KR20160145850A

KR20160145850A - 최적화된 ｆｃ 변이체

Info

Publication number: KR20160145850A
Application number: KR1020167034673A
Authority: KR
Inventors: 크리스티앙 베흐렌; 실비에 조릭스; 아데하킹 크하라트; 칼리 보야디; 필리페 몬돈; 셀리느 모네-마르스
Original assignee: 라보라토이레 프란카이즈 듀 프락티온네먼트 에트 데스 바이오테크놀로지스
Priority date: 2009-03-20
Filing date: 2010-03-19
Publication date: 2016-12-20
Also published as: CN104892762A; WO2010106180A2; EP3395831A1; CA3069425C; IL215041A0; EP2233500A1; EP2805969A2; PL2805969T4; JP5770710B2; WO2010106180A3; KR101757136B1; EP2805969B1; JP2016014020A; USRE45992E1; BR122021019353B1; CN102405231A; CA3069425A1; KR20160105547A; AU2010224800A1; KR20110128883A

Abstract

본 발명은 Fc 영역을 포함하는 모 폴리펩타이드의 변이체에 관한 것으로서, 상기 변이체는 모 폴리펩타이드와 비교하여 FcRn에 대하여 증가된 결합력을 나타내고, Fc 영역에서 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다.

Description

최적화된 ＦＣ 변이체{Optimized FC variants}

본 발명은 Fc 영역을 포함하는 모(parent) 폴리펩타이드의 변이체에 관한 것이다. 상기 변이체는 모 폴리펩타이드에 비해 FcRn에 대한 결합이 증가함을 나타내고, Fc 영역에서 적어도 하나의 아미노산 변형(modification)을 포함한다.

모노클로날 항체는 암, 자가면역 질병, 만성 염증 질병, 이식 거부, 전염성 질병, 및 심장 혈관 질환을 포함하는 다양한 상태를 치료하기 위하여 치료제로서 사용된다. 최근에, 시장에서 인가된 20개 이상의 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체 단편 제품이 있고 임상적 개발에서는 400개 이상이 있다. 이러한 허용과 전망에도 불구하고, 항체의 구조적 및 기능적 성질의 최적화를 위한 상당한 요구가 있다.

치료에서 모노클로날 항체의 사용에서의 중대한 이슈(issue) 중 하나는 혈액 순환에서 그들의 지속성이다. 항체 제거율은 직접적으로 치료의 효력에 영향을 끼치고, 결과적으로, 환자에 악영향을 끼칠 수 있고 또한 의약 비용을 증가시킬 수 있는 약물 투여의 빈도 및 양에 영향을 끼칠 수 있다.

IgG가 인간에서 가장 지배적인 면역글로불린 부류이고, 치료에서 가장 많이 이용된다. IgG 항상성의 메카니즘은 설치류에서 모(mother)로 부터 태아 또는 신생아로의 수동적 면역성의 전달에 관한 연구를 통해 밝혀졌다(Brambell, 1966, Lancet; 2(7473):1087-93.; Rodewald, 1976, J Cell Biol.; 71(2);666-9; Jones et al., 1972, J Clin Invest., 51(11):2916-27). 초기 연구에서, Brambell은 IgG의 모와 태아 사이의(maternoferal) 전달을 위한 수용체가 있고, IgG의 모와 태아 사이의 전달 및 IgG의 이화작용에 포함되는 메카니즘은 같거나, 적어도 매우 관련 있다고 가정해왔다(Brambell, 1966, Lancet; 2(7473):1087-93).

연구들에 따르면, 극성화된(polalized) 세포내 및 그를 가로질러 IgG의 수송은 Fc 영역이 신생아 Fc 수용체(neonatal Fc receptor)(FcRn)라고 명명된 고-친화력 Fc-수용체에의 결합에 의해 중재된다는 것이 밝혀졌다. FcRn은 주 조직접합성 복합체 부류 I 분자의 α-쇄의 외부 도메인에 구조적 상동성을 갖는 막을 통과하는(transmembrane) α-쇄, 및 β₂-마이크로글로불린(β₂m)으로 구성되는 가용성 쇄(light chain)를 포함하는 헤테로다이머이다(Simister and Mostov, 1989, Cold Spring Harb Symp Quant Biol.:54 Pt 1:571-80). 인간에서, FcRn은 태반 세포, 장, 신장 및 기관지 상피 세포, 내피 세포 및 소장 마크로파지, 단핵백혈구 및 단핵백혈구-유래 나뭇가지 모양의(dendritic) 세포와 같은 조혈모세포에서 발현된다(Zhu X et al., 2001, J Immunol.; 166:3266-76). FcRn은 그의 두개의 주요 리간드, IgG 및 혈청 알부민과, pH 의존적 방법으로, pH 6.0-6.5에서 효율적으로 결합하고, pH 7.0-7.5에서 방출하면서 결합한다(Raghavan et al., Biochemistry., 34:14649-57).

이화작용으로부터 IgG 보호에 대해 제안된 메카니즘은 낮은 pH가 FcRn에의 결합을 촉진하는 내피 세포의 엔도좀으로 비-특이적 음세포작용(pinocytosis)에 의해 내화된다(internalized)는 것이다(Ghetie and Ward, 1997, Nat. Biotechnol., 15:637-40). 결합된 IgG-FcRn 복합체는 세포 표면으로 재순환되고, 세포외 유체의 중성 pH에서 분리되어, 혈액에서의 순환으로 복귀한다. FcRn에 결합하지 않은 IgG는 프로테아제에 의해 분해되는 장소인 리소좀으로 간다. IgG의 생존에 대한 농도-의존적 이화작용 메카니즘에 따르면, 낮은 혈청 IgG 농도에서, 수용체는 모든 세포에 흡수된(endocytosed) IgG와 결합하고, 효율적으로 이를 순환에 되돌려보내 IgG가 장기간의 반감기를 갖게 한다. 역으로, 높은 IgG 농도에서, 수용체는 IgG로 포화되어, IgG의 주요 분율(fraction)이 수용체에 의해 결합되지 않아 분해되어, 결합되지 않은 IgG의 보다 빠른 이화작용을 이룬다.

마우스 IgG의 Fc 영역에서 다양한 부위-특이적 돌연변이 유발 실험은 IgG와 FcRn사이의 상호작용에 포함된 특정한 중요한 아미노산 잔기의 동정에 이르게 된다(Kim et al., 1994, EurJ Immunol.;24:2429-34; Kim et al., 1994, EurJ Immunol; 24:54-8; Medesan et al., 1996, EurJ Immunol.; 26:2533-6, Medesan et al., 1997, J Immunol.; 158:2211-7). 이들 연구 및 서열 비교 연구에 의해 위치 253의 이소류신, 위치 310의 히스티딘, 및 위치 435의 히스티딘(Kabat 넘버링(numbering)에 따르면, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))이 인간 및 설치류 IgG에서 높게 보존되어, IgG-FcRn 결합에서의 그들의 중요성을 제시한다. 이들 아미노산 잔기는 CH2-CH3 도메인들 경계면에 위치하고, 이들 잔기에 대한 기능 부위의 맵핑은 래트 Fc와 복합체화된 래트 FcRn의 X-선 결정학적 구조와 일치한다(Burmeister et al., 1994, nature; 372(6504);379-83).

Ghetie 등(1997, Nat. Biotechnol; 15:637-40)은 마우스 IgG1 Fc-힌지(hinge) 단편 중의 위치 252, 위치 254, 및 위치 256을 임의로 돌연변이 시켰다. 한 돌연변이체는 마우스 FcRn에 대해 3.5배 높은 친화력과 야생형의 것과 비교해서 두개의 마우스 스트레인(strains) 각각에서 약 23% 또는 65% 긴 반감기(half-life)를 보였다.

Kim 등(1999, Eur J Immunol; 29:2819-25)은 Fc 영역의 위치 253, 위치 310, 또는 위치 435에서 아미노산 치환에 의해 인간 IgG1을 돌연변이 유발시켰다. 이들은 돌연변이체 Fc-힌지 단편들이 야생형 IgG1 Fc-힌지 단편에 비교해서 마우스에서 혈청 반감기를 감소시킴을 발견하고, Ile253, His310, 및 His435가 IgG의 혈청 반감기를 조절하는데에 중심 역할을 한다고 결론을 내렸다.

Hornick 등(2000, J Nucl Med., 41:355-62)은 키메라 인간 IgG1 항체의 Fc 영역중 위치 253에서 단일 아미노산 치환이 마우스에서 제거(clearance)를 가속화시키고, 고체 종양의 면역신티그래피를 개선시킴을 보여줬다.

Shields 등(2001, J Biol Chem; 276:6591-604)은 인간 IgG1 항체의 Fc 영역에서의 잔기를 변경하는 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발을 사용하고, 이어서 인간 FcRn에의 결합을 평가했다. 알라닌으로 변화되었을 때 FcRn에의 결합을 효과적으로 파기시킨 위치는 I253, S254, H435, 및 Y436을 포함한다. 다른 위치는 다음과 같은 결합에서 덜 두드러진 감소를 보였다:E233-236, R255, K288, L309, S415, 및 H433. 수개의 아미노산 위치가 알라닌으로 변화되었을 때 FcRn 결합에서 개선을 보였다; 이들중 주목할만한 것이 P238, T256, E272, V305, T307, Q311, D312, K317, D376, E380, E382, S424, 및 N434이다. 많은 다른 아미노산 위치는 FcRn 결합에서 약간의 개선을 보이거나(D265, N286, V303, K360, Q362, 및 A378), 변화를 보이지 않았다(S239, K246, K248, D249, M252, E258, T260, S267, H268, S269, D270, K274, N276, Y278, D280, V282, E283, H285, T289, K290, R292, E293, E294, Q295, Y296, N297, S298, R301, N315, E318, K320, K322, S324, K326, A327, P329, P331, E333, K334, T335, S337, K338, K340, Q342, R344, E345, Q345, Q347, R356, M358, T359, K360, N361, Y373, S375, S383, N384, Q386, E388, N389, N390, K392, L398, S400, D401, K414, R416, Q418, Q419, N421, V422, E430, T437, K439, S440, S442, S444, 및 K447).

가장 두드러진 더함(additivity)은 FcRn에의 개선된 결합을 갖는 조합 변이체에서 발견되었다. pH 6.0에서 E380A/N434A 변이체는 천연 IgG1에 비해 FcRn에 대해 8배 이상의 양호한 결합을 나타내고, E380A에 대해서는 2배로 및 N434A에 대해서는 3.5배로 비교되었다. 여기에 T307A를 더하는 것은 천연 IgG1에 비해 결합에서 12배 개선을 나타냈다.

Dall'Acqua 등(2002, J Immunol.;169:5171-80)은 마우스 FcRn에 대해 인간 IgG1 힌지-Fc 단편 파지 디스플레이 라이브러리의 임의의 돌연변이 유발 및 스크리닝을 기술하였다. 이들은 위치 251, 252, 254-256, 308, 309, 311, 312, 314, 385-387, 389, 428, 433, 434, 및 436의 임의의 돌연변이 유발을 개시하였다. IgG1-인간 FcRn 복합체 안정성에서의 주요 개선이 Fc-FcRn 경계면을 가로지르는 밴드에 위치한 잔기를 치환할 때 일어나고(M252, S254, T256, H433, N434, 및 Y436), V308, L309, Q311, G385, Q386, Q387, 및 N389 같은 주변에 있는 잔기의 치환에는 덜 연장된다. 인간 FcRn에 가장 높은 친화력을 갖는 변이체는 M252Y/S254T/T256E 및 H433K/N434F/Y436H 돌연변이를 조합하여 얻어졌고, 야생형 IgG1에 비해 친화력에서 57배 증가를 나타냈다.

Hinton 등(2004, J Biol Chem.; 279:6213-6)은 두 개의 돌연변이, T250Q 및 M428L을 기술하고, 이는 인간 IgG2의 인간 FcRn에의 결합을 각각 약 3배 및 7배 증가시켰다. 조합시, 이들 두 돌연변이는 IgG2의 28배 증가된 결합 능력을 유도하였다. 약물동력학(pharmacokinetic) 연구를 위해 붉은털 원숭이에 주입했을 때, IgG2 돌연변이체, M428L 및 T250Q/M428L은 야생형 항체보다 약 2배 긴 반감기를 보였다.

Dall'Acqua 등(2006, J. Biol. Chem.; 281:23514-24)은 Fc 영역이 위치 252, 254 및 256(M252Y/S254T/T256E)에서 돌연변이되고, 인간화된 항호흡 신시티얼(syncytial) 바이러스 IgG1을 기술하고 있다. 이들 돌연변이는 인간 FcRn에의 결합을, pH 7.4에서 효율적인 방출을 허용하면서, pH 6.0에서 약 10배 증가시킨다(Dall'Acqua et al., 2002, J Immunol.; 169:5171-80). 이러한 돌연변이된 인간 IgG1의 생체내 거동은 야생형 IgG1에 비교해서 시노몰고스(cynomolgus) 원숭이에서 혈청 반감기에서 거의 4배 증가를 나타냈다.

추가적으로, 다양한 간행물이 FcRn-결합 폴리펩타이드를 분자에 도입시키거나(WO 97/43316; U.S. 특허 No. 5,869,046; U.S, 특허 No. 5,747,035; WO 96/32478; WO 91/14438) 또는 분자를 FcRn-결합 친화력이 보존되나 다른 Fc 수용체에 대한 친화력이 크게 감소된 항체와 융합시키거나(WO 99/43713) 또는 항체의 FcRn 결합 도메인과 융합시켜(WO 00/09560; U.S. 특허 No. 4,703,039) 반감기가 변경된 생리적으로 활성인 분자를 얻기 위한 방법을 기술하고 있다.

U.S. 특허 No. 6,165,745는 항체를 인코딩하는 DNA 세그먼트에 돌연변이를 도입시켜 생물학적 반감기가 감소된 항체를 생산하는 방법을 개시하고 있다. 상기 돌연변이는 FC-힌지 도메인의 위치 253, 310, 311, 433 또는 434에서의 아미노산 치환을 포함한다. U.S. 특허 No. 6,165,745의 전 개시 및 본 명세서에 인용된 모든 다른 U.S. 특허 참조문헌의 모든 개시는 본 명세서에서 참조로 혼입된다.

PCT 공개공보 No. WO 00/42072는 변경된 FcRn 결합 친화력을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 개시하고 있고, 이 폴리펩타이드는 Fc 영역의 임의의 하나 이상의 아미노산 위치 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439, 및 447에서의 아미노산 변형을 포함하고, 여기에서, Fc 영역에서의 잔기의 넘버링은 EU 인덱스(Kabat et al., op. cit)의 것이다.

PCT 공개 공보 No. WO 02/060919 A2는 야생형 불변(constant) 도메인에 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 IgG 불변 도메인을 포함하는 변형된 IgG를 개시하고 있고, 여기에서, 변형된 IgG는 야생형 IgG 불변 도메인의 반감기에 비해 증가된 반감기를 갖고, 여기에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 위치 251, 253, 255, 285-290, 308-314, 385-389, 및 428-435의 하나 이상에 있다.

본 분야에는 여전히 신규의 최적화된 Fc 변이체가 요구되고 있다. 본 발명은 최적화된 성질을 갖는, 모 폴리펩타이드의 변이체를 제공한다. 최적화된 성질은 상응하는 모 폴리펩타이드 보다 FcRn에 대해 높은 결합 특성을 포함한다.

발명의 요약

바람직한 실시 형태에서, 모 폴리펩타이드의 상기 변이체는 Fc 영역을 포함하고, 상기 모 폴리펩타이드에 비해 FcRn에 증가된 결합을 나타내며, 상기 모 폴리펩타이드의 Fc 영역에서 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 여기에서, 상기 변형은 상기 모 폴리펩타이드에 비해 Fc 영역의 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315, 317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 및 447로 구성되는 그룹으로부터 선택되고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산의 넘버링은 Kabat의 EU 인덱스(index)의 것이다.

또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 변이체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 변이체를 인코딩하는 분리된 핵산을 제공한다.

또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 상기 기술된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.

또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 상기 기술된 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다.

또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 핵산이 발현하도록 상기 기술된 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 폴리펩타이드 변이체를 생성하는 방법을 제공한다.

또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 변이체를 포함하는 의약품을 제공한다.

또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 약제의 제조를 위한 본 발명의 변이체의 용도를 제공한다.

또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 Fc 최적화된 변이체를 동정하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 아미노산 변형은 하나 이상의 Fc 이펙터(effector) 활성과 화합된 FcRn에 대한 증가된 결합력을 가진 IgG 변이체를 얻을 수 있게 한다. 이는 적어도 관련된 모 IgG(즉, IgG-WT)의 결합력과 유사하다. 또 다른 측면으로서, 본 발명에 다른 아미노산 변형은 CDC 또는 ADCC와 같은 적어도 하나의 감소된 Fc 이펙터(effector) 활성과 결합된 FcRn에 대한 증가된 결합력을 가지는 IgG 변이체를 얻을 수 있다.

도 1은 인간 IgG1 중쇄에서 유래된 아미노산 잔기 226-447(kabat 에서와 같은 EU 인덱스)를 인코딩하는 인간 Fc 유전자(Fc226, SEQ n°1)가 클로닝된 파지미드(phagemid) 벡터 pMG58을 보여준다.
CVDE: VMA1-유래된 엔도뉴클리아제의 C-말단 부분, VMA: 액포 ATPase 서브유니트(VMA), CPIII: 파지 M13의 캡시드 단백질 pIII(또는 p3)의 C-말단 부분.
도 2는 고체 상(2A) 및 용액(2B)에서의 Fc 변이체 선택을 위해 사용된 방법을 보여준다. FcRn-biot는 비오틴화 FcRn을 언급하고, FcRn-p3 는 FcRn-p3 융합 단백질을 언급한다. Fc-파지는 그의 캡시드 상에 Fc 변이체를 발현하는 박테리오파지 M13이다. 고체상 선택에서 면역플레이트의 웰은 FcRn-p3 융합 단백질(Fc-Rn-p3) 또는 FcRn-biot가 이어지는 뉴트라비딘으로 코팅된다.
도 3은 선택된 Fc 변이체 상에 수행된 파지-ELISA 분석의 원리를 보여준다. Fc-파지는 그의 캡시드 상에 Fc 변이체를 발현하는 박테리오파지 M13이다. FcRn-p3은 면역플레이트의 웰 상에서 코팅된 FcRn-p3 융합 단백질이다. anti-M13은 ELISA 검출을 위해 사용된 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)에 융합된 마우스 항-M13 항체를 언급한다.
도 4는 Fc IgG1의 각 아미노산 위치에 대해 상기 위치에서 변형을 포함하는 돌연변이체의 퍼센트를 나타내는 막대 그래프를 보여준다. X-축: Kabat에서와 같은 EU 인덱스에 따라 돌연변이된 위치의 아미노산 번호. Y-축: 돌연변이된 위치를 함유하는 Fc 변이체의 퍼센트.
도 5a는 FcRn에 대한 Fc 변이체의 결합 친화력을 측정하는 전용의 ELISA 분석의 원리를 보여준다. FcRn-p3는 면역플레이트의 웰 상에서 코팅된 FcRn-p3 융합 단백질이다. Fc는 ELISA 검출을 위한 V5 태그를 포함하는 Fc 변이체이다. 항-V5는 HRP에 융합된 항-V5 항체이다. 항체는 ELISA 검출을 위해 사용된다.
도 5b는 실시예 1의 IV.1.a에서 기술된 대로 수행된 ELISA 분석에 의해 얻어진 야생형 Fc(원) 및 Fc-H 변이체(사각형)에 대한 투여량-효과 곡선을 보여준다. X-축: Fc 폴리펩타이드의 농도. Y-축: Fc 폴리펩타이드에 결합된 FcRn의 퍼센트.
도 5c는 실시예 1의 IV.1.a에서 기술된대로 수행된 ELISA 분석에 의해 얻어진 야생형 Fc(원) 및 S3A_07 변이체(사각형)에 대한 투여량-효과 곡선을 보여준다. X -축: Fc 폴리펩타이드의 농도. Y-축: Fc 폴리펩타이드에 결합된 FcRn의 퍼센트.
도 5d는 실시예 1의 IV.1.a에서 기술된 대로 수행된 ELISA분석에 의해 얻어진 야생형 Fc(원) 및 S5A_41 변이체(사각형)에 대한 투여량-효과 곡선을 보여준다. X-축: Fc 폴리펩타이드의 농도. Y-축: Fc 폴리펩타이드에 결합된 FcRn의 퍼센트.
도 6은 인간 IgG2 (SEQ ID NO:14), 인간 IgG3 (SEQ ID NO.:15) 및 인간 IgG4 (SEQ ID NO:16)의 상응하는 서열과 함께 위치 216-447(Kabat에서의 EU 인데스에 따라 )와 관련된 천연의 인간 IgG1 서열의 배열을 보여준다. IgG1 서열은 G1m1,17 알로타입(allotype)(SEQ ID No:12) 및 G1m3 알로타입(SEQ ID NO:13)과 관련된다. IgG1의 "보다 낮은 힌지-CH2-CH3" 도메인은 위치 216(화살표 참조)에서 시작한다.
도 7은 다른 pH들에서 FcRn 에 대한 Fc-변이체 결합 친화력을 보여주도록 수행된 ELISA 분석(보다 상세히는 실시예 2, 파트 IV.2 참조)의 결과를 보여준다. 막대 그래프는 각 변이체에 대해 pH=6(흑색 바), pH=6.5(백색 바) 또는 pH=7.4(회색 바)에서 수행된 ELISSA 분석 경우 측정된 OD_450nm 값을 나타낸다. OD_450nm의 값은 Fc 변이체에 결합된 고정화된 FcRn의 양과 상관 관계가 있다.
도 8a는 본 명세서에 기술된 바와 같은 Fc 변이체를 포함하는 재조합 IgG1 항체를 발현하도록 제기된 발현 벡터의 구조 맵을 도시한 것이다. 결과적인 재조합 IgG1 항체는 CD20 항원에 대해 결합 특이성을 갖는다. 도 8a에 예시된 바와 같이, 본 명세서와 실시예들에 기술된 돌연변이들을 갖는 중쇄 불변 영역을 인코딩하는 핵산이 HKCD20-Opti-GA 벡터에 존재하는 Apa1 및 Ascl 클로닝 부위들 사이에 삽입되어 있다.
도 8b 및 8c는 각각 비환원 조건 및 환원 조건하의 IgG 변이체의 SDS-PAGE를 나타낸다.
(1)은 야생형 Fc를 포함하는 IgG에 관련되고; (2)는 Fc-H 변이체를 포함하는 IgG에 관련되며; (3)은 C6A_69 변이체를 포함하는 IgG에 관련되고; (4)는 C6A_78 변이체를 포함하는 IgG에 관련되며; (5)는 T5A_74 변이체를 포함하는 IgG에 관련되며; (6)은 C6A_74 변이체를 포함하는 IgG에 관련되고; (7)은 C6A-60 변이체를 포함하는 IgG에 관련되며; 및 (8)은 C6A_66을 포함하는 IgG에 관련된다.
도 9는 FcRn 에 대한 IgG 변이체의 결합을 평가하기 위한 실시예 2, III.1에 기술된 바와 같이 수행된 ELISA 분석에 의해 얻어진 본 발명의 IgG 변이체("1") 및 야생형 IgG("2")에 대한 투여량-효과 곡선을 보여준다. X-축: IgG의 농도. Y-축: IgG에 결합된 FcRn 퍼센트.
도 10은 FcγRIIIa를 평가하기 위하여 본 발명의 IgG 변이체에 대한 ELISA 분석에 의해 얻어진 투여량-효과 곡선을 보여준다. (1)은 C6A_66 변이체에 대해 얻어진 곡선과 관련되어 있고, (2)는 리툭시맵(Rituximab)에 대해 얻어진 곡선에 관련되어 있으며, (3)은 C6A_69; C6A_78; T5A_74; C6A_74; C6A_60 변이체, 및 야생형 IgG 에 대해 얻어진 곡선에 관련되어 있다. ELISA 분석은 실시예 2, 파트 IV.1.a에 기술된 대로 수행되었다. X-축: IgG의 농도. Y-축: IgG에 결합된 FcγRIIIa의 퍼센트.
도 11은 Jurkat FcRn에의 다양한 재조합 IgG의 결합을 예시한다. 도 11은 Jurkat FcRn에의 Ritixan 및 본 발명에 따른 다양한 변이체의 결합이 상기 재료 및 방법 부분에서 기술된 대로 측정되었고, 평균 형광 강도(MFI) 값으로 표현됐음을 보여준다.
도 12는 본 발명에 따른 IgG 변이체에 대한 ADCC 분석에서 얻어진 투여량-효과 곡선을 보여준다. (1)은 C6A_66 변이체의 곡선에 관련되어 있고, (2)는 Rituximab의 곡선에 관련되어 있으며, (3)은 LFB-R603, WT-IgG, 및 본 발명의 IgG 변이체(즉, C6A_69; C6A_78; T5A_74; C6A_74; C6A_60 변이체)의 곡선에 관련되어 있다. X-축: IgG의 농도. Y-축: 세포 용해의 퍼센트.

본 출원이 보다 완전히 이해될 수 있도록, 수개의 정의가 하기에 기술된다. 이러한 정의는 문법적(grammatical) 동등물을 포함하는 것으로 의미된다.

본 명세서 및 청구범위를 통하여, Fc 영역 중의 잔기의 넘버링은 본 명세서에 참고문헌으로 명백히 혼입되는 Kabat 등의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)]에서와 같이 EU 인덱스에서 따라 면역글로불린 중쇄의 것이다. "Kabat에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링(numbering)을 참조한다.

본 명세서에서 사용되는 "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 적어도 2개의 공유적으로 부착된 아미노산을 의미하며, 이는 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 및 펩타이드를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 "아미노산"은 20개의 천연적으로 존재하는 아미노산중의 하나 또는 특이적, 정의된 위치에 존재할 수 있는 어느 비-천연 유사체를 의미한다.

천연적으로 존재하는 아미노산은 세개의 문자 코드 또는 한 개의 문자 코드로 약칭될 수 있다:

본 명세서에서 사용되는 "위치"는 단백질의 서열중 위치를 의미한다. Fc 영역 경우, 위치들은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스에 따라 넘버링된다.

본 명세서에서 사용되는 "아미노산 변형"은 폴리펩타이드의 아미노산 서열에서의 변화를 의미한다. 또한, 본 명세서에서 "아미노산 변화들"이라 칭할 수 있는 "아미노산 변형'은 폴리펩타이드 서열에서 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실을 포함한다. 본 명세서에서 사용된바 "아미노산 치환" 또는 "치환"은 모(parent) 폴리펩타이드 서열 중의 특별한 위치에서 한 아미노산을 또 다른 아미노산으로 대체하는 것을 의미한다. 예를 들어, 치환 N434S는 변이체 폴리펩타이드, 이 경우 위치 434에서의 아스파라긴이 세린으로 대체된 Fc 변이체를 언급한다. 본 명세서에서 사용된, "아미노산 삽입" 또는 "삽입"은 모 폴리펩타이드 서열 중 특별한 위치에서 아미노산의 첨가를 의미한다. 예를 들어, insert G>235-236은 위치 235와 236 사이에 글리신을 삽입하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용된바, "아미노산 결실" 또는 "결실"은 모 폴리펩타이드 서열 중의 특별한 위치에서 아미노산의 제거를 의미한다. 예를 들어, E294del은 위치 294에서 글루탐산의 결실을 나타낸다.

예를 들어, 바람직하게는, 다음 포맷의 변형이 사용된다: 434S, 또는 N434S는 위치 434에서의 모 아미노산, 즉, 아스파라긴이 세린으로 대체된다는 것을 의미한다.

치환의 조합 경우에, 바람직한 포맷은 259I/315D/434Y 또는 V259I/N315D/N434Y이다. 이는 변이체에 위치 259에서 하나, 위치 315에서 하나 및 위치 434에서 하나로서 총 세 개의 치환체가 있다는 것을 나타내고, 모 폴리펩타이드의 위치 259에서의 아미노산, 즉 발린이 이소류신으로 대체되었음을 나타내며, 모 폴리펩타이드 위치 315에서의 아미노산, 즉 아스파라긴이 아스파르트 산으로 대체되었음을 나타내고, 모 폴리펩타이드의 위치 434에서의 아미노산, 즉 아스파라긴이 티로신으로 대체되었음을 나타낸다.

본 명세서에서 사용된, "가변 부위"는 각각 카파, 람다, 및 중쇄 면역글로불린 유전자 위치들을 구성하는 Vκ, Vλ, 및/또는 VH 유전자 중 어느 것에 실질적으로 인코딩되는 하나 이상의 Ig 도메인을 포함하는 면역글로불린의 영역을 의미한다. 가변 영역은 상보성-결정 영역(Complementarity-Determining Regions)(CDRs) 및 골격 영역(Framework Regions)(FR)을 포함한다.

본 명세서에서 사용된바, "Fc" 또는 "Fc 영역"은 제 1 불변 영역 면역글로불린 도메인을 배제한 항체의 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 따라서, Fc는 IgA, IgD, 및 IgG의 마지막 두개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, IgE 및 IgM의 마지막 세개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, 및 이들 도메인에 대한 가요성 힌지(hinge) N-말단을 언급한다. IgA 및 IgM 경우, Fc는 J 쇄를 포함할 수 있다. IgG 경우, Fc는 면역글로불린 도메인 C감마2 및 C감마3(IgG에 대해 각각 CH2 및 CH3 도메인인 Cγ2 및 Cγ3) 및 C감마1(Cγ1) 및 C감마2(Cγ2)사이의 보다 낮은 힌지 영역을 포함한다. 인간 IgG1 중쇄 Fc 영역은 그의 카르복실-말단쪽으로 잔기 C226을 포함하는 것으로 정의되고, 여기에서 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스(index)에 따른다. 인간 IgG1의 상황에서, Kabat에서와 같은 EU 인덱스에 따라, 보다 낮은 힌지(hinge)는 위치 226-236을 의미하고, CH2 도메인은 위치 237-340을 언급하며, CH3 도메인은 위치 341-447을 의미한다. 다른 면역글로불린의 상응하는 Fc 영역은 서열 배열에 의해 동정될 수 있다.

Fc는 단리시 이 영역, 또는 하기 기술되는 바와 같이 Fc 폴리펩타이드의 상황에서 이 영역을 언급할 수 있다. 본 명세서에서 사용된바 "Fc 폴리펩타이드"는 Fc 영역의 모두 또는 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. Fc 폴리펩타이드는 제한되는 것은 아니지만 항체, Fc 융합물, 단리된 Fc들, Fc-콘쥬게이트(conjugates) 및 Fc 단편을 포함한다.

용어 "항체"는 본 명세서에서 가장 넓은 의미로 사용된다. "항체"는 적어도 (i) Fc 영역 및 (ii) 면역글로불린의 가변 영역으로부터 유래된 결합 폴리펩타이드 도메인을 포함하는 임의의 폴리펩타이드를 언급한다. 상기 결합 폴리펩타이드 도메인은 하나의 소정의 표적 항원 또는 표적 항원의 그룹에 특이적으로 결합할 수 있다. 면역글로불린의 가변 영역으로에서 유래한 결합 폴리펩타이드 도메인은 하나 이상의 CDR을 포함한다. 항체는 제한되는 것은 아니지만 전장(full-length) 면역글로불린, 모노클로날 항체, 다중-특이적 항체, 적어도 하나의 가변 영역을 포함하는 Fc-융합 단백질, 합성 항체(때때로 본 명세서에서 '항체 모방물(antibody mimetics)"이라고 언급한다), 키메라 항체, 인간화된(humanized) 항체, 완전 인간 항체, 항체-융합 단백질, 항체 콘쥬게이트 및 각각의 단편 각각을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 "전장(full-length) 항체" 또는 면역글로불린은 가변 및 불변 영역을 포함하는, 항체의 천연 생물학적 형태를 구성하는 구조를 의미한다. "전장 항체"는 모노클로날 완전 길이 항체, 야생형 전장 항체, 키메라 완전 길이 항체, 인간화된 전장 항체를 포함하며, 이 목록은 제한적은 아니다.

인간 및 마우스를 포함하는 대부분의 포유동물에서, 전장 항체의 구조는 일반적으로 사량체(tetramer)이다. 상기 사량체는 두 개의 동일한 쌍의 폴리펩타이드 쇄로 구성되며, 각 쌍은 하나의 "경쇄"(전형적으로 약 25 kDa의 분자량을 갖는)와 하나의 "중쇄"(전형적으로 약 50-70 kDa의 분자량을 갖는)를 갖는다. 일부 포유동물에서, 예를 들어, 낙타 및 야마에서, 완전 길이 항체는 오직 두 개 중쇄로 구성될 수 있으며, 각 중쇄는 Fc 영역에 부착된 가변 도메인을 포함한다.

각 쇄의 아미노-말단 부분은 1차적으로 항원 인식에 관련이 있는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 가변 영역에서, 세 개의 루프가 중쇄 및 경쇄의 V 도메인들의 각각을 위해 모여져 항원-결합 부위를 형성한다. 루프의 각각은 아미노산 서열에서의 변이가 가장 중요한, 상보성-결정 영역(이하, "CDR"이라 언급된다.)으로 언급된다.

각 쇄의 카르복시-말단 부분은 주로 효과 인자 기능에 관여하는 불변 영역을 한정한다. Kabat 등은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 다수의 주요 서열들을 수집했다. 서열의 보존 정도에 기초해서, 이들은 개개의 주요 서열들을 CDR과 골격으로 분류하고, 그들의 목록을 작성했다(전체로 본 명세서에 참고로 인용되는 Sequences of Immunological Interest, 5th edition, NIH publication, No. 91-3242, E.A. Kabat 등 참조).

인간 면역글로불린의 경우, 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 아이소타입을 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로서 각각 정의한다. IgG는 제한되는 것은 아니지만 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하는 수개의 서브클래스(subclasses)를 갖는다. IgM은 제한되는 것은 아니지만 IgM1 및 IgM2를 포함하는 서브클래스를 갖는다. 따라서, 본 명세서에서 사용된바 "아이소타입"은 불변 영역의 화학적 및 항원 특성에 의해 정의되는 면역글로불린의 임의의 서브클래스를 의미한다. 공지된 인간 면역글로불린의 아이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM1, IgM2, IgD, 및 IgE이다.

본 명세서에서 사용된바, "IgG"는 인지된 면역글로불린 감마 유전자에 의해 실질적으로 인코딩되는 항체의 부류(class)에 속하는 폴리펩타이드를 의미한다. 인간에서, IgG는 서브클래스 또는 아이소타입 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함한다. 마우스에서, IgG는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3를 포함한다. 완전 길이 IgG들은 사량체이고 두개의 면역글로불린 쇄의 두개의 동일한 쌍으로 구성되며, 각 쌍은 한개의 경쇄 및 한개의 중쇄를 갖고, 각 경쇄는 면역글로불린 도메인 VL 및 CL을 포함하고, 각 중쇄는 면역글로불린 도메인 VH, Cγ1(또한 CH1이라 불리움), Cγ2(또한 CH2라 불리움), 및 Cγ3(또한 CH3이라 불리움)을 포함한다. 인간 IgG1의 상황에서, Kabat에서와 같은 EU 인덱스에 따라 "CH1"은 위치 118-220을 언급하며, CH2 도메인은 위치 237-340을 언급하며, CH3 도메인은 위치 341-447을 언급한다. IgG 중쇄는 또한 IgG1의 경우에 위치 221-236을 언급하는 힌지 도메인을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 "모 폴리펩타이드" 또는 "폴리펩타이드 모"는 추후 변형되어 변이체를 형성하는 비변형된 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 모 폴리펩타이드는 천연적으로 존재하는 폴리펩타이드, 천연적으로 존재하는 폴리펩타이드의 변이체, 천연적으로 존재하는 폴리펩타이드의 처리된(engineered) 버젼 또는 합성 폴리펩타이드일 수 있다. 모 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 자체, 또는 그를 인코딩하는 아미노산 서열을 언급할 수 있다. 본 발명의 상황에서, 모 폴리펩타이드는 야생형 Fc 영역, 그들의 단편 및 그들의 돌연변이체의 그룹으로부터 선택된 Fc 영역을 포함한다. 따라서, 모 폴리펩타이드는 야생형 Fc 영역에 비교해서 그의 Fc 영역에서 기존의 아미노산 변형(즉, Fc 돌연변이체)을 임의로 포함할 수 있다.

유리하게는, 모 폴리펩타이드는 항체, 면역글로불린, Fc 융합 폴리펩타이드, Fc 콘쥬게이트(conjugate)이며, 이 목록에 제한되는 것은 아니다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 "모 면역글로불린"은 변이체 면역글로불린을 생성하도록 변형된 면역글로불린 폴리펩타이드를 의미하고, 본 명세서에서 사용된바 "모 항체"는 변이체 항체를 생성하도록 변형된 항체를 의미한다. "모 항체"는 제한되는 것은 아니지만 공지된 시판되는 재조합적으로 생성된 항체를 포함한다는 것이 주목되어야 한다.

본 명세서에서 사용된바, 용어 "적어도 하나"는 "하나 이상"과 동등하다.

본 명세서에서 사용된바, "변이체 폴리펩타이드", "폴리펩타이드 변이체" 또는 "변이체"는 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모 폴리펩타이드 서열의 것과 다른 폴리펩타이드 서열을 의미한다.

변이체는 Fc 변이체, Fc 폴리펩타이드 변이체, 단백질 변이체, 항체 변이체, 면역글로불린 변이체, IgG 변이체를 언급할 수 있고, 이 목록은 제한적이지 않다.

본 명세서에서 사용된바 "면역글로불린 변이체" 또는 "변이체 면역글로불린"은 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모 면역글로불린 서열의 것과 다른 면역글로불린 서열을 의미한다. 모 폴리펩타이드는 천연적으로 존재하는 또는 야생형(WT) 폴리펩타이드일 수 있거나, WT 폴리펩타이드의 변형된 버젼일 수 있다.

관심의 대상인 모 폴리펩타이드는 상기 정의된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드이다. 바람직하게는, 본 발명의 변이체는 Fc 영역에서 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모 폴리펩타이드 서열의 것과 다른 폴리펩타이드 서열을 갖는다. 결과적으로, 관심의 대상인 변이체는 Fc 변이체를 포함한다.

따라서, 본 명세서에서 사용된바 "Fc 변이체" 또는 "변이체 Fc"는 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모 Fc 서열의 것과 다른 Fc 서열을 의미한다. Fc 변이체는 단리된 Fc 영역 및 그의 단편들일 수 있거나, 항체, Fc 융합물, 및 그들의 단편의 환경으로 존재할 수 있고, 이 목록은 제한적이지 않다.

본 명세서에서 사용된바, "단백질 변이체" 또는 "변이체 단백질"은 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모 단백질과 다른 단백질을 의미한다. 본 명세서에서 사용된바 "항체 변이체" 또는 "변이체 항체"는 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모 항체와 다른 항체를 의미한다. 본 명세서에서 사용된바 "IgG 변이체" 또는 "변이체 IgG"는 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모 IgG와 다른 항체를 의미한다. 바람직하게는, 변이체는 모 폴리펩타이드에 비교해서 적어도 하나의 아미노산 변형, 예를 들어, 약 1 내지 약 45개의 아미노산 변형, 바람직하게는 약 1 내지 약 20개의 아미노산 변형, 및, 보다 바람직하게는 약 1 내지 약 10개의 아미노산 변형을 갖는다.

본 명세서에서, 변이체 서열은 바람직하게는 모 폴리펩타이드 서열과 적어도 약 80% 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 약 90%의 동일성을 소유할 것이다.

본 명세서에서 의도된바, 참조 폴리펩타이드와 적어도 약 90%의 아미노산 동일성을 갖는 결정된 폴리펩타이드는 상기 참조 폴리펩타이드와 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 아미노산 동일성을 갖는다.

두 개의 아미노산 서열의 동일성 퍼센트를 결정하기 위하여, 서열들을 최적의 비교 목적으로 배열한다. 예를 들어, 갭(gaps)을 최적의 배열을 위해 제 1 및 제 2 아미노산 서열의 하나 또는 두 개에 도입할 수 있고, 비상동성 서열을 비교 목적으로 무시할 수 있다. 최적의 비교 목적으로, 두 개 아미노산 서열들의 동일성 퍼센트는 다음 파라미터들을 갖는 CLUSTAL W(버젼 1.82)로 얻을 수 있다: (1) CPU MODE = ClustalW mp ; (2) ALIGNMENT = ≪ 완전(full) ≫ ; (3) OUTPUT FORMAT = ≪ aln w/numbers ≫ ; (4) OUTPUT ORDER = ≪ 배열된(aligned) ≫ ; (5) COLOR 배열(ALIGNMENT) = ≪ 없음 ≫ ; (6) KTUP (단어 크기) = ≪ 기정(default) ≫ ; (7) WINDOW LENGTH = ≪ 기정(default) ≫ ; (8) SCORE TYPE = ≪ 퍼센트 ≫ ; (9) TOPDIAG = ≪ 기정 ≫ ; (10) PAIRGAP = ≪ 기정 ≫ ; (11) 계통 발생의 트리/트리 타입(PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE) = ≪ 없음 ≫ ; (12) MATRIX = ≪ 기정 ≫ ; (13) GAP OPEN = ≪ 기정 ≫ ; (14) END GAPS = ≪ 기정 ≫ ; (15) GAP EXTENSION = ≪ 기정 ≫ ; (16) GAP DISTANCES = ≪ 기정 ≫ ; (17) 트리 타입(TREE TYPE) = ≪ cladogram ≫ et (18) TREE GRAP DISTANCES = ≪ hide ≫.

본 명세서에서 "야생형 또는 WT"는 대립형질(allelic) 변이를 포함하는 자연에서 발견되는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. WT 단백질, 폴리펩타이드, 항체, 면역글로불린, IgG등은 의도적으로 변형되지 않은 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.

본 명세서에서 사용된바 "FcRn" 또는 신생아 Fc 수용체"는 IgG 항체 Fc 영역과 결합하는 단백질을 의미하고 적어도 부분적으로 FCRN 유전자로 인코딩된다. FcRn은 제한되는 것은 아니지만 인간, 마우스, 래트, 토끼, 및 원숭이를 포함하는 어느 유기체로부터 유래될 수 있다. 본 분야에 알려진 바와 같이, 기능적 FcRn은 종종 중쇄 및 경쇄로 언급되는 두 개의 폴리펩타이드를 포함한다. 경쇄는 베타-2-마이크로글로불린이고, 중쇄는 FCRN 유전자에 의해 인코딩된다. 본 명세서에서 달리 언급되지 않으면, FcRn 또는 FcRn 단백질은 α-쇄와 베타-2-마이크로글로불린의 복합체를 언급한다. 인간에서 FcRn을 코딩하는 유전자는 FCGRT라고 업급한다.

본 명세서에서 사용된바 "증가된 FcRn 결합"은 모 폴리펩타이드에 비교하여 생체내 또는 시험관 내에서 FcRn에 대한 본 발명의 변이체의 결합 친화력에서의 증가를 의미한다. FcRn에 결합하는 폴리펩타이드 변이체의 능력은 시험관 내에서 ELISA(실시예 1 파트 IV.1.a) 또는 SPR 기법(실시예 1 파트 IV.1.b)에 평가될 수 있다. FcRn에 대해 향상된 결합 성질을 갖는 변이체는 종종 생체 내에서 향상된 혈청 보유(retention) 및, 따라서 증가된 반감기를 갖는다.

생체 내에서 Fc 영역의 보유(retention)를 증가시키기 위하여 FcRn에 대한 결합 친화력의 증가가 pH 6 주위에서 일어나며, pH 7.4 주위에서 낮은 친화력을 유지하여야 한다.

조사에 따른 것이라고 할지라도, pH 6에서 FcRn에 대한 결합이 Fc 영역의 엔도좀으로의 분리를 허용하기 때문에(본 발명에 전체로 참초를 위하여 포함되는 Ghetie and Ward, 1997 Immunol Today. 18(12):592-598), Fc 영역이 생체 내에서 보다 긴 반감기를 갖는다고 믿어진다. 이어서, 엔도좀 구획(compartment)이 Fc 영역을 세포 표면으로 재순환시킨다. 일단 상기 구획이 세포외 표면으로 개방되면, 보다 높은 pH, 거의 7.4는 Fc 영역의 혈액에로의 방출을 유도한다. 그러므로, 생체내에서 Fc 영역의 반감기를 증가시킬 Fc 영역에서의 아미노산 변형은 이상적으로, 보다 높은 pH에서는 Fc 영역의 방출을 여전히 허용하면서, 낮은 pH에서는 FcRn 결합을 증가시킬 것이다.

본 명세서에서 사용된바, 용어 "생체 내 반감기"는 소정의 동물의 순환(circulation)에서 관심이 있는 폴리펩타이드의 생물학적 반감기를 언급하고, 동물의 순환에 존재하는 양의 반이 동물에서 순환 및/또는 다른 조직에서 제거되는데 요구되는 시간에 의해 나타내진다.

본 발명은 변형(modifications)이 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합 친화력을 증가시키는 Fc 영역에서의 아미노산 변형의 동정에 기초한다. 관심의 대상이 되는 아미노산 변형은 임의의 돌연변이 유발에 의해 두개의 Fc 변이체 라이브러리를 생성하고, FcRn에 대한 상기 변이체의 결합 성질을 측정하여 결정해 왔다.

따라서, 본 발명은 상기 모 폴리펩타이드에 비해 FcRn에 대해 증가된 결합을 나타내는 Fc 영역을 포함하는 모 폴리펩타이드의 변이체에 관련된 것이다.

본 발명의 모 폴리펩타이드는 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드이다. 상기 폴리펩타이드는 단일 폴리펩타이드 쇄 또는 공유적으로 함께 결합되지 않은 수개의 폴리펩타이드 쇄들을 포함할 수 있다. 모 폴리펩타이드는, 제한되는 것은 아니지만, 항체, Fc 융합 단백질, Fc 콘쥬게이트, Fc 유도된 폴리펩타이드, 분리된 Fc 및 그의 단편을 포함한다. 결과적으로, 상기 모 폴리펩타이드는 천연적으로 존재하는 폴리펩타이드, 천연적으로 존재하는 폴리펩타이드의 변이체, 천연적으로 존재하는 폴리펩타이드의 처리된 버젼, 합성 폴리펩타이드 또는 비-단백질성 단편을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. 천연적으로 존재하는 폴리펩타이드의 처리된 버젼은 천연적으로 존재하는 유전자에 의해 인코딩되지 않는 폴리펩타이드이다. 예를 들어, 처리된 폴리펩타이드는 키메라 항체 또는 인간화된 항체일 수 있다.

모 폴리펩타이드의 Fc 영역은 바람직하게는 IgG의 야생형 Fc 영역, 단편 및 그들의 돌연변이체로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 여기에서, IgG의 Fc 영역은 "보다 낮은 힌지"-CH2-CH3 도메인(IgG 경우, CH2 및 CH3는 또한 Cγ2 및 Cγ3 라고 불린다)에 대해 상응한다. 야생형 인간 IgG1의 "보다 낮은 힌지"-CH2-CH3 도메인의 서열은 SEQ ID NO:1의 서열이다. 인간 IgG1의 상황에서, Kabat에서와 같은 EU 인덱스에 따라, 보다 낮은 힌지는 위치 226-236을 언급하고, CH2 도메인은 위치 237-340을 언급하며, CH3 도메인은 위치 341-447을 언급한다. 다른 IgG 서브클래스 경우의 유사 도메인은 인간 IgG의 것과 함께 상기 IgG 서브클래스의 중쇄 또는 중쇄 단편의 아미노산 서열 배열로부터 결정될 수 있다.

Fc 영역의 단편은 야생형 Fc 영역, 바람직하게는 야생형 IgG의 "보다 낮은 힌지-CH2-CH3" 도메인으로부터 유도된 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드로 정의된다. 상기 단편은 실시예 1 파트 IV.1.에 기술된 SPR 분석에 따라 1 마이크로M보다 낮은 FcRn에 대한 분리 상수를 갖는다.

상기 언급된 바와 같이, 모 폴레펩타이드는 야생형, Fc 돌연변이체, 즉 첨가, 삽입 및/또는 치환과 같은 기존 아미노산 변형을 이미 포함하는 Fc 영역을 포함할 수 있다. 단 상기 Fc 돌연변이체는 FcRn 에 대해 실시예 1 파트 IV.1.에 기술된 SPR 분석에 따라 1 마이크로M보다 낮은 분리상수를 갖고, 야생형 Fc 영역이 아니다.

본 명세서에서 사용된바, "변이체 폴리펩타이드" 또는 "변이체"는 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모 폴리펩타이드의 것과 다른 폴리펩타이드 서열을 의미한다.

본 발명에 따른 변이체 폴리펩타이드는 상응하는 모 폴리펩타이드에 비해 FcRn에 결합이 증가됨을 나타낸다. 달리 말하면, FcRn에 대해 변이체의 친화력이 모 폴리펩타이드의것보다 높다. 이러한 변이체는 본 발명에 따라 최적화된 변이체이다.

FcRn에 대한 상기 폴리펩타이드의 친화력은 선행기술의 잘-알려진 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 본 분야에 숙련된 자는 본 출원의 실시예 1 파트 IV.1.b에 예시된 바와 같은 표면 플라즈몬 공명(SPR) 실험을 사용하여 분리 상수(Kd)를 결정할 수 있다. 변이체가 그의 상응하는 모의 것보다 1.1-배 낮은 Kd를 갖는다면, 상기 변이체는 본 발명에 따라 최적화된 변이체이다.

대안으로서, 본 분야에 숙련된 자는 적절한 ELISA 분석을 수행할 수 있다. 적절한 ELISA 분석은 실시예 1에 예시된 바와 같이 FcRn에 대한 변이체의 결합 강도와 모의 것을 비교할 수 있게 한다. 변이체 및 모 폴리펩타이드 경우 검출된 특이적 신호를 비교한다. 변이체는 특이적 신호가 모 폴리펩타이드의 것보다 적어도 1.2배, 보다 바람직하게는 적어도 3.2 배 강한 경우, 본 발명의 최적화된 변이체이다(즉, 이중 아미노산 변형 T250Q/M428L을 갖는 Fc 변이체만큼 적어도 같은).

적절한 ELISA 분석은 본 출원의 실시예 1에 예시되어 있다. 결합 친화력은 전장 폴리펩타이드(실시예 2 파트 Ⅲ 참조)를 평가하여 또는 그의 단리된 Fc 영역을 평가하여(실시예 1 파트 Ⅳ 참조) 차별 없이 결정될 수 있다.

본 발명에 따르면, 관심의 대상이 되는 폴리펩타이드 변이체는 모 폴리펩타이드와 비교해서 그의 Fc 영역에 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다. 아미노산 변형은 아미노산 삽입, 결실 및 치환으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.

본 출원인은 모 폴리펩타이드에 비교해서 FcRn에 증가된 결합을 갖는 폴리펩타이드 변이체를 얻기 위하여, 적어도 하나의 아미노산 변형이 상기 모 폴리펩타이드에 비교해서 Fc 영역의 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315,317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 및 447로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 위치에 도입되어야 한다는 것을 보여줬다. 여기에서, Fc 영역의 아미노산의 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이다.

여기에서, "Kabat에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 언급한다. 예를 들어, 다른 Fc 영역 경우의 유사 위치는 SEQ ID NO:1을 포함하는 인간 IgG1 중쇄 단편과 상기 Fc 영역의 아미노산 배열로부터 결정될 수 있다. 예시적 목적으로, 도 6은 "보다 낮은 힌지-CH2-CH3" 도메인을 포함하는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 중쇄 단편의 서열 배열을 묘사한다.

본 명세서에서 사용된바, "적어도 하나의 아미노산 변형"은 하나 이상의 변형을 의미한다. Fc 영역에 20개 넘게 아미노산의 변형의 도입은 그의 생물학적 활성을 극적으로 손상시킬 수 있다는 것이 고려된다. 따라서, 폴리펩타이드 변이체는 상기 인용된 목록으로부터 선택된 위치에서 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산 변형을 갖는다. 본 명세서에서 사용된, "1 내지 20개의 아미노산 변형"은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20개의 아미노산 변형을 포함한다. 상기 폴리펩타이드 변이체 서열은 바람직하게는 그의 모 폴리펩타이드 서열과 적어도 약 90%의 동일성을 갖는다.

본 명세서에서 의도된 것처럼, 참조 폴리펩타이드와 적어도 약 90%의 아미노산 동일성을 갖는 것으로 결정된 폴리펩타이드는 상기 참조 폴리펩타이드와 적어도 약 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5%의 아미노산 동일성을 갖는다.

FcRn에 대해 가장 높은 결합 친화력을 나타내는 본 발명의 Fc 변이체는 일반적으로 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 실시예 Ⅱ에 기술된 파지 ELISA 분석으로부터 얻어진 결과는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 최적화된 변이체는 야생형 Fc보다 약 3.2배 내지 30배 강한 특이적 신호를 가질 수 있고, 반면에, 단일 점 아미노산 변형(표 1 참조)을 갖는 변이체는 야생형 Fc보다 약 1.2 배 내지 3.5배 강한 신호를 가질 수 있음을 보여준다. 표 3에 예시된 바와 같이, 최적화된 변이체의 신호는 이중 아미노산 변형 T250Q/M428L을 갖는 Fc 변이체를 언급하는 Fc-H의 것보다 약 1배 내지 10배 강할 수 있다.

따라서, 특정 실시 형태에서, 상기 변이체는 상기 모 폴리펩타이드와 비교해서 Fc 영역의 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315,317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 및 447로 구성되는 목록으로부터 선택된 적어도 두 개의 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 Fc 영역의 아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이다.

본 출원의 표 5에서 기술되는 바와 같이, FcRn에 대해 가장 높은 친화력을 나타내는 Fc 변이체는 3 내지 6개의 아미노산 변형을 가질 수 있다.

따라서, 추가의 구현예에서, 본 발명의 변이체 폴리펩타이드는 상기 모 폴리펩타이드와 비교해서 Fc 영역의 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315,317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 및 447로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 위치에서 3 내지 6개의 아미노산 변형을 포함할 수 있고, 여기서 Fc 영역의 아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이다.

아미노산 변형은 바람직하게는 결실 및 치환으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.

상기 목록의 일부 아미노산 위치-즉 226, 230, 241, 264, 307, 315, 330, 342, 362, 378, 382, 389, 396, 397, 421 및 434가 중요한 위치들이다. 달리 말하면, FcRn에 대해 높은 결합 친화력을 나타내는 Fc 변이체는 상기 아미노산 위치들에서 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 것이 좋다.

특정 실시 형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 변이체는 모 폴리펩타이드와 비교해서 Fc 영역의 226, 230, 241, 264, 307, 315, 330, 342, 362, 378, 382, 389, 396, 397, 421 및 434로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 위치에서 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이다.

상기 중요 위치들 중 FcRn에 대해 가장 강한 결합을 보이는 Fc 변이체의 서열화는 아미노산 위치 230, 264, 307, 315, 330, 378 및 434가 가장 종종 돌연변이되는 위치라는 것을 보여줬다. 따라서, 또 다른 실시 형태에서, 적어도 하나의 변형은 모 폴리펩타이드와 비교해서 Fc 영역의 230, 264, 307, 315, 330, 378 및 434로 구성되는 그룹, 보다 바람직하게는 264, 315, 378 및 434로 구성되는 그룹으로부터 선택된 한 위치에서 일어나고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이다.

상기 언급된 바와 같이, 적어도 두 개의 아미노산 변형의 도입은 Fc 모에 비해 FcRn에 대해 Fc 변이체의 결합 친화력을 주목할만하게 향상시킬 수 있다.

따라서, 대안적인 실시 형태에서, 폴리펩타이드 변이체는 적어도 두 개의 아미노산 변형을 포함하고, 상기 적어도 두 개의 아미노산 변형은 모폴리펩타이드와 비교해서 Fc 영역의

(i) 226, 230, 241, 264, 307, 315, 330, 342, 362, 378, 382, 389, 396, 397, 421, 및 434로 구성되는 그룹으로부터 선택된 한 아미노산 위치에서의 하나의 변형; 및

(ii) 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315, 317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 및 447로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미노산 위치에서 적어도 하나의 변형을 포함하고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이며, 단 변형(i)은 변형(ii)에서와 같은 아미노산 위치에서 일어나지 않는다.

예를 들어, 상기 단서에 따르면, 아미노산 변형(i)이 위치 434에서 일어난다면, 적어도 하나의 아미노산 변형(ii)이 위치 434 이외의 (ii)에 언급된 목록의 어느 위치에서 일어날 수 있다.

또 다른 실시 형태에서, 폴리펩타이드 변이체는 적어도 두 개의 아미노산 변형을 포함하고, 상기 적어도 두개의 아미노산 변형은 Fc 영역에서의

(i) 264, 315, 378 및 434로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미노산 위치에서의 하나의 변형; 및

(ii) 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315,317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 및 447로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 위치에서 적어도 하나의 변형을 포함하고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이며, 단 변형(i)은 변형(ii)에서와 같은 아미노산 위치에서 일어나지 않는다.

추가의 실시 형태에서, 상기 변이체는 적어도 두 개의 아미노산 변형을 포함하고, 상기 적어도 두 개의 아미노산 변형은 Fc 영역에서의

(i) 264, 315, 378 및 434로 구성되는 그룹으로부터 선택된 위치에서의 하나의 아미노산 변형; 및

(ii) 226, 230, 241, 264, 307, 315, 330, 342, 362, 378, 382, 389, 396, 397, 421 및 434로 구성되는 그룹으로부터 선택된 위치에서의 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이며, 단 변형(i)은 변형(ii)에서와 같은 아미노산 위치에서 일어나지 않는다.

또 다른 추가의 실시 형태에서, 상기 변이체는 Fc 영역의

(i) 378 및 434로 구성되는 그룹으로부터 선택된 위치에서의 하나의 아미노산 변형; 및

(ii) 226, 230, 241, 264, 307, 315, 330, 342, 362, 378, 382, 389, 396, 397, 421 및 434로 구성되는 그룹으로부터 선택된 위치에서의 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 적어도 두 개의 아미노산 변형을 포함하고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이며, 단 변형(i)은 변형(ii)에서와 같은 아미노산 위치에서 일어나지 않는다.

대안적인 실시 형태에서, 폴리펩타이드 변이체는 그의 Fc 영역에서 적어도 세 개의 아미노산 변형을 포함한다. 따라서, 상기 적어도 세 개의 아미노산 변형은 모 폴리펩타이드와 비교해서 Fc 영역의

(i) 226, 230, 241, 264, 307, 315, 330, 342, 362, 378, 382, 389, 396, 397, 421 및 434로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 두개의 아미노산 위치에서의 두개의 변형; 및

(ii) 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315, 317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 및 447로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 위치에서의 적어도 하나의 변형을 포함할 수 있고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이며, 단 변형(i)은 변형(ii)에서와 같은 아미노산 위치에서 일어나지 않는다.

대안적인 구현예에서, 폴리펩타이드 변이체는 적어도 세 개의 아미노산 변형을 포함하고, 상기 적어도 세 개의 아미노산 변형은 Fc 영역의

(i) 264, 315, 378 및 434로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 위치에서의 하나의 변형;

(ii) 226, 230, 241, 264, 307, 315, 330, 342, 362, 378, 382, 389, 396, 397, 421 및 434로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 위치에서 하나의 변형; 및

(iii) 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315,317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 및 447로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 위치에서의 적어도 하나의 변형을 포함하고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이며, 단 변형(i), 변형(ii) 및 변형(iii)은 같은 아미노산 위치에서 동시에 일어나지 않는다.

다른 실시 형태에서, 폴리펩타이드 변이체는 적어도 세 개의 아미노산 변형을 포함하고, 상기 적어도 세 개의 아미노산 변형은 Fc 영역의

(i) 378 및 434로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 위치에서의 하나의 변형;

(ii) 226, 230, 241, 264, 307, 315, 330, 342, 362, 378, 382, 389, 396, 397, 421 및 434의 그룹으로부터 선택된 아미노산 위치에서 하나의 변형; 및

(iii) 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315,317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 및 447로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 위치에서 적어도 하나의 변형을 포함하고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이며, 단 변형(i), 변형(ii) 및 변형(iii)은 같은 아미노산 위치에서 동시에 일어나지 않는다.

본 발명의 전술된 모든 실시 형태에서, 아미노산 변형은 바람직하게는 아미노산 치환 및 결실로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 추가의 목적은 상기 모 포리펩타이드에 비해 FcRn에 증가된 결합을 나타내는 Fc 영역을 포함하는 모 폴레펩타이드의 변이체에 관한 것이고, 모 폴리펩타이드에 비해 Fc 영역의 226G, 226Y, 227S, 227L, 228R, 228L, 230S, 230T, 230L, 230A, 230Q, 231T, 231V, 233D, 234R, 239A, 241L, 241Y, 241R, 243L, 246R, 250A, 252L, 256N, 259I, 264A, 264E, 264M, 265G, 265N, 267N, 267R, 269D, 269G, 270N, 270E, 276S, 284L, 285Y, 288R, 289I, 290R, 290E, 291S, 291Q, 292W, 294del, 297D, 298G, 298N, 299M, 299A, 299K, 301C, 302A, 303A, 303I, 305A, 307P, 307A, 307N, 308I, 309P, 311R, 315D, 317R, 320T, 320E, 322R, 325S, 327V, 327T, 330V, 330T, 332V, 334E, 334R, 335A, 338R, 340E, 342R, 342E, 342K, 343S, 345Q, 345G, 347R, 350A, 352S, 354P, 355Q, 355G, 356N, 359A, 360N, 360R, 361D, 361S, 362R, 362E, 369A, 370R, 371D, 375A, 375G, 378V, 378T, 378S, 380Q, 382V, 382G, 383R, 383N, 384I, 384T, 385R, 386R, 386K, 387S, 387T, 389T, 389K, 389R, 390S, 392E, 392R, 393N, 394A, 395A, 395S, 396S, 396L, 397A, 397M, 398P, 399N, 400P, 401A, 401G, 403T, 404L, 408T, 411A, 412A, 414R, 415D, 415N, 416K, 416G, 418R, 418K, 418E, 419H, 420R, 421T, 421S, 421D, 422A, 424L, 426T, 428L, 433R, 433P, 434Y, 434S, 434H, 438R, 439R, 440R, 440N, 443R, 444F, 444P, 445S, 446A, 447E 및 447N으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 Fc 영역에서 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이다.

대안적인 실시 형태에서, 상기 폴리펩타이드는 모 폴리펩타이드에 비해서 Fc 영역의 226G, 227L, 230S, 230T, 230L, 231T, 241L, 243L, 250A, 256N, 259I, 264E, 265G, 267R, 290E, 294del, 303A, 305A, 307P, 307A, 308I, 315D, 322R, 325S, 327V, 330V, 342R, 347R, 352S, 361D, 362R, 362E, 370R, 378V, 378T, 382V, 383N, 386R, 386K, 387T, 389T, 389K, 392R, 395A, 396L, 397M, 403T, 404L, 415N, 416K, 421T, 426T, 428L, 433R, 434Y, 434S 및 439R로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 변형을 포함하고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이다.

바람직하게는, 상기 변이체는 모 폴리펩타이드에 비해 상기 목록으로 선택된 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산 변형을 갖는다. 본 명세서에서 사용된바, "1 내지 20개의 변형"은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20개의 변형을 의미한다.

일부 실시 형태에서, 상기 변이체는 모 폴리펩타이드와 비교해서 Fc 영역의 226G, 226Y, 227S, 227L, 228R, 228L, 230S, 230T, 230L, 230A, 230Q, 231T, 231V, 233D, 234R, 239A, 241L, 241Y, 241R, 243L, 246R, 250A, 252L, 256N, 259I, 264A, 264E, 264M, 265G, 265N, 267N, 267R, 269D, 269G, 270N, 270E, 276S, 284L, 285Y, 288R, 289I, 290R, 290E, 291S, 291Q, 292W, 294del, 297D, 298G, 298N, 299M, 299A, 299K, 301C, 302A, 303A, 303I, 305A, 307P, 307A, 307N, 308I, 309P, 311R, 315D, 317R, 320T, 320E, 322R, 325S, 327V, 327T, 330V, 330T, 332V, 334E, 334R, 335A, 338R, 340E, 342R, 342E, 342K, 343S, 345Q, 345G, 347R, 350A, 352S, 354P, 355Q, 355G, 356N, 359A, 360N, 360R, 361D, 361S, 362R, 362E, 369A, 370R, 371D, 375A, 375G, 378V, 378T, 378S, 380Q, 382V, 382G, 383R, 383N, 384I, 384T, 385R, 386R, 386K, 387S, 387T, 389T, 389K, 389R, 390S, 392E, 392R, 393N, 394A, 395A, 395S, 396S, 396L, 397A, 397M, 398P, 399N, 400P, 401A, 401G, 403T, 404L, 408T, 411A, 412A, 414R, 415D, 415N, 416K, 416G, 418R, 418K, 418E, 419H, 420R, 421T, 421S, 421D, 422A, 424L, 426T, 428L, 433R, 433P, 434Y, 434S, 434H, 438R, 439R, 440R, 440N, 443R, 444F, 444P, 445S, 446A, 447E 및 447N으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 3 내지 6개의 아미노산 변형을 포함하고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이다.

대안적인 실시 형태에서, 상기 폴리펩타이드는 모 폴리펩타이드와 비교해서 Fc 영역의 226G, 227L, 230S, 230T, 230L, 231T, 241L, 243L, 250A, 256N, 259I, 264E, 265G, 267R, 290E, 294del, 303A, 305A, 307P, 307A, 308I, 315D, 322R, 325S, 327V, 330V, 342R, 347R, 352S, 361D, 362R, 362E, 370R, 378V, 378T, 382V, 383N, 386R, 386K, 387T, 389T, 389K, 392R, 395A, 396L, 397M, 403T, 404L, 415N, 416K, 421T, 426T, 428L, 433R, 434Y, 434S 및 439R로 구성되는 그룹으로부터 선택된 3 내지 6개의 아미노산 변형을 포함하고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이다.

상기 목록의 일부 아미노산 변형은 중요한(key) 변형이다. 달리 말하면, FcRn에 대해 높은 결합 친화력을 나타내는 Fc 변이체는 상기 중요한 변형들로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 것이 유망하다.

따라서, 상기 폴리펩타이드 변이체는 모 폴리펩타이드와 비교해서 Fc 영역의 226G, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 342R, 362R, 362E, 378V, 378T, 382V, 389T, 389K, 396L, 397M, 421T, 434Y 및 434S로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 변형을 포함할 수 있고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이다.

또 다른 실시 형태에서, 상기 폴리펩타이드 변이체는 상기 모 폴리펩타이드와 비교해서 Fc 영역의 264E, 315D, 378V, 378T, 434Y 및 434S로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이다.

추가의 실시 형태에서, 상기 폴리펩타이드 변이체는 상기 모 폴리펩타이드와 비교해서 Fc 영역의 378V, 378T, 434Y 및 434S로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이다.

상기 언급된 바와 같이, 적어도 두개의 아미노산 변형을 도입하는 것은 모 에 비해서 Fc 변이체의 FcRn에의 결합을 주목할만하게 향상시킨다. 상기 변형들의 적어도 하나는 중요한 변형들, 즉 226G, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 342R, 362R, 362E, 378V, 378T, 382V, 389T, 389K, 396L, 397M, 421T, 434Y 및 434S로 구성되는 그룹으로부터 선택될 수 있다.

대안적인 구현예에서, 상기 폴리펩타이드 변이체는 적어도 두 개의 아미노산 변형을 포함하고, 상기 적어도 두 개의 변이체는 모 폴리펩타이드와 비교해서 Fc 영역의

(i) 226G, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 342R, 362R, 362E, 378V, 378T, 382V, 389T, 389K, 396L, 397M, 421T, 434Y 및 434S로 구성되는 그룹으로부터 선택된 하나의 변형; 및

(ii) 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315,317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 및 447로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 위치에서 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산의 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이며, 단 변형(i)은 변형(ii)에서와 같은 아미노산 위치에서 일어나지 않는다.

추가의 실시 형태에서, 상기 변이체는 적어도 두 개의 변형을 포함하고, 상기 적어도 두 개의 변형은 Fc 영역의

(i) 378V, 378T, 434Y 및 434S로 구성되는 그룹으로부터 선택된 하나의 아미노산 변형; 및

(ii) 226, 230, 241, 264, 307, 315, 330, 342, 362, 378, 382, 389, 396, 397, 421 및 434로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 위치에서의 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산의 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이며, 단 변형(i)은 변형(ii)에서와 같은 아미노산 위치에서 일어나지 않는다.

또 다른 실시 형태에서, 상기 변이체는 적어도 두 개의 아미노산 변형을 포함하고, 상기 적어도 두 개의 변형은 Fc 영역의

(i) 378V, 378T, 434Y 및 434S로부터 선택된 하나의 아미노산 변형; 및

(ii) 226G, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 342R, 362R, 362E, 378V, 378T, 382V, 389T, 389K, 396L, 397M, 421T, 434Y 및 434S로부터, 보다 바람직하게는 226G, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 378V, 378T, 389T, 389K, 434Y 및 434S로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산의 넘버링은 Kabat에서의 EU 인덱스의 것이며, 단 변형(i)은 변형(ii)에서와 같은 아미노산 위치에서 일어나지 않는다.

따라서, 본 발명의 추가의 목적은 상기 모 폴리펩타이드와 비교해서 FcRn에 증가된 결합을 나타내고 Fc 영역에 적어도 한 조합의 아미노산 변형을 포함하는 Fc 영역을 포함하는 모 폴리펩타이드의 변이체에 관한 것이다.

적어도 한 조합의 변형은 Fc 영역의 226G/330V, 230L/264E, 230L/378V, 230S/315D, 230S/434Y, 230T/378V, 241L/434S, 250A/434Y, 264E/378T, 305A/315D, 305A/330V, 305A/434Y, 307P/434Y, 315D/389T, 330V/382V, 330V/389T, 378V/421T, 389K/434Y, 389T/434Y, 396L/434S, 230T/264E, 230T/315D, 230T/434S, 230T/434Y, 241L/307P, 264E/307P, 264E/396L, 315D/362R, 315D/382V, 362R/434Y, 378V/434Y, 382V/434Y, 226G/315D, 226G/434Y, 241L/378V, 307P/378V, 241L/264E, 378V/434S, 264E/378V, 264E/434S, 315D/330V, 330V/434Y 및 315D/434Y로 구성되는 그룹으로부터 선택되고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산의 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이다.

상기 변이체는 추가로 모 폴리펩타이드와 비교해서 Fc 영역의 226G, 226Y, 227S, 227L, 228R, 228L, 230S, 230T, 230L, 230A, 230Q, 231T, 231V, 233D, 234R, 239A, 241L, 241Y, 241R, 243L, 246R, 250A, 252L, 256N, 259I, 264A, 264E, 264M, 265G, 265N, 267N, 267R, 269D, 269G, 270N, 270E, 276S, 284L, 285Y, 288R, 289I, 290R, 290E, 291S, 291Q, 292W, 294del, 297D, 298G, 298N, 299M, 299A, 299K, 301C, 302A, 303A, 303I, 305A, 307P, 307A, 307N, 308I, 309P, 311R, 315D, 317R, 320T, 320E, 322R, 325S, 327V, 327T, 330V, 330T, 332V, 334E, 334R, 335A, 338R, 340E, 342R, 342E, 342K, 343S, 345Q, 345G, 347R, 350A, 352S, 354P, 355Q, 355G, 356N, 359A, 360N, 360R, 361D, 361S, 362R, 362E, 369A, 370R, 371D, 375A, 375G, 378V, 378T, 378S, 380Q, 382V, 382G, 383R, 383N, 384I, 384T, 385R, 386R, 386K, 387S, 387T, 389T, 389K, 389R, 390S, 392E, 392R, 393N, 394A, 395A, 395S, 396S, 396L, 397A, 397M, 398P, 399N, 400P, 401A, 401G, 403T, 404L, 408T, 411A, 412A, 414R, 415D, 415N, 416K, 416G, 418R, 418K, 418E, 419H, 420R, 421T, 421S, 421D, 422A, 424L, 426T, 428L, 433R, 433P, 434Y, 434S, 434H, 438R, 439R, 440R, 440N, 443R, 444F, 444P, 445S, 446A, 447E 및 447N의 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 변형을 포함할 수 있고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산의 넘버링은 Kabat에서 와 같은 EU 인덱스의 것이다.

또 다른 실시 형태에서, 본 발명에 따른 변이체는 모 폴리펩타이드와 비교해서 Fc 영역의

(i) 226G/330V, 230L/264E, 230L/378V, 230S/315D, 230S/434Y, 230T/378V, 241L/434S, 250A/434Y, 264E/378T, 305A/315D, 305A/330V, 305A/434Y, 307P/434Y, 315D/389T, 330V/382V, 330V/389T, 378V/421T, 389K/434Y, 389T/434Y, 396L/434S, 230T/264E, 230T/315D, 230T/434S, 230T/434Y, 241L/307P, 264E/307P, 264E/396L, 315D/362R, 315D/382V, 362R/434Y, 378V/434Y, 382V/434Y, 226G/315D, 226G/434Y, 241L/378V, 307P/378V, 241L/264E, 378V/434S, 264E/378V, 264E/434S, 315D/330V, 330V/434Y, 및 315D/434Y로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 한 조합의 아미노산 변형; 및

(ii) 226G, 227L, 228L, 228R 230S, 230T, 230L, 231T, 241L, 243L, 250A, 256N, 259I, 264E, 265G, 267R, 290E, 294del, 303A, 305A, 307P, 307A, 308I, 315D, 322R, 325S, 327V, 330V, 342R, 347R, 352S, 361D, 362R, 362E, 370R, 378V, 378T, 382V, 383N, 386R, 386K, 387T, 389T, 389K, 392R, 395A, 396L, 397M, 403T, 404L, 415N, 416K, 421T, 426T, 428L, 433R, 434Y, 434S 및 439R로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산의 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이며, 단 변형(i)은 변형(ii)에서와 같은 아미노산 위치에서 일어나지 않는다.

다른 실시 형태에서, 상기 변이체는 Fc 영역의 250A/434Y, 307P/434Y, 230T/434S, 264E/396L, 378V/434Y, 378V/434S, 264E/378V, 264E/434S, 315D/330V, 및 315D/434Y로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 변형의 적어도 하나의 조합을 포함하고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산의 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이다.

상기 변이체는 모 폴리펩타이드에 비교해서 Fc 영역의 226G, 226Y, 227S, 227L, 228R, 228L, 230S, 230T, 230L, 230A, 230Q, 231T, 231V, 233D, 234R, 239A, 241L, 241Y, 241R, 243L, 246R, 250A, 252L, 256N, 259I, 264A, 264E, 264M, 265G, 265N, 267N, 267R, 269D, 269G, 270N, 270E, 276S, 284L, 285Y, 288R, 289I, 290R, 290E, 291S, 291Q, 292W, 294del, 297D, 298G, 298N, 299M, 299A, 299K, 301C, 302A, 303A, 303I, 305A, 307P, 307A, 307N, 308I, 309P, 311R, 315D, 317R, 320T, 320E, 322R, 325S, 327V, 327T, 330V, 330T, 332V, 334E, 334R, 335A, 338R, 340E, 342R, 342E, 342K, 343S, 345Q, 345G, 347R, 350A, 352S, 354P, 355Q, 355G, 356N, 359A, 360N, 360R, 361D, 361S, 362R, 362E, 369A, 370R, 371D, 375A, 375G, 378V, 378T, 378S, 380Q, 382V, 382G, 383R, 383N, 384I, 384T, 385R, 386R, 386K, 387S, 387T, 389T, 389K, 389R, 390S, 392E, 392R, 393N, 394A, 395A, 395S, 396S, 396L, 397A, 397M, 398P, 399N, 400P, 401A, 401G, 403T, 404L, 408T, 411A, 412A, 414R, 415D, 415N, 416K, 416G, 418R, 418K, 418E, 419H, 420R, 421T, 421S, 421D, 422A, 424L, 426T, 428L, 433R, 433P, 434Y, 434S, 434H, 438R, 439R, 440R, 440N, 443R, 444F, 444P, 445S, 446A, 447E 및 447N의 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 변형을 추가로 포함할 수 있고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산의 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이다.

(i) 250A/434Y, 307P/434Y, 230T/434S, 264E/396L, 378V/434Y, 378V/434S, 264E/378V, 264E/434S, 315D/330V, 및 315D/434Y로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 변형의 적어도 하나의 조합; 및

(ii) 226G, 227L, 228L, 228R, 230S, 230T, 230L, 231T, 241L, 243L, 250A, 256N, 259I, 264E, 265G, 267R, 290E, 294del, 303A, 305A, 307P, 307A, 308I, 315D, 322R, 325S, 327V, 330V, 342R, 347R, 352S, 361D, 362R, 362E, 370R, 378V, 378T, 382V, 383N, 386R, 386K, 387T, 389T, 389K, 392R, 395A, 396L, 397M, 403T, 404L, 415N, 416K, 421T, 426T, 428L, 433R, 434Y, 434S 및 439R로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산의 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이며, 단 변형(i)은 변형(ii)에서와 같은 아미노산 위치에서 일어나지 않는다.

일부 실시 형태에서, 상기 변이체는 Fc 영역의 226G/315D/330V, 226G/315D/434Y, 226G/330V/434Y, 230L/264E/378V, 230T/264E/378V, 230T/264E/434S, 230S/315D/434Y, 230T/315D/434Y, 230T/389T/434S, 241L/264E/434S, 241L/264E/378V, 241L/264E/307P, 241L/307P/378V, 250A/389K/434Y, 256N/378V/434Y, 259I/315D/434Y 264E/378T/396L, 264E/378V/416K, 294del/307P/434Y, 264E/307P/378V, 264E/396L/434S, 264E/378V/434S, 305A/315D/330V, 305A/315D/434Y, 305A/330V/434Y, 307P/378V/434Y, 315D/330V/382V, 315D/330V/389T, 315D/378V/434Y, 315D/389T/434Y, 315D/362R/434Y, 315D/382V/434Y, 315D/330V/434Y 330V/382V/434Y, 330V/389T/434Y, 및 378V/383N/434Y로 구성되는 그룹으로부터 선택된 변형의 적어도 하나의 아미노산 조합을 포함하고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산의 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이다.

상기 변이체는 모 폴리펩타이드와 비교해서 Fc영역의 226G, 226Y, 227S, 227L, 228R, 228L, 230S, 230T, 230L, 230A, 230Q, 231T, 231V, 233D, 234R, 239A, 241L, 241Y, 241R, 243L, 246R, 250A, 252L, 256N, 259I, 264A, 264E, 264M, 265G, 265N, 267N, 267R, 269D, 269G, 270N, 270E, 276S, 284L, 285Y, 288R, 289I, 290R, 290E, 291S, 291Q, 292W, 294del, 297D, 298G, 298N, 299M, 299A, 299K, 301C, 302A, 303A, 303I, 305A, 307P, 307A, 307N, 308I, 309P, 311R, 315D, 317R, 320T, 320E, 322R, 325S, 327V, 327T, 330V, 330T, 332V, 334E, 334R, 335A, 338R, 340E, 342R, 342E, 342K, 343S, 345Q, 345G, 347R, 350A, 352S, 354P, 355Q, 355G, 356N, 359A, 360N, 360R, 361D, 361S, 362R, 362E, 369A, 370R, 371D, 375A, 375G, 378V, 378T, 378S, 380Q, 382V, 382G, 383R, 383N, 384I, 384T, 385R, 386R, 386K, 387S, 387T, 389T, 389K, 389R, 390S, 392E, 392R, 393N, 394A, 395A, 395S, 396S, 396L, 397A, 397M, 398P, 399N, 400P, 401A, 401G, 403T, 404L, 408T, 411A, 412A, 414R, 415D, 415N, 416K, 416G, 418R, 418K, 418E, 419H, 420R, 421T, 421S, 421D, 422A, 424L, 426T, 428L, 433R, 433P, 434Y, 434S, 434H, 438R, 439R, 440R, 440N, 443R, 444F, 444P, 445S, 446A, 447E 및 447N으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 변형을 포함할 수 있고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산의 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이다.

(i) 226G/315D/330V, 226G/315D/434Y, 226G/330V/434Y, 230L/264E/378V, 230T/264E/378V, 230T/264E/434S, 230S/315D/434Y, 230T/315D/434Y, 230T/389T/434S, 241L/264E/434S, 241L/264E/378V, 241L/264E/307P, 241L/307P/378V, 250A/389K/434Y, 256N/378V/434Y, 259I/315D/434Y 264E/378T/396L, 264E/378V/416K, 294del/307P/434Y, 264E/307P/378V, 264E/396L/434S, 264E/378V/434S, 305A/315D/330V, 305A/315D/434Y, 305A/330V/434Y, 307P/378V/434Y, 315D/330V/382V, 315D/330V/389T, 315D/389T/434Y, 315D/362R/434Y, 315D/378V/434Y, 315D/382V/434Y, 315D/330V/434Y 330V/382V/434Y, 330V/389T/434Y, 및 378V/383N/434Y로 구성된느 그룹으로부터 선택된 아미노산 변형의 적어도 하나의 조합; 및

다른 실시 형태에서, 상기 변이체는 Fc 영역의 226G/315D/434Y, 230S/315D/434Y, 230T/315D/434Y, 230T/264E/434S, 230T/389T/434S, 241L/264E/378V, 241L/264E/434S, 250A/389K/434Y, 256N/378V/434Y, 259I/315D/434Y, 264E/378T/396L, 264E/378V/416K, 264E/378V/434S, 264E/396L/434S, 294del/307P/434Y, 307P/378V/434Y, 315D/330V/434Y, 315D/378V/434Y, 315D/382V/434Y 및 378V/383N/434Y로 구성되는 그룹으로부터 선택된 변형의 적어도 하나의 아미노산 조합을 포함하고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산의 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이다.

상기 변이체는 모 폴리펩타이드와 비교해서 Fc영역의 226G, 226Y, 227S, 227L, 228R, 228L, 230S, 230T, 230L, 230A, 230Q, 231T, 231V, 233D, 234R, 239A, 241L, 241Y, 241R, 243L, 246R, 250A, 252L, 256N, 259I, 264A, 264E, 264M, 265G, 265N, 267N, 267R, 269D, 269G, 270N, 270E, 276S, 284L, 285Y, 288R, 289I, 290R, 290E, 291S, 291Q, 292W, 294del, 297D, 298G, 298N, 299M, 299A, 299K, 301C, 302A, 303A, 303I, 305A, 307P, 307A, 307N, 308I, 309P, 311R, 315D, 317R, 320T, 320E, 322R, 325S, 327V, 327T, 330V, 330T, 332V, 334E, 334R, 335A, 338R, 340E, 342R, 342E, 342K, 343S, 345Q, 345G, 347R, 350A, 352S, 354P, 355Q, 355G, 356N, 359A, 360N, 360R, 361D, 361S, 362R, 362E, 369A, 370R, 371D, 375A, 375G, 378V, 378T, 378S, 380Q, 382V, 382G, 383R, 383N, 384I, 384T, 385R, 386R, 386K, 387S, 387T, 389T, 389K, 389R, 390S, 392E, 392R, 393N, 394A, 395A, 395S, 396S, 396L, 397A, 397M, 398P, 399N, 400P, 401A, 401G, 403T, 404L, 408T, 411A, 412A, 414R, 415D, 415N, 416K, 416G, 418R, 418K, 418E, 419H, 420R, 421T, 421S, 421D, 422A, 424L, 426T, 428L, 433R, 433P, 434Y, 434S, 434H, 438R, 439R, 440R, 440N, 443R, 444F, 444P, 445S, 446A, 447E 및 447N으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 변형을 추가로 포함할 수 있고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산의 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이다.

(i) 226G/315D/434Y, 230S/315D/434Y, 230T/315D/434Y, 230T/264E/434S, 230T/389T/434S, 241L/264E/378V, 241L/264E/434S, 250A/389K/434Y, 256N/378V/434Y, 259I/315D/434Y, 264E/378T/396L, 264E/378V/416K, 264E/378V/434S, 264E/396L/434S, 294del/307P/434Y, 307P/378V/434Y, 315D/330V/434Y, 315D/378V/434Y, 315D/382V/434Y 및 378V/383N/434Y로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 변형의 적어도 하나의 조합; 및

(ii) 226G, 227L, 228R, 228L, 230S, 230T, 230L, 231T, 241L, 243L, 250A, 256N, 259I, 264E, 265G, 267R, 290E, 294del, 303A, 305A, 307P, 307A, 308I, 315D, 322R, 325S, 327V, 330V, 342R, 347R, 352S, 361D, 362R, 362E, 370R, 378V, 378T, 382V, 383N, 386R, 386K, 387T, 389T, 389K, 392R, 395A, 396L, 397M, 403T, 404L, 415N, 416K, 421T, 426T, 428L, 433R, 434Y, 434S 및 439R로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하며, 여기에서, Fc 영역의 아미노산의 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이며, 단 변형(i)은 변형(ii)에서와 같은 아미노산 위치에서 일어나지 않는다.

상기 언급된 모든 구현예에서, 상기 변이체는 모 폴리펩타이드와 비교해서 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산 변형을 갖는다.

대안적인 실시 형태에서, 상기 변이체는 Fc 영역의 307A/315D/330V/382V/389T/434Y, 307A/315D/382V/389T/434Y, 256N/378V/383N/434Y, 256N/378V/434Y, 315D/330V/361D/378V/434Y, 315D/361D/378V/434Y, 259I/315D/434Y, 230S/315D/428L/434Y, 241L/264E/307P/378V/433R, 250A/389K/434Y, 305A/315D/330V/395A/434Y, 264E/386R/396L/434S/439R, 315D/330V/362R/434Y, 294del/307P/434Y, 305A/315D/330V/389K/434Y, 315D/327V/330V/397M/434Y, 230T/241L/264E/265G/378V/421T, 264E/396L/415N/434S, 227L/264E/378V/434S, 264E/378T/396L, 230T/315D/362R/426T/434Y, 226G/315D/330V/434Y, 230L/241L/243L/264E/307P/378V, 250A/315D/325S/330V/434Y, 290E/315D/342R/382V/434Y, 241L/315D/330V/392R/434Y, 241L/264E/307P/378V/434S, 230T/264E/403T/434S, 264E/378V/416K, 230T/315D/362E/434Y, 226G/315D/434Y, 226G/315D/362R/434Y, 226G/264E/347R/370R/378V/434S, 308I/315D/330V/382V/434Y, 230T/264E/378V/434S, 231T/241L/264E/378T/397M/434S, 230L/264E/378V/434S, 230T/315D/330V/386K/434Y, 226G/315D/330V/389T/434Y, 267R/307P/378V/421T/434Y, 230S/315D/387T/434Y, 230S/264E/352S/378V/434S 및 230T/303A/322R/389T/404L/434S로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 변형의 하나의 조합을 포함하고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산의 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이다.

다른 실시 형태에서, 상기 변이체는 256N/378V/434Y, 307A/315D/330V/382V/389T/434Y, 256N/378V/383N/434Y, 315D/330V/361D/378V/434Y, 259I/315D/434Y 및 230S/315D/428L/434Y로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 변형의 하나의 조합을 포함한다.

본 발명의 추가의 목적은 모 폴리펩타이드에 비교해서 FcRn에 대해 증가된 결합을 갖고, 307A/315D/330V/382V/389T/434Y, 307A/315D/382V/389T/434Y 256N/378V/383N/434Y, 315D/330V/361D/378V/434Y, 315D/361D/378V/434Y 259I/315D/434Y, 230S/315D/428L/434Y, 241L/264E/307P/378V/433R, 250A/389K/434Y, 256N/378V/434Y, 305A/315D/330V/395A/434Y, 264E/386R/396L/434S/439R, 315D/330V/362R/434Y, 294del/307P/434Y, 305A/315D/330V/389K/434Y, 315D/327V/330V/397M/434Y, 230T/241L/264E/265G/378V/421T, 264E/396L/415N/434S, 227L/264E/378V/434S, 264E/378T/396L, 230T/315D/362R/426T/434Y, 226G/315D/330V/434Y, 230L/241L/243L/264E/307P/378V, 250A/315D/325S/330V/434Y, 290E/315D/342R/382V/434Y, 241L/315D/330V/392R/434Y, 241L/264E/307P/378V/434S, 230T/264E/403T/434S, 264E/378V/416K, 230T/315D/362E/434Y, 226G/315D/434Y, 226G/315D/362R/434Y, 226G/264E/347R/370R/378V/434S, 308I/315D/330V/382V/434Y, 230T/264E/378V/434S, 231T/241L/264E/378T/397M/434S, 230L/264E/378V/434S, 230T/315D/330V/386K/434Y, 226G/315D/330V/389T/434Y, 267R/307P/378V/421T/434Y, 230S/315D/387T/434Y, 230S/264E/352S/378V/434S 및 230T/303A/322R/389T/404L/434S로 구성되는 그룹으로부터 선택된 Fc 변이체를 포함하고, 여기에서, Fc 영역의 아미노산의 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것인 폴리펩타이드 변이체를 제공하는 것이다. 일부 다른 실시 형태에서, 모 폴리펩타이드에 비해 FcRn에 대해 증가된 결합을 갖는 폴리펩타이드 변이체는 256N/378V/434Y, 307A/315D/330V/382V/389T/434Y, 256N/378V/383N/434Y, 315D/330V/361D/378V/434Y, 259I/315D/434Y 및 230S/315D/428L/434Y로 구성되는 그룹으로부터 선택된 Fc 변이체를 포함한다.

본 발명에 따른 상기 언급된 모든 변이체 경우, 모 폴리펩타이드의 Fc 영역은 야생형 IgG의 Fc 영역(예로, "보다 낮은 힌지-CH2-CH3") 및 그의 단편으로부터 유도될 수 있다. 보다 바람직한 구현예에서, 모 폴리펩타이드의 Fc영역은 인간 IgG 서브클레스, 즉 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 유도된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 모 폴리펩타이드의 Fc 영역은 야생형 IgG1 Fc 영역(SEQ ID:NO1), 야생형 IgG2 Fc 영역(SEQ ID:NO2), 야생형 IgG3 Fc 영역(SEQ ID:NO3) 및 야생형 IgG4 Fc 영역(SEQ ID:NO4)으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.

이 상황에서, 본 발명의 또 다른 목적은 IgG1 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드로서, 상기 IgG1 Fc 변이체가 IgG1 Fc의 야생형 서열(SEQ ID NO:1)과 비교해서 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 상기 IgG1 Fc 변이체의 서열이 SEQ ID NO;2, SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4가 아니라면, 야생형 IgG1에 비교해서 FcRn에 증가된 결합을 나타내는 IgG1 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드이다.

본 발명의 또 다른 목적은 IgG2 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드로서, 상기 IgG2 Fc 변이체가 IgG2 Fc의 야생형 서열(SEQ ID NO:2)과 비교해서 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 상기 IgG2 Fc 변이체의 서열이 SEQ ID NO;1, SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4가 아니라면, 야생형 IgG2에 비교해서 FcRn에 증가된 결합을 나타내는 IgG2 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드이다.

본 발명의 추가의 목적은 LgG3 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드로서, 상기 IgG3 Fc 변이체가 IgG3 Fc의 야생형 서열(SEQ ID NO:3)과 비교해서 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 상기 IgG3 Fc 변이체의 서열이 SEQ ID NO;1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:4가 아니라면, 야생형 IgG2에 비교해서 FcRn에 증가된 결합을 나타내는 IgG3 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드이다.

본 발명의 또 다른 목적은 IgG4 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드로서, 상기 IgG4 Fc 변이체가 IgG4 Fc의 야생형 서열(SEQ ID NO:4)과 비교해서 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 상기 IgG4 Fc 변이체의 서열이 SEQ ID NO;1, SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:2가 아니라면, 야생형 IgG4에 비교해서 FcRn에 증가된 결합을 나타내는 IgG4 Fc 변이체(SEQ IDNO:4)를 포함하는 폴리펩타이드이다.

바람직한 실시 형태에서, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 변이체 폴리펩타이드에 포함된 적어도 하나의 아미노산 변형은 Fc 영역을 포함하고, 상응하는 모 폴리펩타이드에 비교하여 FcRn에 대해 결합의 증가를 갖는 폴리펩타이드의 변이체를 일반적으로 정의할 때 본 명세서에서 상기 기술된 아미노산 변형 및 아미노산 변형의 조합의 그룹으로부터 선택된다.

상기 기술된 바와 같이, 본 발명에 따른 변이체는 상응하는 모 폴리펩타이드에 비교해서 FcRn에 대해 결합이 증가됨을 나타낸다. 일 실시 형태로서, 상기 변이체의 이펙터(effector) 기능 및 다른 결합 성질이 상응하는 모의 것과 유사하다. 상기 변이체는 특히 그의 모 폴리펩타이드에 비교하여 Fc-감마 수용체 또는 C1q에의 결합에서 어떤 중대한 변화를 나타낼 수 없다.

또 다른 실시 형태에서, 상기 변이체는 하나 이상의 변경된 이펙터 기능 및/또는 Fc 리간드(FcRn 이외)에의 결합과 조합된 FcRn에의 증가된 결합을 갖는다.

실시예 2 에 예시된 바와 같이, 본 발명의 변이체는 폴리펩타이드 변이체에 비교해서 FcγR, 특히 FcγRIIIa에의 비변경된 결합 , ADCC(항체-의존성 세포 매체 세포 독성) 활성 및 CDC(상보적(complement)-의존성 세포독성) 활성과 조합된 FcRn에의 증가된 결합을 가질 수 있다. 본 발명의 변이체는 또한 모 폴리펩타이드의 것과 적어도 유사한 ADCC 및 CDC 활성과 조합된 FcRn에의 증가된 결합을 가질 수 있다. 일부 다른 경우에, 본 발명의 변이체는 그의 모 폴리펩타이드와 비교해서 ADCC 및 CDC로부터 선택된 적어도 하나의 감소된 이펙터 활성과 조합하여 FcRn에 증가된 결합을 가질 수 있다.

ADCC 및 CDC 활성은 본 명세서의 실시예 2 파트 Ⅳ.2 및 Ⅳ.3에 기술된 것과 같은 선행기술의 잘-알려진 방법에 의해 평가될 수 있다.

FcγR에의 결합은 SPR 또는 ELISA분석과 같은 통상적인 방법에 의해 평가될 수 있다.

본 발명의 추가의 목적은 결과적인 변이체가 모 폴리펩타이드에 비교해서 FcRn에 대해 증가된 결합을 갖는다면 앞서 언급된 것과 다른 추가의 아미노산 변형을 임의로 포함하는 변이체를 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명의 Fc 변형은 FcRn에 대한 Fc 친화력을 증가시키는 것으로 알려진 기타 Fc 변형과 조합될 수 있다(예를 들어, 관련된 기술의 기술에 전용인 본 발명의 부분에서 언급된 참조문헌을 참조).

달리는, Fc 변형은 제한되는 것은 아니지만 이펙터 기능 또는 하나 이상의 Fc 리간드와의 상호작용을 변경시키는 변형들을 포함하는 기타 Fc 변형들과 조합될 수 있다. 결과적으로, 이러한 변이체는 모 폴리펩타이드와 비교하여 하나의 Fc 리간드(FcRn 이외)에의 변경된 결합 또는/및 변경된 이펙터 기능과 조합하여 FcRn에의 증가된 결합을 나타낼 수 있다.

Fc 리간드는, 제한되는 것은 아니지만, FcγRs(Fc감마. 수용체), C1q, C3, 만난(mannan) 결합 렉틴, 만노즈 수용체, 스타필로코커스 단백질 A, 스트렙토코커스 단백질 G, 및 바이러스 FcγRs를 포함한다. Fc 리간드는 또한 Fc감마Rs에 동종인 Fc 수용체의 계(family)인 Fc 수용체 동족체(homologs) (FcRH)를 포함한다(Davis et al., 2002, Immunological Reviews 190:123-136).

본 명세서에서 사용된바, "이펙터(effector) 기능"이란 항체 Fc 영역과 Fc 수용체 또는 리간드와의 상호작용으로 부터 생기는 생화학적 또는 세포 사건을 의미한다. 이펙터 기능은 제한되는 것은 아니지만 ADCC(항체-의존성 세포-중재 세포독성), ADCP(항체-의존성 세포-매개 식작용), 및 CDC(상보적 의존성 세포독성)을 포함한다.

본 발명의 변이체는 Fc 영역을 포함하고, 모 폴리펩타이드와 비교해서 FcRn에 대해 증가된 결합 친화력을 나타내는 어떠한 폴리펩타이드도 포함하고, 단 상기 폴리펩타이드는 Fc 영역에서 적어도 하나의 아미노산 변형 또는 아미노산 변형의 조합에 의해 그의 모 폴리펩타이드와 다르다. 관심의 대상인 변형 또는 아미노산 변형의 조합은 본 발명에 따른 변이체의 일반적인 특징을 제공할 때 상기 기술된 것이다.

변이체(및 따라서 모 폴리펩타이드)는 제한되는 것은 아니지만 항체, Fc 융합 단백질, Fc 콘쥬게이트, 분리된 Fc 및 각각 그들의 단편을 포함한다. 특히, 변이체는 Fc-포함 결합 단백질 일 수 있다. 다른 표현으로서, 변이체는 (i) Fc 변이체 및 (ii) 소정의 분자와 특이적으로 결합할 수 있는 결합 폴리펩타이드 도메인을 포함한다.

일 실시 형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 변이체는 Fc-융합 단백질 변이체 및 Fc-콘쥬게이트 변이체로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. Fc-융합 단백질 및 Fc-콘쥬게이트는 파트너에 연결된 Fc 영역으로 구성된다. Fc 영역은 스페이서와 함께 또는 없이 그의 파트너에 연결될 수 있다.

본 발명에 따르면, Fc 융합 단백질은 단일 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이고, Fc 영역에 연결된 단백질, 폴리펩타이드 또는 작은 펩타이드를 포함한다. Fc 융합 단백질은 임의로 펩타이드 스페이서를 포함한다. 실질적으로, 어느 단백질 또는 작은 분자는 Fc 영역에 연결되어 Fc 융합을 생성할 수 있다. 단백질 융합 파트너는, 제한되는 것은 아니지만, 어느 항체의 가변 영역, 어느 항체의 가변 영역으로부터 유래된 폴리펩타이드, 수용체의 표적(target)-결합 영역, 부착 분자, 리간드, 효소, 사이토킨, 케모킨 또는 일부의 기타 단백질 또는 단백질 도메인을 포함할 수 있다. 특히, Fc-융합 단백질은 면역접합제, 즉 이종성 "접착" 단백질(즉 수용체, 리간드 또는 효소)의 결합 도메인과 면역글로불린 불변 도메인(즉 Fc 영역)의 단편을 결합시키는 항체-유사 단백질일 수 있다(면역접착제에 대해서 검토하기 위해 Ashkenazi A, Chamow SM.1997, Curr Opin Immunol.; 9(2):195-200 참조).

작은 펩타이드 융합 파트너는 제한되는 것은 아니지만 Fc 융합물을 치료 표적에 향하게 하는 어느 치료제도 포함할 수 있다. 이러한 표적은 어느 분자, 바람직하게는 질병에 관련된 세포외 수용체일 수 있다.

본 발명에 따르면, Fc 콘쥬게이트(conjugate)는 Fc 영역과 콘쥬게이트 파트너와의 화학적 연결로부터 생긴다. 콘쥬게이트 파트너는 단백질성(proteinaceous) 또는 비-단백질성 일 수 있다. 연결 반응은 일반적으로 Fc 영역과 콘쥬게이트 파트너 상의 작용기를 사용한다. 다양한 링커가 콘쥬게이트의 합성에 적절한 것으로 본 분야에 알려져 있다; 예를 들어 호모- 또는 헤테로-이작용성 링커가 잘 알려져 있다(본 명세서에 참조로 포함되어 있는 Pierce Chemical Compamny catalog, 2005-2006, technical section on cross-linkers, pages 321-350 참조).

적절한 콘쥬게이트 파트너는 제한되는 것은 아니지만 치료 폴리펩타이드, 라벨(라벨의 예로, 추가로 하기 참조), 약물, 세포 독성제, 세포독성 약물(예, 화학 치료제), 독소 및 이러한 독소의 활성 단편을 포함한다. 적절한 독소 및 그들의 상응하는 단편은 제한되는 것은 아니지만 디프테리아 A 쇄, 엑소톡신 A 쇄, 리신 A 쇄, 아르빈 A 쇄, 쿠르신, 크로틴, 페노미신, 에노미신 등을 포함한다. 세포 독성제는 Fc 변이체에 직접적으로 콘쥬게이트될 수 있거나, Fc 변이체에 공유적으로 부착된 킬레이팅제에 의해 떼어지는(sequestated) 어느 방사성 핵종일 수 있다. 추가의 실시 형태에서, 콘쥬게이트 파트너는 칼리체아미신, 아우리스타틴, 겔다나마이신, 마이탄신, 및 듀오카르마이신 및 유사체(후반부(the latter)에 대해서는 본 명세서에 참조로 포함되어 있는 U.S. 200310050331 참조)로 구성되는 그룹으로부터 선택될 수 있다.

관심의 대상이 되는 이러한 변이체는 낮은 pH(예를 들어, 약 pH 6에서)에서 FcRn에 대해 증가된 결합, 및 높은 pH(예로, 약 pH 7.4에서)에서 실질적으로 비변형된 결합을 할 수 있다. 특히 관심의 대상이 되는 것은 모 폴리펩타이드에 비해 증가된 생체내 반감기를 나타내는 Fc-융합 단백질 및 Fc-콘쥬게이트 변이체이다.

바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 변이체는 모 항체의 변이체 항체이다. 용어 "항체"는 본 명세서에서 가장 넓은 의미로 사용된다. 본 발명에 따르면, "항체"는 적어도 (i) Fc 영역 및 (ii) 면역글로불린의 가변 도메인으로부터 유래된 결합 폴리펩타이드를 포함하는 임의의 폴리펩타이드를 언급한다. 상기 결합 폴리펩타이드 도메인은 하나의 소정의 표적 항원 또는 표적 항원의 그룹과 특이적으로 결합할 수 있다. 면역글로불린의 가변 영역으로부터 유래된 결합 폴리펩타이드 도메인은 적어도 하나 이상의 CDR을 포함한다. 본 명세서에서 항체는 제한되는 것은 아니지만 완전-길이 면역글로불린, 모노클로날 항체, 다중-특이적 항체, 적어도 하나의 가변 영역을 포함하는 Fc-융합 단백질, 합성 항체(때때로 본 명세서에서 "항체 모방물"이라 언급), 키메라 항체, 인간화된 항체 및 완전히 인간 항체를 포함한다. 항체는 또한 항체-융합 단백질, 항체 콘쥬게이트 및 각각의 단편을 각각 포함한다. 따라서, 본 발명의 변이체 항체는, Fc 영역에서, 모 항체에 비해 FcRn에 대해 결합 친화력을 증가시키는 적어도 하나의 아미노산 변형 또는 상기-언급된 변형의 조합을 포함한다. 특히 관심의 대상이 되는 것은 저 pH(예를 들어 약 pH 6)에서 FcRn에 대해 증가된 결합 친화력을 나타내고, 고 pH에서(예를 들어 약 pH 7.4) 실질적으로 비변형된 결합을 갖는 항체 변이체이다. 더욱 특별히 관심이 되는 것은 모 폴리펩타이드에 비교하여 증가된 생체 반감기를 갖는 항체 변이체이다.

일 실시 형태로서, 본 발명의 변이체 항체는 모 전장 항체로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 본 명세서에서 "전장(full-length) 항체"는, 가변 및 불변 영역을 포함하는, 항체의 천연 생물학적 형태를 구성하는 구조를 의미한다. 본 발명의 완전-길이 항체 변이체의 모 폴리펩타이드는 야생형 항체, 야생형 항체의 돌연변이체(예를 들어 기존 변형을 포함하는), 야생형 항체의 처리된 버젼(예를 들어, 키메라, 인간화된(humanized) 항체 또는 완전한 인간 항체, 추가로 하기 참조)일 수 있고, 이 목록은 제한적이 아니다. 전장 항체의 구조는 일반적으로 일부 면역글로불린이 이량체인 야마 및 낙타와 같은 일부 포유동물을 제외하고 사량체이다. 각 사량체는 전형적으로 폴리펩타이드 쇄의 두개의 동일한 쌍으로 구성되고, 각 쌍은 하나의 "경쇄"(전형적으로 약 25 kDa의 분자량을 갖는다) 및 하나의 "중쇄"(전형적으로 약 50-70 kDa의 분자량을 갖는)를 갖는다.

전장 항체의 예는 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE 부류를 포함하는 인간 면역글로불린이다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 완전-길이 항체 변이체는 IgG의 변이체로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.

보다 바람직한 구현예에서, 상기 전장 항체 변이체는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 변이체로 구성되는 그룹으로부터 선택되며, 단 상기 변이체의 상기 Fc 영역 서열은 SEQ ID:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4는 아니다.

상기 IgG 변이체는 모 IgG에 비해서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하고, 상기 하나 이상의 변형 또는 아미노산 변형의 조합은 Fc영역을 포함하고 상응하는 모 폴리펩타이드에 비해서 FcRn에 대해 증가된 결합을 갖는 폴리펩타이드의 변이체를 일반적으로 정의할 때, 본 명세서에 앞서 기술된 것이다.

또 다른 실시형태에서, 상기 항체 변이체는 면역글로불린의 가변 도메인으로부터 유래된 결합 폴리펩타이드를 포함하는 Fc-융합 단백질로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 특히 관심의 대상이 되는 것은 (a) 본 발명의 Fc 변이체, 및 (b) 면역글로불린의 가변 영역(즉, 적어도 하나의 CDR을 포함)으로부터 유래된 다음 결합 폴리펩타이드 도메인의 하나를 포함하는 항체이다:(i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fab 단편, (ii) VH 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 단편, (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편; (iv) 단리된 CDR 영역, (v) F(ab')2 단편, 두개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편, (vi) 단일 쇄 Fv 분자(scFv)(여기에서, VH 도메인 및 VL 도메인은 두 개의 도메인이 연합하여 항원 결합 부위를 형성하는 것을 허용하는 펩타이드 링커에 의해 연결된다), (vii) 이중특이적 단일 쇄 Fv 및 (viii) 유전자 융합에 의해 구성된 "디아바디(diabodies)" 또는 "트리아바디", 다가 또는 다중특이적 단편(이 목록에 제한되는 것은 아니다).

또 다른 실시 형태에서, 항체는 미니바디(minibody)이다. 미니바디는 CH3 도메인에 결합된 scFv를 포함하는 최소화된 항체-유사 단백질이다(Hu et al., 1996, Cancer Res. 56:3055-3061, 전체로 본 명세서에 참조로 혼입됨). 일부 경우에, scFv는 완전 길이 Fc 영역에 결합될 수 있고(De Lorenzo et al., 2005, Carcinogenesis 26:1890-1895, 전체로 본 명세서에 참조로 혼입됨), 또한 힌지 영역 또는 그의 단편을 포함할 수 있다.

한 실시형태에서, 본 발명의 항체는 다중특이적 항체의 그룹으로부터, 및 주목하게는 "디아바디"라 때때로 언급되는 이중특이적 항체의 그룹으로부터 선택된다. 이 항체는 두 개(또는 그 이상)의 상이한 항원과 결합한다. 디아바디는 본 분야에 알려진 다양한 방법(Holliger and Winter, 1993, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449, 전체로 본 명세서에 참조로 혼입됨), 예로 화학적으로 제조되거나 하이브리도마(hybrodomas)로부터 유래되어 제조될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 항체 변이체의 골격 성분들은 다양한 종으로부터의 혼합물일 수 있다. 이러한 항체 변이체는 키메라 항체 및/또는 인간화된(humanized) 항체일 수 있다. 일반적으로, "키메라 항체" 및 "인간화된 항체"는 하나 초과의 종으로부터의 영역들을 조합한 항체들을 언급한다. 예를 들어, "키메라 항체"는 전통적으로 비-인간 동물, 일반적으로 마우스(또는 일부 경우에 래트)로부터의 가변 영역(들) 및 인간으로부터의 불변 영역(들)을 포함한다. 대개 인간화된 항체는 비 인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 일반적으로, 인간화된 항체에서, CDRs을 제외한 전 항체는 인간 기원의 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되거나 그의 CDRs 내에서를 제외한 인간 항체와 동일하다. 일부 또는 모두가 비-인간 유기체에서 기원하는 핵산에 의해 인코딩되는 CDRs은 인간 항체 가변 영역의 베타-시트 골격(framework)에 그래프트되어 특이성이 그래프트된 CDRs에 의해 결정되는 항체를 생성한다. 이러한 항체의 생성은 예로, WO 92/11018; Jones, 1986, Nature 321:522-525; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536(모두 전체로 본 명세서에 참조로 포함된다)에 기술되어 있다. 인간화된 항체는 임의로 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부분, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함하고, 따라서 전형적으로 인간 Fc 영역을 포함한다. 인간화된 항체는 유전적으로 처리된(engineered) 면역 시스템을 갖는 마우스를 사용하여 생성시킬 수 있다(Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654, 전체로 본 명세서에 참조로 혼입됨). 비-인간 항체를 인간화시키고 재모양화시키기 위한 다양한 기술 및 방법이 본 분야에 잘 알려져 있다(Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B cells, 533-545, Elsevier Science (USA), 및 거기에 인용된 참조문헌들, 모두 전체로 참조로 혼입됨). 인간화 방법은 제한되는 것은 아니지만 모두 전체로 참조로 혼입되는 Jones et al., 1986, Nature 321:522-525 ; Riechmann et al.,1988; Nature 332:323-329 ; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536 ; Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33 ; He et al., 1998, J. Immunol. 160: 1029-1035 ; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9　; Presta et al., 1997, Cancer Res. 57(20):4593-9 ; Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185 ; O'Connor et al., 1998, Protein Eng 11:321-8에 기술된 방법들을 포함한다. 비인간 항체 가변 영역의 면역원성을 감소시키는 인간화 또는 다른 방법은 전체로 본 명세서에 참조로 인용되는 예를 들어 Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973에 기술된 바와 같은 재표면화(resurfacing) 방법을 포함할 수 있다.

일 실시 형태에서, 상기 항체 변이체는 본 명세서에서 윤곽이 그려진 바와 같은 적어도 하나의 아미노산 변형을 갖는 완전히 인간의 항체이다. "완전히 인간의 항체" 또는 "완전한 인간 항체"는 인간 유전자에서 기원하는 서열을 완전히 포함하는 항체를 언급한다. 일부 경우에, 이는 본 명세서에 개시된 변형을 갖는 인간 크로모좀으로부터 유래된 항체의 유전자 서열을 갖는 인간 항체일 수 있다. 대안으로서, 항체의 성분들은 단일 유전자로부터 유래되지 않은 인간의 것일 수 있다. 따라서, 예를 들어, 한 항체로부터의 인간 CDRs은 하나 이상의 인간 항체로부터의 골격 서열과 같은 서열과 조합될 수 있다. 예를 들어, 다양한 생식계열(germline) 서열이 조합되어 인간 항체 또는 인간 골격(scaffold)(예로, 상기 개시된 바의 인간화된 또는 키메라 서열에서 사용하기 위한), 및 U.S. 특허출원 No. 11/022,289)(전체로 본 명세서에 참조로 포함됨)을 형성할 수 있다.

특정한 실시 형태에서, 본 발명의 항체 변이체는 키메라 IgG, 인간화된 IgG 및 완전한-인간 IgG로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.

항체의 공유적 변형이 또한 본 발명의 범주에 포함되고, 일반적으로 항상은 아니지만 번역 후(post-translationlly) 행해진다. 이러한 변형은 제한되는 것은 아니지만 글리코실화, 라벨링 및 콘쥬게이션을 포함한다.

따라서, 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드 변이체는 하나 이상의 처리된(engineered) 글리코폼(glycoforms)을 포함하도록 변형될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바 "처리된 글리코폼"은 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드에 공유적으로 부착된 탄수화물 조성물을 의미하고, 여기서, 상기 탄수화물 조성물은 모 폴리펩타이드의 것과 화학적으로 다르다. 처리된 글리코폼은 제한되는 것은 아니지만 이펙터 기능을 향상시키거나 감소시키는 것을 포함하는 다양한 목적에 유용할 수 있다. 처리된 글리코폼은 변이체 서열의 임의의 아미노산에서 부착될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 글리코폼은 Fc 영역의 아미노산에 부착된다.

처리된 글리코폼은 본 분야에 알려진 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다(Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; U.S. Pat. No. 6,602,684; U.S. Ser. Nos. 10/277,370; 10/113,929; WO 00/61739A1; WO 01/29246A1; WO 02/31140A1; WO 02/30954A1, WO 01/77181, 모두 전체로서 참조를 위하여 포함됨;(Potelligent®technology [Biowa, Inc., Princeton, N.J.]; GlycoMAb®glycosylation engineering technology [Glycart Biotechnology AG, Zuerich, Switzerland]). 이들 기술의 많은 것이 예를 들어 처리된 또는 다르게 하여 다양한 유기체 또는 세포주(예를 들어 Lec-13 CHO 세포 또는 래트 하이브리도마 YB2/0 세포)에서 항체 변이체를 발현시켜, 글리코실화 경로에 포함된 효소를 조절하여(예를 들어 FUT8 [α1,6-푸코실트랜스퍼라제] 및/또는 β1-4-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III[GnTIII]), 또는 항체 변이체가 발현된 후 탄수화물(들)을 변형시켜, 푸코실화 수준을 조절하고/하거나 Fc 영역에 공유적으로 부착된 올리고사카라이드를 이등분하는 것에 기초한다.

달리는, 처리된 글리코폼은 상이한 탄수화물 또는 올리고사카라이드를 포함하는 항체 변이체를 언급할 수 있다. 본 분야에 알려진 바와 같이, 글리코실화 패턴은 단백질의 서열의 양쪽(예로, 하기에서 언급되는, 특별한 글리코실화 아미노산 잔기의 존재 또는 부재) 또는 단백질이 생성되는 숙주 세포 또는 유기체에 의존할 수 있다. 특별한 발현 시스템이 하기에서 언급된다.

폴리펩타이드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결된은 탄수화물 성분이 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착되는 것을 언급한다. 트리- 펩타이드 서열 아스파라긴-X- 세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기에서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 탄수화물 성분의 아스파라긴 측쇄에의 효소적 부착에 대한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드 내에 이들 트리-펩타이드 서열 어느 하나의 존재는 잠정적인 글리코실화 부위를 만든다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토즈 또는 자일로즈의 하나가 하이드록시아미노산, 비록 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신이 또한 사용될 수 있지만, 가장 흔히는 세린 또는 트레오닌에의 부착을 언급한다.

항체에 글리코실화 부위의 첨가는 하나 이상의 상기 기술된 트리-펩타이드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경하여 용이하게 달성된다(N-연결된 글리코실화 부위 경우). 이 변경은 출발 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 첨가 또는 치환하여 또한 만들어질 수 있다(O-연결된 글리코실화 부위 경우). 용이하게 하기 위하여, 항체 아미노산 서열은 바람직하게는 DNA 수준에서 변화를 통해, 특히 원하는 아미노산으로 번역되는 코돈이 생성되도록 미리 선택된 염기들에서 표적 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA를 돌연변이시켜 변경된다.

항체 상에 탄수화물 성분의 수를 증가시키는 또 다른 수단은 글리코시드를 단백질에 화학적 또는 효소적으로 연결시키는 것이다. 이들 과정은 이들이 N- 및 O-연결된 글리코실화에 대한 글리코실화 능력을 갖는 숙주 세포에서 단백질의 생산을 요구하지 않는다는 점에서 유리하다. 사용된 연결 방식에 따라, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카복실 그룹, (c) 시스테인의 것과 같은 유리 설피드릴 그룹, (d) 세린, 트레오닌 또는 하이드록시프롤린의 것과 같은 유리 하이드록실 그룹, (e) 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 것과 같은 방향족 잔기, 또는 (f) 글루타민의 아마이드 그룹에 부착될 수 있다. 이들 방법은 1987년 9월 11일 공개된 WO 87/05330, 및 문헌[Aplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., 259-306]에 기술되어 있다.

출발 항체에 존재하는 탄수화물 성분의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화는 단백질의 화합물 트리플루오로술폰산, 또는 등가물 화합물에의 노출을 요구한다. 이 처리는 폴리펩타이드는 완전하게 남기면서, 연결 당(N-아세틸글루코자민 또는 N-아세틸갈락토자민)외에는 대부분 또는 모든 당을 절단한다. 화학적 탈글리코실화는 Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 및 Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131에 의해 기술되어 있다. 폴리펩타이드상의 탄수화물 성분의 효소적 절단은 Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol,138:350에 의해 기술된 바와 같이 다양한 엔도- 및 엑소글리코시다제를 사용하여 달성될 수 있다. 잠재적 글리코실화 부위에서의 글리코실화는 Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105에 의해 기술된 바와 같이 화합물 투니카미신을 사용하여 방지될 수 있다. 투니카미신은 단백질-N-글리코시드 연결의 형성을 차단한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체 변이체는 처리된 글리코폼을 포함하는 키메라 IgG, 인간화된 IgG 및 완전한-인간 IgG로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

대안적인 실시 형태에서, 본 발명의 항체 변이체의 공유적 변형은 하나 이상의 라벨의 첨가를 포함한다. 일부 경우에, 이들은 항체 융합으로 여겨진다. 용어 "라벨링 그룹"은 임의의 검출가능한 라벨을 의미한다. 일부 실시 형태에서, 라벨링 그룹은 잠재적 입체적(steric) 방해를 감소시키기 위하여 다양한 길이의 스페이서 팔(arms)을 통해 항체에 연결된다. 단백질을 라벨링하는 다양한 방법이 본 분야에 알려져 있고, 본 발명을 수행하는데에 사용될 수 있다.

일반적으로, 라벨은 그들이 검출되는 분석 또는 진단 과정에 따라 다양한 부류에 속한다:a) 방사성 활성 또는 중 동위원소일 수 있는 동위원소 라벨; b) 자기 라벨(예, 자기 입자); c) 리독스(redox) 활성 성분; d) 광학적 염료; 효소 그룹(예, 양고추냉이 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시페라제, 알칼리성 포스파타제); e) 비오틴화 그룹; 및 2차 리포터(예, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그 등)에 의해 인식되는 미리 예정된 폴리펩타이드 에피토프.

특이적 라벨은 제한되는 것은 아니지만 크로모포르, 포스포르 및 플루오로포르(후반부는 많은 경우에 특이적이다)를 포함하는 광학적 염료를 포함한다. 플루오로포르는 형광의 "작은 분자" 이거나 형광 단백질일 수 있다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 변이체는 상기 기술된 바와 같은 라벨링 그룹으로 사용되지 않는 단백질 또는 작은 분자에 융합되거나 콘쥬게이트될 수 있다. 실제적으로, 임의의 단백질 또는 작은 분자가 항체에 연결될 수 있다. 단백질 융합 파트너는 제한되는 것은 아니지만 수용체의 표적-결합 영역, 부착 분자, 리간드, 효소, 사이토킨, 케모킨 또는 일부 다른 단백질 또는 단백질 도메인을 포함할 수 있다. 작은 분자는 제한되는 것은 아니지만 약물, 세포독성제(예, 치료제), 독소 또는 이러한 독소의 활성 단편을 포함한다.

상기 기술된 바와 같이, 본 발명의 항체 변이체는 하나의 표적 항원 또는 표적 항원의 그룹에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 명세서에서 사용된바 "표적 항원"은 소정의 항체 또는 면역글로불린글로불린영역에 의해 특이적으로 결합되는 분자를 의미한다. 표적 항원은 단백질, 탄수화물, 지질 또는 다른 화학적 화합물일 수 있다.

적절한 항원의 선택은 원하는 적용에 따른다. 실제적으로, 임의의 항원, 예를 들어 RhD 항원, CD3, CD4, CD19, CD20, CD22, CD25, CD28, CD32B, CD33, CD38, CD40, CD44, CD52, CD71 (트랜스페린 수용체), CD80, CD86, CTLA-4, CD147, CD160, CD224, 수용체 ErbB1, ErbB2, ErbB3, ErbB4 (EGFR, HER2/neu, HER3, HER4) ErbB의 계에 속하는 것과 같은 성장 인자 수용체, VEGF-R1, VEGF-R2, IGF-R1, PlGF-R, MHC 부류 I 및 MHC 부류 II 분자, 예로, HLA-DR, IL-1R, IL-2R 알파, IL-2R 베타 및 IL-2R 감마, IL-6R 같은 인터류킨 수용체, Mullerian 억제 물질 타입 II 수용체 같은 호르몬 수용체, LDL 수용체, NKp44L, CXCR4 및 CCR5와같은 케모킨 수용체, 인테그린, CD2, ICAM, EpCAM 같은 접착 분자를 포함하는 막 단백질이 표적화 될 수 있다. 막 단백질은 또한 GD2, GD3, CA125, MUC-1, MUC-16, 암배항원(CEA), Tn, 당단백질 72, PSMA, HMW-MAA와 같은 종양 마커를 포함한다. 본 발명의 항체는 제한되는 것은 아니지만 사이토킨(예를 들어, IL-1 베타, IL-2, IL-6, IL-12, IL-23, TGF 베타, TNF 알파, IFN 감마), 케모킨, VEGF-A, EGF, PIGF, PDGF, IGF와 같은 성장 인자, 호르몬, 박테리아 독소 및 부툴리누스와 같은 다른 기원의 독소, 리신, B. 안트라시스 보호 항원, B. 안트라시스 치사 인자, B. 안타시스 에데마 인자, 시가톡신 1 및 2, 다양한 바이러스, 예를 들어 병원성 바이러스로부터의 바이러스 항원, FVIII 억제 항체를 포함하는 억제 항체를 포함하는 가용성 단백질을 또한 표적화 할 수 있다.

바람직한 실시 형태로서, 본 발명의 변이체(variant)는 타겟 CD20 일 수 있다. 이 경우에, 모 폴리펩타이드(parent polypeptide)는 다음에서 선택될 수 있다: EMAB6 또는 EMAB603 (WO2006064121 참조), 리툭시맵(RITUXIMAB, Rituxan®, IDEC/Genentech/Roche) (예를 들면, U.S. 특허 제5,736,137호 참조, 이는 본 발명에 전체로서 참조를 위하여 포함되어 있음), U.S. 특허 제5,500,362호에 개시된 HUMAX®-CD20(이는 본 발명에 전체로서 참조를 위하여 포함되어 있음), AME-133 (분자진화에 적용됨), hA20 (Immunomedics, Inc.), HumaLYM (Intracel), 및 PRO70769 (PCT/US2003/040426, "Immunoglobulin Variants and Uses Thereof", 본 발명에 전체로서 참조를 위하여 포함되어 있음).

다른 실시 형태로서, 본 발명의 변이체는 타겟 RhD 항원일 수 있다. 이 경우에, 모 폴리펩타이드는 EMAB2 (FR 03 12 229 참조), Sym001 (Symphogen A/S) 또는 MonoRho (ZLB, Zurich)에서 선택될 수 있다.

모 폴리펩타이드는 또한 Avastin®(anti-VEGF), Remicade®(anti-TNF-α), Erbitux®, Vectibix®(anti-EGFR), Tysabri®(인터그린의 anti-alpha4 chain), Herceptin®(anti-HER2/neu)일 수 있고, 이 리스트에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또한 잘 알려진 치료학적 관련 특성의 다양성에서 선택된 또 다른 최적의 특성을 갖춘 FcRn과 증가된 결합을 나타내는 변이체를 제공한다. 최적화 될 수 있는 가장 바람직한 특성은 생체 내에서의 반감기(half-life)이다. 증가된 생체 내 반감기를 나타내기 위하여, 변이체는, 예를 들어 pH 6.0의 엔도솜과 관련된 pH와 같은 낮은 pH에서 FcRn과의 증가된 결합 친화력을 보여야 한다. 반면에 pH 7.4와 같이 더 높은 pH에서는 감소된 친화력이 유지되어, FcRn이 엔도솜과 증가된 결합을 하지만 정상 방출률을 나타낸다(Dall'Acqua et al., 2002, J. Immunol. 169: 5171-180　; Gurbaxani et al., 2006, Mol Immunol. 43(9):1462-73).

유사하게, FcRn 결합을 조절하는 이러한 변이체들은 선택적으로 원하는 다른 특성들, 예를 들면 조절된 FcγR결합을 가질 수 있다. 부가적인 실시형태로서, 변이체들은 인간 활성 FcγR, 바람직하게는 FcRn 결합 프로파일에 더하여 FcγRIIIa와 증가된 친화력을 가지도록 최적화된다. 다른 실시 형태로서, 변이체들은 FcRn와 증가된 친화력을 갖도록 최적화되고, 인간 FcγR에 대한 친화력은 증가하거나 감소화도록 최적화된다. 상기 인간 FcγR은 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, 및 FcγRIIIb, 이들의 대립형질 변이들(allelic variantions)을 포함하고, 이들에 한정되지 않는다. 다른 실시 형태로서, 본 발명의 변이체들은 선택적으로 증가된(또는 감소된) 반응기 작용(effector function)과 증가된 세럼 반감기를 가질 수 있다. 특히 바람직한 실시 형태로서, 본 발명의 변이체는 증가된 ADCC 활성 및/또는 FCγR에 대한 증가된 결합을 가질 수 있고, 모 폴리펩타이드와 비교하여 증가된 혈청(serum) 반감기도 가질 수 있다. 다른 실시 형태로서 본 발명의 변이체는 모 폴리펩타이드와 비교하여 증가된 CDC 활성을 더 가질 수 있다.

변이체들은 넓은 범위의 제품에 적용할 수 있다. 일 실시 형태로서 변이체는 치료, 진단 또는 연구시약일 수 있고, 치료 시약이 바람직하다.

FcRn에 대한 증가된 결합을 나타내기 때문에, 본 발명의 변이체들은 더 긴 생체 내 반감기를 가지는 것이 기대되고, 더 정확하게는 그들의 모 폴리펩타이드보다 더 긴 생체 내 혈청 반감기를 가지는 것이 기대된다. 그 결과, 이러한 변이체들은 모 폴리펩타이드가 너무 빨리 혈액 순환에서 사라졌을 때, 모 폴리펩타이드 대체물로서 유용하게 적용되거나, 긴 반감기 유효성분이 요구되는 만성 또는 장기 질병 치료에 사용된다.

변이체들이 항체들로 이루어진 그룹에서 선택될 때, 그것은 단일클론 또는 다클론성 항체인 항체 조성물에서 용도를 찾을 수 있다. 바람직한 실시 형태로서, 상기 항체 변이체들은 예를 들어 암 세포와 같은 타겟 항원을 산출하는 타겟 세포들을 사멸하는 데 사용된다. 다른 실시 형태로서, 변이체들은 타겟 항원을 차단하거나, 방해하거나(antagonize), 고통을 주는데, 예를 들면 사이토카인 또는 사이토카인 수용체를 방해하거나, 박테리아나 바이러스나 독소(예를 들면 박테리아성 독소)와 같은 감염원을 중화한다. 다른 바람직한 실시 형태로서, 변이체들은 타겟 항원을 차단하거나, 방해하거나(antagonize), 고통을 주고, 타겟 항원을 산출하는 타겟 세포들을 사멸하는 데 사용된다.

바람직한 실시 형태로서, 변이체 항체는 항체 관련 질환을 치료하기 위하여 환자에게 투여된다. 본 발명의 목적에서 "환자"는 사람 및 다른 동물을 포함하여, 바람직하게는 포유류이고, 더 바람직하게는 사람이다. 본 발명에서 "항체 관련 장애", 또는 "항체 반응성 장애", 또는 "질환", "질병"은 본 발명의 변이체를 포함하는 약학 조성물의 투여로 개선될 수 있는 장애(disorder)를 의미한다. 장애 관련 항체는 자가면역질환(autoimmune diseases), 면역학적 질환, 전염성 질환, 염증성 질환, 신경질환, 통증, 폐 질환, 혈액 질환, 섬유증(fibrotic conditions), 및 종양학 및 암을 포함하는 종양 질환을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 이하 "암" 및 "암에 걸린(cancerous)"은 전형적으로 제어할 수 없는 세포 성장을 특징으로 하는 포유류에서의 생리학적 상태를 의미 또는 기술한 것이다. 암의 예들로서 암종(carcinoma), 림프종(lymphoma), 아세포종(blastoma), 육종(sarcoma, 지방육종(liposarcoma)을 포함함), 신경내분비 종양(neuroendocrine tumors), 중피종(othelioma), 신경초종(schwannoma), 수막종(meningioma), 선암(adenocarcinoma, melanoma), 및 백혈병 및 림프종양(lymphoid malignancies)을 포함하고, 이에 제한되는 것은 아니다. 치료될 수 있는 다른 질환들로서, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 소아 류마티스 관절염(juvenile rheumatoid arthritis), 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 쇼그렌병(Sjorgren's disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 천식(asthma), 알레르기(allergies) 및 알레르기성 질환, 이식편대 숙주병(graft versus host disease) 등이 포함되고 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 추가 목적은 상기 변이체를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이다. 상기 제제는 원하는 순도를 가진 폴리펩타이드 변이체를 생리학적으로 허용되고 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제들 또는 안정제들과 선택적으로 혼합하여 동결건조 제형 또는 수용액 형태로 제조된다(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980, 전체로서 참조를 위하여 본 발명에 포함되어 있음). 이러한 약학 조성물은 어려움에 처한 환자를 치료하는데 필요하다.

어려움에 처한 환자를 치료하기 위하여, 치료학적으로 효과가 있는 용량의 변이체가 투여된다. 본 발명에서 "치료학적으로 효과가 있는 용량"이란 투여되어 효과를 나타내는 용량을 의미한다. 정확한 용량은 치료 목적에 따라 좌우되며, 알려진 기술을 사용하는 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 확인될 것이다. 투여량(dosages)은 체중을 기준으로 0.001 내지 100 mg/kg의 범위일 수 있고, 예를 들어 체중을 기준으로 0.1, 1.0, 10 또는 50 mg/kg이 더 좋고, 1 내지 10 mg/kg이 보다 바람직하다. 본 발명의 기술분야에서 알려져 있는 것처럼, 단백질 저하의 조정, 전신에 영향을 주거나 국부적인 전달, 및 새로운 프로테아제 합성률에 더하여 나이, 체중, 일반적인 건강상태, 성별, 식습관, 투여 시간, 약물 상호작용(drug interaction), 및 질환의 강도가 필요할 수 있으며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 정해진 실험을 통하여 확인할 수 있을 것이다.

변이체를 포함하는 약학 조성물의 투여는 다양한 방법으로 이루어질 수 있는데, 구강, 피하주사, 정맥주사, 비경구적으로, 비강으로(intranasally), 대동맥 내로(intraortically), 안구 내로(intraocularly), 직장으로(rectally), 질동맥으로(vaginally), 경피투여로(transdermally), 국소적으로(예를 들면, 겔, 연고, 로션, 크림 등), 복강 내부로(intraperitoneally), 근육 내로(intramuscularly), 폐안으로(intrapulmonary) 투여할 수 있으며, 이들 방법으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 개시된 치료는 부수적으로 다른 치료와 함께 행하질 수 있는데, 즉, 예를 들면, 소 분자, 다른 생물학적 제제, 방사선 치료, 수술 등의 다른 요법 또는 치료와 병행하여 행해질 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 변이체를 인코딩하는 분리된 핵산을 제공하는 것이다. 종종, 모 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA는 이용할 수 있고, 구할 수 있다. 그 결과, 알려져 있는 선행기술의 다양한 방법의 도움으로 모 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA를 변형시킴으로써 관심이 있는 변이체를 생산할 수 있다. 이러한 방법들은 특정 부위(site-directed) 돌연변이 유발, 무작위 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발 및 카세트 돌연변이 유발(cassette mutagenesis)을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 아미노산 치환은 바람직하게는 특정 부위 돌연변이 생성에 의해 이루어진다(예를 들면, Zoller and Smith, 1982, Nucl. Acids Res. 10:6487-6500; Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:488 참조. 이는 본 발명에 전체로서 참조를 위하여 포함되어 있음).

다른 방법 또는 추가적인 방법으로, 폴리펩타이드 변이체를 인코딩하는 원하는 아미노산 서열은 잘 알려진 선행기술의 방법을 사용하여 결정되거나 합성하여 생산할 수 있다.

이들 인코딩 핵산이 얻어지면, 본 발명의 변이체들은 선행기술에 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 일 실시예로서, 변이체 서열(예를 들면, IgG 변이체 서열)은 구성원 서열(member sequense)을 인코딩하는 핵산을 제조하는 데 사용되고, 이후 원한다면 숙주 세포로 클론(clone)될 수 있고, 발현되고 분석될 수 있다. 상기한 내용의 실시는 공지된 과정, 및 "Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3^rd Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001)"과 "Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons)"에 기술된 다양한 방법들을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 두 문헌은 본 발명에 전체로서 참조를 위하여 포함된다. 변이체들을 인코딩하는 핵산들은 단백질을 발현시키기 위하여 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 발현 벡터들은 일반적으로 실시가능하게 제어 또는 조절 서열, 선택가능한 마커들, 융합 파트너들(fusion partners), 및/또는 부가 요소들과 사용가능하게 결합된 단백질, 즉 작용 관계에 위치하는 단백질을 포함한다. 본 발명의 변이체(예를 들면, lgG 변이체들)는 단백질 발현을 유도 또는 야기하기에 적합한 조건하에서 핵산, 바람직하게는 발현 벡터로 변형된 숙주 세포를 배양하여 제조될 수 있고, 상기 핵산들은 변이체를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 넓은 범위의 다양하고 적절한 숙주 세포 라인이 사용될 수 있고, 이들은 포유류 세포, 박테리아, 곤충세포 및 이스트를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 찾아서 사용할 수 있는 다양한 포유류 세포 라인들은 American Type Culture Collection에서 유용한, ATCC 세포 라인 카탈로그에 기술되어 있다. 숙주 세포는 한정되지는 않지만, YB2/0 (YB2/3HL.P2.Gll.lGAg.20 cell, American Type Culture Collection에 기탁됨, ATCC n°CRL-1662), SP2/0, YE2/0, 1R983F, Namalwa, PERC6, CHO 세포 라인들, 특히 CHO-K-1, CHO-Lecl0, CHO-Lecl, CHO-Lecl3, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, KGH6, NSO, SP2/0-Ag 14, P3X63Ag8.653, C127, JC, LA7, ZR-45-30, hTERT, NM2C5, UACC-812 등 일 수 있다. 외인성 핵산을 숙주 세포로 도입하는 방법들은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고, 사용되는 숙주 세포에 따라 다양할 것이다. 본 발명의 바람직한 실시 형태에서, 변이체는 YB2/0 세포에서 발현되고, anti-CD20 항체 또는 anti-RhD 항체이다.

또한, 본 발명에 따른 변이체는 형질전환 비인간 동물 또는 형질전환 식물에 의해 제조될 수 있다. 또한 형질전환 비인간 동물은 원하는 유전자를 수정란에 직접 주입하여 얻어질 수 있다((Gordon et al., 1980 Proc Natl Acad Sci U S A.;77:7380-4). 형질전환 비인간 동물은 마우스, 토끼, 래트, 염소, 소 또는 가금류 등을 포함한다. 원하는 유전자를 가진 형전전환 비인간 동물은, 원하는 유전자를 배아 줄기 세포(embryonic stem cell)로 도입하고 집합 키메라 방법(aggregation chimera method ) 또는 주입 키메라 방법으로 동물을 제조하여 얻어질 수 있다(Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)). 배아 줄기 세포는 마우스(Evans and Kaufman, 1981, Nature; 292:154-156), 래트, 염소, 토끼, 원숭이, 가금류, 소 등의 배아 줄기 세포들을 포함한다. 또한 형질전환 비인간 동물은 원하는 유전자가 도입된 핵을 탈핵시킨 난자에 이식하는 방법인 클론 기술을 사용하여 제조될 수 있다(Ryan et al. , 1997 Science; 278: 873-876; Cibelli et al ., 1998 Science, 280: 1256-1258). 폴리펩타이드 변이체는 DNA 인코딩 변이 분자를 상기한 방법으로 제조된 동물에 도입하여 제조할 수 있고, 그러므로 동물에 변이 분자가 형성되고 축적되게 하여, 동물로부터 폴리펩타이드 변이체를 축적하게 된다. 폴리펩타이드 변이체는 동물의 우유, 계란 등에 형성되고 축적될 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 최적화된 변이체들인 Fc 변이체들을 발견하는 것으로서, 즉, 상응하는 야생형 Rc 영역과 비교하여 Fc 영역에서 증가된 결합력을 가진 Fc 변이체들을 동정하는 것이다. 상기 방법들은 다음의 단계들을 포함한다:

(ⅰ) Fc 변이체들을 인코딩하는 일련의 핵산으로 이루어진 핵산 라이브러리를 만드는 단계;

(ⅱ) 상기 라이브러리에 포함된 핵산의 발현에 의해 Fc 변이체들을 생산하는 단계;

(ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)에서 생산된 Fc 변이체들 중에서 Fc 리간드와 결합할 수 있는 것들을 선택하는 단계;

(ⅳ) 상기 단계 (ⅲ)에서 선택된 Fc 변이체들의 결합 특성 및 Fc 리간드에 대한 Fc 대조군의 결합 특성 및

(ⅴ) 상기한 Fc 대조군과 비교하여 Fc 리간드에 대한 증가된 결합을 나타내는 Fc 변이체들을 선택하는 단계.

상기 핵산 라이브러리에 포함된 핵산 서열은 RNA 또는 DNA일 수 있다. 바람직한 실시 형태로서, 상기 라이브러리는 Fc 변이체들을 인코딩하는 DNA 서열을 포함한다.

Fc 대조군은 야생 Fc 영역 및 Fc 리간드에 대한 야생 Fc의 결합 특성과 동등하거나 더 높은 결합 특성을 가진 것으로 알려져 있는 Fc 변이체들로 이루어진 군에서 선택된다.

Fc 리간드는 FcRn 및 Fc.gamma.수용체에서 선택될 수 있고, 이들에 한정되는 것은 아니다.

일 실시 형태로서, Fc 변이체들을 인코드하는 라이브러리의 DNA 서열은 야생 Fc를 인코딩하는 DNA 서열을 변경시켜서 생산할 수 있다. 여기에서 사용된 "핵산 서열의 변경"이란, 주어진 핵산 서열에서 뉴클레오티드를 삽입, 결실 또는 치환하는 것과 같은 돌연변이의 도입을 의미한다. 이러한 돌연변이들은 선행기술에서 잘 알려진 방법들을 사용하여 실시할 수 있다. 이러한 방법들은 무작위 돌연변이 유발, 부위 특이적 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발 및 카세트 돌연변이 유발을 포함하며, 이들에 한정되는 것은 아니다.

바람직한 실시 형태로서, 라이브러리는 하나 이상의 낮은 정확도를 갖는 DNA 폴리머라제(low fidelity DNA polymerases)에 근거한 무작위 돌연변이 유발에 의해 만들 수 있다. 이러한 무작위 돌연변이 유발은 PCT 국제출원 WO 0238765에 기술되어 있고, 본 발명에서 참조를 위하여 전체로서 포함된다. 따라서 라이브러리는 하나의 단일 폴리머라제 또는 상기 출원의 일부 실시예의 재료 및 방법에서 기재된 단일 폴리머라제 또는 특정 폴리머라제 결합으로 생성된 서브-라이브러리들을 혼합하여 만들 수 있다.

또 다른 실시 형태로서, 상기 핵산 라이브러리는 상기에서 언급된 방법 중 하나를 사용하여 사전에 최적화된 Fc 변이체들의 풀(pool)을 인코딩하는 DNA 서열을 변경하여 만들 수 있다. 무작위 돌연변이 유발은 바람직하게 사용된다. 미리 최적화된 Fc 변이체들은 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 야생 Fc와 비교하여 Fc 리간드에 대한 증가된 결합을 나타낸다. 미리 최적화된 Fc 변이체들은 야생 Fc와 비교하여 바람직하게는 1 내지 4개의 아미노산 변형을 가진다. 이러한 미리 최적화된 Fc 변이체들은 야생 Fc의 돌연변이로 만들어진 라이브러리를 스크리닝하여 얻어질 수 있다. 또한 그들은 선행기술에 개시된 Fc 변이체들을 참조한다(예를 들면, 본 발명의 첫 부분에서 기재한 관련 기술분야의 특허 명세서 참조). 미리 최적화된 Fc 변이체들의 풀(pool)은 몇 개의 폴리펩타이드, 더 바람직하게는 약 2 내지 약 100개의 미리 최적화된 변이체들을 포함한다.

미리 최적화된 변이체들에서 만들어진 라이브러리들은 더 최적화된 Fc 변이체들을 선택할 수 있게 한다. 이해를 돕기 위해, 이러한 라이브러리의 스크리닝에서 선택된 최상의 Fc 변이체들의 결합 친밀도를 나타내는 본 발명 명세서의 표 5를 참조하라.

단계 (ⅱ), 즉 Fc 변이체들의 발현은 이미 기술된 것처럼 숙주 세포를 사용하는 공지의 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 실시 형태에 따르면, Fc 라이브러리는 표준 과정을 사용하여 박테리오파지의 표면(파지 디스플레이)에서 발현된다(Smith, Science, 1985, 228: 1315 참조).

단계 (ⅲ)은 FC 변이체들-Fc 리간드 복합체를 생산하고, 다음으로 미결합된 Fc 변이체들에서 결합된 Fc 변이체들을 분리하는 것에 의해 실시될 수 있다. 이러한 분리 단계를 실시하기 위하여, Fc 리간드는 유리하게도 고체 지지체 위에 고정화되거나, 단계 (ⅲ)의 공정 동안 고체 지지체 위에 고정화될 수 있다. 이러한 과정의 실시예들이 본 발명의 실시예 1에 기술되어 있다. 단계 (ⅲ)은 바람직하게는 가장 효과적인 Fc 리간드들을 찾을 수 있는 여러 개의 선택들을 포함한다(이해를 위하여 실시예 2 참조).

단계 (ⅳ)에서는 Fc 리간드에 대한 Fc 변이체들의 결합 특성이 선행 기술에서 알려진 방법으로 평가될 수 있다. 예를 들면, 본 기술 분야의 통상의 기술자들은 적절한 ELISA를 실시할 수 있다. 변이체들은 특정 신호가 모 Fc(Fc parent) 보다 적어도 1.2배 더 강해지면 선택된다. 적절한 ELISA 분석들은 본 발명의 실시예 Ⅱ 및 실시예 Ⅳ에 설명된 것처럼 분리된 Fc 또는 파지(phage) 상에 나타낸 Fc에 대하여 실시할 수 있다.

또 다른 목적 또는 확인된 목적으로서, 본 기술분야의 당업자들은 본 발명의 실시예 Ⅳ에서 설명된 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Responce, SPR) 실험에 사용하는 해리상수(dissociation constant)를 결정할 수 있다. 변이체들이 모 Fc 변이체들보다 3배 낮은 해리상수를 가지면, 상기 변이체는 단계 (Ⅴ)에서 선택된다.

본 발명은 아래 실시예의 의하여 구체적으로 설명되지만, 이들에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1:

Fc-야생형과 비교하여 FcRn에 대하여 증가된 결합을 나타내는 Fc 변이체들 및 이들 변이체들의 결합 특성 발견

Ⅰ. 재료 및 방법

Ⅰ.1. 인간 FcRn의 발현 및 정제

바큐로바이러스계(baculovirus system)를 사용한 용해성 인간 FcRn의 발현은 이전에 기술된 GTP 기술(Labge, France)에 의해 실시되었다(Popov et al., Mol. Immunol. 33:521-530 (1996). 선도 펩타이드를 인코딩하는 α쇄 cDNA 및 세포밖 도메인(코돈 1-290)이 TEV 서열 및 6x 폴리히스티딘 태그로 태그되었다. 유도체 α쇄 및 β2 마이크로글로불린 쇄는 각각 P10 및 폴리헤드린(polyhedrine) 프로모터 존재하에서 pFastBacDual로 클론되었다. FcRn의 비오틴화(FcRn-biot) 버젼은 제조사의 프로토콜에 따라 FluoReporter® Biotin-XX Protein Labeling Kit, F2610 (Molecular Probes)과 화학적으로 결합시켜 제조되었다. 융합 단백질(fusion protein)은 또한 박테리오파지 p3 단백질 및 CVDE 단백질(FcRn-p3)와 융합된 β2 마이크로글로불린 쇄 및 α쇄를 포함하도록 제조되었다. 90% 이상의 순수 단백질이 IgG-세파로오스(Sepharose) 및 IMAC 정제 단계 후에 얻어졌다.

Ⅰ.2. Fc 라이브러리의 구성

아미노산 잔기 226-447(카바트(Kabat)의 EU 인덱스) 인간 Fc 유전자, 즉 인간 IgG1 중쇄(SEQ n°1)에서 유도된 Fc 폴리펩타이드(Poul MA et al., Eur. J. Immunol. 25(7): 2005-2009 (1995))는 표준 PCR 프로토콜을 사용하여 BamHI/EcoRI 단편으로서 파지플라스미드복합체(phagemid) 벡터 pMG58(pMG58_Fc226, 도 1) 안으로 클론되었다. 상기 벡터는 도 1에 도시하였다. 완전하게 랜덤화된 몇 개의 라이브러리들은, 랜덤 돌연변이들을 전체 타겟 서열에 균일하게 도입하기 위하여, 낮은 정확도를 갖는 인간 DNA 폴리머라제(뮤타아제)를 사용하는 MUTAGEN^TM 공정(WO 0238756)을 사용하여 제조하였다. 세 개의 개별 뮤타아제(mutases)(pol β, pol η, 및 pol ι)가 상보적인 돌연변이 패턴들을 만들기 위하여 서로 다른 조건에서 사용되었다. 이들 인간 폴리머라제들은 선행문헌에 기술되어 있는 방법으로 생산되고 정제되었다(Mondon et al., Biotechnol J. 2: 76-82 (2007), Emond et al. Protein Eng. Des. Sel. 21: 267-274(2008)).

Ⅰ.2-a mutagen™ 공정의 돌연변이 유발

인간 Fc 유전자(Fc 유전자)는 5' 프라이머 MG_619: 5'-AGTACTGACTCTACCTA GGATCCTGCCCACCGTGC-3'(SEQ ID N°5) 및 3' 프라이머 MG_621 5'-ACTGCTCGATGTCCGTACTATGCGGCCGCGAATTC-3'(SEQ ID N°6) (BamHI 및 EcoRI 제한부위(restriction sites)는 밑줄로 표시하고 비특이성 테일은 이태리체로 표시함)를 사용하는 뮤타아제로 이중 복제되었다. 주형으로서 pMG58_Fc226 플라스미드 0.6μg(Mut1 라이브러리를 위한 야생형 Fc 또는 Mut2 라이브러리를 위하여 Fc 변이들), 프라이머 MG_619 및 MG_621 (각각 250nM) 및 적절한 복제 완충용액(상세구성은 아래 참조)을 포함하는 혼합물을 5분 동안 95℃에서 혼합하고, 즉시 4℃로 냉각하여 DNA 가닥을 변성시켰다. pol β를 위한 복제 완충용액은 50mM의 Tris HCl pH 8.8, 10mM의 MgCl₂, 10mM의 KCl, 1mM의 DTT 및 1%(v/v) 글리세롤이다. pol η(pol η 또는 pol ι)을 위한 복제 완충용액은 25mM의 Tris HCl pH 7.5, 5mM의 MgCl₂, 10mM의 KCl, 1mM의 DTT 및 2.5%(v/v) 글리세롤이다. 변성 단계 후 돌연변이성 복제는 dATP/dCTP 50μM, dTTP/dGTP 100μM 및 pol β 1μg 또는 dNTPs 100μM 및 pol η 1μg(또는 pol η 및 pol ι, 각 뮤타아제 1μg)를 첨가하여 실시하였다. 복제 반응은 37℃에서 2시간 동안 실시하였다. 그 다음 복제 산물은 탈염되고 마이크로콘 컬럼(microcon columns) (Millipore)으로 농축되었다.

Ⅰ.2.b. 선택적 증폭 및 돌연변이된 조각의 클로닝

위에서 얻어진 복제 산물은 테일 프라이머들을 가지고 선택적 PCR을 통하여 증폭되었다. 프라이머들(MG_619 및 MG_621)은 뮤타아제에 의해 합성된 DNA 조각들을 특이적으로 증폭시키는 주형에 대하여 비상보적인 테일을 가지고 설계하였다. 복제 산물의 일부는 PCR 완충용액(20mM의 Tris-HCl pH 8.4, 50mM의 KCl), 1.5mM의 MgCl₂, 10pmol의 5' 및 3' 프라이머들, 200μM의 dNTPs 및 1.25 U 플래티늄 태그 DNA 폴리머라제(InvitroGen)를 포함하는 혼합물에 첨가되었다. PCR 사이클은 다음과 같다. 첫 번째 사이클: 94℃에서 2분, 64℃에서 10초, 75℃에서 30초, 94℃에서 1분, 및 다음으로 30회의 선택적 사이클: 94℃에서 20초 및 75℃에서 30초.

중폭된 복제 산물은 1%(v/v) 아가로오스 겔 상에서 정제되고, BamHI 및 EcoRI 제한효소로 분해되고, pMG58 벡터안으로 클론되었다. 결합 혼합물들은 electrocompetent E. coli XL1-Blue 세포로 형질전환(transform)되고, 다음으로 고체 2YT 배지(16g/l의 펩톤, 10g/l의 이스트 추출물, 5g/l의 NaCl, 15g/l 의 한천)에 분주되었다. 성장 후, 콜로니의 수는 라이브러리의 크기를 측정하여 결정되었고, 라이브러리당 96개의 클론들이 무작위로 PCR로 보내졌고, 고속 대량 DNA 염기서열 분석을 실시하였다. 세포들은 15% 글리세롤로 2YT 배지에서 스크랩(scrap)되고, 동결시켜서 -80℃를 유지하였다.

돌연변이 유발 및 스크리닝의 첫 번째 회차(MS1)에서, 4개의 다른 라이브러리가 구성되었다. 첫 번째 라이브러리는 야생형 Fc 유전자 위에 pol β를 사용하여 얻었고, 3.2×10⁶ 클론들(즉, Mut 1.1)을 포함하였다. 첫 번째 라이브러리의 DNA는 각각 pol β(3.8×10⁶클론, Mut1.2) 및 pol η 및 pol ι(3.0×10⁶ 클론, Mut1.3)을 사용하여, 두 번째 및 세 번째 라이브러리를 제조하는데 사용되었다. 두 가지의 누적 복제 단계들에서 이러한 원칙들은 돌연변이 발생율을 증가시켰다. 네 번째 라이브러리는 야생형 Fc 유전자(1.0×10⁶ 클론, Mut1.4) 위에서 폴리머라제 η만으로 제조되었다. 마지막으로, 이들 4개의 라이브러리들은 비례하여 혼합되어 Mut1(1.1×10⁷의 다른 클론들로 나타남)으로 불리는 마지막 라이브러리를 얻게 된다.

돌연변이 유발 및 스크리닝의 두 번째 회차(MS2)에서, 두 개의 다른 라이브러리는 MS1 동안 분리되고, 파아지-ELISA에 의해 개선된 Fc-Rn 결합력을 가진 42개의 단독 및 이중 돌연변이의 DNA 풀을 사용하여 구성된다. 첫 번째 라이브러리는 pol β(1.9×10⁷ 클론, Mut2.1)를 사용하여 얻어졌고, 두 번째 라이브러리는 pol η(1×10⁶ 클론, Mut2.2)를 사용하여 얻어졌다. 마지막으로 이들 두 개의 라이브러리는 비례해서 혼합되어 Mut2(2×10⁷ 클론들로 나타남)로 불리는 마지막 라이브러리를 얻게 된다.

Ⅰ.2.c. 염기서열분석에 의한 Fc 라이브러리의 품질 관리(Quality control)

상기에서 제조된 서로 다른 라이브러리들의 품질은 Fc 유전자(5' 프라이머 5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3' (SEQ ID NO: 7) 및 3' 프라이머 5'-TCACGTGCAAAAGCAGCGGC -3' (SEQ ID NO:8) 및 고속 대량 염기서열분석(5' 프라이머 5'- TGATTACGCCAAGCTTGC -3' (SEQ ID NO:9)을 가짐)을 증폭시켜서 세포 위 PCR에 의해 분석되었다. 각 라이브러리(Mut1.1 내지 Mut1.4 및 Mut 2.1 내지 Mut2.2)에서 랜덤하게 수집된 96개의 클론의 서열은 그렇게 함으로써 결정되었다. 마지막으로 라이브러리 Mut1에 모여있는 35개의 클론들과 라이브러리 Mut2에 모여있는 86개의 클론들은 선택 공정 전에 최종 라이브러리의 품질을 관리하기 위하여 염기서열이 분석되었다.

돌연변이된 서열의 변이체는 앞에서 기술한 Mutanalyse 2.5 소프트웨어에서 Fc 분자를 위하여 조정된 MilleGen 소유 소프트웨어 Mutanalyse4Fc을 사용하여 분석되었다(Mondon et al., Biotechnol J. 2: 76-82 (2007)). 이 분석은 돌연변이가 어떠한 "빈발부위(hot spot)" 없이, 유전자 전체에 무작위로 분포되어 있다는 것을 확인시켜 주었다.

Mut1 분석: Mut1 라이브러리의 돌연변이 빈도는 킬로베이스(kb)당 6.3개의 돌연변이가 발생하고, 이는 유전자(666 nt)당 4.2개의 돌연변이를 의미한다. 이들 돌연변이들 중에서 81.4%는 치환(substitution), 16.8%는 결실(deletion)이고, 1.8%는 부가(addition)이고, 이들 마지막 두 개의 카테고리들은 유전자에서 구조이동(frame shift)이 도입된 것이다. 프레임에서 서열만을 고려하면, 돌연변이 빈도는 kb당 4.0개의 돌연변이이고, 즉 유전자당 2.7개의 돌연변이(유전자당 1 내지 6개의 돌연변이된 뉴클레오티드)이다. 돌연변이 분석은 라이브러리의 활성 부분을 결정하기 위하여 또한 단백질 수준에서 실시되었다. 마지막으로 Mut1 라이브러리는 28.6%의 야생형 단편을 발현하는 클론들(돌연변이 되지 않았거나, 잠재성 돌연변이임), 40.0%의 프레임 밖의 서열을 포함하거나 중지 코돈(발현되지 않음)을 가진 클론들, 및 31.4%의 돌연변이된 서열을 가진 클론들(Fc 변이체)을 포함한다. 이들 중 중 마지막 클론들은 라이브러리의 활성 부분을 나타내며, 분자당 평균 2.3개의 돌연변이된 아미노산을 가진 3.5×10⁶개의 다른 클론들을 포함한다.

Mut2 분석: Mut2 라이브러리의 돌연변이 빈도는 킬로베이스(kb)당 4.5개의 돌연변이가 발생하고, 이는 유전자당 3.0개의 돌연변이를 의미한다. 이들 돌연변이들 중에서 96.3%는 치환(substitution), 3.2%는 결실(deletion)이고, 0.5%는 부가(addition)이다. 프레임에서 서열만을 고려하면, 돌연변이 빈도는 kb당 4.3개의 돌연변이이고, 즉 유전자당 2.9개의 돌연변이(유전자당 1 내지 7개의 돌연변이된 뉴클레오티드)이다. 단백질 수준에서, Mut2 라이브러리는 17.4%의 야생형 단편을 발현하는 클론들(돌연변이 되지 않았거나, 잠재성 돌연변이임), 9.3%의 프레임 밖의 서열을 포함하거나 중지 코돈(발현되지 않음)을 가진 클론들, 및 73.3%의 돌연변이된 서열을 가진 클론들(Fc 변이들)을 포함한다. 이들 중 중 마지막 클론들은 라이브러리의 활성 부분을 나타내며, 분자당 평균 1.9개의 돌연변이된 아미노산을 가진 1.5×10⁷개의 다른 클론들을 포함한다.

Ⅱ. Fc 라이브러리의 파지 디스플레이 발현 및 개선된 바인더(binder)의 FcRn 선택

Fc 라이브러리는 표준 공정을 사용하여 박테리오파지의 표면에서 발현되었다(Smith GP, Science 228: 1315 (1985)). Mut1 라이브러리를 포함하는 E. coli XL1-Blue 박테리아(pMG58 벡터)는 100μg/ml의 앰피실린, 15μg/ml의 테트라사이클린 및 1%(w/v)의 글루코오스로 보충된 60ml의 2YT에서 30℃, 230rpm에서 OD_600nm=0.6에 도달할 때까지 성장하였다. 다음으로 세포들은 M13 헬퍼 파지(M13KO7, Biolabs, bacteria/phage의 비 = 1/3)로 37℃에서 20분간 감염되었고, 파지-Fc 생산은 IPGT 0.5mM 및 카나마이신 30μg/ml를 포함하는 2YT/앰피실린/글루코오스에서 26℃, 230rpm의 조건에서 밤새도록 계속되었다. 다음날, 파지들은 표준 프로토콜을 사용하여 PEG6000으로 침전시키고, 1ml의 인산염 완충용액 pH6(인산나트륨 100mM, 염화나트륨 50mM pH 6.0, P6라고 함)으로 재현탁시키고, 감염된 XL 1-Blue 세포들을 감염시켜서 적정하였다. 세 개의 선택 전략들은 다른 조건을 사용하여 적용하였고(도 2), 3 내지 8의 선택 회차들은 각 전략을 따라 실시되었다(아래 참조).

Ⅱ. 1. 고체상에서의 선택들(전략 1 및 2)(도 2A 참조):

고체상 선택들에서, P6/5% 탈지 우유(skimmed milk)/0.1% Tween 20에서 4×10¹¹ 파지들이 Maxisorp immunoplates의 8웰에서 배양되었다. 상기 Maxisorp immunoplates는 0.5μg의 neutravidin 및 0.5μg의 비오틴화된 FcRn(전략 1) 또는 0.5μg의 FcRn-p3(전략 2)로 미리 코팅되었고, P6에서 5% 탈지우유(skimmed milk)로 차단되었다. 37℃에서 2시간 배양한 후, 웰들(wells)은 P6/0.1% Tween 20으로 20회 세척되고, 100μl의 인산염 완충용액 pH7.4(인산염 나트륨 100mM, 염화나트륨 50mM pH 7.4)에서 37℃에서 2시간 배양하여 용출시켰다. 적정(titration) 후에 용출된 파지들은 기하급수적으로 성장하는 XL1-Blue 박테리아 10ml를 재감염시키는데 사용되고, 다음으로 고체 2YT 배지/앰피실린/글루코오스 위에 분주되었다. 다음날, 세포들은 15% 글리세롤을 이용하여 2YT 배지에서 스크랩(scrap)되고, 동결시켜서 다음 회차의 선택까지 -80℃를 유지하였다.

Ⅱ. 2. 액체상에서의 선택(전략 3)(도 2B 참조):

액체상에서의 선택을 위하여, 4×10¹¹파지들은 1ml의 P6/5% 탈지우유/0.1% Tween 20에서 저속으로 교반하면서 실온에서 1 시간 동안 250nM 또는 100nM의 비오틴화된 FcRn으로 먼저 배양되었다. 마그네틱 비즈(Dynal)로 코팅된 Streptavidin은 미리 5%의 탈지 분유로 P6에서 차단되고, 실온에서 30분 동안 파지가 첨가되었다. 파지-비드(phage-bead) 복합체들은 자석을 사용하여 P6/0.1% Tween 20으로 15회 세척되었다(magnetic particle concentrator, Dynal). 파지들은 500μl의 인산염 완충용액 pH7.4(인산나트륨 100mM, 염화나트륨 50mM, pH 7.4)에서 2시간 동안 실온에서 배양하여 용출시켰다. 비드들은 자석을 사용하여 제거되고, 상청액에서 용출된 파지들은 모아졌다. 적정 후에, 용출된 파지들은 용출된 파지들은 기하급수적으로 성장하는 XL1-Blue 박테리아 10ml를 재감염시키는데 사용되고, 다음으로 고체 2YT 배지/앰피실린/글루코오스 위에 분주되었다. 다음날, 세포들은 15% 글리세롤을 이용하여 2YT 배지에서 스크랩(scrap)되고, 동결시켜서 다음 회차의 선택까지 -80℃를 유지하였다.

Ⅱ. 3. 서열분석:

스크리닝 공정 동안(MS1 및 MS2), 각 전략에서, 3회차에서 8회차까지, 48 내지 96 클론들이 세포상에서 PCR 후에 서열분석되었다(상기 Ⅰ.2-c 참조). 서열 분석은, 선택된 Fc 변이체들을 신속하게 분석하기 위하여 내부적으로 개발된 MilleGen 소유 소프트웨어 AnalyseFc를 사용하여 수행되었다. Fc 변이체들은 그들이 분리된 선택 회차에 따라서 명명되었다(Mut1 스크리닝: 전략 1에서는 B3A 내지 B6A, 전략 2에서는 S3A 내지 S6A, 및 전략 3에서는 L3A/B 내지 L6A-F, Mut2 스크리닝: 전략 1에서는 C3A 내지 C8A, 전략 2에서는 T3A 내지 T8A 및 전략 3에서는 M3A/B). 숫자들(1 내지 96)은 서열분석을 위한 PCR 플레이트 상의 위치(localisation)를 가리킨다. 마지막으로 전체 선택 공정에서 227개의 다른 돌연변이된 클론들이 Mut1을 위하여 분리되었고, 223개의 다른 돌연변이된 클론들이 Mut2를 위하여 분리되었다. 이들 모든 클론들은 파지-ELISA 분석을 사용하여 특정되었다.

Ⅱ. 4. 직접 돌연변이유발:

MS1에서 분리된 개량된 Fc 변이체들의 서열 분석은 다수의 클론들이 유사한 돌연변이를 포함한다는 것을 보여주었다(N434Y, N434S, P230S, P230T...). 직접 돌연변이유발은 관련된 돌연변이들의 효과를 드러내기 위하여 이들 돌연변이들을 제거하고 실시하였다. 이들 새로운 돌연변이체는 모 클론에 기반하여 이름 말단에 A 또는 B를 부가하여 명명되었다. 61개의 새로운 돌연변이체들이 검사되었다. 이들 돌연변이체 중 일부를 표 1에 나타내었다. 긍정적으로 여겨진 돌연변이체들은 파지 ELISA 분석에서 Fc-WT보다 1.2 내지 2.6배 사이로 높은 특정 신호(specific signal)를 가지고 있다(아래 참조). MS2 이후, 몇 개의 새로운 돌연변이체들은 힌지 영역(hinge region)에서 하나 또는 두 개의 돌연변이를 부가하는 것에 직접 돌연변이유발이 구성되었다(P230S 또는 P228L 또는 P228R 또는 P228L/P230S 또는 P228R/P230S). 이들 돌연변이체는 모 클론에 기반하여 이름 말단에 문자(A 내지 G)를 부가하여 명명되었다. 24개의 새로운 돌연변이체들은 테스트되어 표 5에 나타내었다.

Ⅱ. 5. 선택된 변이체들의 파지-ELISA 분석(도 3):

파지 상에 나타나는 MS1 및 MS2 동안 분리된 변이체들의 결합 특성들은 웰상에 코팅된 FcRn-p3로 pH6.0에서 ELISA 테스트를 사용하여 결정되었다(도 3). 요약하면, 파지-Fc 변이체들은 헬퍼 파지 M13K07으로 감염된 2YT/앰피실린/글루코오스에서 800μl 배양균(cultures)의 96-웰 플레이트상에서 클론들을 분리하여 생산되었다(다음 단락에서 설명됨). 26℃에서 하룻밤 동안 생산된 파지들은 3000g으로 30분간 원심분리한 후, 상청액에서 회수되었다. 이들 상청액은 P6/5% 탈지 우유/0.1% Tween 20에서 직접 희석되고(1/2 및 1/4), 0.25μg의 FcRn-p3/웰로 미리 코팅되고, P6에서 5% 탈지 우유로 차단된 Maxisorp immunoplate 상에서 검사되었다. 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, 웰들은 P6/0.1% Tween-20으로 3회 세척되고, 결합된 파지들이 HRP anti-M13 항체로 검출되었다(GE Healthcare).

ELISA 테스트를 사용하여, MS1 동안 227개의 Fc 변이체들이 야생형 FC(Fc-WT) 및 양성 대조군(positive control)과 비교하여 검사되었다. 이 양성 대조군(소위 Fc-H 변이체들)은 이중 돌연변이체 T250Q/M428L이고, FcRn에 대한 개선된 친화력을 가진 것으로 기술되어 있다(x28, Hinton PR et al., J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216 (2004)). 이 변이체는 돌연변이된 코돈과 제한 부위를 포함하는 두 개의 긴 올리고뉴클레오티드를 갖는 표준 PCR 프로토콜에 의해 생성된다. 5' 프라이머 5'-CGGGATCCTGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACCAACTCATGATCTCCCGGAC -3' (SEQ ID NO:10) 및 3' 프라이머 5'-GCGAATTCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGCGTGTAGTGGTTGTGCAGAGCCTCATGCAGCACGGAGCATGAGAAG -3' (SEQ ID NO:11) (BamHI 및 EcoRI 제한부위들은 밑줄로 표시하였고, 회색 문자들은 돌연변이된 코돈과 일치한다). 파지-ELISA 분석에서, Fc-H 변이체는 야생형 Fc, 즉 Fc-WT에 비하여 평균적으로 3.2배 강한 특정 신호를 가졌고(변이체/Fc-WT 비율), 검사된 227개의 Fc-변이체들 중에서 73개의 변이체들이 ratio/Fc-WT>3.2를 가졌다. 이는 Fc-H 변이보다 FcRn에 대한 결합력이 더 좋다는 것을 의미한다(표 2). MS1 유래이고 단일 점 아미노산 변형을 가진 양성 변이체들은 야생형 Fc보다 약 1.2배 내지 3.5배 더 강한 특정 신호를 가진다(표 1 참조)

표 1: MS1에서 동정된 단일 아미노산 변형을 가지거나 직접 돌연변이 유발에 의해 얻어진 변이체들

표 2: MA1에서 선택된 변이체들

MS2 동안 선택된 223개의 변이체들은 동일한 ELISA 프로토콜을 사용하여 시험하였으나, Fc-H 변이체 및 MS1 동안 분리된 최상의 Fc 변이체들(S5A_41)과 비교되었다. 이는 Fc-WT 신호와 Fc 변이체들의 신호의 차이가 동일한 ELISA 플레이트와 비교하기에는 너무 크기 때문이다. 시험된 223개의 Fc 변이체들 중에서 209개의 Fc 변이체들은 Fc-H보다 더 좋았고(ratio/Fc-H>1.1) 39개의 Fc 변이체들은 MS1동안 분리된 최상의 Fc 변이체들보다 더 좋았다. Fc-WT를 갖는 변이체들과 비교하기 위하여, 추정된 ratio/Fc-WT는 변이체들의 ratio/Fc-H를 MS1 동안 결정된 Fc-H의 ratio/Fc-WT(=3.2)에 곱하여 계산된다(ration/Fc-WT=3.2 × ratio/Fc-H)(도 3).

표 3: MS2의 변이체들

전체적으로 Fc-H보다 FcRn에 대하여 보다 향상된 결합력을 갖는 Fc 변이체들은 MS1 및 MS2 공정 동안 분리되었다. 이들 282개의 Fc 변이체들의 서열을 분석한 결과, 그들이 115개의 다른 위치의 분자 곳곳에서 돌연변이를 포함한다는 것이 나타났다(표 4).

표 4: MS1 및 MS2 변이체들의 돌연변이

또한, 16개의 위치들은 바람직하게 돌연변이 되었고, 핵심 위치로 간주된다: C226, P230, F241, V264, T307, N315, A330, Q342, Q362, A378, E382, N389, P396, V397, N421 및 N434. 특히 다음의 4개의 위치들은 더 바람직하게 돌연변이 되었고, 가장 바람직한 핵심 위치로 간주된다: V264, N315, A378 및 N434 (도 4).

MS2의 Fc 변이체들은 최상의 MS1 변이체들(S5A_41)과 비교하여 FcRn과의 결합이 더 좋았고, 이들은 표 5에 나타내었다.

표 5: MS2의 최상의 변이체들

Ⅲ. Fc 변이체들의 E.coli 발현

MS1 및 MS2 공정 동안 분리된 Fc-H 변이체 및 Fc 변이체들에 더하여 Fc-WT 서열은 pMG58 파지플라스미드 복합체 벡터(phagemid vector)에서 pMG62 벡터로 서브클론되었고, BamHI 및 EcoRI 제한 부위를 사용하여, 정제를 위한 C-말단 6xHis 태그 및 ELISA 분석에서 검사하기 위한 V5 태그를 가지고 가용성 주변세포질 발현(periplasmic expression)이 가능하다. 재조합 Fc 폴리펩타이드의 제조는 HB2151 E.coli 가닥에서 수행하였다(20℃에서 16시간 동안 0.5mM IPTG로 유도됨). 정제는 표준 프로토콜을 사용하여 Ni-NTA 상에서 실시하였고, 각 폴리펩타이드는 약 200-500μg이 획득되었다.

Ⅳ. ELISA 및 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용한 Fc 변이체들의 FcRn 결합력 평가

Ⅳ.1. Fc_WT과 비교한 S5A_41, S3A_07 및 Fc-H 변이체들의 FcRn 결합력 평가

Ⅳ.1.a ELISA 분석

가용성 구성방식에서 생산된 Fc 변이체들의 결합 특성은 웰 위에 FcRn-p3를 코팅하고 pH 6.0에서 ELISA 시험을 사용하여 Fc-WT와 비교하여 결정되었다. 연속적으로 P6/5% 탈지 우유/0.1% Tween-20에서 희석된 정제된 Fc 변이체들(Ⅲ에서 기술됨)은 미리 0.25μgdml FcRn-p3/웰로 코팅되고 P6에서 5% 탈지 우유로 차단된 Maxisorp immunoplates 위에서 시험되었다. 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, 웰들은 P6/0.1% Tween-20으로 세척되고, 결합된 Fc-변이체들은 HRP anti-V5 항체(invitroGen)를 사용하여 검출되었다(OD_450nm 측정)(도 5a). ELISA 시험은 MS1에서 최상의 변이체인 S5A_41, 및 Fc-H 변이체와 동등한 변이체인 S3A_07, 및 Fc-H 변이체에서 실시되었다. 이들 ELISA 시험은 Fc-H, S5A_41 및 S3A_07이 Fc-WT와 비교하여 FcRn에 대하여 개선된 결합력을 갖고 있다는 것을 확인해주었다(도 5b, 도 5c 및 도 5d). 각각의 결합 곡선에서, 50% 곡선 포화시(EC50) Fc 농도를 측정하여 Fc-WT와 비교한 Fc 변이체들의 결합 특성을 평가하는데 사용하였다. 그렇게 함으로써 얻어진 비율은 S5A_41이 Fc_H 변이체들보다 더 잘 결합하고, S3A_07이 Fc-H 변이체와 동일하다는 것을 확인하였다(표 6).

Ⅳ.1.b. SPR(표면 플라즈몬 공명) 분석

고정된 FcRn을 가진 Fc 변이체들의 상호작용은 CM5 센서 칩(Biocore, GE Healthcare)을 사용하여 BIAcore X100 장치를 작동시며 모니터링하였다. 방법론은 Fc-FcRn 상호작용을 분석하기 위한 선행기술과 유사하였다(Popov S. et al., Mol Immunol. 33(6):521-530 (1996)). 재조합 가용성 FcRn은 아민-커플링 화학적 성질을 사용하여 센서 칩의 유동 셀(flow cell) 2에 결합되었다. 유동 셀들은 0.1M의 N-하이드록시숙신이미드 및 0.1M의 3-(N,N-디메틸아미노)프로필-N-에틸카보디이미드의 1:1 혼합물을 사용하여 30μl/min의 유량에서 3분간 활성화시켰다. 재조합 인간 FcRn(10mM 아세트산나트륨에서 5μg/ml, pH 5.0)은 8분간 10μl/min의 속도로 유동 셀 2에 주입되었고, 1200 내지 1300 반응 단위(response unit, RU)의 표면 밀도를 나타내었다. 표면들은 pH 8.5인 1M의 에탄올아민-HCl을 3분 주입하여 차단되었다. 유동 셀 1은 FcRn이 없는 대조군 표면으로 사용되었고, 샘플 유동 셀과 유사하게 준비하였다. 이러한 비어있는 유동 셀의 데이타는 샘플 데이터에서 차감되었다.

Fc 단편들은 PBS/Tween-20(50mM 인삼염 완충용액, pH 6.0, 150mM NaCl, 0.02% NaN₃, 0.01% Tween-20)에서 희석되었고, 상기 완충용액은 평형 결합 시험에서 전기영동용 완충용액으로 사용된다. 모든 측정은 25℃에서 실시되었고, Fc 단편 농도는 10μl/min의 유량에서 전형적으로 1 내지 200nM의 범위를 나타내었다.

데이터는 10분 동안 수집되었고, 0.05% Tween-20을 포함하는 pH 8의 PBS의 1-min 펄스(pulse)가 표면을 재생산하기 위하여 사용되었다.

센서그람(Sensorgrams)이 생성되고, BIAevaluation 소프트웨어 버젼 3.1을 사용하여 분석되었다. 각 주입에서 측정된 평형 RU는 Fc 농도에 대하여 플롯(polt)되었다. 평형 Kd 값은 BIAevaluation 소프트웨어에 포함되어 있는 안정적 상태의 친화력 모델(steady-state affinity model)을 사용하여 플롯 분석(analysis of the plots)에 의해 유도되었다.

그렇게 함으로써, 얻어진 Kd 비율은 S5A_41이 Fc-H 변이체들보다 더 우수한 결합력을 나타내고, S3A_07이 Fc-H와 동일하다는 것을 확인해주었다(표 6).

Ⅳ.1.c. 결과 요약

아래 표 6은 (i) 파지 ELISA, (ii) ELISA 및 (iii) SPR에 의하여 Fc_WT와 비교한 S5A_41, S3A_07 및 Fc-H의 FcRn 결합력 평가결과를 보여준다. 모든 경우에서, 변이체 S5A_41은 Fc_WT보다 유의적으로 높은 FcRn 결합 능력을 나타내었다.

표 6: ELISA 및 표면플라즈몬공명(SPR)을 사용한 Fc 변이체들의 FcRn 결합력 평가. 파지-ELISA 및 Fc-rec-ELISA에서, 비율은 Fc-WT 특정 신호에 의해 나눈 변이체 특정 신호를 의미한다. SPR에서, 비율(ration)은 변이체 Kd에 의해 나눈 Fc-WT Kd를 의미한다.

Ⅳ.2. SPR 및 ElISA에 의하여 Fc_WT와 비교한 다른 MS2 변이체들의 FcRn 결합력 평가

MS2에서 몇 개의 Fc 변이체들이 상기 Ⅲ장에서 개시된 것처럼 제조되었다. 각 변이체들이 FcRn에 결합하는 능력은 상기 Ⅳ.2.b. 및 Ⅳ.2.c.에 각각 기술된 (ⅰ) SPR 및 (ⅱ) ELISA에 의해 평가되었다.

결과들은 도 7에 나타내었다.

아래 표 7은 (ⅰ) SPR 및 (ⅱ) ELISA에 의하여 측정된 각 MS2 변이체들에서 얻어진 결과를 나타낸 것이다. ELISA-파지에 의해 얻어진 이전 결과들 역시 나타냈다.

ELISA 및 SPR 분석은 모든 Fc 변이체들이 야생형 Fc보다 FcRn에 대하여 더 나은 결합력을 갖는다는 것을 보여주며, 이는 파지-Fc 변이체들에 대한 ELISA 분석에 의해 얻어진 이전 결과들과 연관된다.

pH=6에서 MS2 변이체들의 Kd 값은 5.2 내지 22.7nM의 범위였고, 이는 Fc-WT와 비교하여 친화력(affinity)이 1.3 내지 5.8배 증가한 것을 의미한다.

표 7: ELISA 및 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용한 Fc 변이체들의 FcRn 결합력 평가. 파지-ELISA에서, 비율은 Fc-WT 특정 신호로 나눈 변이체 특정 신호를 의미한다. ELISA에서, 비율은 variant EC50으로 나눈 Fc-WT EC50을 의미한다. SRP에서, 비율은 Variant Kd로 나눈 Fc-WT Kd를 의미한다.

서로 다른 pH에서 FcRn과 결합하는 Fc 변이체들의 캐퍼시티는 또한 ELISA 분석에 의하여 평가되었다.

미리 시험된 각 Fc 변이체들에 대하여, ELISA 분석은 pH 6.0에서 실시할 때 0.8 내지 1.0 범위의 OD_450nm를 제공하는 농도에서 실시되었다. 실험 조건은 Ⅳ.1.a.에서 기술된 것과 동일하다. 아래 표 8은 ELISA 분석을 실시하는 데 사용된 각 Fc 변이체들의 농도를 표시하였다.

표 8: 서로 다른 pH에서 FcRn에 대한 개별 결합 친화력을 나타내는데 사용되는 각 Fc 변이체들의 농도

도 7은 각 변이체에서 얻어진 ELISA 분석의 결과를 나타낸 것이다. OD_450nm는 고정된 FcRn과 결합된 Fc 변이체들의 양과 연관되어 있다(HRP anti-V5 항체와 Fc 변이체들의 결합 측정). OD_450nm에서 특정 신호가 높을수록, FcRn과 Fc-변이체들의 결합력이 더 높아진다.

도 7은 FcRn에 대한 Fc 변이체들의 결합력이 pH에 의존하여 변화된다는 것을 명확하게 보여준다. 예상대로, pH 7.4에서의 FcRn에 대한 Fc 변이체들의 결합력은 pH 6.0에서의 결합력과 비교하여 작다.

본 발명의 Fc 변이체를 얻기 위하여 도입된 아미노산 변형은 pH 6.0에서의 FcRn에 대한 결합력을 Fc-WT와 비교하여 유의적으로 증가시킬 수 있으며, pH 7.0에서의 결합력을 유의적으로 변동되지 않고 매우 낮은 상태로 유지된다는 결론을 내릴 수 있다.

실시예 2:

Fc 변이체들에 기반한 IgG 변이체들의 생산 및 IgG의 생물학적 평가

Ⅰ. IgG 변이체의 발현

Ⅰ. 1. 벡터 구성

Fc 변이체들 C6A_69; C6A_78; T5A_74 ; C6A_74 ; C6A_60 및 C6-A66은 YB2/0 세포라인에서 anti-CD20 특이성(specificity)을 가지고 IgG 포멧에서 제조되었다. 비교 목적으로, 야생형 Fc에 기반한 IgG(IgG-WT)도 제조되었다.

YB2/0 세포라인에서 생산성을 최대화하기 위하여, 변이체들을 암호화하는 Fc 단편들뿐만 아니라 전장 중쇄 및 경쇄 cDNA (full length heavy chain and light chain cDNA)가 Rattus norvegicus(집쥐)를 위하여 최적화된 코돈으로 네오 합성(neo-synthetized)되었다. 크립틱 스플리싱 부위 또는 제한 부위와 같은 원치않는 특성들은 제거되었다. 단지 제한 부위(Apal)만이 가변/불변 부위 연결지점(junction variable/constant region)에 존재하였다.

첫 번째 단계로서, 야생형 중쇄는 벡터 CHK622-08에서 Nhel 및 Ascl 사이에서 클론되었고, YB2/0에서 발현되기 위하여 최적화되었고, 중간 구성인 HCD20-Opti-GA이 제조되었다. 최적화된 경쇄(light chain)은 다음으로 Spel 및 Xbal 제한부위 사이에서 클론되었고, 야생형 anti-CD20을 발현하기 위한 최종 구성인 HKCD20-Opti-GA가 제조되었다(아래에서 IgG-WT로 명명됨).

Fc 변이체들은 정해진 형태로 HKCD20-Opti-GA에 존재하는 야생 IgG1 Fc 단편을 대체하여 제조되었다. 이것은 Apal 및 Ascl 제한부위 사이에 클론되었다(도 8a).

모든 단편 클로닝은 박테리아 형질전환(transformation) 이전에, 전통적인 소화(digestion) 및 라이게이션(ligation) 과정에 의해 실시되었다. 발현 구조는 PCR에 더하여 효소 소화법에 의해 스크리닝되었고, 염기서열분석(sequencing)에 의해 유효하게 된다.

Ⅰ.2. 세포 배양 생산

YB2/0 세포라인의 5.10⁶ 세포들(ATCC, CRL-1662)은 각 발현 선형 벡터로 전기천공(electroporation)되었고, 다음으로 RPMI 1640 배지 + 5% v/v 투석된 FCS(InvitroGen)에서 25,000 cells/mL로 희석되었고, 24-웰 플레이트에서 1mL/웰 조건으로 분주되었다. 세포회복 3일 후에, 선택적 압력은 최종적으로 0.5g/L로 농축된 게네티신(Invitrogen) 및 최종적으로 25mM로 농축된 메토트렉사트(methotrexate)(Sigma)를 2mL/웰로 추가하여 적용되었다. 배양 11일 후에, 내성 세포들은 8개의 구조물 각각에 대하여 모아졌고(선택된 IgG MS2 변이체들, 및 IgG-WT를 인코딩함), 세포 현탁액 0.9L를 포함하는 2개의 2L-롤러 병들 각각이 2회전/분으로 배양될 수 있을 때까지, DMEM 배지 + 5% v/v Ultra-low IgG FCS(InvitroGen)로 계속해서 희석되었다. 세포들은 상청액 수집, 저속 원심분리에 의한 정화 및 Pellicon XL 필터(Millipore)로 한외여과하여 부피가 감소하기 전에 성장하고 사멸하였다(4 내지 5일).

Ⅱ. 정제 및 IgG 변이체들의 평가

농축된 배양 상청액들은 HiTrap 단백질 A FF 컬럼(GE Healthcare)으로 주입되었다. 결합된 항체들은 구연산 나트륨 완충용액 0.1M, pH 3.0으로 용출되었고, 분획들(fractions)은 용출 완충용액 ml당 pH가 7.5인 1M Tris를 100μl 사용하여 중화시켰다. 항체들을 포함하는 분획들은 모아져서 pH 6.0의 PBS로 여과되었고, 샘플들은 멸균 여과되고(0.22nm) 4℃에서 저장되었다.

정제된 IgGs는 non-reducing 및 reducing 조건하에서 SDS-PAGE로 평가되었다. 쿠마시 불루 염색 겔(Coomassie Blue-stained gel)은, 어떠한 돌연변이든지, IgGs가 95% 이상의 동질성을 가지도록 정제되었고, 각 IgG를 위한 특징적인 중쇄 및 경쇄 밴드를 나타낸다는 것을 표시하였다.

Ⅲ. IgG 변이체들의 FcRn 결합력 평가

IgG 변이체들의 FcRn에 대한 결합력은 하기 3가지의 개별 시험으로 결정되었다: (ⅰ) ELISA, (ⅱ) SPR, 및 (ⅲ) 형광 표지된 리툭시맵(Rituximab) 존재 하에서 짧게 한 FcRn을 발현시키는 Jurkat-cell 라인에서 수행되는 경쟁적 결합력 분석(anti-CD20 IgG).

Ⅲ.1. ELISA

Ⅲ.1.a. 재료 및 방법

Y2B/O에서 생산된 IgG 변이체들의 결합 특성들은 웰 상에 FcRn-p3를 코팅시키고 pH 6.0에서 ELISA 시험을 사용하여 측정되었다. 비교 목적으로 ELISA 분석은 IgG-WT에 대해서 실시하였다.

연속적으로 P6/5% 탈지 우유/0.1% Tween-20으로 희석되고 정제된 IgG는 0.1μg의 FcRn-p3/웰로 미리 코팅되고 P6에서 5% 탈지 우유로 차단된 Maxisorp immunoplates로 시험되었다. 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, 웰들은 P6/0.1% Tween-20으로 3회 세정되었고, 결합된 IgG 변이체들은 HRP Fab'2 goat anti-human Fab'2(Interchim)으로 검출되었다.

각 IgG 변이체들에 대하여, 결합된 FcRn의 퍼센트는 IgG-변이체의 농도 로그에 대하여 플롯되었다. 각 결과 결합력 곡선에서, 50% 포화된 곡선(EC50)과 관련된 IgG 농도를 측정하는 것이 결정되었고, WT-IgG의 EC50과 비교되었다.

Ⅲ.1.b. ELISA 결과

ELISA 시험은 생산된 IgG 변이체들이 WT-IgG와 비교하여 FcRn에 대하여 결합력이 증가하였다는 것을 보여준다. 이 사실은 결합력 곡선(도 9 참조) 및 EC50 값에 의해 명확하게 나타난다.

아래 표 9에 나타낸 것처럼, IgG-변이체들의 EC50은 야생형 IgG보다 5.8배 더 낮다. 최상의 EC50은 C6A_69 변이체에서 얻어졌다.

표9: 50% 포화에서의 농도(EC50)은 각 IgG 변이체들의 ELISA 곡선 커브에서 얻어졌다. 비율(ratio)은 WT EC50을 변이체 EC50으로 나눈 것을 의미한다.

Ⅲ.2. SPR을 이용한 IgG/FcRn 결합 친화력 측정

Ⅲ.2.a. 재료 및 방법

IgG-WT 및 IgG 변이체들과 재조합되고 고정된 인간 FcRn과의 상호작용은 BIAcore×100 장치(GE Healthcare)를 사용하는 표면 플라즈몬 공명(SPR) 검사기에 의해 모니터링되었다. 실험적 프로토콜은 Fc 변이체들의 친화력을 결정하기 위하여 사용된 것과 유사하다(상기 Ⅳ.2.b. 참조).

각 주입에서 관찰된 평형 RU는 Fc 농도에 대하여 플롯되었다. 평형 Kd 값은 BIAevaluation 소프트웨어에 포함되어 있는 안정적 상태의 친화력 모델(steady-state affinity model)을 사용하여 플롯 분석(analysis of the plots)에 의해 유도되었다. 반응속도상수(Kinetic parameters)는 모델 1:2인 결합 상(association phase) 및 해리 상(dissociation phase)의 글로벌 피팅(global fitting)에 의해 결정되었다.

Ⅲ.2.b. SRP 결과

인간 FcRn에 대한 IgG-WT의 결합 친화력(Kd 값)은 78.3nM 이었다. 표 10에 나타낸 것처럼, 6개의 IgG 변이체들의 Kd 값들은 10.5 내지 18.8nM의 범위였고, IgG-WT와 비교하여 pH 6.0에서의 친화력이 4 내지 7개 증가하는 것을 보여주었다.

표 10: SPR에 의해 얻어진 Kd 값. 비율은 WT-Kd를 변이체 Kd로 나눈 값을 의미한다. 반응속도상수를 결정하기 위하여, 인간 FcRn과 IgG WT 및 변이체들의 상호작용에 대한 데이터 세트들이 BIAevaluation 소프트웨어에서 1:2 모델로 맞추어 졌다. IgG WT에서 얻어진 곡선들은 1:2 모델에 맞지 않았고, 반면에 IgG 변이체 C6A_66에서 얻어진 곡선들과 다른 모든 변이체들은 모델 1:2에 잘 맞았다(데이터 도시하지 않음).

아래 표 11에 도시된 것처럼, WT와 비교하여 인간 FcRn에 대한 IgG 변이체들의 강화된 친화력은 증가된 회합 반응속도(association kinetics)에 의해 대부분 만들어진다(k_on values). 그러므로 비율(ratio)은 13 내지 23의 범위인 WT-k_on에 의해 나눈 변이체들 k_on을 의미하고, FcRn에 대한 변이체들의 친화력이 유의적으로 증가하였음을 나타낸다. WT와 비교하여 IgG 변이체들의 증가된 K_off 값들은 2 내지 4의 범위였고, 이는 결합(association)과 비교하여 해리(dissociation)가 약하게 영향을 준다는 것을 나타낸다.

표 11: SPR에 의해 측정된 해리율(K_off)과 결합율(K_on)

Ⅲ.3. Jurkat-FcRn에 대한 결합

Ⅲ.3.a. 재료 및 방법

경쟁적 면역형광 분석법은 IgG WT과 변이체들이 FcRn과 상호작용하는 능력을 평가하기 위하여 Dall'Ozzo 등 (Dall'Ozzo S, Tartas S, Paintaud G, Cartron G, Colombat P, Bardos P, Watier H, Thibault G, Cancer Res., 2004 Jul 1;64(13):4664-9)이 기술한 방법을 채택하여 실시하였다.

요약하면, IgG WT 및 변이체들은 pH 6의 PBS에서 최종 농도가 0.06 내지 2mg/ml 범위가 되도록 희석되었고, 알렉사 복합 리툭시맵(Alexa-conjugated Rituximab)(리툭시맵으로 표지됨)의 존재하에서 Jurkat FcRn으로 50μg/ml 농도로 배양되었다(150000 세포). 20분 후, 세포들은 알렉사-리툭시맵 결합을 정량하기 위하여 유동세포 분석법(flow cytometry)으로 분석되었다. 결과는 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity, MFI)의 퍼센트로 표시되었고, 100%는 알렉사-복합 리툭시맵에서만 얻어진 평균 형광 강도(MFI)를 의미하고, 0%는 Jurkat FcRn이 알렉사 복합 리툭시맵으로 배양되지 않았을 때 측정된 MFI 값을 의미한다. 각 실험은 3회 실시되었다.

대조군은 (ⅰ) 표지되지 않은 리툭시맵 또는 (ⅱ) IgG-WT의 배양을 포함한다.

시험된 각 IgG에서, MFI는 IgG 농도의 로그(log)에 대하여 플롯되었다. MFI 신호를 50%로 억제되도록 하는 각각의 시험 IgG의 농도(IC50)가 측정되었다.

이 분석에 대한 일반적인 설명은 프랑스 특허 FR 2 894 983에서도 찾을 수 있다.

Ⅲ.3.b. 실험 결과

실험 결과는 도 11에 나타내었고, Jurkat FcRn에 대한 본 발명의 다양한 변이체들 및 리툭산(Rituxan)의 결합력이 상기 재료 및 방법 부분에 기재된 평균 형광 강도(MFI)로 측정되었다.

아래 표 11에 나타낸 것처럼, 본 발명의 변이체들에서 얻어진 IC50은 WT-IgG에서 얻어진 것보다 유의적으로 더 낮았다. 본 발명의 IgG 변이체들의 IC50의 감소는 C6A_66을 제외하고는 40 내지 60배였다.

표 12: 형광 표지 리툭시맵 존재하에서 FcRn을 발현하는 Jurkat 세포에 대하여 결합 경쟁 분석(binding competition assay)을 실시하여 얻은 IC50. "50%RTX=1" 값은 μg/ml로도 표현되는 IC50 값들로 이루어진다.

Ⅲ.4. 결론

IgG 변이체들의 FcRn에 대한 결합 특성을 평가하기 위하여 실시한 세 개의 개별 시험에서 일관성 있는 결과들이 나타났다. 모든 케이스에서, 본 발명의 IgG 변이체들은 IgG 야생형과 비교하여 FcRn에 대하여 유의적으로 증가된 결합력을 나타내었다.

Ⅳ. IgG 변이체들의 기능적 평가 및 IgG-WT와 LFB-R603의 비교

IgG 변이체들이 Fcγ 수용체와 결합하는 능력과 그들의 ADCC와 CDC 활성이 그들의 생물학적 기능을 완전히 평가하기 위하여 분석되었다.

Ⅳ.1. IgG 변이체들이 hFcγRⅢA와 결합하는 결합력

Ⅳ.1.a ELISA 분석: 고정된 재조합 hFcγRⅢA에 대한 IgG 변이체의 결합력

인간 재조합 FcγRⅢA(F 158 allotype)은 EZ-link NHS-PEO 키트(Pierce)로 비오틴화 되었고, 분석 완충용액 1μg/ml(assay buffer)(Tris 25 mM, NaCl 150mM, pH 7.35, 0.05% Tween-20, 0.1 BSA)으로 희석되고, react-bind™ 스트렙타비딘 ELISA 플레이트(Pierce) 위에 실온에서 2시간 코팅되었다. 이러한 배양 시간 동안, IgG-F(ab')2 anti-F(ab')2 복합체들은 5μg/ml의 IgG와 2시간 동안 실온에서 호세라디쉬 페록시다제(horseradish peroxidase, Jackson ImmunoResearch)로 표지된 2μg/ml의 F(ab')2 anti-F(ab')2를 혼합하여 분석 완충용액에 제조되었다. 추가로 연속적으로 복합체를 희석하고 천천히 흔들면서 실온에서 2시간 동안 배양되었다. 분석 완충용액으로 플레이트를 세정한 후, hFcγRⅢA에 결합된 복합체들이 TMB(Pierce)로 검출되었다. 450nm에서의 흡수율이 플레이트 판독기(Tecan)를 사용하여 판독되었다.

각 IgG 변이체들에서, 결합된 FcγRⅢA의 퍼센트(OD450nm에서 얻어짐)는 IgG-변이체의 농도에 대하여 플롯되었다.

도 10에 나타난 것처럼, hFcγRⅢA에 대한 IgG 변이체들의 결합력은 IgG WT와 유사하고, C6A_66만이 hFcγRⅢA와 결합하지 못하였다.

Ⅳ.2. ADCC 활성

자연 살해 세포(natural killer cells, NK cells)는 Miltenyi 사에서 개발된 네가티브 방혈 기술(negative depletion technique)에 의하여 건강한 제공자의 말초혈액(peripheral blood)에서 정제되었다. ADCC 시험은 서로 다른 농도의 anti-CD20의 존재 하에서, NK 세포가 CD20 수용체를 발현하는 Raji 라인의 타겟 세포와 함께 배양되는 것을 포함한다. 16시간 배양한 후, anti-CD20 항체에 의해 유도된 세포 독성이 색소원으로 측정되는데, 이는 분해된 타겟 세포에서 방출된 소위 락테이트 디하이드로지나제(LDH)라 불리는 세포간 효소 수준의 세포 상청액에서 정량화됨으로써 측정된다. 결과는 도 12에 나타내었다.

특정한 용해 결과는 항체 농도의 함수로서 용해(lysis)의 퍼센트로 나타내었다. EC50(최대 용해의 50%를 포함하는 항체의 양)은 PRISM 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 대조 실험은 (ⅰ) 리툭시맵, (ⅱ) Y2/0 세포에서 생산된 WT-IgG 및 anti-CD20 항체인 LFB-R630으로 실시되었다. 상기 anti-CD20 항체는 ADDC 기능을 가지는 것으로 알려져 있는데, 이는 2004년에 Romeuf 등에 의해 기술되었고((de Romeuf C, Dutertre CA, Le Garff-Tavernier M, Fournier N, Gaucher C, Glacet A, Jorieux S, Bihoreau N, Behrens CK, Beliard R, Vieillard V, Cazin B, Bourel D, Prost JF, Teillaud JL, Merle-Beral H. Chronic lymphocytic leukaemia cells are efficiently killed by an anti-CD20 monoclonal antibody selected for improved engagement of FcgammaRIIIA/CD16. Br J Haematol. 2008 Mar;140(6):635-43), PCT 국제출원 WO 2006/064121에도 기술되었다.

아래 표 13은 각 변이체에 대한 EC 50을 나타내고, IgG 변이체들의 ADCC 기능을 LFB-R603 및 WT-IgG와 비교하여 나타내었다.

모든 IgG 변이체들은 C6A_66 변이체를 제외하고는 ADCC 활성을 나타낸다. C6A_66 변이체는 FcγRⅢ에 대하여 매우 낮은 친화력을 가지므로 ADCC 활성을 갖지 않는다.

C6A_69, C6A_60 및 C6A_74는 IgG-WT와 비교하여 증가된 ADCC 친화력을 가진다. 다른 변이체들(즉, C6A_78 및 T5A_75)은 IgG-WT와 유사한 ADCC 활성을 갖는다.

표 13: ADCC 분석에서 얻어진 EC50(최대 용해 50%를 포함하는 항체의 양). 비율(Ratio)은 변이체 EC50을 LFB-R603 EC50으로 나눈 값을 의미한다.

Ⅳ.3. CDC 활성

이 기술에서, Raji 라인의 타겟 CD20+ 세포들은, 보체원(source of complement)로서 아기 토끼 혈청의 존재 하에서(Cedarlane ref.: CL3441, 1/10 희석액), 서로 다른 농도의 anti-CD20 항체들에서 배양되었다(0 내지 5000 ng/ml). 37℃에서 1시간 배양한 후, 용해된 타겟 세포에 의하여 상청액에 방출된 LDH의 양이 색소원으로 측정되었고(Roche Applied Sciences Cytotoxicity Detection Kit), 항체로 매개된 보체-의존성 세포독성이 정량화되었다. 그 결과들은 용해(lisys)의 퍼센트로 표현되었다. EC50(최대 용해의 50%를 유도하는 항체의 양) 및 Emax(최대용해의 퍼센트)는 PRISM 소프트웨어를 사용하여 계산되었다.

아래 표 14는 각 변이체들에서 얻어진 Emax 및 EC50을 나타낸 것이다.

CDC 활성 수치는 IgG 변이체들에 의하여 변화된다.

C6A_78 및 C6A_60는 IgG-WT보다 유의적으로 높은 CDC 활성을 가지고, 반면에 C6A_69, T5_74 및 C6A_66는 낮은 CDC 활성을 나타낸다.

C6A_74 변이체의 CDC 활성은 IgG-WT와 유사하다.

표 14: CDC 분석으로 얻어진 EC50(최대 용해의 50%를 유도하는 항체의 양)

Ⅳ.3. 결론

Y2B/0 세포에서 재조합으로 생산된 본 발명의 6개의 IgG 변이체들은 IgG-WT(동일한 숙주 세포에서 동일한 조건으로 생산됨)와 비교하여 FcRn 수용체에 대하여 증가된 결합력을 가진다.

본 발명의 IgG 변이체들은 Ig-WT와 비교하여 FcγRⅢ에 대하여 최소한 동일한 결합 친화력을 기지고, 최소한 동일한 ADCC 활성을 가진다. 다만, C6A_66은 FcγRⅢ에 대하여 나쁜 친화력을 나타낸다.

IgG 변이체들은 뚜렷한 CDC 활성을 나타낸다.

결론적으로, 일 측면으로서, 본 발명에 따른 아미노산 변형은 하나 이상의 Fc 반응기(effector) 활성과 화합된 FcRn에 대한 증가된 결합력을 가진 IgG 변이체를 얻을 수 있게 한다. 이는 적어도 관련된 모 IgG(즉, IgG-WT)의 결합력과 유사하다.

또 다른 측면으로서, 본 발명에 다른 아미노산 변형은 CDC 또는 ADCC와 같은 적어도 하나의 감소된 Fc 반응기(effector) 활성과 결합된 FcRn에 대한 증가된 결합력을 가지는 IgG 변이체를 얻을 수 있다.

아래 표 15는 본 연구와 관련된 IgG 변이체들에 대한 주요 결론을 나타낸 것이다.

표 15: IgG-WT와 비교하여 본 발명의 IgG 변이체들에서 얻어진 주요 결과 ; ++ : IgG-WT와 비교하여 증가된 결합력 ; ↗ : WT-IgG와 비교하여 증가된 활성 ; ↘ : WT-IgG와 비교하여 감소된 활성 ; √ : WT-IgG와 유사한 활성

표 7: 서열목록에 포함된 서열들

SEQUENCE LISTING <110> LFB Biotechnologies <120> Optimized Fc variants <130> W337EP <160> 16 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 222 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (131)..(131) <223> For G1m1,17 allotype, X is D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (131)..(131) <223> For G1m3 allotype, X is E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (133)..(133) <223> For G1m1,17 allotype, X is L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (133)..(133) <223> For G1m3 allotype, X is M <400> 1 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Xaa Glu Xaa Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 2 <211> 221 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 1 5 10 15 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 20 25 30 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln 35 40 45 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 50 55 60 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 65 70 75 80 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 85 90 95 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 100 105 110 Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 115 120 125 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 130 135 140 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 145 150 155 160 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly 165 170 175 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 180 185 190 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 195 200 205 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 3 <211> 222 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 4 <211> 221 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Cys Pro Ser Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 1 5 10 15 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 20 25 30 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 35 40 45 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Met Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 50 55 60 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu 65 70 75 80 Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 85 90 95 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 100 105 110 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 115 120 125 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 130 135 140 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 145 150 155 160 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 165 170 175 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 180 185 190 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 195 200 205 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 220 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 5 agtactgact ctacctagga tcctgcccac cgtgc 35 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 6 actgctcgat gtccgtacta tgcggccgcg aattc 35 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 7 caggaaacag ctatgacc 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 8 tcacgtgcaa aagcagcggc 20 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 9 tgattacgcc aagcttgc 18 <210> 10 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 10 cgggatcctg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct 60 tccccccaaa acccaaggac caactcatga tctcccggac 100 <210> 11 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 11 gcgaattctt tacccggaga cagggagagg ctcttctgcg tgtagtggtt gtgcagagcc 60 tcatgcagca cggagcatga gaag 84 <210> 12 <211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 13 <211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 14 <211> 228 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val 1 5 10 15 Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 65 70 75 80 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Pro Gly Lys 225 <210> 15 <211> 279 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys 1 5 10 15 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 20 25 30 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu 35 40 45 Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro 50 55 60 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 65 70 75 80 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 85 90 95 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp 100 105 110 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 115 120 125 Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 130 135 140 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 145 150 155 160 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg 165 170 175 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 180 185 190 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 195 200 205 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn 210 215 220 Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 225 230 235 240 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser 245 250 255 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser 260 265 270 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 275 <210> 16 <211> 228 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Pro Ala Pro Glu Phe Leu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Met Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 65 70 75 80 Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Leu Gly Lys 225

Claims

Fc 영역을 포함하는 모 폴리펩타이드의 변이체로서,
변이체는 상기 모 폴리펩타이드와 비교하여 FcRn에 대하여 증가된 결합력을 나타내고, 적어도 2개의 아미노산 변형을 포함하고,
상기 적어도 2개의 아미노산 변형은, Fc 영역의
(ⅰ) 378V, 378T, 434Y 및 434S로 이루어진 그룹에서 선택된 하나의 아미노산 변형, 및
(ⅱ) 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 378V, 378T, 389T, 389K, 434Y 및 434S로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 아미노산 변형이고, 상기 Fc 영역에서의 아미노산의 넘버링은 카밧(Kabat)의 EU 인덱스의 넘버링이고, 상기 (ⅰ)의 변형은 상기 (ⅱ)의 변형과 동일한 아미노산 위치에서 발생하지 않는 것을 특징으로 하는, Fc 영역을 포함하는 모 폴리펩타이드의 변이체.
청구항 1에 있어서, 상기 변이체는 상기 모 폴리펩타이드와 비교하여 Fc 영역의 226G/315D/434Y, 230S/315D/434Y, 230T/315D/434Y, 230T/264E/434S, 230T/389T/434S, 241L/264E/378V, 241L/264E/434S, 250A/389K/434Y, 259I/315D/434Y, 264E/378T/396L, 264E/378V/416K, 264E/378V/434S, 264E/396L/434S, 294del/307P/434Y, 307P/378V/434Y, 315D/330V/434Y, 315D/382V/434Y 및 378V/383N/434Y로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 아미노산 변형들의 조합을 포함하고, Fc 영역에서 아미노산의 넘버링은 카밧의 EU 인덱스의 넘버링인 것을 특징으로 하는 변이체.
청구항 2에 있어서, 상기 변이체는, 모 폴리펩타이드와 비교하여, Fc 영역의 226G, 227L, 230S, 230T, 230L, 231T, 241L, 243L, 250A, 256N, 259I, 264E, 265G, 267R, 290E, 294del, 303A, 305A, 307P, 307A, 308I, 315D, 322R, 325S, 327V, 330V, 342R, 347R, 352S, 361D, 362R, 362E, 370R, 378V, 378T, 382V, 383N, 386R, 386K, 387T, 389T, 389K, 392R, 395A, 396L, 397M, 403T, 404L, 415N, 416K, 421T, 426T, 428L, 433R, 434Y, 434S 및 439R로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 아미노산 변형을 추가로 포함하고, Fc 영역에서 아미노산의 넘버링은 카밧의 EU 인덱스의 넘버링인 것을 특징으로 하는 변이체.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 변이체는, 모 폴리펩타이드와 비교하여, Fc 영역의 307A/315D/330V/382V/389T/434Y, 256N/378V/383N/434Y, 315D/330V/361D/378V/434Y, 259I/315D/434Y, 230S/315D/428L/434Y, 241L/264E/307P/378V/433R, 250A/389K/434Y, 305A/315D/330V/395A/434Y, 264E/386R/396L/434S/439R, 315D/330V/362R/434Y, 294del/307P/434Y, 305A/315D/330V/389K/434Y, 315D/327V/330V/397M/434Y, 230T/241L/264E/265G/378V/421T, 264E/396L/415N/434S, 227L/264E/378V/434S, 264E/378T/396L, 230T/315D/362R/426T/434Y, 226G/315D/330V/434Y, 230L/241L/243L/264E/307P/378V, 250A/315D/325S/330V/434Y, 290E/315D/342R/382V/434Y, 241L/315D/330V/392R/434Y, 241L/264E/307P/378V/434S, 230T/264E/403T/434S, 264E/378V/416K, 230T/315D/362E/434Y, 226G/315D/434Y, 226G/315D/362R/434Y, 226G/264E/347R/370R/378V/434S, 308I/315D/330V/382V/434Y, 230T/264E/378V/434S, 231T/241L/264E/378T/397M/434S, 230L/264E/378V/434S, 230T/315D/330V/386K/434Y, 226G/315D/330V/389T/434Y, 267R/307P/378V/421T/434Y, 230S/315D/387T/434Y, 230S/264E/352S/378V/434S 및 230T/303A/322R/389T/404L/434S로 이루어진 군에서 선택된 하나의 아미노산 변형의 조합을 포함하고, Fc 영역에서 아미노산의 넘버링은 카밧의 EU 인덱스의 넘버링인 것을 특징으로 하는 변이체.
청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체는 항체인 것을 특징으로 하는 변이체.
청구항 5에 있어서, 상기 항체는 IgG 항체인 것을 특징으로 하는 변이체.
청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에서 기재된 변이체를 포함하는 약학 조성물.
청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 기재된 변이체를 인코딩하는 분리된 핵산.
청구항 8의 핵산을 포함하는 벡터.
청구항 9의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
핵산이 발현되도록 청구항 10의 숙주세포를 배양하는 것을 포함하는, 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 따른 변이체를 제조하는 방법.
청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 따른 변이체를 포함하는 의약품.
청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 따른 변이체의 용도에 있어서, 의약품을 제조하기 위한 용도.