CN112839713A - 抗il1rap抗体和其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供结合蛋白，如抗体和抗原结合片段，其特异性结合到人类白介素‑1受体辅助蛋白(hu‑IL1RAP)并且完全阻断IL‑1、IL‑33和IL‑36胞内信号传导路径。还提供包含此类结合蛋白的组合物和制备以及使用此类结合蛋白的方法。

Description

抗IL1RAP抗体和其使用方法
交叉引用
本申请案要求2018年8月17日提交的第62/719,397号美国临时专利申请案的优先权，所述美国临时专利申请案出于所有目的特此以引用的方式并入本文中。
技术领域
本公开大体上涉及结合到白介素-1受体辅助蛋白的结合蛋白(如抗体和抗原结合片段)，以及使用此类结合蛋白的方法。
序列表引用
序列表的正式副本与规范同时通过EFS-Web以ASCII格式的文本文件提交，文件名为“09402-002US1_SeqListing_ST25.txt”，创建日期为2019年8月15日，并且大小为180,889字节。经由EFS-Web提交的序列表是说明书的一部分并且通过全文引用的方式并入本文中。
背景技术
细胞因子配体和受体的白介素-1(IL-1)家族与炎症、自身免疫性、免疫调节、细胞增殖和宿主防御相关并且促成炎性、自身免疫、免疫调节、变性和细胞增殖(例如，癌症)疾病和病症的病变，并且其细胞因子和受体充当此类疾病和病症的病原性介体。参见例如Garlanda等人，《免疫(Immunity)》,39:1003-1018(2013)。
IL-1家族的细胞因子包括白介素-1α(IL-1α或IL-1a或IL-1α)、白介素-1β(IL-1β或IL-1b)、白介素-33(IL-33)、白介素-36α(IL-36α或IL-36α)、白介素-36β(IL-36β或IL-36b)和白介素-36γ(IL-36γ或IL-36γ)。这些细胞因子中的每一者充当能够结合在某些细胞表面上表达的特异性IL-1家族细胞膜受体的配体。在将IL-1家族细胞因子结合到其同源受体后，募集辅助受体以形成包含细胞因子、其同源膜受体和其辅助受体的三元复合物。所得三元复合物促进胞内信号转导和转录因子组的活化，包括NF-κB和AP-1以及丝裂原活化蛋白激酶，其触发炎性和免疫反应级联，包括产生大量细胞因子、趋化因子、酶和粘附分子。
白介素-1受体辅助蛋白(IL1RAP)充当IL-1家族中的数种受体的共同细胞膜辅助受体，包括白介素-1受体1(IL1R1)、ST2(也称为白介素-1受体样1或IL1RL1)和白介素-1受体样2(IL1RL2)。IL1RAP是由上文提到的IL-1家族细胞因子中的一者、细胞因子的特异性同源受体和IL1RAP辅助受体形成的三元信号传导复合物的必要组分。因此，IL1RAP在IL-1家族信号转导路径中发挥重要功能，因为需要促进由IL-1家族细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ刺激的特定下游信号传导路径。
WO2012098407A1是涉及包含结合部分(如抗体)的药剂，所述结合部分对IL1RAP具有特异性以用于诱导细胞死亡和/或抑制与表达IL1RAP的实体肿瘤相关的细胞的生长和/或增殖。WO2012098407A1公开了针对人类IL1RAP、“mAbT81.2”的小鼠IgG2a单克隆抗体，其在体内施用时引起黑素瘤小鼠模型中肿瘤生长的统计学上显著的延迟。
WO2015132602A1涉及对人类IL1RAP具有特异性的抗体和其用于治疗实体肿瘤的用途。WO2015132602A1公开了特异性小鼠衍生的抗体“CAN04”，其以200pM的KD特异性结合到人类IL1RAP的结构域2，与食蟹猴IL1RAP交叉反应，能够在一种或多种癌细胞系(如CML)中诱导ADCC，并且对IL-1α、IL-1β和IL-33刺激的信号传导具有抑制作用。
WO2016020502A1公开了两种特异性小鼠衍生的抗体“CAN01”和“CAN03”，其分别以1.4和0.9nM的KD特异性结合到人类IL1RAP的结构域3，与食蟹猴IL1RAP交叉反应，并且能够在一种或多种癌细胞系(如CML)中诱导ADCC。已确定CAN03对IL-1α、IL-1β和IL-33刺激的信号传导具有一定的抑制作用，而发现CAN01对IL-1α、IL-1β和IL-33信号传导缺乏明显的抑制作用。
WO2016207304A1涉及兔衍生的抗体，其特异性结合人类IL-1RAcP，对由IL-1α、IL-1β、IL-33和/或IL-36β刺激的NFkB活性具有一定的抑制作用。
WO2017191325A9涉及人源化IgG1抗体，其特异性结合人类IL-1R3，对由IL-1α、IL-1β、IL-33和/或IL-36β刺激的NFkB活性具有一定的抑制作用。
仍然需要用于治疗、改善或预防与IL-1家族的细胞因子配体和受体有关的炎性、自身免疫、免疫调节、变性和细胞增殖性疾病或病症的疗法。本公开满足这些和其它需求。
发明内容
本公开提供以高亲和力特异性结合人类IL1RAP的抗体。抗体能够减少，抑制和/或完全阻断IL-1、IL-33和/或IL-36信号传导路径，包括通过结合以下一种或多种激动剂刺激的信号传导：IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ。本公开还提供治疗响应于IL-1、IL-33和/或IL-36信号传导的抑制的疾病和病况的方法。
在一些实施例中，本公开提供一种抗IL1RAP抗体，其包含：(i)第一轻链高变区(HVR-L1)、第二轻链高变区(HVR-L2)和第三轻链高变区(HVR-L3)和/或(ii)第一重链高变区(HVR-H1)、第二重链高变区(HVR-H2)和第三重链高变区(HVR-H3)，其中：
(a)HVR-L1包含氨基酸序列RASENIXXNXX(SEQMIDTNO:10)，其中第7位的X为Y或W，第8位的X为S、H、K、L、M、N、Q、R或Y，第10位的X为L、A、G、I、M、N、Q、S、T、V或Y，并且第11位的X为A、G、N、S或T；
(b)HVR-L2包含氨基酸序列GXXNXAD(SEQ ID NO:36)，其中第2位的X为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，第3位的X为K、G或N，并且第5位的X为L、F、H、W或Y；
(c)HVR-L3包含氨基酸序列XXFXTXPRT(SEQ ID NO:62)，其中第1位的X为Q或S，第2位的X为H或S，第4位的X为W、A、F、G、H、I、K、L、M、V或Y，并且第6位的X为T、I或V；
(d)HVR-H1包含氨基酸序列XXXXXXX(SEQ ID NO:77)，其中第1位的X为F、A、D、E、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y，第2位的X为S、E、G、K、P、Q、R或T，第3位的X为N、D、E、G、K、Q或R，第4位的X为Y、A、D、E、H、S或V，第5位的X为A、N或S，第6位的X为M、V或W，并且第7位的X为S或G；
(e)HVR-H2包含氨基酸序列TXXXXXXXXYXLXDVKG(SEQ ID NO:140)，其中第2位的X为V、A、N或S，第3位的X为T或S，第4位的X为E、D、N、T或V，第5位的X为G、I、P、T或V，第6位的X为G、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，第7位的X为D、A、E、G、H、K、N、P、Q、R或S，第8位的X为Y或W，第9位的X为N、A、G、P或R，第11位的X为C、A、D、F、R、S、T、V或Y，并且第13位的X为D、S或W；
(f)HVR-H3包含氨基酸序列XXDXXPYFXDY(SEQ ID NO:202)，其中第1位的X为A、G、S或T，第2位的X为H、I、L、M、N、Q或V，第4位的X为R、A、D、E、I、M、N、Q或S，第5位的X为W或F，并且第9位的X为F、L、M或W。
在一些实施例中，本公开提供抗IL1RAP抗体，其包含(i)第一轻链高变区(HVR-L1)、第二轻链高变区(HVR-L2)和第三轻链高变区(HVR-L3)和/或(ii)第一重链高变区(HVR-H1)、第二重链高变区(HVR-H2)和第三重链高变区(HVR-H3)，其中：(a)HVR-L1包含选自SEQ ID NO:11-35的氨基酸序列；(b)HVR-L2包含选自SEQ ID NO:37-61的氨基酸序列；(c)HVR-L3包含选自SEQ ID NO:63-76的氨基酸序列；(d)HVR-H1包含选自SEQ ID NO:78-120的氨基酸序列；(e)HVR-H2包含选自SEQ ID NO:141-201的氨基酸序列；(f)HVR-H3包含选自SEQ ID NO:203-225的氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开提供抗IL1RAP抗体，其包含(i)第一轻链高变区(HVR-L1)、第二轻链高变区(HVR-L2)和第三轻链高变区(HVR-L3)和/或(ii)第一重链高变区(HVR-H1)、第二重链高变区(HVR-H2)和第三重链高变区(HVR-H3)，其中：(a)HVR-L1包含SEQID NO:11的氨基酸序列；(b)HVR-L2包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；(c)HVR-L3包含SEQID NO:63的氨基酸序列；(d)HVR-H1包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；(e)HVR-H2包含选自SEQ ID NO:141、184、185、186、187、188、189、190和191的氨基酸序列；(f)HVR-H3包含SEQID NO:203的氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开提供抗IL1RAP抗体，其包含(i)第一轻链高变区(HVR-L1)、第二轻链高变区(HVR-L2)和第三轻链高变区(HVR-L3)和/或(ii)第一重链高变区(HVR-H1)、第二重链高变区(HVR-H2)和第三重链高变区(HVR-H3)，其中：(a)HVR-L1包含选自SEQ ID NO:11、13和23的氨基酸序列；(b)HVR-L2包含选自SEQ ID NO:37、38、45、49、54和61的氨基酸序列；(c)HVR-L3包含选自SEQ ID NO:63、67、69、70、71、75和76的氨基酸序列；(d)HVR-H1包含选自SEQ ID NO:78、81、90、92和118的氨基酸序列；(e)HVR-H2包含选自SEQID NO:141、144、149、153、172、181、191、194、195、196、197、198、199、200和201的氨基酸序列；(f)HVR-H3包含选自SEQ ID NO:203、214、215、220和222的氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开的抗IL1RAP抗体包含互补决定区CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
(a)CDR-L1包含氨基酸序列RASENIXXNXX(SEQ ID NO:10)，其中第7位的X为Y或W，第8位的X为S、H、K、L、M、N、Q、R或Y，第10位的X为L、A、G、I、M、N、Q、S、T、V或Y，并且第11位的X为A、G、N、S或T；
(b)CDR-L2包含氨基酸序列GXXNXAD(SEQ ID NO:36)，其中第2位的X为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，第3位的X为K、G或N，并且第5位的X为L、F、H、W或Y；
(c)CDR-L3包含氨基酸序列XXFXTXPRT(SEQ ID NO:62)，其中第1位的X为Q或S，第2位的X为H或S，第4位的X为W、A、F、G、H、I、K、L、M、V或Y，并且第6位的X为T、I或V；
(d)CDR-H1包含氨基酸序列XXXXX(SEQ ID NO:121)，其中第1位的X为N、D、E、G、K、Q或R，第2位的X为Y、A、D、E、H、S或V，第3位的X为A、N或S，第4位的X为M、V或W，并且第5位的X为S或G；
(e)CDR-H2包含氨基酸序列TXXXXXXXXYXLXDVKG(SEQ ID NO:140)，其中第2位的X为V、A、N或S，第3位的X为T或S，第4位的X为E、D、N、T或V，第5位的X为G、I、P、T或V，第6位的X为G、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，第7位的X为D、A、E、G、H、K、N、P、Q、R或S，第8位的X为Y或W，第9位的X为N、A、G、P或R，第11位的X为C、A、D、F、R、S、T、V或Y，并且第13位的X为D、S或W；
(f)CDR-H3包含氨基酸序列DXXPYFXDY(SEQ ID NO:226)，其中第2位的X为R、A、D、E、I、M、N、Q或S，第3位的X为W或F，并且第7位的X为F、L、M或W。
在一些实施例中，本公开的抗IL1RAP抗体包含互补决定区CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：(a)CDR-L1包含选自SEQ ID NO:11-35的氨基酸序列；(b)CDR-L2包含选自SEQ ID NO:37-61的氨基酸序列；(c)CDR-L3包含选自SEQ ID NO:63-76的氨基酸序列；(d)CDR-H1包含选自SEQ ID NO:122-139的氨基酸序列；(e)CDR-H2包含选自SEQ ID NO:141-201的氨基酸序列；(f)CDR-H3包含选自SEQ ID NO:227-239的氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开的抗IL1RAP抗体包含与选自SEQ ID NO:257、258或259的序列具有至少90％一致性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列；和/或与选自SEQ ID NO:279、285或290的序列具有至少90％一致性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列。在一些实施例中，抗体包含选自SEQ ID NO:257-278的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列。在一些实施例中，抗体包含选自SEQ ID NO:279-310的重链可变结构域(VH)氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开提供抗IL1RAP抗体，其中所述抗体包含：
SEQ ID NO:259的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列和SEQ ID NO:290的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
SEQ ID NO:268的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列和SEQ ID NO:307的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
SEQ ID NO:268的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列和SEQ ID NO:298的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
SEQ ID NO:269的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列和SEQ ID NO:307的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
SEQ ID NO:269的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列和SEQ ID NO:298的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
SEQ ID NO:269的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列和SEQ ID NO:297的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
SEQ ID NO:270的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列和SEQ ID NO:307的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；或
SEQ ID NO:270的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列和SEQ ID NO:298的重链可变结构域(VH)氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开的抗IL1RAP抗体包含与选自SEQ ID NO:328、329、330或331的序列具有至少90％一致性的轻链(LC)氨基酸序列；和/或与选自SEQ ID NO:332、333、334、335或336的序列具有至少90％一致性的重链(HC)氨基酸序列。在一些实施例中，抗体包含选自SEQ ID NO:328-331的轻链(LC)氨基酸序列。在一些实施例中，抗体包含选自SEQID NO:332-336的重链(HC)氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开提供抗IL1RAP抗体，其中所述抗体包含：
SEQ ID NO:328的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:332的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:329的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:335的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:329的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:336的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:329的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:333的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:329的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:334的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:330的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:335的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:330的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:336的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:330的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:333的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:330的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:334的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:331的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:335的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:331的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:336的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:331的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:333的重链(HC)氨基酸序列；或
SEQ ID NO:331的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:334的重链(HC)氨基酸序列。
在由本公开提供的抗IL1RAP抗体的各种实施例中，抗体的特征在于以下一种或多种特性：
(a)抗体以1×10-8M或更小、1×10-9M或更小、1×10-10M或更小或1×10-11M或更小的结合亲和力结合到人类IL1RAP；任选地，其中所述结合亲和力通过对SEQ ID NO:3的hu-M-IL1RAP多肽的平衡解离常数(KD)来测量；
(b)抗体将IL-1刺激的信号、IL-33刺激的信号和/或IL-36刺激的信号降低至少90％、至少95％、至少99％或100％；任选地，其中所述信号的降低通过基于细胞的阻断分析来测量；任选地，其中所述IL-1、IL-33和/或IL-36刺激的信号通过选自IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ的激动剂来刺激，其中在约EC50的激动剂浓度下，抗体的IC50为10nM或更低、5nM或更低或1nM或更低。
(c)抗体使由结合到其同源受体的IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ激动剂中的一种或多种引发的胞内信号降低至少90％、至少95％、至少99％或100％；任选地，其中所述胞内信号的降低通过基于细胞的阻断分析来测量；任选地，其中在约EC50的IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ浓度下，抗体以10nM或更低、5nM或更低或1nM的IC50降低由激动剂引发的胞内信号；
(d)抗体抑制IL-1α、IL-1β和/或IL-36β刺激的IL8从原代人肺成纤维细胞(PHLF)的释放；任选地，其中在约EC50的IL-1α、IL-1β和/或IL-36β浓度下，所述抗体的IC50为10nM或更低、5nM或更低或1nM或更低；
(e)抗体抑制IL-1β刺激的IL6从原代人单核细胞的释放；任选地，其中在约EC50的IL-1β浓度下，所述抗体的IC50为10nM或更低、5nM或更低或1nM或更低；
(f)抗体抑制IL-33刺激的INF-γ从人类自然杀伤(NK)细胞的释放；任选地，其中在约EC50的IL-33浓度下，所述抗体的IC50为10nM或更低、5nM或更低或1nM或更低；
(g)抗体抑制IL-36β刺激的IL8从人表皮角质形成细胞(HEKn)的释放；任选地，其中在约EC60的IL-36β浓度下，所述抗体的IC50为10nM或更低、5nM或更低或2nM或更低；
(h)抗体抑制嗜碱粒细胞中IL-33刺激的磷酸化；任选地，其中在约EC56的IL-33浓度下，所述抗体的IC50为75nM或更低、50nM或更低或45nM或更低；
(i)抗体抑制IL-33刺激的INF-γ从CD4+T细胞的释放；任选地，其中在约EC34的IL-33浓度下，所述抗体的IC50为75nM或更低、50nM或更低或45nM或更低；
(j)抗体特异性结合到人类IL1RAP的结构域3内的一个或多个氨基酸残基，其中结构域3包含SEQ ID NO:1或3的氨基酸序列的第238-367位。
(k)抗体特异性结合到SEQ ID NO:1或3的氨基酸序列的第243-255位、257-268位和/或333-336位；
(l)抗体并不结合到人类IL1RAP结构域1或结构域2内的氨基酸残基；任选地，其中结构域1和结构域2包含SEQ ID NO:1或3的氨基酸序列的第21-237位；
(m)抗体与SEQ ID NO:8的食蟹猴IL1RAP多肽交叉反应；和/或
(n)抗体与SEQ ID NO:9的小鼠IL1RAP多肽交叉反应。
本公开还提供抗IL1RAP抗体的实施例，其中：(i)抗体是单克隆抗体；(ii)抗体是人类、人源化或嵌合抗体；(iii)抗体是IgG类的全长抗体，任选地，其中所述IgG类抗体具有选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的同种型；(iv)抗体是Fc区变异体，任选地是改变效应子功能的Fc区变异体(例如，产生无效应子抗体的变异体)；表现出降低的CDC活性、ADCC活性和/或ADCP活性的Fc区变异体；对人单核细胞、嗜中性粒细胞和/或Jurkat细胞表现出降低的细胞毒性活性的Fc区变异体，或改变抗体半衰期的Fc区变异体；(v)抗体是抗体片段，任选地选自由F(ab')2、Fab'、Fab、Fv，单结构域抗体(VHH)和scFv组成的群组；(vi)抗体是免疫缀合物，任选地，其中免疫缀合物包含用于治疗IL1RAP介导的疾病或病况的治疗剂；(vii)抗体是多特异性抗体，任选地是双特异性抗体；(viii)抗体是合成抗体，其中CDR被接枝到除免疫球蛋白骨架或构架之外的骨架或构架上的CDR；任选地选自替代蛋白骨架的骨架和人造聚合物骨架。
在其它实施例中，本公开提供编码本文所公开的抗IL1RAP抗体的分离的核酸。
在一些实施例中，本公开还提供宿主细胞，其包含编码如本文所公开的抗IL1RAP抗体的核酸。
本公开还提供一种产生抗IL1RAP抗体的方法，其中所述方法包含培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码抗IL1RAP抗体的核酸(或载体)，从而产生抗体。
在一些实施例中，本公开提供药物组合物，其包含如本文所公开的抗IL1RAP抗体和药学上可接受的载剂。在一些实施例中，药物组合物还包含用于治疗IL-1、IL-33、IL-36和/或IL1RAP介导的疾病或病况的治疗剂；任选地，其中所述治疗剂为化学治疗剂。
本公开还提供一种在受试者中治疗IL1RAP介导的疾病的方法，所述方法包含向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗IL1RAP抗体，或治疗有效量的如本文所公开的抗IL1RAP抗体的医药调配物。
本公开还提供一种在受试者中治疗由IL-1、IL-33和/或IL-36信号传导介导的疾病的方法，所述方法包含向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗IL1RAP抗体，或治疗有效量的如本文所公开的抗IL1RAP抗体的药物组合物。
本公开还提供一种在受试者中治疗由IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ刺激的信号传导介导的疾病的方法，所述方法包含向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗IL1RAP抗体，或治疗有效量的如本文所公开的抗IL1RAP抗体的药物组合物。
在本文所公开的治疗方法的各种实施例中，IL1RAP介导的疾病和病况或由I-L1、IL-33和/或IL-36信号传导介导的疾病包括炎性疾病、自身免疫疾病、呼吸道疾病、代谢障碍、传染病和癌症。在一些实施例中，IL1RAP介导的疾病和病况可以选自：痤疮、急性胰腺炎、急性重度溃疡性结肠炎、成人斯蒂尔病(adult-onset Still's disease)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、气道高反应性、气道炎症、过敏性结膜炎、过敏性鼻炎、过敏、阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、过敏反应、关节炎疼痛、哮喘、动脉粥样硬化、特应性皮炎、特应性湿疹、自身免疫性血管炎、白塞氏病、骨癌、脑癌、乳癌、恶病质/厌食、软骨损伤、脑缺血、慢性疲劳综合症、慢性阻塞性肺病、梭菌属相关疾病、结肠癌、充血性心脏衰竭、结膜炎、冠状动脉旁路移植术、冠状动脉再狭窄、克罗恩氏病(Crohn's disease)、糖尿病、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病、干眼病、子宫内膜异位症、嗜酸性粒细胞相关的胃肠道病症、嗜酸性粒细胞性食管炎、家族性寒冷性自身炎性综合症、家族性地中海热、发热、纤维肌痛、纤维化病症、食物过敏、泛发性脓疱型牛皮癣、青光眼、肾小球肾炎、痛风性关节炎、移植物抗宿主疾病、蠕虫感染、出血性休克、化脓性汗腺炎、痛觉过敏、高IgD综合症、高尿酸血症、特发性肺纤维化(IPF)、癌症相关的疼痛、感染、炎性肠病(IBD)、由劳损引起的发炎病况、与角膜移植相关的炎性眼病、炎性疼痛、流感、肠癌、局部缺血、幼年型关节炎、川崎氏病(Kawasaki's disease)、肾癌、先天性利伯氏黑蒙(Leber's congenital amaurosis)、肝癌、肝病、肺癌、穆-韦二氏综合症(Muckle-Wells syndrome)、多发性骨髓瘤、多发性硬化症、肌肉骨骼疼痛、骨髓性和其它白血病、心肌功能障碍、肌病、鼻息肉、新生儿发病的多系统炎性疾病、神经毒性、非传染性结膜炎、非小细胞肺癌、骨科手术、骨关节炎、骨质疏松、疼痛、掌跖脓疱病、胰脏癌、帕金森氏病(Parkinson's disease)、牙周病、周围血管疾病、风湿性多肌痛、息肉样脉络膜血管病(PCV)、早产、前列腺癌、原虫感染、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、坏疽性脓皮病、再灌注损伤、呼吸道合胞病毒(RSV)、再狭窄、视网膜脱离、色素性视网膜炎、早产儿视网膜病(ROP)、类风湿性关节炎、败血性休克、镰状细胞性贫血、放射疗法的副作用、鼻窦炎、皮肤癌、睡眠障碍、扭伤、斯特格氏病(Stargardt's disease)、胃癌、颞下颌关节病、TNF受体相关的周期性综合症、移植排斥、创伤、眼外伤、2型糖尿病、溃疡性结肠炎和葡萄膜炎。
在一些实施例中，本公开还提供一种在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包含向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗IL1RAP抗体的抗体，或治疗有效量的如本文所公开的抗IL1RAP抗体的医药调配物。在实施例中，癌症选自乳癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、胰脏癌。
在一些实施例中，本公开还提供一种在受试者中治疗哮喘的方法，所述方法包含向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗IL1RAP抗体的抗体，或治疗有效量的如本文所公开的抗IL1RAP抗体的医药调配物。
在一些实施例中，本公开还提供一种用于检测生物样品中的IL1RAP水平的方法，所述方法包含使样品与如本文所公开的抗IL1RAP抗体接触的步骤。本公开的抗IL1RAP抗体可用于任何已知的分析方法中，如用于检测和量化IL1RAP的竞争性结合分析、直接和间接夹层分析，免疫沉淀分析和酶联免疫吸附分析(ELISA)(参见,Sola,1987,《单克隆抗体:技术手册(Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques)》,第147-158页,CRC出版公司)。抗体以高亲和力结合hu-IL1RAP，适用于广泛范围的分析。
附图说明
图1描绘了小鼠杂交瘤衍生的抗hu-IL1RAP抗体，11C5(Hy)在IL-1、IL-33和IL-36刺激的胞内信号传导的抑制分析的结果的标绘图，所述抑制分析在HEK-BLUETM IL-1/IL-33应答传感器细胞或HEK-BLUETM IL-36应答传感器细胞(即，瞬时表达IL-36受体的IL-33细胞)中评估并且用各种所示激动剂刺激。图1A：11C5(Hy)对HEK-BLUETM IL-1/IL-33应答细胞的IL-1刺激([IL-1α＝35pM)的抑制；IC50＝4.70nM。图1B：11C5(Hy)对HEK-BLUETM IL-1/IL-33应答细胞的IL-1β刺激([IL-1β]＝7pM)的抑制；IC50＝1.00nM。图1C：11C5(Hy)对HEK-BLUETM IL-1/IL-33应答细胞的IL-33刺激([IL-33]＝60pM)的抑制；IC50＝3.71nM。图1D：11C5(Hy)对HEK-BLUETM IL-36响应细胞的IL-36α刺激([IL-36α]＝10pM)的抑制；IC50＝2.52nM。图1E：11C5(Hy)对HEK-BLUETM IL-36应答细胞的IL-36β刺激([IL-36β]＝5pM)的抑制；IC50＝0.98nM。图1F：11C5(Hy)对HEK-BLUETM IL-36应答细胞的IL-36γ刺激([IL-36γ]＝7pM)的抑制；IC50＝0.67nM。所有分析都在约EC50到EC70的激动剂浓度下进行；显示的误差条表示与重复样品的标准差；并且阳性对照(PC)用黑色虚线表示，而阴性对照(NC)用灰色虚线表示。
图2描绘了最接近的人种系κ轻链VL区(基因ID-V基因：IGKVl-NLl*01，J基因：IGKJ4*02)和重链VH区(基因ID-V基因：IGHV3-7*03，J基因：IGHJ4*03)抗杂交瘤衍生的鼠抗hu-IL1RAP抗体11C5(Hy)的VL和VH区的氨基酸序列的比对，和此抗体的人源化形式h11C5。
图3描绘了人源化抗hu-IL1RAP抗体h11C5和阳性和阴性对照参考抗体相对于杆状病毒(BV)颗粒的ELISA信号在450nm处的浓度的标绘图，表明h11C5与BV颗粒不存在非特异性结合。
图4描绘了以下基于杂交瘤衍生的抗hu-IL1RAP抗体11C5(Hy)的重组制备的抗体的胞内信号传导抑制分析结果的标绘图：鼠11C5(“m11C5”)、嵌合11C5(“c11C5”)、人源化11C5 mAb(“h11C5”)、c11C5的C59Y变异体(“c11C5_C59Y”)和h11C5的C59Y变异体(“h11C5_C59Y”)。为了比较，还包括针对11C5(Hy)和人类同种型对照抗体(“Hu IgG1 Ctrl”)的分析结果的标绘图。图4A：11C5(Hy)、m11C5和h11C5对HEK-BLUETM IL-1/IL-33应答细胞的IL-1β刺激([IL-1β]＝7pM)的抑制。图4B：11C5(Hy)、m11C5和h11C5对HEK-BLUETM IL-1/IL-33应答细胞的IL-33刺激([IL-33]＝60pM)的抑制。图4C：h11C5和h11C5_C59Y对HEK-BLUETM IL-1/IL-33应答细胞的IL-1β刺激([IL-1β]＝7pM)的抑制。图4D：h11C5和h11C5_C59Y对HEK-BLUETM IL-1/IL-33应答细胞的IL-33刺激([IL-33]＝60pM)的抑制。图4E：c11C5_C59Y对原代人肺成纤维细胞(PHLF)的IL-1α刺激([IL-1α]＝10pM)的抑制；IC50＝3.96nM。图4F：c11C5_C59Y对原代人单核细胞(PHM)的IL-1β刺激([IL-1β]＝0.925nM)的抑制；IC50＝0.74nM。图4G：c11C5_C59Y对原代人NK(PHNK)细胞的IL-33刺激([IL-33]＝1nM，[IL-12]＝0.1ng/mL)的抑制；IC50＝2.90nM。图4H：c11C5_C59Y对PHLF的IL-36β刺激([IL-36β]＝2nM)的抑制；IC50＝0.28nM。所有重组抗体还含有赋予无效应子功能的N297G突变；激动剂以约EC50至EC70的有效浓度使用；误差条表示与重复样品的标准差；阳性对照(PC)用黑色虚线表示，而阴性对照(NC)用灰色虚线表示。
图5描绘了含有如实例9和10中所描述的VL或VH区中的任一者或两者中的单个、双重或三重突变的h11C5_C59Y/A43S、Fab或IgG蛋白质的亲和力成熟变异体的HEK-Blue胞内信号传导抑制分析结果的标绘图。图5A：对HEK-BLUETM IL-1/IL-33应答细胞的IL-1β刺激([IL-1β]＝7pM)的抑制。图5B：对HEK-BLUETM IL-1/IL-33应答细胞的IL-33刺激([IL-33]＝40pM)的抑制。图5C：对HEK-BLUETM IL-36应答细胞的IL-36α刺激([IL-36α]＝60pM)的抑制。图1D：对HEK-BLUETM IL-1/IL-33应答细胞的IL-1β刺激([IL-1β]＝9pM)的抑制。图5E：对HEK-BLUETM IL-1/IL-33应答细胞的IL-33刺激([IL-33]＝60pM)的抑制。图5F：对HEK-BLUETM IL-36应答细胞的IL-36α刺激([IL-36α]＝50pM)的抑制。实例9中解释了对应于图中使用的变异体的标识符的VL和VH区突变。图5A-C描绘了亲和力成熟变异体的Fab形式的结果，包括非亲和力成熟的亲本抗体“h11C5_AC59Y/A43S”和IgG对照“Fab Ctrl”的Fab形式。图5D-F描绘了亲和力成熟变异体的全长IgG抗体形式的结果，并且包括非亲和力成熟的亲本抗体“h11C5_AC59Y/A43S”和IgG对照的全长IgG抗体形式。所测试的所有全长IgG抗体(包括同种型IgG对照抗体)均含有赋予无效应子功能的N297G突变。在约EC50到EC60的激动剂浓度下进行IL-1β或IL-36α刺激的分析。在约EC35到EC45的激动剂浓度下进行IL-33刺激的分析。显示的误差条表示来自重复样品的标准差。阳性对照(PC)用黑色虚线表示，而阴性对照(NC)用灰色虚线表示。
图6A、6B和6C描绘了与如实例12中所描述的h11C5变异体YKD(或“11C5-YKD”)相比，h11C5变异体YKD/YTE(或“11C5-YKD/YTE”)的HEK-Blue胞内信号传导抑制分析结果的标绘图。图6A显示用IL-1β刺激的HEK-Blue细胞的分析结果；图6B显示用IL-33刺激的HEK-Blue细胞的分析结果；并且图6C显示用IL-36β刺激的HEK-Blue细胞的分析结果。在每个分析中，激动剂浓度接近或大于EC55。显示的误差条表示来自重复样品的平均值的标准误差。阳性对照(PC)用黑色虚线表示，而阴性对照(NC)用灰色虚线表示。
图7描绘了与在大于EC55的激动剂浓度下(如实例12中所描述)用IL-1β刺激的单核细胞中的YKD(或“11C5-YKD”)或同种型对照(IgG Ctrl)相比，h11C5变异体抗体YKD/YTE(或“11C5-YKD/YTE”)的阻断功效的分析的标绘图。显示的误差条表示来自重复样品的标准差。阳性对照(PC)用黑色虚线表示，而阴性对照(NC)用灰色虚线表示。
图8描绘了与在接近或大于EC55的激动剂浓度下(如实例12中所描述)用IL-1α刺激的PHLF细胞中的变异体YKD(或“11C5-YKD”)或同种型对照(IgG Ctrl)相比，h11C5变异体YKD/YTE(或“11C5-YKD/YTE”)的阻断功效的分析的标绘图。显示的误差条表示来自重复样品的标准差。阳性对照(PC)用黑色虚线表示，而阴性对照(NC)用灰色虚线表示。
图9描绘了与在大于EC55的激动剂浓度下(如实例12中所描述)用IL-36β刺激的HEKn中的YKD(或“11C5-YKD”)或同种型对照(IgG Ctrl)相比，h11C5变异体抗体YKD/YTE(或“11C5-YKD/YTE”)的阻断功效的分析的标绘图。显示的误差条表示来自重复样品的标准差。阳性对照(PC)用黑色虚线表示。
图10描绘了与在接近或大于EC55的激动剂浓度下(如实例12中所描述)用IL-36β刺激的PHLF中的YKD(或“11C5-YKD”)或同种型对照(IgG Ctrl)相比，h11C5变异体抗体YKD/YTE(或“11C5-YKD/YTE”)的阻断功效的分析的标绘图。显示的误差条表示来自重复样品的标准差。阳性对照(PC)用黑色虚线表示，而阴性对照(NC)用灰色虚线表示。
图11描绘了与在IL-12存在下(如实例12中所描述)用IL-33刺激的原代人NK细胞中的YKD(或“11C5-YKD”)或同种型对照(IgG Ctrl)相比，h11C5变异体抗体YKD/YTE(或“11C5-YKD/YTE”)的阻断功效的分析的标绘图。IL-33的有效浓度等于EC50。显示的误差条表示来自重复样品的标准差。阳性对照(PC)用黑色虚线表示，而阴性对照(NC)用灰色虚线表示。
图12描绘了在EC56的激动剂浓度下(如实例12中所描述)用IL-33刺激的嗜碱粒细胞中的h11C5变异体抗体YKD/YTE(或“11C5-YKD/YTE”)或同种型对照(IgG Ctrl)的阻断功效的分析的标绘图。显示的误差条表示来自重复样品的标准差。阳性对照(PC)用黑色虚线表示，而阴性对照(NC)用灰色虚线表示。
图13描绘了在EC34的激动剂浓度下(如实例12中所描述)用IL-33刺激的CD4+T细胞中的h11C5变异体抗体YKD/YTE(或“11C5-YKD/YTE”)或同种型对照(IgG Ctrl)的阻断功效的分析的标绘图。显示的误差条表示来自一式三份样品的平均值的标准误差。阳性对照(PC)用黑色虚线表示，而阴性对照(NC)用灰色虚线表示。
图14A描绘了非线性二室模型，其最能描述从如实例14所描述的食蟹猴中进行的药代动力学研究1、2和3中获得的数据。模型参数，变量和初始条件定义如下：“Vc”是中央隔室的体积，每体重以mL/kg为单位；“Vp”是外周隔室的体积/体重，以mL/kg为单位；“CLt”是假定经由FcRn介导的IgG分解代谢和再循环发生的线性间隙，每体重以mL/天/kg为单位；“CLd”是中央隔室和外周隔室之间的分布间隙，以mL/天/kg为单位；“A(1)(t)”是在时间t时每体重中央隔室中的药物量，并且因此，血浆浓度时间曲线的模型预测是“A(1)(t)/Vc”，μg/kg为单位，其中A(1)(0)＝0；并且“A(2)(t)”是在时间t时每体重外周隔室中的药物量，以μg/kg为单位，其中A(2)(0)＝0。
图14B和14C描绘了如实例14所描述的在食蟹猴中施用单次IV剂量的抗体后的YKD(图14B)和YKD/YTE(图14C)的药代动力学。图14B：YKD剂量为40mg/kg(显示为实心圆)、20mg/kg(空心圆)、10mg/kg(实心方形)、3mg/kg(空心方形)和1mg/kg(实心三角形)。图14C：YKD/YTE剂量为40mg/kg(显示为实心圆)、10mg/kg(空心方形)和3mg/kg(实心三角形)。误差条表示标准差。
图15描绘了人类IL1RAP(分子表面)、IL-1猓ㄉ罨疑┖虸L-1R1(浅灰色带)的三元复合物的晶体结构(PDB代码：3O4O)的分子表面和带状表示。所述表示描绘了IL1RAP氨基酸残基的空间分布，这些残基被鉴定为对抗hu-IL1RAP抗体YIS和YKS的结合不利，但(如果突变)对参考抗体的结合无害，如实例15所描述。观察到的具有9个或更多标记取代的IL1RAP残基、I245、E261和T267呈黑色，并且具有6-8个标记取代的表位中的其它残基呈深灰色。
图16A和16B描绘了在如实例18所描述的单一IL-1β攻击模型(图16A)或单一IL-36α攻击模型(图16B)中测定的14F4或同种型对照(IgG Ctrl)的阻断功效的标绘图。图16A：向小鼠给药14F4或IgG Ctrl，并且一天后用D-PBS或50ng IL-1β腹膜内攻击；攻击后两小时，收集血液，并且测定血清IL-6水平；数据来自每组5只小鼠并且代表两个独立的实验；条形图表示平均值+/-SEM；各个圆圈表示来自一只单独小鼠的数据；用14F4或IgG Ctrl给药的小鼠分别用白色或黑色圆圈表示；**p≤0.01使用Mann-Whitney测试比较同种型/PBS和同种型/IL-1β攻击的小鼠或比较同种型/IL-1β攻击的和14F4/IL-1β攻击的小鼠。图16B：向小鼠给药14F4或IgG Ctrl，并且一天后用D-PBS或10ng IL-36α鼻内攻击；攻击后一天，确定了肺空域中的细胞炎症；数据来自每组5只小鼠并且表示两个独立的实验；条形图表示平均值+/-SEM；各个圆圈表示来自一只单独小鼠的数据；用14F4或IgG Ctrl给药的小鼠分别用白色或黑色圆圈表示；**p≤0.01使用Mann-Whitney测试比较同种型/PBS和同种型/IL-36α攻击的小鼠或比较同种型/IL-36α攻击的和14F4/IL-36α攻击的小鼠。
图17A、17B、17C、17D和17E描绘了如在多重IL-1β攻击模型中测定的14F4或同种型对照(IgG Ctrl)的阻断功效的标绘图，所述攻击模型如实例18所描述分析肺空域中免疫细胞浸润。测量了肺空域中五种不同细胞类型的浸润的阻断功效：嗜中性粒细胞(图17A)；CD4T细胞(图17B)；T1-ST2+CD4 T细胞(图17C)；单核细胞(图17D)；和树突状细胞(图17E)。在第1天和第2天向小鼠给药14F4或IgG Ctrl，并且在第0、1和2天用D-PBS或30ng IL-1β鼻内攻击；在第3天，确定了肺空域的细胞炎症；数据来自每组5只小鼠并且表示两个独立的实验；条形图表示平均值+/-SEM。单个圆圈表示来自一只单独小鼠的数据；用14F4或IgG Ctrl给药的小鼠分别用白色或黑色圆圈表示；*p≤0.05和**p≤0.01使用Mann-Whitney测试比较同种型/PBS和同种型/IL-1β攻击的小鼠或比较同种型/IL-1β攻击的和14F4/IL-1β挑战的小鼠。
图18A、18B和18C描绘了如在多重IL-1β攻击模型中测定的14F4或同种型对照(IgGCtrl)的阻断功效的标绘图，所述攻击模型如实例18所描述分析肺组织中的趋化因子和细胞因子水平。基于从肺组织样品中测量的三种不同趋化因子和细胞因子的水平，确定阻断功效：IL-1β(图18A)；IL-17A(图18B)；和CXCL1(图18C)。在第1天和第2天向小鼠给药14F4或IgG Ctrl，并且在第0、1和2天用D-PBS或30ng IL-1β鼻内攻击；在第3天，收集肺组织用于蛋白质趋化因子和细胞因子分析；数据来自每组5只小鼠并且表示两个独立的实验；条形图表示平均值+/-SEM；各个圆圈表示来自一只独立小鼠的数据；用14F4或IgG Ctrl给药的小鼠分别用白色或黑色圆圈表示；*p≤0.05和**p≤0.01使用Mann-Whitney测试比较同种型/PBS和同种型/IL-1β攻击的小鼠或比较同种型/IL-1β攻击的和14F4/IL-1β攻击的小鼠。
图19A和19B描绘了如在急性HDM哮喘模型中测定的14F4或同种型对照(IgG Ctrl)的阻断功效的标绘图，所述急性HDM哮喘模型如实例18所描述分析血清抗体水平。图19A：分析HDM特异性IgE；图19B：分析HDM特异性IgG1。在第1、2、6、9和13天，向小鼠腹膜内给药14F4或IgG对照；在第0-3、6-10、13和14天，用盐水或25μg HDM腹膜内攻击小鼠；最后一次攻击后一天，收集血液，并且测定血清HDM特异性IgE和IgG1水平；数据来自每组6-10只小鼠并且表示两个独立的实验；条形图表示平均值+/-SEM；各个圆圈表示来自一只独立小鼠的数据；用14F4或IgG Ctrl给药的小鼠分别用白色或黑色圆圈表示；*p≤0.05、**p≤0.01、***p≤0.001使用Mann-Whitney测试比较同种型/盐水和同种型/HDM攻击的小鼠或比较同种型/HDM攻击的和14F4/HDM攻击的小鼠。
具体实施方式
本公开提供以高亲和力特异性结合人类IL1RAP的抗体，包括人源化抗体。所公开的抗IL1RAP抗体能够通过IL1RAP介导的路径(包括IL-1、IL-33和/或IL-36信号传导路径)减少、抑制和/或完全阻断胞内信号传导。更具体地，本文所公开的抗IL1RAP抗体能够减少、抑制和/或完全阻断由一种或多种以下激动剂的结合刺激的信号传导：IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ。本公开还提供抗IL1RAP抗体在治疗IL1RAP介导的疾病的方法中的用途，所述疾病包括对IL-1、IL-33和/或IL-36信号传导的抑制有响应的疾病和状况，包括但不限于各种癌症(例如，乳腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、胰脏癌)以及炎性、传染性和自身免疫性疾病，包括关节炎、哮喘和溃疡性结肠炎。
术语和技术概述
对于在本文和所附权利要求书中的描述，除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一个/种(a/an)”包括多个指示物。因此，例如，提及“一种蛋白质”包括多于一种蛋白质，并且提及“一种化合物”是指多于一种化合物。“包含(comprise/comprises/comprising)”、“包括(include/includes/including)”可互换使用并且并不意图是限制性的。应进一步理解，在各种实施例的描述使用所属领域的技术人员将在一些具体情形下所应理解的术语“包含”的情况下，可以使用语言“主要由……组成”或“由……组成”来替代性地描述实施例。
在提供值的范围时，除非上下文另外明确规定，否则应理解，除非上下文另外明确规定否则在那个范围的上限与下限之间的值的每个中介整数和值的每个中介整数的每个十分位以及那个所述范围中的任何其它所述或中介值涵盖于本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括于较小范围中并且也涵盖于本发明内，在所述范围内受到任何特定排他性限制。在所述范围包括这些界限值中的一者或两者的情况下，排除所包括的界限值中的任(i)一者或(ii)两者的范围也包括于本发明中。例如，“1到50”包括“2到25”、“5到20”、“25到50”、“1到10”等。
通常，本文所使用的命名法和本文所描述的技术和程序包括所属领域普通技术人员熟知并且通常采用的命名法，如Sambrook等人,《分子克隆-实验室手册(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)》(第二版),第1-3卷,冷泉港实验室(Cold Spring HarborLaboratory),纽约州冷泉港,1989(以下简称“Sambrook”)；FM Ausubel等人编辑的《分子生 物学现代方法(Current Protocols in Molecular Biology)》,《实验室指南(CurrentProtocols)》,格林出版合伙公司和约翰威立父子公司的合资企业(2011年增补)(以下称“Ausubel”)；《抗体工程改造(Antibody Engineering)》,第1和2卷,R.Kontermann和S.Dubel编辑,施普林格出版社(Springer-Verlag),柏林和海德堡(2010)；《单克隆抗体 (Monoclonal Antibodies)》：方法和方案,VV.Ossipow和N.Fischer编辑,第2版,胡马纳出版社(Humana Press)(2014)；《治疗性抗体：从实验台到临床(Therapeutic Antibodies: From Bench to Clinic)》,Z.An编辑,威立父子公司(J.Wiley&Sons),新泽西州霍博肯(2009)；和《噬菌体展示(Phage Display)》,Tim Clackson和Henry B.Lowman编辑,英国牛津大学出版社(2004年)中所描述的通用技术和方法。
本公开中所参考的所有出版物、专利、专利申请和其它文献都以全文引用的方式并入本文中以用于所有目的，其引用的程度就如同个别地指示将各个别出版物、专利、专利申请或其它文献以引用的方式并入以用于所有目的。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。应当理解，本文所使用的术语仅用于描述特定实施例，而不旨在是限制性的。出于解释本公开的目的，术语的以下描述将适用，并且在适当时，以单数形式使用的术语还将包括复数形式，并且反之亦然。
如本文所使用，“IL1RAP”是指白介素-1受体辅助蛋白，其是IL-1家族中几种受体的细胞膜辅助受体，包括白介素-1受体1(IL1R1)、ST2(也称为白介素-1受体样1或IL1RL1)和白介素-1受体样蛋白2(IL1RL2)。应注意，白介素-1受体辅助蛋白或IL1RAP在所属领域中有时称为“IL-1RAP”、“IL-1RAcP”、“IL1RAcP”或“IL-1R3”。术语“IL1RAP”、“IL1RAP多肽”和“IL1RAP蛋白”在本文可互换使用。
如本文所使用，“IL1RAP介导的病况”或“IL1RAP介导的疾病”涵盖与由IL-1家族的细胞因子以及充当辅助受体的IL1RAP一起介导的信号传导路径的异常功能有关的任何医学病况，包括但不限于，由IL-1家族细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ刺激的下游信号传导路径。例如，IL1RAP介导的疾病可以包括但不限于由IL-1、IL-33和/或IL-36信号传导路径的拮抗剂或抑制剂介导的和/或响应的疾病，包括癌症、炎性、传染性和自身免疫性疾病。更具体地，IL1RAP介导的疾病可以包括但不限于痤疮、急性重度溃疡性结肠炎、成人斯蒂尔病、过敏性鼻炎、痛风性关节炎、幼年型关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、关节炎疼痛、哮喘、动脉粥样硬化、特应性湿疹、白塞氏病、恶病质、乳癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、胰脏癌、慢性阻塞性肺病、干眼综合症、家族性寒冷性自身炎性综合症、家族性地中海热、食物过敏、泛发性脓疱型牛皮癣、化脓性汗腺炎、高IgD综合症、高尿酸血症、穆-韦二氏综合症、新生儿发病的多系统炎性疾病、肌肉骨骼疼痛、掌跖脓疱病、周围血管疾病、风湿性多肌痛、鼻息肉、牛皮癣、坏疽性脓皮病、再狭窄、镰状细胞性贫血、TNF受体相关的周期性综合症、2型糖尿病和溃疡性结肠炎。
如本文所使用，“IL-1刺激信号”是指通过IL-1细胞因子(如IL-1α或IL-1β)与其同源细胞表面受体IL1R1结合而引发的胞内信号。示例性IL-1刺激信号包括可使用基于细胞的阻断分析(如HEK-BLUETM基于IL-1应答细胞的分析)所测量的那些信号，如本文实例中所公开。
如本文所使用，“IL-33刺激信号”是指通过IL-33细胞因子(如IL-33)与其同源细胞表面受体IL1RL1(也称为ST2)结合而引发的胞内信号。示例性IL-33刺激信号包括可使用基于细胞的阻断分析(如HEK-BLUETM基于IL-33应答细胞的分析)所测量的那些信号，如本文实例中所公开。
如本文所使用，“IL-36刺激信号”是指通过IL-36细胞因子(例如IL-36α、IL-36β或IL-36γ)与其同源细胞表面受体IL1RL2结合而引发的胞内信号。示例性IL-36刺激信号包括通过基于替代细胞的阻断分析(例如HEK-BLUETM基于IL-36应答细胞的分析)所测量的那些信号，如本文实例中所公开。
“基于细胞的阻断分析”是指其中可以测量抗体抑制或降低其结合的抗原的生物活性的能力的分析。例如，基于细胞的阻断分析可以用于测量抑制特定生物学或生物化学功能(如经由IL-1、IL-33和IL-36信号传导路径的IL1RAP介导的胞内信号传导)所需的抗体浓度。在一些实施例中，使用基于细胞的阻断分析测量抗体(例如本公开的抗IL1RAP抗体)的半数最大抑制浓度(IC50)和/或90％抑制浓度(IC90)。在一些实施例中，基于细胞的阻断分析用于确定抗体是否阻断激动剂(例如IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、IL-36γ)与其同源受体之间的相互作用。可用于本公开的抗体的基于细胞的阻断分析可以包括原代细胞分析(例如PHLF细胞)以及报告或传感器细胞分析(例如HEK-BLUETM报告细胞分析)。在本文所提供的实例中描述了用于IL-1、IL-33和IL-36信号传导路径的示例性的基于细胞的阻断分析，如合适的HEK-BLUETM基于特异性细胞因子-应答报告细胞的分析。
如本文所使用，“抗体”是指包含与特定抗原特异性结合或对特定抗原具有免疫反应性的一条或多条多肽链的分子。本公开的示例性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、多特异性(或异源缀合物)抗体(例如，双特异性抗体)、单价抗体(例如，单臂抗体)、多价抗体、抗原结合片段(例如，Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、rIgG和scFv片段)、抗体融合体和合成抗体(或抗体模拟物)。
“抗IL1RAP抗体”或“结合IL1RAP的抗体”是指以足够的亲和力结合IL1RAP的抗体，使得所述抗体用作靶向IL1RAP的诊断和/或治疗剂。在一些实施例中，如例如通过放射免疫分析(RIA)所测量，抗IL1RAP抗体与不相关的非IL1RAP抗原的结合程度小于抗体与IL1RAP的结合的约10％。在一些实施例中，结合到IL1RAP的抗体的解离常数(KD)<1μM、<100nM、<10nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nM或<1pM(例如10-8M或更小，例如10-8M到10-13M，例如10-9M到10- 13M)。
“全长抗体”、“完整抗体”或“整个抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本相似的结构或具有含有本文所定义的Fc区的重链的抗体。
“抗体片段”是指全长抗体的一部分，其能够结合与全长抗体相同的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单价或单臂抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，并且将其中几类进一步划分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。
“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的结构域，其涉及抗体与抗原的结合。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守构架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见例如,Kindt等人,《库比免疫学(Kuby Immunology)》,第6版,W.H.弗里曼公司,第91页)。单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可使用VH或VL结构域从结合抗原的抗体中分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域的库(参见例如,Portolano等人,《免疫学杂志(J.Immunol.)》,150:880-887(1993)；Clarkson等人,《自然(nature)》,352:624-628(1991))。
如本文所使用，“高变区”或“HVR”是指在序列上高变和/或形成结构上定义的环(“高变环”)的抗体可变结构域的区域中的每一者。通常，天然抗体包含具有六个HVR的四个链；三个位于重链可变结构域VH(HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3)，并且三个位于轻链可变结构域VL(HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基。除非另外指明，否则可变结构域中的HVR残基和其它残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人,《免疫相关蛋白的序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)》,第5版,公共卫生服务部,美国国家卫生研究院,贝塞斯达,MD(1991)。
如本文所使用，“互补决定区”或“CDR”是指可变结构域的HVR内具有最高序列可变性和/或涉及抗原识别的区。通常，天然抗体包含具有六个CDR的四条链；三个位于重链可变结构域VH(H1、H2、H3)，并且三个位于轻链可变结构域VL(L1、L2、L3)。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)出现在L1的氨基酸残基24-34、L2的50-56、L3的89-97、H1的31-35B、H2的50-65和H3的95-102。(Kabat等人，同上)。
“构架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基以外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常出现在VH(或VL)中的以下序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
“天然抗体”是指天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二硫键键结的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N端到C端，每条重链都有一个可变区(VH)，也称为可变重结构域或重链可变结构域，其后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端到C端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻结构域或轻链可变结构域，其后是恒定轻(CL)结构域。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列可归属于两种类型之一，称为kappa(κ)和lambda(λ)。
如本文所使用，“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群获得的抗体，即，除了可能的变异体抗体(例如，变异体抗体含有突变，所述突变天然存在或在产生单克隆抗体的过程中产生，并且通常以少量存在)之外，包含所述群的单个抗体是相同的和/或结合相同的表位。相对于通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，术语“单克隆”指示如从基本上均质的抗体群获得的抗体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，所使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分人类免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，用于制备单克隆抗体的此类方法和其它示例性方法描述于本文中。
“嵌合抗体”是指其中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同来源或物种的一种抗体。
“人源化抗体”是指包含来自非人类HVR的氨基酸序列和来自人类FR的氨基酸序列的嵌合抗体。在某些实施例中，人源化抗体将包含至少一个且通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部的HVR(例如CDR)对应于非人类抗体的HVR，并且全部或基本上全部的FR对应于人类抗体的FR。人源化抗体可任选地包含来源于人类抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人类抗体)的“人源化形式”是指已经经历人源化的抗体。
“人类抗体”是指具有氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于由人类或人类细胞产生的或来源于利用人类抗体库或其它人类抗体编码序列的非人类来源的抗体的氨基酸序列。人类抗体的此定义尤其排除包含非人类抗原结合残基的人源化抗体。
“人类共有构架”是一个构架，其表示在选择人类免疫球蛋白VL或VH构架序列中最常存在的氨基酸残基。通常，人类免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。通常，序列的亚组是如Kabat等人，《免疫相关蛋白的序列》，第五版，NIH出版物91-3242，马里兰州贝塞斯达(1991)，第1-3卷中的亚组。在一个实施例中，对于VL，亚组是如上文Kabat等人所述的亚组κ。在一个实施例中，对于VH，亚组是如上文Kabat等人所述的亚组III。
如本文所使用，“受体人类架构”是包含来源于人类免疫球蛋白架构或人类共有架构的轻链可变结构域(VL)架构或重链可变结构域(VH)架构的氨基酸序列的架构。“来源于”人类免疫球蛋白架构或人类共有架构的受体人类架构可包含其相同的氨基酸序列，或其可含有氨基酸序列变化。在一些实施例中，氨基酸变化的数目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少或2或更少。在一些实施例中，VL受体人类构架在序列上与VL人类免疫球蛋白构架序列或人类共有构架序列相同。
“Fc区”是指包含免疫球蛋白重链的C端多肽序列的二聚体复合物，其中C端多肽序列是可通过木瓜蛋白酶消化完整抗体而获得的。Fc区可包含天然或变异体Fc序列。尽管免疫球蛋白重链的Fc序列的边界可能不同，但通常将人类IgG重链Fc序列定义为从约Cys226处的氨基酸残基或约Pro230处的氨基酸残基延伸到Lys447处的Fc序列的羧基端。然而，由于酶裂解，Fc序列的C端赖氨酸(Lys447)可能存在于或可能不存在于重组抗体的Fc区中，所述酶裂解可能发生于用于重组生产(例如CHO细胞中的生产)的细胞培养系统中。免疫球蛋白的Fc序列通常包含两个恒定结构域，CH2结构域和CH3结构域，并且任选地包含CH4结构域。
“Fc受体”或“FcR”是指与抗体的Fc区结合的受体。在一些实施例中，FcR是天然人类FcR。在一些实施例中，FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变异体和替代性剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，两者具有主要在其胞质结构域方面不同的类似氨基酸序列。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体Fc鉘IIb在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见例如,Daeron,《免疫学年鉴(Annu.Rev.Immunol.)》,15:203-234(1997))。如本文所使用的FcR还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移到胎儿(Guyer等人,《免疫学杂志》,1 17:587(1976)和Kim等人,《欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)》,24:2429-2434(1994))和免疫球蛋白稳态的调节。FcR评述于例如Ravetch和Kinet,《免疫学年鉴》,9:457-92(1991)；Capel等人,《免疫方法(Immunomethods)》,4:25-34(1994)；以及de Haas等人,《实验室与临床医学杂志(J.Lab.Clin.Med.)》,126:330-41(1995)中。
如本文所使用，“多价抗体”是包含三个或更多个抗原结合位点的抗体。优选将多价抗体工程改造成具有三个或更多个抗原结合位点，并且通常不是天然序列IgM或IgA抗体。
“多特异性抗体”是具有至少两个不同结合位点的抗体，每个位点具有不同的结合特异性。多特异性抗体可以是全长抗体或抗体片段，并且不同的结合位点可各自结合到不同的抗原或不同的结合位点可结合到相同抗原的两个不同表位。
“Fv片段”是指含有完整的抗原识别和结合位点的抗体片段。此区由紧密缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成，所述二聚体在性质上，例如在scFv中可以是共价的。正是在此构型中，每个可变结构域的三个HVR相互作用以限定VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。共同地，这六个HVR或其子集赋予了抗体抗原结合特异性。然而，尽管单个可变结构域(或仅包含三个对抗原具有特异性的HVR的Fv的一半)能够识别并结合抗原，但亲和力通常低于整个结合位点。
“Fab片段”是指含有轻链的可变和恒定结构域以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(CH1)的抗体片段。“F(ab')2片段”包含通常在其羧基端附近由其之间的铰链半胱氨酸共价连接的Fab片段对。抗体片段的其它化学偶联也是所属领域已知的。
如本文所使用，“抗原结合臂”是指具有特异性结合目标靶分子的能力的抗体的组分。通常，抗原结合臂是免疫球蛋白多肽序列，例如HVR和/或免疫球蛋白轻链和重链的可变结构域序列的复合物。
“单链Fv”或“scFv”是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽还包含位于VH结构域与VL结构域之间的多肽连接子，所述多肽连接子使scFv能够形成所需抗原结合结构。
“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含连接到相同多肽链中的轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用太短以至于不允许在相同链上的两个结构域之间配对的连接子，结构域被迫使与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合位点。
“线性抗体”是指在Zapata等人,《蛋白质工程改造(Protein Eng)》,8(10):1057-1062(1995)中描述的抗体。简单来说，这些抗体包含重链片段(VH-CH1-VH-CH1)的串联重复，其与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。
“裸抗体”是指未与异源部分(例如，细胞毒部分)或放射性标记缀合的抗体。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的总非共价相互作用的强度。“结合亲和力”是指固有结合亲和力，其反映结合对成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其结合配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)表示。亲和力可以通过所属领域中已知的常见方法，包括本文所描述的那些方法来测量。用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施例描述如下。
“特异性结合(Binds specifically)”或“特异性结合(specific binding)”是指抗体以不超过约1×10-7M的亲和力值与抗原结合。
“亲和力成熟的”抗体是指与不具有此类改变的亲本抗体相比，在一个或多个HVR中具有一个或多个改变的抗体，此类改变造成抗体对抗原的亲和力的改善。
抗体的“功能性抗原结合位点”是能够结合靶抗原的位点。抗原结合位点的抗原结合亲和力不一定与衍生抗原结合位点的亲本抗体一样强，但结合抗原的能力必须使用已知用于评估抗体与抗原的结合的多种方法中的任一种测量。
“分离抗体”是指已经与其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施例中，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱法(例如，离子交换或反相HPLC)所测定，将抗体纯化到大于95％或99％的纯度。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见例如，Flatman等人,《色谱B分析物，生物测量技术生命科学(J.Chromatogr.BAnalyt.Technol Biomed Life Sci)》,848:79-87。
如本文所使用，“基本上相似”或“基本上相同”是指两个数值之间的足够高的相似度(例如，一个与测试抗体相关联而另一个与参考抗体相关联)，使得一个所属领域技术人员会认为在由所述值(例如，KD值)测量的生物学特征的背景下，两个值之间的差异具有极少或没有生物学和/或统计学意义。
如本文所使用，“基本上不同”是指两个数值之间的足够高的差异度(通常一个数值与一个分子相关联而另一个数值与参考分子相关联)，使得一个所属领域技术人员会认为在由所述值(例如，KD值)测量的生物学特征的背景下，两个值之间的差异具有统计学意义。
“效应子功能”是指归因于抗体的Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调(例如，B细胞受体)；和B细胞活化。
“免疫缀合物”是指与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。
“治疗(Treatment/treat/treating)”是指试图改变被治疗个体中病症的自然过程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理过程中进行。所期望的治疗效果可以包括但不限于预防病症发生或复发、缓解症状、减少病症的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低进展速率、改善或缓和疾病状态和缓解或改善预后。例如，治疗可以包括向受试者施用治疗有效量的包含抗IL1RAP抗体的医药调配物，以延迟由IL1RAP介导的疾病或病况的发展或缓慢进展。
“医药调配物”是指以允许活性成分的生物活性有效的形式的制剂，并且其不含有对施用调配物的受试者有毒的其它组分。
“药学上可接受的载剂”是指医药调配物中除活性成分以外的成分，所述成分对施用其的受试者无毒。药学上可接受的载剂包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
“治疗有效量”是指达到期望的治疗或预防结果，例如治疗或预防受试者中的疾病、病症或病况的活性成分或药剂(例如，医药调配物)的量。在IL1RAP介导的疾病或病况的情况下，治疗剂的治疗有效量是在某种程度上减少、预防、抑制和/或减轻与所述疾病、病症或病况相关的一种或多种症状的量。关于哮喘疗法，可以例如通过评估症状的持续时间、严重性和/或复发、应答率(RR)、应答持续时间和/或生活质量来测量体内的功效。
如本文所使用，“同时”是指两种或更多种治疗剂的施用，其中至少部分施用在时间上重叠。因此，同时施用包括当一种或多种药剂的施用在中止一种或多种其它药剂的施用之后继续时的给药方案。
“个体”或“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人类和非人类灵长类动物，如猴子)、兔子和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。
各种实施例的具体说明
I.IL-1家族的细胞因子
IL-1家族包含多种激动剂细胞因子，包括充当病原性介体和免疫性调节剂、细胞增殖和炎症的IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ。每个此类细胞因子与其各自的同源细胞膜受体的结合导致IL1RAP辅助受体的募集和触发胞内信号转导的信号复合物的形成。
例如，IL-1α充当激动剂细胞因子，通过与其同源受体IL1R1结合而引发胞内信号传导。在IL-1α与IL1R1结合后，募集辅助受体辅助蛋白IL1RAP并且使其参与形成包含IL-1α、IL1R1和IL1RAP的三元信号传导复合物。IL-1α刺激的信号转导导致靶细胞中核因子κB(NF-κB)转录因子路径和丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)路径的活化，并且触发病原性炎症、细胞增殖和免疫反应的级联。随后的信号传导级联导致与病原性炎症、细胞增殖和免疫反应相关的几种蛋白质的表达。参见例如Garlanda等人,《免疫》,39:1003-1018(2013)。
类似地，IL-1β充当激动剂细胞因子，通过与其同源受体IL1R1结合来引发胞内信号传导。当IL-1β与IL1R1结合后，募集并接合辅助受体IL1RAP，从而形成包含IL-1α、IL1R1和IL1RAP的三元信号传导复合物。IL-1β介导的信号转导导致靶细胞中NF-κB转录因子路径和丝裂原活化的蛋白激酶路径的活化，从而沉淀出信号传导级联，从而导致多种与病原性炎症、细胞增殖和免疫反应相关的蛋白质的表达。参见例如，Wang等人,《自然免疫学(Nature Immunol.)》,11(1):905-912(2010)；Saluja等人,《临床和转化性过敏反应(Clin.Transl.Allergy)》,5:33(2015)。
激动剂细胞因子IL-33通过与其同源受体ST2(也称为IL1RL1)结合来介导其功能性胞内信号传导作用，随后募集并接合辅助受体IL1RAP，形成包含IL-33、ST2和IL1RAP的三元信号传导复合物。IL-33介导的信号转导导致NF-κB转录因子路径和AP-1路径的活化，并且产生一系列免疫和炎性反应。参见例如Sebastian Gunther等人,《免疫》,47:510-523(2017)。信号传导级联导致表达与病原性炎症、细胞增殖和免疫反应相关的许多蛋白质。Shafaqat Ali等人,《美国国家科学院院刊(PNAS)》,104(47):18660-18665(2007)。
每个激动剂细胞因子IL-36α、IL-36β和IL-36γ通过结合到同源受体IL1RL2来诱导胞内信号传导。通过这些IL-36细胞因子中的任何一个与IL1RL2的结合都会引起辅助受体IL1RAP的募集和接合，导致形成包含IL1RL2、IL1RAP和引发信号传导事件的各个IL-36细胞因子的三元信号复合物。IL-36α、IL-36β或IL-36γ刺激的信号转导导致靶细胞中NK-κB转录因子和AP-1路径的活化，并且诱导各种炎性、增生性和病原性免疫反应。参见例如,Jennifer Towne等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》,279(14):13677-13688(2004)；Sebastian Gunther等人,《免疫学杂志》,193(2):921-930(2014)。
II.IL1RAP
IL1RAP是在某些细胞表面上表达的膜蛋白。人类IL1RAP(在此也称为“hu-IL1RAP”)的序列和注释可以通过GenBank登录号AAB84059.1或UniProt条目Q9NPH3找到。全长hu-IL1RAP前体蛋白的氨基酸序列在本文中阐述为SEQ ID NO:1。编码全长hu-IL1RAP的示例性1740核苷酸序列在本文中阐述为SEQ ID NO:2。
全长hu-IL1RAP的氨基酸序列以连续顺序包含信号肽、胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。信号序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-20。hu-IL1RAP的成熟形式包含SEQID NO:1的氨基酸21-570。hu-IL1RAP的胞外结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸21-367。hu-IL1RAP的胞外结构域还包含三个不同的结构域。结构域1(“D1”)包含SEQ ID NO:1的氨基酸21-133。结构域2(“D2”)包含SEQ ID NO:1的氨基酸134-237。结构域3(“D3”)包含SEQ IDNO:1的氨基酸238-367。hu-IL1RAP的跨膜结构域和胞质结构域分别包含SEQ ID NO:1的氨基酸368-388和氨基酸389-570。
对应于全长hu-IL1RAP蛋白部分的多肽构建体可用作以高结合亲和力引发抗IL1RAP抗体的抗原。如本文其它地方所公开的，这些抗IL1RAP抗体能够降低通过IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ中的一种或多种与其同源受体结合所引发的胞内信号。对应于可用作抗原的hu-IL1RAP蛋白部分的多肽构建体包括对应于hu-IL1RAP的胞外结构域和结构域D1、D2、D1+D2和D3的多肽。
下表1提供了本公开的hu-IL1RAP多肽构建体的序列和其序列标识符的概述。此外，提供了对应于小鼠和食蟹猴IL1RAP蛋白的缩写多肽构建体，因为它们可用于确定抗hu-IL1RAP抗体的交叉反应性。所述序列也包括在随附的序列表中。
表1：IL1RAP构建体序列
Figure BDA0003013363900000261
Figure BDA0003013363900000271
Figure BDA0003013363900000281
Figure BDA0003013363900000291
III.抗IL1RAP抗体
在一些实施例中，本公开提供在各种熟知的免疫球蛋白特征(例如，CDR、HVR、FR、VH和VL结构域)的氨基酸和编码核苷酸序列方面的抗-IL1RAP抗体的结构。下表2提供本公开的抗IL1RAP抗体序列和其序列标识符的概述。所述序列包括在随附的序列表中。
表2：抗IL1RAP抗体序列
Figure BDA0003013363900000292
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Figure BDA0003013363900000431
Figure BDA0003013363900000441
1.抗IL1RAP抗体的结合亲和力和细胞信号传导抑制。
在一些实施例中，本文提供的抗IL1RAP抗体具有<100nM、<10nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nM或<0.001nM的与人类IL1RAP结合的平衡解离常数(KD)(例如10-8M或更小、10-8M到10-13M，例如10-9M到10-13M)。更具体地，在一些实施例中，本公开的抗IL1RAP抗体以1×10-8M或更小、1×10-9M或更小、1×10-10M或更小或1×10-11M或更小的结合亲和力结合到人类IL1RAP。在一些实施例中，将结合亲和力测量为与SEQ ID NO:3的hu-M-IL1RAP多肽结合的平衡解离常数(KD)。通常，配体与其受体的结合亲和力可以使用多种分析方法中的任一种来测定，并且以在多种定量值表达。在本文的实例中公开了可用于确定抗体亲和力的特异性IL1RAP结合分析。此外，抗原结合分析是所属领域已知的，并且可以在本文中使用，包括但不限于使用如蛋白质印迹(western blots)、放射免疫分析、酶联免疫吸附分析(ELISA)、“夹层”免疫测定、表面等离子体共振分析(如在WO2005/012359中所描述的BIAcore分析)、免疫沉淀分析、荧光免疫分析和蛋白A免疫分析的技术的任何直接或竞争性结合分析。
因此，在一些实施例中，结合亲和力表达为KD值并且反映固有结合亲和力(例如，具有最小的亲合力作用)。本公开的抗IL1RAP抗体对hu-M-IL1RAP多肽(SEQ ID NO:3)表现出强结合亲和力，例如，表现出在10nM与1pM之间的KD值。
在一些实施例中，本文提供的抗IL1RAP抗体通过IL1RAP介导的路径(包括IL-1、IL-33和/或IL-36信号传导路径等)减少、抑制和/或完全阻断胞内信号传导，并且更具体来说，是通过以下激动剂的一种或多种的结合而刺激的信号传导路径：IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ。可以使用已知的基于细胞的阻断分析(包括本公开的实例中所描述的HEK-BLUETM报告细胞分析和基于初级细胞的阻断分析)在体外分析抗体抑制这些IL1RAP介导的信号传导路径的能力。在一些实施例中，使用基于报告细胞的阻断分析，用浓度为约EC50的激动剂IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ将抗体降低、抑制和/或完全阻断胞内信号传导的能力测定为抗体的IC50。激动剂EC50通常只能在分析之前估算，并且在分析完成后使用数据的非线性回归分析来确定。在此类分析中，约EC50的值通常将在EC40-45到EC55-60的范围内。
因此，在一些实施例中，本公开的IL1RAP抗体的特征在于以下一种或多种功能特性中的一种或多种，所述功能特性基于通过IL1RAP介导的路径降低、抑制和/或完全阻断胞内信号传导的能力。
在一些实施例中，抗IL1RAP抗体使IL-1刺激信号、IL-33刺激信号和/或IL-36刺激信号降低至少90％、至少95％、至少99％或100％。在一些实施例中，可以使用基于报告细胞的阻断分析(例如，HEK-BLUETM报告细胞分析)来测量信号的降低。普通技术人员之一可以选择已知用于确定抑制IL-1刺激、IL-33刺激和/或IL-36刺激路径中细胞信号传导的任何已知报告细胞分析。通常，本公开的抗IL1RAP抗体降低了由浓度为约EC50(例如，EC40到EC60)的激动剂与IC50值为10nM或更低、5nM或更低或1nM的抗体的结合而引发的IL1RAP介导的胞内信号传导。
在一些实施例中，抗IL1RAP抗体使IL-1刺激信号、IL-33刺激信号和IL-36刺激信号降低至少95％或至少99％；任选地，其中所述IL-1、IL-33和/或IL-36刺激信号由选自IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ的激动剂刺激；任选地，其中在激动剂浓度为约EC50时，抗体的IC50为10nM或更低、5nM或更低或1nM或更低。
在一些实施例中，抗IL1RAP抗体将由IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ激动剂中的一种或多种与其同源受体结合而引发的胞内信号降低至少90％、至少95％、至少99％或100％。在一些实施例中，抗IL1RAP抗体抑制IL-1α、IL-1β和/或IL-36β刺激的IL8从原代人肺成纤维细胞(PHLF)的释放；任选地，其中在约EC50的IL-1α、IL-1β和/或IL-36β浓度下，所述抗体的IC50为10nM或更低、5nM或更低或1nM或更低。在一些实施例中，抗IL1RAP抗体抑制IL-1β刺激的IL6从原代人单核细胞的释放；任选地，其中在约EC50的IL-1β浓度下，所述抗体的IC50为10nM或更低、5nM或更低或1nM或更低。在一些实施例中，抗IL1RAP抗体抑制IL-33刺激的INF-γ从人类自然杀伤(NK)细胞的释放；任选地，其中在约EC50的IL-33浓度下，所述抗体的IC50为10nM或更低、5nM或更低或1nM或更低。在一些实施例中，抗体抑制IL-36β刺激的IL8从人表皮角质形成细胞(HEKn)的释放；任选地，其中在约EC60的IL-36β浓度下，所述抗体的IC50为10nM或更低、5nM或更低或2nM或更低。在一些实施例中，抗体抑制嗜碱粒细胞中IL-33刺激的磷酸化；任选地，其中在约EC56的IL-33浓度下，所述抗体的IC50为75nM或更低、50nM或更低或45nM或更低。在一些实施例中，抗体抑制IL-33刺激的INF-γ从CD4+T细胞的释放；任选地，其中在约EC34的IL-33浓度下，所述抗体的IC50为75nM或更低、50nM或更低或45nM或更低。
2.抗体片段
在一些实施例中，本公开的抗IL1RAP抗体可以是抗体片段。适用于本公开的结合决定簇的抗体片段包括(但不限于)：Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、单价、一臂(或单臂)抗体、scFv片段和本文所描述的并且所属领域中已知的其它片段。关于各种抗体片段的综述，参见例如,Hudson等人,《自然·医学(Nat.Med.)》,9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如,Pluckthun,在《单克隆抗体的药理学中(The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies)》,第113卷,Rosenburg和Moore编,(纽约施普林格出版社),第269-315页(1994)；另见WO93/16185；和美国专利第5,571,894和5,587,458号。关于包含补救受体结合表位残基并且具有体内半衰期增加的Fab和F(ab')2片段的描述，参见美国专利第5,869,046号。其它单价抗体形式描述于例如WO2007/048037、WO2008/145137、WO2008/145138和WO2007/059782中。单价单臂抗体描述于例如WO2005/063816中。双抗体是具有两个可以是二价或双特异性的抗原结合位点的抗体片段(参见例如，EP0404097；WO93/01161；Hudson等人,《自然·医学》,9:129-134(2003)；和Holliger等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,90:6444-6448(1993))。
在一些实施例中，抗体片段是单结构域抗体，其包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域。在一些实施例中，单结构域抗体是人类单结构域抗体(多曼蒂斯公司(Domantis，Inc.),马萨诸塞州沃尔瑟姆；参见例如，美国专利第6,248,516号)。
抗体片段可以由各种技术制备，包括(但不限于)完整抗体的蛋白水解消化，以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所描述。
预期可以使用所属领域已知的和/或本文所描述的方法和技术将本公开的任何抗IL1RAP抗体制备为抗体片段。例如，在实例8中描述了本公开的各种抗IL1RAP抗体的Fab形式的制备和分析。
3.嵌合和人源化抗体
在一些实施例中，本公开的抗IL1RAP抗体可以是嵌合抗体。(参见例如，如美国专利第4,816,567号；和Morrison等人,《美国国家科学院院刊》,81:6851-6855(1984)中所描述的嵌合抗体)。在一个实施例中，嵌合抗体包含非人类可变区(例如，来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人类灵长类(如猴子)的可变区)和人类恒定区。在一些实施例中，嵌合抗体是其中类别或子类别已经从亲本抗体的类别或子类别改变的“类别转换”抗体。预期嵌合抗体可以包括其抗原结合片段。
在一些实施例中，本公开的抗IL1RAP抗体是人源化抗体。通常，将非人类抗体人源化，以减少对人类的免疫原性，同时保留亲本非人类抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含其中HVR，例如CDR(或其部分)来源于非人类抗体的一个或多个可变结构域，并且FR(或其部分)来源于人类抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人类恒定区的至少一部分。在一些实施例中，在人源化抗体中的一些FR残基被来自非人类抗体(例如CDR残基来源于其的抗体)的对应残基取代，以恢复或改进抗体特异性或亲和力。
人源化抗体和其制备方法评述于例如Almagro和Fransson,《前沿生物科学(Front.Biosci)》,13:1619-1633(2008)，并且还描述于例如Riechmann等人,《自然》,332:323-327(1988)；Queen等人,《美国国家科学院院刊》,86:10029-10033(1989)；美国专利第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号和第7,087,409号；Kashmiri等人,《方法(Methods)》,36:25-34(2005)(描述SDR(a-HVR)接枝)；Padlan,《分子免疫学(Mol.Immunol)》,28:489-498(1991)(描述“表面重建”)；Dall'Acqua等人,《方法》,36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等人,《方法》,36:61-68(2005)和Klimka等人,《英国癌症杂志(Br.J.Cancer)》,83:252-260(2000)(描述FR重组的“引导选择”方法)。
对人源化有用的人类构架区包括(但不限于)：使用“最佳匹配”方法选择的构架区(参见例如,Sims等人,《免疫学杂志》,151:2296(1993))；来源于轻链或重链可变区的特定亚组的人类抗体的共有序列的构架区(参见例如,Carter等人,《美国国家科学院院刊》,89:4285(1992)；和Presta等人,《免疫学杂志》,151:2623(1993))；人类成熟的(体细胞突变的)构架区或人种系构架区(参见例如,Almagro和Fransson,《前沿生物科学》,13:1619-1633(2008))；和来源于筛选FR库的构架区(参见例如,Baca等人,《生物化学杂志》272:10678-10684(1997)和Rosok等人,《生物化学杂志》,271:22611-22618)(1996))。
预期可以使用所属领域已知的和/或本文所描述的方法和技术将本公开的任何抗IL1RAP抗体制备为人源化抗体。例如，在实例5-7中描述了本公开的抗IL1RAP抗体的人源化形式的制备和分析。
4.人类抗体
在一些实施例中，本公开的抗IL1RAP抗体可以是人类抗体。人类抗体可以使用所属领域中已知的各种技术产生。人类抗体通常描述于van Dijk和van de Winkel,《化学生物学当代观点(Curr.Opin.Chem.Biol.)》,5:368-74(2001)和Lonberg,《免疫学当代观点(Curr.Opin.Immunol.)》,20:450-459(2008)。人类抗体可通过将免疫原施用到转基因动物来制备，所述转基因动物已经被修饰以产生完整人类抗体或具有响应抗原攻击的人类可变区的完整抗体。此类动物通常含有全部或一部分的人类免疫球蛋白基因座，其替换内源性免疫球蛋白基因座，或其存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已失活。关于从转基因动物中获得人类抗体的方法的综述，参见Lonberg,《自然·生物技术(Nat.Biotech.)》23:1117-1125(2005)。还参见例如,美国专利第6,075,181和6,150,584中的XENOMOUSETM技术；美国专利第5,770,429号中的
Figure BDA0003013363900000481
技术；美国专利第7,041,870号中的K-M
Figure BDA0003013363900000482
技术；和美国专利申请公开案第US 2007/0061900号中的
Figure BDA0003013363900000483
技术。来自此类动物产生的完整抗体的人类可变区可被进一步修饰，例如，通过与不同的人类恒定区组合。
人类抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于产生人类单克隆抗体的人类骨髓瘤和小鼠-人类异源骨髓瘤细胞系。参见例如,Kozbor,《免疫学杂志》,133:3001(1984)；Brodeur等人,单克隆抗体生产技术和应用,第51-63页(纽约马塞尔德克公司(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等人,《免疫学杂志》,147:86(1991)。经由人类B细胞杂交瘤技术产生的人类抗体还描述于Li等人,《美国国家科学院院刊》,103:3557-3562(2006)。描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人类IgM抗体的其它方法包括例如在美国专利第7,189,826中描述的那些。人类杂交瘤技术(即，三体瘤技术)描述于例如Vollmers等人,《组织学和组织病理学(Histology and Histopathology)》,20(3):927-937(2005)和Vollmers等人,《实验和临床药理学中的方法和发现(Methods and Findings inExperimental and Clinical Pharmacology)》,27(3):185-91(2005)。
人类抗体可能也可通过分离选自人源噬菌体展示库的Fv克隆可变结构域序列来产生。然后可将此类可变结构域序列与所需人类恒定结构域组合。从抗体库中选择人类抗体的技术描述如下。
预期可以使用所属领域已知的和/或本文所描述的方法和技术将本公开的任何抗IL1RAP抗体制备为人类抗体。
5.库来源的抗体
在一些实施例中，本公开的抗IL1RAP抗体可通过筛选组合库中具有所需活性的抗体来分离。例如，所属领域中已知多种方法用于产生噬菌体展示库和针对具有期望结合特征的抗体筛选此类库。在本文所公开的实例中描述了噬菌体展示在制备本公开的人源化形式的抗IL1RAP抗体的亲和力成熟的变异体中的用途。产生此类库来源的抗体的其它方法可以发现于例如,Hoogenboom等人,《分子生物学中的方法(Methods in MolecularBiology)》,178:1-37(O'Brien等人编,《抗体噬菌体展示(Antibody Phage Display)》,新泽西州特图瓦市胡马纳出版社,2001)；McCafferty等人,《自然》,348:552-554；Clackson等人,《自然》,352:624-628(1991)；Marks等人,《分子生物学杂志》,222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》,248:161-175(Lo,编,《抗体工程改造(Antibody Engineering)》,新泽西州特图瓦市胡马纳出版社,2003)；Sidhu等人,《分子生物学杂志》,338(2):299-310(2004)；Lee等人,《分子生物学杂志》,340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,《美国国家科学院院刊》,101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,《免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)》,284(1-2):119-132(2004)。
预期可以使用所属领域已知的和/或本文所描述的方法和技术将组合库筛选用于产生本公开的抗IL1RAP抗体的变异体。例如，在实例8中描述了使用噬菌体展示库产生和筛选来制备本公开的人源化抗IL1RAP抗体的广泛范围的亲和力成熟的变异体。
6.多特异性抗体
在一些实施例中，本公开的抗IL1RAP抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。在一些实施例中，多特异性抗体是具有至少两个不同的结合位点的单克隆抗体，每个结合位点具有对不同抗原的结合特异性，其中至少一个特异性结合IL1RAP。在一些实施例中，至少一个结合位点特异性结合细胞毒性剂。在示例性实施例中，本公开的抗IL1RAP抗体是双特异性抗体，并且可以用于将细胞毒性剂定位到表达IL1RAP的细胞。
用于制备多特异性抗体的技术包括(但不限于)两个具有不同特异性的免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见例如,Milstein和Cuello,《自然》,305:537(1983),WO93/08829,和Traunecker等人,《欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)》,10:3655(1991))。也可以使用“Knob-in-hole”工程改造(参见例如，美国专利第5,731,168号)。
多特异性抗体还可以通过工程改造“静电转向”效应来制备，所述效应有利于形成Fc-异二聚体抗体分子而不是同二聚体(WO 2009/089004A1)；交联两种或更多种抗体或片段(参见例如,美国专利第4,676,980号和Brennan等人,《科学(Science)》,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链生产双特异性抗体(参见例如,Kostelny等人,《免疫学杂志》,148(5):1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术制备双特异性抗体片段(参见例如,Holliger等人,《美国国家科学院院刊》,90:6444-6448(1993))；使用单链Fv(scFv)二聚体(参见例如,Gruber等人,《免疫学杂志》,152:5368(1994))；或三特异性抗体(参见例如，Tutt等人,《免疫学杂志》,147:60(1991)。
预期可以使用所属领域已知的和/或本文所描述的方法和技术将本公开的任何抗IL1RAP抗体制备为多特异性抗体。
7.抗体变异体
在一些实施例中，还考虑了本公开的抗IL1RAP抗体的变异体。例如，具有改进的结合亲和力和/或抗体的其它生物学特性的抗体可通过将适当的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合，以得到最终的构建体，条件是最终的构建体具有IL1RAP抗原结合的所需特征。预期可以使用所属领域已知的和/或本文所描述的方法和技术制备本公开的抗IL1RAP抗体的广泛范围的变异体，所述方法和技术包括(但不限于)：(i)氨基酸取代、插入和/或缺失变异体；(ii)糖基化变异体；(iii)Fc区变异体；(iv)半胱氨酸工程改造的变异体；和(v)衍生变异体。本公开的实例5-9、表2和序列表提供了杂交瘤衍生的11C5(Hy)抗IL1RAP抗体和其人源化形式h11C5的大量示例性变异体。示例性变异体包含以下中的一种或多种：CDR-H2中的氨基酸取代以消除半胱氨酸缺陷(例如，C59Y)；赋予无效应子功能的Fc区变异体(例如，N297G)；和在CDR和可变结构域区中增加抗原亲和力和/或基于细胞的阻断活性的一系列单、双、三氨基酸取代(例如SEQ ID NO:12-35、38-61、64-76、79-120、123-139、142-201、204-225、228-239、259-278和280-310)。
A.取代、插入和缺失变异体
在一些实施例中，提供了除本文所描述的那些之外还具有一个或多个氨基酸取代的抗IL1RAP抗体变异体。诱变位点可以包括HVR和FR。典型的“保守”氨基酸取代和/或基于共同侧链类别或特性的取代在所属领域中是众所周知的，并且可以用于本公开的实施例中。本公开还考虑了基于非保守氨基酸取代的变异体，其中氨基酸侧链类别之一的成员与另一类别的氨基酸交换。
氨基酸侧链通常根据以下类别或共同性质进行分组：(1)疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile、正亮氨酸；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)链定向影响：Gly、Pro；和(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
用于将氨基酸替换成抗体并且随后筛选所需功能的技术(例如，保留/改进的抗原结合、降低的免疫原性或改进的ADCC或CDC)是所属领域众所周知的。
氨基酸取代变异体可以包括取代亲本抗体(例如，人源化或人类抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变异体的某些生物特性(例如亲和力增加、免疫原性降低)相对于亲本抗体将具有修饰，和/或将具有亲本抗体的基本上保留的某些生物特性。示例性取代变异体是亲和力成熟的抗体，所述抗体可方便地例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(如本文实例中所描述的那些技术)产生。简单来说，使一个或多个HVR残基突变并且将变异体抗体展示在噬菌体上，并且针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。
鉴别可能靶向诱变的抗体的残基或区的有用方法是“丙氨酸扫描诱变”(参见例如Cunningham和Wells(1989)《科学》,244：1081-1085)。在此方法中，鉴别靶残基的残基或基团(例如带电残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并且被中性或带负电氨基酸(例如Ala或聚丙氨酸)置换，以确定抗体与抗原的相互作用是否受影响。可在表明对初始取代的功能灵敏性的氨基酸位置处引入其它取代。或者或另外，可以确定用于鉴别抗体与抗原之间的接触点的抗原-抗体复合物的晶体结构。此类接触残基和邻接残基可作为取代的候选物靶向或除去。可筛选变异体，以确定其是否含有所需特性。
氨基酸序列插入包括从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的长度范围内的氨基和/或羧基端融合，以及序列内部插入单个或多个氨基酸残基。末端插入的实例包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入型变异体包括延长抗体的血清半衰期的酶或多肽与抗体的N端或C端的融合。
取代可以在HVR中制成以提高抗体亲和力。此类改变可在由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的“热点”残基(参见例如,Chowdhury,《分子生物学方法(Methods Mol.,Biol.)》207:179-196(2008))中进行，其中测试所得变异体VH或VL的结合亲和力。在一个实施例中，亲和力成熟可以通过从二级库构造和重新选择来进行(参见例如,在Hoogenboom等人,《分子生物学方法》,178:1-37(O'Brien等人编,《抗体噬菌体展示》,新泽西州特图瓦市胡马纳出版社,(2001)。)引入多样性的另一方法涉及HVR引导的方法，其中将几个HVR残基(例如一次4-6个残基)随机化。可例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性地鉴别涉及抗原结合的HVR残基。尤其通常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在一些实施例中，取代、插入或缺失可能发生在一或多个HVR内，只要此类改变基本上不会降低抗体结合抗原的能力。例如，可在HVR中进行基本上不会降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文所提供的保守取代)。此类改变可在HVR“热点”之外。在以上提供的变异体VH和VL序列的一些实施例中，每个HVR要么保持不变，要么含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
B.糖基化变异体
在一些实施例中，改变本公开的抗IL1RAP抗体以增加或降低抗体糖基化的程度。将糖基化位点添加或缺失到抗体可以通过改变氨基酸序列以使得产生或移除一个或多个糖基化位点来进行。
在抗体包含Fc区的实施例中，连接到Fc区的碳水化合物可以改变。通常，由哺乳动物细胞产生的天然抗体包含通过N键连接到Fc区的CH2结构域的Asn297的分支的双触角寡糖(参见例如,Wright等人,《生物技术的发展趋势(TIBTECH)》,15:26-32(1997))。寡糖可包括各种碳水化合物，如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及连接到双触角寡糖结构的“茎”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施例中，抗体的Fc区的寡糖的修饰可以产生具有某些改进的特性的变异体。
在一些实施例中，本公开的抗IL1RAP抗体可以是亲本抗体的变异体，其中所述变异体包含缺乏(直接或间接地)连接到Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖的量可为约1％至约80％、约1％至约65％、约5％至约65％或约20％至约40％。相对于通过MALDI-TOF质谱法测量的与Asn 297连接的所有糖结构(例如，复杂、杂合和高甘露糖结构)的总和，岩藻糖的量可以通过计算Asn297的糖链中岩藻糖的平均含量来确定(参见例如WO 2008/077546)。Asn297是指位于约Fc区中约297处(Fe区残基的EU编号)的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297还可位于297的上游或下游约±3个氨基酸处，即，在294与300处之间。
在一些实施例中，岩藻糖基化变异体可以具有改进的ADCC功能。参见例如美国专利公开案第US 2003/0157108或US 2004/0093621号。“去岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体的实例以及用于制备它们的相关方法公开于例如US2003/0157108；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2000/61739；WO2001/29246；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人,《分子生物学杂志》,336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人,《生物技术与生物工程改造(Biotech.Bioeng)》,87:614(2004)。
可用于产生去岩藻糖基化抗体的细胞系包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Led 3 CHO细胞(参见例如Ripka等人,《生物化学与生物物理快报(Arch.Biochem.Biophys)》,249:533-545(1986)；(例如,US2003/0157108和WO2004/056312)和敲除细胞系，如α-1、6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8、敲除CHO细胞(参见例如,Yamane-Ohnuki等人,《生物技术与生物工程改造(Biotech.Bioeng)》,87:614(2004)；Kanda,Y.等人,《生物技术与生物工程改造》,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
C.Fc区变异体
在一些实施例中，本公开的抗IL1RAP抗体可以包含Fc区(即，Fc区变异体)中的一个或多个氨基酸修饰。Fc区变异体可包含在一个或多个氨基酸残基位置处包含氨基酸取代的人类Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。下文描述了可与本公开的抗IL1RAP抗体一起使用的所属领域已知的广泛范围的Fc区变异体。
在一些实施例中，抗IL1RAP抗体是具有改变的效应子功能的Fc区变异体。在一些实施例中，具有改变的效应子功能的抗体具有亲本抗体的一些(但不是全部)效应子功能、降低的效应子功能或无效应子功能(例如，无效应子)。无效应子Fc区变异体对于其中效应子功能(例如ADCC)是不必要的或有害的和/或抗体的体内半衰期是重要的某些应用是更合乎需要的。
具有降低的效应子功能或无效应子的Fc区变异体抗体可以包括在以下Fc区一个或多个位置处的氨基酸取代：238、265、269、270、297、327和329。(参见例如,美国专利第6,737,056号)。此类Fc区变异体可以在位置265、269、270、297和327处的两个或更多个处包括氨基酸取代。此类Fc区变异体还可以包括将残基265和297替换为丙氨酸(参见例如美国专利第7,332,581号)。如实例和本文其它地方所公开的，在一些实施例中，本公开的抗IL1RAP抗体是无效应子的Fc区变异体。在一些实施例中，抗IL1RAP抗体的无效应子Fc区变异体包含氨基酸取代N297G。
具有改进的或减少的与FcR结合的Fc区变异体公开于例如美国专利第6,737,056号；WO 2004/056312；和Shields等人,《生物化学杂志》,276(9):6591-6604(2001)。具有改进的ADCC的Fc区变异体可以在例如Fc区的位置298、333和/或334处(基于EU编号)包含一个或多个氨基酸取代。Fc区变异体具有改变的(即，改进的或减少的)Clq结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，如例如美国专利第6,194,551、WO99/51642和Idusogie等人,《免疫学杂志》164:4178-4184(2000)中所描述的。在例如US2005/0014934A1(Hinton等人)中公开了具有延长的半衰期和改进的与新生Fc受体(FcRn)的结合的Fc区变异体。此类Fc区变异体在以下一个或多个位置处包含氨基酸取代：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380，382、413、424和434。具有延长的半衰期的其它Fc区变异体包括描述于例如US 7658921B2(Dall'Acqua等人)中的位置252、254和256(即，M252Y/S254T/T256E)处的YTE突变组。如实例和本文其它地方所公开，在一些实施例中，本公开的抗IL1RAP抗体是包括YTE突变组的Fc区变异体。Fc区变异体的其它实例可以在例如美国专利第5,648,260号和5,624,821；和WO94/29351中找到。
如本文其它地方所提到，天然存在的抗体的Fc区通常在位置447(Lys447)处包括C端赖氨酸。然而，由于酶促裂解(例如，在CHO细胞中产生)，所以在细胞培养中的重组抗体产生期间，C端赖氨酸经常从Fc区中裂解。因此，希望本文所描述的包含具有C端赖氨酸的Fc区的任何抗IL1RAP抗体也包括除不具有C端赖氨酸之外的包含Fc区的相同的抗IL1RAP抗体。类似地，希望本文所描述的包含不具有C端赖氨酸的Fc区的任何抗IL1RAP抗体也包括除具有C端赖氨酸之外的包含Fc区的相同的抗IL1RAP抗体。
通常，可以进行体外和/或体内细胞毒性分析，以证实Fc区变异体中CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合分析，以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞、NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。评估目标分子的ADCC活性的体外分析的非限制性实例描述于美国专利第5,500,362号(参见例如Hellstrom等人,《美国国家科学院院刊》,83:7059-7063(1986))和Hellstrom等人,《美国国家科学院院刊》,82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》,166:1351-1361(1987))。或者，可采用非放射性分析方法(参见例如,用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性分析(加利福尼亚州山景城的细胞科技公司；和
Figure BDA0003013363900000541
非放射性细胞毒性分析(美国威斯康星州麦迪逊市的普洛麦格公司)。用于此类分析的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者或另外，目标分子的ADCC活性可以在体内，例如在如Clynes等人,《美国国家科学院院刊》,95:652-656(1998)中所公开的动物模型中。还可进行C1q结合分析，以证实抗体不能够结合Clq并且因此缺乏CDC活性。参见例如WO2006/029879和WO2005/100402中结合ELISA的C1q和C3c。为了评估补体活化后，可进行CDC分析(参见例如Gazzano-Santoro等人,《免疫学方法杂志》,202:163(1997),Cragg,M.S.等人,《血液(Blood)》101,1045-1052(2003)；和Cragg,M.S.和M.J.Glennie,《血液》,103:2738-2743(2004))。可以使用所属领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期确定(参见例如,Petkova等人,《国际免疫学(Intl.Immunol.)》,18(12):1759-1769(2006))。
预期可以使用所属领域已知的和/或本文所描述的方法和技术制备本公开的抗IL1RAP抗体的广泛范围的Fc区变异体。例如，如实例9中所描述，用N297G氨基酸取代制备的Fc区变异体赋予抗IL1RAP抗体无效应子功能并保留基于细胞的阻断活性。
D.半胱氨酸工程改造的变异体
在一些实施例中，预期本文所描述的抗IL1RAP抗体可以在特定的非CDR位置处被半胱氨酸残基取代，从而产生反应性硫醇基团。如本文其它地方所描述，此类工程改造的“thioMAb”可以用于将抗体缀合到例如药物部分或接头-药物部分，从而产生免疫缀合物。半胱氨酸工程改造的抗体可以如例如美国专利第7,521,541号中所描述产生。在一些实施例中，以下抗体残基中的任一个或多个可以由半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。
E.衍生变异体
在一些实施例中，本公开的抗IL1RAP抗体可用非蛋白质部分进一步修饰(即，衍生化)。适用于抗体衍生的非蛋白质部分包括(但不限于)水溶性聚合物，如：聚乙二醇(PEG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸均聚物或无规共聚物和葡聚糖或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇和其混合物。在一些实施例中，抗体的修饰可以使用甲氧基-聚乙二醇丙醛进行。聚合物可具有任何分子量，并且可以是分支链或非分支链的。与抗体连接的聚合物的数量可变化，并且如果连接超过一个聚合物，它们可以是相同或不同的分子。通常来说，用于衍生作用的聚合物的数目和/或类型可以基于包括(但不限于)以下的考虑因素确定：抗体的具体特性或功能，例如抗体衍生物是否将用于限定条件下的疗法等。
8.免疫缀合物
在一些实施例中，本公开的抗IL1RAP抗体也可以是免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含缀合到一种或多种细胞毒性剂的抗IL1RAP抗体。本公开考虑的合适的细胞毒性剂包括化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素、细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素。
在一些实施例中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中如本文所描述的抗IL1RAP抗体与一种或多种药物缀合。
在一些实施例中，本公开的免疫缀合物包含如本文所描述的抗IL1RAP抗体，其与药物或治疗剂缀合以用于治疗IL-1、IL-33、IL-36和/或IL1RAP介导的疾病或病况。
在一些实施例中，本文所描述的抗IL1RAP抗体可以与酶活性毒素或其片段缀合，所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白(Aleurites fordii proteins)、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(Phytolaca americana proteins)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥阜草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒蛋白、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯。
在一些实施例中，本公开的免疫缀合物包含如本文所描述的缀合到放射性同位素的抗IL1RAP抗体(即，放射性缀合物)。多种放射性同位素可用于生产此类放射性缀合物。实例包括211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212Pb和Lu的放射性同位素。在一些实施例中，免疫缀合物可包含用于闪烁显像检测的放射性同位素，或用于NMR检测或MRI的自旋标记。合适的放射性同位素或自旋标记可以包括如123I、131I、111In、13C、19F、15N、17O、Gd、Mn和Fe的各种同位素。
抗IL1RAP抗体和细胞毒性剂的免疫缀合物可以使用适合于与蛋白质缀合的多种众所周知的双功能试剂和化学物质。此类试剂包括但不限于：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(例如己二酸二甲酯HQ)、活性酯(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮基化合物(例如双-(对叠氮基苯甲酰基)-己二胺)、双-重氮衍生物(例如，双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯-2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。
用于制备本公开的免疫缀合物的试剂还可包括可商购的“交联”试剂如：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB，和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)(参见例如,美国伊利诺伊州罗克福德的皮尔斯生物技术有限公司)。
9.合成抗体
在一些实施例中，本公开的抗IL1RAP抗体可以是合成抗体，其包含接枝到移植到除免疫球蛋白骨架或架构(如替代蛋白骨架或人工聚合物骨架)之外的来自抗IL1RAP免疫球蛋白的一组CDR(例如CDR-L1等)。
预期用于制备本公开的合成抗体的示例性替代蛋白骨架可以包括但不限于：纤连蛋白、新抑癌蛋白CBM4-2、脂蛋白、T细胞受体、蛋白A结构域(蛋白Z)、Im9、TPR蛋白、锌指结构域、pVIII、鸟胰多肽、GCN4、WW结构域Src同源结构域3、PDZ结构域、TEM-1β-内酰胺酶、硫氧还蛋白、葡萄球菌核酸酶、PHD-fmger结构域、CL-2、BPTI、APPI、HPSTI、ecotin、LACI-D1、LDTI、MTI-II、蝎毒素、昆虫防御素A肽、EETI-II、Min-23、CBD、PBP、细胞色素b-562、Ldl受体结构域、γ-晶体蛋白、泛素、转铁蛋白和/或C型凝集素样结构域。
可用于合成抗体的示例性人工聚合物(非蛋白质)骨架描述于例如《治疗性抗体手册(Handbook of Therapeutic Antibodies)》(S.Dübel和J.M.Reichert编)中的Fiedler等人(2014)“作为替代治疗剂的非抗体骨架(Non-Antibody Scaffolds as AlternativeTherapeutic Agents)”,威立-德国化学学会出版社公司(Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.)；Gebauer等人,《化学生物学当代观点》,13:245-255(2009)；Binz等人,《自然·生物技术》,23(10):1257-1268(2005)。
IV.重组方法和组合物
可以使用抗体生产领域中众所周知的重组方法和材料来生产本公开的抗IL1RAP抗体。在一些实施例中，本公开提供编码抗IL1RAP抗体的分离的核酸。核酸可以编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在一些实施例中，提供一种或多种包含编码本公开的抗IL1RAP抗体的核酸序列的载体(例如表达载体)。在一些实施例中，提供包含编码本公开的抗IL1RAP抗体的核酸序列的宿主细胞。在一个实施例中，宿主细胞已经用包含核酸的载体转化，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列。在另一个实施例中，宿主细胞已经用第一载体和第二载体转化，所述第一载体包含核酸，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列，所述第二载体包含核酸，所述核酸编码包含抗体的VH的氨基酸序列。
在一些重组方法的实施例中，所使用的宿主细胞是真核细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20)。在一个实施例中，提供一种制备抗IL1RAP抗体的方法，其中所述方法包含在适用于表达抗体的条件下培养包含编码如上文所提供的抗体的核酸的宿主细胞，并且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
简单来说，通过分离编码抗体的核酸(例如，如本文所描述)并且将此核酸插入一种或多种载体中以进一步在宿主细胞中克隆和/或表达，来进行抗IL1RAP抗体的重组生产。此类核酸使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合到编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)轻易地分离和测序。用于克隆或表达编码抗体的载体的合适的宿主细胞和培养方法是所属领域众所周知的，并且包括原核或真核细胞。通常，在表达之后，抗体可以可溶部分从细胞糊中分离，并且进一步纯化。除原核生物之外，真核微生物(如丝状真菌或酵母菌)也是合适的抗体编码载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化路径已被“人源化”的真菌和酵母菌株，从而产生具有部分或完全人类糖基化型态的抗体(参见例如,Gerngross,《自然·生物技术》,22:1409-1414(2004)，和Li等人,《自然·生物技术》,24:210-215(2006))。
用于表达本公开的糖基化抗IL1RAP抗体的合适的宿主细胞也可以来源于多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴别出许多杆状病毒菌株，其可与昆虫细胞结合使用，确切地说，用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。植物细胞培养物也可以用作宿主(参见例如,美国专利第5,959,177号、第6,040,498号、第6,420,548号和第7,125,978号。
可用于产生本公开的抗IL1RAP抗体的哺乳动物宿主细胞系的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(参见例如,Urlaub等人,《美国国家科学院院刊》,77:4216(1980))；骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0；由SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系；人胚肾细胞系(如例如在Graham等人,《普通病毒学杂志(J.Gen Virol.)》,36:59(1977)中所描述的293或293细胞)；幼地鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利氏细胞(mouse Sertoli cells)(例如在Mather,《生殖生物学(Biol.Reprod.)》,23:243-251(1980)中所描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562)；TRI细胞(参见例如Mather等人,《纽约科学院年鉴(Annals NY.Acad.Sci.)》,383:44-68(1982))；MRC 5细胞；和FS4细胞。关于适用于抗体产生的有用哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu,《分子生物学方法》,第248卷(B.K.C.Lo,编,《抗体工程改造》,新泽西州特图瓦市的胡马纳出版社),第255-268页(2003)。
V.抗IL1RAP抗体的药物组合物和调配物
本公开还提供包含抗IL1RAP抗体的药物组合物和医药调配物。在一些实施例中，本公开提供医药调配物，其包含如本文所描述的抗IL1RAP抗体和药学上可接受的载剂。此类医药调配物可以通过将具有所需纯度的抗IL1RAP抗体与一种或多种药学上可接受的载剂混合来制备。通常，此类抗体调配物可以制备成水溶液(参见例如美国专利第6,171,586号和WO2006/044908)或冻干调配物(参见例如美国专利第6,267,958号)。
还预期包含如本文所公开的抗IL1RAP抗体的组合物和调配物还可含有除抗IL1RAP之外的其它活性成分(即，治疗剂)，其对于在施用调配物的受试者中治疗的特定适应症是有用的。优选地，任何额外治疗剂具有与抗IL1RAP抗体活性互补的活性，并且所述活性不会彼此不利地影响。因此，在一些实施例中，本公开提供药物组合物，其包含如本文所公开的抗IL1RAP抗体和药学上可接受的载剂，并且还包含用于治疗IL-1、IL-33、IL-36和/或IL1RAP介导的疾病或状况的治疗剂。在一些实施例中，例如其中疾病适应症是癌症，药剂是适合于特定癌症的化学治疗剂。在一些实施例中，组合物中的另一种治疗剂是IL-1、IL-33、IL-36信号传导路径的拮抗剂。
药学上可接受的载剂在所采用的剂量和浓度下通常对受体无毒。广泛范围的此类药学上可接受的载剂在所属领域中是众所周知的(参见例如《雷明顿药物科学第16版(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition)》,Osol,A.编)(1980))。用于本公开的调配物的示例性药学上可接受的载剂可以包括但不限于：缓冲剂(如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸)；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六羟季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯(如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；亲水聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂(如EDTA)；糖(如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇)；成盐抗衡离子(如钠)；金属复合物(例如锌蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂(如聚乙二醇(PEG))。
用于本公开的调配物中的药学上可接受的载剂还可以包括间质药物分散剂，如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)(参见例如美国专利公开案第2005/0260186和2006/0104968)，如人类可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白(例如rHuPH20或
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百特国际有限公司(Baxter International,Inc.)。
额外治疗剂和活性成分可截留于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。此类技术公开于《雷明顿的药物科学第16版》,Osol,A.编(1980)。
在一些实施例中，调配物可以是抗体和/或其它活性成分的缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半渗透基质，所述基质是成形制品，例如膜或微胶囊形式。
通常，待施用至受试者的本公开的调配物是无菌的。可使用众所周知的技术轻易地制备无菌调配物，例如通过无菌滤膜过滤。
IV.治疗的用途和方法
预期包含本公开的抗IL1RAP抗体的任何组合物或调配物可以用于任何方法或用途，如在治疗方法中，利用它们特异性结合到IL1RAP和/或阻断IL1RAP活性的能力，特别是通过IL-1家族细胞因子，IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ阻断IL1RAP以介导胞内信号传导的能力。IL1RAP介导的胞内信号传导路径包括IL-1、IL-33和IL-36路径，并且更具体而言，包括至少由细胞因子激动剂IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ刺激的信号传导路径。可以使用已知的基于细胞的阻断分析(包括本公开的实例中所描述的HEK-BLUETM报告细胞分析和基于初级细胞的阻断分析)在体外分析IL1RAP介导的信号传导路径的抑制。
IL1RAP介导的疾病可以包括与IL-1家族的细胞因子的体液或组织中水平升高相关的任何疾病或病况，对于所述细胞因子，IL1RAP在介导信号传导中充当辅助受体：IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、和/或IL-36γ。IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ的升高的水平可以包括例如超过特定细胞或组织中正常水平的水平，或通常是不表达这些细胞因子的细胞或组织中任何可检测的水平。通常，IL1RAP介导的病况或疾病表现出以下特征：(1)通过施用IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ，和/或通过上调IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ的表达，可以在动物中通过实验诱导与病况或疾病相关的病理；(2)可以通过已知抑制IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ的作用的药剂抑制与实验动物模型中产生的病况或疾病相关的病理。
已知IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ是促炎性细胞因子，然而，已知如由IL1RAP作为辅助受体介导的这些细胞因子刺激的IL-1、IL-33和/或IL-36信号传导路径的功能异常与广泛范围的疾病和病况(通常包括但不限于炎性疾病、自身免疫性疾病、呼吸系统疾病、代谢障碍、感染和癌症)相关。。
例如，与IL-33信号传导功能异常相关的广泛范围的病况和疾病，并且因此也由IL1RAP的辅助受体活性介导，包括但不限于：介导的疾病可能是炎性病况(例如哮喘、气道高反应性、气道炎症、败血症、败血性休克、特应性皮炎、过敏性鼻炎、类风湿性关节炎或慢性阻塞性肺病(COPD))；免疫病症(例如哮喘、类风湿性关节炎、过敏、特应性过敏、过敏反应、过敏性休克、过敏性鼻炎、牛皮癣、炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病、糖尿病或肝病)；纤维化病症(例如，特发性肺纤维化(IPF))；嗜酸性粒细胞紊乱(例如，嗜酸性粒细胞相关的胃肠道病症，如嗜酸性粒细胞性食管炎)；感染(例如，蠕虫、原生动物(如硕大利什曼原虫)或病毒感染(如RSV或流感))；疼痛(例如炎性疼痛)；中枢神经系统病症(例如阿尔茨海默氏病)；实体肿瘤(例如，乳腺肿瘤、结肠肿瘤、前列腺肿瘤、肺肿瘤、肾肿瘤、肝肿瘤、胰腺肿瘤、胃肿瘤、肠肿瘤、脑肿瘤、骨肿瘤或皮肤肿瘤)；或眼科病症。IL-33介导的特定眼科病症包括但不限于：年龄相关性黄斑变性(AMD)，包括湿性AMD、干性AMD、中度AMD、晚期AMD和地图状萎缩(GA)、视网膜病变(例如糖尿病性视网膜病变(DR)、早产儿视网膜病变(ROP)和高海拔DR)、息肉样脉络膜血管病变(PCV)、糖尿病性黄斑水肿、干眼病、白塞氏病、视网膜脱离、青光眼、葡萄膜炎(例如，传染性和非传染性葡萄膜炎，色素性视网膜炎、先天性利伯氏黑蒙、斯特格氏病、眼外伤和结膜炎(例如，传染性结膜炎、非传染性结膜炎和过敏性结膜炎)。
类似地，与IL-1功能异常相关的各种病况和疾病，并且因此也由IL1RAP的辅助受体活性介导，包括但不限于：急性胰腺炎；肌萎缩侧索硬化症(ALS)；阿尔茨海默氏病；恶病质/厌食，包括艾滋病引起的恶病质；哮喘和其它肺病；动脉粥样硬化；自身免疫性血管炎；慢性疲劳综合症；梭菌属相关疾病，包括梭菌属相关性腹泻；冠状动脉病况和适应症，包括充血性心脏衰竭、冠状动脉再狭窄、心肌梗塞、心肌功能障碍(例如与败血症有关)和冠状动脉旁路移植术；癌症，如多发性骨髓瘤和骨髓性(例如AML或CML)和其它白血病，以及肿瘤转移；糖尿病(例如胰岛素依赖型糖尿病)；子宫内膜异位；发热、纤维肌痛；肾小球肾炎移植物抗宿主疾病/移植排斥；失血性休克；痛觉过敏；炎性肠病；关节的炎性病况，包括骨关节炎、牛皮癣性关节炎和类风湿性关节炎；炎性眼病，可能与例如角膜移植有关；局部缺血，包括大脑局部缺血(例如，由于外伤、癫痫、出血或中风而导致的脑损伤，每一种都可能导致神经变性)；川崎氏病；学习障碍；肺病(例如ARDS)；多发性硬化症；肌病(例如，肌肉蛋白质代谢，尤其是败血症)；神经毒性(例如，由HIV引起)；骨质疏松；疼痛，包括与癌症相关的疼痛；帕金森氏病；牙周病；早产；牛皮癣；再灌注损伤；败血性休克；放射疗法的副作用；颞下颌关节病；睡眠障碍；葡萄膜炎；或因劳损、扭伤、软骨损伤、外伤、骨科手术、感染或其它疾病而导致的炎性病况。
充当IL-1、IL-33和/或IL-36信号传导路径的拮抗剂或抑制剂的药剂正在临床研发中，用于治疗多种疾病和病况，包括但不限于以下物质：痤疮、急性重度溃疡性结肠炎、成人斯蒂尔病、过敏性鼻炎、关节炎(包括痛风性、幼年型、骨质和类风湿性)、关节炎疼痛、哮喘、动脉粥样硬化、特应性湿疹、白塞氏病、恶病质、癌症(包括乳腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌和胰脏癌)、慢性阻塞性肺病、干眼综合症、家族性寒冷性自身炎性综合症、家族性地中海热、食物过敏、泛发性脓疱型牛皮癣、化脓性汗腺炎、高IgD综合症、高尿酸血症、穆-韦二氏综合症、新生儿发病的多系统炎性疾病、肌肉骨骼疼痛、掌跖脓疱病、周围血管疾病、风湿性多肌痛、鼻息肉、牛皮癣、坏疽性脓皮病、再狭窄、镰状细胞性贫血、鼻窦炎、TNF受体相关的周期性综合症、2型糖尿病和溃疡性结肠炎。
预期包含本公开的抗IL1RAP抗体的组合物或调配物中的任一者可以用于治疗与IL1-1、IL-33和/或IL-36信号传导路径的功能异常相关并且因此由IL1RAP的辅助受体活性介导的上文所列出的疾病或病况中的任一者的方法或用途。通常，这些病况和疾病包括但不限于炎性疾病、自身免疫性疾病、呼吸系统疾病、代谢障碍、感染和癌症。
因此，在一些实施例中，包含本公开的抗IL1RAP抗体的组合物或调配物可以用于方法、疗法、药物、诊断或用于治疗选自以下的病况或疾病的用途：痤疮、急性胰腺炎、急性重度溃疡性结肠炎、成人斯蒂尔病(adult-onset Still's disease)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、气道高反应性、气道炎症、过敏性结膜炎、过敏性鼻炎、过敏、阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、过敏反应、关节炎疼痛、哮喘、动脉粥样硬化、特应性皮炎、特应性湿疹、自身免疫性血管炎、白塞氏病、骨癌、脑癌、乳癌、恶病质/厌食、软骨损伤、脑缺血、慢性疲劳综合症、慢性阻塞性肺病、梭菌属相关疾病、结肠癌、充血性心脏衰竭、结膜炎、冠状动脉旁路移植术、冠状动脉再狭窄、克罗恩氏病、糖尿病、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病、干眼病、子宫内膜异位症、嗜酸性粒细胞相关的胃肠道病症、嗜酸性粒细胞性食管炎、家族性寒冷性自身炎性综合症、家族性地中海热、发热、纤维肌痛、纤维化病症、食物过敏、泛发性脓疱型牛皮癣、青光眼、肾小球肾炎、痛风性关节炎、移植物抗宿主疾病、蠕虫感染、出血性休克、化脓性汗腺炎、痛觉过敏、高IgD综合症、高尿酸血症、特发性肺纤维化(IPF)、癌症相关的疼痛、感染、炎性肠病(IBD)、由劳损引起的发炎病况、与角膜移植相关的炎性眼病、炎性疼痛、流感、肠癌、局部缺血、幼年型关节炎、川崎氏病、肾癌、先天性利伯氏黑蒙、肝癌、肝病、肺癌、穆-韦二氏综合症、多发性骨髓瘤、多发性硬化症、肌肉骨骼疼痛、骨髓性和其它白血病、心肌功能障碍、肌病、鼻息肉、新生儿发病的多系统炎性疾病、神经毒性、非传染性结膜炎、非小细胞肺癌、骨科手术、骨关节炎、骨质疏松、疼痛、掌跖脓疱病、胰脏癌、帕金森氏病、牙周病、周围血管疾病、风湿性多肌痛、息肉样脉络膜血管病(PCV)、早产、前列腺癌、原虫感染、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、坏疽性脓皮病、再灌注损伤、呼吸道合胞病毒(RSV)、再狭窄、视网膜脱离、色素性视网膜炎、早产儿视网膜病(ROP)、类风湿性关节炎、败血性休克、镰状细胞性贫血、放射疗法的副作用、鼻窦炎、皮肤癌、睡眠障碍、扭伤、斯特格氏病、胃癌、颞下颌关节病、TNF受体相关的周期性综合症、移植排斥、创伤、眼外伤、2型糖尿病、溃疡性结肠炎和葡萄膜炎。
如本文所公开，包括在以下实例中，本公开的抗IL1RAP抗体具有降低、抑制和/或阻断由IL1RAP介导的胞内信号传导的能力，包括IL-1、IL-33和IL-36信号传导路径。因此，在一些实施例中，本公开提供一种在受试者中治疗IL1RAP介导的疾病或病况的方法，所述方法包含向受试者施用治疗有效量的本公开的抗IL1RAP抗体或向有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含本公开的抗IL1RAP抗体和药学上可接受的载剂。
如本文其它地方所公开，本公开的抗IL1RAP抗体具有降低、抑制和/或阻断IL-1、IL-33和IL-36信号传导路径的能力。因此，本公开还提供治疗响应于IL-1、IL-33和/或IL-36信号传导路径的降低、抑制和/或阻断的疾病和病况的方法。
此外，本公开的抗IL1RAP抗体具有降低、抑制和/或阻断由激动剂IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ刺激的胞内信号传导的能力。因此，本公开还提供治疗响应于由激动剂IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ刺激的胞内信号传导的降低、抑制和/或阻断的疾病和病况的方法。
IL-1信号传导路径也是IL1RAP介导的路径，已经与多种形式的癌症相关。因此，在一些实施例中，本公开提供一种在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包含向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的抗IL1RAP抗体或向受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含本公开的抗IL1RAP抗体和药学上可接受的载剂。
也都是IL1RAP介导的路径的IL-1、IL-33和/或IL-36信号传导路径中的所有三个都与哮喘相关。因此，在一些实施例中，本公开提供一种在受试者中治疗哮喘的方法，所述方法包含向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的抗IL1RAP抗体或向受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含本公开的抗IL1RAP抗体和药学上可接受的载剂。
在一些实施例中，本公开提供治疗和/或预防IL1RAP介导的疾病、IL-1、IL-33和IL-36信号传导路径介导的疾病和/或由胞内信号传导介导的疾病的方法，所述胞内信号传导由激动剂IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ刺激。在此类治疗方法实施例中，所述方法包含向有需要的受试者施用治疗有效量的抗IL1RAP抗体，或包含如本文所描述的抗IL1RAP抗体的组合物或医药调配物。
根据治疗方法施用抗体、组合物或医药调配物提供抗体诱导的治疗作用，其保护受试者免受和/或治疗受试者中IL1RAP介导的疾病的进展。在一些实施例中，治疗方法还可以包含施用所属领域技术人员已知的一种或多种额外治疗剂或治疗，以预防和/或治疗IL1RAP介导的疾病或病况。包含施用一种或多种额外药剂的此类方法可以涵盖组合施用(其中在相同或单独的调配物中包括两种或更多种治疗剂)和单独施用，在这种情况下，抗体组合物或调配物的施用可以先于、同时和/或在施用额外治疗剂之后。
在本公开的治疗方法的一些实施例中，包含抗IL1RAP抗体的抗IL1RAP抗体或医药调配物通过全身递送药剂或递送到期望的靶组织的任何施用方式向受试者施用。全身施用通常是指将抗体在除直接进入期望靶位点、组织或器官之外的位点施用到受试者的任何方式，使得抗体或其调配物进入受试者的循环系统，并且因此经历代谢和其它类似过程。
因此，在本公开的治疗方法中有用的施用方式可以包括但不限于注射、输注、滴注和吸入。通过注射施用可以包括静脉内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、脑脊髓内和胸骨内注射和输注。
在一些实施例中，调配抗IL1RAP抗体的医药调配物，从而保护抗体使其免于在肠道中失活。因此，治疗方法可以包含口服调配物。
在一些实施例中，还提供包含本公开的抗IL1RAP抗体的组合物或调配物作为药物的用途。此外，在一些实施例中，本公开还提供包含抗IL1RAP抗体的组合物或调配物在药物，特别是用于治疗、预防或抑制IL1RAP介导的疾病的药物的制造或制备中的用途。在另一实施例中，药物用于治疗、预防或抑制IL1RAP介导的疾病的方法，所述方法包含向患有IL1RAP介导的疾病的个体施用有效量的药物。在某些实施例中，药物还包含有效量的至少一种额外治疗剂或治疗。
在另一实施例中，药物用于在受试者中治疗、抑制或预防IL1RAP介导的疾病，包含向受试者施用有效量的药物以治疗、抑制或预防IL1RAP介导的疾病。
为了预防或治疗IL1RAP介导的疾病或病况，本公开的组合物和调配物中所含有的抗IL1RAP抗体的适当给药(当单独使用或与一种或多种其它额外治疗剂组合使用时)将取决于所治疗的特定疾病或病况、疾病的严重程度和过程、抗体是否出于预防或治疗目的施用、患者先前所施用的治疗、患者的临床病史和对抗体的反应，和主治医师的判断。本文所描述的组合物和调配物中包括的抗IL1RAP抗体可以一次或通过一系列治疗适当地施用患者。本文考虑了各种给药方案，包括但不限于在各种时间点团注上的单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。
取决于疾病的类型和严重性，本公开的调配物中约1μg/kg到15mg/kg的抗IL1RAP抗体是用于施用到人类受试者的初始候选剂量，不管是否通过一次或多次单独施用，或通过连续输注。通常，抗体的施用剂量将在约0.05mg/kg到约10mg/kg范围内。在一些实施例中，可向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg的一种或多种剂量(或其任何组合)。
取决于受试者的病况，剂量施用可以维持数天或更长时间，例如，如所属领域已知的方法所确定的，可以持续施用直到充分治疗IL1RAP介导的疾病。在一些实施例中，可施用初始的较高负荷量，然后施用一个或多个较低的剂量。然而，其它剂量给药方案可以是有用的。剂量施用的治疗作用的进展可以通过常规技术和分析进行监测。
因此，在本公开的方法的一些实施例中，抗IL1RAP抗体的施用包含约1mg/kg到约100mg/kg的日剂量。在一些实施例中，抗IL1RAP抗体的剂量包含至少约1mg/kg、至少约5mg/kg、至少约10mg/kg、至少约20mg/kg或至少约30mg/kg。
此外，本公开的抗IL1RAP抗体可用于检测IL1RAP的分析方法中。由于它们以高亲和力结合人类IL1RAP的能力，本文所公开的抗IL1RAP抗体适用于广泛范围的分析方法和形式。预期抗IL1RAP抗体可以用于任何已知的分析方法中，如用于检测和量化IL1RAP的竞争性结合分析、直接和间接夹层分析，免疫沉淀分析和酶联免疫吸附分析(ELISA)(参见,Sola,1987,《单克隆抗体:技术手册》,第147-158页,CRC出版公司)。因此，在一些实施例中，本公开提供一种用于检测生物样品中的IL1RAP水平的方法，所述方法包含使样品与如本文所公开的抗IL1RAP抗体接触的步骤。此外，在一些实施例中，预期检测生物样品中的IL1RAP水平的方法可以用于检测和/或诊断例如来自人类受试者的生物样品中IL1RAP介导的病况或疾病。
实例
本公开的各种特征和实施例在以下代表性实例中说明，所述代表性实例意图是说明性的而并非限制性的。所属领域的技术人员将容易地了解，这些具体实例仅是对本发明的说明，如在随后的权利要求中更充分地描述。本申请中所描述的每个实施例和特征应理解为可与其内所含有的每个实施例互换和组合的。
实例1：IL1RAP多肽的产生
本实例说明各种IL1RAP多肽构建体的制备，所述构建体用作引发和筛选本公开的抗IL1RAP抗体的抗原。
基于Wang等人,《自然·免疫学》,11:905-912(2010)中的结构信息，将hu-IL1RAP的胞外结构域以重组方式纯化为全长和单独的结构域(即，D1、D2、D3)。表达构建体的氨基酸序列边界在上文表1和随附的序列表中提供。所有重组IL1RAP多肽构建体均具有用于纯化和检测的以下“GGGS-V5-6XHis”C端标签：GGGSGKPIPNPLLGLDSTHHHHHH(SEQ ID NO:319)。用于纯化和检测，单独结构域的构建体(例如D1、D1D2、D3)具有以下“GGGS-V5-Avi-6XHis”C端标签(还包括“Avi”标签)：GGGSGKPIPNPLLGLDSTGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(SEQ ID NO:320)。
根据制造商的协议，IL1RAP构建体蛋白在Expi293F细胞中表达(美国马萨诸塞州的沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA))。5天后收获细胞，用20mM咪唑pH 7.5补充澄清的上清液，并且施用到在20mM Tris-HCl、150mM NaCl(TBS)、20mM咪唑pH 7.5中平衡的HisTrap FF粗柱(美国伊利诺伊州芝加哥的通用电气医疗集团(GE Healthcare,Chicago,IL,USA))。用20CV梯度到100％TBS、500mM咪唑pH 7.5洗脱蛋白质。收集含有蛋白质的洗脱部分并且根据蛋白质的分子量负载到Superdex 75或Superdex200增加柱(美国伊利诺伊州芝加哥的通用电气医疗集团)上。收集含有单体蛋白的峰部分并且储存在1X PBS，pH 7.5中或25mM HEPES、150mM NaCl(HBS)，pH 8.0中。
实例2：使用杂交瘤方法生成抗人类IL1RAP抗体，进行筛选和选择以进一步表征。
本实例说明使用小鼠杂交瘤技术产生抗hu-IL1RAP抗体的方法和筛选和选择抗体用于进一步表征的方法。
免疫和融合：用包含hu-IL1RAP的膜形式的胞外结构域的SEQ ID NO:3(见表1)的hu-M-IL1RAP多肽构建体使用50μg/小鼠来免疫Balb/c、Swiss Webster和SJ/L小鼠。初次免疫后，在诱导小鼠中的抗IL1RAP抗体的合适滴度所需的时间表和持续时间下施用以下3种不同的IL1RAP免疫原的后续加强免疫：25μg/小鼠的SEQ ID NO:3(hu-M-IL1RAP)的多肽、25μg/小鼠的SEQ ID NO:9(mo-M-IL1RAP)的多肽或25μg/小鼠的SEQ ID NO:6(hu-M-IL1RAP-D3)的多肽。佐剂Magic Mouse(Creative Diagnostics,Shirley,NY)用于所有免疫。如下所描述通过ELISA确定滴度。基于其滴度而选择的小鼠在没有佐剂的情况下进行最终的融合前增强。一天后，收获脾脏并根据标准方案进行处理。使用PEG并按照标准方案将脾细胞与骨髓瘤P3X63Ag8.653细胞(美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)CRL 1580)融合，并且使用标准技术以大约50,000骨髓瘤细胞/孔涂覆到96孔板中，以使所得群落的克隆性最大化。使用补充有AH(重氮丝氨酸+次黄嘌呤)的选择培养基选择亲本杂交瘤。
ELISA分析：培养12-14天后，收集杂交瘤上清液，并且用包被有SEQ ID NO:3的hu-M-IL1RAP胞外结构域的96孔板通过ELISA进行初步筛选。通常按照Baker等人,《生物技术趋势(Trends Biotechnol)》,20:149-156(2002)中所描述进行ELISA分析。简单来说，将96孔
Figure BDA0003013363900000671
平底板(马塞诸塞州的沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技；目录号439454)用在包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH 9.6或磷酸盐缓冲盐水，PBS)中的50μL/孔的浓度为1μg/mL的蛋白质以4℃包被过夜。除去包被溶液后，通过添加200μL含有1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4(ELISA稀释剂)的分析/阻断溶液阻断非特异性结合，并且在室温下搅拌培育1小时或在4℃下在不搅拌的情况下培育过夜。然后将板用300μL PBS、0.05％
Figure BDA0003013363900000672
-20(洗涤缓冲液)洗涤三次。将来自各个杂交瘤克隆(或指定浓度下的纯化抗体)的100μL培养物上清液添加到各个孔中，之后在室温下搅拌培育一小时。将板用洗涤缓冲液洗涤三次，然后将50μL/孔的与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG Fc(美国德克萨斯州的蒙哥马利的bethyl实验室(Bethyl Laboratories,Montgomery,TX,USA)；目录号A90-131P)以1:3,000稀释来添加或将与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG(H+L)(美国宾夕法尼亚州的西格罗夫的杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch,Inc.,WestGrove,PA,USA)；目录号109-035-088)以在ELISA稀释液中以1:10,000稀释来添加。将板在室温下搅拌培育一小时，用洗涤缓冲液洗涤六次，并且通过添加50μL/孔的四甲基联苯胺(TMB)微孔过氧化物酶底物(美国佛蒙特州的洛根的Scytek实验室公司(ScytekLaboratories,Inc.,Logan,UT,USA)；目录号TM1999)显影3-10分钟。通过用50μL/孔的2NNH2SO4(美国密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich Corporation,St.Louis,MO,USA)；目录号258105)酸化来终止酶促显色。450nm的波长下，用SpectraMaxi3X读板器(美国加利福尼亚州圣何塞的分子仪器有限公司(Molecular Devices LLC,SanJose,CA,USA))对板进行分析。
此初步ELISA分析筛选从用SEQ ID NO:3的hu-M-IL1RAP多肽和SEQ ID NO:6的hu-M-IL1RAP-D3多肽免疫的三只Swiss Webster小鼠产生的杂交瘤中鉴别总共470个抗人类IL-1RAP结合剂。将这470个亲本杂交瘤扩增至24孔板，并且如上文所描述进行确认ELISA筛选，得到315种确认的hu-IL1RAP结合剂。
基于HEK-Blue细胞的杂交瘤阻断分析，筛选亚克隆和纯化
使用下文所述的基于HEK-Blue细胞的阻断分析进一步表征经证实对hu-M-IL1RAP结合呈阳性的315杂交瘤抑制IL-1介导的IL1R1/IL1RAP和IL-33介导的ST2/IL1RAP信号传导路径的能力。
HEK Blue细胞系：在本实例和以下实例中所描述的HEK-Blue细胞系使用HEK-293细胞系(人胚肾上皮细胞)作为原始亲代谱系。响应于由IL-1α、IL-1β和IL-33刺激的HEK-Blue IL-1/IL-33传感器细胞获自英潍捷基(InvivoGen)(美国加利福尼亚州圣地亚哥的英潍捷基(InvivoGen,San Diego,CA,USA)；目录号hkb-il33)。这些IL-1/IL-33传感器细胞是通过用表达IL-33受体ST2的人类ST2基因稳定转染HEK-Blue IL-1β传感器细胞(英潍捷基；目录号hkb-il1b)生成的。HEK-Blue IL-1β细胞表达NF-κB/AP-1SEAP(分泌型胚胎碱性磷酸酶)报告基因，并且含有失活的TNF-α反应，以确保SEAP的产生代表IL-1或IL-33路径活化。根据制造商的指导，维持HEK-Blue IL-1/IL-33应答细胞。简单来说，将细胞维持在由DMEM(美国纽约州康宁的康宁公司(Corning,Inc.,Corning,NY,USA))组成的标准生长培养基中，并且补充有10％胎牛血清(FBS)(美国佐治亚州弗罗尔布莱什的亚特兰大生物试剂公司(Atlanta Biologicals,Inc.,Flowery Branch,GA,USA))，100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素。生长培养基中进一步补充有100μg/mL博莱霉素以维持编码SEAP的质粒，200μg/mL潮霉素B以维持IL-1特异性和100μg/mL杀稻瘟菌素以维持编码ST2的质粒。
HEK-Blue SEAP分析：HEK-Blue IL-1/IL-33应答传感器细胞用于发生IL-1α、IL-1β或IL-33刺激的所有HEK-Blue SEAP分析。在所有分析之前，生成由八点连续稀释系列组成的激动剂剂量-反应曲线，以提供用于所述测定的激动剂的半数最大有效浓度(EC50)的估算值。实验使用前24小时，将细胞以一定浓度涂覆到96孔平底板上，以使使用时的最小汇合度达到80％。将所需激动剂添加到细胞中直到最终体积为200μL，并且将细胞在37℃下，在5％CO2下培育24小时。使用SEAP检测分析定量SEAP产生。SEAP检测介质QUANTI-Blue(英潍捷基)用于根据指示的各种条件并根据各一般制造商的指导来测定SEAP的水平。具体来说，将20μL细胞培养物上清液(添加激动剂后24小时收集)添加到130μL的QUANTI-Blue检测培养基中。使反应在37℃下进行1小时，此时，结合SoftMax Pro软件(分子仪器公司)，使用SpectraMax(分子仪器公司)分光光度计测量在650nm波长下的吸光度。使用GraphPadPrism 7软件分析原始分析数据，以对分析中的激动剂EC50值进行非线性回归确定。
如上文所描述进行杂交瘤细胞培养物上清液(SN)中未纯化的抗hu-IL1RAP抗体的HEK-Blue SEAP分析，但是具有以下修改。将含有抗hu-IL1RAP抗体的未纯化杂交瘤细胞培养物SN以50μL的最终体积的4倍添加到HEK-Blue IL-1/IL-33细胞中。将细胞和含有抗体的杂交瘤细胞培养物SN在37℃下，在5％CO2下培育1小时。在培育抗体一小时后，将激动剂以所需浓度的4倍并且以在200μL的总体积内产生最终所需浓度的1倍的方式添加到含有细胞和抗体的孔中。通过从样品(在此情况下为含抗hu-IL1RAP抗体的杂交瘤细胞培养物SN)获得的值中减去从阴性对照获得的吸光度值来计算抑制百分比。然后将阴性对照调整后的样品用于确定与阳性对照(仅在不存在含抗体的杂交瘤细胞培养物SN的情况下暴露到激动剂的细胞)的比率。
与使用杂交瘤细胞培养物SN进行的上述分析类似地进行了使用纯化的杂交瘤衍生的抗hu-IL1RAP抗体进行的HEK-Blue SEAP分析。简单来说，将抗体与细胞在标准生长培养基中不存在激动剂的情况下在37℃下，在5％CO2下培育一小时。培育一小时后，将估测的EC50浓度下的所需激动剂添加到最终体积200μL中，并且使实验再进行24小时。阴性对照(NC)代表仅暴露到生长培养基的细胞，而阳性对照(PC)代表仅暴露到激动剂的细胞(在没有拮抗或对照抗体的情况下)。
为了确定抗体(包括如以下实例中所描述的Fab)的最大半数抑制浓度(IC50)，使用了七点连续稀释系列(以所指示的浓度开始)。与先前所提及的激动剂剂量反应曲线一样，使用GraphPad Prism 7软件进行非线性回归分析，以从分析结果中确定IC50值。
以下市售的人类细胞因子在HEK-Blue分析中用作激动剂：IL-1α(Gibco/赛默飞世尔科技)、IL-1β(美国加利福尼亚圣地亚哥的英潍捷基(InvivoGen,San Diego,CA,USA))和IL-33(英潍捷基；或美国新泽西州洛基山的PeproTech US(PeproTech US,Rocky Hill,NJ,USA))。
ELISA筛选和基于HEK-Blue细胞的阻断分析结果用于选择一组15个亲本杂交瘤细胞系进行亚克隆和纯化。下表3中显示了所选择的杂交瘤和基于HEK-Blue细胞的阻断分析的结果。
表3：所选择的亲本杂交瘤的ELISA和基于HEK-Blue细胞的阻断分析结果
Figure BDA0003013363900000701
杂交瘤亚克隆和纯化：通过用ELISA筛选证实的亚克隆进行标准有限稀释进行亚克隆(如上文所描述)。在无血清培养基中将亚克隆按比例扩大到30mL培养物。如下纯化抗体。通过在300g下离心10分钟以去除细胞并且用0.22μm孔径的过滤器过滤来澄清上清液培养基。将澄清的上清液培养基与用PBS缓冲液平衡的POROS MabCapture A树脂(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA))混合，并且在室温下轻轻旋转培育1.5小时。培育之后，将浆液装入柱中，并且用20柱体积(CV)的含有0.5M NaCl的PBS缓冲液洗涤树脂。用3CV的0.1M乙酸、0.15M NaCl洗脱IgG分子。用1MMOPS，pH 7.0将洗脱液迅速中和至pH 5.2，并且使用PD-10脱盐柱(通用电气医疗集团)将缓冲液更换为PBS缓冲液。
纯化杂交瘤抗体的表征
ELISA分析：ELISA分析(如上文所描述)用于确认从15种亲本杂交瘤中获得的纯化抗体与hu-M-IL1RAP多肽以及可溶性hu-S-IL1RAP多肽(SEQ ID NO:7)结合的能力，并且确定与小鼠mo-M-IL1RAP多肽(SEQ ID NO:9)和食蟹猴cyno-M-IL1RAP多肽(SEQ ID NO:8)的交叉反应程度。从杂交瘤中纯化的15种抗体的连续稀释液以20nM开始测试，并且如下表4所示计算每种抗体的EC50。
表4：杂交瘤衍生的15种纯化抗体的ELISA分析结果
Figure BDA0003013363900000711
结合结构域作图：使用上文所描述的ELISA分析对15种纯化抗体进行结合结构域作图，其中将以下IL1RAP多肽构建体以1μg/ml包被在分析板上：hu-M-IL1RAP、hu-M-IL1RAP-D1、hu-M-IL1RAP-D1D2和hu-M-IL1RAP-D3。在10nM的浓度下测试了15种mAb，ELISA分析结果如下表5所示。
表5：通过ELISA分析对纯化的杂交瘤衍生抗体进行结构域作图
Figure BDA0003013363900000721
HEK-Blue分析：使用如上文所描述的HEK-Blue分析测试来源于15种亲本杂交瘤的纯化抗hu-IL1RAP抗体，以确定其阻断IL-1β和IL-33介导的IL1R1/IL1RAP和ST2/IL1RAP路径活化的能力。对所有mAb进行剂量反应并且确定在抗体浓度为100nM时对IL-1β和IL-33介导的活化的抑制程度，以从仅暴露到激动剂的细胞获得的最大信号的百分比计算。这些HEK-Blue分析的结果如下表6所示。
表6：杂交瘤衍生的纯化抗hu-IL1RAP抗体的HEK Blue分析
Figure BDA0003013363900000731
如表6的HEK-Blue分析结果所示，在所有测试的抗体中，只有来自杂交瘤11C5的mAb在100nM的浓度下均显示了IL-1β和IL-33活化路径的完全或几乎完全的阻断活性(分别为99％和93％)。
OCTET结合亲和力：使用
Figure BDA0003013363900000732
生物膜层反射光干涉(Bio-LayerInterferometry,BLI)结合分析(美国加利福尼亚州弗里蒙特的Pall ForteBio USA(PallForteBio USA,Fremont,CA,USA))测量来自11C5杂交瘤(下文称为“11C5(HY)”)的纯化mAb对hu-M-IL1RAP和cyno-M-IL1RAP多肽构建体的结合亲和力。BLI实验形式将抗体与溶液中的IL1RAP抗原固定在生物层表面。在实验缓冲液(含有0.01％Tween-20的PBS缓冲液)中，将SEQ ID NO:3的hu-M-IL1RAP多肽、SEQ ID NO:8的cyno-M-IL1RAP多肽或来自杂交瘤11C5的纯化mAb各自在200μL的最终体积中稀释。将所有样品放置在黑色96孔板中，并且在25℃下进行实验。将来自杂交瘤11C5的纯化mAb稀释到最终浓度35nM，并且固定在抗小鼠IgG Fc捕获(AMC)生物传感器(Pall ForteBio)上。将分析物在实验缓冲液中以0.9-25nM的范围连续稀释。在开始实验之前，将生物传感器在25℃下的实验缓冲液中平衡10分钟。
通过以下步骤进行动力学实验，其中列出了步骤名称、溶液和时间：基线(缓冲液-60秒)、负载(抗体-200秒)、基线2(缓冲液-最少120秒)、缔合(分析物-200-300秒)和解离(缓冲液-1000秒)。使用
Figure BDA0003013363900000742
数据分析软件(Pall ForteBio)分析由分析物缔合和从固定化抗体解离的抗原产生的BLI信号。首先，使用参考孔(经历与实验孔相同的步骤但没有用于缔合步骤的分析物的生物传感器)对所有记录的迹线进行参考减除，然后将所有迹线对准至缔合步骤的开始。整个缔合和解离步骤用于1:1结合模型中的全局拟合(最少四种分析物浓度迹线)以计算mAb 11C5(Hy)与每种分析物的KD。此OCTET BLI分析的结果显示于下表7中。
表7：BLI测量纯化11C5(Hy)与hu-M-IL1RAP和cyno-M-IL1RAP的结合亲和力
Figure BDA0003013363900000741
概述：基于其在上文所描述的分析中的优良特性，选择衍生自杂交瘤11C5、11C5(Hy)的纯化抗M-IL1RAP抗体用于进一步表征和亲和力成熟。即，如通过ELISA所测定，11C5(Hy)mAb与IL1RAP的结构域3(D3)结合，与hu-M-IL1RAP、hu-S-IL1RAP和cyno-M-IL1RAP多肽同样良好地结合，并且如HEK-Blue分析所测定，在IL-1β和IL-33活化路径上表现出完全或几乎完全的阻断活性。然而，11C5(Hy)mAb不会与SEQ ID NO:9的小鼠M-IL1RAP多肽交叉反应。
实例3：所选择的抗人类IL1RAP抗体的测序
本实例说明杂交瘤来源的抗hu-IL1RAP抗体的序列的测定。
以下方案用于鉴别、克隆和测序编码来自所选择的杂交瘤的抗体重链和轻链片段的基因。
在标准杂交瘤培养基(DMEM/F12、10％FBS、1％Glutamax、1％pen/strep)中，将目标杂交瘤在具有>80％存活力的T75烧瓶中生长至密度为1-3×105 7-10天。将来自培养物的1-3百万个细胞在15mL falcon管中以300g沉淀5分钟。通过将沉淀的细胞再悬浮到5mL冰冷的PBS中进行洗涤。在300g下离心5分钟之后，去除PBS，并且将细胞在1mL TRIZOL试剂(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA))中再悬浮并裂解。使裂解物通过具有20G1规格针头(BD 305175)的1mL注射器20次，以确保细胞完全裂解。紧接着将TRIZOL/细胞悬浮液在干冰上冷冻并储存在-80℃下直至处理为止。
使用Direct-zol RNA Miniprep Plus试剂盒(Zymo Research，Irvine，CA，美国加利福尼亚州尔湾的兹莫研究(Zymo Research,Irvine,CA,USA))将总RNA从裂解物中分离出来，并且使用5μg总RNA使用SMARTer RACE 5'试剂盒(日本宝日医生物技术(Takara Bio,Japan))生成5'-RACE就绪的杂交瘤cDNA。使用以下小鼠VH家族特异性可变区引物扩增来自以下cDNA的重链和轻链特异性基因片段：TCTTGTCCACCTTGGTGCTGCTGGCCGG(SEQ ID NO:321)，和TTTGTCCACCGTGGTGCTGCTGGCTGGT(SEQ ID NO:322)。以下小鼠Vκ家族特异性可变区引物，GATCAGTCCAACTGTTCAGGACGCC(SEQ ID NO:323)或小鼠Vλ家族特异性可变区引物，ACACTCAGCACGGGACAAACTCTTCTCCACAGT(SEQ ID NO:324)、ACACTCTGCAGGAGACAGACTCTTTTCCACAGT(SEQ ID NO:325)和ACACTCAGCACGGGACAAACTCTTCTCCACATG(SEQ ID NO:326)与试剂盒中所提供的通用引物在5'-RACE PCR反应中结合使用。
纯化PCR产物，并且使用In-Fusion克隆试剂盒(日本宝日医生物技术)将其克隆到pRACE中。使用具有M13正向和M13反向引物的Sanger测序仪对两条链进行测序。
所测定的衍生自杂交瘤11C5的mAb的轻链和重链可变结构域氨基酸序列VL和VH列于上表2中，并且在随附的序列表中分别以SEQ ID NO:257和279提供。
此外，所测定的衍生自杂交瘤10A11、9D5、8H1和13D8的mAb的VL和VH序列列于上表2中，并且在随附的序列表中分别以SEQ ID NO:311、312、313、314、315、316、317和318的形式提供。
实例4：通过11C5杂交瘤来源的抗Hu-IL1RAP mAb抑制IL-1、IL-33和IL-36刺激的胞内信号传导
本实例说明如在基于HEK-Blue细胞的阻断分析中所确定，来源于11C5、11C5(Hy)的纯化抗hu-IL1RAP mAb能够阻断IL-1α、IL-1β、IL-33和IL-36α、IL-36β和IL-36γ刺激的胞内信号传导。简单来说，用IL-36受体IL1RL2瞬时转染的HEK-Blue IL-1/IL-33传感器细胞，或HEK-BlueIL-33传感器细胞用于确定11C5(Hy)是否阻断IL-1、IL-33和IL-36依赖性信号传导路径。这两种HEK-Blue细胞系均表达NF-κB/AP-1SEAP报告基因，所述基因允许经由简单的SEAP检测分析监测IL-1、IL-33或IL-36活化。
材料和方法
HEK-Blue细胞：本实例中使用的HEK-Blue IL-1/IL-33传感器细胞已在上文所描述的实例2中进行了描述。HEK-Blue IL-33传感器细胞(英潍捷基；目录号hkb-hil33)与HEK-Blue IL-1/IL-33细胞相似，但IL-1和TNF-α反应均受阻。使用先前所描述的标准生长培养基根据制造商指导维持HEK-Blue IL-33细胞，并且补充有1X HEK-Blue Selection抗生素(英潍捷基；目录号hb-sel)以维持编码SEAP、ST2和IL-33特异性的质粒。
用IL-36受体瞬时转染HEK-Blue IL-33细胞：含有编码IL-36受体的人类IL1RL2基因的质粒由AvantGen(定制)生产。根据制造商的指导，使用LyoVec(英潍捷基)瞬时转染HEK-Blue IL-33传感器细胞。简单来说，将LyoVec-DNA复合物以在转染后24小时最少产生80％汇合度的浓度直接添加到悬浮在标准生长培养基中的细胞中，并且紧接着涂覆在96孔平底板上。转染后24小时，细胞用于标准HEK-Blue SEAP分析。
HEK-Blue SEAP分析：HEK-Blue IL-1/IL-33细胞用于所有HEK-Blue SEAP分析，其中发生了IL-1或IL-33刺激并且已在上文实例2中描述。对于用IL-36刺激的分析，采用瞬时表达IL-36受体IL1RL2的HEK-Blue IL-33细胞。这些瞬时转染的HEK-Blue IL-33传感器细胞对IL-36α、IL-36β和IL-36-γ的刺激有应答。将人类IL-36α、IL-36β和IL-36γ细胞因子从N端序列上裂解以产生完全成熟的细胞因子。如先前所描述获得激动剂EC50和拮抗剂抗体IC50的值。阴性对照(NC)代表仅暴露到生长培养基的细胞，而阳性对照(PC)代表仅暴露到激动剂的细胞(在没有拮抗或对照抗体的情况下)。
结果
将11C5(Hy)mAb与HEK-Blue IL-1/IL-33细胞培育一小时，然后以先前测定的大致相当于EC55-60的浓度添加IL-1α(图1A)或IL-1β(图1B)。11C5(Hy)mAb表现出强大的阻断活性，其中IL-1α和IL-1β的IC50分别等于4.7E-09M和1.0E-09M。在100nM的抗体浓度下，当与相应的阳性(PC)对照和阴性(NC)对照比较时，观察到几乎完全的抑制(对于IL-1α和IL-1β，分别为94％和99％)。
进行类似的分析以测定在IL-33刺激的HEK-Blue IL-1/IL-33细胞中的阻断效力和功效(图1C)。如在IL-1阻断分析中观察到的，11C5(Hy)在IL-33刺激后表现出强大的阻断活性(IC50＝3.71E-09M)，其中在测试抗体的最大浓度(100nM)下观察到几乎完全的阻断(93％)。
将HEK-Blue IL-36应答细胞(即瞬时表达IL-36受体IL1RL2的IL-33细胞)与11C5(Hy)培育1小时，然后用IL-36α(图1D)、IL-36β(图1E)或IL-36γ(图1F)刺激。在100nM的11C5(Hy)抗体浓度下，观察到几乎完全抑制了IL-36依赖性信号传导，具体来说，分别抑制了IL-36α、IL-36β和IL-36γ的98％、98％和99％。IL-36α、IL-36β和IL-36γ的IC50值分别为2.52E-09M、9.81E-10M和6.65E-10M。
下表8概述了HEK-Blue分析中mAb 11C5(Hy)的IC50值和抑制％。
表8：HEK Blue分析中的11C5(Hy)mAb阻断活性、IC50和100nM抗体的抑制
激动剂 IC<sub>50</sub>(M) 抑制(％)
IL-1α 4.70E-09 94
IL-1β 1.00E-09 99
IL-33 3.71E-09 93
IL-36α 2.52E-09 98
IL-36β 9.81E-10 98
IL-36γ 6.65E-10 99
如上表8的结果所示，纯化杂交瘤来源的抗体11C5(Hy)能够在基于HEK Blue细胞的阻断分析中刺激所有六种细胞因子(IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ)后有力地阻断所有三个目标路径(IL-1、IL-33和IL-36)。
实例5：抗IL1RAP mAb 11C5(Hy)的人源化、嵌合和C59突变体形式的制备
本实例说明衍生自杂交瘤11C5的鼠抗IL1RAP mAb 11C5(Hy)的人源化和嵌合形式的制备。此外，实例说明了11C5(Hy)mAb的鼠、人源化和嵌合变异体的制备，其中位置59处的重链半胱氨酸残基被一系列替代氨基酸取代：C59A、C59S、C59T、C59V和C59Y。
鼠抗IL1RAP 11C5可变区序列的人源化
SEQ ID NO:257的小鼠11C5(Hy)抗体轻链可变区(VL)序列和SEQ ID NO:279的重链可变区(VH)序列与人种系抗体序列比对。人种系κ轻链(基因ID-V基因：IGKV1-NL1*01，J基因：IGKJ4*02)和人种系重链(基因ID-V基因：IGHV3-7*03，J基因：IGHJ4*03)被鉴别为最接近的人类构架。鼠11C5(Hy)的VL和VH结构域的氨基酸序列比对，最接近的人种系序列和人源化h11C5在图2中示出。
将鼠11C5(Hy)轻链和重链的互补决定区(CDR)分别接枝到已鉴别的最接近的轻链和重链人类框架中，以产生人源化抗体克隆(以下称为“h11C5”)。鼠11C5(Hy)VL序列(SEQID NO:257)中的CDR-L1中的位置24-34处、CDR-L2中的位置50-56处和CDR-L3中的位置89-97处被接枝到人类κ轻链构架受体。鼠11C5(Hy)VH序列(SEQ ID NO:279)的CDR-H1中的位置31-35处、CDR-H2中的位置50-65处和CDR-H3中的位置95-102处被接枝到人类重链构架受体。鼠11C5(Hy)轻链的构架区2中的位置48处也被接枝到人类κ轻链构架受体，因为发现此位置是VH-VL相互作用界面的一部分或作为“游标”区的构架残基，其可调节CDR结构并且将其微调以适合抗原(参见例如,Foote等人,《分子生物学杂志》,224:4887-499(1992))。
合成作为DNA片段的人源化可变结构域序列，其中AgeI作为VL的5'侧翼限制酶位点且KpnI作为VL的3'侧翼限制酶位点，并且其中AgeI作为VH的5'侧翼限制酶位点且BstEII作为VH的3'侧翼限制酶位点。通过用含有完整人类κ轻链恒定结构域的pRK质粒中合成的h11C5 VL DNA片段替换AgeI-KpnI片段，得到h11C5的轻链表达质粒。通过用含有完整人类IgG1重恒定结构域的pRK质粒中合成的h11C5 VH DNA片段替换AgeI-BstEII片段，得到h11C5的重链表达质粒。
为了与人源化h11C5抗体进行比较，如上文所描述合成鼠11C5(Hy)VL和VH序列的DNA片段。通过将合成的DNA片段克隆到分别携带鼠IgG2a或人类IgGl恒定结构域的pRK质粒中，构建表达鼠11C5(Hy)的轻链和重链或11C5的嵌合形式(含有鼠VL和VH结构域，以及人类CL和CH1-CH3结构域)的质粒。
抗IL1RAP 11C5重链Cys59变异体的生成
鼠11C5(Hy)的VH的CDR-H2序列在位置59(Cys 59)处含有不成对半胱氨酸残基，这可能是进一步治疗性开发抗体的主要责任。为了消除此责任，合成了VH结构域序列的一系列变异体，其中位置59处的半胱氨酸(C)被丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)或酪氨酸(Y)氨基取代。基于与半胱氨酸(丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸和缬氨酸)的氨基酸侧链相似性或基于位置59处最接近的种系序列(酪氨酸)来选择取代。将在鼠11C5(“11C5(Hy)”)、嵌合11C5(“c11C5”)和人源化11C5(“h11C5”)的VH序列的背景下生成的一系列Cys59 mAb变异体合成为以AgeI为5'侧翼限制酶位点且BstEII为3'侧翼限制酶位点的DNA片段。如上文所描述产生Cys59变异体的重链表达质粒。
11C5(Hy)来源的鼠、嵌合和人源化抗IL1RAP mAb和其Cys59变异体的重组形式的 生成
根据制造商所提供的说明书，使用Expi293F表达系统(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA))进行重组IgG分子的表达。转染反应的重链和轻链质粒比例保持在1:1，并且转染细胞在收获前培养6天。
用以下方案纯化重组IgG分子。通过在300g下离心10分钟以去除细胞并且用0.22μm孔径的过滤器过滤来澄清上清液培养基。将澄清的上清液培养基与用PBS缓冲液平衡的POROS MabCapture A树脂(赛默科技)混合，并且在室温下轻轻旋转培育1.5小时。培育之后，将浆液装入柱中，并且用20柱体积的含有0.5M NaCl的PBS缓冲液洗涤树脂。然后用3倍柱体积的0.1M乙酸、0.15M NaCl洗脱重组IgG分子。用1M MOPS，pH 7.0将洗脱液迅速中和至pH 5.2，并且用PD-10柱(GE)将缓冲液更换为PBS缓冲液。
11C5(Hy)来源的鼠、嵌合和人源化抗IL1RAP mAb和其Cys59变异体的重组形式的 结合亲和力
来源于11C5(Hy)的鼠(“m11C5”)、嵌合(“c11C5”)和人源化(“h11C5”)mAb的重组形式对SEQ ID NO:3的hu-M-IL1RAP多肽的结合亲和力通过OCTET生物膜层反射光干涉(BLI)结合分析(Pall ForteBio)来测量。
实验形式将抗体固定在生物层表面，并且抗原IL1RAP处于溶液中。在实验缓冲液(具有0.01％Tween-20的PBS缓冲液)中稀释重组hu-M-IL1RAP和所有11C5变异体(最终体积均为200μL)。将所有样品放置在黑色96孔板中，并且在25℃下进行实验。将鼠和嵌合11C5变异体(35nM)固定在抗小鼠IgG Fc捕获(AMC)生物传感器(Pall ForteBio)上。抗人类IgG Fc捕获(AHC)生物传感器(Pall ForteBio)用于人源化11C5变异体(35nM)。在实验缓冲液中以1-81nM的范围连续稀释hu-M-IL1RAP分析物溶液。在开始实验之前，将生物传感器在25℃下的实验缓冲液中平衡10分钟。
通过以下步骤进行动力学实验，其中列出了步骤名称、溶液和时间：基线(缓冲液-60秒)、负载(抗体-200秒)、基线2(缓冲液-最少120秒)、缔合(分析物-200-300秒)和解离(缓冲液-1000秒)。
使用Octet数据分析软件(Pall ForteBio)分析由固定化抗体的分析物缔合和解离产生的BLI信号。首先，使用参考孔(经历与实验孔相同的步骤但没有用于缔合步骤的分析物的生物传感器)对所有记录的迹线进行参考减除，然后将所有迹线对准至缔合步骤的开始。整个缔合和解离步骤用于1:1结合模型中的全局拟合(最少四种分析物浓度迹线)以计算具有hu-M-IL1RAP的每个11C5变异体的KD。计算的KD值在下表9中列出。
表9：hu-M-IL1RAP与重组鼠、嵌合和人源化11C5 mAb和其Cys59变异体结合的OCTET BLI结果
Figure BDA0003013363900000801
实例6：人源化11C5的非特异性结合评估
本实例说明杆状病毒(BV)颗粒ELISA分析，其显示人源化11C5(h11C5)未表现出非特异性结合。
根据Hotzel等人,《单克隆抗体(mAbs)》,4(6):753-760(2012)中所描述的方案，使用以下方案评估h11C5与杆状病毒(BV)颗粒的非特异性结合。简单来说，将BV颗粒以2.5％悬浮液的形式在4℃下包被在96孔ELISA板上过夜。然后在室温下用PBS中的1％BSA，0.05％Tween-20阻断板一小时。将连续稀释的h11C5抗hu-IL1RAP抗体添加到板中一小时，用与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗-人类IgG检测结合的抗体(杰克逊免疫研究公司)，接着添加3,3,5,5-四甲基联苯胺底物(赛默飞世尔科技)和2N硫酸。测量在450nm处的吸光度，并且与参考抗体进行比较。
结果：如图3的标绘图所示，h11C5抗体在450nm处未显示可检测的BV ELISA信号，表明不存在与BV颗粒的任何非特异性结合。
实例7：基于11C5的鼠、嵌合和人源化抗IL1RAP抗体的功能分析
本实例说明实例4和5中所描述的重组鼠、嵌合和人源化抗IL1RAP抗体的基于细胞的阻断分析，以确定其各自抑制IL-1、IL-33和IL-36刺激的胞内信号传导的能力。
材料&方法
细胞系和HEK-Blue分析：上文实例2和4中描述了本实例7中所使用的细胞系和HEK-Blue分析。
原代人肺成纤维细胞和相关分析：原代人肺成纤维细胞(PHLF)可商购，并且可获自龙沙(Lonza)(目录号CC-2512)。从正常(无疾病)捐赠的人体组织中分离细胞，并且由制造商进行冷冻保存。使用制造商推荐的通用指导解冻并维持细胞。将PHLF维持在由FibroLife基础培养基(LifeLine)组成的生长培养基中，所述培养基补充有在使用前已被热灭活(56℃下持续30分钟)的2％人AB血清(康宁)、7.5mM Glutamax(Gibco)、100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素。在实验使用的前一天，将PHLF以一定浓度接种到平底96孔板上，所述浓度将在使用当天产生～80-85％的汇合度。
在用于抗体阻断分析之前，通过以与实例2中所描述类似的方式对HEK-Blue细胞进行激动剂剂量-响应曲线对激动剂EC50进行测定，其中进行以下修改。将激动剂添加到仅含有PHLF生长培养基(最终体积为200μL)的孔中的PHLF中后，将细胞放回组织培养箱(37℃，5％CO2)中四小时。然后收集组织培养物上清液，并且在4℃下储存1-3天。IL-8(人类)αLISA检测试剂盒(珀金埃尔默(Perkin Elmer))用于量化所收集的上清液中IL-8的水平。按照制造商指导中的指示进行分析。使用GraphPad Prism软件分析使用EnVision-αReader(珀金埃尔默)获得的原始数据，并且使用非线性回归分析(曲线拟合)，Sigmoidal，4PL进行插值，X为log(浓度)且加权由“重量比1/Y2”定义。然后使用标准的非线性回归分析对插值数据进行分析。
如实例4中进行基于细胞的阻断分析，但是以有助于获得IC50值的方式进行，其中进行修改以专门考虑PHLF的使用。简单来说，将c11C5_C59Y或适当的抗体对照(例如HuIgG1Ctrl)与PHLF在37℃下培育1小时，接着添加激动剂(IL-1α或IL-36β)。使实验再进行四小时(37℃，5％CO2)，其中收集细胞培养物上清液，并且如上文所描述进行IL-8的定量。
原代人单核细胞和相关分析。通过负免疫磁选择(也称为“未接触的(untouched)”)分离的原代人单核细胞(PHMO)是可商购的并且可从干细胞技术有限公司(STEMCELL Technologies)获得。根据通用制造商指导将单核细胞解冻，并且如实例4中所描述维持在标准生长培养基中。对于抗体阻断分析，将PHMO在分析的前一天以80,000/孔涂覆在平底96孔板上。将抗体c11C5_C59Y或适当的抗体同种型对照(Hu IgG Ctrl)与PHMO在37℃下，在5％CO2下培育1小时，接着添加目标激动剂(例如IL-1β)。所有孔的最终体积为200μL，其中阳性对照(PC)仅指示生长培养基和激动剂，并且阴性对照(NC)仅指示PHMO和生长培养基。
添加激动剂后二十四小时收集组织培养物上清液并储存在-80℃下，直到可以进行ELISA分析以测定存在的IL-6的水平。使用人类IL-6ELISA试剂盒(赛默飞世尔科技)量化上清液中IL-6的水平。使用GraphPad Prism软件和非线性回归分析进行原始数据分析和插值。在抗体阻断分析之前，如实例2中通常所描述，产生激动剂剂量-反应曲线以确定EC50值，其中进行修改以专门考虑PHMO的使用并且如上文所描述。以相同方式确定抗体IC50值。
原代人NK细胞和相关分析。通过负免疫磁选择分离的原代人NK细胞在商业上购自干细胞技术有限公司(加拿大温哥华(Vancouver,Canada))。在实验使用当天，根据通用制造商指导对NK细胞进行解冻，其中进行以下修改。在由补充有0.05mg/mL DNAse I的RPMI(康宁)组成的解冻培养基中解冻细胞(干细胞技术有限公司)。解冻后的细胞在实验使用前至少需要1小时的恢复时间(37℃，5％CO2)并维持在由RPMI(康宁)组成的NK生长培养基中，所述培养基补充有在使用前已被热灭活(在56℃下持续30分钟)的10％人AB血清(康宁)、1mM丙酮酸钠(康宁Cellgro)、2mM Glutamax(Gibco)和1X MEM非必需氨基酸(Gibco)。
在抗体阻断分析的实验使用之前，通过以与实例2中所描述类似的方式进行激动剂剂量-响应曲线对激动剂EC50进行测定，其中进行以下修改。将NK细胞以50,000/孔接种在圆底96孔板中。在仅将激动剂添加到悬浮在NK生长培养基(最终体积为200μL)中的NK细胞中后，将细胞放回组织培养箱(37℃，5％CO2)中24小时。除了仅含有NK生长培养基的标准阴性对照(NC)之外，阳性对照(PC)由含有IL-33(在指定浓度下)和0.1ng/mL IL-12两者的NK生长培养基组成。还包括一个额外的“仅IL-12”对照。
在添加激动剂后24小时后收集组织培养物上清液并且在4℃下储存1-3天。根据生产商指导，使用人类IFN-γELISA试剂盒(英杰/赛默飞世尔科技(Invitrogen/ThermoFisher Scientific))测定上清液中IFN-γ的水平。使用GraphPad Prism 7软件进行非线性回归分析，以获得最终的EC50值。
抗体阻断分析以类似的方式进行，但是以有利于获得如实例2中通常所描述的IC50值的方式进行，并且进行了修改以专门考虑NK细胞的使用，如上文所描述。简单来说，将c11C5_C59Y或适当的抗体同种型对照(Hu IgG Ctrl)与NK细胞在37℃下培育1小时，接着添加激动剂(仅IL-33+IL-12或IL-12)。实验再进行24小时(37℃，5％CO2)，其中收集细胞培养物上清液，并且如上文所描述进行IFNγ的定量。
结果
为了测定重组人源化11C5(“h11C5”)的阻断效力和功效，我们进行了HEK-BlueIL-1/IL-33阻断分析。还对原始鼠杂交瘤衍生抗体(“11C5(Hy)”)和重组鼠无效应子形式(“m11C5”)进行了分析，以评估由人源化以及无效应子人类IgG同种型对照(“Hu IgG1Ctrl”)导致的阻断活性的任何潜在损失。
人源化导致在IL-1β(图4A)和IL-33(图4B)刺激的细胞中阻断活性的轻微损失。与m11C5(杂交瘤衍生的11C5(Hy)的重组形式)相比，人源化抗体h11C5对IL-1β刺激的细胞表现出98％的抑制(IC50＝3.12nM)，其在100nM(IC50＝0.705nM)下表现出完全抑制。同样，对于IL-33刺激的细胞，与用m11C5(IC50＝2.25nM)观察到的96％抑制相比，h11C5在100nM下表现出80％抑制(IC50＝24.0nM)。如图4C和4D所示，h11C5的IL-1β和IL-33阻断活性部分地被11C5_C59Y变异体恢复，这消除了C59责任。对于h11C5_C59Y，IL-1β阻断活性的IC50提高到1.03nM，并且IL-33阻断活性的IC50提高到3.75nM。
总之，杂交瘤衍生的抗Hu IL1RAP抗体11C5(Hy)成功地人源化，其中其阻断IL-1和IL-33依赖性路径的能力仅略有降低，这通过VH区中的C59Y取代部分恢复。
尽管迄今为止使用的HEK-Blue细胞系为评估IL-1、IL-33或IL-36路径活化提供了一种快速简单的方法，但此类细胞系可能并不代表体内可能发生的情况。因此，我们试图利用原代人细胞评估11C5的阻断活性。已知人肺成纤维细胞表达IL-1受体(IL1R1)和其相关的辅助受体IL1RAP。此外，认为它们有助于先天和炎性免疫反应(Suwara,Green等人,2014)。为了确定11C5抗体在原代人肺成纤维细胞(PHLF)中抑制IL-1信号传导的程度，对用于HEK-Blue细胞系分析的通用实验方法进行了修改，以考虑PHLF的具体和技术要求。此外，在分析中使用特征为无效应子的N297G突变(“c11C5_C59Y”)的11C5抗体的重组嵌合形式。
如图4E所示，c11C5_C59Y表明在PHLF中IL-1α介导的IL-8产生的阻断活性与在HEK-Blue分析中观察到的IL-1α刺激的活性非常相似(参见图1A)，其中在两种情况下观察到的IC50大约为4nM(IC50为3.96nM，和在PHLF中的100nM c11C5_C59Y下的87％抑制)。
认为IL-1路径促成气道炎症，并且已知人单核细胞对IL-1有应答(Sims和Smith2010)。如图4F所示，当在c11C5_C59Y存在下用IL-1β刺激原代人单核细胞(PHMO)时，观察到IL-6产生的100％抑制并且IC50为0.733nM。这表明c11C5_C59Y能够完全阻断PHMO中IL-1β介导的信号传导。
IL-33路径对哮喘症状的作用和贡献已得到充分证明(参见例如,Sims和Smith,《自然综述·免疫学(Nat.Rev.Immunol.)》,10(2):89-102(2010),Garlanda等人,《免疫》,39(6):1003-1018(2013),Saluja等人,《临床和转化性过敏反应》,5:33(2015))。为了确定c11C5_C59Y是否能够阻断原代人细胞中的IL-33路径，使用人NK细胞进行了分析。已知IL-12通过NK细胞刺激ST2(IL-33受体)的表达，并且被认为是一般的NK刺激因子，增加IFN-γ的产生和增殖，以及增强细胞毒性(参见例如,Liew等人,《自然综述·免疫学》,16(11)；676-689(2016),Granzin等人,《前沿免疫学(Front.Immunol.)》,8:458(2017))。在IL-12存在下，用IL-33刺激的原代人NK细胞产生IFN-γ，而仅暴露到IL-12的NK细胞无法产生可检测的IFN-γ。
为了确定c11C5_C59Y在人NK细胞中阻断IL-33/IL-12信号传导的程度，将c11C5_C59Y或无效应子同种型对照抗体(“IgG Ctrl”)与人NK细胞培育一小时，接着IL-33/IL-12刺激24小时。如图4G所示，在用对照抗体培育的人NK细胞中可检测到IFN-γ的产生，但降低至接近用c11C5_C59Y培育的NK细胞中NC的水平，其中IC50为2.90nM，并且在100nM下的抑制为87％。
气道上皮、上皮和免疫细胞之间的相互干扰，以及上皮细胞与成纤维细胞之间的相互作用因其在免疫炎症和哮喘中的作用而受到越来越多的关注(参见例如Lambrecht和Hammad(2012)；Nowarski等人,《细胞(Cell)》,168(3):362-375(2017))。已知支气管上皮细胞有助于在损伤或应激(如病毒或细菌感染和接触香烟烟雾)后产生炎性细胞因子(如IL-1和IL-36)。此外，已知肺成纤维细胞对IL-1和IL-36有应答以诱导炎性反应(参见例如,Suwara等人,《粘膜免疫学(Mucosal Immunol.)》,7(3):684-693(2014)；Bassoy等人,《免疫学综述(Immunol.Rev.)》,281(1):169-178(2018))。如图4H所示，已显示c11C5_C59Y阻断IL-36β对PHLF的刺激，并且发现将IL-8的产生降低至与NC组中的PHLF相当的水平(100％抑制)，其中IC50为0.28nM。
如本实例7的结果所示，包括下文表10中总结的关于c11C5_C59Y的结果，基于杂交瘤衍生的抗hu-IL1RAP抗体11C5(Hy)的重组抗体能够阻断HEK-Blue细胞系和原代人细胞中的IL-1、IL-33和IL-36信号传导。此外，原代人细胞分析进一步证实了HEK-Blue细胞系分析的使用。
表10：c11C5_C59Y对原代人细胞信号传导抑制的结果。
Figure BDA0003013363900000851
实例8：使用噬菌体库淘选的人源化抗IL1RAP抗体的亲和力成熟
本实例说明用于人源化抗IL1RAP抗体h11C5的亲和力成熟以改进与人类IL1RAP的结合的噬菌体库构建和淘选技术。
人源化11C5 C59Y/A43S亲和力成熟NNK库构建
进行了亲和力成熟过程，以进一步改进h11C5_C59Y抗体与hu-IL1RAP的结合亲和力。在开始构建库之前，将丙氨酸(A)到丝氨酸(S)的取代(A43S)引入到h11C5_C59Y轻链的构架区2中。引入A43S取代以最小化由于人源化过程而改变VH-VL相互作用界面的潜在影响(Foote等人,《分子生物学杂志》,224:487-499(1992))。因此，基于使用h11C5_C59Y/A43S变异体作为亲本序列来构建噬菌体库。使用编码所有20个氨基酸的NNK简并密码子，构建了Fab-琥珀型噬菌体库用于对轻链或重链CDR残基进行残基随机化的单价Fab噬菌体展示(Brenner等人,《美国国家科学院院刊》,89(12):5381-5383(1992))。设计诱变寡核苷酸以将一个NNK突变应用到三个轻链或重链CDR中的每一者中的CDR残基。因此，库的每个成员都携带三个NNK简并密码子，每个轻链或重链CDR都有一个。然后使用Kunkel诱变将合成的诱变寡核苷酸用于构建轻链或重链库(Kunkel等人,《酶学方法(Methods Enzymol.)》,154:367-382(1987))。将所得库DNA电穿孔到大肠杆菌(E.coli)XL1细胞中，产生大约1.3×109个转化体。
将SEQ ID NO:3的hu-M-IL1RAP多肽构建体(2μg/mL)在4℃下在Maxisorp板上包被过夜。对于第一轮淘选，将板和噬菌体库在含有0.05％
Figure BDA0003013363900000852
20和1％BSA的PBS缓冲液中阻断1小时(板)或30分钟(噬菌体库)。将板在洗涤缓冲液(含有0.05％
Figure BDA0003013363900000853
20的PBS缓冲液)中洗涤，并且与阻断的噬菌体库一起振荡培育2小时。通过用洗涤缓冲液剧烈洗涤来去除非特异性结合的噬菌体。用0.1N HCl洗脱特异性结合的噬菌体，并且使用1/10th v/v1.3M Tris碱中和。通过添加1/10th v/v 1％BSA抑制非特异性相互作用。
除了使用SUPERBLOCKTMPBS缓冲液(皮尔斯)和0.05％
Figure BDA0003013363900000862
20用于阻断步骤之外，第二轮淘选与第一轮淘选相同。
为了淘选第三至第五轮，将噬菌体库用阻断缓冲液(第3轮中含1％BSA的PBS缓冲液和第4和第5轮中的SUPERBLOCKTMPBS缓冲液(皮尔斯)和0.05％
Figure BDA0003013363900000861
20)培育30分钟，并且然后用降低浓度的生物素化hu-M-IL1RAP培育1小时。在阻断的中性亲和素包被的板上捕获Hu-M-IL1RAP结合的噬菌体，用洗涤缓冲液充分洗涤，并且以与第1轮和第2轮相同的方式洗脱和中和。在最后的选择轮次中，添加了1000×非生物素化的hu-M-IL1RAP作为竞争剂，以提高选择的严格度。
为了使用NGS从亲和力成熟库中提取序列，从大肠杆菌XL-1细胞分离了噬菌粒双链DNA，所述细胞携带来自初始噬菌体库(未分选的库)和来自第二轮和第三轮溶液选择(已分选的库)的噬菌粒。使用Illumina 16s库制备方案(美国加利福尼亚州圣地亚哥的启迪公司(Illumina,Inc.,San Diego,CA,USA))，将纯化的DNA用作模板以生成VL和VH区的扩增子。使用Illumina Nextera XT索引试剂盒(启迪公司)添加测序衔接子和双-索引条形码。为了在Illumina MiSeq上进行测序准备，使用MiSeq试剂试剂盒v3(600个循环)(启迪公司)对衔接子连接的扩增子进行标准的Illumina库变性和样品上样操作。进行配对末端测序以覆盖插入物大小为200bp到300bp的扩增子的全长。
h11C5_C59Y/A43S亲和力成熟库的NGS数据分析
首先使用配对末端装配器PANDAseq装配配对末端测序数据(例如参见Masella等人,《BMC生物信息学(BMC Bioinformatics)》,13:31(2012))以获得完整的扩增子。然后对已鉴别的扩增子进行质量控制(QC)，其中检查每个扩增子的序列的插入或缺失和终止密码子，允许每个CDR序列最多只能携带一个NNK突变，并且不能携带非NNK突变。通过计算每个随机位置的所有突变的频率产生位置权重矩阵。如先前所描述(Koenig,等人,《生物化学杂志》),290(36):21773-27896(2015))，通过将分选样品中给定位置上给定突变的频率除以未分选样品中非常相同突变的频率来计算每个突变的富集率。对NGS数据的分析鉴别了在六个CDR的每一者中的广泛范围的氨基酸取代，其产生保持对hu-M-IL1RAP的高亲和力的抗IL1RAP抗体，并且其在下表11中列出。
表11：保持高亲和力IL1RAP结合的CDR氨基酸取代
Figure BDA0003013363900000871
对来自亲和力成熟库的NGS数据的进一步分析导致计算出的富集率提高和预测的变异体h11C5抗体的选定子集的亲和力改进，其中氨基酸取代预计表现出最高的亲和力改进，如下表12所示。
表12：富集率和预测的亲和力改进
Figure BDA0003013363900000881
具有亲和力成熟的VL或VH区的Fab变异体的Biacore分析
从具有高富集率的亲和力成熟的VL或VH库中鉴别出的突变被选择作为单、双或三重突变克隆到含有8XHis标签的哺乳动物Fab表达构建体中以产生Fab蛋白。将编码亲和力成熟的VL或VH区的质粒转染到Expi293F细胞(赛默飞世尔科技)中，使用1:1的HC:LC比例表达20-30mL。用HisPur Ni-NTA色谱柱纯化Fab蛋白，方法是用pH 7.2的1×磷酸缓冲盐水(PBS)稀释上清液1.5×，添加10mM咪唑，并且以分批模式结合到树脂2小时。在培育之后，将浆液装入柱中，并且用20柱体积(CV)的PBS+20mM咪唑洗涤树脂。用5CV PBS+250mM咪唑洗脱重组Fab分子。使用PD10脱盐柱(通用电气医疗集团)将纯化的Fab缓冲液交换到PBS中。
使用表面等离子共振(SPR)分析，使用BIACORETM8K仪器测定纯化的Fab对hu-M-IL1RAP的结合亲和力，所述Fab在VL或VH区含有选定的单、双和三重突变。简单来说，以2μL/min的流速将生物素捕获试剂(通用电气医疗集团)在HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20)中的1:4稀释液施加到芯片上。为了进行动力学测量，以10μL/min捕获5nM生物素化的hu-M-IL1RAP，以在第二个流动池(FC2)中获得～50个响应单位。保持FC1作为参考。接下来，在25℃或37℃下注入(流速：10μL/min)Fab蛋白在HBS-P缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005％表面活性剂P20)中从低(0.31nM)到高(20nM)的2倍连续稀释液。在使用
Figure BDA0003013363900000891
8K评估软件(1.1.1.7442版本)进行数据分析之前，记录传感图并进行参考和缓冲液相减。使用简单的一对一Langmuir结合模型计算缔合率(kon)和解离率(koff)。平衡解离常数(KD)被计算为koff/kon的比率。
结果
亲和力成熟的Fab变异体的Biacore亲和力结果概括在下表13中。许多变异体显示出改进的结合亲和力。将A51Y和W92I突变引入亲本序列的变异体K13，其亲和力比h11C5_C59Y/A43S的输入亲本Fab提高了9倍。
表13：具有VL或VH区突变的h11C5 Fab变异体的亲和力
Figure BDA0003013363900000901
Figure BDA0003013363900000911
具有改进的亲和力的组合VL和VH区变异体的Fab蛋白
表现出最大改进的KD值的Fab变异体选自VL区(K10、K13和K17)和VH区(H2和H3)变异体，以产生包含VL和VH区变异体的变异体。如上文所描述，对所得组合变异体进行了BIACORETMSPR分析，并且结果概括于下表14中。组合Fab变异体K10/H2、K13/H2和K13/H3表现出比h11C5_C59Y/A43S的输入亲本Fab高～12-13倍的亲和力。
表14：具有组合变异体VL和VH区的h11C5 Fab变异体的亲和力
Figure BDA0003013363900000912
实例9：亲和力成熟的抗IL1RAP抗体的分析
本实例说明基于细胞的阻断分析，其用于表征实例8中所描述的Fab和全长IgG形式的亲和力成熟的人源化抗IL1RAP抗体变异体的功能活性。
材料和方法
细胞系和HEK-Blue分析。如实例2所描述进行本实例9的细胞系和HEK-Blue相关分析。
全长h11C5 IgG变异体的产生。使用1:1的HC:LC比例，将编码重链或轻链的质粒转染到Expi293F细胞(赛默飞世尔科技)表达30mL。通过将上清液流过柱，用20柱体积(CV)的PBS+500mM NaCl洗涤，并且用20CV PBS平衡，用HiTrap MabSelect SuRe柱(通用电气医疗集团)纯化IgG。用5CV 0.1M乙酸+150mM NaCl(pH 3.0)洗脱IgG，并且紧接着用0.2CV 1.0MMOPS(pH 7)中和。在pH 6.5的2×PBS中使用S200制备级上浆柱(通用电气医疗集团)经由凝胶过滤进一步纯化IgG。
结果
进行具有实例8的亲和力成熟的Fab变异体以及全长IgG形式的变异体抗体的HEK-Blue分析(如用于实例4和7)，以确定观察到的对hu-M-IL1RAP的结合亲和力的改进是否与阻断IL-1、IL-33和IL-36信号传导活性的改进相关。如图5A、5B和5C所示，在实例8中显示出最大亲和力改进的九种Fab变异体(即，K10、K13、K17、K10/H2、K10/H3、K13/H2、K13/H3、K17/H2、K17/H3)在HEK-Blue分析中相对于h11C5_C59Y/A43S的亲本Fab也显示出对IL-1、IL-33和IL-36信号传导活性的抑制增加。九种亲和力成熟的Fab变异体在100nM下的效力(IC50)和％抑制概括于下表15中。
表15：亲和力成熟的h11C5 Fab变异体的抑制效力
Figure BDA0003013363900000931
还将相同亲和力成熟的变异体测定为具有无效应子N297G突变的全长IgG抗体。如图5D和5F所示，分别在利用IL-1β或IL-36α刺激的HEK-Blue IL-1/IL-33细胞或IL-33细胞(瞬时表达IL-36受体IL1RL2)的分析中观察到相似的结果。如图5E所示，然而，大多数但不是全部变异体都表现出对IL-33刺激的HEK-Blue IL-1/IL-33细胞的增加的阻断活性。全长IgG亲和力成熟的变异体在100nM下的效力(IC50)和％抑制概括于下表16中。
表16.亲和力成熟的h11C5 IgG变异体的抑制效力。
Figure BDA0003013363900000941
实例10：h11C5变异体的pH依赖性结合
本实例说明实例9的一些亲和力成熟的h11C5变异体在pH 6和pH 7.4下结合hu-IL1RAP和cyno-IL1RAP的动力学。为了延长11C5变异体在体内的半衰期，我们试图提高h11C5在pH 6下对新生Fc受体FcRn的亲和力(同时保持中性pH下的亲和力不变)。施用后，IgG首先被内化到细胞中，并且随后在内体中处理(参见例如,Kuo等人,《单克隆抗体》,3(5),422-430(2011)。内体的酸化促进IgG Fc片段与FcRn的结合，这是在低pH下的高亲和力相互作用(参见例如,Roopenian等人,《自然综述·免疫学(Nature ReviewsImmunology)》,7(9),715-725(2007)。在以复合物形式运输到细胞表面后，由于FcRn在中性pH下对Fc的亲和力较低，所以IgG被释放回到循环中。此循环过程保护IgG免受降解，从而有助于延长其在体内的半衰期。
通过使抗体循环到细胞表面并返回到循环中，在低pH下增加IgG对FcRn的亲和力的突变可能导致治疗性抗体在体内具有更长的半衰期。然而，IL1RAP对治疗性分子的靶介导的药物处置(TMDD)可能会阻止FcRn的再循环。在酸性pH下对IL1RAP具有相对较快的解离速率(“koff”)的h11C5变异体可能会限制TMDD的干扰，并且可最大限度地从增强FcRn结合的突变中受益。
为了确定实例9的哪个h11C5变异体在低pH下逃离TMDD的几率最大，我们在pH 7.4和pH 6下测量了结合IL1RAP的h11C5变异体的动力学。来自实例9的h11C5变异体K17/H2(或“YKD”)在四个测试的11C5变异体中在pH 6下具有最快的koff。此表明YKD具有逃离靶介导的药物处置(TMDD)的最大几率，并且因此可以最大限度地从FcRn结合突变中受益。
材料和方法
在pH 7.4和pH 6下对h11C5 IgG变异体进行BIACORE SPR分析：在pH 7.4下结合hu-M-IL1RAP(SEQ ID NO:3)和cyno-M-IL1RAP(SEQ ID NO:8)的四个h11C5 IgG变异体的BIACORETMSPR分析如实例8中所描述，其中在芯片上捕获0.6nM生物素化的hu-M-IL1RAP或1.8nM cyno-M-IL1RAP，并且将11C5 IgG的3倍连续稀释液从低(0.103nM)到高(10nM)作为分析物在37℃下注入。对于11C5变异体在pH 6下与hu-M-IL1RAP和cyno-M-IL1RAP的结合，方法与在pH 7.4下的结合相同，除了使用pH 6运行缓冲液(10mM MES pH 6、150mM NaCl、0.005％(w/v)P20)，其也用于以1:4稀释生物素捕获试剂(通用电气医疗集团)。
结果
在pH 7.4和pH 6下的BIACORE SPR分析的结果概括于表17中，其中KD是测得的表观亲和力(假定IgG是此形式的分析物)，并且koff是解离速率。
表17.在pH 7.4和pH 6下结合hu-M-IL1RAP和cyno-M-IL1RAP的h11C5变异体的BIACORE SPR动力学。
Figure BDA0003013363900000961
在pH 6下更快的h11C5变异体YKD的解离速率(即“相对于YIS的koff(6)比率”)表明，此变异体可能具有逃离靶介导的药物处置(TMDD)的最大几率。如果将h11C5-IL1RAP复合物内化并且在内体中处理，那么相对于其它h11C5变异体，YKD变异体将从IL1RAP解离最快。FcRn然后可以结合游离的h11C5并将其递送到细胞表面，从而使药物释放回到循环中。因此，h11C5变异体YKD可最大限度地从Fc区中的额外突变中受益，所述突变增加了在酸性pH下对FcRn的亲和力，但在中性pH下却没有增加。
实例11：具有YTE突变的h11C5变异体的产生
本实例说明产生h11C5变异体的方法和进一步表征所述变异体的方法，所述变异体促进在低pH下具有较高亲和力的IgG Fc片段与FcRn的结合。
材料和方法
具有YTE突变的抗体的产生：已知增加Fc片段对FcRn的亲和力的YTE三重突变M252Y/S254T/T256E(由Eu指数、YTE编号)(参见例如,Dall'Acqua等人,《免疫学杂志》169(9):5171-5180(2002))通过基因合成引入到实例9和10所描述的h11C5变异体的Fc部分中，以产生YKD/YTE和YIS/YTE。如实例5所描述产生重组抗体YKD/YTE和YIS/YTE。
具有YTE取代的11C5 IgG变异体的BIACORE SPR分析：在pH 7.4和37℃下，变异体h11C5抗体YIS、YIS/YTE、YKD和YKD/YTE对hu-M-IL1RAP和cyno-M-IL1RAP的BIACORETMSPR结合分析如实例10所描述来进行。
在pH 6.0和7.4下的FcRn结合分析：为了测定YKD和YKD/YTE对人类FcRn和cynoFcRn的结合亲和力，用BIACORETM8K仪器进行了SPR测量。简单来说，使用S系列传感器芯片CAP捕获生物素化的人类FcRn或cyno FcRn进行结合测量。以2μL/min的流速将生物素捕获试剂(通用电气医疗集团，目录号28-9202-34)在HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES pH7.4、0.15MNaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20)中的1:4稀释液施加到芯片上。以10μL/min捕获10nM生物素化的人类FcRn(Acro生物系统，目录号FCN-H52W7)或cyno FcRn(Acro生物系统，目录号FCM-C5284)，以在第二个流动池(FC2)中获得大约50个响应单位。保持第一流动池(FC1)作为参考。接下来，将YKD或YKD/YTE IgG在MES缓冲液(10mM MES pH 6.0、150mMNaCl、0.005％表面活性剂P20)或HBS-P缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005％表面活性剂P20)中的3倍连续稀释液从低浓度(1.37nM)到高浓度(1000nM)在25℃下以30μL/min的流速注入。在通过
Figure BDA0003013363900000971
8K评估软件(版本1.1.1.7442)进行评估之前，记录传感图并进行参考和缓冲液相减。
杆状病毒(BV)ELISA测定具有YTE突变的h11C5变异体的非特异性结合：通过如实例6所描述的BV ELISA评估YIS/YTE和YKD/YTE的非特异性结合，除了板是用PBS中的1％BSA(无0.05％Tween-20)阻断。
结果
具有YTE突变的抗体的产生：产生具有YTE取代的Fc片段，并且其氨基酸序列列于表2中并且在随附序列表中以SEQ ID NO:327提供。
具有YTE突变的h11C5变异体的BIACORE SPR分析：将YKD/YTE和YIS/YTE分别与其亲本分子YKD和YIS进行比较的结合{2}结果概括于表18中。
表18.结合hu-M-IL1RAP和cyno-M-IL1RAP的h11C5 YTE变异体的BIACORE SPR动力学。
Figure BDA0003013363900000981
KD是测得的表观亲和力(假定IgG是此实验形式的分析物)，并且koff是解离速率。YKD/YTE和YIS/YTE对hu-M-IL1RAP或cyno-M-IL1RAP的亲和力与其各自亲本分子的亲和力没有显著差异，如其2倍之内的KD值之比所示(“KD YTE/KD亲本”)。因此，可以得出结论，添加YTE取代不影响与IL1RAP的结合。
在pH 6.0和7.4下的FcRn结合分析：SPR测量用于测定在pH值为6.0和7.4时YKD和YKD/YTE对hu-FcRn和cyno-FcRn的结合亲和力。使用稳态分析来计算平衡解离常数(KD)值，以比较在pH 6.0和pH 7.4下YKD和YKD/YTE之间的人类FcRn和cyno FcRn结合。如表19所示，结果表明YKD/YTE在pH 6.0下明显改进人FcRn和cyno FcRn结合，但在pH 7.4下没有改进。
表19.在pH 6.0和7.4下测得的与人类和cyno FcRn结合的KD值
Figure BDA0003013363900000982
杆状病毒(BV)ELISA测定h11C5 YTE变异体的非特异性结合：如表20所示，YIS/YTE和YKD/YTE抗体在培养基对照抗体样品上方450nm处都不显示可检测的BV ELISA吸光度信号。因此，YTE突变的引入尚未引入对BV颗粒的非特异性结合。
表20.非特异性结合的BV ELISA分析
Figure BDA0003013363900000991
实例12：具有YTE突变的抗人类IL1RAP抗体的阻断活性的基于细胞的分析
本实例说明使用含有实例11中所描述的YTE突变的变异体抗人类IL1RAP抗体，在HEK-Blue报告和基于原代细胞的分析中IL-1、IL-33和IL-36路径的功能抑制。
材料和方法
细胞系和HEK-Blue报告细胞分析：如实例2和4所描述进行细胞系和HEK-Blue报告分析。
原代人NK细胞和相关分析：先前已经在实例7中描述和讨论了原代人NK细胞和相关分析，包括激动剂剂量反应和抗体阻断分析。本实例中的抗体阻断分析以相同的方式进行，但所使用的阻断抗体，即YKD/YTE和YKD除外(实例11中所描述)。已在实例7中描述了阴性和阳性对照。通过从使用所指示的抗体浓度获得的值中减去由阴性对照获得的值来计算抑制百分比。然后使用阴性对照调节值来确定相对于阳性对照的比率。如果阴性对照值不能内插(例如，在检测阈值以下)，那么抑制百分比反映使用所指示的抗体浓度获得的值相对于仅阳性对照的比率。人类细胞因子IL-33和IL-12是商业获得的(派普泰克(Peprotech))。
原代人肺成纤维细胞和相关分析：所使用的原代人肺成纤维细胞(PHLF)和相关分析如实例7所描述。阳性对照表示仅在激动剂(IL-1α或IL-36β)存在下的PHLF。抗体阻断分析在激动剂浓度接近或大于EC55下进行。阴性对照表示尚未暴露到激动剂或抗体的PHLF。如上文针对原代人NK细胞分析所描述计算抑制百分比。经处理产生完全成熟的细胞因子的人类IL-36β是自产的。人类IL-1α可商购获得(Gibco)。
原代人单核细胞和相关分析：如实例7所描述进行单核细胞分析，不同之处在于：将单核细胞接种在96孔板中，并且在实验使用前给予3小时的恢复时间(37℃，5％CO2)。
人表皮角质形成细胞和相关分析：从多个新生包皮中分离的人表皮角质形成细胞(收集的HEKn)获自赛默飞世尔科技(目录号13401)。根据通用制造商指导将HEKn细胞解冻并传代培养，并且维持在
Figure BDA0003013363900001001
培养基(目录号M-EPI-500-CA)中，所述培养基补充有1％人角质形成细胞生长补充剂(HKGS)(目录号S-001-5)和1×青霉素-链霉素溶液(康宁，目录号30-002-CI)。对于抗体阻断分析，将HEKn细胞解冻并且培养直到其达到80％汇合度。然后将细胞以10,000/孔接种在平底96孔板上，并且在37℃下在5％CO2下培育过夜(大约18小时)。过夜培育后，将HEKn细胞暴露到11C5-YKD、11C5-YKD/YTE或适当的抗体同种型对照(IgG Ctrl)溶液中，并且在37℃下在5％CO2下培育1小时，接着通过添加激动剂(EC60下的IL-36β)。阳性对照条件(PC)包括细胞、生长培养基和激动剂(IL-36β)。阴性对照条件(NC)仅包括细胞和生长培养基。加入激动剂后二十四小时收集组织培养物上清液，并且在-80℃下储存直到进行ELISA测定IL-8的水平。根据制造商的建议，使用人类IL-8ELISA试剂盒(英杰/赛默飞世尔科技)来量化上清液中IL-8的水平。在抗体阻断分析之前，如实例5中所描述，(分别)产生激动剂和拮抗剂的剂量-反应曲线以确定EC50和IC50。
嗜碱性细胞分析：根据PCT公开案第WO2016077381A1号中所描述的分析方法修改了以下方案，其以引用的方式并入本文中。PBMC是从在肝素钠(Stemcell Tech)中收集的外周全血中分离出来的。用PBS以1:1稀释血液。将30mL稀释的血液铺在15mL Ficoll PaquePremium(通用电气医疗集团17-5442-03)上，并且在20℃下在无制动的情况下以400g离心样品20min。将含有PBMC的层转移到50mL管中，并且用50mL PBS洗涤两次。将洗涤后的PBMC再悬浮到PBS中，稀释到2,000万个细胞/mL，并且以每孔100万个细胞(50μL)涂覆在v底96孔板中。将25μL连续稀释的抗体溶液以PBS中最终浓度的4倍添加到孔中，并且将板在37℃下在5％CO2下培育。60分钟后，将25μL浓度为PBS中最终浓度的4倍的IL-33(派普泰克200-33)添加到孔中(100μL最终体积)。将细胞在37℃下在5％CO2下培育20分钟，接着添加100μL预热的磷酸流式固定缓冲液I(Phosflow Fix Buffer I)(BD557870)。将板在37℃下在5％CO2下培育10分钟，然后在500g下离心5分钟。舍弃上清液，并且将细胞再悬浮到FACS缓冲液(PBS+0.5％BSA+0.05％叠氮化钠)中。将板在500g下离心5分钟，并且舍弃上清液。通过短暂涡旋板，将细胞沉淀再悬浮到残留体积中，并且向每个孔中缓慢添加100μL冰冷的磷酸流式Perm缓冲液II(BD 558052)。将板在-20℃下储存在Perm缓冲液II中过夜。第二天，将板在500g下旋转5分钟，并且用FACS缓冲液洗涤细胞两次。在室温下，将以下抗体在50μL FACS缓冲液中染色1小时：抗CD123 FITC(Ebiosciences 11-1239-42，以1:10稀释)、抗磷酸化p38PE(细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technology)6908S，以1:50稀释)、抗HLA-DRBV421(百进生物技术有限公司(Biolegend)307636，以1:20稀释)和抗CD203c APC(百进生物技术有限公司324610 1:200)。在一些孔中，同种型对照(细胞信号传导技术公司4752S)取代抗磷酸化p38 PE抗体，以促进对磷酸化p38阳性染色群体的门控。用FACS缓冲液洗涤细胞两次，再悬浮到FACS缓冲液中，并且在CytoFLEX流式细胞仪(贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter))上读数。使用Ultracomp珠(赛默飞世尔01-2222-41)制备补偿对照，并且与细胞并置。使用Flowjo软件(BD)在CD123+HLADR-嗜碱性粒细胞中分析了磷酸化p38染色。CD203c染色用于验证基于CD123+HLADR-门控的嗜碱性粒细胞的身份。使用GraphPad Prism 7软件分析了来自CD123+HLADR-嗜碱性粒细胞的磷酸化p38阳性数据％，以测定分析中的抗体IC50值。激动剂剂量反应与抗体剂量反应同时进行。用在基于先前实验所估测的EC50下的激动剂刺激具有抗体剂量反应的细胞。用在估测的EC50下的激动剂处理阳性对照，并且用PBS代替抗体溶液处理。用PBS代替抗体和激动剂溶液处理阴性对照。数据标绘为平均值±SD，每个浓度重复两次。
CD4 T细胞分析：以下方案基于Komai-Koma等人,《免疫生物学(Immunobiology)》,221(3):412-417(2016)中所描述的方法。将平底96孔板在4℃下用100μL的3μg/mL抗CD3抗体包被过夜(英杰16-0037-85)。如上文所描述，PBMC是从在肝素钠(Stemcell Tech)中收集的外周全血中分离出的。根据制造商的说明，使用阴性选择(美天旎生物技术公司130-096-533)从PBMC中分离CD4+T细胞。分离后，以500,000细胞/mL将细胞再悬浮到T细胞培养基(RPMI-1640、5％热灭活的人A/B血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、1×MEM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠)。包被有抗CD3的板用PBS洗涤一次，并且每孔添加50,000个CD4+细胞(100μL)。在T细胞培养基中以4×最终浓度连续稀释抗体，并且向每个孔中添加50μL抗体溶液。将板在37℃下在5％CO2下培育。一小时后，向每个孔中添加50μL以4×最终浓度的含有IL-33(派普泰克200-33)和IL-12(Peprotech 200-12)的T细胞培养基(总共200μL，10ng/mL最终浓度的IL-12)，并且将板放回培养箱。72小时后，使用常规的IFN-γELISA试剂盒(英杰88-7316-88)测量T细胞上清液中的IFN-γ水平。使用GraphPad Prism 7软件对数据进行插值和分析，以确定分析中的抗体IC50值。激动剂剂量反应与抗体剂量反应同时进行。用在基于先前实验所估测的EC50下的激动剂刺激具有抗体剂量反应的细胞。用在估测的EC50下的激动剂并且用T细胞培养基代替抗体溶液来处理阳性对照。用T细胞培养基代替抗体和IL-33来处理阴性对照，而IL-12的最终浓度保持为10ng/mL。抑制百分比的计算方法是：峰值抗体浓度下的反应减少量除以总反应量值：％抑制百＝100％*(阳性对照-处理后的抗体)/(阳性对照-阴性对照)。数据标绘为平均值±SEM，每个抗体浓度重复三次。
结果
在HEK-Blue分析中IL-1、IL-33和IL-36路径的功能抑制：为了证实通过添加YTE突变没有改变h11C5变异体YKD的阻断效力和功效，如实例2和4中所描述进行HEK-Blue IL-1/IL-33/IL-36阻断分析中YKD和YKD/YTE的功能抑制的比较。如图6A、6B和6C所示，YKD(“11C5-YKD”)和YKD/YTE(“11C5-YKD/YTE”)在IL-1β、IL-33和IL-36β刺激的细胞中显示出相似的阻断活性。用IL1β刺激的细胞YKD和YKD/YTE分别在100nM、97％和98％下具有相同的效力(IC50＝0.51nM)和几乎完全的抑制。对于IL-33刺激的HEK-Blue细胞，YKD和YKD/YTE均表现出约3nM的效力(11C5-YKD IC50＝3.15nM；11C5-YKD/YTE IC50＝3.3nM)，其中在100nM下几乎完全被抑制(分别对YKD和YKD/YTE抑制95％和97％)最后，当用IL-36β刺激HEK-Blue细胞时，在100nM下两个分子均以0.9nM(IC50)的效力抑制98％或更高。总之，在HEK-BlueIL-1、IL-33和IL-36分析中，人源化变异体抗hu-IL1RAP抗体YKD和YKD/YTE表现出相当的效力并且几乎完全阻断了SEAP的产生。
YKD/YTE和YKD抑制原代细胞中的IL-1、IL-33和IL-36活化：如实例7所描述，HEK-Blue报告细胞系可以提供快速分析以确定IL-1、IL-33和IL-36路径活化后11C5变异体的阻断活性。h11C5变异体的阻断活性的进一步表征是使用基于原代人细胞的实验在具有更多生理相关性的分析中进行的。除了实例7中所描述的原代细胞分析，本实例包括利用人表皮角质形成细胞(HEKn)、嗜碱性粒细胞和CD4 T细胞的功能抑制分析。
利用人单核细胞(PHMO)和PHLF中的分析来证实YKD和YKD/YTE在阻断原代人细胞中的IL-1路径方面具有相当的效力和功效。如图7所示，当在YKD或YKD/YTE存在下用IL-1β刺激原代人单核细胞(PHMO)时，观察到IL-6产生的完全抑制。两种抗体均表明相似的效力(对于YKD和YKD/YTE，IC50分别为63pM和158pM)。在YKD/YTE、YKD或同种型对照存在下，用IL-1α(EC55)刺激PHLF。如图8中的标绘图所示，在IL-1α刺激的PHLF中，h11C5抗体变异体的存在均导致IL-8产生的抑制作用几乎完全被抑制(对于YKD/YTE和YKD分别为98％和99％)，对于两种观察到相似的IC50值的抗体(对于YKD/YTE和YKD的IC50分别为6.47nM和9.10nM。总之，分析结果表明YKD/YTE和YKD表现出相当的功效和效力，包括在IL-1β刺激的PHMO中完全抑制IL-6的产生，并且完全阻断了在IL-1α刺激的PHLF中IL-8的产生。
在HEKn细胞和PHLF中的分析用于验证YKD/YTE和YKD在阻断IL-36路径方面表现出相当的效力和功效。已知IL-36受体和其受体辅助蛋白(IL1RAP)在人角质形成细胞上表达(参见例如,Ding等人,Oncotarget,9(2)2895-2901(2017))。用IL-36β刺激的HEKn细胞产生IL-8，其可以通过标准ELISA在上清液中检测到。为了确定YKD/YTE和YKD是否可以阻断IL-36β刺激的HEKn细胞中IL-8的产生，将HEKn细胞与YKD/YTE、YKD或同种型对照(IgG ctrl)的连续稀释液一起培育。如图9所示，YKD和YKD/YTE均表明IL-8产生的完全抑制(100％)。两种变异体均表现出相似的效力，其中对于YKD和YKD/YTE，IC50值分别为1.39nM和1.16nM。如图10所示，当测试YKD/YTE和YKD阻断IL-36β刺激的PHLF中IL-8产生的能力时，均表现出对IL-8产生的完全抑制。此外，两种抗体变异体均具有相似的抑制效力(对于YKD/YTE和YKD，IC50分别为0.50nM和0.39nM)。总之，YKD/YTE和YKD在阻断IL-36β刺激的HEKn细胞和IL-36β刺激的PHLF中IL-8的产生方面具有相当的功效和效力。
分析还证实YKD/YTE可以阻断原代人NK细胞、嗜碱性粒细胞和CD4+T细胞中的IL-33路径。如实例7所描述，与仅暴露到IL-12的NK细胞不能产生可检测的IFN-γ不同，在IL-12存在下用IL-33刺激的原代人NK细胞产生IFN-γ。如图11所示，在用同种型对照抗体培育的NK细胞上清液中可检测到IFN-γ，但用YKD/YTE或YKD处理人NK细胞阻断几乎所有IFN-γ的产生(对于YKD/YTE和YKD，抑制分别为96％和97％)。观察到的两种抗体的IC50值分别为对于YKD/YTE为1.32nM并且对于YKD为2.93nM。在哮喘患者的肺中观察到嗜碱性粒细胞数量增加(参见例如,Schwartz等人,《欧洲药理学杂志(European Journal of Pharmacology)》,778:90-95(2016))。测试了YKD/YTE阻断IL-33刺激嗜碱性粒细胞的能力。IL-33对PBMC的刺激导致嗜碱性粒细胞中p38 MAPK磷酸化。将PBMC与YKD/YTE培育一小时，接着在估测的EC50下用IL-33刺激20分钟。如图12中的结果所示，YKD/YTE以在激动剂EC56处的41nM的IC50基本上完全阻断了嗜碱性粒细胞中的p38磷酸化(99％抑制)。为了检查CD4+T细胞中YKD/YTE的功效和效力，CD4+T细胞用IL-33和IL-12共同刺激，并且分析了IFN-γ产生。将CD4+T细胞与YKD/YTE培育一小时，接着用10ng/mL的IL-12和在估测的EC50下的IL-33刺激。如图13所示，YKD/YTE以在激动剂EC34处的44nM的IC50几乎完全阻断了IFN-γ产生(89％抑制)。总之，YKD/YTE和YKD在IL-33刺激的原代人NK细胞中表明相似的阻断效力和功效。此外，YKD/YTE完全阻断了IL-33诱导的嗜碱性粒细胞中p38 MAPK的磷酸化并且几乎完全阻断了IL-33刺激的CD4+T细胞中FN-γ的产生。
因此，本实例12的结果表明YKD/YTE和YKD阻断了细胞系(HEK-Blue报告细胞系)中的IL-1、IL-33和IL-36活化和所描述的所有原代人细胞分析。结果包括PHLF和PHMO中的IL-1活化、NK细胞、嗜碱性粒细胞和CD4 T细胞中的IL-33活化以及PHLF和HEKn中的IL-36活化的几乎或完全阻断。此外，YKD/YTE和YKD在所进行的所有功能分析中均表现出相当的功效和效力。
实例13：抗人类IL1RAP抗体变异体的细胞毒性缺乏
本实例说明抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的分析，其表明抗人类IL1RAP抗体YKD/YTE、11C5-N297G和YKD缺乏细胞毒性。
材料和方法
试剂：分析中使用的抗体是：YKD/YTE(如实例11中所描述)；YKD(如实例8中所描述)；11C5-N297G(如实例5和7中所描述，含有N297G突变的亲本11C5分子)；11C5 wt(缺乏N297G突变和增加亲和力的YKD突变的亲本11C5分子)；同种型对照hIgG1(N297G)；和作为已知具有细胞毒性活性的阳性对照抗体的抗CD20抗体利妥昔单抗(Rituximab)(加利福尼亚州南旧金山的基因泰克公司(Genentech,South San Francisco,CA))。利用以下细胞系：Jurkat、Daudi和THP-1(弗吉尼亚州马纳萨斯的ATCC)。PBMC、原代人嗜中性粒细胞和原代人单核细胞获自干细胞技术有限公司。Jurkat细胞系由于其显著的IL1RAP表达而被用作对照。表达CD20的Daudi细胞系用作其它阳性对照，并且用作抗CD20抗体利妥昔单抗的靶细胞系。
ADCC分析：为了确定YKD/YTE和相关分子是否显示ADCC活性，将NK细胞用作靶细胞的效应细胞，所述靶细胞由单核细胞、嗜中性粒细胞或Jurkat细胞组成。效应子：将8:1的靶(E:T)比率应用到分析。用细胞印迹紫色(CellTrace Violet)染色(英杰)标记靶细胞。标记后，将靶细胞(96孔板中每孔1×104个细胞)与所指示的抗体以四种不同浓度混合，并且然后在RPMI完全培养基中进一步与NK细胞(96孔板中每孔8×104个细胞)混合。反应在37℃下进行5小时。培育后，将细胞用PBS洗涤一次，并且然后用碘化丙啶(PI)(生命技术公司)染色15分钟。然后使用CytoFLEX流式细胞仪(贝克曼库尔特公司)和Flowjo软件(BD)分析细胞。基于细胞印迹紫色的活靶细胞群中PI染色细胞的百分比来计算细胞死亡。
CDC分析：为了确定YKD/YTE和相关分子是否显示CDC活性，使用Quidel(目录号A113，加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,Calif.))的正常人血清作为细胞毒性效应子，并且将20％血清应用到分析培养基。用细胞印迹紫色染色标记靶细胞(人单核细胞、嗜中性粒细胞和Jurkat细胞)。标记后，将靶细胞(每孔5×104个细胞，96孔板)与所指示的抗体以四种不同浓度混合，并且然后在AIM-V培养基CTSTM(目录号0870112-DK，生命技术公司)中与正常人血清(最终浓度为20％)进一步混合。将反应在37℃下培育1小时。培育后，将细胞用PBS洗涤一次，并且然后用PI染色15分钟。如先前针对ADCC分析所描述，使用流式细胞仪分析细胞样品，并且确定细胞死亡(细胞毒性)百分比。
ADCP分析：为了确定YKD/YTE和相关分子是否存在ADCP活性，将人类THP-1衍生的巨噬细胞用作效应细胞，其中靶细胞由人单核细胞、嗜中性粒细胞、Jurkat或Daudi细胞组成。THP-1细胞用佛波醇肉豆蔻乙酸酯(PMA)(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich))处理两天，并且然后进一步用IFN-γ(50ng/ml)和脂多糖(LPS)(西格玛奥德里奇)刺激。ADCP反应的E:T比率为2:1。用细胞印迹紫色染色标记靶细胞(人单核细胞、嗜中性粒细胞、Jurkat或Daudi细胞)，并且用PKH26标记试剂盒(目录号PKH26PCL-1KT，西格玛)标记THP-1细胞。标记后，将靶细胞(96孔板中每孔5×104个细胞)与所指示的抗体以四种不同浓度混合，并且然后在RPMI完全培养基中进一步与THP-1衍生的巨噬细胞(96孔板中每孔1×105个细胞)混合。将反应在37℃下培育5小时。培育后，通过流式细胞仪分析细胞的细胞印迹紫色荧光(PB450通道以鉴别靶细胞)和PKH26荧光(PE通道以鉴别THP-1衍生的巨噬细胞效应细胞)。细胞吞噬作用由双重荧光的细胞指示，即，在PB450和PE通道中均观察到荧光。噬菌作用率计算为标记的靶细胞上具有双重荧光的细胞数量。
结果
IL1RAP在人血细胞(如嗜中性粒细胞和单核细胞)中表达，因此确定抗IL1RAP抗体(如YKD/YTE)表现出ADCC、CDC或ADCP活性的程度，其中每种都可能在体内引起细胞毒性，这对于进一步临床开发是至关重要的。如上文所描述进行测定YKD/YTE的ADCC、CDC或ADCP活性程度的分析。如表21(下文)中所概括，抗IL1RAP抗体11C5-N297G、YKD、YKD/YTE在分析中没有显示细胞毒性活性。(“+”指示阳性细胞毒性，“-”指示无细胞毒性)。
表21.ADCC、CDC或ADCP细胞毒性活性结果
Figure BDA0003013363900001061
如表21中的结果所示，YKD/YTE、11C5-N297G和YKD对人单核细胞和中性粒细胞或Jurkat细胞没有细胞毒性作用。如通过CDC或ADCP分析所测量，缺乏消除效应子功能的N297G突变的亲本分子11C5 wt未表现出细胞毒性，但在ADCC分析中却表现出一些弱的活性。在这三种分析中，阳性对照抗体利妥昔单抗显示出预期的细胞毒性活性水平(数据未显示)。总之，抗IL1RAP抗体YKD/YTE、11C5-N297G和YKD通过评估ADCC、CDC和ADCP活性的分析未显示出细胞毒性活性。
实例14：变异体抗人类IL1RAP抗体的药代动力学
本实例说明在食蟹猴中进行的研究，以表征YKD和YKD/YTE的药代动力学(PK)，其为具有改进与FcRn的结合亲和力的Fc区中的变化的YKD的变异体。研究1和2检查了单次静脉内(IV)剂量在1-40mg/kg范围内的YKD的PK，以表征抗体在广泛剂量范围内的PK并且量化潜在靶介导的清除机制。研究3检查了在食蟹猴中在3-40mg/kg范围内的单次静脉内IV剂量下的变异体YKD/YTE的PK，以确定YTE突变对YKD药代动力学的影响。
材料和方法
研究设计和药代动力学采样时间表：进行了两项研究(1和2)来检查食蟹猴中YKD的PK。进行另一项研究3以检查YKD/YTE的PK。所有研究均采用静脉内给药。将测试物品在pH5.5下的200mM精氨酸琥珀酸盐中调配。在以下时间点通过每只动物的头静脉收集血液：给药前、10分钟、2h、8h以及第1、2、4、7、10、14、17、21、24、28天。PK样品被处理成血清。研究设计的概述显示于表22(下文)中。
表22.PK研究1、2和3的实验设计概述。
Figure BDA0003013363900001071
用于测量药物浓度的生物分析测定：使用ELISA分析测量猴子血清中IL1RAP特异性抗体的浓度，所述ELISA分析使用从7个标准品产生的标准曲线进行校准，其工作范围为50到0.78ng/mL，再加上0.2％猴血清基质中的零标准品。在0.2％的猴血清中以40ng/mL、8ng/mL和2ng/mL的浓度制备QC样品。将人类IL1RAP蛋白的胞外结构域(SEQ ID NO:3)包被在微量滴定板上，并且然后用于从给药样品、校准标准品和质量控制样品中捕获抗IL1RAP抗体。捕获的抗IL1RAP抗体是通过与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗人类IgG多克隆抗体检测的。添加生色底物四甲基联苯胺(TMB)与HRP反应。然后用酸性溶液终止反应，以达到与每个孔中捕获的抗IL1RAP的量成正比的吸光度信号。使用加权4参数对数(4PL)模型拟合校准标准品的信号强度和其各自的标称浓度，以生成校准等式。使用所述等式，由重复测定的平均值计算每个样品中抗IL1RAP的浓度。
药代动力学分析的方法：合并研究1和2的数据以估测YKD的PK参数。研究3的数据用于估测YKD-YTE的PK参数。使用PK/PD建模软件ADAPT V(D'Argenio,D.Z.等人,《ADAPT 5用户指南：药代动力学/药效动力学系统分析软件,生物医学仿真资源(ADAPT 5 User'sGuide:Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Systems Analysis Software,BiomedicalSimulations Resource)》,加利福尼亚州洛杉矶(Los Angeles,CA.)(2009))进行隔室建模和参数估算。对于每个剂量组，首先生成组平均浓度-时间曲线；然后将来自多个剂量组的组平均浓度-时间曲线同时拟合到各种候选模型结构。基于目视检查中没有显著的性别差异，将来自两个性别的数据合并以计算组平均浓度-时间曲线。所有可分析报告的PK数据都包括在隔室数据分析中。
使用Akiake信息准则(AIC)指导模型选择。使用最大似然估计方法估测参数(D'Argenio,D.Z.,等人,《ADAPT 5用户指南：药代动力学/药效动力学系统分析软件,生物医学仿真资源》,加利福尼亚州洛杉矶(2009))。发现图14A中所描绘的非线性二室模型描述的组平均值数据最好。
结果
YKD和YKD/YTE的组平均血清浓度的时间分布分别示于图14B和图14C中。对于两种抗体，低剂量的浓度下降速度相对于高剂量更快，表明在1-40mg/kg剂量范围内非线性PK，可能是由于与靶IL1RAP结合所致。如上文所描述，组平均值数据适合于非线性二室模型并在图14A中示出。表23(下文)中概括了抗人类IL1RAP抗体YKD和YKD-YTE的所得PK参数估算值。
表23.11C5-YKD和11C5-YKD/YTE的PK参数估算值。
Figure BDA0003013363900001081
变异体抗hu-IL1RAP抗体YKD的线性清除率(CLt)和t1/2分别为6.3mL/天/kg和7.4天。这些值在食蟹猴中IgG1的预期范围内。与YKD相比，抗hu-IL1RAP抗体变异体YKD/YTE表现出降低的CLt(4.9mL/天/kg)和增加的t1/2(11.9天)，表明YKD/YTE变异体相对于YKD在食蟹猴中具有改进的PK特性。
实例15：抗人类IL1RAP抗体的表位残基作图
本实例说明使用噬菌体展示技术，结合下一代测序(NGS)来鉴别对于结合h11C5变异体、K13/H3(或“YIS”)和K17/H3(或“YKS”)而言重要的人类IL1RAP残基的方法。将人类IL1RAP变异体库展示在噬菌体上，并且对库进行针对YIS、YKS或参考抗体的噬菌体淘选。纯化保留与抗体结合的携带人类IL1RAP变异体的噬菌体，并且通过NGS获得人类IL1RAP序列。鉴别对ILS或YKS结合有害但对参考抗体结合无害的人类IL1RAP上的突变，并且将其定义为表位残基。
材料和方法
选择从Ser21到Lys350的人类IL1RAP的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)以在噬菌体上展示。如实例2(上文)的表5中所描述，11C5结合人类IL1RAP的结构域三。因此，通过使用仅在IL1RAP的结构域三(SEQ ID NO:1的Lys 238至Lys 350)中编码所有20个氨基酸的NNK简并密码子的残基随机化，构建展示人类IL1RAP的变异体的噬菌体库。如实例8所描述进行诱变，不同之处在于将诱变寡核苷酸设计为在库的每个成员中的人类IL1RAP结构域三残基中仅发生一个NNK突变。将所得的库DNA电穿孔到大肠杆菌XL1细胞中，产生大约4.6×109个转化体。
如实例8所描述进行第一轮噬菌体淘选，不同的是将1μg/mL的变异体抗体YIS、YKS或结合到人类IL1RAP结构域一(SEQ ID NO:4)的参考抗体包被在Maxisorp板上。结合到人类IL1RAP结构域一的参考抗体在鉴别突变过程中起对照作用，所述突变对人类IL1RAP的一般折叠是有害的，但不一定对11C5抗体与人类IL1RAP结构域三的结合有害。
如实例8所描述进行第二轮至第四轮噬菌体淘选，除了将阻断的噬菌体库用浓度降低的生物素化的YIS、YKS或参考抗体培育1小时。在阻断的中性亲和素包被的板上捕获抗体结合的噬菌体，用洗涤缓冲液充分洗涤，并且以与第1轮相同的方式洗脱和中和。
使用如实例8所描述的NGS提取初始噬菌体库(未分选的样品)和第2到4轮的淘选(分选的样品)的序列，不同之处在于针对NGS产生了人类IL1RAP结构域三扩增子。
在NGS之后，如实例8所描述进行配对末端测序数据汇总和测序读段的质量控制。将第2轮到第4轮的噬菌体淘选的读段合并在一起以进行数据分析。通过计算每个随机位置的所有突变的频率产生位置权重矩阵。如实例8所描述，通过将分选样品中给定位置处给定突变的频率除以未分选样品中极其相同的突变的频率来计算每个突变的富集率。
结果
NGS数据用于分析在人类IL1RAP结构域三的每个氨基酸位置处的取代对YIS或YKS结合的影响。小于零的富集率表明氨基酸取代对YIS、YKS或参考抗体的结合有害。NGS数据还用于标记人类IL1RAP结构域三残基的取代，所述取代对参考抗体的结合无害，但对YIS或YKS的结合有害。人类IL1RAP结构域三残基位置(其中观察到大量标记的取代)可能是YIS或YKS结合表位的一部分，因为对结构域三应用了残基随机化并且不应影响结合到人类IL1RAP结构域一的参考抗体。
如图15所示，当经鉴定的IL1RAP表位残基被映射到人类IL-1β、IL-1R1和IL1RAP三元复合物(PDB:3O4O)的晶体结构上时，其分布成簇并且位于IL1RAP与IL-1β和IL-1R1的二元复合物之间的结合界面处。因此，本实施例的表位数据为本公开的抗hu-IL1RAP抗体(如YIS或YKS)的结合如何能够阻断三元复合物的形成并且由此抑制下游胞内信号传导事件提供了结构上的解释。此外，鉴于IL1RAP与IL-33/ST2之间的结构相互作用的总体相似性(Günther等人,《免疫》,47:510-523(2017))或IL-36/IL1RL2(Yi等人,《生物化学杂志(TheJournal of Biological Chemistry)》,291(32):16597-16609(2016))，本实例的表位数据也支持本公开的抗IL1RAP抗体(如YIS和YKS)也阻断这两种路径的能力的可能的结构上的解释。
表24显示了在人类IL1RAP结构域三位置处观察到的相对数目的标记取代(+++：等于或大于9个标记取代；++：6～8个标记取代；+：3～5个标记取代；-：少于3个标记取代)。具有大量标记取代的残基被认为更可能是表位的一部分。
表24.IL1RAP结构域三结合的标记取代
Figure BDA0003013363900001111
Figure BDA0003013363900001121
如在表24中列出的结果所证明，高亲和力抗体11C5结合到人类IL1RAP残基的表位主要在D3结构域内的位置243-255、位置257-268和位置333-336处。这些位点中的大多数在IL1RAP的结构域3的表面上聚集在一起(参见图15)。这些不连续的残基被映射到主要的补丁，所述主要的补丁被认为是如本文所公开的抗体11C5和其变异体的表位。
实例16：替代抗小鼠IL1RAP抗体的产生
本实例说明使用小鼠杂交瘤技术来产生抗mu-IL1RAP抗体，抗mu-IL1RAP抗体14F4的表征，以及将所述替代抗体用于体内小鼠研究的方法。
材料和方法
免疫和融合：IL1RAP敲除小鼠(杰克逊实验室，仓储号003284)用25μg/免疫/小鼠的mu-M-IL1RAP-D3(具有残基边界K239-T368的mu-IL1RAP结构域3)免疫三次(SEQ ID NO:337)。使用25μg全部/免疫/小鼠与mu-M-IL1RAP的1:1混合物对每只小鼠进行五次后续免疫(与C端6×组氨酸标签融合的胞外部分)(SEQ ID NO:9)和mu-M-IL1RAP-D3(SEQ ID NO:337)。西格玛佐剂系统(西格玛-奥德里奇)用于所有免疫。然后给与小鼠增效25μg/小鼠的mu-M-IL1RAP和mu-M-IL1RAP-D3的1:1混合物(不含佐剂)。三天后，收获脾脏并根据标准方案进行处理。按照标准方案使用PEG将脾细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞(ATCC)融合，并且涂覆到96孔板中。使用补充有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷来选择亲本杂交瘤。
ELISA分析：培养12-14天后，收集杂交瘤上清液，并且通过ELISA用在PBS中包被1μg/mL mu-M-IL1RAP的96孔板进行初步筛选。将杂交瘤上清液(65μL/孔)在室温下在包被的板上培育至少1小时，并且用洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的PBS)将板洗涤三次。添加山羊抗小鼠Fc-HRP二级抗体(杰克逊免疫研究，在PBS中按1:5000稀释)(65μL/孔)，并且在室温下培育1小时。用洗涤缓冲液洗涤三次后，添加1-Step Ultra TMB ELISA底物显影液(赛默皮尔斯科学(Thermo Pierce Scientific)，65μL/孔)，并且在室温下培育20分钟。在不淬灭显影剂的情况下读取650nm下的吸光度。
将在初级ELISA筛选中呈阳性的亲代杂交瘤在含有次黄嘌呤-胸苷的培养基中扩增至24孔板，并且如实例2中所描述使用以1μg/mL包被的mu-M-IL1RAP进行验证性ELISA筛选。使用有限稀释以0.5个细胞/孔的密度亚克隆感兴趣的杂交瘤克隆，并且使用细胞沉淀测定每个抗体克隆的重链和轻链序列(在下文中描述)。
14F4的测序和重组生产：如实例3所描述测定杂交瘤衍生的抗mu-IL1RAP抗体的序列。重组抗mu-IL1RAP抗体14F4如实例5所描述产生。
重组14F4结合mu-IL1RAP的BIACORE SPR分析：使用BIACORETM8K仪器，使用表面等离子体共振(SPR)分析来测定14F4对mu-IL1RAP的结合亲和力。为了进行动力学测量，将重组14F4在HBS-P缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005％表面活性剂P20)中稀释到10μg/mL，并且以10μL/min在第二个流动池(FC2)中捕获在抗小鼠芯片(通用电气医疗集团)上。保持FC1作为参考。接下来，在37℃下注入mu-M-IL1RAP在HBS-P中从低(0.14nM)到高(100nM)的3倍连续稀释液(流速：30μL/min)。芯片在每次分析物注入之前使用60mM盐酸(流速：90μL/min)再生两次。在使用
Figure BDA0003013363900001131
8K评估软件(1.1.1.7442版本)进行数据分析之前，记录传感图并进行参考和缓冲液相减。使用简单的一对一Langmuir结合模型计算缔合率(kon)和解离率(koff)。平衡解离常数(KD)被计算为koff/kon的比率。
用于确定重组14F4的非特异性结合的BV ELISA：如实例11所详述，使用14F4进行BV ELISA以确定非特异性结合的程度。
IL1RAP特异性结合活性的分析：为了确定14F4对hu-IL1RAP和mu-IL1RAP不同结构域的特异性，如先前在实例2中所描述使用ELISA，其中下列蛋白质分别以1μg/mL被包被：mu-M-IL1RAP(SEQ ID NO:337)、mu-M-IL1RAP-D1D2(结构域1-2，S21-P237)(SEQ ID NO:338)、hu-M-IL1RAP(SEQ ID NO:3)、hu-M-IL1RAP-D1(结构域1，S21-Q133)(SEQ ID NO:4)和hu-M-IL1RAP-D3(结构域3，K238-T367)(SEQ ID NO:6)。在10nM的浓度下分析重组14F4。
结果
抗mu-IL1RAP抗体的产生：在免疫IL1RAP敲除小鼠并随后收获脾细胞后，通过ELISA筛选亲本杂交瘤(经由PEG融合产生)以结合到mu-M-IL1RAP(SEQ ID NO:9)。初步ELISA分析筛选共鉴别了来自杂交瘤的17种抗小鼠IL1RAP结合剂，在扩展到24孔板后，通过ELISA进一步证实了其与mu-M-IL1RAP结合。按照实例2中所描述在HEK-Blue SEAP分析中筛选所有17种上清液后(数据未显示)，基于其阻断所有三种路径(IL-1、IL-33和IL-36)的能力选择14F4。选择克隆14F4进行杂交瘤细胞的VL和VH区的测序、重组表达和纯化。
结合到mu-IL1RAP的重组14F4的动力学：如表25所示，重组14F4与mu-M-IL1RAP(SEQ ID NO:9)结合，其中KD＝0.219nM。
表25.结合到mu-IL1RAP的重组14F4的BIACORE SPR结果
Figure BDA0003013363900001141
非特异性结合的BV ELISA结果：如表26所示，重组14F4没有显示出BV ELISA信号大于培养基对照，表明14F4不具有对BV颗粒的非特异性结合。
表26.重组14F4显示没有杆状病毒(BV)ELISA的非特异性结合。
Figure BDA0003013363900001142
IL1RAP特异性结合活性的分析：如表27所示，重组抗mu-IL1RAP抗体14F4显示不与人类IL1RAP结合，但显示了mu-M-IL1RAP(SEQ ID NO:9)与mu-M-IL1RAP-D1D2(SEQ ID NO:338)之间相当的结合，表明14F4与鼠IL1RAP结构域1或结构域2特异性结合。
表27.结合到mu-IL1RAP和hu-IL1RAP结构域的14F4的ELISA分析
Figure BDA0003013363900001151
实例17：替代抗小鼠IL1RAP抗体14F4的IL1RAP阻断活性的基于细胞的分析
本实例说明抗mu-IL1RAP替代抗体14F4在小鼠细胞系或原代小鼠细胞中阻断所有三个路径(IL-1介导、IL-33介导和IL-36介导)的能力。
材料和方法
NIH-3T3细胞和相关分析：小鼠成纤维细胞细胞系NIH-3T3可商购(ATCC CRL-1658)。根据制造商的指导，利用标准生长培养基将NIH-3T3细胞维持在由DMEM(康宁10-013-CV)组成的培养物中，补充有10％胎牛血清(FBS；亚特兰大生物试剂公司(AtlantaBiologicals))、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素、1X非必需氨基酸(Gibco 11140-050、100×溶液)和1×Glutamax(Gibco 35050-61，100×溶液)。小鼠IL-1β(派普泰克)和IL-36α(百进生物技术有限公司)是商业获得的。
抗体阻断分析和激动剂剂量反应曲线以与实例7中所描述类似的方式进行，其中进行一些修改以考虑本实例的条件。简单来说，在实验使用的前一天，将NIH-3T3细胞以一定浓度接种到平底96孔板上，所述浓度将在使用当天产生～80-85％的汇合度。在分析当天，用NIH-3T3细胞将替代抗体14F4或同种型对照培育1小时(37℃，5％CO2)，接着添加激动剂(IL-1β或IL-36α)。使实验再进行24小时(37℃，5％CO2)。收集所有培养物上清液，并且根据制造商的指导通过ELISA(赛默飞世尔科技)测定IL-6产生的水平。对于所描述的所有抗体阻断分析，以EC85或更高的激动剂浓度来刺激NIH-3T3细胞。阳性对照由仅具有生长培养基和激动剂的NIH-3T3细胞组成(不存在抗体)，而阴性对照样品仅由具有生长培养基的NIH-3T3细胞组成(不存在激动剂刺激和抗体)。
J774-Dual细胞和相关分析：J774-Dual细胞衍生自小鼠J774.1巨噬细胞样细胞系。这些细胞已经工程改造为表达NF-κB报告基因，即分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)。J774-Dual细胞是可商购的，并且获自英潍捷基(目录号j774d-nfis)。根据通用制造商的指导解冻J774-Dual细胞，并且维持在细胞培养基中，所述细胞培养基包括：DMEM(2mM L-谷氨酰胺、3.7g/L碳酸氢钠、4.5g/L葡萄糖和1.0mM丙酮酸钠)与10％热灭活的胎牛血清(在56℃下30min)、100μg/ml新霉素(英潍捷基(目录号ant-nr-1)、1×青霉素-链霉素溶液并且补充有选择抗生素杀稻瘟菌素(英潍捷基目录号ant-bl-1))和博莱霉素(英潍捷基目录号ant-zn-1)。为了进行抗体阻断分析，将J774-Dual细胞在无选择抗生素(杀稻瘟菌素和博莱霉素)的细胞培养基中培养，直到细胞达到80％汇合度为止。然后将细胞以50,000/孔涂覆在平底96孔板上，并且在37℃下在5％CO2下培育过夜(约18小时)。在添加激动剂之前，将14F4与J774-Dual细胞培育1小时(EC55下的小鼠IL-33，派普泰克，目录号1209434)。将细胞在37℃下用5％CO2进一步培育二十四小时。使用实例2中所描述的SEAP检测分析量化上清液中的SEAP产生。阳性对照条件(PC)包括细胞、生长培养基和激动剂(IL-33)，而阴性对照条件(NC)仅包括细胞和生长培养基。使用GraphPad Prism 7软件分析数据，并且进行非线性回归分析以确定激动剂EC50值。在抗体阻断分析之前，如实例5中所描述，(分别)产生激动剂和拮抗剂的剂量-反应曲线以确定EC50和IC50。
原代小鼠胚胎成纤维细胞和相关分析：原代小鼠胚胎成纤维细胞(原代MEF)获自龙沙(目录号M-FB-481)。这些原代细胞从交配后的第14天和15天CD-1小鼠胚胎解离，在培养物中扩增，并且然后由制造商冷冻保存。按照由制造商提供的指导，将细胞解冻并且使用具有4.5g/L葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠(康宁，目录号10-013-CV)的DMEM维持在培养物中，所述DMEM补充有10％热灭活胎牛血清(亚特兰大生物试剂公司，目录号S11150H)、10IU青霉素和10μg/mL链霉素(康宁，目录号30-002-CI)。小鼠IL-36β获自百进生物技术有限公司(目录号#554506)。
如实例7所描述进行激动剂剂量反应曲线和抗体阻断分析，其中进行如下文所提及的修改。简单来说，将原代MEF以15,000个细胞/孔的密度涂覆在前述生长培养基中的平底96孔板上。将细胞在37℃下用5％CO2培育过夜。过夜培育后，将14F4或同种型对照与原代MEF在37℃下用5％CO2培育1h。接着添加预定浓度的激动剂(小鼠IL-1β或IL-36β)。每孔的最终体积为200μL并且抗体阻断分析在激动剂EC70或更高的情况下进行。
激动剂刺激后，将细胞在37℃下用5％CO2培育21小时。随后，将板快速离心并且按照制造商的指导使用市售的小鼠IL-6ELISA试剂盒(英杰/赛默飞世尔科技目录号88-7064-88)收集上清液以测定小鼠IL-6分泌的水平。阳性对照孔由在生长培养基中含有激动剂的细胞组成，并且阴性对照孔由仅具有生长培养基的细胞组成。使用Graphpad Prism 7软件进行数据分析，并且进行非线性回归(曲线拟合)以确定激动剂EC50和拮抗剂IC50值。
结果
选择替代抗小鼠IL1RAP抗体14F4(如实例16所描述制备)以在小鼠模型中证明体内功效。在进行体内研究之前，使用小鼠细胞系和原代细胞分析在体外分析14F4阻断所有三个IL1RAP介导的路径(IL-1、IL-36和IL-33)的功效。
使用NIH-3T3细胞系确定14F4是否能够在体外阻断小鼠IL-1和IL-36路径。已知NIH-3T3细胞对IL-1刺激有应答，并且因此表达IL1RAP(参见例如,Smeets等人,《关节炎和风湿病(Arthritis and Rheumatism)》,52(7):2202-2211(2005))。如上文所描述，用IL-1β刺激NIH-3T3细胞，并且使其暴露到14F4，以阻断IL1-β刺激或同种型对照抗体。在暴露到同种型对照抗体的细胞以及阳性对照细胞的上清液中测量IL-6的产生。如表28(下文)所示，接收抗小鼠IL1RAP抗体14F4的NIH-3T3细胞与阳性对照相比，其表现出检测到的IL-6水平几乎完全降低(98％抑制)。14F4以IC50＝1.36nM抑制IL-1β诱导的IL-6产生，其接近于实例12中所描述的HEK-Blue分析中用YKD/YTE观察到的效力(IC50＝0.51nM)。
还发现NIH-3T3细胞对IL-36有应答，在用IL-36α刺激后以剂量依赖性方式分泌IL-6(数据未显示)。无论是用IL-1β还是IL-36α刺激NIH-3T3细胞，观察到的最大IL-6产生是相似的。如表28所示，使用IL-36α刺激的NIH-3T3细胞进行的14F4阻断分析导致IL-6产生的100％抑制。此外，14F4能够抑制IL-36α诱导的IL-6产生，其效力要高于IL-1β刺激(IC50＝0.18nM)后观察到的效力，其中在16.7nM处观察到14F4的完全抑制。如实例12中所描述，14F4的亚纳摩尔抑制效力与在IL-36HEK-Blue分析中观察到的抗人类IL1RAP抗体YKD/YTE相当。总之，替代抗mu-IL1RAP小鼠抗体14F4有效抑制了IL-1和IL-36诱导的小鼠细胞系NIH-3T3中IL-6的产生，并且表明具有与在体外所观察到的效力相当的抗hu-IL1RAP抗体YKD/YTE。
使用巨噬细胞样J774-Dual细胞系来确定14F4是否可以在体外阻断小鼠IL-33刺激的路径。IL-33和其受体IL1R1在包括巨噬细胞在内的许多免疫细胞中广泛表达。IL-33活化的ST2信号传导导致巨噬细胞中NF-κB活化(参见例如,Kakkar等人,《自然综述,药物发现(Nature Reviews.Drug Discovery)》,7(10),827-840(2008))。如表28所示，14F4在IL-33刺激的J774细胞中展示出阻断活性，在2μM下抑制为97％(IC50＝6.6nM)。IL-33刺激的这种抑制效力类似于如实例12的HEK-Blue分析(IC50＝3.30nM)中所描述的抗人类IL1RAP抗体YKD/YTE所观察到的。
在原代MEF中确定替代抗体14F4阻断IL-1和IL-36刺激的路径的能力。原代MEF具有响应于IL-1刺激而产生IL-6的能力，表明IL1RAP的表达(参见例如,Nold-Petry等人,《生物化学杂志》,284(38):25900-25911(2009))。由于这些原代小鼠成纤维细胞表达IL1RAP，并且小鼠胚胎成纤维细胞细胞系NIH-3T3对IL-36刺激有应答，因此可以认为原代MEF也应对IL-36刺激有应答。实际上，在用IL-36β刺激后，原代MEF以剂量依赖性方式分泌IL-6(数据未显示)。如表28所示，相对于IC50为6.1nM的阳性对照，14F4显示IL-1β刺激的IL-6的产生基本上完全抑制。同样，IL-36β刺激的IL-6的产生被完全抑制，其中IC50值为0.094nM。总之，14F4具有完全阻断原代MEF中IL-1和IL-36路径的能力，即使与IL-1路径相比，IL-36的效力更大。
表28.替代抗mu-IL1RAP抗体14F4的基于细胞的分析结果。
Figure BDA0003013363900001181
总之，上述14F4的结果支持其用作小鼠体内研究的替代抗体，以确定通过IL1RAP抑制的同时阻断IL-1、IL-33和IL-36路径的功效和作用。
实例18：替代抗小鼠IL1RAP抗体的体内功效
本实例说明小鼠替代抗体14F4是至少两种IL-1家族路径的功能性体内阻断剂，并且也是在哮喘小鼠模型中诱导的更复杂表型的功能性阻断剂。
材料和方法
体内小鼠模型研究中的研究方案概括于表29中。
表29体内研究方案
Figure BDA0003013363900001191
畜牧业：从Envigo购买雌性BALB/cAnNHsd小鼠，并且在6-13周龄之间使用。给小鼠喂食经照射的哈兰泰克莱(Harlan Teklad)全球18％蛋白质啮齿动物饮食和随意饮水。将动物圈养在带有玉米芯垫料的Innovive可抛弃式通风笼中，每小时彻底换气60次。将环境控制在70°±2°F的温度范围和30-70％的湿度范围内。所有动物工作均根据Explora的机构动物护理和使用委员会(Explora's Institutional Animal Care and Use Committee)(加利福尼亚州圣地亚哥)批准的动物护理使用规程进行。
体内处理：对于鼻内(i.n.)处理，用3-4％的异氟烷(爱达荷州博伊西的VetOne(VetOne,Boise,Idaho))麻醉小鼠，并且使其通过鼻孔吸入35μl通过微量移液管施用的溶液。通过施用麻醉剂量的2.5％2,2,2-三溴乙醇溶液(密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich,St.Louis,Mo))对小鼠实行安乐死，接着进行双侧胸廓切开术或颈脱位术(仅针对单一IL-1β攻击)。
数据分析：对于所有体内研究，均使用GraphPad Prism 8软件进行数据和统计分析。在给药IgG对照的未攻击的小鼠和给药IgG对照的攻击的小鼠之间进行mann-Whitney测试，以确定细胞因子或HDM攻击是否引起生物学反应的统计学上显著的增加。确定显著性后，在给药IgG对照的攻击小鼠和给药14F4的攻击小鼠之间进行了Mann-Whitney测试。
A.单细胞因子攻击模型和相关分析：单IL-1β攻击研究方案基于Gabrielsson等人,《欧洲药物科学杂志：欧洲药物科学联合会官方杂志(European Journal ofPharmaceutical Sciences:Official Journal of the European Federation forPharmaceutical Sciences)》,67:144-159(2015)。在第1天，以每kg平均组体重IgG对照或14F4腹膜内(i.p.)给药小鼠，总体积为100-200μl。在第0天，用D-PBS或50ng IL-1β以100μl的总体积腹膜内攻击小鼠。攻击后两小时，对小鼠实行安乐死，通过心脏穿刺收集血液，并且将其置于BD微量采血血清分离管(BD生物科学(BD Biosciences))中。至少30分钟后，将试管离心9,300×g 5min，并且收集血清并将其在-80℃下保存。根据制造商的说明书，通过商用IL-6ELISA试剂盒(英杰/赛默飞世尔科技目录号88-7064-88)测量小鼠血清IL-6浓度。将血清样品以1:5稀释用于分析。
基于Ramadas等人,《科学公共图书馆综合(PloS One)》7(9):e45784(2012)，对单IL-36α攻击研究方案进行了修改。在第1天，使用与单一IL-1β攻击研究类似的抗体对小鼠腹膜内给药。在第0天，用D-PBS或10ng IL-36α以35μl的总体积鼻内攻击小鼠。在第1天，对小鼠实行安乐死。通过在气管上切开切口，插入20G钝端针或18G导管鞘，并且使用1mL注射器注射和取回0.8mL HBSS/2mM EDTA缓冲液，进行支气管肺泡灌洗(BAL)。此过程进行了3次。为了确定BAL液中的细胞类型数目，将BAL液以365×g离心10min。去除上清液后，添加2mL 1×裂解缓冲液(BD生物科学，目录号555899)到细胞中以裂解任何红细胞。2min后，添加5mL D-PBS/2％FBS缓冲液以终止反应。将细胞以365×g离心5min。去除上清液后，将细胞再悬浮到HBSS/2mM EDTA中，转移到96孔圆底板中，以570×g离心2min，并且然后去除上清液。所有染色步骤均在冰上和黑暗中进行。为了染色死细胞，添加了25μl的LIVE/DEAD可固定的远红色死细胞染色试剂盒(1:1000稀释，赛默飞世尔)。15-20min后，将FACS染色缓冲液中的25μl抗CD16/32(2.4G2，BD生物科学)添加到细胞中以阻断Fc受体结合。15min后，通过向孔中添加在50μl光亮染色缓冲液(Brilliant Stain Buffer)(BD生物科学)中的抗体对细胞进行染色。抗体均以1:200的稀释度使用。以下抗体购自Tonbo生物科学(TonboBiosciences)(加利福尼亚州圣地亚哥)：Ly6G-FITC(1A8)和CD11b-APC(M1/70)。以下抗体购自BD生物科学：SiglecF-PE(E50-2440)和CD11c-BV785(N418)。Ly6C-PerCp-Cyanine5.5(HK1.4)购自赛默飞世尔。30分钟后，将细胞在FACS缓冲液中洗涤2-3次。洗涤后，将细胞再悬浮到FACS缓冲液中，并且然后在CytoFlex流式细胞仪上进行分析。使用FlowJo 10软件分析数据。在对细胞进行门控并排除死细胞和肺泡巨噬细胞(SiglecF+CD11c+)后，基于标志物的表达来定义细胞类型：嗜酸性粒细胞(SiglecF+CD11c-Ly6G-)、嗜中性粒细胞(Ly6G+Ly6C+CD11b+SiglecF-CD11c-)和单核细胞(Ly6C+Ly6G-CD11b+SiglecF-CD11c-)。为了计算BAL液中的细胞类型数量，将每种细胞类型在总采集细胞中所占的百分比乘以全细胞计数。根据制造商的说明书，使用Guava easyCyte 5HT系统流式细胞仪(马塞诸塞州比尔里卡的EMDMillipore(EMD Millipore,Billerica,MA))使用ViaCount分析来获得全细胞计数。
B.多个IL-1β细胞因子攻击模型和相关分析：多个IL-1β攻击研究方案基于Kim等人,《美国呼吸道与危重护理医学杂志(American Journal of Respiratory and CriticalCare Medicine)》,196(3):283-297(2017)。在第1天和第2天，使用与单一IL-1β攻击研究类似的抗体对小鼠腹膜内给药。在第0、1和2天，用D-PBS或30ng IL-1β以在D-PBS中35μl的总体积鼻内攻击小鼠。在第3天，对小鼠实行安乐死。如先前所描述进行BAL。将左、中、下和后空肺肺叶收集在2.0mL试管中，速冻，并且在-80℃下保存以用于后续蛋白质趋化因子/细胞因子分析。如先前所描述进行BAL的细胞分析，不同的是用LIVE/DEAD Aqua可固定死细胞染色试剂盒(1:250稀释，赛默飞世尔)和以下抗体(均以1:200稀释)对细胞染色：Ly6G-FITC(Tonbo生物科学，1A8)；SiglecF-PE(BD生物科学，E50-2440)；Ly6C-PerCp-Cyanine5.5(赛默飞世尔，HK1.4)；CD11b-APC-Cy7(BD生物科学，M1/70)；CD11c-BV785(百进生物技术有限公司，N418)；CD3-PE-Cy7(百进生物技术有限公司，17A2)；CD4-BV605(BD生物科学，RM4-5)；CD19-BV650(BD生物科学，1D3)；T1/ST2-BV421(BD生物科学，U29-93)；和MHC II-APC级(赛默飞世尔，M5/114.15.2)。使用FlowJo 10软件分析数据。在对细胞进行门控后，排除死细胞和肺泡巨噬细胞(CD11c+SiglecF+)，然后基于以下标志物的表达在BAL中定义以下细胞类型：嗜中性粒细胞(Ly6G+Ly6C+CD11b+)、嗜酸性粒细胞(SiglecF+CD11c-Ly6G-)、树突状细胞(CD11c+MHCII+Ly6G-SiglecF-)、单核细胞(Ly6C+Ly6G-CD11b+SiglecF-)、CD4 T细胞(CD3+CD4+CD19-CD11b-Ly6G-SiglecF-)、T1-ST2+CD4 T细胞(CD3+CD4+T1/ST2+CD19-CD11b-Ly6G-SiglecF-)、CD8 T细胞(CD3+CD4-CD19-CD11b-Ly6G-SiglecF-)和B细胞(CD19+MHCII+CD3-CD11b-Ly6G-SiglecF-)。如上文所描述计算BAL中的细胞计数。对于肺趋化因子/细胞因子蛋白分析，使用Tissuelyser II(凯杰(QIAGEN))将肺样品在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(赛默飞世尔科技，目录号78443)的组织提取试剂I(赛默飞世尔科技，目录号FNN0071)中匀化，在25Hz下持续2分钟，进行3个循环。将匀浆液在4℃下以9,300×g离心10分钟。用皮尔斯二喹啉甲酸(Pierce bicinchoninic acid,BCA)蛋白质分析(赛默飞世尔科技，目录号23227)对组织裂解物(上清液)中的蛋白质含量进行定量。将裂解物在-80℃下储存以用于细胞因子分析。将上清液用于细胞因子测量。根据制造商的说明书，使用小鼠定制的ProcartaPlex 17-plex试剂盒(英杰/赛默飞世尔科技，目录号PPX-17-MXCE4AT)测量在200μg的总蛋白肺裂解物中鼠细胞因子和趋化因子(CXCL1、CXCL2、IFNγ、IL-10、IL-12、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-25、IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、IL-17A、IL-33、TNFα和TSLP)的水平。
C.急性屋尘螨(HDM)哮喘模型和相关分析：急性屋尘螨(HDM)哮喘模型基于Piyadasa等人,《开放生物学(Biology Open)》,5(2):112-121(2016)。在第1、2、6、9和13天，以30mg/kg对小鼠腹膜内注射IgG对照或14F4。在第0-3、6-10、13和14天，用盐水或25μg HDM(北达科他州勒诺的Stallergenes Greer(Stallergenes Greer,Lenoir,NC)，目录号XPB82D3A.5)鼻内攻击小鼠。在第15天，对小鼠实行安乐死，并且如先前所描述从血液中收集血清。根据制造商的说明书，使用HDM特异性IgE(华盛顿州雷德蒙德的Chondrex(Chondrex,Redmond,WA)，目录号3037)和HDM特异性IgG1(Chondrex，目录号3034)试剂盒测量小鼠抗体的血清浓度。血清样品以1:4稀释用于HDM特异性IgE，并且以1:12稀释用于HDM特异性IgG1。
结果
如实例17的结果所示，在基于体外细胞的分析中，小鼠替代抗体14F4能够阻断所有三个IL-1家族路径。为了确定14F4是否能够在体内阻断这些路径，本实例18在短药效学(PD)分析中测试了14F4阻断个别路径的能力。先前的研究表明，体内施用时IL-1家族细胞因子具有急性作用(参见例如,Gabrielsson等人,《欧洲药物科学杂志：欧洲药物科学联合会官方杂志》,67:144-159(2015)；Ramadas等人,《科学公共图书馆综合》7(9):e45784(2012))。类似地，如图16A和16B中所描绘的结果所示，与用PBS(图16A)攻击的小鼠相比，用IL-1β全身攻击的小鼠响应于血清IL-6水平的快速增加。与用PBS(图16B)攻击的小鼠相比，用IL36α鼻内攻击的小鼠响应于肺空域嗜中性粒细胞的快速流入。用14F4处理影响了这两个观察到的免疫应答。如图16A所示，在攻击前给药14F4的小鼠表现出对IL-1β诱导的血清IL-6水平的增加的强烈抑制(88％抑制)。此外，如图16B所示，在攻击前用14F4给药的小鼠表现出肺空域中降低的IL-36α诱导的嗜中性粒细胞流入(100％抑制)。这些结果很大程度上表明14F4具有在体内阻断IL-1和IL-36信号传导路径的能力。
本实例的研究还用于确定14F4是否具有阻断人类哮喘中所见的复杂表型的能力。先前的研究已经显示，用IL-1β在4天的过程中每天攻击一次的小鼠在肺空域中具有增加数量的嗜中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞(参见例如Kim等人,《美国呼吸道与危重护理医学杂志》,196(3):283-297(2017))。IL-1β诱导的嗜中性粒细胞流入已显示具有类固醇抗性，类似于在患有严重的不受控制的哮喘的人类患者中所观察到的。如图17A-17E的标绘图中所描绘的结果所示，用IL-1β经过3天的过程攻击的小鼠在肺空域中具有显著增加的嗜中性粒细胞(图17A)、CD4 T细胞(图17B)、T1-ST2+CD4 T细胞(图17C)、单核细胞(图17D)和树突状细胞(图17E)。如图18A-18C中所描绘的标绘图所示，多个IL-1β攻击还导致肺组织中炎性细胞因子IL-1β(图18A)和IL-17A(图18B)，以及嗜中性粒细胞吸引趋化因子CXCL1(图18C)的水平升高。在多个IL-1β攻击后，CXCL2、IFN-γ、IL-10、IL-12、IL-1α、IL-2、IL-25、IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、IL-33、TNF-α和TSLP要么低于检测极限，要么未上调(数据未显示)。用14F4处理降低了在IL-1β攻击的小鼠中观察到的这些作用。如图17A-17E所示，用IL-1β经过3天的过程的攻击并且用14F4处理过的小鼠在肺空域中具有减少数量的中性粒细胞(74％抑制)(图17A)、CD4 T细胞(75％抑制)(图17B)、T1-ST2+CD4 T细胞(76％抑制)(图17C)、单核细胞(58％抑制)(图17D)和树突状细胞(64％抑制)(图17E)。如图18A-18C所示，14F4处理导致肺组织中IL-1β(88％抑制)(图18A)、IL-17A(89％抑制)(图18B)和CXCL1(68％抑制)(图18C)的水平显著下降。这些结果很大程度上表明14F4具有阻断几天内发生的更复杂的免疫应答的能力。
在确定14F4具有在还原者、细胞因子攻击模型中阻断复杂的免疫表型的能力之后，进一步测试了14F4阻断由相关和复杂的人类过敏原、屋尘螨(HDM)诱导的哮喘样表型的能力(参见例如,Nials等人,《疾病模型&机制(Disease Models&Mechanisms)》,1(4-5):213-220(2008))。如图19A和19B所示，类似于先前的研究(参见例如,Piyadasa等人,《开放生物学》,5(2):112-121(2016))，与用盐水攻击的小鼠相比，用HDM攻击的小鼠具有显著升高的HDM特异性IgE(图19A)和IgG1(图19B)水平。然而，与用IgG ctrl处理的小鼠相比，用HMI攻击并用14F4处理的小鼠显示了HDM特异性IgE(64％抑制)(图19A)和HDM特异性IgG1(70％抑制)(图19B)的显著降低。这些结果表明，阻断IL-1家族信号传导可能能够部分阻断哮喘样表型的发展。
尽管出于清楚和理解的目的通过实例和说明的方式对本发明的前述公开进行了详细描述，但是包括本文所描述的实例、说明和实施例的本公开仅出于说明性目的，意图为示例性的并且不应将其解释为限制本公开。对于所属领域技术人员将显而易见的是，可以对本文所描述的实例、说明和实施例进行各种修改或改变，并且将其包括在本公开和随附权利要求书的精神和范围内。此外，所属领域的技术人员将认识到许多与本文所描述的方法和过程等效的方法和过程。所有此类等效物应被理解为在本公开的范围内并且由随附权利要求书覆盖。
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序列表
<110> 23andMe公司
Folletti, Davide
Karrer, Erik
Fuh-Kelly, Germaine
Ibarra, Kristie
Zheng, Quan
Huang, Yao-ming
Deis, Lindsay
Wolak, Christine
Berns, Dominic Samuel
<120> 抗IL1RAP抗体和其使用方法
<130> 09402.002US1
<150> US 62/719,397
<151> 2018-08-17
<160> 338
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 570
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Thr Leu Leu Trp Cys Val Val Ser Leu Tyr Phe Tyr Gly Ile Leu
1 5 10 15
Gln Ser Asp Ala Ser Glu Arg Cys Asp Asp Trp Gly Leu Asp Thr Met
20 25 30
Arg Gln Ile Gln Val Phe Glu Asp Glu Pro Ala Arg Ile Lys Cys Pro
35 40 45
Leu Phe Glu His Phe Leu Lys Phe Asn Tyr Ser Thr Ala His Ser Ala
50 55 60
Gly Leu Thr Leu Ile Trp Tyr Trp Thr Arg Gln Asp Arg Asp Leu Glu
65 70 75 80
Glu Pro Ile Asn Phe Arg Leu Pro Glu Asn Arg Ile Ser Lys Glu Lys
85 90 95
Asp Val Leu Trp Phe Arg Pro Thr Leu Leu Asn Asp Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Met Leu Arg Asn Thr Thr Tyr Cys Ser Lys Val Ala Phe Pro
115 120 125
Leu Glu Val Val Gln Lys Asp Ser Cys Phe Asn Ser Pro Met Lys Leu
130 135 140
Pro Val His Lys Leu Tyr Ile Glu Tyr Gly Ile Gln Arg Ile Thr Cys
145 150 155 160
Pro Asn Val Asp Gly Tyr Phe Pro Ser Ser Val Lys Pro Thr Ile Thr
165 170 175
Trp Tyr Met Gly Cys Tyr Lys Ile Gln Asn Phe Asn Asn Val Ile Pro
180 185 190
Glu Gly Met Asn Leu Ser Phe Leu Ile Ala Leu Ile Ser Asn Asn Gly
195 200 205
Asn Tyr Thr Cys Val Val Thr Tyr Pro Glu Asn Gly Arg Thr Phe His
210 215 220
Leu Thr Arg Thr Leu Thr Val Lys Val Val Gly Ser Pro Lys Asn Ala
225 230 235 240
Val Pro Pro Val Ile His Ser Pro Asn Asp His Val Val Tyr Glu Lys
245 250 255
Glu Pro Gly Glu Glu Leu Leu Ile Pro Cys Thr Val Tyr Phe Ser Phe
260 265 270
Leu Met Asp Ser Arg Asn Glu Val Trp Trp Thr Ile Asp Gly Lys Lys
275 280 285
Pro Asp Asp Ile Thr Ile Asp Val Thr Ile Asn Glu Ser Ile Ser His
290 295 300
Ser Arg Thr Glu Asp Glu Thr Arg Thr Gln Ile Leu Ser Ile Lys Lys
305 310 315 320
Val Thr Ser Glu Asp Leu Lys Arg Ser Tyr Val Cys His Ala Arg Ser
325 330 335
Ala Lys Gly Glu Val Ala Lys Ala Ala Lys Val Lys Gln Lys Val Pro
340 345 350
Ala Pro Arg Tyr Thr Val Glu Leu Ala Cys Gly Phe Gly Ala Thr Val
355 360 365
Leu Leu Val Val Ile Leu Ile Val Val Tyr His Val Tyr Trp Leu Glu
370 375 380
Met Val Leu Phe Tyr Arg Ala His Phe Gly Thr Asp Glu Thr Ile Leu
385 390 395 400
Asp Gly Lys Glu Tyr Asp Ile Tyr Val Ser Tyr Ala Arg Asn Ala Glu
405 410 415
Glu Glu Glu Phe Val Leu Leu Thr Leu Arg Gly Val Leu Glu Asn Glu
420 425 430
Phe Gly Tyr Lys Leu Cys Ile Phe Asp Arg Asp Ser Leu Pro Gly Gly
435 440 445
Ile Val Thr Asp Glu Thr Leu Ser Phe Ile Gln Lys Ser Arg Arg Leu
450 455 460
Leu Val Val Leu Ser Pro Asn Tyr Val Leu Gln Gly Thr Gln Ala Leu
465 470 475 480
Leu Glu Leu Lys Ala Gly Leu Glu Asn Met Ala Ser Arg Gly Asn Ile
485 490 495
Asn Val Ile Leu Val Gln Tyr Lys Ala Val Lys Glu Thr Lys Val Lys
500 505 510
Glu Leu Lys Arg Ala Lys Thr Val Leu Thr Val Ile Lys Trp Lys Gly
515 520 525
Glu Lys Ser Lys Tyr Pro Gln Gly Arg Phe Trp Lys Gln Leu Gln Val
530 535 540
Ala Met Pro Val Lys Lys Ser Pro Arg Arg Ser Ser Ser Asp Glu Gln
545 550 555 560
Gly Leu Ser Tyr Ser Ser Leu Lys Asn Val
565 570
<210> 2
<211> 1740
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
tctcaaagga tgacacttct gtggtgtgta gtgagtctct acttttatgg aatcctgcaa 60
agtgatgcct cagaacgctg cgatgactgg ggactagaca ccatgaggca aatccaagtg 120
tttgaagatg agccagctcg catcaagtgc ccactctttg aacacttctt gaaattcaac 180
tacagcacag cccattcagc tggccttact ctgatctggt attggactag gcaggaccgg 240
gaccttgagg agccaattaa cttccgcctc cccgagaacc gcattagtaa ggagaaagat 300
gtgctgtggt tccggcccac tctcctcaat gacactggca actatacctg catgttaagg 360
aacactacat attgcagcaa agttgcattt cccttggaag ttgttcaaaa agacagctgt 420
ttcaattccc ccatgaaact cccagtgcat aaactgtata tagaatatgg cattcagagg 480
atcacttgtc caaatgtaga tggatatttt ccttccagtg tcaaaccgac tatcacttgg 540
tatatgggct gttataaaat acagaatttt aataatgtaa tacccgaagg tatgaacttg 600
agtttcctca ttgccttaat ttcaaataat ggaaattaca catgtgttgt tacatatcca 660
gaaaatggac gtacgtttca tctcaccagg actctgactg taaaggtagt aggctctcca 720
aaaaatgcag tgccccctgt gatccattca cctaatgatc atgtggtcta tgagaaagaa 780
ccaggagagg agctactcat tccctgtacg gtctatttta gttttctgat ggattctcgc 840
aatgaggttt ggtggaccat tgatggaaaa aaacctgatg acatcactat tgatgtcacc 900
attaacgaaa gtataagtca tagtagaaca gaagatgaaa caagaactca gattttgagc 960
atcaagaaag ttacctctga ggatctcaag cgcagctatg tctgtcatgc tagaagtgcc 1020
aaaggcgaag ttgccaaagc agccaaggtg aagcagaaag tgccagctcc aagatacaca 1080
gtggaactgg cttgtggttt tggagccaca gtcctgctag tggtgattct cattgttgtt 1140
taccatgttt actggctaga gatggtccta ttttaccggg ctcattttgg aacagatgaa 1200
accattttag atggaaaaga gtatgatatt tatgtatcct atgcaaggaa tgcggaagaa 1260
gaagaatttg tattactgac cctccgtgga gttttggaga atgaatttgg atacaagctg 1320
tgcatctttg accgagacag tctgcctggg ggaattgtca cagatgagac tttgagcttc 1380
attcagaaaa gcagacgcct cctggttgtt ctaagcccca actacgtgct ccagggaacc 1440
caagccctcc tggagctcaa ggctggccta gaaaatatgg cctctcgggg caacatcaac 1500
gtcattttag tacagtacaa agctgtgaag gaaacgaagg tgaaagagct gaagagggct 1560
aagacggtgc tcacggtcat taaatggaaa ggggaaaaat ccaagtatcc acagggcagg 1620
ttctggaagc agctgcaggt ggccatgcca gtgaagaaaa gtcccaggcg gtctagcagt 1680
gatgagcagg gcctctcgta ttcatctttg aaaaatgtat gaaaggaata atgaaaagga 1740
<210> 3
<211> 347
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 3
Ser Glu Arg Cys Asp Asp Trp Gly Leu Asp Thr Met Arg Gln Ile Gln
1 5 10 15
Val Phe Glu Asp Glu Pro Ala Arg Ile Lys Cys Pro Leu Phe Glu His
20 25 30
Phe Leu Lys Phe Asn Tyr Ser Thr Ala His Ser Ala Gly Leu Thr Leu
35 40 45
Ile Trp Tyr Trp Thr Arg Gln Asp Arg Asp Leu Glu Glu Pro Ile Asn
50 55 60
Phe Arg Leu Pro Glu Asn Arg Ile Ser Lys Glu Lys Asp Val Leu Trp
65 70 75 80
Phe Arg Pro Thr Leu Leu Asn Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Cys Met Leu
85 90 95
Arg Asn Thr Thr Tyr Cys Ser Lys Val Ala Phe Pro Leu Glu Val Val
100 105 110
Gln Lys Asp Ser Cys Phe Asn Ser Pro Met Lys Leu Pro Val His Lys
115 120 125
Leu Tyr Ile Glu Tyr Gly Ile Gln Arg Ile Thr Cys Pro Asn Val Asp
130 135 140
Gly Tyr Phe Pro Ser Ser Val Lys Pro Thr Ile Thr Trp Tyr Met Gly
145 150 155 160
Cys Tyr Lys Ile Gln Asn Phe Asn Asn Val Ile Pro Glu Gly Met Asn
165 170 175
Leu Ser Phe Leu Ile Ala Leu Ile Ser Asn Asn Gly Asn Tyr Thr Cys
180 185 190
Val Val Thr Tyr Pro Glu Asn Gly Arg Thr Phe His Leu Thr Arg Thr
195 200 205
Leu Thr Val Lys Val Val Gly Ser Pro Lys Asn Ala Val Pro Pro Val
210 215 220
Ile His Ser Pro Asn Asp His Val Val Tyr Glu Lys Glu Pro Gly Glu
225 230 235 240
Glu Leu Leu Ile Pro Cys Thr Val Tyr Phe Ser Phe Leu Met Asp Ser
245 250 255
Arg Asn Glu Val Trp Trp Thr Ile Asp Gly Lys Lys Pro Asp Asp Ile
260 265 270
Thr Ile Asp Val Thr Ile Asn Glu Ser Ile Ser His Ser Arg Thr Glu
275 280 285
Asp Glu Thr Arg Thr Gln Ile Leu Ser Ile Lys Lys Val Thr Ser Glu
290 295 300
Asp Leu Lys Arg Ser Tyr Val Cys His Ala Arg Ser Ala Lys Gly Glu
305 310 315 320
Val Ala Lys Ala Ala Lys Val Lys Gln Lys Val Pro Ala Pro Arg Tyr
325 330 335
Thr Val Glu Leu Ala Cys Gly Phe Gly Ala Thr
340 345
<210> 4
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 4
Ser Glu Arg Cys Asp Asp Trp Gly Leu Asp Thr Met Arg Gln Ile Gln
1 5 10 15
Val Phe Glu Asp Glu Pro Ala Arg Ile Lys Cys Pro Leu Phe Glu His
20 25 30
Phe Leu Lys Phe Asn Tyr Ser Thr Ala His Ser Ala Gly Leu Thr Leu
35 40 45
Ile Trp Tyr Trp Thr Arg Gln Asp Arg Asp Leu Glu Glu Pro Ile Asn
50 55 60
Phe Arg Leu Pro Glu Asn Arg Ile Ser Lys Glu Lys Asp Val Leu Trp
65 70 75 80
Phe Arg Pro Thr Leu Leu Asn Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Cys Met Leu
85 90 95
Arg Asn Thr Thr Tyr Cys Ser Lys Val Ala Phe Pro Leu Glu Val Val
100 105 110
Gln
<210> 5
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 5
Ser Glu Arg Cys Asp Asp Trp Gly Leu Asp Thr Met Arg Gln Ile Gln
1 5 10 15
Val Phe Glu Asp Glu Pro Ala Arg Ile Lys Cys Pro Leu Phe Glu His
20 25 30
Phe Leu Lys Phe Asn Tyr Ser Thr Ala His Ser Ala Gly Leu Thr Leu
35 40 45
Ile Trp Tyr Trp Thr Arg Gln Asp Arg Asp Leu Glu Glu Pro Ile Asn
50 55 60
Phe Arg Leu Pro Glu Asn Arg Ile Ser Lys Glu Lys Asp Val Leu Trp
65 70 75 80
Phe Arg Pro Thr Leu Leu Asn Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Cys Met Leu
85 90 95
Arg Asn Thr Thr Tyr Cys Ser Lys Val Ala Phe Pro Leu Glu Val Val
100 105 110
Gln Lys Asp Ser Cys Phe Asn Ser Pro Met Lys Leu Pro Val His Lys
115 120 125
Leu Tyr Ile Glu Tyr Gly Ile Gln Arg Ile Thr Cys Pro Asn Val Asp
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Gly Tyr Phe Pro Ser Ser Val Lys Pro Thr Ile Thr Trp Tyr Met Gly
145 150 155 160
Cys Tyr Lys Ile Gln Asn Phe Asn Asn Val Ile Pro Glu Gly Met Asn
165 170 175
Leu Ser Phe Leu Ile Ala Leu Ile Ser Asn Asn Gly Asn Tyr Thr Cys
180 185 190
Val Val Thr Tyr Pro Glu Asn Gly Arg Thr Phe His Leu Thr Arg Thr
195 200 205
Leu Thr Val Lys Val Val Gly Ser Pro
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<211> 130
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 6
Lys Asn Ala Val Pro Pro Val Ile His Ser Pro Asn Asp His Val Val
1 5 10 15
Tyr Glu Lys Glu Pro Gly Glu Glu Leu Leu Ile Pro Cys Thr Val Tyr
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Phe Ser Phe Leu Met Asp Ser Arg Asn Glu Val Trp Trp Thr Ile Asp
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Gly Lys Lys Pro Asp Asp Ile Thr Ile Asp Val Thr Ile Asn Glu Ser
50 55 60
Ile Ser His Ser Arg Thr Glu Asp Glu Thr Arg Thr Gln Ile Leu Ser
65 70 75 80
Ile Lys Lys Val Thr Ser Glu Asp Leu Lys Arg Ser Tyr Val Cys His
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100 105 110
Lys Val Pro Ala Pro Arg Tyr Thr Val Glu Leu Ala Cys Gly Phe Gly
115 120 125
Ala Thr
130
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 7
Ser Glu Arg Cys Asp Asp Trp Gly Leu Asp Thr Met Arg Gln Ile Gln
1 5 10 15
Val Phe Glu Asp Glu Pro Ala Arg Ile Lys Cys Pro Leu Phe Glu His
20 25 30
Phe Leu Lys Phe Asn Tyr Ser Thr Ala His Ser Ala Gly Leu Thr Leu
35 40 45
Ile Trp Tyr Trp Thr Arg Gln Asp Arg Asp Leu Glu Glu Pro Ile Asn
50 55 60
Phe Arg Leu Pro Glu Asn Arg Ile Ser Lys Glu Lys Asp Val Leu Trp
65 70 75 80
Phe Arg Pro Thr Leu Leu Asn Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Cys Met Leu
85 90 95
Arg Asn Thr Thr Tyr Cys Ser Lys Val Ala Phe Pro Leu Glu Val Val
100 105 110
Gln Lys Asp Ser Cys Phe Asn Ser Pro Met Lys Leu Pro Val His Lys
115 120 125
Leu Tyr Ile Glu Tyr Gly Ile Gln Arg Ile Thr Cys Pro Asn Val Asp
130 135 140
Gly Tyr Phe Pro Ser Ser Val Lys Pro Thr Ile Thr Trp Tyr Met Gly
145 150 155 160
Cys Tyr Lys Ile Gln Asn Phe Asn Asn Val Ile Pro Glu Gly Met Asn
165 170 175
Leu Ser Phe Leu Ile Ala Leu Ile Ser Asn Asn Gly Asn Tyr Thr Cys
180 185 190
Val Val Thr Tyr Pro Glu Asn Gly Arg Thr Phe His Leu Thr Arg Thr
195 200 205
Leu Thr Val Lys Val Val Gly Ser Pro Lys Asn Ala Val Pro Pro Val
210 215 220
Ile His Ser Pro Asn Asp His Val Val Tyr Glu Lys Glu Pro Gly Glu
225 230 235 240
Glu Leu Leu Ile Pro Cys Thr Val Tyr Phe Ser Phe Leu Met Asp Ser
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260 265 270
Thr Ile Asp Val Thr Ile Asn Glu Ser Ile Ser His Ser Arg Thr Glu
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Asp Leu Lys Arg Ser Tyr Val Cys His Ala Arg Ser Ala Lys Gly Glu
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Val Ala Lys Ala Ala Lys Val Lys Gln Lys Gly Asn Arg Cys Gly Gln
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<210> 8
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 8
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Val Phe Glu Asp Glu Pro Ala Arg Ile Lys Cys Pro Leu Phe Glu His
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<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
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Val Phe Glu Asp Glu Pro Ala Arg Ile Lys Cys Pro Leu Phe Glu His
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Gly Tyr Phe Pro Ser Ser Val Lys Pro Ser Val Thr Trp Tyr Lys Gly
145 150 155 160
Cys Thr Glu Ile Val Asp Phe His Asn Val Leu Pro Glu Gly Met Asn
165 170 175
Leu Ser Phe Phe Ile Pro Leu Val Ser Asn Asn Gly Asn Tyr Thr Cys
180 185 190
Val Val Thr Tyr Pro Glu Asn Gly Arg Leu Phe His Leu Thr Arg Thr
195 200 205
Val Thr Val Lys Val Val Gly Ser Pro Lys Asp Ala Leu Pro Pro Gln
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Ile Tyr Ser Pro Asn Asp Arg Val Val Tyr Glu Lys Glu Pro Gly Glu
225 230 235 240
Glu Leu Val Ile Pro Cys Lys Val Tyr Phe Ser Phe Ile Met Asp Ser
245 250 255
His Asn Glu Val Trp Trp Thr Ile Asp Gly Lys Lys Pro Asp Asp Val
260 265 270
Thr Val Asp Ile Thr Ile Asn Glu Ser Val Ser Tyr Ser Ser Thr Glu
275 280 285
Asp Glu Thr Arg Thr Gln Ile Leu Ser Ile Lys Lys Val Thr Pro Glu
290 295 300
Asp Leu Arg Arg Asn Tyr Val Cys His Ala Arg Asn Thr Lys Gly Glu
305 310 315 320
Ala Glu Gln Ala Ala Lys Val Lys Gln Lys Val Ile Pro Pro Arg Tyr
325 330 335
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340 345
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 变异体
<222> (7)..(7)
<223> X为Y或W
<220>
<221> 变异体
<222> (8)..(8)
<223> X为S、H、K、L、M、N、Q、R或Y
<220>
<221> 变异体
<222> (10)..(10)
<223> X为L、A、G、I、M、N、Q、S、T、V或Y
<220>
<221> 变异体
<222> (11)..(11)
<223> X为A、G、N、S或T
<400> 10
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<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 11
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 12
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Phe Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 13
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Trp Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 14
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr His Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 15
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Lys Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 16
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Leu Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 17
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Met Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 18
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Asn Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 19
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 19
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gln Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 20
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Arg Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 21
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Tyr Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 22
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Ala Ala
1 5 10
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 23
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Gly Ala
1 5 10
<210> 24
<211> 11
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<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 24
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Ile Ala
1 5 10
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 25
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Met Ala
1 5 10
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 26
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Asn Ala
1 5 10
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<211> 11
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<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 27
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Gln Ala
1 5 10
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<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 28
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Ser Ala
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<211> 11
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 29
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<211> 11
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<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 30
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Val Ala
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<211> 11
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<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 31
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Tyr Ala
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<210> 32
<211> 11
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 32
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Gly
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<213> 人工
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<223> 合成多肽
<400> 33
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Asn
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<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 34
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ser
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<211> 11
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<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 35
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<213> 人工
<220>
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<220>
<221> 变异体
<222> (3)..(3)
<223> X为K、G或N
<220>
<221> 变异体
<222> (5)..(5)
<223> X为L、F、H、W或Y
<400> 36
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<211> 7
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 37
Gly Ala Lys Asn Leu Ala Asp
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 38
Gly Asp Lys Asn Leu Ala Asp
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 39
Gly Glu Lys Asn Leu Ala Asp
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<211> 7
<212> PRT
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 40
Gly Phe Lys Asn Leu Ala Asp
1 5
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<211> 7
<212> PRT
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 41
Gly Gly Lys Asn Leu Ala Asp
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 42
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 43
Gly Ile Lys Asn Leu Ala Asp
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<211> 7
<212> PRT
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 44
Gly Lys Lys Asn Leu Ala Asp
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<211> 7
<212> PRT
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 45
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<211> 7
<212> PRT
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 46
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<211> 7
<212> PRT
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 47
Gly Asn Lys Asn Leu Ala Asp
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 48
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
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<211> 7
<212> PRT
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 50
Gly Ser Lys Asn Leu Ala Asp
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
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<211> 7
<212> PRT
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<220>
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<211> 7
<212> PRT
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<220>
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<211> 7
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<220>
<223> 合成多肽
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<220>
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 56
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 57
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<211> 7
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<223> 合成多肽
<400> 58
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 59
Gly Ala Lys Asn Trp Ala Asp
1 5
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<211> 7
<212> PRT
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 60
Gly Ala Lys Asn Tyr Ala Asp
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 61
Gly Arg Gly Asn Leu Ala Asp
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
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<221> 变异体
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<220>
<221> 变异体
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<221> 变异体
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<220>
<221> 变异体
<222> (6)..(6)
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Xaa Xaa Phe Xaa Thr Xaa Pro Arg Thr
1 5
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 63
Gln His Phe Trp Thr Thr Pro Arg Thr
1 5
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 64
Ser His Phe Trp Thr Thr Pro Arg Thr
1 5
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 65
Gln Ser Phe Trp Thr Thr Pro Arg Thr
1 5
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 66
Gln His Phe Ala Thr Thr Pro Arg Thr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 67
Gln His Phe Phe Thr Thr Pro Arg Thr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 68
Gln His Phe Gly Thr Thr Pro Arg Thr
1 5
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 69
Gln His Phe Ile Thr Thr Pro Arg Thr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 70
Gln His Phe Lys Thr Thr Pro Arg Thr
1 5
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 71
Gln His Phe Leu Thr Thr Pro Arg Thr
1 5
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 72
Gln His Phe Met Thr Thr Pro Arg Thr
1 5
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 73
Gln His Phe Val Thr Thr Pro Arg Thr
1 5
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 74
Gln His Phe Tyr Thr Thr Pro Arg Thr
1 5
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 75
Gln His Phe Trp Thr Ile Pro Arg Thr
1 5
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 76
Gln His Phe Trp Thr Val Pro Arg Thr
1 5
<210> 77
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 变异体
<222> (1)..(1)
<223> X为F、A、D、E、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y
<220>
<221> 变异体
<222> (2)..(2)
<223> X为S、E、G、K、P、Q、R或T
<220>
<221> 变异体
<222> (3)..(3)
<223> X为N、D、E、G、K、Q或R
<220>
<221> 变异体
<222> (4)..(4)
<223> X为Y、A、D、E、H、S或V
<220>
<221> 变异体
<222> (5)..(5)
<223> X为A、N或S
<220>
<221> 变异体
<222> (6)..(6)
<223> X为M、V或W
<220>
<221> 变异体
<222> (7)..(7)
<223> X为S或G
<400> 77
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 78
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 78
Phe Ser Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 79
Ala Ser Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 80
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 80
Asp Ser Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 81
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 81
Glu Ser Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 82
Gly Ser Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 83
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 83
His Ser Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 84
Ile Ser Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 85
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 85
Lys Ser Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 86
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 86
Leu Ser Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 87
Met Ser Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 88
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 88
Asn Ser Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 89
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 89
Pro Ser Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 90
Gln Ser Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 91
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 91
Arg Ser Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 92
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 92
Ser Ser Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 93
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 93
Thr Ser Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 94
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 94
Val Ser Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 95
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 95
Trp Ser Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 96
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 96
Tyr Ser Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 97
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 97
Phe Glu Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 98
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 98
Phe Gly Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 99
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 99
Phe Lys Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 100
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 100
Phe Pro Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 101
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 101
Phe Gln Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 102
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 102
Phe Arg Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 103
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 103
Phe Thr Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 104
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 104
Phe Ser Asp Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 105
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 105
Phe Ser Glu Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 106
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 106
Phe Ser Gly Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 107
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 107
Phe Ser Lys Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 108
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 108
Phe Ser Gln Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 109
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 109
Phe Ser Arg Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 110
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 110
Phe Ser Asn Ala Ala Met Ser
1 5
<210> 111
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 111
Phe Ser Asn Asp Ala Met Ser
1 5
<210> 112
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 112
Phe Ser Asn Glu Ala Met Ser
1 5
<210> 113
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 113
Phe Ser Asn His Ala Met Ser
1 5
<210> 114
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 114
Phe Ser Asn Ser Ala Met Ser
1 5
<210> 115
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 115
Phe Ser Asn Val Ala Met Ser
1 5
<210> 116
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 116
Phe Ser Asn Tyr Asn Met Ser
1 5
<210> 117
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 117
Phe Ser Asn Tyr Ser Met Ser
1 5
<210> 118
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 118
Phe Ser Asn Tyr Ala Val Ser
1 5
<210> 119
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 119
Phe Ser Asn Tyr Ala Trp Ser
1 5
<210> 120
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 120
Phe Ser Asn Tyr Ala Met Gly
1 5
<210> 121
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 变异体
<222> (1)..(1)
<223> X为N、D、E、G、K、Q或R
<220>
<221> 变异体
<222> (2)..(2)
<223> X为Y、A、D、E、H、S或V
<220>
<221> 变异体
<222> (3)..(3)
<223> X为A、N或S
<220>
<221> 变异体
<222> (4)..(4)
<223> X为M、V或W
<220>
<221> 变异体
<222> (5)..(5)
<223> X为S或G
<400> 121
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 122
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 122
Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 123
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 123
Asp Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 124
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 124
Glu Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 125
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 125
Gly Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 126
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 126
Lys Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 127
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 127
Gln Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 128
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 128
Arg Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 129
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 129
Asn Ala Ala Met Ser
1 5
<210> 130
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 130
Asn Asp Ala Met Ser
1 5
<210> 131
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 131
Asn Glu Ala Met Ser
1 5
<210> 132
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 132
Asn His Ala Met Ser
1 5
<210> 133
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 133
Asn Ser Ala Met Ser
1 5
<210> 134
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 134
Asn Val Ala Met Ser
1 5
<210> 135
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 135
Asn Tyr Asn Met Ser
1 5
<210> 136
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 136
Asn Tyr Ser Met Ser
1 5
<210> 137
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 137
Asn Tyr Ala Val Ser
1 5
<210> 138
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 138
Asn Tyr Ala Trp Ser
1 5
<210> 139
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 139
Asn Tyr Ala Met Gly
1 5
<210> 140
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 变异体
<222> (2)..(2)
<223> X为V、A、N或S
<220>
<221> 变异体
<222> (3)..(3)
<223> X为T或S
<220>
<221> 变异体
<222> (4)..(4)
<223> X为E、D、N、T或V
<220>
<221> 变异体
<222> (5)..(5)
<223> X为G、I、P、T或V
<220>
<221> 变异体
<222> (6)..(6)
<223> X为G、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y
<220>
<221> 变异体
<222> (7)..(7)
<223> X为D、A、E、G、H、K、N、P、Q、R或S
<220>
<221> 变异体
<222> (8)..(8)
<223> 8处的X为Y或W
<220>
<221> 变异体
<222> (9)..(9)
<223> X为N、A、G、P或R
<220>
<221> 变异体
<222> (11)..(11)
<223> X为C、A、D、F、R、S、T、V或Y
<220>
<221> 变异体
<222> (13)..(13)
<223> X为D、S或W
<400> 140
Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Leu Xaa Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 141
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 141
Thr Val Thr Glu Gly Gly Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 142
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 142
Thr Ala Thr Glu Gly Gly Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 143
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 143
Thr Asn Thr Glu Gly Gly Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 144
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 144
Thr Ser Thr Glu Gly Gly Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 145
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 145
Thr Val Ser Glu Gly Gly Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 146
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 146
Thr Val Thr Asp Gly Gly Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 147
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 147
Thr Val Thr Asn Gly Gly Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 148
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 148
Thr Val Thr Thr Gly Gly Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 149
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 149
Thr Val Thr Val Gly Gly Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 150
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 150
Thr Val Thr Glu Ile Gly Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 151
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 151
Thr Val Thr Glu Pro Gly Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 152
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 152
Thr Val Thr Glu Thr Gly Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 153
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 153
Thr Val Thr Glu Val Gly Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 154
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 154
Thr Val Thr Glu Gly Asp Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 155
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 155
Thr Val Thr Glu Gly Glu Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 156
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 156
Thr Val Thr Glu Gly Phe Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 157
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 157
Thr Val Thr Glu Gly His Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 158
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 158
Thr Val Thr Glu Gly Ile Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 159
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 159
Thr Val Thr Glu Gly Lys Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 160
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 160
Thr Val Thr Glu Gly Leu Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 161
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 161
Thr Val Thr Glu Gly Met Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 162
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 162
Thr Val Thr Glu Gly Asn Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 163
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 163
Thr Val Thr Glu Gly Pro Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 164
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 164
Thr Val Thr Glu Gly Gln Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 165
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 165
Thr Val Thr Glu Gly Arg Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 166
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 166
Thr Val Thr Glu Gly Thr Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 167
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 167
Thr Val Thr Glu Gly Val Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 168
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 168
Thr Val Thr Glu Gly Trp Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 169
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 169
Thr Val Thr Glu Gly Tyr Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 170
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 170
Thr Val Thr Glu Gly Gly Ala Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 171
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 171
Thr Val Thr Glu Gly Gly Glu Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 172
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 172
Thr Val Thr Glu Gly Gly Gly Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 173
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 173
Thr Val Thr Glu Gly Gly His Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 174
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 174
Thr Val Thr Glu Gly Gly Lys Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 175
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 175
Thr Val Thr Glu Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 176
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 176
Thr Val Thr Glu Gly Gly Gln Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 177
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 177
Thr Val Thr Glu Gly Gly Pro Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 178
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 178
Thr Val Thr Glu Gly Gly Arg Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 179
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 179
Thr Val Thr Glu Gly Gly Ser Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 180
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 180
Thr Val Thr Glu Gly Gly Asp Tyr Ala Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 181
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 181
Thr Val Thr Glu Gly Gly Asp Tyr Gly Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 182
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 182
Thr Val Thr Glu Gly Gly Asp Tyr Pro Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 183
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 183
Thr Val Thr Glu Gly Gly Asp Tyr Arg Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 184
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 184
Thr Val Thr Glu Gly Gly Asp Tyr Asn Tyr Ala Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 185
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 185
Thr Val Thr Glu Gly Gly Asp Tyr Asn Tyr Asp Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 186
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 186
Thr Val Thr Glu Gly Gly Asp Tyr Asn Tyr Phe Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 187
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 187
Thr Val Thr Glu Gly Gly Asp Tyr Asn Tyr Arg Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 188
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 188
Thr Val Thr Glu Gly Gly Asp Tyr Asn Tyr Ser Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 189
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 189
Thr Val Thr Glu Gly Gly Asp Tyr Asn Tyr Thr Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 190
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 190
Thr Val Thr Glu Gly Gly Asp Tyr Asn Tyr Val Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 191
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 191
Thr Val Thr Glu Gly Gly Asp Tyr Asn Tyr Tyr Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 192
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 192
Thr Val Thr Glu Gly Gly Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Ser Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 193
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 193
Thr Val Thr Glu Gly Gly Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Trp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 194
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 194
Thr Ser Thr Glu Gly His Asp Tyr Asn Tyr Cys Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 195
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 195
Thr Ser Thr Glu Gly Gly Asp Tyr Asn Tyr Tyr Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 196
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 196
Thr Val Thr Val Gly Gly Asp Tyr Asn Tyr Tyr Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 197
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 197
Thr Val Thr Glu Gly His Asp Tyr Asn Tyr Tyr Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 198
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 198
Thr Val Thr Glu Gly Val Asp Tyr Asn Tyr Tyr Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 199
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 199
Thr Val Thr Glu Gly Gly Gly Tyr Asn Tyr Tyr Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 200
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 200
Thr Val Thr Glu Gly Gly Asp Tyr Gly Tyr Tyr Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 201
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 201
Thr Ser Thr Glu Gly His Asp Tyr Asn Tyr Tyr Leu Asp Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 202
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 变异体
<222> (1)..(1)
<223> X为A、G、S或T
<220>
<221> 变异体
<222> (2)..(2)
<223> X为H、I、L、M、N、Q或V
<220>
<221> 变异体
<222> (4)..(4)
<223> X为R、A、D、E、I、M、N、Q或S
<220>
<221> 变异体
<222> (5)..(5)
<223> 5处的X为W或F
<220>
<221> 变异体
<222> (9)..(9)
<223> X为F、L、M或W
<400> 202
Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Pro Tyr Phe Xaa Asp Tyr
1 5 10
<210> 203
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 203
Ala Arg Asp Arg Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 204
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 204
Gly Arg Asp Arg Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 205
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 205
Ser Arg Asp Arg Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 206
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 206
Thr Arg Asp Arg Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 207
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 207
Ala His Asp Arg Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 208
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 208
Ala Ile Asp Arg Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 209
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 209
Ala Leu Asp Arg Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 210
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 210
Ala Met Asp Arg Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 211
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 211
Ala Asn Asp Arg Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 212
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 212
Ala Gln Asp Arg Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 213
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 213
Ala Val Asp Arg Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 214
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 214
Ala Arg Asp Ala Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 215
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 215
Ala Arg Asp Asp Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 216
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 216
Ala Arg Asp Glu Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 217
Ala Arg Asp Ile Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 218
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 218
Ala Arg Asp Met Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 219
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 219
Ala Arg Asp Asn Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 220
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 220
Ala Arg Asp Gln Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 221
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 221
Ala Arg Asp Ser Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 222
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 222
Ala Arg Asp Arg Phe Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 223
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 223
Ala Arg Asp Arg Trp Pro Tyr Phe Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 224
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 224
Ala Arg Asp Arg Trp Pro Tyr Phe Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 225
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 225
Ala Arg Asp Arg Trp Pro Tyr Phe Trp Asp Tyr
1 5 10
<210> 226
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 变异体
<222> (2)..(2)
<223> X为R、A、D、E、I、M、N、Q或S
<220>
<221> 变异体
<222> (3)..(3)
<223> X为W或F
<220>
<221> 变异体
<222> (7)..(7)
<223> X为F、L、M或W
<400> 226
Asp Xaa Xaa Pro Tyr Phe Xaa Asp Tyr
1 5
<210> 227
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 227
Asp Arg Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5
<210> 228
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 228
Asp Ala Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5
<210> 229
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 229
Asp Asp Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5
<210> 230
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 230
Asp Glu Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5
<210> 231
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 231
Asp Ile Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5
<210> 232
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 232
Asp Met Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5
<210> 233
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 233
Asp Asn Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5
<210> 234
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 234
Asp Gln Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5
<210> 235
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 235
Asp Ser Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 236
Asp Arg Phe Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5
<210> 237
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 237
Asp Arg Trp Pro Tyr Phe Leu Asp Tyr
1 5
<210> 238
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 238
Asp Arg Trp Pro Tyr Phe Met Asp Tyr
1 5
<210> 239
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 239
Asp Arg Trp Pro Tyr Phe Trp Asp Tyr
1 5
<210> 240
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 240
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 241
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 241
Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Arg Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr
1 5 10 15
<210> 242
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 242
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Asn Ile Asn Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 243
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 243
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 244
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 244
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 245
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 245
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val Tyr
1 5 10 15
<210> 246
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 246
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr
1 5 10 15
<210> 247
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 247
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 248
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 248
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 249
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 249
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
20 25
<210> 250
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 250
Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10
<210> 251
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 251
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asp Asn Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Ser His Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 252
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 252
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 253
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 253
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
20 25
<210> 254
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 254
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10
<210> 255
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 255
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 256
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 256
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 257
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 257
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Arg Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Gly Ala Lys Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Asn Ile Asn Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Thr Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 258
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 258
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Gly Ala Lys Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Thr Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 259
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 259
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Gly Ala Lys Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Thr Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 260
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 260
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Trp Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Gly Ala Lys Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Thr Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 261
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 261
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Trp Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Gly Ala Lys Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 262
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 262
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Trp Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Gly Ala Lys Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Phe Thr Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 263
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 263
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Gly Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Gly Ala Lys Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Thr Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 264
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 264
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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<223> 合成多肽
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<220>
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<400> 317
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<220>
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<400> 318
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20 25 30
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35 40 45
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85 90 95
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100 105 110
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<220>
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<400> 319
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20
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<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 320
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<220>
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<220>
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<220>
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<210> 325
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 325
acactctgca ggagacagac tcttttccac agt 33
<210> 326
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 326
acactcagca cgggacaaac tcttctccac atg 33
<210> 327
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 327
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1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
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Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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<223> 合成多肽
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<223> 合成多肽
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<220>
<223> 合成多肽
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<223> 合成多肽
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130 135 140
Gly Tyr Phe Pro Ser Ser Val Lys Pro Ser Val Thr Trp Tyr Lys Gly
145 150 155 160
Cys Thr Glu Ile Val Asp Phe His Asn Val Leu Pro Glu Gly Met Asn
165 170 175
Leu Ser Phe Phe Ile Pro Leu Val Ser Asn Asn Gly Asn Tyr Thr Cys
180 185 190
Val Val Thr Tyr Pro Glu Asn Gly Arg Leu Phe His Leu Thr Arg Thr
195 200 205
Val Thr Val Lys Val Val Gly Ser Pro
210 215

Claims (79)

1.一种抗IL1RAP抗体，其包含：(i)第一轻链高变区(HVR-L1)、第二轻链高变区(HVR-L2)和第三轻链高变区(HVR-L3)和/或(ii)第一重链高变区(HVR-H1)、第二重链高变区(HVR-H2)和第三重链高变区(HVR-H3)；其中：
(a)HVR-L1包含氨基酸序列RASENIXXNXX(SEQ ID NO:10)，其中第7位的X为Y或W，第8位的X为S、H、K、L、M、N、Q、R或Y，第10位的X为L、A、G、I、M、N、Q、S、T、V或Y，并且第11位的X为A、G、N、S或T；
(b)HVR-L2包含氨基酸序列GXXNXAD(SEQ ID NO:36)，其中第2位的X为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，第3位的X为K、G或N，并且第5位的X为L、F、H、W或Y；
(c)HVR-L3包含氨基酸序列XXFXTXPRT(SEQ ID NO:62)，其中第1位的X为Q或S，第2位的X为H或S，第4位的X为W、A、F、G、H、I、K、L、M、V或Y，并且第6位的X为T、I或V；
(d)HVR-H1包含氨基酸序列XXXXXXX(SEQ ID NO:77)，其中第1位的X为F、A、D、E、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y，第2位的X为S、E、G、K、P、Q、R或T，第3位的X为N、D、E、G、K、Q或R，第4位的X为Y、A、D、E、H、S或V，第5位的X为A、N或S，第6位的X为M、V或W，并且第7位的X为S或G；
(e)HVR-H2包含氨基酸序列TXXXXXXXXYXLXDVKG(SEQ ID NO:140)，其中第2位的X为V、A、N或S，第3位的X为T或S，第4位的X为E、D、N、T或V，第5位的X为G、I、P、T或V，第6位的X为G、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，第7位的X为D、A、E、G、H、K、N、P、Q、R或S，第8位的X为Y或W，第9位的X为N、A、G、P或R，第11位的X为C、A、D、F、R、S、T、V或Y，并且第13位的X为D、S或W；
(f)HVR-H3包含氨基酸序列XXDXXPYFXDY(SEQ ID NO:202)，其中第1位的X为A、G、S或T，第2位的X为H、I、L、M、N、Q或V，第4位的X为R、A、D、E、I、M、N、Q或S，第5位的X为W或F，并且第9位的X为F、L、M或W。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中：
(a)HVR-L1包含选自SEQ ID NO:11-35的氨基酸序列；
(b)HVR-L2包含选自SEQ ID NO:37-61的氨基酸序列；
(c)HVR-L3包含选自SEQ ID NO:63-76的氨基酸序列；
(d)HVR-H1包含选自SEQ ID NO:78-120的氨基酸序列；
(e)HVR-H2包含选自SEQ ID NO:141-201的氨基酸序列；
(f)HVR-H3包含选自SEQ ID NO:203-225的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体，其中：
(a)HVR-L1包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；
(b)HVR-L2包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；
(c)HVR-L3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；
(d)HVR-H1包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；
(e)HVR-H2包含选自SEQ ID NO:141、184、185、186、187、188、189、190和191的氨基酸序列；
(f)HVR-H3包含SEQ ID NO:203的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的抗体，其中：
(a)HVR-L1包含选自SEQ ID NO:11、13和23的氨基酸序列；
(b)HVR-L2包含选自SEQ ID NO:37、38、45、49、54和61的氨基酸序列；
(c)HVR-L3包含选自SEQ ID NO:63、67、69、70、71、75和76的氨基酸序列；
(d)HVR-H1包含选自SEQ ID NO:78、81、90、92和118的氨基酸序列；
(e)HVR-H2包含选自SEQ ID NO:141、144、149、153、172、181、191、194、195、196、197、198、199、200和201的氨基酸序列；
(f)HVR-H3包含选自SEQ ID NO:203、214、215、220和222的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含互补决定区CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
(a)CDR-L1包含氨基酸序列RASENIXXNXX(SEQ ID NO:10)，其中第7位的X为Y或W，第8位的X为S、H、K、L、M、N、Q、R或Y，第10位的X为L、A、G、I、M、N、Q、S、T、V或Y，并且第11位的X为A、G、N、S或T；
(b)CDR-L2包含氨基酸序列GXXNXAD(SEQ ID NO:36)，其中第2位的X为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，第3位的X为K、G或N，并且第5位的X为L、F、H、W或Y；
(c)CDR-L3包含氨基酸序列XXFXTXPRT(SEQ ID NO:62)，其中第1位的X为Q或S，第2位的X为H或S，第4位的X为W、A、F、G、H、I、K、L、M、V或Y，并且第6位的X为T、I或V；
(d)CDR-H1包含氨基酸序列XXXXX(SEQ ID NO:121)，其中第1位的X为N、D、E、G、K、Q或R，第2位的X为Y、A、D、E、H、S或V，第3位的X为A、N或S，第4位的X为M、V或W，并且第5位的X为S或G；
(e)CDR-H2包含氨基酸序列TXXXXXXXXYXLXDVKG(SEQ ID NO:140)，其中第2位的X为V、A、N或S，第3位的X为T或S，第4位的X为E、D、N、T或V，第5位的X为G、I、P、T或V，第6位的X为G、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，第7位的X为D、A、E、G、H、K、N、P、Q、R或S，第8位的X为Y或W，第9位的X为N、A、G、P或R，第11位的X为C、A、D、F、R、S、T、V或Y，并且第13位的X为D、S或W；
(f)CDR-H3包含氨基酸序列DXXPYFXDY(SEQ ID NO:226)，其中第2位的X为R、A、D、E、I、M、N、Q或S，第3位的X为W或F，并且第7位的X为F、L、M或W。
6.根据权利要求5所述的抗体，其中：
(a)CDR-L1包含选自SEQ ID NO:11-35的氨基酸序列；
(b)CDR-L2包含选自SEQ ID NO:37-61的氨基酸序列；
(c)CDR-L3包含选自SEQ ID NO:63-76的氨基酸序列；
(d)CDR-H1包含选自SEQ ID NO:122-139的氨基酸序列；
(e)CDR-H2包含选自SEQ ID NO:141-201的氨基酸序列；
(f)CDR-H3包含选自SEQ ID NO:227-239的氨基酸序列。
7.根据权利要求5所述的抗体，其中：
(a)CDR-L1包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；
(b)CDR-L2包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；
(c)CDR-L3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；
(d)CDR-H1包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列；
(e)CDR-H2包含选自SEQ ID NO:141、184、185、186、187、188、189、190和191的氨基酸序列；
(f)CDR-H3包含SEQ ID NO:227的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含：
第一轻链构架区(FR-L1)，其包含SEQ ID NO:240的氨基酸序列；
第二轻链构架区(FR-L2)，其包含SEQ ID NO:241的氨基酸序列；
第三轻链构架区(FR-L3)，其包含SEQ ID NO:242的氨基酸序列；
第四轻链构架区(FR-L4)，其包含SEQ ID NO:243的氨基酸序列；
第一重链构架区(FR-H1)，其包含SEQ ID NO:249的氨基酸序列；
第二重链构架区(FR-H2)，其包含SEQ ID NO:250的氨基酸序列；
第三重链构架区(FR-H3)，其包含SEQ ID NO:251的氨基酸序列；
第四重链构架区(FR-H4)，其包含SEQ ID NO:252的氨基酸序列。
9.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含：
第一轻链构架区(FR-L1)，其包含SEQ ID NO:244的氨基酸序列；
第二轻链构架区(FR-L2)，其包含SEQ ID NO:245或246的氨基酸序列；
第三轻链构架区(FR-L3)，其包含SEQ ID NO:247的氨基酸序列；
第四轻链构架区(FR-L4)，其包含SEQ ID NO:248的氨基酸序列；
第一重链构架区(FR-H1)，其包含SEQ ID NO:253的氨基酸序列；
第二重链构架区(FR-H2)，其包含SEQ ID NO:254的氨基酸序列；
第三重链构架区(FR-H3)，其包含SEQ ID NO:255的氨基酸序列；
第四重链构架区(FR-H4)，其包含SEQ ID NO:256的氨基酸。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含与选自SEQ ID NO:257、258或259的序列具有至少90％一致性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列；和/或与选自SEQ ID NO:279、285或290的序列具有至少90％一致性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:257具有至少90％一致性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:279具有至少90％一致性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:258或259具有至少90％一致性的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:285或290具有至少90％一致性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列。
13.根据权利要求10所述的抗体，其中所述抗体包含选自SEQ ID NO:257-278的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列。
14.根据权利要求10所述的抗体，其中所述抗体包含选自SEQ ID NO:279-310的重链可变结构域(VH)氨基酸序列。
15.根据权利要求10所述的抗体，其中所述抗体包含：
SEQ ID NO:259的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列和SEQ ID NO:290的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
SEQ ID NO:268的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列和SEQ ID NO:307的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
SEQ ID NO:268的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列和SEQ ID NO:298的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
SEQ ID NO:269的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列和SEQ ID NO:307的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
SEQ ID NO:269的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列和SEQ ID NO:298的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
SEQ ID NO:269的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列和SEQ ID NO:297的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
SEQ ID NO:270的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列和SEQ ID NO:307的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；或
SEQ ID NO:270的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列和SEQ ID NO:298的重链可变结构域(VH)氨基酸序列。
16.根据权利要求1至13中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含与选自SEQ ID NO:328、329、330或331的序列具有至少90％一致性的轻链(LC)氨基酸序列；和/或与选自SEQID NO:332、333、334、335或336的序列具有至少90％一致性的重链(HC)氨基酸序列。
17.根据权利要求14所述的抗体，其中所述抗体包含选自SEQ ID NO:328-331的轻链(LC)氨基酸序列。
18.根据权利要求14所述的抗体，其中所述抗体包含选自SEQ ID NO:332-336的重链(HC)氨基酸序列。
19.根据权利要求14所述的抗体，其中所述抗体包含：
SEQ ID NO:328的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:332的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:329的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:335的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:329的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:336的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:329的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:333的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:329的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:334的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:330的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:335的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:330的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:336的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:330的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:333的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:330的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:334的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:331的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:335的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:331的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:336的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:331的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:333的重链(HC)氨基酸序列；或
SEQ ID NO:331的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:334的重链(HC)氨基酸序列。
20.一种抗IL1RAP抗体，其包含：
SEQ ID NO:11的第一轻链高变区(HVR-L1)、SEQ ID NO:37的第二轻链高变区(HVR-L2)、SEQ ID NO:63的第三轻链高变区(HVR-L3)；和/或SEQ ID NO:78的第一重链高变区(HVR-H1)、SEQ ID NO:191的第二重链高变区(HVR-H2)和SEQ ID NO:203的第三重链高变区(HVR-H3)；
SEQ ID NO:11的第一轻链高变区(HVR-L1)、SEQ ID NO:54的第二轻链高变区(HVR-L2)、SEQ ID NO:63的第三轻链高变区(HVR-L3)；和/或SEQ ID NO:78的第一重链高变区(HVR-H1)、SEQ ID NO:191的第二重链高变区(HVR-H2)和SEQ ID NO:215的第三重链高变区(HVR-H3)；
SEQ ID NO:11的第一轻链高变区(HVR-L1)、SEQ ID NO:54的第二轻链高变区(HVR-L2)、SEQ ID NO:63的第三轻链高变区(HVR-L3)；和/或SEQ ID NO:78的第一重链高变区(HVR-H1)、SEQ ID NO:195的第二重链高变区(HVR-H2)和SEQ ID NO:203的第三重链高变区(HVR-H3)；
SEQ ID NO:11的第一轻链高变区(HVR-L1)、SEQ ID NO:54的第二轻链高变区(HVR-L2)、SEQ ID NO:63的第三轻链高变区(HVR-L3)；和/或SEQ ID NO:78的第一重链高变区(HVR-H1)、SEQ ID NO:191的第二重链高变区(HVR-H2)和SEQ ID NO:215的第三重链高变区(HVR-H3)；
SEQ ID NO:11的第一轻链高变区(HVR-L1)、SEQ ID NO:54的第二轻链高变区(HVR-L2)、SEQ ID NO:69的第三轻链高变区(HVR-L3)；和/或SEQ ID NO:78的第一重链高变区(HVR-H1)、SEQ ID NO:195的第二重链高变区(HVR-H2)和SEQ ID NO:203的第三重链高变区(HVR-H3)；
SEQ ID NO:11的第一轻链高变区(HVR-L1)、SEQ ID NO:54的第二轻链高变区(HVR-L2)、SEQ ID NO:70的第三轻链高变区(HVR-L3)；和/或SEQ ID NO:78的第一重链高变区(HVR-H1)、SEQ ID NO:191的第二重链高变区(HVR-H2)和SEQ ID NO:215的第三重链高变区(HVR-H3)；或
SEQ ID NO:11的第一轻链高变区(HVR-L1)、SEQ ID NO:54的第二轻链高变区(HVR-L2)、SEQ ID NO:70的第三轻链高变区(HVR-L3)；和/或SEQ ID NO:78的第一重链高变区(HVR-H1)、SEQ ID NO:195的第二重链高变区(HVR-H2)和SEQ ID NO:203的第三重链高变区(HVR-H3)。
21.一种抗IL1RAP抗体，其包含：
SEQ ID NO:11的第一轻链互补决定区(CDR-L1)、SEQ ID NO:37的第二轻链互补决定区(CDR-L2)、SEQ ID NO:63的第三轻链互补决定区(CDR-L3)；和/或SEQ ID NO:122的第一重链互补决定区(CDR-H1)、SEQ ID NO:191的第二重链互补决定区(CDR-H2)和SEQ ID NO:227的第三重链互补决定区(CDR-H3)；
SEQ ID NO:11的第一轻链互补决定区(CDR-L1)、SEQ ID NO:54的第二轻链互补决定区(CDR-L2)、SEQ ID NO:63的第三轻链互补决定区(CDR-L3)；和/或SEQ ID NO:122的第一重链互补决定区(CDR-H1)、SEQ ID NO:191的第二重链互补决定区(CDR-H2)和SEQ ID NO:229的第三重链互补决定区(CDR-H3)；
SEQ ID NO:11的第一轻链互补决定区(CDR-L1)、SEQ ID NO:54的第二轻链互补决定区(CDR-L2)、SEQ ID NO:63的第三轻链互补决定区(CDR-L3)；和/或SEQ ID NO:122的第一重链互补决定区(CDR-H1)、SEQ ID NO:195的第二重链互补决定区(CDR-H2)和SEQ ID NO:227的第三重链互补决定区(CDR-H3)；
SEQ ID NO:11的第一轻链互补决定区(CDR-L1)、SEQ ID NO:54的第二轻链互补决定区(CDR-L2)、SEQ ID NO:63的第三轻链互补决定区(CDR-L3)；和/或SEQ ID NO:122的第一重链互补决定区(CDR-H1)、SEQ ID NO:191的第二重链互补决定区(CDR-H2)和SEQ ID NO:229的第三重链互补决定区(CDR-H3)；
SEQ ID NO:11的第一轻链互补决定区(CDR-L1)、SEQ ID NO:54的第二轻链互补决定区(CDR-L2)、SEQ ID NO:69的第三轻链互补决定区(CDR-L3)；和/或SEQ ID NO:122的第一重链互补决定区(CDR-H1)、SEQ ID NO:195的第二重链互补决定区(CDR-H2)和SEQ ID NO:227的第三重链互补决定区(CDR-H3)；
SEQ ID NO:11的第一轻链互补决定区(CDR-L1)、SEQ ID NO:54的第二轻链互补决定区(CDR-L2)、SEQ ID NO:70的第三轻链互补决定区(CDR-L3)；和/或SEQ ID NO:122的第一重链互补决定区(CDR-H1)、SEQ ID NO:191的第二重链互补决定区(CDR-H2)和SEQ ID NO:229的第三重链互补决定区(CDR-H3)；或
SEQ ID NO:11的第一轻链互补决定区(CDR-L1)、SEQ ID NO:54的第二轻链互补决定区(CDR-L2)、SEQ ID NO:70的第三轻链互补决定区(CDR-L3)；和/或SEQ ID NO:122的第一重链互补决定区(CDR-H1)、SEQ ID NO:195的第二重链互补决定区(CDR-H2)和SEQ ID NO:227的第三重链互补决定区(CDR-H3)。
22.一种抗IL1RAP抗体，其包含：
SEQ ID NO:259的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列和SEQ ID NO:290的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
SEQ ID NO:268的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列和SEQ ID NO:307的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
SEQ ID NO:268的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列和SEQ ID NO:298的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
SEQ ID NO:269的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列和SEQ ID NO:307的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
SEQ ID NO:269的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列和SEQ ID NO:298的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
SEQ ID NO:269的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列和SEQ ID NO:297的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；
SEQ ID NO:270的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列和SEQ ID NO:307的重链可变结构域(VH)氨基酸序列；或
SEQ ID NO:270的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列和SEQ ID NO:298的重链可变结构域(VH)氨基酸序列。
23.一种抗IL1RAP抗体，其包含：
SEQ ID NO:328的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:332的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:329的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:335的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:329的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:336的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:329的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:333的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:329的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:334的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:330的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:335的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:330的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:336的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:330的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:333的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:330的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:334的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:331的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:335的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:331的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:336的重链(HC)氨基酸序列；
SEQ ID NO:331的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:333的重链(HC)氨基酸序列；或
SEQ ID NO:331的轻链(LC)氨基酸序列和SEQ ID NO:334的重链(HC)氨基酸序列。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的抗体，其中所述抗体以1×10-8M或更小、1×10- 9M或更小、1×10-10M或更小或1×10-11M或更小的结合亲和力结合到人类IL1RAP；任选地，其中所述结合亲和力通过对SEQ ID NO:3的hu-M-IL1RAP多肽的平衡解离常数(KD)来测量。
25.根据权利要求1至23中任一项所述的抗体，其中所述抗体使IL-1刺激信号、IL-33刺激信号和/或IL-36刺激信号降低至少90％、至少95％、至少99％或100％；任选地，其中所述信号的降低通过基于细胞的阻断分析来测量。
26.根据权利要求25所述的抗体，其中所述抗体使IL-1刺激信号、IL-33刺激信号和IL-36刺激信号降低至少95％或至少99％。
27.根据权利要求25所述的抗体，其中所述IL-1、IL-33和/或IL-36刺激信号由选自IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ的激动剂刺激。
28.根据权利要求25所述的抗体，其中在约EC50的激动剂浓度下，所述抗体的IC50为10nM或更低、5nM或更低或1nM或更低。
29.根据权利要求1至23中任一项所述的抗体，其中所述抗体使由结合到其同源受体的IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ激动剂中的一种或多种引发的胞内信号降低至少90％、至少95％、至少99％或100％；任选地，其中所述胞内信号的降低通过基于细胞的阻断分析来测量。
30.根据权利要求29所述的抗体，其中所述抗体使由IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ激动剂结合引发的胞内信号降低至少95％或至少99％。
31.根据权利要求29所述的抗体，其中在约EC50的IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ浓度下，所述抗体的IC50为10nM或更低、5nM或更低，或1nM或更低。
32.根据权利要求31所述的抗体，其中在约EC50的IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ浓度下，所述抗体的IC50为5nM或更低。
33.根据权利要求1至23中任一项所述的抗体，其中所述抗体抑制IL-1α、IL-1β和/或IL-36β刺激的IL8从原代人肺成纤维细胞(PHLF)的释放；任选地，其中在约EC50的IL-1α、IL-1β和/或IL-36β浓度下，所述抗体的IC50为10nM或更低、5nM或更低或1nM或更低。
34.根据权利要求1至23中任一项所述的抗体，其中所述抗体抑制IL-1β刺激的IL6从原代人单核细胞的释放；任选地，其中在约EC50的IL-1β浓度下，所述抗体的IC50为10nM或更低、5nM或更低或1nM或更低。
35.根据权利要求1至23中任一项所述的抗体，其中所述抗体抑制IL-33刺激的INF-γ从人类自然杀伤(NK)细胞的释放；任选地，其中在约EC50的IL-33浓度下，所述抗体的IC50为10nM或更低、5nM或更低或1nM或更低。
36.根据权利要求1至23中任一项所述的抗体，其中所述抗体抑制IL-36β刺激的IL8从人表皮角质形成细胞(HEKn)的释放；任选地，其中在约EC60的IL-36β浓度下，所述抗体的IC50为10nM或更低、5nM或更低或2nM或更低。
37.根据权利要求1至23中任一项所述的抗体，其中所述抗体抑制嗜碱粒细胞中IL-33刺激的磷酸化；任选地，其中在约EC56的IL-33浓度下，所述抗体的IC50为75nM或更低、50nM或更低或45nM或更低。
38.根据权利要求1至23中任一项所述的抗体，其中所述抗体抑制IL-33刺激的INF-γ从CD4+T细胞的释放；任选地，其中在约EC34的IL-33浓度下，所述抗体的IC50为75nM或更低、50nM或更低或45nM或更低。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的抗体，其中所述抗体特异性结合到人类IL1RAP的结构域3内的一个或多个氨基酸残基，其中结构域3包含SEQ ID NO:1或3的氨基酸序列的第238-367位。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的抗体，其中所述抗体特异性结合到SEQ ID NO:1或3的氨基酸序列的第243-255位、第257-268位和/或第333-336位。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的抗体，其中所述抗体不结合到人类IL1RAP的结构域1或结构域2内的氨基酸残基；任选地，其中结构域1和结构域2包含SEQ ID NO:1或3的氨基酸序列的第21-237位。
42.根据权利要求1至41中任一项所述的抗体，其中所述抗体与SEQ ID NO:8的食蟹猴IL1RAP多肽交叉反应。
43.根据权利要求1至42中任一项所述的抗体，其中所述抗体与SEQ ID NO:9的小鼠IL1RAP多肽交叉反应。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。
45.根据权利要求1至43中任一项所述的抗体，其中所述抗体为重组抗体。
46.根据权利要求1至43中任一项所述的抗体，其中所述抗体为嵌合抗体。
47.根据权利要求1至43中任一项所述的抗体，其中所述抗体为人源化或人类抗体。
48.根据权利要求1至47中任一项所述的抗体，其中所述抗体为任选地选自由以下组成的群组的抗体片段：F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、单结构域抗体(VHH)、单臂抗体和scFv。
49.根据权利要求1至47中任一项所述的抗体，其中所述抗体为IgG类的全长抗体；任选地，其中所述IgG类抗体具有选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的同种型。
50.根据权利要求49所述的抗体，其中所述抗体为Fc区变异体；任选地其中所述Fc区变异体改变效应子功能或改变半衰期；任选地其中所述半衰期增加到至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天或更久。
51.根据权利要求50所述的抗体，其中所述Fc区变异体包含YTE突变的集合；任选地其中所述YTE突变包含以下氨基酸取代：M252Y、S254T和T256E。
52.根据权利要求50所述的抗体，其中所述Fc区变异体降低效应子功能和/或产生无效应子抗体。
53.根据权利要求52所述的抗体，其中所述Fc区变异体包含第297位的氨基酸取代；任选地其中第297位的氨基酸取代为N297G。
54.根据权利要求1至43中任一项所述的抗体，其中所述抗体为免疫缀合物；任选地，其中所述免疫缀合物包含用于治疗IL1RAP介导的病况或疾病的治疗剂；任选地，其中所述治疗剂为用于治疗癌症的化学治疗剂或细胞毒性剂。
55.根据权利要求1至43中任一项所述的抗体，其中所述抗体为多特异性抗体，任选地双特异性抗体。
56.根据权利要求1至55中任一项所述的抗体，其中所述抗体为合成抗体，其包含移植到除免疫球蛋白骨架或免疫球蛋白框架之外的骨架上的CDR、任选地选自替代蛋白骨架的骨架和人造聚合物骨架。
57.一种抗IL1RAP抗体，其与根据权利要求1至56中任一项所述的抗体特异性结合到相同的表位。
58.一种抗IL1RAP，其中所述抗体特异性结合到IL1RAP的结构域3内的一个或多个氨基酸残基，其中结构域3包含SEQ ID NO:1或3的所述氨基酸序列的第238-367位。
59.根据权利要求58所述的抗体，其中所述抗体特异性结合到SEQ ID NO:1或3的所述氨基酸序列的第243-255位、第257-268位和/或第333-336位。
60.一种分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1至59中任一项所述的抗体。
61.根据权利要求60所述的多核苷酸，其还包含编码信号肽(SP)的核苷酸序列。
62.根据权利要求60所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码轻链和重链。7
63.根据权利要求60所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含选择用于在哺乳动物细胞中最佳表达所述抗体的一个或多个密码子。
64.根据权利要求60所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列包含选择用于在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中最佳表达所述抗体的一个或多个密码子。
65.一种载体，其包含根据权利要求60至64中任一项所述的多核苷酸。
66.一种分离的宿主细胞，其包含根据权利要求65所述的载体。
67.一种宿主细胞，其包含根据权利要求60至64中任一项所述的多核苷酸。
68.一种分离的宿主细胞，其表达根据权利要求1至59中任一项所述的抗体。
69.根据权利要求68所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、骨髓瘤细胞(例如，Y0、NS0、Sp2/0)、猴肾细胞(COS-7)、人胚肾系(293)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞尔托利氏细胞(例如，TM4)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤细胞、TRI细胞、MRC5细胞和FS4细胞。
70.一种产生抗体的方法，其包含培养根据权利要求66至69中任一项所述的宿主细胞，从而产生抗体。
71.一种杂交瘤，其产生根据权利要求1至59中任一项所述的抗体。
72.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至59中任一项所述的抗体和药学上可接受的载剂。
73.根据权利要求72所述的药物组合物，其中所述组合物还包含用于治疗IL-1、IL-33、IL-36和/或IL1RAP介导的疾病或病况的治疗剂；任选地，其中所述治疗剂为化学治疗剂。
74.一种在受试者中治疗IL1RAP介导的疾病的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至59中任一项所述的抗体或治疗有效量的根据权利要求72所述的药物组合物。
75.一种在受试者中治疗由IL-1、IL-33和/或IL-36信号传导介导的疾病的方法，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至59中任一项所述的抗体或治疗有效量的根据权利要求72所述的药物组合物。
76.一种在受试者中治疗由IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ刺激的信号传导介导的疾病的方法，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至59中任一项所述的抗体或治疗有效量的根据权利要求72所述的药物组合物。
77.根据权利要求74至77中任一项所述的方法，其中所述疾病选自：痤疮、急性胰腺炎、急性重度溃疡性结肠炎、成人斯蒂尔病、年龄相关性黄斑变性(AMD)、气道高反应性、气道炎症、过敏性结膜炎、过敏性鼻炎、过敏、阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、过敏反应、关节炎疼痛、哮喘、动脉粥样硬化、特应性皮炎、特应性湿疹、自身免疫性血管炎、白塞氏病、骨癌、脑癌、乳癌、恶病质/厌食、软骨损伤、脑缺血、慢性疲劳综合症、慢性阻塞性肺病、梭菌属相关疾病、结肠癌、充血性心脏衰竭、结膜炎、冠状动脉旁路移植术、冠状动脉再狭窄、克罗恩氏病、糖尿病、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病变、干眼病、子宫内膜异位症、嗜酸性粒细胞相关的胃肠道病症、嗜酸性粒细胞性食管炎、家族性寒冷性自身炎性综合症、家族性地中海热、发热、纤维肌痛、纤维化病症、食物过敏、泛发性脓疱型牛皮癣、青光眼、肾小球肾炎、痛风性关节炎、移植物抗宿主疾病、蠕虫感染、出血性休克、化脓性汗腺炎、痛觉过敏、高IgD综合症、高尿酸血症、特发性肺纤维化(IPF)、癌症相关的疼痛、感染、炎性肠病(IBD)、由劳损引起的发炎病况、与角膜移植相关的炎性眼病、炎性疼痛、流感、肠癌、局部缺血、幼年型关节炎、川崎氏病、肾癌、先天性利伯氏黑蒙、肝癌、肝病、肺癌、穆-韦二氏综合症、多发性骨髓瘤、多发性硬化症、肌肉骨骼疼痛、骨髓性和其它白血病、心肌功能障碍、肌病、鼻息肉、新生儿发病的多系统炎性疾病、神经毒性、非传染性结膜炎、非小细胞肺癌、骨科手术、骨关节炎、骨质疏松、疼痛、掌跖脓疱病、胰脏癌、帕金森氏病、牙周病、周围血管疾病、风湿性多肌痛、息肉样脉络膜血管病(PCV)、早产、前列腺癌、原虫感染、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、坏疽性脓皮病、再灌注损伤、呼吸道合胞病毒(RSV)、再狭窄、视网膜脱离、色素性视网膜炎、早产儿视网膜病变(ROP)、类风湿性关节炎、败血性休克、镰状细胞性贫血、放射疗法的副作用、鼻窦炎、皮肤癌、睡眠障碍、扭伤、斯特格氏病、胃癌、颞下颌关节病、TNF受体相关的周期性综合症、移植排斥、创伤、眼外伤、2型糖尿病、溃疡性结肠炎和葡萄膜炎。
78.一种治疗受试者的哮喘的方法，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至59中任一项所述的抗体或治疗有效量的根据权利要求73所述的药物组合物。
79.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至59中任一项所述的抗体或治疗有效量的根据权利要求73所述的药物组合物；任选地，其中所述癌症选自乳癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、胰脏癌。
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