KR20210045442A - 항-il1rap 항체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

항-il1rap 항체 및 이의 사용 방법 Download PDF

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KR20210045442A
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데이비드 폴레티
에릭 카러
저메인 퍼켈리
크리스티 이바라
취엔 정
야오밍 황
린지 데이스
크리스틴 워락
도미닉 새뮤얼 번즈
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23앤드미 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 인간 인터류킨-1 수용체 보조 단백질(hu-IL1RAP)에 특이적으로 결합하고 IL-1, IL-33 및 IL-36 세포내 신호전달 경로를 완전히 차단하는 결합 단백질, 예컨대, 항체 및 항원-결합 단편을 제공한다. 이러한 결합 단백질을 포함하는 조성물, 그리고 이러한 결합 단백질을 제조하는 방법 및 이러한 결합 단백질을 사용하는 방법이 또한 제공된다.

Description

항-IL1RAP 항체 및 이의 사용 방법
상호 참조
본 출원은 2018년 8월 17일자로 출원된 미국 가출원 제62/719,397호에 대한 우선권을 주장하며, 이에 의해 이 기초 출원은 모든 목적을 위하여 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
발명의 기술분야
본 개시내용은 일반적으로 인터류킨-1 수용체 보조 단백질에 결합하는, 결합 단백질, 예컨대, 항체 및 항원-결합 단편 및 이러한 결합 단백질을 사용하는 방법에 관한 것이다.
서열 목록에 대한 참조
서열 목록의 정식 사본은, EFS-Web을 통해서, 2019년 8월 15일자로 작성되고 크기가 180,889바이트인 "09402-002US1_SeqListing_ST25.txt"라는 명칭의 ASCII 포맷화된 텍스트 파일로 동시에 제출된다. EFS-Web을 통해 제출된 서열 목록은 본 명세서의 일부이고 그의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
사이토카인 리간드 및 수용체의 인터류킨-1(IL-1) 패밀리는 염증, 자가면역, 면역 조절, 세포 증식 ?? 숙주 방어와 연관되고, 염증성, 자가면역, 면역 조절, 퇴행성, 및 세포 증식(예컨대, 암) 질환 및 장애의 병리에 기여하고, 이의 사이토카인 및 수용체는 이러한 질환 및 장애의 병원성 매개체로서 역할한다. 예컨대, 문헌[Garlanda et al., Immunity, 39:1003-1018 (2013)] 참조.
사이토카인의 IL-1 패밀리는 인터류킨-1 알파(IL-1 알파 또는 IL-1a 또는 IL-1α), 인터류킨-1 베타(IL-1β 또는 IL-1b), 인터류킨-33(IL-33), 인터류킨-36 알파(IL-36 알파 또는 IL-36α), 인터류킨-36 베타(IL-36β 또는 IL-36b), 및 인터류킨-36 감마(IL-36 감마 또는 IL-36γ)를 포함한다. 이들 사이토카인의 각각은 소정의 세포의 표면에 발현된 특정 IL-1 패밀리 세포막 수용체에 결합할 수 있는 리간드로서 역할한다. IL-1 패밀리 사이토카인이 이의 동족 수용체에 결합 시, 공동-수용체가 동원되어 사이토카인, 이의 동족체 막 수용체 및 이의 공동-수용체를 포함하는 삼원 복합체를 형성한다. 얻어지는 삼원 복합체는 NF-κB 및 AP-1를 포함하는 전사 인자 및 미토겐-활성화 단백질 키나제의 세포내 신호 전달 및 활성화를 용이하게 하여, 많은 사이토카인, 케모카인, 효소 및 접착 분자의 생산을 비롯하여, 염증 반응 및 면역 반응의 캐스케이드를 촉발시킨다.
인터류킨-1 수용체 보조 단백질(interleukin-1 receptor accessory protein: IL1RAP)은 인터류킨-1 수용체 1(IL1R1), ST2(인터류킨-1 수용체-유사 1 또는 IL1RL1이라고도 공지됨), 및 인터류킨-1 수용체-유사 2(IL1RL2)를 포함하는 IL-1 패밀리에서 몇 가지 수용체에 대해서 공통 세포막 공동-수용체로서 역할한다. IL1RAP는 위에서 언급된 IL-1 패밀리 사이토카인, 사이토카인의 특정 동족체 수용체, 및 IL1RAP 공동-수용체 중 하나에 의해 형성된 삼원 신호전달 복합체의 필수 성분이다. 따라서, IL1RAP는 IL-1 패밀리 신호 전달 경로에서 중요한 기능을 제공하는데, 그 이유는 IL-1 패밀리 사이토카인인 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ에 의해 자극된 특정 다운스트림 신호전달 경로를 촉진시키기 위하여 필요로 되기 때문이다.
WO2012098407A1은 IL1RAP를 발현하는 고형 종양과 연관된 세포의 성장 및/또는 증식을 저해하고/하거나 세포사를 유도하는데 사용하기 위한 IL1RAP에 대한 특이성을 갖는 결합 모이어티, 예컨대, 항체를 포함하는 제제에 관한 것이다. WO2012098407A1은, 생체내에 투여되는 경우, 흑색종 마우스 모델에서 종양 성장의 통계학적으로 유의한 지연을 초래하는, 인간 IL1RAP에 대한 마우스 IgG2a 단클론성 항체인 "mAb 81.2"를 개시하고 있다.
WO2015132602A1은 인간 IL1RAP에 대하여 특이성을 가진 항체 및 고형 종양의 치료를 위한 이의 용도에 관한 것이다. WO2015132602A1은 인간 IL1RAP의 도메인 2에 200pM의 KD로 특이적으로 결합하고, 시노몰구스 원숭이 IL1RAP와 교차 반응하여 하나 이상의 암 세포주(예컨대, CML)에서 ADCC를 유도할 수 있고, IL-1α, IL-1β 및 IL-33 자극된 신호전달에 대한 일부 저해 효과를 갖는 특이적 마우스-유래 항체 "CAN04"를 개시한다.
WO2016020502A1은 인간 IL1RAP의 도메인 3에 각각 1.4 및 0.9nM의 KD로 특이적으로 결합하고, 시노몰구스 원숭이 IL1RAP와 교차 결합하고, 하나 이상의 암 세포주(예컨대, CML)에서 ADCC를 유도할 수 있는 2가지 특이적 마우스-유래 항체 "CAN01" 및 "CAN03"을 개시한다. CAN03은 IL-1α, IL-1β 및 IL-33 자극된 신호전달에 대한 일부 저해 효과를 갖는 것으로 결정된 반면, CAN01은 IL-1α, IL-1β 및 IL-33 신호전달에 대한 감지 가능한 저해 작용을 결여하는 것으로 발견되었다.
WO2016207304A1은 인간 IL-1RAcP에 특이적으로 결합하고 IL-1α, IL-1β, IL-33 및/또는 IL-36β에 의해 자극된 NFkB 활성도에 대해서 일부 저해 효과를 갖는 토끼-유래 항체에 관한 것이다.
WO2017191325A9는 인간 IL-1R3에 특이적으로 결합하고 IL-1α, IL-1β, IL-33 및/또는 IL-36β에 의해 자극된 NFkB 활성도에 대해서 일부 저해 효과를 갖는 인간화 IgG1 항체에 관한 것이다.
사이토카인 리간드 및 수용체의 IL-1 패밀리와 연관된 염증성, 자가면역, 면역 조절, 퇴행성 및 세포 증식 질환 또는 장애를 치료, 개선 또는 예방하는 요법에 대한 필요가 있다. 본 개시내용은 이들 및 기타 요구를 이행한다.
본 개시내용은 인간 IL1RAP에 높은 친화도로 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 항체는 이하의 작용제: IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ 중 하나 이상의 결합에 의해 자극된 신호전달을 비롯한 IL-1, IL-33 및/또는 IL-36 신호전달 경로를 감소, 저해 및/또는 완전-차단할 수 있다. 본 개시내용은 또한 IL-1, IL-33 및/또는 IL-36 신호전달의 저해에 반응하는 질환 및 병태를 치료하는 방법을 제공한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 (i) 제1 경쇄 초가변 영역(HVR-L1), 제2 경쇄 초가변 영역(HVR-L2) 및 제3 경쇄 초가변 영역(HVR-L3), 및/또는 (ii) 제1 중쇄 초가변 영역(HVR-H1), 제2 중쇄 초가변 영역(HVR-H2) 및 제3 중쇄 초가변 영역(HVR-H3)을 포함하는 항-IL1RAP 항체를 제공하되, 여기서:
(a) HVR-L1은 아미노산 서열 RASENIXXNXX(서열번호 10)를 포함하되, 위치 7에서의 X는 Y 또는 W이고, 위치 8에서의 X는 S, H, K, L, M, N, Q, R 또는 Y이고, 위치 10에서의 X는 L, A, G, I, M, N, Q, S, T, V 또는 Y이고, 그리고 위치 11에서의 X는 A, G, N, S 또는 T이고;
(b) HVR-L2는 아미노산 서열 GXXNXAD(서열번호 36)를 포함하되, 위치 2에서의 X는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y이고, 위치 3에서의 X는 K, G 또는 N이고, 그리고 위치 5에서의 X는 L, F, H, W 또는 Y이고;
(c) HVR-L3은 아미노산 서열 XXFXTXPRT(서열번호 62)를 포함하되, 위치 1에서의 X는 Q 또는 S이고, 위치 2에서의 X는 H 또는 S이고, 위치 4에서의 X는 W, A, F, G, H, I, K, L, M, V 또는 Y이고, 그리고 위치 6에서의 X는 T, I 또는 V이고;
(d) HVR-H1은 아미노산 서열 XXXXXXX(서열번호 77)를 포함하되, 위치 1에서의 X는 F, A, D, E, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, W 또는 Y이고, 위치 2에서의 X는 S, E, G, K, P, Q, R 또는 T이고, 위치 3에서의 X는 N, D, E, G, K, Q 또는 R이고, 위치 4에서의 X는 Y, A, D, E, H, S 또는 V이고, 위치 5에서의 X는 A, N 또는 S이고, 위치 6에서의 X는 M, V 또는 W이고, 그리고 위치 7에서의 X는 S 또는 G이고;
(e) HVR-H2는 아미노산 서열 TXXXXXXXXYXLXDVKG(서열번호 140)를 포함하되, 위치 2에서의 X는 V, A, N 또는 S이고, 위치 3에서의 X는 T 또는 S이고, 위치 4에서의 X는 E, D, N, T 또는 V이고, 위치 5에서의 X는 G, I, P, T 또는 V이고, 위치 6에서의 X는 G, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y이고, 위치 7에서의 X는 D, A, E, G, H, K, N, P, Q, R 또는 S이고, 위치 8에서의 X는 Y 또는 W이고, 위치 9에서의 X는 N, A, G, P 또는 R이고, 위치 11에서의 X는 C, A, D, F, R, S, T, V 또는 Y이고, 그리고 위치 13에서의 X는 D, S 또는 W이고;
(f) HVR-H3은 아미노산 서열 XXDXXPYFXDY(서열번호 202)를 포함하되, 위치 1에서의 X는 A, G, S 또는 T이고, 위치 2에서의 X는 H, I, L, M, N, Q 또는 V이고, 위치 4에서의 X는 R, A, D, E, I, M, N, Q 또는 S이고, 위치 5에서의 X는 W 또는 F이고, 그리고 위치 9에서의 X는 F, L, M 또는 W이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 (i) 제1 경쇄 초가변 영역(HVR-L1), 제2 경쇄 초가변 영역(HVR-L2) 및 제3 경쇄 초가변 영역(HVR-L3), 및/또는 (ii) 제1 중쇄 초가변 영역(HVR-H1), 제2 중쇄 초가변 영역(HVR-H2) 및 제3 중쇄 초가변 영역(HVR-H3)을 포함하는 항-IL1RAP 항체를 제공하되, 여기서: (a) HVR-L1은 서열번호 11 내지 35로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;(b) HVR-L2는 서열번호 37 내지 61로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; (c) HVR-L3은 서열번호 63 내지 76으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; (d) HVR-H1은 서열번호 78 내지 120으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; (e) HVR-H2는 서열번호 141 내지 201로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; (f) HVR-H3은 서열번호 203 내지 225로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 (i) 제1 경쇄 초가변 영역(HVR-L1), 제2 경쇄 초가변 영역(HVR-L2) 및 제3 경쇄 초가변 영역(HVR-L3), 및/또는 (ii) 제1 중쇄 초가변 영역(HVR-H1), 제2 중쇄 초가변 영역(HVR-H2) 및 제3 중쇄 초가변 영역(HVR-H3)을 포함하는 항-IL1RAP 항체를 제공하되, 여기서: (a) HVR-L1은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고; (b) HVR-L2는 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하고; (c) HVR-L3은 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하고; (d) HVR-H1은 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하고; (e) HVR-H2는 서열번호 141, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190 및 191로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; (f) HVR-H3은 서열번호 203의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 (i) 제1 경쇄 초가변 영역(HVR-L1), 제2 경쇄 초가변 영역(HVR-L2) 및 제3 경쇄 초가변 영역(HVR-L3), 및/또는 (ii) 제1 중쇄 초가변 영역(HVR-H1), 제2 중쇄 초가변 영역(HVR-H2) 및 제3 중쇄 초가변 영역(HVR-H3)을 포함하는 항-IL1RAP 항체를 제공하되, 여기서: (a) HVR-L1은 서열번호 11, 13 및 23으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; (b) HVR-L2는 서열번호 37, 38, 45, 49, 54 및 61로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; (c) HVR-L3은 서열번호 63, 67, 69, 70, 71, 75 및 76으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; (d) HVR-H1은 서열번호 78, 81, 90, 92 및 118로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; (e) HVR-H2는 서열번호 141, 144, 149, 153, 172, 181, 191, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200 및 201로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; (f) HVR-H3은 서열번호 203, 214, 215, 220 및 222로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체는 상보성 결정 영역 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하며, 여기서:
(a) CDR-L1은 아미노산 서열 RASENIXXNXX(서열번호 10)를 포함하되, 여기서 위치 7에서의 X는 Y 또는 W이고, 위치 8에서의 X는 S, H, K, L, M, N, Q, R 또는 Y이고, 위치 10에서의 X는 L, A, G, I, M, N, Q, S, T, V 또는 Y이고, 그리고 위치 11에서의 X는 A, G, N, S 또는 T이고;
(b) CDR-L2는 아미노산 서열 GXXNXAD(서열번호 36)를 포함하되, 위치 2에서의 X는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y이고, 위치 3에서의 X는 K, G 또는 N이고, 그리고 위치 5에서의 X는 L, F, H, W 또는 Y이고;
(c) CDR-L3은 아미노산 서열 XXFXTXPRT(서열번호 62)를 포함하되, 위치 1에서의 X는 Q 또는 S이고, 위치 2에서의 X는 H 또는 S이고, 위치 4에서의 X는 W, A, F, G, H, I, K, L, M, V 또는 Y이고, 그리고 위치 6에서의 X는 T, I 또는 V이고;
(d) CDR-H1은 아미노산 서열 XXXXX(서열번호 121)를 포함하되, 위치 1에서의 X는 N, D, E, G, K, Q 또는 R이고, 위치 2에서의 X는 Y, A, D, E, H, S 또는 V이고, 위치 3에서의 X는 A, N 또는 S이고, 위치 4에서의 X는 M, V 또는 W이고, 그리고 위치 5에서의 X는 S 또는 G이고;
(e) CDR-H2는 아미노산 서열 TXXXXXXXXYXLXDVKG(서열번호 140)를 포함하되, 위치 2에서의 X는 V, A, N 또는 S이고, 위치 3에서의 X는 T 또는 S이고, 위치 4에서의 X는 E, D, N, T 또는 V이고, 위치 5에서의 X는 G, I, P, T 또는 V이고, 위치 6에서의 X는 G, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y이고, 위치 7에서의 X는 D, A, E, G, H, K, N, P, Q, R 또는 S이고, 위치 8에서의 X는 Y 또는 W이고, 위치 9에서의 X는 N, A, G, P 또는 R이고, 위치 11에서의 X는 C, A, D, F, R, S, T, V 또는 Y이고, 그리고 위치 13에서의 X는 D, S 또는 W이고;
(f) CDR-H3은 아미노산 서열 DXXPYFXDY(서열번호 226)를 포함하되, 위치 2에서의 X는 R, A, D, E, I, M, N, Q 또는 S이고, 위치 3에서의 X는 W 또는 F이고, 그리고 위치 7에서의 X는 F, L, M 또는 W이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체는 상보성 결정 영역 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하되, (a) CDR-L1은 서열번호 11 내지 35로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; (b) CDR-L2는 서열번호 37 내지 61로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; (c) CDR-L3은 서열번호 63 내지 76으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; (d) CDR-H1은 서열번호 122 내지 139로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; (e) CDR-H2는 서열번호 141 내지 201로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; (f) CDR-H3은 서열번호 227 내지 239로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체는 서열번호 257, 258 또는 259로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열; 및/또는 서열번호 279, 285 또는 290으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체는 서열번호 257 내지 278로부터 선택된 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체는 서열번호 279 내지 310으로부터 선택된 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 항-IL1RAP 항체를 제공하되, 해당 항체는,
서열번호 259의 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열 및 서열번호 290의 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열;
서열번호 268의 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열 및 서열번호 307의 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열;
서열번호 268의 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열 및 서열번호 298의 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열;
서열번호 269의 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열 및 서열번호 307의 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열;
서열번호 269의 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열 및 서열번호 298의 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열;
서열번호 269의 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열 및 서열번호 297의 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열;
서열번호 270의 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열 및 서열번호 307의 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열; 또는
서열번호 270의 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열 및 서열번호 298의 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체는 서열번호 328, 329, 330 또는 331로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 경쇄(LC) 아미노산 서열; 및/또는 서열번호 332, 333, 334, 335 또는 336로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 중쇄(HC) 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체는 서열번호 328 내지 331로부터 선택된 경쇄(LC) 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체는 서열번호 332 내지 336으로부터 선택된 중쇄(HC) 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 항-IL1RAP 항체를 제공하되 해당 항체는,
서열번호 328의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 332의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
서열번호 329의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 335의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
서열번호 329의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 336의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
서열번호 329의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 333의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
서열번호 329의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 334의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
서열번호 330의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 335의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
서열번호 330의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 336의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
서열번호 330의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 333의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
서열번호 330의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 334의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
서열번호 331의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 335의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
서열번호 331의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 336의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
서열번호 331의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 333의 중쇄(HC) 아미노산 서열; 또는
서열번호 331의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 334의 중쇄(HC) 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용에 의해 제공된 항-IL1RAP 항체의 다양한 실시형태에 있어서, 항체는 다음의 특성 중 하나 이상을 특징으로 한다:
(a) 항체는 인간 IL1RAP에 1×10-8 M 이하, 1×10-9 M 이하, 1×10-10 M 이하 또는 1×10-11 M 이하의 결합 친화도로 결합하고; 선택적으로, 결합 친화는 서열번호 3의 hu-M-IL1RAP 폴리펩타이드에 대한 평형 해리 상수(KD)에 의해 측정되고;
(b) 항체는 IL-1 자극된 신호, IL-33 자극된 신호, 및/또는 IL-36 자극된 신호를 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%만큼 감소시키고; 선택적으로, 신호의 감소는 세포-기반 차단 검정에 의해 측정되고; 선택적으로, IL-1, IL-33 및/또는 IL-36 자극된 신호는 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ로부터 선택된 작용제에 의해 자극되고; 선택적으로, 약 EC50의 작용제 농도에서, 항체는 10nM 이하, 5nM 이하 또는 1nM 이하의 IC50을 갖고;
(c) 항체는 이의 동족체 수용체에 대한 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ 작용제 결합 중 하나 이상에 의해 개시되는 세포내 신호를 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%만큼 감소시키되; 선택적으로, 세포내 신호의 감소는 세포-기반 차단 검정에 의해 측정되고; 선택적으로, 약 EC50의 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ 농도에서, 항체는 작용제에 의해 개시된 세포내 신호를 10nM 이하, 5nM 이하 또는 1nM의 IC50으로 감소시키고;
(d) 항체는 원발성 인간 폐 섬유아세포(primary human lung fibroblast: PHLF)로부터의 IL8의 IL-1α, IL-1β 및/또는 IL-36β 자극된 방출을 저해하되; 선택적으로, 약 EC50의 IL-1α, IL-1β 및/또는 IL-36β 농도에서, 항체는 10nM 이하, 5nM 이하 또는 1nM 이하의 IC50을 갖고;
(e) 항체는 원발성 인간 단핵구로부터 IL6의 IL-1β 자극된 방출을 저해하되; 선택적으로, 약 EC50의 IL-1β 농도에서, 항체는 10nM 이하, 5nM 이하 또는 1nM 이하의 IC50을 갖고;
(f) 항체는 인간 자연살해(natural killer: NK) 세포로부터 INF-γ의 IL-33 자극된 방출을 저해하되; 선택적으로, 약 EC50의 IL-33 농도에서, 항체는 10nM 이하, 5nM 이하 또는 1nM 이하의 IC50을 갖고;
(g) 항체는 인간 표피 각질세포(human epidermal keratinocyte: HEKn)로부터 IL8의 IL-36β 자극된 방출을 저해하되; 선택적으로, 약 EC60의 IL-36β 농도에서, 항체는 10nM 이하, 5nM 이하 또는 2nM 이하의 IC50을 갖고;
(h) 항체는 호염기구에서 IL-33 자극된 인산화를 저해하되; 선택적으로, 약 EC56의 IL-33 농도에서, 항체는 75nM 이하, 50nM 이하 또는 45nM 이하의 IC50을 갖고;
(i) 항체는 CD4+ T 세포로부터 INF-γ의 IL-33 자극된 방출을 저해하되; 선택적으로, 약 EC34의 IL-33 농도에서, 항체는 75nM 이하, 50nM 이하 또는 45nM 이하의 IC50을 갖고;
(j) 항체는 인간 IL1RAP의 도메인 3 내에서 하나 이상의 아미노산 잔기에 특이적으로 결합하되, 도메인 3은 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열의 위치 238 내지 367을 포함하고;
(k) 항체는 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열의 위치 243 내지 255, 위치 257 내지 268 및/또는 위치 333 내지 336에 특이적으로 결합하고;
(l) 항체는 인간 IL1RAP의 도메인 1 또는 도메인 2 내에서 아미노산 잔기에 결합하지 않되; 선택적으로, 도메인 1 및 도메인 2는 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열의 위치 21 내지 237을 포함하고;
(m) 항체는 서열번호 8의 시노몰구스 원숭이 IL1RAP 폴리펩타이드와 교차반응하고; 그리고/또는
(n) 항체는 서열번호 9의 마우스 IL1RAP 폴리펩타이드와 교차반응한다.
본 개시내용은 또한 항-IL1RAP 항체의 실시형태들을 제공하되, 여기서: (i) 항체는 단클론성 항체이고; (ii) 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이고; (iii) 항체는 부류 IgG의 전장 항체이고; 선택적으로, 부류 IgG 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택된 아이소타입을 갖고; (iv) 항체는 Fc 영역 변이체, 선택적으로 효과기 기능을 변화시키는 Fc 영역 변이체(예컨대, 무효과기 항체에서 초래되는 변이체), 감소된 CDC 활성도, ADCC 활성도 및/또는 ADCP 활성도를 나타내는 Fc 영역 변이체, 항체 반감기를 변화시키는 인간 단핵구, 호중구, 및/또는 주르카트(Jurkat) 세포 또는 Fc 영역 변이체에 대한 감소된 세포독성 활성도를 나타내는 Fc 영역 변이체이고; (v) 항체는 F(ab')2, Fab', Fab, Fv, 단일 도메인 항체(VHH) 및 scFv로 이루어진 군으로부터 선택적으로 선택된 항체 단편이고; (vi) 항체는 면역접합체이고, 선택적으로, 면역접합체는 IL1RAP-매개 질환 또는 병태의 치료를 위한 치료제를 포함하고; (vii) 항체는 다중-특이적 항체, 선택적으로 이중특이적 항체이고; 그리고 (viii) 항체는 CDR이 면역글로불린 스캐폴드 또는 프레임워크 이외의 스캐폴드 또는 프레임워크; 선택적으로, 대체 단백질 스캐폴드 및 인공 중합체 스캐폴드로부터 선택된 스캐폴드에 이식된 합성 항체이다.
다른 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 항-IL1RAP 항체를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-IL1RAP 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 개시내용은 항-IL1RAP 항체를 생산하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 항체가 생산되도록 항-IL1RAP 항체를 암호화하는 핵산(또는 벡터)을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-IL1RAP 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 약제학적 조성물은 IL-1, IL-33, IL-36 및/또는 IL1RAP-매개 질환 또는 병태의 치료를 위한 치료제를 더 포함하되; 선택적으로, 치료제는 화학요법제이다.
본 개시내용은 또한 대상체에서 IL1RAP-매개 질환을 치료하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 치료적 유효량의 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-IL1RAP 항체 또는 치료적 유효량의 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-IL1RAP 항체의 약제학적 제형을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 또한 대상체에서 IL-1, IL-33 및/또는 IL-36 신호전달에 의해 매개된 질환을 치료하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 치료적 유효량의 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-IL1RAP 항체 또는 치료적 유효량의 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-IL1RAP 항체의 약제학적 제형을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 또한 대상체에서 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ 자극된 신호전달에 의해 매개된 질환을 치료하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 치료적 유효량의 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-IL1RAP 항체 또는 치료적 유효량의 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-IL1RAP 항체의 약제학적 제형을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 개시된 치료 방법의 각종 실시형태에 있어서, IL1RAP-매개 질환 및 병태 또는 IL-1, IL-33 및/또는 IL-36 신호전달에 의해 매개된 질환은, 염증성 질환, 자가면역 질환, 호흡기 질환, 대사 장애, 감염 및 암을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, IL1RAP-매개 질환 및 병태는, 여드름, 급성 췌장염, 급성 중증 궤양성 결장염, 성인발병 스틸병, 연령 관련 황반 변성(AMD), 기도 과민증, 기도 염증, 알레르기 결막염, 알레르기성 비염, 알레르기, 알츠하이머병, 근위축성 축삭경화증(ALS), 아나팔락시스, 관절염 통증, 천식, 죽상동맥경화증, 아토피 피부염, 아토피 습진, 자가면역 혈관염, 베체트병, 골암, 뇌암, 유방암, 악액질/식욕부진, 연골 손상, 대뇌 허혈증, 만성 피로 증후군, 만성 폐쇄성 폐질환, 클로스트리듐 연관 질병, 결장암, 울혈성 심부전, 결막염, 관상동맥 우회로 이식술, 관상동맥 재협착증, 크론병, 당뇨병, 당뇨성 황반부종, 당뇨성 망막병증, 안구 건조증, 자궁내막증, 호산구-연관 위장관 장애, 호산성 식도염, 가족성 한랭 자가염증 증후군, 가족성 지중해열, 열, 섬유근육통, 섬유증 장애, 식품 알레르기, 범발성 농포성 건선, 녹내장, 사구체신염, 통풍 관절염, 이식편대숙주질환, 기생충 감염, 출혈성 쇼크, 화농성 한선염, 통각과민증, 과-IgD 증후군, 고요산혈증, 특발성 폐섬유증(IPF), 암-관련 통증, 감염, 염증성 장 질환(IBD), 좌상(strain)에 기인한 염증성 병태, 각막 이식과 연관된 염증성 안질환, 염증성 통증, 인플루엔자, 장암, 허혈, 연소성 관절염(juvenile arthritis), 가와사키병, 신장암, 레버 선천성 흑내장, 간암, 간 질환, 폐암, 머클-웰스 증후군, 다중 골수종, 다발성 경화증, 근골격 통증, 골수성 및 기타 백혈병, 심근 기능 장애, 근병증, 비용종, 신생아 시작 다발계 염증성 질환, 신경독성, 비감염성 결막염, 비소세포 폐암, 정형외과적 수술(orthopedic surgery), 골관절염, 골다공증, 통증, 수장족 저농포증, 췌장암, 파킨슨병, 치주질환, 말초혈관병, 류마티스성 다발근통, 결절성 맥락막 혈관병증(PCV), 조기산통, 전립선암, 원충 감염, 건선, 건선성 관절염, 괴저성 농피증, 재관류 손상, 호흡기세포융합바이러스(RSV), 재협착증, 망막 박리, 망막색소변성증, 미숙아 망막증(ROP), 류마티스 관절염, 패혈증, 겸상적혈구빈혈증, 방사선 요법으로부터의 부작용, 부비강염, 피부암, 수면장애, 염좌(sprain), 스타르가르트병, 위암, 악관절 질환(temporal mandibular joint disease), TNF 수용체 연관 주기성 증후군, 이식 거부증, 외상, 외상성 눈 부상, 제2형 당뇨병, 궤양성 결장염 및 포도막염으로부터 선택될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 또한 대상체에서 질환을 치료하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 치료적 유효량의 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-IL1RAP 항체 또는 치료적 유효량의 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-IL1RAP 항체의 약제학적 제형을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 실시형태들에 있어서, 암은 유방암, 결장직장암, 비소세포 폐암, 췌장암으로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 또한 대상체에서 천식을 치료하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-IL1RAP 항체의 치료적 유효량의 항체 또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-IL1RAP 항체의 치료적 유효량의 약제학적 제형을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 또한 생물학적 샘플에서 IL1RAP의 수준을 검출하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 샘플을 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-IL1RAP 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체는 IL1RAP의 검출 및 정량화를 위하여 임의의 공지된 검정 방법, 예컨대, 경쟁적 결합 검정, 직접 및 간접 샌드위치 검정, 면역침강 검정 및 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)에 이용될 수 있다(문헌[Sola, 1987, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158, CRC Press, Inc.] 참조). 항체는 광범위한 검정을 위하여 적절한 높은 친화도로 hu-IL1RAP에 결합한다.
도 1은 HEK-BLUETM IL-1/IL-33 반응 센서 세포 또는 HEK-BLUETM IL-36 반응 센서 세포(즉, IL-36 수용체를 일시적으로 발현하는 IL-33 세포)에서 평가되고 다양한 나타낸 작용제로 자극된 IL-1, IL-33 및 IL-36 자극된 세포내 신호전달의 저해 검정에서의 마우스 하이브리도마-유래 항-hu-IL1RAP 항체, 11C5(Hy)에 대한 결과의 플롯을 묘사한다. 도 1A: HEK-BLUETM IL-1/IL-33 반응성 세포의 IL-1α 자극([IL-1α] = 35pM)의 11C5(Hy) 저해; IC50 = 4.70nM. 도 1B: HEK-BLUETM IL-1/IL-33 반응성 세포의 IL-1β 자극([IL-1β] = 7pM)의 11C5(Hy) 저해; IC50 = 1.00nM. 도 1C: HEK-BLUETM IL-1/IL-33 반응성 세포의 IL-33 자극([IL-33] = 60pM)의 11C5(Hy) 저해; IC50 = 3.71nM. 도 1D: HEK-BLUETM IL-36 반응성 세포의 IL-36α 자극([IL-36α] = 10pM)의 11C5(Hy) 저해; IC50 = 2.52nM. 도 1E: HEK-BLUETM IL-36 반응성 세포의 IL-36β 자극([IL-36β] = 5pM)의 11C5(Hy) 저해; IC50 = 0.98nM. 도 1F: HEK-BLUETM IL-36 반응성 세포의 IL-36γ 자극([IL-36γ] = 7pM)의 11C5(Hy) 저해; IC50 = 0.67nM. 모든 검정은 약 EC50 내지 EC70의 작용제 농도에서 수행되었고; 표시된 오차 막대는 두 벌의 샘플로부터의 표준 편차를 나타내고; 양성 대조군(PC)은 흑색 파선으로 나타내는 한편, 음성 대조군(NC)은 회색 파선으로 나타낸다.
도 2는 하이브리도마-유래 쥣과 항-hu-IL1RAP 항체, 11C5(Hy), 및 이 항체의 인간화 버전, h11C5의 VL 및 VH 영역에 대해서 최근접 인간 생식세포계열 카파 경쇄 VL 영역(유전자 ID - V 유전자: IGKV1-NL1*01, J 유전자: IGKJ4*02) 및 중쇄 VH 영역(유전자 ID - V 유전자: IGHV3-7*03, J 유전자: IGHJ4*03)의 아미노산 서열 정렬을 묘사한다.
도 3은 인간화 항-hu-IL1RAP 항체, h11C5의 농도 및 450㎚에서의 양성 및 음성 대조군 참조 항체 대 바큘로바이러스(BV) 입자 ELISA 신호의 플롯을 묘사하며, 이는 BV 입자에 대한 h11C5에 의한 비-특이적 결합의 부재를 나타낸다.
도 4는 하이브리도마-유래 항-hu-IL1RAP 항체, 11C5(Hy): 쥣과 11C5("m11C5"), 키메라 11C5("c11C5"), 인간화 11C5 mAb("h11C5"), c11C5("c11C5_C59Y")의 C59Y 변이체 및 h11C5("h11C5_C59Y")의 C59Y 변이체에 기초하여 이하의 재조합적으로 제조된 항체에 대한 세포내 신호전달 저해 검정 결과의 플롯을 묘사한다. 비교를 위하여, 11C5(Hy) 및 인간 아이소타입 대조 항체("Hu IgG1 Ctrl")에 대한 검정 결과의 플롯이 또한 포함되었다. 도 4A: HEK-BLUETM IL-1/IL-33 반응성 세포의 IL-1β 자극([IL-1β] = 7pM)의 11C5(Hy), m11C5 및 h11C5 저해. 도 4B: HEK-BLUETM IL-1/IL-33 반응성 세포의 IL-33 자극([IL-33] = 60pM)의 11C5(Hy), m11C5 및 h11C5 저해. 도 4C: HEK-BLUETM IL-1/IL-33 반응성 세포의 IL-1β 자극([IL-1β] = 7pM)의 h11C5 및 h11C5_C59Y 저해. 도 4D: HEK-BLUETM IL-1/IL-33 반응성 세포의 IL-33 자극([IL-33] = 60pM)의 h11C5 및 h11C5_C59Y 저해. 도 4E: 원발성 인간 폐 섬유아세포(PHLF)의 IL-1α 자극([IL-1α] = 10pM)의 c11C5_C59Y 저해; IC50 = 3.96nM. 도 4F: 원발성 인간 단핵구(PHM)의 IL-1β 자극([IL-1β] = 0.925nM)의 c11C5_C59Y 저해; IC50 = 0.74nM. 도 4G: 원발성 인간 NK(PHNK) 세포의 IL-33 자극([IL-33] = 1nM, [IL-12] = 0.1 ng/㎖)의 c11C5_C59Y 저해; IC50 = 2.90nM. 도 4H: PHLF의 IL-36β 자극([IL-36β] = 2nM)의 c11C5_C59Y 저해; IC50 = 0.28nM. 모든 재조합 항체는 또한 무효과기 기능을 부여하는 N297G 돌연변이를 함유하고; 작용제는 약 EC50 내지 EC70의 유효 농도에서 사용되었고; 오차 막대는 두 벌의 샘플로부터의 표준 편차를 나타내고; 양성 대조군(PC)은 흑색 파선으로 나타내는 한편, 음성 대조군(NC)은 회색 파선으로 나타낸다.
도 5는 실시예 9 및 10에 기재된 바와 같이 VL 또는 VH 영역 중 어느 한쪽 또는 둘 다에 단일, 이중 또는 삼중 돌연변이를 함유하는 Fab 또는 IgG 단백질 중 한쪽의 h11C5_C59Y/A43S의 친화도 성숙 변이체에 대한 HEK-Blue 세포내 신호전달 저해 검정 결과의 플롯을 묘사한다. 도 5A: HEK-BLUETM IL-1/IL-33 반응성 세포의 IL-1β 자극([IL-1β] = 7pM)의 저해. 도 5B: HEK-BLUETM IL-1/IL-33 반응성 세포의 IL-33 자극([IL-33] = 40pM)의 저해. 도 5C: HEK-BLUETM IL-36 반응성 세포의 IL-36α 자극([IL-36α] = 60pM)의 저해. 도 1D: HEK-BLUETM IL-1/IL-33 반응성 세포의 IL-1β 자극([IL-1β] = 9pM)의 저해. 도 5E: HEK-BLUETM IL-1/IL-33 반응성 세포의 IL-33 자극([IL-33] = 60pM)의 저해. 도 5F: HEK-BLUETM IL-36 반응성 세포의 IL-36α 자극([IL-36α] = 50pM)의 저해. 도면에 사용된 변이체에 대한 식별자에 대응하는 VL 및 VH 영역 돌연변이는 실시예 9에 설명되어 있다. 도 5A 내지 도 5C는 비-친화도 성숙 친계 항체(non-affinity matured parental antibody)인 "h11C5_AC59Y/A43S" 및 IgG 대조군인 "Fab Ctrl"의 Fab 버전을 포함하는 친화도 성숙 변이체의 Fab 버전에 대한 결과를 묘사한다. 도 5D 내지 도 5F는 친화도-성숙 변이체의 전장 IgG 항체 버전에 대한 결과를 묘사하고 비-친화도 성숙 친계 항체인 "h11C5_AC59Y/A43S" 및 IgG 대조군의 전장 IgG 항체 버전을 포함한다. 아이소타입 IgG 대조 항체를 비롯하여 시험된 모든 전장 IgG 항체는 무효과기 기능을 부여하는 N297G 돌연변이를 함유하였다. IL-1β 또는 IL-36α 자극의 검정은 약 EC50 내지 EC60의 작용제 농도에서 수행되었다. IL-33 자극의 검정은 약 EC35 내지 EC45의 작용제 농도에서 수행하였다. 표시된 오차 막대는 두 벌의 샘플로부터의 표준 편차를 나타낸다. 양성 대조군(PC)은 흑색 파선으로 나타내는 한편, 음성 대조군(NC)은 회색 파선으로 나타낸다.
도 6A, 도 6B 및 도 6C는 실시예 12에 기재된 바와 같이 h11C5 변이체 YKD(또는 "11C5-YKD")와 비교해서 h11C5 변이체인 YKD/YTE(또는 "11C5-YKD/YTE")에 대한 HEK-Blue 세포내 신호전달 저해 검정 결과의 플롯을 묘사한다. 도 6A는 IL-1β로 자극된 HEK-Blue 세포에 대한 검정 결과를 도시하고; 도 6B는 IL-33으로 자극된 HEK-Blue 세포에 대한 검정 결과를 도시하고; 도 6C는 IL-36β로 자극된 HEK-Blue 세포에 대한 검정 결과를 도시한다. 각 검정에서, 작용제 농도는 EC55 부근 또는 그보다 높다. 표시된 오차 막대는 두 벌의 샘플로부터의 평균의 표준 오차를 나타낸다. 양성 대조군(PC)은 흑색 파선으로 나타내는 한편, 음성 대조군(NC)은 회색 파선으로 나타낸다.
도 7은 (실시예 12에 기재된 바와 같이) EC55보다 높은 작용제 농도에서 IL-1β로 자극된 단핵구에서의 YKD(또는 "11C5-YKD") 또는 아이소타입 대조군(IgG Ctrl)과 비교한 h11C5 변이체 항체, YKD/YTE(또는 "11C5-YKD/YTE")의 차단 효능의 검정 플롯을 묘사한다. 표시된 오차 막대는 두 벌의 샘플로부터의 표준 편차를 나타낸다. 양성 대조군(PC)은 흑색 파선으로 나타내는 한편, 음성 대조군(NC)은 회색 파선으로 나타낸다.
도 8은 (실시예 12에 기재된 바와 같이) EC55 부근 또는 그보다 높은 작용제 농도에서 IL-1α로 자극된 PHLF 세포에서의 변이체 YKD(또는 "11C5-YKD") 또는 아이소타입 대조군(IgG Ctrl)과 비교한 h11C5 변이체 YKD/YTE(또는 "11C5-YKD/YTE")의 차단 효능의 검정 플롯을 묘사한다. 표시된 오차 막대는 두 벌의 샘플로부터의 표준 편차를 나타낸다. 양성 대조군(PC)은 흑색 파선으로 나타내는 한편, 음성 대조군(NC)은 회색 파선으로 나타낸다.
도 9는 (실시예 12에 기재된 바와 같이) EC55 보다 높은 작용제 농도에서 IL-36β로 자극된 HEKn 세포에서의 YKD(또는 "11C5-YKD") 또는 아이소타입 대조군(IgG Ctrl)과 비교한 h11C5 변이체 항체, YKD/YTE(또는 "11C5-YKD/YTE")의 차단 효능의 검정 플롯을 묘사한다. 표시된 오차 막대는 두 벌의 샘플로부터의 표준 편차를 나타낸다. 양성 대조군(PC)은 흑색 파선으로 나타낸다.
도 10은 (실시예 12에 기재된 바와 같이) EC55 부근 또는 그보다 높은 작용제 농도에서 IL-36β로 자극된 PHLF 세포에서 YKD(또는 "11C5-YKD") 또는 아이소타입 대조군(IgG Ctrl)과 비교한 h11C5 변이체 항체, YKD/YTE(또는 "11C5-YKD/YTE")의 차단 효능의 검정 플롯을 묘사한다. 표시된 오차 막대는 두 벌의 샘플로부터의 표준 편차를 나타낸다. 양성 대조군(PC)은 흑색 파선으로 나타내는 한편, 음성 대조군(NC)은 회색 파선으로 나타낸다.
도 11은 (실시예 12에 기재된 바와 같이) IL-12의 존재에서 IL-33으로 자극된 원발성 인간 NK 세포에서의 YKD(또는 "11C5-YKD") 또는 아이소타입 대조군(IgG Ctrl)과 비교한 h11C5 변이체 항체, YKD/YTE(또는 "11C5-YKD/YTE")의 차단 효능의 검정 플롯을 묘사한다. IL-33은 EC50과 등가인 유효 농도이다. 표시된 오차 막대는 두 벌의 샘플로부터의 표준 편차를 나타낸다. 양성 대조군(PC)은 흑색 파선으로 나타내는 한편, 음성 대조군(NC)은 회색 파선으로 나타낸다.
도 12는 (실시예 12에 기재된 바와 같이) EC56의 작용제 농도에서 IL-33으로 자극된 호염기구 내 h11C5 변이체 항체, YKD/YTE(또는 "11C5-YKD/YTE") 또는 아이소타입 대조군(IgG Ctrl)의 차단 효능의 검정 플롯을 묘사한다. 표시된 오차 막대는 두 벌의 샘플로부터의 표준 편차를 나타낸다. 양성 대조군(PC)은 흑색 파선으로 나타내는 한편, 음성 대조군(NC)은 회색 파선으로 나타낸다.
도 13은 (실시예 12에 기재된 바와 같이) EC34의 작용제 농도에서 IL-33으로 자극된 CD4+ T 세포 내 h11C5 변이체 항체, YKD/YTE(또는 "11C5-YKD/YTE") 또는 아이소타입 대조군(IgG Ctrl)의 차단 효능의 검정 플롯을 묘사한다. 표시된 오차 막대는 세 벌의 샘플로부터의 평균의 표준 오차를 나타낸다. 양성 대조군(PC)은 흑색 파선으로 나타내는 한편, 음성 대조군(NC)은 회색 파선으로 나타낸다.
도 14A는 실시예 14에 기재된 바와 같이 시노몰구스 원숭이에서 수행된 약동학 연구 1, 2 및 3으로부터 얻어진 데이터를 최적으로 기재한 비-선형 2 구획 모델을 묘사한다. 모델 파라미터, 변수 및 초기 조건은 다음과 같이 정의되었다: "Vc"는 ㎖/㎏ 단위의 체중당 중앙 구획부의 용적이고; "Vp"는 ㎖/㎏ 단위의 체중당 주변 구획부의 용적이고; "CLt"는 ㎖/일/㎏ 단위의 체중당, FcRn-매개 IgG 이화작용 및 리사이클링을 통해서 일어나는 것으로 가정된 선형 청소율(linear clearance)이고; "CLd"는 중앙 구획부와 주변 구획부 사이의 분포 청소율이고; "A(1)(t)"는 체중당 시간 t에서의 중앙 구획부에서의 약물의 양이고, 따라서 혈장 농도 시간 프로파일의 모델 예측은 ㎍/㎏ 단위의 "A(1)(t)/Vc"였고, A(1)(0)=0이며; 그리고 "A(2)(t)"는 ㎍/㎏의 단위의 체중당 시간 t에서의 주변 구획부에서의 약물의 양이고 A(2)(0)=0이다.
도 14B 및 도 14C는 실시예 14에 기재된 바와 같은 시노몰구스 원숭이에서의 항체의 단일 IV 용량의 투여 후의 YKD(도 14B) 및 YKD/YTE(도 14C)의 약동학을 묘사한다. 도 14B: 40 ㎎/㎏(흑색 원으로 표시됨), 20 ㎎/㎏(백색 원), 10 ㎎/㎏(흑색 정사각형), 3 ㎎/㎏(백색 정사각형) 및 1 ㎎/㎏(흑색 삼각형)의 YKD 용량. 도 14C: 40 ㎎/㎏(흑색 원으로 표시됨), 10 ㎎/㎏(백색 정사각형) 및 3 ㎎/㎏(흑색 삼각형)의 YKD/YTE 용량. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 15는 인간 IL1RAP(분자 표면), IL-1β(암회색 리본) 및 IL-1R1(연회색 리본)의 삼원 복합체의 결정 구조(PDB 코드: 3O4O)의 분자 표면 및 리본 표시를 묘사한다. 이 표시는, 실시예 15에 기재된 바와 같이, 항-hu-IL1RAP 항체인 YIS 및 YKS의 결합에 유해하지만, 돌연변이된 경우 참조 항체의 결합에 대해서 유해하지 않은 것으로 식별된 IL1RAP 아미노산 잔기의 공간 분포를 묘사한다. 9개 이상의 플래그 부착된 치환으로 관찰되는 IL1RAP 잔기인 I245, E261 및 T267는 흑색으로 착색되어 있고, 6 내지 8개 플래그 부착된 치환을 갖는 에피토프에서의 다른 잔기는 암회색으로 착색되어 있다.
도 16A 및 도 16B는 실시예 18에 기재된 바와 같이 단일 IL-1β 시도 모델(도 16A) 또는 단일 IL-36α 시도 모델(도 16B)에서 결정된 바와 같은 14F4 또는 아이소타입 대조군(IgG Ctrl)의 차단 효능 플롯을 묘사한다. 도 16A: 마우스에게는 14F4 또는 IgG Ctrl을 투여하고 D-PBS 또는 50 ng의 IL-1β로 1일 후 i.p. 시험감염, 즉, 시도하고(challenged); 시도 후 2시간에, 혈액을 수집하고, 혈청 IL-6 수준을 결정하고; 데이터는 군당 5마리 마우스로부터의 것이고 2개의 독립적 실험을 나타내며; 막대 그래프는 평균 +/- SEM을 나타내고; 개별적인 원은 1마리의 개별적인 마우스로부터의 데이터를 나타내고; 14F4 또는 IgG Ctrl이 투여된 마우스는 각각 백색 또는 흑색 원으로 나타내고; 아이소타입/PBS 및 아이소타입/IL-1β-시도된 마우스를 비교하거나 또는 아이소타입/IL-1β-시도된 마우스 및 14F4/IL-1β-시도된 마우스를 비교하는 만-휘트니 시험(Mann-Whitney test)을 이용해서 ** p ≤ 0.01. 도 16B: 마우스에게는 14F4 또는 IgG Ctrl을 투여하고, D-PBS 또는 10ng의 IL-36α로 i.n. 시도 1일 후에, 폐 공간 내 세포 염증을 결정하고; 데이터는 군당 5마리의 마우스이고 2개의 독립적인 실험을 대표하며; 막대 그래프는 평균 +/- SEM을 나타내고; 개별적인 원은 1마리의 개별적인 마우스로부터의 데이터를 나타내고; 14F4 또는 IgG Ctrl이 투여된 마우스는 각각 백색 또는 흑색 원으로 표시되고; 아이소타입/PBS 및 아이소타입/IL-36α-시도된 마우스를 비교하거나 또는 아이소타입/IL-36α-시도된 마우스 및 14F4/IL-36α-시도된 마우스를 비교하는 만-휘트니 시험을 이용해서 ** p ≤ 0.01.
도 17A, 도 17B, 도 17C, 도 17D 및 도 17E는 실시예 18에 기재된 바와 같이 폐 공간에서 면역 세포 침윤을 검정하는 다중 IL-1β 시도 모델에서 결정된 바와 같은 14F4 또는 아이소타입 대조군(IgG Ctrl)의 차단 효능의 플롯을 묘사한다. 차단 효능은 폐 공간에서 5개의 상이한 세포 유형의 침윤을 위하여 측정되었다: 호중구(도 17A); CD4 T 세포(도 17B); T1-ST2+ CD4 T 세포(도 17C); 단핵구(도 17D); 및 수지상 세포(도 17E). 마우스에게는 제-1일 및 제2일에 14F4 또는 IgG Ctrl을 투여하고, 제0일, 제1일 및 제2일에 D-PBS 또는 30ng의 IL-1β으로 i.n. 시도하고; 제3일에, 폐 공간에서의 세포 염증을 결정하였고; 데이터는 군당 5마리의 마우스로부터의 것이고 2개의 독립적인 실험을 나타내고; 막대 그래프는 평균 +/- SEM을 나타낸다. 개별적인 원은 1마리의 개별적인 마우스로부터의 데이터를 나타내고; 14F4 또는 IgG Ctrl이 투여된 마우스는 각각 백색 또는 흑색 원으로 표시되고; 아이소타입/PBS 및 아이소타입/IL-1β-시도된 마우스를 비교하거나 또는 아이소타입/IL-1β-시도된 마우스 및 14F4/IL-1β-시도된 마우스를 비교하는 만-휘트니 시험을 이용해서 * p ≤ 0.05 및 ** p ≤ 0.01.
도 18A, 도 18B 및 도 18C는 실시예 18에 기재된 바와 같이 폐 조직에서 케모카인 및 사이토카인 수준을 검정하는 다중 IL-1β 시도 모델에서 결정된 바와 같은 14F4 또는 아이소타입 대조군(IgG Ctrl)의 차단 효능의 플롯을 묘사한다. 차단 효능은 폐 조직 샘플로부터 측정된 바와 같이 3가지 상이한 케모카인 및 사이토카인의 수준을 기준으로 결정되었다: IL-1β(도 18A); IL-17A(도 18B); 및 CXCL1(도 18C). 마우스에게 제-1일 및 제2일에 14F4 또는 IgG Ctrl을 투여하고, 제0일, 제1일 및 제2일에 D-PBS 또는 30ng의 IL-1β로 i.n. 시도하고; 제3일에, 단백질 케모카인 및 사이토카인 분석을 위하여 폐 조직을 수집하고; 데이터는 군당 5마리의 마우스로부터의 것이고 2개의 독립적인 실험을 대표하며; 막대 그래프는 평균 +/- SEM을 나타내고; 개별적인 원은 1마리의 개별적인 마우스로부터의 데이터를 나타내고; 14F4 또는 IgG Ctrl이 투여된 마우스는 각각 백색 또는 흑색 원으로 나타내고; 아이소타입/PBS 및 아이소타입/IL-1β-시도된 마우스와 비교하거나 또는 아이소타입/IL-1β-시도된 마우스 및 14F4/IL-1β-시도된 마우스와 비교하는 만-휘트니 시험을 이용해서 * p ≤ 0.05 및 ** p ≤ 0.01.
도 19A 및 도 19B는 실시예 18에 기재된 바와 같이 혈청 항체 수준을 검정하는 급성 HDM 천식 모델에서 결정된 바와 같은 14F4 또는 아이소타입 대조군(IgG Ctrl)의 차단 효능의 플롯을 묘사한다. 도 19A: HDM-특이적 IgE에 대한 검정; 도 19B: HDM-특이적 IgG1에 대한 검정. 마우스에게 제-1, 2, 6, 9 및 13일에 14F4 또는 IgG 대조군으로 i.p. 투여하고; 제0 내지 3, 6 내지 10, 13 및 14일에, 마우스에게 식염수 또는 25㎍ HDM으로 i.n. 시도하고; 최종 시도 후 1일에, 혈액을 수집하고, 혈청 HDM-특이적 IgE 및 IgG1 수준을 결정하고; 데이터는 군당 6 내지 10마리의 마우스로부터의 것이고 2개의 독립적인 실험을 대표하며; 막대 그래프는 평균 +/- SEM을 나타내고; 개별적인 원은 1마리의 개별적인 마우스로부터의 데이터를 나타내고; 14F4 또는 IgG Ctrl가 투여된 마우스는 각각 백색 또는 흑색 원으로 표시되고; 아이소타입/식염수 및 아이소타입/HDM-시도된 마우스와 비교하거나 또는 아이소타입/HDM-시도된 마우스 및 14F4/HDM-시도된 마우스와 비교하는 만-휘트니 시험을 이용해서 * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001.
본 개시내용은 인간 IL1RAP에 높은 친화도로 특이적으로 결합하는 인간화 항체를 비롯한 항체를 제공한다. 개시된 항-IL1RAP 항체는 IL-1, IL-33 및/또는 IL-36 신호전달 경로를 비롯한 IL1RAP-매개 경로에 의해 세포내 신호전달을 감소, 저해 및/또는 완전-차단할 수 있다. 더욱 구체적으로, 본 명세서에 개시된 항-IL1RAP 항체는 이하의 작용제 중 1종 이상의 결합에 의해 자극된 신호전달을 감소, 저해 및/또는 완전-차단할 수 있다: IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ. 본 개시내용은 또한 각종 암(예컨대, 유방, 결장직장, 비-소세포 폐, 췌장)뿐만 아니라, 염증성, 감염성 및 자가면역 질환, 예컨대, 관절염, 천식 및 궤양성 결장염을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, IL-1, IL-33 및/또는 IL-36 신호전달의 저해에 반응하는 질환 및 병태를 비롯한 IL1RAP-매개 질환을 치료하는 방법에서의 항-IL1RAP 항체의 용도를 제공한다.
용어 및 기술의 개요
본 명세서의 설명 및 첨부된 청구범위에 대해서, 단수 형태는 문맥이 달리 명확하게 나타내지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "단백질"에 대한 언급은 하나 초과의 단백질을 포함하고, "화합물"에 대한 언급은 하나 초과의 화합물을 지칭한다. "포함하다"(comprise), "포함한다", "포함하는", "포함하다"(include), "포함한다" 및 "포함하는"은 호환 가능하고 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 각종 실시형태의 설명이 "포함하는"이라는 용어를 사용하는 경우, 당업자라면 일부 구체적인 경우에, 실시형태가 "로 본질적으로 이루어진" 또는 "로 이루어진"이라는 언어를 사용하여 대안적으로 설명될 수 있음을 이해할 것이다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥이 달리 명확하게 기술하지 않는 한, 그 범위의 상한과 하한 사이에서 그리고 그 기술된 범위의 임의의 다른 기술된 또는 중간 값 사이에서 그 값의 각 중간 정수 및 값의 각 중간 정주의 각 십분의 일이 본 발명 내에 포괄되는 것이 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한과 하한은 그 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있고, 또한 기술된 범위 내에 임의의 구체적으로 배제된 제한에 따라 본 발명 내에 포함된다. 기술된 범위가 이들 한계 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 이들 포함된 한계 중 (i) 어느 한 쪽 또는 (ii) 둘 다를 배제하는 범위는 또한 본 발명에 포함된다. 예를 들어, "1 내지 50"은 "2 내지 25", "5 내지 20", "25 내지 50", "1 내지 10" 등을 포함한다.
일반적으로, 본 명세서에서 사용되는 명명법 및 본 명세서에 기재된 기술 및 절차는 당업자가 잘 이해하고 통상 사용하는 것들, 예컨대, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 (hereinafter "Sambrook"); Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. (supplemented through 2011) (hereinafter "Ausubel"); Antibody Engineering, Vols. 1 and 2, R. Kontermann and S. Dubel, eds., Springer-Verlag, Berlin and Heidelberg (2010); Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols, V. Ossipow and N. Fischer, eds., 2nd Ed., Humana Press (2014); Therapeutic Antibodies: From Bench to Clinic, Z. An, ed., J. Wiley & Sons, Hoboken, N.J. (2009); 및 Phage Display, Tim Clackson and Henry B. Lowman, eds., Oxford University Press, United Kingdom (2004)]에 기재된 통상의 기술 및 방법을 포함한다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 기타 문서는 마치 각각의 개별적인 간행물, 특허 출원, 특허 또는 기타 문서가 모든 목적을 위하여 본 명세서에 참조에 의해 원용된 것으로 개별적으로 표시된 것과 같은 정도로 모든 목적을 위하여 이들의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 사용되는 용어는 단지 특정 실시형태를 설명하기 위한 것이며 제한하도록 의도된 것이 아님을 이해해야 한다. 본 개시내용을 해석하기 위해, 용어에 대한 다음의 설명이 적용될 것이고, 적절한 경우, 단수형으로 사용되는 용어는 복수형도 포함하고 그 반대도 마찬가지이다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "IL1RAP"는, 인터류킨-1 수용체 1(IL1R1), ST2(인터류킨-1 수용체-유사 1 또는 IL1RL1로도 공지됨), 및 인터류킨-1 수용체-유사 단백질 2(IL1RL2)를 비롯하여, IL-1 패밀리 내의 수 개의 수용체용의 세포막 공동-수용체인 인터류킨-1 수용체 보조 단백질을 지칭한다. 인터류킨-1 수용체 보조 단백질 또는 IL1RAP는 때때로 당업계에서 "IL-1RAP", "IL-1RAcP", "IL1RAcP" 또는 "IL-1R3"으로 지칭되는 것에 유의한다. 용어 "IL1RAP", "IL1RAP 폴리펩타이드" 및 "IL1RAP 단백질"은 본 명세서에서 호환 가능하게 사용된다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "IL1RAP 매개 병태" 또는 "IL1RAP 매개 질환"은, IL-1 패밀리 사이토카인 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ에 의해 매개된 다운스트림 신호전달 경로를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 공동-수용체로서 작용하는 IL1RAP와 함께 사이토카인의 IL-1 패밀리에 의해 매개된 신호전달 경로의 비정상 기능과 연관된 임의의 의학적 병태를 포괄한다. 예를 들어, IL1RAP 매개 질환은 암, 염증성, 감염성 및 자가면역 질환을 비롯하여, IL-1, IL-33 및/또는 IL-36 신호전달 경로의 길항제 또는 저해제에 반응하고/하거나 이에 의해 매개되는 질환을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 더욱 구체적으로, IL1RAP 매개 질환은 여드름, 급성 중증 궤양성 결장염, 성인발병 스틸병, 알레르기성 비염, 통풍 관절염, 연소성 관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 관절염 통증, 천식, 죽상동맥경화증, 아토피 습진, 베체트병, 악액질, 유방암, 결장직장암, 비소세포 폐암, 췌장암, 만성 폐쇄성 폐질환, 안구 건조 증후군, 가족성 한랭 자가염증 증후군, 가족성 지중해열, 식품 알레르기, 범발성 농포성 건선, 화농성 한선염, 과-IgD 증후군, 고요산혈증, 머클-웰스 증후군, 신생아 시작 다발계 염증성 질환, 근골격 통증, 수장족 저농포증, 말초혈관병, 류마티스성 다발근통, 비용종, 건선, 괴저성 농피증, 재협착증, 겸상적혈구빈혈증, 부비강염, TNF 수용체 연관 주기성 증후군, 제2형 당뇨병, 및 궤양성 결장염을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "IL-1 자극된 신호"는, IL-1 사이토카인, 예컨대, IL-1α 또는 IL-1β을, 이의 동족체 세포 표면 수용체인 IL1R1에 결합함으로써 개시된 세포내 신호를 지칭한다. 예시적인 IL-1 자극된 신호는 세포-기반 차단 검정, 예컨대, 본 명세서에서 실시예에 개시된 바와 같은 HEK-BLUETM IL-1 반응성 세포-기반 검정을 이용해서 측정 가능한 것들을 포함한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "IL-33 자극된 신호"는, IL-33 사이토카인, 예컨대, IL-33을, 이의 동족체 세포 표면 수용체인 IL1RL1(ST2로도 지칭됨)에 결합함으로써 개시된 세포내 신호를 지칭한다. 예시적인 IL-33 자극된 신호는 세포-기반 차단 검정, 예컨대, 본 명세서에서 실시예에 개시된 바와 같은 HEK-BLUETM IL-33 반응성 세포-기반 검정을 이용해서 측정 가능한 것들을 포함한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "IL-36 자극된 신호"는, IL-36 사이토카인, 예컨대, IL-36α, IL-36β 또는 IL-36γ를, 이의 동족체 세포 표면 수용체인 IL1RL2에 결합함으로써 개시된 세포내 신호를 지칭한다. 예시적인 IL-36 자극된 신호는 대용물 세포-기반 차단 검정, 예컨대, 본 명세서에서 실시예에 개시된 바와 같은 HEK-BLUETM IL-36 반응성 세포-기반 검정을 이용해서 측정 가능한 것들을 포함한다.
"세포-기반 차단 검정"은 항원이 항체에 결합하는 생물학적 활성도를 저해 또는 거감시키는 항체의 능력이 측정될 수 있는 검정을 지칭한다. 예를 들어, 세포-기반 차단 검정은 저해 특정 생물학적 또는 생화학적 기능, 예컨대, IL-1, IL-33 및 IL-36 신호전달 경로를 통한 IL1RAP-매개 세포내 신호전달을 저해하는데 필요한 항체의 농도를 측정하는데 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체(예컨대, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체)의 반수 최대 저해 농도(IC50) 및/또는 90% 저해 농도(IC90)는 세포-기반 차단 검정을 이용해서 측정된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 세포-기반 차단 검정은 항체가 작용제(예컨대, IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β, IL-36γ)와 이의 동족체 수용체 간의 상호작용을 차단하는지의 결정하는데 사용된다. 본 개시내용의 항체로 유용한 세포-기반 차단 검정은 원발성 세포 검정(예컨대, PHLF 세포)뿐만 아니라 리포터 또는 센서 세포 검정(예컨대, HEK-BLUETM 리포터 세포 검정)을 포함할 수 있다. IL-1, IL-33 및 IL-36 신호전달 경로용의 예시적인 세포-기반 차단 검정, 예컨대, 적합한 HEK-BLUETM 특이적 사이토카인-반응성 리포터 세포-기반 검정은, 본 명세서에서 제공되는 실시예에 기재되어 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "항체"는, 특정 항원에 특이적으로 결합하거나 또는 이에 면역학적으로 반응하는 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 분자를 지칭한다. 본 개시내용의 예시적인 항체는 단클론성 항체, 다클론성 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 다중특이적(또는 헤테로접합체) 항체(예컨대, 이중특이적 항체), 1가 항체(예컨대, 단일-아암 항체(single-arm antibody)), 다가 항체, 항원-결합 단편(예컨대, Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rIgG 및 scFv 단편), 항체 융합체, 및 합성 항체(또는 항체 모방체)를 포함한다.
"항-IL1RAP 항체" 또는 "IL1RAP에 결합하는 항체"는, 항체가 IL1RAP를 표적화함에 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 IL1RAP에 결합하는 항체를 지칭한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항-IL1RAP 항체를 비관련 비-IL1RAP 항원에 결합하는 정도는, 예컨대, 방사선면역검정(RIA)에 의해 측정된 바와 같이, 항체를 IL1RAP에 결합하는 것의 약 10% 미만이다. 몇몇 실시형태에 있어서, IL1RAP에 결합하는 항체는 1μM 미만, 100nM 미만, 10nM 미만, 1nM 미만, 0.1nM 미만, 0.01nM 미만 또는 1pM 미만(예컨대, 10-8 M 이하, 예컨대, 10-8 M 내지 10-13 M, 예컨대, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(KD)를 갖는다.
"전장 항체", "무손상 항체", 또는 "전체 항체"는 본 명세서에 기재된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖거나 또는 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 지칭하기 위하여 본 명세서에서 호환 가능하게 사용된다.
"항체 단편"은 전장 항체와 동일한 항체에 결합 가능한 전장 항체의 일부를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디; 선형 항체; 1가 또는 단일-아암 항체; 단일사슬(single-chain) 항체 분자(예컨대, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
항체의 "부류(class)"는 그의 중쇄에 의해 처리된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 5가지 주된 부류의 항체, 즉, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM가 있고, 이들 중 몇몇은 더욱 하위부류(아이소타입), 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 나뉜다. 상이한 부류의 면역글로불린에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 각각α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
"가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합함에 있어서 연루되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 갖되, 각 도메인은 4개의 보존 프레임워크 영역(FR)와 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함한다(예컨대, 문헌[Kindt et al., Kuby Immunology, 6th　ed., W.H. Freeman and Co., page 91] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하는데 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 선별하도록 항원에 결힙하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 이용해서 단리될 수 있다(예컨대, 문헌[Portolano et al., J. Immunol., 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature, 352:624-628 (1991) 참조).
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "초가변 영역" 또는 "HVR"은, 서열이 초가변이고/이거나 구조적으로 정의된 루프("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역의 각각을 지칭한다. 일반적으로, 천연 항체는 6개의 HVR을 갖는 4개의 사슬을 포함한다; 3개는 중쇄 가변 도메인, VH(HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3), 및 3개는 경쇄 가변 도메인, VL (HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3). HVR은 일반적으로 초가변 루프로부터 그리고/또는 "상보성 결정 영역"(CDR)으로부터 아미노산 잔기를 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인 내 기타 잔기(예컨대, FR 잔기)는 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 따라서 본 명세서에서 넘버링된다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은, 최고 서열 가변성을 갖고/갖거나 항원 인지에 연루된 가변 도메인의 HVR 내의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 천연 항체는 6개의 CDR을 갖는 4개의 사슬을 포함한다; 3개는 중쇄 가변 도메인, VH(H1, H2, H3), 및 3개는 경쇄 가변 도메인, VL(L1, L2, L3). 예시적인 CDR(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 24 내지 34, L2의 50 내지 56, L3의 89 내지 97, H1의 31 내지 35B, H2의 50 내지 65 및 H3의 95 내지 102에서 일어난다(Kabat et al., 상기 참고).
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인, 즉, FR1, FR2, FR3 및 FR4으로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 이하의 서열에서 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
"천연 항체"는 천연 유래 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 다이설파이드-결합되는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된, 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머 당단백질이다. N-에서 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라고도 물리는 가변 영역(VH)에 이어서, 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 마찬가지로, N-에서 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VL)에 이어서, 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파(κ) 및 람다(λ)라 불리는 2개의 유형 중 하나에 배정될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "단클론성 항체"는 항체의 실질적으로 균질환 모집단으로부터 얻어진 항체를 지칭하고, 즉, 집단을 포함하는 개별적인 항체는, 가능한 변이체 항체를 제외하고(예컨대, 변이체 항체는 천연으로 생성되거나 단클론성 항체의 생산 동안에 일어나고, 일반적으로 소량으로 존재하는 돌연변이를 함유함) 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정자(에피토프)에 대해서 지향된 상이한 항체를 포함하는 다클론성 항체 제조와 대조적으로, 단클론성 항체 제제의 각각의 단클론성 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해서 지향된다. 따라서, 용어 "단클론성"은 항체의 실질적으로 균질환 모집단으로부터 얻어지는 바와 같은 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의해 항체의 생산으로 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 사용될 단클론성 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법, 본 명세서에 기재되어 있는 단클론성 항체를 제조하기 위한 이러한 방법 및 다른 예시적인 방법을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
"키메라 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되는 한편 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다.
"인간화 항체"는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 서열 및 인간 FR로부터의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 소정의 실시형태에 있어서, 인간화 항체는 적어도 하나의, 전형적으로 적어도 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이고, HVR(예컨대, CDR)의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 항체의 것에 대응하고, FR의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 항체의 것에 대응한다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예컨대, 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화된 항체를 지칭한다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 기타 인간 항체-암호화 서열을 이용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 것에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 지칭한다. 인강 항체의 이 정의는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다.
"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 통상적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 서브그룹으로부터 유래된다. 일반적으로, 서열의 서브그룹은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에서와 같은 서브그룹이다. 일 실시형태에 있어서, VL에 대해서, 서브그룹은 문헌[Kabat et al., 상기 참조]에서와 같은 서브그룹 카파 I이다. 일 실시형태에 있어서, VH에 대해서, 서브그룹은 문헌[Kabat et al., 상기 참조]에서와 같은 서브그룹 III이다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "억셉터(acceptor) 인간 프레임워크"는 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로부터 유래된" 억셉터 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 아미노산 변화의 수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하 또는 2 이하이다. 몇몇 실시형태에 있어서, VL 억셉터 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열에 대해서 서열이 동일하다.
"Fc 영역"은, 면역글로불린 중쇄의 C-말단 폴리펩타이드 서열을 포함하는 다이머 복합체를 지칭하며, 여기서 C-말단 폴리펩타이드 서열은 무손상 항체의 파파인 소화에 의해 얻어질 수 있는 것이다. Fc 영역은 천연 또는 변이체 Fc 서열을 포함할 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 서열의 경계가 변할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 서열은 통상 약 위치 Cys226에서의 아미노산 잔기로부터 또는 약 위치 Pro230로부터, Lys447에서의 Fc 서열의 카복실-말단까지 연신되도록 정의된다. 그러나, Fc 서열의 C-말단 라이신(Lys447)은 재조합 생산(예컨대, CHO 세포에서의 생산)에 사용되는 세포 배양액 시스템에서 일어날 수 있는 효소적 절단으로 인해 재조합 항체의 Fc 영역에 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 면역글로불린의 Fc 서열은 일반적으로 2개의 불변 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 선택적으로 CH4 도메인을 포함한다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은, 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 지칭한다. 몇몇 실시형태에 있어서, FcR은 천연 인간 FcR이다. 몇몇 실시형태에 있어서, FcR은 IgG 항체(감마 수용체)에 결합하고, 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함하는, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체를 포함하는 것이다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("저해 수용체")를 포함하고, 이는 이의 세포질 도메인이 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 이의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다. 저해 수용체 FcγRIIB는 이의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반 저해 모티프(ITIM)를 함유한다(예컨대, 문헌[Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)] 참조). 본 명세서에서 이용되는 바와 같은 FcR은 또한 모체 IgG를 태아에 전달(Guyer et al., J. Immunol., 1 17:587 (1976) 및 Kim et al., Eur. J. Immunol., 24:2429-2434 (1994))하고 면역글로불린의 항상성을 조절하는 역할을 하는 신생아 수용체인 FcRn을 포함한다. FcR은, 예를 들어, 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol, 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995)]에서 검토되어 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "다가 항체"는 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 항체이다. 다가 항체는 바람직하게는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖도록 조작되고, 일반적으로 천연 서열 IgM 또는 IgA 항체가 아니다.
"다중특이적 항체"는 적어도 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 항체이고, 각 부위는 상이한 결합 특이성을 갖는다. 다중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편일 수 있고, 상이한 결합 부위는 상이한 항원에 각각 결합할 수 있거나, 또는 상이한 결합 부위는 동일한 항원의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다.
"Fv 단편"은 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편을 지칭한다. 이 영역은, 예를 들어 scFv에서 속성상 공유결합할 수 있는 밀접하게 회합된 하나의 중쇄 가변 도메인 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 다이머로 이루어진다. 각 가변 도메인의 3개의 HVR이 VH-VL 다이머의 표면 상에 항원 결합 부위를 정의하도록 상호작용하는 것이 이 형태이다. 집합적으로, 6개의 HVR 또는 이의 서브 세트는 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 HVR만을 포함하는 Fv의 절반)도 통상 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도로 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
"Fab 단편"은 경쇄의 가변 및 불변 도메인 및 중쇄의 가변 도메인 및 제1 불변 도메인(CH1)을 함유하는 항체 단편을 지칭한다. "F(ab')2 단편"은 이들 사이에 힌지 시스테인에 의해 그들의 카복시 단편 부근에 일반적으로 공유 결합되는 Fab 단편의 쌍을 포함한다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 당업계에 공지되어 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "항원 결합 아암"은, 관심 표적 분자에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 항체의 성분을 지칭한다. 전형적으로, 항원 결합 아암은 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 면역글로불린 폴리펩타이드 서열, 예컨대, HVR 및/또는 가변 도메인 서열의 복합체이다.
"단일사슬 Fv" 또는 "scFv"는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 단편을 지칭하는데, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩타이드는 scFv가 목적하는 항원 결합 구조를 형성할 수 있게 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 더 포함한다.
"다이아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하는데, 여기서 그 단편은 동일한 폴리펩타이드 사슬(VH 및 VL)에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 동일한 사슬 상에서 2개의 도메인 사이에 쌍을 이루기를 하기에는 너무 짧은 링커를 이용해서, 도메인은 또 다른 사슬의 상보성 도메인과 강제로 쌍을 이루어 2개의 항원-결합 부위를 생성한다.
"선형 항체"는 문헌[Zapata et al., Protein Eng., 8(10): 1057-1062 (1995)]에 기재된 항체를 지칭한다. 간단히 말하면, 이들 항체는, 상보성 경쇄 폴리펩타이드와 함께, 항원 결합 영역의 쌍을 형성하는 중쇄 단편(VH-CH1-VH-CH1)의 탠덤 반복체를 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.
"네이키드(naked) 항체"는 이종성 모이어티(예컨대, 세포독성 모이어티) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 지칭한다.
"친화도"는 분자(예컨대, 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 상대방(예컨대, 항원) 간의 총 비공유 상호작용의 강도를 지칭한다. "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원(예컨대, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 상대방 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 평형 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본 명세서에 기재된 것들을 비롯하여 당업계에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화도를 측정하는 구체적인 실례 및 예시적인 실시형태는 이하에 기재된다.
"특이적으로 결합하는" 또는 "특이적 결합"은 항체를 항원에 약 1×10-7 M 이하의 친화도 값으로 결합하는 것을 지칭한다.
"친화도 성숙" 항체는, 그러한 변화를 갖지 않는 친계 항체와 비교해서, 하나 이상의 HVR에서 하나 이상의 변화를 갖는 항체를 지칭하며, 이러한 변화는 항원에 대한 항체의 친화도의 향상을 초래한다.
항체의 "기능적 항원 결합 부위"는 표적 항원에 결합할 수 있는 부위이다. 항원 결합 부위의 항원 결합 친화도는 항원 결합 부위가 유래되는 친계 항체만큼 강할 필요는 없지만, 항원을 결합하는 능력은 항원에 대한 항체 결합을 평가하기 위하여 공지된 다양한 방법 중 어느 하나를 이용해서 측정 가능해야 한다.
"단리된 항체"는 자연 환경의 성분으로부터 분리된 항체를 지칭한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체는, 예를 들어, 전기영동(예컨대, SDS-PAGE, 등전위집속(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 방법(예컨대, 이온교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정된 바와 같은 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법을 검토하기 위해서는, 예컨대, 문헌[Flatman et al., J. Chromatogr. B Analyt. Technol Biomed Life Sci, 848:79-87]을 참조한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 동일한"은, 2개의 수치값(예를 들어, 하나는 시험 항체와 연관되고 다른 하나는 참조 항체와 연관됨) 사이에 충분히 높은 정도의 유사성을 지칭하므로, 당업자라면 두 값 사이의 차이가 상기 값(예컨대, KD 값)에 의해 측정된 생물학적 특징의 맥락 내에서 생물학적 및/또는 통계학적 유의성이 거의 또는 전혀 없는 것으로 고려할 것이다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "실질적으로 상이한"은, 2개의 수치값(예를 들어, 하나는 분자와 연관되고 다른 하나는 참조 분자와 연관됨) 사이에 충분히 높은 정도의 차이를 지칭하므로, 당업자라면 두 값 사이의 차이가 상기 값(예컨대, KD 값)에 의해 측정된 생물학적 특징의 맥락 내에서 통계학적 유의성이 있는 것으로 고려할 것이다.
"효과기 기능"은 항체 아이소타입에 따라 달리하는 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성도를 지칭한다. 항체 효과기 기능의 예는 다음을 포함한다: Clq 결합 및 보체 의존 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC); 식균 작용; 세포 표면 수용체(예컨대, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화.
"면역접합체"는 세포독성제를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 하나 이상의 이종성 분자(들)에 접합된 항체를 지칭한다.
"치료", "치료하다" 또는 "치료하는"은, 치료 중인 개체에서 장애의 자연적 과정을 변경하려는 시도의 임상적 개입을 지칭하며, 임상적 병리의 과정 동안 또는 예방을 위해 수행될 수 있다. 치료의 목적하는 결과는 장애의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 장애의 임의의 직접 또는 간접적 병리적 결과의 감소, 질환 상태의 전이 방지, 진행 속도의 감소, 개선 또는 일시적 완화 및 차도 또는 향상된 예후를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 치료는 IL1RAP에 의해 매개된 질환 또는 병태의 발달을 지연시키거나 또는 진행을 둔화시키도록 대상체에게 항-IL1RAP 항체를 포함하는 치료적 유효량의 약제학적 제형을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
"약제학적 제형"은, 활성 성분(들)의 생물학적 활성도를 유효하게 하고 제형이 투여되는 대상체에게 독성이 있는 추가의 성분을 함유하지 않는 형태의 제제를 지칭한다.
"약제학적으로 허용 가능한 담체"는, 투여되는 대상체에게 비독성인, 활성 성분 이외의, 약제학적 제형 내 성분을 지칭한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 완충액, 부형제, 안정제 또는 보존제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
"치료적 유효량"은 대상체에서 목적하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하기 위한, 예컨대, 질환, 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 활성 성분 또는 제제(예컨대, 약제학적 제형)의 양을 지칭한다. IL1RAP 매개 질환 또는 병태의 경우에, 치료제의 치료적 유효량은 질환, 장애 또는 병태와 연관된 하나 이상의 증상을 어느 정도로 저감, 예방, 저해 및/또는 완화시키는 양이다. 천식 요법의 경우에, 생체내 효능은, 예를 들어, 증상의 지속기간, 중증도 및/또는 재발, 반응률(RR), 반응의 지속기간, 및/또는 삶의 질을 평가함으로써 측정될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "동시에"는, 투여의 적어도 일부분이 시간 상으로 겹치는 2종 이상의 치료제의 투여를 지칭한다. 따라서, 동시 투여는 1종 이상의 기타 제제(들)의 투여를 중시한 후 1종 이상의 제제(들)의 투여를 계속할 경우의 투여 요법을 포함한다.
"개체" 또는 "대상체"는 가축(예컨대, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류s(예컨대, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대, 원숭이), 토끼 및 설치류(예컨대, 마우스 및 래트)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 포유동물을 지칭한다.
각종 실시형태의 상세한 설명
I. 사이토카인의 IL-1 패밀리
IL-1 패밀리는, 병원성 매개체 및 면역력, 세포 증식 및 염증의 조절제로서 역할하는 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ를 비롯한 다수의 작용제 사이토카인을 포함한다. 각각 이러한 사이토카인을 그의 각각의 동족체 세포막 수용체에 결합하는 것은 IL1RAP 공동-수용체의 동원 및 세포내 신호 전달을 촉발시키는 신호전달 복합체의 형성을 초래한다.
예를 들어, IL-1α는 동족체 수용체인 IL1R1에의 결합을 통해서 세포내 신호전달을 개시하는 작용제 사이토카인으로서 작용한다. IL-1α를 IL1R1에 결합할 때, 공동-수용체 보조 단백질 IL1RAP가 동원되고 결합되어 IL-1α, IL1R1 및 IL1RAP를 포함하는 삼원 신호전달 복합체를 형성한다. IL-1 알파에 의해 자극된 신호 전달은 표적 세포에서 핵인자 카파 B(NF-κB) 전사 인자 경로 및 미토겐-활성화 단백질 키나제(MAPK) 경로의 활성화를 초래하고 병원성 염증성, 세포 증식 및 면역 반응의 캐스케이드를 촉발시킨다. 이어지는 신호전달 캐스케이드는 병원성 염증성, 세포 증식 및 면역 반응과 연관된 몇 개의 단백질의 발현을 초래한다. 예컨대, 문헌[Garlanda et al., Immunity, 39:1003-1018 (2013)]을 참조한다.
마찬가지로, IL-1β는 동족체 수용체인 IL1R1에 결합함으로써 세포내 신호전달을 개시하는 작용제 사이토카인으로서 작용한다. IL-1β를 IL1R1에 결합할 때, 공동-수용체 IL1RAP를 동원하고 결합시켜, IL-1β, IL1R1 및 IL1RAP를 포함하는 삼원 신호전달 복합체의 형성을 초래한다. IL-1β에 의해 매개된 신호 전달은 표적 세포에 NF-κB 전사 인자 경로 및 미토겐-활성화 단백질 키나제 경로의 활성화를 초래하며, 이는 신호전달 캐스케이드를 침전시켜 병원성 염증성, 세포 증식 및 면역 반응과 연관된 많은 단백질의 발현을 초래한다. 예컨대, 문헌[Wang et al., Nature Immunol., 11(1):905-912 (2010); Saluja et al., Clin. Transl. Allergy, 5:33 (2015)]을 참조한다.
작용제 사이토카인 IL-33은 동족체 수용체 ST2(또한 IL1RL1로도 알려짐)에 결합함으로써 기능적 세포내 신호전달 효과를 매개하고, 이어서 공동-수용체 IL1RAP의 후속적 동원 및 결합에 의해 IL-33, ST2 및 IL1RAP를 포함하는 삼원 신호전달 복합체를 형성한다. IL-33에 의해 매개된 신호 전달은 NF-κB 전사 인자 경로 및 AP-1 경로의 활성화를 초래하고 일정 범위의 면역 및 염증성 반응을 일으킨다. 예컨대, 문헌[Sebastian Gunther et al., Immunity, 47:510-523 (2017)]을 참조한다. 신호전달 캐스케이드는 병원성 염증성, 세포 증식 및 면역 반응과 연관된 많은 단백질의 발현을 초래한다(Shafaqat Ali et al., PNAS, 104(47):18660-18665 (2007)).
작용제 사이토카인 IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ의 각각은 동족체 수용체인 IL1RL2에 결합함으로써 세포내 신호전달을 유발한다. 이들 IL-36 사이토카인 중 임의의 것을 IL1RL2에 결합시킴으로써 공동-수용체 IL1RAP의 동원 및 관여를 유발하여, IL1RL2, IL1RAP, 및 신호전달 이벤트를 개시시키는 각각의 IL-36 사이토카인을 포함하는 삼원 신호전달 복합체를 형성시킨다. IL-36α, IL-36β 또는 IL-36γ에 의해 자극된 신호 전달은 표적 세포에서 NK-κB 전사 인자 및 AP-1 경로의 활성화를 초래하고 각종 염증성, 증식성 및 병원성 면역 반응을 유도한다. 예컨대, 문헌[Jennifer Towne et al., J. Biol. Chem., 279(14):13677-13688 (2004); Sebastian Gunther et al., J. Immunol., 193(2):921-930 (2014)]을 참조한다.
II. IL1RAP
IL1RAP는 소정의 세포의 표면 상에서 발현된 막 단백질이다. 인간 IL1RAP(본 명세서에서 "hu-IL1RAP"로도 지칭됨)의 서열 및 주석은 GenBank 수탁 번호 AAB84059.1 또는 UniProt 등록 Q9NPH3에서 발견될 수 있다. 전장 hu-IL1RAP 전구체 단백질의 아미노산 서열은 본 명세서에서 서열번호 1로 제시된다. 전장 hu-IL1RAP를 암호화하는 예시적인 1740 뉴클레오타이드 서열은 본 명세서에서 서열번호 2에 제시된다.
전장 hu-IL1RAP의 아미노산 서열은 신호 펩타이드, 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 연속적인 순서로 포함한다. 신호 서열은 서열번호 1의 아미노산 1 내지 20을 포함한다. hu-IL1RAP의 성숙 형태는 서열번호 1의 아미노산 21 내지 570을 포함한다. hu-IL1RAP의 세포외 도메인은 서열번호 1의 아미노산 21 내지 367을 포함한다. hu-IL1RAP의 세포외 도메인은 3개의 뚜렷한 도메인을 더 포함한다. 도메인 1("D1")은 서열번호 1의 아미노산 21 내지 133을 포함한다. 도메인 2("D2")는 서열번호 1의 아미노산 134 내지 237을 포함한다. 도메인 3("D3")은 서열번호 1의 아미노산 238 내지 367을 포함한다. hu-IL1RAP의 막관통 도메인 및 세포질 도메인은, 각각 서열번호 1의, 아미노산 368 내지 388, 및 아미노산 389 내지 570을 포함한다.
전장 hu-IL1RAP 단백질의 일부에 대응하는 폴리펩타이드 작제물은 항-IL1RAP 항체를 높은 결합 친화도로 유발하기 위하여 항원으로서 사용될 수 있다. 본 명세서의 다른 곳에서 개시된 바와 같이, 이들 항-IL1RAP 항체는 동족체 수용체에 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ 중 하나 이상의 결합에 의해 개시되는 세포내 신호를 감소시킬 수 있다. 항원으로서 유용한 hu-IL1RAP 단백질의 일부에 대응하는 폴리펩타이드 작제물은 hu-IL1RAP의 세포외 도메인, 및 도메인 D1, D2, D1+D2 및 D3에 대응하는 폴리펩타이드를 포함한다.
아래의 표 1은 본 개시내용의 hu-IL1RAP 폴리펩타이드 작제물의 서열 및 이들의 서열 식별자의 요약 설명을 제공한다. 부가적으로, 마우스 및 시노몰구스 원숭이 IL1RAP 단백질에 대응하는 축약된 폴리펩타이드 작제물이 제공되는데, 이들은 항-hu-IL1RAP 항체의 교차반응성을 결정하는데 유용하다. 서열은 또한 첨부 서열 목록에 포함된다.
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III. 항-IL1RAP 항체
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 다양한 잘 알려진 면역글로불린 특징(예컨대, CDR, HVR, FRs, VH 및 VL 도메인)의 뉴클레오타이드 서열을 암호화하고 아미노산의 관점에서 항-IL1RAP 항체의 구조를 제공한다. 아래의 표 2는 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체 서열 및 이들의 서열 식별자의 요약 설명을 제공한다. 서열은 첨부 서열 목록에 포함된다.
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1. 항-IL1RAP 항체의 결합 친화도 및 세포-신호전달 저해
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항-IL1RAP 항체는 100nM 미만, 10nM 미만, 1nM 미만, 0.1nM 미만, 0.01nM 미만 또는 0.001nM 미만(예컨대, 10-8 M 이하, 10-8 M 내지 10-13 M, 예컨대, 10-9 M 내지 10-13 M)의 인간 IL1RAP에 결합하기 위한 평형 해리 상수(KD)를 갖는다. 더욱 구체적으로, 몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체는 인간 IL1RAP에 1×10-8 M 이하, 1×10-9 M 이하, 1×10-10 M 이하 또는 1×10-11 M 이하의 결합 친화도로 결합한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 결합 친화도는 서열번호 3의 hu-M-IL1RAP 폴리펩타이드에 결합하기 위한 평형 해리 상수(KD)로서 측정된다. 일반적으로, 리간드의 이의 수용체에 대한 결합 친화도는 다양한 검정 중 임의의 것을 이용해서 결정되고 다양한 정량적 값으로 환산해서 표현될 수 있다. 항체의 친화도를 결정하는데 유용한 특정 IL1RAP 결합 검정이 본 명세서의 실시형태에 개시되어 있다. 또한, 항원 결합 검정은 당업계에 공지되어 있고, 제한 없이, 웨스턴 블롯, 방사선면역검정, 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), "샌드위치" 면역검정, 표면 플라스몬 공명 기반 검정(예컨대, WO2005/012359에 기재된 바와 같은 BIAcore 검정), 면역침강 검정, 형광 면역검정, 및 단백질 A 면역검정과 같은 기술을 이용하는 임의의 직접 또는 경쟁적 결합 검정을 비롯하여 본 명세서에서 사용될 수 있다.
따라서, 몇몇 실시형태에 있어서, 결합 친화도는 KD값으로 표현되고 (예컨대, 항원항체결합 효과를 갖는) 고유 결합 친화도를 반영한다. 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체는, 예를 들어, 10nM 내지 1pM의 KD값을 나타내는 hu-M-IL1RAP 폴리펩타이드(서열번호 3)에 대해서 강한 결합 친화도를 나타낸다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항-IL1RAP 항체는 IL-1, IL-33 및/또는 IL-36 신호전달 경로를 포함하는 IL1RAP-매개 경로에 의해 세포내 신호전달을 감소, 저해 및/또는 완전-차단하고, 더욱 구체적으로, 신호전달 경로는 이하의 작용제 중 하나 이상의 결합에 의해 자극된다: IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ. 이들 IL1RAP-매개 신호전달 경로를 저해하는 항체의 능력은 본 개시내용의 실시예에 기재된 HEK-BLUETM 리포터 세포 검정 및 원발성 세포-기반 차단 검정을 포함하는 공지된 세포-기반 차단 검정을 이용해서 시험관내에서 검정될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 세포내 신호전달을 감소, 저해 및/또는 완전-차단하는 항체의 능력은 약 EC50의 농도에서 작용제(들) IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ와 함께 리포터 세포-기반 차단 검정을 이용해서 항체의 IC50으로서 결정된다. 작용제 EC50은 종종 검정 전에 추정될 수 있고, 검정이 데이터의 비선형 회귀 분석을 이용해서 완결된 후에 결정된다. 이러한 검정에서, 약 EC50의 값은 전형적으로 EC40-45 내지 EC55-60의 범위에 있을 것이다.
따라서, 몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 IL1RAP 항체는 IL1RAP-매개 경로에 의해 세포내 신호전달을 감소, 저해 및/또는 완전-차단하는 능력에 기초하여 이하의 기능적 특성 중 하나 이상을 특징으로 한다.
몇몇 실시형태에 있어서 항-IL1RAP 항체는 IL-1 자극된 신호, IL-33 자극된 신호, 및/또는 IL-36 자극된 신호를 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%만큼 감소된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 리포터 세포-기반 차단 검정(예컨대, HEK-BLUETM 리포터 세포 검정). 당업자라면 자극된 IL-1, 자극된 IL-33 및/또는 자극된 IL-36 경로에서 세포-신호전달의 저해를 결정하는데 사용하기 위하여 공지된 리포터 세포 검정법들 중 어느 것인가를 선택할 수 있다. 일반적으로, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체는 약 EC50(예컨대, EC40 내지 EC60)의 농도의 작용제의 10nM 이하, 5nM 이하 또는 1nM의 항체에 대한 IC50값으로의 결합에 의해 개시된 IL1RAP-매개 세포내 신호를 감소시킨다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항-IL1RAP 항체는 IL-1 자극된 신호, IL-33 자극된 신호, 및 IL-36 자극된 신호를 적어도 95% 또는 적어도 99%만큼 감소시키고; 선택적으로, IL-1, IL-33 및/또는 IL-36 자극된 신호는 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ로부터 선택된 작용제에 의해 자극되고; 선택적으로, 약 EC50의 작용제 농도에서, 항체는 10nM 이하, 5nM 이하 또는 1nM 이하의 IC50을 갖는다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항-IL1RAP 항체는 이의 동족체 수용체에 대한 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ 작용제 결합 중 하나 이상에 의해 개시되는 세포내 신호를 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%만큼 감소시킨다. 몇몇 실시형태에 있어서 항-IL1RAP 항체는 원발성 인간 폐 섬유아세포(PHLF)로부터의 IL8의 IL-1α, IL-1β 및/또는 IL-36β 자극된 방출을 저해하되; 선택적으로, 약 EC50의 IL-1α, IL-1β 및/또는 IL-36β 농도에서, 항체는 10nM 이하, 5nM 이하 또는 1nM 이하의 IC50을 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서 항-IL1RAP 항체는 원발성 인간 단핵구로부터 IL6의 IL-1β 자극된 방출을 저해하되; 선택적으로, 약 EC50의 IL-1β 농도에서, 항체는 10nM 이하, 5nM 이하 또는 1nM 이하의 IC50을 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서 항-IL1RAP 항체는 인간 자연살해(NK) 세포로부터 INF-γ의 IL-33 자극된 방출을 저해하되; 선택적으로, 약 EC50의 IL-33 농도에서, 항체는 10nM 이하, 5nM 이하 또는 1nM 이하의 IC50을 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체는 인간 표피 각질세포(HEKn)로부터 IL8의 IL-36β 자극된 방출을 저해하되; 선택적으로, 약 EC60의 IL-36β 농도에서, 항체는 10nM 이하, 5nM 이하 또는 2nM 이하의 IC50을 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체는 호염기구에서 IL-33 자극된 인산화를 저해하되; 선택적으로, 약 EC56의 IL-33 농도에서, 항체는 75nM 이하, 50nM 이하 또는 45nM 이하의 IC50을 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체는 CD4+ T 세포로부터 INF-γ의 IL-33 자극된 방출을 저해하되; 선택적으로, 약 EC34의 IL-33 농도에서, 항체는 75nM 이하, 50nM 이하 또는 45nM 이하의 IC50을 갖는다.
2. 항체 단편
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체는 항체 단편일 수 있다. 본 개시내용의 결합 결정자로 유용한 항체 단편은, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 1가, 1-아암(또는 단일-아암) 항체, scFv 단편, 및 본 명세서에 기재되고 당업계에 공지된 기타 단편을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다양한 항체 단편의 검토를 위하여, 예컨대, 문헌[Hudson et al., Nat. Med., 9: 129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편의 검토를 위하여, 예컨대, 문헌[Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]을 참조하고; 또한 WO93/16185; 및 미국 특허 제5,571,894호 및 제5,587,458호를 참조한다. 구제 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 설명에 대해서는, 미국 특허 제5,869,046호를 참조한다. 다른 1가 항체 형태는, 예컨대, WO2007/048037, WO2008/145137, WO2008/145138 및 WO2007/059782에 기재되어 있다. 1가, 단일-아암 항체는, 예컨대, WO2005/063816에 기재되어 있다. 다이아비디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다(예컨대, EP0404097; WO93/01161; 문헌[Hudson et al., Nat. Med., 9: 129-134 (2003); 및 Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)] 참조).
몇몇 실시형태에 있어서, 항체 단편은 항체의 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 단일-도메인 항체이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(Domantis, Inc., 매사추세츠주 월섬 소재; 예컨대, 미국 특허 제6,248,516호 참조).
항체 단편은, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 무손상 항체의 단백질분해 소화뿐만 아니라 재조합 숙주 세포(예컨대, 이.콜라이(E. coli) 또는 파지)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
본 개시내용의 임의의 항-IL1RAP 항체는 당업계에 공지된 그리고/또는 본 명세서에 기재된 방법 및 기술을 이용해서 항체 단편으로서 제조될 수 있는 것이 상정된다. 예를 들어, 본 개시내용의 각종 항-IL1RAP 항체의 Fab 버전의 제조 및 분석은 실시예 8에 기재되어 있다.
3. 키메라 및 인간화 항체
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체는 키메라 항체일 수 있다. (예컨대, 미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851-6855 (1984)]에 기재된 바와 같은 키메라 항체 참조). 일 실시형태에 있어서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역(예컨대, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대, 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 친계 항체의 것으로부터 변화된 "부류 전환된" 항체이다. 키메라 항체가 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있는 것이 상정된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 인간에 대한 면역원성을 저감시키기 위하여 인간화된 한편, 친계 비-인간 항체의 특이성과 친화도를 유지한다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예컨대, CDR(또는 이의 부분)이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR(또는 이의 부분)이 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 선택적으로 또한 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 인간화 항체에서의 일부 FR 잔기는 항체 특이성 또는 친화도를 복원 또는 향상시키기 위하여 비-인간 항체(예컨대, CDR 잔기가 유도되는 항체)로부터의 대응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 이를 제조하는 방법은, 예를 들어 문헌[Almagro and Fransson, Front. Biosci,. 13: 1619-1633 (2008)]에서 검토되어 있고, 예컨대, 문헌[Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033 (1989)]; 미국 특허 제5,821,337호, 제7,527,791호, 제6,982,321호 및 제7,087,409호; 문헌[Kashmiri et al., Methods, 36:25-34 (2005)](SDR(a-HVR) 이식을 기재); 문헌[Padlan, Mol. Immunol., 28:489-498 (1991)]("리서페이싱(resurfacing)"을 기재); 문헌[Dall'Acqua et al., Methods, 36:43-60 (2005)]("FR 셔플링"을 기재); 및 문헌[Osbourn et al., Methods, 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83 :252-260 (2000)](FR 셔플링에 대한 "유도된 선택" 접근법을 기재)에 더욱 기재되어 있다.
인간화에 유용한 인간 프레임워크 영역은 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: "최적 적합화(best-fit)" 방법을 이용해서 선택된 프레임워크 영역(예컨대, 문헌[Sims et al.,J. Immunol., 151 :2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 서브그룹의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역(예컨대, 문헌[Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al., J. Immunol, 151 :2623 (1993)] 참조); 인간 성숙(체세포 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식세포계열 프레임워크 영역(예컨대, 문헌[Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)] 참조); 및 선별 FR 라이브러리로부터 유래된 프레임워크 영역(예컨대, 문헌[Baca et al., J. Biol. Chem. 272: 10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem., 271 :22611-22618 (1996)] 참조).
본 개시내용의 임의의 항-IL1RAP 항체는 당업계에 공지된 그리고/또는 본 명세서에 기재된 방법 및 기술을 이용해서 인간화 항체로서 제조될 수 있는 것이 상정된다. 예를 들어, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체의 인간화 버전의 제조 및 분석은 실시예 5 내지 7에 기재되어 있다.
4. 인간 항체
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체는 인간 항체일 수 있다. 인간 항체는 당업계에 공지된 각종 수법을 이용해서 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌[van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Chem. Biol., 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol., 20:450-459 (2008)]에 기재되어 있다. 인간 항체는 항원성 시도에 응답하여 인간 가변 영역을 가진 무손상 인간 항체 또는 무손상 항체를 생산하기 위하여 변형된 트랜스제닉 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 면역글로불린 좌위를 대체하거나 또는 동물의 염색체에 무작위로 통합되거나 염색체외에 존재하는 인간 면역글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 면역글로불린 좌위는 일반적으로 불활성화되어 있었다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 얻기 위한 방법의 검토를 위하여, 문헌[Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조한다. 또한, 예컨대, 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호에서의 XENOMOUSE™ 기술; 미국 특허 제5,770,429호에서의 HUMAB® 기술; 미국 특허 제7,041,870호에서의 K-M MOUSE® 기술; 및 미국 특허 출원 공개 제US 2007/0061900호에서의 VELOCIMOUSE® 기술을 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 무손상 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예컨대, 상이한 인간 불변 영역과 조합함으로써 더욱 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 단클론성 항체의 생산용의 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주는 설명되어 있었다. 예컨대, 문헌[Kozbor, J. Immunol, 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)]을 참조한다. 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체는 또한 문헌[Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3557-3562 (2006)]에 기재되어 있다. 하이브리도마 세포주로부터 단클론성 인간 IgM 항체의 생산을 기술하는 추가의 방법은, 예컨대, 미국 특허 제7,189,826호에 기재되어 있다. 인간 하이브리도마 기술(즉, 트리오마(trioma) 기술)은, 예컨대, 문헌[Vollmers et al., Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers et al., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리시킴으로써 생성될 수 있다. 이어서, 이러한 가변 도메인 서열은 목적하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 기술은 이하에 설명되어 있다.
본 개시내용의 임의의 항-IL1RAP 항체는 당업계에 공지된 그리고/또는 본 명세서에 기재된 방법 및 기술을 이용해서 인간 항체로서 제조될 수 있는 것이 상정된다.
5. 라이브러리-유래 항체
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체는 목적하는 활성도 또는 활성도들을 가진 항체를 위하여 조합 라이브러리를 선별함으로써 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 목적하는 결합 특징을 갖는 항체를 위하여 이러한 라이브러리를 선별하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체의 인간화 버전의 친화도 성숙 변이체를 제조하기 위한 파지 디스플레이의 사용은 본 명세서에 개시된 실시예에 기재되어 있다. 이러한 라이브러리-유래 항체를 생산하는 기타 방법은, 예컨대, 문헌[Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology, 178: 1-37 (O'Brien et al., ed., Antibody Phage Display, Humana Press, Totowa, NJ, 2001); McCafferty et al., Nature, 348:552-554; Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, Methods in Molecular Biology, 248: 161-175 (Lo, ed., Antibody Engineering, Humana Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol., 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol., 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods, 284(1-2): 119-132(2004)]에서 발견할 수 있다.
조합 라이브러리 선별은 당업계에 공지된 그리고/또는 본 명세서에 기재된 방법 및 기술을 이용해서 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체의 변이체를 생성하는데 사용될 수 있는 것이 상정된다. 예를 들어, 본 개시내용의 인간화 항-IL1RAP 항체의 광범위한 친화도 성숙 변이체를 제조하기 위하여 파지 디스플레이 라이브러리 생성 및 선별의 사용이 실시예 8에 기재되어 있다.
6. 다중특이적 항체
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체는 다중특이적 항체, 예컨대, 이중특이적 항체이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 단클론성 항체이고, 각각은 상이한 항원에 대해서 결합 특이성을 갖고, 적어도 하나는 IL1RAP에 특이적으로 결합한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 결합 부위의 적어도 하나는 세포독성제에 특이적으로 결합한다. 예시적인 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체는 이중특이적 항체이고 IL1RAP를 발현하는 세포에 세포독성제를 국재화하는데 사용될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하는 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄쌍의 재조합 공발현을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는다(예컨대, 문헌[Milstein and Cuello, Nature, 305: 537 (1983)], WO 93/08829, 및 문헌[Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655 (1991)] 참조). "놉인홀(knob-in-hole)" 조작이 또한 사용될 수 있다(예컨대, 미국 특허 제5,731,168호 참조).
다중특이적 항체는 또한 호모다이머보다 오히려 Fc-헤테로다이머 항체 분자의 형성을 선호하는 "정전기 스티어링(electrostatic steering)" 효과를 조작하고(WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편을 교차결합하고(예컨대, 미국 특허 제4,676,980호, 및 문헌[Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조); 이중특이적 항체를 생산하기 위하여 류신 지퍼(zipper)를 이용하고(예컨대, 문헌[Kostelny et al., J. Immunol, 148(5): 1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이적 항체 단편을 제조하는 "다이아바디" 기술을 이용하고(예컨대, 문헌[Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 단일사슬 Fv(scFv) 다이머를 이용해서(예컨대, 문헌[Gruber et al., J. Immunol, 152:5368 (1994)]); 또는 삼중특이적 항체(예컨대, 문헌[Tutt et al., J. Immunol., 147: 60 (1991)] 참조) 제조될 수 있다.
본 개시내용의 임의의 항-IL1RAP 항체는 당업계에 공지된 그리고/또는 본 명세서에 기재된 방법 및 기술을 이용해서 다중특이적 항체로서 제조될 수 있는 것이 상정된다.
7. 항체 변이체
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체의 변이체가 또한 상정된다. 예를 들어, 향상된 결합 친화도 및/또는 항체의 기타 생물학적 특성을 가진 항체는 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 적절한 변형을 도입함으로써 또는 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내에 잔기로부터의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합은 최종 작제물에 도달할 수 있되, 단, 최종 작제물은 IL1RAP 항원 결합의 목적하는 특징을 갖는다. 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체의 광범위한 변이체는 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 당업계에 공지된 그리고/또는 본 명세서에 기재된 방법 및 기술을 이용해서 제조될 수 있는 것이 상정된다: (i) 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실 변이체; (ii) 글리코실화 변이체; (iii) Fc 영역 변이체; (iv) 시스테인 조작된 변이체; 및 (v) 유도된 변이체. 본 개시내용의 실시예 5 내지 9, 표 2 및 서열 목록은 하이브리도마-유래 11C5(Hy) 항-IL1RAP 항체의 다수의 예시적인 변이체뿐만 아니라 이의 인간화 버전 h11C5를 제공한다. 예시된 변이체는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 시스테인 단점(liability)(예컨대, C59Y)을 제거하기 위하여 CDR-H2에서의 아미노산 치환; 무효과기 기능(예컨대, N297G)을 부여하는 Fc 영역 변이체; 및 항원 친화도 및/또는 세포-기반 차단 활성도를 증가시키는 CDR 및 가변 도메인 영역에서의 다양한 단일, 이중, 삼중 아미노산 치환(예컨대, 서열번호 12 내지 35, 38 내지 61, 64 내지 76, 79 내지 120, 123 내지 139, 142 내지 201, 204 내지 225, 228 내지 239, 259 내지 278 및 280 내지 310).
A. 치환, 삽입 및 결실 변이체
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 것들에 추가하여 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항-IL1RAP 항체 변이체가 제공된다. 돌연변이유발을 위한 부위는 HVR 및 FR을 포함할 수 있다. 공통 곁사슬 부류 또는 특성에 기초한 전형적인 "보존적" 아미노산 치환 및/또는 치환은 당업계에 잘 알려져 있고, 본 개시내용의 실시형태에서 사용될 수 있다. 본 개시내용은 또한 아미노산 곁사슬 부류 중 하나의 구성원이 다른 부류로부터의 아미노산으로 교환되는 비-보존적 아미노산 치환에 기초한 변이체를 상정한다.
아미노산 곁사슬은 전형적으로 이하의 부류 또는 공통 특성에 따라 그룹화된다: (1) 소수성: Met, Ala, Val, Leu, Ile, 노르류신; (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) 산성: Asp, Glu; (4) 염기성: His, Lys, Arg; (5) 사슬 배향 영향: Gly, Pro; 및 (6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
항체 내로의 아미노산 치환 및 후속의 목적하는 기능, 예컨대, 유지된/향상된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 향상된 ADCC 또는 CDC를 위한 선별에 대한 기술은 당업계에 잘 알려져 있다.
아미노산 치환 변이체는 친계 항체(예컨대, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함할 수 있다. 일반적으로, 추가의 연구를 위하여 선택된 얻어진 변이체(들)는 친계 항체에 관하여 소정의 생물학적 특성(예컨대, 증가된 친화도, 저감된 면역원성)에 있어서 변형을 가질 것이고/것이거나 친계 항체의 소정의 생물학적 특성을 실질적으로 보유할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 본 명세서에서의 예에 기재된 것들과 같은, 예컨대, 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 이용해서 편리하게 생성될 수 있는 친화도 성숙 항체이다. 간단히 말하면, 하나 이상의 HVR 잔기는 돌연변이되고, 변이체 항체는 파지 상에 디스플레이되고 특정 생물학적 활성도(예컨대, 결합 친화도)를 위하여 선별된다.
돌연변이유발을 위하여 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역을 식별하기 위한 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이다(예컨대, 문헌[Cunningham and Wells (1989) Science, 244: 1081-1085] 참조). 이 방법에서, 표적 잔기(예컨대, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu와 같은 하전된 잔기)의 잔기 또는 기는, 항체와 항원의 상호작용이 영향을 미치는지의 여부를 결정하기 위하여 식별되고 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예컨대, Ala 또는 폴리알라닌)에 의해 교체된다. 추가의 치환은 초기 치환에 대한 기능적 감도를 입증하는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 항체와 항원 간의 접촉점을 식별하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조가 결정될 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 목적하는 특성을 함유하는지를 결정하기 위하여 선별될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 백개 이상의 잔기를 함유하는 하나의 잔기에서 폴리펩타이드까지의 길이의 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 기타 삽입 변이체는 항체의 N- 또는 C-말단에 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩타이드에 대한 융합을 포함한다.
치환은 항체 친화도를 개선시키기 위하여 HVR에서 제조될 수 있다. 이러한 변화는 "핫스팟(hotspot)"에서 이루어질 수 있는데, 즉, 잔기는 체세포 성숙 과정 동안 고빈도로 돌연변이되는 코돈에 의해 암호화되며(예컨대, 문헌[Chowdhury, Methods Mol., Biol. 207: 179-196 (2008)] 참조), 얻어지는 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도로 시험된다. 일 실시형태에 있어서, 친화도 성숙은 2차 라이브러리를 작제하고 재선택함으로써 수행될 수 있다(예컨대, 문헌[Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology, 178: 1-37 (O'Brien et al., ed., Antibody Phage Display, Humana Press, Totowa, NJ, (2001)] 참조). 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 수개의 HVR 잔기(예컨대, 한번에 4 내지 6개의 잔기)가 무작위화되는 HVR-유도 접근법을 포함한다. 항원 결합에 연루된 HVR 잔기는, 예컨대, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용해서 구체적으로 식별될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3은 특히 종종 표적화된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 치환, 삽입 또는 결실은 그러한 변화가 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 HVR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 저감시키지 않는 보존적 변화(예컨대, 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 보존적 치환)는 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변화는 HVR "핫스팟"의 외부에 있을 수 있다. 위에서 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 몇몇 실시형태에 있어서, 각각의 HVR은 미변경되거나 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
B. 글리코실화 변이체
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체는 해당 항체가 글리코실화되는 정도를 증가 또는 감소시키도록 변화된다. 항체에의 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변화시킴으로써 수행될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 실시형태에 있어서, Fc 영역에 부착된 탄수화물이 변화될 수 있다. 전형적으로, 포유류 세포에 의해 생산된 천연 항체는 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 대한 N-링키지에 의해 부착된 분지형의 바이안테너리(biantennary) 올리고당을 포함한다(예컨대, 문헌[Wright et al., TIBTECH, 15:26-32 (1997)] 참조). 올리고당은 각종 탄수화물, 예컨대, 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토스 및 시알산뿐만 아니라, 바이-안테너리 올리고당 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체의 Fc 영역의 올리고당의 변형은 소정의 향상된 특성을 가진 변이체를 작성할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체는 친계 항체의 변이체일 수 있으며, 변이체는 Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코스를 결여하는 탄수화물 구조를 포함한다. 예를 들어, 이러한 항체 내 푸코스의 양은 약 1% 내지 약 80%, 약 1% 내지 약 65%, 약 5% 내지 약 65% 또는 약 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은 MALDI-TOF 질량 분광법에 의해 측정된 바와 같이 Asn 297에 부착되 모든 글리코-구조의 합계(예컨대, 복합체, 하이브리드 및 높은 만노스 구조)에 비해서, Asn297에서 당 쇄 내에 푸코스의 평균량을 계산함으로써 결정될 수 있다(예컨대, WO 2008/077546 참조). Asn297은 Fc 영역에서 약 위치 297(Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치된 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; 그러나, Asn297은 또한 위치 297의 업스트림 또는 다운스트림에, 즉, 항체 내 최소 서열 변이로 인해 위치 294 내지 300 사이에서 약 ±3개의 아미노산에 위치될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 푸코실화 변이체는 향상된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예컨대, 미국 특허 공개 제US 2003/0157108호 또는 US 2004/0093621호를 참조한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 및 이를 제조하기 위한 관련된 방법의 예는, 예컨대, US2003/0157108; US2003/0115614; US2002/0164328; US2004/0093621; US2004/0132140; US2004/0110704; US2004/0110282; US2004/0109865; WO2000/61739; WO2001/29246; WO2003/085119; WO2003/084570; WO2005/035586; WO2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌[Okazaki et al., J. Mol. Biol., 336: 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]에 개시되어 있다.
탈푸코실화 항체를 제조하는데 유용한 세포주는 단백질 푸코실화가 결여된 Led 3 CHO 세포(예컨대, 문헌[Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys,. 249:533-545 (1986)]; US2003/0157108 및 WO2004/056312 참조), 및 넉아웃 세포주, 예컨대, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 넉아웃 CHO 세포(예컨대, 문헌[Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조)를 포함한다.
C. Fc 영역 변이체
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체는 Fc 영역(즉, Fc 영역 변이체) 내 하나 이상의 아미노산 변형을 포함할 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 잔기 위치에 아미노산 치환을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예컨대, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체에 유용한 당업계에 공지된 광범위한 Fc 영역 변이체는 이하에 기재되어 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항-IL1RAP 항체는 변화된 효과기 기능을 갖는 Fc 영역 변이체이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 변화된 효과기 기능을 갖는 항체는 친계 항체의 효과기 기능의 일부(그러나 전부는 아님), 감소된 효과기 기능을 갖거나 또는 효과기 기능의 어느 것도 갖지 않는다(예컨대, 무효과기). 무효과기 Fc 영역 변이체는 효과기 기능(예컨대, ADCC)이 불필요하거나 유해하고 그리고/또는 항체의 생체내 반감기가 중요한 경우 소정의 용도를 위하여 더욱 바람직하다.
저감된 효과기 기능을 갖거나 또는 무효과기인 Fc 영역 변이체 항체는 이하의 Fc 영역 위치 중 하나 이상에 아미노산 치환을 포함할 수 있다: 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329(예컨대, 미국 특허 제6,737,056호 참조). 이러한 Fc 영역 변이체는 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 둘 이상에 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 이러한 Fc 영역 변이체는 또한 알라닌에 대해서 잔기 265 및 297의 치환을 포함할 수 있다(예컨대, 미국 특허 제7,332,581호 참조). 실시예 및 본 발명의 다른 곳에 개시된 바와 같이, 몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체는 무효과기 Fc 영역 변이체이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항-IL1RAP 항체의 무효과기 Fc 영역 변이체는 아미노산 치환 N297G를 포함한다.
FcR에 대한 향상된 또는 감소된 결합을 갖는 Fc 영역 변이체는, 예컨대, 미국 특허 제6,737,056; WO 2004/056312; 및 문헌[Shields et al., J. Biol. Chem., 276(9): 6591-6604 (2001)]에 개시되어 있다. 향상된 ADCC를 갖는 Fc 영역 변이체는 (EU 넘버링을 기준으로) Fc 영역의 예컨대, 위치 298, 333 및/또는 334에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. Fc 영역 변이체는, 예컨대, 미국 특허 제6,194,551호, WO99/51642, 및 문헌[Idusogie et al., J. Immunol., 164: 4178-4184 (2000)]에 기재된 바와 같이 변화된(즉, 향상된 또는 감소된) Clq 결합 및/또는 보체 의존 세포독성(CDC)을 갖는다. 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 향상된 결합 및 증가된 반감기를 갖는 Fc 영역 변이체는, 예컨대, US2005/0014934A1(Hinton et al.)에 개시되어 있다. 이러한 Fc 영역 변이체는 하나 이상의 위치에 아미노산 치환을 포함한다: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 및 434. 증가된 반감기를 갖는 다른 Fc 영역 변이체는, 예컨대, US 7658921B2(Dall'Acqua et al.)에 기재된 위치 252, 254 및 256에 YTE 돌연변이의 세트(즉, M252Y/S254T/T256E)를 포함한다. 실시예 및 본 발명의 다른 곳에 개시된 바와 같이, 몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체는 YTE 돌연변이의 세트를 포함하는 Fc 영역 변이체이다. Fc 영역 변이체의 다른 예는, 예컨대, 미국 특허 제5,648,260호 및 제5,624,821호; 및 WO94/29351에서 발견할 수 있다.
본 명세서의 다른 곳에 언급된 바와 같이, 천연 유래 항체의 Fc 영역은 전형적으로 위치 447에 C-말단 라이신(Lys447)을 포함한다. 그러나, 이 C-말단 라이신은, 종종 효소적 절단으로 인해 세포 배양액 중 재조합 항체의 생산(예컨대, CHO 세포 내 생산) 동안 Fc 영역으로부터 절단된다. 따라서, C-말단 라이신을 가진 Fc 영역을 포함하는 것과 같은 본 명세서에 기재된 항-IL1RAP 항체 중 어느 것인가는 또한 C-말단 라이신이 없는 것을 제외하고 Fc 영역을 포함하는 동일한 항-IL1RAP 항체를 포함하는 것이 의도된다. 마찬가지로, C-말단 라이신이 없는 Fc 영역을 포함하는 본 명세서에 기재된 항-IL1RAP 항체 중 어느 것인가는 또한 C-말단 라이신을 갖는 것을 제외하고 Fc 영역을 포함하는 동일한 항-IL1RAP 항체를 포함하는 것이 의도된다.
일반적으로, 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정은 Fc 영역 변이체에서 CDC 및/또는 ADCC 활성도의 저감/고갈을 확인하기 위하여 수행될 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체(FcR) 결합 검정은 항체가 FcγR 결합을 결여하지만(따라서 마찬가지로 ADCC 활성도를 결여하지만) FcRn 결합 능력을 보유하는 것을 확실하게 하기 위하여 수행될 수 있다. ADCC를 매개하는 원발성 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 한편, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 관심 분자의 ADCC 활성도를 평가하는 시험관내 검정의 비제한적인 예는 미국 특허 제5,500,362호(예컨대, 문헌[Hellstrom, et al., Proc. Nat 'l Acad. Sci. USA, 83:7059-7063 (1986)] 참조) 및 문헌[Hellstrom, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 82: 1499-1502 (1985)]; 미국 특허 제5,821,337호(문헌[Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med., 166: 1351-1361 (1987)]참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사능 검정 방법이 이용될 수 있다(예를 들어, 유세포 분석을 위한 ACTI™ 비방사능 세포독성 검정(Cell기술, Inc. 캘리포니아주 마운틴뷰 소재; 및 CytoTox96® 비-방사능 세포독성 검정(Promega, 위스콘신주 매디슨 소재). 이러한 검정용의 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 부가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성도는, 생체내에서, 예컨대, 문헌[Clynes et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. Clq 결합 검정은 또한 항체가 Clq에 결합할 수 없으므로 CDC 활성도를 결여하는 것을 확인하기 위하여 수행될 수 있다. 예컨대, WO2006/029879 및 WO2005/100402에서의 Clq 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, CDC 검정이 수행될 수 있다(예컨대, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202: 163 (1997), Cragg, M.S. et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood, 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 청소율/반감기 결정은 당업계에 공지된 방법을 이용해서 수행될 수 있다(예컨대, 예컨대, 문헌[Petkova, et al., Intl. Immunol., 18(12): 1759-1769 (2006)] 참조).
본 개시내용의 항-IL1RAP 항체의 광범위한 Fc 영역 변이체는 당업계에 공지된 그리고/또는 본 명세서에 기재된 방법 및 기술을 이용해서 제조될 수 있는 것이 상정된다. 예를 들어, N297G 아미노산 치환으로 제조된 Fc 영역 변이체는 실시예 9에 기재된 바와 같이 세포-기반 차단 활성도의 유지로 항-IL1RAP 항체에 대한 무효과기 기능을 부여한다.
D. 시스테인 조작된 변이체
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 항-IL1RAP 항체는 반응성 티올기를 작성하도록 시스테인 잔기로 특정 비-CDR 위치에서 치환될 수 있는 것이 상정된다. 본 명세서의 다른 곳에서 기재된 바와 같이, 이러한 조작된 "티오MAb"는 항체를, 예컨대, 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시킴으로써 면역접합체를 생성하는데 사용될 수 있다. 시스테인 조작된 항체는, 예컨대, 미국 특허 제7,521,541호에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 이하의 항체 잔기 중 어느 하나 이상은 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205(카밧 넘버링); 중쇄의 A118(EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 넘버링).
E. 유도된 변이체
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체는 비-단백질성 모이어티로 더 변형(즉, 유도)될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 비-단백질성 모이어티는 수 가용성 중합체, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시-메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리-아미노산 단독-중합체 또는 랜덤 공-중합체, 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독-중합체, poly프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공-중합체, 폴리옥시-에틸화 폴리올(예컨대, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체의 변형은 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드를 이용해서 수행될 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 변화될 수 있고, 하나 초과의 중합체 부착된다면, 이들은 동일 또는 상이할 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 항체의 특정 특성 또는 기능, 예컨대, 항체 유도체가 정의된 조건 하에 요법에 이용되는지의 여부를 포함하는 고려사항에 기초하여 결정될 수 있다.
8. 면역접합체
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체는 또한 면역접합체일 수 있고, 여기서 면역접합체는 1종 이상의 세포독성제에 접합된 항-IL1RAP 항체를 포함한다. 본 개시내용에 의해 상정되는 적합한 세포독성제는 화학요법제, 약물, 성장 저해제, 독소(예컨대, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소 또는 이들의 단편) 또는 방사능 동위원소를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 면역접합체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-IL1RAP 항체가 1종 이상의 약물에 접합되는 항체-약물 접합체(ADC)이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 면역접합체는 IL-1, IL-33, IL-36 및/또는 IL1RAP-매개 질환 또는 병태의 치료용의 약물 또는 치료제에 접합된 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-IL1RAP 항체를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-IL1RAP 항체는 효소적으로 활성인 독소 또는 이의 단편에 접합될 수 있고, 이는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬(슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래), 리신(ricin) A 사슬, 아브린(abrin) A 사슬, 모데신(modeccin) A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질, 모모르디카 카란티아(Momordica charantia) 저해제, 쿠르신(curcin), 크로틴(crotin), 사파오나리아 오피시날리스(Sapaonaria officinalis) 저해제, 겔로닌(gelonin), 미토겔린(mitogellin), 레스트릭토신(restrictocin), 페노마이신, 에노마이신 및 트라이코테센(tricothecene)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 면역접합체는 방사능 동위원소에 접합된 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-IL1RAP 항체(즉, 방사성접합체)를 포함한다. 다양한 방사능 동위원소가 이러한 방사성접합체의 생산에 이용 가능하다. 그 예는 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 212Pb, 및 Lu의 방사능 동위원소를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 면역접합체는 신티그래픽(scintigraphic) 검출용의 방사성동위원소 또는 NMR 검출 또는 MRI용의 스핀 표지를 포함할 수 있다. 적합한 방사성동위원소 또는 스핀 표지는, 123I, 131I, 111In, 13C, 19F, 15N, 17O, Gd, Mn 및 Fe의 각종 동위원소로서 포함할 수 있다.
항-IL1RAP 항체와 세포독성제의 면역접합체는, 단백질에 접합하는데 적합한 다양한 잘 알려진 이작용성 시약 및 화학물질을 이용해서 제조될 수 있다. 이러한 시약은 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스터의 이작용성 유도체(예컨대, 다이메틸 아디피미데이트 HQ), 활성 에스터(예컨대, 다이석신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예컨대, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스-(p-아지도벤조일)-헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예컨대, 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소사이아네이트(예컨대, 톨루엔-2,6-다이아이소사이아네이트), 및 비스-활성 플루오린 화합물(예컨대, 1,5-다이플루오로-2,4-다이나이트로벤젠)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시내용의 면역접합체를 제조하기 위한 시약은 또한 상업적으로 입수 가능한 "가교결합" 시약, 예컨대, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC 및 설포-SMPB, 및 SVSB(석신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)(예컨대, Pierce Biotechnology, Inc.(미국 일리노이즈 록퍼드 소재) 참조)를 포함할 수 있다.
9. 합성 항체
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체는 면역글로불린 스캐폴드 또는 프레임워크 이외의 스캐폴드 또는 프레임워크, 예컨대, 대체 단백질 스캐폴드 또는 인공 중합체 스캐폴드 상에 이식된 항-IL1RAP 면역글로불린(예컨대, CDR-L1 등)으로부터 CDR의 세트를 포함하는 합성 항체일 수 있다.
본 개시내용의 합성 항체의 제조에 상정되는 예시적인 대안적인 단백질 스캐폴드는 피브로넥틴, 네오카르지노스타틴 CBM4-2, 리포칼린, T-세포 수용체, 단백질-A 도메인(단백질 Z), Im9, TPR 단백질, 아연 핑거(zinc finger) 도메인, pVIII, 조류 췌장 폴리펩타이드, GCN4, WW 도메인 Src 상동성 도메인 3, PDZ 도메인, TEM-1 베타-락타마제, 티오레톡신, 스타필로코커스 뉴클레아제, PHD-fmger 도메인, CL-2, BPTI, APPI, HPSTI, 에코틴, LACI-D1, LDTI, MTI-II, 전갈 독소, 곤충용 디펜신-A 펩타이드, EETI-II, Min-23, CBD, PBP, 사이토크롬 b-562, Ldl 수용체 도메인, 감마-크리스탈린, 유비퀴틴, 트랜스페린 및/또는 C-형 렉틴-유사 도메인을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
합성 항체에 유용한 예시적인 인공 중합체(비-단백질) 스캐폴드는, 예컨대, 문헌[Fiedler et al., (2014) "Non-Antibody Scaffolds as Alternative Therapeutic Agents," in Handbook of Therapeutic Antibodies (eds. S.
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and J. M. Reichert), Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.; Gebauer et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 13:245-255 (2009); Binz et al., Nat. Biotech., 23(10): 1257-1268 (2005)]에 기재되어 있다.
IV. 재조합 방법 및 조성물
본 개시내용의 항-IL1RAP 항체는 항체 생산의 당업계에 잘 알려진 재조합 방법 및 재료를 이용해서 생산될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 항-IL1RAP 항체를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. 핵산은 항체의 VL을 포함하는 및/또는 VH(예컨대, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 포함하는 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터(예컨대, 발현 벡터) 가 제공된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 색산을 포함하는 벡터로 형질전환되었다. 또 다른 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 벡터로 형질전환되었다.
재조합 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 사용된 숙주 세포는 진핵생물 세포, 예컨대, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프모양 세포(예컨대, Y0, NS0, Sp20)이다. 일 실시형태에 있어서, 항-IL1RAP 항체를 제조하는 방법이 제공되되, 해당 방법은, 항체의 발현에 적합한 조건 하에, 위에서 제공된 바와 같은 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 선택적으로 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
간단히 말하면, 항-IL1RAP 항체의 재조합 생산은 (예컨대, 본 명세서에 기재된 바와 같은) 항체를 암호화하는 핵산을 단리시키고 숙주 세포에서 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위하여 이 핵산을 하나 이상의 벡터에 삽입함으로써 수행된다. 이러한 핵산은 용이하게 단리되고 (목적하는 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 당업계에 잘 알려진 통상의 절차를 이용해서 서열 결정된다. 적합한 숙주 세포 및 항체-암호화 벡터를 클로닝 또는 발현하는 배양 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 포함한다. 전형적으로, 발현 후에, 항체는 가용성 분획에서 세포 페이스트로부터 단리되고 추가로 정제될 수 있다. 원핵생물 이외에, 진핵 미생물, 예컨대, 사상 진균 또는 효모는, 그의 글리코실화 경로가 "인간화"되어 부분 또는 완전 인간 글리코실화 패턴을 가진 항체의 생산을 초래하는 진균 및 효모 균주를 비롯하여, 항체-암호화 벡터용의 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다(예컨대, 문헌[Gerngross, Nat. Biotech., 22: 1409-1414 (2004), 및 Li et al., Nat. Biotech., 24:210-215 (2006)] 참조).
본 개시내용의 글리코실화된 항-IL1RAP 항체의 발현용의 적합한 숙주 세포는 또한 다중세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래될 수 있다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는, 특히 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위하여 많은 바큘로바이러스 균주가 특히 식별되어 있었다. 식물 세포 배양액이 또한 숙주로서 사용될 수 있다(예컨대, 미국 특허 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호 및 제7,125,978호 참조).
본 개시내용의 항-IL1RAP 항체의 생산에 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예컨대, DHFR-CHO 세포(예컨대, 문헌[Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)] 참조); 골수종 세포주, 예컨대, Y0, NS0 및 Sp2/0; SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CVl 세포주(COS-7); 인간 배아 신장 세포(예컨대, 문헌[Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(예컨대, 문헌[Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CVl); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK; 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유선 종양(MMT 060562); TRI 세포(예컨대, 문헌[Mather et al., Annals N Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)] 참조); MRC 5 세포; 및 FS4 세포를 포함한다. 항체 생산에 적합한 유용한 포유류 숙주 세포주의 일반적인 검토를 위해서는, 예컨대, 문헌[Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248(B.K.C. Lo, ed., Antibody Engineering, Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다.
V. 항-IL1RAP 항체의 약제학적 조성물 및 제형
본 개시내용은 또한 항-IL1RAP 항체를 포함하는 약제학적 조성물 및 약제학적 제형을 제공한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-IL1RAP 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 제형을 제공한다. 이러한 약제학적 제형은 목적하는 수도를 갖는 항-IL1RAP 항체를 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 전형적으로, 이러한 항체 제형은 수용액으로서(예컨대, 미국 특허 제6,171,586호 및 WO2006/044908 참조) 또는 동결건조 제형으로서(예컨대, 미국 특허 제6,267,958호 참조) 제조될 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 항-IL1RAP 항체를 포함하는 조성물 및 제형은, 제형이 투여되는 대상체에서 치료 중인 특정 적응증에 유용한, 항-IL1RAP에 부가해서, 다른 활성 성분(즉, 치료제)을 더 함유할 수 있는 것이 또한 상정된다. 바람직하게는, 임의의 추가의 치료제는 항-IL1RAP 항체 활성도의 것과 상보성인 활성도를 갖고 그 활성도는 서로 악영향을 미치지 않는다. 따라서, 몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-IL1RAP 항체, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하고, IL-1, IL-33, IL-36 및/또는 IL1RAP-매개 질환 또는 병태의 치료에 유용한 치료제를 더 포함한다. 예를 들어 질환 적응징이 암인 몇몇 실시형태에 있어서, 치료제는 특정 암에 적합한 화학요법제이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 조성물 중 추가의 치료제는 IL-1, IL-33, IL-36 신호전달 경로의 길항제이다.
약제학적으로 허용 가능한 담체는 일반적으로 이용되는 투여량 및 농도로 수령체에게 비독성이다. 광범위한 이러한 약제학적으로 허용 가능한 담체는 당업계에 잘 알려져 있다(예컨대, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)] 참조). 본 개시내용의 제형에 유용한 예시적인 약제학적으로 허용 가능한 담체는 완충액, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산; 항산화제, 예컨대, 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예컨대, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 염화벤잘코늄; 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 기타 탄수화물, 예컨대, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예컨대, EDTA; 당, 예컨대, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대, 나트륨; 금속 복합체(예컨대, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-비온성 계면활성제, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시내용의 제형에 유용한 약제학적으로 허용 가능한 담체는 또한 침입형 약물 분산제, 예컨대, 가용성 중성-활성 하이알루로니다제 당단백질(sHASEGP)를 포함할 수 있다(예컨대, 미국 특허 공개 제2005/0260186호 및 제2006/0104968호 참조), 예컨대, 인간 가용성 PH-20 하이알루로니다제 당단백질(예컨대, rHuPH20 또는 HYLENEX®, Baxter International, Inc.).
추가의 치료제 및 활성 성분은, 예를 들어, 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 각각, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀션, 나노-입자 및 나노캡슐)에 또는 매크로에멀션에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 제형은 항체 및/또는 기타 활성 성분의 서방출 제제일 수 있다. 서방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 반투성 기질을 포함하고, 해당 기질은 정형화된 물품의 형태, 예컨대, 필름 또는 마이크로캡슐이다.
전형적으로, 대상체에게 투여될 본 개시내용의 제형은 멸균성이다. 멸균 제형은 잘 알려진 기술을 이용해서, 예컨대, 통한 여과에 의해 용이하게 제조될 수 있다.
IV. 용도 및 치료 방법
본 개시내용의 항-IL1RAP 항체를 포함하는 조성물 또는 제형의 어느 것인가가 IL1RAP에 특이적으로 결합하고/하거나 IL1RAP의 활성도를 차단하는 능력을 이용하는 치료적 방법에서와 같이 임의의 방법 또는 용도를 위하여 사용될 수 있고 특히 IL-1 패밀리 사이토카인, IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ에 의한 세포내 신호전달을 매개하는 IL1RAP의 능력을 차단하는 것이 상정된다. IL1RAP에 의해 매개된 세포내 신호전달 경로는 IL-1, IL-33 및 IL-36 경로를 포함하고, 더욱 구체적으로, 적어도 사이토카인 작용제인 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ에 의해 자극된 신호전달 경로를 포함한다. IL1RAP-매개 신호전달 경로의 저해는 본 개시내용의 실시예에 기재된 HEK-BLUETM 리포터 세포 검정 및 원발성 세포-기반 차단 검정을 포함하는 공지된 세포-기반 차단 검정을 이용해서 시험관내에서 검정될 수 있다.
IL1RAP 매개 질환은 사이토카인의 IL-1 패밀리의 체액 또는 조직에서의 상승된 수준과 연관된 임의의 질환 또는 병태를 포함할 수 있고, 이에 대해서 IL1RAP는 신호전달을 매개함에 있어서의 공동-수용체: IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ로서 작용한다. IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ의 상승된 수준은, 예를 들어, 특정 세포 또는 조직에서 통상 발견되는 것을 초과하는 수준을 포함할 수 있거나 또는 이들 사이토카인을 통상 발현하지 않는 세포 또는 조직에서 임의의 검출 가능한 수준일 수 있다. 전형적으로, IL1RAP 매개 병태 또는 질환은 다음의 특성을 나타낸다: (1) 병태 또는 질환과 연관된 병리는 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ의 투여에 의해, 그리고/또는 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ의 발현의 상승 조절에 의해 동물에서 실험적으로 유도될 수 있고; 그리고 (2) 실험 동물 모델에서 발생되는 병태 또는 질환과 연관된 병리는 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ의 작용이 공지된 저해 작용제에 의해 저해될 수 있다.
IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ는 전염증성 사이토카인인 것으로 공지되었지만, 공동-수용체로서의 IL1RAP에 의해 매개된 바와 같은 이들 사이토카인에 의해 자극된 IL-1, IL-33 및/또는 IL-36 신호전달 경로의 비정상 기능은 일반적으로 염증성 질환, 자가면역 질환, 호흡기 질환, 대사 장애, 감염 및 암을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 광범위한 질환 및 병태와 연관되는 것으로 알려져 있다.
예를 들어, IL-33 신호전달의 비정상 기능과 연관되고 따라서 또한 IL1RAP의 공동-수용체 활성도에 의해 매개된 광범위한 병태 및 질환은 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 매개된 장애는 염증성 병태(예컨대, 천식, 기도 과민증, 기도 염증, 패혈증, 패혈증, 아토피 피부염, 알레르기성 비염, 류마티스 관절염 또는 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)); 면역 장애(예컨대, 천식, 류마티스 관절염, 알레르기, 아토피 알레르기, 아나팔락시스, 아나팔락시스 쇼크, 알레르기성 비염, 건선, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 당뇨병 또는 간 질환); 섬유증 장애(예컨대, 특발성 폐섬유증(IPF)); 호산구성 장애(예컨대, 호산구-연관 위장관 장애, 예컨대, 호산성 식도염); 감염(예컨대, 기생충, 원충, 예컨대, 레슈마니아 주된 또는 바이러스 감염, 예컨대, RSV 또는 인플루엔자); 통증(예컨대, 염증성 통증); 중추신경 전신 장애(예컨대, 알츠하이머병); 고형 종양(예컨대, 유방 종양, 결장 종양, 전립선 종양, 폐 종양, 신장 종양, 간 종양, 췌장 종양, 위 종양, 위장 종양, 뇌 종양, 골 종양 또는 피부 종양); 또는 안과 장애일 수 있다. IL-33에 의해 매개된 구체적인 안과 장애는 연령 관련 황반 변성(AMD), 예컨대, 습성 AMD, 건성 AMD, 중간 AMD, 진행성 AMD, 및 지도모양위축(geographic atrophy: GA)), 망막병증(예컨대, 당뇨성 망막병증(DR), 미숙아 망막증(ROP), 및 고도 DR), 결절성 맥락막 혈관병증(PCV), 당뇨성 황반부종, 안구 건조증, 베체트병, 망막 박리, 녹내장, 포도막염(예컨대, 감염성 및 비감염성 포도막염), 망막색소변성증, 레버 선천성 흑내장, 스타르가르트병, 외상성 눈 부상, 및 결막염(예컨대, 감염성 결막염, 비감염성 결막염 및 알레르기 결막염)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
마찬가지로, IL-1의 비정상 기능과 연관되고, 따라서 또한 IL1RAP의 공동-수용체 활성도에 의해 매개된 광범위한 병태 및 질환은 급성 췌장염; 근위축성 축삭경화증(ALS); 알츠하이머병; 악액질/식욕부진, 예컨대, AIDS-유도 악액질; 천식 및 기타 폐 질환; 죽상동맥경화증; 자가면역 혈관염; 만성 피로 증후군; 클로스트리듐 연관 질병, 예컨대, 클로스트리듐-연관 설사; 관상동맥 병태 및 적응증, 예컨대, 울혈성 심부전, 관상동맥 재협착증, 심근경색, 심근 기능 장애(예컨대, 패혈증과 관련됨), 및 관상동맥 우회로 이식술; 암, 예컨대, 다중 골수종 및 골수성(예컨대, AML 또는 CML) 및 기타 백혈병뿐만 아니라, 종양 전이; 당뇨병(예컨대, 인슐린-의존적 당뇨병); 자궁내막증; 열, 섬유근육통; 사구체신염; 이식편대숙주질환/이식 거부증; 출혈성 쇼크; 통각과민증; 염증성 장 질환; 관절의 염증성 병태, 예컨대, 골관절염, 건선성 관절염 및 류마티스 관절염; 예컨대, 각막 이식과 연관될 수 있는 염증성 안 질환; 허혈, 예컨대, 대뇌 허혈증(예컨대, 외상, 간질, 출혈 또는 뇌졸중의 결과로서의 뇌 손상, 이들 각각은 신경퇴행으로 연결될 수 있음); 가와사키병; 학습 장애; 폐 질환(예컨대, ARDS); 다발성 경화증; 근병증(예컨대, 특히 패혈증에서의 근육 단백질 대사); (예컨대, HIV에 의해 유도된 바와 같은) 신경독성; 골다공증; 통증, 예컨대, 암-관련 통증; 파킨슨병; 치주질환; 조기산통; 건선; 재관류 손상; 패혈증; 방사선 요법으로부터의 부작용; 악관절 질환; 수면장애; 포도막염; 또는 좌상, 염좌, 연골 손상, 외상, 정형외과적 수술, 감염 또는 기타 질환 과정에 기인하는 염증성 병태를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
IL-1, IL-33 및/또는 IL-36 신호전달 경로의 길항제 또는 저해제로서 작용하는 제제는 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 일정 범위의 질환 및 병태의 치료를 위하여 임상 개발 중에 있다: 여드름, 급성 중증 궤양성 결장염, 성인발병 스틸병, 알레르기성 비염, 관절염(통풍성, 연소성, 골 및 류마티스성 포함), 관절염 통증, 천식, 죽상동맥경화증, 아토피 습진, 베체트병, 악액질, 암(유방, 결장직장, 비-소세포 폐 및 췌장 포함), 만성 폐쇄성 폐질환, 안구 건조 증후군, 가족성 한랭 자가염증 증후군, 가족성 지중해열, 식품 알레르기, 범발성 농포성 건선, 화농성 한선염, 과-IgD 증후군, 고요산혈증, 머클-웰스 증후군, 신생아 시작 다발계 염증성 질환, 근골격 통증, 수장족 저농포증, 말초혈관병, 류마티스성 다발근통, 비용종, 건선, 괴저성 농피증, 재협착증, 겸상적혈구빈혈증, 부비강염, TNF 수용체 연관 주기성 증후군, 제2형 당뇨병, 및 궤양성 결장염.
본 개시내용의 항-IL1RAP 항체를 포함하는 조성물 또는 제형 중 어느 것인가가 IL-1, IL-33 및/또는 IL-36 신호전달 경로의 비정상 기능과 연관된, 따라서 IL1RAP의 공동-수용체 활성도에 의해 매개된 위에서 나열된 질환 또는 병태 중 어느 것인가를 치료하기 위한 방법 또는 이러한 치료를 위한 용도에 사용될 수 있는 것이 상정된다. 일반적으로, 이들 병태 및 질환은 염증성 질환, 자가면역 질환, 호흡기 질환, 대사 장애, 감염 및 암을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
따라서 몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체를 포함하는 조성물 또는 제형은, 여드름, 급성 췌장염, 급성 중증 궤양성 결장염, 성인발병 스틸병, 연령 관련 황반 변성(AMD), 기도 과민증, 기도 염증, 알레르기 결막염, 알레르기성 비염, 알레르기, 알츠하이머병, 근위축성 축삭경화증(ALS), 아나팔락시스, 관절염 통증, 천식, 죽상동맥경화증, 아토피 피부염, 아토피 습진, 자가면역 혈관염, 베체트병, 골암, 뇌암, 유방암, 악액질/식욕부진, 연골 손상, 대뇌 허혈증, 만성 피로 증후군, 만성 폐쇄성 폐질환, 클로스트리듐 연관 질병, 결장암, 울혈성 심부전, 결막염, 관상동맥 우회로 이식술, 관상동맥 재협착증, 크론병, 당뇨병, 당뇨성 황반부종, 당뇨성 망막병증, 안구 건조증, 자궁내막증, 호산구-연관 위장관 장애, 호산성 식도염, 가족성 한랭 자가염증 증후군, 가족성 지중해열, 열, 섬유근육통, 섬유증 장애, 식품 알레르기, 범발성 농포성 건선, 녹내장, 사구체신염, 통풍 관절염, 이식편대숙주질환, 기생충 감염, 출혈성 쇼크, 화농성 한선염, 통각과민증, 과-IgD 증후군, 고요산혈증, 특발성 폐섬유증(IPF), 암-관련 통증, 감염, 염증성 장 질환(IBD), 좌상에 기인한 염증성 병태, 각막 이식과 연관된 염증성 안질환, 염증성 통증, 인플루엔자, 장암, 허혈, 연소성 관절염, 가와사키병, 신장암, 레버 선천성 흑내장, 간암, 간 질환, 폐암, 머클-웰스 증후군, 다중 골수종, 다발성 경화증, 근골격 통증, 골수성 및 기타 백혈병, 심근 기능 장애, 근병증, 비용종, 신생아 시작 다발계 염증성 질환, 신경독성, 비감염성 결막염, 비소세포 폐암, 정형외과적 수술, 골관절염, 골다공증, 통증, 수장족 저농포증, 췌장암, 파킨슨병, 치주질환, 말초혈관병, 류마티스성 다발근통, 결절성 맥락막 혈관병증(PCV), 조기산통, 전립선암, 원충 감염, 건선, 건선성 관절염, 괴저성 농피증, 재관류 손상, 호흡기세포융합바이러스(RSV), 재협착증, 망막 박리, 망막색소변성증, 미숙아 망막증(ROP), 류마티스 관절염, 패혈증, 겸상적혈구빈혈증, 방사선 요법으로부터의 부작용, 부비강염, 피부암, 수면장애, 염좌, 스타르가르트병, 위암, 악관절 질환, TNF 수용체 연관 주기성 증후군, 이식 거부증, 외상, 외상성 눈 부상, 제2형 당뇨병, 궤양성 결장염 및 포도막염으로부터 선택된 병태 또는 질환의 치료에서 사용하기 위한 방법, 요법, 의약, 진단 또는 용도에 사용될 수 있다.
이하의 실시예를 포함하여 본 명세서에 개시된 바와 같이, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체는 IL-1, IL-33 및 IL-36 신호전달 경로를 비롯하여 IL1RAP에 의해 매개된 세포내 신호전달을 감소, 저해 및/또는 차단하는 능력을 갖는다. 따라서, 몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 대상체에서 IL1RAP-매개 질환 또는 병태를 치료하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 대상체에게 치료적 유효량의 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체를 투여하거나 또는 이를 필요로 하는 대상체에게 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 치료적 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서의 다른 곳에서 개시된 바와 같이, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체는 IL-1, IL-33 및 IL-36 신호전달 경로를 감소, 저해 및/또는 차단하는 능력을 갖는다. 따라서, 본 개시내용은 또한 IL-1, IL-33 및/또는 IL-36 신호전달 경로의 감소, 저해 및/또는 차단에 반응성인 질환 및 병태를 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체는 작용제인 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ에 의해 자극된 세포내 신호전달을 감소, 저해 및/또는 저해하는 능력을 갖는다. 따라서, 본 개시내용은 또한 작용제인 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ에 의해 자극된 세포내 신호전달의 감소, 저해 및/또는 차단에 반응성인 질환 및 병태를 치료하는 방법을 제공한다.
또한 IL1RAP-매개 경로인 IL-1 신호전달 경로는, 많은 형태의 암과 연관되어 있었다. 따라서, 몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체를 투여하거나 또는 대상체에게 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 치료적 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
또한 IL1RAP-매개 경로인 IL-1, IL-33 및/또는 IL-36 신호전달 경로의 3개 모두는, 천식과 연관되어 있었다. 따라서, 몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 대상체에서 천식을 치료하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체를 투여하거나 또는 대상체에게 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 치료적 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 IL1RAP-매개 질환, IL-1, IL-33 및 IL-36 신호전달 경로 매개 질환, 및/또는 작용제인 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ에 의해 자극된 세포내 신호전달에 의해 매개된 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법을 포함한다. 치료 실시형태의 이러한 방법에 있어서, 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-IL1RAP 항체 또는 항-IL1RAP 항체를 포함하는 조성물 또는 약제학적 제형을 투여하는 단계를 포함한다.
치료 방법에 따라서 항체, 조성물 또는 약제학적 제형의 투여는 대상체를 IL1RAP-매개 질환으로부터 예방하고/하거나 대상체에서 이러한 질환의 진행을 치료하는 항체-유도 치료 효과를 제공한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 치료 방법은 IL1RAP-매개 질환 또는 병태를 예방 및/또는 치료하기 위하여 당업자에 공지된 1종 이상의 추가의 치료제 또는 치료의 투여를 더 포함할 수 있다. 1종 이상의 추가의 제제의 투여를 포함하는 이러한 방법은 조합 투여(여기서 2종 이상의 치료제가 동일 또는 별도의 제형에 포함됨), 및 별도 투여를 포함할 수 있으며, 이 경우, 항체 조성물 또는 제형의 투여는 추가의 치료제의 투여 전에, 동시에 및/또는 후에 일어날 수 있다.
본 개시내용의 치료 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 항-IL1RAP 항체를 포함하는 항-IL1RAP 항체 또는 약제학적 제형은 전신에 또는 목적하는 표적 조직에 제제를 전달하는 임의의 투여 방식에 의해 대상체에게 투여된다. 전신 투여는 일반적으로 목적하는 표적 부위, 조직 또는 기관으로의 직접 이외의 부위에서 대상체에게 항체의 임의의 투여 방식을 지칭하므로, 이의 항체 또는 제형은 대상체의 순환계에 들어가고, 따라서 대사 및 기타 유사한 과정이 적용된다.
따라서, 본 개시내용의 치료 방법에 유용한 투여 방식은 주사 주입, 흡입을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 주사에 의한 투여는 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 심실내, 캡슐내, 안와내, 심장내, 피부내, 복강내, 경기관, 피하, 피부밑, 관절내, 피막하, 지주막하, 척추내, 뇌척수내(intracerebro spinal) 및 흉골내 주사 및 주입을 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항-IL1RAP 항체의 약제학적 제형은 항체가 장 내 불활성화로부터 보호되도록 제형화된다. 따라서, 치료 방법은 제형의 경구 투여를 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체를 액제로서 포함하는 조성물 또는 제형의 용도가 또한 제공된다. 부가적으로, 몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 또한 약제, 특히 IL1RAP-매개 질환을 치료, 예방 또는 저해하기 위한 약제의 제조 또는 제작에서의 항-IL1RAP 항체를 포함하는 조성물 또는 제형의 용도를 제공한다. 추가의 실시형태에 있어서, 약제는, IL1RAP-매개 질환을 갖는 개체에게 유효량의 약제를 투여하는 것을 포함하는, IL1RAP-매개 질환을 치료, 예방 또는 저해하기 위한 방법에서 사용하기 위한 것이다. 소정의 실시형태에 있어서, 약제는 유효량의 적어도 1종의 추가의 치료제 또는 치료를 더 포함한다.
추가의 실시형태에 있어서, 약제는 IL1RAP-매개 질환을 치료, 저해 또는 예방하기 위하여 약제의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 IL1RAP-매개 질환을 치료, 저해 또는 예방하는데 사용하기 위한 것이다.
IL1RAP-매개 질환 또는 병태의 예방 또는 치료를 위하여, 본 개시내용의 조성물 및 제형에 함유된 항-IL1RAP 항체의 적절한 투여량(단독으로 또는 1종 이상의 다른 추가의 치료제와 조합하여 사용되는 경우)은 치료중인 특정 질환 또는 병태, 질환의 중증도 및 과정, 항체가 예방 또는 치료 목적을 위하여 투여되는지의 여부, 환자에게 투여된 이전의 요법, 환자의 임상 이력 및 항체에 대한 반응, 및 담당 의사의 재량에 좌우될 것이다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 제형에 포함된 항-IL1RAP 항체는, 1번에 또는 일련의 치료에 걸쳐서 환자에게 적합하게 투여될 수 있다. 각종 시점에 걸쳐서 단일 또는 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 각종 투약 스케줄이 본 명세서에서 고려된다.
질환의 유형 및 중증도에 따라서, 본 개시내용의 제형 중 약 1㎍/㎏ 내지 15 ㎎/㎏의 항-IL1RAP 항체가, 예를 들어, 1회 이상의 개별 투여에 의해서건 또는 연속 주입에 의해서건 간에 인간 대상체에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 일반적으로, 항체의 투여 용량은 약 0.05 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 범위일 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 약 0.5 ㎎/㎏, 2.0 ㎎/㎏, 4.0 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏(또는 이들의 임의의 조합)의 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다.
투여량 투여는 대상체의 조건에 따라서 수일 이상에 걸쳐서 유지될 수 있고, 예를 들어, 투여는, 당업계에 공지된 방법에 의해 결정되는 바와 같이, IL1RAP-매개 질환이 충분히 치료될 때까지 계속될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 초기의 더 높은 로딩 용량이 투여되고 나서, 하나 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 용량 요법이 유용할 수 있다. 투여량 투여의 치료 효과의 진행은 통상의 기술 및 검정에 의해 모니터링될 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 항-IL1RAP 항체의 투여는 약 1 ㎎/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏의 1일 투여량을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항-IL1RAP 항체의 투여량은 적어도 약 1 ㎎/㎏, 적어도 약 5 ㎎/㎏, 적어도 약 10 ㎎/㎏, 적어도 약 20 ㎎/㎏ 또는 적어도 약 30 ㎎/㎏의 1일 투여량을 포함한다.
또한, 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체는 IL1RAP의 검출을 위하여 검정 방법에서 사용될 수 있다. 인간 IL1RAP에 고 친화도로 결합하는 능력으로 인해, 본 명세서에 개시된 항-IL1RAP 항체는 광범위한 검정 방법 및 포맷에 적절하다. 항-IL1RAP 항체가 IL1RAP의 검출 및 정량화를 위하여 임의의 공지된 검정 방법, 예컨대, 경쟁적 결합 검정, 직접 및 간접 샌드위치 검정, 면역침강 검정 및 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)에 사용될 수 있는 것이 상정된다(문헌[Sola, 1987, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158, CRC Press, Inc.] 참조). 따라서, 몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 생물학적 샘플에서 IL1RAP의 수준을 검출하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 샘플을 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-IL1RAP 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 또한, 몇몇 실시형태에 있어서, 생물학적 샘플 내 IL1RAP의 수준을 검출하는 방법이, 예컨대, 인간 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 IL1RAP-매개 병태 또는 질환을 검출 및/또는 진단하는데 사용될 수 있는 것이 상정된다.
실시예
본 개시내용의 각종 특징 및 실시형태는 제한이 아닌 예시적인 것으로 의도된 이하의 대표적인 실시예에 예시된다. 당업자라면 특정 실시예가 이후의 청구범위에서 보다 완전히 기재된 바와 같이 본 발명을 단지 예시할 뿐임을 용이하게 이해할 것이다. 본 출원에 설명된 모든 실시형태 및 특징은 그 안에 포함된 모든 실시형태와 호환 가능하고 조합 가능한 것으로 이해되어야 한다.
실시예 1: IL1RAP 폴리펩타이드의 생성
본 실시예는 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체를 유발하고 선별함에 있어서 항원으로서 사용되는 각종 IL1RAP 폴리펩타이드 작제물의 제조를 예시한다.
hu-IL1RAP의 세포외 도메인은 문헌[Wang et al., Nat. Immunol., 11:905-912 (2010)]에서의 구조 정보에 기초하여 전장 및 개별적인 도멘인(즉, D1, D2, D3)으로서 재조합적으로 정제되었다. 발현 작제물의 아미노산 서열 경계는 위에서 표 1 및 첨부 서열 목록에 제공되어 있다. 재조합 IL1RAP 폴리펩타이드 작제물의 전부는 정제 및 검출 목적을 위하여 다음의 "GGGS-V5-6XHis" C-말단 태그를 가졌다: GGGSGKPIPNPLLGLDSTHHHHHH(서열번호 319). 개별 도메인(예컨대, D1, D1D2, D3)의 작제물은 정제 및 검출 목적을 위하여 다음의 "GGGS-V5-Avi-6XHis" C-말단 태그(또한 "Avi" 태그를 포함함)를 가졌다: GGGSGKPIPNPLLGLDSTGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(서열번호 320).
IL1RAP 작제물 단백질은 제조사의 프로토콜에 따라서 Expi293F 세포(Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬 소재)에서 발현되었다. 세포를 5일 후에 수거하고, 정화된 상청액을 20mM 이미다졸 pH 7.5로 보충하고 20mM Tris-HCl, 150mM NaCl(TBS), 20mM 이미다졸 pH 7.5에 평형화한 HisTrap FF 미정제 칼럼(GE Healthcare, 미국 일리노이주 시카고 소재)에 적용하였다. 단백질을 100% TBS, 500mM 이미다졸 pH 7.5로 20 CV 구배로 용리시켰다. 단백질을 함유하는 용리 분획을 혼주시키고 단백질의 분자량에 따라서 Superdex 75 또는 Superdex 200 인크리즈 칼럼(increase 칼럼)(GE Healthcare, 미국 일리노이주 시카고 소재)에 로딩하였다. 단량체성 단백질을 함유하는 피크 분획을 혼주시키고 1X PBS, pH 7.5 또는 25mM HEPES, 150mM NaCl (HBS), pH 8.0에 보관하였다.
실시예 2: 하이브리도마 방법을 이용하는 항-인간 IL1RAP 항체이 생성, 추가의 특성규명을 위한 선별 및 선택
본 실시예는 항-hu-IL1RAP 항체를 생성하기 위하여 마우스 하이브리도마 기술을 이용하는 방법, 및 추가의 특성규명을 위하여 항체를 선별하고 선택하는 방법을 예시한다.
면역화 및 융합: Balb/c, 스위스 웹스터 및 SJ/L 마우스를 50 ㎍/마우스를 이용해서 hu-IL1RAP의 막 형태의 세포외 도메인을 포함하는 서열번호 3의 hu-M-IL1RAP 폴리펩타이드 작제물(표 1 참조)로 면역화시켰다. 초기 면역화 후, 다음의 3가지 상이한 IL1RAP 면역원의 추가의 부스트 면역화를 마우스에서 항-IL1RAP 항체의 적합한 역가를 유도하는데 필요한 지속기간 동안 스케줄에 따라 투여하였다: 25 ㎍/마우스의 서열번호 3의 폴리펩타이드(hu-M-IL1RAP), 25 ㎍/마우스의 서열번호 9의 폴리펩타이드(mo-M-IL1RAP) 또는 25 ㎍/마우스의 서열번호 6의 폴리펩타이드(hu-M-IL1RAP-D3). 애주번트 Magic 마우스(Creative Diagnostics, 뉴욕주 셜리 소재)를 모든 면역화에 사용하였다. 역가는 이하에 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 결정하였다. 이들의 역가에 기초하여 선택된 마우스에 애주번트 없이 최종의 융합전 부스트를 부여하였다. 1일 후에, 비장을 수확하고, 표준 프로토콜에 따라 처리하였다. 비장세를 PEG를 이용해서 그리고 표준 프로토콜에 따라 골수종 P3X63Ag8.653 세포(American Type 배양액 Collection CRL 1580)에 융합시키고 얻어지는 콜로니의 클론형성능을 최대하기 위하여 표준 기술을 이용해서 대략 50,000 골수종 세포/웰에서 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 친계 하이브리도마는 AH(아자세린 + 하이포잔틴)가 보충된 선택 배지를 이용해서 선택하였다.
ELISA 검정: 배양 12 내지 14일 후, 하이브리도마 상청액을 수집하고, 서열번호 3의 hu-M-IL1RAP 세포외 도메인으로 코팅된 96 웰 플레이트로 ELISA에 의한 1차 선별에 적용하였다. ELISA 검정은 일반적으로 문헌[Baker et al., Trends Biotechnol., 20:149-156 (2002)]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간단히 말하면, 96-웰 MAXISORP® 평탄한 바닥 플레이트(Thermo Fisher Scientific, 매사추세츠주 월섬 소재; 카탈로그 번호 439454)를 코팅 완충액(0.05M 카보네이트 완충액, pH 9.6 또는 인산염 완충식염수, PBS) 중에 1 ㎍/㎖의 농도의 단백질의 50㎕/웰로 4℃에서 하룻밤 코팅하였다. 코팅 용액을 제거한 후, 인산염 완충식염수(PBS) pH 7.4(ELISA 희석제) 중 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 200㎕의 검정/차단 용액을 첨가하고 교반과 함께 실온에서 1시간 동안 또는 교반 없이 4℃에서 하룻밤 인큐베이션함으로써 비특이적 결합을 차단하였다. 이어서, 플레이트를 300㎕의 PBS, 0.05% TWEEN®-20(세척 완충액)으로 3회 세척하였다. 개별적인 하이브리도마 클론(또는 표시된 농도에서의 정제된 항체)으로부터의 100㎕의 배양 상청액을 개별적인 웰에 첨가하고 나서 실온에서 1시간 동안 교반하면서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하고, 이어서, ELISA 희석제 중 1:3,000 희석으로 서양고추냉이 과산화효소에 접합된 50㎕/웰의 염소 항-마우스 IgG Fc(Bethyl Laboratories, 미국 텍사스주 몽고메리 소재; 카탈로그 번호 A90-131P) 또는 1:10,000 희석으로 서양고추냉이 과산화효소에 접합된 염소 항-마우스 IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch, Inc., 미국 펜실베니아주 웨스트그로브 소재; 카탈로그 번호 109-035-088)를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 교반하면서 인큐베이션하고, 세척 완충액으로 6회 세척하고, 50㎕/웰의 테트라메틸벤지딘(TMB) 마이크로웰 과산화효소 기질(Scytek Laboratories, Inc., 미국 유타주 로건 소재; 카탈로그 번호 TM1999)을 첨가함으로써 3 내지 10분 동안 발색시켰다. 50㎕/웰의 2N H2SO4(Sigma-Aldrich Corporation, 미국 미주리주 세인트루이스 소재; 카탈로그 번호 258105)로 산성화시킴으로써 효소적 발색을 중지시켰다. 플레이트는 450㎚의 파장에서 SpectraMax i3X 플레이트 판독기(Molecular Devices LLC, 미국 캘리포니아주 산호세 소재)로 분석하였다.
이 1차 ELISA 검정 선별은 서열번호 3의 hu-M-IL1RAP 폴리펩타이드와 서열번호 6의 hu-M-IL1RAP-D3 폴리펩타이드로 면역화시킨 3마리의 스위스 웹스터 마우스에 의해 생성된 하이브리도마로부터 총 470종의 항-인간 IL1RAP 결합제를 선별하였다. 이들 470종의 친계 하이브리도마는 w24-웰 플레이트로 확장시키고, 확증적 ELISA 선별을 위에서 기재된 바와 같이 수행하여 315개의 확인된 hu-IL1RAP 결합제를 얻었다.
하이브리도마의 HEK-Blue 세포-기반 차단 검정, 서브클로닝을 위한 선별 및 정제
hu-M-IL1RAP 결합에 대해 양성으로 확인된 315종의 하이브리도마는 이하에 기재된 HEK-Blue 세포-기반 차단 검정을 이용해서 IL-1 매개 IL1R1/IL1RAP 및 IL-33 매개 ST2/IL1RAP 신호전달 경로를 저해하는 능력에 대해서 더욱 특성규명하였다.
HEK Blue 세포주: 본 실시예 및 하기 실시예에 기재된 HEK-Blue 세포주는, HEK-293 세포주(인간 배아 신장 상피 세포)를 원래의 친계 계통으로서 사용한다. IL-1α, IL-1β 및 IL-33에 의한 자극에 반응하는 HEK-Blue IL-1/IL-33 센서 세포는 InvivoGen(InvivoGen, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재; 카탈로그 번호 hkb-il33)로부터 얻었다. 이들 IL-1/IL-33 센서 세포는 IL-33 수용체 ST2를 발현하는 인간 ST2 유전자로 HEK-Blue IL-1β 센서 세포(InvivoGen; 카탈로그 번호 hkb-il1b)의 안정적인 형질감염에 의해 생성되었다. HEK-Blue IL-1β 세포는 NF-κB/AP-1 SEAP(분비된 배아 알칼리성 포스파타제) 리포터 유전자를 발현하고 비활성화된 TNF-α 반응을 포함하고 SEAP 생산이 IL-1 또는 IL-33 경로 활성화를 대표하는 지를 확인한다. HEK-Blue IL-1/IL-33 반응성 세포는 제조사의 지침에 따라서 유지하였다. 간단히 말하면, 세포는 10% 소태아 혈청(FBS)(Atlanta Biologicals, Inc., 미국 조지아주 플라워리 브랜치 소재)이 보충된 DMEM(Corning, Inc., 미국 뉴욕 코닝 소재), 100 IU/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신으로 이루어진 표준 성장 배지에 유지되었다. 성장 배지는 SEAP를 암호화하기 위한 플라스미드를 유지하는 100 ㎍/㎖ 제오신, IL-1 특이성을 유지하는 200 ㎍/㎖ 하이그로마이신 B 및 ST2를 암호화하는 100 ㎍/㎖ 블라스티시딘으로 더욱 보충되었다.
HEK-Blue SEAP 검정: HEK-Blue IL-1/IL-33 반응 센서 세포가 IL-1α, IL-1β 또는 IL-33 자극이 발생하는 모든 HEK-Blue SEAP 검정에 대해서 사용되었다. 8-점 연속 희석 시리즈로 이루어진 작용제 용량-반응 곡선은 검정에 사용될 작용제의 반수 최대 유효 농도(EC50)의 추정치를 제공하기 위하여 모든 검정 전에 생성되었다. 실험적 사용 전 24시간에, 세포를 사용 시 최소 80% 컨플루언시(confluency)를 얻는 농도에서 96-웰, 평탄한-바닥 플레이트 상에 플레이팅하였다. 목적하는 작용제를 세포에 최종 용적 200㎕로 첨가하고, 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. SEAP 검출 검정을 이용해서 SEAP 생산을 정량화하였다. 일반 제조사의 지침에 따라서 표시된 각종 조건으로 SEAP의 수준을 결정하기 위하여 SEAP 검출 배지 QUANTI-Blue(InvivoGen)를 사용하였다. 구체적으로는, 20㎕의 세포 배양액 상청액(작용제 첨가 후 24시간에 수집)을 130㎕의 QU항-Blue 검출 배지에 첨가하였다. 반응을 37℃에서 1시간 동안 처리하고, 이 시점에서 SoftMax Pro 소프트웨어(Molecular Devices)와 함께 650㎚의 파장에서 흡광도를 측정하기 위하여 SpectraMax(Molecular Devices) 분광광도계를 사용하였다. 검정에서 작용제 EC50값의 비-선형 회귀 결정을 수행하기 위하여 GraphPad Prism 7 소프트웨어를 사용해서 원시 검정 데이터를 분석하였다.
하이브리도마 세포 배양액 상청액(SN) 중 비-정제된 항-hu-IL1RAP 항체의 HEK-Blue SEAP 검정을 이하의 변형을 이용하지만 위에서 기재된 바와 같이 수행하였다. 항-hu-IL1RAP 항체를 함유하는 비-정제된 하이브리도마 세포 배양액 SN을 50㎕의 4X 최종 용적에서 HEK-Blue IL-1/IL-33 세포에 첨가하였다. 세포 및 항체-함유 하이브리도마 세포 배양액 SN을 5% CO2와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1시간 항체 인큐베이션 후에, 작용제를, 총 200㎕의 용적 내에 최종 목적하는 1X 농도가 얻어지는 방식으로 4X 목적하는 농도에서 항체 및 세포를 수용하는 웰에 첨가하였다. 저해%는 샘플(이 경우에 항-hu-IL1RAP 항체-함유 하이브리도마 세포 배양액 SN)로부터 얻어진 값으로부터 음성 대조군으로부터 얻어진 흡광도값을 공제함으로써 계산하였다. 이어서, 음성 대조군-조절된 샘플은 양성 대조군(항체-함유 하이브리도마 세포 배양액 SN의 부재시에 작용제에만 노출되 세포)과 관련하여 비를 결정하기 위하여 사용되었다.
정제된 하이브리도마-유래 항-hu-IL1RAP 항체를 사용해서 수행된 HEK-Blue SEAP 검정은 하이브리도마 세포 배양액 SN으로 상기 검정과 유사하게 수행하였다. 간단히 말하면, 항체를, 5% CO2와 함께 37℃에서 1시간 동안, 표준 성장 배지 내에 작용제 없이, 세포와 인큐베이션하였다. 1시간 인큐베이션 후에, 목적하는 작용제는, 추정된 EC50 농도에서 최종 용적 200㎕에 첨가되고, 실험은 추가로 24시간 동안 진행되도록 허용되었다. 음성 대조군(NC)은, 성장 배지 단독에 노출된 세포를 나타내는 한편, 양성 대조군(PC)은 (길항 또는 대조 항체의 부재에서) 작용제 단독에 노출된 세포를 나타낸다.
항체(이하의 실시예에 기재된 바와 같은 Fab 포함)의 반수 최대 저해 농도(IC50)를 결정하기 위하여, 7-점 연속 희석이 (표시된 농도에서 시작해서) 사용되었다. 앞서 언급된 작용제 용량 반응 곡선에서처럼, 비-선형 회귀 분석은 검정 결과로부터의 IC50값을 결정하기 위하여 GraphPad Prism 7 소프트웨어를 이용해서 수행되었다.
이하의 상업적으로 입수 가능한 인간 사이토카인은 HEK-Blue 검정: IL-1α(Gibco/Thermo Fisher Scientific), IL-1β(InvivoGen, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재) 및 IL-33(InvivoGen; 또는 PeproTech US, 미국 뉴저지주 로키 힐 소재)에서 작용제로서 사용되었다.
ELISA 선별 및 HEK-Blue 세포-기반 차단 검정 결과는 서브클로닝 및 정제를 위한 15개의 친계 하이브리도마 계열의 패널을 선택하는데 사용되었다. 선택된 하이브리도마 및 HEK-Blue 세포-기반 차단 검정의 결과를 아래의 표 3에 나타낸다.
Figure pct00020
하이브리도마 서브클로닝 및 정제: 서브클로닝은 (위에서 기재된 바와 같이) ELISA 선별에 의해 확인된 서브클론으로 표준 제한 희석에 의해 수행하였다. 서브클론은 혈청 무함유 배지에서 30㎖ 배양액으로 규모 확대하였다. 항체는 다음과 같이 정제하였다. 상청액 배지는 세포를 제거하기 위하여 300g에서 10분 동안 원심분리하고 0.22㎛ 기공크기 필터로 여과에 의해 정화시켰다. 정화된 상청액 배지는 PBS 완충액으로 평형화된 POROS MabCapture A 수지(Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬 소재)와 혼합하고, 실온에서 1.5시간 동안 온화한 회전으로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 슬러리를 칼럼에 로딩하고, 수지를 0.5M NaCl을 함유하는 20 칼럼 용적(CV)의 PBS 완충액으로 세척하였다. IgG 분자를 3 CV의 0.1M 아세트산, 0.15M NaCl로 용리시켰다. 용리액을 1M MOPS, pH 7.0을 이용해서 pH 5.2로 신속하게 중화시키고, PD-10 탈염 칼럼(GE Healthcare)을 이용해서 PBS 완충액으로 완충액 교환하였다.
정제된 하이브리도마 항체의 특성규명
ELISA 검정: (위에서 기재된 바와 같이) ELISA 검정은, 15종의 친계 하이브리도마로부터 얻어진 정제된 항체가 가용성 hu-S-IL1RAP 폴리펩타이드(서열번호 7)뿐만 아니라 hu-M-IL1RAP 폴리펩타이드에 결합하는 능력을 확인하고, 그리고 마우스 mo-M-IL1RAP 폴리펩타이드(서열번호 9) 및 시노몰구스 원숭이 cyno-M-IL1RAP 폴리펩타이드(서열번호 8)에 대한 교차반응성의 정도를 결정하기 위하여 사용하였다. 하이브리도마로부터의 정제된 15종의 항체의 연속 희석은 20nM에서 시작하여 시험하였고, 각각에 대한 EC50은 아래의 표 4에 나타낸 바와 같이 계산하였다.
Figure pct00021
결합 도메인 매핑: 15종의 정제된 항체의 결합 도메인 매핑은 검정 플레이트 상에 1㎍/㎖로 코팅된 이하의 IL1RAP 폴리펩타이드 작제물로 위에서 기재된 ELISA 검정을 수행하였다: hu-M-IL1RAP, hu-M-IL1RAP-D1, hu-M-IL1RAP-D1D2 및 hu-M-IL1RAP-D3. 15종의 mAb를 10nM의 농도에서 시험하고, ELISA 검정 결과는 아래의 표 5에 나타낸다.
Figure pct00022
HEK-Blue 검정: 15종의 친계 하이브리도마로부터 유래된 정제된 항-hu-IL1RAP 항체는, 위에서 기재된 바와 같이 HEK-Blue 검정을 이용해서 IL1R1/IL1RAP 및 ST2/IL1RAP 경로의 IL-1β 및 IL-33 매개 활성화를 차단하는 능력을 결정하기 위하여 시험하였다. 용량 반응은 모든 mAb에 대해서 수행하고, 100nM의 항체 농도에서의 IL-1β 및 IL-33 매개 활성화의 저해 정도의 결정은 작용제 단독에 노출된 세포로부터 얻어진 최대 신호의 백분율로서 계산하였다. 이들 HEK-Blue 검정의 결과는 아래의 표 6에 나타낸다.
Figure pct00023
표 6의 HEK-Blue 검정 결과에 나타낸 바와 같이, 시험된 모든 항체 중 하이브리도마 11C5로부터의 mAb만이 100nM의 농도에서 IL-1β 및 IL-33 활성화된 경로 둘 다의 전체 또는 거의 전체 차단 활성도(각각 99% 및 93%)를 입증하였다.
OCTET 결합 친화도: 11C5 하이브리도마로부터의 정제된 mAb(이후 "11C5(Hy)")로부터 hu-M-IL1RAP 및 cyno-M-IL1RAP 폴리펩타이드 작제물까지의 결합 친화도는 OCTET® 생물층 간섭계(Bio-Layer Interferometry: BLI) 결합 분석(Pall ForteBio USA, 캘리포니아주 프리몬트 소재)을 이용해서 측정하였다. BLI 실험 포맷은 용액 중 IL1RAP 항원으로 생물층 표면 상의 항체를 고정화시킨다. 서열번호 3의 hu-M-IL1RAP 폴리펩타이드, 서열번호 8의 cyno-M-IL1RAP 폴리펩타이드 또는 하이브리도마 11C5로부터의 정제된 mAb를 실험적 완충액(0.01% Tween-20을 가진 PBS 완충액) 중에 각각 200㎕의 최종 용적으로 희석시켰다. 모든 샘플을 흑색 96-웰 플레이트에 배치하고 실험을 25℃에서 수행하였다. 하이브리도마 11C5로부터의 정제된 mAb를 35nM의 최종 농도로 희석시키고, 항-마우스 IgG Fc Capture(AMC) 바이오센서(Pall ForteBio) 상에 고정화시켰다. 분석물을 0.9 내지 25nM의 범위로 실험적 완충액에 연속 희석시켰다. 바이오센서는 실험을 시작하기 전에 10분 동안 25℃에서 실험 완충액에 평형화시켰다.
동력학 실험은 단계 명칭, 용액 및 시간이 나열된 이하의 단계로 수행되었다: 기준선(완충액 - 60초), 로딩(항체 - 200초), 기준선 2(완충액 - 최소 120초), 회합(분석물 - 200 내지 300초) 및 해리(완충액 - 1000초). 고정화된 항체로부터의 항원의 분석물 회합 및 해리에 기인하는 BLI 신호는 OCTET® 데이터 분석 소프트웨어(Pall ForteBio)를 이용해서 분석하였다. 우선, 참조 공제는 참조 웰(회합 단계에 대해서 분석물이 없지만 실험 웰과 동일한 단계를 거친 바이오센서)을 이용해서 모든 기록된 트레이스에 대해 수행하고, 이어서 모든 트레이스는 회합 단계의 시작에 정렬되었다. 회합 및 해리 단계의 전체는 각 분석물로 mAb 11C5(Hy)에 대해서 KD를 계산하기 위하여 1:1 결합 모델에서 전체적 적합화(4개의 분석물 농도 트레이스 중 최소)에 사용하였다. 이 OCTET BLI 분석의 결과는 아래의 표 7에 나타낸다.
Figure pct00024
요약: 하이브리도마 11C5, 11C5(Hy)로부터 유래된 정제된 항-M-IL1RAP 항체는 위에서 기재된 검정에서 이의 우수한 특성에 기초한 추가의 특성규명 및 친화도 성숙을 위하여 선택되었다. 즉, 11C5(Hy) mAb는 IL1RAP의 도메인 3(D3)에 결합하고, 웰을 ELISA에 의해 결정된 바와 같이 hu-M-IL1RAP, hu-S-IL1RAP 및 cyno-M-IL1RAP 폴리펩타이드에 균등하게 결합하고, HEK-Blue 검정에 의해 결정된 바와 같이 IL-1β 및 IL-33 활성화된 경로 둘 다에 대한 전체 또는 거의 전체 차단 활성도를 나타낸다. 그러나, 11C5(Hy) mAb는 서열번호 9의 마우스-M-IL1RAP 폴리펩타이드와 교차반응하지 않는다.
실시예 3: 선택된 항-인간 IL1RAP 항체의 시퀀싱
본 실시예는 하이브리도마-유래 항-hu-IL1RAP 항체의 서열의 결정을 예시한다.
이하의 프로토콜은 선택된 하이브리도마로부터 항체 중쇄 및 경쇄 단편을 암호화하는 유전자를 식별, 클로닝 및 시퀀싱하는데 사용되었다.
관심 하이브리도마를 80% 초과의 생존력으로 T75 플라스크에서 7 내지 10일 동안 표준 하이브리도마 배지(DMEM/F12, 10% FBS, 1% 글루타맥스(Glutamax), 1% pen/strep)에서 1 내지 3×105의 밀도로 성장시켰다. 배양액으로부터 1 내지 3백만개 세포를 15㎖ 팔콘 튜브에서 300g에서 5분 동안 펠릿화하였다. 펠릿화된 세포를 5㎖ 빙랭 PBS에 재현탁시킴으로써 세척하였다. 300g에서 5분 동안 원심분리 후, PBS를 제거하고, 세포를 재현탁시키고, 1㎖의 TRIZOL 시약(Life Technologies, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)에 용해시켰다. 세포의 완전한 용해를 확실하게 하기 위하여, 용해물을 20G1 게이지 니들(BD 305175)로 20회 1㎖ 시린지를 통과시켰다. TRIZOL/세포 현탁액을 드라이아이스 상에서 즉시 동결시키고 가공처리할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
총 RNA를 Direct-zol RNA Miniprep Plus 키트(Zymo Research, 미국 캘리포니아 어바인 소재)를 이용해서 용해물로부터 단리시키고, 5㎍의 총 RNA를, SMARTer RACE 5' 키트(Takara Bio, 일본 소재)를 이용해서 5'-RACE-준비 하이브리도마 cDNA를 생성하는데 사용하였다. 이하의 마우스 VH 패밀리 특이적 가변 영역 프라이머는 cDNA로부터의 중쇄 및 경쇄 특이적 유전자 단편을 증폭시키는데 사용되었다: TCTTGTCCACCTTGGTGCTGCTGGCCGG(서열번호 321), 및 TTTGTCCACCGTGGTGCTGCTGGCTGGT(서열번호 322). 이하의 마우스 V카파 패밀리 특이적 가변 영역 프라이머, GATCAGTCCAACTGTTCAGGACGCC(서열번호 323) 또는 마우스 V람다 패밀리 특이적 가변 영역 프라이머, ACACTCAGCACGGGACAAACTCTTCTCCACAGT(서열번호 324), ACACTCTGCAGGAGACAGACTCTTTTCCACAGT(서열번호 325), 및 ACACTCAGCACGGGACAAACTCTTCTCCACATG(서열번호 326)는 5'-RACE PCR 반응에서 키트에 제공되는 유니버설 프라이머와 함께 사용되었다.
PCR 산물을 정제하고, In-융합 클로닝 키트(Takara Bio, 일본 소재)를 이용해서 pRACE에 클로닝하였다. M13 정??항 및 M13 역방향 프라이머를 가진 Sanger 시퀀서를 이용해서 두 가닥을 시퀀싱하였다.
하이브리도마 11C5로부터 유래된 mAb에 대해서 결정된 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열인 VL 및 VH는 상기 표 2에 열거되어 있고, 서열번호 257 및 279로서 각각 첨부 서열 목록에 제공되어 있다.
또한, 하이브리도마 10A11, 9D5, 8H1 및 13D8로부터 유래된 mAb에 대해서 결정된 VL 및 VH 서열은 표 2에 열거되어 있고, 서열번호 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317 및 318로서 각각 첨부 서열 목록에 제공되어 있다.
실시예 4: 11C5 하이브리도마-유래 항-Hu-IL1RAP mAb에 의한 IL-1, IL-33 및 IL-36 자극된 세포내 신호전달의 저해
이 실시예는 11C5로부터 유래된 정제된 항-hu-IL1RAP mAb인 11C5(Hy)가 HEK-Blue 세포-기반 차단 검정에서 결정된 바와 같이 IL-1α, IL-1β, IL-33 및 IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ 자극된 세포내 신호전달을 차단할 수 있는 것을 나타낸다. 간단히 말하면, IL-36 수용체 IL1RL2로 일시적으로 형질감염된 HEK-Blue IL-1/IL-33 센서 세포 또는 HEK-Blue IL-33 센서 세포는 11C5(Hy)가 IL-1, IL-33 및 IL-36 의존적 신호전달 경로를 차단하는지를 결정하는데 사용하였다. 이들 HEK-Blue 세포주는 둘 다 IL-1, IL-33 또는 IL-36 활성화가 간단한 SEAP 검출 검정을 통해서 모니터링될 수 있는 NF-κB/AP-1 SEAP 리포터 유전자를 발현한다.
재료 및 방법
HEK-Blue 세포 : 이 실시예에서 사용된 HEK-Blue IL-1/IL-33 센서 세포는 위에서 실시예 2에서 기재되어 있다. HEK-Blue IL-33 센서 세포(InvivoGen; 카탈로그 번호 hkb-hil33)는 HEK-Blue IL-1/IL-33 세포와 유사하지만 차단된 IL-1 및 TNF-α 반응 둘 다를 갖는다. HEK-Blue IL-33 세포는 앞서 기재된 표준 성장 배지를 이용해서 제조사의 지침에 따라서 유지되었고, 1X HEK-Blue 선택 항생제(InvivoGen; 카탈로그 번호 hb-sel)를 보충하여 SEAP, ST2 및 IL-33 특이성에 대해서 암호화하는 플라스미드를 유지하였다.
IL-36 수용체에 의한 HEK-Blue IL-33 세포의 일시적인 형질감염: IL-36 수용체를 암호화하는 인간 IL1RL2 유전자를 함유하는 플라스미드는 AvantGen(고객 주문)에 의해 생성되었다. HEK-Blue IL-33 센서 세포는 제조사의 지침에 따라서 LyoVec(InvivoGen)을 이용해서 일시적으로 형질감염시켰다. 간단히 말하면, LyoVec-DNA 복합체를 형질감염 후 24시간에 최소 80% 컨플루언시를 생성하는 농도에서 표준 성장 배지에 현탁된 세포에 직접 첨가하고, 즉시 96-웰, 평탄한-바닥 플레이트에 플레이팅하였다. 형질감염 후 24시간에, 세포는 표준 HEK-Blue SEAP 검정에 사용되었다.
HEK-Blue SEAP 검정: HEK-Blue IL-1/IL-33 세포가 모든 HEK-Blue SEAP 검정에 사용되었고 여기서 IL-1 또는 IL-33 자극이 일어났고 실시예 2에서 위에서 기재되어 있다. IL-36 자극에 의한 검정을 위하여, IL-36 수용체인 IL1RL2를 일시적으로 발현하는 HEK-Blue IL-33 세포가 사용되었다. 이들 일시적으로 형질감염된 HEK-Blue IL-33 센서 세포는 IL-36α, IL-36β 및 IL-36-γ에 의한 자극에 대해서 반응성이다. 인간 IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ 사이토카인은 N-말단 서열을 절단하여 완전 성숙 사이토카인을 생산하였다. 작용제 EC50 및 길항제 항체 IC50에 대한 값은 앞서 기재된 바와 같이 얻어졌다. 음성 대조군(NC)은 성장 배지 단독에 노출된 세포를 나타낸 한편, 양성 대조군(PC)은 (길항 또는 대조 항체의 부재에서) 작용제 단독에 노출된 세포를 나타낸다.
결과
11C5(Hy) mAb는 EC55-60과 대략 등가인 것으로 앞서 결정된 농도에서 IL-1α(도 1A) 또는 IL-1β(도 1B)의 첨가 전에, HEK-Blue IL-1/IL-33 세포로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 11C5(Hy) mAb는 IL-1α 및 IL-1β에 대해서 각각 4.7E-09 M 및 1.0E-09 M와 동일인 IC50으로 강한 차단 활성도를 나타내었다. 100nM의 항체 농도에서, 거의 완전 저해(IL-1α 및 IL-1β에 대해서 각각 94% 및 99%)가 각각의 양성(PC) 및 음성(NC) 대조군과 비교된 경우 관찰되었다.
유사한 검정이 IL-33 자극된 HEK-Blue IL-1/IL-33 세포에서 차단 효력(potency) 및 효능(efficacy)을 결정하기 위하여 수행되었다(도 1C). IL-1 차단 검정에 대해서 관찰된 바와 같이, 11C5(Hy)는 IL-33 자극(IC50 = 3.71E-09 M) 시 강한 차단 활성도를 나타냈으며, 거의 완전한 차단(93%)이 시험된 항체의 최대 농도(100nM)에서 관찰되었다.
HEK-Blue IL-36 반응성 세포(즉, IL-36 수용체를 일시적으로 발현하는 IL-33 세포 IL1RL2)를 11C5(Hy)로 1시간 동안 인큐베이션하고 나서, IL-36α(도 1D), IL-36β(도 1E) 또는 IL-36γ(도 1F)로 자극시켰다. 100nM의 11C5(Hy) 항체 농도에서, IL-36 의존적 신호전달의 거의 완전 저해, 구체적으로는 각각 IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ의 98%, 98% 및 99% 저해가 관찰되었다. IC50값은 IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ에 대해서 각각 2.52E-09 M, 9.81E-10 M 및 6.65E-10 M이었다.
HEK-Blue 검정에서의 mAb 11C5(Hy)의 IC50값 및 저해%는 아래의 표 8에 요약되어 있다.
Figure pct00025
상기 표 8에서의 결과에 의해 나타낸 바와 같이, 정제된 하이브리도마-유래 항체 11C5(Hy)는 HEK Blue 세포-기반 차단 검정에서 모드 6개의 사이토카인 (IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ)의 자극 시 모두 3개의 관심 경로(IL-1, IL-33 및 IL-36)를 강력하게 차단할 수 있다.
실시예 5: 항-IL1RAP mAb 11C5(Hy)의 인간화, 키메라 및 C59 쥣과 버전의 제조
본 실시예는 하이브리도마 11C5로부터 유래된 쥣과 항-IL1RAP mAb 11C5(Hy)의 인간화 및 키메라 버전의 제조를 예시한다. 부가적으로, 본 실시예는 일련의 대안 아미노산: C59A, C59S, C59T, C59V 및 C59Y로 위치 59에서 중쇄 시스테인 잔기의 치환을 갖는 11C5(Hy) mAb의 쥣과, 인간화 및 키메라 변이체의 제제를 예시한다.
쥣과 항-IL1RAP 11C5 가변 영역 서열의 인간화
서열번호 257의 쥣과 11C5(Hy) 항체 경쇄 가변 영역(VL) 서열 및 서열번호 279의 중쇄 가변 영역(VH) 서열을 인간 생식세포계열 항체 서열에 대해서 정렬하였다. 인간 생식세포계열 카파 경쇄(유전자 ID - V 유전자: IGKV1-NL1*01, J 유전자: IGKJ4*02) 및 인간 생식세포계열 중쇄(유전자 ID - V 유전자: IGHV3-7*03, J 유전자: IGHJ4*03)를 최근접 인간 프레임워크로서 식별하였다. 쥣과 11C5(Hy), 최근접 인간 생식세포계열 서열, 및 인간화, h11C5의 VL 및 VH 도메인의 아미노산 서열 정렬이 도 2에 도시되어 있다.
쥣과 11C5(Hy) 경쇄 및 중쇄의 상보성-결정 영역(CDR)은, 각각 인간화 항체 클론(이후 "h11C5"로 지칭됨)을 생성하기 위하여, 각각 식별된 최근접 경쇄 및 중쇄 인간 프레임워크에 이식되었다. 쥣과 11C5(Hy) VL 서열(서열번호 257)의 CDR-L1에서의 위치 24 내지 34, CDR-L2에서의 위치 50 내지 56 및 CDR-L3에서의 89 내지 97을 인간 카파 경쇄 프레임워크 억셉터에 이식하였다. 쥣과 11C5(Hy) VH 서열(서열번호 279)의 CDR-H1에서의 위치 31 내지 35, CDR-H2에서의 50 내지 65 및 CDR-H3에서의 95 내지 102를 인간 중쇄 프레임워크 억셉터에 이식하였다. 쥣과 11C5(Hy) 경쇄의 프레임워크 영역 2에서의 위치 48은 또한 이 위치가 CDR 구조를 조절하고 이를 항원에 적합화시키기 위하여 미세 조율할 수 있는 "버니어(Vernier)" 영역으로서 작용하는 VH-VL 상호작용 계면 또는 프레임워크 잔기의 일부인 것으로 확인되었으므로 인간 카파 경쇄 프레임워크 억셉터에 이식되었다(예컨대, 문헌[Foote et al., J. Mol. Biol., 224: 4887-499 (1992)] 참조).
인간화 가변 도메인 서열은 VL에 대해서 5' 측접 제한 효소 부위로서 AgeI를 그리고 3' 측접 제한 효소 부위로서 KpnI를 갖고, VH에 대해서 5' 측접 제한 효소 부위로서 AgeI를 그리고 3' 측접 제한 효소 부위로서 BstEII를 갖는 DNA 단편으로서 합성되었다. h11C5에 대해서 경쇄 발현 플라스미드는 AgeI - KpnI 단편을 완전 인간 카파 경쇄 불변 도메인을 함유하는 pRK 플라스미드에서 합성된 h11C5 VL DNA 단편으로 대체함으로써 유래되었다. h11C5에 대해서 중쇄 발현 플라스미드는 AgeI - BstEII 단편을 완전 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인을 함유하는 pRK 플라스미드에서 합성된 h11C5 VH DNA 단편으로 대체함으로써 유래되었다.
인간화 h11C5 항체와의 비교를 위하여, 쥣과 11C5(Hy) VL 및 VH 서열의 DNA 단편을 위에서 기재된 바와 같이 합성하였다. 쥣과 11C5(Hy) 또는 11C5의 키메라 버전(쥣과 VL 및 VH 도메인, 및 인간 CL 및 CH1-CH3 도메인을 함유)의 경쇄 및 중쇄를 발현하는 플라스미드는 합성된 DNA 단편을 각각 쥣과 IgG2a 또는 인간 IgG1 불변 도메인을 보유하는 pRK 플라스미드에 클로닝함으로써 작제하였다.
항-IL1RAP 11C5의 중쇄 Cys59 변이체의 생성
쥣과 11C5(Hy)의 VH의 CDR-H2 서열은, 항체의 추가의 치료적 개발에 있어서 주된 단점일 수 있는 위치 59(Cys59)에서 언페어링된 시스테인 잔기를 포함한다. 이 단점을 제거하기 위하여, 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 발린(V) 또는 티로신(Y)으로 위치 59에서 시스테인(C)의 아미노 치환을 가진 VH 도메인 서열의 일련의 변이체를 합성하였다. 치환은 시스테인에 대해서 아미노산 곁사슬 유사성(알라닌, 세린, 트레오닌 및 발린)에 기초하여 또는 위치 59(티로신)에서 최근접 생식세포계열 서열에 기초하여 선택하였다. 쥣과 11C5("11C5(Hy)"), 키메라 11C5("c11C5") 및 인간화 11C5("h11C5")의 각각의 VH 서열의 맥락에서 생성된 일련의 Cys59 mAb 변이체를, AgeI를 5' 측접 제한 효소 부위로서 그리고 BstEII를 3' 측접 제한 효소 부위로서 갖는 DNA 단편으로서 합성하였다. Cys59 변이체에 대해서 중쇄 발현 플라스미드는 위에서 기재된 바와 같이 생성되었다.
11C5(Hy)-유래 쥣과, 키메라 및 인간화 항-IL1RAP mAb 및 이들의 Cys59 변이체의 재조합 버전의 생성
재조합 IgG 분자의 발현은 제조사에 의해 제공된 지시에 따라서 Expi293F 발현 시스템(Life Technologies, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)을 이용해서 수행하였다. 중쇄 및 경쇄에 대한 플라미드의 비는 형질감염 반응에 대해서 1 대 1로 유지하고 형질감염된 세포를 수확 전에 6일 동안 배양하였다.
재조합 IgG 분자는 이하의 프로토콜로 정제하였다. 상청액 배지를 300g에서 10분 동안 원심분리에 의해 세포를 제거하고 0.22㎛ 기공크기 필터로 여과시켜 정화시켰다. 정화된 상청액 배지를 PBS 완충액으로 평형화한 POROS MabCapture A 수지(Thermo Scientific)와 혼합하고 1.5시간 동안 실온에서 온화한 회전하에 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 슬러리를 칼럼에 로딩하고, 수지를 0.5M NaCl을 함유하는 20 칼럼 용적의 PBS 완충액으로 세척하였다. 이어서, 재조합 IgG 분자를 3 칼럼 용적의 0.1M 아세트산, 0.15M NaCl로 용리시켰다. 용리액을 1M MOPS, pH 7.0으로 pH 5.2로 신속하게 중화시키고, PD-10 칼럼(GE)을 이용해서 PBS 완충액으로 완충액 교환하였다.
11C5(Hy)-유래 쥣과, 키메라 및 인간화 항-IL1RAP mAb 및 이들의 Cys59 변이체의 재조합 버전의 결합 친화도
서열번호 3의 hu-M-IL1RAP 폴리펩타이드에 대해서 11C5(Hy)로부터 유래된 쥣과("m11C5"), 키메라("c11C5") 및 인간화("h11C5") mAb의 재조합 버전의 결합 친화도는 OCTET 생물층 간섭계(BLI) 결합 분석(Pall ForteBio)에 의해 측정하였다.
실험 포맷은 생물층 표면 상에 고정화된 항체를 갖고, 항원 IL1RAP는 용액 중에 있었다. 재조합 hu-M-IL1RAP 및 모든 11C5 변이체를 실험 완충액(0.01% Tween-20을 가진 PBS 완충액) 중 (각각 200㎕의 최종 용적으로) 희석시켰다. 모든 샘플을 흑색 96-웰 플레이트에 배치하고, 실험을 25℃에서 수행하였다. 쥣과 및 키메라 11C5 변이체(35nM)를 항-마우스 IgG Fc 캡처(AMC) 바이오센서(Pall ForteBio) 상에 고정화시켰다. 항-인간 IgG Fc 캡처(AHC) 바이오센서(Pall ForteBio)는 인간화 11C5 변이체(35nM)에 대해서 사용하였다. hu-M-IL1RAP 분석물 용액을 1 내지 81nM의 범위로 실험 완충액으로 연속 희석시켰다. 바이오센서를, 실험을 시작하기 전에 10분 동안 25℃에서 실험 완충액으로 평형화시켰다.
동력학 실험은 단계 명칭, 용액 및 시간이 나열된 이하의 단계로 수행되었다: 기준선(완충액 - 60초), 로딩(항체 - 200초), 기준선 2(완충액 - 최소 120초), 회합(분석물 - 200 내지 300초) 및 해리(완충액 - 1000초).
고정화된 항체로부터의 분석물 회합 및 해리로부터의 얻어지는 BLI 신호는 Octet 데이터 분석 소프트웨어(Pall ForteBio)를 이용해서 분석하였다. 우선, 참조 공제는 참조 웰(회합 단계에 대해서 분석물이 없지만 실험 웰과 동일한 단계를 거친 바이오센서)을 이용해서 모든 기록된 트레이스에 대해 수행하고, 이어서 모든 트레이스는 회합 단계의 시작에 정렬되었다. 회합 및 해리 단계의 전체는 hu-M-IL1RAP로 각 11C5 변이체에 대해서 KD를 계산하기 위하여 1:1 결합 모델에서 전체적 적합화(4개의 분석물 농도 트레이스 중 최소)에 사용하였다. 계산된 KD값은 아래의 표 9에 나타낸다.
Figure pct00026
실시예 6: 인간화 11C5의 비특이적 결합 평가
본 실시예는 인간화 11C5(h11C5)가 비-특이적 결합을 나타내지 않는 것을 나타내는 바큘로바이러스(BV) 입자 ELISA 검정을 예시한다.
이하의 프로토콜을 사용해서 문헌[Hotzel et al., mAbs, 4(6): 753-760 (2012)]에 기재된 프로토콜에 따라서 바큘로바이러스(BV) 입자에 대한 h11C5의 비-특이적 결합을 평가하였다. 간단히 말하면, BV 입자를 4℃에서 하룻밤 2.5% 현탁액으로서 96-웰 ELISA 플레이트 상에 코팅하였다. 이어서, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 PBS 중 1% BSA, 0.05% Tween-20으로 차단하였다. 연속 희석된 h11C5 항-hu-IL1RAP 항체를 이 플레이트에 1시간 동안 첨가하고, 서양고추냉이 과산화효소에 접합된 염소 항-인간 IgG(Jackson ImmunoResearch)로 결합된 항체를 검출하고 나서, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 기질(Thermo Fisher Scientific) 및 2N 황산을 첨가하였다. 450㎚에서의 흡광도를 측정하고 참조 항체와 비교하였다.
결과 : 도 3의 플롯으로 나타낸 바와 같이, h11C5 항체는 450㎚에서 검출 가능한 BV ELISA 신호를 보이지 않았는데, 이는 BV 입자에 대한 어떠한 비-특이적 결합도 존재하지 않는 것을 나타낸다.
실시예 7: 11C5에 기초한 쥣과, 키메라, 및 인간화 항-IL1RAP 항체의 기능적 검정
본 실시예는 저해 IL-1, IL-33 및 IL-36 자극된 세포내 신호전달을 저해하는 각각의 능력을 결정하기 위하여 실시예 4 및 5에 기재된 재조합 쥣과, 키메라 및 인간화 항-IL1RAP 항체의 세포-기반 차단 검정을 예시한다.
재료 및 방법
세포주 및 HEK-Blue 검정: 본 실시예 7에서 사용된 세포주 및 HEK-Blue 검정은 위에서 실시예 2 및 4에 기재되어 있다.
원발성 인간 폐 섬유아세포 및 관련된 검정: 원발성 인간 폐 섬유아세포(PHLF)는 상업적으로 입수 가능하고 Lonza(카탈로그 번호 CC-2512)로부터 얻었다. 세포를 정상(무질환) 공여된 인간 조직으로부터 단리하고 제조사에 의해 저온보관하였다. 세포를 해동하고, 제조사에 의해 권장된 일반적인 지침을 이용해서 유지하였다. PHLF는 사용 전에 열-불활성화된 (56℃, 30분 동안) 2% 인간 AB 혈청(Corning)이 보충된 FibroLife Basal 배지(LifeLine), 7.5mM 글루타맥스(Gibco), 100 IU/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신으로 이루어진 성장 배지에 유지하였다. 실험 사용 전날에, PHLF를 사용일에 대략 80 내지 85% 컨플루언시가 얻어지는 농도로 평탄한-바닥, 96-웰 플레이트에 파종하였다.
항체 차단 검정에서 사용하기 전에, 작용제 EC50은 이하의 변형을 가진 HEK-Blue 세포에 대해서 실시예 2에 기재된 바와 같은 유사한 방법으로 작용제 용량-반응 곡선을 수행함으로써 결정되었다. PHLF 성장 배지 단독(최종 용적 200㎕)을 함유하는 웰 내 PHLF에 작용제의 첨가 후, 세포를 4시간 동안 조직 배양액 인큐베이터(5% CO2와 함께 37℃)로 되돌렸다. 이어서, 조직 배양액 상청액을 수집하고, 1 내지 3일 동안 4℃에서 보관하였다. 수집된 상청액에 존재하는 IL-8의 존재를 정량화하기 위하여 IL-8 (인간) AlphaLISA 검출 키트(Perkin Elmer)를 사용하였다. 검정은 제조사 지침에 지시된 바와 같이 수행하였다. EnVision-Alpha 판독기(Perkin Elmer)를 이용해서 얻어진 원시 데이터는 GraphPad Prism 소프트웨어를 이용해서 분석하고, 보간은 비-선형 회귀 분석(곡선 적합화), Sigmoidal, 4PL(X는 log(농도)임)을 이용하고 "1/Y2에 의한 가중치"로 정의된 가중치 부여해서 수행하였다. 이어서, 보간된 데이터는 표준 비-선형 회귀 분석을 이용해서 분석하였다.
세포-기반 차단 검정은, 구체적으로 PHLF 용법을 고려해서 변형시키고, IC50값을 얻기 위하여 도움이 되는 방식이지만 실시예 4에서와 같이 수행하였다. 간단히 말하면, c11C5_C59Y 또는 적절한 항체 대조군(예컨대, Hu IgG1 Ctrl)을 37℃에서 1시간 동안 PHLF로 인큐베이션하고 나서, 작용제(IL-1α 또는 IL-36β)를 첨가하였다. 실험은 추가로 4시간 동안 (5% CO2와 함께 37℃) 진행하고, 세포 배양 상청액을 수집하고, 위에서 기재된 바와 같이 IL-8의 정량화를 수행하였다.
원발성 인간 단핵구 및 관련된 검정. "미터치된"으로도 공지된 음성 면역자기성(immunomagnetic) 선택에 의해 단리된 원발성 인간 단핵구(PHMO)는 상업적으로 입수 가능하고, Stemcell Technologies로부터 얻었다. 단핵구를 일반적인 제조사 지침에 따라서 해동하고 실시예 4에 기재된 바와 같이 표준 성장 배지에서 유지하였다. 항체 차단 검정에 대해서, PHMO는 평탄한-바닥의 96-웰 플레이트 상에 80,000/웰에서 검정 전날에 플레이팅하였다. 항체인 c11C5_C59Y 또는 적절한 항체 아이소타입 대조군(Hu IgG Ctrl)을, 5% CO2와 함께 37℃에서 1시간 동안 PHMO와 인큐베이션하고 나서, 관심 작용제(예컨대, IL-1β)를 첨가하였다. 모든 웰에 대한 최종 용적은 200㎕였고, 여기서 양성 대조군(PC)은 성장 배지 및 작용제 만을 나타내고, 음성 대조군(NC)은 PHMO 및 성장 배지만을 나타낸다.
조직 배양 상청액을 작용제 첨가 후 24시간 동안 수집하고, ELISA 검정이 존재하는 IL-6의 존재를 결정하기 위하여 수행될 때까지 -80℃에서 보관하였다. 상청액 중 IL-6의 수준을 정량화하기 위하여 인간 IL-6 ELISA 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하였다. 원시 데이터 분석 및 보간은 GraphPad Prism 소프트웨어 및 비-선형 회귀 분석을 이용해서 수행하였다. 항체 차단 검정 전에, 작용제 용량-반응 곡선은, PHMO의 용법을 구체적으로 고려해서 위에서 기재된 바와 같이 변형시켜서, 실시예 2에 일반적으로 기재된 바와 같이 EC50값을 결정하기 위하여 생성되었다. 항체 IC50값은 동일한 방식으로 결정하였다.
원발성 인간 NK 세포 및 관련된 검정. 음성 면역자기성 선택에 의해 단리된 원발성 인간 NK 세포는 Stemcell Technologies(캐나다 밴쿠버 소재)로부터 상업적으로 얻었다. 실험 사용일에, NK 세포를 이하의 변형과 함께 일반적인 제조사의 지침에 따라서 해동시켰다. 세포를 0.05 ㎎/㎖ DNAse I(Stemcell Technologies)가 보충된 RPMI(Corning)로 이루어진 해동 배지에서 해동시켰다. 해동 후 세포를 실험 사용 전에 최소 1시간 회복 시간(5% CO2와 함께 37℃)을 부여하고, 사용 전에 열-불활성화된(56℃ 30분 동안) 10% 인간 AB 혈청(Corning)이 보충된 RPMI(Corning), 1mM 피루브산나트륨(Corning Cellgro), 2mM 글루타맥스(Gibco) 및 1X MEM 비필수 아미노산(Gibco)로 이루어진 NK 성장 배지에서 유지하였다.
항체 차단 검정에서 실험 사용 전에, 작용제 EC50은, 이하의 변형과 함께, 실시예 2에서의 HEK-Blue 세포에 대해서 기재된 것과 유사한 방식으로 작용제 용량-반응 곡선을 수행함으로써 결정되었다. NK 세포는 둥근-바닥, 96-웰 플레이트에 50,000/웰로 파종하였다. NK 성장 배지(최종 용적 200㎕)에만 현탁된 NK 세포에 작용제를 첨가한 후, 세포를 조직 배양액 인큐베이터(5% CO2와 함께 37℃)로 24시간 동안 되돌렸다. NK 성장 배지만을 함유하는 표준 음성 대조군(NC) 이외에, 양성 대조군(PC)은 (특정된 농도에서의) IL-33 및 0.1 ng/㎖의 IL-12를 둘 다 함유하는 NK 성장 배지로 이루어졌다. 추가의 "IL-12 단독" 대조군이 또한 포함되었다.
조직 배양액 상청액을 작용제 첨가 후 24시간에 수집하고, 1 내지 3일 동안 4℃에서 보관하였다. 상청액에 존재하는 IFN-γ의 수준은 제조사 지침에 따라서 인간 IFN-γ ELISA 키트(Invitrogen/Thermo Fisher Scientific)를 이용해서 결정하였다. 비-선형 회귀 분석은 최종 EC50값을 얻기 위하여 GraphPad Prism 7 소프트웨어를 사용해서 수행하였다.
항체 차단 검정은, 마찬가지로, 그러나, 일반적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 그리고 위에서 상세히 기재된 바와 같이 NK 세포 용도를 구체적으로 고려해서 변경시킨 것을 제외하고, IC50 값을 얻기 쉬운 방식으로 수행되었다. 간략히 말하면, c11C5_C59Y 또는 적절한 항체 아이소타입 대조군(Hu IgG Ctrl)을 37℃에서 1시간 동안 NK 세포와 인큐베이션하고 나서, 작용제(IL-33 + IL-12 또는 IL-12 단독)를 첨가하였다. 실험은 추가로 24시간 진행하고(5% CO2와 함께 37℃), 세포 배양 상청액을 수집하고 IFNγ의 정량화는 위에서 기재된 바와 같이 수행하였다.
결과
재조합, 인간화 11C5("h11C5")의 차단 효력 및 효능을 결정하기 위하여, 본 발명자들은 HEK-Blue IL-1/IL-33 차단 검정을 수행하였다. 오리지날 쥣과 하이브리도마 유도 항체("11C5(Hy)") 및 재조합, 쥣과 무효과기 버전("m11C5")은 또한 무효과기 인간 IgG 아이소타입 대조군("Hu IgG1 Ctrl")뿐만 아니라, 인간화의 결과로서 차단 활성의 임의의 잠재적인 손실을 평가하기 위하여 검정되었다.
인간화는 IL-1β(도 4A) 및 IL-33(도 4B) 자극된 세포 둘 다에서 차단 활성도의 약간의 손실을 초래하였다. 인간화 항체 h11C5는, 100nM에서의 완전 저해(IC50 = 0.705nM)를 나타낸 하이브리도마-유래 11C5(Hy)의 재조합 버전인 m11C5에 비해서 IL-1β 자극된 세포로 98% 저해(IC50 = 3.12nM)를 입증하였다. 마찬가지로, IL-33 자극된 세포에 대해서, 100nM에서의 h11C5는 m11C5로 관찰된 96% 저해(IC50 = 2.25nM)에 비해서 80% 저해(IC50 = 24.0nM)를 나타내었다. 도 4C 및 도 4D에 도시된 바와 같이, h11C5의 IL-1β 및 IL-33 차단 활성도는 C59 단점을 제거한 11C5_C59Y 변이체에 의해 부분적으로 회복되었다. h11C5_C59Y에 대해서, IL-1β 차단 활성도에 대한 IC50은 1.03nM로 향상되었고, IL-33 차단 활성도에 대한 IC50은 3.75nM로 향상되었다.
요약하면, 하이브리도마-유래 항-Hu IL1RAP 항체인 11C5(Hy)는 IL-1 및 IL-33 의존적 경로를 차단하는 능력의 단지 약간의 저감으로 성공적으로 인간화하였고, 이는 VH 영역에서 C59Y 치환에 의해 부분적으로 회복되었다.
지금까지 사용된 HEK-Blue 세포주가 IL-1, IL-33 또는 IL-36 경로 활성화를 평가하는 빠르고 간단한 방식을 제공했지만, 이들과 같은 세포주는 생체내에서 발생할 수 있는 것을 대표하지 않을 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 원발성 인간 세포를 이용하여 11C5의 차단 활성도를 평가하고자 추구했다. 인간 폐 섬유아세포는 IL-1 수용체(IL1R1) 및 이의 관련 공동수용체인 IL1RAP를 발현하는 것으로 알려져 있다. 또한, 이들은 선천적 및 염증성 면역 반응 둘 다에 기여하는 것으로 여겨진다(Suwara, Green et al., 2014). 11C5 항체가 원발성 인간 폐 섬유아세포(PHLF)에서 IL-1 신호전달을 저해하는 정도를 결정하기 위하여, HEK-Blue 세포주 검정에 대해서 사용되는 일반적인 시험적 접근법이 PHLF의 구체적인 그리고 기술적인 요건을 고려해서 변형되었다. 부가적으로, 무효과기 N297G 돌연변이를 특징으로 하는 11C5 항체의 재조합 키메라 버전("c11C5_C59Y")이 검정에서 사용되었다.
도 4E에 도시된 바와 같이, c11C5_C59Y는 HEK-Blue 검정에서 IL-1α 자극된 활성도에 대해서 관찰된 바와 같이 PHLF에서의 IL-1α 매개 IL-8 생산의 현저하게 유사한 차단 활성도를 입증하였고(도 1A 참조), 대략 4nM의 IC50이 두 경우에 관찰되었다(PHLF에서 c11C5_C59Y의 IC50 3.96nM 및 100nM에서의 87% 저해).
IL-1 경로는 기도 염증에 기여하는 것으로 여겨지고, 인간 단핵구는 IL-1에 반응하는 것으로 알려져 있다(Sims and Smith 2010). 도 4F에 도시된 바와 같이, 원발성 인간 단핵구(PHMO)가 c11C5_C59Y의 존재 하에 IL-1β로 자극된 경우, IL-6 생산의 100% 저해가 관찰되었고 IC50은 0.733nM이었다. 이것은 c11C5_C59Y가 PHMO에서 IL-1β 매개 신호전달을 완전히 차단할 수 있는 것을 입증한다.
천식의 증상에 대한 IL-33 경로의 역할 및 기여는 잘 문서화되어 있다(예컨대, 문헌[Sims and Smith, Nat. Rev. Immunol., 10(2): 89-102 (2010), Garlanda et al., Immunity, 39(6):1003-1018 (2013), Saluja et al., Clin. Transl. Allergy, 5:33 (2015)] 참조). c11C5_C59Y가 원발성 인간 세포에서 IL-33 경로를 차단할 수 있는지의 여부를 확인하기 위하여, 검정은 인간 NK 세포를 이용해서 수행하였다. IL-12는 NK 세포에 의해 ST2(IL-33 수용체)의 발현을 자극하는 것으로 알려져 있고, 일반적인 NK 자극 인자로서 간주되어, IFN-γ의 생산 및 증식을 증가시킬 뿐만 아니라, 세포독성을 증대시킨다(예컨대, 문헌[Liew et al., Nat. Rev. Immunol., 16(11);676-689 (2016), Granzin et al., Front. Immunol., 8:458 (2017)] 참조). IL-12의 존재하에 IL-33으로 자극된 원발성 인간 NK 세포는 IFN-γ를 생산하는 한편, IL-12에만 노출된 NK 세포는 검출 가능한 IFN-γ를 생산하는데 실패하였다.
c11C5_C59Y가 인간 NK 세포에서 IL-33/IL-12 신호전달을 차단하는 정도를 결정하기 위하여, c11C5_C59Y 또는 무효과기 아이소타입 대조 항체("IgG Ctrl")를 인간 NK 세포와 1시간 동안 인큐베이션하고 나서, 24시간 동안 IL-33/IL-12 자극을 가하였다. 도 4G에 도시된 바와 같이, IFN-γ 생산은 대조 항체로 인큐베이션한 인간 NK 세포에서 검출 가능하였지만, 2.90nM의 IC50 및 100nM에서의 87% 저해로c11C5_C59Y로 인큐베이션된 NK 세포에서 NC의 수준에 가까운 수준으로 저감되었다.
기도 상피, 상피 및 면역 세포는 크로스-토크(cross-talk)되고, 상피 세포와 섬유아세포 간의 상호작용은 면역 염증 및 천식에서의 이들의 역할에 대한 관심이 증가하고 있다(예컨대, 문헌[Lambrecht and Hammad (2012); Nowarski et al., Cell, 168(3):362-375 (2017)] 참조). 기관지 상피 세포는, 예컨대, 바이러스 또는 박테리아 감염 및 담배 연기에 대한 노출과 같은 손상 또는 스트레스 후에, 염증성 사이토카인, 예컨대, IL-1 및 IL-36의 생산에 기여하는 것으로 알려져 있다. 또한, 폐 섬유아세포는 IL-1 및 IL-36에 반응하여 염증성 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다(예컨대, 문헌[Suwara et al., Mucosal Immunol., 7(3): 684-693 (2014); Bassoy et al., Immunol. Rev., 281(1):169-178 (2018)] 참조). 도 4H에 도시된 바와 같이, c11C5_C59Y는 PHLF의 IL-36β 자극을 차단하는 것으로 나타났고, NC군에서 PHLF에 대해서 견줄 만한 수준으로 IL-8 생산을 저감시키고(100% 저해), IC50이 0.28nM인 것으로 판명되었다.
아래의 표 10에 요약된 c11C5_C59Y에 대한 결과를 비롯하여 본 실시예 7의 결과에 나타낸 바와 같이, 하이브리도마-유래 항-hu-IL1RAP 항체인 11C5(Hy)에 기초한 재조합 항체는 HEK-Blue 세포주 및 원발성 인간 세포 둘 다에서 IL-1, IL-33 및 IL-36 신호전달을 차단할 수 있다. 게다가, 원발성 인간 세포 검정은 HEK-Blue 세포주 검정의 사용을 더욱 검증하고 있다.
Figure pct00027
실시예 8: 파지 라이브러리 패닝을 이용한 인간화 항-IL1RAP 항체의 친화도 성숙
본 실시예는 인간 IL1RAP에 대한 결합을 향상시키기 위하여 인간화 항-IL1RAP 항체 h11C5의 친화도 성숙을 위하여 사용되는 파지 라이브러리 작제 및 패닝 기술을 예시한다.
인간화 11C5 C59Y/A43S 친화도 성숙 NNK 라이브러리 작제
친화도 성숙 과정은 hu-IL1RAP에 대한 h11C5_C59Y 항체의 결합 친화도를 더욱 향상시키기 위하여 수행하였다. 라이브러리의 작제 개시 전에, 알라닌(A)에서 세린(S)으로의 치환(A43S)은 h11C5_C59Y 경쇄의 프레임워크 영역 2에 도입하였다. 인간화 과정으로 인해 VH-VL상호작용 계면을 변화시키는 잠재적인 효과를 최소화하기 위하여 A43S 치환을 도입하였다(Foote et al., J. Mol. Biol., 224:487-499 (1992)). 따라서, h11C5_C59Y/A43S 변이체를 친계 서열로서 사용하는 것에 기초하여 파지 라이브러리를 작제하였다. 파지 라이브러리는 모두 20개의 아미노산을 암호화하는 NNK 축퇴 코돈을 이용해서 경쇄 또는 중쇄 CDR 잔기의 잔기 무작위화로 1가 Fab 파지 디스플레이에 대한 Fab-앰버 포랫으로 작제하였다(Brenner et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 89(12):5381-5383 (1992)). 돌연변이유발 올리고뉴클레오타이드는 3개의 경쇄 또는 중쇄 CDR의 각각에서 CDR 잔기에 1개의 NNK 돌연변이를 적용하도록 설계되었다. 이와 같이 해서, 라이브러리의 각 구성원은 3개의 NNK 축퇴 코돈을 보유하고, 하나는 경쇄 또는 중쇄의 각 CDR에 대한 것이다. 이어서, 합성된 돌연변이유발 올리고뉴클레오타이드는 Kunkel 돌연변이유발을 이용해서 경쇄 또는 중쇄 라이브러리를 작제하는데 사용하였다(Kunkel et al., Methods Enzymol., 154:367-382 (1987)). 얻어진 라이브러리 DNA를 이.콜라이 XL1 세포에 전기천공하여, 대략 1.3×109개의 형질전환체를 수득하였다.
서열번호 3의 hu-M-IL1RAP 폴리펩타이드 작제물(2㎍/㎖)을 4℃에서 하룻밤 Maxisorp 플레이트 상에 코팅하였다. 제1 패닝 라운드를 위하여, 플레이트 및 파지 라이브러리를 1시간(플레이트) 또는 30분(파지 라이브러리) 동안 0.05% TWEEN® 20 및 1% BSA를 함유하는 PBS 완충액에서 차단시켰다. 플레이트를 세척 완충액(0.05% TWEEN® 20을 함유하는 PBS 완충액)으로 세척하고 진탕시키면서 2시간 동안 차단된 파지 라이브러리로 인큐베이션하였다. 세척 완충액으로 격렬하게 세척함으로써 비-특이적으로 결합된 파지를 제거하였다. 특이적으로 결합된 파지를 0.1N HCl로 용리시키고, 1/10th v/v 1.3M Tris 염기를 이용해서 중화시켰다. 비-특이적 상호작용은 1/10th v/v 1% BSA를 첨가함으로써 저해되었다.
제2 패닝 라운드는 차단 단계에 대해서 SUPERBLOCK™ PBS 완충액(Pierce) 및 0.05% TWEEN® 20의 사용을 위한 제1 예왜와 동일하였다.
3 내지 5 패닝 라운드를 위하여, 파지 라이브러리를 차단 완충액(3라운드에서 1% BSA를 가진 PBS 완충액 및 SUPERBLOCK™ PBS 완충액(Pierce) 및 4 및 5라운드에서 0.05% TWEEN® 20)으로 30분 동안 인큐베이션하고, 이어서 바이오티닐화 hu-M-IL1RAP의 농도를 1시간 동안 감소시키면서 인큐베이션하였다. Hu-M-IL1RAP-결합된 파지를 차단된 뉴트라비딘-코팅 플레이트 상에서 캡처하고, 세척 완충액으로 광범위하게 세척하고, 라운드 1 및 2에서와 같은 방식으로 용리시키고 중화시켰다. 최종 선택 라운드에서, 선택 엄격성을 증가시키기 위하여 1000x 비-바이오티닐화 hu-M-IL1RAP를 경쟁자로서 첨가하였다.
NGS를 이용해서 친화도 성숙 라이브러리로부터 서열을 추출하기 위하여, 파지미드 이중 가닥 DNA를 초기 파지 라이브러리(미선별 라이브러리)로부터 그리고 제2 및 제3 라운드의 용액 선택(선별된 라이브러리)으로부터 이.콜라이 XL-1 세포 보유 파지미드로부터 단리시켰다. 정제된 DNA는 Illumina 16s 라이브러리 제조 프로토콜(Illumina, Inc., 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)을 이용해서 VL 및 VH 영역의 앰플리콘을 생성하기 위하여 주형으로서 사용하였다. 시퀀싱 어댑터 및 이중-인덱스 바코드를 Illumina Nextera XT Index Kit (Illumina, Inc.)를 이용해서 추가하였다. Illumina MiSeq 상에서 시퀀싱을 위한 준비에서, 어댑터-결찰된 앰플리콘을 MiSeq 시약 Kit v3(600 사이클)(Illumina, Inc.)을 이용해서 표준 Illumina 라이브러리 변성 및 샘플 로딩 프로토콜을 시행하였다. 페어드-엔드 시퀀싱(paired-end sequencing)은 200 bp 내지 300 bp의 삽입 크기로 앰플리콘의 전체 길이를 커버하도록 수행되었다.
h11C5_C59Y/A43S 친화도 성숙 라이브러리의 NGS 데이터 분석
페어드-엔드 시퀀싱 데이터는 먼저 페어드-엔드 어셈블러(paired-end assembler) PANDAseq(예컨대, 문헌[Masella et al., BMC Bioinformatics, 13:31 (2012)] 참조)를 사용해서 조립하여 완전한 앰플리콘을 얻었다. 이어서, 식별된 앰플리콘을 이용해서 품질 제어(QC)를 수행하였으며, 여기서 각 앰플리콘은 서열의 삽입 또는 결실이 없고 정지 코돈이 없는 것에 대해서 체크하였으며, 각 CDR 서열은 단지 최대 하나의 NNK 돌연변이를 보유하지만 비-NNK 돌연변이가 없는 것으로 허용되었다. 위치 가중치 행렬은 모든 무작위화된 위치의 모든 돌연변이의 빈도를 계산함으로써 생성되었다. 각 돌연변이에 대한 풍부화비(enrichment ratio)는, 앞서 기재된 바와 같이, 선별된 샘플 내 주어진 위치에서의 주어진 돌연변이의 빈도를 비선별된 샘플에서의 매우 동일한 돌연변이의 빈도로 나눔으로써 계산하였다(Koenig et al., J. Biol. Chem., 290(36):21773-27896 (2015)). NGS 데이터의 분석은, 아래의 표 11에 열거되고 hu-M-IL1RAP에 대해서 고-친화도를 보유하는 항-IL1RAP 항체에서 초래되는 6개의 CDR의 각각에서의 광범위한 아미노산 치환을 식별하였다.
Figure pct00028
친화도 성숙 라이브러리로부터의 NGS 데이터의 추가의 분석은 아래의 표 12에 나타낸 최고 친화도 개선을 나타내도록 예측되는 아미노산 치환을 갖는 변이체 h11C5 항체의 선택된 서브세트에 대해서 계산된 풍부화비 및 예측된 친화도 개선을 초래하였다.
Figure pct00029
친화도 성숙 V L 또는 V H 영역을 갖는 Fab 변이체의 Biacore 분석
높은 풍부화비를 갖는 친화도 성숙 VL 또는 VH 라이브러리로부터 식별된 돌연변이는 Fab 단백질을 생성하기 위하여 8XHis 태그를 함유하는 포유류 Fab 발현 작제물에 단일, 이중 또는 삼중 돌연변이로서 클로닝하기 위하여 선택되었다. 친화도 성숙 VL 또는 VH 영역을 암호화하는 플라스미드는 HC:LC의 1:1 비를 이용해서 20 내지 30㎖ 발현을 위하여 Expi293F 세포(Thermo Fisher Scientific)에 형질감염시켰다. Fab 단백질을 1X 포스페이트-완충 식염수 pH 7.2(PBS)로 상청액 1.5X를 희석시키고 10mM 이미다졸을 첨가하고 배취 방식으로 2시간 동안 수지에 결합시킴으로써 HisPur Ni-NTA 칼럼을 이용해서 정제시켰다. 인큐베이션 후에, 슬러리를 칼럼에 로딩하고 수지를 20 칼럼 용적(CV)의 PBS + 20mM 이미다졸로 세척하였다. 재조합 Fab 분자를 5 CV PBS + 250mM 이미다졸로 용리시켰다. 정제된 Fab를 PD10 탈염 칼럼(GE Healthcare)을 이용해서 PBS로 완충액 교환하였다.
BIACORE™ 8K 기기를 이용해서 VL 또는 VH 영역에서 선택된 단일, 이중 및 삼중 돌연변이를 함유하는 정제된 Fab의 hu-M-IL1RAP에 대한 결합 친화도를 결정하기 위하여 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석을 사용하였다. 간단히 말하면, HBS-EP 완충액(0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20) 중 Biotin CAPture 시약(GE Healthcare)의 1:4 희석액을 2 ㎕/분 유량으로 칩 상에 적용하였다. 동력학 측정을 위하여, 5nM 바이오티닐화 hu-M-IL1RAP를 2차 플로우 셀(second flow cell: FC2)에서 대략 50 반응 단위를 달성하기 위하여 10 ㎕/분에서 캡처하였다. FC1은 참조로서 유지되었다. 다음에, 저(0.31nM)에서부터 고(20nM)까지 HBS-P 완충액(0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20) 중 Fab 단백질의 2배 연속 희석물을 25℃ 또는 37℃에서 주입하였다(유량: 10㎕/분). 센서그램을 기록하고, BIACORE ® 8K Evaluation 소프트웨어(버전 1.1.1.7442)를 사용해서 데이터 분석 전에 참조 및 완충액 차감을 수행하였다. 회합률(kon) 및 해리율(koff)은 간단한 1-대-1 랭뮈어(Langmuir) 결합 모델을 이용해서 계산하였다. 평형 해리 상수(KD)는 koff/kon의 비로서 계산하였다.
결과
친화도 성숙 Fab 변이체에 대한 Biacore 친화도 결과는 이하에 표 13에 요약되어 있다. 변이체의 다수는 향상된 결합 친화도를 나타내었다. 변이체 K13은 h11C5_C59Y/A43S의 입력 친계 Fab에 비해서 친화도가 9배 향상된 친계 서열에 A51Y 및 W92I 돌연변이가 도입되었다.
Figure pct00030
Figure pct00031
향상된 친화도를 갖는 조합된 V L 및 V H 영역 변이체의 Fab 단백질
가장 향상된 KD 값을 나타내는 Fab 변이체는 VL 및 VH 영역 변이체 둘 다를 포함하는 변이체를 생성하도록 VL 영역(K10, K13 및 K17) 및 VH 영역(H2 및 H3) 변이체로부터 선택되었다. 얻어진 조합 변이체의 BIACORE™ SPR 분석은 위에서 기재된 바와 같이 수행되었고, 그 결과는 아래의 표 14에 요약되어 있다. 조합 Fab 변이체 K10/H2, K13/H2, 및 K13/H3은 h11C5_C59Y/A43S의 입력 친계 Fab에 비해서 대략 12 내지 13배 향상된 친화도를 나타내었다.
Figure pct00032
실시예 9: 친화도 성숙 항-IL1RAP 항체의 검정
본 실시예는, Fab 및 전장 IgG 형태 둘 다에서 실시예 8에 기재된 친화도 성숙 인간화 항-IL1RAP 항체 변이체의 기능적 활성을 특성 규명하는데 사용되는 세포-기반 차단 검정을 예시한다.
재료 및 방법
세포주 및 HEK-Blue 검정. 이 실시예 9의 세포주 및 HEK-Blue 관련 검정은 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다.
전장 h11C5 IgG 변이체의 생산. 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 플라스미드를 HC:LC의 1:1비를 이용해서 30㎖ 발현을 위하여 Expi293F 세포(Thermo Fisher Scientific)에 형질감염시켰다. IgG를 칼럼 위에 상청액을 흐르게 하고, 20 칼럼 용적(CV)의 PBS+500mM NaCl로 세척하고, 20 CV의 PBS로 평형화시킴으로써 HiTrap MabSelect SuRe 칼럼(GE Healthcare)로 정제하였다. IgG를 5 CV 0.1M 아세트산+150mM NaCl, pH 3.0으로 용리시키고, 0.2 CV 1.0 M MOPS, pH 7로 즉시 중화시켰다. IgG를 2X PBS, pH 6.5 중에 S200 분취-등급 사이징 칼럼(GE Healthcare)을 이용해서 겔 여과를 통해서 더욱 정제시켰다.
결과
실시예 8의 친화도 성숙 Fab 변이체뿐만 아니라 변이체 항체의 전장 IgG 버전을 이용한 (실시예 4 및 7에서 사용된 바와 같은) HEK-Blue 검정은 hu-M-IL1RAP에 대한 결합 친화도의 관찰된 개선이 IL-1, IL-33 및 IL-36 신호전달 활성도를 차단함에 있어서의 개선과 상관 관계가 있는지의 여부를 결정하기 위하여 수행하였다. 도 5A, 5B 및 5C에 도시된 바와 같이, 실시예 8(즉, K10, K13, K17, K10/H2, K10/H3, K13/H2, K13/H3, K17/H2, K17/H3)에서의 최대 친화도를 보이는 9개의 Fab 변이체는 또한 HEK-Blue 검정에서 h11C5_C59Y/A43S의 친계 Fab에 비해서 IL-1, IL-33 및 IL-36 신호전달 활성도의 증가된 저해를 나타내었다. 9가지 친화도 성숙 Fab 변이체에 대해서 효력(IC50) 및 100nM에서의 저해 %는 아래의 표 15에 요약되어 있다.
Figure pct00033
동일한 친화도 성숙 변이체는 또한 무효과기 N297G 돌연변이를 가진 전장 IgG 항체로서 검정되었다. 도 5D 및 도 5F에 도시된 바와 같이, 유사한 결과가 각각 IL-1β 또는 IL-36α-자극된 HEK-Blue IL-1/IL-33 세포 또는 IL-33 세포(IL-36 수용체 IL1RL2를 일시적으로 발현)를 이용하는 검정에서 관찰되었다. 그러나, 도 5E에 도시된 바와 같이, 변이체의 전부가 아니라 대부분이 IL-33 자극된 HEK-Blue IL-1/IL-33 세포에 대해서 증가된 차단 활성도를 나타내었다. 전장 IgG 친화도 성숙 변이체에 대해서 효력(IC50) 및 100nM에서의 저해 %는 아래의 표 16에 요약되어 있다.
Figure pct00034
실시예 10: h11C5 변이체의 pH-의존적 결합
본 실시예는 pH 6 및 pH 7.4에서 hu-IL1RAP 및 cyno-IL1RAP를 결합하는데 있어서 실시예 9의 친화도 성숙 h11C5 변이체의 일부의 동력학을 예시한다. 11C5 변이체의 반감기를 생체내에서 지연시키기 위하여, 본 발명자들은 pH 6에서(중성 pH에서 친화도를 변화시키지 않고 유지하면서) 신생아 Fc 수용체인 FcRn에 대해서 h11C5의 친화도를 증가시키고자 추구하였다. 투여 시, IgG는 세포에 초기에 내재화되고, 이어서 엔도솜에서 처리한다(예컨대, 문헌[Kuo et al., MAbs, 3(5), 422-430 (2011)] 참조). 엔도솜의 산성화는 낮은 pH에서 고-친화도 상호작용인 FcRn에 대한 IgG Fc 단편의 결합을 용이하게 한다(예컨대, 문헌[Roopenian et al., Nature Reviews Immunology, 7(9), 715-725 (2007)] 참조). 세포 표면에 복합체로서 수송 후, IgG는 중성 pH에서 Fc에 대해서 FcRn에 대한 더 낮은 친화도로 인해 순환으로 도로 방출된다. 이 재순환 과정은 IgG를 분해로부터 보호하고, 이에 따라서 생체내에 이들의 긴 반감기에 기여한다.
낮은 pH에서 FcRn에 대해서 gG의 친화도를 증가시키는 돌연변이는 항체가 세포 표면으로 재순화되어 순환에 도로 들어가게 함으로써 생체내에서 치료용 항체의 더 큰 반감기를 초래할 수 있었다. 그러나, IL1RAP에 의한 치료용 분자의 표적-매개 약물 처분(target-mediated drug disposition: TMDD)은 FcRn에 의한 재순환을 방지할 수 있었다. 산성 pH에서 IL1RAP에 대한 비교적 빠른 오프-레이트("koff")를 가진 h11C5 변이체는 TMDD으로부터의 간섭을 제한할 수 있었고, FcRn 결합을 향상시키는 돌연변이로부터의 혜택을 가장 많이 받을 수 있다.
실시예 9의 h11C5 변이체가 낮은 pH에서 TMDD를 회피할 최대 기회를 갖는지를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 pH 7.4 및 pH 6에서 h11C5 변이체 결합 IL1RAP의 동력학을 측정하였다. 실시예 9로부터의 h11C5 변이체인 K17/H2(또는 "YKD")는 4종의 시험된 11C5 변이체의 pH 6에서 가장 빠른 koff를 갖는다. 이것은 YKD가 표적-매개 약물 처분(TMDD)을 회피할 최대 기회를 갖고 따라서 FcRn-결합 돌연변이로부터의 혜택을 가장 많이 받을 수 있었음을 시사한다.
재료 및 방법
pH 7.4 및 pH 6에서의 h11C5 IgG 변이체의 BIACORE SPR 분석: pH 7.4에서 4개의 h11C5 IgG 변이체 결합 hu-M-IL1RAP(서열번호 3) 및 cyno-M-IL1RAP(서열번호 8)의 BIACORE™ SPR 분석은, 0.6nM 바이오티닐화 hu-M-IL1RAP 또는 1.8nM cyno-M-IL1RAP를 칩 상에 캡처하고 저(0.103nM)에서 고(10nM)로 11C5 IgG의 3배 연속 희석물을 37℃에서 분석물로서 주사하면서, 실시예 8에 기재된 바와 같이 수행하였다. pH 6에서 11C5 변이체를 hu-M-IL1RAP 및 cyno-M-IL1RAP에 결합하기 위하여, 방법은, 또한 Biotin CAPture 시약(GE Healthcare)을 1:4로 희석시키는데 사용된 pH 6 가동 완충액(10mM MES pH 6, 150mM NaCl, 0.005% (w/v) P20)의 사용을 제외하고, pH 7.4에서 시작하는 것과 동일하다.
결과
pH 7.4 및 pH 6에서의 BIACORE SPR 분석에 대한 결과는 표 17에 요약되어 있으며, 여기서 KD는 (IgG가 이 포맷에서 분석물인 것을 고려해서) 측정된 겉보기 친화도(apparent affinity)이고, koff는 오프-레이트이다.
Figure pct00035
pH 6에서 h11C5 변이체 YKD의 더 빠른 오프-레이트(즉, "YIS에 대한 koff (6) 비"에 대한 최대 값)는 이 변이체가 표적-매개 약물 처분(TMDD)을 회피하는 최대 기회를 가질 가능성이 있을 것을 시사한다. h11C5-IL1RAP 복합체가 내재화되고 엔도솜 내에 처리된 경우, YKD 변이체는 다른 h11C5 변이체에 비해서 가장 빨리 IL1RAP로부터 해리된다. 이어서, FcRn은 유리 h11C5를 결합시키고 이를 세포 표면에 전달할 수 있었고, 약물이 순환계로 도로 방출되게 하였다. 따라서, h11C5 변이체 YKD는 중성 pH에서가 아니라 산성 pH에서 FcRn에 대해서 친화도를 증가시키는 Fc 영역에서 추가의 돌연변이로부터 가장 혜택을 받을 수 있다.
실시예 11: YTE 돌연변이를 갖는 h11C5 변이체의 생성
이 실시예는 낮은 pH에서 더 높은 친화도로 FcRn에 대한 IgG Fc 단편의 결합을 용이하게 하는 h11C5 변이체를 생성하는 방법 및 변이체를 더욱 특성규명하는 방법을 예시한다.
재료 및 방법
YTE 돌연변이를 갖는 항체의 생성: YKD/YTE 및 YIS/YTE를 생성하기 위하여, FcRn에 대한 Fc 단편의 친화도를 증가시키는 것으로 알려진 YTE 삼중 돌연변이 M252Y/S254T/T256E(Eu 지수로 넘버링됨, YTE)(예컨대, 문헌[Dall' Acqua et al., J Immunol 169(9): 5171-5180 (2002)] 참조)를 실시예 9 및 10에 기재된 h11C5 변이체인 YKD 및 YIS의 Fc 부분에 유전자 합성에 의해 도입하였다. 재조합 항체 YKD/YTE 및 YIS/YTE는 실시예 5에 기재된 바와 같이 생성하였다.
YTE 치환을 갖는 11C5 IgG 변이체의 BIACORE SPR 분석: pH 7.4 및 37℃에서 변이체 h11C5 항체, YIS, YIS/YTE, YKD 및 YKD/YTE의 hu-M-IL1RAP 및 cyno-M-IL1RAP에의 BIACORE™ SPR 결합 분석을 실시예 10에 기재된 바와 같이 수행하였다.
pH 6.0 및 7.4에서의 FcRn 결합의 검정: YKD 및 YKD/YTE의 인간 FcRn 및 cyno FcRn에 대한 결합 친화도를 결정하기 위하여, BIACORE™ 8K 기기에 의한 SPR 측정을 수행하였다. 간단히 말하면, 시리즈 S 센서 칩 CAP을 사용해서 결합 측정을 위하여 바이오티닐화 인간 FcRn 또는 cyno FcRn을 캡처하였다. Biotin CAPture 시약(GE Healthcare, 카탈로그 번호 28-9202-34)의 HBS-EP 완충액(0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20)으로의 1:4 희석액을 2 ㎕/분 유량에서 칩에 적용하였다. 10nM 바이오티닐화 인간 FcRn(Acro biosystems, 카탈로그 번호 FCN-H52W7) 또는 cyno FcRn(Acro biosystems, 카탈로그 번호 FCM-C5284)을 제2 플로우 셀(FC2)에서 대략 50개 반응 단위를 달성하기 위하여 10 ㎕/분에 캡처하였다. 제1 플로우 셀(first flow cell: FC1)은 참조로서 유지되었다. 다음에, 저(1.37nM)에서부터 고(1000nM) 농도까지 MES 완충액(10mM MES pH 6.0, 150mM NaCl, 0.005% 계면활성제 P20) 또는 HBS-P 완충액(0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20) 중 YKD 또는 YKD/YTE IgG의 3배 연속 희석물을 25℃에서 30 ㎕/분의 유량으로 주입하였다. 센서그램을 기록하고 BIACORE® 8K 평가 소프트웨어(버전 1.1.1.7442)에 의해 평가하기 전에 참조 및 완충액 차감을 적용하였다.
YTE 돌연변이를 갖는 h11C5 변이체의 비-특이적 결합을 결정하기 위한 바큘로바이러스(BV) ELISA: YIS/YTE 및 YKD/YTE의 비-특이적 결합은 플레이트를 PBS 중 1% BSA(0.05% Tween-20 무함유)로 차단한 것을 제외하고, 실시예 6에 기재된 바와 같이 BV ELISA에 의해 평가되었다.
결과
YTE 돌연변이를 가진 항체의 생성: YTE 치환을 가진 Fc 단편이 생성되었고, 이의 아미노산 서열은 표 2에 열거되어 있고 서열번호 327로서 첨부 서열 목록에서 제공된다.
YTE 돌연변이를 가진 h11C5 변이체의 BIACORE SPR 분석: YKD/YTE 및 YIS/YTE를 그들의 친계 분자 YKD 및 YIS에 대해서 각각 비교한 결합 결과는 표 18에 요약되어 있다.
Figure pct00036
KD는 겉보기 친화도를 측정하고(IgG가 이 실험 포맷에서 분석물인 것을 고려해서), koff는 오프-레이트이다. hu-M-IL1RAP 또는 cyno-M-IL1RAP에 대한 YKD/YTE 및 YIS/YTE의 친화도는 2-배 이내인 KD값의 비("KD YTE/KD 친계")로 나타낸 바와 같이 각각의 친계 분자의 친화도와는 유의하게 상이하지 않다. 따라서, YTE 치환의 부가가 IL1RAP의 결합에 영향을 미치지 않는다고 결론지어진다.
pH 6.0 및 7.4에서의 FcRn 결합의 검정: SPR 측정은 6.0 및 7.4의 pH값에서 YKD 및 YKD/YTE의 hu-FcRn 및 cyno-FcRn에 대한 결합 친화도를 결정하는데 사용되었다. 평형 해리 상수(KD)값은 pH 6.0 및 pH 7.4에서 YKD와 YKD/YTE 간의 인간 FcRn과 cyno FcRn 결합을 비교하기 위하여 정상 상태 분석을 이용해서 계산하였다. 표 19에 도시된 바와 같이, 결과는 YKD/YTE가 pH 7.4에서가 아니라 pH 6.0에서 인간 FcRn과 cyno FcRn 결합을 명백히 개선시키는 것을 나타낸다.
Figure pct00037
h11C5 YTE 변이체의 비-특이적 결합을 결정하기 위한 바큘로바이러스(BV) ELISA: 표 20에 도시된 바와 같이, YIS/YTE나 YKD/YTE 항체는 어느 것도 배지-대조 항체 샘플보다 더 높게 450㎚에서 검출 가능한 BV ELISA 흡광도 신호를 나타내지 않았다. 따라서, YTE 돌연변이의 도입은 BV 입자에 대한 비-특이적 결합을 도입하지 않았다.
Figure pct00038
실시예 12: YTE 돌연변이를 갖는 항-인간 IL1RAP 항체의 차단 활성도의 세포-기반 검정
이 실시예는 HEK-Blue 리포터에서의 IL-1, IL-33 및 IL-36 경로의 기능 저해 및 실시예 11에 기재된 YTE 돌연변이를 함유하는 변이체 항-인간 IL1RAP 항체를 이용하는 원발성 세포-기반 검정을 예시한다.
재료 및 방법
세포주 및 HEK-Blue 리포터 세포 검정: 세포주 및 HEK-Blue 리포터 검정은 실시예 2 및 4에 기재된 바와 같이 수행하였다.
원발성 인간 NK 세포 및 관련된 검정: 작용제 용량 반응 및 항체 차단 검정을 비롯하여 원발성 인간 NK 세포 및 관련된 검정은 실시예 7에서 앞서 기재되고 논의되었다. 본 실시예에서의 항체 차단 검정은 사용된 차단 항체, 즉 YKD/YTE 및 YKD(실시예 11에 기재됨)를 제외하고, 마찬가지 방식으로 수행하였다. 음성 및 양성 대조군은 실시예 7에 기재되었다. 저해%는 표시된 항체 농도를 이용해서 얻어진 값으로부터 음성 대조군으로 얻어진 값을 차감함으로써 계산하였다. 이어서, 음성 대조군-조절된 값은 양성 대조군과 관련하여 비를 결정하기 위하여 사용하였다. 음성 대조군값이 보간되지 않을 수 있었다면(예컨대, 검출 한계 미만), 저해%는 양성 대조군 단독과 비교하여, 표시된 항체 농도를 이용해서 얻어진 값의 비를 나타낸다. 인간 사이토카인 IL-33 및 IL-12는 상업적으로 획득하였다(Peprotech).
원발성 인간 폐 섬유아세포 및 관련된 검정: 사용된 원발성 인간 폐 섬유아세포(PHLF) 및 관련된 검정은 실시예 7에 기재된 바와 같았다. 양성 대조군은 작용제 단독(IL-1α 또는 IL-36β)의 존재 하에 PHLF를 나타낸다. 항체 차단 검정은 EC55 부근 또는 그보다 높은 작용제 농도에서 수행하였다. 음성 대조군은 작용제 또는 항체에 노출되지 않았던 PHLF를 나타낸다. 저해%는 원발성 인간 NK 세포 검정을 위하여 위에서 기재된 바와 같이 계산하였다. 완전 성숙 사이토카인을 생산하도록 처리된 인간 IL-36β는 인하우스에서 생성하였다. 인간 IL-1α는 상업적으로 획득하였다(Gibco).
원발성 인간 단핵구 및 관련된 검정: 단핵구 검정은 이하의 예외와 함께 실시예 7에 기재된 바와 같이 수행하였다: 단핵구는 96-웰 플레이트에 파종하고 실험적 사용 전에 3시간 회복 시간(5% CO2와 함께 37℃)을 부여하였다.
인간 표피 각질세포 및 관련된 검정: 다수의 신생아 포피로부터 단리된 인간 표피 각질세포(HEKn 혼주됨)는 Thermo Fisher Scientific(카탈로그 번호 13401)으로부터 얻었다. HEKn 세포를 해동시키고, 일반적인 제조사 지침에 따라서 계대배양하고, 1% 인간 각질세포 성장 보충제(HKGS) 카탈로그 번호 S-001-5) 및 1x 페니실린-스트렙토마이신 용액(Corning, 카탈로그 번호 30-002-CI)이 보충된 EpiLife® 배지(카탈로그 번호 M-EPI-500-CA)에 유지하였다. 항체 차단 검정을 위하여, HEKn 세포를 해동시키고, 이들이 80% 컨플루언시에 도달할 때까지 배양하였다. 이어서, 세포를 평탄한-바닥의 96-웰 플레이트 상에 10,000/웰로 플레이팅하고, 5% CO2와 함께 37℃에서 하룻밤(대략 18시간) 인큐베이션하였다. 하룻밤 인큐베이션 후, HEKn 세포를 11C5-YKD, 11C5-YKD/YTE 또는 적절한 항체 아이소타입 대조군(IgG Ctrl)의 용액에 노출시키고, 5% CO2와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고 나서, 작용제(EC60에서의 IL-36β)를 첨가하였다. 양성 대조군 조건(PC)은 세포, 성장 배지, 및 작용제(IL-36β)를 포함하였다. 음성 대조 조건(NC)은 세포 및 성장 배지만 포함하였다. 조직 배양액 상청액은 작용제 첨가 후 24시간에 수집하고, IL-8의 수준을 결정하기 위하여 ELISA가 수행될 때까지 -80℃에서 보관하였다. 인간 IL-8 ELISA 키트(Invitrogen/Thermo Fisher Scientific)는 제조사의 지시에 따라서 상청액 중 IL-8의 수준을 정량하기 위하여 사용되었다. 항체 차단 검정 전에, 작용제 및 길항제 용량-반응 곡선은 실시예 5에 기재된 바와 같이 EC50 및 IC50(각각)을 결정하기 위하여 생성되었다.
호염기구 세포 검정: 이하의 프로토콜은 PCT 공개 제WO2016077381A1호(본 명세서에 참조에 의해 원용됨)에 기재된 검정 방법으로부터 변경된 것이다. PBMC를 헤파린 나트륨(sodium heparin)(Stemcell Tech)에 수집된 말초 전혈로부터 단리시켰다. 혈액을 PBS로 1:1로 희석시켰다. 30㎖ 희석된 혈액을 15㎖ Ficoll Paque Premium(GE Healthcare 17-5442-03) 위에 층을 형성하고, 샘플을 브레이크 없이 20℃에서 400g에서 20분 동안 회전시켰다. PBMC-함유 층을 50㎖ 튜브에 옮기고, 50㎖ PBS로 2회 세척하였다. 세척된 PBMC를 PBS에 재현탁시키고, 20백만개 세포/㎖로 희석시키고, v-바닥 96 웰 플레이트의 웰당 1백만개 세포(50㎕)에 플레이팅하였다. PBS 중 4x 최종 농도에서 25㎕의 연속 희석된 항체 용액을 웰에 첨가하고, 플레이트를 5% CO2와 함께 37℃에서 인큐베이션하였다. 60분 후에, PBS 중 4x 최종 농도에서 25㎕의 IL-33(Peprotech 200-33)를 웰에 (100㎕ 최종 용적) 첨가하였다. 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하고 나서, 100㎕의 사전 가온된 Phosflow Fix 완충액 I(BD 557870)을 첨가하였다. 플레이트를 5% CO2와 함께 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하고, 이어서 500g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 세포를 FACS 완충액(PBS + 0.5% BSA + 0.05% 아자이드화나트륨)에 재현탁시켰다. 플레이트를 500g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 플레이트를 간단히 와류시킴으로써 세포 펠릿을 잔류 용적에 현탁시키고, 100㎕의 빙랭 Phosflow Perm 완충액 II(BD 558052)를 각각의 웰에 서서히 첨가하였다. 플레이트를 Perm 완충액 II에 -20℃에서 하룻밤 보관하였다. 다음 날, 플레이트를 500g에서 5분 동안 회전시키고, 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 실온에서 1시간 동안 50㎕의 FACS 완충액에서 이하의 항체로 염색하였다: 항-CD123 FITC(Ebiosciences 11-1239-42, 1:10으로 희석됨), 항-포스포-p38 PE(Cell Signaling Technology 6908S, 1:50으로 희석됨), 항-HLA-DR BV421(Biolegend 307636, 1:20으로 희석됨) 및 항-CD203c APC(Biolegend 324610 1:200). 몇몇 웰에서, 포스포-p38 양성으로 염색된 모집단의 게이팅을 용이하게 하기 위하여 아이소타입 대조군(Cell Signaling Technology 4752S)을 항-포스포-p38 PE 항체 대신에 치환하였다. 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고, FACS 완충액에 재현탁시키고, CytoFLEX 유세포분석기(Beckman Coulter) 상에서 판독하였다. 보정 대조군은 Ultracomp 비즈(ThermoFisher 01-2222-41)를 이용해서 제조하고, 세포와 함께 가동하였다. 포스포-p38 염색은 Flowjo 소프트웨어(BD)를 이용해서 CD123+ HLADR-호염기구에서 분석하였다. CD203c 염색은 CD123+ HLADR- 상에서 기초하여 게이팅된 호염기구의 동일성을 검증하기 위하여 사용하였다. CD123+ HLADR- 호염기구로부터의 포스포-p38-양성 데이터 %는 검정에서 항체 IC50값을 결정하기 위하여 GraphPad Prism 7 소프트웨어를 이용해서 분석하였다. 작용제 용량 반응은 항체 용량 반응으로 시행되었다. 항체 용량 반응으로 인큐베이션된 세포를 종래 실험에 기초하여 추정된 EC50에서 작용제로 자극시켰다. 양성 대조군은 추정된 EC50에서 작용제로 처리하고 항체 용액 대신에 PBS로 처리하였다. 음성 대조군은 항체 및 작용제 용액 둘 다 대신에 PBS로 처리하였다. 데이터는 농도에 대해서 2개 반복체로, 평균 ± SD로서 플로팅된다.
CD4 T 세포 검정: 이하의 프로토콜은 문헌[Komai-Koma et al., Immunobiology, 221(3):412-417 (2016)]에 기재된 방법에 기초하고 있다. 평탄한-바닥 96 웰 플레이트를 100㎕의 3㎍/㎖ 항-CD3 항체(Invitrogen 16-0037-85)로 4℃에서 하룻밤 코팅하였다. PBMC는 위에서 기재된 바와 같이 헤파린 나트륨(Stemcell Tech)에 수집된 말초 전혈로부터 단리시켰다. CD4+ T 세포를 제조사의 지시에 따라서 음성 선택(Miltenyi Biotec 130-096-533)을 이용해서 PBMC로부터 단리시켰다. 단리 후, 세포를 T 세포 배지(RPMI-1640, 5% 열-불활성화된 인간 A/B 혈청, 100 U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 1x MEM 비필수 아미노산, 1mM 피루브산나트륨)에 500,000 세포/㎖에서 재현탁시켰다. 항-CD3 코팅된 플레이트를 PBS로 1회 세척하고, 50,000 CD4+ 세포(100㎕)를 웰에 대해서 첨가하였다. 항체를 T 세포 배지에서 4x 최종 농도에서 연속 희석시키고, 각 웰에 50㎕ 항체 용액을 첨가하였다. 플레이트를 5% CO2와 함께 37℃에서 인큐베이션하였다. 1시간 후에, 4x 최종 농도에서 IL-33(Peprotech 200-33) 및 IL-12(Peprotech 200-12)를 함유하는 50㎕ T 세포 배지를 각 웰에 첨가하고(총 200㎕, 10 ng/㎖ 최종 농도 IL-12), 플레이트를 인큐베이터로 되돌렸다. 72시간 후에, 통상의 IFN-γ ELISA 키트(Invitrogen 88-7316-88)를 이용해서 T 세포 상청액 중 IFN-γ 수준을 측정하였다. 데이터를 보간하고, 검정에서 항체 IC50값을 결정하기 위하여 GraphPad Prism 7 소프트웨어를 분석하였다. 작용제 용량 반응을 항체 용량 반응과 함께 시행하였다. 항체 용량 반응으로 인큐베이션한 세포를 종래 실험에 기초하여 추정된 EC50으로 작용제로 자극시켰다. 양성 대조군은 항체 용액 대신에 T 세포 배지 및 추정된 EC50에서 작용제로 처리하였다. 음성 대조군은 항체 및 IL-33 대신에 T 세포 배지로 처리하는 한편, IL-12 최종 농도는 10 ng/㎖로 유지하였다. 저해%는 총 반응 크기로 나눈 피크 항체 농도에서의 반응의 저감으로서 계산되었다: 저해 % = 100% * (양성 대조군 - 처리된 항체) / (양성 대조군 - 음성 대조군). 데이터는 항체 농도당 세 벌의 평균 ± SEM으로서 플로팅된다.
결과
HEK-Blue 검정에서의 IL-1, IL-33 및 IL-36 경로의 기능 저해: h11C5 변이체 YKD의 차단 효력 및 효능이 YTE 돌연변이의 첨가에 의해 변형되지 않은 것을 확인하기 위하여, HEK-Blue IL-1/IL-33/IL-36 차단 검정에서의 YKD 및 YKD/YTE의 기능 저해의 비교는 실시예 2 및 4에 기재된 바와 같이 수행하였다. 도 6A, 도 6B 및 도 6C에 도시된 바와 같이, YKD("11C5-YKD") 및 YKD/YTE("11C5-YKD/YTE")는 IL-1β, IL-33 및 IL-36β 자극된 세포에서 유사한 차단 활성도를 보였다. IL1β 자극된 세포에 의하면, YKD 및 YKD/YTE는 동일한 효력(IC50 = 0.51nM) 및 100nM에서의 거의 완전 저해 각각 97% 및 98%를 갖는다. IL-33 자극된 HEK-Blue 세포에 대해서, YKD 및 YKD/YTE는 둘 다 3nM 부근에서 효력(11C5-YKD IC50 = 3.15nM; 11C5-YKD/YTE IC50 = 3.3nM), 100nM에서 거의 완전 저해(YKD 및 YKD/YTE에 대해서 각각 95% 및 97% 저해)를 나타내었다. 마지막으로, HEK-Blue 세포가 IL-36β로 자극된 경우, 두 분자는 100nM에서 98% 이상의 저해와 함께 0.9nM (IC50)의 효력으로 저해하였다. 요약하면, 인간화 변이체 항-hu-IL1RAP 항체 YKD 및 YKD/YTE는 HEK-Blue IL-1, IL-33 및 IL-36 검정에서 SEAP 생산의 거의 완전한 차단 및 견줄 만한 효력을 나타내었다.
YKD/YTE 및 YKD는 원발성 세포에서 IL-1, IL-33 및 IL-36 활성화를 저해한다: 실시예 7에 논의된 바와 같이, HEK-Blue 리포터 세포주는 IL-1, IL-33 및 IL-36 경로의 활성화 후 11C5 변이체의 차단 활성도를 결정하기 위하여 신속 검정을 제공할 수 있다. h11C5 변이체의 차단 활성도의 추가의 특성규명은 원발성 인간 세포 기반 실험을 이용해서 더욱 생리학적 관련성을 이용하는 검정에서 수행되었다. 실시예 7에 기재된 원발성 세포 검정 이외에, 본 실시예는 인간 표피 각질세포(HEKn), 호염기구 및 CD4 T-세포를 이용하는 기능 저해 검정을 포함한다.
인간 단핵구(PHMO) 및 PHLF에서의 검정은 YKD 및 YKD/YTE가 원발성 인간 세포에서 IL-1 경로를 차단함에 있어서 견줄 만한 효력 및 효능을 갖는 것을 확인하는데 사용되었다. 도 7에 도시된 바와 같이, 원발성 인간 단핵구(PHMO)가 YKD 또는 YKD/YTE의 존재 하에 IL-1β로 자극된 경우, IL-6 생산의 완전 저해가 관찰되었다. 두 항체는 유사한 효력(YKD 및 YKD/YTE에 대해서 각각 IC50= 63pM 및 158pM)을 입증하였다. PHLF는 YKD/YTE, YKD 또는 아이소타입 대조군의 존재 하에 IL-1α(EC55)로 자극하였다. 도 8의 플롯에 의해 나타낸 바와 같이, h11C5 항체 변이체의 존재는 IL-1α 자극된 PHLF에서 IL-8 생산의 거의 완전 저해(YKD/YTE 및 YKD에 대해서 각각 98% 및 99%)를 초래하였고, 두 항체에 대해서 유사한 IC50값이 관찰되었다(YKD/YTE 및 YKD에 대해서 각각 IC50 = 6.47nM 및 9.10nM) 요약하면, 검정 결과는 YKD/YTE 및 YKD가 IL-1β 자극된 PHMO에서 IL-6 생산의 완전 저해 및 IL-1α 자극된 PHLF에서 IL-8 생산의 완전한 차단을 비롯하여 견줄 만한 효능 및 효력을 나타내는 것을 입증한다.
HEKn 세포 및 PHLF 중 검정은 YKD/YTE 및 YKD가 IL-36 경로를 차단함에 있어서 견줄 만한 효력 및 효능을 나타낸 것을 검증하기 위하여 사용되었다. IL-36 수용체, 및 이의 수용체 보조 단백질(IL1RAP)은, 인간 각질세포 상에서 발현되는 것으로 알려져 있다(예컨대, 문헌[Ding et al., Oncotarget, 9(2) 2895-2901 (2017)] 참조). IL-36β로 자극된 HEKn 세포는 IL-8을 생산하는데, 이는 표준 ELISA를 통해서 상청액 중에서 검출될 수 있다. YKD/YTE 및 YKD가 IL-36β 자극된 HEKn 세포에서 IL-8 생산을 차단할 수 있는지를 결정하기 위하여, HEKn 세포를 YKD/YTE, YKD 또는 아이소타입 대조군(IgG ctrl)의 연속 희석물로 인큐베이션하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, 두 YKD 및 YKD/YTE가 IL-8 생산의 완전 저해(100%)를 입증하였다. 두 변이체는 유사한 효력을 나타내었는데, IC50값은 YKD 및 YKD/YTE에 대해서 각각 1.39nM 및 1.16nM이었다. 도 10에 도시된 바와 같이, YKD/YTE 및 YKD가 IL-36β 자극된 PHLF에서 IL-8 생산을 차단하는 능력에 대해서 시험된 경우, 이들은 둘 다 IL-8 생산의 완전 저해를 나타내었다. 게다가, 두 항체 변이체는 유사한 저해 효력(YKD/YTE 및 YKD에 대해서 각각 IC50 = 0.50nM 및 0.39nM). 요약하면, YKD/YTE 및 YKD는 IL-36β 자극된 HEKn 세포 및 IL-36β 자극된 PHLF에서 IL-8 생산을 차담에 있어서 견줄 만한 효능 및 효력을 갖는다.
검정은 또한 YKD/YTE가 원발성 인간 NK 세포, 호염기구 및 CD4+ T 세포에서 IL-33 경로를 차단할 수 있었던 것을 확인하였다. 실시예 7에 기재된 바와 같이, 검출 가능한 IFN-γ를 생산하는데 실패한 NK 세포가 IL-12에만 노출된 것과는 달리, IL-12의 존재하에 IL-33으로 자극된 원발성 인간 NK 세포는 IFN-γ를 생산하였다. 도 11에 도시된 바와 같이, IFN-γ는 아이소타입 대조 항체로 인큐베이션한 NK 세포의 상청액에서 검출 가능하였지만, YKD/YTE 또는 YKD에 의한 인간 NK 세포의 치료는 거의 모든 IFN-γ 생산을 차단하였다(YKD/YTE 및 YKD에 대해서 각각 96% 및 97% 저해). 두 항체에 대해서 관찰된 IC50값은 YKD/YTE에 대해서 1.32nM이었고, YKD에 대해서 2.93nM이었다. 호염기구는 천식 환자의 폐에서 증가된 수로 관찰되었다(예컨대, 문헌[Schwartz et al., European Journal of Pharmacology, 778: 90-95 (2016)] 참조). YKD/YTE는 호염기구의 IL-33 자극을 차단하는 능력에 대해서 시험되었다. PBMC의 IL-33 자극은 호염기구 중 p38 MAPK의 인산화를 초래하였다. PBMC는 YKD/YTE로 1시간 동안 인큐베이션하고 나서, 추정된 EC50에서 IL-33으로 20분 자극시켰다. 도 12에서의 결과로 나타낸 바와 같이, YKD/YTE는 호염기구에서 p38 인산화를 본질적으로 차단하였고(99% 저해) IC50는 작용제 EC56에서 41nM이었다. CD4+ T 세포에서 YKD/YTE 효능 및 효력을 조사하기 위하여, CD4+ T 세포를 IL-33 및 IL-12으로 공자극시키고 IFN-γ 생산을 검정하였다. CD4+ T 세포는 YKD/YTE로 1시간 동안 인큐베이션하고 나서, IL-12로 10 ng/㎖에서 그리고 IL-33으로 추정된 EC50에서 자극시켰다. 도 13에 도시된 바와 같이, YKD/YTE는 작용제 EC34에서 44nM의 IC50으로 IFN-γ 생산(89% 저해)을 거의 완전히 차단하였다. 요약하면, YKD/YTE 및 YKD는 IL-33 자극된 원발성 인간 NK 세포에서 유사한 차단 효력 및 효능을 입증하였다. 게다가, YKD/YTE는 호염기구에서 p38 MAPK의 IL-33 유도 인산화를 완전히 차단하고 IL-33 자극된 CD4+ T 세포에서 IFN-생산을 거의 완전히 차단하였다.
따라서, 본 실시예 12의 결과는 YKD/YTE 및 YKD가 기재된 모든 원발성 인간 세포 검정 및 세포주(HEK-Blue 리포터 세포주)에서 IL-1, IL-33 및 IL-36 활성화를 차단하는것을 입증하고 있다. 그 결과는 PHLF 및 PHMO에서의 IL-1 활성화, NK 세포, 호염기구 및 CD4 T 세포에서의 IL-33 활성화, 및 PHLF 및 HEKns에서의 IL-36 활성화의 거의 또는 완전한 봉쇄를 포함한다. 또한, YKD/YTE 및 YKD는 수행된 기능적 검정 모두에서 견줄 만한 효능 및 효력을 나타내었다.
실시예 13: 항-인간 IL1RAP 항체 변이체의 세포독성의 결여
본 실시예는 항-인간 IL1RAP 항체 YKD/YTE, 11C5-N297G 및 YKD의 세포독성의 결여를 입증하는 항체-의존적 세포 세포독성(ADCC), 보체-의존적 세포독성(CDC) 및 항체-의존적 세포 식균 작용(ADCP)의 검정을 예시한다.
재료 및 방법
시약: 검정에 사용되는 항체는 (실시예 11에 기재된 바와 같이) YKD/YTE; (실시예 8에 기재된 바와 같이) YKD; 11C5-N297G(실시예 5 및 7에 기재된 바와 같이, N297G 돌연변이를 함유하는 친계 11C5 분자); 11C5 wt(친화도를 증가시키는 N297G 돌연변이 및 YKD 돌연변이를 결여하는 친계 11C5 분자); 아이소타입 대조군 hIgG1(N297G); 및 세포독성 활성도를 갖는 것으로 알려진 양성 대조군으로서의 항-CD20 항체인 리툭시맙(Rituximab)(Genentech, 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재)이었다. 이하의 세포주, 즉, 주르카트, Daudi 및 THP-1(ATCC, 버지니아주 머내서스 소재)가 사용되었다. PBMC, 원발성 인간 호중구 및 원발성 인간 단핵구는 Stemcell Technologies로부터 얻었다. 주르카트 세포주는 이의 유의한 IL1RAP 발현으로 인해 대조군으로서 사용되었다. CD20을 발현하는 Daudi 세포주는 추가의 양성 대조군으로서 사용하였고 항-CD20 항체인 리툭시맙에 대한 표적 세포주로서 기능하였다.
ADCC 검정: YKD/YTE 및 관련된 분자가 ADCC 활성도를 나타내는지의 여부를 결정하기 위하여, NK 세포가 단핵구, 호중구 또는 주르카트 세포로 이루어진 표적 세포에 대해서 효과기 세포로서 사용되었다. 8:1의 효과기:표적(E:T)비가 검정에 적용되었다. 표적 세포는 CellTrace Violet 염색(Invitrogen)으로 표지되었다. 표지화 후, 표적 세포(96-웰 플레이트에 웰당 1×104개 세포)를 4가지 상이한 농도로 표시된 항체와 혼합하고, 이어서 RPMI 완전 배지에 NK 세포(96-웰 플레이트 내 웰당 8×104개 세포)와 더욱 혼합하였다. 반응은 37℃에서 5시간 동안 진행되었다. 인큐베이션 후에, 세포를 PBS로 1회 세척하고, 이어서 프로피듐 아이오다이드(PI)(Life Technologies)로 15분 동안 염색하였다. 이어서 세포를 CytoFLEX 유세포분석기(Beckman Coulter) 및 Flowjo 소프트웨어(BD)를 이용해서 분석하였다. 세포사는 CellTrace Violet 염색된 살아있는 표적 세포 모집단 내에 PI 염색된 세포의 백분율에 기초하여 계산하였다.
CDC 검정: YKD/YTE 및 관련된 분자가 디스플레이ed CDC 활성도를 나타내는지를 결정하기 위하여, Quidel(카탈로그 번호 A113, 캘리포니아주 샌디에고 소재)로부터 정상 인간 혈청이 세포독성 효과기로서 사용되었고, 20%의 혈청이 검정 배지에 적용되었다. 표적 세포(인간 단핵구, 호중구 및 주르카트 세포)는 CellTrace Violet 염색으로 표지화되었다. 표지화 후, 표적 세포(웰당 5×104개 세포, 96-웰 플레이트)를 4개의 상이한 농도에서 표시된 항체와 혼합하고, 이어서 AIM-V 배지 CTSTM(카탈로그 번호 0870112-DK, Life Technologies)에서 정상 인간 혈청(20%의 최종 농도)과 더욱 혼합하였다. 반응물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 1회 세척하고, 이어서 PI로 15분 동안 염색하였다. ADCC 검정에 대해서 앞서 기재된 바와 같이, 세포 샘플은 유세포 분석을 이용해서 분석하고, 세포사 퍼센트(세포독성)를 결정하였다.
ADCP 검정: ADCP 활성도가 YKD/YTE 및 관련된 분자에 대해서 존재하는 지를 확인하기 위하여, 인간 THP-1 유래 대식세포 세포는 효과기 세포로서 사용되었고, 표적 세포는 인간 단핵구, 호중구, 주르카트 또는 Daudi 세포로 이루어져 있다. THP-1 세포는 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)(Sigma Aldrich)로 2일 동안 처리하고, 이어서 IFN-γ(50 ng/㎖) 및 지질다?韜?(LPS)(Sigma Aldrich)로 더욱 자극하였다. ADCP 반응에 대한 E:T비는 2:1이었다. 표적 세포(인간 단핵구, 호중구, 주르카트 또는 Daudi 세포)는 CellTrace Violet 염색으로 표시하고, THP-1 세포는 PKH26 표지화 키트(카탈로그 번호 PKH26PCL-1KT, Sigma)로 표지하였다. 표지화 후, 표적 세포(96-웰 플레이트에서 웰당 5×104개 세포)를 4가지 상이한 농도에서 표시된 항체와 조합하고, 이어서 RPMI 완전 배지에서 THP-1 유래 대식세포 세포(96-웰 플레이트에서 웰당 1×105개 세포)와 더욱 혼합하였다. 반응물을 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 CellTrace Violet(표적 세포를 식별하기 위한 PB450 채널) 및 PKH26 형광(THP-1 유래 대식세포 효과기 세포를 식별하기 위한 PE 채널)의 형광에 대해서 유세포 분석에 의해 분석하였다. 세포 식균 작용은 이중 형광인 세포에 의해 나타내고, 즉, 형광은 PB450 및 PE 채널 둘 다에서 관찰되었다. 식균 작용 비는 표지화된 표적 세포에 비해서 이중 형광을 가진 세포의 수로서 계산된다.
결과
IL1RAP는 호중구 및 단핵구와 같은 인간 혈액 세포에서 발현되고, 따라서, 항-IL1RAP 항체, 예컨대, YKD/YTE가 각각 생체내 세포독성을 초래할 수 있는 ADCC, CDC 또는 ADCP 활성도를 나타내는 정도를 결정하는 것은 추가의 임상 개발을 위하여 중요하다. YKD/YTE에 대한 ADCC, CDC 또는 ADCP 활성도의 정도를 결정하는 검정은 위에서 기재된 바와 같이 수행하였다. 표 21(하기)에 요약된 바와 같이, 항-IL1RAP 항체, 11C5-N297G, YKD, YKD/YTE는 검정의 세포독성 활성도를 나타내지 않았다. ("+"는 양성 세포독성을 나타내고 "-"는 세포독성이 없는 것을 나타낸다).
Figure pct00039
표 21의 결과로 나타낸 바와 같이, YKD/YTE, 11C5-N297G 및 YKD는 인간 단핵구 및 호중구 또는 주르카트 세포에 대한 세포독성 효과를 나타내지 않았다. 효과기 기능을 무효로 하는 N297G 돌연변이를 결여하는 친계 분자 11C5 wt는 CDC 또는 ADCP 검정에 의해 측정된 바와 같은 세포독성을 나타내지 않았지만, ADCC 검정에서 일부 약한 활성도를 나타냈다. 3가지 검정에 있어서, 양성 대조군 항체인 리툭시맙은 예상된 수준의 세포독성 활성도(데이터 미제시)를 나타내었다. 요약하면, 항-IL1RAP 항체 YKD/YTE, 11C5-N297G 및 YKD는 ADCC, CDC 및 ADCP 활성도를 평가하는 검정에 의해 결정되는 바와 같이 세포독성 활성도를 나타내었다.
실시예 14: 변이체 항-인간 IL1RAP 항체의 약동학
본 실시예는 YKD 및 FcRn에 대한 결합 친화도를 개선시키는 Fc 영역의 변화를 갖는 YKD의 변이체인 YKD/YTE의 약동학(PK)을 특성하기 위하여 시노몰구스 원숭이에서 수행된 연구를 예시한다. 연구 1 및 2는 넓은 용량 범위에 걸친 항체의 PK를 특성규명하고 잠재적인 표적 매개 청소율 기전을 정량화하기 위하여 1 내지 40 ㎎/㎏의 범위의 단일 정맥내(IV) 용량에서 YKD의 PK를 조사하였다. 연구 3은 YKD 약동학에 대한 YTE 돌연변이의 영향을 결정하기 위하여 시노몰구스 원숭이에서 3 내지 40 ㎎/㎏의 범위의 단일 정맥내 IV 용량에서 변이체 YKD/YTE의 PK를 조사하였다.
재료 및 방법
연구 설계 및 약동학 샘플링 스케줄: 두 연구(1 및 2)는 시노몰구스 원숭이에서 YKD의 PK를 조사하기 위하여 수행하였다. 추가의 연구 3은 YKD/YTE의 PK를 조사하기 위하여 행하였다. 모든 연구는 IV 투여를 이용하였다. 시험 물품은 pH 5.5에서 200mM 아르기닌 석시네이트로 제형화하였다. 혈액을 이하의 시점에서 각 동물의 요골측피부정맥을 통해서 행하였다: 투여 전, 10분, 2시간, 8시간, 및 제1, 2, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 24, 28일. PK 샘플을 혈청으로 가공처리하였다. 연구 설계의 요약은 표 22(하기)에 나타낸다.
Figure pct00040
약물 농도를 측정하기 위한 생분석 검정: 원숭이 혈청에서의 IL1RAP 특이적 항체의 농도는 0.2% 원숭이 혈청 기질에서의 제로 표준품 + 50 내지 0.78 ng/㎖의 작업 범위를 가진 7개 표준품으로부터 생성된 표준 곡선을 이용해서 교정된 ELISA 검정을 이용해서 측정되었다. QC 샘플은 40 ng/㎖, 8 ng/㎖ 및 2 ng/㎖의 농도에서 0.2% 원숭이 혈청에서 제조되었다. 인간 IL1RAP 단백질(서열번호 3)의 세포외 도메인을 미량정량 플레이트 상에 코팅하고, 이어서 투여된 샘플, 교정 표준품 및 품질 제어 샘플로부터 항-IL1RAP 항체를 포착하는데 사용하였다. 포착된 항-IL1RAP 항체는 서양고추냉이 과산화효소(HRP)와 접합된 염소 항-인간 IgG 다클론성 항체에 의해 검출되었다. 색소생산성 기질인 테트라메틸벤지딘(TMB)을 첨가하여 HRP와 반응하였다. 이어서, 반응을 산 용액에 의해 중지시켜 각 웰에 포착된 항-IL1RAP의 양에 비례하는 흡광도 신호를 달성하였다. 교정 표준품의 신호 강도 및 이들 각각의 공칭 농도는 가중치부여된 4 파라미터 로지스틱(4 Parameter Logistic: 4PL) 모델을 이용해서 적합화시켜 교정 방정식을 생성하였다. 이 방정식을 이용해서, 각 샘플 내 항-IL1RAP의 농도는 이중 결정의 평균으로부터 계산되었다.
약동학 분석 방법: 연구 1 및 2로부터의 데이터는 YKD의 PK 파라미터를 추정하기 위하여 조합하였다. 연구 3으로부터의 데이터는 YKD-YTE의 PK 파라미터를 추정하기 위하여 사용되었다. 구획화 모델링 및 파라미터 추정은 PK/PD 모델링 소프트웨어 ADAPT V를 사용해서 행하였다(D'Argenio, D.Z. et al., ADAPT 5 User's Guide: Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Systems Analysis Software, Biomedical Simulations Resource, Los Angeles, CA. (2009)). 각 투여군에 대해서, 군 평균 농도-시간 프로파일을 우선 생성하고; 이어서 다회 용량 군으로부터의 군 평균 농도-시간 프로파일을 각종 후보 모델 구조에 동시에 적합화시켰다. 두 성별로부터의 데이터를 합하여, 외관 검사 시 유의한 성별 차이의 결여에 기초해서, 군 평균 농도-시간 프로파일을 계산하였다. 모든 분석적으로 보고 가능한 PK 데이터는 구획화 데이터 분석에 포함되었다.
모델 선택은 Akiake 정보 표준(Akiake Information criterion: AIC)을 이용해서 가이드되었다. 파라미터는 최대 우도 추정 방법을 이용해서 추정하였다((D'Argenio, D.Z., et al., ADAPT 5 User's Guide: Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Systems Analysis Software, Biomedical Simulations Resource, Los Angeles, CA. (2009)). 도 14A에 묘사된 비선형 2-구획 모델은 군 평균 데이터 최적화를 기술하는 것으로 발견되었다.
결과
YKD 및 YKD/YTE의 군 평균 혈청 농도의 시간 프로파일은 각각 도 14B 및 도 14C에 도시되어 있다. 두 항체에 대해서, 농도는 낮은 용량 대 높은 용량에서 더 신속하게 감소되었는데, 이는 표적 IL1RAP에 대한 결합으로 인해 마찬가지로 1 내지 40 ㎎/㎏의 용량 범위에 걸쳐 비선형 PK를 시사한다. 군 평균 데이터는 위에서 기재된 바와 같은 비선형의 2개 구획화 모델에 적합화되었고, 도 14A에 도시되어 있다. 항-인간 IL1RAP 항체 YKD 및 YKD-YTE에 대한 얻어지는 PK 파라미터 추정치는 표 23(하기)에 요약되어 있다.
Figure pct00041
변이체 항-hu-IL1RAP 항체 YKD에 대한 선형 청소율(CLt) 및 t1/2은 각각 6.3 ㎖/일/㎏ 및 7.4일이었다. 이들 값은 시노몰구스 원숭이에서 IgG1에 대해서 예상된 범위 내였다. 항-hu-IL1RAP 항체 변이체 YKD/YTE는 감소된 CLt(4.9 ㎖/일/㎏)을 나타냈고 YKD에 비해서 t1/2(11.9일)를 증가시켰는데, 이는 YKD/YTE 변이체가 시노몰구스 원숭이에서 YKD에 비해서 향상된 PK 특성을 갖는 것을 입증하였다.
실시예 15: 항-인간 IL1RAP 항체의 에피토프 잔기 매핑
본 실시예는, h11C5 변이체, K13/H3(또는 "YIS") 및 K17/H3(또는 "YKS")의 결합에 중요한 인간 IL1RAP 잔기를 식별하기 위하여, 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing: NGS)과 커플링된 파지 디스플레이 기술을 이용하는 방법을 예시한다. 인간 IL1RAP 변이체의 라이브러리는 파지 상에 표시되었고, 라이브러리는 YIS, YKS 또는 참조 항체에 대해서 파지 패닝에 적용되었다. 항체에 대한 결합이 유지된 인간 IL1RAP 변이체를 보유하는 파지를 정제하고, 인간 IL1RAP 서열을 NGS에 의해 얻었다. 참조 항체 결합에는 해롭지 않지만 YIS 또는 YKS 결합에 해로운 인간 IL1RAP에 대한 돌연변이를 식별하고, 에피토프 잔기로서 정의하였다.
재료 및 방법
Ser21 내지 Lys350의 인간 IL1RAP(서열번호 1)의 아미노산 서열은 파지 상에 표시되도록 선택되었다. 실시예 2(상기)의 표 5에 기재된 바와 같이 11C5는 인간 IL1RAP의 도메인 3에 결합한다. 따라서, 인간 IL1RAP의 변이체를 표시하는 파지 라이브러리는 IL1RAP의 도메인 3에서 단지 20개의 아미노산 전부(서열번호 1의 Lys238 내지 Lys350)를 암호화하는 NNK 축퇴 코돈을 이용하는 잔기 무작위화에 의해 작제되었다. 돌연변이유발은, 돌연변이유발 올리고뉴클레오타이드가 단지 하나의 NNK 돌연변이를 라이브러리의 각 구성원 내 인간 IL1RAP 도메인 3 잔기에서 일어나도록 설계된 것을 제외하고 실시예 8에 기재된 바와 같이 수행되었다. 얻어지는 라이브러리 DNA를 이.콜라이 XL1 세포에 전기천공하여 대략 4.6×109개의 형질전환체를 수득하였다.
파지 패닝의 제1 라운드는 인간 IL1RAP 도메인 1(서열번호 4)에 결합하는 변이체 항체 YIS, YKS 또는 참조 항체 1㎍/㎖가 Maxisorp 플레이트 상에 코팅된 것을 제외하고 실시예 8에 기재된 바와 같이 수행되었다. 인간 IL1RAP 도메인 1에 결합하는 참조 항체는 11C5 항체를 인간 IL1RAP 도메인 3에 결합하는데 반드시 유해한 것은 아니지만 인간 IL1RAP의 일반적인 접힘에 유해한 돌연변이를 식별하는 과정에서 대조군으로서 역할한다.
파지 패닝의 제2 내지 제4 라운드는, 차단된 파지 라이브러리가 1시간 동안 바이오티닐화 YIS, YKS 또는 참조 항체의 농도를 감소시키면서 인큐베이션한 것을 제외하고 실시예 8에 기재된 바와 같이 수행하였다. 항체-결합된 파지는 차단된 뉴트라비딘-코팅된 플레이트 상에 포착시키고, 세착 완충액으로 광범위하게 세척하고 라운드 1에서와 같은 방식으로 용리 및 중화시켰다.
초기 파지 라이브러리(미선별 샘플) 및 패닝의 라운드 2 내지 4(선별된 샘플)의 서열은 인간 IL1RAP 도메인 3 앰플리콘이 NGS에 대해서 생성된 것을 제외하고 실시예 8에 기재된 바와 같이 NGS를 사용해서 추출되었다.
NGS 후에, 페어링된-단부 시퀀싱 데이터 조립 및 시퀀싱 리드(sequencing read)의 품질 제어는 실시예 8에 기재된 바와 같이 수행되었다. 파지 패닝의 라운드 2 내지 4로부터의 리드는 데이터 분석을 위하여 함께 혼주되었다. 위치 가중치 행렬은 모든 무작위화된 위치의 모든 돌연변이의 빈도를 계산함으로써 생성되었다. 각 돌연변이에 대한 풍부화비는, 실시예 8에 기재된 바와 같이, 선별된 샘플 내 주어진 위치에서의 주어진 돌연변이의 빈도를 비선별된 샘플에서의 매우 동일한 돌연변이의 빈도로 나눔으로써 계산하였다.
결과
NGS 데이터는 YIS 또는 YKS의 결합에 관하여 인간 IL1RAP 도메인 3의 각 아미노산 위치에서 치환의 영향을 분석하는데 사용되었다. 0 미만인 풍부화비는 YIS, YKS 또는 참조 항체의 결합에 유해한 아미노산 치환을 나타내었다. NGS 데이터는 YIS 또는 YKS 결합에 유해하지만 참조 항체 결합에 유해하지 않은 인간 IL1RAP 도메인 3 잔기의 치환을 플래그 부착하는데 더 사용되었다. 높은 수의 플래그 부착된 치환이 관찰된 인간 IL1RAP 도메인 3 잔기 위치는, 잔기 무작위화가 도메인 3에 적용되고 인간 IL1RAP 도메인 1에 결합하는 참조 항체에 영향을 미치지 않아야 하므로 YIS 또는 YKS 결합 에피토프의 일부일 가능성이 있었다.
도 15에 도시된 바와 같이, 식별된 IL1RAP 에피토프 잔기가 인간 IL-1β, IL-1R1 및 IL1RAP 삼원 복합체(PDB:3O4O)의 결정 구조 상에 매핑된 경우, 이들의 분포는 클러스터링되고, IL-1β와 IL-1R1의 이원 복합체와 IL1RAP 간의 결합 계면에 위치된다. 이와 같이 해서 본 실시예의 에피토프 데이터는 본 개시내용의 항-hu-IL1RAP 항체, 예컨대, YIS 또는 YKS가 어떻게 삼원 복합체의 형성을 차단할 수 있고, 이에 의해 다운스트림 세포내 신호전달 이벤트를 어떻게 저해할 수 있는지에 대한 구조적 설명을 제공한다. 또한 IL1RAP와 IL-33/ST2(
Figure pct00042
et al., Immunity, 47:510-523 (2017)) 또는 IL-36/IL1RL2(Yi et al., The Journal of Biological Chemistry, 291(32): 16597-16609 (2016)) 간의 구조적 상호작용의 전체적인 유사성의 관점에서, 본 실시예의 에피토프 데이터는 또한 이들 두 경로를 또한 차단하는 본 개시내용의 항-IL1RAP 항체, 예컨대, YIS 및 YKS의 능력에 대해서 마찬가지 구조적 설명을 뒷받침한다.
표 24는 인간 IL1RAP 도메인 3 위치에서 관찰된 플래그 부착 치환의 상대적인 수를 나타낸다(+++: 9개 이상의 플래그 부착 치환; ++: 6 내지 8개의 플래그 부착 치환; +: 3 내지 5개의 플래그 부착 치환; -: 3개 미만의 플래그 부착 치환). 높은 수의 플래그 부착 치환은 에피토프의 일부일 가능성이 더 많은 것으로 간주되었다.
Figure pct00043
Figure pct00044
표 24에 열거된 결과에 의해 입증되는 바와 같이, 고 친화도 항체 11C5용의 에피토프는 위치 243 내지 255, 위치 257 내지 268 및 위치 333 내지 336에서 D3 도메인 내에서 주로 인간 IL1RAP 잔기에 결합한다. 이들 부위의 대부분은 IL1RAP의 도메인 3의 표면에 함께 클러스터링된다(도 15 참조). 이들 불연속 잔기는 본 명세서에 개시된 바와 같이 항체 11C5의 에피토프, 및 이의 변이체인 것으로 결론지어진 주된 패치에 매핑된다.
실시예 16: 대용물 항-마우스 IL1RAP 항체의 생성
본 실시예는 항-mu-IL1RAP 항체를 생성하기 위한 마우스 하이브리도마 기술의 사용, 항-mu-IL1RAP 항체 14F4의 특성규명 및 생체내 마우스 연구를 위하여 이 대용 항체를 사용하는 방법을 예시한다.
재료 및 방법
면역화 및 융합: IL1RAP 넉아웃 마우스(The Jackson Laboratory, 스톡 번호(Stock No.) 003284)를 25 ㎍/면역화/마우스의 mu-M-IL1RAP-D3(잔기 경계 K239-T368을 가진 mu-IL1RAP 도메인 3)(서열번호 337)으로 3회 면역화시켰다. 각 마우스에게 mu-M-IL1RAP(C-말단 6x히스티딘 태그와 융합된 세포외 부분)(서열번호 9)와 mu-M-IL1RAP-D3(서열번호 337)의 1:1 혼합물로 25㎍의 총/면역화/마우스의 후속 5회 면역화를 부여하였다. Sigma Adjuvant System(Sigma-Aldrich)을 모든 면역화에 사용하였다. 이어서 마우스에게 애주번트 없이 mu-M-IL1RAP와 mu-M-IL1RAP-D3의 1:1 혼합물의 25 ㎍/마우스의 최종 부스트를 부여하였다. 3일 후에, 비장을 수거하고 표준 프로토콜에 따라 처리하였다. 비장세포를 표준 프로토콜에 따라서 PEG를 이용해서 골수종 Sp2/0 세포(ATCC)와 융합시키고 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 친계 하이브리도마는 하이포잔틴-아미노프테린-티미딘이 보충된 선택 배지를 이용해서 선택하였다.
ELISA 검정: 배양 12 내지 14일 후, 하이브리도마 상청액을 수집하고, PBS 중 1 ㎍/㎖ mu-M-IL1RAP로 코팅된 96-웰 플레이트를 이용해서 ELISA에 의한 1차 선별을 행하였다. 하이브리도마 상청액(65㎕/웰)을 코팅된 플레이트 상에서 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션하고, 플레이트를 세척 완충액(0.05% Tween-20을 가진 PBS)로 3회 세척하였다. 염소-항-마우스-Fc-HRP 2차(Goat-anti-mouse-Fc-HRP secondary)(Jackson Immunoresearch, PBS 중 1:5000으로 희석)(65㎕/웰)를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 완충액으로 3회 세척 후, 1-Step Ultra TMB ELISA 기질 현상 용액(Thermo Pierce Scientific, 65㎕/웰)을 첨가하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 650㎚에서의 흡광도는 현상제를 퀀칭하는 일 없이 판독하였다.
1차 ELISA 선별에서 양성이었던 친계 하이브리도마를 하이포잔틴-티미딘을 함유하는 배지에서 24-웰 플레이트로 확장시키고 실시예 2에 기재된 바와 같이 확증적 ELISA 선별을 1 ㎍/㎖로 코팅된 mu-M-IL1RAP를 이용해서 수행하였다. 관심 하이브리도마 클론을 0.5 세포/웰의 밀도로 제한된 희석을 이용해서 서브클로닝하고, 세포 펠릿을 각 항체 클론의 중쇄 및 경쇄 서열(이하에 기재)을 결정하는데 사용하였다.
14F4의 시퀀싱 및 재조합 생산: 하이브리도마-유래 항-mu-IL1RAP 항체의 서열의 결정은 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행하였다. 재조합 항-mu-IL1RAP 항체 14F4는 실시예 5에 기재된 바와 같이 생성하였다.
재조합 14F4 결합 mu-IL1RAP의 BIACORE SPR 분석: BIACORE™ 8K 기기를 이용해서 mu-IL1RAP에 대한 14F4의 결합 친화도를 결정하기 위하여 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석을 사용하였다. 동력학 측정을 위하여, 재조합 14F4를 HBS-P 완충액(0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20) 중 10 ㎍/㎖로 희석시키고, 2차 플로우 셀(FC2)에서 10㎕/분에서 항-마우스 칩(GE Healthcare) 상에 캡처하였다. FC1은 참조로서 유지되었다. 다음에, 저(0.14nM)에서부터 고(100nM)까지 HBS-P 중 mu-M-IL1RAP의 3-배 연속 희석액을 37℃에서 주입하였다(유량: 30㎕/분). 60mM 염산(유량: 90㎕/분)을 이용해서 각 분석물 주입 전에 2회 칩을 재생하였다. 센서그램을 기록하고 BIACORE ® 8K Evaluation 소프트웨어(버전 1.1.1.7442)를 사용해서 데이터 분석 전에 참조 및 완충액 차감을 수행하였다. 회합 률(kon) 및 해리율(koff)은 간단한 1-대-1 랭뮈어 결합 모델을 이용해서 계산하였다. 평형 해리 상수(KD)는 koff/kon의 비로서 계산하였다.
재조합 14F4의 비-특이적 결합의 결정을 위한 BV ELISA: BV ELISA는 비-특이적 결합의 정도를 결정하기 위하여 14F4를 이용해서 실시예 11에 상세히 설명된 바와 같이 수행하였다.
IL1RAP에 대한 특이적 결합 활성도의 검정: hu-IL1RAP 및 mu-IL1RAP의 상이한 도메인에 대해서 14F4의 특이성을 결정하기 위하여, ELISA를 실시예 2에서 앞서 기재된 바와 같이 사용하였고, 이하의 단백질을 1㎍/㎖로 개별적으로 코팅하였다: mu-M-IL1RAP(서열번호 337), mu-M-IL1RAP-D1D2(도메인 1-2, S21-P237)(서열번호 338), hu-M-IL1RAP(서열번호 3), hu-M-IL1RAP-D1(도메인 1, S21-Q133)(서열번호 4), 및 hu-M-IL1RAP-D3(도메인 3, K238-T367)(서열번호 6). 재조합 14F4는 10nM의 농도에서 검정되었다.
결과
항-mu-IL1RAP 항체의 생성: IL1RAP 넉아웃 마우스의 면역화 및 비장세포의 후속 수확 후에, (PEG 융합을 통해 생성된) 친계 하이브리도마는 mu-M-IL1RAP(서열번호 9)에 결합하기 위하여 ELISA에 의해 선별하였다. 1차 ELISA 검정 선별은 하이브리도마로부터 총 17종의 항-마우스 IL1RAP 결합제를 식별하였고, 이는 24-웰 플레이트로 확장 후 ELISA에 의해 mu-M-IL1RAP를 결합하기 위하여 더욱 확인되었다. 실시예 2에 기재된 바와 같이 HEK-Blue SEAP 검정에서 모두 17종의 상청액의 선별 후(데이터 미제시), 모두 3개의 경로(IL-1, IL-33 및 IL-36)를 차단하는 능력에 기초하여 14F4를 선택하였다. 클론 14F4는 하이브리도마 세포, 재조합 발현 및 정제로부터 VL 및 VH 영역의 시퀀싱을 위하여 선택되었다.
mu-IL1RAP에 대한 재조합 14F4 결합의 속도론: 표 25에 나타낸 바와 같이, 재조합 14F4는 mu-M-IL1RAP(서열번호 9)와 KD = 0.219nM으로 결합한다.
Figure pct00045
비-특이적 결합에 대한 BV ELISA 결과: 표 26에 나타낸 바와 같이, 재조합 14F4는 배지 대조군보다 더 큰 BV ELISA 신호를 나타내지 않았는데, 이는 14F4가 BV 입자에 대한 비-특이적 결합을 갖지 않음을 시사한다.
Figure pct00046
IL1RAP에 대한 특이적 결합 활성도의 검정: 표 27에 나타낸 바와 같이, 재조합 항-mu-IL1RAP 항체인 14F4는 인간 IL1RAP에 대한 결합을 나타내지 않지만 mu-M-IL1RAP(서열번호 9)와 mu-M-IL1RAP-D1D2(서열번호 338) 간에 견줄 만한 결합을 나타내는데, 이는 14F4가 쥣과 IL1RAP 도메인 1 또는 도메인 2에 특이적으로 결합하는 것을 시사한다.
Figure pct00047
실시예 17:　대용물 항-마우스 IL1RAP 항체 14F4의 활성도를 차단하는 IL1RAP의 세포-기반 검정
이 실시예는 마우스 세포주 또는 원발성 마우스 세포에서 3개의 모든 경로(IL-1 매개, IL-33 매개 및 IL-36 매개)를 차단하는 항-mu-IL1RAP 대용 항체 14F4의 능력을 예시한다.
재료 및 방법
NIH-3T3 세포 및 관련된 검정: 마우스 섬유아세포 세포주인 NIH-3T3은 상업적으로 획득하였다(ATCC CRL-1658). NIH-3T3 세포는, 10% 소태아 혈청(FBS; Atlanta Biologicals)이 보충된 DMEM(Corning 10-013-CV), 100 IU/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 1X 비필수 아미노산(Gibco 11140-050, 100X 용액) 및 1X 글루타맥스(Gibco 35050-61, 100X 용액)로 이루어진 표준 성장 배지를 이용해서, 제조사의 지침에 따라서, 배양액에서 유지되었다. 마우스 IL-1β(Peprotech) 및 IL-36α(BioLegend)는 상업적으로 획득하였다.
항체 차단 검정 및 작용제 용량 반응 곡선은, 본 실시예의 조건을 고려해서 일부 변형하면서, 실시예 7에 기재된 바와 같은 유사한 방식으로 수행되었다. 간단히 말하면, 실험적 사용 전날에, NIH-3T3 세포는 사용일에 대략 80 내지 85% 컨플루언시로 얻어지는 농도에서 평탄한-바닥의 96-웰 플레이트 상에 파종하였다. 검정일에, 대용 항체 14F4 또는 아이소타입 대조군을 1시간 동안 (5% CO2와 함께 37℃) NIH-3T3 세포와 인큐베이션하고 나서, 작용제(IL-1β 또는 IL-36α)를 첨가하였다. 이 실험은 추가의 24시간 동안 (5% CO2와 함께 37℃) 진행될 수 있었다. 세포 배양 상청액을 수집하고, IL-6 생산 수준은 제조사의 지침에 따라서 ELISA(Thermo Fisher Scientific)에 의해 결정되었다. 기재된 모든 항체 차단 검정을 위하여, NIH-3T3 세포를 EC85 이상의 작용제 농도에서 자극시켰다. 양성 대조군은 성장 배지 및 작용제 단독(항체 존재하지 않음)을 가진 NIH-3T3 세포로 이루어진 한편, 음성 대조군 샘플은 성장 배지만을 가진(작용제 자극 및 항체의 부재) NIH-3T3 세포로 이루어졌다.
J774-이중 세포 및 관련된 검정: J774-이중 세포는 마우스 J774.1 대식세포-유사 세포주로부터 유래되었다. 이들 세포는 NF-κB 리포터 유전자, 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP)를 발현하도록 조작되었다. J774-이중 세포는 상업적으로 입수 가능하고, InvivoGen(카탈로그 번호 j774d-nfis)으로부터 얻었다. J774-이중 세포를 일반 제조사의 지침에 따라서 해동시키고, 하기를 포함하는 세포 배양액 배지에 유지하였다: 10% 열-불활성화된 소태아 혈청(56℃에서 30분)을 갖고 선택 항생제 블라스티시딘(Blasticidin)(InvivoGen 카탈로그 번호 ant-bl-1) 및 제오신(Zeocin)(InvivoGen 카탈로그 번호 ant-zn-1)이 보충된 DMEM(2mM L-글루타민, 3.7 g/ℓ 중탄산나트륨, 4.5 g/ℓ 글루코스 및 1.0mM 피루브산나트륨), 100 ㎍/㎖ Normocin(InvivoGen(카탈로그 번호 ant-nr-1), 1x 페니실린-스트렙토마이신 용액. 항체 차단 검정을 위하여, J774-이중 세포는, 세포가 80% 컨플루언시에 도달할 때까지 선택 항생제(블라스티시딘 및 제오신) 없는 세포 배양액 배지에서 배양하였다. 이어서 세포를 평탄한-바닥, 96-웰 플레이트에서 50,000/웰로 플레이팅하고, 5% CO2와 함께 37℃에서 하룻밤(대략 18시간) 인큐베이션하였다. 14F4를 작용제(EC55에서의 마우스 IL-33, PeproTech, 카탈로그 번호 1209434)의 첨가 전 1시간 동안 J774-이중 세포와 인큐베이션하였다. 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 24시간 동안 더욱 인큐베이션하였다. 상청액 중에서의 SEAP 생산은 실시예 2에 기재된 SEAP 검출 검정을 이용해서 정량화하였다. 양성 대조군 조건(PC)은 세포, 성장 배지 및 작용제(IL-33)를 포함하였고, 음성 대조군 조건(NC)은 세포 및 성장 배지만을 포함하였다. 데이터는 GraphPad Prism 7 소프트웨어를 이용해서 분석되었고, 비-선형 회귀 분석은 작용제 EC50 값을 결정하도록 수행되었다. 항체 차단 검정 전에, 실시예 5에 기재된 바와 같이 작용제 및 길항제 용량-반응 곡선을 생성하여 EC50 및 IC50(각각)을 결정하였다.
원발성 마우스 배아 섬유아세포 및 관련된 검정: 원발성 마우스 배아 섬유아세포(Primary mouse embryonic fibroblast)(원발성 MEF)는 Lonza로부터 얻었다(카탈로그 번호 M-FB-481). 이들 원발성 세포는 교미후 14일 및 15일의 CD-1 마우스 배아로부터 분리하고, 배양액에서 확장되고, 이어서 제조사에 의해 저온보존된다. 세포를 해동시키고, 제조사에서 제공된 지침에 따라서, 10% 열 불활성화 소태아 혈청(Atlanta Biologicals, 카탈로그 번호 S11150H), 10 IU 페니실린 및 10 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(Corning, 카탈로그 번호 30-002-CI)이 보충된, 4.5 g/ℓ 글루코스, L-글루타민 및 피루브산나트륨(Corning, 카탈로그 번호 10-013-CV)을 갖는 DMEM을 이용해서 배양액에서 유지시켰다. 마우스 IL-36β는 Biolegend(카탈로그 번호 554506)로부터 얻었다.
작용제 용량 반응 곡선 및 항체 차단 검정은, 이하에 언급된 바와 같은 변형 외에 실시예 7에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략히 말하면, 원발성 MEF를 위에서 언급된 성장 배지에서 15,000 세포/웰의 밀도로 평탄한 바닥의 96 웰 플레이트에 파종하였다. 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 하룻밤 인큐베이션 후, 14F4 또는 아이소타입 대조군을 5% CO2와 함께 37℃에서 1시간 동안 원발성 MEF와 인큐베이션하였다. 이어서 미리 결정된 농도의 작용제(마우스 IL-1β 또는 IL-36β)를 첨가하였다. 각 웰의 최종 용적은 200㎕였고, 항체 차단 검정은 작용제 EC70 이상에서 수행하였다.
작용제 자극 후, 세포를 37℃, 5% CO2에서 21시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 회전속도 감속시키고, 상청액을 수집하여, 제조사의 지침에 따라서, 상업적으로 입수 가능한 마우스 IL-6 ELISA 키트(Invitrogen/Thermo Fisher Scientific 카탈로그 번호 88-7064-88)를 이용해서 분비된 마우스 IL-6의 수준을 결정하였다. 양성 대조군 웰은 성장 배지에 작용제를 함유하는 세포로 이루어졌고, 음성 대조군 웰은 성장 배지만을 가진 세포로 이루어졌다. 데이터 분석은 Graphpad Prism 7 소프트웨어를 이용해서 수행하고, 비선형 회귀(곡선 적합화)를 사용하여 작용제 EC50값 및 길항제 IC50값을 결정하였다.
결과
대용물 항-마우스 IL1RAP 항체인 14F4(실시예 16에 기재된 바와 같이 제조됨)가 마우스 모델에서 생체내 효능을 입증하기 위하여 선택되었다. 생체내 연구 전에, 14F4는 마우스 세포주 및 원발성 세포 검정을 이용해서 모두 3개의 IL1RAP-매개 경로(IL-1, IL-36 및 IL-33)를 차단함에 있어서의 효능에 대해서 시험관내에서 검정되었다.
NIH-3T3 세포주는 14F4가 마우스 IL-1 및 IL-36 경로를 시험관내에서 차단할 수 있는지의 여부를 결정하는데 사용되었다. NIH-3T3 세포는 IL-1 자극에 반응하는 것으로 알려져 있고, 따라서 IL1RAP를 발현한다(예컨대, 문헌[Arthritis and Rheumatism, 52(7):2202-2211 (2005)] 참조). NIH-3T3 세포를 위에서 기재된 바와 같이 IL-1β로 자극시키고, IL1-β 자극 또는 아이소타입 대조 항체를 차단하도록 14F4에 노출시켰다. IL-6 생산은 아이소타입 대조 항체뿐만 아니라 양성 대조군 세포에 노출된 세포의 상청액에서 측정하였다. 표 28(하기)에 나타낸 바와 같이, 항-마우스 IL1RAP 항체 14F4를 받은 NIH-3T3 세포는 양성 대조군에 비해서 검출된 IL-6의 수준으로 거의 완전한 저감을 나타내었다(98% 저해). 14F4는 실시예 12에 기재된 HEK-Blue 검정에서 YKD/YTE(IC50 = 0.51nM)로 관찰된 효력에 가까운 IC50 = 1.36nM로 IL-1β 유도 IL-6 생산을 저해하였다.
NIH-3T3 세포는 또한 IL-36α에 의한 자극 시 용량 의존적 방식으로 IL-36에 반응성이고 IL-6을 분비하는 것으로 밝혀졌다(데이터 미제시). 관찰된 최대 IL-6 생산은 NIH-3T3 세포가 IL-1β 또는 IL-36α로 자극된 것과 유사하였다. 표 28에 나타낸 바와 같이, IL-36α로 자극된 NIH-3T3 세포를 이용해서 수행된 14F4 차단 검정에 의해 IL-6 생산의 100% 저해를 얻었다. 또한, 14F4는 IL-1β 자극 후 관찰된 것보다 더 큰 효력으로 IL-36α 유도 IL-6 생산을 저해할 수 있었고(IC50 = 0.18nM), 14F4에 의한 완전 저해는 16.7nM에서 관찰되었다. 실시예 12에 기재된 바와 같이, 14F4의 이 서브-나노몰 저해 효력은 IL-36 HEK-Blue 검정에서 항-인간 IL1RAP 항체 YKD/YTE에 대해서 관찰된 것과 견줄 만하다. 요약하면, 대용물 항-mu-IL1RAP 마우스 항체 14F4는 마우스 세포주 NIH-3T3에서 IL-1 및 IL-36 유도 IL-6 생산을 효과적으로 저해하였고, 항-hu-IL1RAP 항체, YKD/YTE에 대해서 관찰된 것과 같이 시험관내에서 견줄 만한 효력을 입증하였다.
대식세포-유사 J774-이중 세포주는 14F4가 마우스 IL-33 자극된 경로를 시험관내에서 차단할 수 있는지를 결정하기 위하여 사용되었다. IL-33 및 이의 수용체 IL1R1은 대식세포를 비롯하여 많은 면역 세포에서 광범위하게 발현된다. IL-33에 의해 활성화된 ST2 신호전달은 대식세포에서 NF-κB 활성화를 초래한다(예컨대, 문헌[Kakkar et al., Nature Reviews. Drug Discovery, 7(10), 827-840 (2008)] 참조). 표 28에 나타낸 바와 같이, 14F4는 2μM에서 97% 저해(IC50= 6.6nM)로 IL-33 자극된 J774 세포의 차단 활성도를 나타내었다. IL-33 자극의 이 저해 효력은 실시예 12의 HEK-Blue 검정에 기재된 것(IC50 = 3.30nM)과 같이 항-인간 IL1RAP 항체 YKD/YTE에 대해서 관찰된 것과 유사하다.
IL-1 및 IL-36 자극된 경로를 차단하는 대용 항체인 14F4의 능력은 원발성 MEF에서 결정되었다. 원발성 MEF는 IL-1 자극에 반응하여 IL-6을 생산하는 능력을 지녔는데, 이는 IL1RAP의 발현을 시사한다(예컨대, 문헌[Nold-Petry et al., Journal of Biological Chemistry, 284(38): 25900-25911 (2009)] 참조). 이러한 원발성 마우스 섬유아세포가 IL1RAP를 발현하고 마우스 배아 섬유아세포 세포주 NIH-3T3이 IL-36 자극에 반응하므로, 원발성 MEF가 또한 IL-36 자극에 반응성이어야 하는 것으로 판단되었다. 실제로, IL-36β에 의한 자극 시, 원발성 MEF는 용량 의존적 방식으로 IL-6을 분비하였다(데이터 미제시). 표 28에 나타낸 바와 같이, 14F4는 6.1nM의 IC50으로 양성 대조군에 관하여 IL-1β 자극된 IL-6 생산의 본질적으로 완전 저해를 나타낸다. 마찬가지로, IL-36β 자극된 IL-6 생산은 0.094nM의 IC50값으로 완전히 저해되었다. 결론적으로, 14F4는 원발성 MEF에서 IL-1 및 IL-36 경로 둘 다를 완전히 차단하는 능력을 가졌지만, IL-1 경로에 비해서 IL-36에 대해서 훨씬 더 큰 효력을 지녔다.
Figure pct00048
요약하면, 14F4에 의한 상기 결과는 IL1RAP 저해를 통해서 동시에 IL-1, IL-33 및 IL-36 경로를 차단하는 효능 및 효과를 결정하기 위하여 마우스 생체내 연구를 위한 대용 항체로서의 그의 용도를 뒷받침한다.
실시예 18: 대용물 항-마우스 IL1RAP 항체의 생체내 효능
본 실시예는 마우스 대용 항체 14F4가 적어도 2개의 IL-1 패밀리 경로의 기능적 생체내 차단제, 그리고 또한 천식의 마우스 모델에서 유도된 더 많은 복합체 표현형의 기능적 차단제인 것을 예시한다
재료 및 방법
생체내 마우스 모델 연구에서 이 연구를 위한 프로토콜은 표 29에 요약되어 있다.
Figure pct00049
동물 및 관리: 암컷 BALB/cAnNHsd 마우스는 Envigo로부터 구입하였고, 6 내지 13주령 사이를 사용하였다. 마우스에는 방사능조사된 Harlan Teklad 글로벌 18% 단백질 설치류 식이를 공급하였고 물은 무제한 급식하였다. 동물을 시간당 60회의 완전 공기 변화에서 옥수수 속대 바닥을 깐 Innovive 일회용 환기 케이지에 수용하였다. 환경은 70℉±2℉의 온도 범위 및 30 내지 70% 습도 범위로 조절하였다. 모든 동물 작업은 Explora의 동물 실험윤리위원회(캘리포니아주의 샌디에고 소재)에 의해 승인된 동물 실험 프로토콜에 따라서 수행하였다.
생체내 치료: 비강내(i.n.) 치료를 위하여, 마우스를 3 내지 4%의 아이소플루란(VetOne, 아이다호주 보이시 소재)으로 마취시키고, 마이크로피펫에 의해 투여된 35㎕의 용액을 콧구멍을 통해서 흡입시켰다. 마우스를 마취 용량의 2.5% 2,2,2-트라이보로에틸 알코올 용액(Sigma Aldrich, 미주리주 세인트루이스 소재)을 투여하여 안락사 시키고 나서, (단일 IL-1β 시도 단독에 대해서) 양측 개흉술 또는 자궁경부 탈구함으로써 안락사시켰다.
데이터 분석: 모든 생체내 연구를 위하여, GraphPad Prism 8 소프트웨어는 데이터 및 통계학적 분석을 위하여 사용하였다. 만-휘트니 시험은 사이토카인 또는 HDM 시도가 생물학적 반응에서 통계학적으로 유의한 증가를 초래했는지의 여부를 결정하기 위하여 IgG 대조군-투여된 미시도된 마우스와 IgG 대조군-투여된 시도된 마우스 간에 수행하였다. 유의성 결정 후, 만-휘트니 시험은 IgG 대조군-투여된 시도된 마우스와 14F4-투여된 시도된 마우스 간에 수행하였다.
A. 단일 사이토카인 시도 모델 및 관련된 검정: 단일 IL-1β 시도 연구 프로토콜은 문헌[Gabrielsson et al., European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences, 67:144-159 (2015)]에 기초하여 변형되었다. 제-1일에, 마우스에게 100 내지 200㎕의 총 용적으로 IgG 대조군 또는 14F4를 평균 군 체중당 30㎎으로 복강내(i.p.) 투여하였다. 제0일째에, 마우스는 100㎕의 총 용적으로 D-PBS 또는 50ng IL-1β로 i.p. 시도하였다. 시도 후 2시간에, 마우스를 안락사시키고, 혈액을 심장 천자를 통해서 수집하고, BD Microtainer 혈청 분리 튜브(BD Biosciences)에 배치하였다. 적어도 30분 후에, 튜브를 9,300×g에서 5분 동안 원심분리하고 혈청을 수집하고 -80℃에서 보관하였다. 마우스 혈청 IL-6 농도는 제조사의 지시에 따라서 상업적 IL-6 ELISA 키트(Invitrogen/ThermoFisher Scientific 카탈로그 번호 88-7064-88)에 의해 측정하였다. 혈청 샘플은 검정을 위하여 1:5로 희석시켰다.
단일 IL-36α 시도 연구 프로토콜은 문헌[Ramadas et al., PloS One, 7(9):e45784 (2012)]에 기초하여 변형시켰다. 제-1일에, 마우스에게 단일 IL-1β 시도 연구와 마찬가지로 항체를 i.p. 투여하였다. 제0일째에, 마우스에게 35㎕의 총 용적으로 D-PBS 또는 10 ng IL-36α로 i.n. 시도하였다. 제1일째에, 마우스를 안락사시켰다. 기관지폐포세척(BAL)은 기도를 절개하고, 20G 무딘 엔드 니들 또는 18G 카테터 시스(catheter sheath)를 삽입하고, 1㎖ 시린지를 이용해서 0.8㎖ HBSS/2mM EDTA 완충액을 주사하고 회수함으로써 수행하였다. 이 절차는 3회 수행하였다. BAL 유체 중 세포 유형의 수를 결정하기 위하여, BAL 유체를 365×g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거한 후, 2㎖의 1X 라이신 완충제(Lysing Buffer)(BD Biosciences, 카탈로그 번호 555899)를 세포에 첨가하여 임의의 적혈구 세포를 용해시켰다. 2분 후에, 5㎖의 D-PBS/2% FBS 완충액을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 세포를 365×g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거한 후, 세포를 HBSS/2mM EDTA에 재현탁시키고, 96-웰 둥근-바닥 플레이트로 옮기고, 570×g에서 2분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 모든 염색 단계는 암소(dark)에서 그리고 얼음 위에서 수행되었다. 죽은 세포를 염색하기 위하여, 25㎕의 LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit(1:1000 희석액, ThermoFisher)를 첨가하였다. 15 내지 20분 후에, 세포에 FACS 염색 완충액 중 25㎕의 항-CD16/32(2.4G2, BD Biosciences)를 첨가하여 Fc 수용체 결합을 차단하였다. 이어서, 15분 후에, 웰에 50㎕의 Brilliant Stain Buffer(BD Biosciences) 중 항체를 첨가함으로써 세포를 염색하였다. 항체는 모두 1:200 희석액으로 사용되었다. 이하의 항체는 Tonbo Biosciences(캘리포니아주 샌디에고 소재)로부터 구입하였다: Ly6G-FITC(1A8) 및 CD11b-APC(M1/70). 이하의 항체는 BD Biosciences로부터 구입하였다: SiglecF-PE(E50-2440) 및 CD11c-BV785(N418). Ly6C-PerCp-Cyanine5.5(HK1.4)는 ThermoFisher로부터 구입하였다. 30분 후에, 세포를 FACS 완충액에서 2 내지 3회 세척하였다. 세척 후에, 세포를 FACS 완충액에 재현탁시키고, 이어서 CytoFlex 유세포분석기 상에서 분석하였다. FlowJo 10 소프트웨어를 이용해서 데이터를 분석하였다. 세포 상에 게이팅하고 죽은 세포와 폐포 대식세포 (SiglecF+CD11c+)를 배제시킨 후, 세포 유형은 마커의 발현에 기초하여 정의되었다: 호산구(SiglecF+CD11c-Ly6G-), 호중구(Ly6G+Ly6C+CD11b+SiglecF-CD11c-) 및 단핵구(Ly6C+Ly6G-CD11b+SiglecF-CD11c-). BAL 유체 중 세포 유형의 수를 계산하기 위하여, 획득된 총 세포 중에서 각 세포 유형의 백분율에 전체 세포수를 곱하였다. 전체 세포수는 제조사의 지시에 따라서 ViaCount 검정을 이용하는 Guava easyCyte 5HT System 유세포분석기(EMD Millipore, 매사추세츠주 빌레리카 소재)를 이용해서 얻었다.
B. 다중 IL-1β 사이토카인 시도 모델 및 관련된 검정: 다중 IL-1β 시도 연구 프로토콜은 문헌[Kim et al., American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 196(3):283-297 (2017)]에 기초하였다. 제-1일 및 제2일에 마우스에게 단일 IL-1β 시도 연구와 마찬가지로 항체로 i.p. 투여하였다. 제0, 1 및 2일에, 마우스에게 D-PBS 중 35㎕의 총 용적의 D-PBS 또는 30 ng IL-1β로 i.n. 시도하였다. 제3일에, 마우스를 안락사시켰다. BAL은 앞서 기재된 바와 같이 수행하였다. 좌측, 중간, 내부 및 대정맥 뒤 폐엽을 2.0㎖ 튜브에 수집하고, 즉시 동결시키고, 후속의 단백질 케모카인/사이토카인 분석을 위하여 -80℃에서 보관하였다. BAL의 세포 분석은, 세포가 LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit(1:250 희석, ThermoFisher), 및 이하의 항체로, 모두 1:200 희석으로 염색된 것을 제외하고, 앞서 기재된 바와 같이 수행되었다: Ly6G-FITC(Tonbo Biosciences, 1A8); SiglecF-PE(BD Biosciences, E50-2440); Ly6C-PerCp-Cyanine5.5(ThermoFisher, HK1.4); CD11b-APC-Cy7(BD Biosciences, M1/70); CD11c-BV785(Biolegend, N418); CD3-PE-Cy7(Biolegend, 17A2); CD4-BV605(BD Biosciences, RM4-5); CD19-BV650(BD Biosciences, 1D3); T1/ST2-BV421(BD Biosciences, U29-93); 및 MHC 부류 II-APC(ThermoFisher, M5/114.15.2). 데이터는 FlowJo 10 소프트웨어를 이용해서 분석되었다. 세포 상에 게이팅하고 죽은 세포 및 폐포 대식세포(CD11c+SiglecF+)를 배제한 후, BAL 내 이하의 세포 유형은 이하의 마커의 발현에 기초하여 정의되었다: 호중구(Ly6G+Ly6C+CD11b+), 호산구(SiglecF+CD11c-Ly6G-), 수지상 세포(CD11c+MHCII+Ly6G-SiglecF-), 단핵구(Ly6C+Ly6G-CD11b+SiglecF-), CD4 T 세포(CD3+CD4+CD19-CD11b-Ly6G-SiglecF-), T1-ST2+ CD4 T 세포(CD3+CD4+T1/ST2+CD19-CD11b-Ly6G-SiglecF-), CD8 T 세포(CD3+CD4-CD19-CD11b-Ly6G-SiglecF-) 및 B 세포(CD19+MHCII+CD3-CD11b-Ly6G-SiglecF-). BAL 중 세포 수는 위에서 기재된 바와 같이 계산하였다. 폐 케모카인/사이토카인 단백질 분석을 위하여, 폐 샘플은 3 사이클에 대해서 2분 동안 25㎐로 Tissuelyser II(QIAGEN)를 이용해서 프로테아제 및 포스파타제 저해제 칵테일(ThermoFisher Scientific, 카탈로그 번호 78443)을 함유하는 조직 추출 시약 I(ThermoFisher Scientific, 카탈로그 번호 FNN0071)에서 균질화였다. 균질액을 9,300×g에서 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 조직 용해물(상청액) 중 단백질량을 Pierce 비시노코닌산(bicinchoninic acid: BCA) 단백질 검정 (ThermoFisher Scientific, 카탈로그 번호 23227)으로 정량화하였다. 용해물을 사이토카인 검정에 대해서 -80℃에서 보관하였다. 상청액은 사이토카인 측정을 위하여 사용하였다. 200㎍의 총 단백질 폐 용해물 중 쥣과 사이토카인 및 케모카인(CXCL1, CXCL2, IFN, IL-10, IL-12, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-25, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, IL-17A, IL-33, TNFα 및 TSLP)의 수준은 제조사의 지시에 따라서 마우스 커스텀 ProcartaPlex 17-plex 키트(Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 PPX-17-MXCE4AT)를 사용해서 측정하였다.
C. 급성 집먼지진드기(house dust mite: HDM) 천식 모델 및 관련된 검정: 급성 집먼지진드기(HDM) 천식 모델은 문헌[Piyadasa et al., Biology Open, 5(2): 112-121 (2016)]을 기초로 하였다. 제-1, 2, 6, 9 및 13일에, 마우스에게 IgG 대조군 또는 14F4를 30 ㎎/㎏으로 i.p. 투여하였다. 제0 내지 3, 6-10, 13 및 14일에, 마우스에게 식염수 또는 25㎍ HDM(Stallergenes Greer, 노스캐롤라이나주 르누아 소재, 카탈로그 번호 XPB82D3A.5)로 i.n. 시도하였다. 제15일에, 마우스를 안락사시키고, 혈액으로부터의 혈청을 앞서 기재된 바와 같이 수집하였다. 마우스 항체의 혈청 농도는 제조사의 지시에 따라서 HDM-특이적 IgE(Chondrex, 워싱턴주의 레드먼드 소재, 카탈로그 번호 3037) 및 HDM-특이적 IgG1(Chondrex, 카탈로그 번호 3034) 키트를 사용해서 측정하였다. 혈청 샘플은 HDM 특이적 IgE에 대해서 1:4 그리고 HDM-특이적 IgG1 측정에 대해서 1:12로 희석되었다.
결과
실시예 17의 결과에 나타낸 바와 같이, 마우스 대용 항체 14F4는 시험관내 세포 기반 검정에서 모두 3개의 IL-1 패밀리 경로를 차단할 수 있다. 14F4가 이들 경로를 생체내에서 차단할 수 있는 지를 결정하기 위하여, 본 실시예 18은 짧은 약력학(PD) 검정에서 개별적인 경로를 차단하는 14F4의 능력을 시험하였다. 이전의 연구는 IL-1 패밀리 사이토카인이 생체내에 투여된 경우 급성 효과를 갖는 것을 입증하였다(예컨대, 문헌[Gabrielsson et al., European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences, 67: 144-159 (2015); Ramadas et al., PloS One, 7(9): e45784 (2012)] 참조). 마찬가지로, 도 16A 및 도 16B에 묘사된 결과에 의해 나타낸 바와 같이, IL-1β로 전신 시도된 마우스는 PBS로 시도된 마우스에 비해서 혈청 IL-6 수준의 신속한 증가에 반응하였다(도 16A). IL36α로 i.n. 시도된 마우스는 PBS로 시도된 마우스에 비해서 폐 공간에서 호중구의 신속한 유입으로 반응하였다(도 16B). 14F4에 의한 처리는 이들 관찰된 면역 반응의 둘 다에 영향을 미쳤다. 도 16A에 도시된 바와 같이, 시도 전에 14F4가 투여된 마우스는 혈청 IL-6 수준의 IL-1β-유도 증가에서 강력한 저해를 나타내었다(88% 저해). 또한, 도 16B에 도시된 바와 같이, 시도 전에 14F4가 투여된 마우스는 폐 공간에서 감소된 IL-36α-유도 호중구 유입을 나타내었다(100% 저해). 이들 결과는 14F4가 IL-1 및 IL-36 신호전달 경로를 생체내에서 차단하는 능력을 가진 것을 강력하게 시사한다.
본 실시예의 연구는 또한 14F4가 인간 천식에서 보이는 복합체 표현형을 차단하는 능력을 갖는지를 결정하는데 사용되었다. 이전의 연구는 4일 과정에 걸쳐서 하루 1회 IL-1β로 시도된 마우스가 폐 공간에서 증가된 수의 호중구, 대식세포 및 림프구를 갖는 것을 나타내었다(예컨대, 문헌[Kim et al., American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 196(3): 283-297 (2017)] 참조). IL-1β-유도 호중구 유입은 중증의 비제어 천식을 가진 인간 환자에서 보여지는 것과 유사한 스테로이드-내성인 것으로 보였다. 도 17A 내지 도 17E의 플롯에서 묘사된 결과에 의해 나타낸 바와 같이, 3일의 과정에 걸쳐서 IL-1β로 시도된 마우스는 폐 공간에서 유의하게 증가된 호중구(도 17A), CD4 T 세포(도 17B), T1-ST2+ CD4 T 세포(도 17C), 단핵구(도 17D) 및 수지상 세포(도 17E)를 가졌다. 도 18A 내지 도 18C에 묘사된 플롯에 의해 도시된 바와 같이, 다중 IL-1β 시도는 또한 폐 조직에서 염증성 사이토카인인 IL-1β(도 18A) 및 IL-17A(도 18B), 및 호중구-유인 케모카인 CXCL1(도 18C)의 증가된 수준을 초래하였다. CXCL2, IFN-, IL-10, IL-12, IL-1α, IL-2, IL-25, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, IL-33, TNF-α 및 TSLP의 수준은 검출 한계 미만이었거나 또는 다중 IL-1β 시도 후에 상승조절되지 않았다(데이터 미제시). 14F4에 의한 처리는 IL-1β 시도된 마우스에서의 이들 관찰된 효과를 감소시켰다. 도 17A 내지 도 17E에 나타낸 바와 같이, 3일의 과정에 걸쳐서 IL-1β로 시도되고 14F4로 처리된 마우스는 폐 공간에서 감소된 수의 호중구(74% 저해)(도 17A), CD4 T 세포(75% 저해)(도 17B), T1-ST2+ CD4 T 세포(76% 저해)(도 17C), 단핵구(58% 저해)(도 17D), 및 수지상 세포(64% 저해)(도 17E)를 가졌다. 도 18A 내지 18C에 도시된 바와 같이, 14F4 치료는 폐 조직에서 IL-1β(88% 저해)(도 18A), IL-17A(89% 저해)(도 18B) 및 CXCL1(68% 저해)(도 18C)의 수준의 유의한 감소를 초래하였다. 이들 결과는 14F4가 며칠에 걸쳐서 발달하는 더 많은 복합체 면역 반응을 차단하는 능력을 갖는 것을 강하게 시사한다.
14F4가 환원자(reductionist)인, 사이토카인 시도 모델에서 면역 표현형인 복합체를 차단하는 능력을 갖는 것을 결정한 후에, 관련된 복합체 인간 알레르겐인 집먼지진드기(HDM)에 의해 유도된 천식-유사 표현형을 차단하는 14F4의 능력은 더욱 시험되었다(예컨대, 문헌[Nials et al., Disease Models & Mechanisms, 1(4-5):213-220 (2008)] 참조). 도 19A 및 도 19B에 도시된 바와 같이, 이전의 연구(예컨대, 문헌[Piyadasa et al., Biology Open, 5(2): 112-121 (2016)] 참조)와 마찬가지로, HDM로 시도된 마우스는 식염수로 시도된 마우스에 비해서 HDM-특이적 IgE(도 19A) 및 IgG1(도 19B)의 유의하게 상승된 수준을 가졌다. 그러나, HDM으로 시도되고 14F4로 처리된 마우스는 IgG ctrl으로 처리된 마우스에 비해서 HDM-특이적 IgE(64% 저해)(도 19A) 및 HDM-특이적 IgG1(70% 저해)(도 19B)에서 유의한 감소를 나타내었다. 이들 결과는 IL-1 패밀리 신호전달을 차단하는 것이 천식-유사 표현형의 발달을 부분적으로 차단 가능할 수 있음을 나타낸다.
본 발명의 이상의 개시내용은 명확성 및 이해를 목적으로 예시 및 단진 예로서 일부 상세히 설명되었지만, 본 명세서에 기재된 실시예, 설명 및 실시형태를 비롯하여 이러한 개시내용은 예시의 목적을 위한 것이며, 예시적인 것으로 의도되고, 본 개시내용을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 명세서에 기재된 실시예, 설명 및 실시형태에 대한 각종 변형 또는 변화가 행해질 수 있고 본 개시내용 및 첨부된 청구범위의 정신 및 범위 내에 포함되어야 하는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 당업자라면 본 명세서에 기재된 것과 등가인 많은 방법 및 절차를 인지할 것이다. 이러한 모든 등가물은 본 개시내용의 범위 내인 것으로 이해되어야 하고 첨부된 청구범위에 의해 커버된다.
본 발명의 추가의 실시형태는 이하의 청구범위에 제시된다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 또는 기타 문서의 개시내용은 마치 이러한 개별적인 간행물, 특허 출원, 특허 또는 기타 문서가 모든 목적을 위하여 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된 것으로 개별적으로 구체적으로 표시되고 본 명세서에 이들의 전문이 제시된 것과 같은 정도로 모든 목적을 위하여 이들의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 명확하게 원용된다. 상충하는 경우에, 명시된 용어를 비롯하여 본 명세서가 통제할 것이다.
참고문헌
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Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
SEQUENCE LISTING <110> 23andMe, Inc. <120> ANTI-IL1RAP ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF <130> WO2020/037154 <140> PCT/US2019/046711 <141> 2019-08-15 <150> US 62/719,397 <151> 2018-08-17 <160> 338 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 570 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Thr Leu Leu Trp Cys Val Val Ser Leu Tyr Phe Tyr Gly Ile Leu 1 5 10 15 Gln Ser Asp Ala Ser Glu Arg Cys Asp Asp Trp Gly Leu Asp Thr Met 20 25 30 Arg Gln Ile Gln Val Phe Glu Asp Glu Pro Ala Arg Ile Lys Cys Pro 35 40 45 Leu Phe Glu His Phe Leu Lys Phe Asn Tyr Ser Thr Ala His Ser Ala 50 55 60 Gly Leu Thr Leu Ile Trp Tyr Trp Thr Arg Gln Asp Arg Asp Leu Glu 65 70 75 80 Glu Pro Ile Asn Phe Arg Leu Pro Glu Asn Arg Ile Ser Lys Glu Lys 85 90 95 Asp Val Leu Trp Phe Arg Pro Thr Leu Leu Asn Asp Thr Gly Asn Tyr 100 105 110 Thr Cys Met Leu Arg Asn Thr Thr Tyr Cys Ser Lys Val Ala Phe Pro 115 120 125 Leu Glu Val Val Gln Lys Asp Ser Cys Phe Asn Ser Pro Met Lys Leu 130 135 140 Pro Val His Lys Leu Tyr Ile Glu Tyr Gly Ile Gln Arg Ile Thr Cys 145 150 155 160 Pro Asn Val Asp Gly Tyr Phe Pro Ser Ser Val Lys Pro Thr Ile Thr 165 170 175 Trp Tyr Met Gly Cys Tyr Lys Ile Gln Asn Phe Asn Asn Val Ile Pro 180 185 190 Glu Gly Met Asn Leu Ser Phe Leu Ile Ala Leu Ile Ser Asn Asn Gly 195 200 205 Asn Tyr Thr Cys Val Val Thr Tyr Pro Glu Asn Gly Arg Thr Phe His 210 215 220 Leu Thr Arg Thr Leu Thr Val Lys Val Val Gly Ser Pro Lys Asn Ala 225 230 235 240 Val Pro Pro Val Ile His Ser Pro Asn Asp His Val Val Tyr Glu Lys 245 250 255 Glu Pro Gly Glu Glu Leu Leu Ile Pro Cys Thr Val Tyr Phe Ser Phe 260 265 270 Leu Met Asp Ser Arg Asn Glu Val Trp Trp Thr Ile Asp Gly Lys Lys 275 280 285 Pro Asp Asp Ile Thr Ile Asp Val Thr Ile Asn Glu Ser Ile Ser His 290 295 300 Ser Arg Thr Glu Asp Glu Thr Arg Thr Gln Ile Leu Ser Ile Lys Lys 305 310 315 320 Val Thr Ser Glu Asp Leu Lys Arg Ser Tyr Val Cys His Ala Arg Ser 325 330 335 Ala Lys Gly Glu Val Ala Lys Ala Ala Lys Val Lys Gln Lys Val Pro 340 345 350 Ala Pro Arg Tyr Thr Val Glu Leu Ala Cys Gly Phe Gly Ala Thr Val 355 360 365 Leu Leu Val Val Ile Leu Ile Val Val Tyr His Val Tyr Trp Leu Glu 370 375 380 Met Val Leu Phe Tyr Arg Ala His Phe Gly Thr Asp Glu Thr Ile Leu 385 390 395 400 Asp Gly Lys Glu Tyr Asp Ile Tyr Val Ser Tyr Ala Arg Asn Ala Glu 405 410 415 Glu Glu Glu Phe Val Leu Leu Thr Leu Arg Gly Val Leu Glu Asn Glu 420 425 430 Phe Gly Tyr Lys Leu Cys Ile Phe Asp Arg Asp Ser Leu Pro Gly Gly 435 440 445 Ile Val Thr Asp Glu Thr Leu Ser Phe Ile Gln Lys Ser Arg Arg Leu 450 455 460 Leu Val Val Leu Ser Pro Asn Tyr Val Leu Gln Gly Thr Gln Ala Leu 465 470 475 480 Leu Glu Leu Lys Ala Gly Leu Glu Asn Met Ala Ser Arg Gly Asn Ile 485 490 495 Asn Val Ile Leu Val Gln Tyr Lys Ala Val Lys Glu Thr Lys Val Lys 500 505 510 Glu Leu Lys Arg Ala Lys Thr Val Leu Thr Val Ile Lys Trp Lys Gly 515 520 525 Glu Lys Ser Lys Tyr Pro Gln Gly Arg Phe Trp Lys Gln Leu Gln Val 530 535 540 Ala Met Pro Val Lys Lys Ser Pro Arg Arg Ser Ser Ser Asp Glu Gln 545 550 555 560 Gly Leu Ser Tyr Ser Ser Leu Lys Asn Val 565 570 <210> 2 <211> 1740 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 2 tctcaaagga tgacacttct gtggtgtgta gtgagtctct acttttatgg aatcctgcaa 60 agtgatgcct cagaacgctg cgatgactgg ggactagaca ccatgaggca aatccaagtg 120 tttgaagatg agccagctcg catcaagtgc ccactctttg aacacttctt gaaattcaac 180 tacagcacag cccattcagc tggccttact ctgatctggt attggactag gcaggaccgg 240 gaccttgagg agccaattaa cttccgcctc cccgagaacc gcattagtaa ggagaaagat 300 gtgctgtggt tccggcccac tctcctcaat gacactggca actatacctg catgttaagg 360 aacactacat attgcagcaa agttgcattt cccttggaag ttgttcaaaa agacagctgt 420 ttcaattccc ccatgaaact cccagtgcat aaactgtata tagaatatgg cattcagagg 480 atcacttgtc caaatgtaga tggatatttt ccttccagtg tcaaaccgac tatcacttgg 540 tatatgggct gttataaaat acagaatttt aataatgtaa tacccgaagg tatgaacttg 600 agtttcctca ttgccttaat ttcaaataat ggaaattaca catgtgttgt tacatatcca 660 gaaaatggac gtacgtttca tctcaccagg actctgactg taaaggtagt aggctctcca 720 aaaaatgcag tgccccctgt gatccattca cctaatgatc atgtggtcta tgagaaagaa 780 ccaggagagg agctactcat tccctgtacg gtctatttta gttttctgat ggattctcgc 840 aatgaggttt ggtggaccat tgatggaaaa aaacctgatg acatcactat tgatgtcacc 900 attaacgaaa gtataagtca tagtagaaca gaagatgaaa caagaactca gattttgagc 960 atcaagaaag ttacctctga ggatctcaag cgcagctatg tctgtcatgc tagaagtgcc 1020 aaaggcgaag ttgccaaagc agccaaggtg aagcagaaag tgccagctcc aagatacaca 1080 gtggaactgg cttgtggttt tggagccaca gtcctgctag tggtgattct cattgttgtt 1140 taccatgttt actggctaga gatggtccta ttttaccggg ctcattttgg aacagatgaa 1200 accattttag atggaaaaga gtatgatatt tatgtatcct atgcaaggaa tgcggaagaa 1260 gaagaatttg tattactgac cctccgtgga gttttggaga atgaatttgg atacaagctg 1320 tgcatctttg accgagacag tctgcctggg ggaattgtca cagatgagac tttgagcttc 1380 attcagaaaa gcagacgcct cctggttgtt ctaagcccca actacgtgct ccagggaacc 1440 caagccctcc tggagctcaa ggctggccta gaaaatatgg cctctcgggg caacatcaac 1500 gtcattttag tacagtacaa agctgtgaag gaaacgaagg tgaaagagct gaagagggct 1560 aagacggtgc tcacggtcat taaatggaaa ggggaaaaat ccaagtatcc acagggcagg 1620 ttctggaagc agctgcaggt ggccatgcca gtgaagaaaa gtcccaggcg gtctagcagt 1680 gatgagcagg gcctctcgta ttcatctttg aaaaatgtat gaaaggaata atgaaaagga 1740 <210> 3 <211> 347 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic polypeptide <400> 3 Ser Glu Arg Cys Asp Asp Trp Gly Leu Asp Thr Met Arg Gln Ile Gln 1 5 10 15 Val Phe Glu Asp Glu Pro Ala Arg Ile Lys Cys Pro Leu Phe Glu His 20 25 30 Phe Leu Lys Phe Asn Tyr Ser Thr Ala His Ser Ala Gly Leu Thr Leu 35 40 45 Ile Trp Tyr Trp Thr Arg Gln Asp Arg Asp Leu Glu Glu Pro Ile Asn 50 55 60 Phe Arg Leu Pro Glu Asn Arg Ile Ser Lys Glu Lys Asp Val Leu Trp 65 70 75 80 Phe Arg Pro Thr Leu Leu Asn Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Cys Met Leu 85 90 95 Arg Asn Thr Thr Tyr Cys Ser Lys Val Ala Phe Pro Leu Glu Val Val 100 105 110 Gln Lys Asp Ser Cys Phe Asn Ser Pro Met Lys Leu Pro Val His Lys 115 120 125 Leu Tyr Ile Glu Tyr Gly Ile Gln Arg Ile Thr Cys Pro Asn Val Asp 130 135 140 Gly Tyr Phe Pro Ser Ser Val Lys Pro Thr Ile Thr Trp Tyr Met Gly 145 150 155 160 Cys Tyr Lys Ile Gln Asn Phe Asn Asn Val Ile Pro Glu 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Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 336 <211> 448 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic polypeptide <400> 336 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Val Thr Glu Gly Gly Asp Tyr Asn Tyr Tyr Leu Asp Asp Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Asp Trp Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg 245 250 255 Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 337 <211> 130 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic polypeptide <400> 337 Lys Asp Ala Leu Pro Pro Gln Ile Tyr Ser Pro Asn Asp Arg Val Val 1 5 10 15 Tyr Glu Lys Glu Pro Gly Glu Glu Leu Val Ile Pro Cys Lys Val Tyr 20 25 30 Phe Ser Phe Ile Met Asp Ser His Asn Glu Val Trp Trp Thr Ile Asp 35 40 45 Gly Lys Lys Pro Asp Asp Val Thr Val Asp Ile Thr Ile Asn Glu Ser 50 55 60 Val Ser Tyr Ser Ser Thr Glu Asp Glu Thr Arg Thr Gln Ile Leu Ser 65 70 75 80 Ile Lys Lys Val Thr Pro Glu Asp Leu Arg Arg Asn Tyr Val Cys His 85 90 95 Ala Arg Asn Thr Lys Gly Glu Ala Glu Gln Ala Ala Lys Val Lys Gln 100 105 110 Lys Val Ile Pro Pro Arg Tyr Thr Val Glu Leu Ala Cys Gly Phe Gly 115 120 125 Ala Thr 130 <210> 338 <211> 217 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic polypeptide <400> 338 Ser Glu Arg Cys Asp Asp Trp Gly Leu Asp Thr Met Arg Gln Ile Gln 1 5 10 15 Val Phe Glu Asp Glu Pro Ala Arg Ile Lys Cys Pro Leu Phe Glu His 20 25 30 Phe Leu Lys Tyr Asn Tyr Ser Thr Ala His Ser Ser Gly Leu Thr Leu 35 40 45 Ile Trp Tyr Trp Thr Arg Gln Asp Arg Asp Leu Glu Glu Pro Ile Asn 50 55 60 Phe Arg Leu Pro Glu Asn Arg Ile Ser Lys Glu Lys Asp Val Leu Trp 65 70 75 80 Phe Arg Pro Thr Leu Leu Asn Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Cys Met Leu 85 90 95 Arg Asn Thr Thr Tyr Cys Ser Lys Val Ala Phe Pro Leu Glu Val Val 100 105 110 Gln Lys Asp Ser Cys Phe Asn Ser Ala Met Arg Phe Pro Val His Lys 115 120 125 Met Tyr Ile Glu His Gly Ile His Lys Ile Thr Cys Pro Asn Val Asp 130 135 140 Gly Tyr Phe Pro Ser Ser Val Lys Pro Ser Val Thr Trp Tyr Lys Gly 145 150 155 160 Cys Thr Glu Ile Val Asp Phe His Asn Val Leu Pro Glu Gly Met Asn 165 170 175 Leu Ser Phe Phe Ile Pro Leu Val Ser Asn Asn Gly Asn Tyr Thr Cys 180 185 190 Val Val Thr Tyr Pro Glu Asn Gly Arg Leu Phe His Leu Thr Arg Thr 195 200 205 Val Thr Val Lys Val Val Gly Ser Pro 210 215

Claims (79)

  1. 항-IL1RAP 항체로서,
    (i) 제1 경쇄 초가변 영역(HVR-L1), 제2 경쇄 초가변 영역(HVR-L2) 및 제3 경쇄 초가변 영역(HVR-L3), 및/또는 (ii) 제1 중쇄 초가변 영역(HVR-H1), 제2 중쇄 초가변 영역(HVR-H2) 및 제3 중쇄 초가변 영역(HVR-H3)을 포함하되;
    (a) HVR-L1은 아미노산 서열 RASENIXXNXX(서열번호 10)를 포함하되, 위치 7에서의 X는 Y 또는 W이고, 위치 8에서의 X는 S, H, K, L, M, N, Q, R 또는 Y이고, 위치 10에서의 X는 L, A, G, I, M, N, Q, S, T, V 또는 Y이고, 그리고 위치 11에서의 X는 A, G, N, S 또는 T이고;
    (b) HVR-L2는 아미노산 서열 GXXNXAD(서열번호 36)를 포함하되, 위치 2에서의 X는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y이고, 위치 3에서의 X는 K, G 또는 N이고, 그리고 위치 5에서의 X는 L, F, H, W 또는 Y이고;
    (c) HVR-L3은 아미노산 서열 XXFXTXPRT(서열번호 62)를 포함하되, 위치 1에서의 X는 Q 또는 S이고, 위치 2에서의 X는 H 또는 S이고, 위치 4에서의 X는 W, A, F, G, H, I, K, L, M, V 또는 Y이고, 그리고 위치 6에서의 X는 T, I 또는 V이고;
    (d) HVR-H1은 아미노산 서열 XXXXXXX(서열번호 77)를 포함하되, 위치 1에서의 X는 F, A, D, E, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, W 또는 Y이고, 위치 2에서의 X는 S, E, G, K, P, Q, R 또는 T이고, 위치 3에서의 X는 N, D, E, G, K, Q 또는 R이고, 위치 4에서의 X는 Y, A, D, E, H, S 또는 V이고, 위치 5에서의 X는 A, N 또는 S이고, 위치 6에서의 X는 M, V 또는 W이고, 그리고 위치 7에서의 X는 S 또는 G이고;
    (e) HVR-H2는 아미노산 서열 TXXXXXXXXYXLXDVKG(서열번호 140)를 포함하되, 위치 2에서의 X는 V, A, N 또는 S이고, 위치 3에서의 X는 T 또는 S이고, 위치 4에서의 X는 E, D, N, T 또는 V이고, 위치 5에서의 X는 G, I, P, T 또는 V이고, 위치 6에서의 X는 G, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y이고, 위치 7에서의 X는 D, A, E, G, H, K, N, P, Q, R 또는 S이고, 위치 8에서의 X는 Y 또는 W이고, 위치 9에서의 X는 N, A, G, P 또는 R이고, 위치 11에서의 X는 C, A, D, F, R, S, T, V 또는 Y이고, 그리고 위치 13에서의 X는 D, S 또는 W이고;
    (f) HVR-H3은 아미노산 서열 XXDXXPYFXDY(서열번호 202)를 포함하되, 위치 1에서의 X는 A, G, S 또는 T이고, 위치 2에서의 X는 H, I, L, M, N, Q 또는 V이고, 위치 4에서의 X는 R, A, D, E, I, M, N, Q 또는 S이고, 위치 5에서의 X는 W 또는 F이고, 그리고 위치 9에서의 X는 F, L, M 또는 W인, 항-IL1RAP 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) HVR-L1은 서열번호 11 내지 35로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    (b) HVR-L2는 서열번호 37 내지 61로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    (c) HVR-L3은 서열번호 63 내지 76으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    (d) HVR-H1은 서열번호 78 내지 120으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    (e) HVR-H2는 서열번호 141 내지 201로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    (f) HVR-H3은 서열번호 203 내지 225로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항-IL1RAP 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    (a) HVR-L1은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고;
    (b) HVR-L2는 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하고;
    (c) HVR-L3은 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하고;
    (d) HVR-H1은 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하고;
    (e) HVR-H2는 서열번호 141, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190 및 191로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    (f) HVR-H3은 서열번호 203의 아미노산 서열을 포함하는, 항-IL1RAP 항체.
  4. 제1항에 있어서,
    (a) HVR-L1은 서열번호 11, 13 및 23으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    (b) HVR-L2는 서열번호 37, 38, 45, 49, 54 및 61로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    (c) HVR-L3은 서열번호 63, 67, 69, 70, 71, 75 및 76으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    (d) HVR-H1은 서열번호 78, 81, 90, 92 및 118로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    (e) HVR-H2는 서열번호 141, 144, 149, 153, 172, 181, 191, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200 및 201로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    (f) HVR-H3은 서열번호 203, 214, 215, 220 및 222로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항-IL1RAP 항체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체는 상보성 결정 영역 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하되,
    (a) CDR-L1은 아미노산 서열 RASENIXXNXX(서열번호 10)를 포함하되, 위치 7에서의 X는 Y 또는 W이고, 위치 8에서의 X는 S, H, K, L, M, N, Q, R 또는 Y이고, 위치 10에서의 X는 L, A, G, I, M, N, Q, S, T, V 또는 Y이고, 그리고 위치 11에서의 X는 A, G, N, S 또는 T이고;
    (b) CDR-L2는 아미노산 서열 GXXNXAD(서열번호 36)를 포함하되, 위치 2에서의 X는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y이고, 위치 3에서의 X는 K, G 또는 N이고, 그리고 위치 5에서의 X는 L, F, H, W 또는 Y이고;
    (c) CDR-L3은 아미노산 서열 XXFXTXPRT(서열번호 62)를 포함하되, 위치 1에서의 X는 Q 또는 S이고, 위치 2에서의 X는 H 또는 S이고, 위치 4에서의 X는 W, A, F, G, H, I, K, L, M, V 또는 Y이고, 그리고 위치 6에서의 X는 T, I 또는 V이고;
    (d) CDR-H1은 아미노산 서열 XXXXX(서열번호 121)를 포함하되, 위치 1에서의 X는 N, D, E, G, K, Q 또는 R이고, 위치 2에서의 X는 Y, A, D, E, H, S 또는 V이고, 위치 3에서의 X는 A, N 또는 S이고, 위치 4에서의 X는 M, V 또는 W이고, 그리고 위치 5에서의 X는 S 또는 G이고;
    (e) CDR-H2는 아미노산 서열 TXXXXXXXXYXLXDVKG(서열번호 140)를 포함하되, 위치 2에서의 X는 V, A, N 또는 S이고, 위치 3에서의 X는 T 또는 S이고, 위치 4에서의 X는 E, D, N, T 또는 V이고, 위치 5에서의 X는 G, I, P, T 또는 V이고, 위치 6에서의 X는 G, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y이고, 위치 7에서의 X는 D, A, E, G, H, K, N, P, Q, R 또는 S이고, 위치 8에서의 X는 Y 또는 W이고, 위치 9에서의 X는 N, A, G, P 또는 R이고, 위치 11에서의 X는 C, A, D, F, R, S, T, V 또는 Y이고, 그리고 위치 13에서의 X는 D, S 또는 W이고;
    (f) CDR-H3은 아미노산 서열 DXXPYFXDY(서열번호 226)를 포함하되, 위치 2에서의 X는 R, A, D, E, I, M, N, Q 또는 S이고, 위치 3에서의 X는 W 또는 F이고, 그리고 위치 7에서의 X는 F, L, M 또는 W인, 항-IL1RAP 항체.
  6. 제5항에 있어서,
    (a) CDR-L1은 서열번호 11 내지 35로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    (b) CDR-L2는 서열번호 37 내지 61로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    (c) CDR-L3은 서열번호 63 내지 76으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    (d) CDR-H1은 서열번호 122 내지 139로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    (e) CDR-H2는 서열번호 141 내지 201로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    (f) CDR-H3은 서열번호 227 내지 239로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항-IL1RAP 항체.
  7. 제5항에 있어서,
    (a) CDR-L1은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고;
    (b) CDR-L2는 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하고;
    (c) CDR-L3은 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하고;
    (d) CDR-H1은 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하고;
    (e) CDR-H2는 서열번호 141, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190 및 191로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    (f) CDR-H3은 서열번호 227의 아미노산 서열을 포함하는, 항-IL1RAP 항체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항체는,
    서열번호 240의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄 프레임워크 영역(FR-L1);
    서열번호 241의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄 프레임워크 영역(FR-L2);
    서열번호 242의 아미노산 서열을 포함하는 제3 경쇄 프레임워크 영역(FR-L3);
    서열번호 243의 아미노산 서열을 포함하는 제4 경쇄 프레임워크 영역(FR-L4);
    서열번호 249의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄 프레임워크 영역(FR-H1);
    서열번호 250의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 프레임워크 영역(FR-H2);
    서열번호 251의 아미노산 서열을 포함하는 제3 중쇄 프레임워크 영역(FR-H3);
    서열번호 252의 아미노산 서열을 포함하는 제4 중쇄 프레임워크 영역(FR-H4)
    을 포함하는, 항-IL1RAP 항체.
  9. 제1항에 있어서, 상기 항체는,
    서열번호 244의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄 프레임워크 영역(FR-L1);
    서열번호 245 또는 246의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄 프레임워크 영역(FR-L2);
    서열번호 247의 아미노산 서열을 포함하는 제3 경쇄 프레임워크 영역(FR-L3);
    서열번호 248의 아미노산 서열을 포함하는 제4 경쇄 프레임워크 영역(FR-L4);
    서열번호 253의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄 프레임워크 영역(FR-H1);
    서열번호 254의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 프레임워크 영역(FR-H2);
    서열번호 255의 아미노산 서열을 포함하는 제3 중쇄 프레임워크 영역(FR-H3);
    서열번호 256의 아미노산 서열을 포함하는 제4 중쇄 프레임워크 영역(FR-H4)
    을 포함하는, 항-IL1RAP 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 257, 258 또는 259로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열; 및/또는 서열번호 279, 285 또는 290으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열을 포함하는, 항-IL1RAP 항체.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 257과 적어도 90% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열 및/또는 서열번호 279와 적어도 90% 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열을 포함하는, 항-IL1RAP 항체.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 258 또는 259와 적어도 90% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열, 및/또는 서열번호 285 또는 290과 적어도 90% 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열을 포함하는, 항-IL1RAP 항체.
  13. 제10항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 257 내지 278로부터 선택된 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열을 포함하는, 항-IL1RAP 항체.
  14. 제10항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 279 내지 310으로부터 선택된 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열을 포함하는, 항-IL1RAP 항체.
  15. 제10항에 있어서, 상기 항체는,
    서열번호 259의 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열 및 서열번호 290의 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열;
    서열번호 268의 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열 및 서열번호 307의 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열;
    서열번호 268의 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열 및 서열번호 298의 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열;
    서열번호 269의 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열 및 서열번호 307의 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열;
    서열번호 269의 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열 및 서열번호 298의 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열;
    서열번호 269의 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열 및 서열번호 297의 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열;
    서열번호 270의 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열 및 서열번호 307의 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열; 또는
    서열번호 270의 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열 및 서열번호 298의 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열
    을 포함하는, 항-IL1RAP 항체.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 328, 329, 330 또는 331로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 경쇄(LC) 아미노산 서열; 및/또는 서열번호 332, 333, 334, 335 또는 336으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 중쇄(HC) 아미노산 서열을 포함하는, 항-IL1RAP 항체.
  17. 제14항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 328 내지 331로부터 선택된 경쇄(LC) 아미노산 서열을 포함하는, 항-IL1RAP 항체.
  18. 제14항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 332 내지 336로부터 선택된 중쇄(HC) 아미노산 서열을 포함하는, 항-IL1RAP 항체.
  19. 제14항에 있어서, 상기 항체는,
    서열번호 328의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 332의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
    서열번호 329의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 335의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
    서열번호 329의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 336의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
    서열번호 329의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 333의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
    서열번호 329의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 334의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
    서열번호 330의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 335의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
    서열번호 330의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 336의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
    서열번호 330의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 333의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
    서열번호 330의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 334의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
    서열번호 331의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 335의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
    서열번호 331의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 336의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
    서열번호 331의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 333의 중쇄(HC) 아미노산 서열; 또는
    서열번호 331의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 334의 중쇄(HC) 아미노산 서열
    을 포함하는, 항-IL1RAP 항체.
  20. 항-IL1RAP 항체로서,
    서열번호 11의 제1 경쇄 초가변 영역(HVR-L1), 서열번호 37의 제2 경쇄 초가변 영역(HVR-L2), 서열번호 63의 제3 경쇄 초가변 영역(HVR-L3); 및/또는 서열번호 78의 제1 중쇄 초가변 영역(HVR-H1), 서열번호 191의 제2 중쇄 초가변 영역(HVR-H2) 및 서열번호 203의 제3 중쇄 초가변 영역(HVR-H3);
    서열번호 11의 제1 경쇄 초가변 영역(HVR-L1), 서열번호 54의 제2 경쇄 초가변 영역(HVR-L2), 서열번호 63의 제3 경쇄 초가변 영역(HVR-L3); 및/또는 서열번호 78의 제1 중쇄 초가변 영역(HVR-H1), 서열번호 191의 제2 중쇄 초가변 영역(HVR-H2) 및 서열번호 215의 제3 중쇄 초가변 영역(HVR-H3);
    서열번호 11의 제1 경쇄 초가변 영역(HVR-L1), 서열번호 54의 제2 경쇄 초가변 영역(HVR-L2), 서열번호 63의 제3 경쇄 초가변 영역(HVR-L3); 및/또는 서열번호 78의 제1 중쇄 초가변 영역(HVR-H1), 서열번호 195의 제2 중쇄 초가변 영역(HVR-H2), 및 서열번호 203의 제3 중쇄 초가변 영역(HVR-H3);
    서열번호 11의 제1 경쇄 초가변 영역(HVR-L1), 서열번호 54의 제2 경쇄 초가변 영역(HVR-L2), 서열번호 63의 제3 경쇄 초가변 영역(HVR-L3); 및/또는 서열번호 78의 제1 중쇄 초가변 영역(HVR-H1), 서열번호 191의 제2 중쇄 초가변 영역(HVR-H2) 및 서열번호 215의 제3 중쇄 초가변 영역(HVR-H3);
    서열번호 11의 제1 경쇄 초가변 영역(HVR-L1), 서열번호 54의 제2 경쇄 초가변 영역(HVR-L2), 서열번호 69의 제3 경쇄 초가변 영역(HVR-L3); 및/또는 서열번호 78의 제1 중쇄 초가변 영역(HVR-H1), 서열번호 195의 제2 중쇄 초가변 영역(HVR-H2), 및 서열번호 203의 제3 중쇄 초가변 영역(HVR-H3);
    서열번호 11의 제1 경쇄 초가변 영역(HVR-L1), 서열번호 54의 제2 경쇄 초가변 영역(HVR-L2), 서열번호 70의 제3 경쇄 초가변 영역(HVR-L3); 및/또는 서열번호 78의 제1 중쇄 초가변 영역(HVR-H1), 서열번호 191의 제2 중쇄 초가변 영역(HVR-H2) 및 서열번호 215의 제3 중쇄 초가변 영역(HVR-H3); 또는
    서열번호 11의 제1 경쇄 초가변 영역(HVR-L1), 서열번호 54의 제2 경쇄 초가변 영역(HVR-L2), 서열번호 70의 제3 경쇄 초가변 영역(HVR-L3); 및/또는 서열번호 78의 제1 중쇄 초가변 영역(HVR-H1), 서열번호 195의 제2 중쇄 초가변 영역(HVR-H2), 및 서열번호 203의 제3 중쇄 초가변 영역(HVR-H3)
    을 포함하는, 항-IL1RAP 항체.
  21. 항-IL1RAP 항체로서,
    서열번호 11의 제1 경쇄 상보성 결정 영역(CDR-L1), 서열번호 37의 제2 경쇄 상보성 결정 영역(CDR-L2), 서열번호 63의 제3 경쇄 상보성 결정 영역(CDR-L3); 및/또는 서열번호 122의 제1 중쇄 상보성 결정 영역(CDR-H1), 서열번호 191의 제2 중쇄 상보성 결정 영역(CDR-H2) 및 서열번호 227의 제3 중쇄 상보성 결정 영역(CDR-H3);
    서열번호 11의 제1 경쇄 상보성 결정 영역(CDR-L1), 서열번호 54의 제2 경쇄 상보성 결정 영역(CDR-L2), 서열번호 63의 제3 경쇄 상보성 결정 영역(CDR-L3); 및/또는 서열번호 122의 제1 중쇄 상보성 결정 영역(CDR-H1), 서열번호 191의 제2 중쇄 상보성 결정 영역(CDR-H2) 및 서열번호 229의 제3 중쇄 상보성 결정 영역(CDR-H3);
    서열번호 11의 제1 경쇄 상보성 결정 영역(CDR-L1), 서열번호 54의 제2 경쇄 상보성 결정 영역(CDR-L2), 서열번호 63의 제3 경쇄 상보성 결정 영역(CDR-L3); 및/또는 서열번호 122의 제1 중쇄 상보성 결정 영역(CDR-H1), 서열번호 195의 제2 중쇄 상보성 결정 영역(CDR-H2) 및 서열번호 227의 제3 중쇄 상보성 결정 영역(CDR-H3);
    서열번호 11의 제1 경쇄 상보성 결정 영역(CDR-L1), 서열번호 54의 제2 경쇄 상보성 결정 영역(CDR-L2), 서열번호 63의 제3 경쇄 상보성 결정 영역(CDR-L3); 및/또는 서열번호 122의 제1 중쇄 상보성 결정 영역(CDR-H1), 서열번호 191의 제2 중쇄 상보성 결정 영역(CDR-H2) 및 서열번호 229의 제3 중쇄 상보성 결정 영역(CDR-H3);
    서열번호 11의 제1 경쇄 상보성 결정 영역(CDR-L1), 서열번호 54의 제2 경쇄 상보성 결정 영역(CDR-L2), 서열번호 69의 제3 경쇄 상보성 결정 영역(CDR-L3); 및/또는 서열번호 122의 제1 중쇄 상보성 결정 영역(CDR-H1), 서열번호 195의 제2 중쇄 상보성 결정 영역(CDR-H2) 및 서열번호 227의 제3 중쇄 상보성 결정 영역(CDR-H3);
    서열번호 11의 제1 경쇄 상보성 결정 영역(CDR-L1), 서열번호 54의 제2 경쇄 상보성 결정 영역(CDR-L2), 서열번호 70의 제3 경쇄 상보성 결정 영역(CDR-L3); 및/또는 서열번호 122의 제1 중쇄 상보성 결정 영역(CDR-H1), 서열번호 191의 제2 중쇄 상보성 결정 영역(CDR-H2) 및 서열번호 229의 제3 중쇄 상보성 결정 영역(CDR-H3); 또는
    서열번호 11의 제1 경쇄 상보성 결정 영역(CDR-L1), 서열번호 54의 제2 경쇄 상보성 결정 영역(CDR-L2), 서열번호 70의 제3 경쇄 상보성 결정 영역(CDR-L3); 및/또는 서열번호 122의 제1 중쇄 상보성 결정 영역(CDR-H1), 서열번호 195의 제2 중쇄 상보성 결정 영역(CDR-H2) 및 서열번호 227의 제3 중쇄 상보성 결정 영역(CDR-H3)
    을 포함하는, 항-IL1RAP 항체.
  22. 항-IL1RAP 항체로서,
    서열번호 259의 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열 및 서열번호 290의 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열;
    서열번호 268의 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열 및 서열번호 307의 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열;
    서열번호 268의 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열 및 서열번호 298의 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열;
    서열번호 269의 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열 및 서열번호 307의 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열;
    서열번호 269의 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열 및 서열번호 298의 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열;
    서열번호 269의 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열 및 서열번호 297의 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열;
    서열번호 270의 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열 및 서열번호 307의 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열; 또는
    서열번호 270의 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열 및 서열번호 298의 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열
    을 포함하는, 항-IL1RAP 항체.
  23. 항-IL1RAP 항체로서,
    서열번호 328의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 332의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
    서열번호 329의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 335의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
    서열번호 329의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 336의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
    서열번호 329의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 333의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
    서열번호 329의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 334의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
    서열번호 330의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 335의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
    서열번호 330의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 336의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
    서열번호 330의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 333의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
    서열번호 330의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 334의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
    서열번호 331의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 335의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
    서열번호 331의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 336의 중쇄(HC) 아미노산 서열;
    서열번호 331의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 333의 중쇄(HC) 아미노산 서열; 또는
    서열번호 331의 경쇄(LC) 아미노산 서열 및 서열번호 334의 중쇄(HC) 아미노산 서열의 중쇄(HC) 아미노산 서열
    을 포함하는, 항-IL1RAP 항체.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간 IL1RAP에 1×10-8 M 이하, 1×10-9 M 이하, 1×10-10 M 이하 또는 1×10-11 M 이하의 결합 친화도로 결합하고; 선택적으로, 상기 결합 친화도는 서열번호 3의 hu-M-IL1RAP 폴리펩타이드에 대한 평형 해리 상수(KD)에 의해 측정되는, 항-IL1RAP 항체.
  25. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 IL-1 자극된 신호, IL-33 자극된 신호, 및/또는 IL-36 자극된 신호를 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%만큼 감소되되; 선택적으로, 신호의 감소는 세포-기반 차단 검정에 의해 측정되는, 항-IL1RAP 항체.
  26. 제25항에 있어서, 상기 항체는 IL-1 자극된 신호, IL-33 자극된 신호, 및 IL-36 자극된 신호를 적어도 95% 또는 적어도 99%만큼 감소시키는, 항-IL1RAP 항체.
  27. 제25항에 있어서, 상기 IL-1, IL-33 및/또는 IL-36 자극된 신호는 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ로부터 선택된 작용제에 의해 자극되는, 항-IL1RAP 항체.
  28. 제25항에 있어서, 약 EC50의 작용제 농도에서, 상기 항체는 10nM 이하, 5nM 이하 또는 1nM 이하의 IC50을 갖는, 항-IL1RAP 항체.
  29. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 이의 동족체 수용체에 대한 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ 작용제 결합 중 하나 이상에 의해 개시되는 세포내 신호를 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%만큼 감소시키되; 선택적으로, 세포내 신호의 감소는 세포-기반 차단 검정에 의해 측정되는, 항-IL1RAP 항체.
  30. 제29항에 있어서, 상기 항체는 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ 작용제 결합에 의해 개시되는 세포내 신호를 적어도 95% 또는 적어도 99%만큼 감소시키는, 항-IL1RAP 항체.
  31. 제29항에 있어서, 약 EC50의 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ 농도에서, 상기 항체는 10nM 이하, 5nM 이하 또는 1nM 이하의 IC50을 갖는, 항-IL1RAP 항체.
  32. 제31항에 있어서, 약 EC50의 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ 농도에서, 상기 항체는 5nM 이하의 IC50을 갖는, 항-IL1RAP 항체.
  33. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 원발성 인간 폐 섬유아세포(primary human lung fibroblast: PHLF)로부터의 IL8의 IL-1α, IL-1β 및/또는 IL-36β 자극된 방출을 저해하되; 선택적으로, 약 EC50의 IL-1α, IL-1β 및/또는 IL-36β 농도에서, 상기 항체는 10nM 이하, 5nM 이하 또는 1nM 이하의 IC50을 갖는, 항-IL1RAP 항체.
  34. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 원발성 인간 단핵구로부터 IL6의 IL-1β 자극된 방출을 저해하되; 선택적으로, 약 EC50의 IL-1β 농도에서, 상기 항체는 10nM 이하, 5nM 이하 또는 1nM 이하의 IC50을 갖는, 항-IL1RAP 항체.
  35. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간 자연살해(natural killer: NK) 세포로부터 INF-γ의 IL-33 자극된 방출을 저해하되; 선택적으로, 약 EC50의 IL-33 농도에서, 상기 항체는 10nM 이하, 5nM 이하 또는 1nM 이하의 IC50을 갖는, 항-IL1RAP 항체.
  36. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간 표피 각질세포(human epidermal keratinocyte: HEKn)로부터 IL8의 IL-36β 자극된 방출을 저해하되; 선택적으로, 약 EC60의 IL-36β 농도에서, 상기 항체는 10nM 이하, 5nM 이하 또는 2nM 이하의 IC50을 갖는, 항-IL1RAP 항체.
  37. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 호염기구에서 IL-33 자극된 인산화를 저해하되; 선택적으로, 약 EC56의 IL-33 농도에서, 상기 항체는 75nM 이하, 50nM 이하 또는 45nM 이하의 IC50을 갖는, 항-IL1RAP 항체.
  38. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 CD4+ T 세포로부터 INF-γ의 IL-33 자극된 방출을 저해하되; 선택적으로, 약 EC34의 IL-33 농도에서, 상기 항체는 75nM 이하, 50nM 이하 또는 45nM 이하의 IC50을 갖는, 항-IL1RAP 항체.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간 IL1RAP의 도메인 3 내에서 하나 이상의 아미노산 잔기에 특이적으로 결합하되, 도메인 3은 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열의 위치 238 내지 367을 포함하는, 항-IL1RAP 항체.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열의 위치 243 내지 255, 위치 257 내지 268 및/또는 위치 333 내지 336에 특이적으로 결합하는, 항-IL1RAP 항체.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간 IL1RAP의 도메인 1 또는 도메인 2 내에서 아미노산 잔기에 결합하지 않되; 선택적으로, 도메인 1 및 도메인 2는 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열의 위치 21 내지 237을 포함하는, 항-IL1RAP 항체.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 8의 시노몰구스 원숭이 IL1RAP 폴리펩타이드와 교차반응하는, 항-IL1RAP 항체.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 9의 마우스 IL1RAP 폴리펩타이드와 교차반응하는, 항-IL1RAP 항체.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단클론성 항체인, 항-IL1RAP 항체.
  45. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 재조합 항체인, 항-IL1RAP 항체.
  46. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 키메라 항체인, 항-IL1RAP 항체.
  47. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간화 또는 인간 항체인, 항-IL1RAP 항체.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 F(ab')2, Fab', Fab, Fv, 단일 도메인 항체(VHH), 단일-아암 항체(single-arm antibody) 및 scFv로 이루어진 군으로부터 선택적으로 선택된 항체 단편인, 항-IL1RAP 항체.
  49. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 부류 IgG의 전장 항체이고; 선택적으로, 상기 부류 IgG 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택된 아이소타입을 갖는, 항-IL1RAP 항체.
  50. 제49항에 있어서, 상기 항체는 Fc 영역 변이체이되; 선택적으로 상기 Fc 영역 변이체는 효과기 기능을 변화시키거나 또는 반감기를 변화시키고; 선택적으로, 상기 반감기는 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일 이상으로 증가되는, 항-IL1RAP 항체.
  51. 제50항에 있어서, 상기 Fc 영역 변이체는 YTE 돌연변이의 세트를 포함하되; 선택적으로 상기 YTE 돌연변이는 아미노산 치환: M252Y, S254T 및 T256E를 포함하는, 항-IL1RAP 항체.
  52. 제50항에 있어서, 상기 Fc 영역 변이체는 무효과기 항체에서 효과기 기능 및/또는 결과를 감소시키는, 항-IL1RAP 항체.
  53. 제52항에 있어서, 상기 Fc 영역 변이체는 위치 297에서 아미노산 치환을 포함하되; 선택적으로 위치 297에서의 아미노산 치환은 N297G인, 항-IL1RAP 항체.
  54. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 면역접합체이되; 선택적으로, 면역접합체는 IL1RAP-매개 병태 또는 질환의 치료를 위한 치료제를 포함하고; 선택적으로, 상기 치료제는 암의 치료를 위한 화학요법제 또는 세포독성제인, 항-IL1RAP 항체.
  55. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 다중특이적 항체, 선택적으로 이중특이적 항체인, 항-IL1RAP 항체.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 면역글로불린 스캐폴드 또는 면역글로불린 프레임워크 이외의 스캐폴드, 선택적으로 대체 단백질 스캐폴드, 및 인공 중합체 스캐폴드로부터 선택된 스캐폴드 상에 이식된 CDR을 포함하는 합성 항체인, 항-IL1RAP 항체.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 항체와 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-IL1RAP 항체.
  58. 항-IL1RAP 항체로서, 상기 항체는 IL1RAP의 도메인 3 내에서 하나 이상의 아미노산 잔기에 특이적으로 결합하되, 도메인 3은 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열의 위치 238 내지 367을 포함하는, 항-IL1RAP 항체.
  59. 제58항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열의 위치 243 내지 255, 위치 257 내지 268, 및/또는 위치 333 내지 336에 특이적으로 결합하는, 항-IL1RAP 항체.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 항체를 암호화하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  61. 제60항에 있어서, 신호 펩타이드(SP)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  62. 제60항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 경쇄 및 중쇄를 암호화하는, 폴리뉴클레오타이드.
  63. 제60항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 포유류 세포에서 상기 항체의 최적 발현을 위하여 선택된 하나 이상의 코돈을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  64. 제60항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 상기 항체의 최적 발현을 위하여 선택된 하나 이상의 코돈을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  65. 제60항 내지 제64항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  66. 제65항의 벡터를 포함하는, 단리된 숙주 세포.
  67. 제60항 내지 제64항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 숙주 세포.
  68. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 항체를 발현하는, 단리된 숙주 세포.
  69. 제68항에 있어서, 상기 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 골수종 세포(예컨대, Y0, NS0, Sp2/0), 원숭이 신장 세포(COS-7), 인간 배아 신장 세포(293), 베이비 햄스터 신장 세포(BHK), 마우스 세르톨리 세포(예컨대, TM4), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76), 인간 자궁경부 암종 세포(HELA), 개 신장 세포, 인간 폐 세포(W138), 인간 간 세포(Hep G2), 마우스 유선 종양 세포, TRI 세포, MRC 5 세포 및 FS4 세포로부터 선택되는, 숙주 세포.
  70. 항체를 생산하는 방법으로서, 상기 항체가 생산되도록 제66항 내지 제69항 중 어느 한 항의 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항체를 생산하는 방법.
  71. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 항체를 생산하는, 하이브리도마.
  72. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  73. 제72항에 있어서, 상기 조성물은 IL-1, IL-33, IL-36 및/또는 IL1RAP-매개 질환 또는 병태의 치료를 위한 치료제를 더 포함하되; 선택적으로, 상기 치료제는 화학요법제인, 약제학적 조성물.
  74. 대상체에서 IL1RAP 매개 질환을 치료하는 방법으로서,
    상기 대상체에게 치료적 유효량의 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 항체 또는 치료적 유효량의 제72항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, IL1RAP 매개 질환을 치료하는 방법.
  75. 대상체에서 IL-1, IL-33 및/또는 IL-36 신호전달에 의해 매개된 질환을 치료하는 방법으로서,
    상기 대상체에게 치료적 유효량의 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 항체 또는 치료적 유효량의 제72항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, IL1RAP 매개 질환을 치료하는 방법.
  76. 대상체에서 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ 자극된 신호전달에 의해 매개된 질환을 치료하는 방법으로서,
    상기 대상체에게 치료적 유효량의 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 항체 또는 치료적 유효량의 제72항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, IL1RAP 매개 질환을 치료하는 방법.
  77. 제74항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환은 여드름, 급성 췌장염, 급성 중증 궤양성 결장염, 성인발병 스틸병, 연령 관련 황반 변성(AMD), 기도 과민증(airway hyperresponsiveness), 기도 염증, 알레르기 결막염, 알레르기성 비염, 알레르기, 알츠하이머병, 근위축성 축삭경화증(ALS), 아나팔락시스, 관절염 통증, 천식, 죽상동맥경화증, 아토피 피부염, 아토피 습진, 자가면역 혈관염, 베체트병, 골암, 뇌암, 유방암, 악액질/식욕부진, 연골 손상, 대뇌 허혈증, 만성 피로 증후군, 만성 폐쇄성 폐질환, 클로스트리듐 연관 질병, 결장암, 울혈성 심부전, 결막염, 관상동맥 우회로 이식술, 관상동맥 재협착증, 크론병, 당뇨병, 당뇨성 황반부종, 당뇨성 망막병증, 안구 건조증, 자궁내막증, 호산구-연관 위장관 장애, 호산성 식도염, 가족성 한랭 자가염증 증후군, 가족성 지중해열, 열, 섬유근육통, 섬유증 장애, 식품 알레르기, 범발성 농포성 건선, 녹내장, 사구체신염, 통풍 관절염, 이식편대숙주질환, 기생충 감염, 출혈성 쇼크, 화농성 한선염, 통각과민증, 과-IgD 증후군, 고요산혈증, 특발성 폐섬유증(IPF), 암-관련 통증, 감염, 염증성 장 질환(IBD), 좌상(strain)에 기인한 염증성 병태, 각막 이식과 연관된 염증성 안질환, 염증성 통증, 인플루엔자, 장암, 허혈, 연소성 관절염(juvenile arthritis), 가와사키병, 신장암, 레버 선천성 흑내장, 간암, 간 질환, 폐암, 머클-웰스 증후군, 다중 골수종, 다발성 경화증, 근골격 통증, 골수성 및 기타 백혈병, 심근 기능 장애, 근병증, 비용종, 신생아 시작 다발계 염증성 질환, 신경독성, 비감염성 결막염, 비소세포 폐암, 정형외과적 수술(orthopedic surgery), 골관절염, 골다공증, 통증, 수장족 저농포증, 췌장암, 파킨슨병, 치주질환, 말초혈관병, 류마티스성 다발근통, 결절성 맥락막 혈관병증(PCV), 조기산통, 전립선암, 원충 감염, 건선, 건선성 관절염, 괴저성 농피증, 재관류 손상, 호흡기세포융합바이러스(RSV), 재협착증, 망막 박리, 망막색소변성증, 미숙아 망막증(ROP), 류마티스 관절염, 패혈증, 겸상적혈구빈혈증, 방사선 요법으로부터의 부작용, 부비강염, 피부암, 수면장애, 염좌(sprain), 스타르가르트병, 위암, 악관절 질환(temporal mandibular joint disease), TNF 수용체 연관 주기성 증후군, 이식 거부증, 외상, 외상성 눈 부상, 제2형 당뇨병, 궤양성 결장염 및 포도막염으로부터 선택되는, 방법.
  78. 대상체에서 천식을 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 치료적 유효량의 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 항체 또는 치료적 유효량의 제73항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 천식을 치료하는 방법.
  79. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 치료적 유효량의 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 항체 또는 치료적 유효량의 제73항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하되; 선택적으로, 상기 암은 유방암, 결장직장암, 비소세포 폐암, 췌장암으로부터 선택되는, 암을 치료하는 방법.
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