각 라운드 동안 표적 CD71의 농도를 400nM 내지 100nM로 연속적으로 낮추고 세척 엄격성을 증가시켜 고친화성 결합제를 단리하였다. 5라운드 패닝으로부터의 결과물에 오프-레이트(off-rate) 선택을 위한 4회의 추가적인 라운드를 적용하였다. 바이오티닐화된 표적 항원 농도는 6라운드 및 7라운드에서 25nM로, 8라운드 및 9라운드에서 2.5nM로 감소하였다.
패닝 후, 선택된 FN3 도메인을 암호화하는 유전자를 PCR로 증폭시키고, 라이게이스 독립적 클로닝 부위를 포함하도록 변형된 pET 벡터에 서브클로닝하고, 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 대장균에서의 가용성 발현을 위해 BL21(DE3)(Stratagene) 세포에 형질전환시켰다. C-말단 폴리-히스티딘 태그를 암호화하는 유전자 서열을 각 FN3 도메인에 첨가하여 정제 및 검출을 가능하게 하였다.
CD71에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인을 스크리닝하기 위해, 스트렙타비딘-코팅된 Maxisorp 플레이트(Nunc 카탈로그 436110)를 Starting Block T20(Pierce)에서 1시간 동안 차단한 다음, 바이오티닐화된 CD71(패닝에서와 동일한 항원을 사용) 또는 음성 대조군(관련되지 않은 Fc-융합된 재조합 단백질 및 인간 혈청 알부민)으로 1시간 동안 코팅하였다. 플레이트를 TBST로 헹구고, 희석된 용해물을 플레이트에 1시간 동안 적용하였다. 추가적인 헹굼 후, 웰을 HRP-접합된 항-V5 태그 항체(Abcam, ab1325)로 1시간 동안 처리한 다음, POD(Roche, 11582950001)로 검정하였다. 스트렙타비딘 대조군보다 적어도 10-배 높은 ELISA 신호를 갖는 FN3 도메인 용해물로부터의 DNA를 시퀀싱하여 9라운드의 스크리닝으로부터 단리된 23개의 고유하고 판독 가능한 FN3 도메인 서열을 얻었다.
크기 배제 크로마토그래피 분석
크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 항-CD71 FN3 도메인의 응집 상태를 결정하였다. 각각의 정제된 FN3 도메인의 분취량(10㎕)을 PBS(pH 7.4)의 이동상에서 0.3 ㎖/분의 유속으로 Superdex 75 5/150 칼럼(GE Healthcare)에 주입하였다. 칼럼으로부터의 용리를 280㎚에서 흡광도에 의해 모니터링하였다. 각 실행에 대조군으로서 텐콘 단백질을 포함시켰다. Agilent ChemStation 소프트웨어를 사용하여 용리 프로파일을 분석하였다.
고속대량 발현 및 접합
확인된 클론을 24 웰 딥 블록 플레이트에서 5ml의 배양물을 2회 반복하여 성장시켰다. 간략하게는, 50 ㎍/㎖ 카나마이신이 보충된 5 ㎖/웰의 TB 배지에 150㎕의 밤새 배양물을 시딩하고, 220rpm(OD600 내지 1)에서 진탕하면서 37℃에서 약 3시간 동안 성장시켰다. 배양물을 IPTG를 사용하여 37℃, 220rpm에서 추가로 4시간 동안 1mM의 최종 농도로 유도하였다. 세균 펠릿을 2250xg에서 15분 동안 원심분리하여 회수하였다. 0.2 ㎎/㎖의 라이소자임(Sigma)이 보충된 600 ㎕/웰의 BugBuster HT(Novagen)를 각 웰에 첨가하고; 펠릿을 피펫으로 분리한 다음, 펠릿이 용해될 때까지 약 30분 동안 플랫폼 진탕기 위에서 격렬하게 진탕하였다. 플레이트를 2250xg에서 15분 동안 회전시켜 용해물을 투명하게 만들고, 각 샘플에 대해 2개의 600㎕의 분취량을 합하였다. His-태깅된 FN3 도메인을 제조업체의 지침에 따라 His Trap 플레이트(GE)에서 정제한 후, Zeba Spin 7K 탈염 플레이트(Thermo Scientific)를 사용하여 TBS로 완충액을 교환하였다. Nanodrop으로 단백질 농도를 평가하였다. GlyGly-VC-MMAF(서열번호 310)에 접합시키기 위해, FN3 도메인(30μM)을 150μM GlyGlyVC-MMAF(서열번호 310)(Concortis) 및 1μM Sortase A와 200㎕의 총 부피로 혼합하였다. 실온에서 1.5시간 동안 접합시키고, 제조업체의 지침에 따라 GE Healthcare의 96 웰 His Multitrap HP 플레이트를 사용하여 다시 정제하였다. Zeba 탈염 플레이트를 사용하여 완충액을 PBS로 교환한 후, Multiscreen HTS GV 플레이트(Durapore)를 사용하여 멸균 여과하고, 3000xg에서 2분 동안 원심분리하였다. Nanodrop으로 농도를 평가하였다.
CD71 매개성 SK-BR3 세포 살해 검정.
시스테인 변이체-세포독소 접합체에 노출시킨 후 CD71-과발현 인간 종양 세포주 H1573 w/SKBR3의 생존력을 측정하여 세포 살해를 평가하였다. 검은색 웰의 투명한 바닥 조직 배양-처리된 플레이트(Falcon 353219)에서 5% 소태아 혈청(Gibco)을 포함한 100 ㎕/웰의 페놀 레드가 없는 RPMI 배지(Gibco11835-030)에 7000/웰로 세포를 플레이팅하였다. 가습된 5% CO2 분위기의 37℃에서 세포를 밤새 부착시켰다. 96-웰 플레이트에서 배지를 흡인하고, 세포를 50㎕의 새로운 배지 및 50㎕의 새로운 배지로 구성된 2X 저해제로 처리하였다. 70시간에 Cell TiterGlo(Promega)를 사용한 종점 검정으로 세포 생존력을 결정하였다. GraphPad Prism 5(GraphPad Software)를 사용하여 가변 기울기를 갖는 S자형 용량 반응에 대한 방정식에 데이터를 피팅함으로써 IC50 값을 결정하였다.
용량-반응 ELISA에 의한 선택된 클론의 결합
선택된 클론을 ELISA로 분석하여 결합에 대한 EC50 값을 결정하였다. 간략하게는, Maxisorb 플레이트를 5 ㎎/㎖의 스트렙타비딘으로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 그런 다음, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 StartingBlock(ThermoFisher)으로 차단한 다음, TBS-Tween으로 세척하였다. 바이오티닐화된 CD71(2 ㎎/㎖)을 스트렙타비딘 플레이트에서 포획하고, 연속 희석된 FN3 단백질을 실온에서 1시간 동안 적절한 웰에 첨가하였다. 세척 후, HRP 및 POD 기질과 발광 플레이트 판독기에 접합된 항-V5 태그 항체를 사용하여 결합된 FN3 단백질을 검출하였다. 발광 값을 농도의 함수로서 플로팅하고 PRISM을 사용하여 용량 반응에 피팅하여 결합에 대한 EC50 값을 결정하였다.
독소 접합체를 통한 FN3 도메인 내재화의 확인. FN3 도메인을 NEM 접합에 대해 설명된 방법론을 사용하여 효소-절단 가능한 Val-Cit 링커 또는 절단 불가능한 PEG4 링커(VC-MMAF)를 통해 세포독성 튜불린 저해제 모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF)에 접합하였다. 시스테인 변이체-세포독소 접합체에 노출 후 SKBR-3 세포의 생존력을 측정함으로써 세포 살해를 평가하였다. 흰색 웰의 불투명한 바닥 조직 배양-처리된 플레이트(Fisher, PI15042)에서 10% 소태아 혈청(Gibco)을 포함한 50 ㎕/웰의 페놀 레드 RPMI 배지(Gibco, 11875093)에 3000/웰로 세포를 플레이팅하였다. 세포를 가습된 5% CO2 분위기의 37℃에서 밤새 부착시켰다. 세포를 25㎕의 새로운 배지 및 새로운 배지로 구성된 25㎕의 4Х 저해제로 처리하였다. 72시간에 Cell TiterGlo(Promega)를 사용한 종점 검정에 의해 세포 생존력을 결정하였다. GraphPad Prism(GraphPad Software)을 사용하여 가변 기울기를 갖는 S자형 용량 반응에 대한 방정식에 데이터를 피팅함으로써 IC50 값을 결정하였다.
2가 FN3 단백질
4개의 반복 G/S 링커 또는 다른 적절한 폴리펩타이드 링커에 의해 연결된 2개의 FN3 도메인을 사용하여 2가 FN3 단백질을 생산하였다. 2가 FN3 단백질을 기재된 바와 같이 VC-MMAF에 접합시키고, SK-BR3 세포에서 세포독성에 대해 평가하였다. 2가 분자에 대한 IC50 값은 종종 1가 버전보다 더 나은 것으로 밝혀졌다.
트랜스페린 결합에 대한 경쟁 및 내재화
위에 설명된 세포독성 검정을 사용하여 인간 트랜스페린과의 경쟁에 대해 FN3 도메인 vcMMAF 접합체를 스크리닝하였다. 0.6μM holo-인간 트랜스페린(T0665-100MG)의 부재 또는 존재하에 FN3 도메인을 스크리닝하였다.
pHrodo-Tf 검정
트랜스페린 수용체에 대한 결합에 대해 트랜스페린과 경쟁하는 능력에 대해 CD71-표적화 센티린을 평가하였다. 산성 구획에서 형광을 발하므로 엔도솜 및 라이소솜 구획으로의 세포 흡수 시 눈에 보이는 염료인 pHrodo-Red에 직접 접합된 트랜스페린으로 세포를 처리하였다
Incucyte에서 pHrodo-트랜스페린(pHrodo-Tf)의 이미징을 수행하여 Tf 흡수를 실시간으로 측정하였다. 세포를 pHrodo-Tf 및 CD71 결합을 위해 Tf와 경쟁하는 분자와 함께 인큐베이션하면, pHrodo 신호가 감소되거나 또는 제거된다. CD71 결합을 위해 Tf와 경쟁하지 않는 센티린은 pHrodo 신호에 영향을 미치지 않는다.
실시예 4: CD71에 결합하고 트랜스페린과 경쟁하지 않는 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인의 선택
트랜스페린과 경쟁하지 않거나 최소한으로 경쟁하는 CD71 결합 FN3 도메인을 확인하기 위해, 편향된 CIS-디스플레이 전략을 설계하였다. 간단히 말해서, 인간 CD71의 ECD에 대한 5라운드 패닝 후에 회수된 산출량을 사용하여(실시예 3), 1) 최종 용리 단계 전에 트랜스페린과 동일한 부위에 결합된 FN3 도메인을 용리시키기 위해 인간 holo 트랜스페린을 사용한 세척 단계 또는 2) 단일클론 항체 OKT9를 가진 FN3 도메인 결합체의 용리를 추가하여 실시예 3에 기재된 바와 같이 추가적인 라운드의 오프-레이트 선택을 수행하였다. 트랜스페린 세척 전략 및 OKT9 용리 전략으로부터 회수된 FN3 도메인을 이전에 설명한 대로 PCR 증폭시키고 pET 벡터에 클로닝하였다(실시예 3). huCD71에 특이적으로 결합된 228개의 FN3 도메인은 huCD71 ECD에 대한 결합에 대해 용액 ELISA에 의해 확인되었다. 고유한 결합체의 서브세트를 SEC로 분석하고, MMAF에 접합시킨 다음, SKBR-3 세포 +/- holo 인간 트랜스페린에서 세포 생존력 검정을 통해 내재화에 대해 평가하였다. 폴리펩타이드는 수용체에 의해 내재화되는 것으로 밝혀졌다. Integral Molecular는 인간 막 단백질의 라이브러리에 대한 ABX1198(서열번호 209), ABX1142(서열번호 209 + His-태그) 및 ABX1100(서열번호 209 + 링커가 있는 siRNA 쌍)의 특이성을 프로파일링하기 위해 막 프로테옴 어레이(MPA) 검정을 수행하였다. MPA 라이브러리에는 GPCR, 이온 채널 및 수송체를 포함한 모든 단일 통과, 다중 통과 및 GPI 고정 단백질의 94%를 포함하여 6000개 이상의 인간 막 단백질이 포함되어 있으며, 각각의 막 단백질은 조류 QT6 세포 배경에서 고유하게 발현된다. 유세포 측정법은 고정되지 않은 세포에서 개별적으로 발현되는 막 단백질에 결합하는 리간드(FN3 도메인)를 직접 검출하는 데 사용된다.
ABX1198(서열 번호: 209), ABX1142(서열번호 209 + His-태그) 및 ABX1100(서열번호 209 + 링커가 있는 siRNA 쌍)을 MPA에 대해 1.25 ㎍/㎖, 1.25 ㎍/㎖ 및 0.31 ㎍/㎖의 최적의 신호/배경 잡음 비를 갖는 농도에서 스크리닝하였다. 스크리닝에서 확인된 막 단백질 표적은 리간드 연속 희석 및 확인된 표적으로 개별적으로 형질감염된 세포를 사용하여 검증 절차에서 추적하였다.
실시예 5. CD71 FN3 도메인-올리고뉴클레오타이드 접합체를 사용한 근육 세포에서 mRNA의 넉다운.
muCD71 결합 FN3 도메인은 FN3 도메인에 고유하게 조작된 시스테인을 통해 말레이미드 화학을 사용하여 siRNA 올리고뉴클레오타이드 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO)에 접합하였다. 시스테인 치환은 본 명세서에 제공된 것과 같은 것일 수 있으며, 또한 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 미국 공개 제20150104808호에 제공된 것과 같은 것일 수 있다. siRNA 또는 ASO는 표준 화학적 변형으로 변형되었으며, 시험관내에서 표적화된 mRNA의 넉다운이 가능하다는 것이 확인되었다. FN3 도메인-올리고뉴클레오타이드 접합체는 최대 10 ㎎/㎏ 올리고뉴클레오타이드 페이로드의 용량으로 마우스에 정맥내 투여하였다. 투여 후 다양한 시점에서 마우스를 희생시키고; 골격근, 심장 근육 및 기타 다양한 조직은 회수하여 필요할 때까지 RNAlater™(Sigma Aldrich)에 보관될 것이다. 표적 유전자 넉다운은 표준 qPCR ΔΔCT 방법과 표적 유전자 및 대조군 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 평가하였다. 표적 유전자는 근육에서 넉다운되는 것으로 밝혀졌으며, 이러한 넉다운은 siRNA 또는 ASO를 CD71 FN3 결합 도메인에 접합시킴으로써 향상된다.
실시예 6. 친화도 성숙 패닝:
선택적 CD71 첨단 도메인 결합을 보인 4개의 서열(A, B, C 및 D)가 친화도 성숙 라이브러리의 기초였다. 각 서열에서, 확장된 시트 라이브러리의 일부인 4개의 아미노산(이중 밑줄)을 18개의 아미노산(프롤린, 메티오닌을 포함하지 않는, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 라이신, 페닐알라닌, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 또는 발린)으로 무작위화하였다. 새로운 라이브러리는 a) 트랜스페린 세척; b) OKT9 용리; c) 첨단 도메인 선택; d) 첨단 도메인, CD71_ECD 선택의 4라운드에 대해 선택을 거쳤다. 아래 서열번호 288 내지 291의 서열을 참조한다.
실시예 7: FN3-siRNA 접합 및 정제
말레이미드 변형된 siRNA를 사용하여 시스테인-특이적 화학을 통해 시스테인 변형된 FN3 CD71-49(서열번호 272)를 ABX0214(표 6)에 접합시켜 ABX1005를 제조하였다. 시스테인-말레이미드 접합을 위해, PBS 중 시스테인-함유 FN3 도메인 50μM 내지 200μM을 실온(30분)에서 10mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP)으로 환원시켜 유리 티올을 생성하였다. TCEP를 제거하기 위해, 포화 암모늄 설페이트 용액으로 FN3 단백질을 침전시킨 다음, 직전에 물에 용해시킨 말레이미드-변형된 siRNA 이중체와 약 1.5:1의 FN3-단백질:siRNA 몰비로 혼합하였다. RT 또는 37℃에서 1시간 인큐베이션한 후, N-에틸 말레이미드(반응 혼합물에서 1mM 최종 NEM 농도)로 반응을 중지시켰다.
FN3-siRNA 접합체를 IMAC 크로마토그래피(HisTrap HP)를 사용하여 미반응된 siRNA 링커를 제거하고 음이온 교환 크로마토그래피-Capto-DEAE를 사용하여 미반응된 FN3 단백질을 제거하는 2단계로 정제하였다. FN3-단백질-siRNA 접합체를 PAGE, 분석적 크기 배제 크로마토그래피 및 LC/MS로 특성화하였다. Nanodrop을 사용하여 260에서 접합체 용액의 흡광도를 기준으로 접합체의 농도를 계산하였다.
마우스에서 FN3-siRNA 생체내 활성
수컷 CD-1 마우스에 1회 또는 3회 정맥내 투여로 10mpk siRNA의 ABX1005(siRNA에 접합된 CD71 FN3 도메인) 또는 등몰 용량의 ABX1007(FN3-단독 대조군)을 처리하였다. 최종 투여 2주 후에 조직을 수집하고, 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)에 의한 AHA-1 넉다운 분석을 위해 처리하였다. 18S 리보솜 RNA를 RT-PCR 내인성 대조군 유전자로서 사용하였다. 넉다운의 수준을 비히클-처리된 마우스와 비교하였다. AHA-1의 siRNA-매개성 넉다운이 본 연구에서 분석된 모든 근육 그룹(비복근, 대퇴사두근, 심장)에서 관찰되었다(도 1).
수컷 C57/BL6 마우스를 10mpk, 3mpk 또는 1mpk siRNA의 ABX1005의 단일 정맥내 투여로 처리하였다. 단일 투여 2주 후에 조직을 수집하고, 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)에 의한 AHA-1 넉다운 분석을 위해 처리하였다. 18S 리보솜 RNA를 RT-PCR 내인성 대조군 유전자로서 사용하였다. 넉다운의 수준을 비히클-처리된 마우스와 비교하였다. AHA-1의 용량-의존적 넉다운이 본 연구에서 분석된 모든 근육 그룹(비복근, 대퇴사두근, 횡격막, 심장)에서 관찰되었다(도 2).
이들 실시예는 본 명세서에 제공된 CD71에 결합하는 FN3 도메인과 같은 FN3 도메인에 접합된 siRNA 분자가 siRNA 분자뿐만 아니라 다른 활성 모이어티를 특정 조직에 전달하고 특정 표적의 발현을 조절하는 데 사용될 수 있음을 보여준다.
실시예 8: CD71 FN3 도메인 siRNA 접합체 결합 특이성.
Integral Molecular(www.integralmolecular.com)는 인간 막 단백질의 라이브러리에 대한 CD71 FN3 도메인 및 CD71 FN3 도메인 siRNA 접합체의 특이성을 프로파일링하기 위해 독점적인 막 프로테옴 어레이(MPA) 검정을 수행하였다(도 3). MPA에는 6000개 이상의 인간 막 단백질이 포함되어 있으며, 이는 조류 QT6 세포 배경에서 고유하게 발현되는 각 막 단백질과 함께 GPCR, 이온 채널 및 수송체를 포함한 모든 단일 통과, 다중 통과 및 GPI 고정 단백질의 94%를 포괄한다. 고정되지 않은 세포에서 개별적으로 발현된 막 단백질에 결합하는 FN3 도메인을 직접 검출하기 위해 유세포 측정법을 사용하였다.
FN3 도메인 및 FN3 도메인-siRNA 접합체는 MPA에 대해 각각 1.25 ㎍/㎖ 또는 0.31 ㎍/㎖의 최적 신호/배경 잡음 비를 갖는 농도에서 스크리닝되었다. 스크리닝에서 확인된 막 단백질 표적은 확인된 표적을 고유하게 발현하는 세포에 대한 리간드 연속 희석을 사용하여 검증되었다.
실시예 9: CD71 센티린 접합체 및 CD71 단일클론 항체 접합체의 생체내 비교.
본 연구에서의 목적은 AHA1 siRNA와 접합된 단일클론 항체 R17와 비교하여 도구 센티린-AHA1 접합체의 약력학적 활성 기간을 결정하는 것이다. C57BL6/J 수컷 마우스에, 10mg AHA1 siRNA를 포함하는 17.9mg의 도구 센티린-AHA1 siRNA 접합체 또는 10mg AHA1 siRNA를 포함하는 AHA1 siRNA와 접합된 120mg 단일클론 항체 R17의 단일 정맥내 볼루스를 투여하였다. 어떤 방향으로든 0.5㎝를 초과하지 않는 비복근 근육 조직을 나중에 RNA의 양호한 침투를 보장하기 위해 투여 후 2주, 4주 및 8주 시점(N=3/시점)에서 수집하고, 4℃에서 24시간 동안 보관한 후 -80℃에서 보관하였다. Qiagen RNeasy 섬유 조직 키트를 사용하여 총 RNA를 비복근으로부터 단리하였다. 실시간 정량적 PCR을 사용하여, 표적 AHA1 및 내인성 대조군, Pgk1의 발현 수준을 측정하였다. 비히클만 투여한 대조군 동물에 대해 정규화된 ΔΔCt 방법을 사용하여 데이터를 분석하였다. 처리 그룹의 각 동물에 대한 AHA1 및 Pgk1의 유전자 발현 수준을 3-비히클 대조군의 평균을 기준으로 제공하였다. 도구 AHA1-siRNA 접합체 처리 그룹 및 AHA1 siRNA 처리 그룹과 접합된 단일클론 항체 R17에서 AHA1 mRNA의 백분율 넉다운은 남아 있는 AHA1 mRNA 수준의 백분율에서 100을 빼서 측정하였다.
CD71 센티린 접합체는 mAb 접합체 용량의 일부에서 지속적인 유전자 넉다운을 유도한다. C57/B6 마우스에 단일 용량(10 mg/kg siRNA)의 테스트 접합체를 투여하였다. 투여 후 2주, 투여 후 4주 및 투여 후 8주에 비복근 근육에서 AHA1의 상대 RNA 발현을 측정하였다. 도 4 및 표 7은 근육에서의 mRNA 넉다운에 대한 동등한 활성을 입증하는 데이터를 제시하지만 CD71 센티린 접합체는 훨씬 적은 접합체 용량을 필요로 한다.
실시예 10: 센티린-siRNA 접합체는 사이노몰구스 원숭이(마카카 파스시쿨라리스) 골격근 및 심장에서 활성이다
NeutrAvidin 코팅된 96-웰 플레이트(Pierce, 15116)를 PBS-Tween(0.05%)으로 세척하고, 차단 완충액(Starting Block T20, ThermoFisher 37539)으로 30분 동안 차단하였다. 바이오티닐화된 항원(인간 CD71-ECD[Acro Biosystems TFR-H8243] 또는 사이노 CD71-ECD[Acro Biosystems TFR-C8249])을 차단된 플레이트에 20nM의 농도로 고정시키고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 센티린 샘플을 차단 완충액에 희석하고, 1000nM에서 0.0169nM까지 적정하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-Tween으로 세척하였다. 차단 완충액에서 1:2500으로 제조된 항-센티린 항체를 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-Tween으로 세척하였다. 항-토끼 HRP 항체를 차단 완충액에서 1:2500으로 제조하고, 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, SpectraMax Paradigm에서 ELISA 기질(Roche, 11582950001)을 사용하여 판독하였다. 도 5 및 표 8은 CD71 센티린뿐만 아니라 CD71 센티린 접합체가 인간 및 사이노 CD71 모두에 효과적으로 결합하며 siRNA 접합체 CD71 센티린 결합을 방해하지 않는다는 것을 입증하는 데이터를 제시한다.
본 연구의 목적은 사이노몰구스 원숭이 모델에서 센티린-AHA1 siRNA 접합체의 약력학적(PD) 활성을 결정하기 위한 것이다. 2마리의 수컷 사이노몰구스 원숭이에게 10mpk AHA1 siRNA를 포함하는 17.12mpk 센티린-AHA1 siRNA 접합체(N=2) 또는 비히클(N=2)을 IV 볼루스를 통해 오른쪽 복재 정맥에 주 1회 3주 동안 처리하였다. 마지막 투여 4주 후, 골격근 조직(왼쪽 및 오른쪽 비복근, 왼쪽 및 오른쪽 대퇴사두근, 횡격막, 왼쪽 및 오른쪽 이두근, 비장근), 평활근 조직(공장), 왼쪽 및 오른쪽 심장 및 비골격근 조직(피부, 간 및 신장)을 수거하고, 나중에 RNA가 잘 침투할 수 있도록 나중에 RNA를 보관하고, 4℃에서 24시간 동안 보관하였다. Qiagen RNeasy 섬유 조직 키트를 사용하여 이들 조직으로부터 총 RNA를 단리하였다. 표적 AHA1 및 내인성 대조군(ARL1, ARFGAP2, HPRT1, GAPDH 및 Gys1)의 발현 수준을 실시간 정량적 PCR로 측정하였다. 비히클만을 투여한 대조군 동물에 대해 정규화된 ΔΔCt 방법을 사용하여 데이터를 분석하였다. 분석을 위해 평균 2개 샘플(조직의 각 측면으로부터 1개의 생검) 또는 1개 샘플(1 생검)을 채취하였다. 센티린-AHA1 siRNA 접합체 처리 그룹 및 비히클 그룹에서 AHA1 mRNA의 넉다운 백분율은 남아 있는 AHA1 mRNA 수준의 백분율에서 100을 빼서 측정하였다. 각 조직에서, AHA1 넉다운의 백분율은 AHA1 넉다운이 가장 높은 것부터 가장 적은 것의 순서로 표시된다.
센티린-siRNA AHA1 접합체는 사이노몰구스 원숭이 근육 및 심장에서 생체내 mRNA 수준을 효과적으로 넉다운시켰으며, 도 6을 참조한다. 원숭이에게 주당 3회 10 mg/kg의 siRNA를 투여하였다. mRNA 수준은 3회 투여 후 제28일에 평가하였다.
일반적인 방법
분자 생물학의 표준 방법은 문헌[Sambrook, Fritsch and Maniatis (1982 & 1989 2nd Edition, 2001 3rd Edition) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3 rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA)]에 기술되어 있다. 표준 방법은 문헌[Ausbel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols.1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY, which describes cloning in bacterial cells and DNA mutagenesis (Vol. 1), cloning in mammalian cells and yeast (Vol. 2), glycoconjugates and protein expression (Vol. 3), and bioinformatics (Vol. 4)]에도 나타나 있다.
면역침전, 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리 및 결정화를 포함하는 단백질 정제 방법이 기술되어 있다(Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York). 화학적 분석, 화학적 변형, 번역-후 변형, 융합 단백질 생산, 단백질의 글리코실화가 기술되어 있다(예를 들어, 문헌[Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391] 참조). 다중클론 및 단클론 항체의 생산, 정제 및 단편화가 기술되어 있다(Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; 상기 Harlow and Lane). 리간드/수용체 상호작용을 특성화하기 위한 표준 기법을 사용할 수 있다(예를 들어, 문헌[Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York] 참조).
본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 개별 간행물, 데이터베이스 항목(예: Genbank 서열 또는 GeneID 항목), 특허 출원 또는 특허가 참조에 의해 원용되도록 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 참조에 의해 원용된다. 참조에 의해 원용된 본 명세서는 모든 개별 출판물, 데이터베이스 항목(예: Genbank 서열 또는 GeneID 항목), 특허 출원 또는 특허와 관련하여 37 C.F.R. §1.57(b)(1)에 따라 출원인에 의해 의도되며, 각각은 해당 인용이 참조에 의해 원용된다는 전용 설명 바로 옆에 있지 않은 경우에도 37 C.F.R. §1.57(b)(2)에 따라 명확하게 식별된다. 명세서 내에 참조에 의해 원용된다는 전용 설명이 포함되어 있다고 해서 참조에 의해 원용된다는 일반적인 설명이 어떤 식으로든 약화되지는 않는다. 본 명세서에서 참고문헌을 인용한다고 해서 해당 참고문헌이 관련 선행 기술임을 인정하는 것은 아니며, 이러한 간행물이나 문서의 내용이나 날짜에 대한 인정을 의미하지도 않는다.
본 실시형태는 본 명세서에 기재된 특정 실시형태에 의해 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 본 명세서에 기술된 것 외에 실시형태의 다양한 변형이 전술한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 속하도록 의도되었다.
전술한 명세서는 당업자가 실시형태를 실시하는 데 충분한 것으로 간주된다. 본 명세서에 도시되고 설명된 것 외에 실시형태의 다양한 변형은 전술한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이며 첨부된 청구범위의 범위 내에 속한다.
SEQUENCE LISTING <110> ARO BIOTHERAPEUTICS COMPANY <120> CD71 BINDING FIBRONECTIN TYPE III DOMAINS <130> WO2022221505 <140> PCT/US2022/024773 <141> 2022-04-14 <150> 63/324,431 <151> 2022-03-28 <150> 63/174,752 <151> 2021-04-14 <160> 311 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe 20 25 30 Pro Ile Thr Tyr Ile Glu Ala Val Val Leu Gly Glu Ala Ile Val Leu 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Pro Val Gly Ile Ser Gly Val Lys Gly Gly His Asn 65 70 75 80 Ser Met Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 90 <210> 2 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu 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Synthetic polypeptide <400> 16 Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe 20 25 30 Gly Ile Ala Tyr Arg Glu Phe Arg Pro Ser Gly Glu Ala Ile Val Leu 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Val Glu Thr Gly 50 55 60 Tyr Arg Asn Glu Val Val Ile Cys Gly Val Lys Gly Gly Pro Trp Ser 65 70 75 80 Gly Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 17 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 17 Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe 20 25 30 Pro Ile Leu Tyr Thr Glu Cys Val Tyr Arg Gly Glu Ala Ile Val Leu 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr His Val Pro Ile Thr Gly Val Lys Gly Gly Gly Gly 65 70 75 80 Ser Trp Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 90 <210> 18 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 89 Met Leu Pro Ala Pro Glu Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe 20 25 30 Trp Ile Glu Tyr Tyr Glu Gly Val Ile Gln Gly Glu Ala Ile Val Leu 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Phe Val Ala Ile Trp Gly Val Lys Gly Gly Lys Trp 65 70 75 80 Ser Val Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 90 <210> 90 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 90 Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Trp Gln Gly Val Ala Arg Ala Phe Asp Ser Phe 20 25 30 Leu Ile Thr Tyr Arg Glu Gln Ile Phe Ala Gly Glu Val Ile Val Leu 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Pro Val Trp Ile Gln Gly Val Lys Gly Gly Ser Pro 65 70 75 80 Ser Ala Glu Phe Thr Thr 85 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 109 Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe 20 25 30 His Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Tyr Thr Phe Gly Glu Ala Ile Tyr Leu 35 40 45 Arg Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Arg Val Val Ile Gly Gly Val Lys Gly Gly Trp Phe 65 70 75 80 Ser Glu Pro Leu Leu Ala Ala Phe Thr Thr 85 90 <210> 110 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 110 Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe 20 25 30 Phe Ile Gly Tyr Leu Glu Pro Gln Pro Pro Gly Glu Ala Ile Tyr Leu 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Asn Val Thr Ile Gln Gly Val Lys Gly Gly Phe Pro 65 70 75 80 Ser Tyr Pro Leu Asp Ala Ser Phe Thr Thr 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 129 Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe 20 25 30 Tyr Ile Ala Tyr Ala Glu Pro Arg Pro Asp Gly Glu Ala Ile Asn Leu 35 40 45 Trp Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Ser Val Leu Ile His Gly Val Lys Gly Gly Leu Leu 65 70 75 80 Ser Ser Pro Leu Asp Ala Ser Phe Thr Thr 85 90 <210> 130 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 130 Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe 20 25 30 Val Ile Glu Tyr Phe Glu Trp Thr Leu Asn Gly Glu Ala Ile Val Leu 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Ser Val Gln Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly Cys Leu 65 70 75 80 Ser Arg Pro Leu Ser Ala Ile 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 149 Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe 20 25 30 Tyr Ile Ala Tyr Ala Glu Pro Arg Pro Asp Gly Glu Ala Ile Gln Leu 35 40 45 Trp Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Ser Val Leu Ile His Gly Val Lys Gly Gly Leu Leu 65 70 75 80 Ser Ser Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 90 <210> 150 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 150 Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Arg Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe 20 25 30 Tyr Ile Ala Tyr Ala Glu Pro Arg Pro Asp Gly Glu Ala Ile Val Leu 35 40 45 Ile Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Ser Val Leu Ile His Gly Val Lys Gly Gly Leu Leu 65 70 75 80 Ser Ser Pro 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 220 Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Pro Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe 20 25 30 Tyr Ile Ala Tyr Ala Glu Pro Arg Pro Asp Gly Glu Ala Ile His Leu 35 40 45 Leu Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Ser Val Leu Ile His Gly Val Lys Gly Gly Leu Leu 65 70 75 80 Ser Ser Pro Leu Lys Arg Leu Ser Pro Pro Val Val Thr Ile Thr Ile 85 90 95 Thr Met Ala Val Cys Arg Lys Pro Val Ala Glu Asn Leu Ser Gln Thr 100 105 110 Leu Ser <210> 221 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 221 Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe 20 25 30 Phe Ile Gly Tyr Leu Glu Pro Gln Pro Pro Gly Glu Ala Ile Phe Leu 35 40 45 Asp Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly 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<400> 267 Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe 20 25 30 Tyr Ile Ala Tyr Ala Glu Pro Arg Pro Asp Gly Glu Ala Ile Gly Leu 35 40 45 Trp Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Ser Val Leu Ile His Gly Val Lys Gly Gly Leu Leu 65 70 75 80 Ser Ser Pro Leu Val Ala Tyr Phe Thr Thr 85 90 <210> 268 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 268 Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe 20 25 30 Tyr Ile Ala Tyr Ala Glu Pro Arg Pro Asp Gly Glu Ala Ile Tyr Leu 35 40 45 Glu Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Ser Val Leu Ile His Gly Val Lys Gly Gly Leu Leu 65 70 75 80 Ser Ser Pro Leu Phe Thr Thr 85 <210> 269 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 269 Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe 20 25 30 Tyr Ile Ala Tyr Ala Glu Pro Arg Pro Asp Gly Glu Ala Ile Trp Leu 35 40 45 Asp Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Ser Val Leu Ile His Gly Val Lys Gly Gly Leu Leu 65 70 75 80 Ser Ser Pro Leu Asp Ala Tyr Phe Thr Thr 85 90 <210> 270 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 270 Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe 20 25 30 Ala Ile Glu Tyr Cys Glu Thr Lys Met Cys Gly Glu Ala Ile Val Leu 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Arg Val Pro Ile Pro Gly Val Lys Gly Gly 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Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Trp Val Gly Ile Asp Gly Val Lys Gly Gly Arg Trp 65 70 75 80 Ser Thr Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 90 <210> 273 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (33)..(33) <223> D, F, Y, or H <220> <221> MOD_RES <222> (35)..(35) <223> Y, G, A, or V <220> <221> MOD_RES <222> (37)..(37) <223> I, T, L, A, or H <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> S, Y or P <220> <221> MOD_RES <222> (40)..(40) <223> Y, G, Q, or R <220> <221> MOD_RES <222> (41)..(41) <223> G or P <220> <221> MOD_RES <222> (42)..(42) <223> A, Y, P, D, or S <220> <221> MOD_RES <222> (47)..(47) <223> A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W, or Y <220> <221> MOD_RES <222> (49)..(49) <223> A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W, or Y <220> <221> MOD_RES <222> (69)..(69) <223> W, N, S, or E <220> <221> MOD_RES <222> (71)..(71) <223> L, Y, or G <220> <221> MOD_RES <222> (73)..(73) <223> D, Q, H, or V <220> <221> MOD_RES <222> (74)..(74) <223> G or S <220> <221> MOD_RES <222> (79)..(79) <223> R, G, F, L, or D <220> <221> MOD_RES <222> (80)..(80) <223> W, S, P, or L <220> <221> MOD_RES <222> (82)..(82) <223> T, V, M, or S <220> <221> MOD_RES <222> (85)..(85) <223> A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W, or Y <220> <221> MOD_RES <222> (87)..(87) <223> A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W, or Y <400> 273 Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe 20 25 30 Xaa Ile Xaa Tyr Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Ala Ile Xaa Leu 35 40 45 Xaa Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Xaa Val Xaa Ile Xaa Xaa Val Lys Gly Gly Xaa Xaa 65 70 75 80 Ser Xaa Pro Leu Xaa Ala Xaa Phe Thr Thr 85 90 <210> 274 <211> 291 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 274 Met Thr Lys Glu Tyr Gln Asp Leu Gln His Leu Asp Asn Glu Glu Ser 1 5 10 15 Asp His His Gln Leu Arg Lys Gly Pro Pro Pro Pro Gln Pro Leu Leu 20 25 30 Gln Arg Leu Cys Ser Gly Pro Arg Leu Leu Leu Leu Ser Leu Gly Leu 35 40 45 Ser Leu Leu Leu Leu Val Val Val Cys Val Ile Gly Ser Gln Asn Ser 50 55 60 Gln Leu Gln Glu Glu Leu Arg Gly Leu Arg Glu Thr Phe Ser Asn Phe 65 70 75 80 Thr Ala Ser Thr Glu Ala Gln Val Lys Gly Leu Ser Thr Gln Gly Gly 85 90 95 Asn Val Gly Arg Lys Met Lys Ser Leu Glu Ser Gln Leu Glu Lys Gln 100 105 110 Gln Lys Asp Leu Ser Glu Asp His Ser Ser Leu Leu Leu His Val Lys 115 120 125 Gln Phe Val Ser Asp Leu Arg Ser Leu Ser Cys Gln Met Ala Ala Leu 130 135 140 Gln Gly Asn Gly Ser Glu Arg Thr Cys Cys Pro Val Asn Trp Val Glu 145 150 155 160 His Glu Arg Ser Cys Tyr Trp Phe Ser Arg Ser Gly Lys Ala Trp Ala 165 170 175 Asp Ala Asp Asn Tyr Cys Arg Leu Glu Asp Ala His Leu Val Val Val 180 185 190 Thr Ser Trp Glu Glu Gln Lys Phe Val Gln His His Ile Gly Pro Val 195 200 205 Asn Thr Trp Met Gly Leu His Asp Gln Asn Gly Pro Trp Lys Trp Val 210 215 220 Asp Gly Thr Asp Tyr Glu Thr Gly Phe Lys Asn Trp Arg Pro Glu Gln 225 230 235 240 Pro Asp Asp Trp Tyr Gly His Gly Leu Gly Gly Gly Glu Asp Cys Ala 245 250 255 His Phe Thr Asp Asp Gly Arg Trp Asn Asp Asp Val Cys Gln Arg Pro 260 265 270 Tyr Arg Trp Val Cys Glu Thr Glu Leu Asp Lys Ala Ser Gln Glu Pro 275 280 285 Pro Leu Leu 290 <210> 275 <211> 230 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 275 Gln Asn Ser Gln Leu Gln Glu Glu Leu Arg Gly Leu Arg Glu Thr Phe 1 5 10 15 Ser Asn Phe Thr Ala Ser Thr Glu Ala Gln Val Lys Gly Leu Ser Thr 20 25 30 Gln Gly Gly Asn Val Gly Arg Lys Met Lys Ser Leu Glu Ser Gln Leu 35 40 45 Glu Lys Gln Gln Lys Asp Leu Ser Glu Asp His Ser Ser Leu Leu Leu 50 55 60 His Val Lys Gln Phe Val Ser Asp Leu Arg Ser Leu Ser Cys Gln Met 65 70 75 80 Ala Ala Leu Gln Gly Asn Gly Ser Glu Arg Thr Cys Cys Pro Val Asn 85 90 95 Trp Val Glu His Glu Arg Ser Cys Tyr Trp Phe Ser Arg Ser Gly Lys 100 105 110 Ala Trp Ala Asp Ala Asp Asn Tyr Cys Arg Leu Glu Asp Ala His Leu 115 120 125 Val Val Val 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<220> <221> SITE <222> (1)..(25) <223> This sequence may encompass 1-5 "Gly Gly Gly Gly Ser" repeating units <400> 280 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 281 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 281 Ala Pro Ala Pro 1 <210> 282 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 282 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 10 <210> 283 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 283 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ala Pro Ala Pro 20 <210> 284 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 284 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 20 25 30 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 35 40 <210> 285 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 285 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala 20 25 <210> 286 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 286 ucucguggcc uuaaugaaa 19 <210> 287 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 287 uucauuaagg ccacgagauu 20 <210> 288 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 288 Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe 20 25 30 Tyr Ile Ala Tyr Ala Glu Pro Arg Pro Asp Gly Glu Ala Ile Val Leu 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Ser Val Leu Ile His Gly Val Lys Gly Gly Leu Leu 65 70 75 80 Ser Ser Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 90 <210> 289 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 289 Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe 20 25 30 Phe Ile Gly Tyr Leu Glu Pro Gln Pro Pro Gly Glu Ala Ile Val Leu 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Asn Val Thr Ile Gln Gly Val Lys Gly Gly Phe Pro 65 70 75 80 Ser Met Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 90 <210> 290 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 290 Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp 1 5 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Synthetic polypeptide <400> 292 Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe 20 25 30 Ala Ile Val Tyr His Glu Pro Arg Pro Asp Gly Glu Ala Ile Val Leu 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Cys Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Glu Val Val Ile Leu Gly Val Lys Gly Gly Val His 65 70 75 80 Ser Tyr Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro 85 90 95 Ala Pro Ala Pro Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val 100 105 110 Thr Glu Asp Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe 115 120 125 Asp Ser Phe Ala Ile Val Tyr His Glu Pro Arg Pro Asp Gly Glu Ala 130 135 140 Ile Val Leu Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly 145 150 155 160 Leu Lys Pro Gly Thr Glu Tyr Glu Val Val Ile Leu Gly Val Lys Gly 165 170 175 Gly Val His Ser Tyr Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 180 185 <210> 293 <211> 199 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 293 Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe 20 25 30 Ala Ile Val Tyr His Glu Pro Arg Pro Asp Gly Glu Ala Ile Val Leu 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Cys Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Glu Val Val Ile Leu Gly Val Lys Gly Gly Val His 65 70 75 80 Ser Tyr Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly 85 90 95 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Pro 100 105 110 Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser Ala Arg 115 120 125 Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Ala Ile Val 130 135 140 Tyr His Glu Pro Arg Pro Asp Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr Val Pro 145 150 155 160 Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly Thr Glu 165 170 175 Tyr Glu Val Val Ile Leu Gly Val Lys Gly Gly Val His Ser Tyr Pro 180 185 190 Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 195 <210> 294 <211> 199 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 294 Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe 20 25 30 Ala Ile Val Tyr His Glu Pro Arg Pro Asp Gly Glu Ala Ile Val Leu 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Cys Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Glu Val Val Ile Leu Gly Val Lys Gly Gly Val His 65 70 75 80 Ser Tyr Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr Glu Ala Ala Ala Lys Glu 85 90 95 Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Leu Pro 100 105 110 Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser Ala Arg 115 120 125 Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Ala Ile Val 130 135 140 Tyr His Glu Pro Arg Pro Asp Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr Val Pro 145 150 155 160 Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly Thr Glu 165 170 175 Tyr Glu Val Val Ile Leu Gly Val Lys Gly Gly Val 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Claims (53)

  1. 서열번호 273의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306 중 2개를 포함하는, 폴리펩타이드.
  4. CD71에 대한 트랜스페린 결합과 경쟁하지 않는 CD71의 부위에서 인간 CD71에 결합하는 폴리펩타이드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 273의 서열을 갖는 폴리펩타이드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
  6. 제4항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306의 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 검출 가능한 표지, 올리고뉴클레오타이드, 치료제 또는 이들의 임의의 조합에 접합되는, 폴리펩타이드.
  8. 제7항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 방사성 동위원소, 자성 비드, 금속 비드, 콜로이드 입자, 형광 염료, 전자-밀집 시약, 효소, 바이오틴, 다이곡시게닌 또는 합텐인, 폴리펩타이드.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 아우리스타틴, 모노메틸 아우리스타틴 페닐알라닌, 돌로스타틴, 화학치료제, 약물, 성장 저해제, 독소 또는 방사성 동위원소인, 폴리펩타이드.
  10. 제7항에 있어서, 상기 치료제는 화학치료제, 약물, 항체, 성장 저해제, 독소, 방사성 동위원소, 항-튜불린제, 폴리뉴클레오타이드, siRNA 분자 또는 이의 센스 또는 안티센스 가닥, 안티센스 분자 또는 이의 가닥, RNA 분자, DNA 분자, DNA 마이너 그루브 결합제, DNA 복제 저해제, 알킬화제, 항생제, 항엽산제, 항대사제, 화학요법 증감제, 토포아이소머레이스 저해제 또는 빈카 알칼로이드인, 폴리펩타이드.
  11. 제7항에 있어서, 상기 치료제는 유전자 발현, RNA 발현 또는 수준, 튜불린 결합, DNA 결합, 토포아이소머레이스 저해, DNA 가교, 킬레이트화, 스플라이소솜 저해, NAMPT 저해 또는 HDAC 저해를 조절함으로써 하나 이상의 세포독성 효과를 유발할 수 있는, 폴리펩타이드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 N-말단에 메티오닌을 추가로 포함하는, 폴리펩타이드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 반감기 연장 모이어티에 커플링되는, 폴리펩타이드.
  14. 제13항에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티는 알부민 결합 분자, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 알부민, 알부민 변이체, 면역글로불린의 Fc 영역의 적어도 일부인, 폴리펩타이드.
  15. 제14항에 있어서, 상기 알부민 결합 분자는 알부민 또는 알부민 변이체에 결합하는 제2 폴리펩타이드인, 폴리펩타이드.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  17. 제16항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  18. 제17항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  19. CD71에 결합하는 폴리펩타이드를 생산하는 방법으로서, 상기 폴리펩타이드가 발현되는 조건하에서 제18항의 단리된 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 폴리펩타이드를 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  21. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드에 결합하는 항-이디오타입 항체.
  22. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 포함하는 키트.
  23. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306과 같은 본 명세서에 제공된 폴리펩타이드를 치료제와 함께 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 암은 뇌암인, 방법.
  25. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 항바이러스제, 면역계 조절제 또는 핵산 분자와 접합된 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306과 같은 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 암 질환은 교모세포종인, 방법.
  27. 종양 조직에서 CD71-발현 암세포를 검출하는 방법으로서,
    a) 대상체로부터 상기 종양 조직의 샘플을 얻는 단계; 및
    b) 상기 종양 조직의 샘플을 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 접촉시키고, CD71와 폴리펩타이드 사이의 결합을 검출함으로써 CD71이 상기 종양 조직에서 발현되는지 여부를 검출하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  28. CD71 발현 세포를 단리하는 방법으로서,
    a) 대상체로부터 샘플을 얻는 단계;
    b) 샘플을 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계, 및
    c) 상기 폴리펩타이드에 결합된 세포를 단리하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  29. 종양 조직에서 CD71-발현 암세포를 검출하는 방법으로서,
    a) 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 검출 가능한 표지에 접합시켜 접합체를 형성하는 단계;
    b) 상기 접합체를 상기 대상체에게 투여하는 단계; 및
    c) 상기 접합체가 결합된 CD71 발현 암세포를 시각화하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  30. 신경학적 병태 및/또는 뇌종양을 치료하는 방법으로서, 제20항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 뇌종양은 비악성, 양성 및 악성 뇌종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 악성 뇌종양은 성상세포종, 수아종, 신경교종, 뇌실막종, 배아종(송과선종), 다형성 교모세포종, 희소돌기아교종, 신경초종, 망막아세포종 또는 척수암, 예를 들어 신경섬유종, 수막종, 신경교종 및 육종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  33. 제31항에 있어서, 상기 뇌종양은 선천성 종양인, 방법.
  34. 제30항에 있어서, 상기 신경학적 병태는 뇌졸중, 당뇨병, 발작, 고혈압성 뇌병증, 후천성 면역결핍 증후군, 외상성 뇌 손상, 다발성 경화증, 파킨슨병(Parkinson's disease: PD) 및 알츠하이머병으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  35. 관심 작용제를 CD71 양성 세포에 전달하는 방법으로서, 세포를 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드와 같은 CD71에 결합하는 FN3 도메인에 커플링된 관심 작용제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 관심 작용제는 CD71 매개성 상호작용을 통해 세포에 내재화되는, 방법.
  37. 제35항에 있어서, 상기 FN3 도메인은 CD71에 대한 트랜스페린 결합과 경쟁하지 않는, 방법.
  38. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 작용제는 화학치료제, 약물, 성장 저해제, 독소, 방사성 동위원소, 항-튜불린제, 폴리뉴클레오타이드, siRNA 분자, 안티센스 분자, RNA 분자, DNA 분자, DNA 마이너 그루브 결합제, DNA 복제 저해제, 알킬화제, 항생제, 항엽산제, 항대사제, 화학요법 증감제, 토포아이소머레이스 저해제 또는 빈카 알칼로이드인, 방법.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FN3 도메인은 서열번호 1 내지 7, 10, 12 내지 219, 221 내지 272, 292 내지 299 또는 304 내지 306의 서열을 포함하는, 방법.
  40. 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 근육 세포인, 방법.
  41. 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 뇌 세포 또는 혈액 뇌 장벽 내의 세포인, 방법.
  42. CD71에 대한 트랜스페린 결합과 경쟁하거나 또는 이를 저해하지 않는 부위에서 CD71에 결합하는 FN3 단백질을 확인하는 방법으로서,
    트랜스페린 또는 상기 CD71 트랜스페린 결합 부위에 결합하는 작용제의 존재하에 상기 CD71을 테스트 FN3 단백질과 접촉시키는 단계; 및
    트랜스페린 또는 상기 CD71 트랜스페린 결합 부위에 결합하는 작용제의 존재하에 CD71에 결합하는 상기 테스트 FN3 단백질을 확인하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 트랜스페린 또는 상기 CD71 트랜스페린 결합 부위에 결합하는 작용제의 존재하에 CD71에 결합하는 상기 테스트 FN3 단백질을 단리하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 트랜스페린 또는 상기 CD71 트랜스페린 결합 부위에 결합하는 작용제의 존재하에 CD71에 결합하는 상기 테스트 FN3 단백질을 시퀀싱하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스페린 또는 상기 CD71 트랜스페린 결합 부위에 결합하는 작용제의 존재하에 CD71에 결합하는 상기 테스트 FN3 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 제조하거나 또는 얻는 단계를 더 포함하는, 방법.
  46. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스페린 또는 상기 CD71 트랜스페린 결합 부위에 결합하는 작용제의 존재하에 CD71에 결합하는 상기 테스트 FN3 단백질을 암호화하는 핵산 서열로부터 트랜스페린 또는 상기 CD71 트랜스페린 결합 부위에 결합하는 작용제의 존재하에 CD71에 결합하는 상기 테스트 FN3 단백질을 발현시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 테스트 FN3 단백질은 세포에서 발현되는, 방법.
  48. 제46항에 있어서, 상기 발현된 테스트 FN3 단백질을 단리 및/또는 정제하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  49. 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따라 확인된 FN3 단백질.
  50. 제49항의 FN3 단백질을 포함하는 약제학적 조성물.
  51. 제49항의 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  52. 제51항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  53. 제52항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
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