JP5770710B2 - 最適化されたFc変異株 - Google Patents

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Description

本発明は、Fc領域を含む親ポリペチドの変異株(ミュータント、variants)に関するものである。
この変異株は親ポリペチドと比べてFcRnに対する結合性が増加し、Fc領域中にも少なくとも一つのアミノ酸突然変異を有する。
モノクローナル抗体は、ガン、自己免疫性疾患、慢性炎症性疾患、移植拒絶反応、感染症および心血管病気を含む各種状態の治療で治療方学として使用されている。現在、20種以上のモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体断片製品が流通されており、400種以上が臨床開発中である。こうした市況および承認にもかかわらず、抗体の構造上および機能上の特性を最適化するという大きなニーズが残っている。
モノクローナル抗体を治療で使用する上で大きな問題の1つは、それが循環血液中に残ることである。抗体のクリアランス速度は治療効果、従って、患者に悪影響を生じさせる医薬品の投与頻度および投薬量に直接影響し、医学コストを増大させる。
IgGは最も普及している免疫グロブリンのクラスであり、ヒトの治療で最も多く利用されている。IgGホメオスタシス機構は母親から胚または齧歯動物の新生児への受動免疫のトランスファーに関する研究で明らかになった(非特許文献1〜3)。初期の研究でBrambellはIgGの母胎間(maternofetal)伝達のためのレセプタがあり、このIgGの母胎間伝達およびIgG異化に関与する機構は同じものであるか、少なくとも非常に密接に関連していると仮定した(非特許文献1)。
研究の結果、分極細胞中またはそれを横切るIgGの運搬はFc領域が高い親和性のFcレセプタ(新生Fcレセプタ(FcRn)といわれる)に結合することによって仲介されるということが分かった。このFcRnは主組織適合性複合クラスI分子のα-鎖の細胞外領域に対して構造上の相同性を有するトランスメンブレンα-鎖I分子とβ2−ミクログロブリン(β2m)とから成る可溶性の軽鎖から成るヘテロダイマである (非特許文献4)。
ヒトではFcRnは胎盤細胞、腸、腎臓、気管支細胞、血管内皮細胞、上皮細胞、造血細胞、例えば小腸マクロファージ、単核細胞および単核細胞派生樹状細胞で発現される(非特許文献5)。FcRnはその2つの主たるリガンドIgGおよび血清アルブミンに結合し、pH依存性で、pH 6.0〜6.5で有効な結合が起こり、pH 7.0〜7.5で解放する (非特許文献6)。
異化(catabolism)からIgGを保護する機構としてはIgGが非特異性のピノサイトーシスによって血管内皮細胞のエンドソームに内面化され、低pHでFcRnへの結合が促進されるという機構が提案されている(非特許文献7)。結合したIgG-FcRn錯体が細胞表面へ再循環され、細胞外液の中性pHで分離し、血液循環中へ戻る。FcRnに結合しないIgGはリソソームへ送られ、プロテアーゼによって分解される。低漿液IgG濃度で生き残ったIgGの濃度依存異化機構によってリセプタは全てのエンドサイトーシス(endocytosed)IgGを結合し、それを効率的に循環形に返し、IgG半減期を長くする。逆に、高IgG濃度ではリセプタがIgGで飽和され、IgGの主画分がリセプタによって結合解除され、劣化し、束縛を解かれたIgGがより急速に異化する。
ハツカネズミIgGのFc領域の各種部位特異的突然変異実験によって、IgGとFcRnとの間の相互作用に関係するある種の重要なアミノ酸残基が確認された非特許文献7〜11)。これらの研究および配列比較研究から、位置253のイソロイシン、的位置310のヒスチ遺伝子、位置435のヒスチ遺伝子(Kabatに従った番号)がヒトおよびウサギで高度に保持され、結合IgG-FcRnでのその重要性を示唆していることが見出された(非特許文献12)。これらのアミノ酸残基はCH2-CH3領域界面に位置し、ラットFcと錯体化したラットFcRnのX−線結晶構造でこれら残基に対する機能サイトのマッピングが作られた(非特許文献13)。
非特許文献14ではハツカネズミIgG1 Fc-ヒンジ断片の位置252、位置254および位置256がランダムに突然変異化(mutagenized)された。そのぞれ、1つのミュータントはハツカネズミFcRnに対して3倍の親和性を示し、2つのハツカネズミ株では半減期が野生型と比べ約23%または65%長くなった。
非特許文献15では、Fc領域の位置253、位置310または位置435のアミノ酸置換によってヒトIgG1を突然変異して突然変異Fcヒンジ断片が野性型IgG1 Fc-ヒンジ断片と比較してハツカネズミ漿液中の半減期を減らすことを示し、Ne253、His310およびHis435がIgGの漿液半減期のコントロールで中心的な役割を演じていると結論している。
非特許文献16はキメラのヒトIgG1抗体のFc領域の位置253の一つのアミノ酸の置換でハツカネズミの排除を加速し、固形腫瘍の免疫シンチグラフィを改善することを示した。
非特許文献17はアラニン走査突然変異生成を用いてヒトIgG1抗体のFc領域の残基を変え、ヒトFcRnへの結合性をアセスしている。アラニンに変えた時のFcRn結合性を効果的に排除する位置には1253、S254、H435およびY436が含まれる。結合性がそれより少なく減少した他の位置はE233-G236、R255、K288、L309、S415およびH433である。アラニンに変えた時にいくつかのアミノ酸位置でFcRn結合性が改良した。特にP238、T256、E272、V305、T307、Q31 1、D312、K317、D376、E380、E382、S424およびN434で顕著である。多くの他のアミノ酸位置でFcRn結合性がわずかな改良を示し(D265、N286、V303、K360、Q362およびA378)すか、変化がなかった(S239、K246、K248、D249、M252、E258、T260、S267、H268、S269、D270、K274、N276、Y278、D280(V282)E283、H285、T289、K290、R292、E293、E294、Q295、Y296、N297、S298、R301、N315、E318、K320、K322、S324、K326、A327、P329、P331、E333、K334、T335、S337、K338、K340、Q342、R344、E345、Q345、Q347、R356、M358、T359、K360、N361、Y373、S375、S383、N384、Q386、E388、N389、N390、K392、L398、S400、D401、K414、R416、Q418、Q419、N421、V422、E430、T437、K439、S440、S442、S444およびK447)。
最も大きな加算性(additivity)はFcRnに対する結合性が改良された複合変異株 (combination 変異株)の場合である。例えばE380Aでは2倍、N434Aでは3倍であるが、E380A/N434A変異株はpH 6.0で天然のIgG1に対してFcRnに対する結合性が8倍強くなる。これにT307Aを加えると天然IgG1に対して結合性は12倍改良する。
非特許文献18はランダム突然変異生成とハツカネズミFcRnに対するヒトIgG1ヒンジ-Fc断片ファージのスクリーニングのライブラリを示しており、位置251、252、254-256、308、309、311、312、314、385-387、389、428、433、434および436でのランダム突然変異生成を記載している。IgG1-ヒトFcRn錯体の安定性の主たる改良はFc-FcRn境界(M252、S254、T256、H433、N434およびY436)を横切るバンド中に位置する残基の置換で起こり、より小さい改良はV308、L309、Q311、G385、Q386、P387およびN389でのような末梢での残基の置換で起こる。ヒトFcRnに対して最も高い親和性を示す変異株は例えばM252Y/S254T/T256E突然変異とH433K/N434F/Y436H突然変異とを組合せた時に得られ、天然型IgG1に対して57倍の増加を示す。
非特許文献19には2つの突然変異(T250QおよびM428L)が記載され、これらはヒトFcRnに対するヒトIgG2の結合性をそれぞれ約3倍および7倍増加させる。これらの2つの突然変異は、組み合わせると、IgG2の28倍の結合能の増加を誘発する。薬物動態学研究のためにM428LおよびT250Q/M428の両方のIgG2ミュータントをアカゲザルに注射すると野生型抗体より半減期が約2倍長くなる。
非特許文献20には、位置252、254および256でFc領域を変化させたヒト型抗-RSウィルスIgG1(M252Y/S254T/T256E)が記載されている。これらの突然変異はヒトFcRnに対する結合性をpH 6.0で約10倍増加させ、pH 7.4で効率的な解除を許す(非特許文献18)。こうした変移させたヒトIgG1のインビボ挙動によってカニクイザルで漿液の半減期を野生型IgG1と比べてほぼ4倍増加する。
さらに、半減期を変えた生理活性分子を得る方法は種々の文献に記載されており、FcRn-結合ポリペチドを分子中に入れる(特許文献1〜5)方法や、上記分子をFcRn-結合親和性を保存し、他のFcレセプタに対する親和性を大きく減少させた抗体と溶合する方法(特許文献6)や、抗体のFcRn結合領域と溶合する(特許文献7、8)方法がある。
特許文献9には抗体をコードするDNAセグメント中に突然変異を誘導して生物学的半減期を減少された抗体を生産する方法が開示されている。この突然変異にはFc-ヒンジ領域の位置253、310、31 1、433または434のアミノ酸の置換が含まれる。上記で引用した特許文献9およびその他全て米国特許の開示内容は本明細書の一部を成す。
特許文献10にはFcRn結合能を変えた突然変異Fc領域を有するポリペチドが開示されている。このポリペチドはFc領域のアミノ酸位置238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、31 1、312、317、340、356、360、362、376、378、380、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439および447の任意の一つ以上のアミノ酸が突然変異し、Fc領域の残基の位置の数え方はEUインデックスの位置の数え方 (上記Kabat et al.) と同じである。
特許文献11には、野性-型IgGの不変領域に対して一つ以上のアミノ酸を変異させたIgG不変領域を有する変成IgGが開示されている。変成したIgGは野性型IgGの不変領域に比べてIgGの半減期が増加し、一つ以上のアミノ酸変異は位置251、253、255、285-290、308-314、385-389および428-435の一つ以上で行われる。
国際特許第WO97/43316号公報 米国特許第5,869,046号明細書 米国特許第5,747,035号明細書 国際特許第WO96/32478号公報 国際特許第WO91/14438号公報 国際特許第WO99/43713号公報 国際特許第WO00/09560号公報 米国特許第4,703,039号明細書 米国特許第6,165,745号明細書 国際特許第WO00/42072号公報 国際特許第WO02/060919 A2号公報
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しかし、さらに最適化した新規なFc変異株に対するニーズが依然としてある。
本発明は、最適化された性状を有する親ポリペチドの変異株を提供する。 この最適化された特性には対応する親ポリペチドよりFcRnに対する高い結合性が含まれる。本発明の好ましい実施例では、親のポリペチドの変異株は親ポリペチドに比べてFcRnに対する結合性か増加したFc領域を有し、親ポリペチドのFc領域中に少なくとも一つのアミノ酸突然変異を有し、その突然変異は親ポリペチドに対してFc領域の中の下記の群の中から選択される:226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291 , 292, 294, 297, 298, 299, 301 , 302, 303, 305, 307, 308, 309, 31 1 , 315, 317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361 , 362, 369, 370, 371 , 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 , 403, 404, 408, 41 1 , 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433、434、438、439、440、443、444、445、446および447。(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabat中でのEUインデックスの数え方と同じである)
本発明の他の実施例では、本発明は本発明の変異株を含む医薬組成物を提供する。
本発明の他の実施例では、本発明は本発明の変異株をコードする単離された核酸を提供する。
本発明の他の実施例では、本発明は上記核酸を含むベクターを提供する。
本発明の他の実施例では、本発明は上記ベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明の他の実施例では、上記宿主細胞を培養して核酸を発現させることから成る、ポリペチド変異株の生産方法を提供する。
本発明の他の実施例では、本発明は本発明の変異株を含む医薬品を提供する。
本発明の他の実施例では、本発明は医薬品製造での本発明変異株の使用を提供する。
本発明の他の実施例では、本発明はFc最適化変異株を識別する方法を提供する。
はヒトIgG1重鎖(Fc226(SEQ番号1))に由来するアミノ酸残基226-447 (KabatでのEUインデックス)をコードするヒトFc遺伝子がクローンされたファージミド(ファージmid)ベクターpMG58を示す図。 CVDE:VMA1-由来のエンドヌクレアーゼのC末端部、 VMA:空胞(vacuolar)ATPアーゼ・サブユニット(VMA)、 CPIII:ファージM13のカプシドタンパクpIII(またはp3)のC末端部。 は固相(2A)および溶液中(2B)でFc変異株を選択するのに使用する方法を示す図。 FcRn-biotはビオチチル化(biotinylated)FcRnを表し、 FcRn-p3はFcRn-p3融合タンパクを表す。 Fc-ファージはそのカプシッド上にFc変異株を発現するファージM13である。固相選択法では免疫プレート(免疫プレート)のウエルにFcRn-p3融合タンパク(FcRn-p3)またはニュトラビディン(neutravidin)、次いでFcRn-biotを被覆する。 は選択したFc変異株で実施したファージ−ELISAアッセイの原理を示す図。Fc-ファージはそのカプシッド上にFc変異株を発現するファージM13であり、FcRn-p3は免疫プレートのウエルに被覆したFcRn-p3融合タンパクであり、抗−M13はELISA検出用に使用したホースラディシュ(Horseradish)ペルオキシダーゼ(HRP)に溶合したハツカネズミ抗M13抗体である。 はFc IgG1の各アミノ酸位置に対するその位置で突然変異を含む変異体の百分比を表すヒストグラム。X−座標:変異位置でのKabatでのEUインデックスに従ったアミノ酸数。Y−座標:変異位置を含むFc変異株の百分比。
はFcRnに対するFc変異株の結合能を測定するためのELISAアッセイの原理を示す。FcRn-p3は免疫プレートのウエルを被覆したFcRn-p3融合タンパクであり、FcはELISA検出用のV5タグを有するFc変異株であり、抗V5はHRPに溶合させた抗V5抗体である。ELISA検出には抗体を使用した。 は実施例1に記載のIV.1.aでのELISAアッセイで得られた野生型Fc(丸)およびFc−H変異株(四角)の投与量効果曲線を示す。X−座標:Fcポリペチドの濃度、Y−座標:Fcポリペチドに結合したFcRnの百分比。 は実施例1に記載のIV.1.aでのELISAアッセイで得られた野生型Fc(丸)およびS3A_07変異株(四角)の投与量効果曲線を示す。X−座標:Fcポリペチドの濃度、Y−座標:Fcポリペチドに結合したFcRnの百分比。 は実施例1に記載のIV.1.aでのELISAアッセイで得られた野生型Fc(丸)およびS5A_41変異株(四角)の投与量効果曲線を示す。X−座標:Fcポリペチドの濃度、Y−座標:Fcポリペチドに結合したFcRnの百分比。 は天然ヒトIgG1配列の位置216-447(KabatでのEUインデックスに従う)とヒトIgG4(SEQ ID NO:16)、ヒトIgG3(SEQ ID NO:15)およびヒトIgG2(SEQ ID NO:14)の対応配列とのアランメントを示す図。IgG1配列はG1m1,17アロタイプ(SEQ ID NO:12)およびG1m3アロタイプ(SEQ ID NO:13)である。IgG1の「低部ヒンジ-CH2-CH3」領域は位置216から開始する(矢印参照)。 は各種pHで実行したFcRnに対するFc-変異株の結合能を示すためのELISAアッセイの結果を示す図(詳細は実施例2のIV.2を参照)。このヒストグラムは各変異株に対してpH=6(黒棒)、pH=6.5(白棒)またはpH=7.4(灰色棒)で実行したELISAアッセイのOD450nmの値を表す。OD450nm値はFc変異株に結合した固定FcRnの量に関係する。
はFc変異株を含む組換え型IgG1抗体を発現するための発現ベクターの模式的な地図を示す。得られた組換え型IgG1抗体はCD20抗体に対して特異的な結合性を有する。明細書および実施例に記載の突然変異を含む重鎖の恒常部をコードする核酸は、[図8a]に示すように、Apa1とHKCD20-Opti-GAベクター中に存在するAsclクローンサイトとの間に挿入される。 および はそれぞれ非還元条件下および還元条件下でのIgG変異株のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。(1) 野生型Fcから成IgGを表し、(2) Fc−H変異株から成るIgGを表し、(3) C6A_69から成るIgGを表し、(4) C6A_78から成るIgGを表し、(5) T5A_74変異株から成るIgGを表し、(6) C6A_74変異株から成るIgGを表し、(7)C6A_60変異株から成るIgGを表し、(8)C6A_66変異株から成るIgGを表す。 はFcRnに対するIgG変異株の結合性を特徴付けるために実施例2の111.1で行ったELISAアッセイで得られた本発明IgG変異株(「1」)および野生型のIgG変異株(「2」)の投与量効果曲線。X−座標:IgG濃度、Y−座標:IgGに結合したFcRnの百分比。
は本発明のIgG変異株のFcγRlllaに対する親和性を特徴付けるためのELISAアッセイで得られた投与量効果曲線。(1)C6A_66変異株で得られた曲線、(2)Rituximabで得られた曲線、(3)C6A_69;C6A_78;T5A_74;C6A_74;C6A_60変異株および野生型IgGで得られた曲線。 ELISAアッセイは実施例2のIV.1a.に記載の方法で実行した。X−座標:IgGの濃度、Y−座標:IgGに結合したFcγRlllaの百分比。 はJurkat FcRnに対する各種組換え型IgGの結合性を示す図。[図11]は「材料と方法」で説明したJurkat FcRnに対する本発明の各種変異株の結合性またはRitixanを示す。平均蛍光強度(MFI)で表す。 は本発明のIgG変異株に対するADCCアッセイで得られた投与量効果曲線。(1) C6A_66変異株の曲線、(2)Rituximabの曲線、(3)LFB-R603、WT-IgGおよび本発明のIgG変異株(すなわちC6A_69;C6A_78;T5A_74;C6A_74;C6A_60変異株)の曲線。X−座標:IgGの濃度、Y−座標:溶菌の百分比。
以下、本発明をより完全に理解できるようにするために、いくつかの定義をする。以下の定義は文法的に均等なものを含む。
本明細書および特許請求の範囲でFc領域の残基の数の教え方は非特許文献12(Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.、1991)に記載のKabat et al.,のEUインデックスに従った免疫グロブリン重鎖の教え方である。非特許文献12の内容は本明細書の一部を成す。「KabatでのEUインデックス」とはヒトIgG1 EU抗体の残基の数え方である。
「ポリペチド」または「タンパク」とは、少なくとも2つの共有結合で結合したアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペチド、オリゴペプチドおよびペプチドを含む。
「アミノ酸」とは特定の定義された位置に存在する20の天然または類似の非天然のアミノ酸を意味する。天然のアミノ酸は3文字または1文字暗号で略記できる:
Figure 0005770710
「位置」とはタンパクの配列の位置を意味し、Fc領域での位置はKabatでのEUインデックスに従って番号を付ける。
「アミノ酸の変更」とはポリペチドのアミノ酸配列の変化を意味する。この「アミノ酸変更」は「アミノ酸変化」ともよばれ、アミノ酸の置換、挿入および/またはポリペチド配列の欠失を含む。「アミノ酸の置換」または「置換」とは親ポリペチド配列の特定の位置でのアミノ酸を他のアミノ酸と置換することを意味する。例えば、置換N434Sとは位置434でのアスパラギンがセリンと置換した変異ポリペチド、この場合Fc変異株を意味する。「アミノ酸の挿入」または「挿入」とは親ポリペチド配列の特定位置でのアミノ酸の付加を意味する。例えば、挿入G>235-236とは位置235と236の間にグリシンを挿入することを示す。「アミノ酸欠失」または「欠失」とは親ポリペチド配列の特定位置のアミノ酸を取り去ることを意味する。例えば、E294delは位置294でのグルタミン酸の欠失を示す。
例えば下記の突然変異のフォーマットが好ましく使われる:434SまたはN434Sは親アミノ酸が位置434で(すなわちアスパラギンが)セリンと置換することを意味する。
置換の組合せの場合の好ましいフォーマットは以下である:259I/315D/434YまたはV259I/N315D/N434Y。これは変異株中に3つの置換(一つは位置259、一つは位置315、一つは位置434)を意味する。すなわち、親ポリペチドの位置259のアミノ酸すなわちバリンがイソロイシに置換され、親ポリペチドの位置315のアミノ酸すなわちアスパラギンがアスパラギン酸に置換され、親ポリペチドの位置434のアミノ酸すなわちアスパラギンがチロシンに置換されることを意味する
「可変部」とはVκ、Vλおよび/またはκ、λおよび重鎖免疫グロブリン遺伝の遺伝子座を形成するVH遺伝子のいずれかによって実質的にコードされる一つ以上のIg領域を有する免疫グロブリンの領域を意味する。可変領域はコンプレメンタリティ−決定領域(CDR)およびフレームワーク領域(FR)を含む。
「Fc」または「Fc領域」とは第1恒常免疫グロブリン領域を除く抗体の恒常部から成るポリペチドを意味する。従って、FcはIgA、IgD、IgGの最後の2つの恒常部の免疫グロブリン領域、IgEおよびIgMの最後の3つの恒常部の免疫グロブリン領域、これら領域への可撓性ヒンジN末端を意味する。IgAおよびIgMの場合、FcはJ鎖を含むことができる。IgGの場合、Fcは免疫グロブリン・領域Cγ2およびCγ3から成る(それぞれCH2およびCH3領域であるCγ2、Cγ3、IgGで)およびCgammal(Cγ1)とCγ2(Cγ2)との間の低ヒンジ領域を含む。ヒトIgG1重鎖Fc領域はそのカルボキシル末端に残基C226を含むと定義されるが、数え方はKabatでのEUインデックスに従う。ヒトIgG1では、低ヒンジはKabatでのEUインデックスに従った位置226-236を示し、CH2領域は位置237-340を示し、CH3はと位置341-447を示す。他の免疫グロブリンの対応するFc領域は配列アランメントによって同定できる。
Fcは単離でのこの領域を示すか、以下で説明するように、Fcポリペチドの内容でのこの領域を示す。「Fcポリペチド」とはFc領域の全部または一部のポリペチドを意味する。Fcポリペチドには抗体、Fc融合体、単離されたFc、Fc-コンジュゲートおよびFc断片を含むが、これらに限定されるものではない。
「抗体」という用語はここで最も広い意味で使われる。「抗体」は少なくとも(i) Fc領域および(ii) 免疫グロブリンの可変部に由来する結合ポリペチド領域を含む任意のポリペチドを意味する。この結合ポリペチド領域は一つの所定標的抗原または一群の標的抗原に特異的に結合できる。免疫グロブリンの可変部から生じる結合ポリペチド領域は一つ以上CDRを有する。抗体には完全長の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、多くの特異抗体、少なくとも一つの可変部を有するFc-融合タンパク、合成の抗体(ここでは「ミメティック抗体」ともいう)、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、抗体-融合タンパク、抗体複合体および各々の断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。
「完全長の抗体」または「免疫グロブリン」とは抗体の天然の生物構造を構成する構造を意味し、変数領域および恒常領域を含む。「完全長の抗体」はモノクローナル完全長抗体、野性型完全長抗体、キメラの完全長抗体、ヒト化完全長抗体を含むがこれらに限定されるものではない。
ヒトおよびハツカネズミを含む大部分の哺乳類では、完全長の抗体の構造は一般にテトラマである。このテトラマは2つの全く同じ一組のポリペプチド鎖から成り、その1つの「軽」鎖(一般に約25kDaの分子量を有する)であり、その1つは「重」鎖(一般に約50-70kDaの分子量を有する)である。いくらかの哺乳類、例えばラクダおよびラマでは、完全長の抗体が2つの重鎖だけから成り、各重鎖はFc領域に付いた変数領域から成る。
各連鎖のアミノ末端部分は主として抗原認識に関与する少なくとも約100〜110のアミノ酸の可変部を含む。可変部では3つの輪状構造が重鎖および軽鎖の各々のV領域と集まり、抗原結合部位を形成する。輪状構造の各々をコンプレメンタリティ-決定領域という(以下に「CDR」という)。ここでのアミノ酸配列の変異が最も重大である。
各鎖のカルボキシ末端部分は主としてエフェクタ機能に関与する恒常部を敵意する。Kabat et alは重鎖および軽鎖の可変部の多くの一次配列を集めてある。配列の保護度に基づいてそれらはCDRおよびフレーム・ワークへの個体一次配列を分類して、リストを作った(非特許文献21)。この文献の内容は本発明の一部を成す。
E. A. Kabat et al. Sequences of Immunological Interest, 5th edition, NIH publication, No. 91 -3242
ヒト免疫グロブリンの場合、軽鎖はカッパ軽鎖およびラムダ軽鎖に分類される。重鎖はミュー、デルタ、ガンマ、αまたはエプシロンに分類され、それぞれIM、ID、IgG、IAおよびIEとして抗体のアイソタイプを定義する。IgG1は複数のサブクラスを有し、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含むが、これらに限定されない。IgMもサブクラスを有し、IgMIおよびlgM2があるが、これらに限定されない。「アイソタイプ」とは恒常部の化学特性および抗原性特性によって定義される免疫グロブリンのサブクラスを意味する。公知のヒト免疫グロブリン・アイソタイプはIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAI、lgA2、IgMI、lgM2、lgDおよびlgEである。
「IgG」は認識された免疫グロブリン・ガンマ遺伝子によって実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペチドを意味する。ヒトではIgGはサブクラスまたはアイソタイプIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4から成る。ハツカネズミではIgGはIgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3から成る。完全長のIgGはテトラマで、2対の全く同じ2つの免疫グロブリン鎖から成り、1つの軽鎖と1つの重鎖を有する各一組から成り、各軽鎖は免疫グロブリン・領域VLおよびCLから成り、各重鎖は免疫グロブリン領域VH、Cγ1(CH1とも呼ばれる)、Cγ2(CH2とも呼ばれる)およびCγ3(CH3とも呼ばれる)から成る。ヒトIgG1では、「CH1」は位置118-220、CH2領域がは位置237-340、CH3領域は位置341−447にある(KabatでのEUインデックスに従う)。IgG 重鎖もIgGLの場合、位置221-236と称するヒンジ領域にある。
「親ポリペチド」または「ポリペチド親」とは変異株を発生するために修正される未変更のポリペチドを意味する。この親ポリペチドは天然由来のポリペチド、天然由来のポリペチドの変異株、天然由来のポリペチドの設計バージョンまたは合成ポリペチドにすることができる。親ポリペチドはそれをコードするポリペチド自体またはアミノ酸配列を表すこともできる。本発明での親ポリペチドはFc領域は野生型Fc領域、その断片およびそのミュータントから成る群の中から選択される。従って、親ポリペチドは野生型Fc領域と比べてそのFc領域中に既存のアミノ酸突然変異(すなわちFcミュータント)を含むことができる。
親ポリペチドは抗体、免疫グロブリン、Fc合着ポリペチド、Fc共役であるのが好ましいが、これらに限定されるものではない。従って、「親免疫グロブリン」とは変異体の免疫グロブリンを生じるように修正された免疫グロブリン・ポリペチドを意味し、「親抗体」とは変異体の抗体を生じるように修正された抗体を意味する。「親抗体」には公知の商業的な組み換え抗体も含まれる点に留意する必要がある。
「少なくとも一つの」という用語は「一つ以上の」と同じ意味である。
「変異株ポリペチド」、「ポリペチド変異株」または「変異株」とは少なくとも一つのアミノ酸突然変異によって親ポリペチド配列のそれと異なるポリペチド配列をを有するものを意味する。
変異株はFc変異株、Fcポリペチド変異株、タンパク変異株、抗体変異株、免疫グロブリン変異株、IgG変異株にすることができるが、これらに限定されるものではない。
「免疫グロブリン変異株」または「変異株免疫グロブリン」とは少なくとも一つのアミノ酸突然変異によって親免疫グロブリン配列のそれと異なる免疫グロブリン配列となったものを意味する。親ポリペチドは天然由来の野性-型(WT)ポリペチドまたはWTポリペチドの修正バージョンでもよい。
重要な親ポリペチドは上記定義のFc領域を有するポリペチドである。本発明の変異株はFc領域の少なくとも一つのアミノ酸突然変異によって親ポリペチド配列のそれと異なるポリペチド配列を有するのが好ましい。従って上記変異株はFc変異株から成る。
従って、「Fc変異株」または「変異株Fc」とは少なくとも一つのアミノ酸突然変異によって親Fc配列のそれと異なるFc配列を意味する。このFc変異株は単離されたFc領域およびそ断片にすることができ、また、抗体はFc合着およびその断片にすることができるが、これらに限定されるものではない。
「タンパク変異株」または「変異株タンパク」とは少なくとも一つのアミノ酸突然変異によって親タンパクと異なるタンパクを意味する。「抗体変異株」または「変異株抗体」とは少なくとも一つのアミノ酸突然変異によって親抗体と異なる抗体を意味する。「IgG変異株」または「変異株IgG」とは少なくとも一つのアミノ酸突然変異によって親IgGと異なる抗体を意味する。変異株は親ポリペチドと比較して少なくとも一つのアミノ酸突然変異を有し、例えば約1〜約45のアミノ酸突然変異、好ましくは約1〜約20のアミノ酸突然変異、より好ましくは約1〜約10のアミノ酸突然変異を有するのが好ましい。
変異配列はその親ポリペチド配列と少なくとも約80%の一致性を有し、より好ましくは少なくとも約90%の一致性を有するのが好ましい。
少なくとも約90%アミノ酸一致性を有するポリペチドには、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または少なくとも99.5%のアミノ酸一致性を有するポリペチドが含まれる。
2つのアミノ酸配列の一致性のパーセントを決定するためには配列を最適比較のために整列させる。例えば、最適のアランメントのためにギャップ期を第一および第二のアミノ酸配列の一方または両方に導入でき、非相同配列は比較のためには無視できる。最適比較のためにの2つのアミノ酸配列の一致性パーセントは下記パラメータでCLUSTAL W(バージョン1.82)で実行できる:
(1) CPU MODE = ClustalW mp ;
(2) ALIGNMENT = full;
(3) OUTPUT FORMAT = aln w/numbers;
(4) OUTPUT ORDER = aligned;
(5) COLOR ALIGNMENT = no;
(6) KTUP (word size) = default;
(7) WINDOW LENGTH = default ;
(8) SCORE TYPE = percent ;
(9) TOPDIAG = default ;
(10) PAIRGAP = default;
(11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = none;
(12) MATRIX = default;
(13) GAP OPEN = default;
(14) END GAPS = default;
(15) GAP EXTENSION = default;
(16) GAP DISTANCES = default;
(17) TREE TYPE = cladogram;
(18) TREE GRAP DISTANCES = hide
「野生型またはWT」とは天然のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味し、対立遺伝子の(allelic)変異を含む。WTタンパク、ポリペチド、抗体、免疫グロブリン、IgG、その他は修正されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
「FcRn」または「新生Fcレセプター」はIgG抗体Fc領域を結合し、少なくともFCRN遺伝子によって、部分的にコードされるタンパクを意味する。FcRnはヒト、ハツカネズミ、ラット、ウサギおよびサルを含む任意のものからのものにすることができる。公知のように、機能性FcRnタンパクは2つのポリペチド、大抵は重鎖および軽鎖から成る。軽鎖はβ-2-ミクログロブリンであり、重鎖はFCRN遺伝子によってコードされる。特に断らない限り、FcRnまたはFcRnタンパクはβ-2ミクログロブリンを有するα鎖の錯体を言う。ヒトではFcRnをコードする遺伝子はFCGRTと呼ばれる。
「増加した結合性FcRn」とはインビボまたはインビトロで親ポリペチドと比較してFcRnに対する本発明の変異株が結合能を増加することを意味する。FcRnを結合するポリペチド変異株の能力はELISA(実施例1のIV.1.a)またはSPR(実施例1のIV.I.b)でインビトロで評価できる。FcRnに対する改良された結合性を最も有する変異株はインビトロで改良された漿液保持性を有し、従って半減期が増加する。
Fc領域の保持をインビトロで増やすに、FcRnへの結合能の増加が約pH 6で起り、約pH 7.4で低い親和性を維持する必要がある。
研究中ではあるが、pH 6でのFcRnへの結合でエンドソーム中にFc領域の隔離をさせ、Fc領域はインビボで長い半減期を有すると考えられている(非特許文献22参照)。
Ghetie and Ward, 1997 Immunol Today. 18(12):592-598
エンドソー区画はFc領域を細胞表面へリサイクルさせる。この区画が細胞外空間に開放されると、より高いpH(約7.4)で血液中へ戻り、Fc領域の開放を誘発する。従って、インビボでFc領域の半減期を増やすFc領域のアミノ酸突然変異は、理想的にはより低いpHでFcRn結合性を増加させ、より高いpHでFc領域を開放するものである。
「インビボ半減期」という用語は所定動物の循環に重要なポリペチドの生物学的半減期を意味し、動物の循環および/または他の組織からの循環に中に存在する半分の量が浄化されるのに必要な時間で表される。
本発明はFcRnに対するFc領域の結合能を増やすFc領域のアミノ酸突然変異を同定することをベースにしたものである。重要なアミノ酸突然変異はランダム突然変異生成によって2つのFc変異株ライブラリを作り、その変異株のFcRnに対する結合性を測定することで決定される。
従って、本発明は親ポリペチドと比べてFcRnへの結合性増加を表するFc領域を有する親ポリペチドの変異株に関するものである。
本発明の親ポリペチドはFc領域から成るポリペチドである。このポリペチドは単一ポリペプチド鎖または共有結合ではなく一緒にリンクした複数のポリペプチド鎖から成ることができる。親ポリペチドは抗体、Fc融合タンパク、Fc共役、Fc由来のポリペチド、単離されたFcおよびその断片を含むが、これらに限定されるものではない。従って、親ポリペチドは天然由来のポリペチド、天然由来のポリペチドの変異株、合成ポリペチドまたは非タンパク性断片から成るポリペチドの設計バージョンにすることができる。天然由来のポリペチドの設計バージョンは天然由来の遺伝子によってコードされないポリペチドである。例えば、設計されたポリペチドはキメラ抗体またはヒト化抗体にできる。
親ポリペチドのFc領域はの野性-型Fc領域のIgG、その断片およびそミュータントから成る群の中から選択するのが好ましい。IgGのFc領域は「低ヒンジ」-CH2-CH3領域(IgGではCH2およびCH3はCγ2およびCγ3領域とも呼ばれる)に対応する。野生型ヒトIgG1の「低ヒンジ」-CH2-CH3領域の配列はSEQ ID番号:1の配列である。ヒトIgG1では、低ヒンジは位置226-236、CH2領域は位置237-340、CH3領域は位置341-447である。これらの位置はKabatでのEUインデックスに従う。他のIgGサブクラスの類似領域はヒトIgG1のそれとIgGサブクラスの重鎖または重鎖断片のアミノ酸配列のアランメントで決定できる。
Fc領域の断片は野性-型Fc領域由来、好ましくは野生型IgGの「より低いヒンジ-CH2-CH3」領域由来の一つ以上のポリペチドを有するポリペチドと定義される。この断片のFcRnに対する解離定数は実施例1のIV.1に記載のSPRアッセイで1microM以下である。
上記のように、親ポリペチドは野生型Fcミュータントから成ることができる。
例えば、Fc領域は既存のアミノ酸突然変異、例えば付加、挿入および/または置換を有することができる。ただし、このミュータントはSPRアッセイに従った解離定数が実施例1のIV.1に記載のSPRアッセイで1microM以下でなければならならず且つ野性-型Fc領域ではない。
「変異株ポリペチド」または「変異株」とは少なくとも一つのアミノ酸突然変異によって親ポリペチドのそれと異なるポリペチド配列を意味する。
本発明の変異ポリペチドは対応する親ポリペチドと比べてFcRnに対する増加した結合性を示す。換言すれば、変異株の親和性は親ポリペチドよりFcRn対する結合性が高い。そうした変異株が本発明の最適化された変異株である。
このポリペチドのFcRnに対する親和性は従来の周知方法で評価できる。例えば、当業者は実施例1のIV.I .bに示すように、表面プラスモン共鳴(Surface Plasmon Resonance、SPR)実験を使用して解離定数(Kd)を求めることができる。変異株のKdが対応する親のそれより1.1倍以下であれば、その変異株は本発明の最適化された変異株である。
変形例では、当業者は抵当なELISAアッセイを実行できる。このELISAアッセイによって実施例 1に示すように、変異株のFcRnに対する結合強度と親のそれとを比較することができる。変異株および親ポリペチドで検出される特定信号を比較する。この特定信号は親ポリペチドのそれより少なくとも1.2-倍強く、より好ましくは少なくとも3.2-倍強い場合、その変異株は本発明の最適化された変異株である(例えば、少なくともダブルアミノ酸突然変異T250Q/M428Lを有するFc変異株と同程度)。
適当なELISAアッセイは本出願の実施例1に示してある。結合能は完全長のポリペチドを評価することによって(実施例 2のIII参照)または単離されたFc領域を評価すること(実施例 1のIV参照)で一義的に決定できる。
本発明で重要なポリペチド変異株は親ポリペチドと比べて少なくとも一つのアミノ酸突然変異をそのFc領域に含む。このアミノ酸突然変異はアミノ酸の挿入、欠失および置換から成る群の中から選択される。
本発明社は、親ポリペチドと比べて、FcRnに対する結合性を増加させたポリペチド変異株を得るためには、少なくとも一つのアミノ酸突然変異が親ポリペチドと比較して、Fc領域の226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、311、315,317、320、322、325、327、330、332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361、362、369、370、371、375、378、380、382、383、384、385、386、387、389、390、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、404、408、411、412、414、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444、445、446および447から成る群の中から選択されるアミノ酸位置で導入されなければならないことを示した。ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
ここで、「KabatでのEUインデックス」とはヒトIgG1EU抗体の残基の数得方を言う。例えば、他のFc領域での類似位置はそのFc領Fc領域をSEQ ID 番号:1のポリペチドから成るヒトIgG1の重鎖断片とアミノ酸配列アランメントして決定できる。例として、図6にヒトIgG1、IgG2、IgG3および「低ヒンジ-CH2-CH3」領域から成るIgG4 重鎖断片の配列アランメントを示した。
「少なくとも一つのアミノ酸突然変異」とは「一つ以上の突然変異」を意味する。Fc領域に20を超えるアミノ酸の突然変異を導入するその生物学的活性度は著しく悪くすると考えられる。従って、ポリペチド変異株は上記でリストした位置の好ましくは1〜20、より好ましくは1〜10のアミノ酸突然変異を有するのが好ましい。「1〜20のアミノ酸突然変異」には1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、そして、20のアミノ酸突然変異を含む。この変異株配列はその親ポリペチド配列と少なく約90%のポリペチド一致性を有するのが好ましい。
ここで少なくとも約90%アミノ酸一致性を有するとは、アミノ酸が参照ポリペチドと少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または99.5%のアミノ酸一致性を有することを含む。
一般にFcRnに対して最も高い結合能を示す本発明のFc変異株は複数のアミノ酸突然変異を有する。実施例IIに記載のファージELISAアッセイから得られる結果は、複数のアミノ酸突然変異を有する最適化された変異株野生型Fcより約3.2-倍から30-倍までの強い特定信号を有することを示し(表2および表3を参照)、単一の先端アミノ酸突然変異を有する変異株は野生型Fcより約1.2-倍から3.5-倍までの強い信号を示す(表1参照)。表3に示すように、二重のアミノ酸突然変異T250Q/M428Lを有するFc変異株とよぶ最適化された変異株の信号はFc−Hのそれより約1-倍から約10-倍強い。
特定実施例では変異株は226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、311、315,317、320、322、325、327、330、332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361、362、369、370、371、375、378、380、382、383(384)385、386、387、389、390、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、404、408、411、412、414、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444、445、446およ447から成るリストの中から選択される少なくとも2つのアミノ酸突然変異を親ポリペチドと比較したFc領域中に有する。Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
[表5]で説明するように、FcRnに対して最も高い結合能を示すFc変異株は3〜6のアミノ酸突然変異を有する。
従って、更なる実施例では、本発明の変異ポリペチドは226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、31 1、315,317、320、322、325、327、330、332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361、362、369、370、371、375、378、380、382、383、384、385、386、387、389、390、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、404、408、41 1、412、414、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444、445、446、447から成る群の中から選択されるアミノ酸位置で親ポリペチドと比較してFc領域中に3〜6のアミノ酸突然変異を有する。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
アミノ酸突然変異は、好ましくは欠失および置換の群の中から選択される。
上記リストのいくつかのアミノ酸位置、すなわち226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421および434にはキーとなる重要な位置である。換言すれば、FcRnに高い結合能を示すFc変異株は少なくとも一つのアミノ酸突然変異を上記アミノ酸位置に有する。
一つの実施例での本発明ポリペチド変異株は親ポリペチドと比較してFc領域中の226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421および434から成る群の中から選択されるアミノ酸位置に少なくとも一つのアミノ酸突然変異を有する。Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
上記のキー位置の中でFcRnに最も強い結合を示すFc変異株のシークエンシングはアミノ酸位置230、264、307、315、330、378および434が最も多く変化した位置であることが示された。従って、本発明の他の実施例では、少なくとも一つの突然変異は親ポリペチドと比べてFc領域中の264、315、378および434、より好ましくは230、264、307、315、330、378および434から成る群の中から選択される1つの位置で起こる。Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
既に述べたように、少なくとも2つのアミノ酸突然変異の導入でFc変異株のFcRnへの結合能はFc親と比べて顕著に改良できる。
従って、変形実施例では、ポリペチド変異株は少なくとも2つのアミノ酸突然変異を有し、この少なくとも2つのアミノ酸突然変異は親ポリペチドと比較したFc領域中の下記にある:
(i) 226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421および434から成る群の中から選択されるアミノ酸位置での1つの突然変異と、
(ii) 226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、311、315、317、320、322、325、327、330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361 , 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389,390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411, 412,414, 415, 416, 418, 419, 420, 421 , 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443、444、445、446、447から成る群の中から選択されるアミノ酸位置での少なくとも一つの突然変異。ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)と同じアミノ酸位置では起らない。
前記例外条件から、例えば、アミノ酸突然変異(i)が位置434で起こる場合、(ii)に記載のリストの中の位置434を除く任意の位置で少なくとも一つのアミノ酸突然変異(ii)が起こる。
本発明の他の実施例では、ポリペチド変異株は少なくとも2つのアミノ酸突然変異を有する、その少なくとも2つのアミノ酸突然変異はFc領域中の下記から成る:
(i) 264、315、378および434から成っている群の中から選択されるアミノ酸位置での1つの突然変異と、
(ii) 226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、31 1、315,317、320、322、325、327、330、332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361、362、369、370、371、375、378、380、382、383、384、385、386、387、389、390、392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 , 403, 404, 408, 411 , 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421 , 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444、445、446および447から成る群の中から選択されるアミノ酸位置での少なくとも一つの突然変異。
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatに記載のEUインデックスと同じである、ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)と同じアミノ酸位置では起こらない)
追加の実施例では、前記変異株は少なくとも2つのアミノ酸突然変異を有するし、その少なくとも2つのアミノ酸突然変異はFc領域中の下記から成る:
(i) 264、315、378および434から成っている群の中から選択される位置での1つのアミノ酸突然変異と
(ii) 226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421および434から成っている群の中から選択される位置での少なくとも一つのアミノ酸突然変異、
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatに記載のEUインデックスと同じである、ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)と同じアミノ酸位置では起こらない)
他の追加の実施例の前記変異株はFc領域中に下記から成る少なくとも2つのアミノ酸突然変異を有する:
(i) 378および434から成っている群の中から選択される位置での1つのアミノ酸突然変異と
(ii) 226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421および434から成っている群の中から選択される位置での少なくとも一つのアミノ酸突然変異、
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatに記載のEUインデックスと同じである、ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)と同じアミノ酸位置では起こらない)
本発明の変形実施例では、ポリペチド変異株は少なくとも3つのアミノ酸突然変異をそのFc領域中に含む。この少なくとも3つのアミノ酸突然変異はFc領域中の下記から成ることができる:
(i) 226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421および434から成っている群の中から選択される2つのアミノ酸位置での2つの突然変異と(ii) 226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301 , 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311 , 315, 317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359,360,
361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389, 390,
392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411 , 412, 414、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444、445、446および447から成る群の中から選択されるアミノ酸位置での少なくとも一つの突然変異。
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatに記載のEUインデックスと同じである、ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)と同じアミノ酸位置では起こらない)
変形実施例では、ポリペチド変異株は少なくとも3つのアミノ酸突然変異を有する、この少なくとも3つのアミノ酸突然変異はFc領域中の下記から成る:
(i) 264、315、378および434から成っている群の中から選択されるアミノ酸位置での1つの突然変異;
(ii) 226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421および434から成っている群の中から選択されるアミノ酸位置での1つの突然変異;
(iii) 227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、31 1、315,317、320、322、325、327、330、332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361、362、369、370、371、375、378、380、382、383、384、385、386、387、389、390、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、404、408、411、412、414、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444、445、446および447から成っている群の中から選択されるアミノ酸位置での少なくとも一つの突然変異、
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatに記載のEUインデックスと同じである、ただし、突然変異(i)、突然変異(ii)および突然変異(iii)が同じアミノ酸位置で同時に起こらない)
本発明の他の実施例では、ポリペチド変異株は少なくとも3つのアミノ酸突然変異を有し、その少なくとも3つのアミノ酸突然変異Fc領域中の下記から成る:
(i) 378および434から成っている群の中から選択されるアミノ酸位置での1つの突然変異;
(ii) 226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421および434の群の中から選択されるアミノ酸位置での1つの突然変異;
(iii) 227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259, 264,
265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291 , 292, 294, 297, 298, 299, 301 , 302, 303, 305, 307, 308, 309, 31 1 , 315,317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371 , 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 , 403, 404, 408, 411 , 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421 , 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444、445、446および447から成る群の中から選択されるアミノ酸位置での少なくとも一つの突然変異。
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatに記載のEUインデックスと同じである、ただし、突然変異(i)、突然変異(ii)および突然変異(iii)が同じアミノ酸位置で同時に起こらない)
本発明の上記全ての実施例で、アミノ酸突然変異はアミノ酸の置換および欠失から成る群の中から選択されるのが好ましい。
本発明のさらに他の対照は、Fc領域中に下記から成る群の中から選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異を有する、親ポリペチドと比べてFcRnに対する結合正が増加した親ポリペチドの変異株にある:
230T、226G、226Y、227S、227L、228R、228L、230S、230L、230A、230Q、231T、231V、233D、234R、239A、241L、241Y、241R、243L、246R、250A、252L、256N、259I、264A、264E、264M、265G、265N、267N、267R、269D、269G、270N、270E、276S、284L、285Y、288R、289I、290R、290E、291S、291Q、292W、294del、297D、298G1、298N1、299M1、299A1、299K1、301C1、302A1、303A1、3031、305A、307P、307A、307N、3081、309P、311R、315D、317R、320T、320E、322R、325S、327V、327T、330V、330T、332V、334E、334R、335A、338R、340E、342R、342E、342K、343S、345Q、345G、347R、350A、352S、354P、355Q、355G、356N、359A、360N、360R、361D、361S、362R、362E、369A、370R、371D、375A、375G、378V、378T、378S、380Q、382V、382G、383R、383N、384I、384T、385R、386R、386K、387S、387T、389T、389K、389R、390S、401G、392E、392R、393N、394A、395A、395S、396S、396L、397A、397M、398P、399N、400P、401のA 403T、404L、408T、411A、412A、414R、415D、415N、416K、416G、418R、418K、418E、419H、420R、421T、421S、421D、422A、424L、426T、428L、433R、433P、434Y、434S、434H、438R、439R、440R、440N、443R、444F、444P、445S、446A、447Eおよび447N。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
変形実施例の前記ポリペチドは親ポリペチドと比較してFc領域中下記の群の中から選択される少なくとも一つの突然変異を有する:
226G、227L、230S、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、259I、264E、265G、267R、290E、294del、303A、305A、307P、307A、308I、315D、322R、325S、327V、330V、342R、347R、352S、361D、362R、362E、370R、378V、378T、382V、383N、386R、386K、387T、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N、421T、416K1、426T、428L、433R、434Y、434Sおよび439R。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
上記変異株は親ポリペチドと比べて上記リストから選択される1〜20、好ましくは1〜10のアミノ酸突然変異を有するのが好ましい。既に述べたように、「1〜20の突然変異」は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19および20の突然変異を意味する。
他の実施例の上記変異株は親ポリペチドと比較してFc領域中に下記の群の中から選択される3〜6のアミノ酸突然変異を有する:
226G、226Y、227S、227L、228R、228L、230S、230T、230L、230A、230Q、231T、231V、233D、234R、239A、241L、241Y、241R、243L、246R、250A、252L、256N、259I、264A、264E、264M、265G、265N、267N、267R、269D、269G、270N、270E、276S、284L、285Y、288R、289I、290R、290E、291S、291Q、292W、294del、297D、298G、298N、299M、299A、299K、301C、302A、303A、303I、305A、307P、307A、307N、308I、309P、311R、315D、317R、320T、320E、322R、325S、327V、327T、330V、330T、332V、334E、334R、335A、338R、340E、342R、342E、342K、343S、345Q、345G、347R、350A、352S、354P、355Q、355G、356N、359A、360N、360R、361D、361S、362R、362E、369A、370R、371D、375A、375G、378V、378T、378S、380Q、382V、382G、383R、383N、3841、384T、385R、386R、386K、387S、387T、389T、389K、389R、390S、392E、392R、393N1、394A1、395A1、395S1、396S1、396L1、397A1、397M1、398P1、399N1、400P1、401A1、401G1、403T、404L、408T、411A1、412A、414R、415D、415N、416K、416G、418R、418K、418E、419H、420R、421T、421S、421D、422A、424L、426T、428L、433R、433P、434Y、434S、434H、438R、439R、440R、440N、443R、444F、444P、445S、446A、447Eおよび447N。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
変形実施例の上記ポリペチドは親ポリペチドと比較してFc領域中に下記の群の中から選択される3〜6のアミノ酸突然変異を有する:
226G、227L、230S、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、259I、264E、265G、267R、290E、294del、303A、305A、307P、307A、308I、315D、322R、325S、327V、330V、342R、347R、352S、361D、362R、362E、370R、378V、378T、382V、383N、386R、386K、387T、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N、416K1、421T、426T、428L、433R、434Y、434Sおよび439R。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
上記のリスト中のいくらかのアミノ酸突然変異は重要な突然変異である。換言すればFcRnに高い結合能を示すFc変異株はこの重要な突然変異から選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異を有する。
従って、上記ポリペチド変異株は親ポリペチドと比較してFc領域中に226G、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、342R、362R、362E、378V、378T、382V、389T、389K、396L、397M、421T、434Yおよび434Sから成っている群の中から選択される少なくとも一つの突然変異を有する。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
他の実施例の上記ポリペチド変異株は、親ポリペチドと比較してFc領域中に315D、264E、378V、378T、434Yおよび434Sから成る群の中から選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異から成る。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
さらに他の実施例の上記ポリペチド変異株は親ポリペチドと比較してFc領域中に378V、378T、434Yおよび434Sから成る群の中から選択される少なくとも一つアミノ酸突然変異を有する。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
既に述べたように、少なくとも2つのアミノ酸突然変異を導入することで親と比べてFcRnに対して結合正が顕著に改良されるFc変異株にすることができる。上記突然変異の少なくとも1つはこの重要な突然変異から選択できる。すなわち342R、226G、230S代、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、362R、362E、378V、378T、382V、389T、389K、396L、397M、421T、434Yおよび434Sから成る群の中から選択される。
変形実施例では上記ポリペチド変異株は親ポリペチドと比較してFc領域中の少なくとも2つのアミノ酸突然変異を有し、その少なくとも2つの突然変異は下記アミノ酸位置から成る:
(i) 226G、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、342R、362R、362E、378V、378T、382V、389T、389K、396L、397M、421T、434Yおよび434Sから成る群の中から選択される1つの突然変異と、
(ii) 227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、31 1、315,317、320、322、325、327、330、332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361、362、369、370、371、375、378、380、382、383、384、385、386、387、389、390、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、404、408、41 1、412、414、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444、445、446および447から成る群の中から選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異。
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)とが同じアミノ酸位置では起こらない)
さらに他の実施例では、上記変異株が少なくとも2つのアミノ酸突然変異から成り、この少なくとも2つの突然変異はFc領域中の下記から成る:
(i) 378V、378T、434Yおよび434Sから成る群の中から選択される1つのアミノ酸突然変異と、
(ii) 226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421および434から成っている群の中から選択されるアミノ酸位置での少なくとも一つのアミノ酸突然変異、
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)とが同じアミノ酸位置では起こらない)
他の実施例では上記変異株が少なくとも2つのアミノ酸突然変異から成り、その少なくとも2つのアミノ酸突然変異は下記から成る:
(i) 378V、378T、434Yおよび434Sから選択される1つのアミノ酸突然変異と、
(ii) 226G、230S代、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、342R、362R、362E、378V、378T、382V、389T、389K、396L、397M、421T、434Yおよび434S、より好ましくは226G、230S、230T、230L、241Lから、264E、307P、315D、330V、362R、378V、378T、389T、389K、434Yおよび434Sから選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異。
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)とが同じアミノ酸位置では起こらない)
従って、本発明のさらに他の対照は、親ポリペチドと比較してFcRnに対する結合正が増加した、Fc領域中に少なくとも一つのアミノ酸突然変異の組合せを有する親ポリペチドの変異株にある。この突然変異の少なくとも一つの組合せはFc領域中の下記の群の中から選択される:
226G/330V、230L/264E、230L/378V、230S/315D、230S/434Y、230T/378V、241L/434S、250A/434Y、264E/378T、305A/315D、305A/330V、305A/434Y、307P/434Y、315D/389T、330V/382V、330V/389T、378V/421T、389K/434Y、389T/434Y、396L/434S、230T/264E、230T/315D、230T/434S、230T/434Y、241L/307P、264E/307P、264E/396L、315D/362R、315D/382V、362R/434Y、378V/434Y、382V/434Y、226G/315D、226G/434Y、241L/378V、307P/378V、241L/264E、378V/434S、264E/378V、264E/434S、315D/330V、330V/434Yおよび315D/434Y。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
上記変異株は親ポリペチドと比較してFc領域中に下記の群の中から選択される少なくとも一つの突然変異をさらに含むことができる:227S、226G、226Y、227L、228R、228L、230S、230T、230L、230A、230Q、231T、231V、233D、234R、239A、241L、241Y、241R、243L、246R、250A、252L、256N、259I、264A、264E、264M、265G、265N、267N、267R、269D、269G、270N、270E、276S、284L、285Y、288R、289I、290R、290E、291S、291Q、292W、294del、297D、298G、298N、299M、299A、299K、301C、315D、302A、303A、303I、305A、307P、307A、307N、308I、309P、311R、317R、320T、320E、322R、325S、327V、327T、330V、330T、332V、334E、334R、335A、338R、340E、342R、342E、342K、343S、345Q、345G、347R、350A、352S、354P、355Q、355G、356N、359A、360N、360R、361D、361S、362R、362E、369A、370R、371D、375A、375G、378V、378T、378S、380Q、382V、382G、383R、383N、384I、384T、385R、386R、386K、387S、387T、389T、389K、389R、390S、392E、401G、392R、393N、394A、395A、395S、396S、396L、397A、397M、398P、399N、400P、401A 403T、404L、408T、411A、412A、414R、415D、415N、416K、416G、418K、418R 418E、419H、420R、421T、421S、421D、422A、424L、426T、428L、433R、433P、434Y、434S、434H、438R、439R、440R、440N、443R、444F、444P、445S、446A、447Eおよび447N。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
本発明の他の実施例では、本発明変異株は親ポリペチドと比較してFc領域中に以下を有する:
(i) 下記の群の中から選択されるアミノ酸突然変異の少なくとも一つの組合せ:226G/330V、230L/264E、230L/378V、230S/315D、230S/434Y、230T/378V、241L/434S、250A/434Y、264E/378T、305A/315D、305A/330V、305A/434Y、307P/434Y、315D/389T、330V/382V、330V/389T、378V/421T、389K/434Y、389T/434Y、396L/434S、230T/264E、230T/315D、230T/434S、230T/434Y、241L/307P、264E/307P、264E/396L、315D/362R、315D/382V、362R/434Y、378V/434Y、382V/434Y、226G/315D、226G/434Y、241L/378V、307P/378V、241L/264E、378V/434S、264E/378V、264E/434S、315D/330V、330V/434Yおよび315D/434Yと、
(ii) 226G、227L、228L、228R 230S代、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、259I, 264E、265G、267R、290E、294del、303A、305A、307P、307A、308I、315D、322R、325S1 327V1 330V1 342R1 347R1 352S1 361のD1 362R1 362E1 370R1 378V1 378T1 382V、383N、386R、386K、387T、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N1、416K1、421T、426T、428L、433R、434Y、434Sおよび439Rから成る群の中から選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異。
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)とが同じアミノ酸位置では起こらない)
他の実施例での上記変異株は250A/434Y、307P/434Y、230T/434S、264E/396L、378V/434Y、378V/434S、264E/378V、264E/434S、315D/330Vおよび315D/434Yから成る群の中から選択されるアミノ酸突然変異の少なくとも一つの組合せをFc領域中に有する。Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
上記変異株は親ポリペチドと比較してFc領域中に下記の群の中から選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異を有する:230T、226G、226Y、227S、227L、228R、228L、230S、230L、230A、230Q、231T、231V、233D、234R、239A、241L、241Y、241R、243L、246R、250A、252L、256N、259I、264A、264E、264M、265G、265N、267N、267R、269D、269G、270N、270E、276S、284L、285Y、288R、289I、290R、290E、291S、291Q、292W、294del、297D、298G、298N、299M、299A、299K、301C、315D、302A、303A、303I、305A、307P、307A、307N、308I、309P、311R、317R、320T、320E、322R、325S、327V、327T、330V、330T、332V、334E、334R、335A、338R、340E、342R、342E、342K、343S、345Q、345G、347R、350A、352S、354P、355Q、355G、356N、359A、360N、360R、361のD、361S、362R、362E、369A、370R、371D、375A、375G、378V、378T、378S、380Q、382V、382G、383R、383N、384I、384T、385R、386R、386K、387S、387T、389T、389K、389R、390S、392E、392R、393N、394A、395A、395S、396S、396L、397A、397M、398P、399N、400P、401A、401G、403T、404L、408T、1A 41、412A、414R、415D、415N、416K、416G、418R、418K、418E、419H、420R、421T、421S、421のD、422A、424L、426T、428L、433R、433P、434Y、434S、434H、438R、439R、440R、440N、443R、444F、444P、445S、446A、447Eおよび447N。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
他の実施例では本発明の変異株は親ポリペチドと比較してFc領域中に下記を有する:(i) 下記の群の中から選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異の組合せ:
250A/434Y、307P/434Y、230T/434S、264E/396L、378V/434Y、378V/434S、264E/378V、264E/434S、315D/330Vおよび315D/434Yと、
(ii) 226G、227L、228L、228R、230S代、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、259I、264E、265G、267R、290E、294del、303A、305A、307P、307A、308I、315D、322R、325S、327V、330V、342R、347R、352S、361D、362R、362E、370R、378V、378T、382V、383N、386R、386K、387T、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N、421T 416K1、426T、428L、433R、434Y、434Sおよび439Rの中から選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異。
そこにおいて、
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)とが同じアミノ酸位置では起こらない)
他の実施例の上記変異株はFc領域中に下記から成る群の中から選択される突然変異の少なくとも一つのアミノ酸の組合せを有する:
226G/315D/330V、226G/315D/434Y、226G/330V/434Y、230L/264E/378V、230T/264E/378V、230T/264E/434S、230S/315D/434Y、230T/315D/434Y、230T/389T/434S、241L/264E/434S、241L/264E/378V、241L/264E/307P、241L/307P/378V、250A/389K/434Y、256N/378V/434Y、2591/315D/264E 434Y/378T/396L、264E/378V/294del 416K1/307P/434Y、264E/307P/378V、264E/396L/434S、264E/378V/434S、305A/315D/330V、305A/315D/434Y、305A/330V/434Y、307P/378V/434Y、315D/330V/382V、315D/330V/389T、315D/378V/434Y、315D/389T/434Y、315D/362R/434Y、315D/382V/434Y、315D/330V/434Y 330V/382V/434Y、330V/389T/434Yおよび378V/383N/434Y。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
上記変異株は親ポリペチドと比較してFc領域中に下記から成る群の中から選択される少なくとも一つの追加の突然変異を有する:226Y、226G、227S、227L、228R、228L、230S、230T、230L、230A、230Q、231T、231V、233D、234R、239A、241L、241Y、241のR、243L、246R、250A、252L、256N、259I、264A、264E、264M、265G、265N、267N、267R、269D、269G、270N、270E、276S、284L、285Y、288R、289I、290R、290E、291S、291Q、292W、294del、297D、298G、298N、299M、299A、299K、301C、315D、302A、303A、303I、305A、307P、307A、307N、308I、309P、311R、317R、320T、320E、322R、325S、327V、327T、330V、330T、332V、334E、334R、335A、338R、340E、342R、342E、342K、343S、345Q、345G、347R、350A、352S、354P、355Q、355G、356N1、359A1、360N1、360R1、361D1、361S1、362R1、362E1、369A1、370R1、371D1、375A1、375G1、378V、378T、378S、380Q、382V、382G、383R、383N、3841、384T、385R、386R、386K、387S、387T、389T、389K、389R、390S、392E、392R、393N、394A、395A、395S、396S、396L、397A、397M、398P、399N、400P、401A、401G、403T、404L、408T、41 1A、412A、414R、415D、415N、416K、416G、418R、418K、418E、419H、420R、421T、421S、421のD、422A、424L、426T、428L、433R、433P、434Y、434S、434H、438R、439R、440R、440N、443R、444F、444P、445S、446A、447Eおよび447N。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
他の実施例では、本発明の変異株は親ポリペチドと比較してFc領域中に下記を有する:
(i)下記から成る群の中から選択されるアミノ酸突然変異の少なくとも一つの組合せ:226G/315D/330V、226G/315D/434Y、226G/330V/434Y、230L/264E/378V、230T/264E/378V、230T/264E/434S、230S/315D/434Y、230T/315D/434Y、230T/389T/434S、241L/264E/434S、241L/264E/378V、241L/264E/307P、241L/307P/378V、250A/389 K/434Y、256N/378V/434Y、2591/315 D/264E 434Y/378T/396L、264E/378V/416K、294del/307P/434Y、264E/307P/378V、264E/396L/434S、264E/378V/434S、305A/315D/330V、305A/315D/434Y、305A/330V/434Y、307P/378V/434Y、315D/330V/382V、315D/330V/389T、315D/389T/434Y、315D/362R/434Y、315D/378V/434Y、315D/382V/434Y、315D/330V/434Y 330V/382V/434Y、330V/389T/434Yおよび378V/383N/434Yと、
(ii) 下記から成る群の中から選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異:226G、227L、228L、228R、230S代、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、259I、264E、265G、267R、290E、294del、303A、305A、307P、307A、308I、315D、322R、325S、327V、330V、342R、347R、352S、361のD、362R、362E、370R、378V、378T、382V、383N、386R、386K、387T、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N、421T 416K1、426T、428L、433R、434Y、434Sおよび439R。
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)とが同じアミノ酸位置では起こらない)
他の実施例の上記変異株はFc領域中に下記から成る群の中から選択される突然変異の少なくとも一つのアミノ酸の組合せを有する:
226G/315D/434Y、230S/315D/434Y、230T/315D/434Y、230T/264E/434S、230T/389T/434S、241のL/264E/378V、241L/264E/434S、250A/389K/434Y、256N/378V/434Y、259I/315D/434Y、264E/378T/396L、264E/378V/416K、264E/378V/434S、264E/396L/434S、294del/307P/434Y、307P/378V/434Y、315D/330V/434Y、315D/378V/434Y、315D/382V/434Yおよび378V/383N/434Y。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
前記変異株はさらに、、親ポリペチドと比較してFc領域中に下記から成る群の中から選択される少なくとも一つの追加の突然変異を有する:226G1、226Y1、227S1、227L1、228R1、228L1、230S1、230T1、230L1、230A、230Q、231T、231V、233D、234R、239A、241L、241Y、241R、243L、246R、250A、252L、256N、259I、264A、264E、264M、265G、265N、267N、267R、269D、269G、270N、270E、276S、284L、285Y、288R、289I、290R、290E、291S、291Q、292W、294del、297D、298G、298N、299M、299A、299K、301C、302A、303A、303I、305A、307P、307A、307N、308I、309P、311R、315D、317R、320T、320E、322R、325S、327V、327T、330V、330T、332V、334E、334R、335A、338R、340E、342R、342E、342K、343S、345Q、345G、347R、350A、352S、354P、355Q、355G、356N、359A、360N、360R、361D、361S、362R、362E、369A、370R、371D、375A、375G、378V、378T、378S、380Q、382V、382G、383R、383N、384I、384T、385R、386R、386K、387S、387T、389T、389K、389R、390S,392E、392R、393N、394A、395A、395S、396S、396L、397A、397M、398P、399N、400P、401A、401G、403T、404L、408T、41の1つのA、412A、414R、415D、415N、416K、416G、418R、418K、418E、419H、420R、421T、421S、421のD、422A、424L、426T、428L、433R、433P、434Y、434S、434H、438R、439R、440R、440N、443R、444F、444P、445S、446A、447Eおよび447N。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
他の実施例では、本発明の変異株は親ポリペチドと比較してFc領域中に以下を有する:
(i) 下記から成る群の中から選択されるアミノ酸突然変異の少なくとも一つの組合せ:226G/315D/434Y、230S/315D/434Y、230T/315D/434Y、230T/264E/434S、
230T/389T/434S、241L/264E/378V、241L/264E/434S、250A/389K/434Y、256N/378V/434Y、2591/315 D/434Y、264E/378T/396L、264E/378V/416K、264E/378V/434S、264E/396L/434S、294del/307P/434Y、307P/378V/434Y、315D/330V/434Y、315D/378V/434Y、315D/382V/434Yおよび378V/383N/434Yと、
(ii) 下記から成る群の中から選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異:227L、228R 226G、228L、230S、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、259I、264E、265G、267R、290E、294del、303A、305A、307P、362R、307A、308I、315D、322R、325S、327V、330V、342R、347R、352S、361D、370R、362E 378V、378T、382V、383N、386R、386K、387T、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N、416K、421T、426T、428L、433R、434Y、434Sおよび439R。
(ここで、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)とが同じアミノ酸位置では起こらない)
上記の全ての実施例のアミノ酸突然変異は親ポリペチドと比較して1〜20、好ましくは1〜10の変異株を有するのが好ましい。
変形例の実施例の上記変異株はFc領域中に下記から成る群の中から選択されるアミノ酸突然変異の1つの組合せを有する:307A/315D/330V/382V/389T/434Y、307A/315D/382V/389T/434Y、256N/378V/383N/434Y、256N/378V/434Y、315D/330V/361D/378V/434Y、315D/361D/378V/434Y、2591/315D/434Y、230S/315D/428L/434Y、241L/264E/307P/378V/433R、250A/389K/434Y、305A/315D/330V/395A/434Y、264E/386R/396L/434S/439R、315D/330V/362R/434Y、294del/307P/434Y、305A/315D/330V/389K/434Y、315D/327V/330V/397M/434Y、230T/241L/264E/265G/378V/421T、264E/396L/415N/434S、227L/264E/378V/434S、264E/378T/396L、230T/315D/362R/426T/434Y、226G/315D/330V/434Y、230L/241L/243L/264E/307P/378V、250A/315D/325S/330V/434Y、290E/315D/342R/382V/434Y、241L/315D/330V/392R/434Y、241L/264E/307P/378V/434S、230T/264E/403T/434S、264E/378V/416K、230T/315D/362E/434Y、226G/315D/434Y、226G/315D/362R/434Y、226G/264E/347R/370R/378V/434S、3081/315D/330V/382V/434Y、230T/264E/378V/434S、231T/241のL/264E/378T/397M/434S、230L/264E/378V/434S、230T/315D/330V/386K/434Y、226G/315D/330V/389T/434Y、267R/307P/378V/421T/434Y、230S/315D/387T/434Y、230S/264E/352S/378V/434Sおよび230T/303A/322R/389T/404L/434S。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
他の実施例の上記変異株は256N/378V/434Y、307A/315D/330V/382V/389T/434Y、256N/378V/383N/434Y、315D/330V/361のD/378V/434Y、259I/315D/434Yおよび230S/315D/428L/434Yから成る群の中から選択されるアミノ酸突然変異の1つの組合せを含む。
本発明のさらに他の対照は、親ポリペチドと比べてFcRnに対する結合正が増加し、且つ下記から成る群の中から選択されるFc変異株を含むポリペチド変異株を提供することにある:307A/315D/330V/382V/389T/434Y、307A/315D/382V/389T/434Y、256N/378V/383N/434Y、315D/330V/361D/378V/434Y/361D/378V/434Y、2591/315D/434Y、230S/315D/428L/434Y、241L/264E/307P/378V/433R、250A/389K/434Y、256N/378V/434Y、305A/315D/330V/395A/434Y、264E/386R/396L/434S/439R、315D/330V/362R/434Y、294del/307P/434Y、305A/315D/330V/389K/434Y、315D/327V/330V/397M/434Y、230T/241L/264E/265G/378V/421T、264E/396L/415N/434S、227L/264E/378V/434S、264E/378T/396L、230T/315D/362R/426T/434Y、226G/315D/330V/434Y、230L/241L/243L/264E/307P/378V、250A/315D/325S/330V/434Y、290E/315D/342R/382V/434Y、241L/315D/330V/392R/434Y、241L/264E/307P/378V/434S、230T/264E/403T/434S、264E/378V/416K、230T/315D/362E/434Y、226G/315D/434Y、226G/315D/362R/434Y、226G/264E/347R/370R/378V/434S、3081/315D/330V/382V/434Y、230T/264E/378V/434S、231T/241L/264E/378T/397M/434S、230L/264E/378V/434S、230T/315D/330V/386K/434Y、226G/315D/330V/389T/434Y、267R/307P/378V/421T/434Y、230S/315D/387T/434Y、230S/264E/352S/378V/434Sおよび230T/303A/322R/389T/404L/434S。
Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatでのEUインデックスの数え方である。
他の実施例では、親ポリペチドと比較してFcRnに対する結合性が増加したポリペチド変異株は下記から成っている群の中から選択されるFc変異株を有する:256N/378V/434Y、307A/315D/330V/382V/389T/434Y、256N/378V/383N/434Y、315D/330V/361D/378V/434Y、259I/315D/434Yおよび230S/315D/428L/434Y。
本発明の上記全ての変異株で、親ポリペチドのFc領域は野生型IgGのFc領域(例えば、「低ヒンジ-CH2-CH3」)およびその断片)から作ることができる。
より多くの好ましい実施例において、親ポリペチドのFc領域は、ヒトIgGサブクラス(すなわち、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4)に由来する。他の好ましい実施例では、親ポリペチドのFc領域は野性-型IgG1 Fc領域(SEQ ID:NO1)、野生型IgG2 Fc領域(SEQ ID:NO2)、野性-型IgG3 Fc領域(SEQ ID:NO3)および野性-型IgG4 Fc領域(SEQ ID:NO4)から成る群の中から選択される。
本発明の別の対照は上記IgG1 Fc変異株から成るポリペチドにあり、このIgG1 Fc変異株はIgG1 Fc(SEQ ID NO:1)の野生型配列と比較して少なくとも一つのアミノ酸突然変異を有し、野性-型IgG1 Fcと比較してFcRnに対する結合性が増加する。ただし、このIgG1 Fc変異株の配列はSEQ ID 番号2、SEQ ID 番号3およびSEQ番号4ではない。
本発明の別の対照は上記IgG2Fc変異株から成るポリペチドであり、このIgG2 Fc変異株はFcRnに野性-型IgG2Fcと比べて少なくとも一つのアミノ酸突然変異を有し、野性-型IgG2Fcと比較してFcRnに対する結合性が増加する。ただし、このIgG2Fc変異株の配列はSEQ ID 番号1、SEQ ID 番号3およびSEQ番号4ではない。
本発明の別の対照は上記IgG3Fc変異株から成るポリペチドであり、このIgG3Fc変異株はFcRnに野性-型IgG3Fcと比べて少なくとも一つのアミノ酸突然変異を有し、野性-型IgG3Fcと比較してFcRnに対する結合性が増加する。ただし、このIgG3Fc変異株の配列はSEQ ID 番号1、SEQ ID 番号2およびSEQ番号4ではない。
本発明の別の対照は上記IgG4Fc変異株から成るポリペチドであり、このIgG4Fc変異株はFcRnに野性-型IgG4Fcと比べて少なくとも一つのアミノ酸突然変異を有し、野性-型IgG4Fcと比較してFcRnに対する結合性が増加する。ただし、このIgG4Fc変異株の配列はSEQ ID 番号1、SEQ ID 番号2およびSEQ番号3ではない。
好ましい実施例では、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4Fc変異株ポリペチドから成る群の中から選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異はは、上記の対応する親ポリペチドと比べてFcRnに対する結合性が増加するアミノ酸突然変異、アミノ酸突然変異の組合せの群の中から選択される。
上記のように、本発明の変異株は、対応する親ポリペチドと比べてFcRnに対する増加した結合性を示す。一つの実施例ではエフェクタ機能および結合性は対応する親のそれと同様である。この変異株は特にFc-γリセプタまたはC1qに対する結合性が親ポリペチドと比べて大きく変化しない。
他の実施例の上記変異株はFcRnへの結合性が増加し且つの一つ以上のエフェクタ機能および/またはFcリガンド結合性(FcRn以外の)を有する。
実施例2に示すように、本発明の変異株はFcγRへの結合性、特にFcγRllla、ADCC(抗体依存細胞介在細胞毒性(Dependent Cell-mediated Cytotoxicity)活性およびCDC(Complement-Dependent Cytotoxicity)活性を変えずに、ポリペチド変異株と比較したFcRnへの結合性が増加する。また、本発明変異株は少なくともそのポリペチド親と同じADCCおよびCDC活性を有すると同時にFcRnに対する結合性が増加する。他のケースでは、本発明変異株は親ポリペチドと比べてFcRnに対する結合性が増加すると同時に、親ポリペチドと同等なADCCおよびCDCの中から選択される少なくとも一つのエフェクタ活性とを組み合わせて有する。
ADCC活性およびCDC活性は従来技術で公知で、実施例2のIV.2、IV.3に記載の方法で評価できる。
FcγRへの結合は従来法(例えばSPRまたはELISAアッセイ)で評価できる。
本発明のさらに他の対照は、親ポリペチドと比べてFcRn対する結合性が増加した上記とは異なる追加のアミノ酸突然変異を含む変異株を提供することにある。
従って、本発明のFc突然変異は、FcRnに対するFc親和性が増加することが公知である他のFc突然変異(例えば関連技術の説明に記載のものを参照)と組み合せることができる。
あるいは、Fc突然変異をエフェクタ機能を変える突然変異または一つ以上のFcリガンドを有する他のFc突然変異と組み合せることができる。すなわち、この種の変異株は親ポリペチドと比較して1つのFcリガンド(FcRn以外)および/またはエフェクタ機能と、FcRnに対する結合性の増加とを組み合わせて有する。
FcリガンドはFcγRs(Fcγリセプタ)、C1q、C3、レクチン結合マンナン、マンノースレセプター、プロテインA、溶連菌タンパクGおよびウイルス性FcγRsを含むが、これに限定されるものではない。FcリガンドもFcレセプタ相同体(FcRH)を含む。これはFcγRs(非特許文献23)に対応するFcレセプタのファミリーである。
Debis et al.,2002、Immunological Reviews 190 123-136
「エフェクタ機能」とはFcレセプタまたはリガンドを有する抗体Fc領域の相互作用で生じる生化学的または細胞事象である。エフェクタ機能はADCC(抗体依存細胞介在細胞毒性(Dependent Cell-mediated Cytotoxicity)、ADCP(抗体依存細胞介在食作用-Dependent Cell-mediated Phagocytosis)およびCDC(補体依存細胞介在細胞毒(Dependent Cytotoxicity)を含むが、これらに限定されるものではない。
本発明の変異株はFc領域を有し、親ポリペチドと比べてFcRnに対する結合性の増加を示す任意のポリペチドを含み、そのポリペチドFc領域のアミノ酸突然変異の少なくとも一つのアミノ酸突然変異またはその組合せが親ポリペチドと異なる。重要なアミノ酸の突然変異およびその組合せは本発明の変異株の一般的な特徴を説明した上記の突然変異である。
変異株(従って親ポリペチド)は抗体、Fc融合タンパク、Fc共役、単離されたFcおよびそれらの断片を含むが、これに限定されるものではない。特に、変異株はFc-含有結合タンパクにすることができる。換言すれば、変異株は(i) Fc変異株と(ii)所定分子に特異的に結合可能な結合ポリペチド領域とを有する。
本発明実施例では、本発明ポリペチド変異株はFc-融合タンパク変異株および変異株をFc-接合(conjugates)から成る群の中から選択される。Fc-融合タンパクおよびFc-接合(conjugates)はパートナーにリンクされるFc領域から成る。Fc領域はスペーサを介してまたは介さずにパートナーにリンクできる。
本発明ではFc融合タンパクは単一遺伝子によってコードされるタンパクであり、タンパク、ポリペチドまたはFc領域に結合した小さいペプチドから成る。Fc融合タンパクは必要に応じてペプチド・スペーサを含む。実質的には任意のタンパクまたは小分子をにFc領域にリンクさせて、Fc合着させることができる。タンパク合着には任意の抗体、任意の抗体可変部に由来するポリペチド、リセプタ、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモキンまたは他のタンパクの標的結合領域またはタンパク領域を含むが、これらに限定されるものではない。特に、Fc-融合タンパクは抗体のようなタンパク、免疫グロブリン不変領域(すなわちFc領域)断片と接着する異種「接着」タンパクの結合領域を結合する免疫接着要素(immunoadhesin)、例えば、リセプタ、リガンドまたは酵素にすることができる。免疫接着要素(immunoadhesin)に関しては下記文献が参照できる。
Ashkenazi A, Chamow SM. 1997, Curr Opin Immunol.;9(2):195-200
小さいペプチド合着パートナーでは、Fc合着を治療の標的に向ける任意の治療剤が含まれるが、これに限定されるものではない。この種の標的は任意の分子、好ましくは病気に関係する細胞外リセプタにすることができる。
本発明では、Fc共役は共役パートナーとFc領域との化学的カップリングで得られる。共役パートナーはタンパク性のものでも非タンパク性のものでもよい。共役反応は一般にFc領域上および共役パートナー上の官能基を使用する。共役の合成に適切な種々のリンカーが公知である。例えば、ホモ-またはヘテロ-二官能性リンカーが周知である(非特許文献25を参照)。
Pierce Chemical Company catalog, 2005-2006, technical section on cross-linkers, pages 321 -350
適した共役パートナーはポリペプチド製剤、標識(例えば下記標識)、医薬品、細胞毒素、細胞毒(例えば化学療法剤)、トキシンおよびこの種のトキシンの活性断片を含むが、これに限定されるものではない。適切なトキシンおよびそれらの対応断片にはdiptheria A連鎖、エキソトキシンA連鎖、リシンA鎖、アブリンA連鎖、curcin、クロチン、phenomycin、enomycin等が含まれるが、これらに限定されるものではない。細胞毒素剤はFc変異株と直接共役できる任意の放射性核種またはFc変異株に共有結合できるキレート剤にすることができる。追加の実施例では、共役パートナーはcalicheamicin、auristatins、ゲルダナマイシン、メイタンシンおよびduocarmycins等から成る群の中から選択できる(特許文献12を参照、この特許の内容は本明細書の一部を成す)。
米国特許第200310050331号明細書
この種の変異株は低pH(例えば、約pH 6)でFcRnに対する結合性が増加し、高pH(例えば約pH 7,4)では実質的に結合性が変更されてない。特に重要なFc-融合タンパクおよびFc-共役体変異株は親ポリペチドと比べてインビボでの半減期が増加するものである。
好ましい実施例では、本発明のポリペチド変異株は親抗体の異なる抗体である。「抗体」という用語はここでは最も広い意味で使われる。本発明で「抗体」とはは少なくとも(i) Fc領域および (ii) 免疫グロブリンの可変領域と結合するポリペチド領域を含む任意のポリペチドを意味する。このポリペチド領域は一つの所定標的抗原または一群の標的抗原に特異的に結合できる。
免疫グロブリンの可変部に由来する結合ポリペチド領域は少なくとも1つのCDRを有する。ここで、抗体は完全長の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、多特異抗体、少なくとも一つの可変部を有するFc-融合タンパク、合成抗体(「疑似抗体(mimetics)」とも呼ばれる)、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体を含むが、これに限定されるものではない。抗体はさらに抗体-融合タンパク、抗体複合体およびその各断片を含む。従って、本発明の異なる抗体はそのFc領域中に親抗体と比べてFcRnに対する結合能が増加させる上記の少なくとも一つのアミノ酸突然変異または突然変異の組合せを含む。FcRnに低pH(例えば、約pH 6)で結合能が増加し、高pH(例えば約pH 7,4)で実質的に接合性が変更しない抗体変異株が重要である。さらに、親ポリペチドと比べてインビボでの半減期が増加する抗体変異株が重要である。
一つの実施例では、本発明の異なる抗体は親の完全長の抗体の変異株から成る群の中から選択される。「完全長の抗体」とは可変領域および恒常部を含む天然抗体の生物学的な形および構造を有するものを意味する。本発明の完全長の抗体変異株の親ポリペチドは野生型抗体、野生型抗体ミュータント(例えば、既存の突然変異を含む)、野生型抗体の設計バージョン(例えばキメラ)、ヒト化抗体または完全ヒト抗体にすることができるがこれらに限定されるものではない。完全長の抗体の構造は一般にラマやラクダ等のいくつかの哺乳類を除いて免疫グロブリンがテトラマおよびダイマーである。各テトラマは典型的に2つの全く同じペアー(1つが典型的に約25kDaの分子量を有する「軽」鎖の1つの「重」鎖(典型的に約50-70kDaの分子量を有するペアー)から成るポリペプチド鎖である。
完全長の抗体の例は免疫グロブリンM、免疫グロブリンD、IgG、免疫グロブリンAおよび免疫グロブリンEのクラスを含むヒト免疫グロブリンである。
好ましい実施例の前記変異株はIgG変異株から成る群の中から選択される完全長の抗体である。
より好ましい実施例の前記変異株では、完全長の抗体がヒトIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4の変異株から成る群の中から選択されるが、そのが変異株のFc領域の配列はSEQ ID番号1、SEQ ID 番号2、SEQ ID番号3およびSEQ ID 番号4ではない。
上記変異株は親IgGと比較して一つ以上のアミノ酸突然変異を有する。この一つ以上のIgG アミノ酸突然変異は、上記のFc領域から成り且つFcRnに対して対応する親ポリペチドより結合性が増加したポリペチド変異株を一般に定義する際に説明した突然変異またはその組合せから成る。
他の実施例では、上記変異株が抗体免疫グロブリンの可変領域から誘導される結合ポリペチド領域を含むFc-融合タンパクから成る群の中から選択される。特に重要な抗体は下記から成る:
(a) 本発明のFc変異株、
(b)免疫グロブリンの可変部から誘導される以下の結合ポリペチド領域の一つ(すなわち少なくとも一つのCDRから成る):
(i) VL、VHClおよびCH1領域から成るFab断片、
(ii) VHおよびCH1領域から成るFd断片、
(iii) 単一抗体のVLおよびVH領域から成るFv断片;
(iv) 単離されたCDR領域、
(v)F(ab')2断片、2つの連結されたFab断片から成る二価断片、
(vi)単鎖Fv分子(scFv)、VH領域とVL領域がペプチドリンカーによって連結され、2つの領域が抗原結合部位を形成する、
(vii)二特異性単鎖Fv、
(viii)「diabodies」または「triabodies」(遺伝子融合によって構築される多価性または多特異性断片。
しかし、上記リストに限定されない。
他の実施例では、抗体はミニボディー(minibody)である。このミニボディー(minibody)はCH3領域に連結したscFvから成る最小抗体のようなタンパクである(非特許文献26参照)場合によっては、scFvは完全長のFc領域に結合でき(非特許文献27)、また、ヒンジ領域またはその断片を含むことができる。
Hu et al., 1996, Cancer Res. 56:3055-3061 De Lorenzo et al., 2005, Carcinogenesis 26:1890-1895
一つの実施例では、本発明抗体は多特異性抗体の群、特に「ジアボディー(diabodies)」とよばれる二特異性抗体の群の中から選択される。これらの抗体は2つ以上の異なる抗原を結合する。ジアボディー(diabodies)は公知の複数の方法、例えば化学的方法またはハイブリドーマにして作ることができる(非特許文献28)。
Holliger and Winter, 1993, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449
他の実施例では、抗体変異株の足場成分が異なる生物種からの混合物である。この種の抗体変異株はキメラ抗体および/またはヒト化抗体にできる。一般に、「キメラ抗体」および「ヒト化抗体」の両方は複数の生物種かの領域を結合した抗体を意味する。例えば伝統的な「キメラ抗体」は非ヒト動物、一般にハツカネズミまたはラットの可変部とヒトからの恒常部とから成る。ほとんどの場合、ヒト化抗体は非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。一般に、ヒト化抗体では、CDR以外の全抗体がヒト起源遺伝子のポリヌクレオチドによってコードされるか、CDRないを除いてヒト抗体と同一である。非ヒト生物由来の核酸によってコードされるCDRの全てまたは一部は、ヒト抗体可変部のβ-シート・フレーム・ワークにグラフトされて抗体を作る。その特異性はグラフトされたCDRによって決定される。例えば、この種の抗体の生成は特許文献13に記載され、非特許文献28、非特許文献29にも記載されている。これら文献の内容は本明細書の一部を成す。
国際特許第WO 92/11018号公報 Jones, 1986, Nature 321 :522-525 Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536
ヒト化抗体は少なくとも免疫グロブリン、典型的にはヒト免疫グロブリンの恒常部の一部から成り、従って、典型的にはヒトFc領域を含む。また、ヒト化抗体は遺伝子操作で設計された免疫系を有するハツカネズミを使用して発生できる (非特許文献30参照)。非ヒトの抗体をヒト化して作り直す方法は種々の方法が公知である(非特許文献31)。非特許文献31〜非特許文献40にも各種のヒト化方法が記載されている。しかし、これちのものに限定さるものではない。これら文献の内容は全て本明細書の一部を成す。ヒト化または非ヒトの抗体可変部の免疫原性を減らす他の方法には例えば非特許文献40に記載のリサーファス法が含まれる。この文献の内容も全て本明細書の一部を成す。
Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654 Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA), Jones et al., 1986, Nature 321 :522-525 ; Riechmann et al.,1988; Nature 332:323-329 ; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536 ; Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33 ; He et al., 1998, J. mmunol. 160: 1029-1035 ; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9 ; Presta et al., 1997, Cancer Res. 57(20):4593-9 ; Gorman et al., 1991 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181 -4185 ; O'Connor et al., 1998, Protein Eng 11 :321-8 Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973
一つの実施例では、上記抗体変異株は少なくとも一つのアミノ酸を有する完全ヒト抗体である。その概略について述べましたように、ここでは突然変異である。「完全ヒト抗体」または「ヒト化抗体」は完全にヒト・遺伝子由来の配列から成る抗体を意味する。場合によっては、これは突然変異を有するヒト染色体由来の抗体の遺伝子配列を有するヒト抗体である。あるいは、抗体成分はヒトであるが、単一遺伝子に由来しない。従って、例えば、1つの抗体からのヒトCDRは一つ以上のヒト抗体からの配列(例えば足場配列)と組み合せることができる。例えば、各種の生殖細胞配列をヒト抗体またはヒト足場を形成するために結合できる(例えばヒト化またはキメラの配列の概略については特許文献14参照)。
米国特許出願第11/022,289号明細書
一つの実施例では、本発明の抗体変異株はキメラのIgG、ヒト化IgGおよび完全ヒトIgGから成る群の中から選択される。
抗体の共有結合による修飾も本発明の範囲に含まれるが、必ずしも後翻訳(post-translationally)されない。この種の突然変異はグルコシレート(glycosylates)、標識化および共役を含むが、これらに限定されるものではない。
従って、いくつかの実施例では、本発明のポリペチド変異株は一つ以上の設計されたグルコホーム(engineering glycoforms)を含むように修正できる。「グルコホームを含むように修正」とは共有結合でFc変異株から成っているポリペチドに付けられる炭水化物組成物を意味する。この炭水化物組成物は親のポリペチドのそれとは化学的に異なる。設計されたグルコホームはエフェクタ機能を改良するかまたは減らす等を含む種々の目的で有用である。設計されたグルコホーは変異配列の任意のアミノ酸に取付けることができる。グルコホームは実施例のFc領域のアミノ酸に取付けるのが好ましい。
設計されたグルコホームは公知の種々の方法で作ることができる(非特許文献42〜非特許文献47、特許文献15〜22参照)。これら文献の内容は本明細書の一部を成す。
Umaa et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001 , Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; Potelligent (登録商標) technology [Biowa, Inc., Princeton, N.J.]; GlycoMAb(登録商標) glycosylation engineering technology [Glycart Biotechnology AG, Zuerich, Switzerland] 米国特許第6,602,684号明細書 米国特許出願第10/277,370号明細書 米国特許出願第10/113,929号明細書 国際特許第WO 00/61739A1号公報 国際特許第WO 01/29246A1号公報 国際特許第WO 02/31140A1号公報 国際特許第WO 02/30954A1号公報 国際特許第WO 01/771811号公報
これらの方法の多くはFc領域に共有結合で付けられるフコシル化(fucosylated)および/または二分オリゴ糖レベルを制御することをベースにしている。例えば、種々の生物の抗体変異株または細胞系、例えば設計(engineering)したLec-13 CHO細胞またはラット・ハイブリドーマYB2/0細胞を発現することによって、グリコシル化経路に関係する酵素(例えばFUT8 [α1,6-フコシトランスラーゼ]および/またはβ1-4-N-セチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII [GnTIII])をコントロールするか、抗体変異株の発現後に炭水化物を修正することによってコントロールする。
設計されグルコホームは異なる炭水化物またはオリゴ糖から成る抗体変異株にすることもある。グリコシル化パターンはタンパクの配列(例えば特定のグリコシル化アミノ酸残基の有無記)またはタンパクが生じる宿主細胞または生物の両方依存することは公知である。特定の発現系については以下で説明する。
ポリペチドのグリコシル化は一般にNに結合されているかOに結合されている。N結合はアスパラギン残基の側鎖への炭化水素部分である。トリ−ペプチド配列アスパラギン−X−セリンおよびアスパラギン−X-チロシン(ここでXはプロリン以外の任意のアミノ酸)はアスパラギン側鎖への炭化水素部分の酵素付加の認識配列である。従って、ポリペチドのこれらのトリ−ペプチド配列のどちらかの存在が潜在的なグリコシル化サイトを作る。Oに結合されたグリコシル化は糖N-アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースの中の1つの付加、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的なセリンまたはスレオニンへの付加であり、5-ヒドロキシプロリンまたは5-ヒドロキシリシンも使うことができる。
従来は抗体へのグリコシル化サイトの付加は上記のトリ−ペプチド配列の少なくとも1つを含むようにアミノ酸配列を変えて行っている(N結合グリコシル化サイト)。また、付加または出発配列に一つ以上のセリンまたはスレオニン残基を置換して製造することもできる(O結合グリコシル化サイト)。簡単には、抗体アミノ酸配列をDNAレベルで所望のアミノ酸変更で変え、特に標的ポリペチドをコードするDNAを所定塩基で突然変異させて、所望アミノ酸に翻訳するコードンを発生される。
抗体上の炭化水素部分の数を増やす他の手段はグリコシドを化学的または酵素でタンパクにカップリングすることである。N結合やO結合グリコシル化可能な宿主細胞のタンパクの生産を必要としない点でこの手順は有利である。使用する結合モードに従って糖を下記に付けることができる:
(a) アラニンおよびヒスチジン、
(b) 遊離カルボキシル基、
(c) シスチンのようなフリーのスルフヒドリル基、
(d) セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンのような遊離水酸基、
(e) フェニルアラニン、チロシンまたはヒドロキプロリンのような芳香族残基、
(f) グルタミンのアミド基。
これらの方法は1987年9月11日公開の特許文献23および非特許文献48に記載されている。
国際特許第WO 87/05330号公報 ApNn and Wriston, 1981 , CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306
出発抗体中に存在する炭化水素部分の除去は化学的または酵素で行うことができる。化学的脱グリコシルはトリフルオロメタンスルフン酸またはその均等化合物にタンパクを暴露する必要がある。この操作で結鎖糖(N アセチルグルコサミンまたはN-アセチルガラクトサミン)以外の大部分の糖を開裂し、ポリペチドは保護できる。化学的グリコシルは非特許文献49、非特許文献50に記載されている。ポリペチド上の炭化水素部分の酵素開裂は非特許文献51に記載のように各種エンド−およびエクソ−グルコダーゼを使用して行うことができる。非特許文献52に記載のように、潜在的なグリコシル化サイトでのグリコシル化はタンパク-N- グリコシド結合の形成をブロックするツニカマイシン化合物の使用によって防止できる。ツニカマイシンは非特許文献52に記載されている。
Hakimuddin et al., 987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 Edge et al., 1981 , Anal. Biochem. 118:131 Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350 Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105
他の実施例では、本発明の抗体変異株はキメラのIgG、ヒト化抗体IgGおよび設計されたグリコホームから成る完全ヒトIgGから成る群の中から選択される。
別の実施例では、本発明の抗体変異株の共有結合による修飾は一つ以上の標識の付加から成る。場合によっては、これは抗体融合と考えられる。「標識化基」という用語は検出可能な任意の標識を意味する。他の実施例では、標識化基はポテンシャル立体障害を減らすための種々の長さのスペーサアームを介して抗体に連結する。タンパクの標識化は種々の方法が公知で、本発明を実行する際に使用できる。
一般に、標識には検出されるアッセイまたは診断手順によって種々のクラスが含まれる:
a) 同位体タグ。これは放射性元素または重質同位体にできる;
b) 磁気標識(例えば磁気粒子);
c) レドックス活性成分;
d) 光学染料、酵素基(例えばワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ)
e) ビオチン化された基;
f) 第2リポータで認識される所定ポリペチドエピトープ(例えばロイシン・ジッパー対配列、第2抗体用の結合部、金属結合領域、エピトープタグ、その他)。
特定の標識には発色団、燐およびフッ化燐の蛍光団が含まれるが、これらに限定されるものではない。フッ化燐の蛍光性団は「小分子」蛍光剤でも蛍光タンパクでもよい。
他の実施例では、本発明の抗体変異株を上記の標識化基として使われないタンパクまたは小分子に融合または共役させることができる。実際に、任意のタンパクまたは小分子を抗体に連結できる。タンパク合着パートナーにはリセプタの標的-結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモキンまたは他のタンパクまたはタンパク領域を含むが、これらに限定されるものではない。小分子は医薬品(例えば、細胞障害剤)、トキシンまたはこのトキシンの活性種(例えば化学療法剤)を含むが、これら限定されるものではない
既に述べたように、本発明の抗体変異株は一つの標的抗原または一群の標的抗原に特異的に結合できる。「標的抗原」とは所定抗体または免疫グロブリンの可変部に特異的に結合する分子を言う。標的抗原はタンパク、炭水化物、リピド、その他の化学化合物にすることができる。
適切な抗原の選択は所望の用途に依存する。実際には下記の任意の抗原を目標にできる。例えば、膜タンパク質、RhD抗原、CD3、CD4、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD32B、CD33、CD38、CD40、CD44、CD52、CD71 (トランスフェリン・リセプタ)、CD80、CD86、CTLA-4、CD147、CD160、CD224、リセプタErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4 ErbBファミリーに属するような生長因子レセプタ(EGFR、HER2/neu、HER3、HER4)、VEGF-R1、VEGF-R2、IGF-FM 1、PIGF-R、MHCクラスIおよびMHCクラスIl分子、例えばHLA-DR、IL-1 R、IL-2Rα)IL-2RβおよびIL-2Rガンマ、IL-6Rのようなインターロイキンレセプタ、M llerian抑制物質タイプIlリセプタのようなホルモンレセプタ、LDLリセプタ、NKp44L、CXCR4およびCCR5のようなケモキンリセプタがあるが、これらに限定されるものではない。膜タンパクはGD2、GD3、CA125、MUC-1、MUC-16のような腫瘍マーカー、carcinoembrionic抗原(CEA)、Tn、グリコプロテイン72、PSMA、HMW-MAAを含む。また、本発明の抗体はサイトカイン(例えば、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、IL-23、TGFベータ、TNFα、IFNガンマ)、ケモキン、成育因子状VEGF-A、EGF、PIGF、PDGF、IGF、ホルモン、細菌毒素、その他のボツリヌス毒素のようなオリ遺伝子トキシン、リシン、B. anthracis感染防御抗原、B. anthracis致死因子、B. anthacis水腫因子、shigatoxins 1および2、異なるウィルスからのウイルス性抗原、例えばFVIII阻害抗体を含む病原ウイルス(阻害抗体)を含む可溶タンパクを目標とすることができるが、これらに限定されない。
好ましい実施例では、本発明の変異株はCD20を目標とすることができる。この場合、親ポリペチドは以下から選択できる:EMAB6またはEMAB603(WO2006064121参照)、RITUXIMAB(Rituxan(登録商標、IDEC/ジェネンテク/ロシュ)(特許文献24参照)、HUMAX(登録商標-CD20)(特許文献25に記載)AME-133(Applied Molecular Evolution)(hA20(Immunomedics社)HumaLYM(Intracel)およびPRO70769(「免疫グロブリン変異株およびその利用」と題する特許文献26)。これらとの内容は本明細書の一部を成す。
米国特許第5,736,137号明細書 米国特許第5,500,362号明細書 国際特許出願第PCT/US2003/040426号
他の実施例では、本発明の変異株は、RhD抗原を目標とすることができる。この場合、親ポリペチドはEMAB2(特許文献27参照)(SymOOI(Symphogen A/S)またはMonoRho(ZLB、チューリッヒ)から選択できる。
フランス特許第FR 03 12 229号公報
親ポリペチドはAvastin(登録商標)、抗VEGF、Remicade(登録商標)、抗TNF-α、Erbitux(登録商標)、Vectibix(登録商標)、抗EGFR、Tysabri(登録商標)、integrineの抗α4鎖、Herceptin(登録商標)、抗HER2/neuでもよいが、これらに限定さるものではない。
本出願はさらに、周知の種々の治療関連特性の中から選択される他の最適化特性と組み合わせたFcRnに対する結合性が増加した変異株を提供する。最適化できる最も好ましい特性はインビボでの半減期である。インビボでの半減期を増加させるためには変異株は低pH(例えばエンドソームと関連があるpH)、例えばpH 6.0でFcRnに対する結合能が増加し、しかも、より高いpH(例えば7.4)で親和性を維持して、FcRnへの結合をエンドソームへ増加させ、且つ通常の開放速度にできるものでなければならない(非特許文献53、非特許文献54);
Dall'Acqua et al., 2002, J. Immunol. 169: 5171-5180 Gurbaxani et al., 2006, MoI Immunol. 43(9):1462-73)
同様に、このように調整されたFcRn結合性を有するこれらの変異株は必要に応じて他の望ましい特性、例えば調整されたFcγR結合特性を有することができる。1つの追加の実施例では、変異株はFcRn結合性に加えてヒト活性FcγR、好ましくはFcγRlllaに対して改良された親和性を有するように最適化される。変形実施例では、変異株はFcRnに対する親和性が増加し、FcγRI、FcγRlla、FcγRllb、FcγRllcおよびFcγRlllbにallelicな変異を含むヒトFcγRに対する親和性を増減するように最適化されるがこれらに限定されない。
別の実施例において、本発明の変異株は、選択的に増加する漿液半減期と同様に(または減少したこと)エフェクタ機能を増やすことができた。特に好ましい実施例では、本発明変異株は漿液半減期の増加と同様に、その親ポリペチドと比べてADCC活性の増加および/またはFcγRへの結合の増加を有することができる。他の実施例では、本発明変異株はその親ポリペチドと比べてCDC活性の増加も有することができる。
本発明変異株は広範囲の製品で使用できる。本発明の一つの実施例では、変異株は治療、診断に使われ、調査試薬として使用されるが、治療で好ましく使用できる。
FcRnに対する結合性が増加するので、本発明変異株はインビボで長い半減期を有する、より正確には親ポリペチドよりインビボで長い漿液半減期を有することが予期される。従って、本発明変異株は、親ポリペチドが循環血液から急速に無くなる様な場合に、親ポリペチドの代替として有利な用途があり、または、長い半減期活性を必要とする慢性または長期的な病気の治療で使用される。
抗体群の中から変異株を選択する場合、はモノクローナルまたはポリクローン抗体組成物での使用できる。好ましい実施例では、抗体変異株は標的抗原、例えば癌細胞を運ぶ標的細胞を殺すのに用いられる。別の実施例では、変異株は標的抗原、例えば細菌毒素をブロックし、抗体化させ、刺激(agonize)する、例えばサイトカインまたはサイトカイン受容体抗体化させ、刺激(agonize)したり、バクテリアまたはウィルスのような感染因子またはトキシンを中和させする。好ましい実施例では、本発明変異株は標的抗原抗体化、刺激し、標的抗原を運ぶ細胞を殺す。
本発明の好ましい実施例では、変異抗体が抗体関連疾患を治療するために患者に与えられる。「患者」とはヒトおよびその他の動物を含み、好ましくは哺乳類であり、最も好ましくはヒトである。「抗体関連疾患」または「抗体応答異常」または「状況」または「病気」とは本発明の変異株含む医薬組成物の投与によって改良できる異常を意味する。この抗体関連疾患には自己免疫疾患、免疫疾患、感染症、炎症疾患、神経病、痛覚、肺の病気、血液疾患、線維症(fibrotic)およびガンを含む腫瘍・腫瘍疾患が含まれるが、これらに限定されるものではない。
「ガン」「ガン性」とは一般に無秩序な細胞発育によって特徴付けられる哺乳類の生理的状況を言う。ガンの例は癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、脂肪肉腫を含む肉腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、神経鞘腫(schwanoma)、髄膜腫、腺癌、メラノーマ、白血病およびリンパ性悪性を含むが、これらに限定されるものではない。治療可能な他の疾患にはリウマチ様関節炎、若年性慢性関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、シェーグレン(Sjorgren)病、多発性硬化症、強直性脊椎炎、喘息、アレルギーおよびアレルギー疾患、移植片対宿主疾患等が含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明のさらに他の目的は上記変異株を含む医薬組成物を提供することにある。そうした処方は所望純度を有するポリペチド変異株に必要に応じて用いる生理的に許容されるまたは薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤を混合し、凍結乾燥品または水溶液の形にすることができる(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980参照)。この医薬組成物を必要とする患者の治療に使用できる。
患者の治療時には治療有効量の変異株を投与することができる。「治療有効量」とは投与効果を生じる供与量を意味する。正確な供与量は治療の目的に応じて公知の方法を使用して当業者が確認できる。供与量は体重1kg当たり0.001〜100mgまたはそれ以上にすることができる。例えば0.1、1.0、10または50mg/kg体重であり、好ましくは1〜10mg/kg体重である。周知のように、投与量はタンパク劣化、全身局所デリバリー、新プロテアーゼ合成速度、加齢、ボディー重量、公衆衛生、性、食餌、投与時間、医薬相互作用等を考えて調整する必要があり、それは当業者がルーチン実験で確認できる。
変異株を含む組成物は経口、皮下、静脈内、非経口的、臓器内、鼻腔内、経直腸、鞘、局所投与、経皮(例えばゲル、サルブ、化粧水、クリーム等)、経筋、腹腔内、肺内、経眼投与を含む医薬品の種々の方法で投与できる。
上記の治療は他の治療と付随して行うことができる。すなわち、上記の治療薬を小分子、他の生物製剤と同時投与したり、て照射治療、外科、その他と同時に行うことができる。
本発明のさらに他の目的は、本発明の変異株をコードする単離された核酸を提供することにある。大抵の場合、親ポリペチドをコードするDNAは利用でき、入手できる。従って、当該変異株は公知の各種方法を用いて親ポリペチドをコードするDNAを変えることで作ることができる。そうした方法には部位特異的突然変異、ランダム突然変異生成、PCR突然変異生成およびカセット突然変異生成が含まれるが、これらに限定されるものではない。アミノ酸の置換は部位特異的突然変異によって行うのが好ましい(例えば、Zoller and Smith, 1982, Nucl. Acids Res. 10:6487-6500; Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:488を参照)。
さらに、ポリペチド変異株をコードする所望アミノ酸配列は決定でき、従って、周知の方法手合成できる。
本発明の変異株は、コードする核酸が得られれば、任意の公知方法で製造できる。本発明の実施例では、変異配列(例えばIgG変異株配列)を構成メンバ配列をコードする核酸を作るのに用い、それを宿主細胞にクローンして、発現させ、必要に応じて、分析することができる。実際に、周知の手順を使用して実行できる。そうした方法は非特許文献53および非特許文献54に記載されている。これらの内容は本発明の一部を成す。
Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Maniatis, Cold SPRing Harbor Laboratory Press, New York, 2001 Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons)
変異株をコードする核酸はタンパクを発現する発現ベクターに組み込むことができる。一般に、発現ベクターは制御配列または調節配列に連結し、機能的に配置されたタンパク、選択マーカーおよび/または追加沃素を含む。本発明の変異株(例えばIgG変異株)は核酸でトランスホームされた宿主細胞、好ましくはそのタンパクの発現を誘発または誘導可能な条件下で変異株をコードする核酸を含んで、発現ベクターを培養して作ることができる。各種のホスト細胞系、例えば、哺乳動物細胞、バクテリア、昆虫細胞およびイーストを使用できる。例えばAmerican Type Culture Collectionから入手可能なATCC細胞系カタログに記載の各種哺乳動物細胞系を使用できる。
宿主細胞にはYB2/0、YB2/3HL.P2.GII.IGAg.2O細胞、American Type Culture Collection にATCC番号CRL-1662で寄託)、SP2/0、YE2/0、1R983F、Namalwa、PERC6、CHO細胞株、特にCHO-K-1、CHO-LeclO、CHO-Lecl、CHO-Lecl3、CHO Pro-5、CHO dhfr-、Wil-2、Jurkat、Vero、Molt-4、COS-7、293-HEK、BHK、KGH6、NSO、SP0/2-Ag 14、P3X63Ag8.653、C127、JC、LA7、ZR-45-30、hTERT、NM2C5、UACC-812等があるがこれらに限定されるものではない。外部核酸を宿主細胞に入れる方法はも周知で、使用する宿主細胞によって変化する。本発明の好ましい実施例では、変異株はYB2/0細胞で発現され、抗CD20抗体または抗RhD抗体である。
本発明の変異株はさらに、トランスジェニックな非ヒト動物またはトランスジェニック植物で作ることができる。トランスジェニックな非ヒト動物は受精卵に所望の遺伝子を直接注入することによって得ることができる(非特許文献55)。
Gordon et al., 1980 Proc Natl Acad Sci U S A.;77:7380-4
トランスジェニックな非ヒト動物はハツカネズミ、ウサギ、ラット、ヤギ、ウシ、ウシまたは鳥等を含む。所望遺伝子を有するトランスジェニックな非ヒト動物は所望遺伝子を胎生期幹細胞に入れ、会合キメラ方法または注入キメラ方法によって動物を調製することで得られる(非特許文献56、非特許文献57)。胎生期幹細胞の例はハツカネズミの胎生期幹細胞 (非特許文献58)、ラット、ヤギ、ウサギ、サル、鳥、ウシ等を含む。また、トランスジェニックな非ヒト動物は細胞核を取り除いた卵子に所望遺伝子を導入した細胞核を移入するクローン法を使用して調製することができる(非特許文献59)。
Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second edition, Cold SPRing Harbor Laboratory Press (1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993) Evans and Kaufman, 1981 , Nature; 292: 154-156 Ryan et aL, 1997 Science; 278: 873 - 876 Cibelli et_al., 1998 Science, 280 : 1256-1258
ポリペチド変異株は上記の方法で作った動物中に異なる分子をコードするDNAを導入して、動物中で異なる分子を形成し、増殖し、動物からポリペチド変異株を回収することで作ることができる。。ポリペチド変異株を乳汁(動物の卵子等)に形成させ、増殖させて作ることもできる。
本発明のさらに他の対照は、最適化された、すなわち、対応する野性-型Fc領域と比べてFcリガンドに対する結合性が増加した変異株であるFc変異株を同定する方法を提供することにある。本発明方法は下記の工程から成る:
(i) Fc変異株をコードする一組の核酸から成る核酸ライブラリを作り、
(ii) 前記ライブラリに含まれる核酸の発現によってFc変異株を生産し、(iii) 段階(ii)で作ったFc変異株の中でFcリガンドに結合可能ものを選択し、
(iv) 段階(iii)で選択したFc変異株およびFcリガンドのための1つのFcコントロール(対照)の結合特性を測定し、
(v) Fcコントロールと比較して、Fcリガンドに対する結性が増加したFc変異株を選択する。
核酸ライブラリ中の核酸配列はRNAでもDNAでもよい。好ましい実施例のライブラリはFc変異株をコードするDNAの塩基配列を有する。
Fcコントロール(対照)は野生型Fc領域、Fcリガンド結合性が野生型Fcのそれとおじか、それより高いものおよび公知のFc変異株から成る群の中から選択される。
FcリガンドはFcRnおよびFcγレセプターの中から選択できるが、これらに限定されない。
本発明の実施例では、Fc変異株をコー化するライブラリの核酸は野生型FcのDNAの塩基配列を変えることによって作ることができる。「核酸配列を変える」とは突然変異、例えば所望核酸配列のヌクレオチドの挿入、欠失または置換を意味する。この種の突然変異は従来周知の方法で実行できる。これらの方法にはランダムな突然変異生成、部位特異的突然変異、PCR突然変異生成およびカセット突然変異生成を含むが、これに限定されるものではない。
好ましい実施例では、一つ以上の低忠実度のDNAポリメラーゼを使用することをベースにしたランダムな突然変異生成によってライブラリを作る。このランダム突然変異生成法は特許文献27に記載されており、その内容は本明細書の一部を成す。すなわち、本明細書の材料と方法の項で説明するように、1つのRNA依存性DNAポリメラーゼまたはRNA依存性DNAポリメラーゼの組合せを用いてライブラリを作ることができる。
国際特許第WO0238756号公報
他の実施例では、前記核酸ライブラリが上記方法の1つを使用して予備最適化(Pre-optimized)されたFc変異株のプールのDNAの塩基配列を変えることで作られる。ランダム突然変異生成を使うのが好ましい。予備最適化されたFc変異株は少なくとも一つのアミノ酸突然変異を有し、野生型Fcと比較してFcリガンドに対する結合性か増加したFc変異株である。予備最適化されたFc変異株は野生型Fcと比べて1〜4つのアミノ酸突然変異を有するのが好ましい。この予備最適化されたFc変異株は野生型Fcの突然変異によって作られるライブラリのスクリーニングで得ることができる。また、従来技術に記載のFc変異株でもよい(例えば、本明細書の関連技術で説明のもの)。予備最適化されたFc変異株のプールは複数のポリペチド、好ましくは約2から約100の予備最適化された変異株を含むのが好ましい。
予備最適化された変異株から作られるライブラリからより最適化されたFcに変異株を選択することが可能になる。本明細書の[表5]にはこの種のライブラリのスクリーニングから選択された最高のFc変異株の結合能が示してある。
段階(ii)すなわちFc変異株の発現は周知の方法を用いて宿主細胞を使用して実行できる。好ましい実施例ではFcライブラリが標準手順(非特許文献61)を使用したファージの発現(ファージ表示)で作られる。
Smith, Science, 1985, 228: 1315
段階(iii)はFc変異株-Fcリガンド錯体を作り、結合したFc変異株を非結合Fc変異株から分離することで実行できる。この分離段階を実行するために、Fcリガンドをは固体担体に固定するか、段階(iii)のプロセス中、固体担体に固定可能でなければならない。この種の手順の例は本出願の実施例 1に記載されている。段階(iii)は最も効果的なFcリガンド見つけるために複数の選抜ラウンドから成るのが好ましい(実施例を参照)。
段階(iv)では、Fcリガンドに対するFc変異株の結合性を従来周知の方法によって評価する。例えば、当業者は該当するELISAを実行することができる。特定信号が少なくとも親Fcのそれより1.2-倍強い場合の変異株を選択する。該当するELISAアッセイは単離されたFcまたは実施例Ilおよび実施例IVに示すようにファージに表示されたFcに対して実行できる。
変形例または確認のために、当業者は本明細書の実施例IVに示すように、表面プラスモン共鳴(Surface Plasmon Resonance、SPR)実験を使用して解離定数を決定することができる。段階(v)では変異株が親Fcの解離定数の3倍を有する場合に、その変異株を選択する。
以下、本発明の実施例を示すが、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
実施例1
Fc-WiId-型と比較してFcRnに対する結合性が増加するFc変異株の同定と、その変異株の結合性の特徴付け
I. 材料と方法
I.1 ヒトFcRnの発現および精製
バクロウイルス系を使用して可溶性ヒトFcRnの発現を非特許文献62に記載のGTP Technology(Labege、フランス)によって実行した。
Popov et al., MoI. Immunol. 33:521 -530 (1996)
TEV配列および6×ポリヒスチジンのタグを用いてリーダーペプチドおよび細胞外領域(コードン1-290)をコードするα鎖相補DNAにタグを付けた。誘導体のα-鎖およびβ2ミクログロブリン鎖はP10およびpolyhedrineプロモータの下にpFastBacDualにクローンした。非オチニル化(biotinylated)したバージョンのFcRn(FcRn-biot)はFluoReporter(登録商標)Biotin-XX Protein Labeling Kit F2610(分子プローブ)を用い、メーカのプロトコルに従って化学的カップリングで作った。さらに、β2ミクログロブリン鎖を含み、α-連鎖がファージp3タンパクおよびCVDEタンパクのアミノ末端部に溶合した融合タンパクも作った(FcRn-p3)。IgG-セファロースおよびIMAC精製段階後に純度が90%以上の純粋なタンパクが得られた。
I.2. Fc遺伝子の構築
Fcポリペチド(ヒトIgG1重鎖(SEQ番号1) (Poul MA et al., Eur. J. Immunol.
25(7):2005-2009 (1995)に由来するアミノ酸残基226-447(KabatでのEUインデックス)をコードするヒトFcライブラリを標準的なPCRを用いてBamHI/EcoRI断片としてのファージミドベクターpMG58(pMG58_Fc226(図1))にクローンした。このベクターは[図1]に示した。複数の完全にランダム化したライブラリはMUTAGEN(登録商標)(特許文献28)を使用して作った。これは低忠実度のヒトDNAポリメラーゼ(ムターゼ)を用いて標的配列全体に突然変異を均一かつランダムに導入する方法である。
国際特許第WO0238756号公報
互いに異なる条件で相補突然変異パターンを作るため3つの別々のムターゼ(polβ、polηおよびpolι)を使用した。これらのヒトポリメラーゼは公知の方法(非特許文献62、63)で製造し、精製した。
Mondon et al., Biotechnol J. 2: 76-82 (2007) Emond et al. Protein Eng. Des. SeI. 21 : 267-274(2008)
I.2a ムータジエンプロセス(登録商標)を用いた突然変異生成
ヒトFc遺伝子(Fc遺伝子)を5’−プライマMG_619:5’-AGTACTGACTCTACCTAGGAT CCTGCCCACCGTGC−3’(SEQ ID番号5)および3’−プライマMG_621:5’-ACTGCTCGATGTCCGTACTATGCGGCCGCGAATTC-3’(SEQ ID番号6)を使用しているムターゼでダブル複製した(BamHIおよびEcoRI制限サイトには下線を引いた。イタリック部は非特異性テイルに対応する)。0.6.μgの鋳型としてのpMG58_Fc226プラスミド(Mut1ライブラリ用の野生型FcまたはMut2ライブラリ用のFc変異株)と、プライマMG_619およびMG_621(それぞれ25OnM)と、適切な複製緩衝液(下記に詳述)とを含む混合物を95℃で5分間処理した後、直ちに4℃まで冷却してDNA鎖の特性を変性させる。Polβの場合の複製緩衝液は5OmMトリスHCl pH 8.8、1OmM-MgCl2、1OmM-KCl、1mM-DTTおよび1%(v/v)グリセリンである。polη(またはpolηおよびpolι) 場合の複製緩衝液は25mMトリスHCl pH 7.2、5mM-MgCl2、1OmM-KCl、1mM-DTTおよび2.5%(v/v)グリセリンである。変性段階後、突然変異誘発性複製を50μM dATP/dCTP、100μM dTTP/dGTPおよび1μgのpolβまたは100μM dNTPs、1μgのpolη(またはpolηおよびpolι、各1μgのムターゼ)を加えて行った。複製反応は37℃で2時間行った。それから複製生成物を脱塩し、ミクロコムカラム(ミリポア)で濃縮した。
l.2.b 変異断片の選択的増幅およびクローン化
上記で得られた複製生成物はテイルプライマを用いた選択的PCRによって増幅した。プライマ(MG_619およびMG_621)はムターゼによって合成されるDNA断片の特異的増幅ができるように鋳型に非相補であるテイルを用いて設計した。PCR緩衝液(2OmM Tris-HCl pH 8.4、5OmM KCl)、1.5mM MgCl2、10pmolの5'および3'プライマ、200μμM-dNTPsおよび1.25 U Platinum Taq DNAポリメラーゼ(InvitroGen)を含む混合物に複製生成物画分を加えた。PCRサイクルは以下のとおり:第1サイクル:94℃で2分、64℃で10秒、75℃で30秒、94℃で1分、および30の選択サイクル:94℃で20秒および75℃で30秒。
増幅された複製生成物は(w/v)1%アガロースゲルで精製し、BamHIおよびEcoRI限定酵素で消化し、pMG58ベクターにクローンした。ライゲーション混合物を電気競合性(electrocompetent)のE. coll XL1-Blue細胞にトランスホームし、100μg/mlのアンピシリンおよび1%(w/v)グルコースを補った固体2YT培地(16g/5g lペプトン、10g/l酵母エキス、5g/l NaCl、15g/l寒天)に塗布した。成長後、コロニー数を求め、ライブラリの寸法を見積り、各ライブラリ当たり96クローンをランダムにPCRし、高速DNA塩基配列決定した。15%グリセリンを含む2YT培地に細胞を掻き取り、凍結し、-80℃に維持した。
第1ラウンドの突然変異生成およびスクリーニング(MS1)で4つの異なるライブラリを構築した。第1のライブラリは3.2×106クローンを含む野生型Fc遺伝子上でのpolβを使用して得た(Mut1.1と呼ぶ)。この第1のライブラリのDNAを用い、polβ(3.8×106クローン(Mut1.2))およびpolηおよびi(3.0×106クローン(Mut1.3))をそれぞれ使用して第2および第3のライブラリを作った。この2累積複製段階戦略で突然変異率を増やすことができる。第4のライブラリは野生型Fc遺伝子(1.0×106クローン、Mut1.4)のみでポリメラーゼηで作った。最後に、これらの4つのライブラリを正比例で混合して、1.1×107の異なるクローンを表すMut1とよばれる最終ライブラリを得る。
第2ラウンドの突然変異生成およびスクリーニング(MS2)ではMS1で単離し、ファージELISAでFcRn-接合性を改良した42の単一変異またはダブル変異体のDNAプールを用いて2つのライブラリを構築した。第1のライブラリはpolβ(1.9×107クローン、Mut2.1)で得られ、第2のライブラリはpolη(1×106クローン、Mut2.2)で得られた。最後に、これらの2つのライブラリを正比例で混合して2×107の異なるクローンを表すMut2とよばれる最終ライブラリを得た。
I. 2.c シークエンシングによるFcライブラリの品質管理
上記で作った各ライブラリの品質を細胞上のPCRで査定した。Fc遺伝子(5'−プライマ、5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'(SEQ ID番号7)および3'−プライマ、5'-TCACGTGCAAAAGCAGCGGC-3'(SEQ ID 番号8)を増幅し、高速シークエンシングした(5'−プライマ、5'-TGATTACGCCAAGCTTGC-3'(SEQ ID 番号9)。各ライブラリからランダムに採った96のクローン配列を(Mut1.4〜Mut1.1、Mut2.2〜Mut2.1)を決定した。最後に、プールしたライブラリMut1の35のクローンとプールしたライブラリMut2の86のクローンもシークエンシングして選択プロセスの前に最終ライブラリの品質を制御した。
変異した配列の変更を上記のソフトウェア(Mutanalyse 2.5のソフトウェアからFc分子に適応させたMilleGen社のMutanalyse4)(Mondon et al., Biotechnol J. 2: 76-82、2007)を使用して分析した)。この解析から突然変異は全遺伝子に沿ってランダムに分布し、「ホットスポット」は無いことが確認された。
Mut1の解析
Mut1ライブラリの突然変異頻度は1キロ塩基(kb)当たり6.3の突然変異であり、これは遺伝子(666nt)当たり4.2の突然変異があることを意味する。これらの突然変異の中で、81.4%は置換でり、16.8%は欠失であり、1.8%は付加であり、最後の2つのカテゴリは遺伝子にフレームシフトをさせる。フレーム中の配列だけを考慮すると、突然変異体頻度は1kb当たり4.0の突然変異であり1遺伝子当たり2.7の突然変異である(遺伝子当たり1〜6つの変化したヌクレオチド)。また、タンパクレベルでライブラリの活性部分を決定することで突然変異の解析をさらに行った。最後に、Mut1ライブラリは28.6%の野生型断片(非変異または、サイレント変異)を発現したクローン、40.0%のフレームからの配列またはストップコードン(非発現)を含むクローン、31.4%の変異した配列(Fc変異株)を有するクローンを含む。これらの最後のクローンは1分子当たり平均2.3の変化したアミノ酸を有する3.5×106の異なるクローンを含むライブラリの活性部分を表す。
Mut2の解析
Mut2ライブラリの突然変異頻度は1キロ塩基(kb)当たり4.5の突然変異であり、これは遺伝子当たり3.0つの突然変異に壮途うする。これらの突然変異の96.3%は置換であり、3.2%は欠失であり、0.5%は付加である。フレーム中の配列だけを考慮した場合、突然変異頻度は4.3/kbであり、遺伝子当たり2.9の突然変異である(1遺伝子当たり1〜7つのヌクレオチド変化1)。Mut2ライブラリはタンパクレベルで17.4%の野生型断片(非変化またはサイレント突然変異)を発現するクローンを含み、9.3%のフレームからの配列またはストップコードン(非発現)を含むクローン、73.3%の変化した配列(Fc変異株)を有するクローンを含む。これらの最後のクローンは1分子当たり平均して1.9の変異aaを有する1.5×107の異なるクローンを含むライブラリの活性部分を有する。
II. Fcライブラリのファージ提示発現およびFcRn改良物の選択
Fcライブラリを標準的手順(Smith GP, Science 228: 1315 (1985))を使用してファージM13の表面で発現させた。E. Mut1ライブラリ(pMG58ベクター)を含む大腸菌XL1-Blueバクテリアを、100μg/mlアンピシリン、15μg/mlテトラサイクリンおよび1%(w/v)グルコースを補った60mlの2YTでOD600nm=0.6に達するまで230回転数/分で3O℃で成長させた。それからら細胞を37℃で20分間、M13ヘルパーファージ(M13KO7、Biolabs、バクテリア/ファージ比=1/3)に感染させ、ファージFcの生産を2YT/アンピシリン/グルコース(0.5mM IPTGおよびカナマイシン30μg/ml)中で230回転数/分、26℃で一晩続けた。次の日、ファージを標準プロトコールを使用してPEG6000中に沈澱させ、1mlのリン酸緩衝液(pH6、(リン酸ナトリウム10OmM、塩化ナトリウム5OmM、pH6.0、P6をよばれる)に再懸濁させ、XL1-Blue細胞を感染させて滴定した。上記の3つの選択戦略を異なる条件を使用して適用し(図2)、1つの戦略に対して選抜を3〜8ラウンド実行した(下記参照)。
11.1. 固相上での選択(戦略1、2)([図2A]参照)
固相選抜のために、P6/5%脱脂乳/0.1%Tween 20中で4×1011ファージをMaxisorp免疫プレートの8つのウエルで培養した。各ウエルには予め0.5μgのニュートラビジン(neutravidin)、0.5μgのビオチニル化(biotinylated)FcRn(戦略1)または0.5μgのFcRn-p3(戦略2)を塗布し、P6中の5%脱脂乳でブロックした。
37℃で2時間培養した後、ウエルをP6/0.1% Tween 20で20回洗浄し、10OμlのpH7.4のリン酸緩衝液で37℃で2時間、培養溶出した(リン酸ナトリウム10OmM、塩化ナトリウム5OmM、pH7.4)/ウエル。滴定後、溶出したファージを用いて指数的に増殖したぺXL1-Blueバクテリアを10ml 再感染させ、固体2YT培地/アンピシリン/グルコースに塗布した。次の日、細胞を15%グリセリンを含む2YT培地に掻き取り、凍結し、80℃で保存した。
11.2. 液相での選択(戦略3)([図2B]参照)
液相での選択では最初に4×1011のファージを1mlのP6/5%脱脂乳/0.1%Tween 20中で低攪拌下に室温で1時間、25OnMまたは10OnMのビオチチル化したFcRnで培養した。予めP6中の5%脱脂乳でブロックしたストレプトアビディンで被覆した磁気ビーズ(Dynal)を室温で30分間、ファージに加えた。このファージ−ビーズ錯体を磁石を使用してP6/0.1%
Tween 20で15回洗浄した(磁気粒子選鉱機(Dynal))。ファージを室温で2時間、500μlのpH7.4リン酸緩衝液(リン酸ナトリウム10OmM、塩化ナトリウム5OmM、pH 7.4)中に培養溶出した。ビーズは磁石を用して捨て、上澄中に溶出したファージを集める。滴定後、溶出したファージを用いて10mlの指数的に増殖するXL1-Blueバクテリアを再感染し、その後、固体2YT培地/アンピシリン/グルコース上に塗布した。次の日、細胞を15%グリセリンで2YT培地に掻き取り、凍結し、次の選択ラウンドまで-80℃でストックした。
11.3. 配列解析
スクリーニング・プロセス(MS1およびMS2)では、各戦略のために、ラウンド3〜8から、48〜96のクローンを細胞のPCR(l.2-cで説明)後、配列決定した。配列解析は選択したFc変異株を迅速に分析するために内部開発しMilleGen社のソフトウェアAnalyseFcを使用して実行した。Fc変異株はそれを単離した選択ラウンドに従って名前を付けた(Mut1スクリーニング用:戦略1用にはB3A〜B6A、戦略2用にはS3〜S6A、戦略3用にはL3A/B〜L6A-F、Mut2スクリーニング用には戦略1用にC3A〜C8A、戦略2用にT3A 〜T8A、戦略3用にM3A/B)。数(1〜96)はシークエンシング用PCRプレート上の場所を示す。最後に全選択プロセス中に、227の異なる変異クローンをMut1のために単利し、Mut2のために223の異なる変異したクローンを単離した。これら全てのクローンはファージ−ELISAアッセイを使用して特徴付けた。
11.4. 目標突然変異生成
MS1で単離した改良型のFc-変異株の配列解析から、多数のクローンが類似した突然変異(N434Y、N434S、P230S、P230T ...)を含むことが明らかになった。付随する突然変異の効果をs綺羅かにするために、目標突然変異生成(directed mutagenesis)を行ってこれらの突然変異を除去した。これらの新しいミュータントは親のクローンの名前の後にAまたはBを付けて命名した。61の新しいミュータントをテストした。これらのミュータントは[表1]に示す。ポジティブとみなされるこれらミュータントはファージ−ELISAアッセイでFc−WTより1.2〜2.6-倍高い特異信号を有する(下記参照)。MS2後にヒンジ領域に1つまたは2つの突然変異を加えて、標的突然変異生成によっていくつかの新しいミュータントを構築した(P230SまたはP228LまたはP228RまたはP228L/P230SまたはP228R/P230S)。これらのミュータントは親クローンの名前の後に文字(A〜G)を加えて命名した。24の新しいミュータントをテストし、[表5]に示した。
II.5. 選択した変異株のファージELISAアッセイ(図3)
MS1、MS2で単離した変異株のファージで表された結合特性を、ウエルに塗布したFcRn-p3でELISAテストを用いpH6.0で決定した(図3)。簡単に言うと、ヘルパーファージM13K07に感染させた2YT/アンピシリングルコース中の800μl倍養液中に6-ウエルプレート上で単離したクローンとしてファージFc変異株を作った(パラグラフ3で説明した方法)。26℃で一晩かけて製造したファージを30分間300Ogで遠心分離して上澄中に回収した。この上澄をP6/5%脱脂乳/0.1%Tween 20に直接希釈(1/2および1/4)し、予め0.25μgFcRn-p3/ウエルを被覆し、P6中の5%脱脂乳でブロックしたMaxisorp 免疫プレート上でテストした。37℃で2時間培養の後、ウエルをP6/0.1%Tween-20で3回洗浄し、結合したファージをHRP抗M13抗体(GE Healthcare)で検出した。
このELISAテストを用いて、MS1中に選択した227Fc変異株を野生型Fc(Fc−WT)およびポジティブ対照と比較するテストを行った。ポジティブ対照(Fc−H変異株という)はダブル突然変異体T250Q/M428Lで、FcRnに対する親和性が改良されたものと記載されいる(x28, Hinton PR et al., J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216 (2004))。この変異株を突然変異コードンと制限サイトとを有する下記の2つの長いオリゴヌクレオチドを用いて標的なPCRプロトコルでジェネレートした:
5'プライマ5'CGGGATCCTGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACCAACTCATGATCTCCCGGAC-3'(SEQ ID NO:10)
3'プライマ5'GCGAATTCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGCGTGTAGTGGTTGTGCAGAGCCTCATGCAGCACGGAGCATGAGAAG-3'(SEQ ID NO:11)
(BamHIおよびEcoRI/制限サイトには下線を引いた。灰色は突然変異コードンに対応する)
ファージELISAアッセイで、Fc−H変異株は野生型FcすなわちFc−WTより平均して3.2-倍強い特定の信号(突然変異/Fc−WT比)を有し、テストした227のFc-変異株の中で、73の変異株が比/Fc−WT>3.2を示した。これはFcRnに対してFc−H変異株変異株より強い結合をすることを意味する(表2)。単一ポイントアミノ酸突然変異を有するMS1からのポジティブ変異株は野生型Fcより約1.2-倍〜3.5-倍強い特定信号を有する(表1参照)。
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MS2中に選択した223の変異株をELISAプロトコルを使用してテストしたが、同じELISAプレート上で比較するにはFc−WT信号とFc変異株の信号との相違が大き過ぎるためFc−H変異株およびMS1(S5A_41)中に単離した最高のFc変異株と比較した。テストした223のFc変異株の中で209のFc変異株はFc−Hより良く(比/Fc−H>1.1)、39のFc変異株はMS1中に単離した最高のFc変異株より良かった。各変異株をFc−WTと比較するために、各変異株の比/Fc−HにMS1中に求めたFc−H(= 3.2)の比/Fc−WTを掛けて予想比/Fc−WTを計算した(比/Fc−WT=3.2×比/Fc−H)(表3)。
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全体として、FcRnに対する結合性がFc−Hより良い282のFc変異株がMS1プロセスおよびMS2プロセスで単離された。これらの282のFc変異株の配列解析から分子全体に115の異なる位置で突然変異を含んでいることが明らかになった(表4)。
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さらに、下記の16の位置は優先して突然変異される重要な位置とみなされる:C226、P230、F241、V264、T307、N315、A330、Q342、Q362、A378、E382、N389、P396、V397、N421およびN434。特に、下記の4つの位置はより優先して突然変異される最も重要な位置とみなされる:V264、N315、A378およびN434(図4)。
MS1(S5A_41)の最高変異株と比較してFcRnに対してより良い結合性を有するMS2のFc変異株を[表5]に示す。
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III. Fc変異株の大腸菌発現
Fc−H変異株と同じFc−WT配列およびMS1およびMS2で単離したFc変異株は、BamHIおよびE.coli制限サイトを使用してpMG58 フアージミド(ファージmid)ベクターからpMG62ベクターにサブクローン(subクローン)し、精製用のC末端6xHisタグとELISAアッセイでの検出用V5タグとを有する可溶性周辺質(periplasmic)発現ができるようにした。組換え型Fcポリペチドの生産はHB2151大腸菌株において実行した(200℃で16時間、0.5mM IPTGで誘導)。精製は標準プロトコルを用いてNi-NTA上で実行し、各ポリペチドの約200-500μgを得た。
IV. ELISAおよび表面プラスモン共鳴(SPR)を用いたFc変異株のFcRn結 合特性
IV.1. Fc_WTと比べたS5A 41、S3A 07およびFc−H変異株のFcRn結合特性
IV.1.a ELISAアッセイ
可溶性フォーマットで産生したFc変異株の結合特性をウエルを被覆したFcRn-p3でpH6.0でELISAテストを使用して決定し、Fc−WTと比較した。P6/5%脱脂乳/0.1%Tween-20に連続的に希釈した精製Fc変異株(IIIに記載)をMaxisorp 免疫プレートでテストされた。この免疫プレートは予め0.25.μgのFcRn-p3/ウエルを被覆し、P6の5%脱脂乳でブロックした。37℃で2時間培養後、ウエルをP6/0.1% Tween-20で3回洗浄し、結合したFc-変異株をHRP抗V5抗体(invitroGen)で検出した(OD450nmの測定)(図5a)。ELISAテストは、S5A_41、MS1の最高変異株およびS3A_07、Fc−H変異株に均等な変異株、Fc−H変異株で実行した。これらのELISAテストによってFc−H、S5A_41、S3A_07がFc−WTと比較してFcRnに対する結合性が改善することを確認した(図5b、図5c、び図5d)。各結合曲線ではFc−WTと比較したFc変異株の結合特性を示すために、曲線の50%飽和でのFc濃度(EC50)の測定値を用いた。得られた比から、S5A_41がFc−H変異株より良い結合剤性を示し、S3A_07がFc−H変異株に匹敵することが確認された(表6)。
IV.I.b. SPR(表面プラスモン共鳴、Surface Plasmon Resonance)アッセイ
Fc変異株と固定されたFcRnとの相互作用をCM5センサーチップ(Biacore, GE Healthcare)を使用したBIAcore X100機器を用いてモニターした。この方法は上記でFc-FcRn相互作用を分析するために記載したものと同様である(Popov S. et al., MoI Immunol. 33(6):521 -530 (1996))。組換え型可溶性FcRnをアミン-カップリング化学を使用したセンサーチップのフローセル2にカップリングさせた。フローセルは0.1MのN-ヒドロキシスクシンイミドと0.1Mの3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル- N-エチルカルボジイミドの1:1混合物で30μl/分の流速3分間慣性化した。組み換えヒトFcRn(10mM酢酸ナトリウム中に5μg/ml、pH 5.0)を10μl/分で2〜8分間、フローセル2に注入し、結果は表面密度を1200〜1300応答単位(RU)となった。表面は1M− エタノールアミン-HCl、pH 8.5を3-分間注入してブロックした。フローセル1はFcRnを含まないコントロール(対照)として使い、同じサンプルフローセルと同様に調整した。このブランクフローセルからのデータをサンプル・データから引いた。
Fc断片をPBS/Tween-20(50mMリン酸緩衝液、pH 6.0、150mM NaCl、0.02% NaN3、0.01% Tween-20)で希釈し、それを平衡結合実験でランニング緩衝液として使用した。全ての測定は25℃で、一般に1〜200nMのFc断片濃度で10μl/分の流速で実行した。
データは10分間、PBSの1分-パルスで集め、表面の再生には0.05% Tween-20を含むpH 8を用いた。センサーグラム(Sensorgrams)を作り、BIAevaluationソフトウェア(バージョン3.1)を使用して分析した。各注入毎に観測された平衡RUをFc濃度に対してプロットした。BIAevaluationソフトウェアに含まれる安定状態親和性モデルを使用してプロット線を解析することによって平衡Kd値を得た。得られたるKd比から、S5A_41がFc−H変異株よりよい結合性であることと、S3A_07がFc−Hに匹敵することが確認された(表6)。
IV.1.c 得られた結果のまとめ
表6は、 (i)ファージELISA、(ii) ELISAおよび(iii) SPRによってFc−WTと比較した変異株S5A_41、S3A_07およびFc−HのFcRn結合能力を示す。全てのケースで変異株S5A_41はFc−WTより大幅に高い能力を示した。
Figure 0005770710
IV.2 SPRおよびELISAによりFc_WTと比較した他のMS2変異株のFcRn結 合特性
IIIuに記載の方法でMS2のいくつかのFc変異株を作った。各変異株のFcRn結合能力を上記IV.2.bおよびIV.2cに記載の(i)SPRおよび(ii) ELISAによって分析した。
結果は図7に示した。この[表7]は(i) SPRおよび(ii) ELISAでテストした各MS2変異株で得られた結果を示す。なお、上記で得られたELISA−ファージの結果も示してある。
ELISAおよびSPRアッセイから、全てのFc変異株はFcRnに対して野生型Fcより良い結合性を示すことが示され、これはファージFc変異株でのELISAアッセイで得られた全館の結果と一致した。pH=6でのMS2変異株のKd値は5.2〜22.7nMであり、これはFc−WTと比べて親和性が1.3〜5.8倍増加することに対応する。
Figure 0005770710
FcRnを異なるpH結合させるFc変異株の能力もELISAアッセイで調べた。上記でテストした各Fc変異株に対してpH=6でELISAアッセイを実行した時の0.8〜1.0の範囲のOD450nmを与える濃度でELISAアッセイを実行した。実験的条件とIV.I.aに記載のものである。[表8]はこのELISAアッセイを実行するのに使用した各Fc変異株の濃度を示す。
Figure 0005770710
[図7]は各変異株で得れれたELISAアッセイの結果を示す。OD450 nmは、固定されたFcRnに結合したFc変異株の量に関係する(HRP抗V5抗体で結合したFc変異株を検出)。OD450 nmでの特異的信号が高い程、FcRnに対するFc-変異株の結合はより強い。
[図7]はFcRnとFc変異株の結合がpHによって変化することを明らかに示している。予想した通り、pH 7,4でのFcRnに対するFc変異株の結合性はpH 6.0での結合と比較すると弱い。
本発明のFc変異株を得るために導入したアミノ酸変更によってpH 6.0でFcRnへの結合をFc−WTのそれと比較して大幅に増加でき、pH 7.4での結合は極めて低くしたままにすることができると結論できる。
実施例2
Fc変異株ベースのIgG変異株の製造と、このIgGの生物学的特徴
I. IgG変異株の発現
1.1. ベクター構築
Fc変異株C6A_69;C6A_78;T5A_74;C6A_74;C6A_60およびC6-A66を、YB2/0細胞系での抗CD20特異性を用いたIgGフォーマットで調製した。比較のために、野生型Fc(IgG−WT)をベースにしたIgGも作った。
YB2/0の細胞系の生産性を最大にするために、完全長の重鎖および軽鎖cDNAおよび変異株をコードするFc断片をRattus norvegicusに対するコードン最適化で合成した。暗号スプライシングサイトや制限サイトのような不必要な特徴は除去した。変数/恒常部結合には制限サイト(Apal)のみが存在する。
第1段階で、YB2/0の発現のために最適化した発現ベクターCHK622-08のNhelとAsclの間で野生型重鎖をクローンして、中間の構造物HCD20-Opti-GAにした。次に、最適化した軽鎖をSpelとXbal制限サイトの間でクローンして、野性型抗CD20抗体の発現のための最終構造物HKCD20-Opti-GA(以下、IgG−WTという)にした。
Fc変異株はHKCD20-Opti-GAに存在する野生型IgG1Fc断片を適当な変異に代えることで調製した。これをApalとAscl制限サイトの間でクローンした(図8a)。
全ての断片クローニングは従来バクテリアのトランスフォーメーションの古典的な消化/ライゲーション手順で行った。発現構造物は酵素消化にPCRを加え、シークエンシングして確認した。
1.2. 細胞培養生産
YB2/0細胞系(ATCC(CRL-1662))の5.106細胞を各発現線形ベクターと一緒にで電気穿孔し、RPMI 1640媒体+5% v/v透析FCS(InvitroGen)中に25,000細胞/mlに希釈し、1ml/ウエルで24-ウエルに分けた。3日後に細胞を回収し、ジエネティシン(geneticin)(Invitrogen)を最終0.5g/L、濃縮MTX(シグマ)を最終25mM、2ml/ウエルで加えることによって選択圧を加えた。11日間の培養後、耐性細胞は各々8つの構造物用(選択されたIgG MS2変異株、IgG−WTのコード用)に集め、DMEM媒体+5% v/v Ultra-lowIgG FCS(InvitroGen)で希釈し、0.9Lの細胞懸濁液の含む2L-ローラボトルの各々を2サイクル/分で培養する。細胞は成長し、死ぬ(4〜5日)。その前に上澄を回収し、低速度遠心して清浄し、容積を減し、Pellicon XL Filter(ミリポア)で限外濾過する。
II. IgG変異株の精製と特徴付け
濃縮した培養上清はをHiTrapプロテインA FFカラム(GE Healthcare)に注入した。結合した抗体はpH 3.0の0.1M−クエン酸ナトリウム緩衝液で溶出させ、各画分を1mlの溶出緩衝液当たり100μlのpH 7.5の1M−トリスを使用して中和した。抗体を含む画分を集め、PBS pH 6.0で透析し、サンプルを滅菌濾過(0.22ナノメートル)し、4℃で保存した。
精製したIgGをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で非還元性および還元性条件下で特徴付けた。クマシー青色染色(Coomassie Blue-stained) ゲルから、全ての突然変異で、IgGは95%以上の均質性で精製され、各IgGに対する特徴的な重鎖および軽鎖バンドが示された([図8]および[図8c])。
III. IgG変異株のFcRn結合特性
FcRnへのIgG変異株の結合特性を (i) ELISAアッセイ、(ii) SPRおよび(iii) 蛍光ラベ化したRituximab(抗CD20IgG)の存在下で先端を切ったFcRnを発現するJurkat-細胞株を用いた結合競合アッセイの3つの別々のテストで決定した。
III.1 ELISA
III.1a 材料および方法
Y2B/Oで産生したIgG変異株の結合特性をウエルに被覆したFcRn-p3でpH6.0でELISAテストを用いて決定した。比較のためにIgG−WTでもELISAアッセイを実行した。
精製したIgG変異株をP6/5%脱脂乳/0.1%Tween-20を用いて連続的に希釈し、予め0.1μgのFcRn-p3/ウエルで被覆し、P6中の5%脱脂乳でブロックしたMaxisorp 免疫プレートでテストした。37℃で2時間培養した後、ウエルをP6/0.1% Tween-20で3回洗浄し、結合したIgG変異株をHRP Fab'2ヤギ抗ヒトFab'2(Interchim)で検出した。
各IgG変異株に対して結合したFcRnの百分比をIgG-変異株の濃度(log)に対してプロットした。得られた各結合曲線で、曲線(EC50)の50%飽和に関連するIgG濃度の測定値を決定し、WT-IgGのEC50と比較した。
III.1.b ELISAの結果
ELISAテストの結果は、産生したIgG変異株はがWT-IgGと比べて、FcRnに対する結合性か増加することを示している。この事実は結合曲線([図9]参照)およびEC50値から明らかである。
下記の[表9]に示すように、IgG-変異株のEC50は野生型IgGより少なくとも5.8-倍以下低い。最大EC50はC6A_69変異株で得られる。
Figure 0005770710
III.2 SPRを用いたIgG/FcRn結合親和性の測
lll.2.a 材料および方法
IgG−WTおよびIgG変異株の固定したヒト組換え型FcRnとの相互作用をBIAcore X100機器(GE Healthcare)を用いて表面プラスモン共振(SPR)検出によってモニターした。実験のプロトコルはFc変異株(パラグラフIV.2b参照)で親和性を決定するのに使用したものと同様である。
各注入で観測される平衡RUをFc濃度に対してプロットした。平衡Kd値はBIAevaluationソフトウェアに含まれる安定親和性モデルを使用してプロット線の解析によって得た。動力学的パラメータはモデル1:2で解離相と会合層のデータをグローバルフィッテングして決定した。
lll.2.b SPRの結果
ヒトFcRnに対するIgG−WTの結合能(Kd値)は78,3nMであった。[表10]に示すように、6つのIgG変異株 Kd値は10.5〜18.8 nMで変動し、これはFcRnへの親和性がpH 6.0でのIgG−WTのそれと比べて4〜7倍増加することを示す。
Figure 0005770710
[表11]に示すように、WTに対するヒトFcRnへのIgG変異株の改良された親和性は主として会合キネティクス(kon値)の増加によるものである。すなわち、変異株konをWT-konで割った比は13〜23で、これはFcRnに対する変異株の親和性の大きな増加を示している。WTに対するIgG変異株のKoffof値の増加は2〜4で、これは会合に比べて解離が弱いことを示す。
Figure 0005770710
III.3 Jurkat-FcRnへの結合
lll.3.a 材料および方法
IgG−WTおよび変異株のFcRnとの相互作用の能力を評価するために、Dall'Ozzo達が記載の方法(Dall'Ozzo S, Tartas S, Paintaud G, Cartron G, Colombat P, Bardos
P, Watier H, Thibault G, Cancer Res., 2004 JuI 1 ;64(13):4664-9)の変形法で競合免疫蛍光法アッセイを実行した。
簡単に言うと、IgG−WTおよび変異株をPBS pH6に希釈して最終濃度を0,06〜2mg/mlにし、Alexa-共役 Rituximab(ラベル化Rituximab)の存在下で、50μg/mlの濃度でJurkat FcRn(150000セル)と一緒に培養する。20分後、細胞をフローサイトメトリで分析して、結合したAlexa-共役 Rituximabを定量する。結果は平均蛍光強度(MFI)の百分比で表される。100%は Alexa- Rituximab単独(すなわち競争なし)で得られる平均蛍光強度(MFI)であり、0%はJurkat FcRnがAlexa-共役 Rituximabと一緒に培養されなかった時の測定MFI値である。各実験は3回行った。
コントロール(対照)は(i) ラベル化なしのRituximabまたは(ii)IgG−WTの培養から成る。
各テストしたIgGに対してMFIをIgG濃度(log)に対してプロットした。MFI信号の50%阻害を与える各テストしたIgGの濃度(IC50)を決定した。このアッセイの一般的な説明は下記特許文献12(フランス特許第FR 2 894 983号公報)にも記載されている。
フランス特許第FR 2 894 983号公報
III.3.b 実験結果
[図11]にいくつかの結果を示す。この図では本発明およびJurkatFcRnの各種変異株の結合またはRitixanを上記の「材料および方法」に記載のようにして決定し、平均蛍光強度(MFI)値で表してある。
下記の[表12]に示すように、本発明の変異株で得られるIC50はWT-IgGにで得られるそれに比べて大幅に低い。本発明のIgG変異株のIC50の減少度はC6A_66を除いて40〜60-倍である。
Figure 0005770710
III.4 結論
FcRnへのIgG変異株の結合特性を特徴付けるために実行した3,の別々のテストは一貫した結果を与えた。全てのケースで本発明のIgG変異株はFcRnに対してIgG野生型のそれと比べて結合性か大きく増加した。
IV. IgG変異株の機能上の特徴と、G-WTおよびLFB-R603との比
Fcγリセプタを結合するIgG変異株の能と、そのADCCおよびCDC活性をアッセイしてその生物学的機能を完全に特徴付けた。
IV.1 hFcγRIIIAに結合するIgG変異株の結合性
IV.1a. ELISAアッセイ:固定した組換え型hFcγRIIIAに結合するIgG変異株の 結合性
ヒト組換え型FcγRIIIA(F158アロタイプ)をEZ-link NHS-PEOキット(Pierce)でビオチン化し、アッセイ緩衝液(25mMトリス、150mM- NaCl、pH 7.35、0.05% Tween-20、0.1% BSA)中に1μg/mlに希釈し、react-bind(登録商標)ストレプトアビ遺伝子 ELISAプレート(Pierce)上に塗布し、室温で2時間培養した。この培養中に、5μg/mlのIgGと2μg/mlのワサビペルオキシダーゼでラベル化したF(ab')2抗ヒトF(ab')2(Jackson ImmunoResearch)とを室温で2時間混合して、緩衝液中にIgG-F(ab')2抗-F(ab')2錯体が作られる。一連の希釈をした錯体をプレートに加え、室温で2時間穏やかに振盪して培養する。プレートをアッセイ緩衝液で洗浄した後、hFcγRIIIAへ結合した錯体をTMB(Pierce)で検出した。450nmでの吸光度をプレートリーダ(Tecan)を使用して読んだ。
各IgG変異株に対して結合したFcγRIIIA(OD450nmから得られる)の百分比をIgG-変異株の濃度に対してプロットした。
[図10]に示すように、、hFcγRIIIAへのIgG変異株の結合性はhFcγRIIIAと結合しない変異株C6A_66を除いて、IgG−WTのそれと同様である。
IV.2 ADCC活性
天然キラー細(NK細胞)は健康なドナーの抹消血液からMiltenyi社が開発したネガティブ減損法を用いて精製した。ADCCテストでは異なる濃度の抗CD20抗体の存在下で、CD20リセプタを発現するRaji株の標的細胞と一緒にNK細胞を培養する。16時間培養した後、抗CD20抗体が誘導した細胞毒性をクロマトグラフで測定し、溶解した標的細胞が開放した細胞上澄中の乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)と呼ばれる細胞内酵素のレベルを定量する。結果は[図12]に示してある。
特異的リーシス(溶離)の結果、リーシスパーセントが抗体濃度の関数として表される。EC50(最大細胞溶解の50%を誘発する抗体量)はPRISMソフトウェアを使用して計算した。対照実験は (i) Rituximab、(ii) Y2/0細胞およびLFB-R603中に産生されるWT−IgGを用いて実行した。LFB-R603がADDC機能を有する抗CD20抗体であることは下記文献の記載の通り公知である:de Romeuf et al. in 2004 (de RomeuFc, Dutertre CA, Le Garff-Tavernier M, Fournier N, Gaucher C, Glacet A, Jorieux S, Bihoreau N, Behrens
CK, Beliard R, Vieillard V, Cazin B, Bourel D, Prost JF, Teillaud JL, Merle-Beral H。すなわち、慢性リンパ球白血病細胞はFcγRIIIA/CD16の改良のために選択した抗CD20モノクローナル抗体で能率的に殺される:Br J Haematol. 2008 Mar;140(6):635-43)。また、特許文献13(国際特許第W02006/064121号公報)にも記載されている。
[表13]は各変異株のEC50とLFB-R603およびWT-IgGと比較したIgG変異株のADCC機能を示している。全てのIgG変異株は、C6A_66変異株を除いて、ADCC活性を示す。C6A_66変異株はADCC活性がなく、それはFcγRIIIに対する極めて低い親和性と一致している。
C6A_69、C6A_60およびC6A_74はIgG−WTと比べてADCC活性が増加する点に注意する必要がある。他の変異株(すなわちC6A_78およびT5A_75)はIgG−WTのそれと同様なADCC活性を有する。
Figure 0005770710
IV.3 CDC活性
こここでは、標的CD20+Raji株の細胞を、補助ソースとしてのベビー・ウサギ漿液(Cedarlane参照番号CL3441、希釈度1/10)の存在下で、抗CD20抗体の異なる濃度(0〜5000ng/ml)で培養した。37℃で1時間培養後、溶解した標的細胞によって上澄中に開放されたLDHの量をクロマトグラフ (Roche Applied Sciences Cytotoxicity Detection Kit)で測定し、抗体を介した補体依存性細胞毒性を定量した。結果は細胞溶解の百分比で表しした。EC50(最大細胞溶解の50%を誘発する抗体量)およびEmax(最大細胞溶解百分比)はPRISMソフトウェアを使用して計算した。
[表14]は各変異株で得られたEmaxおよびEC50を示す。CDC活性レベルはIgG変異株によって変化する。C6A_78およびC6A_60はIgG−WTよりかなり高いCDC活性を示す。C6A_69、T5_74およびC6A_66のCDC活性は低い。C6A_74変異株のCDC活性はIgG−WTと同様である。
Figure 0005770710
IV.3 結論
Y2B/0細胞株が産生する組み換え型の6つの本発明のIgG変異株はIgG−WTと比べてFcRnリセプタに対して結合性が増加する(同じ宿主細胞で同じ条件下で)。
本発明のIgG変異株は、FcgRIII少なくとも同じ結合能を有し、IgG−WTと少なくとも同じADCC活性を有す(但し、FcgRIIIに対する親和性が悪いC6AA_66は除く)。
IgG変異株は別々のCDC活性を示す。
いくつかの観点から、本発明によるアミノ酸変更によって対応する親IgG(例えばIgG−WT)と少なくとも同様な一つ以上のFcエフェクタ活性を有し且つFcRnに対する結合性が増加したIgG変異株を得ることができる。
別の観点から、本発明のアミノ酸変更によって、例えばCDCまたはADCCのような少なくとも一つの減少したFcエフェクタ活性を有し且つFcRnに対する結合性が増加したIgG変異株を得ることができる。
[表15]は本研究のIgG変異株に関する主たる結論を示している。
Figure 0005770710
Figure 0005770710

Claims (13)

  1. c領域に少なくとも2つのアミノ酸の変異を有する、親ポリペチドに比べてFcRnに対する結合性が増加した親ポリペチドの変異株であって、上記の少なくとも2つのアミノ酸の変異がFc領域の下記の(i)と(ii)の変異から成ることを特徴とする変異株:
    (i) 378V、378T、434Yおよび434Sから成る群の中から選択される1つのアミノ酸変異
    (ii) 226G、P228L、P228R、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、362R、378V、378T、389T、389K、434Yおよび434Sから成る群の中から選択され少なくとも1つのアミノ酸変異、
    (ただし、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatのEUインデックスでの数え方であり、(i)の変異は(ii)の変異と同じアミノ酸位置では起こらない)
  2. 上記変異株が親ポリペチドと比較してFc領域の下記の群の中から選択される少なくとも一つのアミノ酸変異組合せを有する請求項1に記載の変異株:226G/315D/434Y、230S/315D/434Y、
    230T/315D/434Y、230T/264E/434S、
    230T/389T/434S、241L/264E/378V、
    241L/264E/434S、250A/389K/434Y、
    2591/315D/434Y、264E/378T/396L、
    264E/378V/416K、264E/378V/434S、
    264E/396L/434S、294del/307P/434Y、
    307P/378V/434Y、315D/330V/434Y、
    315D/382V/434Yおよび378V/383N/434Y、
    (ただし、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatのEUインデックスでの数え方である)
  3. 上記変異株が親ポリペチドと比較してFc領域の下記の群の中から選択される少なくとも一つのアミノ酸変異さらに有する請求項2に記載の変異株:
    226G、227L、230S、230T、230L、231T、241L、
    243L、250A、256N、259I、264E、265G、267R、
    290E、294del、303A、305A、307P、307A、
    308I、315D、322R、325S、327V、330V、342R、
    347R、352S、361D、362R、362E、370R、378V、
    378T、382V、383N、386R、386K、387T、389T、
    389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、
    415N、421T、416K、426T、428L、433R、434Y、
    434Sおよび439R
    (ただし、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatのEUインデックスでの数え方である)
  4. 上記変異株が親ポリペチドと比較してFc領域の下記の群の中から選択される少なくとも一つのアミノ酸変異組合せを有する請求項1または2に記載の変異株:
    307A/315D/330V/382V/389T/434Y、
    256N/378V/383N/434Y、
    315D/330V/361D/378V/434Y、
    2591/315D/434Y、
    230S/315D/428L/434Y、
    241L/264E/307P/378V/433R、
    250A/389K/434Y、
    305A/315D/330V/395A/434Y、
    264E/386R/396L/434S/439R、
    315D/330V/362R/434Y、
    294del/307P/434Y、
    305A/315D/330V/389K/434Y、
    315D/327V/330V/397M/434Y、
    230T/241L/264E/265G/378V/421T、
    264E/396L/415N/434S、
    227L/264E/378V/434S、
    264E/378T/396L、
    230T/315D/362R/426T/434Y、
    226G/315D/330V/434Y、
    230L/241L/243L/264E/307P/378V、
    250A/315D/325S/330V/434Y、
    290E/315D/342R/382V/434Y、
    241L/315D/330V/392R/434Y、
    241L/264E/307P/378V/434S、
    230T/264E/403T/434S、
    264E/378V/416K、
    230T/315D/362E/434Y、
    226G/315D/434Y、
    226G/315D/362R/434Y、
    226G/264E/347R/370R/378V/434S、
    3081/315D/330V/382V/434Y、
    230T/264E/378V/434S、
    231T/241L/264E/378T/397M/434S、
    230L/264E/378V/434S、230T/315D/330V/386K/434Y、
    226G/315D/330V/389T/434Y、
    267R/307P/378V/421T/434Y、
    230S/315D/387T/434Y、
    230S/264E/352S/378V/434Sおよび
    230T/303A/322R/389T/404L/434S
    (ただし、Fc領域のアミノ酸の数え方はKabatのEUインデックスでの数え方である)
  5. 変異株が抗体である請求項1〜4のいずれか一項に記載の変異株。
  6. 抗体がIgG抗体である請求項5に記載の変異株。
  7. 請求項1〜6のいずれか一項に記載の変異株含む医薬組成物。
  8. 請求項1〜6のいずれか一項に記載の変異株をコードする単離された核酸。
  9. 請求項8の核酸を含むベクター。
  10. 請求項9のベクターを含む宿主細胞。
  11. 請求項10の宿主細胞を培養して上記抗体を発現させる請求項1〜6のいずれか一項に記載の変異株を作る方法。
  12. 請求項1〜6のいずれか一項に記載の変異株を含む医薬品。
  13. 請求項1〜のいずれか一項に記載の変異株の医薬品製造での使用。
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