CN107056946A

CN107056946A - 一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体及制备方法和应用

Info

Publication number: CN107056946A
Application number: CN201611236387.6A
Authority: CN
Inventors: 徐振林; 陈子键; 雷红涛; 刘辉; 王弘; 孙远明; 杨金易
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2016-12-28
Filing date: 2016-12-28
Publication date: 2017-08-18

Abstract

本发明公开了一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体及制备方法和应用。Fab抗体包括轻链和重链，所述重链具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列；所述轻链具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。本发明提供的Fab抗体与抗原的结合可被游离的半抗原竞争性抑制，IC₅₀为135.7ng/mL，具有很好的抗原结合活性。通过标准曲线可知线性检测范围分别在7.2～861.7 ng/mL之间。

Description

一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及食品安全免疫检测技术领域，具体地，涉及一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体及制备方法和应用。

背景技术

我国是农业大国，同时也是农药生产与使用大国。有机磷是当今农药中主要类别之一，其应用几乎遍及了整个农药领域。当今，市面上有机磷农药商品不胜枚举，特别在杀虫剂方面，有机磷类农药的使用量也是长年鳌居首位。然而，农药是一把“双刃剑”。全世界因有机磷农药急性中毒引起的死亡每年超过20万人，而由于长期低剂量接触有机磷农药而引起的肿瘤、生殖毒性及神经毒性等潜在中毒人数无法估计。尽管一些高毒的有机磷农药(如对硫磷等)的使用已经被明令禁止，但是在农产品及环境中仍有残留，此外，一些中低毒的有机磷农药(如三唑磷、毒死蜱和治螟磷等)作为高毒农药替代品正在农业生产中广泛应用。近几年卫生部对市面所售叶类蔬菜进行卫生监督抽查，结果显示，有机磷等禁用农药仍然是叶类蔬菜抽检不合格的主要原因。农药残留问题不仅仅危害到国内民众的健康，还会影响我国在国际贸易中的地位和形象。在国际市场上，日趋严格的农药残留标准已成为发达国家或农产品进口国重要的技术贸易壁垒手段，然而，在我国趋于恶化的农产品农药残留问题已成为制约农产品贸易的首要因素之一，据统计，因有机磷农药多残留问题每年给我国的农产品贸易都带来了巨额的经济损失。为保证居民健康诉求，避免农药残留技术壁垒对我国农产品出口的影响，加强对此类农药的检测十分必要。

目前国内外检测有机磷农药的常用方法主要集中在仪器方法如高效液相色谱-质谱联用等方法以及酶抑制法，这些方法样品预处理要求高、步骤复杂、操作需专业人员、检测费用高、所依赖仪器昂贵复杂、费时费力，很难适应许多场合快速检测的需要，在应用上不能广泛推广。而酶抑制法技术具有快速、简便、低成本等特点，特别适合现场大批样品的筛选检测，易于推广普及。但是稳定性较差、性能差异性较大的酶制剂导致其准确度和可靠性均不太理想，无法满足日趋严格的残留限量标准。

基于抗原-抗体特异性结合的免疫分析法具有样品前处理简便、操作简单、快速、灵敏、高通量等特点，被誉为是21世纪最具竞争和挑战的快速检测技术，在食品安全领域具有广阔的应用前景。

随着人们对抗体基因结构与功能的深入了解和分子生物学技术的发展及向各学科渗透，小分子有害物的特异性抗体制备正在朝着第三代抗体——基因工程抗体的方向发展。基因工程抗体最显著的优势之一在于其分子量小，易于获得抗体蛋白及其编码序列，因此可以在分子水平对其进行进化改造，实现抗体性能的可控性。基因工程抗体技术，是将对免疫球蛋白基因结构与功能的认识与DNA重组技术有机结合，在基因水平上对免疫球蛋白分子的基因片段进行重组后，转入真核或原核表达系统中表达，形成基因工程重组抗体。应用DNA重组和蛋白质工程技术可以按人们的意愿在基因水平上对抗体分子进行切割、拼接或修饰，重新组装成新型抗体分子，并可赋予抗体分子新的生物学活性。

Fab片段是将重链Fd(VH+CH1)段基因与完整的轻链基因5’端接上细菌的信号序列，所表达的蛋白在细菌信号肽的引导下可分泌到周质腔，信号肽被信号肽酶所裂解，生成的Fd段和轻链在周质腔中完成立体折叠和链内链间二硫键形成异二聚体，成为有功能的Fab。这种小分子抗体具有抗体的活性，而大小为完整抗体的三分之一。目前，还没有针对二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药(DPPS)的Fab抗体。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体。

本发明的另一个目的是提供一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体的制备方法。

本发明的在一个目的是提供一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体，包括轻链和重链，所述重链具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO:1所示序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸但与SEQ ID NO:1所示序列具有相同功能的氨基酸序列；所述轻链具有SEQID NO:2所示的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO:2所示序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸但与SEQ ID NO:2所示序列具有相同功能的氨基酸序列。

一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体，包括轻链和重链，所述重链具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO:3所示序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸但与SEQ ID NO:3所示序列具有相同功能的核苷酸序列；所述轻链具有SEQID NO:4所示的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO:4所示的序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸但与SEQ ID NO:4所示序列具有相同功能的核苷酸序列。

一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体的制备方法，包括如下步骤：将SEQ ID NO:3所示的重链和SEQ ID NO:4所示的轻链与载体质粒连接并进行鉴定之后，转化受体菌株，筛选阳性重组受体菌株，经表达优化后，获得抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体。

作为优选实施方案，所述载体质粒为pComb3XSS质粒，所述受体菌株为大肠杆菌TOP 10F’。

更优选地，所述阳性重组大肠杆菌TOP 10F’的表达优化条件为IPTG诱导浓度为0.1～0.2mM，表达温度为18～20℃，表达时间为10～14h。最优选地，所述阳性重组大肠杆菌XL1-Blue的表达优化条件为IPTG诱导浓度为0.1mM，表达温度为18℃，表达时间为12h。

最优选地，一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体的制备方法，包括如下步骤：

如上所述的抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体在检测二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药中的应用。

本发明提供的Fab抗体可以用于检测所有含有二乙氧基硫代磷酸醋共有结构的有机磷农药，优选地，所述二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药为蝇毒磷、对硫磷、除线磷、辛硫磷、喹硫磷、三唑磷、伏杀硫磷、甲拌磷、毒死蜱、乙基溴硫磷、治螟磷、氯唑磷、二嗪磷或乙基嘧啶磷中的一种或多种。

优选地，所述检测的具体技术手段可以是酶联免疫分析法或其他分析方法。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明制备的基因工程抗体是针对抗DPPS的单克隆抗体的抗原结合片断；本发明建立的ELISA检测方法是的基于Fab基因工程抗体的同时检测DPPS多残留的ELISA检测方法，可实施大量样品的快速检测筛选，降低成本。本发明的Fab抗体保持了亲本抗体的抗原亲和活性和特异性的功能性抗体片段，具有较高稳定性和灵敏度，可通过基因工程技术体外表达得到，可在细菌中很经济的大规模生产，避免单克隆细胞阳性丢失风险。

附图说明

图1为pComb3XSS-Fab噬粒载体构建示意图。

图2为pComb3XSS噬粒载体图。

图3为icELISA测定Fab抗体标准曲线。

图4为Fab抗体三维同源建模模型图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

Fab重组质粒的构建筛选与鉴定

1.1总mRNA提取

S1.与RNA实验操作相关的PCR管，离心管，枪头，镊子等耗材及器具就先用0.1％DEPC溶液完全浸泡，次日倒尽DEPC溶液，高压灭菌备用；

S2.将培养好约1×10⁷杂交瘤细胞12C2((Xu et al.Analytical Chemistry,2010,82,9314-9321)悬浮后加入到15mL离心管中，1000r/min离心沉淀细胞，弃上清液，用枪头尽量吸尽残液；

S3.加入2mL Trizol，用枪头反复抽吸，混匀细胞，室温下放置5min；

S4.将此溶液各1mL分装在两个1.5mL无RNAase的离心管中，分别加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min后，4℃，12000r/min离心15min；

S5.小心吸取上层透明溶液(含RNA)到两个新的1.5mL无RNAase的离心管中(约500μL)，分别加入500μL异丙醇，涡旋混匀，4℃，12000r/min离心15min；

S6.弃上清，在吸水纸上扣干残留液体，加入1mL 75％的乙醇，涡将白色沉淀悬浮，4℃下7500r/min离心5min，弃上清，在吸水纸上扣干残留液体，并用移液枪尽量吸干管底液体，空气中挥干残留乙醇；

S7.用RNAase水30～50μL溶解RNA沉淀，取1μL稀释到1mL，于核酸蛋白分析仪上测定RNA含量与纯度。

1.2cDNA第一链合成：cDNA试剂盒购自香港莱德尔公司，参照试剂盒说明书进行。取总RNA约10μg，70℃加热5min以除去二级结构，立即置于冰上，于2min内准备好反应体系。将所有溶液混匀，短暂离心后，25℃退火10min，42℃,20min(反转录合成cDNA第一链)，95℃,5min(反转录酶灭活)，反应产物置于冰上。

1.3κ链(轻链)、Fd段(重链)基因序列PCR扩增及鉴定

引物序列见表1，其中上游引物Mκ51、Mκ52、Mκ53三条引物混合与下游引物Mκ3配对用于扩增抗体κ链基因，分别含有限制性酶切位点SacI、XbaI。上游引物MH5、下游引物MH3两条引物配对用于扩增抗体Fd段基因，分别含有限制性酶切位点XhoI、SpeI。

PCR反应体系见表2，PCR反应条件：94℃变性5min，进行以下循环：94℃,50s，55℃,50s，72℃,50s，共30个循环，最后72℃延伸8min。反应完毕后，取反应产物5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。扩增后的PCR产物用PCR清洁试剂盒(北京天根生物技术有限公司)进行切胶纯化。纯化后的κ链、Fd段基因目的片段用pEASY-Blunt Simple Cloning Kit试剂盒(北京全式金生物有限公司)进行T载体连接以及转化。挑取单克隆阳性转化菌落进行培养、质粒提取并进行双酶切和测序鉴定。

表1为PCR扩增所用兼并引物

表2为κ链、Fd段基因序列扩增PCR反应体系

cDNA第一链反应物(约10μg)	2μL
		10×PCR Buffer	2μL
dNTP(2.5mmol/L)	1.2μL
		MgCl₂(25mmol/L)	1.2μL
Mκ5/MH5混合引物(10μmol/L)	0.6μL
		Mκ3/MH3引物(10μmol/L)	0.6μL
rTaq酶(20U/μL)	0.4μL
		无菌纯水	12μL
总体积	20L

1.3 pComb3XSS重组质粒的构建

pComb3XSS重组质粒的构建如图1所示，κ链、Fd段序列以及pComb3XSS(图2)质粒进行双酶切，反应体系见表3～5。反应条件：37℃反应3小时或4℃反应过夜。酶切后的κ链、Fd段片段与pComb3XSS载体的进行连接，反应体系见表6，反应条件：22℃反应1小时或4℃反应过夜。

表3为κ链双酶切体系

pEASY-T3-κ质粒(约200ng)	8μL
		10×Buffer	5μL
SacI	2μL
		XbaI	2μL
无菌纯水	33μL
		总体积	50μL

表4为Fd段双酶切体系

pEASY-T3-κ质粒(约200ng)	8μL
		10×Buffer	5μL
SpeI	2μL
		XhoI	2μL
无菌纯水	33μL
		总体积	50μL

表5为pComb3XSS双酶切体系

pComb3XSS质粒(约200ng)	8μL
		10×Buffer	5μL
SpeI	2μL
		SacI	2μL
无菌纯水	33μL
		总体积	50μL

表6为pComb3XSS连接体系

双酶切κ链/Fd段纯化产物(60ng)	4μL
		预双酶切pComb3XSS(100ng)	4μL
10×Buffer	1μL
		T4连接酶	1μL
总体积	10μL

1.4κ链、Fd段双酶切片段与pComb3XSS载体连接产物的转化

将5μL的连接产物加入到50μL以上制备好的XL1-Blue感受态细胞中，轻轻旋转以混匀内容物，置于冰上。将管放入预冷至0℃的电击杯中，放置于预冷电击仪内，启动电穿孔开关，结束后将感受态细胞吸出。加入1mL 2×YT培养基中，37℃，250r/min振荡培养45min；取100μL菌液涂布于LB-AG平板上，37℃静置培养过夜。

1.5 pComb3XSS重组质粒的phage-ELISA筛选

式(I)展示半抗原结构(专利公开号CN 101475587A)，通过活泼酯法偶联到OVA，形成包被原。半抗原-OVA包被抗原用包被液稀释至1μg/mL，100μL/孔加入到酶标板上，4℃孵育过夜。弃孔中溶液，用PBST洗涤2次，将封闭液150μL/孔加入到酶标板上，37℃孵育3h。弃孔中溶液，37℃烘干后，4℃避光保存，用于phage-ELISA筛选。

酶切鉴定含κ链与Fd段两个插入片段的单菌落，以1mL含0.1μg/mL Amp 的2×YT培养基过夜培养，加入30μL 5×10¹⁰pfu/mL辅助噬菌体VCSM13，30℃，250r/min振荡培养12h。取诱导菌液，50μL/孔加到酶标板上，3个平行，加入50μL/孔0.01M PBS。同时以包被了OVA蛋白的酶标板作为空白对照。37℃温育1h，PBST(0.01M PBS含有0.5％吐温-20)洗涤4次，加入100μL抗M13抗体-HRP二抗(用PBST 1:5000稀释)，37℃温育1h，PBST洗涤4次，加入100μL的TMB底物液，37℃反应15min至出现明显蓝色，加入50μL终止液终止反应，用酶标仪测定OD₄₅₀nm。以A₄₅₀nm值大于阴性对照3倍以上判定为阳性。获得的阳性克隆后，进行过夜培养，抽提的质粒为阳性pComb3XSS-重组质粒。

实施例2 Fab抗体基因序列测定及同源建模

取经phage-ELISA筛选阳性验证的大肠杆菌菌株进行序列测定，测序引物为通用引物OmpA和gback。Fab抗体重链可变区氨基酸序列见SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。Fab抗体重链可变区核苷酸序列见SEQID NO：3所示的氨基酸序列；轻链可变区核苷酸序列SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。重链采用同源性为90.54，Coverage为99％的蛋白质(PDB ID:1WC7)为模板，轻链采用同源性为96.73，Coverage为100％的蛋白质(PDB ID:1WEJ)为模板。Fab三维图形如图4所示。

实施例3 Fab可溶性表达

本发明所采用的pComb3XSS噬粒载体是含有噬菌体基因间隔区的质粒载体，它综合了噬菌体和质粒载体的优点，噬粒在多克隆位点与gⅢ之间有一个琥珀酸终止子(AmberStop Codon)，当重组噬菌体pComb3XSS-Fab转化抑制型大肠杆菌XL1-Blue时，琥珀酸终止子被通读成谷氨酸，结果抗体融合蛋白会表达在噬菌体的表面，即噬菌体表面展示。当pComb3XSS-Fab转化非抑制型的大肠杆菌TOP 10F’，琥珀酸终止子被辨认为终止密码子，通过乳糖类似物IPTG的诱导，抗体表达后分泌到胞浆中，成为可溶性分子。

将阳性pComb3XSS重组质粒转化大肠杆菌TOP 10F’，其步骤如下：

S1.从-70℃冰箱取出冻存的TOP 10F’感受态细胞(50μL)，冰上融化，加在1.5mL离心管中，轻轻混匀，冰上静置30min，然后42℃水浴热击90s，于冰上放置1～2min。

S2.随后加入950μL 2×YT培养基，置于37℃摇床中，200r/min振荡培养1h，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。

S3.取适量菌液涂布于含有Amp的LB平板上，倒置37℃静置过夜。同时做未转化菌对照。

S4.阳性pComb3XSS-Fab重组质粒带有氨苄抗性标记，在抗氨苄青霉素的LB平板上挑取白色菌落，接种于10mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃条件下，200r/min振荡培养过夜。

将转化至TOP 10F’的阳性pComb3XSS克隆子接种于10mL 2×YT培养基中，37℃，250r/min振荡培养过夜。取过夜培养菌液2mL加入到100mL 2×YT培养基中，37℃，250r/min振荡培养至A600nm为0.6～0.8，补加IPTG，250r/min振荡培养过夜表达。同时以不含质粒的空菌TOP 10F’设置为阴性对照。

优选地，IPTG诱导浓度为0.1mM。

优选地，表达温度为18℃。

优选地，表达时间为12小时。

实施例4 Fab可溶性蛋白提取

本发明采用Tris-蔗糖法提取大肠杆菌周质腔中的Fab蛋白。其具体步骤如下：

S1.取200mL已经过表达的菌液，8000rpm离心15min，弃掉上清液。加入20mL Tris-蔗糖-EDTA溶液，用移液枪把沉积在离心管底部的细菌吹散，然后搅拌10min。

S2.将搅拌后的菌液8000rpm离心，离心温度为4℃，离心时间为10min。离心后弃掉上清。

S3.加入10mL冰冻的5mmol/L MgSO₄溶液，用移液枪把沉积在离心管底部的细菌吹散。在冰上缓慢搅拌1h，此时周质腔蛋白被释放到溶液中，然后8000rpm离心，离心温度为4℃，离心时间为10min，取上清液，上清液即为Fab蛋白提取液。

实施例5 Fab可溶性蛋白ci-ELISA检测

测定Fab与蝇毒磷、对硫磷、除线磷、辛硫磷、喹硫磷、三唑磷、伏杀硫磷、甲拌磷、毒死蜱、乙基溴硫磷、治螟磷、氯唑磷、二嗪磷以及乙基嘧啶磷14种DPPS的半抑制浓度(IC₅₀)，按下式计算交叉反应率CR(％)：

CR(％)＝[IC₅₀(Hapten)/IC₅₀(DPPs)]×100％

ci-ELISA检测步骤如下：

S1.包被：用包被液将包被原稀释至合适1μg/mL，加入酶标板孔中，100μL/孔，37℃水浴箱中过夜。

S2.洗涤：倾去孔内液体，洗板机洗板2次，每孔加洗涤液250μL，甩干孔中液体。

S3.封闭：每孔加入120μL封闭液，37℃封闭3h，甩干孔内液体，倒置于37℃烘箱中1h备用。

S4.加样及孵育：将半抗原稀释成系列梯度标准液，分别稀释为10000、1000、100、10、1、0.1、0.01ng/mL，每孔加50μL，然后加入合理稀释Fab蛋白稀释液50μL。稀释震荡混匀，37℃水浴箱中反应40min后，洗板机洗板5次，每孔加入洗涤液250μL，甩干孔中液体。

S5.加二抗：每孔加入100μL稀释5000倍的HRP-羊抗鼠Fab片段I，37℃水浴箱中反应30min后，洗板同S4。

S6.显色：TMB底物液和底物缓冲液等体积混合，每孔加入混合液100μL，置于37℃水浴箱中显色10min后，每孔加入50μL 10％H₂SO₄终止液。

S7.测定：用酶联免疫检测仪测定各孔A450nm的吸光值。

S8.计算：用Origin8.5的四参数拟合模块计算抑制曲线的IC₅₀值，标准曲线见图4。

本发明以免疫半抗原hapten(式I)为参照物(CR＝100％)，采用间接ci-ELISA方法对14种DPPS与Fab反应的交叉反应率和检出限进行评价，结果显示(表7)，抗DPPS的可溶性Fab抗体与抗原的结合可被游离的hapten竞争性抑制，IC₅₀为135.7ng/mL，具有很好的抗原结合活性。通过标准曲线可知线性检测范围分别在7.2～861.7ng/mL之间。与亲本单克隆抗体(Mab)的交叉反应率相比，其规律基本一致，所制备的Fab的交叉反应率有整体提高，较Mab而言，提高介于1.4～2.8倍，说明所制备的Fab的广谱特异性优于亲本Mab。由于Fab与Mab相比具有诸多优点，因此本研究为有机磷农药多残留检测方法的建立提供了一种更广谱、更灵敏的新型识别分子。

表7为Fab与亲本Mab的交叉反应率比较结果

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体及其制备方法与应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 229

<212> PRT

<213> 重链的氨基酸序列

<400> 1

Leu Glu Glu Val Lys Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser

20 25 30

His Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ala Glu Ile Arg Leu Arg Phe Ser Asn His Val Thr Gln Tyr

50 55 60

Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asp Ser Lys

65 70 75 80

Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly

85 90 95

Ile Tyr Tyr Cys Thr Ser Ile Tyr Tyr Asp Asn Leu Tyr Tyr Ala Met

100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr

115 120 125

Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr

130 135 140

Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn

195 200 205

Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro

210 215 220

Arg Asp Cys Thr Ser

225

<210> 2

<211> 216

<212> PRT

<213> 轻链氨基酸序列

<400> 2

Glu Leu Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile His

20 25 30

Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu

35 40 45

Leu Val Tyr Tyr Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu

65 70 75 80

Arg Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Thr Thr

85 90 95

Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp

100 105 110

Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr

115 120 125

Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys

130 135 140

Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly

145 150 155 160

Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

165 170 175

Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn

180 185 190

Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val

195 200 205

Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215

<210> 3

<211> 690

<212> DNA

<213> 重链核苷酸序列

<400> 3

ctcgaggaag tgaaagttga ggagtctgga ggaggcttgg tgcaacctgg aggatccatg 60

aaactctcct gtgttgcctc tggaatcact ttcagtcact actggatgaa ttgggtccgc 120

cagtctccag agaaggggct tgagtgggtt gctgaaatta gattgagatt tagtaatcat 180

gtaacacaat atgcggagtc tgtgaaaggg aggttcacca tgtcaagaga cgattccaaa 240

agtagtgtct acctgcaaat gaacaactta agagctgaag acactggcat ttattactgt 300

accagcatct actatgataa cctgtactac gctatggact actggggtca aggaacctca 360

gtcaccgtct cctcggccaa aacgacaccc ccatctgtct atccactggc ccctggatct 420

gctgcccaaa ctaactccat ggtgaccctg ggatgcctgg tcaagggcta tttccctgag 480

ccagtgacag tgacctggaa ctctggatcc ctgtccagcg gtgtgcacac cttcccagct 540

gtcctgcagt ctgacctcta cactctgagc agctcagtga ctgtcccctc cagcacctgg 600

cccagcgaga ccgtcacctg caacgttgcc cacccggcca gcagcaccaa ggtggacaag 660

aaaattgtgc ccagggattg tactagttaa 690

<210> 4

<211> 651

<212> DNA

<213> 轻链核苷酸序列

<400> 4

gagctcgata ttctgatgac ccagtctcca gcctccctat ctgcatctgt gggagaaact 60

gtcaccatca catgtcgagc aagtgaaaat attcacaatt atttagcatg gtatcagcag 120

aaacagggaa aatctcctca actcctggtc tattatgcaa aaaccttagc agatggtgtg 180

ccatcaaggt tcagtggcag tggatcagga acacaatatt ctctcaagat caacagcctg 240

cggcctgaag attttgggac ttattactgt caacattttt ggactactcc tcggacgttc 300

ggtggaggca ccaagctgga aatcaaacgt gctgatgctg caccaactgt atccatcttc 360

ccaccatcca gtgagcagtt aacatctgga ggtgcctcag tcgtgtgctt cttgaacaac 420

ttctacccca aagacatcaa tgtcaagtgg aagattgatg gcagtgaacg acaaaatggc 480

gtcctgaaca gttggactga tcaggacagc aaagacagca cctacagcat gagcagcacc 540

ctcacgttga ccaaggacga gtatgaacga cataacagct atacctgtga ggccactcac 600

aagacatcaa cttcacccat tgtcaagagc ttcaacagga atgagtgtta a 651

Claims

1.一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体，其特征在于，包括轻链和重链，所述重链具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO :1所示序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸但与SEQ ID NO :1所示序列具有相同功能的氨基酸序列；所述轻链具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO :2所示序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸但与SEQ ID NO :2所示序列具有相同功能的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的Fab抗体，其特征在于，所述重链具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO :3所示序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸但与SEQID NO :3所示序列具有相同功能的核苷酸序列；所述轻链具有SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO :4所示的序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸但与SEQ IDNO :4所示序列具有相同功能的核苷酸序列。

3.一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将SEQ ID NO :3所示的重链和SEQ ID NO :4所示的轻链与载体质粒连接并进行鉴定之后，转化受体菌株，筛选阳性重组受体菌株，经表达优化后，获得抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述载体质粒为pComb3XSS质粒，所述受体菌株为大肠杆菌TOP 10F’。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述阳性重组大肠杆菌TOP 10F’的表达优化条件为IPTG诱导浓度为0.1～0.2mM，表达温度为18～20℃，表达时间为10～14h。

6.权利要求1或2所述的抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体在检测二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药为蝇毒磷、对硫磷、除线磷、辛硫磷、喹硫磷、三唑磷、伏杀硫磷、甲拌磷、毒死蜱、乙基溴硫磷、治螟磷、氯唑磷、二嗪磷或乙基嘧啶磷中的一种或多种。