BR112020019795A2 - Anticorpo multivalente - Google Patents

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Cornelis Adriaan De Kruif
Linda Johanna Aleida Hendriks
Ton Logtenberg
Pieter Fokko Van Loo
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Abstract

"anticorpo multivalente" a invenção se refere a um anticorpo multivalente que compreende: uma porção anticorpo de base que compreende dois domínios de ligação; e ao menos um domínio de ligação adicional, sendo que a porção anticorpo de base é conectada por um ligante a ao menos um domínio de ligação adicional, sendo que cada domínio de ligação da porção anticorpo de base e cada um de ao menos um dos domínios de ligação adicionais têm, todos, uma região variável comum, e sendo que o ligante compreende uma sequência de dobradiça ou uma sequência derivada de uma sequência de dobradiça. a invenção também se refere a um anticorpo multivalente que compreende: uma porção anticorpo de base que compreende dois domínios de ligação; e ao menos um domínio de ligação adicional, sendo que ao menos um domínio de ligação adicional compreende uma região ch1 e é conectado à porção anticorpo de base pelo dito ligante, que conecta uma região variável da porção anticorpo de base e a região ch1, e sendo que o anticorpo multivalente se liga a ao menos três epítopos diferentes.

Description

Relatório descritivo da patente de invenção para "ANTICORPO MULTIVALENTE"
CAMPO
[0001] A invenção se refere aos anticorpos multivalentes tendo três ou mais domínios de ligação e a um método para produzir tais anticorpos multivalentes. A invenção se refere aos polipeptídeos constituintes dos anticorpos multivalentes e aos ligantes que podem ser utilizados para conectar um ou mais domínios de ligação do anticorpo multivalente. A invenção adicionalmente se refere aos ácidos nucleicos que codificam tais anticorpos multivalentes, ligantes e aos vetores que compreendem tais ácidos nucleicos, e também às células hospedeiras que produzem os anticorpos multivalentes. A invenção também se refere aos anticorpos multivalentes que são capazes de simultaneamente se ligarem a três antígenos ou alvos, incluindo aos antígenos alvo presentes sobre células cancerosas ou células tumorais, e aos antígenos e alvos que se engatam células efetoras imunes. Também a invenção se refere a uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo multivalente e ao anticorpo multivalente para uso no tratamento do ser humano ou animal por terapia. Além disso, a invenção se refere a um método para o tratamento de um ser humano ou animal com o uso do anticorpo.
ANTECEDENTES
[0002] Anticorpos multivalentes, como anticorpos biespecíficos, capazes de se ligarem a dois antígenos ou dois epítopos são conhecidos na técnica. Tais proteínas de ligação multivalentes podem ser geradas usando várias tecnologias, incluindo fusão celular, a conjugação química ou técnicas de DNA recombinante.
[0003] Anticorpos são tipicamente multímeros compreendidos de quatro proteínas, incluindo duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas, sendo que a cadeia pesada é compreendida de um domínio variável (VH), e três regiões constantes (CH1, CH2, CH3), e sendo que a cadeia leve é compreendida de um domínio variável de cadeia leve (VL) e uma região constante (CL). Tipicamente, a cadeia leve emparelha com a cadeia pesada mediante a influência de muitas interações não covalentes e também via ligações de dissulfeto. As duas cadeias pesadas emparelham na região de dobradiça que conecta CH1 a CH2 e/ou mediante interações de aminoácidos na interface entre os dois domínios CH3. O emparelhamento de VH com VL forma um domínio de ligação ao antígeno, e tipicamente variabilidade é encontrada em três regiões formadoras de alça superficial nos domínios VH e VL, que são as regiões determinantes de complementaridade ou CDRs.
[0004] Certos formatos de anticorpos multivalentes são conhecidos na técnica, como os anticorpos tendo dois domínios de ligação diferentes, como em anticorpos biespecíficos, que podem se ligar a dois antígenos diferentes, ou a dois epítopos diferentes dentro do mesmo antígeno. Tal formato pode permitir o uso de ligação calibrada que permitirá que o anticorpo multivalente seja seletivamente direcionado para células ou alvos que expressam dois antígenos ou epítopos como uma célula tumoral enquanto que não é direcionado para células saudáveis que expressam um antígeno, ou para reconhecimento de tais células saudáveis que expressam um antígeno em níveis de expressão mais baixos. De modo similar, a existência de dois domínios de ligação diferentes em um anticorpo multivalente, como um anticorpo biespecífico, pode permitir a ligação de antígenos diferentes, de modo que o dito anticorpo multivalente poderia ser utilizado para direcionar tanto uma molécula inibitória quanto uma molécula estimulatória sobre uma célula única ou sobre duas células interagentes para resultar em potência intensificada do anticorpo multivalente. Um anticorpo multivalente também poderia ser utilizado para redirecionar células, por exemplo, células imunomodulatórias, que poderiam ser redirecionadas para um tumor.
[0005] A incorporação de mais de dois domínios de ligação em um único anticorpo pode permitir uma variedade mais ampla de combinações benéficas de alvos e eficácia. Por exemplo, um anticorpo multivalente que tem três ou mais domínios de ligação pode reconhecer os mesmos antígeno e epítopo, permitindo especificidade para um dado alvo e/ou saturação de um alvo em uma razão mais baixa entre anticorpo e alvo. Um anticorpo multivalente pode conter dois ou mais domínios de ligação ao antígeno idênticos para possibilitar ligação de alta avidez a uma célula alvo. Isto pode ser utilizado para especificamente reconhecer antígenos como gangliosídeos que são superexpressos sobre células tumorais. Estes antígenos associados a tumores estão presentes sobre células normais mas em densidade muito mais alta sobre células tumorais. Um anticorpo multivalente contendo várias regiões de ligação de afinidade mais baixa pode possibilitar o reconhecimento específico de células tumorais enquanto que não reage com células saudáveis ou realiza isto em uma razão mais baixa e, ao mesmo tempo, ativa ou bloqueia receptores adicionais. Por fim, três ou mais regiões de ligação são úteis em tais aplicações.
[0006] Embora certos anticorpos multivalentes tenham sido descritos na técnica, há uma necessidade na técnica de novos formatos, e novos ligantes, que possibilitem a produção eficiente de anticorpos multivalentes, para os quais domínios de ligação a uma variedade de antígenos podem ser facilmente preparados e convertidos eficazmente, estavelmente em um anticorpo multivalente, e que são capazes de se ligarem a uma ampla variedade de antígenos e epítopos. A engenharia de um anticorpo que contém mais de dois domínios de ligação tradicionalmente tem sido demorada, ineficiente e dispendiosa. De fato, há numerosos impedimentos para a produção eficiente de anticorpos multivalentes de alta qualidade, de baixa imunogenicidade, que podem ser gerados para reconhecerem uma variedade de antígenos.
[0007] Por exemplo, formatos multivalentes existentes contendo três ou quatro domínios de ligação baseiam-se em ligantes sintéticos como repetições Gly4Ser (G4S) que contêm domínios de sequência que, primeiro, tendem a restringir o acesso a todos os domínios de ligação na molécula e que, segundo, podem também ser problemáticos para capacidade de desenvolvimento.
[0008] Formatos de anticorpo multivalente existentes também dependem de diferentes cadeias pesadas e leves que são associadas por ligações de dissulfeto e interações de aminoácidos ou podem por unidas por ligantes curtos no caso de fragmentos variáveis de cadeia única (scFvs). Ainda a necessidade de usar cadeias variáveis diferentes (pesada e/ou leve) em cada um dos múltiplos domínios variáveis utilizados em um formato multiespecífico de três ou mais especificidades de ligação requer engenharia extensiva de tais moléculas para evitar pareamento incorreto das cadeias pesadas e cadeias leves. Invariavelmente isto tem uma influência sobre a complexidade, a estabilidade, a imunogenicidade e os níveis de produção destas moléculas.
[0009] Formatos de anticorpo multivalente podem depender do uso da mesma cadeia leve para cada domínio de ligação, onde uma ou mais das regiões variáveis cognatas emparelhadas com a dita cadeia leve são forçadas para emparelharem mediante modificações químicas, ao invés de a cadeia cognata ser formada com e emparelhada com uma cadeia leve comum em resposta à exposição antigênica, e os processos de coevolução que ocorrem durante o desenvolvimento de células B.
[0010] Formatos de anticorpo multivalente podem também depender da cadeia leve de um anticorpo monoespecífico existente que se liga a um antígeno, que é então utilizado em uma biblioteca para identificar cadeias pesadas capazes de emparelhamento com a dita cadeia leve, enquanto que também se liga a um epítopo ou antígeno diferente.
[0011] Tais cadeias leves pseudocomuns não são preferenciais para uso na presente invenção. As cadeias leves comuns preferenciais para a presente invenção são aquelas que são capazes de emparelhamento com uma diversidade de cadeias cognatas e são obtidas a partir de, derivadas de ou baseadas em cadeias comuns que se emparelham com uma cadeia cognata rearranjada, que é codificada pelo DNA tendo sido submetido à recombinação somática, e de preferência à hipermutação somática em resposta à exposição antigênica.
[0012] Uma abordagem de cadeia pseudoleve limita a variedade de cadeias cognatas disponíveis. Forçar o emparelhamento de cadeias pesada e leve, que não foram formadas juntas em uma resposta à exposição antigênica, resulta na perda de especificidade e de afinidade limitando a utilidade. Adicionalmente, é tipicamente raro para qualquer dado anticorpo permitir o embaralhamento de VH e VL e conservar afinidade e especificidade.
[0013] Forçar o emparelhamento de cadeia leve com uma cadeia pesada onde as duas não coevoluíram na resposta imune enquanto que mantêm a capacidade de se ligarem a um antígeno não é trivial e pode limitar a flexibilidade desta abordagem.
[0014] De modo similar, a reutilização de uma cadeia leve de um anticorpo para identificar cadeias pesadas que são capazes de se ligarem à dita cadeia leve e também de se ligarem a um anticorpo diferente de interesse, limita a variedade de cadeias pesadas disponíveis, e torna-se progressivamente improvável para identificar cadeias pesadas adicionais adequadas almejadas para serem ligadas a mais antígenos ou epítopos. Isto é, pode-se usar uma cadeia leve que se emparelha com uma cadeia pesada para formar um Fab que se liga a um dado antígeno para identificar uma cadeia pesada subsequente que se emparelha com a dita cadeia leve,
e que é capaz de se ligar a um segundo antígeno. Entretanto, o uso daquela cadeia leve uma terceira vez, para identificar a terceira cadeia pesada capaz de se emparelhar com a dita cadeia leve enquanto que se liga a um terceiro antígeno ou epítopo torna-se progressivamente raro, e mais raras ainda as cadeias mais pesadas, que são almejadas para serem identificadas, capazes de se emparelharem com a dita cadeia leve, enquanto que também se ligam a epítopos ou antígenos diferentes.
[0015] Uma modalidade preferencial da invenção aqui descrita utiliza uma cadeia comum, que se emparelha com uma diversidade de cadeias pesadas em resposta a um antígeno, e não exige o uso de uma cadeia leve existente de um anticorpo monoespecífico ou emparelhamento forçado de uma cadeia leve com uma cadeia cognata mediante modificação química.
[0016] A construção bem sucedida de anticorpos multivalentes baseia-se na escolha adequada de ligantes de proteína entre os diferentes domínios porque a fusão direta de dois domínios pode resultar em atividade biológica comprometida. As características biofísicas do ligante ou dos ligantes como carga, rigidez ou flexibilidade e também a distância entre os domínios de ligação e a conformação espacial entre as regiões de ligação podem influenciar o acesso ao epítopo e a capacidade da proteína multivalente para se ligar aos seus alvos. Dessa forma, há uma necessidade de um formato multivalente que, em uma maneira modular, pode utilizar uma variedade de ligantes com características diferentes para permitir a construção de anticorpos multivalentes que permitem a ligação simultânea às diferentes combinações de epítopos que podem estar localizados em moléculas diferentes e/ou sobre células diferentes.
[0017] Consequentemente, há uma necessidade na técnica do planejamento de um conjunto de ligantes contendo diferentes características de rigidez, flexibilidade, comprimento que podem ser utilizados em uma maneira modular dependendo da combinação de alvos, enquanto que mantêm estabilidade, imunogenicidade baixa e facilidade de capacidade de desenvolvimento.
[0018] Consequentemente, há uma necessidade de formatos novos e úteis de anticorpos multivalentes tendo três ou mais domínios de ligação e ligantes para a produção de tais anticorpos que sejam amplamente aplicáveis para a geração rápida e robusta de uma ampla variedade de anticorpos que compreendem mais de dois domínios de ligação.
SUMÁRIO
[0019] A invenção é baseada em formatos novos modulares, para um anticorpo multivalente compreendendo três ou mais domínios de ligação que pode ser um anticorpo multiespecífico. Nestes formatos, ao menos um domínio de ligação é conectado a uma porção anticorpo de base, a dita porção anticorpo de base compreendendo dois domínios de ligação. O domínio de ligação adicional pode compreender uma região variável, um domínio Fv, um domínio Fab ou um domínio Fab modificado ou um fragmento funcional de qualquer um dos mesmos. A porção anticorpo de base pode ser, por exemplo, um anticorpo de comprimento completo ou fragmento do mesmo, mas em cada caso compreende dois domínios de ligação.
[0020] Os um ou mais domínios de ligação adicionais são conectados à porção anticorpo de base via um ligante(s), fornecendo uma ou mais porções de ligação em adição àquelas da porção anticorpo de base.
[0021] Um ligante é utilizado para conectar os um ou mais domínios de ligação adicionais à porção anticorpo de base. O ligante compreende uma região de peptídeo, por exemplo uma ou mais regiões de dobradiça e/ou uma ou mais regiões derivadas de uma região de dobradiça. A combinação do ligante e uma região constante (por exemplo, CH1) à qual ele é conectado pode ser crítica na determinação das propriedades do anticorpo multivalente e possibilitar a funcionalidade correta do anticorpo e/ou a orientação correta dos um ou mais domínios de ligação adicionais relativos ao anticorpo base. Dessa forma, se uma sequência ligante é baseada em uma dobradiça de um dado subtipo, pode ser preferencial que a região constante do domínio de ligação adicional ao qual ele está ligado seja do mesmo subtipo.
[0022] Os um ou mais domínios de ligação adicionais podem compreender uma região variável, um domínio Fv, um domínio Fab ou um domínio Fab modificado.
[0023] Os domínios Fab em particular constituem domínios de ligação adicionais benéficos, porque eles compreendem domínios de proteína que têm comportamento previsível que é útil para a fabricação de moléculas multivalentes que são estáveis e podem ser facilmente fabricadas.
[0024] Para facilitar a produção eficiente e a capacidade de desenvolvimento do anticorpo multivalente da invenção, o dito anticorpo multivalente pode compreender uma região variável comum, que pode ser uma região variável de cadeia pesada (VH) de imunoglobulina ou uma região variável de cadeia leve (VL), mas é tipicamente uma região variável de cadeia leve comum (cLC).
[0025] A região variável comum é tipicamente emparelhada com uma região variável cognata que é codificada por um ácido nucleico que foi submetido à recombinação somática e, de preferência, à maturação de afinidade ou é baseada em ou derivada de uma região variável rearranjada que é codificada por um ácido nucleico que foi submetido ao processo de recombinação somática e, de preferência, à maturação de afinidade, e/ou é baseada em ou derivada de técnicas de geração de anticorpo conhecidas, como apresentação em fagos, imunização de animais, incluindo animais transgênicos com sistemas imunes humanizados e outras técnicas bem conhecidas na técnica.
[0026] O uso de uma região variável comum que é essencialmente idêntica em cada domínio de ligação do anticorpo multivalente da invenção facilita o desenvolvimento e a fabricação de tais anticorpos.
[0027] A escolha da região variável comum para uso em um anticorpo multivalente da invenção deve, dessa forma, ser uma que pode ser utilizada amplamente com muitas diferentes regiões pesadas ou leves cognatas.
[0028] Uma região variável comum, idêntica, ou substancialmente idêntica, por exemplo, uma região variável de cLC, permite o uso de domínios Fab completos, ou substancialmente completos para todas as três ou mais regiões de ligação sem a necessidade de engenharia extensiva conforme utilizada na tecnologia Crossmab ou para ligantes para evitar o pareamento incorreto de cadeias pesadas e leves, como aqueles utilizados em domínios scFv. Além disso, visto que são conhecidas regiões variáveis comuns essencialmente codificadas na linhagem germinativa e não imunogênicas (consulte WO2009/157771), a utilização dela em cada um dos três ou mais domínios Fab pode fornecer imunogenicidade reduzida.
[0029] Um benefício adicional do formato aqui descrito para a produção de anticorpos multivalentes permite o uso de animais transgênicos, preferencialmente de roedores transgênicos, que têm em seus genomas uma região variável comum, capaz de se emparelhar com uma diversidade de regiões variáveis cognatas (por exemplo, emparelhamento de região variável de cadeia leve comum com uma diversidade de regiões variáveis de cadeia pesada) (consulte WO2009/157771), que permite que o DNA que codifica as regiões variáveis cognatas formadas a partir da exposição a antígenos diferentes seja introduzido em uma célula hospedeira com o DNA que codifica a região variável comum, que pode, cada uma, ser expressa para a geração de anticorpos multivalentes.
[0030] Por exemplo, um camundongo transgênico que compreende em sua linhagem germinativa, DNA que codifica uma região variável comum e
DNA que codifica um locus de imunoglobulina não rearranjado que pode se rearranjar para formar uma região variável cognata e é capaz de ser submetido à recombinação somática, pode ser exposto a um ou mais antígenos, de modo que as regiões variáveis rearranjadas produzidas com base na exposição aos três ou mais antígenos podem então ser utilizadas para gerar um anticorpo multivalente da presente invenção. Sequências de ácidos nucleicos que codificam a região variável comum, e as três ou mais regiões variáveis rearranjadas podem ser transformadas em uma célula hospedeira, para expressarem um anticorpo multivalente da presente invenção.
[0031] Dessa forma, os formatos aqui descritos para a produção de anticorpos multivalentes fazem uso de três ou mais domínios de ligação que podem compreender uma região variável comum, de preferência, uma região variável de cadeia leve comum.
[0032] Os formatos da presente invenção compreendem um ou mais domínios de ligação em adição àqueles da porção anticorpo de base. Tal domínio de ligação adicional pode ser um domínio Fv, um domínio Fab ou um domínio Fab modificado que compreende, de preferência, um domínio CH1 e um domínio variável, que é conectado à porção anticorpo de base via um ligante. Em um domínio Fab modificado, o domínio CH1 não é emparelhado com um CL. Um domínio CH1 adequado pode ser um que é manipulado para remover uma ou mais regiões hidrofóbicas ou pode ser um derivado de um animal camelídeo ou de um tubarão. Alternativamente, um domínio de ligação adicional pode compreender um domínio CL e um domínio variável que é conectado à porção anticorpo de base via um ligante. O domínio CL pode ser um domínio Ckappa ou um domínio Clambda.
[0033] Tipicamente, o(s) domínio(s) de ligação adicional(ais) é/são conectados a um ou ambos domínios de ligação da porção anticorpo de base na região N-terminal de uma porção variável comum ou uma região variável rearranjada do domínio de ligação da porção anticorpo de base ou ambas.
[0034] Alternativamente, um domínio de ligação adicional pode estar conectado à porção anticorpo de base via um ligante que conecta tanto uma cadeia comum quanto um domínio variável rearranjado do domínio de ligação da porção anticorpo de base a uma região CH1 e CL do domínio de ligação adicional. Se um domínio de ligação adicional não possui uma região constante, os ligantes novos aqui revelados podem conectar tanto uma cadeia comum quanto um domínio variável rearranjado do domínio de ligação da porção anticorpo de base à cadeia comum e/ou à região variável rearranjada do domínio de ligação adicional.
[0035] Alternativamente, um domínio de ligação adicional pode ser uma região VH e VL, isto é, um domínio Fv, que é conectado por um peptídeo ligante único à porção anticorpo de base. Tipicamente, este tipo de domínio(s) de ligação adicional(ais) é/são ligado(s) a um ou ambos domínios de ligação da porção anticorpo de base na região N- terminal da porção variável comum ou da região variável rearranjada do domínio de ligação da porção anticorpo de base.
[0036] Este formato, quando utilizado com os ligantes da invenção aqui revelados, incluindo comprimentos, estruturas e graus de rigidez diferentes, é surpreendentemente flexível. Dessa forma, a invenção fornece um repertório de ligantes com propriedades diferentes para uso nos formatos de anticorpo multivalente revelados que tornam fácil de desenvolver a combinação de três ou mais domínios de ligação em um anticorpo multivalente.
[0037] Por meio dos ligantes aqui revelados, a invenção fornece, dessa forma, uma abordagem modular na qual a seleção do ligante adequado juntamente com a seleção de um conjunto correspondente de domínios de ligação, como domínios Fab, permite que aqueles domínios de ligação funcionem juntos em um anticorpo multivalente para uma variedade de eficácia.
[0038] Um anticorpo multivalente da invenção pode ser utilizado na terapia, em particular, como um chamado anticorpo "engatador" pelo qual o anticorpo é capaz de formar uma conexão entre uma célula efetora imune e uma célula tumoral.
[0039] De acordo com a invenção, é fornecido, dessa forma, um anticorpo multivalente que compreende: - uma porção anticorpo de base que compreende dois domínios de ligação; e - ao menos um domínio de ligação adicional, sendo que a porção anticorpo de base é conectada por um ligante a ao menos um domínio de ligação adicional,
sendo que cada domínio de ligação da porção anticorpo de base e cada um de ao menos um dos domínios de ligação adicionais têm, todos, uma região variável comum, e sendo que o ligante compreende uma sequência de dobradiça ou uma sequência derivada de uma sequência de dobradiça.
[0040] A invenção também fornece um anticorpo multivalente que compreende: - uma porção anticorpo de base que compreende dois domínios de ligação; e - ao menos um domínio de ligação adicional, sendo que ao menos um domínio de ligação adicional compreende uma região CH1 e é conectado à porção anticorpo de base pelo dito ligante, que conecta uma região variável da porção anticorpo de base e a região CH1, e sendo que o anticorpo multivalente se liga a ao menos três epítopos diferentes.
[0041] De preferência, cada domínio de ligação da porção anticorpo de base e cada um de ao menos um dos domínios de ligação adicionais podem ter, todos, uma região variável comum. Variedade dos um ou mais domínios de ligação adicionais
[0042] Uma modalidade preferencial é um anticorpo multivalente, sendo que um ou mais domínios de ligação são um domínio Fv compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL).
[0043] Uma outra modalidade preferencial é um anticorpo multivalente, sendo que os um ou mais domínios de ligação são um domínio Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), a dita região variável de cadeia pesada do dito domínio Fab compreendendo uma região CH1 (VH-CH1) e a dita região variável de cadeia leve do dito Fab compreendendo uma região CL (VL-CL). O dito domínio Fab pode conter uma VL-CL que é uma Vkappa-Ckappa, Vlambda-Clambda, Vlambda-Ckappa ou Vkappa-Clambda.
[0044] Uma outra modalidade é um anticorpo multivalente, sendo que os um ou mais domínios de ligação adicionais são um domínio Fab modificado consistindo em um VH-CH1 e VL. Alternativamente, uma modalidade é um anticorpo multivalente, sendo que os um ou mais domínios de ligação adicionais são um domínio Fab modificado consistindo em um VL-CL e um VH. Em tais domínios Fab modificados, uma região constante, CH1 ou CL, está presente que não está emparelhada com sua região cognata e/ou uma região variável VH ou VL, está presente, que não está emparelhada com sua região cognata. Cadeia comum
[0045] Uma modalidade preferencial é um anticorpo multivalente sendo que os um ou mais domínios de ligação adicionais compreendem um domínio Fab compreendendo uma região variável rearranjada comum emparelhada com uma região variável rearranjada que foi submetida ao rearranjo somático após exposição a um antígeno ou é codificada por ácidos nucleicos obtidos de, derivados de, ou baseados em uma sequência,
que é o resultado de rearranjo somático. Alternativamente, a região variável rearranjada poderia ser uma obtida de, derivada de, ou baseada em um repertório sintético onde diversidade é introduzida em um repertório usando técnicas de biologia molecular conhecidas na técnica, incluindo o uso de bibliotecas sintéticas de apresentação em fagos. De preferência, o dito domínio Fab compreende uma região variável de cadeia leve comum emparelhada com uma região variável de cadeia pesada rearranjada correspondente. De preferência, a dita região variável de cadeia leve comum é conectada a uma região CL e a dita região variável de cadeia pesada rearranjada é conectada a uma região CH1. De preferência, a dita cadeia leve comum é emparelhada com a dita região variável de cadeia pesada via junção das regiões CL e CH1. Alternativamente, sendo que a cadeia comum é uma cadeia pesada, a região variável rearranjada é uma cadeia leve, e as ditas cadeias podem compreender um domínio CH1 e CL respectivamente e podem ser emparelhadas via junção das regiões CL e CH1.
[0046] Uma modalidade preferencial é um anticorpo multivalente sendo que os três ou mais domínios de ligação compreendem, cada, a mesma cadeia comum, mas sendo que os três ou mais domínios de ligação compreendem diferentes cadeias cognatas variáveis rearranjadas, com maior preferência, sendo que a dita mesma cadeia comum é uma cadeia leve comum.
[0047] Uma modalidade preferencial é um anticorpo multivalente, sendo que os três ou mais domínios de ligação compreendem regiões variáveis rearranjadas codificadas por ácidos nucleicos obtidos de,
derivados de, ou baseados em sequências de ácidos nucleicos de um animal transgênico compreendendo uma cadeia leve comum e uma região variável de cadeia pesada não rearranjada, que tem sido exposta a um antígeno e tem produzido anticorpos compreendendo uma região variável de cadeia pesada rearranjada emparelhada com uma cadeia leve comum. Alternativamente, em uma modalidade de um anticorpo multivalente, os três ou mais domínios de ligação compreendem regiões variáveis rearranjadas codificadas por ácidos nucleicos obtidos de, derivados de, ou baseados em sequências de ácidos nucleicos de um animal transgênico compreendendo uma cadeia pesada comum e uma região variável de cadeia leve não rearranjada, que tem sido exposta a um antígeno e tem produzido anticorpos compreendendo uma região variável de cadeia leve rearranjada emparelhada com uma cadeia pesada comum. Composição de ligante
[0048] Uma modalidade preferencial é o dito anticorpo multivalente, sendo que o dito ligante é uma sequência de ocorrência natural, ou baseada em uma sequência de ocorrência natural. Mais especificamente, o dito ligante é uma sequência de dobradiça ou compreende uma sequência baseada em uma sequência de dobradiça. Mais especificamente o dito ligante pode compreender uma região de dobradiça baseada em uma região de dobradiça de IgG1, uma região de dobradiça de IgG2, uma região de dobradiça de IgG3 ou uma região de dobradiça de IgG4.
[0049] Alternativamente, o dito ligante compreende uma região de peptídeo compreendendo uma ou mais das seguintes:
ESKYGPP (SEQ ID NO: 1) EPKSCDKTHT (SEQ ID NO: 2) GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 3) ERKSSVESPPSP (SEQ ID NO: 4) ERKCSVESPPSP (SEQ ID NO: 5) ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO: 6) ESKYGPPSPSSP (SEQ ID NO: 7) ERKSSVEAPPVAG (SEQ ID NO: 8) ERKCSVEAPPVAG (SEQ ID NO: 9) ESKYGPPAPEFLGG (SEQ ID NO: 10) EPKSCDKTHTSPPSP (SEQ ID NO: 11) EPKSCDGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 12) GGGGSGGGGSAPPVAG (SEQ ID NO: 13) EPKSCDKTHTAPELLGG (SEQ ID NO: 14) ERKSSVESPPSPAPPVAG (SEQ ID NO: 15) ERKCSVESPPSPAPPVAG (SEQ ID NO: 16) ELKTPLGDTTHTAPEFLGG (SEQ ID NO: 17) ESKYGPPSPSSPAPEFLGG (SEQ ID NO 18) EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGG (SEQ ID NO: 19) ERKSSVEEAAAKEAAAKAPPVAG (SEQ ID NO: 20) ERKCSVEEAAAKEAAAKAPPVAG (SEQ ID NO: 21) ESKYGPPEAAAKEAAAKAPEFLGG (SEQ ID NO: 22) EPKSCDKTHTEAAAKEAAAKAPELLGG (SEQ ID NO: 23) ELKTPLGDTTHTEAAAKEAAAKAPEFLGG (SEQ ID NO: 24)
ou uma sequência tendo ao menos cerca de 85% de identidade de sequência com qualquer uma das mesmas.
[0050] De preferência, um anticorpo multivalente da invenção compreende um ligante que conecta a porção anticorpo de base a um ou mais domínios de ligação por compreender uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 1 a 24 ou um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo ao menos cerca de 85% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 1 a 24.
[0051] A Tabela 1 ilustra como tais ligantes podem ser conectados a uma região CH1.
[0052] Um anticorpo multivalente preferencial da invenção, compreende um ligante que é rígido. Com mais preferência, o dito anticorpo multivalente compreende um ligante que compreende uma sequência formadora de hélice.
[0053] Um anticorpo multivalente preferencial da invenção compreende um ligante compreendendo uma sequência de peptídeos compreendendo um motivo (EAAK)2.
[0054] Um anticorpo multivalente da invenção, compreende um ligante que é flexível.
[0055] Um anticorpo multivalente preferencial da invenção, compreende um ligante compreendendo três ou mais resíduos de aminoácidos que correspondem a uma região de dobradiça de um subtipo de uma região constante, à qual ele é conectado, do dito anticorpo multivalente.
[0056] Um anticorpo multivalente preferencial da invenção compreende um ligante compreendendo uma sequência das SEQ ID NOs: 1 a 24 que corresponde a uma região de dobradiça de um subtipo de uma região constante, à qual ele é conectado, do dito anticorpo multivalente. Localização/Orientação do ligante
[0057] Uma modalidade preferencial é um anticorpo multivalente, sendo que a porção anticorpo de base é conectada aos um ou mais domínios de ligação adicionais por um ligante, sendo que o dito ligante junta uma extremidade N-terminal de uma região variável da dita porção anticorpo de base à extremidade C-terminal de um ou mais domínios de ligação adicionais. De preferência, a porção anticorpo de base compreende um domínio Fab e os um ou mais domínios de ligação adicionais compreendem um domínio Fab compreendendo um domínio CH1 e um domínio CL e o ligante conecta uma extremidade N-terminal de uma região variável do Fab da porção anticorpo de base a uma ou ambas de uma extremidade C-terminal do domínio CH1 e do domínio CL do domínio Fab dos um ou mais domínios de ligação adicionais.
[0058] Uma modalidade preferencial da invenção é um anticorpo multivalente compreendendo uma cadeia comum em cada domínio de ligação da porção anticorpo de base e cada um dos um ou mais domínios de ligação adicionais e um ligante que conecta uma extremidade N-terminal de uma região variável rearranjada da porção anticorpo de base a um extremidade C-terminal de uma região variável rearranjada dos um ou mais domínios de ligação adicionais. Com mais preferência, os um ou mais domínios de ligação adicionais compreendem um domínio Fab compreendendo um domínio CH1 e um domínio CL e o ligante conecta uma extremidade N-terminal de uma região variável do domínio Fab da porção anticorpo de base ao domínio CH1 ou ao domínio CL do domínio Fab dos um ou mais domínios de ligação adicionais. Emparelhamento das regiões compreendendo o domínio de ligação adicional
[0059] A montagem de anticorpo ocorre mediante associação das cadeias leve e pesada, isto é, a associação (emparelhamento) de VH com VL e de CH1 com CL, que é baseada nos resíduos de interação na interface entre VH e VL, e entre CH1 e CL. Tipicamente, o emparelhamento é adicionalmente estabilizado, por meio do qual uma cadeia leve é conectada covalentemente à cadeia pesada por uma ligação de dissulfeto entre um resíduo de cisteína da cadeia leve no CL, e um resíduo de cisteína da cadeia pesada no CH1 ou dobradiça, dependendo do subtipo.
[0060] Dessa forma, em um anticorpo multivalente da invenção, um ou mais domínios de ligação adicionais são conectados à porção anticorpo de base via um ligante(s), sendo que os um ou mais domínios de ligação compreendem um domínio Fv, um domínio Fab ou um domínio Fab modificado, e as cadeias de imunoglobulina correspondentes que compreendem o domínio de ligação (tipicamente uma região de cadeia pesada e uma região de cadeia leve) são emparelhadas juntas em uma associação estável.
[0061] Para anticorpos multivalentes da presente invenção que contêm um domínio de ligação adicional, sendo que o domínio de ligação é um domínio Fv ou um domínio Fab, um resíduo de cisteína pode estar presente ou ser manipulado nos domínios das cadeias pesada e leve, de modo que uma ligação de dissulfeto se forme para estabilizar o emparelhamento entre a cadeia pesada e a cadeia leve do domínio de ligação adicional. Quando o anticorpo multivalente da invenção inclui um domínio de ligação adicional compreendendo uma subclasse de IgG1, pode ser utilizada uma dobradiça superior de IgG1 (EPKSC) da cadeia pesada que é conectada a e a montante (lado N- terminal) de um ligante artificial, como (G4S)n, para fornecer uma cisteína para emparelhar covalentemente com a cadeia leve do domínio de ligação adicional. Para outras subclasses utilizadas no domínio de ligação adicional, o versado na técnica reconhecerá a habilidade para manipular, por engenharia genética, um resíduo de cisteína no ligante utilizado para estabilizar o emparelhamento dos domínios de cadeias leve e pesada do domínio de ligação adicional e para formar uma ponte de dissulfeto entre a dita cadeia leve e a dita cadeia pesada utilizadas.
[0062] A região de dobradiça de IgG1 de tipo selvagem tem a sequência: EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 42). O resíduo C sublinhado é Cys220 que, na cadeia pesada de IgG1, emparelha com Cys214 da cadeia leve. Quando um anticorpo multivalente da invenção compreende um ligante baseado em uma tal dobradiça, de preferência, quaisquer resíduos Cys diferentes de Cys220 são substituídos por um resíduo de aminoácido que não pode formar uma ligação de dissulfeto, por exemplo, Ser.
[0063] A região de dobradiça de IgG2 de tipo selvagem tem a sequência: ERKCCVECPPCPAPPVAG(SEQ ID NO: 46). O resíduo C sublinhado é Cys219 que, na cadeia pesada de IgG2-B, emparelha com Cys214 da cadeia leve. Em IgG2-A, Cys127 na cadeia pesada emparelha com Cys214. Quando um anticorpo multivalente da invenção compreende um ligante baseado em tal dobradiça, de preferência, quaisquer resíduos Cys diferentes de Cys215 são substituídos por um resíduo de aminoácido que não pode formar uma ligação de dissulfeto, por exemplo, Ser.
[0064] A região de dobradiça de IgG3 de tipo selvagem tem a sequência:
ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP EPKSCDTPPPCPRCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 50). Na IgG3, Cys131 na cadeia pesada emparelha com Cys214 da cadeia leve.
[0065] A região de dobradiça de IgG4 tem a sequência: ESKYGPPCPSCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 54). Na IgG4, Cys131 na cadeia pesada emparelha com Cys214 da cadeia leve. Quando um anticorpo multivalente da invenção compreende um ligante baseado em tal dobradiça, de preferência um dos resíduos Cys ou ambos na região CPSPC da dobradiça são substituídos por um resíduo de aminoácido que não pode formar uma ligação de dissulfeto, por exemplo, Ser.
[0066] Conforme aqui demonstrado, para gerar construtos multivalentes, incluindo construtos trivalentes, baseados em uma estrutura de IgG capazes de se ligarem simultaneamente a três epítopos diferentes, são utilizados ligantes baseados em dobradiças de IgG de subclasses diferentes para conectar um domínio de ligação de uma porção anticorpo de base a um domínio de ligação adicional que compreende uma região constante de cadeia pesada. Para assegurar uma estabilização da ligação covalente entre uma cisteína na cadeia leve e uma cisteína na cadeia pesada do domínio de ligação adicional, a invenção combina um ligante compreendendo uma região de dobradiça ou baseado em uma região de dobradiça de um subtipo específico com o CH1 do domínio de ligação adicional que é do mesmo subtipo.
[0067] Se o anticorpo multivalente compreende um domínio de ligação adicional compreendido de regiões de emparelhamento (por exemplo, VH- CH1 emparelhada com VL-CL, ou VH emparelhada com VL), a estabilização da interface entre as regiões pode ser realizada na presente invenção em uma variedade de maneiras. Se os um ou mais domínios de ligação adicionais são um domínio Fab compreendido de uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, um CH1 pode ser conectado à região variável de cadeia pesada. O CH1 pode ser emparelhado com um CL com uma ligação covalente, tipicamente uma ponte de dissulfeto, que é conectada à região variável de cadeia leve. Além disso, as cadeias pesada e leve de um domínio Fab são emparelhadas via interações não covalentes. Alternativamente, o ligante que conecta os um ou mais domínios de ligação adicionais à porção anticorpo de base também pode ser utilizado para emparelhar a região variável de cadeia pesada com a região variável de cadeia leve do domínio de ligação adicional pela formação de uma ligação peptídica com qualquer cadeia e uma ligação covalente com a cadeia correspondente. Isto pode ser realizado pelo planejamento de uma cisteína no N-terminal ou próximo a ele do ligante e de uma cisteína no C-terminal ou próximo a ele das regiões variáveis de cadeia pesada e/ou das regiões variáveis de cadeia leve dos um ou mais domínios de ligação adicionais, formando, assim, uma ligação covalente entre o ligante e as regiões variáveis de cadeia leve e/ou as regiões variáveis de cadeia leve dos um ou mais domínios de ligação adicionais. Outros meios de emparelhar os domínios que compreendem os um ou mais domínios de ligação adicionais, como um domínio Fab, são conhecidos pelos versados na técnica e descritos adicionalmente em detalhes abaixo.
[0068] Uma modalidade preferencial é um anticorpo multivalente, compreendendo uma porção anticorpo de base e um ou mais domínios de ligação adicionais. Se os um ou mais domínios de ligação adicionais são um domínio Fv compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), um ligante da invenção conecta a porção anticorpo de base ao dito Fv, enquanto emparelha a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve do Fv.
[0069] Alternativamente, o domínio de ligação é um domínio Fab compreendendo uma região pesada variável compreendendo uma região CH1 e uma região leve variável compreendendo uma região CL. Um ligante da invenção conecta a porção anticorpo de base ao domínio Fab na região CH1 ou na região CL ou em ambas enquanto emparelha a região CH1 e a região CL do domínio Fab. Emparelhamento da porção anticorpo de base
[0070] Diferentes técnicas são conhecidas na técnica para emparelhar e provocar a heterodimerização de regiões constantes de cadeia pesada
(por exemplo, CH2 e CH3) de uma porção anticorpo de base. O uso, por exemplo, de mutações DEKK para provocar a heterodimerização de cadeias pesadas de anticorpos (WO2013/157954 e De Nardis et al., J. Biol. Chem. (2017) 292 (35) 14706-14717, aqui incorporados a título de referência), possibilita adicionalmente a eficiente formação de heterodímero, de região Fc estável e facilidade de fabricação. Esta abordagem deixa a região Fc da molécula funcional e capaz de engatar com imunorreceptores como receptores de Fc, complemento e FcRn. Consequentemente, certas modalidades de anticorpo multivalente da invenção utilizam as modificações DEKK, ou outras modificações em Fc conhecidas pelos versados na técnica, para, de preferência, heterodimerizar as cadeias pesadas da porção anticorpo de base.
[0071] Adicionalmente, para certas modalidades de anticorpos multivalentes, pode ser desejável não engatar a função efetora do sistema imune (por exemplo, para limitar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo, a fagocitose mediada por anticorpo e/ou a citotoxicidade dependente de célula), como o uso de um anticorpo multivalente para engatar, estimular e/ou coestimular células T, em cujo caso modificações adicionais podem ser utilizadas na região Fc para eliminar ou mitigar a função efetora. Consequentemente, certas modalidades de anticorpo multivalente da invenção contêm modificações nas regiões constantes de cadeia pesada da porção anticorpo de base que eliminam ou mitigam a(s) função(ões) efetora(s).
[0072] Uma modalidade preferencial adicional da invenção é um anticorpo multivalente compreendendo uma porção anticorpo de base compreendida de duas cadeias pesadas que não possuem a região CH2 ou CH3, sendo que as ditas cadeias pesadas são ligadas juntas na região de dobradiça.
[0073] A invenção também fornece um método para a preparação de um anticorpo multivalente, sendo que o método compreende fornecer uma célula que compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos que são capazes de montagem em um anticorpo multivalente da invenção. A célula pode ser cultivada sob condições para fornecer a expressão da porção anticorpo de base, do ao menos um domínio de ligação adicional e do ao menos um ligante e para a montagem deles em um anticorpo multivalente da invenção.
[0074] A invenção também fornece ácidos nucleicos que codificam as proteínas constituintes de um anticorpo multivalente da invenção e o anticorpo multivalente que eles produzem.
[0075] A invenção também fornece um vetor compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos da invenção.
[0076] A invenção também fornece células hospedeiras que expressam os ditos ácidos nucleicos e produzem os ditos anticorpos multivalentes.
[0077] A invenção também fornece métodos para gerar o dito anticorpo multivalente, incluindo mediante o uso de animais transgênicos compreendendo uma cadeia comum em sua linhagem germinativa que produzem anticorpos de cadeia comum tendo diversidade em uma cadeia cognata, sendo que o dito anticorpo multivalente compreende um ou mais domínios de ligação tendo uma região variável rearranjada codificada por um ácido nucleico obtida de, derivada de ou baseada em uma ou mais cadeias cognatas dos anticorpos de cadeia comum expressos pelo animal transgênico exposto a um antígeno.
[0078] A invenção também fornece um animal transgênico não humano compreendendo uma região variável de cadeia leve humana comum capaz de emparelhar com uma diversidade de regiões variáveis de cadeia pesada humana, sendo que os ácidos nucleicos que codificam a região variável de cadeia leve comum e as regiões variáveis de cadeia pesada humana estão presentes nos loci (leves e pesados respectivamente ou vice-versa) da região variável endógena de animal transgênico não humano e/ou estão estavelmente integrados em outro local na linhagem germinativa do dito animal transgênico (por exemplo, o locus Rosa), sendo que o contato do dito animal transgênico com um antígeno gera um arranjo de regiões variáveis de cadeia pesada humana rearranjadas que emparelham com a dita região variável de cadeia leve comum, sendo que um ácido nucleico que codifica as ditas regiões variáveis de cadeia pesada humana rearranjadas é transformado em uma célula hospedeira capaz de produzir um anticorpo multivalente da invenção, e o anticorpo multivalente compreende um ou mais domínios de ligação compreendendo a dita região variável de cadeia pesada humana rearranjada codificada por um ácido nucleico obtida de, derivada de ou baseada em uma ou mais regiões variáveis de cadeia pesada humana rearranjadas produzidas pelo animal transgênico exposto a um antígeno.
[0079] A invenção também fornece uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo da invenção e um veículo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável.
[0080] A invenção também fornece um anticorpo da invenção para uso no tratamento do corpo humano ou animal por terapia.
[0081] A invenção também fornece um método para o tratamento de um ser humano ou animal sofrendo de uma indicação médica, sendo que o método compreende administrar ao ser humano ou animal uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0082] Para facilidade de referência, para as Figuras quinze até vinte e oito, quando se descrevem moléculas triespecíficas, o seguinte formato é utilizado MFAxMFB:MFC ou AntígenoAxAntígenoB:AntígenoC, de modo que AMF ou AntígenoA seguido por x constitui o "braço curto", enquanto que x denota a dimerização, seguido por MFB ou AntígenoB descreve a posição interior do braço longo, seguido por um ":" designando um ligante seguido por MFC ou AntígenoC descreve MFC ou AntígenoC no domínio distal do braço longo. Onde o termo "mock" (controle negativo do experimento) é utilizado no contexto de uma molécula multivalente, ele se refere a um domínio de ligação de tal molécula, que é capaz de se ligar a um antígeno não presente no dado ensaio no qual ela é testada. Tipicamente, os domínios de ligação "mock" utilizados na presente invenção se ligam à toxina do tétano (TT), ao fibrinogênio (Fibri) ou à tiroglobulina (Thyro).
[0083] A Figura 1(a-u) apresenta formatos de anticorpos multivalentes da invenção, incluindo diferentes estruturas de domínio de ligação, ligantes e porções de anticorpo base.
[0084] A Figura 2a apresenta um diagrama esquemático do elemento de inserção VH1-CH1-ligante-VH2 utilizado para clonar os construtos no vetor MV1626. É entendido, embora não mostrado, que o vetor pode codificar também a região CH3-CH2-CH1, que é conectada ao VH2. A Figura 2b mostra um anticorpo triespecífico, onde VH1 liga- se a um antígeno toxoide tetânico, VH2 liga-se a um antígeno fibrinogênio e VH3 liga-se a um antígeno tiroglobulina.
[0085] A Figura 3 apresenta um diagrama esquemático do vetor MV1626.
[0086] A Figura 4 apresenta um diagrama esquemático do vetor de expressão MG1025C377.
[0087] A Figura 5 apresenta o alinhamento das sequências de insertos utilizadas para clonagem em MV1626. Observar que o alinhamento abrange apenas CH1-ligante para propósitos de clareza.
[0088] A Figura 6 apresenta um diagrama esquemático do vetor MV1057.
[0089] A Figura 7 apresenta um diagrama esquemático do vetor MV1260.
[0090] A Figura 8 apresenta géis de SDS-PAGE de IgGs em condições não redutoras (topo) e redutoras (fundo).
[0091] A Figura 9 apresenta dados de triagem de 24 construtos multivalentes.
[0092] A Figura 10 apresenta dados de triagem de 18 construtos multivalentes.
[0093] Figura 11A: Sequência de aminoácidos da cadeia leve comum. Figura 11B: Sequência de DNA do domínio variável da cadeia leve comum e tradução (IGKV1-39/jk1). Figura 11C: Sequência de DNA da região constante da cadeia leve comum e tradução. Figura 11D: Tradução do domínio variável de cadeia leve comum IGKV1-39/jk5. Figura 11E: região V de IGKV1-39A; Figura 11F: CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve comum.
[0094] Figura 12: Análise de estabilidade de 18 construtos de IgG multivalentes e de 4 anticorpos de controle analisados sob 4 condições diferentes.
[0095] Figura 13: Modelagem bioinformática de 8 ligantes.
[0096] Figura 14: Dois formatos triespecíficos de engatadores, com um domínio de ligação de célula imune situado na região interior do braço longo e um domínio de ligação ao antígeno de célula tumoral localizado no braço curto (14a) e um domínio de ligação ao antígeno de célula tumoral localizado na região distal do braço longo e um domínio de ligação ao antígeno de célula tumoral localizado no braço curto (14b).
[0097] Figura 15: Ativação de célula T em células BxPC3 (expressão média de EGFR) por citometria de fluxo com a expressão de CD25 e de CD69 como uma leitura para ambos os formatos: EGFR no braço curto (EGFRxCD3:TT na Figura 15a) e EGFR no braço longo (ThyroxCD3:EGFR na Figura 15b). O anticorpo biespecífico (EGFRxCD3) é utilizado como um controle positivo.
[0098] Figura 16: Citotoxicidade de célula T em células HCT116 (expressão média de EGFR) foi determinada pela medição dos níveis de ATP avaliados por "CellTiterGlo" tanto para EGFRxCD3:TT (Figura 16a) quanto para ThyroxCD3:EGFR (Figura 16b). Os níveis de ATP dos gráficos superiores, medidos por luminescência em um leitor de placa Envision resulta em valores de Unidade de Luz Relativa (ULR), que foram analisados usando GraphPad Prism, que o gráfico inferior correlaciona com o extermínio percentual baseado na seguinte equação, %Extermínio = (100 - (ULR de amostra/ULR sem IgG) x 100).
[0099] Figura 17: Efeito dos ligantes sobre a citotoxicidade de célula T em células HCT116 (Figura 17a). Comparação entre lise de célula alvo versus liberação de citocina para uma variedade de ligantes foi demonstrada para IL-2 (Figura 17b), IFN-g (Figura 17c) e TNF-a (Figura 17d).
[0100] Figura 18: Configuração da molécula engatadora de célula T triespecífica CD3xPD-L1:EGFR com domínio de ligação ao CD3 localizado no braço curto.
[0101] Figura 19: Configuração da molécula engatadora de célula T triespecífica EGFRxCD3:PD-L1 com domínio de ligação ao CD3 localizado na região interna do braço longo.
[0102] Figura 20: Dados de atividade de citotoxicidade de célula T são fornecidos contra células MDA-MB-231 comparando moléculas triespecíficas que combinam um domínio de ligação ao CD3 e dois domínios de ligação ao antígeno de célula tumoral com controles triespecíficos com um domínio de ligação ao antígeno de célula tumoral,
um domínio mock e um domínio de ligação ao CD3, e o controle positivo descrito acima.
[0103] Figura 21: Dados de atividade de citotoxicidade de célula T são fornecidos contra células MDA-MB-231 comparando moléculas triespecíficas que combinam um domínio de ligação ao CD3 e dois domínios de ligação ao antígeno de célula tumoral versus controles triespecíficos com um domínio de ligação ao antígeno de célula tumoral, um domínio mock e um domínio de ligação ao CD3, sendo que as moléculas triespecíficas compreendem domínios de ligação ao antígeno de célula tumoral que compreendem uma faixa de afinidades para o direcionamento ao EGFR e ao PD-L1.
[0104] Figura 22: Dados de atividade de citotoxicidade de célula T são fornecidos contra células HCT116 comparando moléculas triespecíficas que combinam um domínio de ligação ao CD3 e dois domínios de ligação ao antígeno de célula tumoral versus controles triespecíficos com um domínio de ligação ao antígeno de célula tumoral, um domínio mock e um domínio de ligação ao CD3, sendo que as moléculas triespecíficas compreendem domínios de ligação de antígeno de célula tumoral que compreendem uma faixa de afinidades para o direcionamento ao EGFR e ao PD-L1.
[0105] Figura 23a: Dados de FACS contra células MDA-MB-231 são mostrados como área sob a curva (ASC) para uma faixa de afinidades por PD-L1 e uma faixa de afinidades por EGFR, demonstrando ligação a dois antígenos correlacionada com a afinidade crescente dos domínios de ligação ao antígeno tumoral.
[0106] Figura 23b: Dados de atividade de citotoxicidade de célula T são fornecidos contra células BxPC3 demonstrando que certas moléculas triespecíficas têm o formato de CD3xPD-L1:EGFR. Ligação a dois antígenos e engate de célula imune simultâneos ocorreram com um efeito aditivo sobre a citotoxicidade sobre as moléculas que se ligam a um único antígeno e ao CD3 (ou CD3xEGFR:Mock ou CD3xMock:PD-L1). Sequências de cadeia pesada específica não mostradas.
[0107] Figura 24: Configuração da molécula engatadora de célula T triespecífica EGFRxFibrinogênio:CD3 com o domínio de ligação ao CD3 localizado na região distal do braço longo.
[0108] Figura 25: Dados de ativação de célula T são fornecidos contra células HT29, e demonstrando ativação de célula T por uma variedade de moléculas engatadoras de célula T triespecíficas EGFRxFibrinogênio:CD3 usando diferentes domínios de ligação ao CD3 em comparação com o anticorpo biespecífico EGFRxCD3 de controle utilizado na Figura 15.
[0109] Figura 26: Configuração da molécula trivalente, biespecífica EGFRxCD3:EGFR com os mesmos domínios de ligação ao EGFR (MF9891).
[0110] Figura 27: Atividade de ativação de célula T em células HCT116 foi medida para uma série de moléculas trivalentes biespecíficas EGFRxCD3:EGFR com os mesmos domínios de ligação ao EGFR (MF9891) e diferentes domínios de ligação ao CD3 de diferentes superagrupamentos com uma variedade de ligantes.
[0111] Figura 28: Atividade de ativação de célula T em células MDA- MB-231 foi medida para uma série de moléculas trivalentes biespecíficas
EGFRxCD3:EGFR com os mesmos domínios de ligação ao EGFR (MF9891) e diferentes domínios de ligação ao CD3 de diferentes superagrupamentos com uma variedade de ligantes.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0112] Um "anticorpo" é uma molécula proteinácea pertencente à classe de imunoglobulinas de proteínas, contendo um ou mais domínios que se ligam a um epítopo em um antígeno, em que tais domínios são derivados de ou compartilham a homologia de sequência com a região variável de um anticorpo. Ligação de anticorpo tem qualidades diferentes incluindo especificidade e afinidade. A especificidade determina qual antígeno ou epítopo do mesmo é especificamente ligado pelo domínio de ligação. A afinidade é uma medida para a força da ligação a um antígeno ou epítopo específico. É conveniente notar aqui que a 'especificidade' de um anticorpo se refere à sua seletividade para um antígeno específico, enquanto que a 'afinidade' se refere à força da interação entre o sítio de ligação ao antígeno do anticorpo e o epítopo ao qual ele se liga.
[0113] Dessa forma, a "especificidade de ligação", como aqui utilizada, se refere à capacidade de um sítio de ligação do anticorpo individual para reagir com um determinante antigênico. Tipicamente, o sítio de ligação do anticorpo da invenção está localizado nos domínios Fab e é construído a partir de uma região hipervariável de cadeias pesadas e/ou leves.
[0114] "Afinidade" é a força da interação entre um único sítio de ligação ao antígeno e seu antígeno. Um único sítio de ligação ao antígeno de um anticorpo da invenção para um antígeno pode ser expresso em termos da constante de dissociação (KD). Tipicamente, os anticorpos para aplicações terapêuticas podem ter afinidades de até 1x1010 M ou ainda mais altas.
[0115] Um "antígeno" é uma molécula capaz de induzir uma resposta imune (para produzir um anticorpo) em um organismo hospedeiro e/ou ser reconhecida por um anticorpo. No nível molecular, um antígeno é caracterizado por sua capacidade de ser ligado pelo sítio de ligação ao antígeno de um anticorpo. Também misturas de antígenos podem ser consideradas como um 'antígeno', isto é o versado na técnica entenderia que algumas vezes um lisado de células tumorais, ou partículas virais pode ser indicado como 'antígeno', enquanto que tal tumor lisado de células tumorais ou preparação de partículas virais existe de muitos determinantes antigênicos. Um antígeno compreende ao menos um, mas com frequência mais epítopos.
[0116] O termo "epítopo" ou "determinante antigênico" é um sítio em um antígeno ao qual uma imunoglobulina ou um anticorpo especificamente se liga. Os epítopos podem ser formados a partir de aminoácidos contíguos ou aminoácidos não contíguos justapostos pelo enovelamento terciário de uma proteína (chamados epítopos lineares e conformacionais). Os epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos lineares são tipicamente mantidos sob exposição a solventes desnaturantes, enquanto que epítopos formados por enovelamento terciário, a conformação é tipicamente perdida sob tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo pode tipicamente incluir 3, 4, 5, 6,
7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos em uma conformação espacial exclusiva.
[0117] O termo "cadeia pesada" ou "cadeia pesada de imunoglobulina" inclui uma sequência da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de qualquer organismo, e exceto se especificado em contrário, inclui um domínio variável de cadeia pesada. O termo domínios variáveis de cadeia pesada inclui três CDRs de cadeia pesada e quatro regiões FR, exceto se especificado em contrário. Fragmentos de cadeias pesadas incluem CDRs, CDRs e FRs, e combinações das mesmas. Uma cadeia pesada tem, após o domínio variável (do N-terminal para o C-terminal), um domínio CH1, uma dobradiça, um domínio CH2, e um domínio CH3. Um fragmento funcional de uma cadeia pesada inclui um fragmento que é capaz de reconhecer especificamente um antígeno e que compreende ao menos uma CDR.
[0118] O termo "cadeia leve" inclui um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina, ou um VL (ou fragmento funcional da mesma); e um domínio constante de imunoglobulina, ou sequência C L (ou fragmento funcional da mesma) de qualquer organismo. Exceto se especificado em contrário, o termo cadeia leve pode incluir uma cadeia leve selecionada dentre uma cadeia kappa humana, uma cadeia lambda humana e uma combinação das mesmas. Os domínios variáveis de cadeia leve (VL) tipicamente incluem três CDRs de cadeia leve e quatro regiões framework (FR), exceto se especificado em contrário. Em geral, uma cadeia leve de comprimento completo inclui, do N-terminal para o C-terminal, um domínio VL, que inclui FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-
CDR3-FR4, e um domínio constante de cadeia leve. As cadeias leves que podem ser utilizadas com esta invenção incluem aquelas, por exemplo, que não se ligam seletivamente a um epítopo ligado seletivamente pelas cadeias pesadas.
[0119] As cadeias leves adequadas para uso em um anticorpo multivalente da invenção incluem uma cadeia leve comum, como aquelas que podem ser identificadas por triagem para as cadeias leves mais comumente utilizadas em bibliotecas de anticorpos existentes (bibliotecas a úmido ou in silico), onde as cadeias leves não interferem substancialmente com a afinidade e/ou a seletividade dos domínios de ligação ao epítopo das cadeias pesadas, mas também são adequadas para se emparelharem com um conjunto de cadeias pesadas. Por exemplo, uma cadeia leve adequada inclui uma de um animal transgênico, como um roedor transgênico, que compreende a cadeia leve comum integrada em seu genoma e que pode ser utilizada para gerar grandes painéis de anticorpos de cadeia leve comum tendo diversidade na cadeia pesada mediante a exposição a um antígeno.
[0120] O termo "cadeia leve comum", de acordo com a invenção, se refere às cadeias leves que podem ser idênticas ou ter algumas diferenças na sequência de aminoácidos, enquanto a especificidade de ligação de um anticorpo da invenção não é afetada, isto é as diferenças não influenciam substancialmente a formação de regiões funcionais de ligação.
[0121] É, por exemplo, possível dentro do escopo da definição de cadeias leves comuns, como utilizado aqui, preparar ou encontrar cadeias leves que não são idênticas, mas ainda funcionalmente equivalentes, por exemplo, por introdução e teste de alterações conservativas de aminoácidos, alterações de aminoácidos em regiões que não contribuem ou que contribuem apenas parcialmente para a especificidade de ligação quando emparelhadas com uma cadeia cognata, e similares. Tais variantes são, dessa forma, também capazes de se ligar a diferentes cadeias cognatas e de formar domínios funcionais de ligação ao antígeno. O termo "cadeia leve comum", como utilizado aqui, se refere, dessa forma, às cadeias leves que podem ser idênticas ou ter algumas diferenças na sequência de aminoácidos, enquanto que mantêm a especificidade de ligação do anticorpo resultante após o emparelhamento com uma cadeia pesada. Uma combinação de uma certa cadeia leve comum e tais variantes funcionalmente equivalentes é abrangida dentro do termo "cadeia leve comum".
[0122] Um "domínio Fv" significa um domínio de ligação que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL).
[0123] Um "domínio Fab" significa um domínio de ligação que compreende uma região variável, tipicamente um domínio de ligação que compreende uma região variável de cadeia pesada e região variável de cadeia leve emparelhadas. Um domínio Fab pode compreender domínios da região constante, incluindo um domínio CH1 e um domínio VH emparelhados com um domínio constante de cadeia leve (CL) e domínio VL. Tal emparelhamento pode ocorrer, por exemplo, como ligação covalente via uma ponte de dissulfeto nos domínios CH1 e CL.
[0124] Um "domínio Fab modificado" significa um domínio de ligação que compreende um domínio CH1 e um domínio VH, sendo que o domínio VH é emparelhado com um domínio VL e nenhum domínio CL está presente. Alternativamente, um domínio Fab modificado é um domínio de ligação que compreende um domínio CL e um domínio VL, sendo que o domínio VL é emparelhado com um domínio VH e nenhum domínio CH1 está presente. Com o propósito de que a região CH1 ou CL possa estar presente em uma forma não emparelhada, pode ser necessário remover ou reduzir os comprimentos das regiões de hidrofobicidade. Podem ser utilizadas regiões CH1 de espécies de animais que expressam naturalmente anticorpos de cadeia única, por exemplo, de um animal camelídeo, como um lhama ou um camelo, ou de um tubarão. Outros exemplos de um domínio Fab modificado incluem uma região constante, CH1 ou CL, que não está emparelhada com a sua região cognata e/ou uma região variável VH ou VL, está presente, que não está emparelhada com sua região cognata.
[0125] O termo "célula efetora imune" ou "célula efetora", como utilizado aqui, se refere a uma célula dentro do repertório natural de células do sistema imune de mamíferos que pode ser ativada para afetar a viabilidade de uma célula alvo. As células efetoras imunes incluem células da linhagem linfoide como células assassinas naturais (NK), células T incluindo células T citotóxicas, ou células B, mas também células da linhagem mieloide podem ser consideradas como células efetoras imunes, como monócitos ou macrófagos, células dendríticas e granulócitos neutrofílicos. Portanto, a dita célula efetora é de preferência uma célula NK, uma célula T, uma célula B, um monócito, um macrófago, uma célula dendrítica ou um granulócito neutrofílico.
[0126] "Porcentagem (%) de identidade", em relação às sequências de ácidos nucleicos ou de aminoácidos da presente invenção, é definida como a porcentagem de resíduos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos em uma sequência selecionada, após o alinhamento das sequências para propósitos de comparação ótima. Para otimizar o alinhamento entre as duas sequências, podem ser introduzidas lacunas em qualquer uma das duas sequências que são comparadas. Tal alinhamento pode ser executado ao longo de todo o comprimento das sequências que estão sendo comparadas. Alternativamente, o alinhamento pode ser executado ao longo de um comprimento mais curto, por exemplo, cerca de 20, cerca de 50, cerca de 100 ou mais ácidos nucleicos/aminoácidos. A identidade da sequência é a porcentagem de igualdades idênticas entre as duas sequências na região alinhada relatada.
[0127] A comparação de sequências e determinação da porcentagem de identidade da sequência entre duas sequências podem ser feitas com o uso de um algoritmo matemático. O versado na técnica estará ciente do fato de que vários programas de computador diferentes estão disponíveis para alinhar duas sequências e determinar a identidade entre duas sequências (Kruskal, J. B. (1983) "An overview of sequence comparison" em D. Sankoff and J. B. Kruskal, (ed.), "Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison", pp. 1-44 Addison Wesley). A porcentagem de identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos ou sequências de ácidos nucleicos pode ser determinada com o uso do algoritmo de Needleman e Wunsch para o alinhamento de duas sequências. (Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443 a 453). O algoritmo de Wunsch Needleman foi implementado no programa de computador NEEDLE. Para o propósito desta invenção o programa NEEDLE do pacote EMBOSS é utilizado para determinar a identidade percentual de sequências de aminoácidos e de ácidos nucleicos (versão 2.8.0 ou superior, "EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite" (2000) Rice, P. LongdenJ. and Bleasby, A. Trends em Genetics 16, (6) pp276— 277, http://emboss.bioinformatics.nl/). Para sequências de proteína, é usado EBLOSUM62 para a matriz de substituição. Para sequências de DNA, DNAFULL é usado. Os parâmetros usados são uma penalidade por lacuna aberta de 10 e uma penalidade por extensão de lacuna de 0,5.
[0128] Após o alinhamento pelo programa NEEDLE, conforme descrito acima, a porcentagem de identidade de sequência entre uma sequência de consulta e uma sequência da invenção é calculada conforme exposto a seguir: Número de posições correspondentes no alinhamento mostrando um aminoácido idêntico ou nucleotídeo idêntico em ambas as sequências dividido pelo comprimento total do alinhamento após a subtração do número total de lacunas no alinhamento.
[0129] Na presente invenção, o termo "conectado" se refere aos domínios que são juntados um ao outro por meio de ligações peptídicas na sequência de aminoácidos primária. Por exemplo, uma cadeia pesada de uma porção anticorpo de base que compreende VH-CH1-CH2-CH3 pode ser conectada a uma cadeia pesada de um domínio de ligação adicional VH-CH1 (ou um domínio de ligação adicional a um domínio de ligação adicional) via um ligante (que conecta a cadeia pesada do domínio de ligação adicional na CH1 à região VH da porção anticorpo de base), que juntas constituem uma cadeia polipeptídica. De modo similar, um domínio CH1 pode ser conectado a uma região variável de cadeia pesada e um domínio CL pode ser conectado a uma região variável de cadeia leve.
[0130] "Emparelhamento" se refere às interações entre os polipeptídeos que constituem um anticorpo multivalente da invenção de modo que eles possam se multimerizar. Por exemplo, um domínio de ligação adicional pode compreender uma região de cadeia pesada (VH CH1) emparelhada com uma região de cadeia leve (VL-CL), onde o par CH1 e CL forma o dito domínio de ligação. Conforme descrito na presente invenção, o emparelhamento de domínios de anticorpos (por exemplo, pesado e leve) ocorre devido às interações não covalentes e também via ligações de dissulfeto, e pode ser manipulado mediante técnicas aqui reveladas e por métodos conhecidos na técnica.
[0131] Em todo o presente relatório descritivo e nas reivindicações anexadas, as palavras "compreendem", "incluem" e "tendo" e variações como "compreende", "compreendendo", "inclui" e " incluindo" devem ser interpretadas de modo inclusivo. Ou seja, estas palavras destinam-se a comunicar a inclusão possível de outros elementos ou números inteiros não especificamente citados, onde o contexto permite.
[0132] Os artigos "um" e "uma" são utilizados na presente invenção para se referirem a um ou a mais de um (isto é, a um ou ao menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, "um elemento" pode significar um elemento ou mais de um elemento.
[0133] A invenção fornece um anticorpo multivalente que compreende: - uma porção anticorpo de base que compreende dois domínios de ligação; e - ao menos um domínio de ligação adicional, sendo que a porção anticorpo de base é conectada por um ligante a ao menos um domínio de ligação adicional, sendo que cada domínio de ligação da porção anticorpo de base e cada um de ao menos um dos domínios de ligação adicionais têm, todos, uma região variável comum, e sendo que o ligante compreende uma sequência de dobradiça ou uma sequência derivada de uma sequência de dobradiça.
[0134] A invenção também fornece um anticorpo multivalente que compreende: - uma porção anticorpo de base que compreende dois domínios de ligação; e - ao menos um domínio de ligação adicional, sendo que ao menos um domínio de ligação adicional compreende uma região CH1 e é conectado à porção anticorpo de base pelo dito ligante, que conecta uma região variável da porção anticorpo de base e a região CH1, e sendo que o anticorpo multivalente se liga a ao menos três epítopos diferentes.
[0135] Em um tal anticorpo multivalente, cada domínio de ligação da porção anticorpo de base e cada um de ao menos um dos domínios de ligação adicionais podem ter, todos, uma região variável comum.
[0136] A presente invenção, dessa forma, fornece um anticorpo multivalente que é tipicamente capaz de se ligar ao seu alvo ou aos seus alvos via ao menos três domínios de ligação, isto é o anticorpo é um anticorpo multivalente. O anticorpo multivalente pode opcionalmente ser um anticorpo multiespecífico. Isto quer dizer que, um anticorpo da invenção pode ser capaz de se ligar a dois ou mais epítopos diferentes ou a dois ou mais antígenos diferentes, por exemplo dois, três, quatro ou mais epítopos ou antígenos diferentes. Diferentes formatos de anticorpos multivalentes
[0137] Deve ser observado que outras características e aspectos da presente invenção são evidentes a partir da descrição detalhada, considerada juntamente com os desenhos anexados, que ilustram, a título de exemplo, as características de acordo com as modalidades da invenção. As figuras são exemplificadoras e não se destinam ao escopo da invenção e nem o limitam, que é definido pelas reivindicações e pela extensão completa da revelação detalhada, que descreve e permite que as invenções sejam aqui apresentadas. Um anticorpo multivalente da invenção pode compreender uma porção anticorpo de base e um domínio de ligação adicional, de preferência, um domínio Fab que compreende uma região VH-CH1 emparelhada com uma região VL-CL.
O dito anticorpo multivalente compreende três regiões VH, e três regiões VL. Qualquer uma dentre a VH ou VL pode ser uma região variável comum (VHc ou VLc) emparelhada com uma região variável rearranjada da cadeia cognata. Por exemplo, as três regiões VL podem ser uma cadeia comum (VLc), e cada região VH (VH1-VH3) pode compreender uma região variável rearranjada, sendo que as ditas regiões VH1, VH2 e VH3 podem se ligar ao mesmo epítopo ou até a três epítopos diferentes. Sendo que, o anticorpo multivalente compreende uma cadeia leve comum (VLc) e três regiões variáveis de cadeia pesada (VH1-VH3), o domínio Fab adicional compreendido de uma VH3-CH1 emparelhada com uma VLc-CL pode ser conectado ao anticorpo base via um ligante posicionado entre uma região VH1 ou VH2 da porção anticorpo de base e CH1 do domínio Fab adicional. Consulte, por exemplo, a Figura 1a.
[0138] Alternativamente, o domínio Fab adicional pode ser conectado ao anticorpo base via um ligante posicionado entre a região de cadeia leve comum (VLc) do anticorpo base e a região CL do domínio Fab adicional. Consulte, por exemplo, a Figura 1b. Em um outro aspecto da invenção, as três regiões VH podem ser uma cadeia comum (VHc), e cada região VL pode compreender uma região variável rearranjada, sendo que as ditas três regiões VL podem se ligar aos mesmos ou diferentes epítopos (VL1-VL3). Sendo que o anticorpo multivalente compreende uma cadeia pesada comum (VHc) e três regiões variáveis de cadeia leve (VL1-VL3), o domínio Fab adicional pode ser conectado ao anticorpo base via um ligante posicionado entre uma região VL1 ou VL2 da porção anticorpo de base e CL do domínio Fab adicional. Consulte, por exemplo, a Figura 1c.
Alternativamente, o domínio Fab adicional pode ser conectado ao anticorpo base via um ligante posicionado entre a região de cadeia pesada comum (VHc) do anticorpo base e a região CH1 do domínio Fab adicional. Consulte, por exemplo, a Figura 1d.
[0139] Alternativamente, o domínio Fab adicional pode ser conectado ao anticorpo base via um ligante posicionado entre ambas as regiões variáveis de cadeias pesada e leve do anticorpo base e as regiões CH1 e CL do domínio Fab adicional, independentemente de se a cadeia comum é pesada ou leve. Consulte, por exemplo, a Figura 1e.
[0140] Um anticorpo multivalente da invenção pode compreender uma porção anticorpo de base e mais de um domínio de ligação adicional, por exemplo dois domínios Fab. Qualquer das regiões VH ou VL do dito anticorpo multivalente pode ser uma região variável comum (por exemplo, VHc ou VLc) com a cadeia cognata compreendendo uma região variável rearranjada que se liga ao mesmo ou diferente antígeno ou epítopo (por exemplo, VHc e VL1-VL4; ou VH1-VH4 e VLc). Os domínios Fab adicionais podem ser conectados à porção anticorpo de base via um ligante posicionado entre a cadeia comum da porção anticorpo de base (VHc ou VLc) e a respectiva região constante da região variável comum dos domínios Fab adicionais, ou os domínios variáveis rearranjados (VH1 e VH2; ou VL1 e VL2) do anticorpo base e a respectiva região constante do domínio variável rearranjado dos domínios Fab adicionais. Por exemplo, a Figura 1f representa um anticorpo multivalente da invenção que compreende um anticorpo base e dois domínios Fab adicionais, sendo que o anticorpo compreende uma cadeia leve comum (VLc), e quatro regiões variáveis de cadeia pesada (VH1-VH4), sendo que um ligante conecta o anticorpo base aos domínios Fab adicionais nas regiões variáveis de cadeia pesada rearranjadas do anticorpo base (VH2 e VH3) e as regiões CH1 dos domínios Fab adicionais.
Alternativamente, a Figura 1g mostra um anticorpo multivalente da invenção, sendo que o anticorpo base é conectado a dois domínios Fab adicionais em uma primeira região de cadeia pesada rearranjada (VH2) à região CH1 do primeiro domínio Fab adicional, e uma região variável de cadeia leve comum (VLc) do anticorpo base à região CL do segundo domínio Fab adicional.
Alternativamente, a Figura 1h mostra um anticorpo multivalente da invenção, sendo que o anticorpo base é conectado a dois domínios Fab adicionais via um ligante que conecta ambas regiões de cadeia leve comum (VLc) do anticorpo base às regiões CL dos dois domínios Fab adicionais.
Alternativamente, a Figura 1j mostra um anticorpo multivalente da invenção, sendo que o anticorpo base é conectado a um primeiro domínio Fab adicional via um ligante que conecta tanto a região variável de cadeia pesada rearranjada (VH3) quanto a região de cadeia leve comum (VLc) do anticorpo base ao primeiro domínio Fab adicional nas CH1 e CL respectivamente, e o segundo domínio Fab adicional é conectado via um ligante à segunda região variável de cadeia pesada rearranjada (VH2) do anticorpo base na região CH1 do segundo domínio Fab adicional.
Alternativamente, (Figura 1i), o segundo domínio Fab adicional é conectado via um ligante à região variável de cadeia leve comum (VLc) do anticorpo base à região CL do segundo domínio Fab adicional.
Alternativamente, (Figura 1k), o segundo domínio Fab adicional é conectado via um ligante tanto à segunda região variável de cadeia pesada rearranjada (VH2) quanto à cadeia leve comum (VLc) da porção anticorpo de base nas regiões CH1 e CL do segundo domínio Fab adicional, respectivamente. Os formatos descritos na presente invenção e representados nas Figuras 1f a 1k também se aplicam a se a cadeia comum é uma cadeia pesada (VHc) e o anticorpo multivalente compreende quatro regiões variáveis de cadeia leve rearranjadas (VL1-VL4) compreendendo até quatro diferentes especificidades de ligação.
[0141] Adicionalmente, dois ou mais domínios de ligação adicionais podem ser conectados via ligantes a apenas um domínio de ligação de uma porção anticorpo de base, de modo que um primeiro domínio Fab é conectado a um segundo domínio Fab via um ligante, que é então conectado à porção anticorpo de base. Isto quer dizer que, um primeiro ligante está posicionado entre a porção anticorpo de base e um dos domínios Fab adicionais e um segundo ligante está posicionado entre os dois domínios Fab adicionais. Os dois ligantes podem ser iguais ou diferentes.
[0142] Em um outro aspecto da invenção, as proteínas individuais que compõem o anticorpo multivalente podem misturar cadeias pesadas e leves dentro da mesma proteína. Por exemplo, um anticorpo multivalente pode ser compreendido de uma primeira proteína que compreende o domínio Fab adicional ligado ao anticorpo base no sentido do N-terminal para o C- terminal de VLc-CL-VH2-CH1-CH2-CH3, de modo que um ligante conecta a região VLc-CL do domínio Fab adicional à porção anticorpo de base em VH2-CL. A segunda proteína compreendendo VH1-CH1, que se emparelha com a VLc-CL da primeira proteína. Uma terceira proteína compreendendo no sentido do N-terminal para o C-terminal VH3-CH1-CH2-CH3, de modo que as terceira e primeira proteínas se emparelham abaixo das respectivas regiões CH1 delas. E uma quarta proteína compreende no sentido do N- terminal para o C-terminal VLc-CL, que se emparelha com a VH2-CH1 da primeira proteína e VH3-CH1 da terceira proteína. Consulte, por exemplo, a Figura 1l.
[0143] Embora o formato descrito e representado na Figura 1l ilustre o uso de uma cadeia leve comum e ao menos três regiões variáveis de cadeia pesada rearranjadas (VH1-VH3) compreendendo até três diferentes especificidades de ligação, deve ser entendido que este formato aplica-se se a cadeia comum é uma cadeia pesada (VHc) e o anticorpo multivalente compreende três ou mais regiões variáveis de cadeia leve rearranjadas (VL1-VL3) compreendendo até três diferentes especificidades de ligação.
[0144] Um outro aspecto da invenção é um anticorpo multivalente compreendendo quatro proteínas, sendo que a cadeia comum é uma cadeia leve comum. O anticorpo multivalente é compreendido de quatro proteínas no sentido do N-terminal para o C-terminal que compreende: uma primeira proteína de VH1-CH1-VLc-CL, sendo que um ligante conecta a CH1 à VLc; uma segunda proteína de VLc-CL que se emparelha com a VH1-CH1 para formar um domínio Fab adicional; uma terceira proteína compreendendo VH2-CH1-CH2-CH3, sendo que a CH1 da terceira proteína se emparelha com a CL da segunda proteína; e uma quarta proteína compreendendo VH3-CH1-CH2-CH3, sendo que as terceira e quarta proteínas são emparelhadas abaixo da região CH1, e a segunda proteína (VLc-CL) é emparelhada com a quarta proteína na região CH1 da quarta proteína. Consulte, por exemplo, a Figura 1m.
[0145] Um anticorpo multivalente da invenção pode compreender uma porção anticorpo de base e um domínio Fab adicional, sendo que qualquer das regiões VH ou VL do anticorpo multivalente pode ser uma região variável comum, e sendo que o domínio Fab adicional pode ser conectado à porção anticorpo de base via um ligante posicionado ou na VH (Figura 1n) ou na VL (Figura 1o) do anticorpo base, sendo que o dito ligante conecta simultaneamente o anticorpo base ao domínio Fab e também emparelha as cadeias cognatas do domínio Fab. Em tais casos o dito domínio Fab pode opcionalmente não possuir um domínio CH1-CL, e usar o ligante para emparelhar os domínios variáveis do domínio Fab.
[0146] Um anticorpo multivalente da invenção pode compreender uma porção anticorpo de base e um domínio de ligação adicional que compreende uma VH e VL emparelhada. O dito domínio de ligação adicional que compreende uma VH e VL pode ser emparelhado via uma ponte de cisteína, formada entre as VH e VL, de modo que possa não precisar da presença de uma região CH1 ou CL. Consulte, por exemplo, a Figura 1p. Nota-se que uma ponte de cisteína é representada na Figura 1p, embora o versado na técnica entenda que pontes de cisteína adicionais estão tipicamente presentes na interface de CH1/CL (não mostrada nas figuras).
[0147] Um anticorpo multivalente da invenção pode compreender uma porção anticorpo de base e um domínio Fab modificado adicional. O domínio Fab modificado pode compreender uma CH1 modificada de modo que não precise se emparelhar com uma CL. Por exemplo, a CH1 poderia ser uma CH1 de camelídeo ou baseada em uma CH1 de camelídeo, ou ser modificada para não possuir resíduos hidrofóbicos mediante técnicas conhecidas na técnica. Cada VH ou VL pode ser uma região variável rearranjada ou comum. O domínio Fab modificado adicional pode ser conectado à porção anticorpo de base via um ligante posicionado entre a VH2 da porção anticorpo de base e a CH1 do domínio Fab modificado. As VH e VL do domínio Fab modificado podem ser emparelhadas via uma ponte de cisteína, ou alternativamente, via interações não covalentes. Consulte, por exemplo, a Figura 1q. Alternativamente, o domínio Fab modificado adicional pode ser conectado à porção anticorpo de base via um ligante posicionado entre a VL da porção anticorpo de base e a CH1 do domínio Fab modificado. As VH e VL do domínio Fab modificado podem ser emparelhadas via uma ponte de cisteína. Consulte, por exemplo, a Figura 1r.
[0148] Um anticorpo multivalente da invenção pode compreender uma porção anticorpo de base e um domínio Fab modificado adicional, sendo que o domínio Fab modificado pode compreender uma CL modificada de modo que ela não precisa se emparelhar com uma CH1. Por exemplo, a CL poderia ser manipulada para remover regiões hidrofóbicas. Cada VH ou VL do domínio Fab modificado pode ser uma região variável rearranjada ou comum. O domínio Fab modificado adicional pode ser conectado à porção anticorpo de base via um ligante posicionado entre a VL da porção anticorpo de base e a CL de domínio
Fab modificado. As VH e VL do domínio Fab modificado podem ser emparelhadas via uma ponte de cisteína. Consulte, por exemplo, a Figura 1s.
[0149] Um anticorpo multivalente da invenção pode compreender uma porção anticorpo de base e um domínio Fab modificado adicional, sendo que o domínio Fab modificado pode compreender uma CL modificada de modo que ela não precisa se emparelhar com uma CH1. Por exemplo, a CL poderia ser manipulada para remover regiões hidrofóbicas. Cada VH ou VL do domínio Fab modificado pode ser uma região variável rearranjada ou comum. O domínio Fab modificado adicional pode ser conectado à porção anticorpo de base via um ligante posicionado entre a VH2 da porção anticorpo de base e a CL de domínio Fab modificado. As VH e VL do domínio Fab modificado podem ser emparelhadas via uma ponte de cisteína. Consulte, por exemplo, a Figura 1t. Porção anticorpo base da invenção
[0150] Deve ser observado que embora as Figuras 1a a 1u representem uma porção anticorpo de base do anticorpo multivalente como incluindo regiões constantes de cadeia pesada emparelhadas CH2 e CH3, estas regiões são mostradas apenas para propósitos ilustrativos e a invenção não se limita a estas modalidades. São descritos, na presente invenção, diferentes formatos para a porção anticorpo de base e domínio de ligação adicional adequados para uso nos anticorpos revelados.
[0151] A porção anticorpo de base do anticorpo multivalente da invenção pode ser uma imunoglobulina de comprimento completo, por exemplo, uma porção de IgG, IgA, IgE, IgD ou IgM de comprimento completo, mas, de preferência, IgG e, com mais preferência, IgG1.
[0152] Em qualquer anticorpo da invenção, ao menos um dos domínios de ligação adicionais, de preferência, um domínio Fab, pode compreender um domínio CH1 de uma subclasse de imunoglobulina diferente daquela do(s) domínio(s) CH1 da porção anticorpo de base do anticorpo e/ou pode ter uma cadeia leve de uma classe diferente. Por exemplo, se a porção base do anticorpo é uma IgG1 de comprimento completo, ao menos um dos domínios de ligação adicionais pode compreender um domínio CH1 da subclasse IgG2a, IgG2b, IgG3 ou IgG4 e/ou se a porção base do anticorpo inclui uma cadeia leve kappa, ao menos um dentre o domínio de ligação adicional pode incluir uma cadeia leve lambda.
[0153] As cadeias pesadas do anticorpo base podem ser projetadas, de preferência, preferencialmente se emparelharem mediante técnicas conhecidas pelos versados na técnica, como engenharia das modificações DEKK nas regiões CH3 do anticorpo base. Consulte WO2013/157954 e De Nardis et al., J. Biol. Chem. (2017) 292 (35) 14706-14717, aqui incorporados a título de referência, demonstrando a engenharia na região CH3 para conduzir a heterodimerização das cadeias pesadas. Abordagens alternativas para conduzir a heterodimerização que podem ser utilizadas na invenção incluem o formato knob-in-hole (WO1998/050431) e o uso da engenharia de alteração (Gunasekaran, JBC 2010, volume 285, ppp. 19637-19646).
[0154] A região Fc medeia as funções efetoras de um anticorpo, como citotoxicidade dependente de complemento (CDC), citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP). Dependendo do anticorpo multivalente, pode ser desejado reduzir ou aumentar a função efetora. A função efetora reduzida pode ser desejada quando uma resposta imune deve ser ativada, intensificada ou estimulada como em algumas das modalidades da invenção. Os anticorpos com funções efetoras reduzidas podem ser utilizados para reconhecer moléculas de superfície celular de células imunes, dentre outras. A função efetora aumentada pode ser desejada quando um anticorpo está reconhecendo células nocivas, aumentando, assim, a capacidade de células efetoras imunes ou a cascata de complemento para eliminar ou lisar tais alvos.
[0155] A função efetora da região Fc de cadeia pesada pode ser mitigada ou eliminada mediante modificações conhecidas pelos versados na técnica. De modo similar, a função efetora da região Fc de cadeia pesada pode ser intensificada mediante modificações conhecidas pelos versados na técnica. Por exemplo, a ADCC pode ser intensificada via a modificação genética do domínio CH2. Consulte, por exemplo, Strohl, Curr. Opin. Biotechnol. 2009(6):685-91.
[0156] Um anticorpo multivalente da invenção pode, em uma modalidade, ser afucosilado. Um anticorpo multivalente da invenção compreende, de preferência, uma quantidade reduzida de fucosilação da estrutura de carboidrato N-ligada na região Fc, quando comparado com o mesmo anticorpo produzido em uma célula CHO normal.
[0157] Um aspecto do anticorpo multivalente da invenção também inclui um anticorpo base, que não possui uma região CH2 ou CH3, sendo que as ditas cadeias pesadas da porção anticorpo de base podem ser juntadas por uma ponte covalente de cisteína abaixo da região CH1.
[0158] Aspectos da invenção, incluindo variações na porção anticorpo de base da invenção, são Ilustrados na Figura 1u.
[0159] Na presente invenção, é descrito um repertório de ligantes que podem ser utilizados para conectar a porção base do anticorpo da invenção com um ou mais domínios de ligação. Um ou mais domínios de ligação, como uma região variável, um domínio Fv, um domínio Fab ou um domínio Fab modificado, podem ser conectados à porção anticorpo de base de um anticorpo da invenção.
[0160] O anticorpo da presente invenção compreende uma porção anticorpo de base e, ligados à mesma, via um ligante ou ligantes, um ou mais domínios de ligação.
[0161] Anticorpos multivalentes que compreendem uma porção anticorpo de base de IgG de comprimento completo são preferenciais porque tais estruturas tipicamente têm propriedades benéficas como uma meia-vida favorável, comportamento biofísico previsível e imunogenicidade mais baixa. Os anticorpos da invenção são tipicamente adequados para uso terapêutico e portanto são compreendidos de sequências humanas para o uso de terapêutica humana. Alternativamente, os ditos anticorpos têm sequências da espécie para a qual o agente terapêutico está sendo utilizado ou é baseado em sequências consenso dentro daquela dada espécie, usando técnicas bem conhecidas pelos versados na técnica.
[0162] Se a porção anticorpo de base de um anticorpo da invenção é uma IgG de comprimento completo, a IgG de comprimento completo pode compreender mutações que fornecem as características desejadas. Tais mutações tipicamente não são deleções de porções substanciais de qualquer das regiões. Entretanto, as porções IgG de comprimento completo nas quais um ou vários resíduos de aminoácidos são inseridos, deletados ou substituídos sem alterar essencialmente as características de ligação da porção IgG resultante, são abrangidas pelo termo "IgG de comprimento completo". Por exemplo, tais porções de IgG podem ter uma ou mais inserções, deleções ou substituições entre 1 e 10 resíduos de aminoácidos, de preferência, em regiões não CDR, sendo que os aminoácidos inseridos, deletados ou substituídos não são essenciais para a especificidade de ligação da IgG.
[0163] IgG1 pode ser favorecida com base em sua longa meia-vida circulatória no homem. Também, para mitigar a imunogenicidade em seres humanos, é preferencial que a porção anticorpo de base de um anticorpo de acordo com a invenção seja um anticorpo humano.
[0164] A porção base do anticorpo da invenção pode ser uma imunoglobulina de comprimento completo que é definida como compreendendo um anticorpo essencialmente completo. Tal anticorpo essencialmente completo pode não ter necessariamente todas as funções de um anticorpo intacto.
[0165] Uma porção base de comprimento completo de um anticorpo, conforme descrita na presente invenção, compreende duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Cada cadeia contém as regiões constantes (C) e variáveis (V), que podem ser decompostas em domínios designados CH1, CH2, CH3, VH para a cadeia pesada, e CL, VL para a cadeia leve. O anticorpo pode interagir com moléculas e células do sistema imune mediante os domínios constantes, tipicamente mediante a porção Fc.
[0166] A região constante de um anticorpo da presente invenção, incluindo um anticorpo biespecífico ou multiespecífico, é, de preferência, uma região constante humana. A região constante pode conter um ou mais, de preferência, não mais que 10, de preferência, não mais que 5 diferenças de aminoácidos em relação à região constante de um anticorpo humano de ocorrência natural. Vários domínios variáveis de anticorpos produzidos na presente invenção são derivados de uma biblioteca de domínios variáveis de anticorpos humanos. Como tais, esses domínios variáveis são humanos. As regiões de CDR únicas podem ser derivadas de seres humanos, ser sintéticas ou derivadas de outro organismo. Um anticorpo ou anticorpo biespecífico da invenção é, de preferência, um anticorpo humano ou humanizado. Regiões constantes de cadeia pesada adequadas são exemplificadas de forma não limitadora na Tabela 21.
[0167] Um anticorpo da invenção tipicamente tem uma região Fc intacta que mantém a meia-vida e a estabilidade do anticorpo multiespecífico. O Fc pode também permitir a interação com moléculas efetoras imunes como receptores Fc, complemento e FcRn. Conforme entendido pelos versados na técnica, técnicas estão disponíveis para projetar uma região Fc para prevenir ou mitigar as interações com receptores Fc ou para intensificar as interações com o receptor de Fc.
[0168] A porção anticorpo de base e um ou mais domínios de ligação adicionais, por exemplo, domínios Fab, são conectados via um ou mais ligantes. O ao menos um domínio Fab adicional pode ser de um dado isotipo ou uma dada subclasse, por exemplo, isotipos IgG1, 2a, 2d, 3 ou 4: ao menos um Fab adicional pode ser de uma subclasse diferente daquela dos domínios Fab da porção IgG de comprimento completo ou pode transportar uma cadeia leve de uma classe diferente (kappa ou lambda). Conectores para uso no formato de anticorpo multivalente
[0169] Um anticorpo da invenção compreende um ou mais ligantes que conectam os um ou mais domínios de ligação adicionais à porção anticorpo de base. O ligante juntamente com o domínio de ligação ao qual o ligante é conectado determina, ao menos em parte, a funcionalidade do anticorpo multivalente.
[0170] Em um anticorpo da invenção, a região de peptídeo de um ligante pode compreender uma sequência de dobradiça ou compreender uma sequência baseada em uma sequência de dobradiça. Dessa forma, a sequência de aminoácidos de uma região de peptídeo adequada pode compreender uma sequência de ocorrência natural ou compreender uma sequência baseada em uma sequência de ocorrência natural. O uso de tais sequências pode ajudar no desenvolvimento de anticorpos multivalentes da invenção e ajudar a assegurar baixa imunogenicidade.
[0171] Uma região de dobradiça é um trecho de aminoácidos flexível na parte central das cadeias pesadas das classes de imunoglobulinas IgG e IgA (isto é, aquela porção que conecta o Fab ao Fc), que emparelha estas duas cadeias pesadas por ligações de dissulfeto. Ela é rica em aminoácidos cisteína e prolina, e tem pouca semelhança com qualquer outra região da imunoglobulina.
[0172] Consequentemente, um ligante adequado para conectar os um ou mais domínios de ligação adicionais à porção anticorpo de base para uso em um anticorpo multivalente da invenção pode ser derivado de uma sequência de dobradiça de IgG ou de IgA. A região conectora pode ser baseada em uma região de dobradiça de IgG1, uma região de dobradiça de IgG2, uma região de dobradiça de IgG3 ou uma região de dobradiça de IgG4.
[0173] Tipicamente, o tipo da região de dobradiça utilizado é igual ao tipo da região constante, por exemplo, CH1, do domínio Fab adicional à qual o ligante é conectado. Isto quer dizer que, se um ligante é baseado em uma sequência ou sequências de uma região de dobradiça de IgG1, a CH1 do domínio Fab adicional à qual ele é conectado é uma CH1 de uma IgG1.
[0174] Um ligante de um anticorpo pode ser baseado em uma região de dobradiça superior, intermediária ou inferior, ou em um subconjunto de uma tal região.
[0175] A região de dobradiça de IgG1 tem a sequência: EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 42).
[0176] A região de dobradiça superior é definida como: EPKSCDKTHT (SEQ ID NO: 43)
[0177] A região de dobradiça intermediária é definida como: CPPCP (SEQ ID NO: 44)
[0178] A região de dobradiça inferior é definida como: APELLGG (SEQ ID NO: 45)
[0179] Dessa forma, em um anticorpo da invenção, o ligante pode compreender uma ou mais destas sequências e/ou uma sequência baseada em uma ou mais destas sequências.
[0180] A região de dobradiça de IgG2 tem a sequência: ERKCCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 46).
[0181] A região de dobradiça superior é definida como: ERKCCVE (SEQ ID NO: 47)
[0182] A região de dobradiça intermediária é definida como: CPPCP (SEQ ID NO: 48)
[0183] A região de dobradiça inferior é definida como: APPVAG(SEQ ID NO: 49)
[0184] Dessa forma, em um anticorpo da invenção, o ligante pode compreender uma ou mais destas sequências e/ou uma sequência baseada em uma ou mais destas sequências.
[0185] A região de dobradiça de IgG3 tem a sequência:
ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPE PKSCDTPPPCPRCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 50)
[0186] A região de dobradiça superior é definida como: ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO: 51)
[0187] A região de dobradiça intermediária é definida como:
CPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCP RCP (SEQ ID NO: 52)
[0188] A região de dobradiça inferior é definida como: APEFLGG (SEQ ID NO: 53)
[0189] A região de dobradiça de IgG4 tem a sequência: ESKYGPPCPSCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 54).
[0190] A região de dobradiça superior é definida como: ESKYGPP (SEQ ID NO: 55)
[0191] A região de dobradiça intermediária é definida como: CPSCP (SEQ ID NO: 56)
[0192] A região de dobradiça inferior é definida como: APEFLGG (SEQ ID NO: 57).
[0193] A região intermediária com sequência consenso CXXC conecta ambas as cadeias pesadas de IgG no contexto de uma IgG de tipo selvagem e é rígida. Estas pontes de dissulfeto não são necessárias para a atual aplicação e, portanto, se um ligante compreende uma sequência da dobradiça intermediária, de preferência, um ou ambos resíduos Cys na sequência consenso CXXC são substituídos, por exemplo, por um resíduo Ser. Dessa forma, em uma modalidade preferencial CxxC pode ser SxxS.
[0194] Um ligante adequado para uso em um anticorpo multivalente da invenção pode ser um baseado em uma sequência de dobradiça intermediária, por exemplo uma sequência que compreende uma sequência de dobradiça intermediária, mas que não compreende uma sequência de dobradiça inferior e/ou uma sequência de dobradiça superior. Um ligante adequado para uso em um anticorpo multivalente da invenção pode ser um baseado em uma sequência de dobradiça superior, por exemplo uma sequência que compreende uma sequência de dobradiça superior, mas que não compreende uma sequência de dobradiça inferior e/ou uma sequência de dobradiça intermediária. Um ligante adequado para uso em um anticorpo multivalente da invenção pode ser um que não compreende uma sequência de dobradiça intermediária, por exemplo, uma sequência que compreende uma combinação de sequências de dobradiça inferior e superior.
[0195] Consequentemente, a invenção fornece um ligante compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma das SEQ ID NOs: 3 a 5, 7 a 11 ou 13 a 24.
[0196] Dessa forma, em um anticorpo da invenção, o ligante pode compreender uma ou mais destas sequências e/ou uma sequência baseada em uma ou mais destas sequências. A região de peptídeo pode consistir essencialmente em uma sequência de região intermediária ou ser baseada em tal sequência ou consistir essencialmente em uma sequência de região superior e uma sequência de região inferior ou ser baseada em tais sequências.
[0197] Um ligante adequado para uso em um anticorpo da invenção pode ser definido com referência a uma sequência compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer sequência ligante conforme apresentada na presente invenção na qual é realizada de 0 a 5 inserções, deleções, substituições ou adições de aminoácidos (ou uma combinação das mesmas). Em algumas modalidades, o ligante compreende uma sequência de aminoácidos compreendendo de 0 a 4, de preferência, de 0 a 3, preferencialmente de 0 a 2, de preferência, de 0 a 1 e, de preferência, 0 inserções, deleções, substituições ou adições de aminoácidos (ou uma combinação das mesma) com respeito a uma sequência ligante conforme apresentada na presente invenção.
[0198] Um ligante adequado pode ter de cerca de 7 a cerca de 29 aminoácidos de comprimento, por exemplo, de cerca de 10 a cerca de 20 aminoácidos de comprimento. Entretanto, um ligante adequado pode ser um ligante curto, por exemplo, de cerca de 7 a cerca de 10 aminoácidos de comprimento ou pode ser um ligante longo, por exemplo, de cerca de 20 a cerca de 29 aminoácidos de comprimento.
[0199] O ligante pode compreender uma região de dobradiça de Ig ou compreender uma sequência baseada em uma região de dobradiça de IgG conectada a uma região CH1 da mesma subclasse que a do ligante e pode compreender cisteínas para ligação covalente da cadeia leve comum.
[0200] Um ligante adequado para uso em um anticorpo da invenção pode ser baseado em uma região de dobradiça de IgG1, uma região de dobradiça de IgG2, uma região de dobradiça de IgG3 ou uma região de dobradiça de IgG4.
[0201] Se uma sequência (G4S)n for utilizada, de preferência, ela é utilizada em combinação com uma sequência de dobradiça de um isotipo diferente de IgG ou de uma subclasse diferente de IgG1 e inclui uma região CH1.
[0202] Em um anticorpo da invenção, o ligante pode ser rígido ou flexível, pode compreender uma sequência carregada, pode ser reto ou curvo.
[0203] Uma sequência rígida, para os propósitos desta invenção, é uma sequência tendo uma Predição de flexibilidade de Karplus e Schulz de cerca de 1,015 ou menos. Uma sequência parcialmente flexível é uma tendo uma Predição de flexibilidade de Karplus e Schulz de cerca de 1,015 a cerca de 1,04. Uma sequência flexível, para os propósitos desta invenção, é a sequência tendo uma Predição de flexibilidade de Karplus e Schulz de ao menos cerca de 1,015 (Karplus PA, Schulz GE. Prediction of Chain Flexibility in Proteins - A tool for the Selection of Peptide Antigens. Naturwissenschaften 1985; 72:212-3; http://tools.immuneepitope.org/bcell/). A predição de flexibilidade é calculada sobre janelas consecutivas de 7 resíduos ao longo da sequência (etapa de 1 resíduo) produzindo o índice de "flexibilidade" predito por janela. A flexibilidade total em relação à sequência ligante é dada como a média ao longo de toda a sequência.
[0204] Remoção ou substituição de resíduos Cys de uma região de dobradiça de IgG pode tornar mais flexível um ligante baseado naquela dobradiça incluindo mediante a substituição do resíduo Cys por uma serina (Ser). Alternativamente, um ligante pode ser um ligante rígido devido à presença de uma sequência formadora de hélice. Consequentemente, uma região de dobradiça intermediária, por exemplo, um motivo CPPCP conservado, pode ser substituída por uma sequência formadora de hélice, por exemplo, (EAAAK)2, o que resultará em uma hélice rígida curta no ligante. Portanto, em um anticorpo da invenção, o ligante pode compreender uma sequência formadora de hélice, por exemplo, que compreende a sequência de aminoácidos (EAAAK)2. O uso de tal sequência pode ajudar a adicionar rigidez.
[0205] Um ligante da invenção pode, de preferência, compreender uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 3 a 5, 7 a 11 ou 13 a 24 ou uma sequência de aminoácidos tendo ao menos cerca de 90% de identidade de sequência com qualquer uma das mesmas, de preferência, ao menos cerca de 95% de identidade de sequência com qualquer uma das mesmas, com mais preferência ao menos cerca de 97% de identidade de sequência com qualquer uma das mesmas, com mais preferência ao menos cerca de 98% de identidade de sequência com qualquer uma das mesmas, com mais preferência ao menos cerca de 99% de identidade de sequência com qualquer uma das mesmas.
[0206] Por exemplo, um ligante adequado para uso em um anticorpo multivalente da invenção pode ser definido com referência a uma sequência compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 1 a 24 na qual é realizada de 0 a 5 inserções, deleções, substituições ou adições de aminoácidos (ou uma combinação das mesmas). Em algumas modalidades, o ligante compreende uma sequência de aminoácidos tendo de 0 a 4, de preferência, de 0 a 3, de preferência, de 0 a 2, de preferência, de 0 a 1 e, de preferência, 0 inserções, deleções, substituições ou adições de aminoácidos (ou uma combinação das mesmas) com respeito a uma sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 3 a 5, 7 a 11 ou 13 a 24.
[0207] Um ligante adequado para uso em um anticorpo multivalente da invenção pode ser definido com referência a uma sequência compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 1 a 24 ou uma sequência de aminoácidos tendo ao menos cerca de 85% de identidade de sequência com qualquer uma das mesmas, como ao menos cerca de 90% de identidade de sequência com qualquer uma das mesmas, por exemplo, ao menos cerca de 95% de identidade de sequência com qualquer uma das mesmas, como ao menos cerca de 98% de identidade de sequência com qualquer uma das mesmas, por exemplo, ao menos cerca de 99% de identidade de sequência com qualquer uma das mesmas.
[0208] A Tabela 1 ilustra como uma sequência ligante pode ser conectada às regiões CH1 e VH2.
Tabela 1: A sequência sublinhada é a sequência ligante; as sequências flanqueadoras são a região CH1 do Fab adicional e a região VH2 de uma região VH da cadeia pesada seguinte # Nome Sequências ligantes (sublinhadas) contendo a região CH1 e sequência VH anteriores e posteriores à sequência ligante respectivamente. Na sequência de IgG1 de controle, a região CH2 está presente (sublinhada) 1 IgG1 H NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGEVQLVESGGGV VQPG (SEQ ID NO: 58) 2 IgG1 MH NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTSPPSPEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 59) 3 IgG1 UH NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 60) 4 IgG1 G4S NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPG
(SEQ ID NO: 61) 5 IgG1 R NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTEAAAKEAAAKAPELLGGEVQLVES GGGVVQPG (SEQ ID NO: 62) 6 IgG1 UL NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTAPELLGGEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 63) 7 IgG2A H NVDHKPSNTKVDKTVERKSSVESPPSPAPPVAGEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 64) 8 IgG2A MH NVDHKPSNTKVDKTVERKSSVESPPSPEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 65) 9 IgG2A UL NVDHKPSNTKVDKTVERKSSVEAPPVAGEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 66) 10 IgG2B H NVDHKPSNTKVDKTVERKCSVESPPSPAPPVAGEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 67) 11 IgG2B MH NVDHKPSNTKVDKTVERKCSVESPPSPEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 68) 12 IgG2B UL NVDHKPSNTKVDKTVERKCSVEAPPVAGEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 69) 13 IgG2A NVDHKPSNTKVDKTVGGGGSGGGGSAPPVAGEVQLVESGGGVVQPG G4SL (SEQ ID NO: 70) 14 IgG2A NVDHKPSNTKVDKTVGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID G4SS NO: 71) 15 IgG2A R NVDHKPSNTKVDKTVERKSSVEEAAAKEAAAKAPPVAGEVQLVESGGG VVQPG (SEQ ID NO: 72) 16 IgG2B R NVDHKPSNTKVDKTVERKCSVEEAAAKEAAAKAPPVAGEVQLVESGGG VVQPG (SEQ ID NO: 73) 17 IgG3 ULH NVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTAPEFLGGEVQLVESGGGVVQP G (SEQ ID NO: 74) 18 IgG3 UH NVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 75) 19 IgG3 R NVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTEAAAKEAAAKAPEFLGGEVQLV ESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 76) 20 IgG4 H NVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPSPSSPAPEFLGGEVQLVESGGGVVQP G (SEQ ID NO: 77) 21 IgG4 MH NVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPSPSSPEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 78) 22 IgG4 UL NVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPAPEFLGGEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 79) 23 IgG4 UH NVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 80) 24 IgG4 R NVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPEAAAKEAAAKAPEFLGGEVQLVESGG GVVQPG (SEQ ID NO: 81)
25 dobradiça NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD de IgG1 TLM (SEQ ID NO: 82) Nota-se que a sequência VH2, após o ligante (sublinhada acima), pode variar, dependendo da região variável específica utilizada. Em outras modalidades, a sequência após o ligante pode ser uma região variável de cadeia leve, incluindo uma cadeia leve comum.
Uso de ligantes para emparelhar regiões do domínio de ligação adicional
[0209] Os ligantes utilizados aqui podem conectar a porção anticorpo de base a ao menos um domínio de ligação adicional. Além disso, se o ao menos um domínio de ligação adicional é um domínio Fab ou é compreendido de emparelhamento de uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, o ligante pode emparelhar as cadeias pesada e leve via ligação covalente, tipicamente via uma ponte de dissulfeto. A ponte de dissulfeto pode se formar entre um resíduo de cisteína no ligante e uma região variável do(s) domínio(s) de ligação adicional(ais). Tal emparelhamento causado pelo ligante pode aplicar-se a um domínio de ligação adicional, compreendendo um domínio Fab que compreende uma cadeia leve comum e uma região variável de cadeia pesada correspondente ou que compreende uma cadeia pesada comum e uma região variável de cadeia leve rearranjada correspondente. Multivalência e multiespecificidade
[0210] Se os dois domínios de ligação do anticorpo base de uma proteína multivalente da invenção ligam-se a antígenos diferentes, os ditos primeiro e segundo antígenos podem ser duas moléculas ou porções diferentes que estão localizadas sobre uma célula ou sobre diferentes tipos de células. Os anticorpos que compreendem dois domínios de ligação que medeiam citotoxicidade pelo recrutamento e pela ativação de células imunes endógenas são uma classe emergente de terapêutica com anticorpo.
Isto pode ser realizado pela combinação de especificidades de ligação ao antígeno para células alvo (isto é, células tumorais) e células efetoras (isto é, células T, células NK e macrófagos) em uma molécula (consulte, por exemplo, WO2014/051433). Um anticorpo da invenção compreende ao menos três domínios de ligação.
A porção anticorpo de base tipicamente compreenderá dois domínios de ligação diferentes (embora os dois domínios de ligação possam ter a mesma sequência ou se ligarem ao mesmo epítopo). Um anticorpo multivalente compreendendo três ou mais domínios de ligação pode reconhecer um, dois, três ou mais antígenos associados a tumores, permitindo um reconhecimento específico de células prejudiciais mais que de células saudáveis.
Por exemplo, um domínio de ligação ou dois domínios de ligação do anticorpo multivalente podem ligar-se a um antígeno sobre uma célula aberrante (de tumor), enquanto que um segundo ou terceiro domínio de ligação do anticorpo multivalente pode ligar-se a um antígeno sobre uma célula efetora imune que pode causar extermínio direcionado da célula tumoral que expressa os um ou mais antígenos associados a tumor.
Alternativamente, dois domínios de ligação do anticorpo multivalente podem ligar-se especificamente a dois epítopos diferentes em um antígeno idêntico ou em antígenos diferentes expressos sobre células tumorais, enquanto as afinidades destes braços são atenuadas para mitigar a ligação às células que expressam apenas um antígeno ou onde apenas um domínio de ligação do anticorpo multivalente é engatado.
Ou três domínios de ligação do anticorpo multivalente da invenção podem ligar-se a três antígenos diferentes ou a antígenos idênticos, mas em diferentes epítopos de células efetoras imunes.
[0211] De modo similar, um anticorpo multivalente compreendendo três ou mais domínios de ligação pode se ligar a um alvo funcional como um ligante ou uma enzima, disparar uma resposta biológica ou bloquear a função do alvo, resultando em atividade celular inibitória ou agonística. Pelo menos um domínio de ligação de um anticorpo multivalente da invenção é conectado via um ligante a um domínio de ligação da porção anticorpo de base. Se o domínio de ligação da porção anticorpo de base é um domínio Fab, este pode assumir a forma, por exemplo, de VH-CH1-ligante-VH-CH1, sendo que o ligante conecta a cadeia pesada da porção anticorpo de base a ao menos um domínio de ligação adicional, de preferência, um domínio Fab.
[0212] Alternativamente, este pode assumir a forma, por exemplo, de VL-CL-ligante-VL-CL, sendo que o ligante conecta a cadeia leve da porção anticorpo de base a ao menos um domínio de ligação adicional, preferencialmente um domínio Fab.
[0213] Um domínio de ligação adicional, como um domínio Fab, pode ser conectado a cada um dos domínios de ligação da porção anticorpo de base, cada um via um ligante separado. Os dois ou mais ligantes que conectam os domínios de ligação adicionais à porção anticorpo de base ou aos domínios de ligação adicionais podem ser iguais ou diferentes. Adicionalmente, os ligantes podem permitir o emparelhamento de cadeias cognatas do domínio de ligação.
[0214] Se um anticorpo da presente invenção compreende mais de um ligante, aqueles ligantes podem ser iguais ou diferentes ou uma combinação dos mesmos. Um exemplo da última situação é aquela na qual um anticorpo multiespecífico compreende três ligantes, dois dos quais são iguais e um terceiro que é diferente (dos outros dois).
[0215] Adicionalmente um domínio de ligação conectado via um ligante a um domínio de ligação de uma porção anticorpo de base, pode por si mesmo ser ligado a um domínio de ligação conectado via um ligante aqui descrito, sendo que a porção anticorpo de base pode ser estendida em uma maneira modular pela conexão mediante um ligante a um domínio de ligação adicional, e conexão daquele domínio de ligação a um segundo domínio de ligação adicional mediante um ligante e assim por diante.
[0216] Nesta maneira, um anticorpo da invenção pode ser capaz de se ligar a três ou mais epítopos. Dessa forma, um anticorpo multiespecífico da invenção pode ser capaz de se ligar especificamente a três ou mais epítopos.
[0217] Um anticorpo da invenção pode ser capaz de se ligar a dois, três ou mais antígenos. Um anticorpo multiespecífico da invenção pode, dessa forma, ser capaz de se ligar especificamente a dois, três ou mais antígenos.
[0218] Um anticorpo da invenção pode compreender dois ou mais domínios de ligação, como dois ou mais domínios Fab, que são capazes de se ligarem a epítopos diferentes em um antígeno.
[0219] Consequentemente, um anticorpo da invenção compreende ao menos três domínios de ligação, como dois ou mais domínios Fab que são diferentes.
[0220] Um outro aspecto da invenção compreende um anticorpo multivalente compreendendo ao menos três domínios Fab e portanto é capaz de se ligar a três epítopos que são tipicamente todos diferentes entre si.
[0221] Um anticorpo da invenção pode ser multivalente. Um anticorpo da invenção pode também ser multiespecífico. Multivalente indica que o anticorpo tem ao menos três domínios de ligação e portanto tem ao menos três sítios de ligação ao antígeno. Multiespecífico indica que o anticorpo é capaz de se ligar a ao menos dois epítopos diferentes, por exemplo dois antígenos diferentes ou dois epítopos no mesmo antígeno. Triespecífico indica que o anticorpo é capaz de se ligar a três epítopos diferentes. Tetraespecífico indica que o anticorpo é capaz de se ligar a quatro epítopos diferentes e assim por diante.
[0222] Um anticorpo da invenção pode ligar-se a epítopos alvo que estão localizados na mesma molécula. Isto pode permitir a neutralização mais eficiente da função (biológica) da dita molécula alvo em comparação com uma situação na qual apenas um epítopo é reconhecido. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode simultaneamente se ligar a 2 ou 3 ou mais epítopos presentes sobre uma célula antigênica, por exemplo, receptores de fatores de crescimento ou moléculas solúveis críticas para células tumorais se proliferarem, deste modo bloqueando eficazmente várias vias de sinalização Independentes que resultam em proliferação descontrolada.
[0223] Qualquer combinação de ao menos dois anticorpos da invenção pode simultaneamente se ligar a 2, 3, 4 ou mais epítopos presentes em uma molécula alvo, como um receptor de fator de crescimento ou uma molécula solúvel.
[0224] A porção alvo pode ser uma molécula solúvel ou pode ser uma porção ligada à membrana ou pode ser uma porção presente sobre uma superfície celular que se internaliza mediante ligação.
[0225] Os epítopos alvo podem estar localizados em porções diferentes, por exemplo em duas (isto é, dois ou mais epítopos alvo em uma primeira porção e um ou mais epítopos alvo em uma segunda porção) ou três porções diferentes (isto é, ao menos um epítopo alvo em cada uma das três porções). Neste caso, cada uma das diferentes porções alvo pode ser quer uma porção solúvel uma porção ligada à membrana ou uma porção presente sobre uma superfície celular que se internaliza mediante ligação. Em uma modalidade, as diferentes porções alvo são porções solúveis. Alternativamente, ao menos uma porção alvo é uma porção solúvel, enquanto que ao menos uma porção alvo e é uma porção ligada à membrana. Em ainda outra alternativa, todas as porções alvo são porções ligadas à membrana. Em uma modalidade, as diferentes porções alvo são expressas na mesma célula, enquanto que em outras modalidades a diferentes porções alvo são expressas em células diferentes.
[0226] Como um exemplo não limitador, qualquer anticorpo da invenção ou qualquer combinação de um anticorpo da invenção e um anticorpo adicional podem ser adequados para bloquear simultaneamente múltiplos receptores ligados à membrana, neutralizar múltiplas moléculas solúveis como citocinas ou fatores de crescimento para células tumorais ou para neutralizar diferentes sorotipos virais ou cepas virais.
[0227] Em um anticorpo da invenção, ao menos um epítopo alvo pode estar localizado sobre uma célula tumoral. Alternativamente, ou adicionalmente, ao menos um epítopo alvo pode estar localizado sobre a superfície de uma célula efetora. Isto é por exemplo adequado para o recrutamento de células T ou células NK para extermínio de células tumorais. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser capaz de recrutar células efetoras imunes, de preferência, células efetoras imunes humanas, pela ligação especifica a uma molécula alvo localizada sobre células efetoras imunes. Em uma outra modalidade, a dita célula efetora imune é ativada mediante ligação do anticorpo da invenção à molécula alvo. O recrutamento de mecanismos efetores pode, por exemplo, abranger o redirecionamento de citotoxicidade imunomodulada pela administração de uma molécula do tipo Ig, produzida por um método de acordo com a invenção, que é capaz de se ligar a uma molécula de disparo citotóxica como o receptor de célula T ou um receptor de Fc-gama, ativando assim as vias efetoras imunes a jusante ou células efetoras imunes.
Engatadores de células imunes
[0228] Um multímero multivalente, como um anticorpo da invenção, pode ser um anticorpo engatador de célula efetora imune. Isto quer dizer que, um anticorpo multivalente da invenção pode ser um que compreenda ao menos um domínio de ligação que se liga especificamente a um antígeno sobre uma célula efetora imune, como uma célula T, e também compreenda ao menos um domínio de ligação que se liga especificamente a um antígeno sobre uma célula aberrante, como uma célula cancerosa ou tumoral.
[0229] Um multímero multivalente da invenção, como um anticorpo triespecífico, pode ser um que tem três domínios de ligação que juntam três células em um complexo engatador, incluindo uma célula tumoral, e duas células efetoras imunes.
[0230] Um multímero multivalente da invenção, como um anticorpo triespecífico, pode ainda ser um tendo três domínios de ligação direcionados a duas células e uma molécula solúvel.
[0231] Para as modalidades aqui apresentadas, o Fc pode ser um Fc de tipo selvagem, pode ser melhorado para ADCC ou ligação de Cq1 com base em meios conhecidos pelos versados na técnica, ou pode ser inativado para tal atividade com base em meios conhecidos pelos versados na técnica.
[0232] Os componentes de tais anticorpos multivalentes engatadores de célula imune podem estar mutuamente dispostos em uma variedade de configurações. Configurações exemplificadoras são representadas nas Figuras 1a a 1u. Em modalidades específicas, a presente invenção é direcionada a um anticorpo multivalente engatador de célula imune no qual um terceiro domínio de ligação é ligado no C- terminal da cadeia pesada de Fab ao N-terminal de um primeiro ou segundo domínio de ligação do anticorpo base.
[0233] Em uma modalidade, um anticorpo multivalente engatador de célula imune compreende três domínios de ligação, isto é, uma porção anticorpo de base e um domínio de ligação adicional, de modo que o dito anticorpo multivalente é triespecífico.
[0234] Um dos domínios de ligação da porção anticorpo de base pode se ligar a um antígeno sobre uma célula efetora imune. Alternativamente, o domínio de ligação adicional pode se ligar a um antígeno de uma célula efetora imune. Isto quer dizer que, o domínio de ligação para um antígeno sobre uma célula efetora imune pode estar na posição 1, 2 ou 3, sendo que estas posições correspondem aos VH1, VH2 e VH3 indicados na Figura 1a. Alternativamente, se uma cadeia pesada comum é utilizada, o domínio de ligação para um antígeno sobre uma célula efetora imune pode estar na posição 1, 2 ou 3, sendo que estas posições correspondem aos VL1, VL2 e VL3, por exemplo, conforme indicado na Figura 1c.
[0235] Em um anticorpo engatador de célula efetora imune da invenção, ao menos um dos domínios de ligação pode ligar-se especificamente a um antígeno sobre uma célula aberrante. Tipicamente, ao menos dois domínios de ligação ligam-se a um antígeno sobre uma célula aberrante, tipicamente ao menos dois domínios de ligação ligam-se a ao menos dois antígenos diferentes ou epítopos diferentes sobre uma célula aberrante. Em um anticorpo engatador de célula efetora imune da invenção, dois ou mais domínios de ligação podem ligar-se ao mesmo alvo, incluindo antígeno e epítopo, e outro domínio de ligação engata-se a uma célula efetora imune.
[0236] Em uma modalidade preferencial da invenção, um anticorpo multivalente da invenção se liga especificamente a um antígeno sobre uma célula efetora imune e também se liga especificamente a dois antígenos diferentes sobre uma célula aberrante, como uma célula tumoral.
[0237] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo multivalente engatador de célula T é capaz de ligação simultânea a um antígeno da célula alvo, particularmente a um antígeno da célula tumoral, e a um antígeno de superfície de uma célula T humana. Em uma modalidade, o anticorpo multivalente engatador de célula T é capaz de simultaneamente se ligar a um antígeno de célula alvo, particularmente a um antígeno de célula tumoral, e ao CD3 humano. Em uma modalidade, o anticorpo multivalente engatador de célula T é capaz de ligação cruzada a uma célula T e a uma célula alvo por ligação simultânea a um CD3 e antígeno da célula alvo. Em outra modalidade, a ligação simultânea resulta na lise da célula alvo, particularmente de uma célula tumoral. Em uma modalidade, a ligação simultânea resulta na ativação da célula T. Em outras modalidades, a ligação simultânea resulta em uma resposta celular de um linfócito T, particularmente de um linfócito T citotóxico, selecionado do grupo de: proliferação, diferenciação, secreção de citocinas, liberação de moléculas efetoras citotóxicas, atividade citotóxica, e expressão de marcadores de ativação. Em uma modalidade, a ligação do polipeptídeo engatador de célula T ao CD3 sem a ligação simultânea ao antígeno da célula alvo não resulta em ativação de células T, onde, por exemplo os domínios de ligação restantes não se ligam a um antígeno da célula tumoral.
[0238] Em uma modalidade, o anticorpo multivalente engatador de célula T é capaz de redirecionamento da atividade citotóxica de uma célula T para uma célula alvo. Em uma modalidade, o redirecionamento é independente da apresentação de antígeno peptídico mediada por MHC pela célula alvo e/ou da especificidade da célula T. Em uma modalidade, a célula T é uma célula T citotóxica. Em outra modalidade, a célula T é uma célula T CD4 + ou uma célula T CD8+. Em uma outra modalidade a célula T é uma célula T CD8 +.
[0239] O anticorpo multivalente engatador de célula T da invenção compreende ao menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação a um antígeno de superfície de uma célula T humana. Em uma modalidade, o domínio de ligação se liga ao CD3 (também chamado na presente invenção de um "domínio de ligação ao antígeno CD3").
[0240] O termo "CD3" (agrupamento de diferenciação 3) refere-se a um complexo de proteínas, que é composto de uma cadeia de CD3γ (SwissProt P09693), uma cadeia CD3δ (Swiss Prot P04234), cadeias CD3ε (SwissProt P07766), e um homodímero de cadeia zeta CD3 (SwissProt P20963). CD3ε é conhecido por vários nomes, alguns dos quais são: "Molécula CD3e, Epsílon (Complexo CD3-TCR)"; "Antígeno CD3e, polipeptídeo Epsílon (Complexo TiT3)"; Antígeno T3 de superfície de célula-
T/Leu-4 Cadeia Epsílon; T3E; Complexo do receptor de antígeno de célula T, subunidade Epsílon de T3; Antígeno CD3e; CD3-Epsílon 3; IMD18; TCRE. Ids para Gene CD3E são HGNC: 1674; Gene Entrez: 916; Ensembl: ENSG00000198851; OMIM: 186830 e UniProtKB: P07766. Estas cadeias associam-se ao receptor de célula T (TCR) e à cadeia ζ para formar um complexo TCR que pode, mediante sinalização mitogênica, gerar um sinal de ativação em linfócitos T. CD3 é expresso sobre células T e células T-NK. Onde é feita aqui referência ao CD3, a referência é para o CD3 humano, exceto se especificamente mencionado em contrário.
[0241] Em uma modalidade específica, o polipeptídeo engatador de célula T compreende não mais de um domínio de ligação capaz de ligação específica ao CD3. Em uma modalidade o polipeptídeo engatador de célula T fornece ligação monovalente ao CD3. Em uma modalidade, o polipeptídeo engatador de célula T compreende um membro de um superagrupamento de domínios de ligação ao CD3. Um 'superagrupamento' é aqui utilizado para se referir às regiões variáveis tendo alterações de aminoácidos que são toleradas, por exemplo, com respeito às regiões variáveis de cadeia pesada, incluindo, nas mesmas, uma VH ou VL e/ou CDR, da presente invenção, sem perder a especificidade de ligação ao antígeno específico. Mais especificamente, um ‘superagrupamento’ é um grupo de clones que compartilham o mesmo uso do gene V VH e que têm ao menos 70% de identidade de sequência na HCDR3 e o mesmo comprimento da HCDR3. Supõe-se que os clones em um superagrupamento se ligam ao mesmo antígeno potencialmente com afinidades diferentes e/ou localização diferente no epítopo.
[0242] O domínio de ligação ao CD3 pode variar em afinidade, epítopo e outras características. Domínios variáveis específicos que podem ligar-se a uma parte extracelular de CD3 são domínios variáveis que compreendem a sequência de aminoácidos da VH de MF8057, MF8058, MF8078 e regiões variáveis deste superagrupamento, MF8397 e regiões variáveis deste superagrupamento, MF8508 e regiões variáveis deste superagrupamento, e MF9249 e MF9267 e regiões variáveis deste superagrupamento.
[0243] O domínio de ligação ao antígeno CD3 compreende ao menos uma região determinante de complementaridade (CDR) de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em VH de MF8057, MF8058, MF8078 e regiões variáveis deste superagrupamento, MF8397 e regiões variáveis deste superagrupamento, MF8508 e regiões variáveis deste superagrupamento, e MF9249 e MF9267 e regiões variáveis deste superagrupamento (SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:134 SEQ ID NO:143 SEQ ID NO:152SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:144 e/ou SEQ ID NO:153) e ao menos uma CDR de cadeia leve do grupo de SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 256.
[0244] Em uma modalidade, o domínio de ligação ao antígeno CD3 compreende a CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 97, SEQ ID
NO:106, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:133, ou SEQ ID NO:142, a CDR2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:134 SEQ ID NO:143 ou SEQ ID NO:152, a CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:144 ou SEQ ID NO:153, a CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 254, a CDR2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 255, e a CDR3 de cadeia leve de SEQ ID NO: 256.
[0245] Em uma modalidade, o domínio de ligação ao antígeno CD3 compreende uma sequência de região variável de cadeia pesada que é ao menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo da: SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:145 e SEQ ID NO:154, e uma sequência de região variável de cadeia leve que é ao menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo da: SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 40.
[0246] Em uma modalidade, o domínio de ligação ao antígeno CD3 compreende a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:145 ou SEQ ID NO:154 e a região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 40.
[0247] As posições dos domínios de ligação no anticorpo multivalente podem ser definidas. Quando os domínios de ligação ou variáveis do anticorpo base são nomeados como domínios de ligação 1 e 2, os um ou mais domínios de ligação adicionais podem ser nomeados como domínios de ligação 3, 4 etc. Um domínio de ligação é também nomeado como BD ("Binding Domain"). BD3 pode ser ligado ao BD1 ou ao BD2. Quando BD3 é ligado a um de BD1 ou BD2, BD4, quando presente, é ligado ao outro de BD1 e BD2.
[0248] O anticorpo multivalente engatador de célula T da invenção compreende ao menos dois domínios de ligação ao antígeno capazes de ligação a um antígeno de uma célula alvo (também chamado na presente invenção de um "domínio de ligação ao antígeno da célula alvo" ou "segundo domínio de ligação ao antígeno" ou "terceiro domínio de ligação ao antígeno"). Em certas modalidades, o anticorpo multivalente engatador de célula T compreende dois domínios de ligação ao antígeno capazes de ligação a um antígeno de célula alvo. Em uma modalidade, cada um destes domínios de ligação ao antígeno liga-se especificamente ao mesmo determinante antigênico. Em outra modalidade, os domínios de ligação ao antígeno de célula alvo são idênticos. Em uma modalidade, o polipeptídeo engatador de célula T compreende mais de dois domínios de ligação ao antígeno de célula alvo capazes de ligação a um antígeno de célula alvo.
[0249] Em uma modalidade, o anticorpo multivalente possui um BD1 que compreende um domínio de ligação ao CD3, um BD2 que é um domínio de ligação que se liga a um primeiro antígeno da célula alvo, adicionalmente chamado de TA1 e um BD3 que é um domínio de ligação que se liga a um segundo antígeno da célula alvo,
adicionalmente chamado de TA2. Nesta modalidade, BD3 pode ser ligado ao BD1 ou ao BD2. Em uma modalidade, o BD3 que se liga ao TA2 é ligado ao BD1 que se liga ao CD3. Em outra modalidade, o BD3 que se liga ao TA2 é ligado ao BD2 que se liga ao TA1.
[0250] Em uma modalidade, o anticorpo multivalente compreende um BD1 que se liga ao TA1, um BD2 que se liga ao TA2, e um BD3 que se liga ao CD3. Nesta modalidade, BD3 pode ser ligado ao BD1 ou ao BD2. Em uma modalidade, o BD3 que se liga ao CD3 é ligado ao BD1 que se liga ao TA1. Em outra modalidade, o BD3 que se liga ao CD3 é ligado ao BD2 que se liga ao TA2.
[0251] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo multivalente em que o anticorpo base compreende os domínios de ligação 1 e 2 (BD1 e BD2) e em que o domínio de ligação adicional 3 (BD3) é ligado ao domínio de ligação 1 (BD1) e em que um domínio de ligação adicional opcional 4 (BD4) é ligado ao domínio de ligação 2 (BD2). Em uma modalidade, o domínio de ligação 1 é um domínio de ligação ao CD3 e os domínios de ligação 2 e 3 ligam-se a diferentes antígenos da célula alvo. Em outra modalidade, o domínio de ligação 2 é um domínio de ligação ao CD3 e os domínios de ligação 1 e 3 ligam-se a diferentes antígenos da célula alvo. Em uma outra modalidade, o domínio de ligação 3 é um domínio de ligação ao CD3 e os domínios de ligação 1 e 2 ligam- se a diferentes antígenos das células alvo.
[0252] Em uma modalidade preferencial o anticorpo multivalente compreende um domínio de ligação 4 que se liga ainda um outro diferente antígeno da célula alvo.
[0253] A invenção fornece adicionalmente um anticorpo multivalente, conforme descrito na presente invenção, sendo que o anticorpo base compreende os domínios de ligação 1 e 2 e sendo que o domínio de ligação adicional 3 é ligado ao domínio de ligação 1 e sendo que um domínio de ligação adicional opcional 4 é ligado ao domínio de ligação 2. Em uma modalidade, o domínio de ligação 1 é um domínio de ligação ao CD3 e os domínios de ligação 2 e 3 ligam-se a diferentes antígenos da célula alvo. Em outra modalidade, o domínio de ligação 2 é um domínio de ligação ao CD3 e os domínios de ligação 1 e 3 ligam-se a diferentes antígenos da célula alvo. Em uma outra modalidade, o domínio de ligação 3 é um domínio de ligação ao CD3 e os domínios de ligação 1 e 2 ligam-se a diferentes antígenos das células alvo.
[0254] Quando compreende um domínio de ligação 4, o domínio liga- se, de preferência, ainda a um outro diferente antígeno da célula alvo.
[0255] Em uma modalidade, um primeiro do dito domínio de ligação ao antígeno da célula alvo liga-se a PD-L1, EGFR, CD137, CLEC12A, fibrinogênio, ou tiroglobulina. Em uma modalidade, um primeiro e um segundo dos ditos domínios de ligação ao antígeno de célula alvo ligam-se aos antígenos selecionados dentre PD-L1, EGFR, CD137, CLEC12A, fibrinogênio, e tiroglobulina. Os primeiro e segundo domínios de ligação ao antígeno da célula alvo ligam-se, de preferência, a antígenos diferentes.
[0256] Um domínio de ligação ao CD3 compreende, de preferência, uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos das CDR1, CDR2 e CDR3 de MF8057, ou de MF8058,
ou de MF8078, ou de MF8397, ou de MF8508, ou de MF9249 ou de MF9267. O domínio de ligação ao CD3 compreende, de preferência, uma região variável de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da VH de MF8057, de MF8058, de MF8078, de MF8397, de MF8508, de MF9249 ou de MF9267 com 0 a 10, de preferência, 0 a 5 inserções, deleções, substituições, adições de aminoácidos ou uma combinação das mesmas em uma ou mais posições diferentes das CDRs.
[0257] Um domínio de ligação ao antígeno da célula alvo pode ser um domínio de ligação a PD-L1. Se presente, o domínio de ligação a PD-L1 compreende, de preferência, uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos das CDR1, CDR2 e CDR3 de MF5377, ou de MF5444 ou de MF5380. O domínio de ligação a PD-L1 compreende, de preferência, uma região variável de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da VH de MF5377, de MF5444 ou de MF5380 com 0 a 10, de preferência, 0 a 5 inserções, deleções, substituições, adições de aminoácidos ou uma combinação das mesmas em uma ou mais posições diferentes das CDRs.
[0258] O domínio de ligação ao antígeno da célula alvo pode ser um domínio de ligação ao EGFR. Se presente, o domínio de ligação ao EGFR compreende, de preferência, uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos das CDR1, CDR2 e CDR3 de MF8233, ou de MF9891, ou de MF9886, ou de MF9873, ou de MF9988. O domínio de ligação ao EGFR compreende, de preferência, uma região variável de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da VH de MF8233,
de MF9891, de MF9886, de MF9873 ou de MF9988 com 0 a 10, de preferência, 0 a 5 inserções, deleções, substituições, adições de aminoácidos ou uma combinação das mesmas em uma ou mais posições diferentes das CDRs.
[0259] O domínio de ligação ao antígeno da célula alvo pode ser um domínio de ligação ao CLEC12A. Se presente, o domínio de ligação ao CLEC12A compreende, de preferência, uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos das CDR1, CDR2 e CDR3 de MF4327. O domínio de ligação ao CLEC12A compreende, de preferência, uma região variável de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da VH de MF4327 com 0 a 10, de preferência, 0 a 5 inserções, deleções, substituições, adições de aminoácidos ou uma combinação das mesmas em uma ou mais posições diferentes das CDRs.
[0260] Em uma modalidade o anticorpo multivalente compreende um domínio de ligação ao CD3, um domínio de ligação ao EGFR e um domínio de ligação a PD-L1.
[0261] Os domínios de ligação com as regiões variáveis de cadeia pesada indicadas compreendem uma região variável de cadeia leve. A região variável de cadeia leve compreende, de preferência, uma região CDR1, CDR2, e CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos CDR1 - QSISSY, CDR2 – AAS, CDR3 – QQSYSTP, isto é, as CDRs de IGKV1-39 (de acordo com IMGT). As variações, inserções, deleções, substituições, adições de aminoácidos ou combinação das mesmas estão, de preferência, não na região CDR3 da região variável de cadeia leve, de preferência, não na região CDR1 ou CDR2 da região variável de cadeia leve. Em uma modalidade preferencial, a região variável de cadeia leve não compreende uma deleção, adição ou inserção com respeito à sequência indicada. Nesta modalidade, a região variável de cadeia leve pode ter 0 a 5 substituições de aminoácidos com respeito à sequência de aminoácidos indicada. Uma substituição de aminoácido é, de preferência, uma substituição de aminoácido conservativa. As CDR1, CDR2 e CDR3 de uma cadeia leve de um anticorpo da invenção compreendem, de preferência, respectivamente a sequência de aminoácidos CDR1 - QSISSY, CDR2 – AAS, CDR3 – QQSYSTP, isto é, as CDRs de IGKV1-39 (de acordo com IMGT), conforme descrito em outro local na presente invenção. Todas as cadeias leves dos domínios de ligação com as regiões variáveis de cadeia pesada indicadas compreendem, de preferência, a mesma cadeia leve. De preferência, uma cadeia leve comum conforme definida em outro local na presente invenção.
[0262] As inserções, deleções, substituições, adições de aminoácidos ou combinação das mesmas estão, de preferência, não na região CDR3 da região variável de cadeia pesada, preferencialmente, não na região CDR1 e/ou na região CDR2 da região variável de cadeia pesada. Em uma modalidade preferencial, a região variável de cadeia pesada não compreende uma deleção, adição ou inserção com respeito à sequência indicada. Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada pode ter de 0 a 10, de preferência, de 0 a 5 substituições de aminoácidos com respeito à sequência de aminoácidos indicada. Em uma modalidade preferencial, a região variável de cadeia pesada compreende de 0 a 9, 0 a 8, 0 a 7, 0 a 6, 0 a 5, 0 a 4, de preferência, 0 a 3, de preferência, 0 a 2, de preferência. 0 a 1 e, de preferência, 0 inserções, deleções, substituições, adições de aminoácidos com respeito à sequência de aminoácidos indicada, ou uma combinação das mesmas em posições diferentes das CDRs. A combinação de uma inserção, adição, deleção ou substituição é uma combinação conforme reivindicada se as sequências alinhadas não diferem em mais que 10, de preferência, em não mais que 5 posições. Uma lacuna em uma das sequências alinhadas representa tantos aminoácidos quanto aminoácidos faltantes na outra sequência. Uma substituição de aminoácidos, se houver, é, de preferência, uma substituição de aminoácido conservativa.
[0263] Em uma modalidade, o domínio de ligação ao antígeno da célula alvo é uma molécula de Fab. Em uma modalidade, o domínio de ligação ao antígeno da célula alvo é uma molécula de Fab que se liga a um determinante antigênico específico e é capaz de direcionar o anticorpo multivalente engatador de célula T para um sítio alvo, por exemplo, para um tipo específico de célula tumoral que possui o determinante antigênico.
[0264] Em certas modalidades, a ligação ao antígeno da célula alvo liga-se especificamente ao Ligante de Proteína de Morte Celular Programada 1 (PD-L1), de preferência, ao PD-L1 humano (SEQ ID NO: 257).
[0265] PD-L1 é uma proteína transmembrana tipo 1 que desempenha uma função na supressão de uma resposta imune durante eventos específicos como gravidez, aloenxertos de tecido, doença autoimune e outros estados doentios como hepatite. A ligação de PD-L1 a PD-1 ou B7.1 (CD80) transmite um sinal inibitório que reduz a proliferação das células T que expressam PD-1. Acredita-se que PD-1 é capaz de controlar o acúmulo de células T específicas de antígenos estranhos mediante apoptose. PD-L1 é expresso por uma variedade de células de câncer e a expressão dos mesmos é vista como ao menos em parte responsável por um amortecimento de uma resposta imune contra as células cancerosas. DP-L1 é um membro da família B7 de proteínas e é conhecido sob uma variedade de outros nomes como molécula CD274; Antígeno CD274; Homólogo 1 de B7; Ligante 1 de PDCD1; PDCD1LG1; PDCD1L1; B7H1; PDL1; ligante 1 de morte celular programada 1; ligante 1 de morte programada; B7-H1; e B7-H. Ids externos de CD274 são HGNC: 17635; Gene Entrez: 29126; Ensembl: ENSG00000120217; OMIM: 605402; UniProtKB: Q9NZQ7.
[0266] O domínio de ligação a PD L1 pode variar em afinidade, epítopo e outras características. Os domínios variáveis específicos que podem se ligar a uma parte extracelular de PD-L1 são domínios variáveis que compreendem a sequência de aminoácidos da VH de MF5377, MF5444 ou MF5380.
[0267] O domínio de ligação ao antígeno PD-L1 compreende ao menos uma CDR de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em VH da SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO:169, SEQ ID NO:178, SEQ ID
NO: 161, SEQ ID NO:170, SEQ ID NO:179 SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO:171 e SEQ ID NO:180 e ao menos uma CDR de cadeia leve selecionada do grupo da SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 255, e SEQ ID NO: 256.
[0268] Em uma modalidade, o domínio de ligação ao antígeno PD-L1 compreende a CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO:169 ou SEQ ID NO:178, a CDR2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO:170 ou SEQ ID NO:179, a CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO:171 ou SEQ ID NO:180, a CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 254, a CDR2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 255, e a CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 256.
[0269] Em uma modalidade, o domínio de ligação ao antígeno PD- L1 compreende uma sequência de região variável de cadeia pesada que é ao menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo da: SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO:172 e SEQ ID NO:181, e uma sequência de região variável de cadeia leve que é ao menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo da: SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 40.
[0270] Em uma modalidade, o domínio de ligação ao antígeno PD- L1 compreende a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO:172 ou SEQ ID NO:181 e a região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO:40.
[0271] Em certas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno PD-L1 compreende as regiões variáveis de cadeias pesada e leve dos anticorpos anti-PD-L1 que compreendem as sequências de aminoácidos reveladas para MPDL3280A, RG7446, consulte US 2010/0203056 A1; MEDI-4736, consulte WO 2011/066389; MSB- 0010718C, consulte WO 2013/079174; STI-014 consulte WO2013/181634; CX 072, consulte WO2016/149201; KN035, consulte Zhang et al., Cell Discov. 7:3 (March 2017); LY3300054, consulte, por exemplo, WO 2017/034916; e CK-301, consulte Gorelik et al., AACR:Abstract 4606 (Apr 2016)), e 12A4 ou MDX-1105, consulte, por exemplo, WO 2013/173223.
[0272] Em certas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno PD- L1 liga-se ao mesmo epítopo que as regiões variáveis de cadeia pesada e leve dos anticorpos anti-PD-L1, MPDL3280A, RG7446, consulte US 2010/0203056 A1; MEDI-4736, consulte WO 2011/066389; MSB- 0010718C, consulte WO 2013/079174; STI-1014, consulte WO2013/181634; CX-072, consulte WO2016/149201; KN035, consulte Zhang et al., Cell Discov. 7:3 (March 2017); LY3300054, consulte, por exemplo, WO 2017/034916; and CK-301, consulte Gorelik et al., AACR:Abstract 4606 (Apr 2016)), e 12A4 ou MDX-1105, consulte, por exemplo, WO 2013/173223.
[0273] Em certas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno PD- L1 compete pela ligação a PD-L1 com as regiões variáveis de cadeias pesada e leve dos anticorpos anti-PD-L1, MPDL3280A, RG7446, consulte US 2010/0203056 A1; MEDI-4736, consulte WO 2011/066389; MSB-
0010718C, consulte WO 2013/079174; STI-1014, consulte WO2013/181634; CX-072, consulte WO2016/149201; KN035, consulte Zhang et al., Cell Discov. 7:3 (March 2017); LY3300054, consulte, por exemplo, WO 2017/034916; e CK-301, consulte Gorelik et al., AACR:Abstract 4606 (Apr 2016)), e 12A4 ou MDX-1105, consulte, por exemplo, WO 2013/173223.
[0274] Em certas modalidades, a ligação ao antígeno da célula alvo liga-se especificamente ao receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) humano (SEQ ID NO: 258). ‘ErbB1’ ou ‘EGFR’ é um membro da família de quatro tirosina-quinases receptoras (RTKs), chamadas de Her- ou cErbB-1, -2, -3 e -4. EGFR tem um domínio extracelular (ECD, "Extracellular Domain") que é composto de quatro subdomínios, dois dos quais estão envolvidos na ligação ao ligante e um dos quais está envolvido em homodimerização e heterodimerização. Os números de referência usados nesta seção referem-se à numeração das referências na lista intitulada "referências citadas no relatório descritivo". O EGFR integra os sinais extracelulares de uma variedade de ligantes para produzir diferentes respostas intracelulares. A principal via de transdução de sinal ativada por EGFR é composta pela cascata de sinalização mitogênica da proteína quinase ativada por mitógeno Ras (MAPK). Ativação desta via é iniciada pelo recrutamento de Grb2 que se liga ao EGFR fosforilado na tirosina. Isso leva à ativação do Ras através do fator de troca de nucleotídeo Ras-guanina ligado ao Grb2 Son of Sevenless (SOS). Além disso, a via de transdução de sinal da PI3-quinase-Akt também é ativada pelo EGFR, embora esta ativação seja muito mais forte no caso de haver coexpressão de Her3. O EGFR está envolvido em várias malignidades epiteliais humanas, notavelmente em cânceres de mama, de bexiga, de pulmão de câncer de pulmão de células não pequenas, de cólon, de ovário, de cabeça e pescoço e de cérebro.
Foram encontradas mutações de ativação no gene, bem como a superexpressão do receptor e de seus ligantes, dando origem a loops de ativação autócrinos.
Este RTK, portanto, foi amplamente usado como alvo para a terapia de câncer.
Ambos os inibidores de molécula pequena direcionados para o RTK e os anticorpos monoclonais (mAbs) direcionados aos domínios de ligação de ligante extracelular foram desenvolvidos e demonstraram, até o momento, vários sucessos clínicos, embora principalmente para um grupo selecionado de pacientes.
Um número de acesso à base de dados para a proteína de EGFR humano e o gene que a codifica é (GenBank NM_005228.3). Esse número de acesso é primariamente dado para fornecer um método adicional de identificação da proteína EGFR como um alvo, a sequência real da proteína EGFR ligada por um anticorpo pode variar, por exemplo, devido a uma mutação no gene de codificação, como aquelas que ocorrem em alguns cânceres ou similares.
Onde é feita referência na presente invenção ao EGFR, a referência refere-se ao EGFR humano, exceto onde especificado em contrário.
O sítio de ligação ao antígeno que se liga ao EGFR se liga ao EGFR e a uma variedade de variantes do mesmo, como aqueles expressos em alguns tumores positivos para o EGFR.
[0275] O domínio de ligação ao EGFR pode variar em afinidade, epítopo e outras características. Os domínios variáveis específicos que podem se ligar a uma parte extracelular de EGFR são domínios variáveis que compreendem a sequência de aminoácidos da VH de MF8233, MF9891, MF9886, MF9873, MF9988.
[0276] O domínio de ligação ao antígeno EGFR compreende ao menos uma CDR de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO:196, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:223, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:206, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:224, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:207, SEQ ID NO:216 e SEQ ID NO:225 e ao menos uma CDR de cadeia leve selecionada do grupo da SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 256.
[0277] Em uma modalidade, o domínio de ligação ao antígeno EGFR compreende a CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO:196, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:214 ou SEQ ID NO:223, a CDR2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:206, SEQ ID NO:215 ou SEQ ID NO:224, a CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:207, SEQ ID NO:216 ou SEQ ID NO:225, a CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 254, a CDR2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 255, a CDR3 de cadeia leve de SEQ ID NO: 256.
[0278] Em uma modalidade, o domínio de ligação ao antígeno EGFR compreende uma região variável de cadeia pesada que é ao menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo da: SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO:199,
SEQ ID NO:208, SEQ ID NO:217 e SEQ ID NO:226, e uma sequência de região variável de cadeia leve que é ao menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo da: SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 40.
[0279] Em uma modalidade, o domínio de ligação ao antígeno EGFR compreende a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO:199, SEQ ID NO:208, SEQ ID NO:217 ou SEQ ID NO:226 e a região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 40.
[0280] Em certas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno EGFR compreende as regiões variáveis de cadeias pesada e leve dos anticorpos anti-EGFR cetuximabe (C225, Erbitux®, Lilly) ou panitumumabe (Vectibix, Amgen).
[0281] Em certas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno EGFR liga-se ao mesmo epítopo que as regiões variáveis de cadeias pesada e leve dos anticorpos anti-EGFR cetuximabe (C225, Erbitux®, Lilly) ou panitumumabe (Vectibix, Amgen).
[0282] Em certas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno EGFR compete pela ligação ao EGFR com as regiões variáveis de cadeias pesada e leve dos anticorpos anti-EGFR cetuximabe (C225, Erbitux®, Lilly) ou panitumumabe (Vectibix, Amgen). Região variável comum
[0283] O anticorpo multivalente da invenção, de preferência, usa uma cadeia comum em cada um dos três ou mais domínios de ligação. Conforme descrito, a porção anticorpo de base do anticorpo multivalente da invenção tem, de preferência, uma primeira combinação de região variável de cadeia pesada/região variável de cadeia leve (VH/VL) que se liga a um antígeno e um segunda combinação de VH/VL que se liga a um segundo antígeno. Cada domínio de ligação adicional conectado à porção anticorpo de base pode compreender também uma combinação VH/VL adicional que se liga a um outro epítopo em um antígeno.
[0284] Uma porção anticorpo de base da invenção, de preferência, compreende duas cadeias pesadas (uma ou ambas compreendendo um ou mais domínios CH1 e VH adicionais) e uma cadeia leve que emparelha com cada domínio CH1 e VH. De preferência, as duas cadeias pesadas têm domínios de heterodimerização compatíveis, e de preferência a cadeia leve é uma cadeia leve comum. Alternativamente, a porção anticorpo de base do anticorpo multivalente da invenção compreende duas cadeias leves (uma ou ambas compreendendo um ou mais domínios CL e VL adicionais) e uma região variável de cadeia pesada que emparelha com cada domínio CL e VL, e a região variável de cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada comum.
[0285] Se a modalidade da invenção inclui um anticorpo multivalente compreendendo uma cadeia leve comum, se a dita cadeia leve é expressa em células hospedeiras que incluem DNA que codifica duas ou mais regiões variáveis de cadeia pesada, a dita cadeia leve é capaz de emparelhamento com cada uma das cadeias pesadas (ou regiões CH1-VH1) disponíveis, formando, assim, ao menos três domínios funcionais de ligação ao antígeno.
[0286] Um domínio funcional de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a um epítopo em um antígeno. De preferência, uma cadeia leve comum utilizada em um anticorpo multivalente da invenção é capaz de emparelhamento com todas as cadeias pesadas (ou regiões CH1-VH1) produzidas com um método de acordo com a invenção, formando, assim, domínios funcionais de ligação ao antígeno, de modo que o pareamento incorreto de cadeias pesadas e leves não correlacionadas seja evitado ou produzido em uma razão significativamente mais baixa que o anticorpo multivalente.
[0287] É um aspecto preferencial da presente invenção que um anticorpo multivalente da invenção tenha uma cadeia leve comum (região variável) que possa combinar com um conjunto de regiões variáveis de cadeia pesada para formar um anticorpo com domínios funcionais de ligação ao antígeno (WO2004/009618, WO2009/157771).
[0288] Uma cadeia leve comum (região variável) para uso no anticorpo multivalente da invenção é, de preferência, uma cadeia leve humana (região variável). Uma cadeia leve comum (região variável) tem, de preferência, uma sequência de linhagem germinativa. Uma sequência de linhagem germinativa preferencial é uma região variável de cadeia leve que é frequentemente usada no repertório humano e tem boa estabilidade termodinâmica, rendimento e solubilidade. Uma cadeia leve da linhagem germinativa preferencial é O12. Uma cadeia leve comum é, de preferência, a cadeia leve kappa humana rearranjada da linhagem germinativa IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 (Figura 11A; SEQ ID NO: 35). A região variável de cadeia leve comum é, de preferência, a região variável da cadeia leve kappa humana rearranjada da linhagem germinativa IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 (Figura 11A; SEQ ID NO: 35). Uma cadeia leve comum compreende, de preferência, uma região variável de cadeia leve conforme mostrada na Figura 11B ou 8D (SEQ ID NOs: 37 ou 40, respectivamente) com 0 a 5 inserções, deleções, substituições, adições de aminoácidos ou uma combinação das mesmas. A cadeia leve comum de preferência compreende adicionalmente uma região constante da cadeia leve, de preferência uma região constante da cadeia leve kappa. Um ácido nucleico que codifica a cadeia leve comum pode ser otimizado por códon para o sistema celular usado para expressar a proteína de cadeia leve comum. O ácido nucleico que codifica pode se desviar de uma sequência de ácido nucleico de linha germinativa.
[0289] A cadeia leve comum (região variável) para uso nos anticorpos multivalentes da invenção pode ser uma cadeia leve lambda e esta é, portanto, também fornecida no contexto da invenção, entretanto uma cadeia leve kappa é preferencial. A cadeia leve comum da invenção pode compreender uma região constante de uma cadeia leve kappa ou de uma cadeia leve lambda. É, de preferência, uma região constante de um cadeia leve kappa, de preferência, sendo que a dita cadeia leve comum é uma cadeia leve da linhagem germinativa, de preferência, uma cadeia leve kappa humana rearranjada da linhagem germinativa, compreendendo o segmento gênico IgVKI-39, por exemplo, a cadeia leve kappa humana rearranjada da linhagem germinativa IgVKl-39*01/IGJKl*01 (Figura 11). Os termos cadeia leve kappa humana rearranjada de linhagem germinativa IgVκ1-39*01/IGJκ1*01, IGKV1-39/IGKJ1, cadeia leve huVκ1-39 ou, abreviadamente, huVκ1-39, ou simplesmente 1-39, são usados de intercambiavelmente em todo o pedido. Os versados na técnica reconhecerão que "comum" também se refere aos equivalentes funcionais da cadeia leve cuja sequência de aminoácidos não é idêntica. Existem muitas variantes da dita cadeia leve em que mutações (deleções, substituições, adições) estão presentes que não influenciam substancialmente a formação de regiões de ligação funcional.
[0290] IgVκ1-39 é uma forma abreviada de gene 1-39 da imunoglobulina variável kappa. O gene é também conhecido como imunoglobulina kappa variável 1-39; IGKV139; IGKV1-39; O12a ou O12. IDs externos do gene são HGNC: 5740; Gene Entrez: 28930; Ensembl: ENSG00000242371. Uma sequência de aminoácidos preferencial para IgVκ1-39 é apresentada na Figura 11. Essa figura mostra a sequência da região V. A região V pode ser combinada com uma de cinco regiões J. A Figura 11 descreve duas sequências preferenciais para IgVκ1-39 em combinação com uma região J. As sequências juntadas são indicadas como IGKV1-39/jk1 e IGKV1-39/jk5; nomes alternativos são IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 ou IgVκ1-39*01/IGJκ5*01 (nomenclatura de acordo com o banco de dados IMGT www@imgt.org).
[0291] Uma região variável de cadeia leve comum é preferencialmente ligada a uma região constante de cadeia leve kappa. Em uma modalidade preferencial, a região variável de cadeia leve utilizada no anticorpo multivalente da invenção compreende a cadeia leve kappa IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 ou IgVκ1-39*01/IGJκ5*01. Em uma modalidade preferencial, a cadeia leve comum no anticorpo multivalente é IgVκ1-39*01/IGJκ1*01.
[0292] Uma célula que produz uma cadeia leve comum pode produzir, por exemplo, uma cadeia leve kappa humana rearranjada de linhagem germinativa IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 e uma cadeia leve compreende a região variável da cadeia leve mencionada fusionada a uma região constante lambda. Onde é aqui feita referência a uma sequência de linhagem germinativa, é preferencial que a região variável seja uma sequência de linhagem germinativa.
[0293] Uma cadeia leve comum preferencial para uso em um anticorpo multivalente da invenção é uma que compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 29.
[0294] A cadeia comum para uso nos anticorpos multivalentes da invenção também pode ser uma cadeia pesada e esta também é, portanto, fornecida no contexto da invenção. As cadeias pesadas comuns têm sido utilizadas na técnica para produzir anticorpos biespecíficos, e podem ser aqui utilizadas na produção de um anticorpo multivalente compreendendo três ou mais domínios de ligação, dois ou mais dos ditos domínios de ligação compreendem uma cadeia pesada comum conhecida na técnica. Por exemplo, o uso de bibliotecas de anticorpos em que o domínio variável de cadeia pesada é o mesmo para todos os membros da biblioteca e dessa forma a diversidade é baseada no domínio variável de cadeia leve. Estas bibliotecas são descritas, por exemplo, em PCT/US2010/035619, e PCT/US2010/057780, cada um dos quais é aqui incorporado em sua totalidade a título de referência. Estas e outras técnicas para gerar os domínios de ligação tendo cadeias pesadas comuns podem ser geradas pelo versado na técnica, e podem ser utilizadas na presente invenção para produzir anticorpos multivalentes tendo novos formatos revelados na presente invenção. Produção de um anticorpo multivalente
[0295] Um anticorpo multivalente da invenção pode ser produzido por cotransfecção de células individuais com um ou mais construtos genéticos que juntos codificam as três ou mais proteínas que formam um multímero compreendendo o anticorpo multivalente como aqueles descritos acima, incluindo nas Figuras 1a-u. Por exemplo, uma célula hospedeira pode ser cotransfectada com ácido nucleico que codifica três ou mais regiões variáveis de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve comum para produzir um anticorpo multivalente. Alternativamente, um anticorpo multivalente da invenção pode ser produzido por cotransfecção de células individuais com um ou mais construtos genéticos que juntos codificam as três ou mais regiões variáveis de cadeia leve e uma cadeia pesada comum.
[0296] Vários métodos têm sido publicados para favorecer a produção de anticorpos que são heterodímeros. Na presente invenção, é preferencial que a célula favoreça a produção dos heterodímeros em relação à produção dos respectivos homodímeros. Isso é tipicamente realizado por modificação da região constante das cadeias pesadas de modo que elas favoreçam a heterodimerização (isto é, a dimerização com uma cadeia pesada que se combina com a segunda cadeia pesada) mais que a homodimerização. Em uma modalidade preferencial, o anticorpo multivalente da invenção compreende duas diferentes cadeias pesadas de imunoglobulina com domínios de heterodimerização compatíveis.
[0297] Os domínios de heterodimerização compatíveis são, de preferência, domínios de heterodimerização CH3 de cadeia pesada de imunoglobulina. Quando domínios CH3 tipo selvagem são usados, a coexpressão de duas cadeias pesadas diferentes (A e B) e de uma cadeia leve comum resultará em três diferentes espécies de anticorpo, AA, AB e BB. AA e BB são designações para os dois anticorpos homodiméricos, e AB é uma designação para o anticorpo multivalente. Para aumentar a porcentagem do produto homodimérico desejado (AB), a engenharia de CH3 pode ser utilizada, ou em outras palavras, podem- se usar cadeias pesadas com domínios de heterodimerização compatíveis, conforme definidos abaixo neste documento. A técnica descreve várias maneiras pelas quais tal heterodimerização de cadeias pesadas pode ser realizada.
[0298] O termo "domínios de heterodimerização compatíveis", como usado aqui, refere-se aos domínios de proteína que são engenhados de modo que o domínio engenhado A’ preferivelmente formará heterodímeros com o domínio engenhado B’ e vice-versa, a homodimerização entre A’-A’ e B’-B’ é diminuída.
[0299] Em US13/866.747 (agora concedida como US 9.248.181), US14/081.848 (agora concedida como US 9.358.286), WO2013/157953 e WO2013/157954, métodos e meios são revelados para produzir anticorpos multivalentes usando domínios de heterodimerização compatíveis. Estes meios e métodos podem também ser favoravelmente utilizados na presente invenção. Especificamente, um anticorpo multivalente da invenção, de preferência, compreende mutações para produzir essencialmente apenas moléculas biespecíficas de IgG de comprimento completo. As mutações preferenciais são as substituições de aminoácido L351K e T366K (numeração EU) no primeiro domínio CH3 ou nas posições correspondendo às mesmas (a cadeia pesada ‘variante-KK’) e as substituições de aminoácido L351D e L368E no segundo domínio ou nas posições correspondendo às mesmas (a cadeia pesada ‘variante-DE’), ou vice-versa. Foi anteriormente demonstrado em nossas patentes US 9.248.181 e US 9.358.286 e também no pedido de patente PCT WO2013/157954 que a variante-DE e a variante-KK preferencialmente emparelham para formar heterodímeros (as denominadas moléculas 'DEKK' biespecíficas). A homodimerização de cadeias pesadas variantes-DE (homodímeros DEDE) ou de cadeias pesadas variantes-KK (homodímeros KKKK) quase não ocorre devido à forte repulsão entre os resíduos carregados na interface CH3-CH3 entre cadeias pesadas idênticas.
[0300] Em uma célula hospedeira preferencial da presente invenção, capaz de expressar proteínas que se multimerizam para formar um anticorpo multivalente, a célula hospedeira é transformada com um ácido nucleico que codifica três proteínas. No sentido do N- terminal para o C-terminal, as proteínas codificadas incluem uma primeira proteína que compreende VH1-CH1-VH2-CH1-CH2-CH3, sendo que um ligante conecta VH2 e CH1 na primeira proteína, uma segunda proteína codificada que compreende VLc-CL, uma terceira proteína codificada que compreende VH3-CH1-CH2-CH3, sendo que o CH1 da primeira e da terceira proteína codificadas emparelha com o CL da segunda proteína codificada, e a região CH3 da primeira e da terceira proteína codificadas codifica os aminoácidos L351K e T366K (numeração EU) na CH3 da primeira proteína ou nas posições correspondendo aos mesmos e os aminoácidos L351D e L368E na terceira proteína ou nas posições correspondendo aos mesmos respectivamente, ou vice-versa. Alternativamente, as ditas primeira e terceira proteínas compreendem outros domínios de heterodimerização compatíveis que causam o emparelhamento eficiente dos domínios CH3 de cada uma destas proteínas.
[0301] Os ditos ácidos nucleicos que codificam as ditas três proteínas podem estar em um ou mais vetores, para gerar um anticorpo multivalente da invenção. De modo similar, podem ser geradas células hospedeiras que codificam mais de três proteínas para cada um dos anticorpos multivalentes descritos acima, incluindo aqueles nas Figuras 1a-1u.
[0302] Os ditos ácidos nucleicos que codificam as ditas três proteínas podem adicionalmente ser integrados de maneira estável no genoma da célula hospedeira, de preferência, em regiões cromossômicas conhecidas pela alta expressão e uma ausência ou redução de silenciamento gênico.
[0303] De acordo com a invenção, é fornecido, dessa forma, um método para a preparação de um anticorpo multivalente, sendo que o método compreende:
fornecer uma célula que compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos que são capazes de montagem em um anticorpo multivalente de acordo com a invenção; e cultivar a dita célula hospedeira sob condições para fornecer a expressão dos polipeptídeos e para a montagem deles em um anticorpo multivalente.
[0304] Uma célula hospedeira da presente invenção pode ser capaz de produzir o anticorpo multivalente em uma pureza de ao menos cerca de 50%, ao menos cerca de 60%, ao menos cerca de 70%, ao menos cerca de 80%, ao menos cerca de 90%, ao menos cerca de 95%, ao menos cerca de 98% do anticorpo multivalente da invenção com base na imunoglobulina total expressa.
[0305] Uma célula hospedeira da invenção pode ser capaz de produzir o anticorpo multivalente, sendo que ao menos cerca de 50%, ao menos cerca de 60%, ao menos cerca de 70%, ao menos cerca de 80%, ao menos cerca de 90%, ao menos cerca de 95%, ao menos cerca de 98% do anticorpo multivalente produzido compreende uma região rearranjada variável emparelhada com uma cadeia comum cognata para todos os sítios de ligação.
[0306] Uma célula hospedeira da invenção pode ser capaz de produzir o anticorpo multivalente, sendo que ao menos cerca de 50%, ao menos cerca de 60%, ao menos cerca de 70%, ao menos cerca de 80%, ao menos cerca de 90%, ao menos cerca de 95%, ao menos cerca de 98% de cadeia comum expressa é emparelhada com o anticorpo multivalente e não é proteína livre, não associada.
[0307] Células adequadas para a produção de anticorpos são conhecidas na técnica e incluem uma célula de hibridoma, uma célula de ovário de hamster chinês (CHO), uma célula NS0 ou uma célula PER-C6. Em uma modalidade particularmente preferencial, a dita célula é uma célula CHO. As células para a produção de um anticorpo, conforme revelado na presente invenção, são também chamadas de células hospedeiras.
[0308] Várias instituições e empresas desenvolveram linhagens celulares para a produção em larga escala de anticorpos, por exemplo, para uso clínico. Exemplos não limitadores dessas linhagens celulares são células CHO, células NS0 ou células PER.C6. Estas células também são utilizadas para outros propósitos, como a produção de proteínas. As linhagens celulares desenvolvidas para a produção em escala industrial de proteínas e anticorpos são, mais adiante neste documento, chamadas de linhagens de células industriais. Em uma modalidade preferencial a invenção fornece uma linhagem de célula industrial que produz um anticorpo da invenção.
[0309] A invenção em uma modalidade fornece uma célula (célula hospedeira) que compreende um anticorpo de acordo com a invenção e/ou um ácido nucleico de acordo com a invenção. A dita célula é, de preferência, uma célula animal, com mais preferência, uma célula de mamífero, com mais preferência, uma célula de primata, e com a máxima preferência, uma célula de ser humano. Para os propósitos da invenção,
uma célula adequada, célula hospedeira adequada é qualquer célula capaz de compreender e, de preferência, produzir um anticorpo de acordo com a invenção e/ou um ácido nucleico de acordo com a invenção.
[0310] A invenção fornece, adicionalmente, uma célula que compreende um anticorpo de acordo com a invenção. De preferência, a dita célula (tipicamente uma célula in vitro, isolada ou recombinante) produz o dito anticorpo. Em uma modalidade preferencial, a dita célula é uma célula de hibridoma, uma célula de ovário de hamster chinês (CHO), uma célula NS0 ou uma célula PER.C6. Em uma modalidade particularmente preferencial, a dita célula é uma célula CHO. É adicionalmente fornecida uma cultura celular que compreende uma célula de acordo com a invenção. Várias instituições e empresas desenvolveram linhagens celulares para a produção em larga escala de anticorpos, por exemplo, para uso clínico. Exemplos não limitadores dessas linhagens celulares são células CHO, células NS0 ou células PER.C6. Essas células também são usadas para outras finalidades, como a produção de proteínas. As linhagens celulares desenvolvidas para a produção em escala industrial de proteínas e anticorpos são, mais adiante neste documento, chamadas de linhagens de células industriais. Dessa forma, em uma modalidade preferencial, a invenção fornece o uso de uma linhagem de célula desenvolvida para a produção em larga escala de anticorpo para a produção de um anticorpo multivalente da invenção. A invenção fornece adicionalmente uma célula para produzir um anticorpo multivalente compreendendo uma ou mais moléculas de ácidos nucleicos que sozinhas ou juntas codificam um anticorpo multivalente conforme reivindicado.
[0311] A invenção também fornece um método para produzir dois ou mais anticorpos pela mesma célula sendo que ao menos um dos ditos anticorpos é um anticorpo multivalente, conforme descrito aqui. Esta modalidade é agora exemplificada pelo sistema de heterodimerização DE/KK anteriormente descrito. A invenção, entretanto, não é limitada a um método específico para permitir a heterodimerização de cadeias pesadas. Conforme anteriormente descrito, a variante-DE e a variante-KK preferencialmente se emparelham para formar heterodímeros (as chamadas moléculas bi/multivalentes ‘DEKK’). A homodimerização de cadeias pesadas variantes-DE (homodímeros DEDE) ou de cadeias pesadas variantes-KK (homodímeros KKKK) quase não ocorre devido à forte repulsão entre os resíduos carregados na interface CH3-CH3 entre cadeias pesadas idênticas. A introdução de uma outra cadeia pesada que tem a cadeia pesada variante-DE ou a cadeia pesada variante-KK, possibilita a produção de uma outra molécula bi/multivalente DEKK. Uma cadeia pesada-DE recentemente introduzida (DE2) pode associar-se com a cadeia pesada-KK existente. A célula, dessa forma, produz dois anticorpos bi/multivalentes um anticorpo bivalente DE1KK e um anticorpo bivalente DE2KK. Se uma nova cadeia pesada KK (KK2) é introduzida ao invés da nova cadeia pesada DE, são produzidos os anticorpos bivalentes com as combinações DEKK1 e DEKK2. Os níveis nos quais os anticorpos diferentes podem ser produzidos pela célula são tipicamente melhor ajustados pelo ajuste da expressão relativa das cadeias DE1/2 e KK1/2 em relação uma à outra.
A cadeia leve é tipicamente produzida suficientemente para reduzir o nível de cadeias pesadas individuais e o nível no qual uma cadeia é produzida é tipicamente suficiente para possibilitar o emparelhamento com as cadeias complementares.
Nos exemplos de DE1/2 e KK, as cadeias pesadas DE1 e DE2, de preferência, são produzidas em um teor no qual juntas, se iguala ao teor da cadeia pesada KK.
O nível dos respectivos anticorpos pode ser ajustado pelo ajuste dos níveis nos quais as DE1 e DE2 são produzidas em relação uma à outra.
Para a variante KK1/2 DE, a situação é, obviamente, similar, mas agora para as cadeias KK1 e KK2 em relação uma à outra.
Dependendo do número de domínios de ligação ou domínios variáveis associados com cada uma das cadeias pesadas, este método possibilita a produção de uma variedade de diferentes anticorpos bi/multivalentes.
Vários exemplos não limitadores são agora descritos aqui.
Neste exemplo, a cadeia pesada DE1 tem uma região variável de cadeia pesada que em conjunto com a cadeia leve comum a todos os domínios de ligação para um domínio de ligação ou domínio variável se liga ao antígeno V, a cadeia pesada DE2 tem duas regiões variáveis de cadeia pesada que em conjunto com a cadeia leve comum formam dois domínios de ligação ou domínios variáveis que se ligam aos antígenos W e X.
A cadeia pesada KK tem uma região variável de cadeia pesada que em conjunto com a cadeia leve comum forma um domínio de ligação ou domínio variável que se liga ao antígeno Y.
A produção destas cadeias pesadas e leves em uma célula produzirá um anticorpo DE1KK e um anticorpo DE2KK sendo que o anticorpo DE1KK é um anticorpo bivalente que se liga aos antígenos V e
Y. O anticorpo DE2KK é um anticorpo multivalente que se liga aos antígenos W, X e Y. Se no exemplo acima DE1 também tem duas regiões pesadas de cadeia variável que em conjunto com a cadeia comum leve formam dois domínios de ligação ou domínios variáveis, são produzidos dois anticorpos multivalentes da invenção. A cadeia pesada KK também pode ser fornecida com uma região variável da cadeia pesada adicional adicionando, assim, ainda outros domínios da mesma ou diferente especificidade de ligação ao antígeno. A combinação de dois ou mais diferentes domínios de heterodimerização como o DE/KK, descrito acima, e os domínios knob-in-hole, podem adicionar diversidade adicional na produção de anticorpos oligoclonais. Por exemplo, a adição de duas cadeias pesadas, uma com o knob e a outra com o hole complementar permite a produção de um anticorpo bi/multivalente independente que compreende uma cadeia pesada com knobe uma cadeia pesada com hole. Dependendo do número de regiões variáveis de cadeia pesada associadas com cada cadeia pesada e dependendo se elas são iguais ou diferentes, é produzido um outro anticorpo monoespecífico, ou um outro anticorpo biespecífico ou multivalente.
[0312] De acordo com a invenção, é fornecida uma composição que compreende dois ou mais anticorpos, ao menos um dos quais pode ser um anticorpo multivalente da invenção. Tal composição da presente invenção pode compreender dois ou mais anticorpos multivalentes da invenção.
[0313] Tal composição pode compreender três, quatro, cinco ou mais anticorpos, ao menos um dos quais pode ser um anticorpo multivalente da invenção. Tal composição pode compreender três, quatro, cinco ou mais anticorpos, todos os quais podem ser um anticorpo multivalente da invenção.
[0314] Tal composição, um ou mais dentre os anticorpos presentes na composição podem ter uma cadeia pesada em comum.
[0315] Uma célula hospedeira da invenção pode expressar ou pode ser capaz de expressar dois ou mais anticorpos, ao menos um dos quais pode ser um anticorpo multivalente da invenção. Uma célula hospedeira da invenção pode expressar ou pode ser capaz de expressar dois ou mais anticorpos multivalentes da invenção. Tais células hospedeiras podem expressar ou podem ser capazes de expressar três, quatro, cinco ou mais anticorpos, ao menos um dos quais pode ser um anticorpo multivalente da invenção. Tais células hospedeiras podem expressar ou podem ser capazes de expressar três, quatro, cinco ou mais anticorpos, todos os quais podem ser um anticorpo multivalente da invenção.
[0316] De acordo com a invenção, é fornecido, dessa forma, um método para a preparação de uma composição que compreende dois ou mais anticorpos, sendo que o método compreende: fornecer uma célula que compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos que são capazes de montagem em dois ou mais anticorpos, ao menos um dos quais é um anticorpo multivalente de acordo com a invenção; e cultivar a dita célula hospedeira sob condições para produzir a expressão dos polipeptídeos e para montagem deles em dois ou mais anticorpos, ao menos um dos quais é um anticorpo multivalente de acordo com a invenção.
[0317] A invenção também fornece um método para produzir dois ou mais anticorpos pela mesma célula sendo que ao menos um dos ditos anticorpos é um anticorpo multivalente, conforme descrito aqui.
[0318] A invenção fornece um método para produzir uma composição que compreende dois ou mais anticorpos dos quais ao menos um é um anticorpo multivalente, conforme reivindicado, o método compreendendo fornecer uma célula com - um ácido nucleico que codifica uma primeira cadeia pesada com uma região variável de cadeia pesada que juntamente com uma cadeia leve comum forma um domínio de ligação ou domínio variável que se liga a um primeiro antígeno; - um ácido nucleico que codifica uma segunda cadeia pesada com uma região variável de cadeia pesada que juntamente com a dita cadeia leve comum forma um domínio variável que se liga a um segundo antígeno e uma região variável de cadeia pesada que juntamente com a dita cadeia leve comum forma um domínio variável que se liga a um terceiro antígeno; - um ácido nucleico que codifica uma terceira cadeia pesada com uma região variável de cadeia pesada que juntamente com a dita cadeia leve comum forma um domínio variável que se liga a um quarto antígeno; e - um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende a dita cadeia leve comum;
sendo que dois ou mais dos ditos ácidos nucleicos podem estar ou não fisicamente ligados e sendo que cada um dos ditos ácidos nucleicos compreende adicionalmente uma sequência de controle de expressão para possibilitar a expressão das cadeias pesadas e leves codificadas na dita célula e sendo que o método compreende adicionalmente cultivar a dita célula para possibilitar a expressão da ditas cadeias pesadas e leves e, opcionalmente, coletar os ditos dois ou mais anticorpos. Em uma modalidade, as ditas primeira e segunda cadeias pesadas têm um domínio de heterodimerização compatível, de preferência, um domínio de heterodimerização DE/KK. Em uma modalidade preferencial, a dita terceira cadeia pesada compreende uma das partes do domínio de heterodimerização compatível como resultado da qual são produzidos dois anticorpos. Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente fornecer uma coleção de células com o dito ácido nucleico e selecionar, da dita coleção, uma célula com uma razão desejada de expressão das respectivas cadeias pesadas e leves. Em uma modalidade preferencial, os ditos dois ou mais anticorpos são dois ou mais anticorpos multiespecíficos. Em uma modalidade preferencial, as células produzem quantidades essencialmente equimolares dos dois ou mais anticorpos. Em algumas modalidades, as células produzem mais de um anticorpo do que do outro dos ditos dois ou mais anticorpos. Animais não humanos
[0319] Síntese e expressão de proteínas de ligação multivalentes têm sido problemáticas, em parte devido aos problemas associados com a identificação de uma cadeia leve adequada que pode associar-se e expressar com duas ou mais diferentes cadeias pesadas, e em parte devido aos problemas de isolamento. Adicionalmente, a técnica não possui uma matriz de ligantes que possibilite uma matriz diversa de valência, flexibilidade com estabilidade e baixa imunogenicidade do anticorpo.
[0320] Os métodos e composições aqui descritos permitem a produção de proteínas de ligação multivalentes adequadas que têm domínios de ligação obtidos de, derivados de, ou baseados em métodos adequados. Métodos adequados podem incluir métodos de apresentação em fagos (incluindo a modificação de sequências de linhagem germinativa geradas em sistemas de apresentação em fagos), e outros métodos in vitro conhecidos na técnica. Um método particularmente útil é ter um animal não humano geneticamente modificado produzindo através de processos naturais de recombinação somática, e maturação de afinidade, um domínio variável de cadeia pesada adequado que pode associar-se e expressar com uma cadeia leve comum.
[0321] Em uma modalidade, os domínios variáveis utilizados em um anticorpo multivalente da invenção são obtidos a partir de, derivados de ou baseados em regiões variáveis de cadeias pesada e leve de um animal não humano transgênico, que compreende em sua linhagem germinativa um locus variável de cadeia pesada não rearranjado e expressa um único domínio variável de cadeia leve humana rearranjado, por exemplo, uma cadeia leve comum de mamífero, como um roedor. Tal animal transgênico, não humano, mediante exposição a um antígeno, expressará uma diversidade de regiões variáveis de cadeia pesada emparelhadas com uma cadeia leve comum, que podem, então, ser utilizadas para desenvolver sequências de ácidos nucleicos que codificam regiões variáveis de cadeia pesada obtidas a partir de, derivadas de, ou baseadas naquelas do dito animal transgênico que são capazes de ser eficientemente transformadas em células hospedeiras para a produção de anticorpos multivalentes.
[0322] Em particular, as sequências de região variável de cadeia leve comum humana de células B adequadas, de um animal imunizado, que são geneticamente modificadas para expressar os domínios variáveis de cadeia leve humana derivados de não mais do que um, ou não mais do que dois, segmentos gênicos de VL humana podem ser utilizadas como uma fonte de domínios VH potenciais para um anticorpo multivalente da invenção. As células B de ditos animais que são imunizados com um ou mais antígenos de interesse, que são, em várias modalidades, antígenos aos quais o anticorpo multivalente se ligará. Células, tecidos ou soro, materiais esplênicos ou linfáticos dos ditos animais são triados para obter domínios variáveis de cadeia pesada (ou células B que os expressam) que apresentam características desejadas com respeito aos antígenos de interesse, por exemplo, alta afinidade, baixa afinidade, capacidade de bloqueio, ativação, internalização ou outras características. Como praticamente todos os domínios pesados de cadeia variável que são gerados em resposta a um estímulo antigênico no dito animal transgênico são feitos em conjunto com a expressão de uma cadeia leve de imunoglobulina humana derivada de não mais que um, ou não mais que dois segmentos gênicos de VL, as regiões variáveis da cadeia pesada são capazes de se expressar e se associar com domínios comuns de cadeia leve que são expressos no animal transgênico.
[0323] Em um aspecto, é fornecida uma proteína de ligação ao epítopo, conforme descrita na presente invenção, na qual sequências VL e VH humanas são codificadas por um ácido nucleico baseado no ácido nucleico obtido da célula B de um camundongo transgênico aqui descrito, e/ou de um animal transgênico conforme revelado no documento WO2009/157771, aqui incorporado a título de referência, que foi imunizado com um antígeno que compreende um epítopo de interesse. Sequências de ácidos nucleicos, polipeptídeos, vetores e células
[0324] A invenção fornece adicionalmente: sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos ou ligantes que podem ser utilizados na montagem de um anticorpo multivalente da invenção; vetores que compreendem tais sequências de ácidos nucleicos; uma célula que é capaz de produzir um anticorpo multivalente da invenção; e um método para a preparação de um tal anticorpo multivalente usando tal célula.
[0325] Os anticorpos multivalentes, de acordo com a invenção, são tipicamente produzidos por células que expressam sequências de ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos que juntos se montam para formar um anticorpo da invenção.
[0326] Consequentemente, a invenção fornece um ligante que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs 1 a 3 ou 5 a 24 ou um polipeptídeo que tem ao menos cerca de 85% de identidade de sequência com qualquer um das mesmas, ao menos cerca de 85% de identidade de sequência com qualquer uma das mesmas, como ao menos cerca de 90% de identidade de sequência com qualquer uma das mesmas, por exemplo, ao menos cerca de 95% de identidade de sequência com qualquer uma das mesmas, como ao menos cerca de 98% de identidade de sequência com qualquer uma das mesmas, por exemplo, ao menos cerca de 99% de identidade com qualquer uma das mesmas.
[0327] A invenção fornece adicionalmente um polipeptídeo que compreende: um ligante VH2-CH1 baseado em dobradiças-VH1-CH1.
[0328] Em certas modalidades, VH1 e VH2 ligam-se ao mesmo epítopo. Em certa modalidade, VH1 e VH2 ligam-se ao mesmo antígeno, mas a epítopos diferentes. E em certas modalidades, VH1 e VH2 ligam-se a epítopos e antígenos separados.
[0329] Também é fornecida pela invenção uma sequência de ácidos nucleicos que codifica tal ligante ou polipeptídeo e um vetor que compreende uma sequência de ácidos nucleicos.
[0330] As sequências de ácidos nucleicos utilizadas para produzir os polipeptídeos descritos podem ser colocadas em qualquer vetor de expressão adequado e, em circunstâncias adequadas, em dois ou mais vetores em uma célula hospedeira única.
[0331] De modo geral, as sequências de ácidos nucleicos que codificam domínios variáveis são clonadas com os ligantes adequados e/ou as regiões constantes adequadas e as sequências são colocadas em ligação funcional com um promotor em um construto de expressão adequado em uma linhagem celular adequada para expressão.
[0332] Consequentemente, a invenção também fornece um método para a preparação de um anticorpo, cujo método compreende: fornecer uma célula que compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos que são capazes de montagem em um anticorpo multivalente da invenção; e cultivar a dita célula hospedeira sob condições para fornecer a expressão dos polipeptídeos e para a montagem deles em um anticorpo multivalente. Expressão de um anticorpo multivalente
[0333] A expressão de anticorpos em células hospedeiras recombinantes tem sido descrita na técnica. As moléculas de ácidos nucleicos que codificam as cadeias leves e pesadas de um anticorpo da invenção podem estar presentes como cópias extracromossômicas estavelmente integradas no cromossomo da célula hospedeira. Neste último caso, são preferenciais loci que sejam alvos conhecidos pela falta de silenciamento gênico.
[0334] Para obter a expressão de sequências de ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos que se montam como um anticorpo da invenção, é bem conhecido pelos versados na técnica que as sequências capazes de conduzir tal expressão podem estar funcionalmente ligadas às sequências de ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos. Funcionalmente ligadas significa descrever que as sequências de ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos ou precursores dos mesmos estão ligadas às sequências capazes de conduzir a expressão de tal modo que estas sequências possam conduzir a expressão dos polipeptídeos ou precursores dos mesmos. Vetores de expressão úteis estão disponíveis na técnica, por exemplo, a série de vetores pcDNA da Invitrogen. Onde a sequência que codifica o polipeptídeo de interesse é adequadamente inserida com referência às sequências que governam a transcrição e a tradução do polipeptídeo codificado, o cassete de expressão resultante é útil para produzir o polipeptídeo de interesse, chamado de expressão. Sequências que conduzem a expressão podem incluir promotores, intensificadores e similares, e combinações dos mesmos. Estas devem ser capazes de funcionar na célula hospedeira, conduzindo, assim, a expressão das sequências de ácidos nucleicos que estão funcionalmente ligadas a elas. Os promotores podem ser constitutivos ou regulados, e podem ser obtidos de várias fontes, incluindo vírus, fontes procarióticas, ou eucarióticas, ou planejados artificialmente.
[0335] A expressão de sequências de ácidos nucleicos da invenção pode ser a partir do promotor natural ou de um derivado do mesmo ou de um promotor inteiramente heterólogo. Alguns promotores bem conhecidos e muito utilizados para expressão em células eucarióticas compreendem promotores derivados de vírus, como adenovírus, por exemplo, o promotor E1A, promotores derivados de citomegalovírus (CMV), como o promotor precoce imediato (IE, "Immediate Early") de CMV, promotores derivados de Vírus Símio 40 (SV40), e similares. Os promotores adequados podem também ser derivados de células eucarióticas, como os promotores metalotioneína (MT), o promotor fator de alongamento la (EF-Ia), o promotor actina, um promotor imunoglobulina, os promotores de choque térmico, e similares. Qualquer promotor ou intensificador/promotor capaz de conduzir a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos da invenção em uma célula hospedeira é adequado na invenção. Em uma modalidade, a sequência capaz de conduzir a expressão compreende uma região de um promotor de CMV, de preferência, a região que compreende os nucleotídeos -735 a +95 do intensificador/promotor do gene precoce imediato de CVM. O versado na técnica estará ciente de que a expressão de sequências utilizadas na invenção pode ser adequadamente combinada com elementos que podem estabilizar ou intensificar a expressão, como isolantes, região de fixação da matriz, elementos STAR e similares. Isto pode intensificar a estabilidade e/ou os níveis de expressão.
[0336] Qualquer célula adequada para expressar uma sequência de ácidos nucleicos recombinante pode ser utilizada para gerar um anticorpo da invenção. De preferência, a dita célula é adaptada para crescimento em suspensão.
[0337] Um anticorpo multivalente da invenção pode ser expresso em células hospedeiras, tipicamente pelas cultura de uma célula adequada da invenção e coleta do dito anticorpo da dita cultura. De preferência, a dita célula é cultivada em um meio sem soro. Um anticorpo da invenção pode ser recuperado das células ou, de preferência, do meio de cultura celular por métodos que são geralmente conhecimentos pelo versado na técnica.
[0338] É adicionalmente fornecido um anticorpo obtenível por um método para produzir um anticorpo de acordo com a invenção. O anticorpo é, de preferência, purificado a partir do meio da cultura.
[0339] Após a recuperação, um anticorpo pode ser purificado da cultura usando métodos conhecidos na técnica. Tais métodos podem incluir precipitação, centrifugação, filtração, cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de afinidade, cromatografia de troca catiônica e/ou aniônica, interação hidrofóbica, cromatografia, e similares. Pode ser utilizada cromatografia de afinidade, incluindo com base na sequência ligante como um meio de separação do anticorpo multivalente da invenção. Composições farmacêuticas e métodos de uso
[0340] Também é fornecido pela invenção uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo da invenção e um veículo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável.
[0341] Consequentemente, a invenção fornece um anticorpo multiespecífico, conforme descrito na presente invenção, para uso no tratamento do corpo humano ou animal por terapia.
[0342] É adicionalmente fornecido pela invenção um método para o tratamento de um ser humano ou animal que sofre de uma condição médica, cujo método compreende administrar ao ser humano ou animal uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo conforme descrito na presente invenção.
[0343] A quantidade de anticorpo de acordo com a invenção a ser administrada a um paciente está tipicamente na janela terapêutica, o que significa que uma quantidade suficiente é usada para obter um efeito terapêutico, enquanto a quantidade não excede um valor limite que leva a uma extensão inaceitável dos efeitos colaterais. Quanto menor for a quantidade de anticorpo necessária para obter um efeito terapêutico desejado, maior será a janela terapêutica. É, portanto, preferencial um anticorpo de acordo com a invenção que exerce efeitos terapêuticos suficientes em dosagem baixa.
[0344] Uma referência aqui a um documento de patente ou outro assunto que é proposto como técnica anterior não deve ser considerada como uma admissão de que este documento ou assunto era conhecido ou que a informação que ele contém era parte do conhecimento geral comum na data de prioridade de qualquer uma das reivindicações.
[0345] A revelação de cada referência aqui apresentada é incorporada em sua totalidade na presente invenção a título de referência.
[0346] Com o propósito de clareza e de uma descrição concisa, as características são descritas na presente invenção como parte de modalidades iguais ou separadas; entretanto, será entendido que o escopo da invenção pode incluir modalidades que têm combinações de todas ou algumas das características descritas.
[0347] Os Exemplos a seguir ilustram a invenção. Para facilidade de referência, para os Exemplos oito a quinze, quando se descrevem moléculas triespecíficas, o seguinte formato é utilizado MFAxMFB:MFC ou AntígenoAxAntígenoB:AntígenoC, de modo que AMF ou AntígenoA seguido por x constitui o "braço curto", enquanto que o x denota a dimerização, seguido por MFB ou AntígenoB descreve a posição interior do braço longo, seguido por um ":" designando um ligante seguido por MFC ou AntígenoC descreve MFC ou AntígenoC no domínio distal do braço longo. Exemplos Exemplo 1: Clonagem dos domínios variáveis e ligante para a geração de um vetor capaz de expressar um anticorpo multiespecífico
[0348] 24 construtos de ligantes foram clonados em agrupamentos de acordo com o tamanho deles, conforme detalhado na Tabela 2, no vetor MV1626 (consulte a Figura 3), contendo os resíduos KK (L351K, T366K) na região CH3 para a geração de heterodímeros de cadeia pesada de IgG (WO2013/157954 e WO2013/157953). Os construtos foram clonados no vetor MV1626 usando enzimas de restrição SfiI e XhoI. Todos os construtos contêm sequencialmente o gene VH de MF1337, um domínio CH1, as sequências ligantes cujas traduções são listadas na Tabela 2, e o gene VH de MF1122. Como um exemplo, a sequência de DNA do construto MF1337xIgG4 UHxMF1122 é fornecida abaixo na Tabela 3. O construto é representado esquematicamente na Figura 2a. Os construtos são baseados tanto no CH1 quanto na sequência ligante do isotipo IgG indicado no nome dos construtos. A tradução de todas as 24 regiões CH1 em combinação com as sequências ligantes é fornecida na Figura 5. As traduções de todos os três genes VH e do gene de cadeia leve comum são fornecidas abaixo na Tabela 4.
Tabela 2: As sequências dos 24 diferentes ligantes/construtos e nomenclatura conforme utilizada; notar que também há diferenças em CH1 (Figura 5). A sequência do ligante é indicada abaixo.
As respectivas sequências de CH1 juntas com o ligante são indicadas na Figura 5. O "nome do ligante" se refere à sequência do indicado junto com o domínio CH1. Nome do Sequência Tamanho ligante do ligante (aa) Agrupamento1 1 IgG4 UH ESKYGPP (SEQ ID NO: 1) 7 2 IgG1 UH EPKSCDKTHT (SEQ ID NO: 2) 10 3 IgG2A G4SS GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 3) 10 4 IgG2A MH ERKSSVESPPSP (SEQ ID NO: 4) 12 5 IgG2B MH ERKCSVESPPSP (SEQ ID NO: 5) 12 6 IgG3 UH ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO: 6) 12 7 IgG4 MH ESKYGPPSPSSP (SEQ ID NO: 7) 12 8 IgG2A UL ERKSSVEAPPVAG (SEQ ID NO: 8) 13 9 IgG2B UL ERKCSVEAPPVAG (SEQ ID NO: 9) 13 10 IgG4 UL ESKYGPPAPEFLGG (SEQ ID NO: 10) 14 11 IgG1 MH EPKSCDKTHTSPPSP (SEQ ID NO: 11) 15 12 IgG1 G4S EPKSCDGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 12) 16 13 IgG2 G4SL GGGGSGGGGSAPPVAG (SEQ ID NO: 13) 16 Agrupamento2 1 IgG1 UL EPKSCDKTHTAPELLGG (SEQ ID NO: 14) 17 2 IgG2A H ERKSSVESPPSPAPPVAG (SEQ ID NO: 15) 18 3 IgG2B H ERKCSVESPPSPAPPVAG (SEQ ID NO: 16) 18 4 IgG3 ULH ELKTPLGDTTHTAPEFLGG (SEQ ID NO: 17) 19 5 IgG4 H ESKYGPPSPSSPAPEFLGG (SEQ ID NO 18) 19 6 IgG1 H EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGG (SEQ ID NO: 19) 22 7 IgG2A R ERKSSVEEAAAKEAAAKAPPVAG (SEQ ID NO: 20) 23
8 IgG2B R ERKCSVEEAAAKEAAAKAPPVAG (SEQ ID NO: 21) 23 9 IgG4 R ESKYGPPEAAAKEAAAKAPEFLGG (SEQ ID NO: 22) 24 EPKSCDKTHTEAAAKEAAAKAPELLGG (SEQ ID 10 IgG1 R 27 NO: 23) ELKTPLGDTTHTEAAAKEAAAKAPEFLGG (SEQ ID 11 IgG3 R 29 NO: 24) Tabela 3: Sequência de DNA do construto MF1337xIgG4 UHxMF1122 Sequência de DNA SEQ ID
NO ggcccagccggccatggccgaggtgcagctggtggagactggggctgaggtgaagaagccgggggcctca SEQ ID gtgaaggtctcctgcaaggcttctgactacatcttcaccaaatatgacatcaactgggtgcgccaggccc NO: 25 ctggacaagggcttgaatggatgggatggatgagcgctaacactggaaacacgggctatgcacagaagtt ccagggcagagtcaccatgaccagggacacgtccataaacacagcctacatggagctgagcagcctgaca tctggtgacacggccgtttatttctgtgcgaggagtagtcttttcaagacagagacggcgccctactatc acttcgctctggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctccagtgctagcaccaagggccccag cgtgttccccctggccccctgcagccggagcaccagcgagagcaccgccgccctgggctgcctggtgaag gactacttccccgagcccgtgaccgtgagctggaacagcggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcc ccgccgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgagcagcgtggtgacggtgcccagcagcagcctggg caccaagacctacacctgcaacgtggaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagcgggtggagagc aagtacggcccccccgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctga gactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccagg caaggggctggagtgggtggcagttatatcatatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaag ggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagctg aggacacggccgtgtattactgtgcaagagccctcttcacgaccatcgccatggactattggggccaagg tacccttgtcaccgtctcgagt gaggtgcagctggtggagactggggctgaggtgaagaagccgggggcctca SEQ ID gtgaaggtctcctgcaaggcttctgactacatcttcaccaaatatgacatcaactgggtgcgccaggccc NO: 284 ctggacaagggcttgaatggatgggatggatgagcgctaacactggaaacacgggctatgcacagaagtt ccagggcagagtcaccatgaccagggacacgtccataaacacagcctacatggagctgagcagcctgaca tctggtgacacggccgtttatttctgtgcgaggagtagtcttttcaagacagagacggcgccctactatc acttcgctctggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctccagtgctagcaccaagggccccag cgtgttccccctggccccctgcagccggagcaccagcgagagcaccgccgccctgggctgcctggtgaag gactacttccccgagcccgtgaccgtgagctggaacagcggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcc ccgccgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgagcagcgtggtgacggtgcccagcagcagcctggg caccaagacctacacctgcaacgtggaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagcgggtggagagc aagtacggcccccccgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctga gactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccagg caaggggctggagtgggtggcagttatatcatatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaag ggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagctg aggacacggccgtgtattactgtgcaagagccctcttcacgaccatcgccatggactattggggccaagg tacccttgtcaccgtctcgagt
EVQLVETGAEVKKPGASVKVSCKASDYIFTKYDINWVRQAPGQGLEWMGWMSA SEQ ID NTGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSINTAYMELSSLTSGDTAVYFCARSSLFKTETAP NO: 285 YYHFALDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEP Tradução VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSN da SEQ ID TKVDKRVESKYGPPEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQ NO: 284
APGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY
YCARALFTTIAMDYWGQGTLVTVSS Tabela 4: Traduções de todos os três genes VH e do gene de cadeia leve comum Sequência de proteína Descrição SEQ ID
NO EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAP Tradução de SEQ ID GKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM MF1122 NO: 26
NSLRAEDTAVYYCARALFTTIAMDYWGQGTLVT EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAP Tradução de SEQ ID GKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM MF1122 NO: 286
NSLRAEDTAVYYCARALFTTIAMDYWGQGTLVTVSS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAP Tradução de SEQ ID GKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM MF1025 NO: 27
NSLRAEDTAVYYCARADWWATFDYWGQGTLVT EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAP Tradução de SEQ ID GKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM MF1025 NO: 287
NSLRAEDTAVYYCARADWWATFDYWGQGTLVTVSS EVQLVETGAEVKKPGASVKVSCKASDYIFTKYDINWVRQAPGQ Tradução de SEQ ID GLEWMGWMSANTGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSINTAYMELS MF1337 NO: 28
SLTSGDTAVYFCARSSLFKTETAPYYHFALDVWGQGTTVT EVQLVETGAEVKKPGASVKVSCKASDYIFTKYDINWVRQAPGQ Tradução de SEQ ID GLEWMGWMSANTGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSINTAYMELS MF1337 NO: 288
SLTSGDTAVYFCARSSLFKTETAPYYHFALDVWGQGTTVTVSS
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKA Tradução de SEQ ID PKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYY cadeia leve NO: 29 CQQSYSTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA comum (cLC)
SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[0349] Os elementos de inserção e o vetor foram digeridos a 50°C durante 2 h usando a enzima de restrição SfiI, seguido por 2 h a 37°C com a enzima XhoI. O DNA digerido foi carregado sobre um gel de agarose 0,8% e corrido durante 2 horas a 100 V. O vetor digerido e os elementos de inserção foram subsequentemente isolados do gel usando o kit de extração Qiagen QlAquick Gel antes da ligação de um dia para o outro a 16°C usando T4-DNA-ligase na razão de 1/5 (p/p de vetor/elemento de inserção). 50 µL de E. coli competente DH5α-T1R foram transformados na presença de 5 µL da mistura de ligação seguindo um procedimento de choque térmico de 30 min sobre gelo seguido por 2 min a 42°C e 2 min sobre gelo. As bactérias transformadas foram plaqueadas em ágar LB suplementado com ampicilina e incubadas de um dia para o outro a 37°C. As colônias individuais foram coletadas e misturadas com 100 µL de água desionizada estéril e utilizadas para PCR da colônia usando iniciadores DO_2130 e DO_1056 para confirmar a presença do elemento de inserção, seguida pela PCR de sequência com o BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Thermofisher) para a confirmação de clone usando o iniciador DO_2130.
[0350] As colônias individuais de clones confirmados foram utilizadas para inocular 4 mL de LB-Amp. As culturas de um dia para o outro a 37°C foram preparadas em mini-prep de formato de 24 poços usando o QIAGEN Plasmid Mini Kit de acordo com o manual do fabricante. Após a eluição da coluna, o DNA purificado foi precipitado pela adição de 0,7 volumes de isopropanol à temperatura ambiente. O pélete de DNA foi lavado com 1 mL de etanol 70% e seco ao ar em condições estéreis e ressuspenso em tampão de Tris-EDTA estéril antes do armazenamento a -20°C. Os construtos finais foram sequenciados pelo método didesóxi usando os iniciadores DO_1488, DO_1056 e DO_2130 para o elemento de inserção e também os iniciadores DO_0182 e DO_0091 para a região CH2/CH3 usando o "BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit".
[0351] Todas as sequências dos iniciadores são apresentadas na Tabela 5.
[0352] O sequenciamento mostrou que todos os construtos haviam sido preparados com sucesso.
Tabela 5: sequências de iniciadores Iniciador Sequência Descrição SEQ ID NO DO_0091 CCTCATGCATCACGGAGCATG CH3_rev (reverso) SEQ ID NO: 30 DO_0182 CAAAGGCCAAACTCTCCACTC CH2 fwd (direto) SEQ ID NO: 31 DO_1056 CGCTGTGCCCCCAGAGGTGC VH_rev (reverso) SEQ ID NO: 32 DO_1488 GTACCGGTGAATTGGCCGG VH_fwd (direto) SEQ ID NO: 33 DO_2130 GCGCCCTACTATCACTTCGCTCTGG MF1337 CDR3 fwd (direto) SEQ ID NO: 34
Exemplo 2: Transfecção e purificação de IgG
[0353] Os vetores de expressão gerados no Exemplo 1 foram combinados com o vetor MG1025C377 (Figura 4) que expressa a segunda cadeia pesada da porção anticorpo de base dos anticorpos multiespecíficos, possuindo as mutações L351D-L368E na região CH3 (WO2013/157954 e WO2013/157953) e o gene Tiroglobulina Fab do anticorpo MF1025 (consulte o Exemplo 2 de WO2013/157953). A expressão de duas cadeias pesadas juntas com uma cadeia leve comum resulta na produção do anticorpo triespecífico conforme mostrado na Figura 2b.
[0354] Células FreeStyle 293-F (Thermofisher) foram utilizadas para a expressão dos anticorpos projetados em um formato de placa de 24 poços. Dois dias antes da transfecção, o estoque de células FreeStyle 293-F foi dividido em meio de cultura 293-F em uma razão de 1:1 e incubado de um dia para o outro a 37°C e 8% de CO2 em uma velocidade de agitação orbital de 155 rpm. As células foram diluídas no dia antes da transfecção para uma densidade de 5 x 105 células/mL, 4 mL da suspensão de células foram semeados em uma placa de 24 poços profundos, a placa foi coberta com uma vedação respirável, e a suspensão de células foi incubada de um dia para o outro a 37°C e 8% de CO2 em uma velocidade de agitação orbital de 285 rpm. No dia da transfecção, 4,8 mL de meio de cultura 293-F foram misturados com 240 µg de polietilenimina (PEI) linear (PM 25.000). Para cada IgG a ser produzida, 200 µL da mistura de meio de cultura 293-F - PEI foram adicionados a 8 µL de DNA (para heterodímeros de IgG, 4 µL de DNA que codifica cada cadeia pesada) conforme detalhado na Tabela 6. A mistura foi incubada durante 20 minutos à temperatura ambiente antes da adição suave às células. No dia após a transfecção, Penicilina-Estreptomicina (Pen-Estrep) diluída em 500 µL de meio 293F foi adicionada a cada poço. As placas foram incubadas a 37°C e 8% de CO2 em uma velocidade de agitação orbital de 285 rpm até sete dias de coleta após a transfecção. As placas foram centrifugadas durante 5 min a 500 g, os sobrenadantes contendo IgGs foram filtrados usando placas de filtro de polipropileno meltblown de 10 a 12 µm e armazenados a -20°C antes da purificação.
[0355] Vários anticorpos de controle também foram expressos, a saber: Anticorpo Bivalente anti-Toxoide Tetânico usando Fab MF1337 (usando vetor MG1337C057) Anticorpo Bivalente anti-Tiroglobulina usando Fab MF1025 (usando vetor MG1025C059) Anticorpo Bivalente anti-Fibrinogênio usando Fab MF1122v (usando vetor MG1122C057)
[0356] MG1337C057 indica um construto que expressa a região VH de MF1337 do vetor MV1057. MG1025C059 indica um construto que expressa a região VH de MF1025 do vetor MV1059. MG1122C057 indica um construto que expressa a região VH de MF1122 do vetor MV1057. MV1057 (Figura 6) e MV1059 são vetores que expressam moléculas de IgG1 humana bivalente monoespecífica. MV1057 e MV1059 são essencialmente os mesmos vetores que resultam na expressão de moléculas de IgG1 idênticas.
Anticorpo Biespecífico anti-Tiroglobulina x anti-Toxoide Tetânico combinando Fab MF1337 e Fab MF1025 (usando MG1025C377 x MG1337C260) Anticorpo Biespecífico anti-Tiroglobulina x anti-Fibrinogênio combinando Fab MF1122 e Fab MF1025 (usando MG1025C377 x MG1122C260)
[0357] MG1025C377 (Figura 4) expressa o domínio variável de cadeia pesada de anticorpo MF1025 no contexto de uma cadeia pesada de IgG1 humana contendo as mutações L351D, L368E (DE). MG1337C260 (Figura 7) expressa o domínio variável de cadeia pesada do anticorpo MF1337 no contexto de uma cadeia pesada de IgG1 humana contendo as mutações L351K, T366K (KK). MG1122C260 expressa o domínio variável de cadeia pesada do anticorpo MF1122 no contexto de uma cadeia pesada de IgG1 humana contendo as mutações L351K, T366K (KK).
Tabela 6: Esquema de transfecção para produção de IgG. construto 1 construto 2 MG1025C377 MF1337xIgG4 UHxMF1122 MG1025C377 MF1337xIgG1 UHxMF1122 MG1025C377 MF1337xIgG2A G4SSxMF1122 MG1025C377 MF1337xIgG2A MHxMF1122 MG1025C377 MF1337xIgG2B MHxMF1122 MG1025C377 MF1337xIgG3 UHxMF1122 MG1025C377 MF1337xIgG4 MHxMF1122 MG1025C377 MF1337xIgG2A ULxMF1122 MG1025C377 MF1337xIgG2B ULxMF1122 MG1025C377 MF1337xIgG4 ULxMF1122 MG1025C377 MF1337xIgG1 MHxMF1122
MG1025C377 MF1337xIgG1 G4SxMF1122 MG1025C377 MG1337C260 MG1025C377 MG1122C260 MG1337C057 -* MG1122C057 -* MG1025C059 -* MG1025C377 MF1337xIgG2 G4SLxMF1122 MG1025C377 MF1337xIgG1 ULxMF1122 MG1025C377 MF1337xIgG2A HxMF1122 MG1025C377 MF1337xIgG2 BHxMF1122 MG1025C377 MF1337xIgG3 ULHxMF1122 MG1025C377 MF1337xIgG4 HxMF1122 MG1025C377 MF1337xIgG1HxMF1122 MG1025C377 MF1337xIgG2A RxMF1122 MG1025C377 MF1337xIgG2B RxMF1122 MG1025C377 MF1337xIgG4 RxMF1122 MG1025C377 MF1337xIgG1 RxMF1122 MG1025C377 MF1337xIgG3 RxMF1122 *= controles bivalentes
[0358] Após a coleta, os anticorpos foram purificados em formato de 24 poços como segue: os sobrenadantes foram misturados com 50 µL de Trizma 1M, pH 8, e 100 µL de microesferas Proteína A Sefarose CL- 4B (50% v/v, G.E Healthcare Life Sciences) e incubados a 25°C durante 2 h sob agitação orbital de 600 rpm. As microesferas foram filtradas a vácuo e lavadas 2 vezes com 3 mL de PBS de pH 7,4. A eluição dos anticorpos foi realizada pela adição de 200 µL de tampão de citrato 0,1M, pH 3, seguida pela neutralização com 300 µL de Trizma 1M pH 8. As frações de IgG purificadas foram imediatamente trocadas de tampão para PBS pH 7,4. Amostras de IgG foram transferidas para uma placa de filtro de 96 poços de 30 kDa, com membrana de polietersulfona, e centrifugadas a 1.500 g a 4°C até que um volume de 10 µL fosse deixado por poço. 200 µL de PBS foram adicionados a cada poço, as amostras foram misturadas a 500 rpm durante 3 min antes de as IgGs serem coletadas para armazenamento a 4°C. A concentração de IgG foi determinada por biossensores Octet e Proteína A (Pall ForteBio). IgG humana foi utilizada como padrão em sete diluições de 2 vezes partindo de 192 µg/mL para 3 µg/mL. As concentrações de IgG foram determinadas em duplicata.
[0359] SDS-PAGE reduzida e não reduzida foram realizadas para todas as trinta IgGs produzidas, incluindo, dessa forma, os controles. Os resultados são apresentados na Figura 8. Em condições NR, foram observados os tamanhos de produtos esperados de ~200 kDa para os anticorpos multivalentes, triespecíficos, e de ~150 kDa para as IgGs monoclonais de controle e Biclonics®. Para condições R, foram observados os tamanhos de produtos de ~25 kDa (LC), ~50 kDa (HC/1VH) e ~75kDa (HC/2VH) para os anticorpos trivalentes. Os tamanhos de banda de IgGs de controle de ~25 kDa (LC) e ~50 kDa (HC) foram conforme esperado. Os resultados também mostraram bandas a ~150 kDa para os construtos triespecíficos. Estes são os homodímeros resultantes da associação de cadeias pesadas DE que podem ser o resultado de níveis de expressão mais altos da cadeia pesada mais curta contendo DE em relação aos níveis de expressão da cadeia pesada mais longa contendo KK.
Exemplo 3: Atividade de ligação dos domínios Fab na posição VH1, VH2 e VH3 medida em ELISA
[0360] Atividade de ligação dos três domínios Fab em cada construto foi verificada por ELISA usando os antígenos toxoide tetânico, fibrinogênio e tiroglobulina e o antígeno huEGFR-Fc como um controle negativo (consulte a Tabela 7 para condições de revestimento, fornecedor e números de catálogo).
[0361] Cada amostra de IgG multiespecífica foi primeiro diluída para 10 µg/mL em PBS e analisada por titulação de Fibrinogênio, Toxoide Tetânico e Tiroglobulina; em quatro diluições de 5 vezes, de 10 para 0,08 µg/mL. Todas as 30 amostras foram analisadas em huEGFR-Fc a 10 µg/mL. Foram preparadas quantidades adequadas de antígeno em PBS. 50 µL de solução de antígeno diluída foram adicionados por poço de placa de ELISA e a placa foi revestida durante a noite a 4°C. As placas foram lavadas duas vezes com tampão de lavagem (PBS/Tween). Os poços foram bloqueados durante 1 hora à temperatura ambiente com 300 µL de tampão de bloqueio (PBS/BSA 2%). Durante a incubação, diluições de IgG adequadas foram realizadas em tampão de bloqueio. As placas foram esvaziadas por inversão acima do dreno seguida por pancadas no tecido. 50 µL de amostras de IgG diluídas e controles foram adicionados aos poços da placa bloqueada, a placa foi coberta com vedação e incubada durante 60 minutos à temperatura ambiente. As placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem (PBS/ Tween 0,05%). Anticorpo de detecção diluído (Anticorpo de Camundongo anti-IgG-Humana Conjugado com HRP; Becton Dickinson, n° de catálogo 555788), 1/2.000 em tampão de bloqueio foi adicionado a 50 µL por poço. A placa foi coberta com vedação e incubada durante 60 minutos à temperatura ambiente. A placa foi lavada três vezes com tampão de lavagem. Solução de substrato TMB (BD, OptEIA™, n° de catálogo 51-2606KC) foi preparada pela mistura de reagentes A e B na razão 1:1 e adição de 50 µL por poço e revelada durante 10 minutos (máximo). 50 µL de H2SO4 1M foram adicionados a cada poço para interromper a reação de coloração.
[0362] As placas foram lidas a A450 usando um leitor de placa BioTek Elx808 ELISA. As curvas de ligação foram plotadas usando GraphPad Prism 7 e a Área Sob a Curva (ASC) foi calculada para cada ELISA de antígeno de cada construto e listada na Tabela 8. Uma pequena variação na ASC é vista para ligação à Tiroglobulina (VH1, no braço-DE, consulte a Figura 1) e ao Toxoide Tetânico (VH3, na ponta do braço-KK, consulte a Figura 1) de 12% e 8%. Uma variação maior é vista para o braço-Fibrinogênio (este é VH2, Figura 1). Isto indica que a acessibilidade ou afinidade do domínio Fab na posição VH2 depende do ligante que conecta o Fab na posição VH2 ao Fab na posição VH3. Todos os ligantes fornecem VH2s que são funcionais.
Tabela 7. Lista de antígenos utilizados para ELISA Antígeno Concentração de Tampão de Fornecedor Número de revestimento Revestimento Catálogo (µg/mL) Fibrinogênio 10 PBS Sigma F4753 Toxoide 2 PBS Statens T162-2 tetânico Institute Tiroglobulina 10 PBS Sigma T1126- 500MG huEGFR-Fc 2,5 PBS R&D 344-ER Systems
Tabela 8: Valores de área sob a curva resultantes de ensaios de ligação ELISA dos 24 anticorpos triespecíficos, multivalentes, listados na Tabela 6. Os anticorpos foram titulados em ELISA para ligação a três antígenos diferentes.
Os valores de ASC resultantes foram classificados com base na atividade de ligação em relação ao Fibrinogênio, resultante do Fab na posição VH2. Isto identificou que existe uma faixa de atividades de ligação do Fab na posição VH2. Os quinze construtos com atividade mais alta para o Fab na posição VH2 foram priorizados para experimentação adicional, os seis construtos com a atividade mais baixa são indicados em itálico.
ND significa Não Feito Construto Toxoide Fibrinogênio, Tiroglobulina, Tetânico, VH3 VH2 VH1 IgG1 MH 2,50 1,68 2,29 IgG1 H 2,55 1,64 2,44 IgG1 R 2,46 1,63 2,44 IgG1 G4S 2,54 1,56 2,19 IgG1 UH 2,33 1,42 2,31 IgG3 R 2,48 1,34 2,48 IgG3 UH 2,45 1,30 2,40 IgG2A R 2,51 1,30 2,40 IgG2A MH 2,43 1,25 2,31 IgG3 ULH 2,42 1,23 2,38 IgG2B R 2,51 1,21 2,42 IgG4 MH 2,46 1,18 2,35 IgG4 UL 2,50 1,17 2,25 IgG2A H 2,39 1,16 2,37 IgG2B H 2,42 1,16 2,36
IgG2A G4SS 2,34 1,12 2,32 IgG2B MH 2,48 1,11 2,25 IgG4 UH 2,31 1,08 2,33 IgG2A UL 2,36 1,07 2,27 IgG2B UL 2,46 1,03 2,36 IgG2 G4SL 2,29 1,03 2,31 IgG1 UL ND ND ND IgG4 H ND ND ND IgG4 R ND ND ND Exemplo 4: Estabilidade da atividade de ligação
[0363] A estabilidade da atividade de ligação dos três domínios Fab nos construtos de anticorpos trivalentes foi analisada após quatro condições de estresse acelerado. As amostras foram diluídas para 10 µg/mL em PBS e incubadas durante 1 mês a 4°C. As amostras foram diluídas para 10 µg/mL em meio D10F e incubadas durante 7 dias a 40°C. As amostras foram também diluídas para 10 µg/mL em meio D10F e incubadas durante 2 dias a 50°C. As amostras foram também diluídas em PBS e submetidas a cinco ciclos de congelamento-descongelamento (5XFT, "Freeze-Thaw").
[0364] Após estas condições de estresse acelerado, a atividade de ligação para os antígenos reconhecidos pelos três domínios Fab foi analisada por ELISA conforme descrito anteriormente. Áreas Sob a Curva foram calculadas e tabuladas.
[0365] Estresse aplicado a 40°C apenas afetou significativamente a ligação do Fab na posição VH2, a ligação ao Fibrinogênio em graus diferentes nos construtos diferentes testados. Estresse a 4°C, a 50°C e
5xFT afetou a ligação de todos os três domínios Fab em graus diferentes nos construtos diferentes testados.
[0366] As atividades de ligação foram classificadas para cada antígeno e condição de estresse e os 16 construtos mais otimizados sob cada condição de estresse foram identificados para cada posição de Fab. O número de vezes que um construto esteve entre os 16 construtos mais otimizados foi adicionado e utilizado para classificar todos os construtos com base na conservação da atividade de ligação dos três Fab sob condições de estresse acelerado.
[0367] Os resultados apresentados na Figura 9 indicam que há uma faixa de estabilidades dos construtos diferentes sob condições de estresse acelerado. A estabilidade da atividade de ligação dos três domínios Fab nos 21 construtos de anticorpos trivalentes produzidos foi analisada após quatro condições de estresse acelerado. Dados de ELISA (ASC, Área Sob a Curva) são tabulados. As atividades de ligação foram classificadas e os 16 construtos mais otimizados sob cada condição de estresse foram identificados para cada posição em Fab. O número de vezes que um construto esteve entre os 16 construtos mais otimizados foi adicionado e utilizado para classificar todos os construtos com base na conservação da atividade de ligação dos três Fab sob condições de estresse acelerado.
[0368] Todos os anticorpos são estáveis e alguns são mais estáveis do que os outros. Exemplo 5: Transfecção em larga escala e purificação de IgG
[0369] Dezoito construtos foram selecionados para uma produção em larga escala para análise adicional como segue: IgG1 MH, IgG1 H,
IgG1 R, IgG1 G4S, IgG1 UH, IgG3 R, IgG3 UH, **IgG2A R, IgG2A MH, IgG3 ULH, IgG2B R, IgG4 MH, IgG4 UL, IgG2A H, IgG2B H, *IgG1 UL, *IgG4 H, *IgG4 R. Como um controle, as seguintes produções foram incluídas: Anticorpo anti-Tiroglobulina x anti-Toxoide Tetânico Biespecífico (usando MG1025C377 x MG1337C260 descrito anteriormente no Exemplo 2) e Anticorpo Biespecífico anti-Tiroglobulina x anti-Fibrinogênio (usando MG1025C377 x MG1122C260 descrito anteriormente).
[0370] O DNA destes construtos foi preparado conforme descrito anteriormente. As IgGs multiespecíficas foram transfectadas conforme descrito anteriormente por cotransfecção dos construtos mencionados na Tabela 6. Aqueles construtos selecionados foram produzidos em maior escala. Dois dias antes da transfecção, o estoque de células FreeStyle HEK293-F foi dividido em meio de cultura 293-F em uma razão de 1:1 em volume final de 100 mL por frasco de cultura de 500 mL e incubado a 37°C e 8% de CO2, em uma velocidade de agitação orbital de 155 rpm. Um dia antes da transfecção, as células foram contadas e uma suspensão de células com uma densidade de 5,0x105 células/mL foi preparada pela diluição das células com o meio de cultura 293-F. As células foram então semeadas a 100 mL de suspensão de células por frasco T500 e incubadas a 37°C e 8% de CO2 em uma velocidade de agitação orbital de 155 rpm. No dia seguinte as células foram transfectadas. Uma mistura de meio de cultura 293-F, PEI e DNA foi preparada misturando 7,5 mL de meio de cultura 293-F, 187,5 µL de estoque de PEI a 1 µg/µL e 150 µL de DNA a 0,5 µg/µL. Esta foi incubada durante 20 minutos à temperatura ambiente e, então, adicionada às células que foram então incubadas a 37°C e 8% de CO2 em uma velocidade de agitação orbital de 155 rpm durante 7 dias.
[0371] O sobrenadante contendo proteína de anticorpo foi centrifugado a 1.000 g durante 10 minutos para remover as células. O sobrenadante foi filtrado usando um filtro de 0,45 µm. A IgG foi purificada do sobrenadante usando um sistema ÄKTAexplorer 100 (GE Health Care) e cromatografia de afinidade com proteína A seguida por dessalinização. Uma coluna HiTrap MabSelect SuRe de 5 mL e uma coluna HiTrap Desalting de 5 mL (GE Health Care) foram utilizadas de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de IgG foi determinada por absorção a OD280. Isto produziu 0,8 a 4,9 mg de IgG em PBS para todos os construtos. As proteínas geradas foram analisadas por SDS-PAGE, reduzida e não reduzida, conforme descrito acima no Exemplo 2. Os dados confirmaram os dados como encontrados no Exemplo 2 e não são aqui fornecidos.
[0372] HP-SEC foi realizada para estabelecer a razão de expressão entre as duas cadeias pesadas que compõem a porção anticorpo de base dos anticorpos multiespecíficos. Devido à diferença de tamanho das duas cadeias pesadas nos construtos trivalentes, os semianticorpos e homodímeros podem ser identificados e quantificados por Cromatografia de Exclusão por Tamanho de Alta Eficiência (HP-SEC, "High Performance Size Exclusion Chromatography"). HP-SEC foi realizada usando um sistema HPLC Dionex equipado com uma coluna de guarda TSK SWXL (Tosoh Bioscience, n° de catálogo 08543) e uma coluna TSK-gel
G3000SWXL (Tosoh Bioscience, n° de catálogo 08541). Para cada análise, 20 µg de amostra de proteína em PBS foram injetados na coluna, que foi corrida usando Fosfato de Sódio 200 mM, NaCl 50 mM como tampão de corrida em uma velocidade de fluxo de 1 mL/min a 4°C. Os cromatogramas foram analisados para tempos de retenção e áreas de pico relativas com base nos resultados a UV280 usando o software Chromeleon 6.80. A razão entre as quantidades de IgG trivalente/homodímero DEDE foram calculadas e são apresentadas na Tabela 9 abaixo. Os construtos que têm uma razão de IgG trivalente/homodímero DEDE acima da média são apresentados em itálico.
Tabela 9: HP-SEC foi realizada para estabelecer as razões de expressão entre as duas cadeias pesadas que compõem a porção anticorpo de base dos anticorpos multiespecíficos. A razão entre as quantidades de IgG trivalente/homodímero DEDE foram calculadas e são tabuladas Construto Razão Trivalente versus DEDE IgG1 MH 6,1 IgG1 H 5,7 IgG1 UH 5,6 IgG2B H 5,6 IgG2A MH 5,4 IgG1 UL 5,3 IgG2A H 5,3 IgG1 G4S 5,1 IgG2B R 4,4 IgG1 R 4,3 IgG4 H 3,1
IgG4 UL 3,1 IgG4 MH 2 IgG4 R 2 IgG3 R 1,7 IgG3 ULH 1,7 IgG3 UH 1,7 IgG2A R NA
[0373] A estabilidade das IgGs purificadas em grande escala (incluindo os dois controles) foi avaliada após diferentes condições de estresse conforme descritas anteriormente; após cinco ciclos de congelamento-descongelamento em PBS, após incubação durante uma semana a 40°C em meio D10F, após incubação durante uma semana a 50°C em meio D10F e após incubação durante uma semana a 50°C em PBS. O desempenho das amostras estressadas foi comparado com o desempenho das mesmas amostras após uma incubação durante uma semana a 4°C (controle). Para esse propósito, IgGs purificadas das produções de 100 mL foram diluídas em PBS a 0,2 mg/mL e divididas em dois lotes: um para testes de estabilidade em PBS a 0,2 mg/mL (4°C, 3xFT e 50°C), um diluído para 0,1 mg/mL em D10F para testes de estresse a 4°C, 40°C e 50°C conforme descrito acima. Para a amostra de IgG1 H, foi utilizada uma concentração de 0,194 mg/mL.
[0374] Após estas condições de estresse acelerado, a atividade de ligação para os antígenos reconhecidos pelos três fragmentos Fab foi analisada por ELISA conforme descrito anteriormente. Áreas Sob a curva foram calculadas e tabuladas (consulte a Figura 10). A porcentagem de atividade de ligação restante após o estresse em comparação com a atividade da amostra de controle armazenada a 4°C foi calculada para cada atividade de ligação. As amostras foram classificadas com base nestas porcentagens para cada atividade de ligação contra cada alvo em cada condição de estresse. As porcentagens acima da média foram indicadas e o número de vezes que cada amostra desempenhou acima da média foi adicionado e é apresentado na última coluna da Tabela na Figura 10. Isto mostra que há uma faixa na estabilidade dos construtos conforme medida pela atividade de ligação dos três braços Fab após o estresse. Exemplo 6: Análise de estabilidade de 18 construtos de IgG multivalentes
[0375] A análise de estabilidade foi realizada nos 18 construtos multivalentes identificados na Figura 10 e conforme anteriormente descrito no Exemplo 5. Além disso, quatro anticorpos de controle foram utilizados tendo domínios de ligação de cadeia pesada que compreendem MF6744 (SEQ ID NO:91), MF1337 (SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO:288) anteriormente descrito em WO 2018/056821 A1, que é incorporado a título de referência, e MF1122 (SEQ ID NO:26 e SEQ ID NO:286), acoplado a uma cLC, a saber: anticorpo monoespecífico anti-CD137 usando Fab MF6744/cLC; anticorpo monoespecífico anti-Fibrinogênio usando Fab MF1122/cLC; anticorpo monoespecífico anti-Toxoide Tetânico usando Fab MF1337/cLC; e anticorpo biespecífico anti-Fibrinogênio x anti-Toxoide Tetânico contendo Fab MF1122/cLC e Fab MF1337/cLC como um controle biespecífico DEKK.
[0376] A lista das amostras testadas para análise de estabilidade é fornecida abaixo na Tabela 10.
Tabela 10. Lista de amostras testadas para análise de estabilidade: 18 anticorpos multivalentes e 4 anticorpos de controle IgG CH3 Fab(s) Comentários AA Controle Tipo selvagem MF6744 IgG Monoespecífica BB Controle Tipo selvagem MF1122 IgG Monoespecífica CC Controle Tipo selvagem MF1337 IgG Monoespecífica BC Controle DE-KK MF1122-MF1337 DEKK – Biespecífico Amostra 1 DE-KK MF6744xMF1337:MF1122 IgG1 H – Triespecífica (SEQ ID NO: 19) Amostra 2 DE-KK MF6744xMF1337:MF1122 IgG2A MH – Triespecífica (SEQ ID NO: 4) Amostra 3 DE-KK MF6744xMF1337:MF1122 IgG4 UL – Triespecífica (SEQ ID NO: 10) Amostra 4 DE-KK MF6744xMF1337:MF1122 IgG1 G4S – Triespecífica (SEQ ID NO: 12) Amostra 5 DE-KK MF6744xMF1337:MF1122 IgG1 MH – Triespecífica (SEQ ID NO: 11) Amostra 6 DE-KK MF6744xMF1337:MF1122 IgG1 R – Triespecífica (SEQ ID NO: 23) Amostra 7 DE-KK MF6744xMF1337:MF1122 IgG1 UH – Triespecífica (SEQ ID NO: 2) Amostra 8 DE-KK MF6744xMF1337:MF1122 IgG1 UL – Triespecífica (SEQ ID NO: 14) Amostra 9 DE-KK MF6744xMF1337:MF1122 IgG2A H – Triespecífica (SEQ ID NO: 15) Amostra 10 DE-KK MF6744xMF1337:MF1122 IgG2A R – Triespecífica (SEQ ID NO: 20) Amostra 11 DE-KK MF6744xMF1337:MF1122 IgG2B H – Triespecífica
(SEQ ID NO: 16) Amostra 12 DE-KK MF6744xMF1337:MF1122 IgG2B R – Triespecífica (SEQ ID NO: 21) Amostra 13 DE-KK MF6744xMF1337:MF1122 IgG3 R – Triespecífica (SEQ ID NO: 24) Amostra 14 DE-KK MF6744xMF1337:MF1122 IgG3 UH – Triespecífica (SEQ ID NO: 6) Amostra 15 DE-KK MF6744xMF1337:MF1122 IgG3 ULH – Triespecífica (SEQ ID NO: 17) Amostra 16 DE-KK MF6744xMF1337:MF1122 IgG4 H – Triespecífica (SEQ ID NO: 18) Amostra 17 DE-KK MF6744xMF1337:MF1122 IgG4 MH – Triespecífica (SEQ ID NO: 7) Amostra 18 DE-KK MF6744xMF1337:MF1122 IgG4 R – Triespecífica (SEQ ID NO: 22)
[0377] A estabilidade dos 18 construtos multivalentes e dos 4 anticorpos de controle foi analisada após 4 condições diferentes. Consequentemente, as 22 amostras (18 trivalentes + 4 controles) foram diluídas para 0,2 mg/mL em PBS e submetidas a: 1 mês a 4°C (T0) visto como referência; 7 dias a 50°C; 5x ciclos de congelamento-descongelamento (FT) a -80°C; ou 4 horas de agitação a 400 rpm à temperatura ambiente.
[0378] Após cada uma destas quatro condições, a estabilidade foi analisada usando 7 métodos diferentes, a saber:
[0379] Espectroscopia de absorção no UV-Vis: após a subtração da absorção do tampão de fundo e dispersão de luz devido aos agregados, a absorbância é testada a 350 nm para fornecer informações sobre o estado de agregação das amostras, conforme explicado em Eckhardt, 1994: Mulinacci, 2011b e Peters, 2013.
[0380] Espectroscopia de dispersão de luz a 90°: em solução, a intensidade de dispersão de luz pode ser afetada por fatores diferentes, como concentração de proteína, índice de refração, tamanho e formato de partícula, e o comprimento de onda da luz incidente. Este método é utilizado para estudar a agregação de proteínas conforme relatado em Cappelle, 2005; Demeule, 2007a e b; Mulinacci, 2011a e 2013; Luca, 2010; Patois, 2011 e 2012; Peters 2013.
[0381] Emissão de fluorescência intrínseca de triptofano, expressa como % de alteração comparada com T0: alterações na hidrofobicidade e na rigidez do ambiente podem ser medidas mediante a emissão de fluorescência de triptofano (Capelle, 2005; Demeule, 2007a e b e 2009; Mulinacci, 2011a e b; Luca, 2010; Patois, 2011; Peters, 2013).
[0382] Emissão de fluorescência de 1,8-ANS, expressa como % de alteração comparada com T0 como uma sonda fluorescente hidrofóbica pequena não carregada, ácido 1-anilino-8-sulfônico (1,8-ANS) torna-se fluorescente em água quando ligado às cavidades eletrostáticas em proteínas, aos agregados de proteínas, às micelas de detergentes, aos lixiviáveis, às membranas e aos componentes celulares, e pode, portanto, ser utilizado para estudar superfícies de membrana e proteínas (Demeule, 2009; Mulinacci, 2011a e b; Luca 2010).
[0383] Emissão de fluorescência de Vermelho do Nilo, expressa como % de alteração em comparação com T0: como uma sonda fluorescente hidrofóbica pequena não carregada, o Vermelho do Nilo é influenciado pela polaridade do ambiente e pode ser utilizado para analisar a degradação de proteína, a agregação de proteína, as estruturas lipídicas, o desenovelamento de proteína (Sackett e Wolff, 1987).
[0384] Microscopia de fluorescência com Vermelho do Nilo, onde o número de partículas/1 µL é medido: Vermelho do Nilo é utilizado para colorir as amostras com o propósito de visualizar agregados de proteína para microscopia de fluorescência usando um microscópio Leica DMi8 (Demeule, 2007a e b, e 2009; Mulinacci, 2011b e 2013; Patois 2011).
[0385] Dispersão dinâmica de luz, expressa como % de alteração de monômero (cálculo de intensidade) em comparação com T0: dispersão dinâmica de luz é medido usando um instrumento NanoFlex. O laser que passa através da fibra óptica é espalhado e refletido das partículas para o detector que mede a intensidade de luz dispersa para determinar o perfil de distribuição de tamanho das partículas.
[0386] A leitura destes métodos se refere à agregação, à fragmentação e ao desenovelamento das proteínas que é uma medida da estabilidade das proteínas. Os resultados mostraram que 4 horas de agitação a 400 rpm tiveram a máxima influência sobre a estabilidade dos anticorpos. O anticorpo monoespecífico de controle PG1337/MF1337 foi o mais afetado pelas condições de estresse. Portanto, como todos os 18 construtos multivalentes e o controle biespecífico continham o Fab PG1337/MF1337, todos os resultados foram normalizados com PG1337 definido como o limiate.
[0387] A estabilidade das moléculas foi calculada pela combinação das pontuações de todos os 7 métodos durante as 4 condições diferentes. Os resultados podem ser vistos na Figura 12 e revelam que os construtos têm uma faixa de estabilidades, que para um conjunto de moléculas triespecíficas, demonstraram estabilidade superior à IgG biespecífica de controle. Exemplo 7: Caracterização bioinformática do ligante
[0388] Oito ligantes conforme apresentados na Tabela 11 abaixo, e representados na Figura 13, foram adicionalmente caracterizados. A predição de flexibilidade foi obtida para cada uma destas sequências usando o método de predição de flexibilidade de Karplus e Schulz (que computa a média do índice de flexibilidade para cada aminoácido na sequência). O índice de flexibilidade é derivado das propriedades médias de cada aminoácido em estruturas de proteínas conforme descrito em Karplus PA, Schulz GE. Prediction of Chain Flexibility in Proteins - A tool for the Selection of Peptide Antigens. Naturwissenschaften 1985; 72:212- 3; http://tools.immuneepitope.org/bcell/). Na Tabela 11, foi designado um ligante como rígido (R) se a pontuação SK é 1,015 ou menos, parcialmente flexível se a pontuação SK é de cerca de 1,015 a 1,04. Uma sequência flexível, para os propósitos da presente invenção, é uma sequência tendo uma predição de flexibilidade de Karplus e Schulz maior que 1,04.
Tabela 11: Oito ligantes e flexibilidade conforme determinada de acordo com Karplus e Schulz # Ligante Sequência Flexibilidade SEQ ID NO 1 IgG1 G4S EPKSCDGGGGSGGGGS F F 12 2 IgG1 H EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGG F 19 3 IgG1 MH EPKSCDKTHTSPPSP F 11
4 IgG1 UH EPKSCDKTHT Med 2 5 IgG2A H ERKSSVESPPSPAPPVAG F 15 6 IgG2A MH ERKSSVESPPSP R 4 7 IgG2B H ERKCSVESPPSPAPPVAG Med 16 8 IgG2B R ERKCSVEEAAAKEAAAKAPPVAG R 21
[0389] Uma segunda previsão bioinformática destes ligantes foi obtida usando a predição de estrutura local pelo método Rosetta. Aqui, o seletor de fragmentos Rosetta foi utilizado para fornecer predições de estrutura local conforme descrito em Gront D, Kulp DW, Vernon RM, Strauss CEM, Baker D (2011) Generalized Fragment Picking in Rosetta: Design, Protocols and Applications. PLoS ONE 6(8): e23294. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0023294. Para este uso da ferramenta de predição, um número mínimo de 40 resíduos é preferencial, e consequentemente resíduos de glicina foram introduzidos nas terminações dos ligantes para tornar cada uma das sequências com comprimento de 40 resíduos, com a sequência ligante no meio. Estes ligantes foram caracterizados quanto à estrutura secundária, passando as sequências através do pipeline de fragmentos Rosetta que encontra as igualdades de sequências locais exatas em estruturas no ProteinDataBank e usa estas igualdades de sequência-sequência exatas para predizer a estrutura local. O fragmento centralizado foi, então, visualizado para cada uma das 8 sequências acima. Figura 13.
[0390] O resumo dos resultados é apresentado abaixo na Tabela 12: F = flexível; M = média; R = rígida; C = novelo= flexível; H= hélice = rígida; e E = fita = média, que demonstra uma concordância geral com a pontuação de Karplus e Schultz baseada na estrutura secundária predita.
Tabela 12: Sumário de resultados de flexibilidade. # Ligante SEQ ID NO Karplus Predição de Schultz Fragmento 1 IgG1 G4S 12 F CE 2 IgG1 H 19 F CH 3 IgG1 MH 11 F C 4 IgG1 UH 2 M H 5 IgG2A H 15 F C 6 IgG2A MH 4 R H 7 IgG2B H 16 M CE 8 IgG2B R 21 R H Exemplo 8: Geração de domínios de ligação anti-CD3, anti-PD-L1 e anti-
EGFR Camundongos utilizados para imunização.
[0391] Para a geração de anticorpos humanos que se ligam a CD3, EGFR e PD-L1, camundongos transgênicos para a cadeia leve comum humana e para um minilocus de cadeia pesada (HC) humana (compreendendo uma seleção de segmentos gênicos V humanos, todos Ds humanos e todos Js humanos) (consulte WO2009/157771, aqui incorporado a título de referência) podem ser imunizados com o DNA que codifica as proteínas ou com o DNA recombinante, visto abaixo. Estes camundongos são chamados de camundongos ‘MeMo®’. Para determinadas regiões variáveis de cadeia pesada, ou multímeros trivalentes tendo as sequências reveladas na presente invenção, eles podem ser produzidos por qualquer um dos meios conhecidos pelos versados na técnica. Imunizações de proteína
[0392] Camundongos 'MeMo®' foram imunizados por injeções subcutâneas com proteína recombinante e Gerbu adjuvante MM (Gerbu Biotechnik c#3001). As proteínas huPD-huPDL1-His recombinante (SinoBiological; n° de catálogo 10084-H08H) foram utilizadas para as imunizações. Os camundongos foram imunizados com 40 µg de proteína recombinante em PBS misturados com 40 µl de adjuvante em um volume total de 100 µl. Subsequentemente, os camundongos foram reforçados nos dias 14 e 28 com 20 µg de proteína recombinante em PBS, juntamente com 20 µl de adjuvante em um volume total de 50 µl. O soro dos camundongos foi coletado no dia 35 para determinar os títulos séricos. Os camundongos com títulos séricos baixos receberam ciclos adicionais de imunizações de reforço e análises séricas. Cada ciclo consistiu em duas imunizações semanais com o uso de 20 µg de proteína recombinante em 50 µl de PBS seguido, após uma semana, de coleta de soro para análise de título. Os camundongos que mostraram altos títulos séricos contra o alvo humano e macaco receberam uma imunização de reforço final que consistia em injeções diárias com 20 µg de proteína recombinante em 50 µl de PBS em três dias consecutivos. Um dia após a injeção final, o tecido linfoide do camundongo foi coletado. Imunizações com DNA
[0393] Camundongos MeMo® foram imunizados por tatuagem intradérmica ("DNA tattoing") com o uso de um dispositivo de micropigmentação. Imunizações por tatuagem de DNA foram realizadas com 20 µg de DNA plasmidial que codifica o antígeno alvo. Os camundongos foram imunizados com DNA que codifica o PD-L1 humano alvo. Para imunizações com PD-L1, células Treg foram depletadas quatro dias antes do início da imunização dos camundongos por injeção de 0,5 mg de anticorpo PC61.5 anti-CD25 para romper a tolerância. Os camundongos foram imunizados nos dias 0, 3, 6, 14, 17, 28 e 31. O soro dos camundongos foi coletado no dia 35 para determinar os títulos séricos. Os camundongos com baixa reatividade sérica contra o alvo humano e/ou de macaco receberam ciclos adicionais de imunizações de reforço antígeno de DNA humano, de rato ou de macaco e análises séricas. Cada ciclo consistiu em duas imunizações semanais de DNA seguido, após uma semana, de coleta de soro para análise de título. Os camundongos que mostraram reatividade sérica contra células que expressam o alvo humano e de macaco receberam uma imunização de reforço final seguida, após 3 dias, pela coleta de tecido linfoide. Recuperação do tecido linfoide
[0394] O baço e os linfonodos de drenagem foram removidos de todos os camundongos que foram imunizados com sucesso. Suspensões de células individuais foram geradas tanto do baço quanto dos linfonodos inguinais e, subsequentemente, estes tecidos foram lisados em reagente Trizol LS e armazenados a -80°C até o uso. Geração de repertórios de anticorpos de fago ‘imunes’ por clonagem por RT-PCR de genes VH. Dos camundongos imunizados com sucesso, os linfonodos inguinais foram utilizados para a construção de repertórios de anticorpos de fagos ‘imunes’.
Para esta finalidade, o RNA foi extraído do tecido linfoide lisado em Trizol LS e 1 µg de RNA total foi utilizado em uma reação RT usando um iniciador específico para IgG-CH1. O cDNA resultante foi, então, utilizado para amplificar o agrupamento policlonal de cDNA que codifica VH usando iniciadores específicos para VH desenvolvidos internamente, essencialmente conforme descrito em Marks et al. (J Mol Biol. 5 de dezembro de 1991; 222(3): 581-97). O produto de PCR resultante foi, então, clonado em um vetor fagomídeo (Figura 6) para apresentar os fragmentos Fab no fago, conforme descrito em Haard et al. (J Biol Chem. 25 de junho de 1999; 274 (26): 18218-30), com exceção de que a cadeia leve era igual para cada anticorpo e foi codificada pelo vetor. Após a ligação, os fagomídeos foram utilizados para transformar as bactérias E.coli TG1, e as bactérias transformadas foram plaqueadas sobre placas LB- agar105 contendo ampicilina e glicose. Todas as bibliotecas de fago continham >106 transformantes e tiveram uma frequência de inserção > 80%. As bactérias foram coletadas após o crescimento de um dia para o outro e foram usadas para preparar fagos, de acordo com os protocolos estabelecidos (de Haard et al., J Biol Chem. 25 de junho de 1999; 274 (26): 18218 - 30). Anticorpos direcionadores
[0395] Os anticorpos com cLC anti-EGFR e anti-PD-L1 foram obtidos usando métodos descritos anteriormente a partir de repertórios de anticorpos de fagos gerados a partir de camundongos MeMo® alvo imunizados com sucesso. Adicionalmente, métodos para gerar as cadeias VH de domínio variável de anticorpo para os anticorpos anti-
EGFR, incluindo anticorpos humanos sintéticos anti-EGFR, também têm sido descritos em pedidos pendentes que são aqui incorporados a título de referência: WO 2015/130173 A1; WO 2015/130172 A1. Imunização de camundongos Memo® com CDR3
[0396] Para a geração de anticorpos humanos que se ligam ao CD3, os camundongos transgênicos para a cadeia leve comum humana e para um minilocus de cadeia pesada (HC) humana (compreendendo uma seleção de segmentos gênicos V humanos, todos Ds humanos e todos Js humanos) (consulte WO2009/157771, aqui incorporado a título de referência) foram imunizados com lipopartículas contendo TCR/CD3 (Intergral Molecular). Esses camundongos são chamados de camundongos "MeMo®". Para determinadas regiões variáveis de cadeia pesada, ou multímeros trivalentes tendo as sequências reveladas na presente invenção, eles podem ser produzidos por qualquer um dos meios conhecidos pelos versados na técnica.
[0397] Camundongos Memo® foram imunizados com lipopartículas contendo 5D5M TCR/CD3 de humano, derivadas de Hek293T, seguido por células T humanas para a geração de uma resposta imune anti- TCR/CD3 e a geração de painel de anticorpos anti-TCR/CD3.
[0398] As lipopartículas concentram proteínas de membrana conformacionalmente intactas diretamente da superfície celular, permitindo que estas proteínas complexas sejam manipuladas como proteínas solúveis, de alta concentração, para a imunização com anticorpos e a triagem de anticorpos.
[0399] As lipopartículas utilizadas no presente estudo para imunização contêm a combinação 5D5M TCRαβ. As sequências de aminoácidos (SEQ ID NO: 289 e SEQ ID: 290) das lipopartículas TCR/CD3, derivadas de Hek293T, da combinação 5D5M TCRαβ, foram sintetizadas, clonadas e utilizadas para gerar lipopartículas, contendo esta combinação TCR/CD3, por transfecção transiente em células HEK293T (Intergral Molecular). 5D5M TCRα (SEQ ID NO: 289)
MWGVFLLYVSMKMGGTTGQNIDQPTEMTATEGAIVQINCTY QTSGFNGLFWYQQHAGEAPTFLSYNVLDGLEEKGRFSSFLSRSKGYSY LLLKELQMKDSASYLCAVMDSNYQLIWGAGTKLIIKPDIQNPDPAVYQLR DSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNS AVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNL
NFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 5D5M TCRβ (SEQ ID NO: 290)
MRIRLLCCVAFSLLWAGPVIAGITQAPTSQILAAGRRMTLRC TQDMRHNAMYWYRQDLGLGLRLIHYSNTAGTTGKGEVPDGYSVSRA NTDDFPLTLASAVPSQTSVYFCASSEAGGNTGELFFGEGSRLTVLEDL NKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKE VHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQV QFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLS ATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
[0400] Camundongos Memo® foram utilizados para imunizações usando lipopartículas TCR/CD3 e células T humanas primárias.
[0401] O cronograma de imunização contém pontos nos dias 35, 56, 77 e 98, onde o título sérico de Ig específica para antígeno foi determinado por ELISA usando lipopartículas positivas e negativas para 3SDX TCR/CD3, derivadas de QTG, usando detecção por IgG anti- camundongo e por ELISA usando proteína de fusão CD3c5E-Fc como um controle positivo. A reatividade foi observada em soros extraídos no dia 35, que determinará quais camundongos desenvolveram uma resposta anti-TCR/CD3 relevante.
[0402] Para todos os camundongos imunizados, material linfoide para descoberta de anticorpo foi coletado e armazenado quando: Títulos são 1/300 para TCR/CD3 de humano (em ELISA usando lipopartículas), ou: Títulos são < 1/300 e >1/100 para TCR/CD3 humano e não aumentaram durante a última imunização de reforço. Primoimunização usando lipopartículas
[0403] Para a obtenção da estimulação primária da resposta imune humoral nos camundongos Memo® para TCR/CD3, lipopartículas contendo a combinação 5D5M TCRαβ de humano foram utilizadas para imunização. As lipopartículas foram utilizadas juntas com adjuvante Gerbu para a primeira injeção e a segunda injeção. Imunizações de reforço usando célula T policlonais
[0404] Os camundongos foram imunizados por injeção subcutânea de suspensão celular. As primeiras imunizações de reforço (dia 28) compreenderam uma mistura de células em PBS com adjuvante e todas as injeções subsequentes são apenas compostas de células em PBS. Os camundongos que desenvolveram, no dia 35, títulos séricos de IgG de 1/300 contra TCR/CD3 humano (determinado por ELISA usando lipopartículas) receberam injeções adicionais com células nos dias 42, 43 e 44. Os camundongos que não atenderam a estes critérios recebem imunizações de reforço (dia 42 e dia 49) com células. Todas as imunizações subsequentes são administradas como injeções subcutâneas de células em PBS. Após a imunização final, os camundongos são mortos, sangrados para soro, e o baço e os linfonodos inguinais esquerdos são coletados. Triagem por ELISA de soros dos camundongos imunizados
[0405] Os títulos séricos provisórios de lgG foram triados por ELISA usando lipopartículas contendo TCR/CD3 e lipopartículas 'nulas'. Os títulos séricos de lgG foram determinados usando coloração com lgG anti- camundongo, porque foi comprovado que esta marcação é a mais sensível.
[0406] Domínios variáveis de ligação ao CD3 foram preparados usando a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de um CD3 MF das regiões CDR do mesmo conforme indicado nas SEQ ID NO: 92-154. Reclonagem dos cDNAs do vetor fagomídeo, que codificam VH, em vetores de expressão de IgG
[0407] Os cDNAs que codificam a VH de todos os clones específicos alvo foram sequenciados. Uma seleção de clones exclusivos com base na identidade de sequência e análise de agrupamentos foi, então, reclonada em diferentes vetores de expressão de IgG usando digestão com Sfi1-BstEII ou SfiI/XhoI e ligação do agrupamento de cDNAs digeridos no plasmídio de expressão de IgG de acordo com técnicas de biologia molecular padrão. Purificação de anticorpos do sobrenadante da cultura
[0408] O meio contendo anticorpos é coletado e centrifugado para remover os restos de células. Esferas de Sefarose-Proteína A são subsequentemente adicionadas ao meio. Meio e esferas de Sefarose- Proteína A são incubados com os anticorpos para permitir a ligação.
[0409] Após a incubação as esferas são isoladas do meio e lavadas, por um filtro de vácuo. Os anticorpos são eluídos das esferas pela incubação com tampão de eluição.
[0410] Opcionalmente, o tampão da IgG purificada é trocado/dessalinizado. Troca de tampão
[0411] Com o propósito de dessalinizar os anticorpos purificados, a fração de anticorpos é centrifugada utilizando uma placa de filtro ou uma coluna de filtro. A placa ou coluna é centrifugada para reduzir o volume da fração de anticorpos. Subsequentemente, PBS ou o tampão necessário é adicionado à fração para substituir o tampão por um tampão de baixa salinidade. Opcionalmente esta etapa de centrifugação seguida pela adição de tampão é repetida para adicionalmente dessalinizar o tampão de armazenamento dos anticorpos. Exemplo 9: Geração de anticorpos triespecíficos com um antígeno de célula tumoral no braço curto ou longo.
[0412] Anticorpos triespecíficos foram gerados por cotransfecção transiente de dois plasmídeos que codificam IgG com diferentes domínios VH, usando uma tecnologia de engenharia de CH3 para heterodimerização e formação eficientes de anticorpos triespecíficos. A cadeia leve comum também é cotransfectada na mesma célula, seja no mesmo plasmídeo ou em outro plasmídeo. Em nossos pedidos copendentes (por exemplo WO2013/157954 e WO2013/157953; aqui incorporados, a título de referência) foram revelados métodos e meios para produzir anticorpos multiespecíficos a partir de uma célula individual, pelos quais são fornecidos meios que favorecem a formação de anticorpos triespecíficos em relação à formação de anticorpos monoespecíficos. Estes métodos também podem ser favoravelmente utilizados na presente invenção para a geração de multímeros multivalentes, incluindo anticorpos triespecíficos.
[0413] Especificamente, as variações preferenciais para produzir predominantemente moléculas de IgG triespecíficas de comprimento completo são substituições de aminoácidos com referência a uma sequência de tipo selvagem nas posições 351 e 366, por exemplo, L351K e T366K (numeração de acordo com a numeração EU) no primeiro domínio CH3 (a cadeia pesada ‘variante KK’) e substituições de aminoácidos nas posições 351 e 368, por exemplo, L351D e L368E no segundo domínio CH3 (a cadeia pesada ‘variante DE’), ou vice-versa. Foi demonstrado anteriormente em nossos pedidos copendentes que a cadeia pesada variante-DE negativamente carregada e a cadeia pesada variante- KK positivamente carregada, de preferência, se emparelham para formar heterodímeros (as assim chamadas moléculas ‘DEKK’). A homodimerização de cadeias pesadas variantes-DE (homodímeros DE-
DE) ou de cadeias pesadas variantes-KK (homodímeros KK-KK) quase não ocorre devido à forte repulsão entre os resíduos carregados na interface CH3-CH3 entre as cadeias pesadas idênticas.
[0414] De acordo com a presente invenção, o domínio de ligação engatador de célula imune ou domínio de ligação ao antígeno tumoral pode estar localizado em qualquer posição na molécula multivalente, incluindo a posição distal ou interior do braço longo ou do braço curto, e a tecnologia de heterodimerização pode ser utilizada para gerar favoravelmente a molécula triespecífica em relação ao homodímero bivalente, monoespecífico, ou ao homodímero tetraespecífico.
[0415] Primeiro, foi demonstrado que um domínio de ligação ao antígeno de célula tumoral pode estar localizado na região distal ou interior do braço longo ou do braço curto.
[0416] Para cada um dos anticorpos triespecíficos e/ou trivalentes aqui descritos, a expressão é realizada mediante o crescimento em suspensão adaptado de células 293 que foram cultivadas em frascos T125 sobre uma placa agitadora até uma densidade de 3,0 x 106 células/mL. As células foram semeadas a uma densidade de 0,3 a 0,5 x 106 células viáveis/mL em cada poço de uma placa com 24 poços profundos. As células foram temporariamente transfectadas com uma mistura de dois plasmídeos que codificam diferentes anticorpos, clonados no sistema vetor proprietário. Sete dias após a transfecção, o sobrenadante celular foi coletado e filtrado através de um filtro de 0,22 µm. O sobrenadante estéril foi armazenado a 4°C até a purificação dos anticorpos triespecíficos.
[0417] Para um exemplo de uma molécula triespecífica tendo um domínio de ligação engatador de célula imune na posição interna do braço longo e um antígeno de célula tumoral no braço curto, o DNA que codifica o gene de VH para o domínio de ligação ao CD3 (MF8078), um conector da invenção e um domínio de ligação ao toxoide tetânico (TT) (MF1337) são clonados em um vetor que codifica o domínio CH3 positivamente carregado (KK), onde o DNA que codifica o gene VH para o domínio de ligação ao EGFR (MF8233) é clonado em um vetor que codifica o domínio CH3 negativamente carregado (DE) que codifica uma molécula triespecífica de EGFR x CD3:TT. As regiões variáveis de cadeia pesada para os três domínios de ligação são indicadas na Tabela 13, com a atividade para estas moléculas triespecíficas descrita nas Figuras 15a e 16a. Para estas moléculas triespecíficas, cada região variável de cadeia pesada emparelha-se com uma cadeia leve comum. SEQ ID NO: 29.
Tabela 13. EGFR x CD3: Mock braço DE braço KK Propósito Ligante utilizado SEQ ID do ligante MF8233 MF8078 IgG1 G4S 12 MF1337 amostra MF8233 MF8078 IgG1 H 19 MF1337 amostra MF8233 MF8078 IgG2A MH 4 MF1337 amostra MF8233 MF8078 IgG1 MH 11 MF1337 amostra MF8233 MF8078 IgG1 R 23 MF1337 amostra MF8233 MF8078 IgG1 UH 2 MF1337 amostra MF8233 MF8078 IgG1 UL 14 MF1337 amostra MF8233 MF8078 IgG2A H 15 MF1337 amostra
MF8233 MF8078 IgG2A R 20 MF1337 amostra MF8233 MF8078 IgG2B H 16 MF1337 amostra MF8233 MF8078 IgG2B R 21 MF1337 amostra MF1025 MF8078 IgG1 H* 19 MF1337 Controle Negativo MF1025 MF8078 IgG2 AMH 4 MF1337 Controle Negativo
[0418] Para um exemplo de um anticorpo triespecífico tendo um domínio de ligação engatador de célula imune na posição interior e um antígeno de célula tumoral na posição distal do braço longo, o DNA que codifica o gene VH para o domínio de ligação ao CD3 (MF8078), um ligante da invenção e o DNA que codifica o gene VH para o domínio de ligação ao EGFR (MF8233) são clonados em um vetor que codifica o domínio CH3 positivamente carregado (KK), onde o DNA que codifica o gene VH para o domínio de ligação à Tiroglobulina ("Thyro") (MF1025) é clonado em um vetor que codifica o domínio CH3 negativamente carregado (DE) que codifica uma molécula triespecífica de Thyro x CD3:EGFR. Figura 14b. As regiões variáveis de cadeia pesada para os três domínios de ligação são apresentadas na Tabela 14, com a atividade para estas moléculas triespecíficas descrita nas Figuras 15b e 16b. Para estas moléculas triespecíficas, cada região variável de cadeia pesada emparelha-se com uma cadeia leve comum. SEQ ID NO: 29.
Tabela 14. Mock x CD3: EGFR braço DE braço KK Propósito Ligante utilizado SEQ ID do ligante MF1025 MF8078 IgG1 G4S 12 MF8233 amostra
MF1025 MF8078 IgG1 H 19 MF8233 amostra MF1025 MF8078 IgG2A MH 4 MF8233 amostra MF1025 MF8078 IgG1 MH 11 MF8233 amostra MF1025 MF8078 IgG1 R 23 MF8233 amostra MF1025 MF8078 IgG1 UH 2 MF8233 amostra MF1025 MF8078 IgG1 UL 14 MF8233 amostra MF1025 MF8078 IgG2A H 15 MF8233 amostra MF1025 MF8078 IgG2A R 20 MF8233 amostra MF1025 MF8078 IgG2B H 16 MF8233 amostra MF1025 MF8078 IgG2B R 21 MF1337 Comparador tipo A MF1025 MF8078 IgG1 H 19 MF1337 Comparador tipo A MF1025 MF1122 IgG2 AMH 4 MF1337 Controle Negativo MF1025 MF8078 IgG1 H 19 MF1337 Controle Negativo MF1025 MF1122 IgG2 AMH 4 MF1337 Controle Negativo Exemplo 10: Efeito de posicionamento do domínio de ligação ao antígeno de célula tumoral no braço curto ou no braço longo para moléculas trivalentes engatadoras de célula T. Linhagens celulares
[0419] BxPC3 é uma linhagem celular de câncer pancreático humano.
[0420] HCT-116 é uma linhagem celular de carcinoma de cólon humano.
[0421] A série, acima, de IgGs triespecíficas foram geradas por produção em 24 poços que incorporou onze ligantes diferentes em IgGs triespecíficas contendo um domínio de ligação anti-EGFR no braço curto (Figura 14a e Tabela 13) e um domínio de ligação anti-EGFR no braço longo (Figura 14b e Tabela 14) e um conjunto de anticorpos de controle.
Estas moléculas foram avaliadas para a capacidade delas para causar ativação de células T e em um ensaio de citotoxicidade.
[0422] Usando Ficoll e o kit "EasySep" de isolamento de células T humanas de acordo com técnicas padrão, as células T em repouso foram isoladas de sangue inteiro de doadores saudáveis, checadas para > 95% de pureza de células T pelo anticorpo anti-CD3 usando análise citométrica de fluxo e foram subsequentemente criopreservadas. Para um ensaio de citotoxicidade, as células T criopreservadas foram descongeladas e utilizadas, se a viabilidade delas foi > 90% após o descongelamento, determinada pela coloração padrão com Azul de Tripano. Ensaio de citotoxicidade de modo resumido, as células T em repouso, descongeladas, e as células alvo BxPC3 (Figura 15) ou HCT116 (Figuras 16 e 17) foram cocultivadas em uma razão E:T de 5:1 durante 48 horas. Para os anticorpos trivalentes, foi utilizada uma série de diluições de 3 vezes em 6 etapas começando em uma concentração de 4 µg/mL. Anticorpos biespecíficos EGFRxCD3 foram utilizados como um controle positivo; anticorpos trivalentes MockxMock:Mock, MockxCD3:Mock e EGFRxMock:Mock foram utilizados para controles de especificidade. A ativação de células T foi quantificada por citometria de fluxo; as células T CD4 e CD8 foram agrupadas em janela de análise com base na expressão de CD4 e de CD8 e subsequentemente analisadas quanto ao estado de ativação delas pela medição da expressão de CD25 e de CD69 sobre as células T. A lise de células alvo foi determinada pela medição da fração de células vivas pela medição dos níveis de ATP avaliados por CellTiterGlo (Promega). Níveis de ATP, medidos por luminescência em um leitor de placa de microtitulação Envision resulta em valores de Unidade de Luz Relativa (ULR), que foram analisados usando GraphPad Prism.
[0423] A lise de célula alvo para cada amostra foi calculada como segue: %Extermínio = (100 - (ULR da amostra/URL sem IgG) × 100).
[0424] Estes dados relativos à ativação de células T (consulte a Figura 15) e à citotoxicidade de células T (Figura 16) demonstram que os anticorpos triespecíficos são funcionais. Conforme mostrado nas Figuras 15 e 16, é demonstrado que as moléculas triespecíficas MockxCD3:EGFR e EGFRxCD3:Mock são capazes de induzir a ativação e a citotoxicidade de células T específicas para o alvo EGFR. Quando o Fab anti-EGFR estava posicionado na posição distal no braço longo, a molécula triespecífica MockxCD3:EGFR mostrou atividade intensificada em relação tanto à molécula biespecífica EGFRxCD3 quanto à molécula triespecífica tendo o domínio de ligação ao EGFR no braço curto e o domínio de ligação ao CD3 e ao TT (MF1337) no braço longo (consulte a Figura 14a), em termos tanto de ativação de células T (Figura 15.) quanto de citotoxicidade de células T (Figura 16).
[0425] Adicionalmente, com base na atividade dos anticorpos triespecíficos tendo EGFR e CD3 no braço longo, os ligantes podem estar posicionados naqueles que se correlacionam com produção de citocinas relativamente alta (IgG1 UH (SEQ ID NO: 2), IgG1 MH (SEQ ID NO: 11), IgG2A MH (SEQ ID NO: 4) e IgG1 G4S (SEQ ID NO: 12)) e naqueles que se correlacionam com produção de citocinas relativamente baixa (IgG1 UL (SEQ ID NO: 14), IgG2A H (SEQ ID NO: 15), IgG2B R (SEQ ID NO: 21), IgG2A R (SEQ ID NO: 20), IgG1 H (SEQ ID NO: 19), IgG1R (SEQ ID NO: 23)) conforme mostrado nas Figuras 17b-d. A alteração no uso de ligante e a influência sobre a citotoxicidade foram menos pronunciadas. Figura 17a. Exemplo 11: Geração de anticorpos triespecíficos com um domínio de ligação engatador de célula imune no braço curto ou no braço longo.
[0426] De acordo com a presente invenção, o domínio de ligação engatador de célula imune pode estar posicionado em qualquer posição na molécula multivalente, incluindo a posição distal ou interior do braço longo ou do braço curto, e a tecnologia de heterodimerização pode ser utilizada para favoravelmente gerar a molécula trivalente. Consulte a Figura 18 (domínio de ligação ao CD3 no braço curto), a Figura 19 (domínio de ligação ao CD3 na posição interior do braço longo) e a Figura 25 (domínio de ligação ao CD3 na posição distal do braço longo).
[0427] Por exemplo, um domínio de ligação que se engata à célula imune está posicionado no braço curto, onde o DNA que codifica o gene de VH para o domínio de ligação ao CD3 (MF8078) é clonado em um vetor que codifica o domínio CH3 positivamente carregado (KK), onde o DNA que codifica o gene de VH para o domínio de ligação ao EGFR (MF9988 (SEQ ID NO:218) ou MF9891 (SEQ ID NO:191)), o ligante de IgG2A MH e o gene de VH para o domínio de ligação a PD-L1 (MF5380 (SEQ ID NO:173) ou MF5444 (SEQ ID NO:164)) é clonado em um vetor que codifica o domínio CH3 negativamente carregado (DE). Figura 8 (CD3xPD-L1:EGFR).
Tabela 15 CD3xPD-L1:EGFR braço KK braço DE MF8078 MF5380 MF9988 MF8078 MF5380 MF9891 MF8078 MF5444 MF9988 MF8078 MF5444 MF9891
[0428] Alternativamente, um domínio de ligação que se engata à célula imune está posicionado na posição interna do braço longo, onde o DNA que codifica o gene de VH para um domínio de ligação ao CD3 (MF8078), o ligante de IgG2A MH (SEQ ID NO:4) e um gene de VH para um domínio de ligação a PD-L1 (MF5444 (SEQ ID NO:164), MF5380 (SEQ ID NO:173), MF5377 (SEQ ID NO:155)) é clonado em um vetor que codifica o domínio CH3 positivamente carregado (KK), onde o DNA que codifica o gene de VH para um domínio de ligação ao EGFR (MF9886 (SEQ ID NO:200), MF9988 (SEQ ID NO:218), MF9891 (SEQ ID NO:191) ou MF9873 (SEQ ID NO:209)) é clonado em um vetor que codifica o domínio CH3 negativamente carregado (DE). Figura 19 (EGFRxCD3:PD-L1).
Tabela 16 EGFRxCD3:PD-L1 braço DE braço KK MF9988 MF8078 MF5444 MF9988 MF8078 MF5380
MF9886 MF8078 MF5380 MF9988 MF8078 MF5377 MF9886 MF8078 MF5377 MF9891 MF8078 MF5377 MF9873 MF8078 MF5377 MF9891 MF8078 MF5380 MF9873 MF8078 MF5380 MF9891 MF8078 MF5444 MF9873 MF8078 MF5444 MF1337 MF8078 MF5377 MF1337 MF8078 MF5380 MF1337 MF8078 MF5444 MF9886 MF8078 MF1337 MF9988 MF8078 MF1337 MF9891 MF8078 MF1337 MF9873 MF8078 MF1337 Anticorpos de Controle MF1337 MF8078 - MF8233 MF8078 -
[0429] Alternativamente, um domínio de ligação que se engata à célula imune está posicionado na posição distal do braço longo, onde o DNA que codifica o gene de VH para um domínio de ligação ao CD3 (MF8078 (SEQ ID NO:110), MF8508 (SEQ ID NO: 128) ou MF8057 (SEQ ID NO: 92)) um ligante de IgG 1H (SEQ ID NO:19) e um gene de VH para um domínio de ligação ao fibrinogênio ("Fibri") (MF1025) é clonado em um vetor que codifica o domínio CH3 positivamente carregado (KK), onde o DNA que codifica o gene de VH para um domínio de ligação ao
EGFR (MF8233) é clonado em um vetor que codifica o domínio CH3 negativamente carregado (DE). Figura 24 (EGFRxFibri:CD3).
Tabela 17 EGFRxFibri:CD3 braço DE braço KK Ligante Sequência utilizado do ligante MF8233 MF1122 IgG1H 19 MF8078 MF8233 MF1122 IgG1H 19 MF8508 MF8233 MF1122 IgG1H 19 MF8057
[0430] Para cada uma das moléculas triespecíficas descritas acima, e apresentadas nas Figuras 18, 19 e 24, cada região variável de cadeia pesada emparelha-se com uma cadeia leve comum. SEQ ID NO: 29.
[0431] Conforme descrito adicionalmente abaixo, foi demonstrado que cada posicionamento de domínio de ligação ao CD3 é eficaz na geração de ativação e citotoxicidade de células T contra células que expressam um ou mais antígenos de células tumorais extracelularmente expostos. Exemplo 12: Ligação ao antígeno tumoral duplo eficaz e engajamento de células T via CD3 para o formato triespecífico EGFRxCD3:PD-L1.
[0432] Linhagens celulares: células MDA-MB-231 (ATCC® HTB-26) são células de câncer de mama; derivadas do sítio metastático.
[0433] Anticorpos triespecíficos foram produzidos de acordo com o formato na Figura 19 para analisar a capacidade de tais moléculas para realizar simultaneamente o reconhecimento de antígenos tumorais e o engate à célula T por meio da citotoxicidade. Estes anticorpos foram gerados pelas técnicas descritas acima.
[0434] Quatro Fabs anti-EGFR (MF9886, MF9988, MF9891, MF9873) com uma faixa de afinidades de relativamente baixa a alta foram utilizados para o braço curto e foram combinados com diferentes Fabs anti-PD-L1 (MF5444, MF5380 e MF5377) que também contêm uma faixa de afinidades de baixa a alta para o braço longo distal. O Fab anti-CD3 e o ligante foram mantidos constantes, usando MF8078, e o ligante IgG2 AMH (SEQ ID NO: 4).
[0435] A classificação para as afinidades por EGFR e por PD-L1 foi baseada em dados de ligação das Tabelas 18 e 19, respectivamente; a classificação foi baseada na ligação relativa a um anticorpo anti-EGFR e anti PD-L1 de referência conforme descrito abaixo.
Tabela 18 Painel de anticorpos bivalentes, monoespecíficos anti-EGFR que têm as cadeias pesadas MF9886, MF9988, MF9891, MF9873. MF Células MDA-MB-231 (%) 9886 10,7 9988 21,0 9891 44,2 9873 82,5 8233 100
[0436] A classificação de afinidade de cadeias pesadas anti-EGFR é baseada na capacidade relativa destes anticorpos bivalentes e monoespecíficos de se ligarem às células que expressam EGFR, conforme apresentado acima, em comparação com o controle positivo de um anticorpo bivalente e monoespecífico, que tem a cadeia pesada MF8233.
Tabela 19. Painel de anticorpos bivalentes, monoespecíficos anti-PD-L1 que têm as cadeias pesadas MF5444, MF5380 e MF5377 Cadeia pesada anti-PD-L1 Liga-se a huPD-L1 Razão CE50/CE50 RG7446 MF5377 Sim 3,09 MF5380 Sim 3,67 MF5444 Sim 5,46
[0437] A classificação de afinidade relativa dos braços de cadeia pesada anti-PD-L1 é baseada na capacidade de se ligar ao PD-L1 humano em ELISA. Para esta finalidade, placas de ELISA foram revestidas com huPD-L1-His (Sinobiological) em uma faixa de diluições de titulação de 3 vezes, em 8 etapas, começando em 10 µg/mL. Subsequentemente, a ligação de cada Fab anti-PD L1 foi avaliada como uma PD-L1xTT IgG a 5 µg/mL. CE50s para ligação foram determinadas, e normalizadas para a CE50 de ligação conforme determinada para RG7446 MPDL3280A anti- PD-L1, consulte US 2010/0203056, presente em cada placa de ELISA.
[0438] Estas moléculas triespecíficas EGFRxCD3:PD-L1 foram então testadas para verificar a capacidade delas para induzir citotoxicidade com base em métodos anteriormente descritos na presente invenção contra duas linhagens celulares (HCT116 e MDA- MB-231) que têm diferentes densidades antigênicas para os antígenos de células tumorais. Os perfis de expressão destas linhagens celulares foram determinados usando coloração para FACS pelo uso de anticorpos de controle (cetuximabe para EGFR, e MPDL3280A para PD-L1) que foram considerados positivos para a expressão do antígeno de interesse quando a intensidade média de fluorescência (IMF) foi 3x mais alta que o sinal de fundo. Triplicatas foram realizadas para PD-L1 e quadruplicatas para EGFR, e os resultados foram relatados como IMF conforme apresentados abaixo.
Tabela 20 Linhagem celular EGFR (IMF) PD-L1 (IMF) HCT116 178.523 10.876 MDA-MB-231 276.915 74.581
[0439] Este estudo que examina a citotoxicidade das moléculas triespecíficas contra estas linhagens celulares mostra que todos os três domínios de ligação das moléculas triespecíficas EGFRxCD3:PD-L1 são capazes de ligação simultânea aos dois antígenos de células tumorais e ao CD3, de modo que ambos os domínios de ligação aos antígenos tumorais da molécula triespecífica contribuem para citotoxicidade mediante o engate de célula T. Figuras 20 e 21 (contra células MDA-MB- 231) e Figura 22 (contra células HCT116). Estas moléculas triespecíficas geralmente mostraram atividade funcional intensificada em relação aos controles biespecíficos EGFRxCD3xMock e MockxCD3xPD-L1, com a molécula triespecífica 9873x8078: 5377 mostrando a mais alta porcentagem de lise. Figura 21. As moléculas triespecíficas testadas aqui são mais potentes contra células MDA-MB-231 que têm níveis de antígeno alvo relativamente altos em comparação com as células HCT116. Figura 21 e Figura 22. Exemplo 13: Ligação ao antígeno tumoral duplo eficaz e engate de célula T via CD3 para o formato triespecífico de CD3xPD-L1:EGFR.
[0440] Anticorpos triespecíficos foram produzidos de acordo com o formato na Figura 18 para mostrar adicionalmente o reconhecimento simultâneo de antígenos tumorais onde o domínio de ligação que se engata à célula imune está presente no braço curto. Estes anticorpos foram gerados pelas técnicas descritas acima. Para este formato, a ligação correlacionada ao reconhecimento de dois antígenos foi demonstrada, de modo que com o aumento da afinidade por PD-L1 houve uma intensificação contínua da ligação às células alvo, conforme medida por FACs em células MDA-MB-231 conforme observado para moléculas CD3xPD-L1:EGFR. Figura 23a. Para certas destas moléculas triespecíficas tendo o formato de CD3xPD-L1:EGFR, tem sido demonstrado que a ligação a dois antígenos e o engate de célula imune simultâneos têm um efeito aditivo sobre a citotoxicidade de células BxPC3 em relação às moléculas de ligação a um único antígeno e ao CD3 (sequências de cadeias pesadas não mostradas) que verifica a capacidade destas moléculas para engatarem todos os três braços de ligação simultaneamente. Figura 23b. O protocolo para o ensaio de citotoxicidade para estes dados é descrito acima.
Exemplo 14: Ativação eficaz de células T via CD3 no braço longo distal, para o formato triespecífico de EGFRxFibrinogênio:CD3.
[0441] Células Jurkat-NFAT-RE-luc2 (Promega) são uma linhagem de célula T Jurkat geneticamente modificada que expressa um repórter luciferase ativado por um elemento de resposta ao NFAT (NFAT-RE). HT29 (ATCC HTB-38) é uma célula de câncer de cólon humano.
[0442] Um estudo foi realizado para posicionar o domínio de ligação ao CD3 na região distal do braço longo, com uma molécula trivalente de EGFR(MF8233)xFibrinogênio(MF1122):CD3(MF8078). Figura 24. Realização de um ensaio de ativação de células T em células Jurkat- NFAT-RE-luc2 contra a célula alvo HT29 para estabelecer a capacidade funcional de ativação de células T para este formato. O ensaio repórter de modo resumido: Células T efetoras Jurkat foram coincubadas com as células alvo na presença de uma faixa de concentrações de anticorpos triespecíficos e de anticorpos de controle. Após 5 horas de incubação, a atividade de Luciferase das células repórter foi medida como uma leitura para a ativação de células T, usando o sistema de ensaio Bio-Glo Luciferase (Promega). A atividade de luminescência foi medida em um leitor de placa de microtitulação Envision em valores de Unidade de Luz Relativa (ULR), que foram analisados usando GraphPad Prism.
[0443] Conforme mostrado na Figura 25, a ativação de células T pelas moléculas triespecíficas EGFRxFibri:CD3 foi demonstrada em níveis iguais ou maiores que o controle positivo, que é um anticorpo EGFRxCD3 demonstrado anteriormente que gera a ativação de células T na Figura 15a.
Exemplo 15: Ligação eficaz ao antígeno tumoral eficaz e engate de célula T via CD3 para um conjunto de domínios de ligação ao CD3 e ligantes
[0444] Um painel de moléculas trivalentes biespecíficas EGFRxCD3:EGFR foi gerado (Figura 26) para demonstrar a eficácia de reconhecimento de tumor e engate de célula T através de uma variedade de diferentes domínios de ligação engatadores de célula imune, e de ligação ao CD3, e oito ligantes diferentes. Cada molécula trivalente continha dois dos mesmos domínios de ligação anti-EGFR (MF9891) no braço curto e na posição distal do braço longo, com o domínio de ligação ao CD3 na posição interior, do braço longo. Para este estudo, uma linhagem de células repórter de células Jurkat-NFAT-RE-luc2, e células alvo HCT116 (expressão intermediária de EGFR) e MDA-MB-231, foram utilizadas para medir a ativação de células T, pelos métodos anteriormente descritos. Para um controle negativo, moléculas trivalentes usando um domínio de ligação ao CD3 de diferentes superagrupamentos foram produzidas MockxCD3xMock ou as moléculas biespecíficas (EGFR (MF8233) xTT (MF1337)) (4.000 ng/mL). A leitura baseou-se na ativação de repórter após 5 horas de incubação.
[0445] Cada CD3 testado de vários superagrupamentos demonstrou atividade repórter usando células HCT116, com um domínio de ligação ao CD3 do superagrupamento 7 demonstrando a atividade repórter relativa mais baixa, enquanto que evidencia um espectro de atividade com base nos braços ligantes. Em contraste, os dois domínios de ligação ao CD3 do superagrupamento 1 (MF8058 e MF8078) e um domínio de ligação ao CD3 do superagrupamento 4 (MF8508) demonstraram atividade relativamente consistente independente do braço ligante. Finalmente, um domínio de ligação ao CD3 do superagrupamento 1 (MF8057) evidenciou atividade repórter relativamente baixa, que forneceu alguma diferenciação associada com diferentes ligantes. Consulte a Figura 27. Uma revisão destes dados indica que as moléculas trivalentes contendo o ligante IgG1 MH parecem ser consistentemente as mais potentes dentre os superagrupamentos.
[0446] De modo similar, cada domínio de ligação ao CD3 testado dos vários superagrupamentos demonstrou atividade repórter usando células MDA-MB-231, com os domínios de ligação ao CD3 do superagrupamento 7 demonstrando atividade repórter relativamente baixa, com um espectro de atividade com base no ligante utilizado. Em contraste, os três domínios de ligação ao CD3 do superagrupamento 1 (MF8057, MF8058 e MF8078) e o domínio de ligação ao CD3 do superagrupamento 4, demonstraram atividade relativamente similar independentemente do ligante utilizado. Consulte a Figura 28.
Tabela 21 Cadeias pesadas de IgG para a geração de moléculas biespecíficas. Tabela 21A: Região CH1. Tabela 21B: região de dobradiça. Tabela 21C: Região CH2. Tabela 21D: CH2 contendo substituições de silenciamento L235G e G236R. Tabela 21E: Domínio CH3 contendo as substituições L351K e T366K (KK). Tabela 21F Domínio CH3 contendo substituições L351D e L368E (DE).
Tabela 21A CH1: gctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctggg
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSG ggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcg
GTAALGCLVKDYFPEPVTVS tggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctca
WNSGALTSGVHTFPAVLQSS ggactctactccctcagcagcgtcgtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacc
GLYSLSSVVTVPSSSLGTQT Tacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagtt (SEQ ID NO: 291) YICNVNHKPSNTKVDKRV (SEQ ID NO: 292) Tabela 21B Dobradiça: Gagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgccca (SEQ ID NO: 293) EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 294) Tabela 21C CH2: gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacacc
APELLGGPSVFLFPPKPKDT ctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagac
LMISRTPEVTCVVVDVSHED cctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaag
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTK ccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcac
PREEQYNSTYRVVSVLTVLH caggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc
QDWLNGKEYKCKVSNKALPA Cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaa (SEQ ID NO: 295)
PIEKTISKAK (SEQ ID NO: 296) Tabela 21D CH2 contendo substituições de silenciamento L235G e G236R: gcacctgaactcggcaggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacacc
APELGRGPSVFLFPPKPKDT ctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagac
LMISRTPEVTCVVVDVSHED cctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaag
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTK ccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcac
PREEQYNSTYRVVSVLTVLH caggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc
QDWLNGKEYKCKVSNKALPA Cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaa (SEQ ID NO: 297) PIEKTISKAK (SEQ ID NO: 298) Tabela 21E CH3: KK de DEKK gggcagccccgagaaccacaggtgtacaccaagcccccatcccgggaggagatgaccaag
GQPREPQVYTKPPSREEMTK aaccaggtcagcctgaagtgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag
NQVSLKCLVKGFYPSDIAVE tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactcc
WESNGQPENNYKTTPPVLDS gacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcagggg
DGSFFLYSKLTVDKSRWQQG aacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagc
NVFSCSVMHEALHNHYTQKS ctctccctgtctccgggttga (SEQ ID NO: 299) LSLSPG- (SEQ ID NO: 300)
Tabela 21F CH3: DE de DEKK gggcagccccgagaaccacaggtgtacaccgaccccccatcccgggaggagatgaccaag
GQPREPQVYTDPPSREEMTK aaccaggtcagcctgacctgcgaggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag
NQVSLTCEVKGFYPSDIAVE tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactcc
WESNGQPENNYKTTPPVLDS gacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcagggg
DGSFFLYSKLTVDKSRWQQG aacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagc
NVFSCSVMHEALHNHYTQKS ctctccctgtctccgggttga (SEQ ID NO: 301) LSLSPG- (SEQ ID NO: 302)

Claims (83)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo multivalente, caracterizado por compreender: - uma porção anticorpo de base que compreende dois domínios de ligação; e - ao menos um domínio de ligação adicional, sendo que a porção anticorpo de base é conectada por um ligante a ao menos um domínio de ligação adicional, sendo que cada domínio de ligação da porção anticorpo de base e cada um de ao menos um dos domínios de ligação adicionais têm, todos, uma região variável comum, e sendo que o ligante compreende uma sequência de dobradiça ou uma sequência derivada de uma sequência de dobradiça.
2. Anticorpo multivalente, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ao menos um domínio de ligação adicional compreender um domínio Fv, um domínio Fab ou um domínio Fab modificado.
3. Anticorpo multivalente, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ao menos um domínio de ligação adicional compreender uma região CH1 e estar conectado à porção anticorpo de base pelo dito ligante, que conecta uma região variável da porção anticorpo de base e a região CH1.
4. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a região variável comum estar sob a forma de uma cadeia leve comum que compreende VL-CL.
5. Anticorpo multivalente, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a cadeia leve comum compreender a sequência da SEQ ID NO: 29.
6. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a região variável comum estar sob a forma de uma cadeia pesada comum que compreende VH-CH1.
7. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por cada domínio de ligação da porção anticorpo de base se ligar a um epítopo diferente.
8. Anticorpo multivalente de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se ligar a ao menos três epítopos diferentes.
9. Anticorpo multivalente, caracterizado por compreender: - uma porção anticorpo de base que compreende dois domínios de ligação; e - ao menos um domínio de ligação adicional, sendo que ao menos um domínio de ligação adicional compreende uma região CH1 e é conectado à porção anticorpo de base pelo dito ligante, que conecta uma região variável da porção anticorpo de base e a região CH1, e sendo que o anticorpo multivalente se liga a ao menos três epítopos diferentes.
10. Anticorpo multivalente, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por cada domínio de ligação da porção anticorpo de base e cada um de ao menos um dos domínios de ligação adicionais terem, todos, uma região variável comum.
11. Anticorpo multivalente, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado por ao menos um domínio de ligação adicional compreender um domínio Fv, um domínio Fab ou um domínio Fab modificado.
12. Anticorpo multivalente, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado por a região variável comum estar sob a forma de uma cadeia leve comum que compreende VL-CL.
13. Anticorpo multivalente, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a cadeia leve comum compreender a sequência da SEQ ID NO: 29.
14. Anticorpo multivalente, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado por a região variável comum estar sob a forma de uma cadeia pesada comum que compreende VH-CH1.
15. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizado por cada domínio de ligação da porção anticorpo de base se ligar a um epítopo diferente.
16. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o ligante compreender uma sequência conforme apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 24 ou um polipeptídeo que tem ao menos cerca de 85% de identidade de sequência com qualquer uma das mesmas.
17. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a porção anticorpo de base ser uma imunoglobulina de comprimento completo.
18. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por os domínios de ligação da porção anticorpo de base serem domínios Fab.
19. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a porção base do anticorpo compreender um primeiro domínio CH3 que dimeriza com um segundo domínio CH3, o primeiro dos quais compreende um resíduo de aminoácido lisina nas posições 351 e 366 ou nas posições correspondendo às mesmas e o segundo dos quais compreende os resíduos de aminoácidos de ácido aspártico em 351 e de ácido glutâmico em 368 ou nas posições correspondendo às mesmas.
20. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por as regiões variáveis comuns dos domínios de ligação do dito anticorpo serem codificadas por um ácido nucleico que é obtido de, derivado de ou baseado em um ácido nucleico codificado por um roedor transgênico que compreende uma sequência de ácidos nucleicos de cadeia variável rearranjada em sua linhagem germinativa.
21. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por cada domínio Fab da porção anticorpo de base estar conectado via um ligante a um domínio de ligação adicional.
22. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a extremidade N-terminal de um domínio de ligação da porção anticorpo de base estar conectada à extremidade C-terminal de um domínio de ligação adicional via um ligante.
23. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por uma extremidade N- terminal do primeiro domínio de ligação da porção anticorpo de base ser conectada a uma extremidade C-terminal de um primeiro domínio de ligação adicional via um ligante e sendo que uma extremidade N- terminal do segundo domínio de ligação adicional da porção anticorpo de base é unida a uma extremidade C-terminal de um segundo domínio de ligação adicional via um ligante.
24. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado por uma extremidade N-terminal do primeiro domínio de ligação da porção anticorpo de base ser conectada a uma extremidade C-terminal de um primeiro domínio de ligação adicional via um ligante e sendo que uma extremidade C-terminal de um segundo domínio de ligação adicional é conectada a uma extremidade N-terminal do primeiro domínio de ligação adicional via um ligante.
25. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ser capaz de se ligar a ao menos quatro epítopos diferentes.
26. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ser capaz de se ligar a ao menos dois antígenos diferentes.
27. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por pelo menos um domínio de ligação adicional ser um domínio Fab e o dito domínio Fab adicional compreender uma região CH1 que é de uma subclasse diferente comparada com a região CH1 da porção anticorpo de base.
28. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o ligante ser curto, longo, carregado, rígido ou flexível.
29. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a sequência de aminoácidos do ligante compreender uma sequência de ocorrência natural ou compreender uma sequência derivada de uma sequência de ocorrência natural.
30. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o ligante compreender uma sequência de região de dobradiça intermediária.
31. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o ligante compreender uma sequência de dobradiça superior e uma sequência de dobradiça inferior.
32. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o ligante compreender uma sequência formadora de hélice.
33. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado por o ligante compreender uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 24.
34. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ao menos um domínio de ligação adicional compreender um domínio CH1.
35. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ao menos um dos domínios de ligação se ligar especificamente a um antígeno sobre uma célula efetora imune.
36. Anticorpo multivalente, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado por a célula efetora imune ser uma célula T.
37. Anticorpo multivalente, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado por o antígeno sobre a dita célula T ser CD3.
38. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 37, caracterizado por ao menos um dos domínios de ligação se ligar especificamente a um antígeno sobre uma célula aberrante.
39. Anticorpo multivalente, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por ao menos dois domínios de ligação se ligarem especificamente a um antígeno sobre uma célula aberrante.
40. Anticorpo multivalente, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado por ao menos dois domínios de ligação se ligarem especificamente a ao menos dois antígenos diferentes sobre uma célula aberrante.
41. Anticorpo multivalente, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por os ao menos dois domínios de ligação se ligarem especificamente a ao menos EGFR e PD-L1.
42. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 41, caracterizado por um primeiro domínio de ligação se ligar especificamente ao PD-L1; um segundo domínio de ligação se ligar especificamente ao CD3, e um terceiro domínio de ligação se ligar especificamente ao EGFR.
43. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 42, caracterizado por a célula aberrante ser uma célula tumoral.
44. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 43, caracterizado por o anticorpo base compreender os domínios de ligação 1 e 2 e sendo que o domínio de ligação adicional 3 é ligado ao domínio de ligação 1 e sendo que um domínio de ligação adicional opcional 4 é ligado ao domínio de ligação 2.
45. Anticorpo multivalente, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado por o domínio de ligação 1 ser um domínio de ligação ao CD3 e os domínios de ligação 2 e 3 se ligarem aos diferentes antígenos da célula alvo.
46. Anticorpo multivalente, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado por o domínio de ligação 2 ser um domínio de ligação ao CD3 e os domínios de ligação 1 e 3 se ligarem aos diferentes antígenos da célula alvo.
47. Anticorpo multivalente, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado por o domínio de ligação 3 ser um domínio de ligação ao CD3 e os domínios de ligação 1 e 2 se ligarem aos diferentes antígenos da célula alvo.
48. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 47, caracterizado por compreender um domínio de ligação 4 que se liga a ainda um outro diferente antígeno da célula alvo.
49. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 48, caracterizado por um primeiro do dito domínio de ligação ao antígeno de célula alvo se ligar a PD-L1, EGFR, CD137, CLEC12A, fibrinogênio, ou tiroglobulina.
50. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 49, caracterizado por os ditos primeiro e segundo domínios de ligação à célula alvo se ligarem a antígenos diferentes.
51. Anticorpo multivalente, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado por um primeiro e um segundo dos ditos domínios de ligação ao antígeno da célula alvo se ligarem aos antígenos selecionados dentre PD-L1, EGFR, CD137, CLEC12A, fibrinogênio, e tiroglobulina.
52. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das 44 a 51, caracterizado por o domínio de ligação ao CD3 compreender uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos das CDR1,
CDR2 e CDR3 de MF8057, ou de MF8058, ou de MF8078, ou de MF8397, ou de MF8508, ou de MF9249 ou de MF9267.
53. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 52, caracterizado por o domínio de ligação ao CD3 compreender uma região variável de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da VH de MF8057, de MF8058, de MF8078, de MF8397, de MF8508, de MF9249 ou de MF9267 com 0 a 10, de preferência, 0 a 5 inserções, deleções, substituições, adições de aminoácidos ou uma combinação das mesmas em uma ou mais posições diferentes das CDRs.
54. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 53, caracterizado por um domínio de ligação ao antígeno da célula alvo ser um domínio de ligação ao PD-L1.
55. Anticorpo multivalente, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado por o domínio de ligação ao PD-L1 compreender uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos das CDR1, CDR2 e CDR3 de MF5377, ou de MF5444, ou de MF5380.
56. Anticorpo multivalente, de acordo com a reivindicação 54 ou a reivindicação 55, caracterizado por o domínio de ligação ao PD-L1 compreender uma região variável de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da VH de MF5377, de MF5444, ou de MF5380 com 0 a 10, de preferência, 0 a 5 inserções, deleções, substituições, adições de aminoácidos ou uma combinação das mesmas em uma ou mais posições diferentes das CDRs.
57. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 56, caracterizado por um domínio de ligação ao antígeno de célula alvo ser um domínio de ligação ao EGFR.
58. Anticorpo multivalente, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado por o domínio de ligação ao EGFR compreender uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos das CDR1, CDR2 e CDR3 de MF8233, ou de MF9891, ou de MF9886, ou de MF9873, ou de MF9988.
59. Anticorpo multivalente, de acordo com a reivindicação 57 ou a reivindicação 58, caracterizado por o domínio de ligação ao EGFR compreender uma região variável de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da VH de MF8233, de MF9891, de MF9886, de MF9873, ou de MF9988 com 0 a 10, de preferência, 0 a 5 inserções, deleções, substituições, adições de aminoácidos ou uma combinação das mesmas em uma ou mais posições diferentes das CDRs.
60. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 44 a 59, caracterizado por um domínio de ligação ao antígeno de célula alvo ser um domínio de ligação ao CLEC12A.
61. Anticorpo multivalente, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado por o domínio de ligação ao CLEC12A compreender uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos das CDR1, CDR2 e CDR3 de MF4327.
62. Anticorpo multivalente, de acordo com a reivindicação 60 ou a reivindicação 61, caracterizado por o domínio de ligação ao CLEC12A compreender uma região variável de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da VH de MF4327 com 0 a 10, de preferência, 0 a 5 inserções, deleções, substituições, adições de aminoácidos ou uma combinação das mesmas em uma ou mais posições diferentes das CDRs.
63. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 52 a 62, caracterizado por compreender um domínio de ligação ao CD3, um domínio de ligação ao EGFR e um domínio de ligação ao PD-L1.
64. Método para a preparação de um anticorpo multivalente, sendo o método caracterizado por compreender: fornecer uma célula que compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos que são capazes de montagem em um anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 63; e cultivar a dita célula hospedeira sob condições para fornecer a expressão dos polipeptídeos e para a montagem deles em um anticorpo multivalente.
65. Método para a preparação de um anticorpo multivalente, sendo o método caracterizado por compreender: fornecer uma célula que compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos que são capazes de montagem em: (i) uma porção anticorpo de base que compreende dois domínios de ligação; (ii) ao menos um domínio de ligação adicional; e (iii) ao menos um ligante que compreende uma sequência de dobradiça ou uma sequência derivada de uma sequência de dobradiça, cultivar a dita célula hospedeira sob condições para produzir a expressão da porção anticorpo de base, do ao menos um domínio de ligação adicional e do ao menos um ligante e para a montagem deles em um anticorpo multivalente, sendo que, mediante a montagem, a porção anticorpo de base é conectada por um ligante a ao menos um domínio de ligação adicional e sendo que cada domínio de ligação da porção anticorpo de base de cada um de ao menos um dos domínios de ligação adicionais têm, todos, uma região variável comum.
66. Método para a preparação de um anticorpo multivalente, sendo o método caracterizado por compreender: fornecer uma célula que compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos que são capazes de montagem em: (i) uma porção anticorpo de base que compreende dois domínios de ligação; (ii) ao menos um domínio de ligação adicional; e (iii) ao menos um ligante, cultivar a dita célula hospedeira sob condições para produzir a expressão da porção anticorpo de base, do ao menos um domínio de ligação adicional e do ao menos um ligante e para a montagem deles em um anticorpo multivalente, sendo que, mediante a montagem, a porção anticorpo de base é conectada por um ligante a ao menos um domínio de ligação adicional, sendo que cada domínio de ligação da porção anticorpo de base e cada um de ao menos um dos domínios de ligação adicionais têm, todos, uma região variável comum e sendo que o anticorpo multivalente se liga a ao menos três epítopos diferentes.
67. Método para a preparação de um anticorpo multivalente, sendo o método caracterizado por compreender: fornecer uma célula que compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos que são capazes de montagem em: (i) uma porção anticorpo de base que compreende dois domínios de ligação; (ii) ao menos um domínio de ligação adicional; e (iii) ao menos um ligante, cultivar a dita célula hospedeira sob condições para produzir a expressão da porção anticorpo de base, do ao menos um domínio de ligação adicional e do ao menos um ligante e para a montagem deles em um anticorpo multivalente, sendo que, mediante a montagem, a porção anticorpo de base é conectada por um ligante a ao menos um domínio de ligação adicional, sendo que cada domínio de ligação da porção anticorpo de base e cada um de ao menos um dos domínios de ligação têm, todos, uma região variável comum e sendo que cada domínio de ligação inclui uma região variável rearranjada que é obtida a partir de, baseada em ou derivada de um ácido nucleico que foi submetido à recombinação somática em resposta à estimulação antigênica para formar um domínio Fab com a dita região variável comum.
68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 67, caracterizado por o ao menos um domínio de ligação adicional compreender um domínio Fv, um domínio Fab ou um domínio Fab modificado.
69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 68, caracterizado por o ao menos um domínio de ligação adicional compreender uma região CH1.
70. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 69, caracterizado por a região variável comum estar sob a forma de uma cadeia leve comum que compreende VL-CL.
71. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado por a cadeia leve comum compreender a sequência da SEQ ID NO: 29.
72. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 71, caracterizado por a região variável comum estar sob a forma de uma cadeia pesada comum que compreende VH-CH1.
73. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 72, caracterizado por cada domínio de ligação da porção anticorpo de base se ligar a um epítopo diferente.
74. Célula, caracterizada por compreender uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos que são capazes de montagem em um anticorpo multivalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 63.
75. Célula, caracterizada por compreender uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos que são capazes de montagem em: (i) uma porção anticorpo de base que compreende dois domínios de ligação; (ii) ao menos um domínio de ligação adicional; e (iii) ao menos um ligante que compreende uma sequência de dobradiça ou uma sequência derivada de uma sequência de dobradiça, sendo que, mediante a montagem, a porção anticorpo de base é conectada por um ligante a ao menos um domínio de ligação adicional e sendo que cada domínio de ligação da porção anticorpo de base de cada um de ao menos um dos domínios de ligação adicionais têm, todos, uma região variável comum.
76. Célula, caracterizada por compreender uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos que são capazes de montagem em: (i) uma porção anticorpo de base que compreende dois domínios de ligação; (ii) ao menos um domínio de ligação adicional; e (iii) ao menos um ligante, sendo que, mediante a montagem, a porção anticorpo de base é conectada por um ligante a ao menos um domínio de ligação adicional, sendo que cada domínio de ligação da porção anticorpo de base e cada um de ao menos um dos domínios de ligação adicionais têm, todos, uma região variável comum e sendo que o anticorpo multivalente se liga a ao menos três epítopos diferentes.
77. Célula, caracterizada por compreender uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos que são capazes de montagem em: (i) uma porção anticorpo de base que compreende dois domínios de ligação; (ii) ao menos um domínio de ligação adicional; e (iii) ao menos um ligante,
sendo que, mediante a montagem, a porção anticorpo de base é conectada por um ligante a ao menos um domínio de ligação adicional, sendo que cada domínio de ligação da porção anticorpo de base e cada um de ao menos um dos domínios de ligação adicionais têm, todos, uma região variável comum e sendo que cada região variável comum coevoluiu com sua região cognata.
78. Polipeptídeo, caracterizado por compreender uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: SEQ ID NOs: 3 a 5, 7 a 11 ou 13 a 24 ou um polipeptídeo que tem ao menos cerca de 85% de identidade de sequência com qualquer uma das mesmas.
79. Sequência de ácidos nucleicos, caracterizada por codificar um polipeptídeo de acordo com a reivindicação 78.
80. Vetor, caracterizado por compreender uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com a reivindicação 79.
81. Composição farmacêutica, caracterizada por compreender um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 63 e um veículo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável.
82. Anticorpo multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 63, caracterizado por ser para uso no tratamento do corpo humano ou animal por terapia.
83. Método para o tratamento de um ser humano ou de um animal que sofre de uma indicação médica, sendo o método caracterizado por compreender administrar ao ser humano ou ao animal uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 63.
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