JP5951856B2 - 最適化されたＦｃ変異株 - Google Patents

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Description

本発明は、Ｆｃ領域を含む親ポリペチドの変異株（ミュータント、variants）に関する
ものである。
この変異株は親ポリペチドと比べてＦｃＲｎに対する結合性が増加し、Ｆｃ領域中にも
少なくとも一つのアミノ酸突然変異を有する。
モノクローナル抗体は、ガン、自己免疫性疾患、慢性炎症性疾患、移植拒絶反応、感染
症および心血管病気を含む各種状態の治療で治療方学として使用されている。現在、20種
以上のモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体断片製品が流通されており、400種
以上が臨床開発中である。こうした市況および承認にもかかわらず、抗体の構造上および
機能上の特性を最適化するという大きなニーズが残っている。
モノクローナル抗体を治療で使用する上で大きな問題の1つは、それが循環血液中に残
ることである。抗体のクリアランス速度は治療効果、従って、患者に悪影響を生じさせる
医薬品の投与頻度および投薬量に直接影響し、医学コストを増大させる。
ＩｇＧは最も普及している免疫グロブリンのクラスであり、ヒトの治療で最も多く利用
されている。ＩｇＧホメオスタシス機構は母親から胚または齧歯動物の新生児への受動免
疫のトランスファーに関する研究で明らかになった(非特許文献１〜３)。初期の研究でBr
ambellはＩｇＧの母胎間（maternofetal）伝達のためのレセプタがあり、このＩｇＧの母
胎間伝達およびＩｇＧ異化に関与する機構は同じものであるか、少なくとも非常に密接に
関連していると仮定した（非特許文献１)。
研究の結果、分極細胞中またはそれを横切るＩｇＧの運搬はＦｃ領域が高い親和性のＦ
ｃレセプタ（新生Ｆｃレセプタ（ＦｃＲｎ）といわれる）に結合することによって仲介さ
れるということが分かった。このＦｃＲｎは主組織適合性複合クラスＩ分子のα-鎖の細
胞外領域に対して構造上の相同性を有するトランスメンブレンα-鎖Ｉ分子とβ２−ミク
ログロブリン（β２ｍ）とから成る可溶性の軽鎖から成るヘテロダイマである (非特許文
献４)。
ヒトではＦｃＲｎは胎盤細胞、腸、腎臓、気管支細胞、血管内皮細胞、上皮細胞、造血
細胞、例えば小腸マクロファージ、単核細胞および単核細胞派生樹状細胞で発現される(
非特許文献５)。ＦｃＲｎはその２つの主たるリガンドＩｇＧおよび血清アルブミンに結
合し、pH依存性で、pH 6.0〜6.5で有効な結合が起こり、pH 7.0〜7.5で解放する (非特許
文献６)。
異化(catabolism)からＩｇＧを保護する機構としてはＩｇＧが非特異性のピノサイトー
シスによって血管内皮細胞のエンドソームに内面化され、低pHでＦｃＲｎへの結合が促進
されるという機構が提案されている(非特許文献７)。結合したＩｇＧ-ＦｃＲｎ錯体が細
胞表面へ再循環され、細胞外液の中性pHで分離し、血液循環中へ戻る。ＦｃＲｎに結合し
ないＩｇＧはリソソームへ送られ、プロテアーゼによって分解される。低漿液ＩｇＧ濃度
で生き残ったＩｇＧの濃度依存異化機構によってリセプタは全てのエンドサイトーシス（
endocytosed）ＩｇＧを結合し、それを効率的に循環形に返し、ＩｇＧ半減期を長くする
。逆に、高ＩｇＧ濃度ではリセプタがＩｇＧで飽和され、ＩｇＧの主画分がリセプタによ
って結合解除され、劣化し、束縛を解かれたＩｇＧがより急速に異化する。
ハツカネズミＩｇＧのＦｃ領域の各種部位特異的突然変異実験によって、ＩｇＧとＦｃ
Ｒｎとの間の相互作用に関係するある種の重要なアミノ酸残基が確認された非特許文献７
〜11)。これらの研究および配列比較研究から、位置253のイソロイシン、的位置310のヒ
スチ遺伝子、位置435のヒスチ遺伝子（Kabatに従った番号)がヒトおよびウサギで高度に
保持され、結合ＩｇＧ-ＦｃＲｎでのその重要性を示唆していることが見出された(非特許
文献12)。これらのアミノ酸残基はCH2-CH3領域界面に位置し、ラットＦｃと錯体化したラ
ットＦｃＲｎのＸ−線結晶構造でこれら残基に対する機能サイトのマッピングが作られた
(非特許文献13）。
非特許文献14ではハツカネズミＩｇＧ１ Ｆｃ-ヒンジ断片の位置252、位置254および位
置256がランダムに突然変異化（mutagenized）された。そのぞれ、1つのミュータントは
ハツカネズミＦｃＲｎに対して３倍の親和性を示し、２つのハツカネズミ株では半減期が
野生型と比べ約23％または65％長くなった。
非特許文献15では、Ｆｃ領域の位置253、位置310または位置435のアミノ酸置換によっ
てヒトＩｇＧ1を突然変異して突然変異Ｆｃヒンジ断片が野性型ＩｇＧ1 Ｆｃ-ヒンジ断片
と比較してハツカネズミ漿液中の半減期を減らすことを示し、Ne253、His310およびHis43
5がＩｇＧの漿液半減期のコントロールで中心的な役割を演じていると結論している。
非特許文献16はキメラのヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域の位置253の一つのアミノ酸の置
換でハツカネズミの排除を加速し、固形腫瘍の免疫シンチグラフィを改善することを示し
た。
非特許文献17はアラニン走査突然変異生成を用いてヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域の残基
を変え、ヒトＦｃＲｎへの結合性をアセスしている。アラニンに変えた時のＦｃＲｎ結合
性を効果的に排除する位置には1253、S254、H435およびY436が含まれる。結合性がそれよ
り少なく減少した他の位置はE233-G236、R255、K288、L309、S415およびH433である。ア
ラニンに変えた時にいくつかのアミノ酸位置でＦｃＲｎ結合性が改良した。特にP238、T2
56、E272、V305、T307、Q31 1、D312、K317、D376、E380、E382、S424およびN434で顕著
である。多くの他のアミノ酸位置でＦｃＲｎ結合性がわずかな改良を示し（D265、N286、
V303、K360、Q362およびA378）すか、変化がなかった（S239、K246、K248、D249、M252、
E258、T260、S267、H268、S269、D270、K274、N276、Y278、D280（V282）E283、H285、T2
89、K290、R292、E293、E294、Q295、Y296、N297、S298、R301、N315、E318、K320、K322
、S324、K326、A327、P329、P331、E333、K334、T335、S337、K338、K340、Q342、R344、
E345、Q345、Q347、R356、M358、T359、K360、N361、Y373、S375、S383、N384、Q386、E3
88、N389、N390、K392、L398、S400、D401、K414、R416、Q418、Q419、N421、V422、E430
、T437、K439、S440、S442、S444およびK447）。
最も大きな加算性(additivity)はＦｃＲｎに対する結合性が改良された複合変異株 (co
mbination 変異株)の場合である。例えばE380Aでは2倍、N434Aでは3倍であるが、E380A/N
434A変異株はpH 6.0で天然のＩｇＧ１に対してＦｃＲｎに対する結合性が8倍強くなる。
これにT307Aを加えると天然ＩｇＧ１に対して結合性は12倍改良する。
非特許文献18はランダム突然変異生成とハツカネズミＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１ヒ
ンジ-Ｆｃ断片ファージのスクリーニングのライブラリを示しており、位置251、252、254
-256、308、309、311、312、314、385-387、389、428、433、434および436でのランダム
突然変異生成を記載している。ＩｇＧ1-ヒトＦｃＲｎ錯体の安定性の主たる改良はＦｃ-
ＦｃＲｎ境界（M252、S254、T256、H433、N434およびY436）を横切るバンド中に位置する
残基の置換で起こり、より小さい改良はV308、L309、Q311、G385、Q386、P387およびN389
でのような末梢での残基の置換で起こる。ヒトＦｃＲｎに対して最も高い親和性を示す変
異株は例えばM252Y/S254T/T256E突然変異とH433K/N434F/Y436H突然変異とを組合せた時に
得られ、天然型ＩｇＧ１に対して57倍の増加を示す。
非特許文献19には２つの突然変異（T250QおよびM428L）が記載され、これらはヒトＦｃ
Ｒｎに対するヒトＩｇＧ2の結合性をそれぞれ約3倍および7倍増加させる。これらの２つ
の突然変異は、組み合わせると、ＩｇＧ2の28倍の結合能の増加を誘発する。薬物動態学
研究のためにM428LおよびT250Q/M428の両方のＩｇＧ2ミュータントをアカゲザルに注射す
ると野生型抗体より半減期が約２倍長くなる。
非特許文献20には、位置252、254および256でＦｃ領域を変化させたヒト型抗-ＲＳウィ
ルスＩｇＧ1（M252Y/S254T/T256E）が記載されている。これらの突然変異はヒトＦｃＲｎ
に対する結合性をpH 6.0で約10倍増加させ、pH 7.4で効率的な解除を許す（非特許文献18
）。こうした変移させたヒトＩｇＧ1のインビボ挙動によってカニクイザルで漿液の半減
期を野生型ＩｇＧ1と比べてほぼ４倍増加する。
さらに、半減期を変えた生理活性分子を得る方法は種々の文献に記載されており、Ｆｃ
Ｒｎ-結合ポリペチドを分子中に入れる（特許文献１〜５）方法や、上記分子をＦｃＲｎ-
結合親和性を保存し、他のＦｃレセプタに対する親和性を大きく減少させた抗体と溶合す
る方法（特許文献６）や、抗体のＦｃＲｎ結合領域と溶合する（特許文献７、８）方法が
ある。
特許文献９には抗体をコードするＤＮＡセグメント中に突然変異を誘導して生物学的半
減期を減少された抗体を生産する方法が開示されている。この突然変異にはＦｃ-ヒンジ
領域の位置253、310、31 1、433または434のアミノ酸の置換が含まれる。上記で引用した
特許文献９およびその他全て米国特許の開示内容は本明細書の一部を成す。
特許文献１０にはＦｃＲｎ結合能を変えた突然変異Ｆｃ領域を有するポリペチドが開示
されている。このポリペチドはＦｃ領域のアミノ酸位置238、252、253、254、255、256、
265、272、286、288、303、305、307、309、31 1、312、317、340、356、360、362、376
、378、380、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439および447の任意
の一つ以上のアミノ酸が突然変異し、Ｆｃ領域の残基の位置の数え方はＥＵインデックス
の位置の数え方 (上記Kabat et al.) と同じである。
特許文献１１には、野性-型ＩｇＧの不変領域に対して一つ以上のアミノ酸を変異させ
たＩｇＧ不変領域を有する変成ＩｇＧが開示されている。変成したＩｇＧは野性型ＩｇＧ
の不変領域に比べてＩｇＧの半減期が増加し、一つ以上のアミノ酸変異は位置251、253、
255、285-290、308-314、385-389および428-435の一つ以上で行われる。
国際特許第WO97/43316号公報 米国特許第5,869,046号明細書 米国特許第5,747,035号明細書 国際特許第WO96/32478号公報 国際特許第WO91/14438号公報 国際特許第WO99/43713号公報 国際特許第WO00/09560号公報 米国特許第4,703,039号明細書 米国特許第6,165,745号明細書 国際特許第WO00/42072号公報 国際特許第WO02/060919 A2号公報
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しかし、さらに最適化した新規なＦｃ変異株に対するニーズが依然としてある。
本発明は、最適化された性状を有する親ポリペチドの変異株を提供する。 この最適化
された特性には対応する親ポリペチドよりＦｃＲｎに対する高い結合性が含まれる。本発
明の好ましい実施例では、親のポリペチドの変異株は親ポリペチドに比べてＦｃＲｎに対
する結合性か増加したＦｃ領域を有し、親ポリペチドのＦｃ領域中に少なくとも一つのア
ミノ酸突然変異を有し、その突然変異は親ポリペチドに対してＦｃ領域の中の下記の群の
中から選択される：226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、25
2、256、259、264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291 , 292, 2
94, 297, 298, 299, 301 , 302, 303, 305, 307, 308, 309, 31 1 , 315, 317, 320, 322
, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355
, 356, 359, 360, 361 , 362, 369, 370, 371 , 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 3
86, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 , 403, 404,
408, 41 1 , 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433、434
、438、439、440、443、444、445、446および447。(ここで、Ｆｃ領域のアミノ酸の数え
方はKabat中でのＥＵインデックスの数え方と同じである)
本発明の他の実施例では、本発明は本発明の変異株を含む医薬組成物を提供する。
本発明の他の実施例では、本発明は本発明の変異株をコードする単離された核酸を提供
する。
本発明の他の実施例では、本発明は上記核酸を含むベクターを提供する。
本発明の他の実施例では、本発明は上記ベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明の他の実施例では、上記宿主細胞を培養して核酸を発現させることから成る、ポ
リペチド変異株の生産方法を提供する。
本発明の他の実施例では、本発明は本発明の変異株を含む医薬品を提供する。
本発明の他の実施例では、本発明は医薬品製造での本発明変異株の使用を提供する。
本発明の他の実施例では、本発明はＦｃ最適化変異株を識別する方法を提供する。
はヒトＩｇＧ１重鎖（Ｆｃ226（SEQ番号１））に由来するアミノ酸残基226-447 (KabatでのＥＵインデックス)をコードするヒトＦｃ遺伝子がクローンされたファージミド（ファージmid）ベクターpMG58を示す図。 CVDE：VMA1-由来のエンドヌクレアーゼのＣ末端部、 VMA：空胞（vacuolar）ＡＴＰアーゼ・サブユニット（VMA）、 CPIII：ファージM13のカプシドタンパクpIII（またはp3）のＣ末端部。 は固相（2A）および溶液中（2B）でＦｃ変異株を選択するのに使用する方法を示す図。 ＦｃＲｎ-biotはビオチチル化（biotinylated）ＦｃＲｎを表し、 ＦｃＲｎ-p3はＦｃＲｎ-p3融合タンパクを表す。 Ｆｃ-ファージはそのカプシッド上にＦｃ変異株を発現するファージM13である。固相選択法では免疫プレート（免疫プレート）のウエルにＦｃＲｎ-p3融合タンパク（ＦｃＲｎ-p3）またはニュトラビディン（neutravidin）、次いでＦｃＲｎ-biotを被覆する。 は選択したＦｃ変異株で実施したファージ−ＥＬＩＳＡアッセイの原理を示す図。Ｆｃ-ファージはそのカプシッド上にＦｃ変異株を発現するファージM13であり、ＦｃＲｎ-p3は免疫プレートのウエルに被覆したＦｃＲｎ-p3融合タンパクであり、抗−M13はＥＬＩＳＡ検出用に使用したホースラディシュ（Horseradish）ペルオキシダーゼ（HRP）に溶合したハツカネズミ抗M13抗体である。 はＦｃ ＩｇＧ１の各アミノ酸位置に対するその位置で突然変異を含む変異体の百分比を表すヒストグラム。Ｘ−座標：変異位置でのKabatでのＥＵインデックスに従ったアミノ酸数。Ｙ−座標：変異位置を含むＦｃ変異株の百分比。
はＦｃＲｎに対するＦｃ変異株の結合能を測定するためのＥＬＩＳＡアッセイの原理を示す。ＦｃＲｎ-p3は免疫プレートのウエルを被覆したＦｃＲｎ-p3融合タンパクであり、ＦｃはＥＬＩＳＡ検出用のV5タグを有するＦｃ変異株であり、抗V5はHRPに溶合させた抗V5抗体である。ＥＬＩＳＡ検出には抗体を使用した。 は実施例１に記載のIV.1.aでのＥＬＩＳＡアッセイで得られた野生型Ｆｃ（丸）およびＦｃ−Ｈ変異株（四角）の投与量効果曲線を示す。Ｘ−座標：Ｆｃポリペチドの濃度、Ｙ−座標：Ｆｃポリペチドに結合したＦｃＲｎの百分比。 は実施例１に記載のIV.1.aでのＥＬＩＳＡアッセイで得られた野生型Ｆｃ（丸）およびS3A_07変異株（四角）の投与量効果曲線を示す。Ｘ−座標：Ｆｃポリペチドの濃度、Ｙ−座標：Ｆｃポリペチドに結合したＦｃＲｎの百分比。 は実施例１に記載のIV.1.aでのＥＬＩＳＡアッセイで得られた野生型Ｆｃ（丸）およびS5A_41変異株（四角）の投与量効果曲線を示す。Ｘ−座標：Ｆｃポリペチドの濃度、Ｙ−座標：Ｆｃポリペチドに結合したＦｃＲｎの百分比。 は天然ヒトＩｇＧ１配列の位置216-447（KabatでのＥＵインデックスに従う）とヒトＩｇＧ4（SEQ ID NO：16）、ヒトＩｇＧ3（SEQ ID NO：15）およびヒトＩｇＧ2（SEQ ID NO：14）の対応配列とのアランメントを示す図。ＩｇＧ１配列はG1m1,17アロタイプ（SEQ ID NO：12）およびG1m3アロタイプ（SEQ ID NO：13）である。ＩｇＧ１の「低部ヒンジ-CH2-CH3」領域は位置216から開始する（矢印参照）。 は各種pHで実行したＦｃＲｎに対するＦｃ-変異株の結合能を示すためのＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図（詳細は実施例2のIV.2を参照）。このヒストグラムは各変異株に対してpH=6（黒棒）、pH＝6.5（白棒）またはpH＝7.4（灰色棒）で実行したＥＬＩＳＡアッセイのＯＤ450nmの値を表す。ＯＤ450nm値はＦｃ変異株に結合した固定ＦｃＲｎの量に関係する。
はＦｃ変異株を含む組換え型ＩｇＧ１抗体を発現するための発現ベクターの模式的な地図を示す。得られた組換え型ＩｇＧ１抗体はCD20抗体に対して特異的な結合性を有する。明細書および実施例に記載の突然変異を含む重鎖の恒常部をコードする核酸は、[図8a]に示すように、Apa1とHKCD20-Opti-GAベクター中に存在するAsclクローンサイトとの間に挿入される。 の図８ｂおよび図８ｃはそれぞれ非還元条件下および還元条件下でのＩｇＧ変異株のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。(1) 野生型Ｆｃから成ＩｇＧを表し、(2) Ｆｃ−Ｈ変異株から成るＩｇＧを表し、(3) C6A_69から成るＩｇＧを表し、(4) C6A_78から成るＩｇＧを表し、(5) T5A_74変異株から成るＩｇＧを表し、(6) C6A_74変異株から成るＩｇＧを表し、(7）C6A_60変異株から成るＩｇＧを表し、(8）C6A_66変異株から成るＩｇＧを表す。 はＦｃＲｎに対するＩｇＧ変異株の結合性を特徴付けるために実施例2の111.1で行ったＥＬＩＳＡアッセイで得られた本発明ＩｇＧ変異株（「1」）および野生型のＩｇＧ変異株（「2」）の投与量効果曲線。Ｘ−座標：ＩｇＧ濃度、Ｙ−座標：ＩｇＧに結合したＦｃＲｎの百分比。
は本発明のＩｇＧ変異株のＦｃγRlllaに対する親和性を特徴付けるためのＥＬＩＳＡアッセイで得られた投与量効果曲線。（1）C6A_66変異株で得られた曲線、（2）Rituximabで得られた曲線、（3）C6A_69；C6A_78；T5A_74；C6A_74；C6A_60変異株および野生型ＩｇＧで得られた曲線。 ＥＬＩＳＡアッセイは実施例２のIV.1a.に記載の方法で実行した。Ｘ−座標：ＩｇＧの濃度、Ｙ−座標：ＩｇＧに結合したＦｃγRlllaの百分比。 はJurkat ＦｃＲｎに対する各種組換え型ＩｇＧの結合性を示す図。［図11］は「材料と方法」で説明したJurkat ＦｃＲｎに対する本発明の各種変異株の結合性またはRitixanを示す。平均蛍光強度（MFI）で表す。 は本発明のＩｇＧ変異株に対するADCCアッセイで得られた投与量効果曲線。（1) C6A_66変異株の曲線、（2）Rituximabの曲線、（3）LFB-R603、WT-ＩｇＧおよび本発明のＩｇＧ変異株（すなわちC6A_69；C6A_78；T5A_74；C6A_74；C6A_60変異株）の曲線。Ｘ−座標：ＩｇＧの濃度、Ｙ−座標：溶菌の百分比。
以下、本発明をより完全に理解できるようにするために、いくつかの定義をする。以下
の定義は文法的に均等なものを含む。
本明細書および特許請求の範囲でＦｃ領域の残基の数の教え方は非特許文献12（Sequen
ces of Proteins of Immunological Interest、5th Ed. Public Health Service, Nation
al Institutes of Health, Bethesda, Md.、1991）に記載のKabat et al.,のＥＵインデ
ックスに従った免疫グロブリン重鎖の教え方である。非特許文献12の内容は本明細書の一
部を成す。「KabatでのＥＵインデックス」とはヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基の数え方で
ある。
「ポリペチド」または「タンパク」とは、少なくとも２つの共有結合で結合したアミノ
酸を意味し、タンパク質、ポリペチド、オリゴペプチドおよびペプチドを含む。
「アミノ酸」とは特定の定義された位置に存在する20の天然または類似の非天然のアミ
ノ酸を意味する。天然のアミノ酸は３文字または１文字暗号で略記できる：
Figure 0005951856
「位置」とはタンパクの配列の位置を意味し、Ｆｃ領域での位置はKabatでのＥＵイン
デックスに従って番号を付ける。
「アミノ酸の変更」とはポリペチドのアミノ酸配列の変化を意味する。この「アミノ酸
変更」は「アミノ酸変化」ともよばれ、アミノ酸の置換、挿入および／またはポリペチド
配列の欠失を含む。「アミノ酸の置換」または「置換」とは親ポリペチド配列の特定の位
置でのアミノ酸を他のアミノ酸と置換することを意味する。例えば、置換N434Sとは位置4
34でのアスパラギンがセリンと置換した変異ポリペチド、この場合Ｆｃ変異株を意味する
。「アミノ酸の挿入」または「挿入」とは親ポリペチド配列の特定位置でのアミノ酸の付
加を意味する。例えば、挿入G＞235-236とは位置235と236の間にグリシンを挿入すること
を示す。「アミノ酸欠失」または「欠失」とは親ポリペチド配列の特定位置のアミノ酸を
取り去ることを意味する。例えば、E294delは位置294でのグルタミン酸の欠失を示す。
例えば下記の突然変異のフォーマットが好ましく使われる：434SまたはN434Sは親アミ
ノ酸が位置434で（すなわちアスパラギンが）セリンと置換することを意味する。
置換の組合せの場合の好ましいフォーマットは以下である：259I/315D/434YまたはV259
I/N315D/N434Y。これは変異株中に3つの置換（一つは位置259、一つは位置315、一つは位
置434）を意味する。すなわち、親ポリペチドの位置259のアミノ酸すなわちバリンがイソ
ロイシに置換され、親ポリペチドの位置315のアミノ酸すなわちアスパラギンがアスパラ
ギン酸に置換され、親ポリペチドの位置434のアミノ酸すなわちアスパラギンがチロシン
に置換されることを意味する
「可変部」とはＶκ、Ｖλおよび／またはκ、λおよび重鎖免疫グロブリン遺伝の遺伝
子座を形成するＶＨ遺伝子のいずれかによって実質的にコードされる一つ以上のＩｇ領域
を有する免疫グロブリンの領域を意味する。可変領域はコンプレメンタリティ−決定領域
（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。
「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」とは第1恒常免疫グロブリン領域を除く抗体の恒常部から
成るポリペチドを意味する。従って、ＦｃはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧの最後の２つの恒常
部の免疫グロブリン領域、ＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの恒常部の免疫グロブリン領
域、これら領域への可撓性ヒンジＮ末端を意味する。ＩｇＡおよびＩｇＭの場合、Ｆｃは
Ｊ鎖を含むことができる。ＩｇＧの場合、Ｆｃは免疫グロブリン・領域Cγ2およびCγ3か
ら成る（それぞれCH2およびCH3領域であるCγ2、Cγ3、ＩｇＧで）およびCgammal（Cγ1
）とCγ2（Cγ2）との間の低ヒンジ領域を含む。ヒトＩｇＧ１重鎖Ｆｃ領域はそのカルボ
キシル末端に残基C226を含むと定義されるが、数え方はKabatでのＥＵインデックスに従
う。ヒトＩｇＧ１では、低ヒンジはKabatでのＥＵインデックスに従った位置226-236を示
し、CH2領域は位置237-340を示し、CH3はと位置341-447を示す。他の免疫グロブリンの対
応するＦｃ領域は配列アランメントによって同定できる。
Ｆｃは単離でのこの領域を示すか、以下で説明するように、Ｆｃポリペチドの内容での
この領域を示す。「Ｆｃポリペチド」とはＦｃ領域の全部または一部のポリペチドを意味
する。Ｆｃポリペチドには抗体、Ｆｃ融合体、単離されたＦｃ、Ｆｃ-コンジュゲートお
よびＦｃ断片を含むが、これらに限定されるものではない。
「抗体」という用語はここで最も広い意味で使われる。「抗体」は少なくとも(i) Ｆｃ
領域および(ii) 免疫グロブリンの可変部に由来する結合ポリペチド領域を含む任意のポ
リペチドを意味する。この結合ポリペチド領域は一つの所定標的抗原または一群の標的抗
原に特異的に結合できる。免疫グロブリンの可変部から生じる結合ポリペチド領域は一つ
以上CDRを有する。抗体には完全長の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、多くの特異
抗体、少なくとも一つの可変部を有するＦｃ-融合タンパク、合成の抗体(ここでは「ミメ
ティック抗体」ともいう)、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、抗体-融合タンパク
、抗体複合体および各々の断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。
「完全長の抗体」または「免疫グロブリン」とは抗体の天然の生物構造を構成する構造
を意味し、変数領域および恒常領域を含む。「完全長の抗体」はモノクローナル完全長抗
体、野性型完全長抗体、キメラの完全長抗体、ヒト化完全長抗体を含むがこれらに限定さ
れるものではない。
ヒトおよびハツカネズミを含む大部分の哺乳類では、完全長の抗体の構造は一般にテト
ラマである。このテトラマは２つの全く同じ一組のポリペプチド鎖から成り、その1つの
「軽」鎖（一般に約25kDaの分子量を有する）であり、その1つは「重」鎖（一般に約50-7
0kDaの分子量を有する）である。いくらかの哺乳類、例えばラクダおよびラマでは、完全
長の抗体が２つの重鎖だけから成り、各重鎖はＦｃ領域に付いた変数領域から成る。
各連鎖のアミノ末端部分は主として抗原認識に関与する少なくとも約100〜110のアミノ
酸の可変部を含む。可変部では3つの輪状構造が重鎖および軽鎖の各々のV領域と集まり、
抗原結合部位を形成する。輪状構造の各々をコンプレメンタリティ-決定領域という（以
下に「CDR」という）。ここでのアミノ酸配列の変異が最も重大である。
各鎖のカルボキシ末端部分は主としてエフェクタ機能に関与する恒常部を敵意する。Ka
bat et alは重鎖および軽鎖の可変部の多くの一次配列を集めてある。配列の保護度に基
づいてそれらはCDRおよびフレーム・ワークへの個体一次配列を分類して、リストを作っ
た（非特許文献2１）。この文献の内容は本発明の一部を成す。
E. A. Kabat et al. Sequences of Immunological Interest, 5th edition, NIH publication, No. 91 -3242
ヒト免疫グロブリンの場合、軽鎖はカッパ軽鎖およびラムダ軽鎖に分類される。重鎖は
ミュー、デルタ、ガンマ、αまたはエプシロンに分類され、それぞれＩＭ、ＩＤ、ＩｇＧ
、ＩＡおよびＩＥとして抗体のアイソタイプを定義する。ＩｇＧ１は複数のサブクラスを
有し、ＩｇＧ1、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むが、これらに限定されない。
ＩｇＭもサブクラスを有し、ＩｇＭＩおよびｌｇＭ２があるが、これらに限定されない。
「アイソタイプ」とは恒常部の化学特性および抗原性特性によって定義される免疫グロブ
リンのサブクラスを意味する。公知のヒト免疫グロブリン・アイソタイプはＩｇＧ１、Ｉ
ｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡＩ、ｌｇＡ２、ＩｇＭＩ、ｌｇＭ２、ｌｇＤおよびｌ
ｇＥである。
「ＩｇＧ」は認識された免疫グロブリン・ガンマ遺伝子によって実質的にコードされる
抗体のクラスに属するポリペチドを意味する。ヒトではＩｇＧはサブクラスまたはアイソ
タイプＩｇＧ１、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3およびＩｇＧ4から成る。ハツカネズミではＩｇＧは
ＩｇＧ１、ＩｇＧ2a、ＩｇＧ2b、ＩｇＧ3から成る。完全長のＩｇＧはテトラマで、２対
の全く同じ２つの免疫グロブリン鎖から成り、1つの軽鎖と1つの重鎖を有する各一組から
成り、各軽鎖は免疫グロブリン・領域VLおよびCLから成り、各重鎖は免疫グロブリン領域
VH、Cγ1（CH1とも呼ばれる）、Cγ2（CH2とも呼ばれる）およびCγ3（CH3とも呼ばれる
）から成る。ヒトＩｇＧ１では、「CH1」は位置118-220、CH2領域がは位置237-340、CH3
領域は位置341−447にある（KabatでのＥＵインデックスに従う）。ＩｇＧ 重鎖もＩｇＧ
Lの場合、位置221-236と称するヒンジ領域にある。
「親ポリペチド」または「ポリペチド親」とは変異株を発生するために修正される未変
更のポリペチドを意味する。この親ポリペチドは天然由来のポリペチド、天然由来のポリ
ペチドの変異株、天然由来のポリペチドの設計バージョンまたは合成ポリペチドにするこ
とができる。親ポリペチドはそれをコードするポリペチド自体またはアミノ酸配列を表す
こともできる。本発明での親ポリペチドはＦｃ領域は野生型Ｆｃ領域、その断片およびそ
のミュータントから成る群の中から選択される。従って、親ポリペチドは野生型Ｆｃ領域
と比べてそのＦｃ領域中に既存のアミノ酸突然変異（すなわちＦｃミュータント）を含む
ことができる。
親ポリペチドは抗体、免疫グロブリン、Ｆｃ合着ポリペチド、Ｆｃ共役であるのが好ま
しいが、これらに限定されるものではない。従って、「親免疫グロブリン」とは変異体の
免疫グロブリンを生じるように修正された免疫グロブリン・ポリペチドを意味し、「親抗
体」とは変異体の抗体を生じるように修正された抗体を意味する。「親抗体」には公知の
商業的な組み換え抗体も含まれる点に留意する必要がある。
「少なくとも一つの」という用語は「一つ以上の」と同じ意味である。
「変異株ポリペチド」、「ポリペチド変異株」または「変異株」とは少なくとも一つの
アミノ酸突然変異によって親ポリペチド配列のそれと異なるポリペチド配列をを有するも
のを意味する。
変異株はＦｃ変異株、Ｆｃポリペチド変異株、タンパク変異株、抗体変異株、免疫グロ
ブリン変異株、ＩｇＧ変異株にすることができるが、これらに限定されるものではない。
「免疫グロブリン変異株」または「変異株免疫グロブリン」とは少なくとも一つのアミ
ノ酸突然変異によって親免疫グロブリン配列のそれと異なる免疫グロブリン配列となった
ものを意味する。親ポリペチドは天然由来の野性-型（WT）ポリペチドまたはWTポリペチ
ドの修正バージョンでもよい。
重要な親ポリペチドは上記定義のＦｃ領域を有するポリペチドである。本発明の変異株
はＦｃ領域の少なくとも一つのアミノ酸突然変異によって親ポリペチド配列のそれと異な
るポリペチド配列を有するのが好ましい。従って上記変異株はＦｃ変異株から成る。
従って、「Ｆｃ変異株」または「変異株Ｆｃ」とは少なくとも一つのアミノ酸突然変異
によって親Ｆｃ配列のそれと異なるＦｃ配列を意味する。このＦｃ変異株は単離されたＦ
ｃ領域およびそ断片にすることができ、また、抗体はＦｃ合着およびその断片にすること
ができるが、これらに限定されるものではない。
「タンパク変異株」または「変異株タンパク」とは少なくとも一つのアミノ酸突然変異
によって親タンパクと異なるタンパクを意味する。「抗体変異株」または「変異株抗体」
とは少なくとも一つのアミノ酸突然変異によって親抗体と異なる抗体を意味する。「Ｉｇ
Ｇ変異株」または「変異株ＩｇＧ」とは少なくとも一つのアミノ酸突然変異によって親Ｉ
ｇＧと異なる抗体を意味する。変異株は親ポリペチドと比較して少なくとも一つのアミノ
酸突然変異を有し、例えば約1〜約45のアミノ酸突然変異、好ましくは約1〜約20のアミノ
酸突然変異、より好ましくは約1〜約10のアミノ酸突然変異を有するのが好ましい。
変異配列はその親ポリペチド配列と少なくとも約80％の一致性を有し、より好ましくは
少なくとも約90％の一致性を有するのが好ましい。
少なくとも約90％アミノ酸一致性を有するポリペチドには、少なくとも約90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または少なくとも99.5％のアミノ酸一
致性を有するポリペチドが含まれる。
２つのアミノ酸配列の一致性のパーセントを決定するためには配列を最適比較のために
整列させる。例えば、最適のアランメントのためにギャップ期を第一および第二のアミノ
酸配列の一方または両方に導入でき、非相同配列は比較のためには無視できる。最適比較
のためにの２つのアミノ酸配列の一致性パーセントは下記パラメータでCLUSTAL W（バー
ジョン1.82）で実行できる：
(1) CPU MODE = ClustalW mp ;
(2) ALIGNMENT = full;
(3) OUTPUT FORMAT = aln w/numbers;
(4) OUTPUT ORDER = aligned;
(5) COLOR ALIGNMENT = no;
(6) KTUP (word size) = default;
(7) WINDOW LENGTH = default ;
(8) SCORE TYPE = percent ;
(9) TOPDIAG = default ;
(10) PAIRGAP = default;
(11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = none;
(12) MATRIX = default;
(13) GAP OPEN = default;
(14) END GAPS = default;
(15) GAP EXTENSION = default;
(16) GAP DISTANCES = default;
(17) TREE TYPE = cladogram;
(18) TREE GRAP DISTANCES = hide
「野生型またはWT」とは天然のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味し、対立遺
伝子の（allelic）変異を含む。WTタンパク、ポリペチド、抗体、免疫グロブリン、Ｉｇ
Ｇ、その他は修正されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
「ＦｃＲｎ」または「新生Ｆｃレセプター」はＩｇＧ抗体Ｆｃ領域を結合し、少なくと
もＦＣＲＮ遺伝子によって、部分的にコードされるタンパクを意味する。ＦｃＲｎはヒト
、ハツカネズミ、ラット、ウサギおよびサルを含む任意のものからのものにすることがで
きる。公知のように、機能性ＦｃＲｎタンパクは２つのポリペチド、大抵は重鎖および軽
鎖から成る。軽鎖はβ-2-ミクログロブリンであり、重鎖はＦＣＲＮ遺伝子によってコー
ドされる。特に断らない限り、ＦｃＲｎまたはＦｃＲｎタンパクはβ-2ミクログロブリン
を有するα鎖の錯体を言う。ヒトではＦｃＲｎをコードする遺伝子はＦＣＧＲＴと呼ばれ
る。
「増加した結合性ＦｃＲｎ」とはインビボまたはインビトロで親ポリペチドと比較して
ＦｃＲｎに対する本発明の変異株が結合能を増加することを意味する。ＦｃＲｎを結合す
るポリペチド変異株の能力はＥＬＩＳＡ（実施例1のIV.1.a）またはＳＰＲ（実施例1のIV
.I.b）でインビトロで評価できる。ＦｃＲｎに対する改良された結合性を最も有する変異
株はインビトロで改良された漿液保持性を有し、従って半減期が増加する。
Ｆｃ領域の保持をインビトロで増やすに、ＦｃＲｎへの結合能の増加が約pH 6で起り、
約pH 7.4で低い親和性を維持する必要がある。
研究中ではあるが、pH 6でのＦｃＲｎへの結合でエンドソーム中にＦｃ領域の隔離をさ
せ、Ｆｃ領域はインビボで長い半減期を有すると考えられている(非特許文献２２参照）
。
Ghetie and Ward, 1997 Immunol Today. 18(12):592-598
エンドソー区画はＦｃ領域を細胞表面へリサイクルさせる。この区画が細胞外空間に開
放されると、より高いpH（約7.4）で血液中へ戻り、Ｆｃ領域の開放を誘発する。従って
、インビボでＦｃ領域の半減期を増やすＦｃ領域のアミノ酸突然変異は、理想的にはより
低いpHでＦｃＲｎ結合性を増加させ、より高いpHでＦｃ領域を開放するものである。
「インビボ半減期」という用語は所定動物の循環に重要なポリペチドの生物学的半減期
を意味し、動物の循環および／または他の組織からの循環に中に存在する半分の量が浄化
されるのに必要な時間で表される。
本発明はＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合能を増やすＦｃ領域のアミノ酸突然変異を同
定することをベースにしたものである。重要なアミノ酸突然変異はランダム突然変異生成
によって２つのＦｃ変異株ライブラリを作り、その変異株のＦｃＲｎに対する結合性を測
定することで決定される。
従って、本発明は親ポリペチドと比べてＦｃＲｎへの結合性増加を表するＦｃ領域を有
する親ポリペチドの変異株に関するものである。
本発明の親ポリペチドはＦｃ領域から成るポリペチドである。このポリペチドは単一ポ
リペプチド鎖または共有結合ではなく一緒にリンクした複数のポリペプチド鎖から成るこ
とができる。親ポリペチドは抗体、Ｆｃ融合タンパク、Ｆｃ共役、Ｆｃ由来のポリペチド
、単離されたＦｃおよびその断片を含むが、これらに限定されるものではない。従って、
親ポリペチドは天然由来のポリペチド、天然由来のポリペチドの変異株、合成ポリペチド
または非タンパク性断片から成るポリペチドの設計バージョンにすることができる。天然
由来のポリペチドの設計バージョンは天然由来の遺伝子によってコードされないポリペチ
ドである。例えば、設計されたポリペチドはキメラ抗体またはヒト化抗体にできる。
親ポリペチドのＦｃ領域はの野性-型Ｆｃ領域のＩｇＧ、その断片およびそミュータン
トから成る群の中から選択するのが好ましい。ＩｇＧのＦｃ領域は「低ヒンジ」-CH2-CH3
領域（ＩｇＧではCH2およびCH3はCγ2およびCγ3領域とも呼ばれる）に対応する。野生型
ヒトＩｇＧ１の「低ヒンジ」-CH2-CH3領域の配列はSEQ ID番号：1の配列である。ヒトＩ
ｇＧ１では、低ヒンジは位置226-236、CH2領域は位置237-340、CH3領域は位置341-447で
ある。これらの位置はKabatでのＥＵインデックスに従う。他のＩｇＧサブクラスの類似
領域はヒトＩｇＧ１のそれとＩｇＧサブクラスの重鎖または重鎖断片のアミノ酸配列のア
ランメントで決定できる。
Ｆｃ領域の断片は野性-型Ｆｃ領域由来、好ましくは野生型ＩｇＧの「より低いヒンジ-
CH2-CH3」領域由来の一つ以上のポリペチドを有するポリペチドと定義される。この断片
のＦｃＲｎに対する解離定数は実施例１のIV.1に記載のＳＰＲアッセイで1microM以下で
ある。
上記のように、親ポリペチドは野生型Ｆｃミュータントから成ることができる。
例えば、Ｆｃ領域は既存のアミノ酸突然変異、例えば付加、挿入および／または置換を有
することができる。ただし、このミュータントはＳＰＲアッセイに従った解離定数が実施
例１のIV.1に記載のＳＰＲアッセイで1microM以下でなければならならず且つ野性-型Ｆｃ
領域ではない。
「変異株ポリペチド」または「変異株」とは少なくとも一つのアミノ酸突然変異によっ
て親ポリペチドのそれと異なるポリペチド配列を意味する。
本発明の変異ポリペチドは対応する親ポリペチドと比べてＦｃＲｎに対する増加した結
合性を示す。換言すれば、変異株の親和性は親ポリペチドよりＦｃＲｎ対する結合性が高
い。そうした変異株が本発明の最適化された変異株である。
このポリペチドのＦｃＲｎに対する親和性は従来の周知方法で評価できる。例えば、当
業者は実施例１のIV.I .bに示すように、表面プラスモン共鳴（Surface Plasmon Resonan
ce、ＳＰＲ)実験を使用して解離定数（Kd）を求めることができる。変異株のKdが対応す
る親のそれより1.1倍以下であれば、その変異株は本発明の最適化された変異株である。
変形例では、当業者は抵当なＥＬＩＳＡアッセイを実行できる。このＥＬＩＳＡアッセ
イによって実施例 1に示すように、変異株のＦｃＲｎに対する結合強度と親のそれとを比
較することができる。変異株および親ポリペチドで検出される特定信号を比較する。この
特定信号は親ポリペチドのそれより少なくとも1.2-倍強く、より好ましくは少なくとも3.
2-倍強い場合、その変異株は本発明の最適化された変異株である（例えば、少なくともダ
ブルアミノ酸突然変異T250Q/M428Lを有するＦｃ変異株と同程度）。
適当なＥＬＩＳＡアッセイは本出願の実施例1に示してある。結合能は完全長のポリペ
チドを評価することによって（実施例 2のIII参照）または単離されたＦｃ領域を評価す
ること（実施例 1のIV参照）で一義的に決定できる。
本発明で重要なポリペチド変異株は親ポリペチドと比べて少なくとも一つのアミノ酸突
然変異をそのＦｃ領域に含む。このアミノ酸突然変異はアミノ酸の挿入、欠失および置換
から成る群の中から選択される。
本発明社は、親ポリペチドと比べて、ＦｃＲｎに対する結合性を増加させたポリペチド
変異株を得るためには、少なくとも一つのアミノ酸突然変異が親ポリペチドと比較して、
Ｆｃ領域の226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、
259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、
298、299、301、302、303、305、307、308、309、311、315,317、320、322、325、327、3
30、332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、3
60、361、362、369、370、371、375、378、380、382、383、384、385、386、387、389、3
90、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、404、408、411、412、4
14、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、4
43、444、445、446および447から成る群の中から選択されるアミノ酸位置で導入されなけ
ればならないことを示した。ここで、Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatでのＥＵイン
デックスの数え方である。
ここで、「KabatでのＥＵインデックス」とはヒトＩｇＧ１EU抗体の残基の数え方を言
う。例えば、他のＦｃ領域での類似位置はそのＦｃ領Ｆｃ領域をSEQ ID 番号：1のポリペ
チドから成るヒトＩｇＧ１の重鎖断片とアミノ酸配列アランメントして決定できる。例と
して、図6にヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3および「低ヒンジ-CH2-CH3」領域から成る
ＩｇＧ4 重鎖断片の配列アランメントを示した。
「少なくとも一つのアミノ酸突然変異」とは「一つ以上の突然変異」を意味する。Ｆｃ
領域に20を超えるアミノ酸の突然変異を導入するその生物学的活性度は著しく悪くすると
考えられる。従って、ポリペチド変異株は上記でリストした位置の好ましくは1〜20、よ
り好ましくは1〜10のアミノ酸突然変異を有するのが好ましい。「1〜20のアミノ酸突然変
異」には1つ、２つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13、14、15、16
、17、18、19、そして、20のアミノ酸突然変異を含む。この変異株配列はその親ポリペチ
ド配列と少なく約90％のポリペチド一致性を有するのが好ましい。
ここで少なくとも約90％アミノ酸一致性を有するとは、アミノ酸が参照ポリペチドと少
なくとも約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または99.5％
のアミノ酸一致性を有することを含む。
一般にＦｃＲｎに対して最も高い結合能を示す本発明のＦｃ変異株は複数のアミノ酸突
然変異を有する。実施例IIに記載のファージＥＬＩＳＡアッセイから得られる結果は、複
数のアミノ酸突然変異を有する最適化された変異株野生型Ｆｃより約3.2-倍から30-倍ま
での強い特定信号を有することを示し（表2および表3を参照）、単一の先端アミノ酸突然
変異を有する変異株は野生型Ｆｃより約1.2-倍から3.5-倍までの強い信号を示す（表1参
照）。表3に示すように、二重のアミノ酸突然変異T250Q/M428Lを有するＦｃ変異株とよぶ
最適化された変異株の信号はＦｃ−Ｈのそれより約1-倍から約10-倍強い。
特定実施例では変異株は226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、2
50、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、2
92、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、311、315,317、320、32
2、325、327、330、332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、35
5、356、359、360、361、362、369、370、371、375、378、380、382、383（384）385、38
6、387、389、390、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、404、40
8、411、412、414、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、43
8、439、440、443、444、445、446およ447から成るリストの中から選択される少なくとも
２つのアミノ酸突然変異を親ポリペチドと比較したＦｃ領域中に有する。Ｆｃ領域のアミ
ノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方である。
［表5］で説明するように、ＦｃＲｎに対して最も高い結合能を示すＦｃ変異株は3〜6
のアミノ酸突然変異を有する。
従って、更なる実施例では、本発明の変異ポリペチドは226、227、228、230、231、233
、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284
、285、288、289、290、291、292、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308
、309、31 1、315,317、320、322、325、327、330、332、334、335、338、340、342、343
、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361、362、369、370、371、375、378
、380、382、383、384、385、386、387、389、390、392、393、394、395、396、397、398
、399、400、401、403、404、408、41 1、412、414、415、416、418、419、420、421、42
2、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444、445、446、447から成る群の中
から選択されるアミノ酸位置で親ポリペチドと比較してＦｃ領域中に3〜6のアミノ酸突然
変異を有する。
Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方である。
アミノ酸突然変異は、好ましくは欠失および置換の群の中から選択される。
上記リストのいくつかのアミノ酸位置、すなわち226、230、241、264、307、315、330
、342、362、378、382、389、396、397、421および434にはキーとなる重要な位置である
。換言すれば、ＦｃＲｎに高い結合能を示すＦｃ変異株は少なくとも一つのアミノ酸突然
変異を上記アミノ酸位置に有する。
一つの実施例での本発明ポリペチド変異株は親ポリペチドと比較してＦｃ領域中の226
、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421および434
から成る群の中から選択されるアミノ酸位置に少なくとも一つのアミノ酸突然変異を有す
る。Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方である。
上記のキー位置の中でＦｃＲｎに最も強い結合を示すＦｃ変異株のシークエンシングは
アミノ酸位置230、264、307、315、330、378および434が最も多く変化した位置であるこ
とが示された。従って、本発明の他の実施例では、少なくとも一つの突然変異は親ポリペ
チドと比べてＦｃ領域中の264、315、378および434、より好ましくは230、264、307、315
、330、378および434から成る群の中から選択される1つの位置で起こる。Ｆｃ領域のアミ
ノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方である。
既に述べたように、少なくとも２つのアミノ酸突然変異の導入でＦｃ変異株のＦｃＲｎ
への結合能はＦｃ親と比べて顕著に改良できる。
従って、変形実施例では、ポリペチド変異株は少なくとも２つのアミノ酸突然変異を有
し、この少なくとも２つのアミノ酸突然変異は親ポリペチドと比較したＦｃ領域中の下記
にある：
(i) 226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421お
よび434から成る群の中から選択されるアミノ酸位置での1つの突然変異と、
(ii) 226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、
264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、
299、301、302、303、305、307、308、309、311、315、317、320、322、325、327、330,
332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360,
361 , 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389,390,
392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411, 412,414, 4
15, 416, 418, 419, 420, 421 , 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443、
444、445、446、447から成る群の中から選択されるアミノ酸位置での少なくとも一つの突
然変異。ここで、Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方で
ある。ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)と同じアミノ酸位置では起らない。
前記例外条件から、例えば、アミノ酸突然変異(i)が位置434で起こる場合、(ii)に記載
のリストの中の位置434を除く任意の位置で少なくとも一つのアミノ酸突然変異(ii)が起
こる。
本発明の他の実施例では、ポリペチド変異株は少なくとも２つのアミノ酸突然変異を有
する、その少なくとも２つのアミノ酸突然変異はＦｃ領域中の下記から成る：
(i) 264、315、378および434から成っている群の中から選択されるアミノ酸位置での1つ
の突然変異と、
(ii) 226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、
264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、
299、301、302、303、305、307、308、309、31 1、315,317、320、322、325、327、330、
332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、
361、362、369、370、371、375、378、380、382、383、384、385、386、387、389、390、
392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 , 403, 404, 408, 411 , 412, 414
, 415, 416, 418, 419, 420, 421 , 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 44
3, 444、445、446および447から成る群の中から選択されるアミノ酸位置での少なくとも
一つの突然変異。
（ここで、Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatに記載のＥＵインデックスと同じである
、ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)と同じアミノ酸位置では起こらない）
追加の実施例では、前記変異株は少なくとも２つのアミノ酸突然変異を有するし、その
少なくとも２つのアミノ酸突然変異はＦｃ領域中の下記から成る：
(i) 264、315、378および434から成っている群の中から選択される位置での1つのアミノ
酸突然変異と
(ii) 226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421お
よび434から成っている群の中から選択される位置での少なくとも一つのアミノ酸突然変
異、
（ここで、Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatに記載のＥＵインデックスと同じである
、ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)と同じアミノ酸位置では起こらない）
他の追加の実施例の前記変異株はＦｃ領域中に下記から成る少なくとも２つのアミノ酸
突然変異を有する：
(i) 378および434から成っている群の中から選択される位置での1つのアミノ酸突然変異
と
(ii) 226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421お
よび434から成っている群の中から選択される位置での少なくとも一つのアミノ酸突然変
異、
（ここで、Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatに記載のＥＵインデックスと同じである
、ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)と同じアミノ酸位置では起こらない）
本発明の変形実施例では、ポリペチド変異株は少なくとも3つのアミノ酸突然変異をそ
のＦｃ領域中に含む。この少なくとも3つのアミノ酸突然変異はＦｃ領域中の下記から成
ることができる：
(i) 226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421お
よび434から成っている群の中から選択される２つのアミノ酸位置での２つの突然変異と
(ii) 226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259,
264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298,
299, 301 , 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311 , 315, 317, 320, 322, 325, 327, 330
, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359,360,
361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389, 390,
392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411 , 412, 414
、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443
、444、445、446および447から成る群の中から選択されるアミノ酸位置での少なくとも一
つの突然変異。
（ここで、Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatに記載のＥＵインデックスと同じである
、ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)と同じアミノ酸位置では起こらない）
変形実施例では、ポリペチド変異株は少なくとも3つのアミノ酸突然変異を有する、こ
の少なくとも3つのアミノ酸突然変異はＦｃ領域中の下記から成る：
(i) 264、315、378および434から成っている群の中から選択されるアミノ酸位置での1つ
の突然変異；
(ii) 226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421お
よび434から成っている群の中から選択されるアミノ酸位置での1つの突然変異；
(iii) 227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264
、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、299
、301、302、303、305、307、308、309、31 1、315,317、320、322、325、327、330、332
、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361
、362、369、370、371、375、378、380、382、383、384、385、386、387、389、390、392
、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、404、408、411、412、414、415
、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444
、445、446および447から成っている群の中から選択されるアミノ酸位置での少なくとも
一つの突然変異、
（ここで、Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatに記載のＥＵインデックスと同じである
、ただし、突然変異(i)、突然変異(ii)および突然変異(iii)が同じアミノ酸位置で同時に
起こらない）
本発明の他の実施例では、ポリペチド変異株は少なくとも3つのアミノ酸突然変異を有
し、その少なくとも3つのアミノ酸突然変異Ｆｃ領域中の下記から成る：
(i) 378および434から成っている群の中から選択されるアミノ酸位置での1つの突然変異
；
(ii) 226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421お
よび434の群の中から選択されるアミノ酸位置での1つの突然変異；
(iii) 227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259, 264,
265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291 , 292, 294, 297, 298, 299
, 301 , 302, 303, 305, 307, 308, 309, 31 1 , 315,317, 320, 322, 325, 327, 330, 3
32, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 3
61, 362, 369, 370, 371 , 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389, 390,
392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 , 403, 404, 408, 411 , 412, 414
, 415, 416, 418, 419, 420, 421 , 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 44
3, 444、445、446および447から成る群の中から選択されるアミノ酸位置での少なくとも
一つの突然変異。
（ここで、Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatに記載のＥＵインデックスと同じである
、ただし、突然変異(i)、突然変異(ii)および突然変異(iii)が同じアミノ酸位置で同時に
起こらない）
本発明の上記全ての実施例で、アミノ酸突然変異はアミノ酸の置換および欠失から成る
群の中から選択されるのが好ましい。
本発明のさらに他の対照は、Ｆｃ領域中に下記から成る群の中から選択される少なくと
も一つのアミノ酸突然変異を有する、親ポリペチドと比べてＦｃＲｎに対する結合正が増
加した親ポリペチドの変異株にある：
230T、226G、226Y、227S、227L、228R、228L、230S、230L、230A、230Q、231T、231V、23
3D、234R、239A、241L、241Y、241R、243L、246R、250A、252L、256N、259I、264A、264E
、264M、265G、265N、267N、267R、269D、269G、270N、270E、276S、284L、285Y、288R、
289I、290R、290E、291S、291Q、292W、294del、297D、298G1、298N1、299M1、299A1、29
9K1、301C1、302A1、303A1、3031、305A、307P、307A、307N、3081、309P、311R、315D、
317R、320T、320E、322R、325S、327V、327T、330V、330T、332V、334E、334R、335A、33
8R、340E、342R、342E、342K、343S、345Q、345G、347R、350A、352S、354P、355Q、355G
、356N、359A、360N、360R、361D、361S、362R、362E、369A、370R、371D、375A、375G、
378V、378T、378S、380Q、382V、382G、383R、383N、384I、384T、385R、386R、386K、38
7S、387T、389T、389K、389R、390S、401G、392E、392R、393N、394A、395A、395S、396S
、396L、397A、397M、398P、399N、400P、401のA 403T、404L、408T、411A、412A、414R
、415D、415N、416K、416G、418R、418K、418E、419H、420R、421T、421S、421D、422A、
424L、426T、428L、433R、433P、434Y、434S、434H、438R、439R、440R、440N、443R、44
4F、444P、445S、446A、447Eおよび447N。
Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方である。
変形実施例の前記ポリペチドは親ポリペチドと比較してＦｃ領域中下記の群の中から選
択される少なくとも一つの突然変異を有する：
226G、227L、230S、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、259I、264E、265G、26
7R、290E、294del、303A、305A、307P、307A、308I、315D、322R、325S、327V、330V、34
2R、347R、352S、361D、362R、362E、370R、378V、378T、382V、383N、386R、386K、387T
、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N、421T、416K1、426T、428L
、433R、434Y、434Sおよび439R。
Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方である。
上記変異株は親ポリペチドと比べて上記リストから選択される1〜２０、好ましくは１
〜１０のアミノ酸突然変異を有するのが好ましい。既に述べたように、「1〜20の突然変
異」は1、２、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19および20
の突然変異を意味する。
他の実施例の上記変異株は親ポリペチドと比較してＦｃ領域中に下記の群の中から選択
される３〜６のアミノ酸突然変異を有する：
226G、226Y、227S、227L、228R、228L、230S、230T、230L、230A、230Q、231T、231V、23
3D、234R、239A、241L、241Y、241R、243L、246R、250A、252L、256N、259I、264A、264E
、264M、265G、265N、267N、267R、269D、269G、270N、270E、276S、284L、285Y、288R、
289I、290R、290E、291S、291Q、292W、294del、297D、298G、298N、299M、299A、299K、
301C、302A、303A、303I、305A、307P、307A、307N、308I、309P、311R、315D、317R、32
0T、320E、322R、325S、327V、327T、330V、330T、332V、334E、334R、335A、338R、340E
、342R、342E、342K、343S、345Q、345G、347R、350A、352S、354P、355Q、355G、356N、
359A、360N、360R、361D、361S、362R、362E、369A、370R、371D、375A、375G、378V、37
8T、378S、380Q、382V、382G、383R、383N、3841、384T、385R、386R、386K、387S、387T
、389T、389K、389R、390S、392E、392R、393N1、394A1、395A1、395S1、396S1、396L1、
397A1、397M1、398P1、399N1、400P1、401A1、401G1、403T、404L、408T、411A1、412A、
414R、415D、415N、416K、416G、418R、418K、418E、419H、420R、421T、421S、421D、42
2A、424L、426T、428L、433R、433P、434Y、434S、434H、438R、439R、440R、440N、443R
、444F、444P、445S、446A、447Eおよび447N。
Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方である。
変形実施例の上記ポリペチドは親ポリペチドと比較してＦｃ領域中に下記の群の中から
選択される３〜６のアミノ酸突然変異を有する：
226G、227L、230S、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、259I、264E、265G、26
7R、290E、294del、303A、305A、307P、307A、308I、315D、322R、325S、327V、330V、34
2R、347R、352S、361D、362R、362E、370R、378V、378T、382V、383N、386R、386K、387T
、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N、416K1、421T、426T、428L
、433R、434Y、434Sおよび439R。
Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方である。
上記のリスト中のいくらかのアミノ酸突然変異は重要な突然変異である。換言すればＦ
ｃＲｎに高い結合能を示すＦｃ変異株はこの重要な突然変異から選択される少なくとも一
つのアミノ酸突然変異を有する。
従って、上記ポリペチド変異株は親ポリペチドと比較してＦｃ領域中に226G、230S、23
0T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、342R、362R、362E、378V、378T、382V、389T
、389K、396L、397M、421T、434Yおよび434Sから成っている群の中から選択される少なく
とも一つの突然変異を有する。
Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方である。
他の実施例の上記ポリペチド変異株は、親ポリペチドと比較してＦｃ領域中に315D、26
4E、378V、378T、434Yおよび434Sから成る群の中から選択される少なくとも一つのアミノ
酸突然変異から成る。
Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方である。
さらに他の実施例の上記ポリペチド変異株は親ポリペチドと比較してＦｃ領域中に378V
、378T、434Yおよび434Sから成る群の中から選択される少なくとも一つアミノ酸突然変異
を有する。
Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方である。
既に述べたように、少なくとも２つのアミノ酸突然変異を導入することで親と比べてＦ
ｃＲｎに対して結合正が顕著に改良されるＦｃ変異株にすることができる。上記突然変異
の少なくとも1つはこの重要な突然変異から選択できる。すなわち342R、226G、230S代、2
30T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、362R、362E、378V、378T、382V、389T、389
K、396L、397M、421T、434Yおよび434Sから成る群の中から選択される。
変形実施例では上記ポリペチド変異株は親ポリペチドと比較してＦｃ領域中の少なくと
も２つのアミノ酸突然変異を有し、その少なくとも２つの突然変異は下記アミノ酸位置か
ら成る：
(i) 226G、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、342R、362R、362E、378V
、378T、382V、389T、389K、396L、397M、421T、434Yおよび434Sから成る群の中から選択
される1つの突然変異と、
(ii) 227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、
265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、299、
301、302、303、305、307、308、309、31 1、315,317、320、322、325、327、330、332、
334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361、
362、369、370、371、375、378、380、382、383、384、385、386、387、389、390、392、
393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、404、408、41 1、412、414、415
、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444
、445、446および447から成る群の中から選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異
。
（ここで、Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方である。
ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)とが同じアミノ酸位置では起こらない)
さらに他の実施例では、上記変異株が少なくとも２つのアミノ酸突然変異から成り、こ
の少なくとも２つの突然変異はＦｃ領域中の下記から成る：
(i) 378V、378T、434Yおよび434Sから成る群の中から選択される1つのアミノ酸突然変異
と、
(ii) 226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421お
よび434から成っている群の中から選択されるアミノ酸位置での少なくとも一つのアミノ
酸突然変異、
（ここで、Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方である。
ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)とが同じアミノ酸位置では起こらない)
他の実施例では上記変異株が少なくとも２つのアミノ酸突然変異から成り、その少なく
とも２つのアミノ酸突然変異は下記から成る：
(i) 378V、378T、434Yおよび434Sから選択される1つのアミノ酸突然変異と、
(ii) 226G、230S代、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、342R、362R、362E、3
78V、378T、382V、389T、389K、396L、397M、421T、434Yおよび434S、より好ましくは226
G、230S、230T、230L、241Lから、264E、307P、315D、330V、362R、378V、378T、389T、3
89K、434Yおよび434Sから選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異。
（ここで、Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方である。
ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)とが同じアミノ酸位置では起こらない)
従って、本発明のさらに他の対照は、親ポリペチドと比較してＦｃＲｎに対する結合正
が増加した、Ｆｃ領域中に少なくとも一つのアミノ酸突然変異の組合せを有する親ポリペ
チドの変異株にある。この突然変異の少なくとも一つの組合せはＦｃ領域中の下記の群の
中から選択される：
226G/330V、230L/264E、230L/378V、230S/315D、230S/434Y、230T/378V、241L/434S、2
50A/434Y、264E/378T、305A/315D、305A/330V、305A/434Y、307P/434Y、315D/389T、330V
/382V、330V/389T、378V/421T、389K/434Y、389T/434Y、396L/434S、230T/264E、230T/31
5D、230T/434S、230T/434Y、241L/307P、264E/307P、264E/396L、315D/362R、315D/382V
、362R/434Y、378V/434Y、382V/434Y、226G/315D、226G/434Y、241L/378V、307P/378V、2
41L/264E、378V/434S、264E/378V、264E/434S、315D/330V、330V/434Yおよび315D/434Y。
Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方である。
上記変異株は親ポリペチドと比較してＦｃ領域中に下記の群の中から選択される少なく
とも一つの突然変異をさらに含むことができる：227S、226G、226Y、227L、228R、228L、
230S、230T、230L、230A、230Q、231T、231V、233D、234R、239A、241L、241Y、241R、24
3L、246R、250A、252L、256N、259I、264A、264E、264M、265G、265N、267N、267R、269D
、269G、270N、270E、276S、284L、285Y、288R、289I、290R、290E、291S、291Q、292W、
294del、297D、298G、298N、299M、299A、299K、301C、315D、302A、303A、303I、305A、
307P、307A、307N、308I、309P、311R、317R、320T、320E、322R、325S、327V、327T、33
0V、330T、332V、334E、334R、335A、338R、340E、342R、342E、342K、343S、345Q、345G
、347R、350A、352S、354P、355Q、355G、356N、359A、360N、360R、361D、361S、362R、
362E、369A、370R、371D、375A、375G、378V、378T、378S、380Q、382V、382G、383R、38
3N、384I、384T、385R、386R、386K、387S、387T、389T、389K、389R、390S、392E、401G
、392R、393N、394A、395A、395S、396S、396L、397A、397M、398P、399N、400P、401A 4
03T、404L、408T、411A、412A、414R、415D、415N、416K、416G、418K、418R 418E、419H
、420R、421T、421S、421D、422A、424L、426T、428L、433R、433P、434Y、434S、434H、
438R、439R、440R、440N、443R、444F、444P、445S、446A、447Eおよび447N。
Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方である。
本発明の他の実施例では、本発明変異株は親ポリペチドと比較してＦｃ領域中に以下を
有する：
(i) 下記の群の中から選択されるアミノ酸突然変異の少なくとも一つの組合せ：226G/330
V、230L/264E、230L/378V、230S/315D、230S/434Y、230T/378V、241L/434S、250A/434Y、
264E/378T、305A/315D、305A/330V、305A/434Y、307P/434Y、315D/389T、330V/382V、330
V/389T、378V/421T、389K/434Y、389T/434Y、396L/434S、230T/264E、230T/315D、230T/4
34S、230T/434Y、241L/307P、264E/307P、264E/396L、315D/362R、315D/382V、362R/434Y
、378V/434Y、382V/434Y、226G/315D、226G/434Y、241L/378V、307P/378V、241L/264E、3
78V/434S、264E/378V、264E/434S、315D/330V、330V/434Yおよび315D/434Yと、
(ii) 226G、227L、228L、228R 230S代、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、25
9I， 264E、265G、267R、290E、294del、303A、305A、307P、307A、308I、315D、322R、3
25S1 327V1 330V1 342R1 347R1 352S1 361のD1 362R1 362E1 370R1 378V1 378T1 382V、3
83N、386R、386K、387T、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N1、41
6K1、421T、426T、428L、433R、434Y、434Sおよび439Rから成る群の中から選択される少
なくとも一つのアミノ酸突然変異。
（ここで、Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方である。
ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)とが同じアミノ酸位置では起こらない)
他の実施例での上記変異株は250A/434Y、307P/434Y、230T/434S、264E/396L、378V/434
Y、378V/434S、264E/378V、264E/434S、315D/330Vおよび315D/434Yから成る群の中から選
択されるアミノ酸突然変異の少なくとも一つの組合せをＦｃ領域中に有する。Ｆｃ領域の
アミノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方である。
上記変異株は親ポリペチドと比較してＦｃ領域中に下記の群の中から選択される少なく
とも一つのアミノ酸突然変異を有する：230T、226G、226Y、227S、227L、228R、228L、23
0S、230L、230A、230Q、231T、231V、233D、234R、239A、241L、241Y、241R、243L、246R
、250A、252L、256N、259I、264A、264E、264M、265G、265N、267N、267R、269D、269G、
270N、270E、276S、284L、285Y、288R、289I、290R、290E、291S、291Q、292W、294del、
297D、298G、298N、299M、299A、299K、301C、315D、302A、303A、303I、305A、307P、30
7A、307N、308I、309P、311R、317R、320T、320E、322R、325S、327V、327T、330V、330T
、332V、334E、334R、335A、338R、340E、342R、342E、342K、343S、345Q、345G、347R、
350A、352S、354P、355Q、355G、356N、359A、360N、360R、361のD、361S、362R、362E、
369A、370R、371D、375A、375G、378V、378T、378S、380Q、382V、382G、383R、383N、38
4I、384T、385R、386R、386K、387S、387T、389T、389K、389R、390S、392E、392R、393N
、394A、395A、395S、396S、396L、397A、397M、398P、399N、400P、401A、401G、403T、
404L、408T、1A 41、412A、414R、415D、415N、416K、416G、418R、418K、418E、419H、4
20R、421T、421S、421のD、422A、424L、426T、428L、433R、433P、434Y、434S、434H、4
38R、439R、440R、440N、443R、444F、444P、445S、446A、447Eおよび447N。
Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方である。
他の実施例では本発明の変異株は親ポリペチドと比較してＦｃ領域中に下記を有する：
(i) 下記の群の中から選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異の組合せ：
250A/434Y、307P/434Y、230T/434S、264E/396L、378V/434Y、378V/434S、264E/378V、264
E/434S、315D/330Vおよび315D/434Yと、
(ii) 226G、227L、228L、228R、230S代、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、2
59I、264E、265G、267R、290E、294del、303A、305A、307P、307A、308I、315D、322R、3
25S、327V、330V、342R、347R、352S、361D、362R、362E、370R、378V、378T、382V、383
N、386R、386K、387T、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N、421T
416K1、426T、428L、433R、434Y、434Sおよび439Rの中から選択される少なくとも一つの
アミノ酸突然変異。
そこにおいて、
（ここで、Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方である。
ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)とが同じアミノ酸位置では起こらない)
他の実施例の上記変異株はＦｃ領域中に下記から成る群の中から選択される突然変異の
少なくとも一つのアミノ酸の組合せを有する：
226G/315D/330V、226G/315D/434Y、226G/330V/434Y、230L/264E/378V、230T/264E/378V、
230T/264E/434S、230S/315D/434Y、230T/315D/434Y、230T/389T/434S、241L/264E/434S、
241L/264E/378V、241L/264E/307P、241L/307P/378V、250A/389K/434Y、256N/378V/434Y、
2591/315D/264E 434Y/378T/396L、264E/378V/294del 416K1/307P/434Y、264E/307P/378V
、264E/396L/434S、264E/378V/434S、305A/315D/330V、305A/315D/434Y、305A/330V/434Y
、307P/378V/434Y、315D/330V/382V、315D/330V/389T、315D/378V/434Y、315D/389T/434Y
、315D/362R/434Y、315D/382V/434Y、315D/330V/434Y 330V/382V/434Y、330V/389T/434Y
および378V/383N/434Y。
Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方である。
上記変異株は親ポリペチドと比較してＦｃ領域中に下記から成る群の中から選択される
少なくとも一つの追加の突然変異を有する：226Y、226G、227S、227L、228R、228L、230S
、230T、230L、230A、230Q、231T、231V、233D、234R、239A、241L、241Y、241のR、243L
、246R、250A、252L、256N、259I、264A、264E、264M、265G、265N、267N、267R、269D、
269G、270N、270E、276S、284L、285Y、288R、289I、290R、290E、291S、291Q、292W、29
4del、297D、298G、298N、299M、299A、299K、301C、315D、302A、303A、303I、305A、30
7P、307A、307N、308I、309P、311R、317R、320T、320E、322R、325S、327V、327T、330V
、330T、332V、334E、334R、335A、338R、340E、342R、342E、342K、343S、345Q、345G、
347R、350A、352S、354P、355Q、355G、356N1、359A1、360N1、360R1、361D1、361S1、36
2R1、362E1、369A1、370R1、371D1、375A1、375G1、378V、378T、378S、380Q、382V、382
G、383R、383N、3841、384T、385R、386R、386K、387S、387T、389T、389K、389R、390S
、392E、392R、393N、394A、395A、395S、396S、396L、397A、397M、398P、399N、400P、
401A、401G、403T、404L、408T、41 1A、412A、414R、415D、415N、416K、416G、418R、4
18K、418E、419H、420R、421T、421S、421のD、422A、424L、426T、428L、433R、433P、4
34Y、434S、434H、438R、439R、440R、440N、443R、444F、444P、445S、446A、447Eおよ
び447N。
Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方である。
他の実施例では、本発明の変異株は親ポリペチドと比較してＦｃ領域中に下記を有する
：
(i)下記から成る群の中から選択されるアミノ酸突然変異の少なくとも一つの組合せ：226
G/315D/330V、226G/315D/434Y、226G/330V/434Y、230L/264E/378V、230T/264E/378V、230
T/264E/434S、230S/315D/434Y、230T/315D/434Y、230T/389T/434S、241L/264E/434S、241
L/264E/378V、241L/264E/307P、241L/307P/378V、250A/389 K/434Y、256N/378V/434Y、25
91/315 D/264E 434Y/378T/396L、264E/378V/416K、294del/307P/434Y、264E/307P/378V、
264E/396L/434S、264E/378V/434S、305A/315D/330V、305A/315D/434Y、305A/330V/434Y、
307P/378V/434Y、315D/330V/382V、315D/330V/389T、315D/389T/434Y、315D/362R/434Y、
315D/378V/434Y、315D/382V/434Y、315D/330V/434Y 330V/382V/434Y、330V/389T/434Yお
よび378V/383N/434Yと、
(ii) 下記から成る群の中から選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異：226G、227
L、228L、228R、230S代、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、259I、264E、265
G、267R、290E、294del、303A、305A、307P、307A、308I、315D、322R、325S、327V、330
V、342R、347R、352S、361のD、362R、362E、370R、378V、378T、382V、383N、386R、386
K、387T、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N、421T 416K1、426T
、428L、433R、434Y、434Sおよび439R。
（ここで、Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方である。
ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)とが同じアミノ酸位置では起こらない)
他の実施例の上記変異株はＦｃ領域中に下記から成る群の中から選択される突然変異の
少なくとも一つのアミノ酸の組合せを有する：
226G/315D/434Y、230S/315D/434Y、230T/315D/434Y、230T/264E/434S、230T/389T/434S、
241のL/264E/378V、241L/264E/434S、250A/389K/434Y、256N/378V/434Y、259I/315D/434Y
、264E/378T/396L、264E/378V/416K、264E/378V/434S、264E/396L/434S、294del/307P/43
4Y、307P/378V/434Y、315D/330V/434Y、315D/378V/434Y、315D/382V/434Yおよび378V/383
N/434Y。
Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方である。
前記変異株はさらに、、親ポリペチドと比較してＦｃ領域中に下記から成る群の中から
選択される少なくとも一つの追加の突然変異を有する：226G1、226Y1、227S1、227L1、22
8R1、228L1、230S1、230T1、230L1、230A、230Q、231T、231V、233D、234R、239A、241L
、241Y、241R、243L、246R、250A、252L、256N、259I、264A、264E、264M、265G、265N、
267N、267R、269D、269G、270N、270E、276S、284L、285Y、288R、289I、290R、290E、29
1S、291Q、292W、294del、297D、298G、298N、299M、299A、299K、301C、302A、303A、30
3I、305A、307P、307A、307N、308I、309P、311R、315D、317R、320T、320E、322R、325S
、327V、327T、330V、330T、332V、334E、334R、335A、338R、340E、342R、342E、342K、
343S、345Q、345G、347R、350A、352S、354P、355Q、355G、356N、359A、360N、360R、36
1D、361S、362R、362E、369A、370R、371D、375A、375G、378V、378T、378S、380Q、382V
、382G、383R、383N、384I、384T、385R、386R、386K、387S、387T、389T、389K、389R、
390S,392E、392R、393N、394A、395A、395S、396S、396L、397A、397M、398P、399N、400
P、401A、401G、403T、404L、408T、41の1つのA、412A、414R、415D、415N、416K、416G
、418R、418K、418E、419H、420R、421T、421S、421のD、422A、424L、426T、428L、433R
、433P、434Y、434S、434H、438R、439R、440R、440N、443R、444F、444P、445S、446A、
447Eおよび447N。
Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方である。
他の実施例では、本発明の変異株は親ポリペチドと比較してＦｃ領域中に以下を有する
：
(i) 下記から成る群の中から選択されるアミノ酸突然変異の少なくとも一つの組合せ：22
6G/315D/434Y、230S/315D/434Y、230T/315D/434Y、230T/264E/434S、
230T/389T/434S、241L/264E/378V、241L/264E/434S、250A/389K/434Y、256N/378V/434Y、
2591/315 D/434Y、264E/378T/396L、264E/378V/416K、264E/378V/434S、264E/396L/434S
、294del/307P/434Y、307P/378V/434Y、315D/330V/434Y、315D/378V/434Y、315D/382V/43
4Yおよび378V/383N/434Yと、
(ii) 下記から成る群の中から選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異：227L、228
R 226G、228L、230S、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、259I、264E、265G、
267R、290E、294del、303A、305A、307P、362R、307A、308I、315D、322R、325S、327V、
330V、342R、347R、352S、361D、370R、362E 378V、378T、382V、383N、386R、386K、387
T、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N、416K、421T、426T、428L
、433R、434Y、434Sおよび439R。
（ここで、Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方である。
ただし、突然変異(i)は突然変異(ii)とが同じアミノ酸位置では起こらない)
上記の全ての実施例のアミノ酸突然変異は親ポリペチドと比較して１〜２０、好ましく
は１〜１０の変異株を有するのが好ましい。
変形例の実施例の上記変異株はＦｃ領域中に下記から成る群の中から選択されるアミノ
酸突然変異の1つの組合せを有する：307A/315D/330V/382V/389T/434Y、307A/315D/382V/3
89T/434Y、256N/378V/383N/434Y、256N/378V/434Y、315D/330V/361D/378V/434Y、315D/36
1D/378V/434Y、2591/315D/434Y、230S/315D/428L/434Y、241L/264E/307P/378V/433R、250
A/389K/434Y、305A/315D/330V/395A/434Y、264E/386R/396L/434S/439R、315D/330V/362R/
434Y、294del/307P/434Y、305A/315D/330V/389K/434Y、315D/327V/330V/397M/434Y、230T
/241L/264E/265G/378V/421T、264E/396L/415N/434S、227L/264E/378V/434S、264E/378T/3
96L、230T/315D/362R/426T/434Y、226G/315D/330V/434Y、230L/241L/243L/264E/307P/378
V、250A/315D/325S/330V/434Y、290E/315D/342R/382V/434Y、241L/315D/330V/392R/434Y
、241L/264E/307P/378V/434S、230T/264E/403T/434S、264E/378V/416K、230T/315D/362E/
434Y、226G/315D/434Y、226G/315D/362R/434Y、226G/264E/347R/370R/378V/434S、3081/3
15D/330V/382V/434Y、230T/264E/378V/434S、231T/241のL/264E/378T/397M/434S、230L/2
64E/378V/434S、230T/315D/330V/386K/434Y、226G/315D/330V/389T/434Y、267R/307P/378
V/421T/434Y、230S/315D/387T/434Y、230S/264E/352S/378V/434Sおよび230T/303A/322R/3
89T/404L/434S。
Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方である。
他の実施例の上記変異株は256N/378V/434Y、307A/315D/330V/382V/389T/434Y、256N/37
8V/383N/434Y、315D/330V/361のD/378V/434Y、259I/315D/434Yおよび230S/315D/428L/434
Yから成る群の中から選択されるアミノ酸突然変異の1つの組合せを含む。
本発明のさらに他の対照は、親ポリペチドと比べてＦｃＲｎに対する結合正が増加し、
且つ下記から成る群の中から選択されるＦｃ変異株を含むポリペチド変異株を提供するこ
とにある：307A/315D/330V/382V/389T/434Y、307A/315D/382V/389T/434Y、256N/378V/383
N/434Y、315D/330V/361D/378V/434Y/361D/378V/434Y、2591/315D/434Y、230S/315D/428L/
434Y、241L/264E/307P/378V/433R、250A/389K/434Y、256N/378V/434Y、305A/315D/330V/3
95A/434Y、264E/386R/396L/434S/439R、315D/330V/362R/434Y、294del/307P/434Y、305A/
315D/330V/389K/434Y、315D/327V/330V/397M/434Y、230T/241L/264E/265G/378V/421T、26
4E/396L/415N/434S、227L/264E/378V/434S、264E/378T/396L、230T/315D/362R/426T/434Y
、226G/315D/330V/434Y、230L/241L/243L/264E/307P/378V、250A/315D/325S/330V/434Y、
290E/315D/342R/382V/434Y、241L/315D/330V/392R/434Y、241L/264E/307P/378V/434S、23
0T/264E/403T/434S、264E/378V/416K、230T/315D/362E/434Y、226G/315D/434Y、226G/315
D/362R/434Y、226G/264E/347R/370R/378V/434S、3081/315D/330V/382V/434Y、230T/264E/
378V/434S、231T/241L/264E/378T/397M/434S、230L/264E/378V/434S、230T/315D/330V/38
6K/434Y、226G/315D/330V/389T/434Y、267R/307P/378V/421T/434Y、230S/315D/387T/434Y
、230S/264E/352S/378V/434Sおよび230T/303A/322R/389T/404L/434S。
Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatでのＥＵインデックスの数え方である。
他の実施例では、親ポリペチドと比較してＦｃＲｎに対する結合性が増加したポリペチ
ド変異株は下記から成っている群の中から選択されるＦｃ変異株を有する：256N/378V/43
4Y、307A/315D/330V/382V/389T/434Y、256N/378V/383N/434Y、315D/330V/361D/378V/434Y
、259I/315D/434Yおよび230S/315D/428L/434Y。
本発明の上記全ての変異株で、親ポリペチドのＦｃ領域は野生型ＩｇＧのＦｃ領域（例
えば、「低ヒンジ-CH2-CH3」）およびその断片）から作ることができる。
より多くの好ましい実施例において、親ポリペチドのＦｃ領域は、ヒトＩｇＧサブクラス
（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3およびＩｇＧ4）に由来する。他の好ましい実
施例では、親ポリペチドのＦｃ領域は野性-型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域（SEQ ID：NO1）、野生
型ＩｇＧ2 Ｆｃ領域（SEQ ID：NO2）、野性-型ＩｇＧ3 Ｆｃ領域（SEQ ID：NO3）および
野性-型ＩｇＧ4 Ｆｃ領域（SEQ ID：NO4）から成る群の中から選択される。
本発明の別の対照は上記ＩｇＧ１ Ｆｃ変異株から成るポリペチドにあり、このＩｇＧ
１ Ｆｃ変異株はＩｇＧ１ Ｆｃ（SEQ ID NO：1）の野生型配列と比較して少なくとも一つ
のアミノ酸突然変異を有し、野性-型ＩｇＧ１ Ｆｃと比較してＦｃＲｎに対する結合性が
増加する。ただし、このＩｇＧ１ Ｆｃ変異株の配列はSEQ ID 番号2、SEQ ID 番号3およ
びSEQ番号4ではない。
本発明の別の対照は上記ＩｇＧ２Ｆｃ変異株から成るポリペチドであり、このＩｇＧ2
Ｆｃ変異株はＦｃＲｎに野性-型ＩｇＧ２Ｆｃと比べて少なくとも一つのアミノ酸突然変
異を有し、野性-型ＩｇＧ２Ｆｃと比較してＦｃＲｎに対する結合性が増加する。ただし
、このＩｇＧ２Ｆｃ変異株の配列はSEQ ID 番号１、SEQ ID 番号3およびSEQ番号4ではな
い。
本発明の別の対照は上記ＩｇＧ３Ｆｃ変異株から成るポリペチドであり、このＩｇＧ３
Ｆｃ変異株はＦｃＲｎに野性-型ＩｇＧ３Ｆｃと比べて少なくとも一つのアミノ酸突然変
異を有し、野性-型ＩｇＧ３Ｆｃと比較してＦｃＲｎに対する結合性が増加する。ただし
、このＩｇＧ３Ｆｃ変異株の配列はSEQ ID 番号１、SEQ ID 番号２およびSEQ番号4ではな
い。
本発明の別の対照は上記ＩｇＧ４Ｆｃ変異株から成るポリペチドであり、このＩｇＧ４
Ｆｃ変異株はＦｃＲｎに野性-型ＩｇＧ４Ｆｃと比べて少なくとも一つのアミノ酸突然変
異を有し、野性-型ＩｇＧ４Ｆｃと比較してＦｃＲｎに対する結合性が増加する。ただし
、このＩｇＧ４Ｆｃ変異株の配列はSEQ ID 番号１、SEQ ID 番号２およびSEQ番号３では
ない。
好ましい実施例では、ＩｇＧ１、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3またはＩｇＧ4Ｆｃ変異株ポリペチ
ドから成る群の中から選択される少なくとも一つのアミノ酸突然変異はは、上記の対応す
る親ポリペチドと比べてＦｃＲｎに対する結合性が増加するアミノ酸突然変異、アミノ酸
突然変異の組合せの群の中から選択される。
上記のように、本発明の変異株は、対応する親ポリペチドと比べてＦｃＲｎに対する増
加した結合性を示す。一つの実施例ではエフェクタ機能および結合性は対応する親のそれ
と同様である。この変異株は特にＦｃ-γリセプタまたはC1qに対する結合性が親ポリペチ
ドと比べて大きく変化しない。
他の実施例の上記変異株はＦｃＲｎへの結合性が増加し且つの一つ以上のエフェクタ機
能および／またはＦｃリガンド結合性（ＦｃＲｎ以外の）を有する。
実施例２に示すように、本発明の変異株はＦｃγRへの結合性、特にＦｃγRllla、ＡＤ
ＣＣ（抗体依存細胞介在細胞毒性（Dependent Cell-mediated Cytotoxicity）活性および
ＣＤＣ（Complement-Dependent Cytotoxicity）活性を変えずに、ポリペチド変異株と比
較したＦｃＲｎへの結合性が増加する。また、本発明変異株は少なくともそのポリペチド
親と同じＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性を有すると同時にＦｃＲｎに対する結合性が増加する
。他のケースでは、本発明変異株は親ポリペチドと比べてＦｃＲｎに対する結合性が増加
すると同時に、親ポリペチドと同等なＡＤＣＣおよびＣＤＣの中から選択される少なくと
も一つのエフェクタ活性とを組み合わせて有する。
ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性は従来技術で公知で、実施例２のIV.2、IV.3に記載の方
法で評価できる。
ＦｃγRへの結合は従来法（例えばＳＰＲまたはＥＬＩＳＡアッセイ）で評価できる。
本発明のさらに他の対照は、親ポリペチドと比べてＦｃＲｎ対する結合性が増加した上
記とは異なる追加のアミノ酸突然変異を含む変異株を提供することにある。
従って、本発明のＦｃ突然変異は、ＦｃＲｎに対するＦｃ親和性が増加することが公知
である他のＦｃ突然変異（例えば関連技術の説明に記載のものを参照）と組み合せること
ができる。
あるいは、Ｆｃ突然変異をエフェクタ機能を変える突然変異または一つ以上のＦｃリガ
ンドを有する他のＦｃ突然変異と組み合せることができる。すなわち、この種の変異株は
親ポリペチドと比較して1つのＦｃリガンド（ＦｃＲｎ以外）および/またはエフェクタ機
能と、ＦｃＲｎに対する結合性の増加とを組み合わせて有する。
ＦｃリガンドはＦｃγＲｓ(Ｆｃγリセプタ)、Ｃ１ｑ、Ｃ３、レクチン結合マンナン、
マンノースレセプター、プロテインＡ、溶連菌タンパクＧおよびウイルス性ＦｃγＲｓを
含むが、これに限定されるものではない。ＦｃリガンドもＦｃレセプタ相同体（ＦｃＲＨ
）を含む。これはＦｃγＲｓ（非特許文献２３）に対応するＦｃレセプタのファミリーで
ある。
Debis et al.,2002、Immunological Reviews 190 123-136
「エフェクタ機能」とはＦｃレセプタまたはリガンドを有する抗体Ｆｃ領域の相互作用
で生じる生化学的または細胞事象である。エフェクタ機能はＡＤＣＣ（抗体依存細胞介在
細胞毒性（Dependent Cell-mediated Cytotoxicity）、ＡＤＣＰ(抗体依存細胞介在食作
用-Dependent Cell-mediated Phagocytosis)およびＣＤＣ（補体依存細胞介在細胞毒(Dep
endent Cytotoxicity）を含むが、これらに限定されるものではない。
本発明の変異株はＦｃ領域を有し、親ポリペチドと比べてＦｃＲｎに対する結合性の増
加を示す任意のポリペチドを含み、そのポリペチドＦｃ領域のアミノ酸突然変異の少なく
とも一つのアミノ酸突然変異またはその組合せが親ポリペチドと異なる。重要なアミノ酸
の突然変異およびその組合せは本発明の変異株の一般的な特徴を説明した上記の突然変異
である。
変異株（従って親ポリペチド）は抗体、Ｆｃ融合タンパク、Ｆｃ共役、単離されたＦｃ
およびそれらの断片を含むが、これに限定されるものではない。特に、変異株はＦｃ-含
有結合タンパクにすることができる。換言すれば、変異株は(i) Ｆｃ変異株と（ii）所定
分子に特異的に結合可能な結合ポリペチド領域とを有する。
本発明実施例では、本発明ポリペチド変異株はＦｃ-融合タンパク変異株およびＦｃ-共役(conjugates)変異株から成る群の中から選択される。Ｆｃ-融合タンパクおよびＦｃ-共役物(conjugates)はパートナーに結合されるＦｃ領域から成る。このＦｃ領域はスペーサを介してまたは介さずにパートナーにリンクできる。
本発明ではＦｃ融合タンパクは単一遺伝子によってコードされるタンパクであり、タンパク、ポリペチドまたはＦｃ領域に結合した小さいペプチドから成る。Ｆｃ融合タンパクは必要に応じてペプチド・スペーサを含む。実質的には任意のタンパクまたは小分子をＦｃ領域に結合させてＦｃ融合物（fusion)にすることができる。タンパク融合パートナーは任意の抗体、任意の抗体可変部に由来するポリペチド、レセプタの標的結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモキンまたは他のタンパクまたはタンパク領域を含むが、これらに限定されるものではない。特に、Ｆｃ-融合タンパクは免疫接着要素(immunoadhesin)にすることができ、この免疫接着要素は免疫グロブリン不変領域断片（すなわちＦｃ領域）と接着する異種「接着」タンパク(例えばレセプタ、リガンドまたは酵素)の結合領域を有するタンパク、例えば抗体にすることができる。免疫接着要素(immunoadhesin)に関しては下記文献を参照のこと：
Ashkenazi A、Chamow SM. 1997、Curr Opin Immunol.;9(2):195-200
小さいペプチド合着パートナーでは、Ｆｃ合着を治療の標的に向ける任意の治療剤が含
まれるが、これに限定されるものではない。この種の標的は任意の分子、好ましくは病気
に関係する細胞外リセプタにすることができる。
本発明では、Ｆｃ共役は共役パートナーとＦｃ領域との化学的カップリングで得られる
。共役パートナーはタンパク性のものでも非タンパク性のものでもよい。共役反応は一般
にＦｃ領域上および共役パートナー上の官能基を使用する。共役の合成に適切な種々のリ
ンカーが公知である。例えば、ホモ-またはヘテロ-二官能性リンカーが周知である（非特
許文献25を参照）。
Pierce Chemical Company catalog, 2005-2006, technical section on cross-linkers, pages 321 -350
適した共役パートナーはポリペプチド製剤、標識(例えば下記標識)、医薬品、細胞毒素剤、細胞毒薬（例えば化学療法剤）、トキシンおよびトキシンの活性断片を含むが、これに限定されるものではない。適切なトキシンおよびその対応断片にはジフテリアＡ鎖、エキソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クロシン、クロチン、フェノミシン（phenomycin）、エノミシン（enomycin）等が含まれるが、これらに限定されるものではない。細胞毒素剤はＦｃ変異株と直接共役できる任意の放射性核種またはＦｃ変異株に共有結合できるキレート剤にすることができる。追加の実施例では、共役パートナーはカリキアミシン（calicheamicin）、オウリスタチン（auristatins）、ゲルダナマイシン、メイタンシンおよびドュオカルミシン（duocarmycins）等から成る群の中から選択できる（特許文献１２を参照、この特許の内容は本明細書の一部を成す）。
米国特許第200310050331号明細書
この種の変異株は低pH（例えば、約pH 6）でＦｃＲｎに対する結合性が増加し、高pH（
例えば約pH 7,4）では実質的に結合性が変更されてない。特に重要なＦｃ-融合タンパク
およびＦｃ-共役体変異株は親ポリペチドと比べてインビボでの半減期が増加するもので
ある。
好ましい実施例では、本発明のポリペチド変異株は親抗体の異なる抗体である。「抗体
」という用語はここでは最も広い意味で使われる。本発明で「抗体」とはは少なくとも(i
) Ｆｃ領域および (ii) 免疫グロブリンの可変領域と結合するポリペチド領域を含む任意
のポリペチドを意味する。このポリペチド領域は一つの所定標的抗原または一群の標的抗
原に特異的に結合できる。
免疫グロブリンの可変部に由来する結合ポリペチド領域は少なくとも1つのＣＤＲを有
する。ここで、抗体は完全長の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、多特異抗体、少な
くとも一つの可変部を有するＦｃ-融合タンパク、合成抗体（「疑似抗体(mimetics)」と
も呼ばれる）、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体を含むが、これに限定される
ものではない。抗体はさらに抗体-融合タンパク、抗体複合体およびその各断片を含む。
従って、本発明の異なる抗体はそのＦｃ領域中に親抗体と比べてＦｃＲｎに対する結合能
が増加させる上記の少なくとも一つのアミノ酸突然変異または突然変異の組合せを含む。
ＦｃＲｎに低pH（例えば、約pH 6）で結合能が増加し、高pH（例えば約pH 7,4）で実質的
に接合性が変更しない抗体変異株が重要である。さらに、親ポリペチドと比べてインビボ
での半減期が増加する抗体変異株が重要である。
一つの実施例では、本発明の異なる抗体は親の完全長の抗体の変異株から成る群の中か
ら選択される。「完全長の抗体」とは可変領域および恒常部を含む天然抗体の生物学的な
形および構造を有するものを意味する。本発明の完全長の抗体変異株の親ポリペチドは野
生型抗体、野生型抗体ミュータント（例えば、既存の突然変異を含む）、野生型抗体の設
計バージョン（例えばキメラ）、ヒト化抗体または完全ヒト抗体にすることができるがこ
れらに限定されるものではない。完全長の抗体の構造は一般にラマやラクダ等のいくつか
の哺乳類を除いて免疫グロブリンがテトラマおよびダイマーである。各テトラマは典型的
に２つの全く同じペアー（1つが典型的に約25kDaの分子量を有する「軽」鎖の1つの「重
」鎖（典型的に約50-70kDaの分子量を有するペアー）から成るポリペプチド鎖である。
完全長の抗体の例は免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンＤ、ＩｇＧ、免疫グロブリンＡ
および免疫グロブリンＥのクラスを含むヒト免疫グロブリンである。
好ましい実施例の前記変異株はＩｇＧ変異株から成る群の中から選択される完全長の抗
体である。
より好ましい実施例の前記変異株では、完全長の抗体がヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、Ｉｇ
Ｇ３およびＩｇＧ４の変異株から成る群の中から選択されるが、そのが変異株のＦｃ領域
の配列はSEQ ID番号1、SEQ ID 番号2、SEQ ID番号3およびSEQ ID 番号4ではない。
上記変異株は親ＩｇＧと比較して一つ以上のアミノ酸突然変異を有する。この一つ以上
のＩｇＧ アミノ酸突然変異は、上記のＦｃ領域から成り且つＦｃＲｎに対して対応する
親ポリペチドより結合性が増加したポリペチド変異株を一般に定義する際に説明した突然
変異またはその組合せから成る。
他の実施例では、前記抗体変異株が抗体免疫グロブリンの変数領域から誘導される結合ポリペチド領域を有するＦｃ-融合タンパクから選択される。特に重要な抗体は(a)本発明のＦｃ変異株と、（b）免疫グロブリンの可変部から誘導される下記の結合ポリペチド領域の一つ（すなわち少なくとも一つのＣＤＲ）とを有する抗体である：
(i) ＶＬ、ＶＨＣｌおよびＣＨ１領域から成るＦａｂ断片、
(ii) ＶＨおよびＣＨ１領域から成るＦｄ断片、
(iii) 単一抗体のＶＬおよびＶＨ領域から成るＦｖ断片、
(iv) 単離したＣＤＲ領域、
(v）Ｆ（ａｂ'）２断片、２つの互いに連結されたＦａｂ断片から成る二価断片
(vi）抗原結合部位を形成することができるペプチド・リンカーによって結合されたＶＨ領域とＶＬ領域とを有する単一鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、
(vii）二特異的（bispecific）な単鎖Ｆｖ、
(viii）遺伝子融合によって得られる「diabodies」または「triabodies」、多価または多特異的（miltispecific)な断片。
しかし、これらに限定されるものではない。
他の実施例では、抗体はミニボディー（minibody）である。このミニボディー（minibo
dy）はCH3領域に連結したscFvから成る最小抗体のようなタンパクである（非特許文献２
６参照）場合によっては、scFvは完全長のＦｃ領域に結合でき（非特許文献２７）、また
、ヒンジ領域またはその断片を含むことができる。
Hu et al., 1996, Cancer Res. 56:3055-3061 De Lorenzo et al., 2005, Carcinogenesis 26:1890-1895
一つの実施例では、本発明抗体は多特異性抗体の群、特に「ジアボディー（diabodies
）」とよばれる二特異性抗体の群の中から選択される。これらの抗体は2つ以上の異なる
抗原を結合する。ジアボディー（diabodies）は公知の複数の方法、例えば化学的方法ま
たはハイブリドーマにして作ることができる（非特許文献２８）。
Holliger and Winter, 1993, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449
他の実施例では、抗体変異株の足場成分が異なる生物種からの混合物である。この種の
抗体変異株はキメラ抗体および／またはヒト化抗体にできる。一般に、「キメラ抗体」お
よび「ヒト化抗体」の両方は複数の生物種かの領域を結合した抗体を意味する。例えば伝
統的な「キメラ抗体」は非ヒト動物、一般にハツカネズミまたはラットの可変部とヒトか
らの恒常部とから成る。ほとんどの場合、ヒト化抗体は非ヒト免疫グロブリン由来の最小
配列を含むキメラ抗体である。一般に、ヒト化抗体では、CDR以外の全抗体がヒト起源遺
伝子のポリヌクレオチドによってコードされるか、CDRないを除いてヒト抗体と同一であ
る。非ヒト生物由来の核酸によってコードされるCDRの全てまたは一部は、ヒト抗体可変
部のβ-シート・フレーム・ワークにグラフトされて抗体を作る。その特異性はグラフト
されたCDRによって決定される。例えば、この種の抗体の生成は特許文献１３に記載され
、非特許文献２８、非特許文献２９にも記載されている。これら文献の内容は本明細書の
一部を成す。
国際特許第WO 92/11018号公報 Jones, 1986, Nature 321 :522-525 Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536
ヒト化抗体は少なくとも免疫グロブリン、典型的にはヒト免疫グロブリンの恒常部の一
部から成り、従って、典型的にはヒトＦｃ領域を含む。また、ヒト化抗体は遺伝子操作で
設計された免疫系を有するハツカネズミを使用して発生できる (非特許文献３０参照）。
非ヒトの抗体をヒト化して作り直す方法は種々の方法が公知である（非特許文献３1）。
非特許文献３１〜非特許文献４０にも各種のヒト化方法が記載されている。しかし、これ
ちのものに限定さるものではない。これら文献の内容は全て本明細書の一部を成す。ヒト
化または非ヒトの抗体可変部の免疫原性を減らす他の方法には例えば非特許文献４０に記
載のリサーファス法が含まれる。この文献の内容も全て本明細書の一部を成す。
Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654 Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA), Jones et al., 1986, Nature 321 :522-525 ; Riechmann et al.,1988; Nature 332:323-329 ; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536 ; Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33 ; He et al., 1998, J. mmunol. 160: 1029-1035 ; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9 ; Presta et al., 1997, Cancer Res. 57(20):4593-9 ; Gorman et al., 1991 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181 -4185 ; O'Connor et al., 1998, Protein Eng 11 :321-8 Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973
一つの実施例では、上記抗体変異株は少なくとも一つのアミノ酸を有する完全ヒト抗体
である。その概略について述べましたように、ここでは突然変異である。「完全ヒト抗体
」または「ヒト化抗体」は完全にヒト・遺伝子由来の配列から成る抗体を意味する。場合
によっては、これは突然変異を有するヒト染色体由来の抗体の遺伝子配列を有するヒト抗
体である。あるいは、抗体成分はヒトであるが、単一遺伝子に由来しない。従って、例え
ば、1つの抗体からのヒトCDRは一つ以上のヒト抗体からの配列（例えば足場配列）と組み
合せることができる。例えば、各種の生殖細胞配列をヒト抗体またはヒト足場を形成する
ために結合できる（例えばヒト化またはキメラの配列の概略については特許文献１４参照
）。
米国特許出願第11/022,289号明細書
一つの実施例では、本発明の抗体変異株はキメラのＩｇＧ、ヒト化ＩｇＧおよび完全ヒ
トＩｇＧから成る群の中から選択される。
抗体の共有結合による修飾も本発明の範囲に含まれるが、必ずしも後翻訳（post-trans
lationally）されない。この種の突然変異はグルコシレート（glycosylates）、標識化お
よび共役を含むが、これらに限定されるものではない。
従って、いくつかの実施例では、本発明のポリペチド変異株は一つ以上の設計されたグ
ルコホーム（engineering glycoforms）を含むように修正できる。「グルコホームを含む
ように修正」とは共有結合でＦｃ変異株から成っているポリペチドに付けられる炭水化物
組成物を意味する。この炭水化物組成物は親のポリペチドのそれとは化学的に異なる。設
計されたグルコホームはエフェクタ機能を改良するかまたは減らす等を含む種々の目的で
有用である。設計されたグルコホーは変異配列の任意のアミノ酸に取付けることができる
。グルコホームは実施例のＦｃ領域のアミノ酸に取付けるのが好ましい。
設計されたグルコホームは公知の種々の方法で作ることができる(非特許文献４２〜非
特許文献４７、特許文献１５〜２２参照)。これら文献の内容は本明細書の一部を成す。
Umaa et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001 , Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; Potelligent （登録商標） technology [Biowa, Inc., Princeton, N.J.]; GlycoMAb（登録商標） glycosylation engineering technology [Glycart Biotechnology AG, Zuerich, Switzerland] 米国特許第6,602,684号明細書 米国特許出願第10/277,370号明細書 米国特許出願第10/113,929号明細書 国際特許第WO 00/61739A1号公報 国際特許第WO 01/29246A1号公報 国際特許第WO 02/31140A1号公報 国際特許第WO 02/30954A1号公報 国際特許第WO 01/771811号公報
これらの方法の多くはＦｃ領域に共有結合で付けられるフコシル化(fucosylated)およ
び／または二分オリゴ糖レベルを制御することをベースにしている。例えば、種々の生物
の抗体変異株または細胞系、例えば設計(engineering)したLec-13 CHO細胞またはラット
・ハイブリドーマYB2/0細胞を発現することによって、グリコシル化経路に関係する酵素
（例えばFUT8 [α1,6-フコシトランスラーゼ]および／またはβ1-4-N-セチルグルコサミ
ニルトランスフェラーゼIII [GnTIII]）をコントロールするか、抗体変異株の発現後に炭
水化物を修正することによってコントロールする。
設計されグルコホームは異なる炭水化物またはオリゴ糖から成る抗体変異株にすること
もある。グリコシル化パターンはタンパクの配列（例えば特定のグリコシル化アミノ酸残
基の有無記）またはタンパクが生じる宿主細胞または生物の両方依存することは公知であ
る。特定の発現系については以下で説明する。
ポリペチドのグリコシル化は一般にＮに結合されているかＯに結合されている。Ｎ結合
はアスパラギン残基の側鎖への炭化水素部分である。トリ−ペプチド配列アスパラギン−
Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ-チロシン(ここでＸはプロリン以外の任意のアミノ酸
)はアスパラギン側鎖への炭化水素部分の酵素付加の認識配列である。従って、ポリペチ
ドのこれらのトリ−ペプチド配列のどちらかの存在が潜在的なグリコシル化サイトを作る
。Ｏに結合されたグリコシル化は糖N-アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシ
ロースの中の1つの付加、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的なセリンまたはスレオニンへ
の付加であり、5-ヒドロキシプロリンまたは5-ヒドロキシリシンも使うことができる。
従来は抗体へのグリコシル化サイトの付加は上記のトリ−ペプチド配列の少なくとも1
つを含むようにアミノ酸配列を変えて行っている（Ｎ結合グリコシル化サイト）。また、
付加または出発配列に一つ以上のセリンまたはスレオニン残基を置換して製造することも
できる（Ｏ結合グリコシル化サイト）。簡単には、抗体アミノ酸配列をＤＮＡレベルで所
望のアミノ酸変更で変え、特に標的ポリペチドをコードするＤＮＡを所定塩基で突然変異
させて、所望アミノ酸に翻訳するコードンを発生される。
抗体上の炭化水素部分の数を増やす他の手段はグリコシドを化学的または酵素でタンパ
クにカップリングすることである。Ｎ結合やＯ結合グリコシル化可能な宿主細胞のタンパ
クの生産を必要としない点でこの手順は有利である。使用する結合モードに従って糖を下
記に付けることができる：
(a) アラニンおよびヒスチジン、
(b) 遊離カルボキシル基、
(c) シスチンのようなフリーのスルフヒドリル基、
(d) セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンのような遊離水酸基、
(e) フェニルアラニン、チロシンまたはヒドロキプロリンのような芳香族残基、
(f) グルタミンのアミド基。
これらの方法は1987年9月11日公開の特許文献２３および非特許文献４８に記載されて
いる。
国際特許第WO 87/05330号公報 ApNn and Wriston, 1981 , CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306
出発抗体中に存在する炭化水素部分の除去は化学的または酵素で行うことができる。化
学的脱グリコシルはトリフルオロメタンスルフン酸またはその均等化合物にタンパクを暴
露する必要がある。この操作で結鎖糖（N アセチルグルコサミンまたはN-アセチルガラク
トサミン）以外の大部分の糖を開裂し、ポリペチドは保護できる。化学的グリコシルは非
特許文献４９、非特許文献５０に記載されている。ポリペチド上の炭化水素部分の酵素開
裂は非特許文献５１に記載のように各種エンド−およびエクソ−グルコダーゼを使用して
行うことができる。非特許文献５２に記載のように、潜在的なグリコシル化サイトでのグ
リコシル化はタンパク-N- グリコシド結合の形成をブロックするツニカマイシン化合物の
使用によって防止できる。ツニカマイシンは非特許文献５２に記載されている。
Hakimuddin et al., 987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 Edge et al., 1981 , Anal. Biochem. 118:131 Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350 Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105
他の実施例では、本発明の抗体変異株はキメラのＩｇＧ、ヒト化抗体ＩｇＧおよび設計
されたグリコホームから成る完全ヒトＩｇＧから成る群の中から選択される。
別の実施例では、本発明の抗体変異株の共有結合による修飾は一つ以上の標識の付加か
ら成る。場合によっては、これは抗体融合と考えられる。「標識化基」という用語は検出
可能な任意の標識を意味する。他の実施例では、標識化基はポテンシャル立体障害を減ら
すための種々の長さのスペーサアームを介して抗体に連結する。タンパクの標識化は種々
の方法が公知で、本発明を実行する際に使用できる。
一般に、標識には検出されるアッセイまたは診断手順によって種々のクラスが含まれる
：
a) 同位体タグ。これは放射性元素または重質同位体にできる；
b) 磁気標識（例えば磁気粒子）；
c) レドックス活性成分；
d) 光学染料、酵素基（例えばワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェ
ラーゼ、アルカリホスファターゼ）
e) ビオチン化された基；
f) 第２リポータで認識される所定ポリペチドエピトープ（例えばロイシン・ジッパー対
配列、第２抗体用の結合部、金属結合領域、エピトープタグ、その他）。
特定の標識には発色団、燐およびフッ化燐の蛍光団が含まれるが、これらに限定される
ものではない。フッ化燐の蛍光性団は「小分子」蛍光剤でも蛍光タンパクでもよい。
他の実施例では、本発明の抗体変異株を上記の標識化基として使われないタンパクまた
は小分子に融合または共役させることができる。実際に、任意のタンパクまたは小分子を
抗体に連結できる。タンパク合着パートナーにはリセプタの標的-結合領域、接着分子、
リガンド、酵素、サイトカイン、ケモキンまたは他のタンパクまたはタンパク領域を含む
が、これらに限定されるものではない。小分子は医薬品（例えば、細胞障害剤）、トキシ
ンまたはこのトキシンの活性種（例えば化学療法剤）を含むが、これら限定されるもので
はない
既に述べたように、本発明の抗体変異株は一つの標的抗原または一群の標的抗原に特異
的に結合できる。「標的抗原」とは所定抗体または免疫グロブリンの可変部に特異的に結
合する分子を言う。標的抗原はタンパク、炭水化物、リピド、その他の化学化合物にする
ことができる。
適切な抗原の選択は所望の用途に依存する。実際には下記の任意の抗原を目標にできる
。例えば、膜タンパク質、RhD抗原、CD3、CD4、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD32B、
CD33、CD38、CD40、CD44、CD52、CD71 （トランスフェリン・リセプタ）、CD80、CD86、C
TLA-4、CD147、CD160、CD224、リセプタErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4 ErbBファミリーに
属するような生長因子レセプタ（EGFR、HER2/neu、HER3、HER4）、VEGF-R1、VEGF-R2、IG
F-FM 1、PIGF-R、MHCクラスIおよびMHCクラスIl分子、例えばHLA-DR、IL-1 R、IL-2Rα）
IL-2RβおよびIL-2Rガンマ、IL-6Rのようなインターロイキンレセプタ、M llerian抑制物
質タイプIlリセプタのようなホルモンレセプタ、ＬＤＬリセプタ、NKp44L、CXCR4およびC
CR5のようなケモキンリセプタがあるが、これらに限定されるものではない。膜タンパク
はGD2、GD3、CA125、MUC-1、MUC-16のような腫瘍マーカー、carcinoembrionic抗原（CEA
）、Tn、グリコプロテイン72、PSMA、HMW-MAAを含む。また、本発明の抗体はサイトカイ
ン（例えば、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、IL-23、TGFベータ、TNFα、IFNガンマ）、ケ
モキン、成育因子状VEGF-A、EGF、PIGF、PDGF、IGF、ホルモン、細菌毒素、その他のボツ
リヌス毒素のようなオリ遺伝子トキシン、リシン、B. anthracis感染防御抗原、B. anthr
acis致死因子、B. anthacis水腫因子、shigatoxins 1および2、異なるウィルスからのウ
イルス性抗原、例えばFVIII阻害抗体を含む病原ウイルス（阻害抗体）を含む可溶タンパ
クを目標とすることができるが、これらに限定されない。
好ましい実施例では、本発明の変異株はCD20を目標とすることができる。この場合、親
ポリペチドは以下から選択できる：EMAB6またはEMAB603（WO2006064121参照）、RITUXIMA
B（Rituxan（登録商標、IDEC/ジェネンテク/ロシュ）（特許文献２４参照）、HUMAX（登
録商標-CD20）（特許文献２５に記載）AME-133（Applied Molecular Evolution）（hA20
（Immunomedics社）HumaLYM（Intracel）およびPRO70769（「免疫グロブリン変異株およ
びその利用」と題する特許文献２６）。これらとの内容は本明細書の一部を成す。
米国特許第5,736,137号明細書 米国特許第5,500,362号明細書 国際特許出願第PCT/US2003/040426号
他の実施例では、本発明の変異株は、RhD抗原を目標とすることができる。この場合、
親ポリペチドはEMAB2（特許文献２７参照）（SymOOI（Symphogen A/S）またはMonoRho（Z
LB、チューリッヒ）から選択できる。
フランス特許第FR 03 12 229号公報
親ポリペチドはAvastin（登録商標）、抗VEGF、Remicade（登録商標）、抗TNF-α、Erb
itux（登録商標）、Vectibix（登録商標）、抗EGFR、Tysabri（登録商標）、integrineの
抗α4鎖、Herceptin（登録商標）、抗HER2/neuでもよいが、これらに限定さるものではな
い。
本出願はさらに、周知の種々の治療関連特性の中から選択される他の最適化特性と組み
合わせたＦｃＲｎに対する結合性が増加した変異株を提供する。最適化できる最も好まし
い特性はインビボでの半減期である。インビボでの半減期を増加させるためには変異株は
低pH（例えばエンドソームと関連があるpH）、例えばpH 6.0でＦｃＲｎに対する結合能が
増加し、しかも、より高いpH（例えば7.4）で親和性を維持して、ＦｃＲｎへの結合をエ
ンドソームへ増加させ、且つ通常の開放速度にできるものでなければならない(非特許文
献５３、非特許文献５４)；
Dall'Acqua et al., 2002, J. Immunol. 169: 5171-5180 Gurbaxani et al., 2006, MoI Immunol. 43(9):1462-73)
同様に、このように調整されたＦｃＲｎ結合性を有するこれらの変異株は必要に応じて
他の望ましい特性、例えば調整されたＦｃγR結合特性を有することができる。1つの追加
の実施例では、変異株はＦｃＲｎ結合性に加えてヒト活性ＦｃγR、好ましくはＦｃγRll
laに対して改良された親和性を有するように最適化される。変形実施例では、変異株はＦ
ｃＲｎに対する親和性が増加し、ＦｃγRI、ＦｃγRlla、ＦｃγRllb、ＦｃγRllcおよび
ＦｃγRlllbにallelicな変異を含むヒトＦｃγRに対する親和性を増減するように最適化
されるがこれらに限定されない。
別の実施例において、本発明の変異株は、選択的に増加する漿液半減期と同様に（また
は減少したこと）エフェクタ機能を増やすことができた。特に好ましい実施例では、本発
明変異株は漿液半減期の増加と同様に、その親ポリペチドと比べてＡＤＣＣ活性の増加お
よび／またはＦｃγRへの結合の増加を有することができる。他の実施例では、本発明変
異株はその親ポリペチドと比べてＣＤＣ活性の増加も有することができる。
本発明変異株は広範囲の製品で使用できる。本発明の一つの実施例では、変異株は治療
、診断に使われ、調査試薬として使用されるが、治療で好ましく使用できる。
ＦｃＲｎに対する結合性が増加するので、本発明変異株はインビボで長い半減期を有す
る、より正確には親ポリペチドよりインビボで長い漿液半減期を有することが予期される
。従って、本発明変異株は、親ポリペチドが循環血液から急速に無くなる様な場合に、親
ポリペチドの代替として有利な用途があり、または、長い半減期活性を必要とする慢性ま
たは長期的な病気の治療で使用される。
抗体群の中から変異株を選択する場合、はモノクローナルまたはポリクローン抗体組成
物での使用できる。好ましい実施例では、抗体変異株は標的抗原、例えば癌細胞を運ぶ標
的細胞を殺すのに用いられる。別の実施例では、変異株は標的抗原、例えば細菌毒素をブ
ロックし、抗体化させ、刺激(agonize)する、例えばサイトカインまたはサイトカイン受
容体抗体化させ、刺激(agonize)したり、バクテリアまたはウィルスのような感染因子ま
たはトキシンを中和させする。好ましい実施例では、本発明変異株は標的抗原抗体化、刺
激し、標的抗原を運ぶ細胞を殺す。
本発明の好ましい実施例では、変異抗体が抗体関連疾患を治療するために患者に与えら
れる。「患者」とはヒトおよびその他の動物を含み、好ましくは哺乳類であり、最も好ま
しくはヒトである。「抗体関連疾患」または「抗体応答異常」または「状況」または「病
気」とは本発明の変異株含む医薬組成物の投与によって改良できる異常を意味する。この
抗体関連疾患には自己免疫疾患、免疫疾患、感染症、炎症疾患、神経病、痛覚、肺の病気
、血液疾患、線維症（fibrotic）およびガンを含む腫瘍・腫瘍疾患が含まれるが、これら
に限定されるものではない。
「ガン」「ガン性」とは一般に無秩序な細胞発育によって特徴付けられる哺乳類の生理
的状況を言う。ガンの例は癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、脂肪肉腫を含む肉腫、神経内分泌
腫瘍、中皮腫、神経鞘腫（schwanoma）、髄膜腫、腺癌、メラノーマ、白血病およびリン
パ性悪性を含むが、これらに限定されるものではない。治療可能な他の疾患にはリウマチ
様関節炎、若年性慢性関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、シェーグレン（Sjorgr
en）病、多発性硬化症、強直性脊椎炎、喘息、アレルギーおよびアレルギー疾患、移植片
対宿主疾患等が含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明のさらに他の目的は上記変異株を含む医薬組成物を提供することにある。そうし
た処方は所望純度を有するポリペチド変異株に必要に応じて用いる生理的に許容されるま
たは薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤を混合し、凍結乾燥品または水溶液
の形にすることができる(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A
. Ed., 1980参照)。この医薬組成物を必要とする患者の治療に使用できる。
患者の治療時には治療有効量の変異株を投与することができる。「治療有効量」とは投
与効果を生じる供与量を意味する。正確な供与量は治療の目的に応じて公知の方法を使用
して当業者が確認できる。供与量は体重１kg当たり0.001〜100mgまたはそれ以上にするこ
とができる。例えば0.1、1.0、10または50mg/kg体重であり、好ましくは１〜10mg/kg体重
である。周知のように、投与量はタンパク劣化、全身局所デリバリー、新プロテアーゼ合
成速度、加齢、ボディー重量、公衆衛生、性、食餌、投与時間、医薬相互作用等を考えて
調整する必要があり、それは当業者がルーチン実験で確認できる。
変異株を含む組成物は経口、皮下、静脈内、非経口的、臓器内、鼻腔内、経直腸、鞘、
局所投与、経皮（例えばゲル、サルブ、化粧水、クリーム等）、経筋、腹腔内、肺内、経
眼投与を含む医薬品の種々の方法で投与できる。
上記の治療は他の治療と付随して行うことができる。すなわち、上記の治療薬を小分子
、他の生物製剤と同時投与したり、て照射治療、外科、その他と同時に行うことができる
。
本発明のさらに他の目的は、本発明の変異株をコードする単離された核酸を提供するこ
とにある。大抵の場合、親ポリペチドをコードするＤＮＡは利用でき、入手できる。従っ
て、当該変異株は公知の各種方法を用いて親ポリペチドをコードするＤＮＡを変えること
で作ることができる。そうした方法には部位特異的突然変異、ランダム突然変異生成、Ｐ
ＣＲ突然変異生成およびカセット突然変異生成が含まれるが、これらに限定されるもので
はない。アミノ酸の置換は部位特異的突然変異によって行うのが好ましい（例えば、Zoll
er and Smith, 1982, Nucl. Acids Res. 10:6487-6500; Kunkel, 1985, Proc. Natl. Aca
d. Sci USA 82：488を参照）。
さらに、ポリペチド変異株をコードする所望アミノ酸配列は決定でき、従って、周知の
方法手合成できる。
本発明の変異株は、コードする核酸が得られれば、任意の公知方法で製造できる。本発
明の実施例では、変異配列（例えばＩｇＧ変異株配列）を構成メンバ配列をコードする核
酸を作るのに用い、それを宿主細胞にクローンして、発現させ、必要に応じて、分析する
ことができる。実際に、周知の手順を使用して実行できる。そうした方法は非特許文献５
３および非特許文献５４に記載されている。これらの内容は本発明の一部を成す。
Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Maniatis, Cold ＳＰＲing Harbor Laboratory Press, New York, 2001 Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons)
変異株をコードする核酸はタンパクを発現する発現ベクターに組み込むことができる。
一般に、発現ベクターは制御配列または調節配列に連結し、機能的に配置されたタンパク
、選択マーカーおよび／または追加沃素を含む。本発明の変異株（例えばＩｇＧ変異株）
は核酸でトランスホームされた宿主細胞、好ましくはそのタンパクの発現を誘発または誘
導可能な条件下で変異株をコードする核酸を含んで、発現ベクターを培養して作ることが
できる。各種のホスト細胞系、例えば、哺乳動物細胞、バクテリア、昆虫細胞およびイー
ストを使用できる。例えばAmerican Type Culture Collectionから入手可能なＡＴＣＣ細
胞系カタログに記載の各種哺乳動物細胞系を使用できる。
宿主細胞にはYB2/0、YB2/3HL.P2.GII.IGAg.2O細胞、American Type Culture Collectio
n にATCC番号CRL-1662で寄託）、SP2/0、YE2/0、1R983F、Namalwa、PERC6、CHO細胞株、
特にCHO-K-1、CHO-LeclO、CHO-Lecl、CHO-Lecl3、CHO Pro-5、CHO dhfr-、Wil-2、Jurkat
、Vero、Molt-4、COS-7、293-HEK、BHK、KGH6、NSO、SP0/2-Ag 14、P3X63Ag8.653、C127
、JC、LA7、ZR-45-30、hTERT、NM2C5、UACC-812等があるがこれらに限定されるものでは
ない。外部核酸を宿主細胞に入れる方法はも周知で、使用する宿主細胞によって変化する
。本発明の好ましい実施例では、変異株はYB2/0細胞で発現され、抗CD20抗体または抗RhD
抗体である。
本発明の変異株はさらに、トランスジェニックな非ヒト動物またはトランスジェニック
植物で作ることができる。トランスジェニックな非ヒト動物は受精卵に所望の遺伝子を直
接注入することによって得ることができる(非特許文献５５)。
Gordon et al., 1980 Proc Natl Acad Sci U S A.;77:7380-4
トランスジェニックな非ヒト動物はハツカネズミ、ウサギ、ラット、ヤギ、ウシ、ウシ
または鳥等を含む。所望遺伝子を有するトランスジェニックな非ヒト動物は所望遺伝子を
胎生期幹細胞に入れ、会合キメラ方法または注入キメラ方法によって動物を調製すること
で得られる(非特許文献５６、非特許文献５7）。胎生期幹細胞の例はハツカネズミの胎生
期幹細胞 (非特許文献５8)、ラット、ヤギ、ウサギ、サル、鳥、ウシ等を含む。また、ト
ランスジェニックな非ヒト動物は細胞核を取り除いた卵子に所望遺伝子を導入した細胞核
を移入するクローン法を使用して調製することができる(非特許文献５9)。
Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second edition, Cold ＳＰＲing Harbor Laboratory Press (1994)； Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993) Evans and Kaufman, 1981 , Nature; 292: 154-156 Ryan et aL, 1997 Science; 278: 873 - 876 Cibelli et_al., 1998 Science, 280 : 1256-1258
ポリペチド変異株は上記の方法で作った動物中に異なる分子をコードするＤＮＡを導入
して、動物中で異なる分子を形成し、増殖し、動物からポリペチド変異株を回収すること
で作ることができる。。ポリペチド変異株を乳汁（動物の卵子等）に形成させ、増殖させ
て作ることもできる。
本発明のさらに他の対照は、最適化された、すなわち、対応する野性-型Ｆｃ領域と比
べてＦｃリガンドに対する結合性が増加した変異株であるＦｃ変異株を同定する方法を提
供することにある。本発明方法は下記の工程から成る：
(i) Ｆｃ変異株をコードする一組の核酸から成る核酸ライブラリを作り、
(ii) 前記ライブラリに含まれる核酸の発現によってＦｃ変異株を生産し、(iii) 段階(ii
)で作ったＦｃ変異株の中でＦｃリガンドに結合可能ものを選択し、
(iv) 段階(iii)で選択したＦｃ変異株およびＦｃリガンドのための1つのＦｃコントロー
ル(対照)の結合特性を測定し、
(v) Ｆｃコントロールと比較して、Ｆｃリガンドに対する結性が増加したＦｃ変異株を選
択する。
核酸ライブラリ中の核酸配列はＲＮＡでもＤＮＡでもよい。好ましい実施例のライブラ
リはＦｃ変異株をコードするDNAの塩基配列を有する。
Ｆｃコントロール(対照)は野生型Ｆｃ領域、Ｆｃリガンド結合性が野生型Ｆｃのそれと
おじか、それより高いものおよび公知のＦｃ変異株から成る群の中から選択される。
ＦｃリガンドはＦｃＲｎおよびＦｃγレセプターの中から選択できるが、これらに限定
されない。
本発明の実施例では、Ｆｃ変異株をコー化するライブラリの核酸は野生型ＦｃのＤＮＡ
の塩基配列を変えることによって作ることができる。「核酸配列を変える」とは突然変異
、例えば所望核酸配列のヌクレオチドの挿入、欠失または置換を意味する。この種の突然
変異は従来周知の方法で実行できる。これらの方法にはランダムな突然変異生成、部位特
異的突然変異、PCR突然変異生成およびカセット突然変異生成を含むが、これに限定され
るものではない。
好ましい実施例では、一つ以上の低忠実度のＤＮＡポリメラーゼを使用することをベー
スにしたランダムな突然変異生成によってライブラリを作る。このランダム突然変異生成
法は特許文献２７に記載されており、その内容は本明細書の一部を成す。すなわち、本明
細書の材料と方法の項で説明するように、1つのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたは
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの組合せを用いてライブラリを作ることができる。
国際特許第WO0238756号公報
他の実施例では、前記核酸ライブラリが上記方法の1つを使用して予備最適化（Pre-opt
imized）されたＦｃ変異株のプールのDNAの塩基配列を変えることで作られる。ランダム
突然変異生成を使うのが好ましい。予備最適化されたＦｃ変異株は少なくとも一つのアミ
ノ酸突然変異を有し、野生型Ｆｃと比較してＦｃリガンドに対する結合性か増加したＦｃ
変異株である。予備最適化されたＦｃ変異株は野生型Ｆｃと比べて１〜4つのアミノ酸突
然変異を有するのが好ましい。この予備最適化されたＦｃ変異株は野生型Ｆｃの突然変異
によって作られるライブラリのスクリーニングで得ることができる。また、従来技術に記
載のＦｃ変異株でもよい（例えば、本明細書の関連技術で説明のもの）。予備最適化され
たＦｃ変異株のプールは複数のポリペチド、好ましくは約2から約100の予備最適化された
変異株を含むのが好ましい。
予備最適化された変異株から作られるライブラリからより最適化されたＦｃに変異株を
選択することが可能になる。本明細書の［表5］にはこの種のライブラリのスクリーニン
グから選択された最高のＦｃ変異株の結合能が示してある。
段階(ii)すなわちＦｃ変異株の発現は周知の方法を用いて宿主細胞を使用して実行でき
る。好ましい実施例ではＦｃライブラリが標準手順（非特許文献６１）を使用したファー
ジの発現（ファージ表示）で作られる。
Smith, Science, 1985, 228: 1315
段階(iii)はＦｃ変異株-Ｆｃリガンド錯体を作り、結合したＦｃ変異株を非結合Ｆｃ変
異株から分離することで実行できる。この分離段階を実行するために、Ｆｃリガンドをは
固体担体に固定するか、段階(iii)のプロセス中、固体担体に固定可能でなければならな
い。この種の手順の例は本出願の実施例 1に記載されている。段階(iii)は最も効果的な
Ｆｃリガンド見つけるために複数の選抜ラウンドから成るのが好ましい（実施例を参照）
。
段階（iv）では、Ｆｃリガンドに対するＦｃ変異株の結合性を従来周知の方法によって
評価する。例えば、当業者は該当するＥＬＩＳＡを実行することができる。特定信号が少
なくとも親Ｆｃのそれより1.2-倍強い場合の変異株を選択する。該当するＥＬＩＳＡアッ
セイは単離されたＦｃまたは実施例Ilおよび実施例IVに示すようにファージに表示された
Ｆｃに対して実行できる。
変形例または確認のために、当業者は本明細書の実施例IVに示すように、表面プラスモ
ン共鳴（Surface Plasmon Resonance、ＳＰＲ)実験を使用して解離定数を決定することが
できる。段階（v）では変異株が親Ｆｃの解離定数の３倍を有する場合に、その変異株を
選択する。
以下、本発明の実施例を示すが、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
実施例１
Ｆｃ-WiId-型と比較してＦｃＲｎに対する結合性が増加するＦｃ変異株の同定と、その
変異株の結合性の特徴付け
I. 材料と方法
I.1 ヒトＦｃＲｎの発現および精製
バクロウイルス系を使用して可溶性ヒトＦｃＲｎの発現を非特許文献６２に記載のGTP
Technology（Labege、フランス）によって実行した。
Popov et al., MoI. Immunol. 33:521 -530 (1996)
TEV配列および6×ポリヒスチジンのタグを用いてリーダーペプチドおよび細胞外領域（
コードン1-290）をコードするα鎖相補ＤＮＡにタグを付けた。誘導体のα-鎖およびβ2
ミクログロブリン鎖はP10およびpolyhedrineプロモータの下にpFastBacDualにクローンし
た。非オチニル化（biotinylated）したバージョンのＦｃＲｎ（ＦｃＲｎ-biot）はFluoR
eporter（登録商標）Biotin-XX Protein Labeling Kit F2610（分子プローブ）を用い、
メーカのプロトコルに従って化学的カップリングで作った。さらに、β2ミクログロブリ
ン鎖を含み、α-連鎖がファージp3タンパクおよびCVDEタンパクのアミノ末端部に溶合し
た融合タンパクも作った（ＦｃＲｎ-p3）。ＩｇＧ-セファロースおよびIMAC精製段階後に
純度が90％以上の純粋なタンパクが得られた。
I.2. Ｆｃ遺伝子の構築
Ｆｃポリペチド（ヒトＩｇＧ１重鎖（SEQ番号1） (Poul MA et al., Eur. J. Immunol.
25(7）：2005-2009 （1995）に由来するアミノ酸残基226-447（KabatでのＥＵインデッ
クス）をコードするヒトＦｃライブラリを標準的なPCRを用いてBamHI/EcoRI断片としての
ファージミドベクターpMG58（pMG58_Ｆｃ226（図1））にクローンした。このベクターは
［図1］に示した。複数の完全にランダム化したライブラリはMUTAGEN（登録商標）（特許
文献２８）を使用して作った。これは低忠実度のヒトＤＮＡポリメラーゼ（ムターゼ）を
用いて標的配列全体に突然変異を均一かつランダムに導入する方法である。
国際特許第WO0238756号公報
互いに異なる条件で相補突然変異パターンを作るため３つの別々のムターゼ（polβ、p
olηおよびpolι）を使用した。これらのヒトポリメラーゼは公知の方法（非特許文献６
２、６３）で製造し、精製した。
Mondon et al., Biotechnol J. 2: 76-82 (2007) Emond et al. Protein Eng. Des. SeI. 21 : 267-274(2008)
I.2a ムータジエンプロセス（登録商標）を用いた突然変異生成
ヒトＦｃ遺伝子（Ｆｃ遺伝子）を５’−プライマMG_619：５’-AGTACTGACTCTACCTAGGAT
CCTGCCCACCGTGC−３’（SEQ ID番号5）および３’−プライマMG_621：５’-ACTGCTCGATGT
CCGTACTATGCGGCCGCGAATTC-３’（SEQ ID番号6）を使用しているムターゼでダブル複製し
た（BamHIおよびEcoRI制限サイトには下線を引いた。イタリック部は非特異性テイルに対
応する）。0.6.μｇの鋳型としてのpMG58_Ｆｃ226プラスミド（Mut1ライブラリ用の野生
型ＦｃまたはMut2ライブラリ用のＦｃ変異株）と、プライマMG_619およびMG_621（それぞ
れ25OnM）と、適切な複製緩衝液（下記に詳述）とを含む混合物を95℃で5分間処理した後
、直ちに４℃まで冷却してＤＮＡ鎖の特性を変性させる。Polβの場合の複製緩衝液は5Om
MトリスHCl pH 8.8、1OmM-MgCl2、1OmM-KCl、1mM-DTTおよび1％（v/v）グリセリンである
。polη(またはpolηおよびpolι) 場合の複製緩衝液は25mMトリスHCl pH 7.2、5mM-MgCl
2、1OmM-KCl、1mM-DTTおよび2.5％（v/v）グリセリンである。変性段階後、突然変異誘発
性複製を50μM dATP/dCTP、100μM dTTP/dGTPおよび1μｇのpolβまたは100μM dNTPs、1
μｇのpolη(またはpolηおよびpolι、各1μｇのムターゼ）を加えて行った。複製反応
は37℃で2時間行った。それから複製生成物を脱塩し、ミクロコムカラム（ミリポア）で
濃縮した。
l.2.b 変異断片の選択的増幅およびクローン化
上記で得られた複製生成物はテイルプライマを用いた選択的PCRによって増幅した。プ
ライマ（MG_619およびMG_621）はムターゼによって合成されるＤＮＡ断片の特異的増幅が
できるように鋳型に非相補であるテイルを用いて設計した。PCR緩衝液（2OmM Tris-HCl p
H 8.4、5OmM KCl）、1.5mM MgCl2、10pmolの５'および３'プライマ、200μμM-dNTPsおよ
び1.25 U Platinum Taq ＤＮＡポリメラーゼ（InvitroGen）を含む混合物に複製生成物画
分を加えた。PCRサイクルは以下のとおり：第1サイクル：94℃で2分、64℃で10秒、75℃
で30秒、94℃で1分、および30の選択サイクル：94℃で20秒および75℃で30秒。
増幅された複製生成物は（w/v）1％アガロースゲルで精製し、BamHIおよびEcoRI限定酵
素で消化し、pMG58ベクターにクローンした。ライゲーション混合物を電気競合性(electr
ocompetent)のE. coll XL1-Blue細胞にトランスホームし、100μg/mlのアンピシリンおよ
び1％（w/v）グルコースを補った固体2YT培地（16g/5g lペプトン、10g/l酵母エキス、5g
/l NaCl、15g/l寒天）に塗布した。成長後、コロニー数を求め、ライブラリの寸法を見積
り、各ライブラリ当たり96クローンをランダムにPCRし、高速ＤＮＡ塩基配列決定した。1
5％グリセリンを含む2YT培地に細胞を掻き取り、凍結し、-80℃に維持した。
第1ラウンドの突然変異生成およびスクリーニング（ＭＳ１）で４つの異なるライブラ
リを構築した。第1のライブラリは3.2×106クローンを含む野生型Ｆｃ遺伝子上でのpolβ
を使用して得た（Mut1.1と呼ぶ）。この第1のライブラリのＤＮＡを用い、polβ（3.8×1
06クローン（Mut1.2））およびpolηおよびi（3.0×106クローン（Mut1.3））をそれぞれ
使用して第２および第３のライブラリを作った。この２累積複製段階戦略で突然変異率を
増やすことができる。第４のライブラリは野生型Ｆｃ遺伝子（1.0×106クローン、Mut1.4
）のみでポリメラーゼηで作った。最後に、これらの４つのライブラリを正比例で混合し
て、1.1×107の異なるクローンを表すMut1とよばれる最終ライブラリを得る。
第２ラウンドの突然変異生成およびスクリーニング（ＭＳ２）ではＭＳ１で単離し、フ
ァージＥＬＩＳＡでＦｃＲｎ-接合性を改良した42の単一変異またはダブル変異体のＤＮ
Ａプールを用いて２つのライブラリを構築した。第1のライブラリはpolβ（1.9×107クロ
ーン、Mut2.1）で得られ、第2のライブラリはpolη（1×106クローン、Mut2.2）で得られ
た。最後に、これらの２つのライブラリを正比例で混合して2×107の異なるクローンを表
すMut2とよばれる最終ライブラリを得た。
I. 2.c シークエンシングによるＦｃライブラリの品質管理
上記で作った各ライブラリの品質を細胞上のPCRで査定した。Ｆｃ遺伝子（５'−プライ
マ、５'-CAGGAAACAGCTATGACC-３'（SEQ ID番号7)および３'−プライマ、５'-TCACGTGCAAA
AGCAGCGGC-３'（SEQ ID 番号8）を増幅し、高速シークエンシングした（５'−プライマ、
５'-TGATTACGCCAAGCTTGC-３'（SEQ ID 番号9）。各ライブラリからランダムに採った96の
クローン配列を（Mut1.4〜Mut1.1、Mut2.2〜Mut2.1）を決定した。最後に、プールしたラ
イブラリMut1の35のクローンとプールしたライブラリMut2の86のクローンもシークエンシ
ングして選択プロセスの前に最終ライブラリの品質を制御した。
変異した配列の変更を上記のソフトウェア（Mutanalyse 2.5のソフトウェアからＦｃ分
子に適応させたMilleGen社のMutanalyse4）（Mondon et al., Biotechnol J. 2: 76-82、
2007)を使用して分析した)。この解析から突然変異は全遺伝子に沿ってランダムに分布し
、「ホットスポット」は無いことが確認された。
Mut1の解析：
Mut1ライブラリの突然変異頻度は１キロ塩基（kb）当たり6.3の突然変異であり、これ
は遺伝子（666nt）当たり4.2の突然変異があることを意味する。これらの突然変異の中で
、81.4％は置換でり、16.8％は欠失であり、1.8％は付加であり、最後の２つのカテゴリ
は遺伝子にフレームシフトをさせる。フレーム中の配列だけを考慮すると、突然変異体頻
度は１kb当たり4.0の突然変異であり１遺伝子当たり2.7の突然変異である（遺伝子当たり
１〜6つの変化したヌクレオチド）。また、タンパクレベルでライブラリの活性部分を決
定することで突然変異の解析をさらに行った。最後に、Mut1ライブラリは28.6％の野生型
断片（非変異または、サイレント変異）を発現したクローン、40.0％のフレームからの配
列またはストップコードン（非発現）を含むクローン、31.4％の変異した配列（Ｆｃ変異
株）を有するクローンを含む。これらの最後のクローンは１分子当たり平均2.3の変化し
たアミノ酸を有する3.5×106の異なるクローンを含むライブラリの活性部分を表す。
Mut2の解析：
Mut2ライブラリの突然変異頻度は１キロ塩基（kb）当たり4.5の突然変異であり、これ
は遺伝子当たり3.0つの突然変異に壮途うする。これらの突然変異の96.3％は置換であり
、3.2％は欠失であり、0.5％は付加である。フレーム中の配列だけを考慮した場合、突然
変異頻度は4.3／kbであり、遺伝子当たり2.9の突然変異である（１遺伝子当たり１〜7つ
のヌクレオチド変化1）。Mut2ライブラリはタンパクレベルで17.4％の野生型断片（非変
化またはサイレント突然変異）を発現するクローンを含み、9.3％のフレームからの配列
またはストップコードン（非発現）を含むクローン、73.3％の変化した配列（Ｆｃ変異株
）を有するクローンを含む。これらの最後のクローンは１分子当たり平均して1.9の変異a
aを有する1.5×107の異なるクローンを含むライブラリの活性部分を有する。
II. Ｆｃライブラリのファージ提示発現およびＦｃＲｎ改良物の選択
Ｆｃライブラリを標準的手順(Smith GP, Science 228: 1315 (1985))を使用してファー
ジM13の表面で発現させた。E. Mut1ライブラリ（pMG58ベクター）を含む大腸菌XL1-Blue
バクテリアを、100μｇ/mlアンピシリン、15μｇ/mlテトラサイクリンおよび1％（w/v）
グルコースを補った60mlの2YTでOD600nm＝0.6に達するまで230回転数／分で3O℃で成長さ
せた。それからら細胞を37℃で20分間、M13ヘルパーファージ（M13KO7、Biolabs、バクテ
リア/ファージ比＝1/3）に感染させ、ファージＦｃの生産を2YT/アンピシリン/グルコー
ス(0.5mM IPTGおよびカナマイシン30μｇ/ml)中で230回転数／分、26℃で一晩続けた。次
の日、ファージを標準プロトコールを使用してPEG6000中に沈澱させ、1mlのリン酸緩衝液
(pH6、（リン酸ナトリウム10OmM、塩化ナトリウム5OmM、pH6.0、P6をよばれる）に再懸濁
させ、XL1-Blue細胞を感染させて滴定した。上記の３つの選択戦略を異なる条件を使用し
て適用し（図2）、１つの戦略に対して選抜を3〜8ラウンド実行した（下記参照）。
11.1. 固相上での選択（戦略1、2）（［図2A］参照）：
固相選抜のために、P6/5％脱脂乳/0.1％Tween 20中で4×1011ファージをMaxisorp免疫
プレートの８つのウエルで培養した。各ウエルには予め0.5μｇのニュートラビジン（neu
travidin）、0.5μｇのビオチニル化（biotinylated）ＦｃＲｎ（戦略1）または0.5μｇ
のＦｃＲｎ-p3（戦略2）を塗布し、P6中の5％脱脂乳でブロックした。
37℃で2時間培養した後、ウエルをP6/0.1％ Tween 20で２０回洗浄し、10OμｌのpH7.4
のリン酸緩衝液で37℃で2時間、培養溶出した（リン酸ナトリウム10OmM、塩化ナトリウム
5OmM、pH7.4）/ウエル。滴定後、溶出したファージを用いて指数的に増殖したぺXL1-Blue
バクテリアを10ml 再感染させ、固体2YT培地/アンピシリン/グルコースに塗布した。次の
日、細胞を15％グリセリンを含む2YT培地に掻き取り、凍結し、80℃で保存した。
11.2. 液相での選択（戦略3）（［図2B］参照）：
液相での選択では最初に4×1011のファージを1mlのP6/5％脱脂乳/0.1％Tween 20中で低
攪拌下に室温で1時間、25OnMまたは10OnMのビオチチル化したＦｃＲｎで培養した。予めP
6中の5％脱脂乳でブロックしたストレプトアビディンで被覆した磁気ビーズ（Dynal）を
室温で30分間、ファージに加えた。このファージ−ビーズ錯体を磁石を使用してP6/0.1％
Tween 20で１５回洗浄した（磁気粒子選鉱機（Dynal））。ファージを室温で2時間、500
μｌのpH7.4リン酸緩衝液（リン酸ナトリウム10OmM、塩化ナトリウム5OmM、pH 7.4）中に
培養溶出した。ビーズは磁石を用して捨て、上澄中に溶出したファージを集める。滴定後
、溶出したファージを用いて10mlの指数的に増殖するXL1-Blueバクテリアを再感染し、そ
の後、固体2YT培地/アンピシリン/グルコース上に塗布した。次の日、細胞を15％グリセ
リンで2YT培地に掻き取り、凍結し、次の選択ラウンドまで-80℃でストックした。
11.3. 配列解析：
スクリーニング・プロセス（ＭＳ１およびＭＳ２）では、各戦略のために、ラウンド３
〜８から、48〜96のクローンを細胞のPCR（l.2-cで説明）後、配列決定した。配列解析は
選択したＦｃ変異株を迅速に分析するために内部開発しMilleGen社のソフトウェアAnalys
eＦｃを使用して実行した。Ｆｃ変異株はそれを単離した選択ラウンドに従って名前を付
けた（Mut1スクリーニング用：戦略1用にはB3A〜B6A、戦略2用にはS3〜S6A、戦略3用には
L3A/B〜L6A-F、Mut2スクリーニング用には戦略1用にC3A〜C8A、戦略2用にT3A 〜T8A、戦
略3用にM3A/B）。数（１〜96）はシークエンシング用PCRプレート上の場所を示す。最後
に全選択プロセス中に、227の異なる変異クローンをMut1のために単利し、Mut2のために2
23の異なる変異したクローンを単離した。これら全てのクローンはファージ−ＥＬＩＳＡ
アッセイを使用して特徴付けた。
11.4. 目標突然変異生成
ＭＳ１で単離した改良型のＦｃ-変異株の配列解析から、多数のクローンが類似した突
然変異（N434Y、N434S、P230S、P230T ．．．）を含むことが明らかになった。付随する
突然変異の効果をｓ綺羅かにするために、目標突然変異生成（directed mutagenesis）を
行ってこれらの突然変異を除去した。これらの新しいミュータントは親のクローンの名前
の後にAまたはBを付けて命名した。61の新しいミュータントをテストした。これらのミュ
ータントは［表1］に示す。ポジティブとみなされるこれらミュータントはファージ−Ｅ
ＬＩＳＡアッセイでＦｃ−ＷＴより1.2〜2.6-倍高い特異信号を有する（下記参照）。Ｍ
Ｓ２後にヒンジ領域に１つまたは２つの突然変異を加えて、標的突然変異生成によってい
くつかの新しいミュータントを構築した（P230SまたはP228LまたはP228RまたはP228L/P23
0SまたはP228R/P230S）。これらのミュータントは親クローンの名前の後に文字（A〜G）
を加えて命名した。24の新しいミュータントをテストし、[表5]に示した。
II.5. 選択した変異株のファージＥＬＩＳＡアッセイ（図３）
ＭＳ１、ＭＳ２で単離した変異株のファージで表された結合特性を、ウエルに塗布した
ＦｃＲｎ-p3でＥＬＩＳＡテストを用いpH6.0で決定した（図3）。簡単に言うと、ヘルパ
ーファージM13K07に感染させた2YT/アンピシリングルコース中の800μｌ倍養液中に6-ウ
エルプレート上で単離したクローンとしてファージＦｃ変異株を作った（パラグラフ３で
説明した方法）。26℃で一晩かけて製造したファージを30分間300Ogで遠心分離して上澄
中に回収した。この上澄をP6/5％脱脂乳/0.1％Tween 20に直接希釈（1/2および1/4）し、
予め0.25μｇＦｃＲｎ-p3／ウエルを被覆し、P6中の5％脱脂乳でブロックしたMaxisorp
免疫プレート上でテストした。37℃で2時間培養の後、ウエルをP6/0.1％Tween-20で３回
洗浄し、結合したファージをHRP抗M13抗体（GE Healthcare）で検出した。
このＥＬＩＳＡテストを用いて、ＭＳ１中に選択した227Ｆｃ変異株を野生型Ｆｃ（Ｆ
ｃ−ＷＴ）およびポジティブ対照と比較するテストを行った。ポジティブ対照（Ｆｃ−Ｈ
変異株という）はダブル突然変異体T250Q/M428Lで、ＦｃＲｎに対する親和性が改良され
たものと記載されいる(x28, Hinton PR et al., J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216 (20
04))。この変異株を突然変異コードンと制限サイトとを有する下記の２つの長いオリゴヌ
クレオチドを用いて標的なPCRプロトコルでジェネレートした：
５'プライマ５'CGGGATCCTGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCC
CCCAAAACCCAAGGACCAACTCATGATCTCCCGGAC-３'（SEQ ID NO：10）
３'プライマ５'GCGAATTCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGCGTGTAGTGGTTGTGCAGAGCCTCAT
GCAGCACGGAGCATGAGAAG-３'（SEQ ID NO：11）
（BamHIおよびEcoRI／制限サイトには下線を引いた。灰色は突然変異コードンに対応する
）
ファージＥＬＩＳＡアッセイで、Ｆｃ−Ｈ変異株は野生型ＦｃすなわちＦｃ−ＷＴより
平均して3.2-倍強い特定の信号（突然変異/Ｆｃ−ＷＴ比）を有し、テストした227のＦｃ
-変異株の中で、73の変異株が比/Ｆｃ−ＷＴ＞3.2を示した。これはＦｃＲｎに対してＦ
ｃ−Ｈ変異株変異株より強い結合をすることを意味する（表２）。単一ポイントアミノ酸
突然変異を有するＭＳ１からのポジティブ変異株は野生型Ｆｃより約1.2-倍〜3.5-倍強い
特定信号を有する（表1参照）。
Figure 0005951856
Figure 0005951856
Figure 0005951856
ＭＳ２中に選択した223の変異株をＥＬＩＳＡプロトコルを使用してテストしたが、同
じＥＬＩＳＡプレート上で比較するにはＦｃ−ＷＴ信号とＦｃ変異株の信号との相違が大
き過ぎるためＦｃ−Ｈ変異株およびＭＳ１（S5A_41）中に単離した最高のＦｃ変異株と比
較した。テストした223のＦｃ変異株の中で209のＦｃ変異株はＦｃ−Ｈより良く（比/Ｆ
ｃ−Ｈ＞1.1）、39のＦｃ変異株はＭＳ１中に単離した最高のＦｃ変異株より良かった。
各変異株をＦｃ−ＷＴと比較するために、各変異株の比／Ｆｃ−ＨにＭＳ１中に求めたＦ
ｃ−Ｈ（＝ 3.2）の比／Ｆｃ−ＷＴを掛けて予想比／Ｆｃ−ＷＴを計算した（比／Ｆｃ−
ＷＴ＝3.2×比／Ｆｃ−Ｈ）（表３）。
Figure 0005951856
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Figure 0005951856
Figure 0005951856
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Figure 0005951856
全体として、ＦｃＲｎに対する結合性がＦｃ−Ｈより良い282のＦｃ変異株がＭＳ１プ
ロセスおよびＭＳ２プロセスで単離された。これらの282のＦｃ変異株の配列解析から分
子全体に115の異なる位置で突然変異を含んでいることが明らかになった（表４）。
Figure 0005951856
Figure 0005951856
Figure 0005951856
Figure 0005951856
さらに、下記の16の位置は優先して突然変異される重要な位置とみなされる：C226、P2
30、F241、V264、T307、N315、A330、Q342、Q362、A378、E382、N389、P396、V397、N421
およびN434。特に、下記の４つの位置はより優先して突然変異される最も重要な位置とみ
なされる：V264、N315、A378およびN434（図４）。
ＭＳ１（S5A_41）の最高変異株と比較してＦｃＲｎに対してより良い結合性を有するＭ
Ｓ２のＦｃ変異株を［表５］に示す。
Figure 0005951856
Figure 0005951856
Figure 0005951856
III. Ｆｃ変異株の大腸菌発現
Ｆｃ−Ｈ変異株と同じＦｃ−ＷＴ配列およびＭＳ１およびＭＳ２で単離したＦｃ変異株
は、BamHIおよびE.coli制限サイトを使用してpMG58 フアージミド（ファージmid）ベクタ
ーからpMG62ベクターにサブクローン（subクローン）し、精製用のＣ末端6xHisタグとＥ
ＬＩＳＡアッセイでの検出用V5タグとを有する可溶性周辺質（periplasmic）発現ができ
るようにした。組換え型Ｆｃポリペチドの生産はHB2151大腸菌株において実行した（200
℃で16時間、0.5mM IPTGで誘導）。精製は標準プロトコルを用いてNi-NTA上で実行し、各
ポリペチドの約200-500μｇを得た。
IV. ＥＬＩＳＡおよび表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）を用いたＦｃ変異株のＦｃＲｎ結
合特性
IV.1. Ｆｃ_WTと比べたS5A 41、S3A 07およびＦｃ−Ｈ変異株のＦｃＲｎ結合特性
IV.1.a ＥＬＩＳＡアッセイ
可溶性フォーマットで産生したＦｃ変異株の結合特性をウエルを被覆したＦｃＲｎ-p3
でpH6.0でＥＬＩＳＡテストを使用して決定し、Ｆｃ−ＷＴと比較した。P6/5％脱脂乳/0.
1％Tween-20に連続的に希釈した精製Ｆｃ変異株（IIIに記載）をMaxisorp 免疫プレート
でテストされた。この免疫プレートは予め0.25.μｇのＦｃＲｎ-p3／ウエルを被覆し、P6
の5％脱脂乳でブロックした。37℃で2時間培養後、ウエルをP6/0.1％ Tween-20で３回洗
浄し、結合したＦｃ-変異株をHRP抗V5抗体（invitroGen）で検出した（OD450nmの測定）
（図5a）。ＥＬＩＳＡテストは、S5A_41、ＭＳ１の最高変異株およびS3A_07、Ｆｃ−Ｈ変
異株に均等な変異株、Ｆｃ−Ｈ変異株で実行した。これらのＥＬＩＳＡテストによってＦ
ｃ−Ｈ、S5A_41、S3A_07がＦｃ−ＷＴと比較してＦｃＲｎに対する結合性が改善すること
を確認した（図5b、図5c、び図5d）。各結合曲線ではＦｃ−ＷＴと比較したＦｃ変異株の
結合特性を示すために、曲線の50％飽和でのＦｃ濃度（EC50）の測定値を用いた。得られ
た比から、S5A_41がＦｃ−Ｈ変異株より良い結合剤性を示し、S3A_07がＦｃ−Ｈ変異株に
匹敵することが確認された（表6）。
IV.I.b. ＳＰＲ（表面プラスモン共鳴、Surface Plasmon Resonance）アッセイ
Ｆｃ変異株と固定されたＦｃＲnとの相互作用をCM5センサーチップ(Biacore, GE Healt
hcare)を使用したBIAcore X100機器を用いてモニターした。この方法は上記でＦｃ-Ｆｃ
Ｒｎ相互作用を分析するために記載したものと同様である(Popov S. et al., MoI Immuno
l. 33(6):521 -530 (1996))。組換え型可溶性ＦｃＲｎをアミン-カップリング化学を使用
したセンサーチップのフローセル2にカップリングさせた。フローセルは0.1MのN-ヒドロ
キシスクシンイミドと0.1Mの3-（N，N-ジメチルアミノ）プロピル- N-エチルカルボジイ
ミドの1:1混合物で30μｌ/分の流速3分間慣性化した。組み換えヒトＦｃＲｎ（10mM酢酸
ナトリウム中に5μg/ml、pH 5.0）を10μｌ/分で2〜8分間、フローセル2に注入し、結果
は表面密度を1200〜1300応答単位（RU）となった。表面は1M− エタノールアミン-HCl、p
H 8.5を3-分間注入してブロックした。フローセル1はＦｃＲｎを含まないコントロール（
対照）として使い、同じサンプルフローセルと同様に調整した。このブランクフローセル
からのデータをサンプル・データから引いた。
Ｆｃ断片をPBS/Tween-20（50mMリン酸緩衝液、pH 6.0、150mM NaCl、0.02％ NaN3、0.0
1％ Tween-20）で希釈し、それを平衡結合実験でランニング緩衝液として使用した。全て
の測定は25℃で、一般に1〜200nMのＦｃ断片濃度で10μｌ/分の流速で実行した。
データは10分間、PBSの1分-パルスで集め、表面の再生には0.05％ Tween-20を含むpH 8
を用いた。センサーグラム（Sensorgrams）を作り、BIAevaluationソフトウェア（バージ
ョン3.1）を使用して分析した。各注入毎に観測された平衡RUをＦｃ濃度に対してプロッ
トした。BIAevaluationソフトウェアに含まれる安定状態親和性モデルを使用してプロッ
ト線を解析することによって平衡Kd値を得た。得られたるKd比から、S5A_41がＦｃ−Ｈ変
異株よりよい結合性であることと、S3A_07がＦｃ−Ｈに匹敵することが確認された（表6
）。
IV.1.c 得られた結果のまとめ
表６は、 (i)ファージＥＬＩＳＡ、(ii) ＥＬＩＳＡおよび(iii) ＳＰＲによってＦｃ
−ＷＴと比較した変異株S5A_41、S3A_07およびＦｃ−ＨのＦｃＲｎ結合能力を示す。全て
のケースで変異株S5A_41はＦｃ−ＷＴより大幅に高い能力を示した。
Figure 0005951856
IV.2 ＳＰＲおよびＥＬＩＳＡによりＦｃ_WTと比較した他のＭＳ２変異株のＦｃＲｎ結
合特性
IIIｕに記載の方法でＭＳ２のいくつかのＦｃ変異株を作った。各変異株のＦｃＲｎ結
合能力を上記IV.2.bおよびIV.2cに記載の(i)ＳＰＲおよび(ii) ＥＬＩＳＡによって分析
した。
結果は図7に示した。この［表７］は(i) ＳＰＲおよび(ii) ＥＬＩＳＡでテストした各
ＭＳ２変異株で得られた結果を示す。なお、上記で得られたＥＬＩＳＡ−ファージの結果
も示してある。
ＥＬＩＳＡおよびＳＰＲアッセイから、全てのＦｃ変異株はＦｃＲｎに対して野生型Ｆ
ｃより良い結合性を示すことが示され、これはファージＦｃ変異株でのＥＬＩＳＡアッセ
イで得られた全館の結果と一致した。pH＝6でのＭＳ２変異株のKd値は5.2〜22.7nMであり
、これはＦｃ−ＷＴと比べて親和性が1.3〜5.8倍増加することに対応する。
Figure 0005951856
ＦｃＲｎを異なるpH結合させるＦｃ変異株の能力もＥＬＩＳＡアッセイで調べた。上記
でテストした各Ｆｃ変異株に対してpH＝6でＥＬＩＳＡアッセイを実行した時の0.8〜1.0
の範囲のOD450nmを与える濃度でＥＬＩＳＡアッセイを実行した。実験的条件とIV.I.aに
記載のものである。［表８］はこのＥＬＩＳＡアッセイを実行するのに使用した各Ｆｃ変
異株の濃度を示す。
Figure 0005951856
［図７］は各変異株で得れれたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。OD450 nmは、固定さ
れたＦｃＲｎに結合したＦｃ変異株の量に関係する（HRP抗V5抗体で結合したＦｃ変異株
を検出）。OD450 nmでの特異的信号が高い程、ＦｃＲｎに対するＦｃ-変異株の結合はよ
り強い。
［図７］はＦｃＲｎとＦｃ変異株の結合がpHによって変化することを明らかに示してい
る。予想した通り、pH 7,4でのＦｃＲｎに対するＦｃ変異株の結合性はpH 6.0での結合と
比較すると弱い。
本発明のＦｃ変異株を得るために導入したアミノ酸変更によってpH 6.0でＦｃＲｎへの
結合をＦｃ−ＷＴのそれと比較して大幅に増加でき、pH 7.4での結合は極めて低くしたま
まにすることができると結論できる。
実施例２
Ｆｃ変異株ベースのＩｇＧ変異株の製造と、このＩｇＧの生物学的特徴
I. ＩｇＧ変異株の発現
1.1. ベクター構築
Ｆｃ変異株C6A_69；C6A_78；T5A_74；C6A_74；C6A_60およびC6-A66を、YB2/0細胞系で
の抗CD20特異性を用いたＩｇＧフォーマットで調製した。比較のために、野生型Ｆｃ（Ｉ
ｇＧ−ＷＴ）をベースにしたＩｇＧも作った。
YB2/0の細胞系の生産性を最大にするために、完全長の重鎖および軽鎖ｃＤＮＡおよび
変異株をコードするＦｃ断片をRattus norvegicusに対するコードン最適化で合成した。
暗号スプライシングサイトや制限サイトのような不必要な特徴は除去した。変数/恒常部
結合には制限サイト（Apal）のみが存在する。
第1段階で、YB2/0の発現のために最適化した発現ベクターCHK622-08のNhelとAsclの間
で野生型重鎖をクローンして、中間の構造物HCD20-Opti-GAにした。次に、最適化した軽
鎖をSpelとXbal制限サイトの間でクローンして、野性型抗CD20抗体の発現のための最終構
造物HKCD20-Opti-GA（以下、ＩｇＧ−ＷＴという）にした。
Ｆｃ変異株はHKCD20-Opti-GAに存在する野生型ＩｇＧ１Ｆｃ断片を適当な変異に代える
ことで調製した。これをApalとAscl制限サイトの間でクローンした（図8a）。
全ての断片クローニングは従来バクテリアのトランスフォーメーションの古典的な消化
／ライゲーション手順で行った。発現構造物は酵素消化にPCRを加え、シークエンシング
して確認した。
1.2. 細胞培養生産
YB2/0細胞系（ATCC（CRL-1662））の5.106細胞を各発現線形ベクターと一緒にで電気穿
孔し、RPMI 1640媒体＋5％ v/v透析ＦＣS（InvitroGen）中に25,000細胞/mlに希釈し、1m
l/ウエルで24-ウエルに分けた。3日後に細胞を回収し、ジエネティシン（geneticin）（I
nvitrogen）を最終0.5g/L、濃縮ＭＴＸ（シグマ）を最終25mM、２ml/ウエルで加えること
によって選択圧を加えた。11日間の培養後、耐性細胞は各々8つの構造物用（選択された
ＩｇＧ ＭＳ２変異株、ＩｇＧ−ＷＴのコード用）に集め、DMEM媒体＋5％ v/v Ultra-low
ＩｇＧ ＦＣS（InvitroGen）で希釈し、0.9Lの細胞懸濁液の含む２L-ローラボトルの各々
を２サイクル/分で培養する。細胞は成長し、死ぬ（4〜5日）。その前に上澄を回収し、
低速度遠心して清浄し、容積を減し、Pellicon XL Filter（ミリポア）で限外濾過する。
II. ＩｇＧ変異株の精製と特徴付け
濃縮した培養上清はをHiTrapプロテインＡ FFカラム（GE Healthcare）に注入した。結
合した抗体はpH 3.0の0.1M−クエン酸ナトリウム緩衝液で溶出させ、各画分を１mlの溶出
緩衝液当たり100μｌのpH 7.5の1M−トリスを使用して中和した。抗体を含む画分を集め
、PBS pH 6.0で透析し、サンプルを滅菌濾過（0.22ナノメートル）し、４℃で保存した。
精製したＩｇＧをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で非還元性および還元性条件下
で特徴付けた。クマシー青色染色(Coomassie Blue-stained) ゲルから、全ての突然変異
で、ＩｇＧは95％以上の均質性で精製され、各ＩｇＧに対する特徴的な重鎖および軽鎖バ
ンドが示された([図8]および[図8c]）。
III. ＩｇＧ変異株のＦｃＲｎ結合特性
ＦｃＲｎへのＩｇＧ変異株の結合特性を (i) ＥＬＩＳＡアッセイ、(ii) ＳＰＲおよび
(iii) 蛍光ラベ化したRituximab（抗CD20ＩｇＧ）の存在下で先端を切ったＦｃＲｎを発
現するJurkat-細胞株を用いた結合競合アッセイの3つの別々のテストで決定した。
III.1 ＥＬＩＳＡ
III.1a 材料および方法
Y2B/Oで産生したＩｇＧ変異株の結合特性をウエルに被覆したＦｃＲｎ-p3でpH6.0でＥ
ＬＩＳＡテストを用いて決定した。比較のためにＩｇＧ−ＷＴでもＥＬＩＳＡアッセイを
実行した。
精製したＩｇＧ変異株をP6/5％脱脂乳/0.1％Tween-20を用いて連続的に希釈し、予め0.
1μｇのＦｃＲｎ-p3／ウエルで被覆し、P6中の5％脱脂乳でブロックしたMaxisorp 免疫プ
レートでテストした。37℃で2時間培養した後、ウエルをP6/0.1％ Tween-20で３回洗浄し
、結合したＩｇＧ変異株をHRP Fab'2ヤギ抗ヒトFab'2（Interchim）で検出した。
各ＩｇＧ変異株に対して結合したＦｃＲｎの百分比をＩｇＧ-変異株の濃度（log）に対
してプロットした。得られた各結合曲線で、曲線（EC50）の50％飽和に関連するＩｇＧ濃
度の測定値を決定し、WT-ＩｇＧのEC50と比較した。
III.1.b ＥＬＩＳＡの結果
ＥＬＩＳＡテストの結果は、産生したＩｇＧ変異株はがWT-ＩｇＧと比べて、ＦｃＲｎ
に対する結合性か増加することを示している。この事実は結合曲線（[図9]参照）およびE
C50値から明らかである。
下記の[表9]に示すように、ＩｇＧ-変異株のEC50は野生型ＩｇＧより少なくとも5.8-倍
以下低い。最大EC50はC6A_69変異株で得られる。
Figure 0005951856
III.2 ＳＰＲを用いたＩｇＧ/ＦｃＲｎ結合親和性の測定
lll.2.a 材料および方法
ＩｇＧ−ＷＴおよびＩｇＧ変異株の固定したヒト組換え型ＦｃＲｎとの相互作用をBIAc
ore X100機器（GE Healthcare）を用いて表面プラスモン共振（ＳＰＲ）検出によってモ
ニターした。実験のプロトコルはＦｃ変異株（パラグラフIV.2b参照）で親和性を決定す
るのに使用したものと同様である。
各注入で観測される平衡RUをＦｃ濃度に対してプロットした。平衡Kd値はBIAevaluatio
nソフトウェアに含まれる安定親和性モデルを使用してプロット線の解析によって得た。
動力学的パラメータはモデル1：2で解離相と会合層のデータをグローバルフィッテングし
て決定した。
lll.2.b ＳＰＲの結果
ヒトＦｃＲｎに対するＩｇＧ−ＷＴの結合能（Kd値）は78,3nMであった。［表10］に示
すように、6つのＩｇＧ変異株 Kd値は10.5〜18.8 nMで変動し、これはＦｃＲｎへの親和
性がpH 6.0でのＩｇＧ−ＷＴのそれと比べて4〜7倍増加することを示す。
Figure 0005951856
［表11］に示すように、WTに対するヒトＦｃＲｎへのＩｇＧ変異株の改良された親和性
は主として会合キネティクス（kon値）の増加によるものである。すなわち、変異株konを
WT-konで割った比は13〜23で、これはＦｃＲｎに対する変異株の親和性の大きな増加を示
している。WTに対するＩｇＧ変異株のKoffof値の増加は２〜４で、これは会合に比べて解
離が弱いことを示す。
Figure 0005951856
III.3 Jurkat-ＦｃＲｎへの結合
lll.3.a 材料および方法
ＩｇＧ−ＷＴおよび変異株のＦｃＲｎとの相互作用の能力を評価するために、Dall'Ozz
o達が記載の方法(Dall'Ozzo S, Tartas S, Paintaud G, Cartron G, Colombat P, Bardos
P, Watier H, Thibault G, Cancer Res., 2004 JuI 1 ;64(13):4664-9)の変形法で競合
免疫蛍光法アッセイを実行した。
簡単に言うと、ＩｇＧ−ＷＴおよび変異株をPBS pH6に希釈して最終濃度を0,06〜2mg/m
lにし、Alexa-共役 Rituximab（ラベル化Rituximab）の存在下で、50μｇ/mlの濃度でJur
kat ＦｃＲｎ（150000セル）と一緒に培養する。20分後、細胞をフローサイトメトリで分
析して、結合したAlexa-共役 Rituximabを定量する。結果は平均蛍光強度（MFI）の百分
比で表される。100％は Alexa- Rituximab単独（すなわち競争なし）で得られる平均蛍光
強度（MFI）であり、0％はJurkat ＦｃＲｎがAlexa-共役 Rituximabと一緒に培養されな
かった時の測定MFI値である。各実験は３回行った。
コントロール（対照）は(i) ラベル化なしのRituximabまたは(ii)ＩｇＧ−ＷＴの培養
から成る。
各テストしたＩｇＧに対してMFIをＩｇＧ濃度(log)に対してプロットした。MFI信号の5
0％阻害を与える各テストしたＩｇＧの濃度（IC50）を決定した。このアッセイの一般的
な説明は下記特許文献１２（フランス特許第FR 2 894 983号公報）にも記載されている。
フランス特許第FR 2 894 983号公報
III.3.b 実験結果
［図11］にいくつかの結果を示す。この図では本発明およびJurkatＦｃＲｎの各種変異
株の結合またはRitixanを上記の「材料および方法」に記載のようにして決定し、平均蛍
光強度（MFI）値で表してある。
下記の［表12］に示すように、本発明の変異株で得られるIC50はWT-ＩｇＧにで得られ
るそれに比べて大幅に低い。本発明のＩｇＧ変異株のIC50の減少度はC6A_66を除いて40〜
60-倍である。
Figure 0005951856
III.4 結論
ＦｃＲｎへのＩｇＧ変異株の結合特性を特徴付けるために実行した３，の別々のテスト
は一貫した結果を与えた。全てのケースで本発明のＩｇＧ変異株はＦｃＲｎに対してＩｇ
Ｇ野生型のそれと比べて結合性か大きく増加した。
IV. ＩｇＧ変異株の機能上の特徴と、Ｇ-WTおよびLFB-R603との比較
Ｆｃγリセプタを結合するＩｇＧ変異株の能と、そのADCCおよびCDC活性をアッセイし
てその生物学的機能を完全に特徴付けた。
IV.1 hＦｃγRIIIAに結合するＩｇＧ変異株の結合性
IV.1a. ＥＬＩＳＡアッセイ：固定した組換え型hＦｃγRIIIAに結合するＩｇＧ変異株の
結合性
ヒト組換え型ＦｃγRIIIA（F158アロタイプ）をEZ-link NHS-PEOキット（Pierce）でビ
オチン化し、アッセイ緩衝液（25mMトリス、150mM- NaCl、pH 7.35、0.05％ Tween-20、0
.1％ BSA）中に1μg/mlに希釈し、react-bind(登録商標)ストレプトアビ遺伝子 ＥＬＩＳ
Ａプレート（Pierce）上に塗布し、室温で2時間培養した。この培養中に、5μg/mlのIgG
と2μg/mlのワサビペルオキシダーゼでラベル化したF(ab')2抗ヒトF(ab')2（Jackson Imm
unoResearch）とを室温で2時間混合して、緩衝液中にIgG-F(ab')2抗-F(ab')2錯体が作ら
れる。一連の希釈をした錯体をプレートに加え、室温で2時間穏やかに振盪して培養する
。プレートをアッセイ緩衝液で洗浄した後、hＦｃγRIIIAへ結合した錯体をTMB（Pierce
）で検出した。450ｎｍでの吸光度をプレートリーダ（Tecan）を使用して読んだ。
各ＩｇＧ変異株に対して結合したＦｃγRIIIA（OD450nmから得られる）の百分比をＩｇ
Ｇ-変異株の濃度に対してプロットした。
［図10］に示すように、、hＦｃγRIIIAへのＩｇＧ変異株の結合性はhＦｃγRIIIAと結
合しない変異株C6A_66を除いて、ＩｇＧ−ＷＴのそれと同様である。
IV.2 ＡＤＣＣ活性
天然キラー細（ＮＫ細胞）は健康なドナーの抹消血液からMiltenyi社が開発したネガテ
ィブ減損法を用いて精製した。ADCCテストでは異なる濃度の抗CD20抗体の存在下で、CD20
リセプタを発現するRaji株の標的細胞と一緒にＮＫ細胞を培養する。16時間培養した後、
抗CD20抗体が誘導した細胞毒性をクロマトグラフで測定し、溶解した標的細胞が開放した
細胞上澄中の乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）と呼ばれる細胞内酵素のレベルを定量する。
結果は[図12]に示してある。
特異的リーシス（溶離）の結果、リーシスパーセントが抗体濃度の関数として表される
。EC50（最大細胞溶解の50％を誘発する抗体量）はPRISMソフトウェアを使用して計算し
た。対照実験は (i) Rituximab、(ii) Y2/0細胞およびLFB-R603中に産生されるＷＴ−Ｉ
ｇＧを用いて実行した。LFB-R603がADDC機能を有する抗CD20抗体であることは下記文献の
記載の通り公知である：de Romeuf et al. in 2004 (de RomeuＦｃ, Dutertre CA, Le Ga
rff-Tavernier M, Fournier N, Gaucher C, Glacet A, Jorieux S, Bihoreau N, Behrens
CK, Beliard R, Vieillard V, Cazin B, Bourel D, Prost JF, Teillaud JL, Merle-Ber
al H。すなわち、慢性リンパ球白血病細胞はＦｃγRIIIA/CD16の改良のために選択した抗
CD20モノクローナル抗体で能率的に殺される：Br J Haematol. 2008 Mar;140(6):635-43
）。また、特許文献１3（国際特許第W02006/064121号公報）にも記載されている。
［表13］は各変異株のEC50とLFB-R603およびWT-ＩｇＧと比較したＩｇＧ変異株のADCC
機能を示している。全てのＩｇＧ変異株は、C6A_66変異株を除いて、ADCC活性を示す。C6
A_66変異株はADCC活性がなく、それはＦｃγRIIIに対する極めて低い親和性と一致してい
る。
C6A_69、C6A_60およびC6A_74はＩｇＧ−ＷＴと比べてADCC活性が増加する点に注意する
必要がある。他の変異株（すなわちC6A_78およびT5A_75）はＩｇＧ−ＷＴのそれと同様な
ADCC活性を有する。
Figure 0005951856
IV.3 ＣＤＣ活性
こここでは、標的CD20＋Raji株の細胞を、補助ソースとしてのベビー・ウサギ漿液（Ce
darlane参照番号CL3441、希釈度1/10）の存在下で、抗CD20抗体の異なる濃度（０〜5000n
g/ml）で培養した。37℃で1時間培養後、溶解した標的細胞によって上澄中に開放されたL
DHの量をクロマトグラフ (Roche Applied Sciences Cytotoxicity Detection Kit）で測
定し、抗体を介した補体依存性細胞毒性を定量した。結果は細胞溶解の百分比で表しした
。EC50（最大細胞溶解の50％を誘発する抗体量）およびEmax（最大細胞溶解百分比）はPR
ISMソフトウェアを使用して計算した。
［表14］は各変異株で得られたEmaxおよびEC50を示す。CDC活性レベルはＩｇＧ変異株
によって変化する。C6A_78およびC6A_60はＩｇＧ−ＷＴよりかなり高いCDC活性を示す。C
6A_69、T5_74およびC6A_66のCDC活性は低い。C6A_74変異株のCDC活性はＩｇＧ−ＷＴと同
様である。
Figure 0005951856
IV.3 結論
Y2B/0細胞株が産生する組み換え型の６つの本発明のＩｇＧ変異株はＩｇＧ−ＷＴと比
べてＦｃＲｎリセプタに対して結合性が増加する（同じ宿主細胞で同じ条件下で）。
本発明のＩｇＧ変異株は、ＦｃgRIIIとに少なくとも同じ結合能を有し、ＩｇＧ−ＷＴ
と少なくとも同じADCC活性を有する（但し、ＦｃgRIIIに対する親和性が悪いC6AA_66は除
く）。
ＩｇＧ変異株は別々のCDC活性を示す。
いくつかの観点から、本発明によるアミノ酸変更によって対応する親ＩｇＧ（例えばＩ
ｇＧ−ＷＴ）と少なくとも同様な一つ以上のＦｃエフェクタ活性を有するし、ＦｃＲｎに
対する結合性が増加したＩｇＧ変異株を得ることができる。
別の観点から、本発明のアミノ酸変更によって、例えばＣＤＣまたはＡＤＣＣのような
少なくとも一つの減少したＦｃエフェクタ活性を有する、ＦｃＲｎに対する結合性が増加
したＩｇＧ変異株を得ることができる。
［表15］は本研究のＩｇＧ変異株に関する主たる結論を示している。
Figure 0005951856
Figure 0005951856

Claims (15)

  1. 下記（１）〜（３）：
    （１）スペーサーを介してまたは介さずにパートナーに結合したＦｃ領域から成るＦｃ融合（フュージョン）タンパクおよびＦｃ共役（コンジュゲート）タンパク、
    （２）Ｆｃの断片、
    （３）単離したＦｃ、
    の中から選択されるＦｃ領域を有し、親ポリペチドに比べてＦｃＲｎに対する結合性が増加した親ポリペチドの変異株であって、
    下記（ｉ）および（ｉｉ）の変異から成る少なくとも２つのアミノ酸の変異を有することを特徴とする変異株：
    (i) ３７８Ｖ、３７８Ｔ、４３４Ｙおよび４３４Ｓから成る群の中から選択される１つのアミノ酸変異、
    (ii) ２２６Ｇ、Ｐ２２８Ｌ、Ｐ２２８Ｒ、２３０Ｓ、２３０Ｔ、２３０Ｌ、２４１Ｌ、２６４Ｅ、３０７Ｐ、３１５Ｄ、３３０Ｖ、３６２Ｒ、３７８Ｖ、３７８Ｔ、３８９Ｔ、３８９Ｋ、４３４Ｙおよび４３４Ｓから成る群の中から選択され少なくとも１つのアミノ酸変異、
    （ただし、Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatのＥＵインデックスでの数え方であり、(i)の変異は(ii)の変異と同じアミノ酸位置では起こらない）
  2. 変異株がＦｃ融合（フュージョン）タンパクであって、上記パートナーが抗体の可変領域に由来するポリペプチド、レセプターの標的結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモキンの中から選択される請求項１に記載の変異株。
  3. 上記パートナーが下記の中から選択される免疫グロブリンの可変領域に由来する結合ポリペプチドである請求項１に記載の変異株：
    (i) ＶＬ、ＶＨ、ＣｌおよびＣＨ１領域から成るＦａｂ断片、
    (ii) ＶＨおよびＣＨ１領域から成るＦｄ断片、
    (iii) 単一抗体のＶＬおよびＶＨ領域から成るＦｖ断片；
    (iv) 単離したＣＤＲ領域、
    (v）Ｆ（ａｂ'）２断片
    (vi）ｓｃＦｖ
    (vii）二特異性（bispecific）単鎖Ｆｖ
    (viii）二特異性抗体（diabodies）または三特異性抗体（triabodies）
  4. 上記Ｆｃ共役（コンジュゲート）タンパクが共役パートナーとのＦｃ領域の化学的カップリングで得られたものである請求項１に記載の変異株。
  5. 上記共役パートナーがポリペプチド製剤、医薬品、細胞毒素剤、細胞毒薬、トキシンおよびトキシンの活性断片、カリキアミシン（calicheamicin）、オウリスタチン（auristatins）、ゲルダナマイシン、メイタンシンおよびドュオカルミシン（duocarmycins）の中から選択される請求項４に記載の変異株。
  6. 下記の群の中から選択されるアミノ酸変異の少なくとも一つの組合せを有する請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異株：226G/315D/434Y、230S/315D/434Y、230T/315D/434Y、230T/264E/434S、230T/389T/434S、241L/264E/378V、241L/264E/434S、250A/389K/434Y、2591/315D/434Y、264E/378T/396L、264E/378V/416K、264E/378V/434S、264E/396L/434S、294del/307P/434Y、307P/378V/434Y、315D/330V/434Y、315D/382V/434Yおよび378V/383N/434Y、
    （ただし、Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatのＥＵインデックスでの数え方である）
  7. 下記の群の中から選択されるアミノ酸変異の少なくとも一つの組合せをさらに有する請求項６に記載の変異株：
    226G、227L、230S、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、259I、264E、265G、267R、290E、294del、303A、305A、307P、307A、308I、315D、322R、325S、327V、330V、342R、347R、352S、361のD、362R、362E、370R、378V、378T、382V、383N、386R、386K、387T、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N、421T 416K1、426T、428L、433R、434Y、434Sおよび439R
    （ただし、Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatのＥＵインデックスでの数え方である）
  8. 下記の群の中から選択されるアミノ酸変異の少なくとも一つの組合せをさらに有する請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異株：
    307A/315D/330V/382V/389T/434Y、256N/378V/383N/434Y、315D/330V/361D/378V/434Y、2591/315D/434Y、230S/315D/428L/434Y、241L/264E/307P/378V/433R、250A/389K/434Y、305A/315D/330V/395A/434Y、264E/386R/396L/434S/439R、315D/330V/362R/434Y、294del/307P/434Y、305A/315D/330V/389K/434Y、315D/327V/330V/397M/434Y、230T/241L/264E/265G/378V/421T、264E/396L/415N/434S、227L/264E/378V/434S、264E/378T/396L、230T/315D/362R/426T/434Y、226G/315D/330V/434Y、230L/241L/243L/264E/307P/378V、250A/315D/325S/330V/434Y、290E/315D/342R/382V/434Y、241L/315D/330V/392R/434Y、241L/264E/307P/378V/434S、230T/264E/403T/434S、264E/378V/416K、230T/315D/362E/434Y、226G/315D/434Y、226G/315D/362R/434Y、226G/264E/347R/370R/378V/434S、3081/315D/330V/382V/434Y、230T/264E/378V/434S、231T/241L/264E/378T/397M/434S、230L/264E/378V/434S、230T/315D/330V/386K/434Y、226G/315D/330V/389T/434Y、267R/307P/378V/421T/434Y、230S/315D/387T/434Y、230S/264E/352S/378V/434Sおよび230T/303A/322R/389T/404L/434S
    （ただし、Ｆｃ領域のアミノ酸の数え方はKabatのＥＵインデックスでの数え方である）
  9. Ｆｃ領域がSEQ ID番号１の配列を有する請求項１〜８のいずれか一項に記載の変異株。
  10. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の変異株含む医薬組成物。
  11. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の変異株をコードする単離された核酸。
  12. 請求項１１の核酸を含むベクター。
  13. 請求項１２のベクターを含む宿主細胞。
  14. 請求項１３の宿主細胞を培養して上記核酸を発現させる請求項１〜９のいずれか一項に記載の変異株を作る方法。
  15. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の変異株を含む医薬品。
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