CN116802213A - 重组cd3结合蛋白及其用途 - Google Patents

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C·瑞驰恩
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Abstract

本发明涉及包含对CD3具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白。此外，本发明涉及编码此类结合蛋白的核酸、包含此类结合蛋白或核酸的药物组合物，以及此类结合蛋白、核酸或药物组合物在T细胞的疾病定位激活方法中以及在治疗包括人在内的哺乳动物的疾病诸如感染性疾病或癌症的方法中的用途。

Description

重组CD3结合蛋白及其用途
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2020年12月16日提交的US 63/126,356、2020年12月22日提交的EP20216705以及2021年4月30日提交的US 63/182,394的优先权权益。这些专利申请的公开内容全文以引用方式并入本文用于所有目的。
技术领域
本发明涉及包含对CD3具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白。此外，本发明涉及编码此类结合蛋白的核酸、包含此类结合蛋白或核酸的药物组合物，以及此类结合蛋白、核酸或药物组合物在T细胞的疾病定位激活方法中以及在治疗包括人在内的哺乳动物的疾病诸如感染性疾病或癌症的方法中的用途。
背景技术
T细胞在适应性免疫应答中起重要作用，并且特异性识别感染细胞或癌细胞中的外源蛋白。这种识别通过T细胞受体(TCR)发生，该T细胞受体结合由主要组织相容性复合物(MHC)展示的外源蛋白抗原。尽管TCR配体通常相对弱地结合，但即使少量的配体也足以完全激活T细胞(Birnbaum等人，Proc Natl Acad Sci U S A；111(49):17576-81(2014)；Davis等人，Annu Rev Immunol；16:523-44(1998))。T细胞受体本身不发出信号，但它与通常包含CD3εγ和CD3εδ异源二聚体以及CD3ζζ同源二聚体的多亚基信号传导装置非共价缔合，它们共同形成TCR/CD3复合物。由于其在免疫适应性应答中的关键作用，这种多蛋白TCR/CD3复合物已经吸引了在癌症免疫疗法中开发新治疗工具的浓厚兴趣。这些工具中有T细胞接合物。
T细胞接合物(TCE)是一种蛋白质，其同时结合到例如肿瘤细胞上的靶抗原和T细胞上的TCR/CD3复合物，从而通过绕过正常的TCR-MHC相互作用而触发T细胞激活(Ellerman,Methods；154:102-117(2019))。TCE的示例是分子(Amgen)。
目前，T细胞接合物通常具有针对TCR/CD3复合物的恒定组分(诸如CD3)和肿瘤相关抗原(TAA)的双特异性抗体或抗体片段的形式。然而，这些接合T细胞的治疗工具存在若干缺点，诸如高生产成本以及不能靶向多种疾病相关抗原，同时还具有引起某些严重副作用的风险，诸如细胞因子释放综合征(CRS)(Shimabukuro-Vornhagen等人，J ImmunotherCancer；6(1):56(2018)；Labrjin等人，Nat Rev Drug Discov；18(8):585-608(2019))和靶向/肿瘤外毒性(Weiner等人，Cancer Res.；55(20):4586–4593(1995)；Weiner等人，CancerImmunol.Immunother.；42(3)；141–150(1996))。例如，在非人灵长类动物中测试了靶向EGFR的TCE，其安全发现涉及与表达较低水平的抗原的正常组织的接合(Lutterbuese等人，Proc Natl Acad Sci U S A；107(28):12605-10(2010))。另外，靶向HER的TCE的高亲和力CD3结合物被证明优先分配到次级淋巴组织，减少全身暴露(Mandikian等人，Mol.CancerTher.；17(4):776LP-785(2018))。当与天然TCR-MHC相互作用相比时，基于抗体的T细胞接合物通常显示出对CD3的亲和力高1000倍以上(Wu等人，Pharmacol Ther；182:161–75(2018)；WO2014/167022；Junntila等人，Cancer Res.；19:5561–71(2014)；Yang等人，JImmunol Aug.；15(137):1097–100(1986))。就T细胞激活和肿瘤细胞杀伤而言，这种高亲和力与较低的效率相关(Bortoletto等人，Eur.J.Immunol.32；11:3102–3107(2002)；Ellerman,Methods；154:102-117(2019)；Mandikian等人，Mol.Cancer Ther.；17(4):776LP-785(2018)；Vafa等人，Frontiers in Oncology；10:446(2020))。
因此，仍然需要具有适于以T细胞接合物形式使用的有益特性的新CD3特异性结合蛋白，以及受益于CD3特异性结合的用于治疗包括癌症和感染性疾病在内的疾病的治疗方法。
发明内容
本发明提供了包含对CD3具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白。还提供了连接到一种或多种结合剂、优选地锚蛋白重复结构域的此类结合蛋白，其具有对疾病相关抗原(DAA)(诸如例如，感染相关抗原(IAA)，优选地病毒相关抗原(VAA)，或肿瘤相关抗原(TAA))的结合特异性，这促进结合蛋白对T细胞的DAA依赖性激活。此外，本发明提供了编码此类结合蛋白的核酸和包含此类结合蛋白或核酸的药物组合物。本发明还提供了此类结合蛋白、核酸或药物组合物在用于T细胞的定位激活(例如，肿瘤定位或感染定位激活)的方法中以及在治疗包括人在内的哺乳动物的疾病诸如感染性疾病、优选地病毒感染性疾病或癌症的方法中的用途。
本申请人进行了专门的研究以设计、生成和选择适合用于T细胞接合物药物并具有有益特性的CD3特异性结合结构域(参见下文)。作为复杂筛选过程、随后若干轮亲和力成熟与合理设计的组合的结果，对四种CD3特异性锚蛋白重复蛋白进行了工程化，即蛋白质#1(SEQ ID NO:1)、蛋白质#2(SEQ ID NO:2)、蛋白质#3(SEQ ID NO:3)和蛋白质#4(SEQ ID NO:4)。这些重组结合蛋白都包含经设计的锚蛋白重复结构域，其对CD3具有结合特异性，同时对CD3和/或T细胞显示出不同的结合亲和力。结合蛋白对CD3和/或对T细胞具有足够高的结合亲和力以实现靶向T细胞激活，并且同时相对低，使得副作用(例如，由过多T细胞激活引起)的风险降低。据发现，这些重组结合蛋白适于连接到一种或多种DAA特异性结合剂以形成功能性T细胞接合物(TCE)分子，包括多特异性TCE。因此，本发明的结合蛋白还可包含对疾病相关抗原具有结合特异性的结合剂。这种TCE形式的结合蛋白能够以定位和靶向方式接合免疫系统，更具体地接合T细胞，具体取决于疾病相关细胞诸如肿瘤细胞或感染细胞上相应DAA的存在。因此，包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域(诸如SEQ ID NO:1、2、3或4或其变体)的本发明结合蛋白代表CD3特异性结合蛋白的“工具箱”，其尤其在TCE药物候选物的生成和治疗人类疾病的方法中使用，该方法涉及有效激活T细胞，同时避免或减少T细胞的过度刺激和/或副作用。
在一个方面，本发明提供了一种包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，该锚蛋白重复模块具有选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:5至9，以及(2)其中SEQ ID NO:5至9中的任一者中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块是第一锚蛋白重复模块，并且其中所述锚蛋白重复结构域还包含第二锚蛋白重复模块，该第二锚蛋白重复模块具有选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:5至9，以及(2)其中SEQ ID NO:5至9中的任一者中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个具体实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:5，以及(2)其中SEQ ID NO:5中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且其中所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:6，以及(2)其中SEQ ID NO:6中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在另一个具体实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且其中所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQID NO:6，以及(2)其中SEQ ID NO:6中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在另一个具体实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且其中所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ IDNO:8，以及(2)其中SEQ ID NO:8中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在另一个具体实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且其中所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ IDNO:9，以及(2)其中SEQ ID NO:9中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个优选的实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N末端。
在一个方面，本发明提供了一种重组结合蛋白，该重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且其中SEQ ID NO:1至4的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:1至4的最后一个位置处的A任选地被N取代。
在一个实施方案中，所述结合蛋白中任一者在PBS中以低于10-7M的解离常数(KD)结合人CD3。在另一个实施方案中，所述结合蛋白中任一者以2nM至900nM、优选地约5nM至约400nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3。在另一个实施方案中，所述结合蛋白中包含的所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域具有高于65℃、优选地高于70℃的熔融温度(Tm)。在另一个实施方案中，所述结合蛋白中包含的所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域具有高于70℃、优选地高于75℃的聚集起始温度(Tagg)。在一个具体实施方案中，所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述结合蛋白在PBS中以低于10-7M的解离常数(KD)结合人CD3并且/或者以2nM至900nM、优选地约5nM至约400nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3。在一个具体实施方案中，所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述锚蛋白重复结构域具有高于75℃、优选地高于80℃的熔融温度(Tm)，并且/或者所述锚蛋白重复结构域具有高于75℃、优选地高于80℃的聚集起始温度(Tagg)，并且/或者所述结合蛋白在PBS中以低于10-7M的解离常数(KD)结合人CD3，并且/或者所述结合蛋白以2nM至900nM、优选地约5nM至约400nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3。在另一个具体实施方案中，所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述结合蛋白在PBS中以低于10-7M、优选地等于或低于约5×10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且/或者以2nM至900nM、优选地约250nM至约400nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3。在另一个具体实施方案中，所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含与SEQID NO:2具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述锚蛋白重复结构域具有高于72℃、优选地高于77℃的熔融温度(Tm)，并且/或者所述锚蛋白重复结构域具有高于70℃、优选地高于75℃的聚集起始温度(Tagg)，并且/或者所述结合蛋白在PBS中以低于10-7M、优选地等于或低于约5×10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且/或者所述结合蛋白以2nM至900nM、优选地约250nM至约400nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3。在一个另选的具体实施方案中，所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述结合蛋白在PBS中以低于10-7M、优选地等于或低于约2×10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且/或者以2nM至900nM、优选地约50nM至约100nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3。在另一个具体实施方案中，所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述锚蛋白重复结构域具有高于65℃、优选地高于70℃的熔融温度(Tm)，并且/或者所述锚蛋白重复结构域具有高于70℃、优选地高于75℃的聚集起始温度(Tagg)，并且/或者所述结合蛋白在PBS中以低于10-7M、优选地等于或低于约2×10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且/或者所述结合蛋白以2nM至900nM、优选地约50nM至约100nM的EC50结合T细胞上的人CD3。在另一个另选的实施方案中，所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且所述结合蛋白在PBS中以低于10-7M、优选地等于或低于约10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且/或者以2nM至900nM、优选地约5nM至约15nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3。在另一个具体实施方案中，所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述锚蛋白重复结构域具有高于73℃、优选地高于78℃的熔融温度(Tm)，并且/或者所述锚蛋白重复结构域具有高于70℃、优选地高于75℃的聚集起始温度(Tagg)，并且/或者所述结合蛋白在PBS中以低于10-7M、优选地等于或低于约10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且/或者所述结合蛋白以2nM至900nM、优选地约5nM至约15nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3。
在另一方面，本发明提供了一种包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中所述结合蛋白还包含对疾病相关抗原具有结合特异性的结合剂。在一个实施方案中，所述结合剂是对疾病相关抗原具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域。在另一个实施方案中，所述疾病相关抗原是感染相关抗原(IAA)，优选地病毒相关抗原(VAA)。在另一个实施方案中，所述疾病相关抗原是肿瘤相关抗原(TAA)。在本发明的一个方面，对疾病相关抗原具有结合特异性的结合剂共价连接到或融合到对CD3具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域。在一个具体实施方案中，对疾病相关抗原具有结合特异性的结合剂通过肽接头、优选地富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头共价连接到对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。在一个实施方案中，所述肽接头的氨基酸序列具有1至50个氨基酸、优选地6至38个氨基酸的长度。在一个优选的实施方案中，所述对疾病相关抗原具有结合特异性的结合剂位于所述结合蛋白内的所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的N末端。
在另一方面，本发明提供了一种包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中所述结合蛋白还包含半衰期延长部分。在一个实施方案中，所述半衰期延长部分包含对人血清白蛋白具有结合特异性的结合剂。在一个实施方案中，所述对人血清白蛋白具有结合特异性的结合剂是对人血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域。在一个具体实施方案中，所述对人血清白蛋白具有结合特异性的结合剂是对人血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，其包含SEQ ID NO:28至30中的任一者、优选地SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，所述半衰期延长部分位于所述结合蛋白内的所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的N末端。
在另一方面，本发明提供了编码本发明的重组结合蛋白的核酸以及包含本发明的结合蛋白或本发明的核酸和任选地药学上可接受的载剂和/或稀释剂的药物组合物。
在另一方面，本发明提供了本发明的结合蛋白、本发明的核酸或本发明的药物组合物，其用于治疗医学病症的方法中。在一个实施方案中，所述医学病症是感染性疾病，优选病毒感染性疾病。在另一个实施方案中，所述医学病症是癌症。
在另一方面，本发明提供了一种在哺乳动物、优选地人中肿瘤定位激活T细胞的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用本发明的结合蛋白、本发明的核酸或本发明的药物组合物。在一个具体实施方案中，这种方法包括向哺乳动物(包括患有肿瘤的人类患者)施用本发明的结合蛋白，导致肿瘤组织中的定位T细胞激活，该结合蛋白还包含对肿瘤相关抗原具有结合特异性的结合剂。
在另一方面，本发明提供了一种在哺乳动物、优选地人中感染定位激活T细胞的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用本发明的结合蛋白、本发明的核酸或本发明的药物组合物。在一个具体实施方案中，这种方法包括向哺乳动物(包括患有病毒感染的人类患者)施用本发明的结合蛋白，导致感染组织中的定位T细胞激活，该结合蛋白还包含对病毒相关抗原具有结合特异性的结合剂。
在另一方面，本发明提供了一种用于治疗人类患者的医学病症的方法，该方法包括向所述患者施用治疗有效量的本发明的结合蛋白、本发明的核酸或本发明的药物组合物。在一个具体实施方案中，这种方法包括向所述患者施用治疗有效量的本发明的结合蛋白、编码本发明的此类结合蛋白的核酸或包含本发明的此类结合蛋白的药物组合物，该结合蛋白还包含对疾病相关抗原具有结合特异性的结合剂。在一个实施方案中，所述医学病症是癌症。在另一个实施方案中，所述医学病症是感染性疾病，优选地病毒感染性疾病。
在一个具体实施方案中，医学病症是癌症，其中癌症或肿瘤组织包含表达或展示肿瘤相关抗原的细胞，并且所述对疾病相关抗原具有结合特异性的结合剂结合在所述细胞中表达或展示的所述肿瘤相关抗原。在一个具体实施方案中，所述疾病相关抗原是在所述癌症或肿瘤组织中表达或过表达的细胞表面蛋白的胞外结构域。在另一个具体实施方案中，所述对肿瘤相关抗原具有结合特异性的结合剂结合到肽-MHC复合物，其中所述肽来源于在肿瘤细胞中表达的蛋白质(诸如例如NY-ESO-1或MAGE-A3)。在一个具体实施方案中，所述MHC是MHC I类。在一个实施方案中，所述癌症选自恶性肿瘤、恶性毒瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴癌和混合型癌。
在另一个具体实施方案中，医学病症是感染性疾病，优选地病毒感染性疾病，其中受感染组织包含表达或展示感染相关抗原、优选地病毒相关抗原的细胞，并且所述对疾病相关抗原具有结合特异性的结合剂结合在所述细胞中表达或展示的所述感染相关抗原。在一个具体实施方案中，所述疾病相关抗原是在所述受感染组织中表达或过表达的病毒蛋白的胞外结构域。在另一个具体实施方案中，所述对病毒相关抗原具有结合特异性的结合剂结合到肽-MHC复合物，其中所述肽来源于感染因子的蛋白质，该感染因子诸如细菌感染因子或病毒感染因子，优选地病毒感染因子(诸如例如HBcAg或EBNA-1)。在一个具体实施方案中，所述MHC是MHC I类。
本发明还提供了包含本发明的重组结合蛋白、本发明的核酸或本发明的药物组合物的试剂盒。本发明还提供了一种用于产生本发明的重组结合蛋白的方法，该方法包括以下步骤：(i)在合适的宿主细胞(原核或真核细胞)中表达所述重组结合蛋白，以及(ii)纯化所述重组结合蛋白(例如，使用色谱法)。
基于本文提供的公开内容，本领域技术人员将认识到或仅能够使用常规实验来确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同物。此类等同物旨在由以下实施方案(E)涵盖。
E1.一种重组结合蛋白，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，所述锚蛋白重复模块具有选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:5至9，以及(2)其中SEQ ID NO:5至9中的任一者中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。
E2.根据E1所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复模块是第一锚蛋白重复模块，并且其中所述锚蛋白重复结构域还包含第二锚蛋白重复模块，所述第二锚蛋白重复模块具有选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:5至9，以及(2)其中SEQ ID NO:5至9中的任一者中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。
E3.根据E2所述的结合蛋白，其中所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:5，以及(2)其中SEQ ID NO:5中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且其中所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:6，以及(2)其中SEQ ID NO:6中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。
E4.根据E2所述的结合蛋白，其中所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且其中所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:6，以及(2)其中SEQ ID NO:6中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。
E5.根据E2所述的结合蛋白，其中所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且其中所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:8，以及(2)其中SEQ ID NO:8中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。
E6.根据E2所述的结合蛋白，其中所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且其中所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:9，以及(2)其中SEQ ID NO:9中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。
E7.根据E2至E6中任一项所述的结合蛋白，其中所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N末端。
E8.一种重组结合蛋白，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且其中SEQ ID NO:1至4的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:1至4的最后一个位置处的A任选地被N取代。
E9.根据E1至E8中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白在PBS中以低于10-7M的解离常数(KD)结合人CD3。
E10.根据E1至E9中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白以2nM至900nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3。
E11.根据E1至E10中任一项所述的结合蛋白，其中所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
E12.根据E1至E10中任一项所述的结合蛋白，其中所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
E13.根据E12所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白在PBS中以等于或低于约5×10- 8M的解离常数(KD)结合人CD3。
E14.根据E12或E13所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白以约250nM至约400nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3。
E15.根据E1至E10中任一项所述的结合蛋白，其中所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
E16.根据E15所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白在PBS中以等于或低于约2×10- 8M的解离常数(KD)结合人CD3。
E17.根据E15或E16所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白以约50nM至约100nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3。
E18.根据E1至E10中任一项所述的结合蛋白，其中所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
E19.根据E18所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白在PBS中以等于或低于约10-8M的解离常数(KD)结合人CD3。
E20.根据E18或E19所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白以约5nM至约15nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3。
E21.根据E1至E20中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白还包含对疾病相关抗原具有结合特异性的结合剂。
E22.根据E21所述的结合蛋白，其中所述结合剂是对疾病相关抗原具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。
E23.根据E21或E22所述的结合蛋白，其中所述疾病相关抗原是感染相关抗原(IAA)，优选地病毒相关抗原(VAA)，或肿瘤相关抗原(TAA)。
E24.根据E21至E23中任一项所述的结合蛋白，其中所述对疾病相关抗原具有结合特异性的结合剂位于所述结合蛋白内的所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的N末端。
E25.根据E21至E24中任一项所述的结合蛋白，其中所述对疾病相关抗原具有结合特异性的结合剂通过肽接头共价连接到所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。
E26.根据E25所述的结合蛋白，其中所述肽接头是富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。
E27.根据E25或E26所述的结合蛋白，其中所述肽接头的氨基酸序列具有1至50个氨基酸、优选地6至38个氨基酸的长度。
E28.根据E1至E27中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白还包含半衰期延长部分。
E29.根据E28所述的结合蛋白，其中所述半衰期延长部分包含对人血清白蛋白具有结合特异性的结合剂。
E30.根据E29所述的结合蛋白，其中所述对人血清白蛋白具有结合特异性的结合剂是锚蛋白重复结构域，所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:28至30中的任一者、优选地SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
E31.根据E28至E30中任一项所述的结合蛋白，其中所述半衰期延长部分位于所述结合蛋白内的所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的N末端。
E32.一种核酸，所述核酸编码根据E1至E31中任一项所述的结合蛋白。
E33.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据E1至E31中任一项所述的结合蛋白或根据E32所述的核酸，以及任选地药学上可接受的载剂和/或稀释剂。
E34.根据E1至E31中任一项所述的结合蛋白、根据E32所述的核酸或者根据E33所述的药物组合物，其用于治疗医学病症的方法中。
E35.根据E34所述的结合蛋白，其中所述医学病症是感染性疾病，优选地病毒感染性疾病，或癌症。
E36.一种在包括人在内的哺乳动物中肿瘤定位激活T细胞的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用根据E1至E31中任一项所述的结合蛋白、根据E32所述的核酸或者根据E33所述的药物组合物的步骤。
E37.一种在包括人在内的哺乳动物中感染定位激活T细胞的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用根据E1至E31中任一项所述的结合蛋白、根据E32所述的核酸或者根据E33所述的药物组合物的步骤。
E38.一种治疗医学病症的方法，所述方法包括向对有需要的患者施用治疗有效量的根据E1至E31中任一项所述的结合蛋白、根据E32所述的核酸或者根据E33所述的药物组合物的步骤。
E39.根据E38所述的方法，其中所述医学病症是感染性疾病，优选地病毒感染性疾病，或癌症。
附图说明
图1：对人CD3、蛋白质#1和蛋白质#2、蛋白质#3和蛋白质#4具有结合特异性的四种所选择的锚蛋白重复蛋白的纯化的SDS-PAGE凝胶分析。M对应于蛋白质大小标记(还原性SDS-PAGE，NuPAGE 4％-12％，Bis Tris(invitrogen)凝胶；5μg/泳道；MES缓冲液；即时蓝染色)。指示标志物蛋白质的分子量(kDa)。泳道1：蛋白质大小标记；泳道2：纯化的蛋白质#1；泳道3：纯化的蛋白质#2；泳道4：纯化的蛋白质#3；泳道5：纯化的蛋白质#4。
图2A至图2D：使用UV光谱法评估示例性经设计的锚蛋白重复蛋白的稳定性。将蛋白质#1-4在TBS pH 8.0(50mM Tris，500mM NaCl)中1:1稀释并充分混合，然后通过Nanodrop进行UV-VIS测量。在-70℃处对样品进行评估，而在50℃处进行热应激18天。在320nm处没有可见的吸收(表明沉淀)。参比和应激样品的光谱没有差异。
图3：使用还原性SDS-PAGE评估示例性经设计的锚蛋白重复蛋白的稳定性；10％Bis-Tris凝胶；5μg/泳道；MES缓冲液；即时蓝染色。预期MW：14.5kDa。泳道1，M：预染色标记-示出标记蛋白的分子量(kDa)；泳道2和3：-70℃处的蛋白质#1与50℃处的18天热应激；泳道4和5：-70℃处的蛋白质#2与50℃处的18天热应激；泳道6和7：-70℃处的蛋白质#3与50℃处的18天热应激；泳道8和9：-70℃处的蛋白质#4与50℃处的18天热应激。
图4A至图4D：使用尺寸排阻色谱法(SEC)评估示例性经设计的锚蛋白重复蛋白的稳定性。将#1-4蛋白质样品稀释至2mg/ml，并在TBS pH 8.0(50mM Tris，500mMNaCl)中通过GE Superdex 200 150/5Increased柱运行。在280nm处分析痕量。黑色：储存在-70℃处的参比样品；灰色：在50℃处温育18天的热应激样品。这些曲线在很大程度上重叠。
图5A至图5D：使用圆二色性(CD)光谱法评估示例性经设计的锚蛋白重复蛋白的热稳定性。将蛋白质#1-4的样品(分别为A至D)在TBS pH 8.0(50mM Tris，500mMNaCl)中稀释至2μM。监测蛋白质去折叠(正向)和重折叠(反向)。所有蛋白质显示出可逆去折叠，其中Tm高于65℃(在图中用虚线示出)。
图6A至图6D：用动态光散射(DLS)确定聚集开始温度Tagg。将蛋白质#1-4的样品在TBS pH 8.0(50mM Tris，500mM NaCl)中稀释至1mg/ml，并通过DLS确定Tagg(5个平行测定样，A1、A2、A3、A4、A5)。所测试的所有四种锚蛋白重复蛋白在80℃以上显示出高Tagg。
图7A：示例性CD3特异性结合蛋白在雌性BALB/c小鼠中的药代动力学分析。该图示出了在单次静脉内推注施用1mg/kg后，蛋白质#5、蛋白质#6、蛋白质#7和蛋白质#8在雌性BALB/c小鼠(平均值+/-最大值/最小值，N＝3只/组)中的组平均血清浓度-时间曲线。
图7B：结合到人CD3的结合蛋白的表面等离子体共振(SPR)分析，由蛋白质#3例示。将各种浓度(8nM、16nM、32nM和64nM)的经纯化的锚蛋白重复蛋白施加到具有固定的人CD3的GLC芯片以用于结合率和解离率测量。使用所获得的SPR迹线分析来确定锚蛋白重复蛋白CD3相互作用。RU，共振单位；s，以秒为单位的时间。
图8A至图8B：例示性结合蛋白与T细胞的CD3结合。通过Mirrorball评估与Pan-T细胞上的CD3的结合。示出了基准对照分子(已知的基准T细胞接合物、对TAA2具有结合特异性的TCE1和对TAA3具有结合特异性的TCE2)和不具有(图A)或具有(图B)半衰期延长(HLE)的所选择的锚蛋白重复蛋白蛋白质A、蛋白质B、蛋白质C和蛋白质D。与(A)中所示的对应非HLE分子相比，半衰期延长的蛋白质(B)显示出类似的结合。测试了来自5个不同供体的Pan-T细胞，此处示出一个代表性供体。(*阴性对照：经设计的锚蛋白重复蛋白，其仅对TAA2和TAA3具有结合特异性，分别具有和不具有半衰期延长)。
图9A至图9B：短期靶细胞杀伤(LDH)。将Pan-T细胞(作为效应细胞(E))和表达TAA2/TAA3的肿瘤细胞(作为靶细胞(T))以5:1的E:T比率温育，并且在所示分子的系列稀释液的存在下共培养48小时后，通过上清液中的LDH释放评估肿瘤细胞杀伤。示出了基准对照分子(已知的基准T细胞接合物，对TAA2具有结合特异性的TCE1)和不具有(图A)或具有(图B)半衰期延长(HLE)的所选择的锚蛋白重复蛋白蛋白质A、蛋白质B、蛋白质C和蛋白质D。(A)对于不具有半衰期延长的蛋白质，由蛋白质B和蛋白质C诱导的肿瘤细胞杀伤与基准分子相当，而蛋白质D和蛋白质A显示出较低的细胞毒性效力。(B)与(A)中所示的对应非HLE分子相比，半衰期延长的蛋白质显示出效力降低至1/4-1/70。测试了来自5个不同供体的Pan-T细胞，此处示出一个代表性供体。(*阴性对照：经设计的锚蛋白重复蛋白，其对TAA2和TAA3具有结合特异性，分别具有或不具有半衰期延长)。
图10A至图10B：通过激活标记CD25测量的短期T细胞激活。将Pan-T和表达TAA2/TAA3的肿瘤细胞以1:1的E:T比率温育，并且在所示分子的系列稀释液的存在下共培养24小时后，通过FACS评估T细胞激活。将激活的T细胞作为活的CD8+/CD25+细胞进行门控。示出了基准对照分子(已知的基准T细胞接合物，对TAA2具有结合特异性的TCE1)和不具有(图A)或具有(图B)半衰期延长(HLE)的所选择的锚蛋白重复蛋白蛋白质A、蛋白质B、蛋白质C和蛋白质D。(A)在不具有半衰期延长的情况下，由蛋白质B和蛋白质C诱导的T细胞激活与基准相当，而蛋白质D和蛋白质A显示出较低的效力。(B)与(A)中所示的对应非HLE分子相比，半衰期延长的蛋白质显示出效力降低至1/4-1/100。测试了来自7个不同供体的Pan-T细胞，此处示出一个代表性供体。(*阴性对照：经设计的锚蛋白重复蛋白，其仅对TAA2和TAA3具有结合特异性，分别具有或不具有半衰期延长)。
图11A至图11B：通过IFNγ分泌测量的短期T细胞激活。将Pan-T和表达TAA2/TAA3的肿瘤细胞以1:1的E:T比率温育。在所示分子的系列稀释液的存在下共培养24小时后，通过ELISA分析培养物上清液中的IFNγ分泌。示出了基准对照分子(已知的基准T细胞接合物，对TAA2具有结合特异性的TCE1)和不具有(图A)或具有(图B)半衰期延长(HLE)的所选择的锚蛋白重复蛋白蛋白质A、蛋白质B、蛋白质C和蛋白质D。(A)在不具有半衰期延长的情况下，由蛋白质B和蛋白质C诱导的T细胞激活与基准分子相当，而蛋白质D和v118蛋白质A显示出较低的效力。(B)与(A)中所示的对应非HLE分子相比，半衰期延长的蛋白质显示出效力降低至1/3-1/20。测试了来自4个不同供体的Pan-T细胞，此处示出一个代表性供体。(*阴性对照：经设计的锚蛋白重复蛋白，其仅对TAA2和TAA3具有结合特异性，分别具有或不具有半衰期延长)。
图12：长期肿瘤细胞杀伤。将Pan-T和表达TAA2/TAA3的肿瘤细胞以5:1的E:T比率温育，并且通过在所示分子的系列稀释液的存在下共培养6天，用IncuCyte评估肿瘤细胞杀伤。肿瘤细胞杀伤被计算为膜联蛋白V染色曲线下面积与细胞增殖之间的比率。示出了两种基准对照分子(已知的基准T细胞接合物、对TAA2具有结合特异性的TCE1和对TAA3具有结合特异性的TCE2)和不具有或具有半衰期延长(HLE)的所选择的锚蛋白重复蛋白蛋白质A、蛋白质B、蛋白质C和蛋白质D。数据显示出大多数测试蛋白质的与基准分子相当的有效和特异性肿瘤细胞杀伤，与半衰期延长无关。只有较低亲和力的蛋白质A显示出杀伤效力的明显降低。浓度从左至右为2nM，随后对于基准和不含HSA结合结构域的测试蛋白各自以1/10稀释，以及20nM，随后对于具有HSA结合结构域的测试蛋白质各自以1/10稀释。使用来自5个不同供体的Pan-T细胞，此处示出一个代表性供体。
图13 A至图13 B：长期T细胞激活。将Pan-T和表达TAA2/TAA3的肿瘤细胞以1:1的E:T比率温育，并且在所示分子的系列稀释液的存在下共培养5天后，通过FACS评估T细胞激活。将激活的T细胞作为活的CD8+/CD25+细胞进行门控。示出了基准对照分子(已知的基准T细胞接合物、对TAA2具有结合特异性的TCE1和对TAA3具有结合特异性的TCE2)和不具有或具有半衰期延长(HLE)的所选择的锚蛋白重复蛋白蛋白质A、蛋白质B、蛋白质C和蛋白质D。(A)在不具有半衰期延长的情况下，由蛋白质B和蛋白质C诱导的T细胞激活与基准分子相当，而蛋白质A和蛋白质D显示出效力降低至低于1/100。(B)与(A)中所示的对应非HLE分子相比，半衰期延长的蛋白质显示出效力降低至低于1/10。使用来自2个不同供体的Pan-T细胞，此处示出一个代表性供体。
图14A至图14B：长期T细胞增殖。将Pan-T和表达TAA2/TAA3的肿瘤细胞以1:1的E:T比率温育，并且在所示分子的系列稀释液的存在下共培养5天后，通过FACS评估T细胞增殖。将增殖的T细胞作为显示出至少一次细胞分裂的CellTrace Violet阳性细胞进行门控。示出了两种基准对照分子(已知的基准T细胞接合物、对TAA2具有结合特异性的TCE1和对TAA3具有结合特异性的TCE2)和不具有或具有半衰期延长(HLE)的所选择的锚蛋白重复蛋白蛋白质A、蛋白质B、蛋白质C和蛋白质D。(A)在不具有半衰期延长的情况下，由蛋白质B和蛋白质C诱导的T细胞增殖与基准分子相当，而蛋白质A和蛋白质D显示出效力降低至低于1/100。(B)与(A)中所示的对应非HLE分子相比，半衰期延长的蛋白质显示出效力降低至低于1/30。使用来自2个不同供体的Pan-T细胞，此处示出一个代表性供体。
图15A至图15C：肿瘤细胞注射和小鼠治疗后随时间推移的肿瘤生长。用媒介物、基准TAA3 T细胞接合物、蛋白质#E、蛋白质#F、蛋白质#G和蛋白质#H进行处理，如实施例10中所示和所述。
图16A至图16B：(A)腹膜内注射hPBMC的小鼠(n＝5只小鼠/供体/使用2个hPBMC供体)中随时间推移的肿瘤生长，皮下异种移植表达TAA2/TAA3/TAA4的肿瘤细胞，并用PBS 1X(黑色圆形)、0.5mg/kg的多特异性TCE形式的蛋白质#3(黑色方形)或0.5mg/kg的基准TAA3 T细胞接合物(黑色三角形)处理。如实施例10中所述施用治疗。数据以平均值+SEM表示。(B)肿瘤细胞异种移植后第17天的肿瘤体积评价。
具体实施方式
如本文所公开和例示的，本公开提供了特异性靶向CD3的锚蛋白重复蛋白。经设计的锚蛋白重复蛋白文库(WO2002/020565；Binz等人，Nat.Biotechnol.22,575-582,2004；Stumpp等人，Drug Discov.Today 13,695-701,)可用于选择以高亲和力结合其靶标的靶标特异性设计的锚蛋白重复结构域。此类靶标特异性设计的锚蛋白重复结构域继而可用作用于治疗疾病的重组结合蛋白的有价值的组分。经设计的锚蛋白重复蛋白是一类结合分子，其具有克服单克隆抗体限制的潜力，从而允许新型治疗方法。此类锚蛋白重复蛋白可包含单个经设计的锚蛋白重复结构域，或者可包含两个或更多个具有相同或不同靶标特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的组合(Stumpp等人，Drug Discov.Today 13,695-701,2008；美国专利9,458,211)。仅包含单个经设计的锚蛋白重复结构域的锚蛋白重复蛋白为小蛋白质(14kDa)，其可被选择为以高亲和力和特异性结合给定靶蛋白。这些特征以及将两个、三个、四个或更多个经设计的锚蛋白重复结构域组合在一个蛋白质中从而产生具有两种、三种、四种或更多种不同特异性的结合蛋白的可能性使得经设计的锚蛋白重复蛋白成为理想的激动性、拮抗性和/或抑制性药物候选物，并且允许新型药物设计，包括例如T细胞接合物药物分子的新型设计。此外，此类锚蛋白重复蛋白可被工程化以携带各种效应子功能，例如细胞毒性剂或半衰期延长剂，从而实现全新的药物形式。总之，经设计的锚蛋白重复蛋白为具有超过现有抗体药物的潜力的下一代蛋白质治疗剂的示例。
是Molecular Partners AG(Switzerland)拥有的商标。
在一个方面，本发明涉及包含锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域对CD3具有结合特异性，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，该锚蛋白重复模块具有选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:5至9，以及(2)其中SEQ ID NO:5至9中的任一者中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:5至9，以及(2)其中SEQ ID NO:5至9中的任一者中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:5至9，以及(2)其中SEQ ID NO:5至9中的任一者中的至多3个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:5至9，以及(2)其中SEQ ID NO:5至9中的任一者中的至多2个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:5至9，以及(2)其中SEQ ID NO:5至9中的任一者中的至多1个氨基酸被另一个氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所有所述9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代发生在所述锚蛋白重复模块的框架位置中。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由SEQ ID NO:5至9组成的组的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其中SEQ ID NO:5中的一个或两个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其中SEQ ID NO:6中的一个或两个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其中SEQ ID NO:7中的一个或两个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其中SEQ ID NO:8中的一个或两个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其中SEQ ID NO:9中的一个或两个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含SEQ IDNO:9的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含第一锚蛋白重复模块和第二锚蛋白重复模块。在一个优选的实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N末端。在一个实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块和所述第二锚蛋白重复模块各自包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ IDNO:5至9，以及(2)其中SEQ ID NO:5至9中的任一者中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含第一锚蛋白重复模块，该第一锚蛋白重复模块具有选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:5至9，以及(2)其中SEQ ID NO:5至9中的任一者中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且还包含第二锚蛋白重复模块，该第二锚蛋白重复模块具有选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:5至9，以及(2)其中SEQ ID NO:5至9中的任一者中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。
在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:5，以及(2)其中SEQ ID NO:5中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:6，以及(2)其中SEQ ID NO:6的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。
因此，在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:5，以及(2)其中SEQ ID NO:5中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:6，以及(2)其中SEQ ID NO:6中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:5，以及(2)其中SEQ ID NO:5中的至多6个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:6，以及(2)其中SEQ ID NO:6中的至多6个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ IDNO:5，以及(2)其中SEQ ID NO:5中的至多5个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:6，以及(2)其中SEQ ID NO:6中的至多5个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:5，以及(2)其中SEQ ID NO:5中的至多4个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ IDNO:6，以及(2)其中SEQ ID NO:6中的至多4个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:5，以及(2)其中SEQ ID NO:5中的至多3个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:6，以及(2)其中SEQ ID NO:6中的至多3个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:5，以及(2)其中SEQ ID NO:5中的至多2个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:6，以及(2)其中SEQ ID NO:6中的至多2个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:5，以及(2)其中SEQ ID NO:5中的1个氨基酸被另一个氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:6，以及(2)其中SEQ ID NO:6中的1个氨基酸被另一个氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列。
在一个优选的实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:5，以及(2)其中SEQ ID NO:5中的至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:6，以及(2)其中SEQ ID NO:6中的至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，其中所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N末端。此外，在一个更优选的实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，其中所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N末端。
在另一个具体实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:6，以及(2)其中SEQ ID NO:6的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。
因此，在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:6，以及(2)其中SEQ ID NO:6中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多6个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:6，以及(2)其中SEQ ID NO:6中的至多6个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ IDNO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多5个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:6，以及(2)其中SEQ ID NO:6中的至多5个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多4个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ IDNO:6，以及(2)其中SEQ ID NO:6中的至多4个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多3个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:6，以及(2)其中SEQ ID NO:6中的至多3个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多2个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:6，以及(2)其中SEQ ID NO:6中的至多2个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的1个氨基酸被另一个氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:6，以及(2)其中SEQ ID NO:6中的1个氨基酸被另一个氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列。
在一个优选的实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:6，以及(2)其中SEQ ID NO:6中的至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，其中所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N末端。此外，在一个更优选的实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，其中所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N末端。
在另一个具体实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:8，以及(2)其中SEQ ID NO:8的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。
因此，在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:8，以及(2)其中SEQ ID NO:8中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多6个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:8，以及(2)其中SEQ ID NO:8中的至多6个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ IDNO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多5个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:8，以及(2)其中SEQ ID NO:8中的至多5个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多4个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ IDNO:8，以及(2)其中SEQ ID NO:8中的至多4个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多3个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:8，以及(2)其中SEQ ID NO:8中的至多3个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多2个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:8，以及(2)其中SEQ ID NO:8中的至多2个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的1个氨基酸被另一个氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:8，以及(2)其中SEQ ID NO:8中的1个氨基酸被另一个氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含SEQ IDNO:8的氨基酸序列。
在一个优选的实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:8，以及(2)其中SEQ ID NO:8中的至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，其中所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N末端。此外，在一个更优选的实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，其中所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N末端。
在另一个具体实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:9，以及(2)其中SEQ ID NO:9的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。
因此，在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:9，以及(2)其中SEQ ID NO:9中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多6个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:9，以及(2)其中SEQ ID NO:9中的至多6个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ IDNO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多5个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:9，以及(2)其中SEQ ID NO:9中的至多5个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多4个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ IDNO:9，以及(2)其中SEQ ID NO:9中的至多4个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多3个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:9，以及(2)其中SEQ ID NO:9中的至多3个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多2个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:9，以及(2)其中SEQ ID NO:9中的至多2个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的1个氨基酸被另一个氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:9，以及(2)其中SEQ ID NO:9中的1个氨基酸被另一个氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含SEQ IDNO:9的氨基酸序列。
在一个优选的实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:9，以及(2)其中SEQ ID NO:9中的至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，其中所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N末端。此外，在一个更优选的实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，其中所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N末端。
在一个优选的实施方案中，如本文所述和所提及的所述锚蛋白重复模块的所有所述氨基酸取代发生在所述锚蛋白重复模块的框架位置中，其中通常模块的总体结构不受取代的影响。无论此类取代是否被明确描述，此类在框架位置中的取代的实施方案应适用于所有实施方案。
在一个优选的实施方案中，如本文所述和所提及的所述锚蛋白重复模块的所有所述氨基酸取代发生在SEQ ID NO:5至9的所述锚蛋白重复模块的框架位置以及除位置3、4、6、14和15之外、优选地除位置2、3、4、5、6、14和15之外的位置中，其中通常该模块的总体结构不受取代的影响。
在另一方面，本发明涉及包含锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域对CD3具有结合特异性，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且其中SEQ ID NO:1至4的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ IDNO:1至4的最后一个位置处的A任选地被N取代。
因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含SEQ IDNO:1至4中的任一者的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含选自SEQ ID NO:1至4的氨基酸序列，并且其中SEQ ID NO:1至4的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:1至4的最后一个位置处的A任选地被N取代。
在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且其中SEQ ID NO:1的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:1的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且其中SEQ ID NO:2的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:2的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且其中SEQ ID NO:3的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:3的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且其中SEQ ID NO:4的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:4的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域中的潜在相互作用残基与SEQ ID NO:1至4的锚蛋白重复结构域中的任一者中的对应位置相同。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述结合蛋白以小于900nM、700nM、500nM、400nM、300nM、200nM、150nM、100nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、15nM或10nM的EC50结合T细胞上的人CD3。因此，在一个实施方案中，所述结合蛋白以小于900nM的EC50结合T细胞上的人CD3；在另一个实施方案中，所述结合蛋白以小于700nM的EC50结合T细胞上的人CD3；在另一个实施方案中，所述结合蛋白以小于500nM的EC50结合T细胞上的人CD3；在另一个实施方案中，所述结合蛋白以小于400nM的EC50结合T细胞上的人CD3；在另一个实施方案中，所述结合蛋白以小于300nM的EC50结合T细胞上的人CD3；在另一个实施方案中，所述结合蛋白以小于200nM的EC50结合T细胞上的人CD3；在另一个实施方案中，所述结合蛋白以小于100nM的EC50结合T细胞上的人CD3；在另一个实施方案中，所述结合蛋白以小于70nM的EC50结合T细胞上的人CD3；在另一个实施方案中，所述结合蛋白以小于60nM的EC50结合T细胞上的人CD3；在另一个实施方案中，所述结合蛋白以小于50nM的EC50结合T细胞上的人CD3；在另一个实施方案中，所述结合蛋白以小于40nM的EC50结合T细胞上的人CD3；在另一个实施方案中，所述结合蛋白以小于30nM的EC50结合到T细胞；在另一个实施方案中，所述结合蛋白以小于20nM的EC50结合到T细胞；在另一个实施方案中，所述结合蛋白以小于15nM的EC50结合到T细胞；在另一个实施方案中，所述结合蛋白以小于10nM的EC50结合到T细胞。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述结合蛋白以2nM至900nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3。在另一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述结合蛋白以约5nM至约400nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3。在另一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述结合蛋白以约250nM至约400nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3；在另一个实施方案中，所述结合蛋白以约50nM至约100nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3；在另一个实施方案中，所述结合蛋白以约5nM至约15nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3。
通过使用Mirrorball激光扫描成像细胞计量术进行的对CD3具有结合特异性的本发明重组结合蛋白在T细胞上的CD3结合(EC50)的典型和优选的确定描述于实施例5中(用原代人T细胞)。因此，在一个实施方案中，通过Mirrorball激光扫描成像细胞计量术在原代人T细胞上测定本发明重组结合蛋白的所述CD3结合(EC50)，如实施例5所述。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述结合蛋白以2nM至900nM、5nM至400nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且其中所述结合蛋白包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且其中SEQ ID NO:1至4的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:1至4的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述结合蛋白以2nM至900nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述结合蛋白以2nM至900nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述结合蛋白以2nM至900nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述结合蛋白以2nM至900nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述结合蛋白以2nM至900nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述结合蛋白以2nM至900nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1至4中的任一者的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述结合蛋白以2nM至900nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1至4中的任一者的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1至4的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:1至4的最后一个位置处的A任选地被N取代。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述结合蛋白以约250nM至约400nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且其中所述结合蛋白包含与SEQ ID NO:2中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且其中SEQ ID NO:2的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:2的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述结合蛋白以250nM至400nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述结合蛋白以250nM至400nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述结合蛋白以250nM至400nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述结合蛋白以250nM至400nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述结合蛋白以250nM至400nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述结合蛋白以250nM至400nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述结合蛋白以约250nM至约400nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:2的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:2的最后一个位置处的A任选地被N取代。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述结合蛋白以约50nM至约100nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且其中所述结合蛋白包含与SEQ ID NO:3中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且其中SEQ ID NO:3的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:3的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述结合蛋白以50nM至100nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述结合蛋白以50nM至100nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述结合蛋白以50nM至100nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述结合蛋白以50nM至100nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述结合蛋白以50nM至100nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述结合蛋白以50nM至100nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述结合蛋白以约50nM至约100nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:3的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:3的最后一个位置处的A任选地被N取代。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述结合蛋白以约5nM至约15nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且其中所述结合蛋白包含与SEQ ID NO:4中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且其中SEQ ID NO:4的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:4的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述结合蛋白以5nM至15nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述结合蛋白以5nM至15nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述结合蛋白以5nM至15nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述结合蛋白以5nM至15nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述结合蛋白以5nM至15nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述结合蛋白以5nM至15nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述结合蛋白以约5nM至约15nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:4的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQID NO:4的最后一个位置处的A任选地被N取代。
在一个实施方案中，本发明涉及一种重组结合蛋白，该重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述结合蛋白在PBS中以等于或低于约10-6M、或者等于或低于约10-7M、或者等于或低于约5×10-8M、或者等于或低于约2×10-8M、或者等于或低于约10-8M的解离常数(KD)结合到人CD3。因此，在一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以等于或低于约10-6M的解离常数(KD)结合人CD3。在另一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以等于或低于约10-7M的解离常数(KD)结合人CD3。在另一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以等于或低于约5×10-8M的解离常数(KD)结合人CD3；并且在另一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以等于或低于约2×10-8M的解离常数(KD)结合人CD3。在另一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以等于或低于约10-8M的解离常数(KD)结合人CD3。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述结合蛋白在PBS中以等于或低于10-6M的解离常数(KD)结合人CD3，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1至4的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:1至4的最后一个位置处的A任选地被N取代。在另一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述结合蛋白在PBS中以等于或低于10-7M的解离常数(KD)结合人CD3，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1至4的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:1至4的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以低于10-7M的解离常数(KD)结合人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以低于10-7M的解离常数(KD)结合人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以低于10-7M的解离常数(KD)结合人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以低于10-7M的解离常数(KD)结合人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以低于10-7M的解离常数(KD)结合人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以低于10-7M的解离常数(KD)结合人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1至4中的任一者的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述结合蛋白在PBS中以等于或低于约10-7M的解离常数(KD)结合人CD3，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQID NO:1至4中的任一者的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1至4的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:1至4的最后一个位置处的A任选地被N取代。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述结合蛋白在PBS中以等于或低于约5×10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1至4的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:1至4的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以等于或低于约5×10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以低于5×10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以低于5×10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以低于5×10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以低于5×10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以低于5×10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1至4中的任一者的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述结合蛋白在PBS中以等于或低于约5×10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1至4中的任一者的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1至4的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ IDNO:1至4的最后一个位置处的A任选地被N取代。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述结合蛋白在PBS中以等于或低于约2×10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:3或4具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1至4的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:3或4的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以等于或低于约2×10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:3或4具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以低于2×10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:3或4具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以低于2×10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:3或4具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以低于2×10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:3或4具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以低于2×10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:3或4具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以低于2×10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含SEQID NO:3或4的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述结合蛋白在PBS中以等于或低于约2×10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:3或4的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:3或4的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:3或4的最后一个位置处的A任选地被N取代。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述结合蛋白在PBS中以等于或低于约10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且其中SEQ ID NO:4的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:4的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以等于或低于约10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以低于10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以低于10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以低于10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以低于10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述结合蛋白在PBS中以低于10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述结合蛋白在PBS中以等于或低于约10-8M的解离常数(KD)结合人CD3，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，并且其中SEQ ID NO:4的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:4的最后一个位置处的A任选地被取代。
通过表面等离子体共振(SPR)分析进行的对CD3具有结合特异性的本发明重组结合蛋白的解离常数(KD)的典型和优选的确定描述于实施例4中。因此，在一个实施方案中，本发明重组结合蛋白对CD3的所述结合特异性通过表面等离子体共振(SPR)在PBS中确定。在一个实施方案中，本发明重组结合蛋白对CD3的所述结合特异性通过如实施例4中所述的表面等离子体共振(SPR)在PBS中确定。
在一个实施方案中，本发明涉及包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域具有高于65℃、高于68℃、高于70℃、高于72℃、高于75℃、高于78℃、高于80℃、等于约75℃、等于约80℃、等于约82℃、等于约85℃、介于65℃和95℃之间、介于70℃和90℃之间、介于72℃和88℃之间的熔融温度(Tm)。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于65℃的熔融温度(Tm)。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于70℃的熔融温度(Tm)。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于75℃的熔融温度(Tm)。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于80℃的熔融温度(Tm)。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有介于65℃和95℃之间的熔融温度(Tm)。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有介于72℃和88℃之间的熔融温度(Tm)。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1至4的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:1至4的最后一个位置处的A任选地被N取代；并且其中所述锚蛋白重复结构域具有高于65℃的熔融温度(Tm)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于68℃的熔融温度(Tm)。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于70℃的熔融温度(Tm)。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于72℃的熔融温度(Tm)。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于75℃的熔融温度(Tm)。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于78℃的熔融温度(Tm)。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于80℃的熔融温度(Tm)。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:1的最后一个位置处的A任选地被N取代；并且其中所述锚蛋白重复结构域具有高于75℃的熔融温度(Tm)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于78℃的熔融温度(Tm)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于80℃的熔融温度(Tm)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有介于75℃和95℃之间的熔融温度(Tm)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有约85℃的熔融温度(Tm)。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:2的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:2的最后一个位置处的A任选地被N取代；并且其中所述锚蛋白重复结构域具有高于72℃的熔融温度(Tm)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于75℃的熔融温度(Tm)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于77℃的熔融温度(Tm)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有介于72℃和92℃之间的熔融温度(Tm)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有约82℃的熔融温度(Tm)。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:3的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:3的最后一个位置处的A任选地被N取代；并且其中所述锚蛋白重复结构域具有高于65℃的熔融温度(Tm)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于68℃的熔融温度(Tm)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于70℃的熔融温度(Tm)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有介于65℃和85℃之间的熔融温度(Tm)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有约75℃的熔融温度(Tm)。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:4的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:4的最后一个位置处的A任选地被N取代；并且其中所述锚蛋白重复结构域具有高于73℃的熔融温度(Tm)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于75℃的熔融温度(Tm)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于78℃的熔融温度(Tm)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有介于73℃和93℃之间的熔融温度(Tm)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有约83℃的熔融温度(Tm)。
通过圆二色性(CD)光谱法进行的对CD3具有结合特异性的本发明重组结合蛋白或锚蛋白重复结构域的熔融温度(Tm)的典型和优选的确定描述于实施例2中。因此，在一个实施方案中，通过圆二色性(CD)光谱法在TBS pH 8.0(50mM Tris，500mM NaCl)中确定本发明重组结合蛋白或锚蛋白重复结构域的所述熔融温度(Tm)。在一个实施方案中，通过圆二色性(CD)光谱法在TBS pH 8.0(50mM Tris，500mM NaCl)中确定本发明重组结合蛋白或锚蛋白重复结构域的所述熔融温度(Tm)，如实施例2所述。
在一个实施方案中，本发明涉及包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域具有高于65℃、高于68℃、高于70℃、高于72℃、高于75℃、高于78℃、高于80℃、高于82℃、高于85℃、介于75℃和100℃之间、介于70℃和95℃之间、或介于75℃和95℃之间的聚集起始温度(Tagg)因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于65℃的聚集起始温度(Tagg)。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于70℃的聚集起始温度(Tagg)。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于75℃的聚集起始温度(Tagg)。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于80℃的聚集起始温度(Tagg)。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有介于75℃和100℃之间的聚集起始温度(Tagg)。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有介于70℃和95℃之间的聚集起始温度(Tagg)。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1至4的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:1至4的最后一个位置处的A任选地被N取代；并且其中所述锚蛋白重复结构域具有高于65℃的聚集起始温度(Tagg)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于68℃的聚集起始温度(Tagg)。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于70℃的聚集起始温度(Tagg)。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于72℃的聚集起始温度(Tagg)。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于75℃的聚集起始温度(Tagg)。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于78℃的聚集起始温度(Tagg)。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于80℃的聚集起始温度(Tagg)。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:1的最后一个位置处的A任选地被N取代；并且其中所述锚蛋白重复结构域具有高于70℃的聚集起始温度(Tagg)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于75℃的聚集起始温度(Tagg)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于80℃的聚集起始温度(Tagg)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于85℃的聚集起始温度(Tagg)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有介于75℃和100℃之间的聚集起始温度(Tagg)。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:2的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:2的最后一个位置处的A任选地被N取代；并且其中所述锚蛋白重复结构域具有高于65℃的聚集起始温度(Tagg)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于70℃的聚集起始温度(Tagg)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于75℃的聚集起始温度(Tagg)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于80℃的聚集起始温度(Tagg)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有介于70℃和95℃之间的聚集起始温度(Tagg)。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:3的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:3的最后一个位置处的A任选地被N取代；并且其中所述锚蛋白重复结构域具有高于65℃的聚集起始温度(Tagg)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于70℃的聚集起始温度(Tagg)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于75℃的聚集起始温度(Tagg)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于80℃的聚集起始温度(Tagg)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有介于70℃和95℃之间的聚集起始温度(Tagg)。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:4的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:4的最后一个位置处的A任选地被N取代；并且其中所述锚蛋白重复结构域具有高于65℃的聚集起始温度(Tagg)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于70℃的聚集起始温度(Tagg)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于75℃的聚集起始温度(Tagg)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有高于80℃的聚集起始温度(Tagg)。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域具有介于70℃和95℃之间的聚集起始温度(Tagg)。
通过动态光散射(DLS)分析进行的对CD3具有结合特异性的本发明重组结合蛋白或锚蛋白重复结构域的聚集起始温度(Tagg)的典型和优选的确定描述于实施例2中。因此，在一个实施方案中，通过动态光散射(DLS)分析在TBS pH 8.0(50mM Tris，500mM NaCl)中确定本发明重组结合蛋白或锚蛋白重复结构域的所述聚集起始温度(Tagg)。在一个实施方案中，通过动态光散射(DLS)分析在TBS pH 8.0(50mM Tris，500mM NaCl)中确定本发明重组结合蛋白或锚蛋白重复结构域的所述聚集起始温度(Tagg)，如实施例2所述。
本文所公开的重组结合蛋白的重复结构域、优选地锚蛋白重复结构域优选地包含N末端和/或C末端封端模块(此后也称为封端重复序列或封端单元)。封端模块位于锚蛋白重复结构域的N末端和/或C末端，通常与其间的锚蛋白重复模块形成紧密的三级相互作用(即三级结构相互作用)，从而提供保护一侧的锚蛋白重复结构域的疏水核免于暴露于溶剂的盖。N末端和/或C末端封端模块可来源于存在于邻近重复单元的天然存在的重复蛋白质中的封端单元或其他结构单元。封端序列的示例在国际专利公布WO 2002/020565和WO2012/069655、美国专利公布US20130296221以及Interlandi等人，J Mol Biol.2008年1月18日；375(3):837-54中有所描述。N末端封端模块(即N末端封端重复序列)的示例是SEQ IDNO:10-16，并且C末端封端模块(即C末端封端重复序列)的示例是SEQ ID NO:17-26。
在一个示例性实施方案中，N末端封端模块包含SEQ ID NO:10至15中的任一者的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:10至15中的任一者的至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸任选地被任何氨基酸交换。
在一个示例性实施方案中，C末端封端模块包含SEQ ID NO:17至25中的任一者的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:17至25中的任一者的至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸任选地被任何氨基酸交换。
有利地，在一些实施方案中，本文提供的经设计的锚蛋白重复结构域的N末端封端模块和/或C末端封端模块中的某些氨基酸残基被改变，导致该经设计的锚蛋白重复结构域和包含经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白的药代动力学特性(包括延长的终末半衰期)得到改善。经改变的氨基酸残基主要是表面暴露的残基。优选地，经改变的氨基酸残基是N末端封端模块的位置8和15处的氨基酸残基，其中位置8处的氨基酸为Q，并且位置15处的氨基酸为L，并且其中位置编号对应于SEQ ID NO:10中的位置；以及C末端封端模块的位置14和18处的氨基酸残基，其中位置14处的氨基酸为R，并且位置18处的氨基酸为Q，并且其中位置编号对应于SEQ ID NO:17中的位置。
例如，具有经改变的氨基酸残基的N末端封端模块可包含以下序列：DLGxxLLQAAxxGQLDxVRxLxxxGADVNA(SEQ ID NO:16)，其中“x”表示任何氨基酸。
例如，具有经改变的氨基酸残基的C末端封端模块可包含以下序列：xDxxGxTPADxAARxGHQxIAxVLQxAA(SEQ ID NO:26)，其中“x”表示任何氨基酸。
因此，在一个实施方案中，本发明的对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的N末端封端模块，其中“x”表示任何氨基酸。另选地或除此之外，本发明的对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域可包含具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的C末端封端模块，其中“x”表示任何氨基酸。
在一个具体实施方案中，本发明的对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1至4中的任一者的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1至4中的任一者的位置8处的氨基酸E被Q取代，并且SEQ ID NO:1至3中的任一者的位置15处的氨基酸D被L取代。另选地或除此之外，本发明的对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1至4中的任一者的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1至4中的任一者的位置110处的氨基酸K被R取代，并且SEQ ID NO:1和2的位置114处的氨基酸E或SEQ ID NO:4的氨基酸R被Q取代。
此外，本发明的CD3结合结构域还可任选地在其N末端处包含“G”、“S”或“GS”序列。因此，在一些实施方案中，本文提供的CD3结合结构域(i)包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且(ii)在其N末端处还包含G、S或GS。在一个示例性实施方案中，CD3结合结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且在其N末端处还包含G、S或GS。在一个示例性实施方案中，CD3结合结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且在其N末端处还包含G、S或GS。在一个示例性实施方案中，CD3结合结构域包含SEQ ID NO:1至4中的任一者的氨基酸序列，并且在其N末端处还包含G、S或GS。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白还包含对疾病相关抗原具有结合特异性的结合剂。
因此，在一个具体实施方案中，本发明的重组结合蛋白包含如本文任一方面或实施方案中更具体地描述的对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且还包含对疾病相关抗原具有结合特异性的结合剂。在一个优选的实施方案中，所述对疾病相关抗原具有结合特异性的结合剂位于所述结合蛋白内的所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的N末端。
在一个实施方案中，所述疾病相关抗原是肿瘤相关抗原(TAA)。肿瘤相关抗原的例示性示例包括但不限于在肿瘤细胞的细胞表面上表达的蛋白质，诸如例如HER2(本文中也称为TAA1)、CD123(本文中也称为TAA2)、CD33(本文中也称为TAA3)和CD70(本文中也称为TAA4)或肽-MHC复合物，其中所述肽来源于在肿瘤细胞中表达的蛋白质(诸如例如NY-ESO-1或MAGE-A3)，并且所述MHC是MHC I类。在另一个实施方案中，所述疾病相关抗原是感染相关抗原，优选地病毒相关抗原(VAA)。病毒相关抗原的例示性示例包括但不限于肽-MHC复合物，其中所述肽来源于病毒感染因子(诸如例如HBcAg或EBNA-1)，并且所述MHC是MHC I类。在一个实施方案中，所述对疾病相关抗原具有结合特异性的结合剂连接、缀合、融合或以其他方式物理附接到所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。在一个实施方案中，所述对疾病相关抗原具有结合特异性的结合剂共价连接到所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。在一个实施方案中，所述对疾病相关抗原具有结合特异性的结合剂通过肽接头共价连接到所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。在一个实施方案中，所述肽接头的氨基酸序列具有1至50个氨基酸、优选地6至38个氨基酸的长度。在一个实施方案中，所述肽接头是富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述肽接头是SEQ IDNO:31和42至46中的任一者的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述对疾病相关抗原具有结合特异性的结合剂通过SEQ ID NO:31和42至46中的任一者的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头共价连接到所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。在一个优选的实施方案中，所述对疾病相关抗原具有结合特异性的结合剂是对疾病相关抗原具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域。
在一个实施方案中，本发明的重组结合蛋白包含如本文任一方面或实施方案中更具体地描述的对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且还包含如本文任一方面或实施方案中更具体地描述的两个对疾病相关抗原具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。在一个优选的实施方案中，所述两个对疾病相关抗原具有结合特异性的锚蛋白重复结构域位于所述结合蛋白内的所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的N末端。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白还包含半衰期延长部分。
因此，在一个具体实施方案中，本发明的重组结合蛋白包含如本文任一方面或实施方案中更具体地描述的对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且还包含半衰期延长部分。在一个优选的实施方案中，所述半衰期延长部分位于所述结合蛋白内的所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的N末端。
在一个实施方案中，所述半衰期延长部分包含对人血清白蛋白具有结合特异性的结合剂。
在一个实施方案中，所述半衰期延长部分是对人血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白结合结构域。在一个实施方案中，所述对人血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白结合结构域包含与SEQ ID NO:28至30中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，本发明的重组结合蛋白包含如本文任一方面或实施方案中更具体描述的对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且还包含对人血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白结合结构域，其具有与SEQ ID NO:28至30中的任一者具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述对人血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:28至30中的任一者具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述对人血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:28至30中的任一者具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述对人血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:28至30中的任一者具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述对人血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:28至30中的任一者具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述对人血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:28至30中的任一者的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，本发明的重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且还包含对人血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且其中对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1至4中的任一者的氨基酸序列，并且其中所述对人血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:28至30中的任一者的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，所述对人血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域位于所述结合蛋白内的所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的N末端。
在一个优选的实施方案中，所述对人血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白结合结构域包含与SEQ ID NO:29具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，本发明的重组结合蛋白包含如本文任一方面或实施方案中更具体描述的对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且还包含对人血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白结合结构域，其具有与SEQ ID NO:29具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述对人血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:29具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述对人血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:29具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述对人血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:29具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述对人血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:29具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述对人血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，本发明的重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且还包含对人血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且其中对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含SEQID NO:1至4中的任一者的氨基酸序列，并且其中所述对人血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，所述对人血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域位于所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的N末端。
在一个实施方案中，与包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域但不包含对人血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的对应重组结合蛋白相比，包含所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域并且还包含所述对人血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的本发明的重组结合蛋白表现出增加的终末半衰期，优选地增加至少5％、优选地10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或250％的终末半衰期。
在一个实施方案中，本发明的重组结合蛋白包含如本文任一方面或实施方案中更具体地描述的对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且还包含如本文任一方面或实施方案中更具体地描述的两个对人血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。
在一个实施方案中，本发明的重组结合蛋白还包含多肽标签。多肽标签为附接到多肽/蛋白质的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列可用于纯化、检测或靶向所述多肽/蛋白质，或者其中所述氨基酸序列改善多肽/蛋白质的物理化学行为，或者其中所述氨基酸序列具有效应子功能。结合蛋白的各个多肽标签可直接或经由肽接头连接到结合蛋白的其他部分。多肽标签在本领域中是众所周知的，并且是本领域技术人员完全可用的。多肽标签的示例为小的多肽序列，例如His、HA、myc、FLAG或Strep标签；或多肽，诸如允许检测所述多肽/蛋白质的酶(例如，碱性磷酸酶)或可用于靶向的多肽(诸如，免疫球蛋白或其片段)和/或可用作效应分子的多肽。
在一个实施方案中，本发明的重组结合蛋白还包含肽接头。肽接头为能够连接例如两个蛋白质结构域、多肽标签和蛋白质结构域、蛋白质结构域和非蛋白质类化合物或聚合物(诸如聚乙二醇)、蛋白质结构域和生物活性分子、蛋白质结构域和定位剂、或两个序列标签的氨基酸序列。肽接头是本领域技术人员已知的。示例的列表在专利申请WO2002/020565的说明书中提供。此类接头的具体示例为可变长度的甘氨酸-丝氨酸接头和脯氨酸-苏氨酸接头。甘氨酸-丝氨酸接头的示例为氨基酸序列GS和SEQ ID NO:41的氨基酸序列，并且脯氨酸-苏氨酸接头的示例为SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:42至46的氨基酸序列。
在另一方面，本发明涉及编码本发明的锚蛋白重复结构域或重组结合蛋白的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的重组结合蛋白的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码选自由SEQ ID NO:1至4组成的组的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码SEQ IDNO:4的氨基酸序列的核酸。此外，本发明涉及包含本发明的任何核酸的载体。核酸是本领域技术人员熟知的。在实施例中，使用核酸在大肠杆菌中产生本发明的经设计的锚蛋白重复结构域或重组结合蛋白。本发明的核酸的示例由SEQ ID NO:37至40提供，这些核酸分别编码SEQ ID NO:1至4的氨基酸序列。
在一个方面，本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的重组结合蛋白和/或经设计的锚蛋白重复结构域，和/或编码本发明的重组结合蛋白和/或经设计的锚蛋白重复结构域的核酸，以及任选地药学上可接受的载剂和/或稀释剂。
在一个实施方案中，本发明涉及包含重组结合蛋白或编码本发明的重组结合蛋白的核酸以及任选地药学上可接受的载剂和/或稀释剂的药物组合物。
药学上可接受的载剂和/或稀释剂是本领域技术人员已知的，并且将在下文更详细地说明。
药物组合物包含本文所述的重组结合蛋白和/或经设计的锚蛋白重复结构域和/或核酸，优选地重组结合蛋白和/或核酸，以及药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂，例如如Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.编辑，1980中所述。
本领域技术人员已知的合适载剂、赋形剂或稳定剂包括例如盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液、汉克氏溶液、固定油，油酸乙酯、5％右旋糖盐水、增强等渗性和化学稳定性的物质、缓冲液和防腐剂。其他合适载剂包括本身不诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体的任何载剂，诸如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸和氨基酸共聚物。药物组合物还可以是组合制剂，其包含另外的活性剂，诸如抗癌剂或抗血管生成剂，或另外的生物活性化合物。
待用于体内给药的制剂必须是无菌的或经过消毒的。这很容易通过无菌过滤膜过滤实现。
本发明的一个实施方案涉及包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域并且还包含对人血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的本发明的重组结合蛋白用于制造药物组合物的用途，其中与包含所述对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域但不包含所述对血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的对应重组结合蛋白相比，所述重组结合蛋白表现出增加的终末半衰期，优选地增加至少5％、优选地10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或250％的终末半衰期。在本发明的一个实施方案中，重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且还包含两个对血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。
在一个实施方案中，药物组合物包含至少一种如本文所述的重组结合蛋白以及洗涤剂诸如非离子洗涤剂、缓冲液诸如磷酸盐缓冲液和糖诸如蔗糖。在一个实施方案中，这种组合物包含如上所述的重组结合蛋白以及PBS。
在另一方面，本发明提供了在包括人在内的哺乳动物的肿瘤细胞或组织中进行CD3介导的T细胞激活的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用本发明的重组结合蛋白的步骤，该重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的阴蛋白重复结构域并且还包含定位剂分子。在一个实施方案中，所述定位剂分子是对不同于CD3的靶标、优选地TAA或VAA具有结合特异性的结合蛋白。在一个实施方案中，所述哺乳动物为人，并且所述表达TAA的细胞或组织位于肿瘤中，包括原发性肿瘤、转移和/或肿瘤基质中。
在另一方面，本发明提供了一种在包括人在内的哺乳动物中肿瘤定位激活T细胞的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用本发明的结合蛋白、本发明的核酸或本发明的药物组合物的步骤。
在另一方面，本发明提供了一种在包括人在内的哺乳动物中感染定位激活T细胞的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用本发明的结合蛋白、本发明的核酸或本发明的药物组合物的步骤。
在另一方面，本发明提供了一种治疗医学病症的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的本发明重组结合蛋白的步骤，所述重组结合蛋白还包含对疾病相关抗原具有结合特异性的结合剂、编码所述结合蛋白的核酸或包含所述结合蛋白的药物组合物。在另一方面，本发明提供了一种治疗医学病症的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的本发明重组结合蛋白的步骤，所述重组结合蛋白还包含对疾病相关抗原具体结合特异性的结合剂，其中所述结合剂能够有效地将所述结合蛋白定位到靶肿瘤组织或感染组织，并且其中所述结合蛋白的所述定位导致靶肿瘤或感染组织中的T细胞激活。在一个实施方案中，所述对疾病相关抗原具有结合特异性的结合剂是对TAA或VAA具有结合特异性的结合蛋白，优选地锚蛋白重复结合蛋白。
在一个实施方案中，本发明涉及将根据本发明的药物组合物、重组结合蛋白或核酸用于治疗疾病。为此目的，将根据本发明的药物组合物、核酸或重组结合蛋白以治疗有效量施用给有需要的患者。给药可包括局部给药、口服给药和肠胃外给药。典型的给药途径是肠胃外给药。在肠胃外给药中，本发明的药物组合物将与上述药学上可接受的赋形剂联合被配制成单位剂量可注射形式，诸如溶液、混悬液或乳液。给药的剂量和模式将取决于待治疗的个体和具体疾病。
另外，考虑将上文提到的药物组合物、核酸或重组结合蛋白中的任一种用于治疗病症。
在一个实施方案中，静脉内施用所述重组结合蛋白或本文所述的其他此类药物组合物。对于肠胃外应用，重组结合蛋白或所述药物组合物可以治疗有效量快速推注或通过缓慢输注来注射。
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗医学病症的方法，该方法包括向需要这种治疗的患者施用治疗有效量的本发明的重组结合蛋白、本发明的核酸或本发明的药物组合物的步骤。在一个实施方案中，本发明涉及本发明的重组结合蛋白、本发明的核酸或本发明的药物组合物用于治疗疾病的用途。在一个实施方案中，本发明涉及将本发明的重组结合蛋白、本发明的核酸或本发明的药物组合物用于治疗疾病。在一个实施方案中，本发明涉及将本发明的重组结合蛋白、本发明的核酸或本发明的药物组合物用于治疗医学病症。在一个实施方案中，本发明涉及本发明的重组结合蛋白、本发明的核酸或本发明的药物组合物作为用于治疗疾病的药物的用途。在一个实施方案中，本发明涉及本发明的重组结合蛋白、本发明的核酸或本发明的药物组合物用于制造药物的用途。在一个实施方案中，本发明涉及本发明的重组结合蛋白、本发明的核酸或本发明的药物组合物用于制造用于治疗疾病的药物的用途。在一个实施方案中，本发明涉及一种用于制造用于治疗疾病的药物的方法，其中本发明的重组结合蛋白、本发明的核酸或本发明的药物组合物是该药物的活性成分。在一个实施方案中，本发明涉及一种使用本发明的重组结合蛋白、本发明的核酸或本发明的药物组合物治疗疾病的方法。
本发明的重组结合蛋白、本发明的核酸或本发明的药物组合物用于治疗癌症或感染性疾病的用途也可与本领域已知的一种或多种其他疗法结合。如本文所用的术语“与……结合使用”应指在给定方案下进行的共同施用。这包括不同化合物的同步给药以及不同化合物的错时给药(例如，化合物A给药一次，之后化合物B给药多次，反之亦然，或者两种化合物同步给药并且其中一种化合物在后续阶段中也给药)。
在一个实施方案中，所述医学病症是癌症。在另一个实施方案中，所述医学病症是感染性疾病，优选地病毒感染性疾病。
在一个具体实施方案中，医学病症是癌症，其中癌症或肿瘤组织包含表达或展示肿瘤相关抗原的细胞，并且所述对疾病相关抗原具有结合特异性的结合剂结合在所述细胞中表达或展示的所述肿瘤相关抗原。在一个具体实施方案中，所述疾病相关抗原是在所述癌症或肿瘤组织中表达或过表达的细胞表面蛋白的胞外结构域。在另一个具体实施方案中，所述对肿瘤相关抗原具有结合特异性的结合剂结合到肽-MHC复合物，其中所述肽来源于在肿瘤细胞中表达的蛋白质(诸如例如NY-ESO-1或MAGE-A3)。在一个具体实施方案中，所述MHC是MHC I类。在一个实施方案中，所述癌症选自腺癌和鳞状细胞癌。在一个实施方案中，所述癌症选自骨肉瘤或成骨原性肉瘤(骨)、软骨肉瘤(软骨)、平滑肌肉瘤(平滑肌)、横纹肌肉瘤(骨骼肌)、间皮肉瘤或间皮瘤(体腔的膜内衬)、纤维肉瘤(纤维组织)、血管肉瘤或血管内皮瘤(血管)、脂肪肉瘤(脂肪组织)、胶质瘤或星形细胞瘤(存在于脑中的神经原性结缔组织)、粘液肉瘤(原始胚胎结缔组织)和间质瘤或中胚叶混合瘤(混合结缔组织类型)。在一个实施方案中，所述癌症选自髓性白血病或粒细胞白血病(髓系和粒细胞白细胞系的恶性肿瘤)、淋巴、淋巴细胞或淋巴母细胞白血病(淋巴和淋巴细胞系的恶性肿瘤)以及真性红细胞增多症或红细胞增多症(各种血细胞产物的恶性肿瘤，但红细胞占多数)。在一个实施方案中，所述癌症选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。在一个实施方案中，所述癌症选自腺鳞癌、中胚叶混合瘤、癌肉瘤和畸胎癌。在一个实施方案中，所述癌症选自结直肠癌、胃癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、头颈癌、卵巢癌、肺癌、浸润性膀胱癌、胰腺癌、脑转移性癌症、头颈鳞状细胞癌、食道鳞状细胞癌、肺鳞状细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、黑素瘤、乳腺腺癌、肺腺癌、子宫颈鳞状细胞癌、胰腺鳞状细胞癌、结肠鳞状细胞癌或胃鳞状细胞癌、前列腺癌、骨肉瘤或软组织肉瘤和良性肿瘤。在一个实施方案中，这种癌症选自上皮恶性肿瘤(原发性和转移性)，包括肺癌、结直肠癌、胃癌、膀胱癌、卵巢癌和乳腺癌，以及骨和软组织肉瘤。
在另一个具体实施方案中，医学病症是感染性疾病，优选地病毒感染性疾病，其中受感染组织包含表达或展示感染相关抗原、优选地病毒相关抗原的细胞，并且所述对疾病相关抗原具有结合特异性的结合剂结合在所述细胞中表达或展示的所述感染相关抗原。在一个具体实施方案中，所述疾病相关抗原是在所述受感染组织中表达或过表达的病毒蛋白的胞外结构域。在另一个具体实施方案中，所述对病毒相关抗原具有结合特异性的结合剂结合到肽-MHC复合物，其中所述肽来源于感染因子的蛋白质，该感染因子诸如细菌感染因子或病毒感染因子，优选地病毒感染因子(诸如例如HBcAg或EBNA-1)。在一个具体实施方案中，所述MHC是MHC I类。在一个实施方案中，所述感染性疾病选自由乙肝病毒(HBV)引起的病毒感染、由Epstein–Barr病毒(EBV)引起的病毒感染、HIV感染、西尼罗河病毒感染、甲型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎、天花、肺结核、水泡性口炎病毒(VSV)感染、呼吸道合胞病毒(RSV)感染、人乳头状瘤病毒(HPV)感染、SARS、流行性感冒、埃博拉病毒、病毒性脑膜炎、疱疹、炭疽热、莱姆病和大肠杆菌感染。在一个实施方案中，本发明涉及包含任一上述锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白。
在一个实施方案中，本发明涉及一种包括本发明的重组结合蛋白的试剂盒。在一个实施方案中，本发明涉及一种包括编码本发明的重组结合蛋白的核酸的试剂盒。在一个实施方案中，本发明涉及一种包括本发明的药物组合物的试剂盒。在一个实施方案中，本发明涉及一种包括本发明的重组结合蛋白、和/或本发明的核酸、和/或本发明的药物组合物的试剂盒。在一个实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，该试剂盒包括：重组结合蛋白，该重组结合蛋白包含本发明的对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，例如SEQ ID NO:1至4；和/或核酸，该核酸编码包含具有对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白例如SEQ ID NO:1至4；和/或药物组合物，该药物组合物包含具有对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白例如SEQ ID NO:1至4。
在一个实施方案中，本发明涉及用于产生本发明的重组结合蛋白的方法。在一个实施方案中，本发明提供了一种用于产生重组结合蛋白(例如，包含SEQ ID NO:1至4的氨基酸序列的重组结合蛋白)的方法，该方法包括以下步骤：(i)在合适的宿主细胞(例如，细菌)中表达所述重组结合蛋白，以及(ii)纯化所述重组结合蛋白(例如，使用色谱法)。所述方法可包括附加步骤。此类产生本发明的重组结合蛋白的方法描述于实施例1中。
本发明不限于实施例中描述的具体实施方案。
本说明书涉及在所附序列表中公开的许多氨基酸序列、核酸序列和SEQ ID NO，该序列表全文以引用方式并入本文。
定义
除非本文另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语应具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
在本发明的上下文中，术语“蛋白质”是指包含多肽的分子，其中多肽的至少一部分通过在单个多肽链内和/或多个多肽链之间形成二级、三级和/或四级结构而具有或能够获得限定的三维排列。如果蛋白质包含两个或更多个多肽链，则各个多肽链可非共价连接或共价连接，例如通过两个多肽之间的二硫键连接。通过形成二级和/或三级结构而单独具有或能够获得限定的三维排列的蛋白质部分被称为“蛋白质结构域”。这种蛋白质结构域是本领域技术人员熟知的。
在重组蛋白、重组多肽等中使用的术语“重组”是指所述蛋白质或多肽是通过使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术产生的。例如，可将编码多肽的重组DNA分子(例如，通过基因合成产生)克隆到细菌表达质粒(例如，pQE30，QIAgen公司)、酵母表达质粒、哺乳动物表达质粒或植物表达质粒，或者能够体外表达的DNA中。如果例如将此类重组细菌表达质粒插入适当的细菌(例如，大肠杆菌(Escherichia coli))中，则这些细菌可产生由该重组DNA编码的多肽。对应产生的多肽或蛋白质被称为重组多肽或重组蛋白。
在本发明的上下文中，术语“结合蛋白”是指包含结合结构域的蛋白质。结合蛋白还可包含两个、三个、四个、五个或更多个结合结构域。优选地，所述结合蛋白是重组结合蛋白。本发明的结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。
此外，任何此类结合蛋白可包含附加多肽(诸如例如多肽标签、肽接头、与其他具有结合特异性的蛋白质结构域的融合、细胞因子、激素、或拮抗剂)、或本领域技术人员熟知的化学修饰(诸如偶联到聚乙二醇、毒素(例如，来自免疫原的DM1)、小分子、抗生素等)。本发明的结合蛋白可包含定位剂分子。
术语“结合结构域”意指对靶标表现出结合特异性的蛋白质结构域。优选地，所述结合结构域是重组结合结构域。
术语“靶标”是指单个分子，诸如核酸分子、多肽或蛋白质、碳水化合物或任何其他天然存在的分子，包括此类单个分子的任何部分，或者两种或更多种此类分子的复合物，或整个细胞或组织样品，或任何非天然化合物。优选地，靶标是天然存在的或非天然的多肽或蛋白质，或含有化学修饰(例如天然或非天然的磷酸化、乙酰化或甲基化)的多肽或蛋白质。在本发明的上下文中，T细胞是CD3特异性结合蛋白和定位剂靶蛋白的靶标，并且细胞和组织是定位剂的靶标。
在本发明的上下文中，术语“多肽”涉及由多个(即两个或更多个)经由肽键连接的氨基酸的链组成的分子。优选地，多肽由八个以上经由肽键连接的氨基酸组成。术语“多肽”还包括通过半胱氨酸的S-S桥连接在一起的氨基酸的多个链。多肽是本领域技术人员熟知的。
专利申请WO2002/020565和Forrer等人，2003(Forrer,P.,Stumpp,M.T.,Binz,H.K.,Plückthun,A.,2003.FEBS Letters 539,2-6)包含重复蛋白特征和重复结构域特征、技术和应用的一般描述。术语“重复蛋白”是指包含一个或多个重复结构域的蛋白质。优选地，重复蛋白包含一个、两个、三个、四个、五个或六个重复结构域。此外，所述重复蛋白可包含附加的非重复蛋白质结构域、多肽标签和/或肽接头。重复结构域可以是结合结构域。
术语“重复结构域”是指包含两个或更多个连续重复模块作为结构单元的蛋白质结构域，其中所述重复模块具有结构和序列同源性。优选地，重复结构域还包含N-末端和/或C-末端封端模块。为了清楚起见，封端模块可以是重复模块。这种重复结构域、重复模块和封端模块、序列基序以及结构同源性和序列同源性是本领域技术人员根据以下各项的示例所熟知的：锚蛋白重复结构域(WO2002/020565)、富含亮氨酸的重复结构域(WO2002/020565)、三十四肽重复结构域(Main,E.R.,Xiong,Y.,Cocco,M.J.,D'Andrea,L.,Regan,L.,Structure 11(5),497-508,2003)和犰狳重复结构域(WO2009/040338)。本领域技术人员还熟知，此类重复结构域不同于包含重复氨基酸序列的蛋白质，其中每个重复氨基酸序列能够形成单个结构域(例如纤连蛋白的FN3结构域)。
如在经设计的重复蛋白、经设计的重复结构域等中所用，术语“经设计的”是指此类重复蛋白和重复结构域分别是人造的并且在自然界中不存在的性质。本发明的结合蛋白是经设计的重复蛋白，并且它们包含至少一个经设计的锚蛋白重复结构域。
术语“靶标相互作用残基”是指有助于与靶标直接相互作用的重复模块的氨基酸残基。
术语“框架残基”是指重复模块的氨基酸残基，其有助于折叠拓扑结构，即有助于所述重复模块的折叠或有助于与相邻模块的相互作用。此类贡献可为与重复模块中其他残基的相互作用，或是对如α-螺旋或β-片层中存在的多肽主链构象的影响，或是参与形成直链多肽或环的氨基酸延伸。
此类框架和靶标相互作用残基可通过分析由物理化学方法(诸如X射线晶体学、NMR和/或CD光谱)获得的结构数据，或通过与结构生物学和/或生物信息学领域从业者熟知的已知和相关结构信息进行比较来鉴定。
术语“重复模块”是指经设计的重复结构域的重复氨基酸序列和结构单元，其最初来源于天然存在的重复蛋白的重复单元。包含在重复结构域中的每个重复模块来源于天然存在的重复蛋白家族或亚家族(例如锚蛋白重复蛋白家族)的一个或多个重复单元。此外，重复结构域中包含的每个重复模块可包含从同源重复模块导出的“重复序列基序”，该同源重复模块从靶标上选择的重复结构域获得，例如如实施例1中所述，并且具有相同的靶标特异性。
因此，术语“锚蛋白重复模块”是指最初来源于天然存在的锚蛋白重复蛋白的重复单元的重复模块。锚蛋白重复蛋白是本领域技术人员熟知的。
重复模块可包含具有为了选择靶标特异性重复结构域而在文库中未被随机化的氨基酸残基的位置(“非随机化位置”)和具有为了选择靶标特异性重复结构域而在文库中已被随机化的氨基酸残基的位置(“随机化位置”)。非随机化位置包含框架残基。随机化位置包含靶标相互作用残基。“已被随机化”意指在重复模块的氨基酸位置处允许两个或更多个氨基酸，例如，其中允许通常二十种天然存在的氨基酸中的任一种，或者其中允许二十种天然存在的氨基酸中的大多数，诸如除半胱氨酸之外的氨基酸，或除甘氨酸、半胱氨酸和脯氨酸之外的氨基酸。在本文所公开的SEQ ID NO:5至9的模块序列的变体中，这些位置通常不被取代。
术语“重复序列基序”是指从一个或多个重复模块导出的氨基酸序列。优选地，所述重复模块来自对相同靶标具有结合特异性的重复结构域。此类重复序列基序包含框架残基位置和靶标相互作用残基位置。所述框架残基位置对应于重复模块的框架残基位置。同样，所述靶标相互作用残基位置对应于重复模块的靶标相互作用残基的位置。重复序列基序包含非随机化位置和随机化位置。
术语“重复单元”是指包含一种或多种天然存在的蛋白质的序列基序的氨基酸序列，其中所述“重复单元”存在于多个拷贝中，并且表现出确定蛋白质折叠的所有所述基序共有的限定的折叠拓扑结构。此类重复单元的示例包括富含亮氨酸的重复单元、锚蛋白重复单元、犰狳重复单元、三十四肽重复单元、HEAT重复单元和富含亮氨酸的变体重复单元。
术语“对靶标具有结合特异性”、“特异性结合到靶标”、“高特异性结合到靶标”、“特异于靶标”或“靶标特异性”等是指，在PBS中结合蛋白或结合结构域以比其结合到不相关的蛋白质(诸如，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP))更低的解离常数(即，其以更高的亲和性结合)结合到靶标。优选地，靶标在PBS中的解离常数(“KD”)是MBP的对应解离常数的至少102倍、更优选地至少103倍、更优选地至少104倍或更优选地至少105倍。确定蛋白质-蛋白质相互作用的解离常数的方法，诸如基于表面等离子共振(SPR)的技术(例如，SPR均衡分析)或等温滴定量热法(ITC)是本领域技术人员熟知的。如果在不同条件(例如，盐浓度、pH)下进行测量，则具体蛋白质-蛋白质相互作用的测量KD值可以是变化的。因此，优选地利用标准化蛋白质溶液和标准化缓冲液(诸如，PBS)来进行KD值的测量。通过表面等离子体共振(SPR)分析进行的对CD3具有结合特异性的本发明重组结合蛋白的解离常数(KD)的典型和优选的确定描述于实施例4中。
术语“结合剂”是指能够特异性结合靶分子的任何分子。结合剂包括例如抗体、抗体片段、适体、肽(例如，Williams等人，J Biol Chem266:5182-5190(1991))、抗体模拟物、重复蛋白(例如，经设计的锚蛋白重复蛋白)、受体蛋白和靶分子的任何其他天然存在的相互作用配偶体，并且可包括天然蛋白和经修饰或经遗传工程化(例如以包含非天然残基和/或以缺少天然残基)的蛋白。
术语“约”意指所提及的值+/-20％；例如，“约50”应意指40至60。
术语“PBS”意指含有137mM NaCl、10mM磷酸盐和2.7mM KCl并且pH为7.4的磷酸盐缓冲水溶液。
术语“小鼠血清白蛋白”是指UniProt登录号P07724，术语“食蟹猴血清白蛋白”(即食蟹称猴)是指UniProt登录号A2V9Z4，并且术语“人血清白蛋白”是指UniProt登录号P02768。
优选地，在哺乳动物、更优选小鼠和/或食蟹猴、更优选食蟹猴中评估清除率和/或暴露率和/或终末半衰期。可如实施例3中所述评估清除率和/或暴露率和/或终末半衰期。优选地，当在小鼠中测量清除率/或暴露率和/或终末半衰期时，考虑注射后至多48小时的数据来进行评估。更优选地，在小鼠中评估终末半衰期时，用从24小时至48小时的数据进行计算。优选地，当在食蟹猴中测量清除率和/或暴露率和/或终末半衰期时，考虑注射后至多第7天的数据进行评估。更优选地，在食蟹猴中评估终末半衰期时，用从第1天至第5天的数据进行计算。本领域的技术人员还能够识别诸如靶标介导的清除等效应，并且在计算终末半衰期时考虑它们。药物(诸如，本发明的重组结合蛋白)的术语“终末半衰期”是指达到伪平衡后药物血浆浓度达到施加于哺乳动物的该药物浓度的一半所需的时间(例如，在小鼠中用从24小时至48小时的数据进行计算，或者在食蟹猴中用从第1天至第5天的数据进行计算)。并未将终末半衰期定义为施用给哺乳动物的药物剂量消除一半所需的时间。术语“终末半衰期”是本领域技术人员熟知的。优选地，药代动力学比较以任何剂量、更优选地以当量剂量(即相同的mg/kg剂量)或等摩尔剂量(即相同的mol/kg剂量)、更优选地以等摩尔剂量(即相同的mol/kg剂量)进行。本领域技术人员应当理解，动物中当量和/或等摩尔给药的实验剂量变化为至少20％，更优选地为30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。优选地，用于药代动力学测量的剂量选自0.001mg/kg至1000mg/kg、更优选地0.01mg/kg至100mg/kg、更优选地0.1mg/kg至50mg/kg、更优选地0.5mg/kg至10mg/kg。
术语“CD3”或“分化簇3”是指由组装成三对(εγ、εδ、ζζ)的四个不同多肽链epsilon(ε)、gamma(γ)和zeta(ζ)组成的多聚体蛋白复合物。CD3复合物充当与T细胞受体非共价缔合的T细胞共受体。它可以指任何形式的CD3，以及其保留至少一部分CD3活性的变体、同种型和物种同源物。因此，如本文所定义和公开的结合蛋白也可结合来自除人以外的物种的CD3。在其他情况下，结合蛋白可完全特异于人CD3，并且可不表现出物种或其他类型的交叉反应性。除非另有说明，否则诸如通过具体参考人CD3，CD3包括天然序列CD3的所有哺乳动物种类，例如人、犬、猫、马和牛。人CD3γ、δ和ζ链的氨基酸序列分别示于NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)Ref.Seq.NP_000064.1、NP_000723.1和NP_932170.1中。
如本文所用，术语“表达CD3的细胞”是指在细胞表面上表达CD3(分化簇3)的任何细胞，包括但不限于T细胞诸如细胞毒性T细胞(CD8+T细胞)和T辅助细胞(CD4+T细胞)。
术语“T细胞的肿瘤定位激活”意指与非肿瘤组织相比，T细胞优先在肿瘤组织中被激活。
术语“T细胞的感染定位激活”意指与未感染组织相比，T细胞优先在受感染组织中被激活。
此外，术语“肽”还涵盖通过例如糖基化修饰的肽，以及包含两条或更多条多肽链的蛋白质，每条多肽链的长度为4至600个氨基酸长，通过例如二硫键交联，诸如例如胰岛素和免疫球蛋白。术语“化学或生物化学剂”旨在包括可施用于接受者的任何天然存在的或合成的化合物。
术语“医学病症”(或障碍或疾病)包括自身免疫障碍、炎性障碍、视网膜病变(特别是增殖性视网膜病变)、神经退行性障碍、感染、代谢疾病和肿瘤性疾病。本文所述的重组结合蛋白中的任一种可用于制备用于治疗此类障碍、特别是选自由以下项组成的组的障碍的药物：自身免疫障碍、炎性障碍、免疫障碍和肿瘤性疾病。“医学病症”可能是以不适当的细胞增殖为特征的病症。医学病症可能是过度增生病症。本发明具体涉及治疗医学病症的方法，该方法包括向需要这种治疗的患者施用治疗有效量的本发明的重组结合蛋白或所述药物组合物的步骤。在一个优选的实施方案中，所述医学病症是肿瘤性疾病。如本文所用，术语“肿瘤性疾病”是指以细胞生长或肿瘤快速增殖为特征的细胞或组织的异常状态或病症。在一个实施方案中，所述医学病症是恶性肿瘤性疾病。在一个实施方案中，所述医学病症是癌症。术语“治疗有效量”是指足以对患者产生期望效应的量。
术语“抗体”不仅意指完整的抗体分子，而且意指保留免疫原结合能力的抗体分子的任何片段和变体。此类片段和变体也是本领域熟知的，并且经常在体外和体内使用。因此，术语“抗体”涵盖完整免疫球蛋白分子、抗体片段(诸如例如Fab、Fab'、F(ab')2和单链V区片段(scFv))、双特异性抗体、嵌合抗体、抗体融合多肽和非常规抗体。
术语“癌症”和“癌性”在本文中用来指或描述哺乳动物中通常以未受调控的细胞生长为特征的生理状况。癌症涵盖实体瘤和液体瘤，以及原发性肿瘤和转移。“肿瘤”包含一个或多个癌细胞。实体瘤通常还包含肿瘤基质。癌症的示例包括但不限于原发性和转移性癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病，以及任何其他上皮和淋巴恶性肿瘤。此类癌症的更具体示例包括脑癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、透明细胞肾癌、头/颈鳞状细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、恶性黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌(SCLC)、三阴性乳腺癌、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(HL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、头颈鳞状细胞癌(SCCHN)、慢性髓性白血病(CML)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、恶性间皮瘤、结直肠癌或胃癌。
术语“感染性疾病”和“感染”在本文中用于指代或描述微生物在身体组织中的侵入和增殖，尤其是引起病理症状。感染性疾病的示例包括但不限于病毒性疾病和细菌性疾病，诸如例如HIV感染、西尼罗河病毒感染，甲型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎，天花、结核病、水疱性口炎病毒(VSV)感染、呼吸道合胞病毒(RSV)感染、人乳头状瘤病毒(HPV)感染、SARS、流感、埃博拉病毒、病毒性脑膜炎、疱疹、炭疽、莱姆病和大肠杆菌感染等。
实施例
下文公开的起始材料和试剂是本领域技术人员已知的，是可商购获得的和/或可使用熟知的技术制备。
材料
化学品购自Sigma-Aldrich(USA)。寡核苷酸来自Microsynth(Switzerland)。除非另有说明，否则DNA聚合酶、限制酶和缓冲液来自New England Biolabs(USA)或Fermentas/Thermo Fisher Scientific(USA)。诱导型大肠杆菌表达菌株用于克隆和蛋白质产生，例如大肠杆菌XL1-blue(Stratagene，USA)或BL21(Novagen，USA)。
分子生物学
除非另有说明，否则根据已知方案执行方法(参见例如Sambrook J.、FritschE.F.和Maniatis T.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory 1989,New York)。
经设计的锚蛋白重复蛋白文库
用于生成经设计的锚蛋白重复蛋白文库的方法已经描述于以下文献中：例如，美国专利7,417,130；Binz等人，2003，同前；Binz等人,2004，同前。通过此类方法，可构建具有随机化锚蛋白重复模块和/或随机化封端模块的经设计的锚蛋白重复蛋白文库。例如，此类文库可以因此基于固定的N末端封端模块(例如SEQ ID NO:10、11、12、13、14或15的N末端封端模块)或根据SEQ ID NO:16的随机化N末端封端模块、以及固定的C末端封端模块(例如SEQ ID NO:17、18、19、20、21、22、23、24或25的C末端封端模块)或根据SEQ ID NO:26的随机化C末端封端模块进行组装。优选地，此类文库被组装成在重复或封端模块的随机化位置处不具有氨基酸C、G、M、N(在G残基前面)和P中的任一者。
此外，此类文库中的此类随机化模块可包含具有随机化氨基酸位置的附加的多肽环插入。此类多肽环插入的示例是抗体的互补决定区(CDR)环文库或从头生成的肽文库。例如，可以使用人核糖核酸酶L的N末端锚蛋白重复结构域的结构(Tanaka,N.,Nakanishi,M,Kusakabe,Y,Goto,Y.,Kitade,Y,Nakamura,K.T.,EMBO J.23(30),3929-3938,2004)作为指导来设计这种环插入。类似于其中将十个氨基酸插入在靠近两个锚蛋白重复的边界存在的β-转角中的这种锚蛋白重复结构域，锚蛋白重复蛋白文库可包含插入在锚蛋白重复结构域的一个或多个β-转角中的可变长度(例如，1至20个氨基酸)的随机化环(具有固定位置和随机化位置)。
锚蛋白重复蛋白文库的任何这种N末端封端模块优选地具有RILLAA、RILLKA或RELLKA基序(例如，存在于SEQ ID NO:1中的位置21至26)，并且锚蛋白重复蛋白文库的任何这种C末端封端模块优选地具有KLN、KLA或KAA基序(例如，存在于SEQ ID NO:1中的最后三个氨基酸处)。SEQ ID NO:10、11、12、13、14或15提供了包含RILLAA、RILLKA或RELLKA基序的N末端封端模块的实施例，并且SEQ ID NO:17、18、19、20、21、22、23、24或25提供了包含KLN、KLA或KAA基序的C末端封端模块的实施例。
此类锚蛋白重复蛋白文库的设计可由与靶标相互作用的锚蛋白重复结构域的已知结构来指导。由其蛋白质数据库(PDB)唯一登录号或识别码(PDB-ID)识别的此类结构的示例为1WDY、3V31、3V30、3V2X、3V2O、3UXG、3TWQ-3TWX、1N11、1S70和2ZGD。
已经描述了经设计的锚蛋白重复蛋白文库(诸如N2C和N3C经设计的锚蛋白重复蛋白文库)的示例(美国专利号7,417,130；Binz等人,2003，同前；Binz等人，2004，同前)。N2C和N3C中的数字描述了存在于N-末端和C-末端封端模块之间的随机化重复模块的数量。
用于定义重复单元和模块内部的位置的命名法基于Binz等人，2004(同前)，修改之处在于，锚蛋白重复模块和锚蛋白重复单元的边界移位一个氨基酸位置。例如，Binz等人2004(同前)的锚蛋白重复模块的位置1对应于本公开的锚蛋白重复模块的位置2，因而Binz等人2004(同前)的锚蛋白重复模块的位置33对应于本公开的以下锚蛋白重复模块的位置1。
通过测序确认所有DNA序列，并且通过质谱法确认所选择的蛋白质的计算分子量。
实施例1：包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的结合蛋白的选择
使用核糖体展示(Hanes,J.和Plückthun,A.,PNAS 94,4937-42,1997)，从与如Binz等人2004(同前)所述相似的文库中选择许多对人scCD3具有结合特异性的锚蛋白重复蛋白。通过粗提取物均相时间分辨荧光(HTRF)评估所选择的克隆对重组人CD3靶标的结合，表明成功选择数百种人scCD3特异性结合蛋白。例如，SEQ ID NO:1的锚蛋白重复结构域构成所选择的包含对scCD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的结合蛋白的氨基酸序列。来自此类对scCD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的各个锚蛋白重复模块例如在SEQ ID NO:5至9中提供。
人重组CD3靶标制备
所选择的靶标形式基于单链形式，由通过26个氨基酸的接头(scCD3εγ)和用于定点生物素化的C末端Avi标签连接的人CD3ε和CD3γ异源二聚体组成。靶蛋白仅含有CD3胞外结构域，缺少C末端半胱氨酸“突起”和整个跨膜区和胞质区。
将人scCD3εγ的胞外结构域(SEQ ID NO:32_scCD3εγ_Avi-Bio)以类似于先前所述(Kjer-Nielsen等人，PNAS,2004,101(20):7675-7680)的单链形式在大肠杆菌中表达，之后从包涵体重折叠并通过制备型尺寸排阻色谱法(SEC)纯化。将该物质在10mM Tris-HCl、50mM NaCl、pH 8.0中浓缩至3.4mg/ml，并使用重组BirA体外生物素化。为了分离功能性靶物质，使用负载OKT3的柱(GE HiTrap NHS活化的HP柱)再纯化该物质。最终的物质在尺寸排阻上是单体的，并且以0.39mg/ml的最终浓度储存在10mM Tris、100mM NaCl、pH 8.0、10％甘油中。
重组人scCD3靶标制备方法的综述描述于Dunstone等人，ActaCrystallographica 2004中。
通过核糖体展示选择CD3特异性锚蛋白重复蛋白
CD3特异性锚蛋白重复蛋白的选择使用CD3的部分胞外结构域(SEQ ID NO:32)(作为靶蛋白)、如上所述的锚蛋白重复蛋白文库和已确立的方案(参见例如Zahnd,C.、Amstutz,P.和Plückthun,A.，Nat.Methods 4,69-79,2007)通过核糖体展示技术(Hanes和Plückthun，同前)进行。每轮选择后，逆转录(RT)-PCR循环数不断从45减少至28，从而由于结合物的富集而调整收率。前四轮选择采用标准核糖体展示选择，使用降低靶标浓度(分别为400nM、133nM、45nM和15nM)和增加洗涤严格性来增加从第1轮到第4轮的选择压力(Binz等人，2004，同前)。在第2-4轮中，使用过量的CD3结合抗体OKT3通过竞争性洗脱回收mRNA(在每轮中，竞争剂过量恒定地从35倍增加到300倍)。
所选克隆以二价形式激活T细胞
通过核糖体展示选择结合到CD3靶标的各个锚蛋白重复蛋白克隆，将其克隆到pQE30(Qiagen)表达载体的衍生物中，转化到大肠杆菌XL1-Blue(Stratagene)中，将其铺板在LB-琼脂(含有1％葡萄糖和50μg/ml氨苄青霉素)上，然后在37℃处温育过夜。使用表达载体(具有His和Myc标签以及CD3特异性锚蛋白重复结构域的Jun亮氨酸拉链构建体)以二价形式筛选(关于CD3特异性结合域)，其允许通过T细胞的交联来测试功能。将单个菌落挑取到含有160μl生长培养基(含有1％葡萄糖和50μg/ml氨苄青霉素的TB)的96孔板中(每个克隆在单个孔中)，并以800rpm振荡在37℃处温育过夜。将含50μg/ml氨苄青霉素的150μl新鲜TB培养基与8.5μl过夜培养物一起接种于新鲜的96孔板中。在37℃和850rpm处温育120分钟后，用IPTG(0.5mM最终浓度)诱导表达并持续4小时。收获细胞，并将沉淀物在-20℃处冷冻过夜，然后重悬于8.5μl B-PERII(Thermo Scientific)中，并在室温处振荡(600rpm)温育一小时。然后，添加160μl PBS，并通过离心(3220g，持续15min)去除细胞碎片，储存于-20℃处以供将来使用。
在第一步骤中，使用BK112 CD8+单克隆T细胞进行T细胞激活筛选。将每个裂解的克隆的提取物以在PBSB(补充有12％(w/v)FBS的PBS pH 7.4)中的1:20稀释液(最终浓度)施加到抗五组氨酸抗体(Qiagen)包被的96孔板上，并在4℃处温育过夜。用PBS洗涤板五次，然后每孔添加100μl 100,000BK112 T细胞，在T细胞测定培养基RPMI-1640+10％FBS+1％L-谷氨酰胺+1％Pen Strep+200IU IL2中培养。添加0.1μg/100μL的Golgi Stop，并将板在室温处以20g离心3分钟，然后在37℃处在CO2培养箱中温育4小时-5小时。将细胞在4℃处以350g离心5分钟并倾析。对细胞染色以进行表面CD8表达，然后使用BD Cytofix保存细胞，在4℃处温育过夜。用1xPBS+2％FBS洗涤细胞，并且通过在Cell perm(BD)中添加50μl IFNγ-APC抗体并在4℃处温育30分钟来对胞内IFNγ进行染色。在PBS中再次洗涤细胞，并使用得自BD的细胞计数器FACS Canto II进行分析。
所选择的克隆显示出与CD3的结合(由HTRF和OKT3竞争显示)和双特异性形式的功 能
将鉴定的功能性设计的锚蛋白重复结构域命中亚克隆到含有N末端His标签、肿瘤相关抗原1(TAA1)特异性锚蛋白重复结构域和CD3特异性锚蛋白重复结构域的pQE30(Qiagen)表达载体的衍生物中，以形成T细胞接合物(TCE)构建体。在大肠杆菌细胞中表达构建体，并根据标准方案使用其His标签纯化。使用25ml固定过夜培养物(TB，1％葡萄糖、50μg/ml的氨苄青霉素；37℃)接种500ml培养物(TB，50μg/ml氨苄青霉素，37℃)。在600nm处1.0至1.5的吸光度下，用0.5mM IPTG诱导培养物并在37℃处温育4小时-5小时，同时振荡。将培养物离心，并将所得沉淀重悬于25ml TBS500(50mM Tris–HCl，500mM NaCl，pH8)中并裂解(超声处理)。裂解后，将样品与50KU DNase/ml混合，温育15分钟，然后在62.5℃处热处理30分钟，离心并收集上清液并过滤。向匀浆中添加Triton X100(1％(v/v)最终浓度)和咪唑(20mM最终浓度)。根据本领域技术人员已知的标准方案和树脂，将蛋白质在镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)柱上进行纯化，随后在系统上进行尺寸排阻色谱法。
在第一步骤中，使用HTRF测定法测试与重组蛋白的结合。针对384孔板的孔中的48nM(最终浓度)人生物素酰化scCD3εγ、1:100(最终浓度)的抗6His-D2 HTRF抗体-FRET受体缀合物(Cisbio)和1:100(最终浓度)的抗strep-Tb抗体FRET供体缀合物(Cisbio)进行PBS-TC(补充有0.1％(w/v)Casein和0.1％Tween20的PBS，pH 7.4)中的锚蛋白重复蛋白(5nM-640nM)的滴定，并在室温处温育120分钟。使用340nm激发波长和665±10nm发射滤光器在Tecan M1000上读出HTRF。若干种候选物显示出剂量依赖性结合，并用于进一步评价。对于所有这些构建体，当与20倍过量的CD3结合抗体(含有人Fc区的OKT3变体，最终浓度2.4mM)竞争时，结合信号处于背景水平，该抗体结合到CD3ε的构象表位(Kjer-Nielsen等人，PNAS,2004,101(20):7675-7680)。在表达TAA1的肿瘤细胞的存在下，使用BK112 T细胞激活测定法(用CD3/CD28 Dynabeads预激活的BK112 CD8单克隆T细胞)确认剂量依赖性体外T细胞激活。在1pM-100,000pM双特异性TCE构建体的存在下，在BK112和SKOV3细胞(E:T＝1:10)温育5小时后，测量CD8+或CD4+T细胞上的胞内IFNy水平。对于CD4+和CD8+细胞，最有效的构建体分别显示出0.5nM和0.4nM的EC50值。
所选择的CD3特异性锚蛋白重复蛋白的亲和力成熟和合理设计
将与合理设计组合的若干轮亲和力成熟应用于亲本低亲和力结合CD3特异性锚蛋白重复蛋白(命名为前体A)，并得到四种更高亲和力的CD3特异性锚蛋白重复蛋白(命名为前体B、C和D)。然后将这些前体分子最终工程化为CD3特异性锚蛋白重复蛋白蛋白质#1、蛋白质#2、蛋白质#3和蛋白质#4。
如Zahnd等人，Nat Methods,2007,4:269–279中所述，通过使用易错PCR和DNA I改组引入多样性，在亲本CD3特异性锚蛋白重复蛋白之一(前体A)上进行亲和成熟，选择该特异性锚蛋白重复蛋白时考虑其对CD3靶标的足够结合能力和其有效体外激活T细胞的能力。简言之：使用不同浓度的dNTP类似物(得自Jena Biosciences的诱变试剂盒，使用5μM-10μM8-氧代-dGTP和dPTP)进行三轮核糖体展示，以随着选择压力的增加每个CD3特异性锚蛋白重复蛋白/轮引入约1-2个突变(洗涤步骤从第1轮(3×15分钟)增加至3×30分钟(第2轮)，至3×45分钟(第3轮))，同时靶浓度保持恒定在5nM。在第二步骤中，在一轮或两轮核糖体展示中使用90秒的DNAse I温育时间和DNA聚合酶HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen)，使用亲本克隆对DNA库进行DNA改组和回交，如先前所述(Cadwell和Joyce，PCR Methods Appl,1992,2:28–33；Stemmer,Nature,1994 370:389–391；Zaccolo等人，J Mol Biol 1996,255:589–603)。将亲和力成熟的CD3特异性锚蛋白重复蛋白库亚克隆到pQE30(Qiagen)表达载体的衍生物中，最终含有N末端His-Flag标签、用于半衰期延长的HSA结合锚蛋白重复结构域、TAA1结合锚蛋白重复结构域和CD3特异性锚蛋白重复结构域，并且通过HTRF表达并筛选与重组scCD3εγ的结合，如先前所述。选择前导克隆(前体B，在5轮亲和力成熟后生成，包括在所有步骤中使用10μM dNTP类似物的3轮易错PCR和两轮DNA改组和回交)。
在相同的过程中，通过BK112测定中IFNγ+T细胞的％鉴定了用于增加的T细胞激活的若干种潜在的有益突变，包括在位置5和20的N帽突变、在位置2和4的第1内部重复突变、在位置2、5和20的第2内部重复突变以及在位置1和18的C帽突变。这些突变的组合(同时保持N帽和C帽框架突变最少以维持热稳定性)得到一组经设计的变体，其以相同形式再次测试改善的T细胞激活。因此，生成了新的进一步成熟的变体(前体C)，与亲本和最初成熟的变体相比，其具有更高的T细胞激活效力。
为了进一步提高CD3亲和力和T细胞激活效力，与上述相似，对前体C克隆进行第二次亲和力成熟。简言之：进行四轮核糖体展示。在前三轮中，用7.5μM dNTP类似物通过易错PCR引入突变。在第一轮和第三轮中，使用进一步成熟的克隆本身或非生物素化的CD3靶蛋白进行解离率选择以实现竞争。在第1轮和第2轮中使用1nM靶标，而在较不严格的第3轮和第4轮中应用5nM靶标。使用解离率HTRF测定，以250倍的进一步成熟的克隆作为竞争物，以三特异性形式筛选CD3变体，包含HSA结合结构域和TAA1结合锚蛋白重复结构域。对竞争后具有最高剩余HTRF信号的总共3x96个克隆进行测序。所鉴定的用于改善结合的有益突变(包括N帽位置16，第一内部重复位置1、12、18、19、26、30和33，第二内部重复位置2、3、7、20、21、26和32，以及C帽位置9、11和18)或用于减少结构域相互作用的有益突变(包括N帽位置11、18、19、26，以及C帽位置3、19和22)首先作为单独或配对突变在纯化的蛋白质变体上测试用于BK112 T细胞激活。然后在第二步骤中重组最有益的变体，并筛选具有最高T细胞激活的变体，这导致前体D的鉴定。
在最后一步中，分别基于CD3特异性锚蛋白重复蛋白前体A、B、C和D生成变体蛋白质#1、蛋白质#2、蛋白质#3和蛋白质#4，以改善血清半衰期和生物物理特性。由此，在位置23和/或26引入N帽突变，同时去除一些框架突变(在位置19、18)。
如下所述，将对人CD3具有结合特异性的亲和力成熟的锚蛋白重复结构域克隆到基于pQE(QIAgen，Germany)的表达载体中，从而提供N末端His标签(SEQ ID NO:27)以有利于简单蛋白质纯化。例如，构建编码以下锚蛋白重复蛋白的表达载体：
蛋白质#1(SEQ ID NO:1，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ ID NO:27))；
蛋白质#2(SEQ ID NO:2，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ ID NO:27))；
蛋白质#3(SEQ ID NO:3，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ ID NO:27))；
蛋白质#4(SEQ ID NO:4，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ ID NO:27))；
CD3特异性锚蛋白重复蛋白的高水平和可溶性表达
为进行深入分析，将显示出特异性CD3结合的所选克隆作为一价或与TAA和/或HSA结合锚蛋白重复结构域组合在大肠杆菌细胞中表达并使用其His标签纯化，随后根据本领域技术人员已知的标准方案和树脂在系统上进行尺寸排阻色谱法分析。对于一价和多价构建体，当分别在TBS pH 8.0(50mM Tris，500mM NaCl)或PBS pH 7.4中浓缩至10mg/ml时，蛋白质是单体的和可溶的。此类SDS-PAGE分析的代表性示例示于图1中。
实施例2:示例性CD3特异性锚蛋白重复蛋白的稳定性评估
使用UV光谱法、SDS-PAGE和尺寸排阻色谱法(SEC)评估示例性CD3特异性锚蛋白重 复蛋白
对四种所选择的CD3特异性锚蛋白重复蛋白进行深入分析，以评估它们的生物物理特性。简言之，将在TBS pH 8.0(50mM Tris，500mM NaCl)中的纯化的CD3特异性锚蛋白重复蛋白(SEQ ID NO:1)、(SEQ ID NO:2)、(SEQ IDNO:3)和(SEQ ID NO:4)等分到灭菌玻璃小瓶(Schmidlin：LPP 11 090620)中，并通过在50℃温育18天进行应激。所施加的应激条件允许预测在4℃处储存2年后的生物物理特性。对于每个CD3特异性锚蛋白重复蛋白，将等分试样储存在-70℃作为参比。在分析之前，将参比样品和热应激样品暴露于相同次数的冻融循环。通过UV光谱法评价样品的聚集和浊度(尺寸范围>100μm)，并通过SDS-PAGE和分析型SEC评价多聚化、聚集和片段化。然后将应激样品与各自的参比样品进行比较(图2、图3和图4)。
使用圆二色性(CD)光谱法评价示例性CD3特异性锚蛋白重复蛋白的热稳定性
还使用Jasco J-815分光光度计评估相同的CD3特异性锚蛋白重复蛋白的热稳定性和去折叠/重折叠倾向(仅非应激蛋白)。通过CD确定所选蛋白质的Tm(熔融温度)作为热稳定性的参数。简言之，在222nM处记录椭圆率，并应用20℃至95℃的温度范围，之后进行反向扫描以记录重折叠行为。所选择的CD3特异性锚蛋白重复蛋白的Tm是蛋白去折叠的中点。
在TBS pH 8.0(50mM Tris，500mM NaCl)中以2μM的浓度制备样品(图5)。对于所有四种所测试的蛋白质，获得高于65℃的Tm。
表1：四种示例性CD3特异性锚蛋白重复蛋白的Tm(熔融温度)
用动态光散射(DLS)确定聚集起始温度Tagg
评估相同的CD3特异性锚蛋白重复蛋白的温度依赖性聚集倾向(Tagg)。应用25℃至85℃的温度范围，并相对于蛋白质的流体动力学半径作图。为进行评估，使用WyattDynaPro读板器II(序列号140-WPR2)装置，同时用Dynamics 7.8.1.30软件处理测量结果。在TBS pH 8.0(50mM Tris，500mM NaCl)中以1mg/ml的浓度制备锚蛋白重复样品(表2)，并以5个平行测定(A1、A2、A3、A4和A5)进行测量(图6)。
如图6所示，所有四种所测试的锚蛋白重复蛋白倾向于在比65℃高得多的温度处聚集。
表2：四种示例性CD3特异性锚蛋白重复蛋白的Tagg(温度依赖性聚集倾向)
实施例3：雌性BALB/c小鼠中CD3特异性锚蛋白重复蛋白的药代动力学分析
为了确定本发明的CD3特异性锚蛋白重复结构域是否可具有使其可用于开发治疗剂的适当体内血清半衰期，在小鼠中分析蛋白质#1、蛋白质#2、蛋白质#3和蛋白质#4的药代动力学特征。为此，如上所述将DARPin构建体亚克隆并表达到pQE30(Qiagen)表达载体的衍生物中，该衍生物含有N末端His标签、用于半衰期延长的HSA结合锚蛋白重复结构域、随后是CD3特异性结合结构域之一。两个锚蛋白重复结构域通过肽接头(诸如SEQ ID NO:31的接头)彼此连接。
例如，构建编码以下锚蛋白重复蛋白的表达载体：
蛋白质#5(SEQ ID NO:33，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:27))；
蛋白质#6(SEQ ID NO:34，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:27))；
蛋白质#7(SEQ ID NO:35，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:27))；
蛋白质#8(SEQ ID NO:36，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:27))；
体内施用和样品收集
对于每种锚蛋白重复融合蛋白，将用人血清白蛋白特异性锚蛋白重复结构域(SEQID NO:29)格式化的蛋白质#5、蛋白质#6、蛋白质#7和蛋白质#8以单次静脉内推注的方式施用到6只小鼠的尾静脉中。目标剂量水平是1mg/kg，其中施用体积为5mL/kg。锚蛋白重复融合蛋白在磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中配制。
将小鼠分成具有相同数量动物的2组。从每只小鼠收集四个血清样本。在化合物施用后5分钟、4小时、24小时、48小时、76小时、96小时和168小时，从隐静脉收集用于药代动力学研究的血液样品。将血液保持在室温下以允许凝结，随后进行离心和血清收集。
通过ELISA进行生物分析以测量血清样品中的锚蛋白重复蛋白
将每孔100μl的PBS中的10nM多克隆山羊抗兔IgG抗体(Ab18)在4℃处包被到NUNCMaxisorb ELISA板上过夜。在每孔用300μl PBST(补充有0.1％Tween20的PBS)洗涤五次后，在室温(RT)处将孔用300μl补充有0.25％酪蛋白的PBST(PBST-C)在Heidolph Titramax1000摇动器(450rpm)上封闭1小时。板如上所述进行洗涤。添加100μl在PBST-C中的5nmol/L兔抗1-1-1抗体，并将板在RT(22℃)处伴随轨道振荡(450rpm)温育1小时。将板如上所述进行洗涤。
将100μl稀释的血清样品(在1:5稀释步骤中1:20-1:312500)或锚蛋白重复蛋白标准曲线样品(在1:3稀释步骤中0nmol/L和50nmol/L-0.0008nmol/L)在RT处以450rpm施加振荡2h。板如上所述进行洗涤。
然后将孔与100μl鼠抗-RGS-His-HRP IgG(Ab06，PBST-C中1:2000)一起温育，并在RT、450rpm处温育1小时。板如上所述进行洗涤。将ELISA使用100μl/孔TMB底物溶液显色5分钟，并通过添加100μl1mol/L H2SO4终止。计算450nm处吸光度和620nm处吸光度之间的差值。在两个不同的板上一式两份测量样本。图7A示出了蛋白质#5、蛋白质#6、蛋白质#7和蛋白质#8在单次静脉内施用到小鼠后作为时间的函数的血清浓度。迹线指示化合物的大致单指数消除。
药代动力学分析
使用作为Phoenix 64(Pharsight，North Carolina)一部分的WinNonlin程序7.0版，在Molecular Partners处进行药代动力学数据分析。基于经由静脉内推注给药的动物的平均浓度-时间数据的药代动力学参数的计算通过非房室分析(NCA模型200-202、IV推注、线性梯形线性插值)进行。计算以下药代动力学参数：
AUCinf、AUClast、AUC_％extrapol、Cmax、Tmax、Cl_pred、Vss_pred、t1/2
最大血清浓度(Cmax)及其发生时间(Tmax)直接从血清浓度-时间曲线获得。血清浓度-时间曲线下面积(AUCinf)通过线性梯形公式直到最后取样点(Tlast)并外推至无穷大(假设终末期单指数下降)来确定。使用Clast/λz进行直至无穷大的外推，其中λz表示通过对数线性回归估计的终点速率常数，并且Clast表示借助于终点对数-线性回归在Tlast处估计的浓度。总血清清除率(Cl_pred)和表观终末半衰期如下计算：Cl_pred＝i.v.剂量/AUCinf，并且t1/2＝ln2/λz。稳态分布体积Vss由下式确定：Vss＝静脉注射剂量πAUMCinf/(AUCinf)2。AUMCinf表示使用与AUCinf计算中所述相同的外推程序外推至无穷大的药物浓度-时间曲线一阶矩下的总面积。为了计算基于以nmol/L给出的浓度的PK参数，通过使用锚蛋白重复蛋白的分子量，将以mg/kg给出的剂量值转换为nmol/kg。表3示出了单次静脉内施用1mg/kg后四种所测试的锚蛋白重复蛋白蛋白质#5、蛋白质#6、蛋白质#7和蛋白质#8的药代动力学特征的汇总。
表3：四种示例性HSA/CD3特异性锚蛋白重复蛋白的药代动力学参数
实施例4：通过表面等离子体共振(SPR)分析确定对人CD3具有结合特异性的锚蛋白重复蛋白的解离常数(KD)
使用ProteOn仪器(BioRad)分析四种纯化的锚蛋白重复蛋白对重组人CD3靶标的结合亲和力，并且根据本领域技术人员已知的标准程序进行测量。为此，将本发明的蛋白质#1、蛋白质#2、蛋白质#3和蛋白质#4如上所述亚克隆并表达到pQE30(Qiagen)表达载体的衍生物中，该衍生物含有N末端His标签、两个不同的TAA(分别为TAA2和TAA3)结合锚蛋白重复结构域，之后是四种CD3特异性锚蛋白重复蛋白构建体之一。
简言之，将生物素酰化的人scCD3εγ稀释在PBST(PBS，pH 7.4，含有0.005％Tween)中，并且在NLC芯片(BioRad)上包被至约700-1400个共振单位(RU)的水平。然后通过注射包含锚蛋白重复蛋白的系列稀释液(覆盖64nM与4nM之间的浓度范围，用于多迹线SPR测量)的300μl运行缓冲液(PBS，pH 7.4，含有0.005％Tween)，随后以60μl/min的恒定流速注射运行缓冲液流至少10分钟(解离率测量)，来测量锚蛋白重复蛋白和人CD3的相互作用。使用30μl的10mM甘氨酸pH 2进行再生。从注射锚蛋白重复蛋白(双参考)后获得的共振单位(RU)迹线中减去点间和参考注射(即，仅注射运行缓冲液)的信号(即RU值)。测定亲和力成熟的构建体针对CD3的结合参数(KD、结合率、解离率)。结合率(kon)和解离常数(KD)仅作为近似值给出，因为即使在最高样品浓度下也没有适当地达到结合平衡，导致结合率的非最佳拟合。
作为代表性实施例，图7B示出了用经TAA2和TAA3结合设计的锚蛋白重复结构域格式化的分子#3获得的SPR迹线。使用本领域技术人员已知的标准程序，由估计的结合率和解离率计算解离常数(KD)。所选择的锚蛋白重复蛋白与人CD3的结合相互作用的KD值被测定为在6nM至35nM的范围内(参见表4)。
表4.锚蛋白重复蛋白-人CD3相互作用的KD值
实施例5：CD3 T细胞结合的确定
使用Mirrorball激光扫描成像细胞计量术对原代人T细胞进行CD3结合的确定。因此，使用pan-T细胞纯化试剂盒(Miltenyi Biotec)从人外周血单核细胞(PBMC)中分离原代T细胞。蛋白质#1、蛋白质#2、蛋白质#3和蛋白质#4的滴定被格式化为三特异性形式(包括TAA2和TAA3结合锚蛋白重复结构域，在本文中分别命名为蛋白质#A、蛋白质#B、蛋白质#C和蛋白质#D)或四特异性形式(包括与人血清白蛋白特异性结合的另外的锚蛋白重复结构域)，将其在600μM人血清白蛋白(以模拟生理血清浓度)的存在下，与50,000pan-T细胞/孔在4℃一起温育30分钟。为了生成三特异性TCE蛋白，分别将蛋白质#1、蛋白质#2、蛋白质#3和蛋白质#4如上所述亚克隆并表达到pQE30(Qiagen)表达载体的衍生物中，该衍生物编码N末端His标签，之后是两个不同的TAA特异性锚蛋白重复结构域(分别以TAA2-和TAA3-特异性的顺序)，然后是本发明的CD3特异性锚蛋白重复结构域之一。对于四特异性TCE蛋白，在His标签和TAA2特异性结构域之间还包括人血清白蛋白特异性锚蛋白重复结构域。锚蛋白重复结构域通过肽接头(诸如SEQ IDNO:31的接头)彼此连接。应用两个基准T细胞接合物作为对照，靶向TAA2或TAA3。洗涤后，用1:100稀释的抗-五-His Alexa Fluor 488抗体(Qiagen)检测CD3结合。在4℃温育30分钟后，洗涤细胞并重悬于Cytofix固定缓冲液(BD Biosciences)中，并在室温处用5μM DRAQ5(Abcam)复染15分钟。使用Cellista软件(SPT Labtech)通过Mirrorball测量结合在远红复染细胞上的Alexa Fluor 488的平均荧光强度的中值，并使用GraphPad Prism 8对数据作图。
如图8A-图8B所示，蛋白质显示出宽范围内的亲和力，从#A检测不到结合到#D的与基准分子一样好的结合(已知的基准T细胞接合物、对TAA2具有结合特异性的TCE1和对TAA3具有结合特异性的TCE2)。与T细胞的CD3结合与通过SPR测量的CD3亲和力匹配。另外的HSA结合结构域的存在(参见图8B)对与T细胞的结合仅具有较小的影响。表5示出了四种示例性锚蛋白重复蛋白的CD3结合亲和力，由它们的EC50值表示。
表5.TAA2-TAA3-CD3特异性 蛋白质的EC50值
实施例6：通过LDH细胞毒性测定评估由CD3特异性锚蛋白重复蛋白诱导的靶特异性短期肿瘤细胞杀伤
通过利用LDH释放的体外短期细胞毒性测定来评估针对细胞结合(实施例5)描述的形式的四种CD3特异性锚蛋白重复蛋白(蛋白质#1至#4)的特异性和效力。
在600μM人血清白蛋白(以模拟生理浓度)的存在下，在96孔板中以5:1的E:T比率一式两份共温育效应细胞和靶细胞。使用pan-T细胞分离试剂盒(Miltenyi)从人PBMC中分离未接触的T细胞。将每孔100,000个纯化的pan-T细胞(效应细胞)和20,000个表达TAA2/TAA3的肿瘤细胞(靶细胞)与所选的所选CD3特异性锚蛋白重复蛋白、对照基准分子或含有1％Triton X-100的对照的系列稀释液在37℃温育48小时。温育48小时后，将细胞离心，并将每孔100μl上清液和每孔100μl LDH反应混合物(LDH检测试剂盒；Roche AppliedScience)温育30分钟。通过TECAN infinite M1000Pro读数器测量492nm-620nm处的吸光度。背景校正后，使用GraphPad Prism 8对OD值作图。
如图9A所示，对于不具有半衰期延长的DARPin蛋白质，即蛋白质#2和蛋白质#3诱导与基准分子(已知的基准T细胞接合物，对TAA2具有结合特异性的TCE1)相当的肿瘤细胞杀伤，而蛋白质#1和蛋白质#4显示出低至1/10至1/100的效力。在图9B中，与对应的非半衰期延长的分子相比，半衰期延长的蛋白质表现出降低至约1/4至1/70的效力。
实施例7：评估靶特异性短期T细胞激活和IFNγ分泌。
通过测量CD8+T细胞上的CD25激活标记的FACS和通过测量IFNγ分泌的ELISA，在体外短期T细胞激活测定中评估上述CD3特异性锚蛋白重复蛋白(实施例5和6)的特异性和效力。
因此，将每孔100,000个纯化的pan-T细胞(效应细胞)和100,000个表达TAA2/TAA3的肿瘤细胞(靶细胞)与所选结合蛋白或对照基准分子的系列稀释液一式两份地在600μM人血清白蛋白的存在下在37℃共温育(E:T比率1:1)24小时。24小时后，转移每孔100μl上清液，以根据制造商的方案通过人IFNγ标准ABTS ELISA开发试剂盒(PeproTech)测量IFNγ分泌。洗涤细胞，并用1:1’000Live/Dead Aqua(Thermo Fisher)、1:250小鼠抗人CD8Pacific Blue(BD)和1:100小鼠抗人CD 25PerCP-Cy5.5(eBiosciences)抗体在4℃染色30分钟。洗涤和固定后，在FACS Canto II(BD)机器上分析细胞。通过测量Live/Dead阴性和CD8+门控T细胞上的CD25+细胞来评估T细胞激活。使用FlowJo软件分析FACS数据，并使用GraphPad Prism 8对数据作图。
如图10A所示，不具有半衰期延长的蛋白质#2和蛋白质#3诱导与基准分子(已知的基准T细胞接合物，对TAA2具有结合特异性的TCE1)相当的特异性短期T细胞激活，而蛋白质#1和蛋白质#4显示出降低至1/10至1/100的效力。在图10B中，与对应的非半衰期延长的分子相比，半衰期延长的蛋白质显示出降低至约1/3至1/100的效力。
实施例8：通过IncuCyte评估靶特异性长期肿瘤细胞杀伤
使用IncuCyte S3平台，通过体外长期杀伤测定法评估CD3特异性锚蛋白重复蛋白的特异性和效力(描述于实施例5、6和7中)。
首先用NucLight Red(NLR)慢病毒颗粒(Sartorius)转导表达TAA2/TAA3的肿瘤细胞，并通过0.7μg/ml嘌呤霉素和/或FACS分选来选择红色荧光细胞。然后用IncuCyte S3系统(Sartorius)评估长期肿瘤细胞杀伤。在1:200膜联蛋白V绿(Sartorius)和600μM人血清白蛋白(以模拟生理浓度)的存在下，以5:1的E:T比率在0.01％聚-L-鸟氨酸包被的96孔板上一式两份地共温育效应细胞和靶细胞。将每孔50,000个纯化的(Miltenyi)pan-T细胞(从健康供体PBMC中分离)+10,000个表达TAA2/TAA3的肿瘤细胞(经NLR转导)与所选锚蛋白重复蛋白或对照基准分子的系列稀释液在37℃一起温育多达6天。每2小时拍摄一次图像以评估细胞增殖(来自NLR的红色荧光)和细胞死亡(来自膜联蛋白V的绿色荧光)。通过使用GraphPad Prism 8计算共培养6天后的曲线下面积来分析总细胞增殖和肿瘤细胞杀伤。
如图12所示，测试的蛋白质#2、#3和#4显示出与基准分子(已知的基准T细胞接合物、对TAA2具有结合特异性的TCE1和对TAA3具有结合特异性的TCE2)相当的有效且特异性的肿瘤细胞杀伤，与半衰期延长无关。只有较低亲和力的显示出杀灭效力的降低。
实施例9：通过FACS评估靶特异性长期T细胞激活和增殖
通过基于FACS的体外长期T细胞激活测定法评估CD3特异性锚蛋白重复蛋白的特异性和效力(描述于实施例5、6、7和8中)。
为了评估药物特异性和靶特异性T细胞激活和增殖，在所选分子的系列稀释液的存在下，将效应细胞和靶细胞以1:1的E:T比率一式两份共温育。将纯化的(Miltenyi)pan-T细胞(从健康供体PBMC中分离)首先用5μM CellTrace Violet(CTV)(Thermo Fischer)在37℃标记20分钟。然后将50,000个CTV标记的pan-T细胞+50,000个表达TAA2/TAA3的肿瘤细胞/孔与所选的CD3特异性锚蛋白重复蛋白或对照基准分子TCE1和TCE2的系列稀释液在600μM人血清白蛋白(以模拟生理浓度)的存在下在37℃一起温育。5天后，用PBS洗涤细胞，并用1:5'000Live/Dead Green(Thermo Fisher)、1:100小鼠抗人CD8 PE(BD)和1:100小鼠抗人CD25PerCP-Cy5.5(eBiosciences)抗体在4℃染色30分钟。用PBS洗涤2次后，使用CellFIX(BD)在4℃处固定细胞20分钟，最后用PBS替换缓冲液。在FACS Canto II(BD)机器上分析染色的细胞。通过测量Live/Dead阴性和CD8+门控T细胞上的CD25+细胞来评估T细胞激活。通过门控Live/Dead阴性和CTV阳性细胞来评估T细胞增殖。使用FlowJo软件分析FACS数据；使用GraphPad Prism 8对数据作图。
如图13和图14所示，不具有半衰期延长的蛋白质#2和#3诱导与基准分子(已知的基准T细胞接合物，对TAA2具有结合特异性的TCE1和对TAA3具有结合特异性的TCE2)相当的长期T细胞激活和增殖，而蛋白质#1和#4显示出降低至1/10至1/100的效力。与对应的非半衰期延长的分子相比，半衰期延长的CD3特异性锚蛋白重复蛋白显示出降低至约1/5至1/30的效力。
实施例10：示例性多特异性TCE结合蛋白在PBMC人源化小鼠和表达TAA的肿瘤模型中的体内功效评价
实验A：蛋白质#2、蛋白质#3和蛋白质#4被格式化为四特异性TCE分子，其除了蛋白质#2、蛋白质#3或蛋白质#4之外还包含对TAA2、TAA3和人血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。为此，将蛋白质#2、蛋白质#3和蛋白质#4如上所述亚克隆并表达到pQE30(Qiagen)表达载体的衍生物中，该衍生物编码N末端His标签，之后是人血清白蛋白特异性锚蛋白重复结构域，然后是两个不同的TAA特异性(分别是TAA2-和TAA3-特异性)锚蛋白重复结构域，然后是本发明的CD3特异性锚蛋白重复结构域之一。锚蛋白重复结构域通过肽接头(诸如SEQ ID NO:31的接头)彼此连接。对应的TCE蛋白在本文中分别命名为蛋白质#F(包含蛋白质#2)、蛋白质#G(包含蛋白质#3)和蛋白质#H(包含蛋白质#4)。蛋白质#2类似地被格式化为三特异性TCE分子，其除了蛋白质#2之外还包含对TAA2和TAA3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，但缺乏HSA特异性锚蛋白重复结构域。该TCE蛋白在本文中称为蛋白质#E。在携带表达TAA2/TAA3的肿瘤细胞系作为实体皮下肿瘤的外周血单核细胞(PBMC)人源化小鼠模型中测试蛋白质#E、蛋白质#F、蛋白质#G和蛋白质#H，并与目前在临床试验中测试的已知靶向TAA3的T细胞接合物进行比较。
材料和方法
动物：60只雌性NOG小鼠，研究开始时动物年龄为65天(提供者TaconicBiosciences)
测试和对照分子： 蛋白质#E、蛋白质#F、蛋白质#G和蛋白质#H如前所述以5mg/ml的浓度制备；对照，基准靶向TAA3的TCE 0.59mg/ml：由Evitria AG提供
治疗组：在该研究中招募60只小鼠。将所有动物随机分配到8个不同的研究组中。肿瘤细胞接种的日期表示为第0天。
方法：在实验开始前两天记录体重，并将小鼠随机化以在每组中具有相等的平均重量和相似的标准偏差。平均重量为19.6g。
在第2天，用5×106个PBMC腹膜内注射小鼠。
在第0天，为小鼠在右胁腹皮下注射106个表达TAA2/TAA3的肿瘤细胞。
在第5天，根据表8，以腹膜内注射开始治疗。最后一次治疗在第16天。
在第7天、第10天、第12天、第14天、第17天、第19天进行肿瘤测量和称重。根据下式计算肿瘤体积：[长度×(宽度)2×π]/6。
通过Anova比较生长曲线并遵循针对多重比较校正的非参数Kruskal-Wallis检验(Dunn检验)来分析肿瘤体积数据。
将治疗组的肿瘤体积与对照组的体积进行比较。一起和分别分析来自两个不同PBMC供体的数据。
表7：治疗组的分配和治疗方案
结果
肿瘤生长抑制
暴露于测试的多特异性结合蛋白和已知的基准T细胞接合物后的肿瘤生长曲线汇总于图15A-图15C中，包括一起和分开的两个供体。
表8(两个供体)、表9(供体A)和表10(供体B)：肿瘤生长的统计
+＝p<0.1；**＝p<0.05；+++＝p<0-01；++++＝p<0.001；ns＝不显著
来自供体B的PBMC导致小鼠血液中较低量的CD8阳性淋巴细胞。一般来讲，在所有测试分子中都观察到抗肿瘤效果。蛋白质#F和已知的TAA3 T细胞接合物从治疗开始后5天开始显示效果，而蛋白质#G和蛋白质#H的效果从治疗开始后7天开始显著且相关。当仅比较亚组A时，从治疗开始后第5天开始所有测试分子都观察到统计学上显著的效果。蛋白质#F、蛋白质#G和蛋白质#H的效果强于基准TAA3 T细胞接合物和蛋白质#E的效果。当比较亚组B时，蛋白质#G和基准TAA3T细胞接合物观察到显著的抗肿瘤效果。
用基准TCE获得的结果验证了所用的模型。同时，在用来自供体B的PBMC人源化的小鼠中观察到的基准的较不显著的效果表明属于该亚组的小鼠的敏感性较低。这也通过在用来自供体B的PBMC人源化的小鼠中在实验结束时发现的显著较低量的人CD8阳性淋巴细胞得到反映。
因此，更多的相关性应归因于用来自供体A的PBMC人源化的小鼠所产生的数据。
肿瘤大小的高度可变性是由于在小鼠中没有进行随机化和范围选择这一事实，因为治疗是在所有小鼠中可识别肿瘤之前开始的。尽管有这种高度可变性，但可以进行统计分析而不需要对初始肿瘤体积进行归一化。
我们证实，所有测试的多特异性结合蛋白显示出抗肿瘤活性，并且半衰期延长的分子蛋白质#F、蛋白质#G和蛋白质#H在所用的剂量和施用方案下比半衰期未延长的蛋白质#E具有更强的抗肿瘤活性。不希望受理论束缚，据信由于该分子的较短半衰期，蛋白质#E的暴露可能较低。
总之，所有四种测试的多特异性结合蛋白显示出与基准T细胞接合物相当或更强的体内抗肿瘤活性。这些结果证明本发明的CD3特异性锚蛋白重复结构域可与TAA特异性结合结构域(和半衰期延长部分)组合以形成具有体内抗肿瘤活性的T细胞接合物分子。因此，当在此类TCE分子中格式化时，本发明的CD3特异性锚蛋白重复结构域维持它们在体内结合CD3和激活T细胞的能力。
实验B：在类似的实验设置中，将蛋白质#3格式化为六特异性TCE分子，其另外包含分别对TAA2、TAA3和TAA4具有结合特异性的三个经设计的锚蛋白重复结构域，以及对人血清白蛋白具有结合特异性的两个经设计的锚蛋白重复结构域。为此，将蛋白质#3如上所述亚克隆并表达到pQE30(Qiagen)表达载体的衍生物中，该衍生物编码N末端His标签，之后是两个人血清白蛋白特异性锚蛋白重复结构域，然后是三个不同的TAA特异性锚蛋白重复结构域(分别以TAA3-、TAA2-和TAA4-特异性的顺序)，然后是本发明的CD3特异性锚蛋白重复结构域之一(蛋白质#3)。锚蛋白重复结构域通过肽接头(诸如SEQ ID NO:31的接头)彼此连接。该六特异性TCE分子更详细地描述于2021年12月9日提交的美国专利申请63/265,184中，该专利申请的公开内容全文以引用方式并入本文。在携带表达TAA2/TAA3/TAA4的肿瘤细胞系(Molm-13)作为实体皮下肿瘤的外周血单核细胞(PBMC)人源化小鼠模型中测试这种多特异性TCE形式的蛋白质#3，并与目前在临床试验中测试的已知靶向TAA3的T细胞接合物进行比较。
简言之，在6至9周龄雌性免疫缺陷NXG小鼠(由Janvier Labs提供)中进行体内实验。将小鼠在标准环境条件下维持在标准啮齿动物微型隔离笼(20+/-1℃室温、50+/-10％相对湿度和12小时光暗循环)中。小鼠接受辐照食品和被褥以及0.22um过滤饮用水。所有实验均根据瑞士动物保护法(Swiss Animal Protection Law)进行，并得到州和联邦兽医机构的授权。
用hPBMC为NXG小鼠腹膜内注射，然后异种移植癌细胞。将表达TAA2/TAA3/TAA4的肿瘤细胞在右胁腹区域皮下(s.c.)异种移植到NXG小鼠中。使用两个hPBMC供体。癌细胞植入后四天静脉内注射(i.v.)治疗。大多数肿瘤在该时间点尚未建立。如下施用治疗：
-将蛋白质#3(以多特异性TCE形式)以0.5mg/kg每周三次静脉内注射施用，持续2周
-基准靶向TAA3的T细胞接合物以0.5mg/kg每日静脉内注射施用，持续2周
通过卡尺测量来评估肿瘤大小。使用下式计算肿瘤体积:肿瘤体积(mm3)＝0.5×长度×宽度2。
如图16(A-B)中可见，在整个实验时间内(图16A)和第一次注射后17天(图16B)，多特异性TCE形式的蛋白质#3在抑制肿瘤生长和肿瘤体积方面显示出良好的功效。该结果进一步证明本发明的CD3特异性锚蛋白重复结构域可与TAA特异性结合结构域和半衰期延长部分组合以形成具有体内抗肿瘤活性的T细胞接合物分子。因此，当在此类TCE分子中格式化时，本发明的CD3特异性锚蛋白重复结构域维持它们在体内结合CD3和激活T细胞的能力。
按照本说明书内引用的参考文献的教导内容最彻底地理解本说明书。本说明书内的各方面提供了对本发明的各方面的说明，并且不应理解为限制本发明的范围。技术人员容易认识到，本发明涵盖许多其他方面。本公开中引用的所有出版物、专利和GenBank序列均全文以引用方式并入。在以引用方式并入的材料与本说明书矛盾或不一致的程度上，本说明书将取代任何此类材料。对本文任何参考文献的引用不是承认此类参考文献是本发明的现有技术。
本领域的技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的本发明的特定方面的许多等同物。此类等同物旨在由以下权利要求涵盖。
序列表
<110> MOLECULAR PARTNERS AG
<120> 重组CD3结合蛋白及其用途
<130> AD4028 PCT S3
<150> US 63/126,356
<151> 2020-12-16
<150> US 63/182,394
<151> 2021-04-30
<150> EP 20 216 705.2
<151> 2020-12-22
<160> 46
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 对CD3具有特异性的锚蛋白重复结构域
<400> 1
Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Ser Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Thr Ala Ala Gln Thr Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Asp Lys Gly Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Leu Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Gln Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly
100 105 110
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120
<210> 2
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 对CD3具有特异性的锚蛋白重复结构域
<400> 2
Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn
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Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr Ala Ala Gln Thr Gly His Leu
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Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Asp Lys Gly Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Leu Gly His
65 70 75 80
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85 90 95
Gln Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly
100 105 110
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120
<210> 3
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 对CD3具有特异性的锚蛋白重复结构域
<400> 3
Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn
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Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr Ala Ala Gln Thr Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asn Asp Lys Arg Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Leu Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
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<223> 对CD3具有特异性的锚蛋白重复结构域
<400> 4
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Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Thr Asn Lys Arg Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Leu Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Arg Asp Thr Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly
100 105 110
His Arg Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120
<210> 5
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锚蛋白重复模块1
<400> 5
Lys Asp Ser Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Thr Ala Ala Gln Thr Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 6
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锚蛋白重复模块2
<400> 6
Lys Asp Asp Lys Gly Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Leu Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 7
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锚蛋白重复模块3
<400> 7
Lys Asn Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr Ala Ala Gln Thr Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 8
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锚蛋白重复模块4
<400> 8
Lys Asn Asp Lys Arg Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Leu Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 9
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锚蛋白重复模块5
<400> 9
Lys Thr Asn Lys Arg Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Leu Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 10
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-封端模块1
<400> 10
Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
<210> 11
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-封端模块2
<400> 11
Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Trp Ala Gly Gln Leu Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
<210> 12
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-封端模块3
<400> 12
Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
<210> 13
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-封端模块4
<400> 13
Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
<210> 14
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-封端模块5
<400> 14
Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Trp Ala Gly Gln Leu Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
<210> 15
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-封端模块6
<400> 15
Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Trp Ala Gly Gln Leu Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
<210> 16
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-封端模块随机化
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 16
Asp Leu Gly Xaa Xaa Leu Leu Gln Ala Ala Xaa Xaa Gly Gln Leu Asp
1 5 10 15
Xaa Val Arg Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
<210> 17
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C-封端模块1
<400> 17
Gln Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly
1 5 10 15
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
20 25
<210> 18
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C-封端模块2
<400> 18
Arg Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly
1 5 10 15
His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
20 25
<210> 19
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C-封端模块3
<400> 19
Arg Asp Thr Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly
1 5 10 15
His Arg Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
20 25
<210> 20
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C-封端模块4
<400> 20
Gln Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly
1 5 10 15
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Ala
20 25
<210> 21
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C-封端模块5
<400> 21
Gln Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly
1 5 10 15
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn
20 25
<210> 22
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C-封端模块6
<400> 22
Arg Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly
1 5 10 15
His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Ala
20 25
<210> 23
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C-封端模块7
<400> 23
Arg Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly
1 5 10 15
His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn
20 25
<210> 24
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C-封端模块8
<400> 24
Arg Asp Thr Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly
1 5 10 15
His Arg Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Ala
20 25
<210> 25
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C-封端模块9
<400> 25
Arg Asp Thr Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly
1 5 10 15
His Arg Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn
20 25
<210> 26
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C-封端模块随机化
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 26
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 26
Xaa Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Ala Asp Xaa Ala Ala Arg Xaa Gly
1 5 10 15
His Gln Xaa Ile Ala Xaa Val Leu Gln Xaa Ala Ala
20 25
<210> 27
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> His标签
<400> 27
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser
1 5 10
<210> 28
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 对人血清白蛋白具有特异性的锚蛋白重复结构域1
<400> 28
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu
35 40 45
Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly
100 105 110
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120
<210> 29
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 对人血清白蛋白具有特异性的锚蛋白重复结构域2
<400> 29
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu
35 40 45
Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly
100 105 110
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120
<210> 30
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 对人血清白蛋白具有特异性的锚蛋白重复结构域3
<400> 30
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu
35 40 45
Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly
100 105 110
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120
<210> 31
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PT接头
<400> 31
Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr
1 5 10 15
Pro Thr Pro Thr Pro Thr
20
<210> 32
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scCD3εγ_Avi-Bio
<400> 32
Met Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr
1 5 10 15
Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr
20 25 30
Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly
35 40 45
Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu
50 55 60
Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro
65 70 75 80
Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala
85 90 95
Arg Val Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp
100 105 110
Asp Ala Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Gly Ser Gln Ser Ile Lys
115 120 125
Gly Asn His Leu Val Lys Val Tyr Asp Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val
130 135 140
Leu Leu Thr Cys Asp Ala Glu Ala Lys Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp
145 150 155 160
Gly Lys Met Ile Gly Phe Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu
165 170 175
Gly Ser Asn Ala Lys Asp Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser
180 185 190
Gln Asn Lys Ser Lys Pro Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Gly Gly Gly
195 200 205
Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
210 215 220
<210> 33
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 对HSA-CD3具有特异性的锚蛋白重复蛋白
<400> 33
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu
35 40 45
Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly
100 105 110
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr
115 120 125
Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr
130 135 140
Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Trp Ala
145 150 155 160
Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
165 170 175
Asn Ala Lys Asp Ser Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Thr Ala Ala Gln
180 185 190
Thr Gly His Leu Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp
195 200 205
Val Asn Ala Lys Asp Asp Lys Gly Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala
210 215 220
Ala Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala
225 230 235 240
Asp Val Asn Ala Gln Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala
245 250 255
Ala Lys Tyr Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
260 265 270
<210> 34
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 对HSA-CD3具有特异性的锚蛋白重复蛋白
<400> 34
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu
35 40 45
Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly
100 105 110
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr
115 120 125
Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr
130 135 140
Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Trp Ala
145 150 155 160
Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
165 170 175
Asn Ala Lys Asn Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr Ala Ala Gln
180 185 190
Thr Gly His Leu Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp
195 200 205
Val Asn Ala Lys Asp Asp Lys Gly Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala
210 215 220
Ala Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala
225 230 235 240
Asp Val Asn Ala Gln Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala
245 250 255
Ala Lys Tyr Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
260 265 270
<210> 35
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 对HSA-CD3具有特异性的锚蛋白重复蛋白
<400> 35
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu
35 40 45
Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly
100 105 110
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr
115 120 125
Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr
130 135 140
Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Trp Ala
145 150 155 160
Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
165 170 175
Asn Ala Lys Asn Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr Ala Ala Gln
180 185 190
Thr Gly His Leu Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp
195 200 205
Val Asn Ala Lys Asn Asp Lys Arg Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala
210 215 220
Ala Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala
225 230 235 240
Asp Val Asn Ala Arg Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala
245 250 255
Ala Lys Tyr Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
260 265 270
<210> 36
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 对HSA-CD3具有特异性的锚蛋白重复蛋白
<400> 36
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu
35 40 45
Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly
100 105 110
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr
115 120 125
Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr
130 135 140
Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Trp Ala
145 150 155 160
Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
165 170 175
Asn Ala Lys Asn Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr Ala Ala Gln
180 185 190
Thr Gly His Leu Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp
195 200 205
Val Asn Ala Lys Thr Asn Lys Arg Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala
210 215 220
Ala Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala
225 230 235 240
Asp Val Asn Ala Arg Asp Thr Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala
245 250 255
Ala Lys Tyr Gly His Arg Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
260 265 270
<210> 37
<211> 417
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO 1的结构域的核酸
<400> 37
atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggctcagatc tgggtcaaaa gttattggag 60
gcagcttggg ctggacaaga tgacgaagta cgtgaattgt taaaagcggg agcagatgta 120
aacgcaaaag atagtcaagg ttggactccg ttacacacag cagcgcaaac cggccacctg 180
gaaattttcg aggtgttatt gaaggctgga gcagatgtga atgcaaaaga cgacaaaggg 240
gtgactccgc tgcatctggc agcggcgttg gggcacttgg aaatcgttga ggtccttctg 300
aaagcaggcg ctgatgtgaa tgcgcaagac tcctggggaa ccacaccagc ggacctggcg 360
gctaagtacg gccacgaaga tattgctgaa gttctgcaga aggcagcata atgatag 417
<210> 38
<211> 417
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO 2的结构域的核酸
<400> 38
atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggctcagatc tgggtcaaaa gttgttggaa 60
gctgcctggg cgggacagga tgatgaggtg cgcgaattac ttaaggcggg agcagacgtg 120
aatgcgaaaa actctcgtgg ctggacacca ctgcacacgg ccgcgcaaac tggtcacctt 180
gaaattttcg aagtgcttct gaaggcaggc gcagatgtaa acgccaagga tgacaaaggg 240
gtaacaccgc ttcatctggc tgctgcactg ggacatcttg agattgtcga agtactgctt 300
aaggcaggtg ctgacgtaaa cgctcaggat tcatggggga ccacaccggc ggacctggcg 360
gctaaatacg gacatgaaga tattgctgaa gttctgcaga aggcagcata atgatag 417
<210> 39
<211> 417
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO 3的结构域的核酸
<400> 39
atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggctcagatc tgggtcaaaa gctgttggaa 60
gccgcgtggg cgggtcagga cgatgaagtc cgtgagctgc ttaaagcagg agccgacgtg 120
aacgcgaaga actcacgcgg gtggacgcca cttcacacgg ccgcgcagac aggtcacctt 180
gaaatctttg aggttcttct gaaggcagga gcagacgtta acgccaaaaa cgacaagcgc 240
gtgactccgt tgcaccttgc cgcagctctg gggcatttgg agatcgttga ggtactgttg 300
aaagcgggag cagatgttaa tgctcgcgac agttggggga cgacaccagc agacctggcc 360
gcaaaatacg gacaccaaga cattgctgaa gttctgcaga aggcagcata atgatag 417
<210> 40
<211> 417
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO 4的结构域的核酸
<400> 40
atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggctcagatc tgggtcaaaa attgttagag 60
gcagcctggg cgggacagtt agacgaggtt cgtattcttt tgaaagctgg tgcggatgtg 120
aacgcaaaga attctcgtgg atggactccg ttgcacaccg ccgcacagac tgggcacttg 180
gaaatctttg aggttctgtt aaaagcaggg gcagatgtta acgctaaaac taataaacgt 240
gtcacccccc ttcacctggc tgcggcttta ggccatttag aaatcgtgga agtattactt 300
aaagccgggg ctgacgttaa cgcccgtgac acttggggga caacccctgc ggatctggcc 360
gccaaatatg gtcaccgcga cattgctgaa gttctgcaga aggcagcata atgatag 417
<210> 41
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有GS接头
<220>
<221> 变体
<222> 1..5
<223> [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n，其中n为1、2、3、4、5或6
<400> 41
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 42
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 富含PT的肽接头（标准）
<400> 42
Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr
1 5 10 15
Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser
20
<210> 43
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头L
<400> 43
Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr
1 5 10 15
Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr
20 25 30
Pro Thr Pro Thr Gly Ser
35
<210> 44
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头S
<400> 44
Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 45
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头XS
<400> 45
Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Gly Ser
1 5 10
<210> 46
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头XXS
<400> 46
Gly Ser Pro Thr Gly Ser
1 5

Claims (15)

1.一种重组结合蛋白，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，所述锚蛋白重复模块具有选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:5至9，以及(2)其中SEQ ID NO:5至9中的任一者中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。
2.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复模块是第一锚蛋白重复模块，并且其中所述锚蛋白重复结构域还包含第二锚蛋白重复模块，所述第二锚蛋白重复模块具有选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:5至9，以及(2)其中SEQ ID NO:5至9中的任一者中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。
3.根据权利要求2所述的结合蛋白，其中所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:5，以及(2)其中SEQ ID NO:5中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且其中所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:6，以及(2)其中SEQ ID NO:6中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。
4.根据权利要求2所述的结合蛋白，其中所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且其中所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:6，以及(2)其中SEQ ID NO:6中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。
5.根据权利要求2所述的结合蛋白，其中所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且其中所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:8，以及(2)其中SEQ ID NO:8中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。
6.根据权利要求2所述的结合蛋白，其中所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7，以及(2)其中SEQ ID NO:7中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列，并且其中所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:9，以及(2)其中SEQ ID NO:9中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的结合蛋白，其中所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N末端。
8.一种重组结合蛋白，所述重组结合蛋白包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至4中的任一者具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且其中SEQ ID NO:1至4的倒数第二个位置处的A任选地被L取代，并且/或者SEQ ID NO:1至4的最后一个位置处的A任选地被N取代。
9.根据前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白在PBS中以低于10- 7M的解离常数(KD)结合人CD3。
10.根据前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白以2nM至900nM范围内的EC50结合T细胞上的人CD3。
11.根据前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白还包含对疾病相关抗原具有结合特异性的结合剂。
12.根据前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白还包含半衰期延长部分。
13.一种核酸，所述核酸编码根据前述权利要求中任一项所述的结合蛋白。
14.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至12中任一项所述的结合蛋白或根据权利要求13所述的核酸，以及任选地药学上可接受的载剂和/或稀释剂。
15.一种治疗医学病症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的根据权利要求1至12中任一项所述的结合蛋白、根据权利要求13所述的核酸或根据权利要求14所述的药物组合物的步骤。
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