ES2679168T3 - Inhibidor del HB-EGF derivado del dominio R de la toxina diftérica para el tratamiento de enfermedades asociadas a la activación de la ruta HB-EGF/EGFR - Google Patents

Abstract

Proteína recombinante, que comprende un dominio R aislado de la toxina diftérica que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad con los restos 380 a 535 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1, comprendiendo dicha secuencia la combinación de sustituciones siguiente: - Y380K y L390T, y estando desprovista dicha secuencia, en su extremo N o C, de dicho dominio R, de la secuencia del dominio C y del dominio T de la toxina diftérica y de la secuencia de una proteína o de un dominio de proteína capaz de mejorar la estabilidad o la purificación de dicho dominio R, y siendo dicha proteína recombinante un ligando inhibidor del HBEGF.

Description

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DESCRIPCION

Inhibidor del HB-EGF derivado del dominio R de la toxina diftérica para el tratamiento de enfermedades asociadas a la activación de la ruta HB-EGF/EGFR

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a una proteína recombinante ligando inhibidora del HB-EGF (análogo del factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina, por sus siglas en inglés), obtenida a partir del dominio R de la toxina diftérica, de utilidad para el tratamiento y diagnóstico de enfermedades que implican la activación de la ruta HB- EGF/EGFR.

Estado de la técnica

El HB-EGF es un factor de crecimiento expresado en la superficie de las células del organismo en forma de una proteína de membrana precursora, el pro-HB-EGF, que es el receptor natural de la toxina diftérica.

La toxina diftérica (DT) es una exotoxina de 535 aminoácidos (SEQ ID NO: 1) compuesta por un fragmento A (extremo N) y un fragmento B (extremo C). El fragmento A comprende el dominio catalítico (C o dTa/DT-A; restos 1 a 193) y el fragmento B comprende el dominio de translocación (T; extremo N; restos 202 a 378), y el dominio de unión al receptor celular (R o DTR; extremo C; restos 379-386 a 535). La DT se fija a la superficie de las células mediante la unión de su dominio R a la pro-HB-EGF; tras la activación de la DT por escisión proteolítica entre los fragmentos A y B, el dominio T permite la translocación del fragmento A al interior del citoplasma. Una vez dentro del citoplasma, el dominio catalítico que transporta el fragmento A bloquea la síntesis proteica, inactivando el factor de alargamiento EF2, produciendo de esta forma la muerte de las células. El estudio de mutantes naturales o sintéticos de DT ha mostrado que la unión de la DT al receptor pro-HB-EGF se anula mediante la sustitución del resto S508 (S508F) o de los restos del bucle de la región K516-F530 de DTR (K516A, K516E, F530A, F530S y S525F) pero no por la deleción de los 4 restos del extremo C (restos E532-S535; Shen et al., J. Biol. Chem., 1994, 269, 29077-29084). Además, el mutante natural de la DT que comprende la mutación G52E, denominado CRM197, tiene una actividad catalítica muy disminuida (Giannini et al., N.A.R., 1984, 12, 4063-4069).

En los procesos inflamatorios que implican HB-EGF, la proteína de la membrana pro-HB-EGF se escinde mediante una proteasa y el HB-EGF se libera de la superficie celular, en forma de una proteína secretada. A continuación, se une de forma autocrina o paracrina según los subtipos ErbB1 (HER1 o EGFR) y ErbB4 (HER4) de la familia de los receptores de EGF (familia EGFR o EGFR), expresados en la práctica totalidad de los tejidos del organismo. Existen al menos diez ligandos del EGFR además del HB-EGF, es decir EGF, TGF-alfa, anfirregulina, betacelulina, epígeno, epirregulina y las neurregulinas 1, 2, 3 y 4. Es el contexto local el que determina su estimulación por uno u otro de estos ligandos.

La activación de la ruta HB-EGF/EGFR que está asociada a un aumento en la expresión de pro-HB-EGF y/o a la liberación de HB-EGF, conlleva una proliferación celular perjudicial responsable de numerosas patologías:

- glomerulonefritis de rápida progresión (GNRP) durante las cuales, la proliferación de células renales glomerulares (podocitos) da como resultado la destrucción del riñón (Feng et al., J. Clin. Invest., 2000, 105, 341-350; Bollee et al., Nat. Med., 2011, 17, 1242-1250),

- cánceres, incluidos el cáncer de ovario, del endometrio, de mama, del útero (adenocarcinoma uterino), de la vesícula, de estómago, de la piel (melanoma maligno), de cerebro (glioblastoma) y de pulmón (Yotsumoto et al., Biochem Biophys Res Commun, 2008, 365, 555-561; Miyamoto et al., Adv. Exp. Med. Biol., 2008, 622, 281-295; Miyamoto et al., Anticancer Res., 2009, 29, 823-830; Fu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1999, 96, 5716-5721; Tsujioka et al., Anticancer. Res., 2010, 30, 3107-3112),

- vasoespasmo asociado a contusiones cerebrales (Chansel et al., FASEB J., 2006, 20, 1936-1938),

- hipertrofia cardiaca (Asakura et al., Nat. Med., 2002, 8, 35-40; Hamaoka et al., J. Biochem., 2010, 148, 55-69),

- hiperplasia de las células de la musculatura lisa (Miyagawa et al., J. Clin. Invest., 1995, 95, 404-411; Hamaoka et al., J. Biochem., 2010, 148, 55-69),

- hipertensión pulmonar (Powell et al., Am. J. Pathol., 1993, 143, 784-793; Hamaoka et al., J. Biochem., 2010, 148, 55-69),

- retinopatías diabéticas, y

- restenosis arterial.

Debido a su implicación en un número creciente de enfermedades, HB-EGF representa una diana terapéutica. En la actualidad existen dos tipos de moléculas disponibles para bloquear la acción del HB-EGF sobre el EGFR, los inhibidores del EGFR y los inhibidores del HB-EGF. Sin embargo, estas moléculas potencialmente útiles para tratar patologías que implican una activación del EGFR mediante el HB-EGF (ruta HB-EGF/EGFR) tienenalgunos inconvenientes importantes.

Inhibidores del EGFR

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Teóricamente se podrían utilizar dos inhibidores del EGFR para bloquear la estimulación del EGFR por el HB-EGF: los inhibidores de las tirosina quinasas reversibles que actúan sobre el EGFR, como erlotinib, y los anticuerpos contra el EGFR, como cetuximab (Ciardiello y Tortora, N. Engl. J. Med., 358, 1160-1174; documento WO 2008/053270).

No obstante, estas moléculas que actúan sobre la tirosina-quinasa del EGFR (moléculas pequeñas) o sobre el propio EGFR (anticuerpos monoclonales) no son específicas de la ruta HB-EGF/EGFR, dado que bloquean la activación del EGFR independientemente del origen del estímulo, independientemente del ligando activador y de lo que sea dicho ligando. Debido a su falta de especificidad, los inhibidores del EGFR producen efectos secundarios significativos. Como ejemplo, se pueden citar los siguientes efectos adversos comunicados, respectivamente para erlotinib y cetuximab: neutropenia, trombocitopenia, anemia, edemas, náuseas, vómitos, cefaleas, prurito y dolores musculoesqueléticos; fiebre, escalofríos, urticaria, pruritos, erupción cutánea, hipotensión, broncoespasmo, disnea, edemas, confusión, choque anafiláctico y parada cardíaca.

Además, los anticuerpos tienen un tamaño demasiado grande (150 kDa) para llegar a su diana en el caso de la GNRP, dado que el EGFR estimulado por el HB-EGF se expresa en los podocitos de los glomérulos renales, y el umbral de filtración glomerular es de aproximadamente 68 kDa. Análogamente, la penetración de los anticuerpos en tumores sólidos está limitada en razón de su tamaño.

Inhibidores del HB-EGF

En ratones, la invalidación del gen de pro-HB-EGF impide la activación de una GNRP provocada (Bollee et al., Nat. Med., 2011, 17, 1242-1250), justificando así el interés por desarrollar un ligando inhibidor del HB-EgF y de pro-HB- EGF para el tratamiento de patologías que implican la activación de la ruta HB-EGF/EGFR.

En la actualidad existen dos tipos de inhibidores de HB-EGF, potencialmente útiles para bloquear la estimulación del EGFR por el HB-EGF: los anticuerpos contra el HB-EGF (documentos WO 2009/040134; WO 2011/21381; WO 2009/72628; EP 2221374; EP 2281001; EP 2093237; EP 2078731; EP 2039704; WO 2008/053270) y CRM197 (documentos US 7,700,546; US 2006/0270600; EP 1894575).

Los anticuerpos dirigidos contra el HB-EGF son más específicos que los inhibidores del EGFR, puesto que bloquean exclusivamente la activación de la ruta HB-EGF/EGFR pero tienen los mismos inconvenientes que los anticuerpos anti-EGFR, vinculados a su tamaño demasiado grande.

CRM197 es un ligando natural del HB-EGF capaz de bloquear su unión al EGFR. En la actualidad se utiliza en ensayos clínicos para bloquear el HB-EGF con el objetivo de combatir el cáncer de ovario (Koshikawa et al., Cancer Sci., 2011, 102, 111-116; Tsujioka et al., Anticancer Res., 2011, 31, 2461-2465).

No obstante, CRM197 tiene los inconvenientes de toxicidad residual, de tamaño, de afinidad, de inmunogenicidad y antigenicidad.

La toxicidad residual de CRM197 es 106 veces menor que la de la toxina diftérica natural (Kageyama et al., J. Biochem., 2007, 142, 95-104). Sin embargo, esta no es despreciable porque la toxina natural es muy potente, con una dosis letal 50 (DL50) de 5 pM en cultivo de células de primate. Por tanto, CRM197 es tóxica a dosis micromolares (pM). Esto puede suponer un riesgo si se administra al ser humano a dosis elevada (Kageyama et al., J. Biochem., 2007, 142, 95-104).

CRM197 tiene una masa molecular de 58 Da, por lo que atraviesa con dificultad el umbral de filtración glomerular. Por tanto, no se puede utilizar para tratar las GNRP u otras patologías tales como los tumores sólidos, donde la penetración tisular es un factor importante para la eficacia terapéutica.

CRM197 tiene una afinidad media por HB-EGF (Kd = 27 nM; Brooke et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1998, 248, 297-302). Esta afinidad es menor que la de un buen anticuerpo terapéutico.

CRM197 es muy inmunógena. Se diferencia de la toxina diftérica solamente en un resto (G52E). Por tanto, contiene la totalidad de los epítopos T CD4 de la toxina diftérica, o casi todos, si la mutación afecta a un epítopo T. O bien, las poblaciones occidentales están vacunadas contra la toxina diftérica. Tratar los pacientes con CRM197 es equivalente a una vacunación de recuerdo. Desde la primera inyección, CRM197 puede conllevar la reactivación de los linfocitos T CD4 de memoria y reestimular la producción de anticuerpos en circulación. Varios días después de la primera administración de CRM197, estos anticuerpos deberían neutralizar la proteína y convertir el tratamiento en ineficaz.

CRM197 es muy antigénica porque tiene prácticamente todos los epítopos B de la toxina diftérica. Puesto que la población occidental está vacunada contra la toxina diftérica, una fracción significativa de los individuos tiene anticuerpos circulantes capaces de neutralizar CRM197 desde la primera administración. Esto obliga a utilizar dosis masivas de CRM197 para obtener un efecto terapéutico, lo que aumenta considerablemente los riesgos de efectos secundarios (toxicidad, choque anafiláctico, etc.).

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En consecuencia, existe una necesidad real de disponer de inhibidores novedosos del HB-EGF que tengan un tamaño más pequeño, una mayor afinidad por el HB-EGF, una antigenicidad, una inmunogenicidad y toxicidad reducidas, en comparación con CRM197.

Hasta el momento, no ha sido posible producir el dominio DTR aislado, directamente, en forma recombinante, con rendimiento elevado, y sin utilizar detergentes o agentes caotrópicos o desnaturalizantes para extraer la proteína recombinante de las células transformadas.

En efecto, para estabilizar la estructura del dominio DTR aislado, y mejorar la extracción y la purificación de este dominio a partir de bacterias transformadas, ha sido indispensable fusionar el dominio DTR a una proteína (Glutatión- S-transferasa, GST) o a un dominio de proteína (dominio ZZ procedente de la proteína A de S. aureus (Lobeck et al., Infect. Immun., 1998, 66, 418-423; Shen et al., J. Biol. Chem., 1994, 269, 29077-29084). Además, se produjeron mutantes del bucle de la región 516-530 de DTR a partir de la fusión GST-DTR; estos mutantes de DTR son incapaces de vincularse al receptor pro-HB-EGF (Shen et al., 1994).

En los casos anteriormente mencionados, la proteína recombinante producida en E.coli no es un dominio DTR aislado, sino una proteína de fusión GST-DTR o ZZ-DTR. En el caso de la proteína de fusión GST-DTR, los rendimientos de producción son bajos, y es indispensable utilizar un detergente (Triton X-100 al 1 %) para extraer la proteína de fusión de las bacterias transformadas. Además, para producir una proteína recombinante, el ligando de fusión se debe eliminar, lo que convierte el procedimiento en algo mucho más complejo y disminuye aún más los rendimientos.

Los inventores han construido mutantes del dominio DTR aislado, desprovistos de secuencias de un ligando de fusión. Estos mutantes del dominio DTR aislado se expresan directamente y en gran cantidad en forma de una proteína DTR recombinante soluble, de tamaño pequeño (aproximadamente 17500 Da) afín por el pro-HB-EGF y el HB-EGF. Estos mutantes de DTR se han modificados para producir proteínas DTR recombinantes mejoradas, que de forma sorprendente, tienen, al mismo tiempo, una antigenicidad y una inmunogenicidad reducidas y una afinidad considerablemente aumentada, en comparación con CRM197.

Objeto de la invención

En consecuencia, la presente invención tiene por objeto una proteína recombinante que comprende un dominio R aislado de la toxina diftérica que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad con los restos 380 a 535 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 correspondientes al dominio R de la toxina diftérica, comprendiendo dicha secuencia la combinación de sustituciones Y380K y L390T, y estando dicha secuencia desprovista en sus extremos N o C de dicho dominio R, de la secuencia del dominio C y del dominio T de la toxina diftérica y de la secuencia de una proteína o de un dominio de proteína capaz de mejorar la estabilidad o la purificación de dicho dominio R, y siendo dicha proteína recombinante un ligando inhibidor del HB-EGF.

La invención es tal como se ha definido en las reivindicaciones.

La invención proporciona una proteína recombinante que es un ligando terapéutico del HB-EGF y de pro-HB-EGF que tiene las siguientes ventajas:

- tiene una solubilidad muy aumentada con respecto a la forma natural (WT, del inglés wild type) DTRwt. La combinación de las sustituciones Y380K y L390T, permite aumentar considerablemente la solubilidad de la proteína DTR en solución acuosa. De este modo, la proteína recombinante de acuerdo con la invención se puede extraer de las células hospedadoras y purificarse sin utilizar detergentes o agentes caotrópicos o desnaturalizantes. Por comparación, la proteína DTR natural (DTRwt), producida en el mismo sistema de expresión, es insoluble y no se solubiliza utilizando detergentes compatibles con el uso terapéutico. La proteína DTRwt se solubiliza en presencia de sarcosilo al 0,5 % o dodecil sulfato de sodio, detergentes incompatibles con el uso terapéutico a dichas concentraciones.

- es mucho más fácil de producir en forma recombinante que DTRwt. Se produce directamente, sin utilizar ligandos de fusión para mejorar la estabilidad o la purificación del dominio R. Se produce en E. coli según procedimientos de fermentación convencionales, en forma soluble, replegada, y en gran cantidad después de su purificación final (varias decenas de mg/l de cultivo en condiciones de laboratorio no optimizadas).

- tiene una afinidad por HB-EGF y proHB-EGF al menos 10 veces superior a la de CRM197. De manera sorprendente, aunque la proteína DTR natural (DTRwt) tiene una afinidad por HB-EGF y proHB-EGF que es menor en un factor de 2 a la de CRM197, las proteínas DTR mutantes de acuerdo con la invención tienen una afinidad por HB-EGF y pro-HB-EGF considerablemente superior a la de CRM197; las proteínas denominadas DTR1, DTR3 y DTR8 tienen, respectivamente, una afinidad 60, 300 y 1400 veces superior a la de CRM197. Esto significa que DTR8 se podría utilizar a dosis muy inferiores a las de CRM197 para conseguir un mismo efecto terapéutico. De este modo, los riesgos de producirse efectos secundarios, generalmente vinculados a la existencia de uniones de baja afinidad con otras proteínas o ligandos del organismo, se reducen considerablemente, de este modo, en comparación con CRM197. Estas interacciones se suprimen mediante el uso de dosis, del orden pM, lo que debería ser el caso de DTR8.

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- tiene una inmunogenicidad disminuida con respecto a la de CRM197 y DTRwt. Diez de los 26 epítopos T identificados en DTRwt se han suprimido en la proteína DTR8 mediante mutagénesis dirigida, entre ellos, 7 de los 9 epítopos inmunodominantes.

- tiene una antigenicidad muy disminuida con respecto a la de CRM197 y DTRwt. Los sueros de individuos vacunados contra la toxina diftérica reconocen preferentemente el dominio catalítico de la misma. Este dominio está presente en la molécula CRM197 y ausente en la proteína DTR mutada de acuerdo con la invención. Por otro lado, la proteína DTR mutada de acuerdo con la invención es menos bien reconocida que DTRwt por los anticuerpos de sujetos vacunados que reconocen DTRwt.

- bloquea una vía de activación del EGFR (ErbB1 y ErbB4) por el HB-EFG de forma mucho más específica que los inhibidores comerciales del EGFR (moléculas pequeñas y anticuerpos terapéuticos), y tiene por este motivo, potencialmente, un riesgo mucho menor de producirse efectos secundarios,

- tiene un tamaño pequeño; las proteínas de las SEQ ID NO:2 a 5 y SEQ ID NO:7 a 9 tienen una secuencia de 158 aminoácidos y un PM de aproximadamente 17500 Da, es decir, un tamaño 3,4 veces inferior al de CRM197 y 8,8 veces inferior al de los anticuerpos anti-HB-EGF utilizados actualmente en los protocolos clínicos para bloquear la ruta HB-EGF. Debido a su pequeño tamaño, la proteína recombinante de acuerdo con la invención es más eficaz en el tratamiento de patologías relacionadas con la activación de la ruta del HB-EGF, especialmente la GNRP o el cáncer de ovario, debido a que se difunde más fácilmente en los tejidos, especialmente los tumores, y puesto que puede penetrar en los glomérulos renales.

Además, por su elevada afinidad por HB-EGF y pro-HB-EGF, la proteína de acuerdo con la invención también se puede utilizar para el diagnóstico de enfermedades que impliquen la activación de la ruta del HB-EGF/EGFR.

Definiciones

- En la presente solicitud, se entiende por "DTR" o "dominio DTR", el dominio R de la toxina diftérica que corresponde a los restos 380-385 a 531-535 de la secuencia de aminoácidos de la toxina diftérica natural (SEQ ID NO:1).

- La expresión "proteína DTR" designa una proteína recombinante que comprende un dominio DTR aislado, es decir, desprovisto en sus extremos N o C de la secuencia del dominio C y del dominio T de la toxina diftérica y de la secuencia de una proteína o un dominio de proteína capaz de mejorar la estabilidad o la purificación de dicho dominio R. Además, la purificación del dominio R incluye la extracción y purificación de dicho dominio, dado que se produce en forma de una proteína recombinante.

- La proteína recombinante de acuerdo con la invención que comprende al menos dos sustituciones tal como se han definido anteriormente se denomina con el nombre de proteína DTR mutante, proteína DTR mutada o proteína DTRn donde n es un número entero, por oposición a la proteína recombinante DTR natural (DTRwt) que no comprende dicha sustitución.

- Los aminoácidos se denominan según el código de una letra.

- La similitud entre una secuencia de aminoácidos con respecto a una secuencia de referencia se valora en función

del porcentaje del restos de aminoácidos que son idénticos o que difieren por sustituciones conservativas, cuando las dos secuencias se alinean para obtener la máxima correspondencia entre las mismas. Cuando solamente se tienen en cuenta los restos idénticos, y se determina el porcentaje de restos idénticos, se habla entonces de la identidad de dicha secuencia de aminoácidos con respecto a la secuencia de referencia. En el sentido de la presente invención, por sustitución conservativa en la secuencia de aminoácidos de una proteína, se entiende la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido natural o sintético que tenga propiedades químicas o físicas similares (tamaño, carga o polaridad), que no tienen ningún efecto perjudicial sobre la actividad biológica de la proteína. Por tanto, dos secuencias de aminoácidos de una proteína son similares cuando difieren entre sí por la sustitución de un aminoácido, la deleción y/o la inserción de un aminoácido o de un número reducido de aminoácidos (inferior a 5) en posiciones que no tienen ningún efecto perjudicial sobre la actividad biológica de dicha proteína. El experto en la materia puede calcular el porcentaje de similitud o identidad mediante un programa

informático de comparación de secuencias tal como, por ejemplo, el de la suite informática BLAST (Altschul et al.,

NAR, 1997, 25, 3389-3402). Los programas BLAST se aplican utilizando los parámetros preconfigurados, para una ventana de comparación formada por los restos 380 a 535 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1.

- Salvo indicación en contra, el término "HB-EGF" designa a la vez el precursor de membrana (pro-HB-EGF) y la forma secretada del HB-EGF.

- La actividad del ligando inhibidor del HB-EGF se refiere a la capacidad de unión a pro-HB-EGF y al HB-EGF y a la inhibición de diferentes fenómenos biológicos cuantificables, tales como:

- la inhibición del efecto tóxico de la toxina diftérica sobre células humanas o simias tales como células Vero,

- la inhibición de la actividad proliferativa del HB-EGF sobre células que expresan los subtipos ErbB1 y/o ErbB4 del EGFR y cuyo crecimiento es independiente del HB-EGF, tal como una línea de células linfoides de murino Ba/F3 transfectada con el gen del EGFR.

La proteína recombinante de acuerdo con la invención comprende un dominio DTR aislado, desprovisto en sus extremos N o C de una de las secuencias siguientes: (1) la secuencia del dominio C y del dominio T de la toxina diftérica, y (2) la secuencia de un ligando de fusión que puede mejorar la estabilidad del dominio DTR, tal como la secuencia de la glutatión-S-transferasa (GST) o capaz de mejorar la extracción y purificación del dominio DTR a partir de las bacterias transformadas, tal como la secuencia de un dominio de unión de las inmunoglobulinas procedente de la proteína A de S. aureus (dominio ZZ).

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La proteína recombinante de acuerdo con la invención comprende por lo general un dominio DTR aislado que se extiende entre los restos 380 y 535 de la secuencia SEQ ID NO:1 y comprende la combinación de las sustituciones Y380K y L390T. No obstante, también puede comprender un dominio DTR aislado algo más corto cuyo extremo N está en la posición 381 a 385 y el extremo C en la posición 531 a 534 de la secuencia SEQ ID NO:1. Cuando la secuencia del extremo N de DTR está en la posición 381 o 382, la proteína recombinante de acuerdo con la invención comprende la sustitución del resto L390. Cuando la secuencia del extremo N de DTR está en la posición 383, 384 o 385, la proteína recombinante de acuerdo con la invención comprende la sustitución del resto L390.

La proteína recombinante de acuerdo con la invención comprende opcionalmente una metionina (M) en su extremo N y/o secuencias adicionales en los extremos N y/o C del dominio DTR. En efecto, el precursor de dicha proteína recombinante comprende una metionina en el extremo N que se puede escindir mediante modificaciones posteriores a la traducción, de forma que está ausente en la proteína recombinante madura.

En aplicaciones terapéuticas, la proteína de acuerdo con la invención está constituida sucesivamente de: (1) une secuencia de 1 a 10 aminoácidos, preferentemente de 1 a 5 aminoácidos, de forma preferida de 1 o 2 aminoácidos, la secuencia del precursor y opcionalmente la de la proteína madura que se inicia con una metionina (M), por ejemplo una secuencia MG, y (2) un dominio DTR mutado tal como se define más adelante. Una proteína terapéutica de ese tipo tiene un tamaño pequeño, de aproximadamente 145 a 200 aminoácidos, preferentemente de 145 a 175 aminoácidos, preferentemente, de aproximadamente 160 aminoácidos.

En aplicaciones diagnósticas, la proteína de acuerdo con la invención se marca, especialmente con un trazador peptídico que se puede detectado por medición de una señal adecuada. El trazador peptídico es, especialmente, una etiqueta reconocida por un anticuerpo, una proteína fluorescente, o un péptido unido como mínimo a un átomo de tecnecio 99. El marcador se encuentra en el extremo N o el extremo C de la proteína, es decir, fusionado, directamente, o mediante un separador peptídico, respectivamente, al extremo N o al extremo C del dominio DTR. Una proteína de ese tipo tiene un tamaño de aproximadamente 145 a 500 aminoácidos, preferentemente de 145 a 300 aminoácidos, de forma preferida de aproximadamente 145 a 200 aminoácidos.

La invención abarca las proteínas recombinantes modificadas derivadas de la anterior mediante la introducción de cualquier modificación en uno o más restos de aminoácidos, en el enlace peptídico o en los extremos de la proteína recombinante, siempre que dicha proteína modificada mantenga una buena afinidad y una actividad inhibidora con respecto al HB-EGF y al pro-HB-EGF. Estas modificaciones, que se introducen en las proteínas usando métodos clásicos conocidos del experto en la materia, incluyen de forma no limitativa: la sustitución de un aminoácido por un aminoácido sintético (aminoácido D o análogo de aminoácido); adición de un grupo químico (lípido, oligo o polisacárido) en una función reactiva, especialmente en la cadena lateral R; la modificación del enlace péptido (-CO- NH-), especialmente mediante un enlace de tipo retro o retroinverso (-NH-CO-) o un enlace diferente del enlace peptídico; la ciclación; la fusión (mediante ingeniería genética) con un péptido o una proteína de interés o acoplamiento (mediante enlace químico) a una molécula de interés, especialmente con un agente de marcado o trazador detectable por medición de una señal.

Dicha proteína comprende al menos las sustituciones Y380K y L390T. Por ejemplo, dicha proteína comprende una de las combinaciones de sustituciones siguientes: Y380K y L390T; Y380K, Q387E y L390T; Y380K, Q387E, P388T y L390T; Y380K, Q387E, P382T e L390T. Preferentemente, se trata de una proteína que comprende o consiste en una de las secuencias SEQ ID NO:2 a 5.

De manera aún más preferida, dicha proteína comprende las sustituciones Y380K, Q387E y L390T. Por ejemplo, dicha proteína comprende o consiste en una de las secuencias SEQ ID NO:3 a 5, preferentemente la secuencia SEQ ID NO:3.

De acuerdo con otra realización ventajosa de dicha proteína, esta comprende además la sustitución A395T. La adición de la sustitución produce un aumento adicional del rendimiento de proteína soluble. Preferentemente, dicha proteína comprende la secuencia SEQ ID NO:7; esta proteína, denominada DTR1, comprende las sustituciones Y380K, Q387E, L390T y A395T. La afinidad de unión de la proteína DTR1 a HB-EGF está aumentada en un factor de 60 en comparación con CRM197, y en un factor de 130 en comparación con la proteína DTRwt solubilizada con un 0,5 % del detergente sarcosilo.

De acuerdo con otra realización adicional ventajosa de dicha proteína, esta comprende además, al menos una de las sustituciones F389Y y/o G510A. La adición de una de estas sustituciones aumenta la afinidad de unión de la proteína DTR a HB-EGF. Además, la combinación de las dos sustituciones produce un aumento adicional de la afinidad de unión a HB-EGF, con respecto al aumento obtenido con una sola sustitución. Preferentemente, dicha proteína comprende o consiste en la secuencia SEQ ID NO:8; esta proteína, denominada DTR3, comprende las sustituciones Y380k, Q387E, L390T, A395T, F389Y y G510A. La afinidad de la proteína DTR3 por el HB-EgF está aumentada en un factor de 5 en comparación con la de DTR1, y en un factor de 300 en comparación con la de CRM197.

De acuerdo con otra realización ventajosa de dicha proteína, esta comprende igualmente al menos una sustitución

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seleccionada del grupo que consiste en: N399K, V452T, T517E, V483Q, H492E, S494K, T436H y E497D. Dicha proteína comprende ventajosamente al menos 3, preferentemente al menos 5 de dichas sustituciones.

Preferentemente, dicha proteína comprende las sustituciones N399K, V452T, T517E, V483Q, H492E y S494K. Estas mutaciones han permitido eliminar 10 de los 26 epítopos T CD4 identificados en DTRwt. Entre estos 10 epítopos, se encuentran 7 de los 9 epítopos previstos como los epítopos inmunodominantes de DTRwt. La capacidad de la proteína resultante, para inducir una respuesta inmunitaria de tipo CD4, es decir, productora de anticuerpos, se encuentra por tanto considerablemente disminuida con respecto a la de DTRwt. De forma notable e inesperada, la adición de las seis mutaciones destinadas a reducir la inmunogenicidad de DTR ha contribuido a aumentar su afinidad por HB-EGF.

Preferentemente, dicha proteína comprende o consiste en la secuencia SEQ ID NO:9; esta proteína, denominada DTR8, comprende las sustituciones Y380K, Q387E, L390T, A395T, F389Y, G510A, N399K, V452T, T517E, V483Q, H492E y S494K. Tiene un peso molecular de 17458 Da.

La afinidad de la proteína DTR8 por el HB-EGF está aumentada en un factor de 3 en comparación con la de DTR3, y en un factor de 1400 en comparación con la de CRM197. Además, DTR8 es al menos 300 veces más eficaz que CRM197 para unirse al HB-eGf secretado e inhibir la ruta HB-EGF/EGFR.

La antigenicidad de la proteína DTR8 resulta ser muy reducida con respecto a la de CRM197. En efecto, la parte más importante de los anticuerpos presentes en adultos vacunados contra la DT (vacunación obligatoria) se dirige contra el dominio catalítico de la Dt. De manera sorprendente e inesperada, la antigenicidad de la proteína DTR8 resulta ser reducida con respecto a la de DTR1 y, por tanto, respecto a DTRwt.

La proteína de acuerdo con la invención puede comprender sustituciones adicionales, en particular, de restos situados en la superficie del dominio DTR, para reducir todavía más su antigenicidad.

De acuerdo con otra realización ventajosa de dicha proteína, comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, 85 % o 90 % de identidad, con los restos 380 a 535 de la secuencia SEQ ID NO:1.

De acuerdo con otra realización ventajosa de dicha proteína, está marcada con un trazador detectable. Los medios y las técnicas de marcado de proteínas son bien conocidos del experto en la materia e incluyen el marcado radiactivo, magnético o fluorescente que se puede llevar a cabo directa o indirectamente. Los agentes de marcado directo son especialmente isótopos radiactivos tales como tritio (3H), yodo (125I) y tecnecio (99mTc) o compuestos luminiscentes (radioluminescentes, quimioluminiscentes, bioluminiscentes, fluorescentes o fosforescentes) tales como fluoróforos tales como, de forma no limitativa, AlexaFluor®, FITC y Cianina 3, y proteínas fluorescentes tales como la GFP y sus derivados. Los agentes de marcado indirecto incluyen especialmente las enzimas y las etiquetas epitópicas reconocidas por un anticuerpo específico. El marcado se lleva a cabo especialmente mediante: (1 ) injerto de un fluoróforo en un grupo reactivo tal como una amina reactiva de un resto lisina, (2) incorporación de un grupo reactivo (cisteína libre) por síntesis química o producción recombinante, y posterior utilización de este grupo para injertar un fluoróforo, (3) incorporación directa de un fluoróforo, en el extremo N o C, mediante síntesis química, (4) incorporación directa de una proteína fluorescente o de una enzima mediante la producción de una proteína de fusión. Dichas proteínas marcadas se utilizan especialmente como reactivo para el diagnóstico in vitro o in vivo (mediante obtención de imágenes) de enfermedades relacionadas con la activación de la ruta HB-EGF/EGFR o como herramienta para el estudio de esta ruta de activación. La proteína DTR se puede marcar directamente mediante acoplamiento covalente del tecnecio (99mTc) o de un trazador fluorescente; el trazador fluorescente está especialmente acoplado a uno de los restos lisina de la proteína DTR.

La proteína recombinante de la presente invención se puede producir mediante un procedimiento en el que un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica dicha proteína unida de forma funcional a elementos reguladores que permiten su expresión en el hospedador elegido, se transfiere a una célula hospedadora que se cultiva en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína. A continuación, la proteína producida se recupera y se purifica. Los procedimientos de purificación utilizados son conocidos del experto en la técnica. La proteína recombinante obtenida se puede purificar a partir de lisados y extractos celulares, del sobrenadante del medio de cultivo, con métodos utilizados individualmente o en combinación, tales como el fraccionamiento, métodos de cromatografía, técnicas de inmunoafinidad mediante anticuerpos monoclonales o policlonales específicos. La proteína recombinante obtenida es soluble.

La presente invención tiene también por objeto un polinucleótido aislado que codifica dicha proteína recombinante. Dicho polinucleótido comprende ventajosamente una secuencia de codificación optimizada para la expresión en el hospedador celular en donde se produce la proteína de la invención. Preferentemente, dicho polinucleótido comprende la secuencia SEQ ID NO:10, 12 o 14 que está optimizada para la expresión en E. coli y codifica respectivamente la proteína recombinante DTR1, DTR3 y DTR8. El polinucleótido de la invención es un ADN o un ARN preparado por los métodos convencionales de síntesis química o de biología molecular conocidos por el experto en la materia.

La presente invención tiene igualmente por objeto un vector recombinante de clonación y/o de expresión que comprende dicho polinucleótido. Preferentemente, dicho vector es un vector de expresión que comprende dicho

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polinucleótido unido de manera funcional a secuencias reguladoras que permiten la expresión de la proteína de la invención en el hospedador celular utilizado para la producción de dicha proteína (promotor, activador, codón de inicio (ATG), codón de detención, señal de finalización de transcripción). El vector, replicador o integrador, especialmente un plásmido o un vector vírico, se prepara según los métodos habitualmente utilizados por el experto en la materia.

La presente invención tiene también por objeto una célula hospedadora modificada de forma transitoria o estable mediante un vector recombinante tal como se ha definido anteriormente. Estas células se pueden obtener mediante la introducción en una célula hospedadora eucariota de un vector recombinante tal como se ha definido anteriormente, según métodos convencionales conocidos del experto en la materia, tales como la electroporación. Los ejemplos de células hospedadoras incluyen especialmente las células de mamíferos, de insectos, de bacterias tales como E. coli y levaduras.

La presente invención tiene igualmente por objeto una composición farmacéutica, que comprende al menos una proteína recombinante o vector recombinante de expresión tales como se han definido anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La composición farmacéutica comprende una dosis eficaz de proteína o de vector que permite obtener un efecto terapéutico sobre las enfermedades asociadas a una activación de la ruta HB-EGF/EGFR tales como se han definido anteriormente. De manera general, una cantidad terapéuticamente eficaz está comprendida de aproximadamente 0,1 |jg a aproximadamente 100 mg, preferentemente de 10 |jg a 10 mg, se puede administrar a adultos humanos. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son los utilizados de forma clásica. La composición se presenta en una forma farmacéutica adaptada a la administración elegida: solución estéril inyectable, polvo, comprimidos, cápsulas, suspensión, jarabe, supositorios, que se preparan según los protocolos normalizados. La administración puede ser subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intraperitoneal, oral, sublingual, rectal, vaginal, intranasal, mediante inhalación, o por aplicación transdérmica.

Las vías de administración, las posologías y formas farmacéuticas de las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención se pueden determinar de la forma habitual por el experto en la materia, especialmente según los criterios generalmente utilizados para establecer un tratamiento terapéutico adaptado a un paciente (por lo general, un ser humano y opcionalmente un mamífero no-humano), como por ejemplo, la edad, el peso corporal, la gravedad de su estado general, la tolerancia del tratamiento y los efectos secundarios comprobados.

La presente invención tiene también por objeto una proteína recombinante tal como se ha definido anteriormente como un medicamento.

La presente invención se refiere también a una proteína recombinante tal como se ha definido anteriormente para su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la activación de la ruta HB-EGF/EGFR.

La presente invención tiene también por objeto el uso de una proteína recombinante tal como se ha definido anteriormente en la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la activación de la ruta HB-EGF/EGFR.

La presente invención tiene también por objeto un método para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la activación de la ruta HB-EGF/EGFR, que comprende la administración de una composición farmacéutica como se ha definido anteriormente, a un individuo. La administración se realiza de acuerdo con una vía y una pauta adecuados tales como se han definido anteriormente.

Preferentemente, dichas enfermedades se seleccionan entre el grupo seleccionado por: glomerulonefritis de rápida progresión (GNRP), cánceres, especialmente el cáncer de ovario, del endometrio, de mama, del útero (adenocarcinoma uterino), de la vesícula, de estómago, de la piel (melanoma maligno), de cerebro (glioblastoma) y de pulmón, vasoespasmo asociado a contusiones cerebrales, hipertrofia cardiaca, hiperplasia de las células de la musculatura lisa, hipertensión pulmonar, retinopatías diabéticas y restenosis arterial.

La presente invención tiene también por objeto el uso de una proteína tal como se ha definido anteriormente, para el diagnóstico in vitro o in vivo de una enfermedad relacionada con la activación de la ruta del HB-EGF/EGFR.

La invención se refiere también a un método de diagnóstico in vitro de una enfermedad relacionada con la activación de la ruta del HB-EGF/EGFR, que comprende la puesta en contacto de una muestra biológica con una proteína marcada tal como se ha definido anteriormente, en condiciones que permitan la formación de un complejo específico entre dicha proteína marcada y el HB-EGF y/o el proHB-EGF, y la detección de dichos complejos marcados de proteína/HB-EGF, por cualquier medio adecuado.

La muestra biológica es especialmente una muestra de biopsia (riñón, tumor, musculatura lisa, corazón, pulmón, vasos, retina), suero u orina.

La presente invención tiene también por objeto el uso de una proteína recombinante tal como se ha definido

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anteriormente para la detección, in vitro o in vivo, del HB-EGF.

La presente invención tiene también por objeto un procedimiento de detección del HB-EGF, in vitro e in vivo, que comprende al menos las siguientes etapas:

- la puesta en contacto de células a analizar con una proteína marcada tal como se ha definido anteriormente, y

- la detección de células y/o del medio extracelular marcados, por cualquier medio adecuado.

Este procedimiento permite determinar el perfil de expresión tisular del HB-EGF en condiciones fisiológicas, patológicas o en respuesta a un estímulo endógeno o exógeno. La detección del HB-EGF, in vivo, en el organismo de un mamífero (obtención de imágenes celulares), especialmente en tiempo real, comprende una etapa anterior de administración de dicha proteína a dicho mamífero (inyección parenteral, administración oral). La detección del HB- EGF in vivo en el ser humano se puede utilizar para el diagnóstico de una enfermedad relacionada con la activación de la ruta del HB-EGF/EGFR.

El marcado de las células y del medio extracelular que contiene el HB-EGF es especialmente un marcado fluorescente, radiactivo, o un marcado magnético, que se puede detectar por cualquier técnica conocida por el experto en la materia (microscopía de fluorescencia, citometría de flujo, gammagrafía, imagen de resonancia magnética).

La invención tiene también por objeto un kit para la aplicación de los métodos de diagnóstico o de detección que se han descrito anteriormente, que comprende una proteína marcada tal como se ha definido anteriormente.

Descripción de las figuras

Además de las disposiciones precedentes, la invención comprende además otras disposiciones, que se pondrán de manifiesto con la descripción que sigue a continuación, que se refiere a ejemplos de aplicaciones del objeto de la presente invención, con referencia a los dibujos anexos en los que:

- la figura 1 representa las mutaciones (A) y el análisis (B) de las fracciones solubles e insolubles de los 5 clones seleccionados por cribado del banco R1 para producir una proteína DTR más soluble que DTRwt. Todos los clones son solubles; el mejor clon es el clon 1D6.

- la figura 2 muestra los efectos de las mutaciones A395T y N399D sobre la solubilidad de la proteína DTR producida por el clon 1D6 (aquí denominado G1). El mejor clon contiene la mutación A395T.

- la figura 3 representa: (A) la inhibición del efecto tóxico de dosis crecientes de toxina diftérica sobre células Vero

mediante dosis crecientes de DTR1 y (B) la regresión de Schild para evaluar el valor de Kd de DTR1 para HB-EGF según la ecuación log (CE50 - 1) = Kd log (B) donde CE50 es la concentración de toxina diftérica que proporciona el 50 % de toxicidad y B la concentración del inhibidor DTR1.

- la figura 4 representa la inhibición del efecto tóxico de la toxina diftérica a la concentración de 10'11 M sobre células Vero para todos los mutantes de DTR1 (aquí denominado G2) a una concentración de 10'9 M.

- la figura 5 representa: (A) la inhibición del efecto tóxico de dosis crecientes de toxina diftérica sobre células Vero

mediante dosis crecientes de DTR8 y (B): la regresión de Schild para evaluar el valor de Kd de DTR8 para HB- EGF según la ecuación log (CE50 - 1) = Kd log (B) donde CE50 es la concentración de toxina diftérica que proporciona el 50 % de toxicidad y B la concentración del inhibidor DTR8.

- la figura 6 representa la inhibición del efecto proliferativo de dosis crecientes de HB-EGF sobre células Ba/F3 que expresan EGFR y dependencia de HB-EGF para su crecimiento, mediante dosis crecientes de DTR8 (A) y de CRM197 (B).

- la figura 7 representa el reconocimiento de las proteínas CRM197, dominio C (C) y dominio T (T) de la toxina diftérica, DTR1 y DTR8 por los anticuerpos presentes en el suero de 20 donantes sanos. El título se define mediante la dilución del suero donante de una señal de fluorescencia de 5000 unidades arbitrarias en el ensayo ELISA, tras restar el ruido de fondo. Un título < 20 corresponde al ruido de fondo y, por tanto, a ausencia de unión del anticuerpo cuantificable. De forma arbitraria, se fijó un título de 30 para distinguir entre respuestas de anticuerpos débiles y las respuestas medias o fuertes.

Descripción detallada de la invención

Ejemplo 1: Materiales y métodos

1) Clonación de las secuencias genéticas, expresión y purificación de la proteína DTRwt y de sus mutantes

La secuencia genética que codifica el dominio DTR de la toxina diftérica, que recubre la secuencia Y380-S535 de la toxina natural fue el punto de partida de este estudio. Todas las secuencias genéticas se sintetizaron después de la optimización tras una expresión en E. coli por la empresa GENEART según las secuencias proteicas previamente determinadas. Sus secuencias se clonaron en el vector pET28a(+) (NOVAGEN) entre los sitios de restricción Ncol y SalI. La presencia del sitio Ncol genera los codones no nativos M y G correspondientes al extremo N de la proteína recombinante. La secuencia SEQ ID NO:16 es la secuencia nucleotídica optimizada que codifica la proteína DTR natural (DTRwt) de 158 aminoácidos que consiste en los restos M y G seguidos por los restos Y380 a S535 de la

toxina diftérica natural. Las secuencias nucleotídicas optimizadas que codifican las formas mutantes y solubles de la proteína DTR se derivan de la secuencia SEQ ID NO:16 por sustitución de cada codón a mutar por un codón optimizado que codifica el aminoácido mutado, como se indica en la Tabla I:

5 Tabla I: Lista de codones optimizados seleccionados según las mutaciones de^ DTR

Mutación

Codón natural Codón mutado optimizado

Y380K

tac aaa

Y380E

tac gaa

P382T

ccg acg

Q387E

cag gag

Q387K

cag aag

P388T

ccg acg

F389Y

ttt tat

L390T

ctg acc

L390N

ctg aac

H391K

cat aaa

A395T

gcg acc

N399D

aac gat

N399K

aac aaa

V401Q

gtg cag

L427Q

ctg cag

L427N

ctg aac

L427S

ctg agc

T436K

acc aaa

T436H

acc cat

V452T

gtg acg

I457D

att gat

I457E

att gaa

R460T

cgt acc

A463T

gcg acc

A463S

gcg agc

A463E

gcg gaa

A463D

gcg gat

A463G

gcg ggc

Y478T

tat acc

V483D

gtg gat

V483E

gtg gaa

V483H

gtg cat

V483Q

gtg cag

A490G

gcg ggc

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35

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Mutación

Codón natural Codón mutado optimizado

H492E

cat gaa

S494K

agc aaa

S496K

agc aaa

E497D

gaa gat

G510A

ggc gcg

G510M

ggc atg

G510Q

ggc cag

G510S

ggc agc

Q515E

cag gaa

T517D

acc gat

T517E

acc gaa

T521R

acc cgc

K522R

aaa cgc

La expresión de la proteína DTRwt se llevó a cabo en la bacteria Escherichia coli BL21(DE3) en medio Terrific Broth en presencia de 50 pg/ml de kanamicina a 37°C. La inducción de la proteína se consiguió mediante la adición de isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido 1 mM (IPTG). Las bacterias se recuperaron por centrifugación a 5000 g durante 45 min y se lisaron en tampón fosfato de sodio 20 mM, NaCl 500 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,25 mM, lisozima (0,25 mg/ml), pH 8 por paso en el Cell Disrupter (CONSTANT SYSTEM). Los cuerpos de inclusión que contenían la proteína se solubilizaron en una solución que contenía urea 8 M y Tris-HCl 0,1 M, pH 8. La proteína se purificó por cromatografía de intercambio de cationes en una columna HiTrap™ SP 5 ml (GE HEALTH CARE LIFE SCIENCES) con un gradiente de tampón entre urea 8 M y Tris-HCl 0,1 M, pH 8 y urea 8 M, NaCl 1 M en Tris-HCl 0,1 M, pH 8, y después replegada mediante diálisis en 2 etapas, en primer lugar, contra un tampón Tris-HCl 20 mM, NaCl 50 mM, cisteína 1 mM/cistina 8 mM, sarcosilo al 0,5 %, pH 8 y después contra un tampón Tris-HCl 20 mM, NaCl 50 mM, sarcosilo al 0,5 %, pH 8.

La expresión de las formas mutantes y solubles de la proteína DTR se llevó a cabo en la bacteria Escherichia coli BL21(DE3) en medio 2YT en presencia de 50 pg/ml de kanamicina. Después de 2 h 20 min de cultivo a 37°C, la inducción de la proteína se realizó por adición de IPTG 1 mM. A continuación, después de 4 h 30 min a 30°C, las bacterias se recuperaron por centrifugación a 5000 g durante 30 min y se lisaron en un tampón fosfato de sodio 20 mM, PMSF 0,25 mM, MgCl2 2 mM, con adición de benzonasa (6,25 U/ml), pH 7,8 en el Cell Disrupter (CONSTANT SYSTEM). La proteína, soluble en la mezcla de lisis, se purificó por cromatografía de intercambio de cationes en una columna HiT rap™ SP 5 ml con un gradiente entre fosfato de sodio 20 mM pH 7,8 y fosfato de sodio 20 mM, NaCl 1 M pH 7,8 (GE) y almacenado a -20°C en un tampón fosfato de sodio 20 mM, NaCl 500 mM, pH 7,8.

2) Cribado de selección de mutantes solubles

Tres bancos de secuencias de DTR fabricadas mediante síntesis y clonadas en el plásmido pET28a(+) se transfectaron en la cepa E. coli BL21(DE3) (GENEART). Para cada banco, se repicaron clones en 2 o 4 placas de 96 pocillos en medio de cultivo en presencia de un antibiótico de selección y del inductor de expresión (IPTG). Tras el crecimiento, las bacterias se lisaron mediante una solución Bugbuster™ (0,5X final) (NOVAGEN) con adición de Lysonase™ (NOVAGEN). Tras centrifugación de las placas durante 20 min a 2700 g a 4°C, se evaluó la presencia de cuerpos de inclusión un pocillo tras otro según el tamaño del aglomerado y la fracción de proteína soluble se identificó por análisis de los sobrenadantes de lisis en un gel de poliacrilamida en condiciones de desnaturalización y coloración con azul de Coomassie.

3) Ensayo de actividad de las proteínas DTR por inhibición de la toxicidad de la toxina diftérica

Células Vero (ATCC CCL-81™) se sembraron en placas de 96 pocillos Cytostar-T™ (PERKIN ELMER) con fondo de centelleo a 50.000 células por pocillo en medio D-MEM (medio esencial mínimo de Eagle modificado por Dulbecco) con adición de glutamina 2 mM, una solución de penicilina/estreptomicina al 1 %, una solución de aminoácidos no esenciales al 1 % y suero bovino fetal al 10 %. Se añadieron por duplicado concentraciones variables de toxina diftérica (SIGMA). Estas condiciones se repitieron en presencia del agonista analizado: proteína DTRwt, DTR mutante o CRM197 (Sigma). Después de 22 h de incubación a 37 °C en una atmósfera con CO2 al 5%, el medio de cultivo se sustituyó por medio sin leucina que contenía 1 pCi/pocillo de 14[C]-leucina (GE HEALTH CARE LIFE SCIENCES).

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Después de 5 h de incubación a 37 °C en una atmósfera con CO2 al 5%, la radioactividad incorporada a las células se contó introduciendo las placas revestidas de película adhesiva en un aparato MicroBeta® (WALLAC).

4) Ensayo de actividad de las proteínas DTR mediante inhibición de la actividad proliferadora del HB-EGF

El ensayo utiliza una línea de células linfoides de murino Ba/F3 (Palacios, R & Steinmetz, M., Cell, 1985, 81, 727-734) transfectadas en el laboratorio con el gen del EGFR. Esta línea es dependiente del HB-EGF o de la anfirregulina para su crecimiento. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos Nunclon™ (NUNC) a 10.000 células por pocillo en medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium) 1640 con adición de glutamina 2 mM, una solución de penicilina/estreptomicina al 1 %, una solución de aminoácidos no esenciales al 1 % y suero bovino fetal al 10 %. Se añadieron por duplicado concentraciones variables de HB-EGF o anfirregulina. Estas condiciones se repitieron en presencia del agonista analizado: proteína DTR mutante o CRM197. Después de 24 h de incubación a 37 °C en una atmósfera con CO2 al 5%, 1 pCi/pocillo de 3[H]-timidina (GE HEALTH CArE LIFE SCIENCES) se añadió a cada pocillo. Después de 5 h de incubación a 37 °C en una atmósfera con CO2 al 5%, las células se aspiraron sobre un filtro de fibra de vidrio (filtermat A, WALLAC) con un aparato TOMTEC®. Tras el secado de los filtros, estos se introdujeron en una bolsita sellada en presencia de líquido de centelleo y la radioactividad incorporada a las células se contó en un aparato MicroBeta® (WALLAC).

5) Identificación de los epítopos T CD4 de la proteína DTR

La identificación de los epítopos T CD4 de la proteína DTR se llevó a cabo mediante el análisis de los péptidos de la DTR reconocidos por líneas de linfocitos T CD4 específicos de DTR, restringidos a las moléculas HLA-DRB1 mayoritarias en los fenotipos caucásicos. Los protocolos utilizados son los descritos anteriormente en la solicitud WO 2010/076413 salvo por las modificaciones siguientes: (1) las líneas de linfocitos T CD4 específicos de DTR se produjeron mediante cultivo simultáneo de los linfocitos T CD4 del donante con células dendríticas maduras autólogas cargadas con una combinación de péptidos solapantes de DTR y (2) la especificidad de las líneas producidas se analizó en un ensayo ELISPOT-IFN-y usando células mononucleares de sangre periférica (PBMc) autólogas cargadas, bien con la combinación de péptidos utilizada para producir la línea de linfocitos T CD4, para comprobar la especificidad de la línea para DTR, bien con un péptido de la combinación, para determinar la especificidad de cada línea.

a) Aislamiento de los linfocitos T CD4 a partir de PBMC

Se seleccionaron siete donantes de edad y fenotipo HLA-DRB1 diferentes, de forma que el conjunto de estos donantes expresa las 8 moléculas HLA-DRB1 mayoritarias en los fenotipos caucásicos (HLA-DR1; HLA-DR3; HLA-DR4; HLA- dR7; HLA-DR11; HLA-DR13; HLA-DR15; HLA-DR8). Los linfocitos T CD4 de cada donante se aislaron de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), con un grado de pureza superior al 98 %, mediante trimagnética en columna con partículas magnéticas acopladas a un anticuerpo dirigido contra CD4, según un procedimiento estándar definido por el fabricante (MYLTENYI BIOTECH).

b) Producción y caracterización de las líneas de linfocitos T CD4 específicos de DTR

Se sintetizaron 25 péptidos solapantes de 15 aminoácidos que cubren la totalidad de la secuencia del DTR (INTAVIS BIOANALYTICAL INSTRUMENTS).

Tabla II: Péptidos solapantes que cubren la secuencia de DTR (SEQ ID NO:18 a 42)

Péptido

Localización Secuencia de aminoácidos

1

378-392 M G Y S P G H K T Q P F L H D

2

385-399 K T Q P F L H D G Y A V S W N

3

391-405 H D G Y A V S W N T V E D S I

4

397-411 S W N T V E D S I I R T G F Q

5

403-417 D S I I R T G F Q G E S G H D

6

409-423 G F Q G E S G H D I K I T A E

7

415-429 G H D I K I T A E N T P L P I

8

421-435 T A E N T P L P I A G V L L P

9

427-441 L P I A G V L L P T I P G K L

10

433-447 L L P T I P G K L D V N K S K

11

439-453 G K L D V N K S K T H I S V N

12

445-459 K S K T H I S V N G R K I R M

13

451-465 S V N G R K I R M R C R A I D

14

457-471 I R M R C R A I D G D V T F C

5

10

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20

25

30

35

40

45

50

Péptido

Localización Secuencia de aminoácidos

15

463-477 A I D G D V T F C R P K S P V

16

469-483 T F C R P K S P V Y V G N G V

17

475-489 S P V Y V G N G V H A N L H V

18

482-496 G V H A N L H V A F H R S S S

19

488-502 H V A F H R S S S E K I H S N

20

494-508 S S S E K I H S N E I S S D S

21

500-514 H S N E I S S D S I G V L G Y

22

506-520 S D S I G V L G Y Q K T V D H

23

512-526 L G Y Q K T V D H T K V N S K

24

518-532 V D H T K V N S K L S L F F E

25

521-535 T K V N S K L S L F F E I K S

Los péptidos se agruparon en 3 combinaciones:

- Combinación 1: péptidos 1 a 8

- Combinación 2: péptidos 9 a 16

- Combinación 3: péptidos 17 a 25

Cada una de las combinaciones se utiliza in vitro para sensibilizar independientemente, de forma repetida, los linfocitos T CD4 procedentes de los donantes seleccionados para el estudio. Se prepararon un mínimo de 30 pocillos de cultivo simultáneo por combinación de péptidos. En un primer momento, los linfocitos T CD4 sensibilizados capaces de reconocer la combinación de péptidos utilizada durante la estimulación, denominados líneas de linfocitos T CD4, se seleccionaron para un ensayo ELISPOT-IFN-y usando los mismos PBMC autólogos cargados con la combinación de péptidos como células presentadoras del antígeno. En un segundo momento, el uno o varios péptidos reconocidos específicamente por las líneas T CD4 seleccionadas durante el primer análisis se identifican mediante un ensayo ELISPOT-IFN-y usando PBMC autólogas cargadas por separado con cada uno de los péptidos de la combinación como células presentadoras de antígeno. La especificidad del reconocimiento del antígeno (péptido aislado o combinación de péptidos) está definido por: (1) una relación entre el número de linfocitos T CD4 productores de IFN- Y en respuesta al antígeno (PBMC + péptidos), con respecto al ruido de fondo (ausencia del antígeno, es decir, PBMC solas) que es superior a 2, y (2) un número mínimo de 30 puntos en presencia de antígeno, tras eliminar el ruido de fondo.

6) Evaluación de la antigenicidad de las proteínas DTR

En cada etapa, las incubaciones se llevaron a cabo en una u otra de las tres condiciones siguientes: 1 h a 37°C o 2 h a 20°C o 16 h a 4°C. Las proteínas estudiadas (CRM197, dominio catalítico, dominio de translocación, DTR1 y DTR8) se solubilizaron a la concentración de 1,7x10'8 M en tampón PBS a pH 7,4 para adsorberse sobre placas de 96 pocillos Maxisorp™ (NUNC). Los pocillos se saturaron con una solución de albúmina de suero bovino (BSA) (SIGMA) al 3 % en PBS. Después de 4 lavados con una solución de tampón PBS que contenía Tween 20 al 0,05 %, los sueros de donantes sanos se incubaron por duplicado en los pocillos tras dilución al 1/20ésimo, 1/200ésimo o 1/2000ésimo en un tampón PBS que contenía BSA al 0,2 % y Tween 20 al 0,05 %. Después de 4 lavados con una solución de tampón PBS que contenía Tween 20 al 0,05 %, un anticuerpo de cabra dirigido contra IgG humana conjugado con fosfatasa alcalina (SIGMA) se incubó en los pocillos tras dilución al 1/200ésimo en una solución de PBS que contenía BSA al 0,2 % y Tween 20 al 0,05 %. Después de 4 lavados en una solución de PBS que contenía Tween 20 al 0,05 %, el ensayo se reveló por incubación en una solución de fosfato de 4-metilumbeliferilo 0,1 mM (SIGMA) diluida en tampón carbonato 50 mM, MgCh 1 mM a pH 9,8 durante 30 min a 20 °C. La fluorescencia de los pocillos (emisión a 450 nm) se midió en un fluorímetro Victor (WALLAC) por excitación a 365 nm.

Antes de someterse a ensayo, los sueros se dejaron reposar a 20 °C durante un día, se centrifugaron a 10.000 g durante 10 min y después se añadió timerosal al 0,003 % antes del almacenamiento a 4 °C o a -20 °C.

Ejemplo 2: Mejora de la solubilidad de la proteína DTR

La proteína DTRwt expresada en E. coli se acumula en cuerpos de inclusión insolubles. La proteína solamente se pudo obtener, solubilizar y purificar en presencia de sarcosilo al 0,5 % o dodecilsulfato de sodio, detergentes incompatibles con el uso terapéutico a dichas concentraciones. El uso de otras moléculas solubilizantes no tuvo resultados (Tween-80, sacarosa, arginina). El uso de agentes caotrópicos tales como la urea o el cloruro de guanidina para solubilizar la proteína, seguido de diálisis contra diferentes tampones de replegado, tampoco permitió obtener una proteína funcional soluble. La influencia del sitio de truncamiento del DTR con respecto a la secuencia de la toxina diftérica completa se estudió de igual forma. Las formas de DTR que se inician en los restos A379, Y380, S381, P382, G383, H384, K385 resultaron ser todas insolubles en ausencia de detergente.

La estrategia utilizada para aumentar la solubilidad de la proteína DTR consistió en mutar los restos hidrófobos presentes en la superficie de la proteína por restos hidrófilos, polares o cargados. En efecto, los restos hidrófobos en la superficie de una proteína son potencialmente responsables de una baja solubilidad y una tendencia a la agregación.

5 Las mutaciones a introducir se identificaron sobre la base de una modelización molecular. El efecto potencial de las mutaciones sobre la estructura de la proteína se indica en la Tabla III.

Tabla III: Efecto esperado de las mutaciones seleccionadas

Posiciones

Mutaciones Nota de orden estructural e interacciones

Y380

- flexible al finalizar el bucle del extremo N, sin enlace de hidrógeno estable

Y380E enlace iónico con K385

Y380K enlace iónico con E532

P382

- En un codo de tipo II

P382T

Q387

- En el bucle del extremo N, sin enlace de hidrógeno estable

Q387E enlace iónico con Y380K

P388

- En el bucle del extremo N, justo antes de una hebra beta

P388T P388T

L390

- En una hebra beta

L390N donante de enlace de hidrógeno para el grupo CO de la cadena principal de Y394

L390T resto beta ramificado promovido

A395

- En una hebra beta

A395T resto beta ramificado promovido

N399

- En un bucle, sin enlace de hidrógeno estable

N399D enlace iónico con K419

N424

- En un bucle, sin enlace de hidrógeno estable

N424D enlace iónico con N481K

N424E enlace iónico con N481K

N424K enlace iónico con E423 o N481E o N481D

P426

- En el extremo de un bucle

P426T

L427

- En una hebra beta, interacciones de Van der Waals con Y394

L427K interacciones de Van der Waals con Y394, donante de enlace de hidrógeno para T425, enlace iónico con E423

L427R interacciones de Van der Waals con Y394, donante de enlace de hidrógeno para T425, enlace iónico con E423

P428

- En un saliente

P428T

P476

- En un saliente

P476T

Y478

- En una hebra beta, interacciones de Van der Waals con P426, P428, P476

Y478D

5

10

15

20

25

Posiciones

Mutaciones Nota de orden estructural e interacciones

Y478N

N481

- En un bucle, sin enlace de hidrógeno estable

N481D enlace iónico con N424K

N481E enlace iónico con N424K

N481K enlace iónico con N424E o N424D

V483

- En un bucle

V483T

Se prepararon tres bancos de secuencias de DTR mediante síntesis (Tabla IV). Cada banco contenía secuencias mutadas en 4 o 5 codones seleccionados según los datos de modelización molecular. Cada banco correspondía a codones mutados en una misma región de la secuencia codificante. Las secuencias contenían degeneraciones parciales de los codones a mutar para limitar las mutaciones posibles a los restos hidrófilos potencialmente aceptables según los datos de la modelización (1, 2 o 3 mutaciones posibles por cada posición). La posibilidad de conservar el codón natural se mantuvo en aquellos casos donde la posición estudiada no pudo tolerar mutaciones (Tabla IV), salvo en Y380 donde la posición del extremo N relativamente poco constreñida se considera tolerante.

Tabla IV: Combinaciones de mutaciones posibles alcanzadas en cada uno de los tres bancos de secuencias ______________mutantes generadas para aumentar la solubilidad del dominio R (R1, R2, R3).______________

Región mutada

Posiciones mutadas Restos posibles Diversidad del banco

R1

Y380 K/E 72

P382

P/T

Q387

Q/E/K

P388

P/T

L390

L/T/N

R2

N424 N/K/D/E 48

P426

P/T

L427

L/R/K

P428

P/T

R3

P476 P/T 48

Y478

Y/N/D

N481

N/K/D/E

V483

V/T

*La diversidad indica el número de combinaciones de mutaciones posibles para cada uno de los bancos.

Después de la transfección de los bancos de ADN, cada una de las colonias bacterianas obtenidas correspondientes a una combinación de mutaciones dada se analizó para determinar su capacidad posible para producir una forma mutante soluble de la proteína DTR. Para ello, 740 clones producidos en los tres bancos, que representan el 85 % de la diversidad conseguida (41 clones diferentes para cada banco), se repicaron en placas de 96 pocillos, cultivadas en condiciones de inducción de la expresión de la proteína, se centrifugaron y posteriormente se lisaron con solución de lisis. Tras la centrifugación, la solubilidad de las proteínas expresadas por cada clon se evaluó mediante observación de un aglomerado de cuerpos de inclusión en el fondo del pocillo, opcional, y mediante análisis del sobrenadante mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones de desnaturalización y coloración con azul de Coomassie (Figura 1).

El análisis de las colonias llevó a seleccionar los clones que mostraban una ausencia de aglomerado (aglomerado correspondiente a los cuerpos de inclusión) o un aglomerado de tamaño reducido, junto con una elevada cantidad de proteína en el sobrenadante de lisis. Solo el banco R1 permitió generar clones productores de DTR soluble (Figura 1), en número de cinco. Estos clones, denominados 1D3, 1D6, 2C8, 5G5 y 1H3, comprenden secuencias nucleotídicas

5

10

15

20

25

30

35

que codifican las proteínas SEQ ID NO:2 a 6, respectivamente. Todos los clones eran solubles tras la purificación según el método descrito en el ejemplo 1. El clon 1D6, también denominado G1, que permitió obtener la mayor cantidad de DTR en forma soluble tras su expresión a 30°C, contenía las mutaciones: Y380K/Q387E/L390T.

El enfoque de modelización llevó a proponer dos mutaciones adicionales, no representadas en el banco R1: A395T y N399D. Cada una de estas dos mutaciones se introdujo en el clon 1D6 (o G1) para investigar un efecto de solubilidad aumentada, lo que ha sido correcto para la mutación A395T (Figura 2).

En total, la proteína DTR más soluble, denominada DTR1 (SEQ ID NO:7), contiene las mutaciones: Y380K/Q387E/L390T/A395T

Esto no excluye que otras mutaciones de DTR pudieran mejorar aún más su solubilidad y su producción en E. coli.

La actividad de unión de la proteína DTR1 a HB-EGF se evaluó según su capacidad para inhibir la intoxicación de células Vero por la toxina diftérica y, por tanto, la unión de la toxina a la pro-HB-EGF. Los resultados muestran que DTR1 inhibe la intoxicación de células Vero por la toxina diftérica de forma dependiente de la dosis (Figura 3). El efecto inhibidor de DTR1 se comparó con el de CRM197, del clon 1D6 y DTRwt solubilizado en sarcosilo al 0,5 %. Las Kd estimadas mediante regresión de Schild para las tres interacciones proporcionan los siguientes valores:

Tabla V: Afinidad por HB-EGF

proteína

Kd (pM)

DTR1

~ 49

Clon 1D6

~ 25

DTRwt (+ sarcosilo al 0,5 %)

~ 6500

CRM197

~ 3100

Los experimentos de Biacore en los que el HB-EGF se inmovilizó sobre la microplaca (chip) del aparato y DTR1 se inyectó en la fracción móvil para medir las constantes de asociación y disociación, permitieron confirmar la Kd estimada de CRM197 y mostrar una Kd muy superior para DTR1. Sin embargo, la lentitud de la disociación no permite una medición precisa de la constante de disociación de DTR1 en Biacore. En la continuación del estudio, la afinidad de los mutantes se estimó mediante citotoxicidad y regresión de Schild.

Ejemplo 3: Mejora de sitio de unión de la proteína DTR

La estructura de la toxina diftérica cuando interactúa con el HB-EGF (Louie et al., Mol. Cell., 1997, 1, 67-78) permite analizar la interfase entre las dos proteínas. Este análisis estructural, junto con experimentos in silico de modelización molecular, ha permitido seleccionar 10 mutaciones en el sitio de unión de DTR para aumentar la afinidad de la proteína por HB-EGF. Estas mutaciones estaban destinadas a aumentar la entalpía de la interacción favoreciendo la formación de enlaces de hidrógeno, puentes salinos y/o contactos de Van der Wals entre las dos proteínas. El efecto potencial de las mutaciones seleccionadas sobre la estructura de la proteína se indica en la Tabla VI.

Tabla VI: Notas del orden estructural sobre los restos seleccionados para aumentar la afinidad de la proteína

DTR y efecto es

perado de las mutaciones

Posiciones

Mutaciones Nota de orden estructural e interacciones potenciales

F389

En una hebra beta, en el límite de la reacción de interacción con HB-EGF, posición para cerca de una molécula de agua de la interfase estructurada y de HB-EGF H139

F389Y Donante o aceptor de enlace de hidrógeno para una molécula de agua de la interfase estructurada o HB-EGF H139

H391

En una hebra beta, en el límite de la reacción de interacción con HB-EGF, donante del enlace de hidrógeno para HB-EGF E141

H391K Enlace iónico con HB-EGF E141

G510

En una hebra beta, en el centro de la reacción de interacción con HB-EGF, al lado de una cavidad entre DTR y HB-EGF, frente al grupo CO de la cadena principal de HB-EGF C132

Posiciones

Mutaciones Nota de orden estructural e interacciones potenciales

G510A El cambio más conservativo para rellenar la cavidad y aumentar las interacciones de Van der Waals

G510M Cadena lateral hidrófoba flexible para rellenar la cavidad y aumentar las interacciones de Van der Waals

G510Q Donante de enlace de hidrógeno para el grupo CO de la cadena principal de HB-EGF C132 y/o aceptor de enlace de hidrógeno H para el grupo NH de la cadena principal HB-EGF C134.

G510S Cadena lateral pequeña aire para rellenar la cavidad y aumentar las interacciones de Van der Waals

T521

En un pseudocodo de tipo II, en el límite de la reacción de interacción con HB-EGF

T521R Donante de enlace de hidrógeno para el grupo CO de la cadena principal de HB-EGF K111 y/o el grupo CO de la cadena principal de HB-EGF K113

Q515

En una hebra beta, en el límite de la reacción de interacción con HB-EGF, donante de enlace de hidrógeno para el grupo CO de la cadena principal de HB-EGF L127

Q515E En una red de enlaces iónicos y de hidrógeno que involucran K522R, HB-EGF R128, el grupo CO de la cadena principal de HB-EGF R128, el grupo CO de la cadena principal de HB-EGF L127

K522

En una hebra beta, en el límite de la reacción de interacción con HB-EGF, donante de enlace de hidrógeno T517

K522R En una red de enlaces iónicos y de hidrógeno que involucran Q515E, HB-EGF R128, el grupo CO de la cadena principal de HB-EGF R128, el grupo CO de la cadena principal de HB-EGF L127

Las mutaciones se introdujeron en la proteína DTR1 mediante mutagénesis dirigida (Tabla VII).

Tabla VII: Mutaciones para mejorar la afinidad de unión de DTR al HB-EGF identificadas por modelización 5 ______________________________molecular y estudiadas experimentalmente____________________________

F389Y

G510Q

H391K

G510S

F389Y/ H391K

T521R

G510A

Q515E/K522R

G510M

F389Y/H391K/Q515E/K522R

Las proteínas se expresaron en E. coli. Se estudiaron para determinar su capacidad de inhibir la unión de la toxina diftérica a la pro-HB-EGF según el ensayo de citotoxicidad descrito en el ejemplo 1. La Figura 4A muestra la capacidad de cada mutante para inhibir o no la toxicidad de la toxina diftérica en células Vero. Los resultados muestran que 10 solamente los mutantes F389Y y G510A inhiben de forma importante la toxicidad de la toxina diftérica. La introducción de estas dos mutaciones en DTR1 conlleva un efecto acumulativo (Figura 4B).

El mutante más activo, que corresponde a la proteína DTR1 que contiene las mutaciones F389Y y G510A se denominó DTR3 (SEQ ID NO:8). Su afinidad de unión al HB-EGF se evaluó por la capacidad de dosis crecientes de DTR3 para 15 inhibir el efecto tóxico de dosis crecientes de toxina diftérica en células Vero como se describe en el ejemplo 2. La Kd estimada por regresión de Schild a partir de los datos de CE50 de las curvas de inhibición se presenta en la Tabla VIII.

Tabla VIII: Afinidad por HB-EGF

Proteína

Kd (pM)

DTR3

~ 9,5

Este valor sugiere que DTR3 es al menos 300 veces más afín que CRM197 para HB-EGF y 5 veces más afín que DTR1.

Ejemplo 4: Disminución de la inmunogenicidad de la proteína DTR por supresión de los principales epítopos 5 T CD4

La capacidad de 25 péptidos solapantes que abarcan la totalidad de la secuencia de DTRwt para activar los linfocitos T CD4 específicos se estudió mediante ELISPOT, en experimentos de inmunización in vitro a partir de linfocitos T CD4 y de células dendríticas purificadas de la sangre de 7 donantes sanos, de edades y fenotipos HLA-DRB1 diferentes.

10

Los resultados muestran que la respuesta inmunitaria contra la proteína DTRwt está dirigida principalmente contra cinco regiones epitópicas que abarcan el 60 % de la proteína y contra las cuales al menos el 71 % de los donantes han mostrado respuesta, es decir, 5 donantes en 7 estudiados (Tabla IX):

15 - la región L427-L441 (Péptido 9) contra la que se han detectado linfocitos T CD4 específicos para la totalidad de los

donantes estudiados con una amplitud elevada (51 líneas entre 230 líneas cribadas, es decir, un 22 %),

- las regiones H391-Q411 / S451-D465 / S475-N502 (Péptidos 3-4, 13 y 17-18-19 respectivamente) contra las que se han detectado, de una forma global, linfocitos T CD4 específicos para el 86 % de los donantes (es decir, 6 donantes/7) con una amplitud un poco más moderada que para la región anteriormente descrita (20 a 30 líneas de linfocitos T

20 CD4 específicos, es decir, 8,5 a 13 %), y

- la región S506-H520 (péptido 22) contra la que se han detectado linfocitos T CD4 específicos se detectaron en el 71 % de los donantes con una amplitud del 8 %.

Claims (14)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   1. Proteína recombinante, que comprende un dominio R aislado de la toxina diftérica que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad con los restos 380 a 535 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1, comprendiendo dicha secuencia la combinación de sustituciones siguiente:

   - Y380K y L390T,

   y estando desprovista dicha secuencia, en su extremo N o C, de dicho dominio R, de la secuencia del dominio C y del dominio T de la toxina diftérica y de la secuencia de una proteína o de un dominio de proteína capaz de mejorar la estabilidad o la purificación de dicho dominio R, y siendo dicha proteína recombinante un ligando inhibidor del HB- EGF.
2. 2. Proteína de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende al menos las sustituciones Y380K, Q387E y L390T.
3. 3. Proteína de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende además la sustitución A395T.
4. 4. Proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende también al menos una de las sustituciones F389Y y/o G510A.
5. 5. Proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende también al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en: N399K, V452T, T517E, v483Q, H492E, S494K, T436H y E497D.
6. 6. Proteína de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende las sustituciones N399K, V452T, T517E, V483Q, H492E y S494K.
7. 7. Proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende o consiste en una de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 a 5 y SEQ ID NO:7 a 9.
8. 8. Proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, marcada con un trazador detectable.
9. 9. Polinucleótido aislado que codifica una proteína recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. 10. Vector recombinante de clonación y/o de expresión que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 9.
11. 11. Célula modificada con un vector de acuerdo con la reivindicación 10.
12. 12. Composición farmacéutica, que comprende al menos una proteína recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o un vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 10, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
13. 13. Proteína recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 10, para su uso en el tratamiento de enfermedades asociadas a una activación de la ruta HB-EGF/EGFR seleccionadas entre el grupo constituido por: glomerulonefritis de rápida progresión, cánceres, vasoespasmo asociado a contusiones cerebrales, hipertrofia cardiaca, hiperplasia de las células de la musculatura lisa, hipertensión pulmonar, retinopatías diabéticas y restenosis arterial.
14. 14. Utilización de una proteína marcada de acuerdo con la reivindicación 8 para el diagnóstico in vitro de una enfermedad relacionada con una activación de la ruta del HB-EGF/EGFR seleccionada entre el grupo constituido por: glomerulonefritis de rápida progresión, cánceres, vasoespasmo asociado a contusiones cerebrales, hipertrofia cardiaca, hiperplasia de las células de la musculatura lisa, hipertensión pulmonar, retinopatías diabéticas y restenosis arterial.

    A

    O

    WT

    imagen1

    B

    20°C,20h

    Soluble Insoluble

    3Q°C, 4h

    Soluble Insoluble

    ----^-------- „---------------

    imagen2

    Figura 1

    I.L

    n

    crq

    QJ

    NJ

    ro

    i

    G1

    G1 A395T

    G1 N399D

    i- V'f--.

    G1

    G1 A395T

    1 1 ■

    G1 N399D

    Figura 3

    Incorporación de [14C]-Leu (%)

    imagen3

    >

    log (relación CES0 -1)

    03

    imagen4

    Figura 4

    ez

    imagen5

    imagen6

    100'

    imagen7

    w

    -8 -7

    9

    sin DTR8

    H

    DTR8 á 10'7 M

    i

    DTR8 á 3.10'8 M

    s 111

    DTR8á 10-8 M

    O c

    DTR8 á 3.10"9 M

    :o

    DTR8 á 10'9 M

    u JO <D i» dúo o

    imagen8

    log [DTR8] (M)

    Figura 5

    *

    imagen9

    •

    sin DTR8 *TJ E 100-

    ■

    DTR8 SxIO^M P

    A

    DTR81O^M X 80-

    *

    DTR8 3x10 r'M ■rt 60-

    O

    DTR8 10'SM "O 40-

    «

    DTR8 3x10 1 ’M '0

    o O 20-

    0

    O- 0-

    0

    imagen10

    ■12

    —r-

    -11

    -10 -9 -3

    log [HB-EGF] (M)

    • sinCRM197

    ■ CRM19710-7M

    i CRM1Q7 3.10 8M » CRMI9V1CH5M

    ♦ CRM1973.10-9M o CRM1871Q-3M

    n

    -7

    Figura 6

    CT>

    imagen11

    Figura 7