CN104892762A - 优化的Fc变体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含Fc区的亲本多肽的变体，该变体与该亲本多肽相比显示增加的与FcRn的结合，且在Fc区中包含至少一个氨基酸修饰。

Description

优化的Fc变体

本申请是发明人于2010年3月19日提交的题为“具优化的Fc变体”的中国专利申请201080017521.8号的分案申请。

技术领域

本发明涉及包含Fc区的亲本多肽的变体。该变体与亲本多肽相比显示增加的与FcRn的结合，且在它的Fc区中包含至少一个氨基酸修饰。

相关技术描述

单克隆抗体被用作治疗剂来治疗包括癌症、自身免疫病、慢性炎性疾病、移植排斥、传染病和心血管疾病的多种病症。目前，市场上存在超过二十种批准的单克隆抗体或单克隆抗体片段产品，且超过四百种处于临床开发中。尽管这种接受和前景，但仍存在优化抗体的结构特性和功能特性的显著需要。

单克隆抗体在治疗中的用途中的关键问题之一是它们在血液循环中的持久性。抗体清除的速度直接影响治疗的功效，并因此影响可以在患者中引起副作用且还增加治疗费用的药物施用的频率和量。

IgG是人类中最主要的免疫球蛋白种类，也最常用于治疗中。已通过与啮齿类动物中被动免疫从母亲至胎儿或新生儿的转移相关的研究阐明了IgG稳态的机制(Brambell,1966,Lancet；2(7473):1087-93；Rodewald,1976,J Cell Biol.；71(2):666-9；Jones等,1972,J Clin Invest.,51(11):2916-27)。在早期研究中，Brambell推测存在用于IgG母胎(maternofetal)传递的受体，且涉及IgG母胎转移和IgG分解代谢的机制可以相同，或者至少非常密切相关(Brambell,1966,Lancet；2(7473):1087-93)。

研究发现，极性细胞内和跨极性细胞的IgG转运由Fc区与称为新生儿Fc受体(FcRn)的高亲和力Fc受体的结合介导。FcRn是异二聚体，其包含与I类主要组织相容性复合体分子α-链的胞外域具有结构同源性的跨膜α-链，及由β₂-微球蛋白(β₂m)组成的可溶性轻链(Simister和Mostov,1989,Cold Spring Harb Symp Quant Biol.:54Pt 1:571-80)。在人类中，FcRn表达在胎盘细胞中；肠、肾和支气管上皮细胞中；内皮细胞中；及造血细胞(hematopoetic cell)，如小肠巨噬细胞、单核细胞和单核细胞衍生的树枝状细胞中(Zhu X等,2001,J Immunol.；166:3266-76)。FcRn以pH依赖性方式结合它的两种主要配体IgG和血清白蛋白，在pH 6.0-6.5下有效结合，而在pH 7.0-7.5下释放(Raghavan等,1995,Biochemistry.,34:14649-57)。

针对IgG免受分解代谢提出的机制是，IgG通过非特异性胞饮作用内化进入内皮细胞的内体，其中低pH促进与FcRn结合(Ghetie和Ward,1997,Nat.Biotechnol.,15:637-40)。结合的IgG-FcRn复合体再循环回到细胞表面，并在细胞外液的中性pH下解离，回到血液中的循环。未与FcRn结合的IgG转运进入溶酶体中，其中它们被蛋白酶降解。根据IgG存活的浓度依赖性分解代谢机制，在低血清IgG浓度下，受体将结合所有胞吞的IgG，并有效地使其回到循环，产生长的IgG半衰期。相反，在高IgG浓度下，受体被IgG饱和，IgG的主要级分未被受体结合，并转运降解，产生未结合的IgG的更快的分解代谢。

小鼠IgG的Fc区中的多种位点特异性诱变实验已导致涉及IgG和FcRn间相互作用的某些关键氨基酸残基的鉴定(Kim等,1994,Eur JImmunol.；24:2429-34；Kim等,1994,Eur J Immunol；24:542-8；Medesan等,1996,Eur J Immunol.；26:2533-6；Medesan等,1997,JImmunol.；158:2211-7)。这些研究和序列比较研究发现，位置253上的异亮氨酸、位置310上的组氨酸和位置435上的组氨酸(根据Kabat编号，Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))在人和啮齿类动物IgG中高度保守，暗示它们在IgG-FcRn结合中的重要性。这些残基定位在CH2-CH3结构域界面上，功能位点定位于这些残基符合与大鼠Fc复合的大鼠FcRn的X射线晶体结构(Burmeister等,1994,Nature；372(6504):379-83)。

Ghetie等(1997,Nat.Biotechnol；15:637-40)在小鼠IgG1 Fc-铰合部片段中随机诱变了位置252、位置254和位置256。与野生型相比，一个突变体对小鼠FcRn显示高3.5倍的亲和力和在两个小鼠品系中分别长约23％或65％的半衰期。

Kim等(1999,Eur J Immunol；29:2819-25)通过Fc区的位置253、位置310或位置435上的氨基酸取代诱变了人IgG1。他们发现，与野生型IgG1 Fc-铰合部片段相比，突变体Fc-铰合部片段在小鼠中具有减少的血清半衰期，并得出Ile253、His310和His435在调节IgG的血清半衰期中发挥中心作用的结论。

Hornick等(2000,J Nucl Med.,41:355-62)显示，嵌合人IgG1抗体Fc区中位置253上的单个氨基酸取代在小鼠中加快清除，并改善实体瘤的免疫闪烁显像(immunoscintigraphy)。

Shields等(2001,J Biol Chem；276:6591-604)用丙氨酸扫描诱变改变人IgG1抗体的Fc区中的残基，然后评估与人FcRn的结合。在改变为丙氨酸时有效废除与FcRn的结合的位置包含I253、S254、H435和Y436。在结合中显示较不显著的减少的其他位置如下：E233-G236、R255、K288、L309、S415和H433。几个氨基酸位置在改变为丙氨酸时显示FcRn结合的改善，这些位置尤其是P238、T256、E272、V305、T307、Q311、D312、K317、D376、E380、E382、S424和N434。许多其他氨基酸位置显示FcRn结合的轻微改善(D265、N286、V303、K360、Q362和A378)或无变化(S239、K246、K248、D249、M252、E258、T260、S267、H268、S269、D270、K274、N276、Y278、D280、V282、E283、H285、T289、K290、R292、E293、E294、Q295、Y296、N297、S298、R301、N315、E318、K320、K322、S324、K326、A327、P329、P331、E333、K334、T335、S337、K338、K340、Q342、R344、E345、Q345、Q347、R356、M358、T359、K360、N361、Y373、S375、S383、N384、Q386、E388、N389、N390、K392、L398、S400、D401、K414、R416、Q418、Q419、N421、V422、E430、T437、K439、S440、S442、S444和K447)。

针对具有改善的与FcRn的结合的组合变体发现了最显著的加和性。在pH 6.0下，与相对于天然IgG1与FcRn的结合，E380A好2倍和N434A好3.5倍相比，E380A/N434A变体相对于天然IgG1显示与FcRn的结合好超过8倍。向此加入T307A导致结合相对于天然IgG1改善12倍。

Dall'Acqua等(2002,J Immunol.；169:5171-80)描述了针对小鼠FcRn的人IgG1铰合部-Fc片段噬菌体展示文库的随机诱变和筛选。他们公开了位置251、252、254-256、308、309、311、312、314、385-387、389、428、433、434和436的随机诱变。IgG1-人FcRn复合体稳定性的主要改善存在于定位在横跨Fc-FcRn界面的带中的取代残基中(M252、S254、T256、H433、N434和Y436)，且以较小的程度存在于外周残基如V308、L309、Q311、G385、Q386、P387和N389的取代。通过组合M252Y/S254T/T256E和H433K/N434F/Y436H突变获得了对人FcRn具有最高亲和力的变体，且相对于野生型IgG1显示亲和力增加57倍。

Hinton等(2004,J Biol Chem.；279:6213-6)描述了两个突变T250Q和M428L，其分别使人IgG2与人FcRn的结合增加约3倍和7倍。组合时，这两个突变诱导IgG2的结合能力增加28倍。注射至猕猴进行药物代谢动力学研究时，两个IgG2突变体M428L和T250Q/M428L都显示比野生型抗体长约2倍的半衰期。

Dall’Acqua等(2006,J.Biol.Chem.；281:23514-24)描述了在位置252、254和256上突变其Fc区(M252Y/S254T/T256E)的人源化抗呼吸道合胞病毒IgG1。这些突变使pH 6.0下与人FcRn的结合增加约10倍，同时允许pH 7.4下的有效释放(Dall'Acqua等,2002,J Immunol.；169:5171-80)。与野生型IgG1相比，这种突变的人IgG1的体内行为显示在食蟹猴中的血清半衰期增加近4倍。

此外，多种出版物描述了用于获得通过以下改变其半衰期的生理活性分子的方法：通过将FcRn结合多肽引入分子中(WO 97/43316、美国专利号5,869,046、美国专利号5,747,035、WO 96/32478、WO 91/14438)；或通过使分子与保留FcRn结合亲和力但对其他Fc受体的亲和力大幅降低的抗体融合(WO 99/43713)；或与抗体的FcRn结合结构域融合(WO00/09560；美国专利号4,703,039)。

美国专利号6,165,745公开了通过将突变引入编码抗体的DNA区段中来产生具有减少的生物半衰期的抗体的方法。该突变包含Fc-铰合部结构域的位置253、310、311、433或434上的氨基酸取代。美国专利号6,165,745的全部公开内容，以及本文中引用的所有其他美国专利参考文献的全部公开内容在此引入作为参考。

PCT公开号WO 00/42072公开了包含具有改变的FcRn结合亲和力的变体Fc区的多肽，该多肽在Fc区的氨基酸位置238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439和447中的任一个或多个上包含氨基酸修饰，其中Fc区中残基的编号是EU索引(index)的编号(Kabat等,在以上引文中)。

PCT公开号WO 02/060919 A2公开了包含相对于野生型IgG恒定结构域含有一个或多个氨基酸修饰的IgG恒定结构域的修饰IgG，其中，与具有野生型IgG恒定结构域的IgG的半衰期相比，该修饰IgG具有增加的半衰期，且其中该一个或多个氨基酸修饰在位置251、253、255、285-290、308-314、385-389和428-435中的一个或多个上。

本领域中仍然存在对新的优化的Fc变体的需要。

发明概述

本发明提供具有优化特性的亲本多肽的变体。该优化特性包含比对应的亲本多肽高的与FcRn的结合特性。在优选实施方案中，该亲本多肽的变体包含Fc区，与该亲本多肽相比显示增加的与FcRn的结合，且与该亲本多肽相比在该亲本多肽的Fc区中包含至少一个氨基酸修饰，其中该修饰选自Fc区的226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264,265,267,269,270,276,284,285,288,289,290,291,292,294,297,298,299,301,302,303,305,307,308,309,311,315,317,320,322,325,327,330,332,334,335,338,340,342,343,345,347,350,352,354,355,356,359,360,361,362,369,370,371,375,378,380,382,383,384,385,386,387,389,390,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,403,404,408,411,412,414,415,416,418,419,420,421,422,424,426,428,

433、434、438、439、440、443、444、445、446和447，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号。

在另一实施方案中，本发明提供包含本发明的变体的药物组合物。

在另一实施方案中，本发明提供分离的编码本发明的变体的核酸。

在另一实施方案中，本发明提供包含上述核酸的载体。

在另一实施方案中，本发明提供包含上述载体的宿主细胞。

在另一实施方案中，本发明提供用于产生多肽变体的方法，该方法包括培养上述宿主细胞，使得核酸表达。

在另一实施方案中，本发明提供包含本发明的变体的药物。

在另一实施方案中，本发明提供本发明的变体在制备药物中的用途。

在另一实施方案中，本发明提供用于鉴定Fc优化变体的方法。

附图简述

图1显示噬菌粒载体pMG58，其中克隆入编码源自人IgG1重链的氨基酸残基226-447(Kabat中的EU索引)(Fc226，SEQ n^o1)的人Fc基因。

CVDE：VMA1衍生的内切核酸酶的C端部分；VMA：液泡ATP酶亚基(VMA)；CPIII：M13噬菌体的衣壳蛋白pIII(或p3)的C端部分。

图2显示用于固相中(2A)和溶液中(2B)的Fc变体选择的方法。FcRn-biot指生物素化FcRn，而FcRn-p3指FcRn-p3融合蛋白质。Fc-噬菌体是在它的衣壳上表达Fc变体的M13噬菌体。在固相选择中，用FcRn-p3融合蛋白质(Fc-Rn-p3)，或用neutravidin然后用FcRn-biot包被免疫平板(immunoplate)的孔。

图3显示对选择的Fc变体进行的噬菌体-ELISA测定的原理。Fc-噬菌体是在它的衣壳上表达Fc变体的M13噬菌体。FcRn-p3是包被在免疫平板的孔上的FcRn-p3融合蛋白质。抗-M13指用于进行ELISA检测的与辣根过氧化物酶(HRP)融合的小鼠抗-M13抗体。

图4显示直方图，其表示Fc IgG1的各氨基酸位置上包含修饰的突变体的百分比。X坐标：突变位置根据Kabat中的EU索引的氨基酸编号。Y坐标：包含突变位置的Fc变体的百分比。

图5a显示用于测量Fc变体对FcRn的结合亲和力的ELISA测定的原理。FcRn-p3是包被在免疫平板的孔上的FcRn-p3融合蛋白质。Fc是包含用于ELISA检测的V5标记的Fc变体。抗-V5是与HRP融合的抗-V5抗体。该抗体用于进行ELISA检测。

图5b显示通过按实施例1中的IV.1.a中所述进行的ELISA测定获得的野生型Fc(圆形)和Fc-H变体(正方形)的剂量效应曲线。X坐标：Fc多肽的浓度。Y坐标：与Fc多肽结合的FcRn的百分比。

图5c显示通过按实施例1的IV.1.a中所述进行的ELISA测定获得的野生型Fc(圆形)和S3A_07变体(正方形)的剂量效应曲线。X坐标：Fc多肽的浓度。Y坐标：与Fc多肽结合的FcRn的百分比。

图5d显示通过按实施例1的IV.1.a中所述进行的ELISA测定获得的野生型Fc(圆形)和S5A_41变体(正方形)的剂量效应曲线。X坐标：Fc多肽的浓度。Y坐标：与Fc多肽结合的FcRn的百分比。

图6显示涉及位置216-447(根据Kabat中的EU索引)的天然人IgG1序列与人IgG2(SEQ ID NO:14)、人IgG3(SEQ ID NO:15)和人IgG4(SEQ ID NO:16)的对应序列的比对。IgG1序列指G1m1,17同种异型(SEQ ID NO:12)和G1m3同种异型(SEQ ID NO:13)。IgG1的“下铰合部-CH2-CH3”结构域开始于位置216(见箭头)。

图7显示ELISA测定的结果，进行该ELISA测定来显示不同pH下Fc变体与FcRn的结合亲和力(详见实施例2，IV.2部分)。直方图表示各变体在pH＝6(黑条)、pH＝6.5(白条)或pH＝7.4(灰条)下进行ELISA测定所测量的OD_450nm的值。OD_450nm的值与结合Fc变体的固定化FcRn的量相关。

图8a显示提出用于表达具有本文中所述Fc变体的重组IgG1抗体的表达载体的示意图谱。产生的重组IgG1抗体具有针对CD20抗原的结合特异性。如图8a中所示，将编码具有本说明书中和实施例中所述突变的重链恒定区的核酸插在HKCD20-Opti-GA载体中存在的Apa1和AscI克隆位点之间。

图8b和8c分别显示IgG变体在非还原条件和还原条件下的SDS-PAGE。

(1)指包含野生型Fc的IgG；(2)指包含Fc-H变体的IgG；(3)指包含C6A_69变体的IgG；(4)指包含C6A_78变体的IgG；(5)指包含T5A_74变体的IgG；(6)指包含C6A_74变体的IgG；(7)指包含C6A_60变体的IgG；和(8)指包含C6A_66(的IgG)。

图9显示为了表征IgG变体与FcRn的结合而通过按实施例2的III.1中所述进行的ELISA测定获得的本发明的IgG变体(“1”)和野生型IgG(“2”)的剂量效应曲线。X坐标：IgG的浓度。Y坐标：与IgG结合的FcRn的百分比。

图10显示为了表征它们与FcγRIIIa的亲和力而通过ELISA测定针对本发明的IgG变体获得的剂量效应曲线。(1)指针对C6A_66变体获得的曲线；(2)指针对利妥昔单抗(Rituximab)获得的曲线；和(3)指针对C6A_69、C6A_78、T5A_74、C6A_74、C6A_60变体和野生型IgG获得的曲线。按实施例2的IV.1.a部分中所述进行ELISA测定。X坐标：IgG的浓度。Y坐标：与IgG结合的FcγRIIIa的百分比。

图11显示多种重组IgG与Jurkat FcRn的结合。图11显示按上文材料和方法部分中所述测定了Ritixan和本发明的多种变体与Jurkat FcRn的结合，并表示为平均荧光强度(MFI)值。

图12显示在用于本发明的de IgG变体的ADCC测定中获得的剂量效应曲线。(1)指C6A_66变体的曲线；(2)指利妥昔单抗的曲线；和(3)指LFB-R603、WT-IgG和本发明的IgG变体(即C6A_69、C6A_78、T5A_74、C6A_74、C6A_60变体)的曲线。X坐标：IgG的浓度。Y坐标：细胞裂解的百分比。

发明详述

为了本申请可以被更充分地理解，下文给出了几个定义。这类定义意在包含语法等同形式。

在本说明书和权利要求全文中，Fc区中残基的编号是根据在此明确引用作为参考的Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中的EU索引的免疫球蛋白重链编号。“Kabat中的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号。

本文中使用的“多肽”或“蛋白质”意指至少两个共价结合的氨基酸，其包含蛋白质、多肽、寡肽和肽。

本文中使用的“氨基酸”意指可以存在于具体的、确定的位置上的20种天然氨基酸或任意非天然类似物之一。

可以用三字母密码或用单字母密码缩写天然氨基酸：

氨基酸	三字母密码	单字母密码
			丙氨酸	ala	A
精氨酸	arg	R
			天冬酰胺	asn	N
天冬氨酸	asp	D
			天冬酰胺或天冬氨酸	asx	B
半胱氨酸	cys	C
			谷氨酸	glu	E
谷氨酰胺	gln	Q
			谷氨酰胺或谷氨酸	glx	Z
甘氨酸	gly	G
			组氨酸	his	H

氨基酸	三字母密码	单字母密码
			异亮氨酸	ile	I
亮氨酸	leu	L
			赖氨酸	lys	K
甲硫氨酸	met	M
			苯丙氨酸	phe	F
脯氨酸	pro	P
			丝氨酸	ser	S
苏氨酸	thr	T
			色氨酸	try	W
酪氨酸	tyr	Y
			缬氨酸	val	V

本文中使用的“位置”意指蛋白质的序列中的位置。对于Fc区，根据Kabat中的EU索引编号位置。

本文中的“氨基酸修饰”意指多肽的氨基酸序列中的改变。在本文中还可以称为“氨基酸改变”的“氨基酸修饰”包含多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。本文中的“氨基酸取代”或“取代”意指用另一氨基酸取代亲本多肽序列中特定位置上的氨基酸。例如，取代N434S指其中用丝氨酸取代位置434上的天冬酰胺的变体多肽(在此情况下为Fc变体)。本文中使用的“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列中的特定位置上添加氨基酸。例如，插入G>235-236指在位置235和236之间插入甘氨酸。本文中使用的“氨基酸缺失”或“缺失”意指在亲本多肽序列中的特定位置上去除氨基酸。例如，E294del指缺失位置294上的谷氨酸。

例如，优选使用以下修饰形式：434S或N434S，意指通过丝氨酸取代位置434中的亲本氨基酸，即天冬酰胺。

在取代的组合的情况下，优选的形式如下：259I/315D/434Y或V259I/N315D/N434Y。这意指变体中存在三个取代，一个在位置259中，一个在位置315中，一个在位置434中，且通过异亮氨酸取代亲本多肽的位置259中的氨基酸，即缬氨酸，通过天冬氨酸取代亲本多肽的位置315中的氨基酸，即天冬酰胺，通过酪氨酸取代亲本多肽的位置434中的氨基酸，即天冬酰胺。

本文中使用的“可变区”意指包含一个或多个Ig结构域的免疫球蛋白区域，该Ig结构域基本上由分别占据κ、λ和重链免疫球蛋白基因座的任意Vκ、Vλ和/或VH基因编码。可变区包含互补决定区(CDR)和构架区(FR)。

本文中使用的“Fc”或“Fc区”意指包含排除第一恒定区免疫球蛋白结构域的抗体恒定结构域的多肽。因此，Fc指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，及这些结构域N端的柔性铰合部。对于IgA和IgM，Fc可以包含J链。对于IgG，Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3(对于IgG，Cγ2和Cγ3分别是CH2和CH3结构域)及Cγ1和Cγ3之间的下铰链区。本文中将人IgG1重链Fc区定义为包含它的羧基端残基C226，其中该编号根据Kabat中的EU索引。在人IgG1的背景中，根据Kabat中的EU索引，下铰链区指位置226-236，CH2结构域指位置237-340，而CH3结构域指位置341-447。可以通过序列比对鉴定其他免疫球蛋白的对应的Fc区。

如下文所述，Fc可以指分离的此区域，或Fc多肽背景中的此区域。本文中使用的“Fc多肽”意指包含全部或部分Fc区的多肽。Fc多肽包括但不限于抗体、Fc融合、分离的Fc、Fc缀合物和Fc片段。

本文中以最广泛的含义使用术语“抗体”。“抗体”指至少包含(i)Fc区和(ii)源自免疫球蛋白可变区的结合多肽结构域的任意多肽。该结合多肽结构域能够特异性结合一种给定的靶抗原或一组靶抗原。源自免疫球蛋白可变区的结合多肽结构域包含一个或多个CDR。抗体包括但不限于全长免疫球蛋白、单克隆抗体、多特异性抗体、包含至少一个可变区的Fc融合蛋白质、合成抗体(有时在本文中称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、抗体融合蛋白质、抗体缀合物及各自的片段。

本文中使用的“全长抗体”或“免疫球蛋白”意指组成包含可变区和恒定区的抗体的天然生物形式的结构。“全长抗体”涵盖单克隆全长抗体、野生型全长抗体、嵌合全长抗体、人源化全长抗体，此列表并非限制性的。

在包括人类和小鼠的大多数哺乳动物中，全长抗体的结构一般是四聚体。该四聚体由两个相同的多肽链对组成，每对具有一条“轻”链(通常具有约25kDa的分子量)和一条“重”链(通常具有约50-70kDa的分子量)。在一些哺乳动物中，例如在骆驼和美洲驼(llamas)中，全长抗体可以仅由两条重链组成，每条重链包含与Fc区连接的可变结构域。

每条链的氨基端部分包含主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。在可变区中，重链和轻链的各V结构域聚集成三个环，形成抗原结合部位。每个环称为互补决定区(后文中称为“CDR”)，其中氨基酸序列中的变异最显著。

每条链的羧基端部分定义了主要负责效应子功能的恒定区。Kabat等收集了重链和轻链的可变区的许多一级序列。根据序列的保守程度，他们将各个一级序列分类入CDR和构架，并产生其列表(见Sequences ofImmunological Interest,第5版,NIH publication,No.91-3242,E.A.Kabat等，在此以其整体引入作为参考)。

在人免疫球蛋白的情况下，轻链分类为κ和λ轻链。重链分类为μ、δ、γ、α或ε，并分别定义了抗体的IgM、IgD、IgG、IgA和IgE同种型。IgG具有包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的几个亚类。IgM具有包括但不限于IgM1和IgM2的亚类。因此，本文中使用的“同种型”意指通过它们的恒定区的化学特征和抗原特征定义的任意免疫球蛋白亚类。已知的人免疫球蛋白同种型是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM1、IgM2、IgD和IgE。

本文中使用的“IgG”意指隶属于基本上由已知的免疫球蛋白γ基因编码的抗体种类的多肽。在人类中，IgG包含IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类或同种型。在小鼠中，IgG包含IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。全长IgG是四聚体，由两个相同的双免疫球蛋白链对组成，每对具有一条轻链和一条重链，每条轻链包含免疫球蛋白结构域VL和CL，每条重链包含免疫球蛋白结构域VH、Cγ1(也称CH1)、Cγ2(也称CH2)和Cγ3(也称CH3)。在人IgG1的背景中，根据Kabat中的EU索引，“CH1”指位置118-220，CH2结构域指位置237-340，而CH3结构域指位置341-447。IgG重链还包含铰合部结构域，在IgG1的情况下，铰合部结构域指位置221-236。

本文中使用的“亲本多肽”或“多肽亲本”意指随后修饰来产生变体的未修饰的多肽。该亲本多肽可以是天然存在的多肽、天然存在的多肽的变体、天然存在的多肽的改造形式或合成多肽。亲本多肽可以指多肽本身，或指编码它的氨基酸序列。在本发明的背景中，亲本多肽包含选自野生型Fc区、它们的片段和它们的突变体的Fc区。因此，与野生型Fc区相比，亲本多肽可以可选地在它的Fc区中包含预先存在的氨基酸修饰(即Fc突变体)。

有利地，亲本多肽是抗体、免疫球蛋白、Fc融合多肽、Fc缀合物，此列表并非限制性的。因此，本文中使用的“亲本免疫球蛋白”意指修饰其来产生变体免疫球蛋白的免疫球蛋白多肽，而本文中使用的“亲本抗体”意指修饰其来产生变体抗体的抗体。应注意，“亲本抗体”包括但不限于已知的市售的重组产生的抗体。

本文中使用的术语“至少一个”等同于“一个或多个”。

本文中使用的“变体多肽”、“多肽变体”或“变体”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本多肽序列的多肽序列。

变体可以指Fc变体、Fc多肽变体、蛋白质变体、抗体变体、免疫球蛋白变体、IgG变体，此列表并非限制性的。

本文中使用的“免疫球蛋白变体”或“变体免疫球蛋白”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本免疫球蛋白序列的免疫球蛋白序列。亲本多肽可以是天然存在的多肽或野生型(WT)多肽，或者可以是WT多肽的修饰形式。

目的亲本多肽是包含上文定义的Fc区的多肽。优选地，本发明的变体具有由于Fc区中的至少一个氨基酸修饰而不同于亲本多肽序列的多肽序列。因此，目的变体包含Fc变体。

因此，本文中使用的“Fc变体”或“变体Fc”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本Fc序列的Fc序列。Fc变体可以是分离的Fc区及其片段，或者可以存在于抗体、Fc融合及其片段的背景中，此列表并非限制性的。

本文中使用的“蛋白质变体”或“变体蛋白质”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同亲本蛋白质的蛋白质。本文中使用的“抗体变体”或“变体抗体”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本抗体的抗体。本文中使用的“IgG变体”或“变体IgG”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本IgG的抗体。优选地，变体与亲本多肽相比具有至少一个氨基酸修饰，例如从约1至约45个氨基酸修饰，优选从约1至约20个氨基酸修饰，且更优选从约1至约10个氨基酸修饰。

本文中的变体序列将优选与它的亲本多肽序列具有至少约80％同一性，且最优选至少约90％同一性。

如本文中所预期，与参考多肽具有至少约90％氨基酸同一性的测定的多肽与该参考序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％氨基酸同一性。

为了测定两个氨基酸序列的同一性百分比，以最佳比较为目的比对序列。例如，可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸序列之一或二者中引入缺口，且可以为了比较的目的而不考虑非同源序列。为了最佳比较的目的，可以按以下参数用CLUSTAL W(1.82版)达到两个氨基酸序列的同一性百分比：(1)CPU MODE＝ClustalW mp；(2)ALIGNMENT＝《全部》；(3)OUTPUT FORMAT＝《aln w/数目》；(4)OUTPUT ORDER＝《比对的》；(5)COLOR ALIGNMENT＝《否》；(6)KTUP(字长)＝《默认》；(7)WINDOW LENGTH＝《默认》；(8)SCORE TYPE＝《百分比》；(9)TOPDIAG＝《默认》；(10)PAIRGAP＝《默认》；(11)PHYLOGENETICTREE/TREE TYPE＝《无》；(12)MATRIX＝》默认》；(13)GAP OPEN＝《默认》；(14)END GAPS＝《默认》；(15)GAP EXTENSION＝《默认》；(16)GAP DISTANCES＝《默认》；(17)TREE TYPE＝《进化树》；(18)TREEGRAP DISTANCES＝《隐藏》。

本文中的“野生型或WT”意指包含等位基因变异的见于自然界中的氨基酸序列或核苷酸序列。WT蛋白质、多肽、抗体、免疫球蛋白、IgG等具有未经有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。

本文中使用的“FcRn”或“新生儿Fc受体”意指结合IgG抗体Fc区，且至少部分由FCRN基因编码的蛋白质。FcRn可以来自包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔和猴的任意生物。如本领域中已知，功能性FcRn蛋白质包含通常称为重链和轻链的两条多肽。轻链是β-2-微球蛋白，而重链由FCRN基因编码。除非本文中另有说明，FcRn或FcRn蛋白质指α-链与β-2-微球蛋白的复合体。在人类中，编码FcRn的基因称为FCGRT。

本文中使用的“增加的FcRn结合”意指本发明的变体与亲本多肽相比在体内或体外与FcRn的结合亲和力的增加。可以通过ELISA(实施例1的IV.1.a部分)或SPR技术(实施例1的IV.1.b部分)在体外评价多肽变体结合FcRn的能力。对FcRn具有增强的结合特性的变体最常在体内具有增强的血清滞留，并因此具有增加的半衰期。

为了在体内增加Fc区的滞留，对FcRn的结合亲和力的增加必须发生在约pH 6下，同时在约pH 7.4下保持较低的亲和力。

虽然仍处于检查下，但据信Fc区具有更长的体内半衰期，因为pH 6下与FcRn的结合允许螯合Fc区进入内体(Ghetie和Ward,1997ImmunolToday.18(12):592-598，在此以其整体引入作为参考)。然后内体区室再循环Fc区至细胞表面。一旦区室对胞外空间开放，较高的pH(几乎7.4)即诱导Fc区释放回到血液中。因此，将增加Fc区的体内半衰期的Fc区中的氨基酸修饰将理想地增加较低pH下的FcRn结合，同时仍允许较高pH下的Fc区释放。

本文中使用的术语“体内半衰期”指目的多肽在给定动物的循环中的生物半衰期，并表示为在动物中从循环和/或其他组织清除存在于该动物循环中的量的一半所需的时间。

本发明基于Fc区的氨基酸修饰的鉴定，该修饰增加Fc区对FcRn的结合亲和力。通过随机诱变产生两个Fc变体文库并测量该变体对FcRn的结合特性来测定了目的氨基酸修饰。

因此，本发明涉及包含Fc区的亲本多肽的变体，该变体与该亲本多肽相比显示增加的与FcRn的结合。

本发明的亲本多肽是包含Fc区的多肽。该多肽可以包含单条多肽链或非共价连接在一起的几条多肽链。亲本多肽包括但不限于抗体、Fc融合蛋白质、Fc缀合物、Fc衍生的多肽、分离的Fc及其片段。因此，该亲本多肽可以是天然存在的多肽、天然存在的多肽的变体、天然存在的多肽的改造形式、合成多肽或包含非蛋白质片段的多肽。天然存在的多肽的改造形式是并非由天然存在的基因编码的多肽。例如，改造的多肽可以是嵌合抗体或人源化抗体。

亲本多肽的Fc区优选选自IgG的野生型Fc区、其片段和突变体。在本文中，IgG的Fc区对应于“下铰合部”-CH2-CH3结构域(对于IgG，CH2和CH3也称为Cγ2和Cγ3结构域)。野生型人IgG1的“下铰合部”-CH2-CH3结构域的序列是SEQ ID NO:1的序列。在人IgG1的背景中，根据Kabat中的EU索引，下铰合部指位置226-236，CH2结构域指位置237-340，而CH3结构域指位置341-447。可以从该IgG亚类的重链或重链片段与人IgG1的重链或重链片段的氨基酸序列比对测定其他IgG亚类的类似结构域。

Fc区的片段定义为包含源自野生型Fc区，优选源自野生型IgG的“下铰合部-CH2-CH3”结构域的一个或多个多肽的多肽。根据实施例1的IV.1部分中所述的SPR测定，该片段对FcRn具有低于1μM的解离常数。

如上文所述，亲本多肽可以包含野生型Fc突变体，即已包含预先存在的氨基酸修饰，如添加、插入和/或取代的Fc区，只要该Fc突变体根据实施例1的IV.1.部分中所述的SPR测定对FcRn具有低于1μM的解离常数，且不是野生型Fc区。

本文中使用的“变体多肽”或“变体”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本多肽的序列的多肽序列。

本发明的变体多肽与对应的亲本多肽相比显示增加的与FcRn的结合。换言之，变体对FcRn的亲和力高于亲本多肽对FcRn的亲和力。这类变体是本发明的优化的变体。

可以通过现有技术的公知方法来评价该多肽对FcRn的亲和力。例如，本领域技术人员可以用本申请实施例1的IV.1.b.部分中所阐述的表面等离振子共振(SPR)实验来测定解离常数(Kd)。如果变体具有比它对应的亲本的Kd低1.1倍的Kd，则该变体是本发明的优化的变体。

作为备选，本领域技术人员可以进行适当的ELISA测定。如实施例1中所阐述，适当的ELISA测定使得能够比较变体和亲本与FcRn的结合强度。比较针对变体和亲本多肽检测到的特异性信号。如果变体的特异性信号比亲本多肽的特异性信号强至少1.2倍，更优选强至少3.2倍(即至少与具有双氨基酸修饰T250Q/M428L的Fc变体一样好)，则它是本发明的优化的变体。

适当的ELISA测定阐述于本申请的实施例1中。可以通过评价全长多肽(见实施例2的III部分)或通过评价其分离的Fc区(见实施例1的IV部分)来无差别地测定结合亲和力。

根据本发明，与亲本多肽相比，目的多肽变体在它的Fc区中包含至少一个氨基酸修饰。该氨基酸修饰选自氨基酸插入、缺失和取代。

申请人已显示，为了获得与它的亲本多肽相比具有增加的与FcRn的结合的多肽变体，与该亲本多肽相比，应在选自Fc区的226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264,265,267,269,270,276,284,285,288,289,290,291,292,294,297,298,299,301,302,303,305,307,308,309,311,315,317,320,322,325,327,330,332,334,335,338,340,342,343,345,347,350,352,354,355,356,359,360,361,362,369,370,371,375,378,380,382,383,384,385,386,387,389,390,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,403,404,408,411,412,414,415,416,418,419,420,421,422,424,426,428,433、434、438、439、440、443、444、445、446和447的氨基酸位置上引入该至少一个氨基酸修饰，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号。

在本文中，“Kabat中的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号。例如，可以从该Fc区与包含SEQ ID NO:1的多肽的人IgG1重链片段的氨基酸序列比对测定其他Fc区的类似位置。为了说明的目的，图6显示包含“下铰合部-CH2-CH3”结构域的人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4重链片段的序列比对。

本文中使用的“至少一个氨基酸修饰”意指“一个或多个修饰”。认为在Fc区中引入超过20个氨基酸修饰可以彻底损伤其生物学活性。因此，多肽变体优选在选自上文引用的列表的位置上具有1至20个，且更优选1至10个氨基酸修饰。本文中使用的“1至20个氨基酸修饰”包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20个氨基酸修饰。该多肽变体序列优选与它的亲本多肽序列具有至少约90％同一性。

如本文中所预期，与参考多肽具有至少约90％氨基酸的测定的多肽与该参考多肽具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％氨基酸同一性。

对FcRn显示最高结合亲和力的本发明的Fc变体一般包含一个以上氨基酸修饰。获自实施例II中所述噬菌体ELISA测定的结果显示，包含一个以上氨基酸修饰的优化的变体可以具有比野生型Fc强约3.2倍至30倍的特异性信号(见表2和表3)，而具有单点氨基酸修饰的变体(见表1)可以具有比野生型Fc强约1.2倍至3.5倍的信号。如表3中所示，优化的变体的信号可以比Fc-H的信号强约1倍至约10倍，Fc-H指具有双氨基酸修饰T250Q/M428L的Fc变体。

因此，在具体实施方案中，该变体与该亲本多肽相比包含选自Fc区的226、227、228、230、231、233、234、239,241,243,246,250,252,256,259,264,265,267,269,270,276,284,285,288,289,290,291,292,294,297,298,299,301,302,303,305,307,308,309,311,315,317,320,322,325,327,330,332,334,335,338,340,342,343,345,347,350,352,354,355,356,359,360,361,362,369,370,371,375,378,380,382,383,384,385,386,387,389,390,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,403,404,408,411,412,414,415,416,418,419,420,421,422,424,426,428,433,434,438,439,440,443,444,445,446和447的至少两个氨基酸修饰，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号。

如本申请表5中所述，对FcRn显示最高亲和力的Fc变体可以具有3至6个氨基酸修饰。

因此，在另一实施方案中，本发明的变体多肽与该亲本多肽相比可以在选自Fc区的226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264,265,267,269,270,276,284,285,288,289,290,291,292,294,297,298,299,301,302,303,305,307,308,309,311,315,317,320,322,325,327,330,332,334,335,338,340,342,343,345,347,350,352,354,355,356,359,360,361,362,369,370,371,375,378,380,382,383,384,385,386,387,389,390,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,403,404,408,411,412,414,415,416,418,419,420,421,422,424,426,428,433、434、438、439、440、443、444、445、446和447的氨基酸位置上包含3至6个氨基酸修饰，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号。

该氨基酸修饰优选选自缺失和取代。

以上列表的一些氨基酸位置(即226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421和434)是关键位置。换言之，对FcRn显示最高亲和力的Fc变体很可能在该氨基酸位置上包含至少一个氨基酸修饰。

在某些实施方案中，本发明的多肽变体与亲本多肽相比在选自Fc区的226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421和434的氨基酸位置上包含至少一个氨基酸修饰，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号。

在以上关键位置中，对FcRn显示最强结合的Fc变体的测序显示，氨基酸位置230、264、307、315、330、378和434是最常突变的位置。因此，在另一实施方案中，与亲本多肽相比，该至少一个修饰发生在选自Fc区的230、264、307、315、330、378和434，更优选选自Fc区的264、315、378和434的一个位置上，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号。

如上文所述，与Fc亲本相比，引入至少两个氨基酸修饰可以显著增强Fc变体对FcRn的结合亲和力。

因此，在备选实施方案中，多肽变体与亲本多肽相比包含至少两个氨基酸修饰，该至少两个氨基酸修饰包含：

(i)选自Fc区的226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421和434的氨基酸位置上的一个修饰；和

(ii)选自Fc区的226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259,264,265,267,269,270,276,284,285,288,289,290,291,292,294,297,298,299,301,302,303,305,307,308,309,311,315,317,320,322,325,327,330,332,334,335,338,340,342,343,345,347,350,352,354,355,356,359,360,361,362,369,370,371,375,378,380,382,383,384,385,386,387,389,390,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,403,404,408,411,412,414,415,416,418,419,420,421,422,424,426,428,433,434,438,439,440,443、444、445、446和447的氨基酸位置上的至少一个修饰；

其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号，只要修饰(i)不发生在与修饰(ii)相同的氨基酸位置上。

例如，根据该条件，如果氨基酸修饰(i)发生在位置434上，则该至少一个氨基酸修饰(ii)可以发生在(ii)中所引用的列表除位置434外的任意位置上。

在另一实施方案中，多肽变体包含至少两个氨基酸修饰，该至少两个氨基酸修饰包含：

(i)选自Fc区的264、315、378和434的氨基酸位置上的一个修饰；和

(ii)选自Fc区的226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259,264,265,267,269,270,276,284,285,288,289,290,291,292,2g4,2g7,298,299,301,302,303,305,307,308,309,311,315,317,320,322,325,327,330,332,334,335,338,340,342,343,345,347,350,352,354,355,356,359,360,361,362,369,370,371,375,378,380,382,383,384,385,386,387,389,390,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,403,404,408,411,412,414,415,416,418,419,420,421,422,424,426,428,433,434,438,439,440,443,444、445、446和447的氨基酸位置上的至少一个修饰；

其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号，只要修饰(i)不发生在与修饰(ii)相同的氨基酸位置上。

在另一实施方案中，该变体包含至少两个氨基酸修饰，该至少两个氨基酸修饰包含：

(i)选自Fc区的264、315、378和434的位置上的一个氨基酸修饰；和

(ii)选自Fc区的226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421和434的位置上的至少一个氨基酸修饰；

其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号，只要修饰(i)不发生在与修饰(ii)相同的氨基酸位置上。

在另一实施方案中，该变体包含至少两个氨基酸修饰，该至少两个氨基酸修饰包含：

(i)选自Fc区的378和434的位置上的一个氨基酸修饰；和

(ii)选自Fc区的226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421和434的位置上的至少一个氨基酸修饰；

其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号，只要修饰(i)不发生在与修饰(ii)相同的氨基酸位置上。

在备选实施方案中，多肽变体在它的Fc区中包含至少三个氨基酸修饰。因此，与亲本多肽相比，该至少三个氨基酸修饰可以包含：

(i)选自Fc区的226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421和434的两个氨基酸位置上的两个修饰；和

(ii)选自Fc区的226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259,264,265,267,269,270,276,284,285,288,289,290,291,292,294,297,298,299,301,302,303,305,307,308,309,311,315,317,320,322,325,327,330,332,334,335,338,340,342,343,345,347,350,352,354,355,356,359,360,361,362,369,370,371,375,378,380,382,383,384,385,386,387,389,390,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,403,404,408,411,412,414,415,416,418,419,420,421,422,424,426,428,433,434,438,439,440,443、444、445、446和447的氨基酸位置上的至少一个修饰；

其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号，只要修饰(i)不发生在与修饰(ii)相同的氨基酸位置上。

在备选实施方案中，多肽变体包含至少三个氨基酸修饰，该至少三个氨基酸修饰包含：

(i)选自Fc区的264、315、378和434的氨基酸位置上的一个修饰；

(ii)选自Fc区的226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421和434的氨基酸位置上的一个修饰；和

(iii)选自Fc区的227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259,264,265,267,269,270,276,284,285,288,289,290,291,292,294,297,298,299,301,302,303,305,307,308,309,311,315,317,320,322,325,327,330,332,334,335,338,340,342,343,345,347,350,352,354,355,356,359,360,361,362,369,370,371,375,378,380,382,383,384,385,386,387,389,390,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,403,404,408,411,412,414,415,416,418,419,420,421,422,424,426,428,433,434,438,439,440,443,444、445、446和447的氨基酸位置上的至少一个修饰；

其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号，只要修饰(i)、修饰(ii)和修饰(iii)不同时发生在相同的氨基酸位置上。

在其他实施方案中，多肽变体包含至少三个氨基酸修饰，该至少三个氨基酸修饰包含：

(i)选自Fc区的378和434的氨基酸位置上的一个修饰；

(ii)选自Fc区的226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421和434的氨基酸位置上的一个修饰；和

(iii)选自Fc区的227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259，264，265，267，269，270，276，284，285，288，289，290，291，292，294，297，298，299，301，302，303，305，307，308，309，311，315，317，320，322，325，327，330，332，334，335，338，340，342，343，345，347，350，352，354，355，356，359，360，361，362，369，370，371，375，378，380，382，383，384，385，386，387，389，390，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，403，404，408，411，412，414，415，416，418，419，420，421，422，424，426，428，433，434，438，439，440，443，444、445、446和447的氨基酸位置上的至少一个修饰；

其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号，只要修饰(i)、修饰(ii)和修饰(iii)不同时发生在相同的氨基酸位置上。

在所有之前引用的本发明的实施方案中，氨基酸修饰优选选自氨基酸取代和缺失。

本发明的另一目的涉及包含Fc区的亲本多肽的变体，该变体与该亲本多肽相比显示增加的与FcRn的结合，且与该亲本多肽相比在Fc区中包含选自Fc区的226G、226Y、227S、227L、228R、228L、230S、230T、230L，230A，230Q，231T，231V，233D，234R，239A，241L，241Y，241R，243L，246R，250A，252L，256N，259I，264A，264E，264M，265G，265N，267N，267R，269D，269G，270N，270E，276S，284L，285Y，288R，289I，290R，290E，291S，291Q，292W，294del，297D，298G，298N，299M，299A，299K，301C，302A，303A，303I，305A，307P，307A，307N，308I，309P，311R，315D，317R，320T，320E，322R，325S，327V，327T，330V，330T，332V，334E，334R，335A，338R，340E，342R，342E，342K，343S，345Q，345G，347R，350A，352S，354P，355Q，355G，356N，359A，360N，360R，361D，361S，362R，362E，369A，370R，371D，375A，375G，378V，378T，378S，380Q，382V，382G，383R，383N，384I，384T，385R，386R，386K，387S，387T，389T，389K，389R，390S，392E，392R，393N，394A，395A，395S，396S，396L，397A，397M，398P，399N，400P，401A，401G，403T，404L，408T，411A，412A，414R，415D，415N，416K，416G，418R，418K，418E，419H，420R，421T，421S，421D，422A，424L，426T，428L，433R，433P，434Y，434S，434H，438R，439R，440R，440N，443R，444F、444P、445S、446A、447E和447N的至少一个氨基酸修饰，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号。

在备选实施方案中，该多肽与亲本多肽相比包含选自Fc区的226G、227L、230S、230T、241L，243L，250A，256N，259I，264E，265G，267R，290E，294del，303A，305A，307P，307A，308I，315D，322R，325S，327V，330V，342R，347R，352S，361D，362R，362E，370R，378V，378T，382V，383N，386R，386K，387T，389T，389K，392R，395A，396L，397M，403T，404L、415N、416K、421T、426T、428L、433R、434Y、434S和439R的至少一个修饰，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号。

优选地，该变体与亲本多肽相比具有选自以上列表的1至20个，更优选1至10个氨基酸修饰。本文中使用的“1至20个修饰”意指1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20个修饰。

在一些实施方案中，该变体与亲本多肽相比包含选自Fc区的226G、226Y、227S、227L、228R、228L、230S，230T，230L，230A，230Q，231T，231V，233D，234R，239A，241L，241Y，241R，243L，246R，250A，252L，256N，259I，264A，264E，264M，265G，265N，267N，267R，269D，269G，270N，270E，276S，284L，285Y，288R，289I，290R，290E，291S，291Q，292W，294del，297D，298G，298N，299M，299A，299K，301C，302A，303A，303I，305A，307P，307A，307N，308I，309P，311R，315D，317R，320T，320E，322R，325S，327V，327T，330V，330T，332V，334E，334R，335A，338R，340E，342R，342E，342K，343S，345Q，345G，347R，350A，352S，354P，355Q，355G，356N，359A，360N，360R，361D，361S，362R，362E，369A，370R，371D，375A，375G，378V，378T，378S，380Q，382V，382G，383R，383N，384I，384T，385R，386R，386K，387S，387T，389T，389K，389R，390S，392E，392R，393N，394A，395A，395S，396S，396L，397A，397M，398P，399N，400P，401A，401G，403T，404L，408T，411A，412A，414R，415D，415N，416K，416G，418R，418K，418E，419H，420R，421T，421S，421D，422A，424L，426T，428L，433R，433P，434Y，434S，434H，438R，439R、440R、440N、443R、444F、444P、445S、446A、447E和447N的3至6个氨基酸修饰，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号。

在备选实施方案中，该多肽与亲本多肽相比包含选自Fc区的226G、227L、230S、230T、230L、231T、241L，243L，250A，256N，259I，264E，265G，267R，290E，294del，303A，305A，307P，307A，308I，315D，322R，325S，327V，330V，342R，347R，352S，361D，362R，362E，370R，378V，378T，382V，383N，386R，386K，387T，389T，389K，392R，395A，396L，397M，403T，404L、415N、416K、421T、426T、428L、433R、434Y、434S和439R的3至6个氨基酸修饰，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号。

以上列表的一些氨基酸修饰是关键修饰。换言之，对FcRn显示高结合亲和力的Fc变体很可能包含选自该关键修饰的至少一个氨基酸修饰。

因此，该多肽变体与该亲本多肽相比可以包含选自Fc区的226G、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、342R、362R、362E、378V、378T、382V、389T、389K、396L、397M、421T、434Y和434S的至少一个修饰，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号。

在另一实施方案中，该多肽变体与该亲本多肽相比包含选自Fc区的264E、315D、378V、378T、434Y和434S的至少一个氨基酸修饰，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号。

在另一实施方案中，该多肽变体与该亲本多肽相比包含选自Fc区的378V、378T、434Y和434S的至少一个氨基酸修饰，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号。

如上文所述，与亲本相比，引入至少两个氨基酸修饰可以显著增强Fc变体与FcRn的结合。该修饰中的至少一个可以选自关键修饰，即选自226G、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、342R、362R、362E、378V、378T、382V、389T、389K、396L、397M、421T、434Y和434S。

在备选实施方案中，该多肽变体与亲本多肽相比包含至少两个氨基酸修饰，该至少两个氨基酸修饰包含：

(i)选自Fc区的226G、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、342R、362R、362E、378V、378T、382V、389T、389K、396L、397M、421T、434Y和434S的一个修饰；和

(ii)选自Fc区的227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252,256,259,264,265,267,269,270,276,284,285,288,289,290,291,292,294,297,298,299,301,302,303,305,307,308,309,311,315,317,320,322,325,327,330,332,334,335,338,340,342,343,345,347,350,352,354,355,356,359,360,361,362,369,370,371,375,378,380,382,383,384,385,386,387,389,390,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,403,404,408,411,412,414,415,416,418,419,420,421,422,424,426,428,433,434,438,439,440、443、444、445、446和447的氨基酸位置上的至少一个氨基酸修饰；

其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号，只要修饰(i)不发生在与修饰(ii)相同的氨基酸位置上。

在另一实施方案中，该变体包含至少两个氨基酸修饰，该至少两个氨基酸修饰包含：

(i)选自Fc区的378V、378T、434Y和434S的一个氨基酸修饰；和

(ii)选自Fc区的226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421和434的氨基酸位置上的至少一个氨基酸修饰；

其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号，只要修饰(i)不发生在与修饰(ii)相同的氨基酸位置上。

在另一实施方案中，该变体包含至少两个氨基酸修饰，该至少两个修饰包含：

(i)选自Fc区的378V、378T、434Y和434S的一个氨基酸修饰；和

(ii)选自Fc区的226G、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、342R、362R、362E、378V、378T、382V、389T、389K、396L、397M、421T、434Y和434S，且更优选选自226G、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、362R、378V、378T、389T、389K、434Y和434S的至少一个氨基酸修饰；

其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号，只要修饰(i)不发生在与修饰(ii)相同的氨基酸位置上。

因此，本发明的另一目的涉及包含Fc区的亲本多肽的变体，该变体与该亲本多肽相比显示增加的与FcRn的结合，且在Fc区中包含至少一个氨基酸修饰组合。

该至少一个修饰组合选自：

Fc区的226G/330V，230L/264E，230L/378V，230S/315D，230S/434Y，230T/378V，241L/434S，250A/434Y，264E/378T，305A/315D，305A/330V，305A/434Y，307P/434Y，315D/389T，330V/382V，330V/389T，378V/421T，389K/434Y，389T/434Y，396L/434S，230T/264E，230T/315D，230T/434S，230T/434Y，241L/307P，264E/307P，264E/396L，315D/362R，315D/382V，362R/434Y，378V/434Y，382V/434Y，226G/315D，226G/434Y，241L/378V，307P/378V，241L/264E，378V/434S，264E/378V，264E/434S，315D/330V，330V/434Y和315D/434Y，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号。

该变体与亲本多肽相比可以进一步包含选自Fc区的226G、226Y、227S、227L、228R、228L、230S、230T、230L、230A、230Q、231T、231V，233D，234R，239A，241L，241Y，241R，243L，246R，250A，252L，256N，259I，264A，264E，264M，265G，265N，267N，267R，269D，269G，270N，270E，276S，284L，285Y，288R，289I，290R，290E，291S，291Q，292W，294del，297D，298G，298N，299M，299A，299K，301C，302A，303A，303I，305A，307P，307A，307N，308I，309P，311R，315D，317R，320T，320E，322R，325S，327V，327T，330V，330T，332V，334E，334R，335A，338R，340E，342R，342E，342K，343S，345Q，345G，347R，350A，352S，354P，355Q，355G，356N，359A，360N，360R，361D，361S，362R，362E，369A，370R，371D，375A，375G，378V，378T，378S，380Q，382V，382G，383R，383N，384I，384T，385R，386R，386K，387S，387T，389T，389K，389R，390S，392E，392R，393N，394A，395A，395S，396S，396L，397A，397M，398P，399N，400P，401A，401G，403T，404L，408T，411A，412A，414R，415D，415N，416K，416G，418R，418K，418E，419H，420R，421T，421S，421D，422A，424L，426T，428L，433R，433P，434Y，434S，434H，438R，439R，440R，440N，443R，444F，444P，445S，446A，447E和447N的至少一个修饰，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号。

在另一实施方案中，本发明的变体与亲本多肽相比包含：

(i)选自Fc区的226G/330V，230L/264E，230L/378V，230S/315D，230S/434Y，230T/378V，241L/434S，250A/434Y，264E/378T，305A/315D，305A/330V，305A/434Y，307P/434Y，315D/389T，330V/382V，330V/389T，378V/421T，389K/434Y，389T/434Y，396L/434S，230T/264E，230T/315D，230T/434S，230T/434Y，241L/307P，264E/307P，264E/396L，315D/362R，315D/382V，362R/434Y，378V/434Y，382V/434Y，226G/315D，226G/434Y，241L/378V，307P/378V，241L/264E，378V/434S，264E/378V，264E/434S，315D/330V，330V/434Y，and315D/434Y的至少一个氨基酸修饰组合；和

(ii)选自Fc区的226G，227L，228L，228R 230S，230T，230L，231T，241L，243L，250A，256N，259I，264E，265G，267R，290E，294del，303A，305A，307P，307A，308I，315D，322R，325S，327V，330V，342R，347R，352S，361D，362R，362E，370R，378V，378T，382V，383N，386R，386K，387T，389T，389K，392R，395A，396L，397M，403T，404L，

415N、416K、421T、426T、428L、433R、434Y、434S和439R的至少一个氨基酸修饰；

其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号，只要修饰(i)不发生在与修饰(ii)相同的氨基酸位置上。

在其他实施方案中，该变体包含选自Fc区的250A/434Y、307P/434Y、230T/434S、264E/396L、378V/434Y、378V/434S、264E/378V、264E/434S、315D/330V和315D/434Y的至少一个氨基酸修饰组合，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号。

该变体与亲本多肽相比可以进一步包含选自Fc区的226G、226Y、227S、227L、228R、228L、230S、230T、230L、230A、230Q、231T，231V，233D，234R，239A，241L，241Y，241R，243L，246R，250A，252L，256N，259I，264A，264E，264M，265G，265N，267N，267R，269D，269G，270N，270E，276S，284L，285Y，288R，289I，290R，290E，291S，291Q，292W，294del，297D，298G，298N，299M，299A，299K，301C，302A，303A，303I，305A，307P，307A，307N，308I，309P，311R，315D，317R，320T，320E，322R，325S，327V，327T，330V，330T，332V，334E，334R，335A，338R，340E，342R，342E，342K，343S，345Q，345G，347R，350A，352S，354P，355Q，355G，356N，359A，360N，360R，361D，361S，362R，362E，369A，370R，371D，375A，375G，378V，378T，378S，380Q，382V，382G，383R，383N，384I，384T，385R，386R，386K，387S，387T，389T，389K，389R，390S，392E，392R，393N，394A，395A，395S，396S，396L，397A，397M，398P，399N，400P，401A，401G，403T，404L，408T，411A，412A，414R，415D，415N，416K，416G，418R，418K，418E，419H，420R，421T，421S，421D，422A，424L，426T，428L，433R，433P，434Y，434S，434H，438R，439R，440R，440N，443R，444F，444P，445S、446A、447E和447N的至少一个氨基酸修饰，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号。

在另一实施方案中，本发明的变体与亲本多肽相比包含：

(i)选自Fc区的250A/434Y、307P/434Y、230T/434S、264E/396L、378V/434Y、378V/434S、264E/378V、264E/434S、315D/330V和315D/434Y的至少一个氨基酸修饰组合；和

(ii)选自Fc区的226G，227L，228L，228R，230S，230T，230L，231T，241L，243L，250A，256N，259I，264E，265G，267R，290E，294del，303A，305A，307P，307A，308I，315D，322R，325S，327V，330V，342R，347R，352S，361D，362R，362E，370R，378V，378T，382V，383N，386R，386K，387T，389T，389K，392R，395A，396L，397M，403T，404L，415N、416K、421T、426T、428L、433R、434Y、434S和439R的至少一个氨基酸修饰；

其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号，只要修饰(i)不发生在与修饰(ii)相同的氨基酸位置上。

在一些实施方案中，该变体包含选自Fc区的226G/315D/330V，226G/315D/434Y，226G/330V/434Y，230L/264E/378V，230T/264E/378V，230T/264E/434S，230S/315D/434Y，230T/315D/434Y，230T/389T/434S，241L/264E/434S，241L/264E/378V，241L/264E/307P，241L/307P/378V，250A/389K/434Y，256N/378V/434Y，259I/315D/434Y 264E/378T/396L，264E/378V/416K，294del/307P/434Y，264E/307P/378V，264E/396L/434S，264E/378V/434S，305A/315D/330V，305A/315D/434Y，305A/330V/434Y，307P/378V/434Y，315D/330V/382V，315D/330V/389T，315D/378V/434Y，315D/389T/434Y，315D/362R/434Y，315D/382V/434Y，315D/330V/434Y330V/382V/434Y、330V/389T/434Y和378V/383N/434Y的至少一个氨基酸修饰组合，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号。

该变体与亲本多肽相比可以包含选自Fc区的226G、226Y、227S、227L、228R、228L、230S、230T、230L、230A、230Q、231T，231V，233D，234R，239A，241L，241Y，241R，243L，246R，250A，252L，256N，259I，264A，264E，264M，265G，265N，267N，267R，269D，269G，270N，270E，276S，284L，285Y，288R，289I，290R，290E，291S，291Q，292W，294del，297D，298G，298N，299M，299A，299K，301C，302A，303A，303I，305A，307P，307A，307N，308I，309P，311R，315D，317R，320T，320E，322R，325S，327V，327T，330V，330T，332V，334E，334R，335A，338R，340E，342R，342E，342K，343S，345Q，345G，347R，350A，352S，354P，355Q，355G，356N，359A，360N，360R，361D，361S，362R，362E，369A，370R，371D，375A，375G，378V，378T，378S，380Q，382V，382G，383R，383N，384I，384T，385R，386R，386K，387S，387T，389T，389K，389R，390S，392E，392R，393N，394A，395A，395S，396S，396L，397A，397M，398P，399N，400P，401A，401G，403T，404L，408T，411A，412A，414R，415D，415N，416K，416G，418R，418K，418E，419H，420R，421T，421S，421D，422A，424L，426T，428L，433R，433P，434Y，434S，434H，438R，439R，440R，440N，443R，444F，444P，445S、446A、447E和447N的至少一个其他修饰，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号。

在另一实施方案中，本发明的变体与亲本多肽相比包含：

(i)选自Fc区的226G/315D/330V，226G/315D/434Y，226G/330V/434Y，230L/264E/378V，230T/264E/378V，230T/264E/434S，230S/315D/434Y，230T/315D/434Y，230T/389T/434S，241L/264E/434S，241L/264E/378V，241L/264E/307P，241L/307P/378V，250A/389K/434Y，256N/378V/434Y，259I/315D/434Y264E/378T/396L，264E/378V/416K，294del/307P/434Y，264E/307P/378V，264E/396L/434S，264E/378V/434S，305A/315D/330V，305A/315D/434Y，305A/330V/434Y，307P/378V/434Y，315D/330V/382V，315D/330V/389T，315D/389T/434Y，315D/362R/434Y，315D/378V/434Y，315D/382V/434Y，315D/330V/434Y 330V/382V/434Y、330V/389T/434Y和378V/383N/434Y的至少一个氨基酸修饰组合；和

(ii)选自Fc区的226G，227L，228L，228R，230S，230T，230L，231T，241L，243L，250A，256N，259I，264E，265G，267R，290E，294del，303A，305A，307P，307A，308I，315D，322R，325S，327V，330V，342R，347R，352S，361D，362R，362E，370R，378V，378T，382V，383N，386R，386K，387T，389T，389K，392R，395A，396L，397M，403T，404L，415N、416K、421T、426T、428L、433R、434Y、434S和439R的至少一个氨基酸修饰；

其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号，只更修饰(i)不发生在与修饰(ii)相同的氨基酸位置上。

在其他实施方案中，该变体包含选自Fc区的226G/315D/434Y，230S/315D/434Y，230T/315D/434Y，230T/264E/434S，230T/389T/434S，241L/264E/378V，241L/264E/434S，250A/389K/434Y，256N/378V/434Y，259I/315D/434Y，264E/378T/396L，264E/378V/416K，264E/378V/434S，264E/396L/434S，294del/307P/434Y，307P/378V/434Y，315D/330V/434Y，315D/378V/434Y，315D/382V/434Y和378V/383N/434Y的至少一个氨基酸修饰组合，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号。

该变体与亲本多肽相比可以进一步包含选自Fc区的226G、226Y、227S、227L、228R、228L、230S、230T、230L、230A，230Q，231T，231V，233D，234R，239A，241L，241Y，241R，243L，246R，250A，252L，256N，259I，264A，264E，264M，265G，265N，267N，267R，269D，269G，270N，270E，276S，284L，285Y，288R，289I，290R，290E，291S，291Q，292W，294del，297D，298G，298N，299M，299A，299K，301C，302A，303A，303I，305A，307P，307A，307N，308I，309P，311R，315D，317R，320T，320E，322R，325S，327V，327T，330V，330T，332V，334E，334R，335A，338R，340E，342R，342E，342K，343S，345Q，345G，347R，350A，352S，354P，355Q，355G，356N，359A，360N，360R，361D，361S，362R，362E，369A，370R，371D，375A，375G，378V，378T，378S，380Q，382V，382G，383R，383N，384I，384T，385R，386R，386K，387S，387T，389T，389K，389R，390S，392E，392R，393N，394A，395A，395S，396S，396L，397A，397M，398P，399N，400P，401A，401G，403T，404L，408T，411A，412A，414R，415D，415N，416K，416G，418R，418K，418E，419H，420R，421T，421S，421D，422A，424L，426T，428L，433R，433P，434Y，434S，434H，438R，439R，440R，440N，443R，444F，444P、445S、446A、447E和447N的至少一个其他修饰，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号。

在另一实施方案中，本发明的变体与亲本多肽相比包含：

(i)选自Fc区的226G/315D/434Y，230S/315D/434Y，230T/315D/434Y，230T/264E/434S，230T/389T/434S，241L/264E/378V，241L/264E/434S，250A/389K/434Y，256N/378V/434Y，259I/315D/434Y，264E/378T/396L，264E/378V/416K，264E/378V/434S，264E/396L/434S，294del/307P/434Y，307P/378V/434Y，315D/330V/434Y、315D/378V/434Y、315D/382V/434Y和378V/383N/434Y的至少一个氨基酸修饰组合；和

(ii)选自Fc区的226G，227L，228R，228L，230S，230T，230L，231T，241L，243L，250A，256N，259I，264E，265G，267R，290E，294del，303A，305A，307P，307A，308I，315D，322R，325S，327V，330V，342R，347R，352S，361D，362R，362E，370R，378V，378T，382V，383N，386R，386K，387T，389T，389K，392R，395A，396L，397M，403T，404L，415N、416K、421T、426T、428L、433R、434Y、434S和439R的至少一个氨基酸修饰；

其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号，只要修饰(i)不发生在与修饰(ii)相同的氨基酸位置上。

在所有之前引用的实施方案中，该变体与亲本多肽相比优选具有1至20个，更优选1至10个氨基酸修饰。

在备选实施方案中，该变体包含选自Fc的307A/315D/330V/382V/389T/434Y，307A/315D/382V/389T/434Y，256N/378V/383N/434Y，256N/378V/434Y，315D/330V/361D/378V/434Y，315D/361D/378V/434Y，259I/315D/434Y，230S/315D/428L/434Y，241L/264E/307P/378V/433R，250A/389K/434Y，305A/315D/330V/395A/434Y，264E/386R/396L/434S/439R，315D/330V/362R/434Y，294del/307P/434Y，305A/315D/330V/389K/434Y，315D/327V/330V/397M/434Y，230T/241L/264E/265G/378V/421T，264E/396L/415N/434S，227L/264E/378V/434S，264E/378T/396L，230T/315D/362R/426T/434Y，226G/315D/330V/434Y，230L/241L/243L/264E/307P/378V，250A/315D/325S/330V/434Y，290E/315D/342R/382V/434Y，241L/315D/330V/392R/434Y，241L/264E/307P/378V/434S，230T/264E/403T/434S，264E/378V/416K，230T/315D/362E/434Y，226G/315D/434Y，226G/315D/362R/434Y，226G/264E/347R/370R/378V/434S，308I/315D/330V/382V/434Y，230T/264E/378V/434S，231T/241L/264E/378T/397M/434S，230L/264E/378V/434S，230T/315D/330V/386K/434Y，226G/315D/330V/389T/434Y，267R/307P/378V/421T/434Y，230S/315D/387T/434Y，230S/264E/352S/378V/434S和230T/303A/322R/389T/404L/434S的一个氨基酸修饰组合，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号。在一些其他实施方案中，该变体包含选自256N/378V/434Y、307A/315D/330V/382V/389T/434Y、256N/378V/383N/434Y、315D/330V/361D/378V/434Y、259I/315D/434Y和230S/315D/428L/434Y的一个氨基酸修饰组合。

本发明的另一目的是提供多肽变体，该变体与它们的亲本多肽相比具有增加的对FcRn的结合，且包含选自307A/315D/330V/382V/389T/434Y、307A/315D/382V/389T/434Y 256N/378V/383N/434Y，315D/330V/361D/378V/434Y，315D/361D/378V/434Y 259I/315D/434Y，230S/315D/428L/434Y，241L/264E/307P/378V/433R，250A/389K/434Y，256N/378V/434Y，305A/315D/330V/395A/434Y，264E/386R/396L/434S/439R，315D/330V/362R/434Y，294del/307P/434Y，305A/315D/330V/389K/434Y，315D/327V/330V/397M/434Y，230T/241L/264E/265G/378V/421T，264E/396L/415N/434S，227L/264E/378V/434S，264E/378T/396L，230T/315D/362R/426T/434Y，226G/315D/330V/434Y，230L/241L/243L/264E/307P/378V，250A/315D/325S/330V/434Y，290E/315D/342R/382V/434Y，241L/315D/330V/392R/434Y，241L/264E/307P/378V/434S，230T/264E/403T/434S，264E/378V/416K，230T/315D/362E/434Y，226G/315D/434Y，226G/315D/362R/434Y，226G/264E/347R/370R/378V/434S，308I/315D/330V/382V/434Y，230T/264E/378V/434S，231T/241L/264E/378T/397M/434S，230L/264E/378V/434S，230T/315D/330V/386K/434Y，226G/315D/330V/389T/434Y，267R/307P/378V/421T/434Y，230S/315D/387T/434Y，230S/264E/352S/378V/434S和230T/303A/322R/389T/404L/434S的Fc变体，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号。在一些其他实施方案中，与它的亲本多肽相比具有增加的对FcRn的结合的多肽变体包含选自256N/378V/434Y、307A/315D/330V/382V/389T/434Y、256N/378V/383N/434Y、315D/330V/361D/378V/434Y、259I/315D/434Y和230S/315D/428L/434Y的Fc变体。

对于本发明的所有上述变体，它们的亲本多肽的Fc区可以源自野生型IgG的Fc区(例如“下铰合部-CH2-CH3”)及其片段。在更优选的实施方案中，亲本多肽的Fc区源自人IgG亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在另一优选实施方案中，亲本多肽的Fc区选自野生型IgG1 Fc区(SEQ ID：NO1)、野生型IgG2 Fc区(SEQ ID：NO2)、野生型IgG3 Fc区(SEQ ID：NO3)和野生型IgG4 Fc区(SEQ ID：NO4)。

在此背景中，本发明的另一目的是包含IgG1 Fc变体的多肽，其中该IgG1 Fc变体与IgG1 Fc的野生型序列(SEQ ID NO：1)相比包含至少一个氨基酸修饰，且与野生型IgG1 Fc相比显示增加的与FcRn的结合，只要该IgG1 Fc变体的序列不是SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4。

本发明的另一目的是包含IgG2 Fc变体的多肽，其中该IgG2 Fc变体与IgG2 Fc的野生型序列(SEQ ID NO:2)相比包含至少一个氨基酸修饰，且与野生型IgG2 Fc相比显示增加的与FcRn的结合，只要该IgG2 Fc变体的序列不是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

本发明的另一目的是包含IgG3 Fc变体的多肽，其中该IgG3 Fc变体与IgG3 Fc的野生型序列(SEQ ID NO:3)相比包含至少一个氨基酸修饰，且与野生型IgG3 Fc相比显示增加的与FcRn的结合，只要该IgG3 Fc变体的序列不是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4。

本发明的另一目的是包含IgG4 Fc变体的多肽，其中该IgG4 Fc变体与IgG4 Fc的野生型序列(SEQ ID NO:4)相比包含至少一个氨基酸修饰，且与野生型IgG4 Fc相比显示增加的与FcRn的结合，只要该IgG4 Fc变体的序列不是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:2。

在优选实施方案中，包含于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc变体多肽中的该至少一个氨基酸修饰选自本说明书上文在一般性定义包含Fc区且与对应的亲本多肽相比具有增加的与FcRn的结合的多肽变体时所描述的氨基酸修饰和氨基酸修饰组合。

如上文所述，本发明的变体与对应的亲本多肽相比显示增加的与FcRn的结合。在一个实施方案中，该变体的效应子功能和其他结合特性类似于对应的亲本。该变体与它的亲本多肽相比尤其可以显示与Fc-γ受体或C1q的结合无显著改变。

在另一实施方案中，该变体具有与一种或多种改变的效应子功能和/或与Fc配体(除FcRn外)的结合组合的增加的与FcRn的结合。

如实施例2中所阐述，本发明的变体与多肽变体相比可以具有与未改变的与FcγR尤其是与FcγRIIIa的结合、ADCC(依赖抗体的细胞毒性)活性和CDC(依赖补体的细胞毒性)活性组合的增加的与FcRn的结合。本发明的变体还可以具有与至少类似于它的多肽亲本的ADCC和CDC活性组合的增加的对FcRn的结合。在一些其他情况下，本发明的变体与它的多肽亲本相比可以具有与选自ADCC和CDC的至少一种降低的效应子活性组合的增加的与FcRn的结合。

可以通过现有技术的公知方法，如本说明书实施例2的IV.2和IV.3部分中所述的那些来评估ADCC和CDC活性。

可以通过常规方法，如SPR或ELISA测定来评估与FcγR的结合。

本发明的另一目的是提供可选地包含不同于之前引用的那些的其他氨基酸修饰的变体，只要产生的变体与亲本多肽相比具有增加的与FcRn的结合。

因此，本发明的Fc修饰可以与已知增加Fc对FcRn的亲和力的其他Fc修饰(见例如本申请用于描述相关技术的部分中所引用的参考文献)组合。

备选地，Fc修饰可以与包括但不限于改变效应子功能或改变一种或多种Fc配体的相互作用的其他Fc修饰组合。因此，这类变体与亲本多肽相比可以显示与改变的与一种Fc配体(除FcRn外)的结合或/和改变的效应子功能组合的增加的与FcRn的结合。

Fc配体包括但不限于FcγR(Fcγ受体)、C1q、C3、甘露聚糖结合性凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌A蛋白、葡萄球菌G蛋白和病毒FcγR。Fc配体还包含Fc受体同源物(FcRH)，Fc受体同源物是与FcγR同源的Fc受体的家族(Davis等,2002,Immunological Reviews 190:123-136)。

本文中使用的“效应子功能”意指由抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用引起的生化或细胞事件。效应子功能包括但不限于ADCC(依赖抗体的细胞毒性)、ADCP(依赖抗体的吞噬作用)和CDC(依赖补体的细胞毒性)。

本发明的变体包含含有Fc区且与它的亲本多肽相比显示增加的对FcRn的结合亲和力的任意多肽，只要该多肽由于Fc区中的至少一个氨基酸修饰或氨基酸修饰组合而不同于它的亲本多肽。目的修饰和氨基酸修饰组合是上文在给出本发明的变体的一般特征时所描述的那些。

变体(且因此亲本多肽)包括但不限于抗体、Fc融合蛋白质、Fc缀合物、分离的Fc及它们各自的片段。尤其是，变体可以是包含Fc的结合蛋白质。换言之，变体包含(i)Fc变体和(ii)能够特异性结合给定分子的结合多肽结构域。

在一个实施方案中，本发明的多肽变体选自Fc融合蛋白质变体和Fc缀合物变体。Fc融合蛋白质和Fc缀合物由与配偶体连接的Fc区组成。可以使用或不使用间隔区来将Fc区与它的配偶体连接。

根据本发明，Fc融合蛋白质是由单基因编码，且包含与Fc区连接的蛋白质、多肽或小肽的蛋白质。Fc融合蛋白质可选地包含肽间隔区。基本上可以使任意蛋白质或小分子与Fc区连接来产生Fc融合。蛋白质融合配偶体可以包括但不限于任意抗体的可变区、源自任意抗体的可变区的多肽、受体的靶结合区、黏附分子、配体、酶、细胞因子、趋化因子或某种其他蛋白质或蛋白质结构域。尤其是，Fc融合蛋白质可以是免疫黏附素，即将异源“黏附”蛋白质(即受体、配体或酶)的结合结构域与免疫球蛋白恒定结构域的片段(即Fc区)组合的抗体样蛋白质(见关于免疫黏附素的综述，Ashkenazi A,Chamow SM.1997,Curr OpinImmunol.；9(2):195-200)。

小肽融合配偶体可以包括但不限于将Fc融合定向至治疗靶点的任意治疗剂。这类靶点可以是任意分子，优选涉及疾病的胞外受体。

根据本发明，Fc缀合物产生自Fc区与缀合配偶体的化学偶联。缀合配偶体可以是蛋白质或非蛋白质。偶联反应一般使用Fc区上和缀合配偶体上的官能团。本领域中已知多种接头适合用于合成缀合物；例如，同双功能或异双功能接头是公知的(见Pierce Chemical Company目录,2005-2006,关于交联剂的技术部分，321-350页，其在此引入作为参考)。

适宜的缀合配偶体包括但不限于治疗性多肽、标记(标记的实例进一步见下文)、药物、细胞毒剂、毒害细胞的药物(例如化疗剂)、毒素和这类毒素的活性片段。适宜的毒素和它们对应的片段包括但不限于白喉A链、外毒素A链、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、酚霉素、伊诺霉素等。细胞毒剂可以是可以与Fc变体直接缀合或通过与Fc变体共价连接的螯合剂螯合的任意放射性核素。在其他实施方案中，缀合配偶体可以选自加利车霉素、auristatin、格尔德霉素、美登素及倍癌霉素(duocarmycin)和类似物(后者见U.S.200310050331，在此以其整体引入作为参考)。

这类目的变体可以在降低的pH下(例如在约pH 6下)具有增加的与FcRn的结合，在较高的pH下(例如在约pH 7.4下)具有基本未改变的结合。尤其有利的是与亲本多肽相比显示增加的体内半衰期的Fc融合蛋白质和Fc缀合物。

在优选实施方案中，本发明的多肽变体是亲本抗体的变体抗体。本文中以最广泛的含义使用术语“抗体”。根据本发明，“抗体”指至少包含(i)Fc区和(ii)源自免疫球蛋白可变结构域的结合多肽结构域的任意多肽。该结合多肽结构域能够特异性结合一种给定的靶抗原或一组靶抗原。源自免疫球蛋白可变区的结合多肽结构域包含至少一个或多个CDR。在本文中，抗体包括但不限于全长免疫球蛋白、单克隆抗体、多特异性抗体、包含至少一个可变区的Fc融合蛋白质、合成抗体(有时在本文中称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体。抗体还包含抗体融合蛋白质、抗体缀合物和各自的片段。因此，本发明的变体抗体在它的Fc区中包含上文引用的至少一个氨基修饰或修饰组合，与它的亲本抗体相比，该至少一个氨基酸修饰或修饰组合增加该变体抗体对FcRn的结合亲和力。尤其有利的是在降低的pH下(例如在约pH 6下)显示增加的与FcRn的结合亲和力，且在较高的pH下(例如在约pH 7.4下)具有基本上未改变的结合的抗体变体。此外，尤其有利的是与亲本多肽相比具有增加的体内半衰期的抗体变体。

在一个实施方案中，本发明的变体抗体选自亲本全长抗体的变体。本文中的“全长抗体”意指组成包含可变区和恒定区的抗体的天然生物学形式的结构。本发明的全长抗体变体的亲本多肽可以是野生型抗体、野生型抗体的突变体(例如包含预先存在的修饰)、野生型抗体的改造形式(例如嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体，进一步见下文)，此列表并非限制性的。除其中一些免疫球蛋白是二聚体的一些哺乳动物，如美洲驼和骆驼外，全长抗体的结构一般是四聚体。每个四聚体通常由两个相同的多肽链对组成，每对具有一条“轻”链(通常具有约25kDa的分子量)和一条“重”链(通常具有约50-70kDa的分子量)。

全长抗体的实例是包含IgM、IgD、IgG、IgA和IgE种类的人免疫球蛋白。

在优选实施方案中，该全长抗体变体选自IgG的变体。

在更优选的实施方案中，该全长抗体变体选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的变体，只要该变体的该Fc区序列不是SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

该IgG变体与它的亲本IgG相比包含一个或多个氨基酸修饰，该一个或多个修饰或氨基酸修饰组合是之前本说明书中在一般性定义包含Fc区，且与对应的亲本多肽相比具有增加的与FcRn的结合的多肽变体时所描述的那些。

在另一实施方案中，该抗体变体选自包含源自免疫球蛋白可变结构域的结合多肽结构域的Fc融合蛋白质。尤其有利的是包含以下的抗体：(a)本发明的Fc变体；和(b)以下源自免疫球蛋白可变区的结合多肽结构域(即包含至少一个CDR)之一：(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段，(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段，(iii)由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段，(iv)分离的CDR区，(v)包含两个连接的Fab片段的二价片段F(ab')2片段，(vi)单链Fv分子(scFv)，其中通过允许VH结构域和VL结构域结合形成抗原结合部位的肽接头连接这两个结构域，(vii)双特异性单链Fv，和(viii)通过基因融合构建的多价或多特异性片段“双抗体”或“三抗体”，此列表并非限制性的。

在另一实施方案中，该抗体是微抗体(minibody)。微抗体是包含与CH3结构域连接的scFv的最小化抗体样蛋白质(Hu等,1996,Cancer Res.56:3055-3061，在此以其整体引入作为参考)。在一些情况下，scFv可以与全长Fc区连接(De Lorenzo等,2005,Carcinogenesis 26:1890-1895，在此以其整体引入作为参考)，且还可以包含铰链区或其片段。

在一个实施方案中，本发明的抗体选自多特异性抗体，且尤其是选自有时称为“双抗体”的双特异性抗体。这些抗体与两个(或多个)不同的抗原结合。可以以本领域中已知的多种方式(Holliger和Winter,1993,Current Opinion Biotechnol.4:446-449，在此以其整体引入作为参考)制备双抗体，例如化学制备或从杂交瘤衍生。

在一些实施方案中，抗体变体的支架成分可以是来自不同物种的混合物。这种抗体变体可以是嵌合抗体和/或人源化抗体。一般而言，“嵌合抗体”和“人源化抗体”都指组合了来自一个以上物种的区域的抗体。例如，“嵌合抗体”通常包含来自非人动物(一般是小鼠(或者在一些情况下是大鼠))的可变区和来自人的恒定区。大多数情况下，人源化抗体是包含最少的源自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。一般而言，在人源化抗体中，除CDR外，整个抗体由人来源的多核苷酸编码或除它的CDR内之外与人抗体是同一的。将CDR(其中一些或全部由源于非人生物的核酸编码)移植入人抗体可变区的β-折叠构架中来产生抗体，该抗体的特异性由所移植的CDR决定。这类抗体的产生描述于例如WO 92/11018；Jones,1986,Nature 321:522-525；Verhoeyen等,1988,Science 239:1534-1536中，所有文献均在此以其整体引入作为参考。人源化抗体还将可选地包含至少部分免疫球蛋白恒定区，通常是人免疫球蛋白的恒定区，并因此通常将包含人Fc区。还可以用具有经遗传改造的免疫系统的小鼠产生人源化抗体(Roque等,2004,Biotechnol.Prog.20:639-654，在此以其整体引入作为参考)。用于人源化和重构非人抗体的多种技术和方法为本领域公知(见Tsurushita&Vasquez,2004,Humanization of Monoclonal Antibodies,MolecularBiology of B Cells,533-545,Elsevier Science(USA)及其中引用的参考文献，所有文献均在此以其整体引入作为参考)。人源化方法包括但不限于描述于Jones等,1986,Nature 321:522-525；Riechmann等,1988；Nature332:323-329；Verhoeyen等,1988,Science,239:1534-1536；Queen等,1989,Proc Natl Acad Sci,USA 86:10029-33；He等,1998,J.Immunol.160:1029-1035；Carter等,1992,Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9；Presta等,1997,Cancer Res.57(20):4593-9；Gorman等,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4181-4185；O'Connor等,1998,Protein Eng 11:321-8中的方法；所有文献均在此以其整体引入作为参考。人源化或降低非人抗体可变区的免疫原性的其他方法可以包括描述于例如Roguska等,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:969-973中的表面重建法，该文献在此以其整体引入作为参考。

在一个实施方案中，该抗体变体是具有本文中所述的至少一个氨基酸修饰的全人抗体。“全人抗体”或“完整的人抗体”指完整地包含源自人基因的序列的抗体。在一些情况下，这可以是具有本文中所述的修饰的具有源自人染色体的抗体基因序列的人抗体。备选地，抗体的成分可以是人的，但不是源自单基因。因此，例如，可以将来自一个抗体的人CDR与来自一个或多个人抗体的序列，如支架序列组合。例如，可以组合多种种系序列来形成人抗体或人支架(例如用于上文所述的人源化或嵌合序列中)，以及美国专利申请系列号11/022,289，在此以其整体引入作为参考。

在某些实施方案中，本发明的抗体变体选自嵌合IgG、人源化IgG和全人IgG。

抗体的共价修饰也包含在本发明的范围内，且一般但并非总是在翻译后进行。这类修饰包括但不限于糖基化、标记和缀合。

因此，在一些实施方案中，可以修饰本文中公开的多肽变体为包含一个或多个改造的糖形。本文中使用的“改造的糖形”意指与包含Fc变体的多肽共价连接的糖类组合物，其中该糖类组合物在化学上不同于多肽亲本的糖类组合物。改造的糖形可以用于多种目的，包括但不限于增强或减弱效应子功能。改造的糖形可以连接在变体序列的任意氨基酸上。在优选实施方案中，该糖形连接在Fc区的氨基酸上。

可以通过本领域中已知的多种方法(等,1999,Nat Biotechnol17:176-180；Davies等,2001,Biotechnol Bioeng 74:288-294；Shields等,2002,J Biol Chem 277:26733-26740；Shinkawa等,2003,J Biol Chem278:3466-3473；美国专利号6,602,684；美国系列号10/277,370；10/113,929；WO 00/61739A1；WO 01/29246A1；WO 02/31140A1；WO 02/30954A1；WO 01/77181；所有文献均以其整体引入作为参考；技术[Biowa,Inc.,Princeton,N.J.]；糖基化改造技术[GlycartBiotechnology AG,Zuerich,瑞士])产生改造的糖形。这些技术中的许多基于控制岩藻糖基化的水平和/或等分与Fc区共价连接的寡糖，例如通过在多种改造的生物或细胞系(例如Lec-13CHO细胞或大鼠杂交瘤YB2/0细胞)中表达抗体变体，或通过调节涉及糖基化途径的酶(例如FUT8[α1,6-岩藻糖基转移酶]和/或β1-4-N-乙酰葡糖胺基转移酶III[GnTIII])，或通过在表达抗体变体后修饰糖类。

备选地，改造的糖形可以指包含不同糖类或寡糖的抗体变体。如本领域中已知，糖基化模式可以依赖于蛋白质的序列(例如下文讨论的特定糖基化氨基酸残基的存在或缺乏)或在其中产生蛋白质的宿主细胞或生物二者。下文讨论具体的表达系统。

多肽的糖基化通常是N联糖基化或O联糖基化。N联糖基化指糖类部分与天冬酰胺残基侧链的连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸)是糖类部分与天冬酰胺侧链的酶促连接的识别序列。因此，这些三肽序列中的任一个在多肽中的存在产生潜在的糖基化位点。O联糖基化指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与羟基氨基酸(虽然也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸，但最常用的是丝氨酸或苏氨酸)的连接。

通过改变氨基酸序列，使得它包含一个或多个上述三肽序列(对于N联糖基化位点)来方便地实现向抗体添加糖基化位点。还可以通过向起始序列添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代起始序列(对于O联糖基化位点)来产生改变。为方便，优选通过DNA水平上的改变来改变抗体氨基酸序列，尤其是通过在预先选择的碱基上突变编码靶多肽的DNA，使得产生将翻译为希望的氨基酸的密码子。

在抗体上增加糖类部分的数目的另一手段是通过糖苷与蛋白质的化学或酶促偶联。这些方法是有利的，因为它们不需要在具有进行N联和O联糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生蛋白质。取决于所使用的偶联方式，糖类可以连接至(a)精氨酸和组氨酸；(b)自由羧基；(c)自由巯基，如半胱氨酸的那些；(d)自由羟基，如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些；(e)芳香残基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些；或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述于1987年9月11日公开的WO 87/05330中，及Aplin和Wriston,1981,CRC Crit.Rev.Biochem.,259-306页中。

可以通过化学或酶促方法实现起始抗体上存在的糖类部分的去除。化学去糖基化需要将蛋白质暴露于化合物三氟甲磺酸或等同的化合物。此处理导致除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)外的大部分或全部糖类的切割，同时保持多肽完整。Hakimuddin等,1987,Arch.Biochem.Biophys.259:52和Edge等,1981,Anal.Biochem.118:131描述了化学去糖基化。可以通过使用Thotakura等,1987,Meth.Enzymol.138:350所述的多种内切糖苷酶和外切糖苷酶来达到多肽上的糖类部分的酶促切割。可以通过使用Duskin等,1982,J.Biol.Chem.257:3105所述的化合物衣霉素来防止潜在的糖基化位点上的糖基化。衣霉素阻断蛋白质-N-糖苷键的形成。

在一些实施方案中，本发明的抗体变体选自包含改造的糖形的嵌合IgG、人源化IgG和全人IgG。

在备选实施方案中，本发明的抗体变体的共价修饰包含一个或多个标记的添加。在一些情况下，认为这些是抗体融合。术语“标记基团”意指任意可检测的标记。在一些实施方案中，通过多种长度的间隔区臂将标记基团偶联至抗体，以减小潜在的空间位阻。用于标记蛋白质的多种方法是本领域中已知的，且可以用于进行本发明。

一般而言，取决于将在其中检测它们的测定或诊断方法，标记分为多种种类：a)同位素标记，其可以是放射性同位素或重同位素；b)磁性标记(例如磁性颗粒)；c)氧化还原活性部分；d)荧光染料(optical dye)；酶基团(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)；e)生物素化基团；和f)由第二报道分子识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合部位、金属结合结构域、附加表位等)。

特异性标记包含荧光染料，其包括但不限于生色团、磷光体和荧光团，后者在许多情况下是特异性的。荧光团可以是荧光“小分子”或荧光蛋白质。

在另一实施方案中，本发明的抗体变体可以与并非用作上述标记基团的蛋白质或小分子融合或缀合。基本上可以将任意蛋白质或小分子与抗体连接。蛋白质融合配偶体可以包括但不限于受体的靶结合区、黏附分子、配体、酶、细胞因子、趋化因子或某种其他蛋白质或蛋白质结构域。小分子包括但不限于药物、细胞毒剂(例如化疗剂)、毒素或这类毒素的活性片段。

如上文所述，本发明的抗体变体能够特异性结合一种靶抗原或一组靶抗原。本文中使用的“靶抗原”意指由给定的抗体或免疫球蛋白的可变区特异性结合的分子。靶抗原可以是蛋白质、糖类、脂质或其他化学化合物。

适宜抗原的选择取决于所希望的应用。基本上可以靶向任意抗原，例如膜蛋白质，其包括但不限于RhD抗原、CD3、CD4、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD32B、CD33、CD38、CD40、CD44、CD52、CD71(转铁蛋白受体)、CD80、CD86、CTLA-4、CD147、CD160、CD224；生长因子受体，如隶属于ErbB受体家族的那些，ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4(EGFR、HER2/neu、HER3、HER4)、VEGF-R1、VEGF-R2、IGF-R1、PlGF-R；I类MHC和II类MHC分子，例如HLA-DR；白细胞介素受体，如IL-1R，IL-2Rα、IL-2Rβ和IL-2Rγ，IL-6R；激素受体，如Müllerian抑制物质II型受体、LDL受体、NKp44L；趋化因子受体，如CXCR4和CCR5；整联蛋白；黏附分子，如CD2、ICAM、EpCAM。膜蛋白质还包括肿瘤标记，如GD2、GD3、CA125、MUC-1、MUC-16、癌胚抗原(CEA)、Tn、糖蛋白72、PSMA、HMW-MAA。本发明的抗体还可以靶向可溶性蛋白质，其包括但不限于细胞因子(例如IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、IL-23、TGFβ、TNFα、IFNγ)；趋化因子；生长因子，如VEGF-A、EGF、PlGF、PDGF、IGF；激素；细菌毒素和其他来源的毒素，如肉毒杆菌毒素、蓖麻毒蛋白、炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)保护性抗原、炭疽芽孢杆菌致死因子、炭疽芽孢杆菌水肿因子、志贺菌毒素1和2；来自不同病毒，例如病原病毒的病毒抗原；抑制性抗体，包括FVIII抑制性抗体。

在优选实施方案中，本发明的变体可以靶向CD20。在这种情况下，亲本抗体可以选自EMAB6或EMAB603(见WO2006064121)、RITUXIMAB(IDEC/Genentech/Roche)(见例如美国专利号5,736,137，以其整体引入作为参考)、(描述于美国专利号5,500,362中，以其整体引入作为参考)、AME-133(Applied MolecularEvolution)、hA20(Immunomedics,Inc.)、HumaLYM(Intracel)和PRO70769(PCT/US2003/040426，标题为"Immunoglobulin Variants andUses Thereof"，以其整体引入作为参考)。

在另一实施方案中，本发明的变体可以靶向RhD抗原。在这种情况下，亲本抗体可以选自EMAB2(见FR 03 12 229)、Sym001(Symphogen A/S)或MonoRho(ZLB,Zurich)。

亲本多肽还可以是(抗VEGF)、(抗TNF-)、(抗EGFR)、(抗整联蛋白的α4链)、(抗HER2/neu)，此列表并非限制性的。

本申请还提供显示与另一优化特性组合的增加的与FcRn的结合的变体，该优化特性选自多种公知的治疗上相关的特性。可以优化的最优选的特性是体内半衰期。为了显示增加的体内半衰期，变体应在较低的pH，如与内体相关的pH，例如pH 6.0下显示增加的与FcRn的结合亲和力，同时在较高的pH，如7.4下保持降低的亲和力，以允许内体中增加的与FcRn的结合，但正常的释放速度(Dall’Acqua等,2002,J.Immunol.169:5171–5180；Gurbaxani等,2006,Mol Immunol.43(9):1462-73)。

类似地，具有这种受调节的FcRn结合的这些变体可以可选地具有其他希望的特性，如受调节的FcγR结合。在一个其他实施方案中，除FcRn结合特性外，优化变体为具有增强的对人活化FcγR，优选FcγRIIIa的亲和力。在备选实施方案中，优化变体为具有增加的对FcRn的亲和力和增加的或减少的对人FcγR的亲和力，该人FcγR包括但不限于FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc和FcγRIIIb(包括它们的等位基因变体)。在备选实施方案中，本发明的变体可以可选地具有增加(或减少)的效应子功能，以及增加的血清半衰期。在尤其优选的实施方案中，本发明的变体与它的多肽亲本相比可以具有增加的ADCC活性和/或增加的与FcγR的结合，以及增加的血清半衰期。在其他实施方案中，本发明的变体与它的多肽亲本相比可以进一步具有增加的CDC活性。

变体可以用于广范围的产品中。在一个实施方案中，变体可以是治疗剂、诊断剂或研究剂，优选治疗剂。

由于它们显示增加的与FcRn的结合，预期本发明的变体具有比它们的亲本多肽长的体内半衰期，更确切而言，具有比它们的亲本多肽长的体内血清半衰期。因此，这类变体在亲本多肽太快地从血液循环清除时作为亲本多肽的取代物具有有用的应用，或者用于治疗需要长半衰期的有效成分的慢性或长期疾病。

在变体选自抗体时，它们可以用于单克隆或多克隆的抗体组合物中。在优选实施方案中，用该抗体变体来杀死具有靶抗原的靶细胞，例如癌细胞。在备选实施方案中，用变体来阻断、拮抗或激动靶抗原，例如用于拮抗细胞因子或细胞因子受体，用于中和传染物质，如细菌或病毒或毒素，例如细菌毒素。在另一优选实施方案中，用变体来阻断、拮抗或激动靶抗原和杀死具有靶抗原的靶细胞。

在优选实施方案中，对患者施用变体抗体来治疗抗体相关障碍。为了本发明的目的，“患者”包括人类和其他动物，优选哺乳动物，且最优选人类。本文中的“抗体相关障碍”或“抗体反应性障碍”或“病症”或“疾病”意指可以通过施用包含本发明的变体的药物组合物来改善的障碍。抗体相关障碍包括但不限于自身免疫病、免疫性疾病、传染病、炎性疾病、神经性疾病、疼痛、肺部疾病、血液病症、纤维变性病症、包括癌症的癌性和瘤性疾病。本文中的“癌症”和“癌性的”指或描述哺乳动物中的生理病症，其通常表征为失调的细胞生长。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤(包括脂质肉瘤)、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、施万细胞瘤、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤和白血病及淋巴恶性肿瘤。可以治疗的其他病症包括但不限于类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、克罗恩病(Crohn's disease)、溃疡性结肠炎、Sjorgren's disease、多发性硬化、关节强硬性脊椎炎、哮喘、变态反应和变应原病症、移植物抗宿主疾病等。

本发明的另一目的是提供包含该变体的药物组合物。通过将具有希望的纯度的多肽变体与可选的生理上可用的可药用的载体、赋形剂或稳定剂混合，以冻干制剂或水溶液的形式制备该制剂。(Remington'sPharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑,1980，在此以其整体引入作为参考)。这类药物组合物预定用于治疗有需要的患者。

为了治疗有需要的患者，可以施用治疗有效剂量的变体。本文中的“治疗有效剂量”意指产生施用它所要达到的作用的剂量。确切的剂量将取决于治疗的目的，且将是本领域技术人员用已知的技术可确定的。剂量可以在0.001至100mg/kg体重或更大的范围内，例如0.1、1.0、10或50mg/kg体重，优选1至10mg/kg。如本领域中已知，针对蛋白质降解、全身对局部递送和新蛋白酶合成的速度，以及年龄、体重、一般健康、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和病症严重度的调整可以是必要的，且将是本领域技术人员用常规实验可确定的。

可以以多种方式进行包含变体的药物组合物的施用，其包括但不限于口服、皮下、静脉内、肠胃外、鼻内、intraortically、眼内、直肠、阴道、经皮、局部(例如凝胶、软膏、洗剂、霜剂等)、腹膜内、肌内、肺内。

本文中所述的治疗可以与其他治疗同时施用，即本文中所述的治疗可以与包括例如小分子、其他生物制品、放射疗法、手术等的其他疗法或治疗共同施用。

本发明的另一目的是提供编码本发明的变体的分离的核酸。通常，编码亲本多肽的DNA是可利用的或可以获得的。因此，由于现有技术中已知的多种方法，可以通过改变编码亲本多肽的DNA来产生编码目的变体的DNA。这些方法包括但不限于位点定向诱变、随机诱变、PCR诱变和盒诱变。优选通过位点定向诱变产生氨基酸取代(见例如Zoller和Smith,1982,Nucl.Acids Res.10:6487-6500；Kunkel,1985,Proc.Natl.Acad.SciUSA 82:488，在此以其整体引入作为参考)。

备选地或此外，可以确定希望的编码多肽变体的氨基酸序列，并因此可以通过现有技术的公知方法合成产生。

一旦获得它们的编码核酸，即可以通过本领域中已知的任意方法产生本发明的变体。在一个实施方案中，用变体序列(例如IgG变体序列)来产生编码成员序列，且然后可以根据需要克隆入宿主细胞、表达和测定的核酸。用公知的方法进行这些实施，且可以使用的多种方法描述于Molecular Cloning-A Laboratory Manual,第3版(Maniatis,Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York,2001)和Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley&Sons)中，二者都以其整体引入作为参考。为了表达蛋白质，可以将编码变体的核酸掺入表达载体中。表达载体通常包含与控制或调节序列、选择标记、任意融合配偶体和/或其他元件有效连接(即置于功能关系中)的蛋白质。可以通过在诱导或引起蛋白质表达的适当条件下培养用包含编码变体的核酸的核酸，优选表达载体转化的宿主细胞来产生本发明的变体(例如IgG变体)。可以使用多种适当的宿主细胞系，其包括但不限于哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞和酵母。例如，可以使用的多种哺乳动物细胞系描述于可从美国典型培养物保藏中心获得的ATCC细胞系目录中。宿主细胞可以是但不限于：YB2/0(YB2/3HL.P2.Gll.lGAg.20细胞，保藏于美国典型培养物保藏中心，ATCC号CRL-1662)；SP2/0；YE2/0；1R983F；Namalwa；PERC6；CHO细胞系，尤其是CHO-K-1、CHO-Lecl0、CHO-Lecl、CHO-Lecl3、CHO Pro-5、CHO dhfr-；Wil-2；Jurkat；Vero；Molt-4；COS-7；293-HEK；BHK；KGH6；NSO；SP2/0-Ag 14；P3X63Ag8.653；C127；JC；LA7；ZR-45-30；hTERT；NM2C5；UACC-812等。将外源核酸引入宿主细胞的方法为本领域公知，且将随所使用的宿主细胞而不同。在本发明的优选实施方案中，在YB2/0细胞中表达变体，且该变体是抗-CD20抗体或抗-RhD抗体。

此外，可以通过转基因非人动物或转基因植物产生本发明的变体。另外，可以通过将希望的基因直接注射入受精卵中来获得转基因非人动物(Gordon等,1980Proc Natl Acad Sci U S A.；77:7380-4)。转基因非人动物包括小鼠、兔、大鼠、山羊、母牛、牛或家禽等。可以通过将希望的基因引入胚胎干细胞中，并通过聚集嵌合体法或注射嵌合体法制备动物来获得具有希望的基因的转基因非人动物(Manipulating the Mouse Embryo,ALaboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)；Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press at OxfordUniversity Press(1993))。胚胎干细胞的实例包括小鼠(Evans和Kaufman,1981,Nature；292:154-156)、大鼠、山羊、兔、猴、家禽、牛等的胚胎干细胞。此外，还可以用克隆技术制备转基因非人动物，其中将引入了希望的基因的细胞核移植入去核卵中(Ryan等,1997Science；278:873-876；Cibelli等,1998Science,280:1256-1258)。可以通过以下方法产生多肽变体：将编码变体分子的DNA引入通过以上方法制备的动物中，从而在动物中形成和累积变体分子，然后从动物收集多肽变体。可以产生多肽变体，使其形成和累积在动物的乳、卵等中。

本发明的另一目的是提供用于鉴定Fc变体的方法，该Fc变体是优化的变体，即该变体与对应的野生型Fc区相比具有增加的对Fc配体的结合。该方法包括以下步骤：

(i)产生由编码Fc变体的一组核酸组成的核酸文库；

(ii)通过表达包含于该文库中的核酸产生Fc变体；

(iii)在步骤(ii)中产生的Fc变体中选择能够与Fc配体结合的那些；

(iv)测量步骤(iii)中选择的Fc变体和一个Fc对照对Fc配体的结合特性；

(v)选择与该Fc对照相比显示增加的对Fc配体的结合的Fc变体。

包含于该核酸文库中的核酸序列可以是RNA或DNA。在优选实施方案中，该文库包含编码Fc变体的核酸序列。

Fc对照选自野生型Fc区和已知的Fc变体，该变体具有等于或高于野生型Fc的对Fc配体的结合特性。

Fc配体可以选自FcRn和Fcγ受体，此列表并非限制性的。

在一个实施方案中，可以通过改变编码野生型Fc的DNA序列来产生编码Fc变体的文库的核酸。本文中使用的“改变核酸序列”意指在给定的核酸序列中引入诸如核苷酸的插入、缺失或取代的突变。可以通过现有技术的公知方法进行这类突变。这些方法包括但不限于随机诱变、位点定向诱变、PCR诱变和盒诱变。

在优选实施方案中，通过基于一种或多种低保真度DNA聚合酶的使用的随机诱变来产生文库。这种随机诱变描述于以其整体引入作为参考的PCT申请WO0238756中。因此，可以通过按本申请实施例的材料和方法部分中所述用单种聚合酶或指定的聚合酶组合产生的亚文库的混合来产生文库。

在另一实施方案中，通过用上述方法之一改变编码预优化的Fc变体库的DNA序列来产生该核酸文库。优选使用随机诱变。预优化的Fc变体是与野生型Fc相比包含至少一个氨基酸修饰并显示增加的对Fc配体的结合的Fc变体。预优化的Fc变体与野生型Fc相比优选具有1至4个氨基酸修饰。可以从通过野生型Fc的突变产生的文库的筛选获得这类预优化的Fc变体。它们还指现有技术中描述的Fc变体(例如见上文用于描述相关技术的本申请的第一部分)。预优化的Fc变体库包含几种多肽，更优选从约2种至约100种预优化的变体。

从预优化的变体产生的文库使得能够选择更优化的Fc变体。说明见本申请的表5，其显示从这种文库的筛选选择的最佳Fc变体的结合亲和力。

可以使用之前描述的宿主细胞，通过公知的方法进行步骤(ii)，即Fc变体的表达。在优选实施方案中，用标准方法(见Smith,Science,1985,228:1315)将Fc文库表达在噬菌体的表面(噬菌体展示)。

可以通过产生Fc变体-Fc配体复合体，然后从未结合的Fc变体分离结合的Fc变体来进行步骤(iii)。为了进行此分离步骤，Fc配体可以有利地固定在固相支持物上，或者应能够在步骤(iii)的过程中固定在固相支持物上。这类方法的实例描述于本申请的实施例1中。步骤(iii)优选包含几轮选择，其使得能够鉴定最有效的Fc配体(说明见实施例2)。

在步骤(iv)中，可以通过现有技术的公知方法评价Fc变体对Fc配体的结合特性。例如，本领域技术人员可以进行适当的ELISA。如果它的特异性信号比Fc亲本的特异性信号强至少1.2倍，则选择该变体。可以按本申请实施例II中和实施例IV中所述，对分离的Fc或对展示在噬菌体上的Fc进行适当的ELISA测定。

作为备选或为了确认的目的，本领域技术人员可以用本申请实施例IV中所阐述的表面等离振子共振(SPR)实验测定解离常数。如果变体具有比Fc亲本的解离常数低3倍的解离常数，则在步骤(v)中选择该变体。

通过以下实施例进一步阐述本发明，而不以任意方式限于以下实施例。

实施例

实施例1：

与Fc野生型相比具有增加的与FcRn的结合的Fc变体的鉴定及该变体的结合表征

I.材料和方法

I.1.人FcRn的表达和纯化

按之前所述(Popov等,Mol.Immunol.33:521-530(1996))通过GTP技术(Labège，法国)进行使用杆状病毒系统的可溶性人FcRn的表达。用TEV序列和6×多组氨酸标记标记编码前导序列和胞外域的α链cDNA(密码子1-290)。衍生的α-链和β2微球蛋白链分别在P10和polyhedrine启动子下克隆入pFastBacDual。通过按照厂家的流程用Biotin-XX Protein Labeling Kit,F2610(Molecular Probes)化学偶联来制备FcRn的生物素化形式(FcRn-biot)。还产生了包含β2微球蛋白链和与噬菌体p3蛋白质和CVDE蛋白质的氨基端部分融合的α-链的融合蛋白质(FcRn-p3)。IgG-琼脂糖和IMAC纯化步骤后获得超过90％纯的蛋白质。

I.2.Fc文库的构建

使用标准PCR流程，将编码源自人IgG1重链的氨基酸残基226-447(Kabat中的EU索引)，即Fc多肽(SEQ n^o1)的人Fc基因(Poul MA等,Eur.J.Immunol.25(7):2005-2009(1995))作为BamHI/EcoRI片段克隆入噬菌粒载体pMG58(pMG58_Fc226，图1)。该载体显示在图1中。用MUTAGEN^TM方法(WO0238756)产生了几个完全随机化文库，该方法用低保真度人DNA聚合酶(变位酶)在整个靶序列内均匀地引入随机突变。在不同条件中使用三种不同的变位酶(polβ、polη和polι)来产生互补的突变模式。按之前所述产生和纯化这些人聚合酶(Mondon等,Biotechnol J.2:76-82(2007)；Emond等Protein Eng.Des.Sel.21:267-274(2008))。

1.2-a.mutagen^TM法诱变

使用5’引物MG_6195’-AGTACTGACTCTACCTAGGATCCTGCCCACCGTGC-3’(SEQ IDN^o5)和3’引物MG_6215’-ACTGCTCGATGTCCGTACTATGCGGCCGCGAATTC-3’(SEQ IDN^o6)(BamHI和EcoRI限制位点下划线，斜体字母对应于非特异性尾)，用变位酶双复制人Fc基因(Fc基因)。95℃处理包含0.6μg pMG58_Fc226质粒作为模版(用于Mut1文库的野生型Fc或用于Mut2文库的Fc变体)、引物MG_619和MG_621(各250nM)及适当的复制缓冲液(下文详述)的混合物5分钟，并立即冷却至4℃，以变性DNA链。对于polβ，复制缓冲液是50mM Tris HCl pH 8.8、10mM MgCl₂、10mM KCl、1mM DTT和1％(v/v)甘油。对于polη(或polη和polι)，复制缓冲液是25mM TrisHCl pH 7.2、5mM MgCl₂、10mM KCl、1mM DTT和2.5％(v/v)甘油。变性步骤之后，通过添加50μM dATP/dCTP、100μM dTTP/dGTP和1μgpolβ或100μM dNTP和1μg polη(或polη和polι，每种变位酶1μg)来进行诱变复制。复制反应在37℃进行2小时。然后在microcon柱(Millipore)上脱盐和浓缩复制产物。

1.2.b.突变片段的选择性扩增和克隆

用tail引物通过选择性PCR扩增之前获得的复制产物。设计允许特异性扩增由变位酶合成的DNA片段的具有与模板不互补的尾的引物(MG_619和MG_621)。将一部分复制产物加至含有PCR缓冲液(20mMTris-HCl pH 8.4、50mM KCl)、1.5mM MgCl₂、10pmol 5’和3’引物、200μM dNTP和1.25U Platinum Taq DNA聚合酶(InvitroGen)的混合物。PCR循环如下，第一循环：94℃2分钟、64℃10秒、75℃30秒、94℃1分钟，然后30个选择性循环：94℃20秒和75℃30秒。

在1％(w/v)琼脂糖凝胶上纯化扩增的复制产物，用BamHI和EcoRI限制酶消化，并克隆入pMG58载体。将连接混合物转化入电转感受态(electrocompetent)大肠杆菌(E.coli)XL1-Blue细胞，随后涂布在补充了100μg/ml氨苄青霉素和1％(w/v)葡萄糖的固体2YT培养基(16g/l蛋白胨、10g/l酵母提取物、5g/l NaCl、15g/l琼脂)上。生长后，测定菌落的数目来估计文库的大小，并随机对每个文库的96个克隆进行PCR和高通量DNA测序。将细胞刮入含有15％甘油的2YT培养基中，-80℃冷冻和保存。

对于第一轮诱变和筛选(MS1)，构建了4个不同的文库。第一文库是对野生型Fc基因使用polβ获得的，且包含3.2×10⁶个克隆(称为Mut1.1)。分别使用polβ(3.8×10⁶个克隆，Mut1.2)及polη和ι(3.0×10⁶个克隆，Mut1.3)，用此第一文库的DNA来产生第二和第三文库。此两个累积复制步骤中的策略允许增加突变率。对野生型Fc基因单独使用聚合酶η产生了第四文库(1.0×10⁶个克隆，Mut1.4)。最后，按比例混合这四个文库来获得称为Mut1的最终文库，其代表1.1×10⁷个不同的克隆。

对于第二轮诱变和筛选(MS2)，用MS1期间分离且通过噬菌体-ELISA测定具有改善的FcRn结合的42个单突变体和双突变体的DNA库构建了两个不同的文库。用polβ获得第一文库(1.9×10⁷个克隆，Mut2.1)，用polη获得第二文库(1×10⁶个克隆，Mut2.2)。最后，按比例混合这两个文库来获得称为Mut2的最终文库，其代表2×10⁷个不同的克隆。

I.2.c.通过测序进行Fc文库的质量控制

通过对细胞进行PCR扩增Fc区基因(用5'引物5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'(SEQ ID NO:7)和3'引物5'-TCACGTGCAAAAGCAGCGGC-3'(SEQ ID NO:8))和高通量测序(用5'引物5'-TGATTACGCCAAGCTTGC-3'(SEQ ID NO:9))来评估之前产生的不同文库的质量。藉此测定了在各文库(Mut1.1至Mut1.4和Mut2.1至Mut2.2)中随机挑选的96个克隆的序列。最后，还在选择过程之前测序了混合文库Mut1的35个克隆和混合文库Mut2的86个克隆来控制最终文库的质量。

用针对Fc分子修改自之前描述的Mutanalyse 2.5软件(Mondon等,Biotechnol J.2:76-82(2007))的MilleGen特有(proprietary)软件Mutanalyse4Fc分析了突变序列的修饰。此分析确认，突变沿整个基因随机分布，无任何“热点”。

Mut1分析：Mut1文库的突变频率是每千碱基(kb)6.3个突变，即每个基因(666nt)4.2个突变。在这些突变中，81.4％是取代，16.8％是缺失，1.8％是添加，后两类在基因中引入移码。只考虑读框中的序列时，突变频率是每kb 4.0个突变，即每个基因2.7个突变(每个基因1至6个突变核苷酸)。还在蛋白质水平上进行了突变分析来测定文库的活性部分。最后，Mut1文库包含28.6％表达野生型片段(未突变或具有沉默突变)的克隆、40.0％含有处于读框外或具有终止密码子的序列(不表达)的克隆和31.4％具有突变序列(Fc变体)的克隆。最后的这些克隆代表文库的活性部分，其包含3.5×10⁶个不同克隆，平均每个分子2.3个突变氨基酸。

Mut2分析：Mut2文库的突变频率是每千碱基(kb)4.5个突变，即每个基因3.0个突变。在这些突变中，96.3％是取代，3.2％是缺失，0.5％是添加。只考虑读框中的序列时，突变频率是每kb 4.3个突变，即每个基因2.9个突变(每个基因1至7个突变核苷酸)。在蛋白质水平上，Mut2文库包含17.4％表达野生型片段(未突变或具有沉默突变)的克隆、9.3％含有处于读框外或具有终止密码子的序列(不表达)的克隆和73.3％具有突变序列(Fc变体)的克隆。最后的这些克隆代表文库的活性部分，其包含1.5×10⁷个不同克隆，平均每个分子1.9个突变氨基酸。

II.Fc文库的噬菌体展示表达和改善的FcRn结合剂的选择

用标准方法(Smith GP,Science 228:1315(1985))在M13噬菌体的表面表达Fc文库。将包含Mut1文库(pMG58载体)的大肠杆菌XL1-Blue菌于30℃下培养在60ml补充了100μg/ml氨苄青霉素、15μg/ml四环素和1％(w/v)葡萄糖的2YT中，直至达到OD_600nm＝0.6。然后用M13辅助噬菌体(M13KO7，Biolabs，比值细菌/噬菌体＝1/3)在37℃下感染细胞20分钟，并于26℃、230转/分钟下在含IPTG 0.5mM和卡那霉素30μg/ml的2YT/氨苄青霉素/葡萄糖中持续过夜产生噬菌体-Fc。次日，用标准方法用PEG6000沉淀噬菌体，重悬在1ml磷酸缓冲液pH 6(磷酸钠100mM、氯化钠50mM pH6.0，称为P6)中，并通过感染XL1-Blue细胞来滴定。用不同的条件应用了三种选择策略(图2)，且每种策略进行了3至8轮选择(见下文)。

II.1.固相上的选择(策略1和2)(见图2A)：

对于固相选择，在之前用0.5μg neutravidin和0.5μg生物素化FcRn(策略1)或0.5μg FcRn-p3(策略2)包被并用P6中的5％脱脂乳封闭的Maxisorp免疫平板的8个孔上孵育P6/5％脱脂乳/0.1％Tween 20中的4×10¹¹个噬菌体。37℃孵育2小时后，用P6/0.1％Tween 20洗涤孔20次，并通过在100μl/孔磷酸缓冲液pH 7.4(磷酸钠100mM、氯化钠50mMpH7.4)中37℃孵育2小时来洗脱。滴定后，用洗脱的噬菌体再感染10ml指数生长的XL1-Blue菌，随后涂布在固体2YT培养基/氨苄青霉素/葡萄糖上。次日，将细胞刮入含有15％甘油的2YT培养基中，-80℃冷冻和保存，直至下一轮选择。

II.2.液相中的选择(策略3)(见图2B)：

对于液相选择，首先使4×10¹¹个噬菌体与1ml P6/5％脱脂乳/0.1％Tween 20中的250nM或100nM生物素化FcRn在低速搅拌下室温孵育1小时。然后在室温下将之前用P6中的5％脱脂乳封闭的链酶抗生物素蛋白包被磁珠(Dynal)加至噬菌体30分钟。使用磁体(磁性颗粒浓缩器，Dynal)，用P6/0.1％Tween 20洗涤噬菌体-磁珠复合体15次。通过在500μl磷酸缓冲液pH 7.4(磷酸钠100mM、氯化钠50mM，pH7.4)中室温孵育2小时来洗脱噬菌体。用磁体去除磁珠，并收集上清中洗脱的噬菌体。滴定后，用洗脱的噬菌体再感染10ml指数生长的XL1-Blue菌，随后涂布在固体2YT培养基/氨苄青霉素/葡萄糖上。次日，将细胞刮入含有15％甘油的2YT培养基中，-80℃冷冻和保存，直至下一轮选择。

II.3.序列分析

在筛选过程(MS1和MS2)中，对于每种策略，从第3轮至第8轮，对细胞进行PCR(如I.2-c.中所述)后测序48至96个克隆。用内部开发用于快速分析所选择的Fc变体的MilleGen特有软件AnalyseFc进行了序列分析。根据分离它们的选择轮次命名Fc变体(对于Mut1筛选：策略1为B3A至B6A，策略2为S3A至S6A，策略3为L3A/B至L6A-F；对于Mut2筛选：策略1为C3A至C8A，策略2为T3A至T8A，策略3为M3A/B)。数字(1至96)指在用于测序的PCR板上的定位。最后，在整个筛选过程中，针对Mut1分离了227个不同的突变克隆，针对Mut2分离了223个不同的突变克隆。用噬菌体-ELISA测定表征了所有这些克隆。

II.4.定向诱变

MS1期间分离的改善的Fc变体的序列分析显示，许多克隆包含相似的突变(N434Y、N434S、P230S、P230T…)。为了揭示相关突变的作用，进行了定向诱变来去除这些突变。基于亲本克隆命名这些新的突变体，在名称末尾加上A或B。测试了61个新突变体。这些突变体中的一些显示在表1中。认为是阳性的克隆在噬菌体ELISA测定中具有比Fc-WT的特异性信号高1.2至2.6倍的特异性信号(见下文)。MS2之后，通过在铰链区中添加一个或两个突变(P230S或P228L或P228R或P228L/P230S或P228R/P230S)，通过定向诱变构建了几个新突变体。基于亲本克隆命名这些突变体，在名称末尾加上字母(A至G)。测试了24个新突变体并显示在表5中。

II.5.所选择的变体的噬菌体-ELISA测定(图3)

用FcRn-p3包被在孔上，于pH 6下的ELISA测试测定了MS1和MS2期间分离的展示在噬菌体上的变体的结合特征(图3)。简言之，在用辅助噬菌体M13K07感染(按第3段中所述)的2YT/氨苄青霉素/葡萄糖中的800μl培养物中产生噬菌体-Fc变体为96孔板上的分离的克隆。3000g离心30分钟后，将26℃下过夜产生的噬菌体回收在上清中。将这些上清直接稀释(1/2和1/4)在P6/5％脱脂乳/0.1％Tween 20中，并在用0.25μgFcRn-p3/孔包被并用P6中的5％脱脂乳封闭之后，在Maxisorp免疫平板上测试。37℃孵育2小时后，用P6/0.1％Tween-20洗涤孔3次，并用HRP抗-M13抗体(GE Healthcare)检测结合的噬菌体。

使用此ELISA测试，与野生型Fc(Fc-WT)和阳性对照比较测试了MS1期间选择的227个Fc变体。此阳性对照(称为Fc-H变体)是双突变体T250Q/M428L，且被描述为对FcRn具有改善的亲和力(×28，HintonPR等,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216(2004))。使用包含突变密码子和限制位点的两个长寡核苷酸：5'引物CGGGATCCTGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACCAACTCATGATCTCCCGGAC-3′(SEQIDNO：10)和3'引物5′-GCGAATTCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGCGTGTAGTGGTTGTGCAGAGCCTCATGCAGCACGGAGCATGAGAAG-3′(SEQIDNO：11)(BamHI和EcoRI限制位点下划线，灰色字母对应于突变密码子)，通过标准PCR流程产生此变体。在噬菌体-ELISA测定中，Fc-H变体具有平均比野生型Fc，即Fc-WT强3.2倍的特异性信号(比值变体/Fc-WT)，且在所测试的227个Fc变体中，73个变体具有比值/Fc-WT>3.2，即它们具有比Fc-H变体好的与FcRn的结合(表2)。来自MS1且具有单点氨基酸修饰的阳性变体具有比野生型Fc强约1.2倍至3.5倍的特异性信号(见表1)。

表1：MS1期间鉴定或通过定向诱变获得的具有单个氨基酸修饰的变体

表2：MS1期间选择的变体

使用相同的ELISA流程，但与Fc-H变体和MS1期间分离的最佳Fc变体(S5A_41)比较，测试了MS2期间选择的223个变体，因为Fc-WT信号和Fc变体信号间的差异太大而不能在同一ELISA平板上比较。在所测试的223个Fc变体中，209个Fc变体比Fc-H好(比值/Fc-H>1.1)，39个Fc变体比MS1期间分离的最佳Fc变体好。为了比较变体和Fc-WT，通过用变体的比值/Fc-H乘以MS1期间测定的Fc-H的比值/Fc-WT(＝3.2)计算了估计的比值/Fc-WT(比值/Fc-WT＝3.2×比值/Fc-H)(表3)。

表3：MS2的变体

总体上，在MS1和MS2过程中分离了对FcRn具有比Fc-H好的结合的282个Fc变体。这282个Fc变体的序列分析揭示，它们在全部分子中在115个不同位置上包含突变(表4)。

表4：MS1和MS2变体的突变

此外，16个位置优选地突变，被认为是关键位置：C226、P230、F241、V264、T307、N315、A330、Q342、Q362、A378、E382、N389、P396、V397、N421和N434。尤其是，4个位置更优选地突变，被认为是最优选的关键位置：V264、N315、A378和N434(图4)。

与MS1的最佳变体(S5A_41)相比对FcRn具有更好的结合的Fc变体显示于表5中。

表5：MS2的最佳变体

III.Fc变体的大肠杆菌表达

用BamHI和EcoRI限制位点将Fc-WT序列以及Fc-H变体和MS1和MS2期间分离的Fc变体从pMG58噬菌粒载体亚克隆入pMG62载体，允许与用于纯化的C端6×His标记和用于ELISA测定中检测的V5标记可溶性周质表达。在HB2151大肠杆菌菌株中进行重组Fc多肽的产生(用0.5mM IPTG 20℃诱导16小时)。用标准流程在Ni-NTA上进行纯化，获得了约200-500μg的各多肽。

IV.使用ELISA和表面等离振子共振(SPR)的Fc变体的FcRn结合表征

IV.1.与Fc_WT比较的S5A_41、S3A_07和Fc-H变体的FcRn结合表征

IV.1.a.ELISA测定

使用FcRn-p3包被在孔上的pH 6.0下的ELISA测试，与Fc-WT比较，测定了以可溶性形式产生的Fc变体的结合特征。在之前用0.25μgFcRn-p3/孔包被并用P6中的5％脱脂乳封闭的Maxisorp免疫平板上测试了系列稀释在P6/5％脱脂乳/0.1％Tween-20中的纯化的Fc变体(如III中所述)。37℃孵育2小时后，用P6/0.1％Tween-20洗涤孔3次，并用HRP抗-V5抗体(invitroGen)检测结合的Fc变体(OD450nm的测量)(图5a)。对S5A_41(MS1的最佳变体)、S3A_07(等同于Fc-H的变体)和Fc-H变体进行了ELISA测试。这些ELISA测试确认，Fc-H、S5A_41和S3A_07与Fc-WT相比具有改善的与FcRn的结合(图5b、图5c和图5d)。对于各结合曲线，用曲线的50％饱和下的Fc浓度的测量(EC50)来表征Fc变体与Fc-WT相比的结合特性。藉此获得的比值确认，S5A_41是比Fc-H变体好的结合剂，而S3A_07等同于Fc-H变体(表6)。

IV.1.b.SPR(表面等离振子共振)测定

用CM5传感芯片(Biacore，GE Healthcare)在BIAcore×100仪器上进行了Fc变体与固定化FcRn的相互作用的监测。该方法类似于之前针对分析Fc-FcRn相互作用描述的方法(Popov S.等,Mol Immunol.33(6):521-530(1996))。用胺偶联化学将重组可溶性FcRn偶联至传感芯片的流动室2。按30μl/分钟的流速用0.1M N-羟基琥珀酰亚胺与0.1M3-(N,N-二甲氨基)丙基-N-乙基碳二亚胺的1:1混合物活化流动室3分钟。按10μl/分钟在流动室2上注射重组人FcRn(5μg/ml在10mM乙酸钠pH5.0中)8分钟，其产生1200至1300响应单位(RU)的表面密度。用3分钟的1M乙醇胺-HCl pH 8.5的注射封闭表面。将流动室1用作无FcRn的对照表面，并与样品流动室类似地制备。从样品数据减去来自此空白流动室的数据。

将Fc片段稀释于在平衡结合实验中用作流动缓冲液的PBS/Tween-20(50mM磷酸缓冲液pH 6.0，150mM NaCl，0.02％NaN₃，0.01％Tween-20)中。在25℃下进行所有测量，Fc片段浓度通常在1至200nM的范围内，流速为10μl/分钟。

收集数据10分钟，用含有0.05％Tween-20的PBS pH 8的1分钟脉冲再生表面。

通过使用3.1版BIAevaluation软件来产生和分析传感图。用针对各注射观察到的平衡RU对Fc的浓度作图。通过用包含于BIAevaluation软件中的稳态亲和力模型分析图来衍生平衡Kd值。

藉此获得的Kd比值确认，S5A_41是比Fc-H变体好的结合剂，而S3A_07等同于Fc-H(表6)。

IV.1.c.所获得的结果的总结

下文表6显示通过(i)噬菌体ELISA、(ii)ELISA和(iii)SPR与Fc_WT比较的变体S5A_41、S3A_07和Fc-H的FcRn结合表征。在所有情况下，变体S5A 41都显示显著高于Fc-WT的结合FcRn的能力。

表6：使用ELISA和表面等离振子共振(SPR)的Fc变体的FcRn结合表征。对于噬菌体-ELISA和Fc-rec-ELISA，比值指变体特异性信号除以Fc-WT特异性信号。对于SPR，比值指Fc-WT Kd除以变体Kd。

IV.2.通过SPR和ELISA与Fc_WT比较的其他MS2变体的FcRn结合表征

按上文III部分中所述产生了MS2的几个Fc变体。分别按上文IV.2.b部分中和IV.2.c部分中所述，通过(i)SPR和(ii)ELISA测定了各变体结合FcRn的能力。

几个结果显示于图7中。

下文表7显示通过(i)SPR和(ii)ELISA针对所测试的各MS2变体获得的结果。还显示之前通过ELISA-噬菌体获得的结果。

ELISA和SPR测定显示，所有Fc变体对FcRn而言都是比野生型Fc好的结合剂，这与之前通过对噬菌体-Fc变体的ELISA测定获得的结果相关。

MS2变体在pH＝6下的Kd值在从5.2至22.7nM的范围内，这对应于与Fc-WT相比1.3至5.8倍的亲和力增加。

表7：使用ELISA和表面等离振子共振(SPR)的Fc变体的FcRn结合表征。对于噬菌体-ELISA，比值指变体特异性信号除以Fc-WT特异性信号。对于ELISA，比值指Fc-WT EC50除以变体EC50。对于SPR，比值指Fc-WT Kd除以变体Kd。

还通过ELISA测定评估了Fc变体在不同pH下结合FcRn的能力。

对于之前测试的各Fc变体，按在pH＝6下进行ELISA测定时提供0.8至1.0的OD450nm的浓度进行ELISA测定。实验条件是之前描述于IV.1.a部分中的那些。下文表8显示用于进行ELISA测定的各Fc变体的浓度。

	Fc浓度(nM)
		Fc-WT	200.0
Fc-H	6.2
		C6A_69	1.2
T5A_74	1,2
		C6A_60	1,2
S5A_41	2.0
		C6A_78	2.5
C6A_74	5.0
		C6A_72	5.0
T5A_78	12.5
		C6A_66	20.0
T5A_58	50.0

表8：用来显示不同pH下与FcRn的不同结合亲和力的各Fc变体的浓度。

图7显示针对各变体获得的ELISA测定的结果。OD_450nm与结合至固定化FcRn的Fc变体的量相关(用HRP抗-V5抗体检测结合的Fc变体)。OD_450nm下的特异性信号越高，Fc变体与FcRn的结合越高。

图7清除地显示，Fc变体与FcRn的结合依pH而变。如所预期，与pH 6.0下的结合相比，Fc变体在pH 7.4下与FcRn的结合不显著。

可以得出结论，与Fc-WT的结合相比，为获得本发明的Fc变体而引入的氨基酸修饰可以显著增加pH 6.0下与FcRn的结合，但可以不显著改变pH 7.4下的结合，其仍然非常低。

实施例2：

基于Fc变体的IgG变体的产生和该IgG的生物学表征

I.IgG变体的表达

I.1.载体构建

在YB2/0细胞系中以具有抗-CD20特异性的IgG形式制备Fc变体C6A_69、C6A_78、T5A_74、C6A_74、C6A_60和C6-A66。为了比较的目的，还产生了基于野生型Fc的IgG(IgG-WT)。

为了最大化YB2/0细胞系中的生产力，用褐家鼠(Rattus norvegicus)的密码子优化新合成全长重链和轻链cDNA以及编码变体的Fc片段。去除不想要的特征，如隐蔽剪接位点或限制位点。仅一个限制位点(ApaI)存在于可变/恒定区连接处。

在第一步骤中，将野生型重链克隆在针对在YB2/0中表达优化的表达载体CHK622-08中的NheI和AscI之间，产生中间构建体HCD20-Opti-GA。然后将优化的轻链克隆在SpeI和XbaI限制位点之间，产生用于表达野生型抗-CD20抗体(下文称为IgG-WT)的最终构建体HKCD20-Opti-GA。

通过用它的适当形式取代存在于HKCD20-Opti-GA中的野生型IgG1Fc片段来制备Fc变体。这克隆在ApaI和AscI限制位点之间(图8a)。

细菌转化之前，通过经典的消化/连接方法进行每个片段克隆。通过酶消化加PCR筛选表达构建体，并通过测序验证。

I.2.细胞培养物产生

用各线性化表达载体电转YB2/0细胞系(ATCC，CRL-1662)的5×10⁶个细胞，然后按25,000细胞/mL稀释在RPMI 1640培养基+5％v/v透析FCS(InvitroGen)中，并按1mL/孔分配在24孔板中。细胞恢复3天后，通过按0.5g/L终浓度加入浓缩遗传霉素(Invitrogen)和按25mM终浓度加入浓缩氨甲喋呤(Sigma)来应用选择压力，2mL/孔。孵育11天后，针对8个构建体(编码所选择的IgG MS2变体和IgG-WT)中的每一个混合抗性细胞，并用DMEM培养基+5％v/v Ultra-low IgG FCS(InvitroGen)逐步稀释，直至可以按2转/分钟孵育各包含0.9L细胞悬液的两个(2)2L的滚瓶。使细胞生长并死亡(4至5天)，然后收集上清，通过低速离心澄清，并通过在Pellicon XL Filter(Millipore)上超滤减少体积。

II.IgG变体的纯化和表征

将浓缩的培养物上清注入HiTrap蛋白A FF柱(GE Healthcare)。用0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 3.0洗脱结合的抗体，并用每毫升洗脱缓冲液100μl 1M Tris pH 7.5中和级分。混合包含抗体的级分并透析入PBS pH 6.0，对样品进行除菌过滤(0.22nm)并保存于4℃。

通过非还原和还原条件下的SDS-PAGE表征纯化的IgG。考马斯蓝染色的凝胶显示，无论什么突变，IgG都被纯化至大于95％同质，并显示各IgG的特征性重链和轻链条带(图8b和图8c)。

III.IgG变体的FcRn结合表征

通过三种不同的测试测定了IgG变体与FcRn的结合特性：(i)通过ELISA测定；(ii)通过SPR；和(iii)通过在存在荧光标记的利妥昔单抗(抗-CD20IgG)的情况下在表达截短FcRn的Jurkat细胞系上进行的竞争结合测定。

III.1.ELISA

III.1.a.材料和方法

用FcRn-p3包被在孔上的pH 6.0下的ELISA测试测定了在Y2B/O中产生的IgG变体的结合特性。为了比较的目的，还对IgG-WT进行了ELISA测定。

在之前用0.1μg FcRn-p3/孔包被并用P6中的5％脱脂乳封闭的Maxisorp免疫平板上测试了系列稀释在P6/5％脱脂乳/0.1％Tween-20中的纯化的IgG变体。37℃孵育2小时后，用P6/0.1％Tween-20洗涤孔3次，并用HRP Fab’2山羊抗-人Fab’2(Interchim)检测结合的IgG变体。

对于各IgG变体，将结合的FcRn的百分比对IgG变体浓度的对数作图。对于产生的各结合曲线，测定与曲线的50％饱和相关的IgG浓度的测量(EC50)，并与WT-IgG的EC50比较。

III.1.b.ELISA结果

ELISA测试显示，与WT-IgG的结合相比，产生的IgG变体具有增加的与FcRn的结合。结合曲线(见图9)和EC50值清楚地说明了此事实。

如下文表9中所显示，IgG变体的EC50比野生型IgG的EC50低至少5.8倍。针对C6A_69变体获得了最佳EC50。

IgG变体	EC50(ng/ml)	比值变体/WT
			WT	11060	1.0
C6A_69	1021.6	10.8
			C6A_78	1440.9	7.7
T5A_74	1191.8	9.3
			C6A_74	2116.0	5.2
C6A_60	1904.0	5.8
			C6A_66	1900.4	5.8

表9：从各IgG变体的ELISA结合曲线获得的50％饱和处的浓度(EC50)。比值指WT EC50除以变体EC50.

III.2.使用SPR的IgG/FcRn结合亲和力测量

III.2.a.材料和方法

使用BIAcore×100仪器(GE Healthcare)，通过表面等离振子共振(SPR)检测来监测IgG-WT和IgG变体与重组固定化人FcRn的相互作用。实验流程类似于用于测定Fc变体的亲和力的流程(见上文段落IV.2.b)。

将针对各注射观察到的平衡RU对Fc的浓度作图。通过用包含于BIAevaluation软件中的稳态亲和力模型分析图来衍生平衡Kd值。通过用模型1:2整体拟合结合期和解离期数据来测定动力学参数。

III.2.b.SPR结果

IgG-WT对人FcRn的结合亲和力(Kd值)为78.3nM。如表10中所示，6个IgG变体的Kd值在从10.5至18.8nM的范围内，与IgG-WT相比，其显示pH 6.0下对FcRn的亲和力增加4至7倍。

	Kd(nM)	比值WT/变体
			WT	78.27	1
C6A_69	18.77	4
			C6A_78	17.64	4
T5A_74	10.55	7
			C6A_74	12.87	6
C6A_60	13.79	6
			C6A_66	15.18	5

表10：通过SPR获得的Kd值。比值指WT-Kd除以变体Kd。为了测定动力学参数，用包含于BIAevaluation软件中的1:2模型拟合IgG WT和变体与人FcRn相互作用的数据集。用IgG WT获得的曲线不符合1:2模型，而用IgG变体C6A_66和所有其他变体获得的曲线很好地符合模型1:2(数据未显示)。

如下文表11中所示，IgG变体相对于WT对人FcRn的增强的亲和力主要由增加的结合动力学(kon值)驱动。因此，比值(指变体kon除以WT-kon)在从13至23的范围内，表明变体与FcRn的亲和力显著增加。IgG变体的Koff相对于WT的增加值在从2至4的范围内，显示解离与结合相比的微弱影响。

	kon(×105)	koff(1/s)	KD(nM)
				WT	0.36	0.00355	99
C6A_69	7.60	0.00837	11
				C6A_78	8.19	0.00981	12
T5A_74	5.22	0.00885	17
				C6A_74	5.81	0.01349	23
C6A_60	8.12	0.00788	9.7
				C6A_66	4.83	0.01264	26

表11：通过SPR测定的解离(koff)和结合(kon)的速率。

III.3.与Jurkat-FcRn的结合

III.3.a.材料和方法

通过修改自Dall'Ozzo等(Dall'Ozzo S、Tartas S、Paintaud G、CartronG、Colombat P、Bardos P、Watier H、Thibault G、Cancer Res.,2004年7月1日；64(13):4664-9)所描述的方法的方法进行竞争免疫荧光测定来评价IgG WT和变体与FcRn相互作用的能力。

简言之，按0.06至2mg/ml的终浓度将IgG WT和变体稀释在PBS pH6中，并在存在浓度为50μg/ml的Alexa缀合的利妥昔单抗(标记的利妥昔单抗)的情况下与Jurkat FcRn(150000细胞)孵育。20分钟后，通过流式细胞术分析细胞来定量Alexa-利妥昔单抗结合。结果表示为平均荧光强度(MFI)的百分比，100％指用Alexa缀合的利妥昔单抗单独(即无竞争剂)获得的平均荧光强度(MFI)，0％指未用与Alexa缀合的利妥昔单抗孵育Jurkat FcRn时测量的MFI值。每个实验进行3个重复。

对照包含(i)未标记的利妥昔单抗或(ii)IgG-WT的孵育。

对于各测试IgG，将MFI对IgG浓度的对数作图。测定了提供MFI信号的50％抑制的各测试IgG的浓度(IC50)。

此测定的一般描述还可以见于公开为FR 2 894 983的法国专利申请中。

III.3.b.实验结果

几个结果显示于图11中，其中按上文材料和方法部分中所述测定了Ritixan和本发明的多种变体与Jurkat FcRn的结合，并表示平均荧光强度(MFI)值。

如下文表12中所示，针对本发明的变体获得的IC50显著低于针对WT-IgG获得的IC50。除C6A_66外，本发明的变体的IC50减少40至60倍。

表12：在存在荧光标记的利妥昔单抗的情况下在表达FcRn的Jurkat细胞上进行的结合竞争测定所获得的IC50。“50％RTX＝1”值由同样以μg/ml表示的IC50值组成。

III.4.结论

为表征IgG变体与FcRn的结合特性而进行的三种不同测试提供一致的结果。在所有情况下，本发明的IgG变体与IgG野生型相比都显示显著增加的与FcRn的结合。

IV.IgG变体的功能表征及与IgG-WT和LFB-R603的比较

为了充分表征它们的生物学功能，评估了IgG变体结合Fcγ受体的能力及它们的ADCC和CDC活性。

IV.1.IgG变体与hFcγRIIIA的结合

IV.1.a.ELISA测定：IgG变体与固定化重组hFcγRIIIA的结合

用EZ-link NHS-PEO试剂盒(Pierce)生物素化人重组FcγRIIIA(F158同种异型)，按1μg/ml稀释在测定缓冲液(Tris 25mM、NaCl 150mM、pH 7.35、0.05％Tween-20、0.1％BSA)中，并在室温下包被react-bind^TM链霉抗生物素蛋白ELISA平板(Pierce)2小时。在此孵育时间内，通过在室温下混合5μg/ml IgG和2μg/ml辣根过氧化物酶标记的F(ab’)2抗-人F(ab’)2(Jackson ImmunoResearch)2小时来在测定缓冲液中制备IgG-F(ab’)2抗-F(ab’)2复合体。将复合体的系列稀释加至平板，并在轻轻摇动下室温孵育2小时。用测定缓冲液洗涤平板后，用TMB(Pierce)检测与hFcγRIIIA结合的复合体。用酶标仪(Tecan)读取450nm下的吸光度。

对于各IgG变体，将结合的FcγRIIIA的百分比(其获自OD450nm)对IgG变体的浓度作图。

如图10中所示，除未能结合hFcγRIIIA的变体C6A_66外，IgG变体与hFcγRIIIA的结合类似于IgG WT与hFcγRIIIA的结合。

IV.2.ADCC活性

通过Miltenyi公司开发的阴性排除技术(negative depletion technique)从健康供体的外周血纯化天然杀伤细胞(NK细胞)。ADCC测试包括在存在不同浓度的抗-CD20抗体的情况下将NK细胞与表达CD20受体的Raji细胞系的靶细胞孵育。孵育16小时后，通过定量细胞上清中由裂解的靶细胞释放的称为乳酸脱氢酶(LDH)的胞内酶的水平来生色测量抗-CD20抗体诱导的细胞毒性。

结果显示在图12中。

将特异性裂解结果作为抗体浓度的函数表示为百分比裂解。用PRISM软件计算EC50(诱导最大裂解的50％的抗体量)。用(i)利妥昔单抗、(ii)在Y2/0细胞中产生的WT-IgG和LFB-R603进行对照实验，LFB-R603是已知具有ADCC功能的抗-CD20抗体，其已于2004年由Romeuf等描述(de Romeuf C、Dutertre CA、Le Garff-Tavernier M、Fournier N、GaucherC、Glacet A、Jorieux S、Bihoreau N、Behrens CK、Béliard R、VieillardV、Cazin B、Bourel D、Prost JF、Teillaud JL、Merle-Béral H.Chroniclymphocytic leukaemia cells are efficiently killed by an anti-CD20monoclonal antibody selected for improved engagement ofFcgammaRIIIA/CD16.Br J Haematol.2008年3月；140(6):635-43)，以及描述于PCT申请第WO 2006/064121号中。

下文表13显示各变体的EC50，并将IgG变体的ADCC功能与LFB-R603和WT-IgG的ADCC功能相比较。

除C6A_66变体外，所有IgG变体都显示ADCC活性。C6A_66变体无ADCC活性，这与它对FcγRIII的非常低的亲和力一致。

应注意，C6A_69、C6A_60和C6A_74与IgG-WT相比具有增加的ADCC活性。其他变体(即C6A_78和T5A_75)具有与IgG-WT的ADCC活性相似的ADCC活性。

表13：从ADCC测定获得的EC50(诱导最大裂解的50％的抗体量)。比值指变体EC50除以LFB-R603EC50。

IV.3.CDC活性

在此技术中，在存在幼兔血清作为补体来源(Cedarlane ref.:CL3441，稀释至1/10)的情况下将Raji细胞系的靶CD20+细胞与不同浓度的抗-CD20抗体(0至5000ng/ml)孵育。37℃孵育1小时后，生色测量(RocheApplied Sciences Cytotoxicity Detection Kit)由裂解的靶细胞释放在上清中的LDH的量，并用来定量由抗体介导的依赖补体的细胞毒性。结果表示为裂解的百分比。用PRISM软件计算EC50(诱导最大裂解的50％的抗体量)和Emax(最大裂解的百分比)。

下文表14显示针对各变体获得的Emax和EC50。

CDC活性的水平依IgG变体而变。

C6A_78和C6A_60具有显著高于IgG-WT的CDC活性的CDC活性，而C6A_69、T5_74和C6A_66显示低CDC活性。

C6A_74变体的CDC活性与IgG-WT的CDC活性相似。

表14：从CDC测定获得的EC50(诱导最大裂解的50％的抗体量)。

IV.3.结论

与IgG-WT(在相同的宿主细胞中和相同的条件中产生)相比，在Y2B/0细胞系中重组产生的本发明的6个IgG变体具有增加的与FcRn受体的结合。

除对FcgRIII显示弱亲和力的C6AA_66外，本发明的IgG变体具有至少与IgG-WT相同的与FcgRIII的结合亲和力，及至少与IgG-WT相同的ADCC活性。

IgG变体显示不同的CDC活性。

总之，在一些方面，本发明的氨基酸修饰使得能够获得IgG变体，该变体具有与至少类似于对应的亲本IgG(即IgG-WT)的一种或多种Fc效应子活性组合的增加的对FcRn的结合。

在其他方面，本发明的氨基酸修饰使得能够获得IgG变体，该变体具有与至少一种减少的Fc效应子活性如CDC或ADCC组合的增加的对FcRn的结合。

下文表15显示关于本研究的IgG变体的主要结论。

变体	突变	结合FcRn	ADCC	CDC
					C6A_69	T307A/N315D/A330V/E382V/N389T/N434Y	++	↗	↘
C6A_78	T256N/A378V/S383N/N434Y	++	√	↗
					T5A_74	N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y	++	√	↘
C6A_74	V259I/N315D/N434Y	++	↗	√
					C6A_60	P230S/N315D/M428L/N434Y	++	↗	↗
C6A_66	E294del/T307P/N434Y	++	↘	↘

表15：与IgG-WT比较的针对本发明的IgG变体获得的主要结果；++：与WT-IgG相比增加的与FcRn的结合；↗：与WT-IgG相比增加的活性；↘：与WT-IgG相比减少的活性；√：类似于WT-IgG的活性的活性。

表7：包含于序列表中的序列

Claims (13)

1.包含Fc区的亲本多肽的变体，该变体与所述亲本多肽相比显示增加的与FcRn的结合，且包含至少两个氨基酸修饰，所述至少两个氨基酸修饰包含：

(i)选自Fc区的378V、378T、434Y和434S的一个氨基酸修饰；和

(ii)选自Fc区的226G、P228L、P228R、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、362R、378V、378T、389T、389K、434Y和434S的至少氨基酸修饰；

其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号，只要修饰(i)不发生在与修饰(ii)相同的氨基酸位置上。

2.权利要求1的变体，所述变体与所述亲本多肽相比包含选自Fc区的

226G/315D/434Y，230S/315D/434Y，230T/315D/434Y，230T/264E/434S，230T/389T/434S，241L/264E/378V，241L/264E/434S，250A/389K/434Y，259I/315D/434Y，264E/378T/396L，264E/378V/416K，264E/378V/434S，264E/396L/434S，294deI/307P/434Y，307P/378V/434Y，315D/330V/434Y，315D/382V/434Y和378V/383N/434Y的至少一个氨基酸修饰组合，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中EU索引的编号。

3.权利要求2的变体，其中所述变体与所述亲本多肽相比进一步包含选自Fc区的226G、227L、230S、

230T，230L，231T，241L，243L，250A，256N，259I，264E，265G，267R，290E，294deI，303A，305A，307P，307A，308I，315D，322R，325S，327V，330V，342R，347R，352S，361D，362R，362E，370R，378V，378T，382V，383N，386R，386K，387T，389T，389K，392R，395A，396L，397M、403T、404L、415N、416K、421T、426T、428L、433R、434Y、434S和439R的至少一个氨基酸修饰，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中EU索引的编号。

4.权利要求1或2的变体，其中所述变体与所述亲本多肽相比包含选自Fc区的

307A/315D/330V/382V/389T/434Y，256N/378V/383N/434Y，315D/330V/361D/378V/434Y，259I/315D/434Y，230S/315D/428L/434Y，241L/264E/307P/378V/433R，250A/389K/434Y，305A/315D/330V/395A/434Y，264E/386R/396L/434S/439R，315D/330V/362R/434Y，294deI/307P/434Y，305A/315D/330V/389K/434Y，315D/327V/330V/397M/434Y230T/241L/264E/265G/378V/421T，264E/396L/415N/434S，227L/264E/378V/434S264E/378T/396L，230T/315D/362R/426T/434Y，226G/315D/330V/434Y230L/241L/243L/264E/307P/378V，250A/315D/325S/330V/434Y290E/315D/342R/382V/434Y，241L/315D/330V/392R/434Y，241L/264E/307P/378V/434S230T/264E/403T/434S，264E/378V/416K，230T/315D/362E/434Y，226G/315D/434Y226G/315D/362R/434Y，226G/264E/347R/370R/378V/434S，308I/315D/330V/382V/434Y230T/264E/378V/434S，231T/241L/264E/378T/397M/434S，230L/264E/378V/434S230T/315D/330V/386K/434Y，226G/315D/330V/389T/434Y，267R/307P/378V/421T/434Y，230S/315D/387T/434Y，230S/264E/352S/378V/434S和

230T/303A/322R/389T/404L/434S的一个氨基酸修饰组合，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中EU索引的编号。

5.权利要求1至4中任一项的变体，其中所述变体是抗体。

6.权利要求5的变体，其中所述抗体是IgG抗体。

7.药物组合物，其包含权利要求1至6中任一项定义的变体。

8.分离的核酸，其编码权利要求1至6中任一项定义的变体。

9.载体，其包含权利要求8的核酸。

10.宿主细胞，其包含权利要求9的载体。

11.用于产生权利要求1至6中任一项的变体的方法，其包括培养权利要求10的宿主细胞，以使得核酸表达。

12.药物，其包含权利要求1至6中任一项的变体。

13.权利要求1至12中任一项的变体的用途，用于制备药物。