CN111542536A - 多特异性分子 - Google Patents

Abstract

本申请涉及通过将OB‑折叠变体，尤其是来自Sac7d家族的OB‑折叠变体融合至抗体轻链或抗体重链，而具有多特异性结合能力的蛋白。

Description

多特异性分子

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其涉及具有多种结合特异性的新型分子和缀合物的开发。

背景技术

双特异性单克隆抗体(Mab)是一种人工蛋白，可以同时结合两种不同类型的抗原。它们可以制造成多种结构形式。通常，它们用于癌症免疫疗法和药物递送。

有不同的双特异性抗体形式：

-保留完整IgG结构的双特异性抗体。这受益于Fc介导的效应子功能，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、补体固定和FcRn介导的循环(这与长半衰期有关)。它们包含两个Fab臂和一个Fc区，其中两个Fab位点结合不同的抗原。通常，每个重链和轻链的配对，均来自独特的mAb。这些双特异性抗体通常是通过四源杂交瘤(quadroma)或杂交杂交瘤方法制造的。

-缺乏Fc的抗体。这包括仅由Fab区所组成的化学连接的Fab，以及各种类型的二价和三价单链可变片段(scFv)，或模仿两种抗体可变结构域的融合蛋白。

然后，根据产生对称或不对称分子的工程化过程，可以对完整的IgG双特异性抗体进行区分，从而带来了不同的挑战。

不对称的双特异性抗体是体外链交换的结果，可以通过酶促方法或融合不同的杂交瘤(称为四源杂交瘤)来辅助体外链交换。但是，这些技术允许在含有大量不希望的副产物的混合物中生成预期的双特异性分子，而所述不希望的副产物需要进行分离。作为一个示例，采用四源杂交瘤技术，在一个细胞中表达两种抗体的重链和轻链的混杂配对，理论上可以产生16种不同的组合(10种不同的分子)，只有一种是双特异性的，其余的配对则产生无功能或单特异性分子。这样的过程在溶液中产生双特异性分子的统计量(和回收率)为12.5％。

然后，主要的挑战在于驱动重链和轻链正确配对的能力。这已经通过例如用于重链的“旋钮入孔”技术和例如用于轻链的“crossmab”技术进行了评估。这些技术的实施使得在生成过程中可以显著减少副产物的数量，但是只有通过插入许多点突变来支持正确的重链和轻链组装，才能实现这一目标；在进一步开发分子的能力方面，并不是没有任何后果。具体地，这样的抗体可以是免疫原性的，其中Fc区引起有害的下游免疫应答。

对称的双特异性抗体则依赖于融合额外的ScFv结构域(串联Fab-IgG，DVD-IG，CODV-Ig…)为初始IgG带来额外的特异性。这里要考虑的关键问题取决于将ScFv连接到IgG的接头，以及所连接的ScFv的固有稳定性，这可能会影响生产性和生产能力。对于双特异性抗体尤其如此，当考虑使用三特异性或四特异性抗体时，挑战就更加严峻。

双特异性分子，尤其是抗体，可用在需要解决在同一平行或不同通路上的多个靶标的任何时间。具体而言，已经在癌症免疫疗法中开发了这种双特异性抗体，以结合肿瘤细胞和细胞毒性细胞。双特异性抗体还具有更高的细胞毒性潜能，并与表达相对较弱的抗原结合。此外，靶向多于一个分子可用于规避平行通路的调节，并避免对治疗的抗性。

WO 2012/009705涉及包含一个或多个模块识别结构域和引用作为替代性支架的亲和素(基于来自超嗜热古细菌的Sac7d)的复合物。但是，该文件本身并未提供有关所谓亲和素的性质的任何信息，尤其是其具体结构，也未提供有关其性质的任何参考，该文件也没有实际表明任何复合物会正确折叠并保持活性。总而言之，该文件的教导是不完整的且推测性的。

Yu等人(MAbs.2014；6(6)：1598-607)D2公开了与结合IL6的亲和体(affibody)ZIL6融合的阿达木单抗(一种人源化抗体，其结合TNFα)。亲和体分子是抗体模拟物，由基于三螺旋束结构域的小蛋白组成，这些蛋白经工程化以高亲和性(affinity)结合靶标蛋白，这区别于本文公开的OB-折叠结构域。该文件未提及任何有关产量的信息。

Brack等人(Mol Cancer Ther.2014Aug；13(8)：2030-9)公开了一种双特异性靶向Her2的融合蛋白，该蛋白包含抗Her2抗体帕妥珠单抗和FynSH3衍生的结合蛋白，其是源自人Fyn激酶SH3结构域的7kDa球状蛋白。

等人(PLoS One.2012；7(7)：e40331)公开了neffin蛋白，它是融合到57个氨基酸长的SH3结构域上的单结构域抗体片段(美洲驼Ig重链可变结构域，VHH)，经工程化而旨在结合多种目的蛋白(见摘要)。此处公开的单链neffin蛋白不能与包含两条重链和轻链的修饰抗体融合。

Spangler等人(J Mol Biol.2012Sep 28；422(4)：532-44)公开了基于西妥昔单抗的抗EGFR抗体，其融合至人纤连蛋白第10型III结构域的工程化EGFR-结合变体。这些复合物不同于本文公开的复合物。

WO 2008/100470公开了Ig融合蛋白，并且没有提及本文公开的OB-折叠蛋白和变体，也没有提及它们用于生产修饰抗体的用途。

因此，仍然有待开发多特异性分子，该多特异性分子将易于生产，具有良好的产量，并且还有望与抗体一样稳定。

申请人提出通过产生新型人工蛋白来生产这种分子，所述人工蛋白包括具有OB-折叠结构域的抗体(常规抗体或双特异性抗体)，所述OB-折叠结构域位于所述抗体的重链或轻链中至少一个的N-或C-端。优选，通过基因工程将OB-折叠结构域融合或连接至抗体链：编码该结构域的序列与抗体重链和/或轻链序列的5'-和/或3'-端进行遗传融合，因此，通过将修饰的序列引入合适的细胞系或细菌菌株中，可以生产人工蛋白。值得注意的是，在抗体和OB-折叠结构域之间可以添加一些氨基酸(接头)。

实施例显示，与没有融合OB结构域的抗体相比，获得了更高或至少相似或相等产量的公开多肽。实施例表明对于各种构建体都获得了这种效果。由于抗体和OB-折叠结构域(尤其是Sac7d家族的蛋白的变体)保留其功能，因此表明它们保留了其结构。认为并假设在生产过程中OB-折叠结构域(特别是当被选为Sac7d家族的蛋白时)将稳定抗体链，从而增加产量。因此，在实施例中对各种复合物观察到的效果，可以概括为均具有相同结构的其他抗体和OB-折叠变体。

发明内容

因此，本发明涉及包含修饰抗体的多肽。通过使OB-折叠结构域的至少一个变体与免疫球蛋白单体重链或轻链中的至少一个融合，优选在轻链或重链的N-或C-端处融合，来修饰所述抗体。

优选地，所述融合是通过基因工程进行的，但是也可以预期OB-折叠变体与抗体的重链或轻链的化学连接。

优选地，变体在OB-折叠结构域与其天然配体的结合位点中包含5至20个突变残基。

OB-折叠结构域和抗体可能能够结合不同的靶标或相同靶标的不同表位，因此本文公开的蛋白将能够结合多个这些靶标或给定靶标的多个表位。

如图1所示(仅说明对称分子)，一个以上OB-折叠结构域抗体的变体可与该抗体的轻链或重链结合。优选地，当本发明的蛋白是对称的(即，当它由相同的异二聚体组成时)，即当相同的OB-折叠变体融合至该蛋白的两条轻链或重链时。然而，仅一个OB-折叠变体仅结合至重链或轻链之一的实施方案也包括在内，以及其中一个OB-折叠变体结合至蛋白的轻链或重链、和另一个(不同的)OB-折叠变体结合至另一个轻链或重链的实施方案也包括在内。因此可以有多种组合，图1并不是穷尽的。

具体而言，如所示OB-折叠变体融合至抗体的两条重链或轻链。在每条重链或轻链上的OB-折叠变体可以相同或不同。在另一个实施方案中，OB-折叠变体融合至抗体的至少一条重链和至少一条轻链。在重链和轻链上的OB-折叠变体可以相同或不同。

在另一个实施方案中，两个OB-折叠变体(相同或不同)融合至相同的轻链或重链(在链的N-端和C-端)。

蛋白可以包含一个OB-折叠变体。它可包含两个OB-折叠变体(当它们相同且对称存在于蛋白上时，则优选)。它可包含三个OB-折叠变体。它可包含四个OB-折叠变体(当有两对OB-折叠变体且蛋白对称时，则优选)。它可包含五个OB-折叠变体。它可包含六个OB-折叠变体(当有三对OB-折叠变体并且蛋白对称时，则优选)。它可包含七个OB-折叠变体。它可包含八个OB-折叠变体(当有四对OB-折叠变体时，则优选；在这种情况下，蛋白将是对称的)。需要提醒的是，对称蛋白是由相同的重链和轻链制备的蛋白。

本发明还涉及包含选自以下的DNA序列的遗传构建体：

a.编码抗体重链的序列，在其3'端与编码OB-折叠蛋白变体的序列融合；

b.编码抗体重链的序列，在其5'端与编码OB-折叠蛋白变体的序列融合；

c.编码抗体轻链的序列，在其3'端与编码OB-折叠蛋白变体的序列融合；

d.编码抗体轻链的序列，在其5'端与编码OB-折叠蛋白变体的序列融合。

当这些遗传序列引入具有互补抗体遗传序列(对于a)或b)的情况是编码轻链的序列，或对于c)或d)的情况是编码重链的序列)的合适宿主细胞时，使得能够生产本文公开的蛋白。本发明还涉及包含这样的遗传构建体的载体，以及在其基因组中包含权利要求所述这种遗传构建体(优选具有互补序列)的宿主细胞(特别是真核细胞)。

本发明还涉及生产本发明多肽的方法，包括以下步骤：

a.培养细胞培养物，其中所述细胞已转化有上述遗传构建体和抗体的互补序列，和

b.回收由此生产的多肽。

这种培养是在一定条件下进行的，以表达并组装由遗传构建体表达的蛋白。当多肽分泌在培养介质中时，该方法特别合适。

本发明还涉及生产本发明多肽的方法，包括以下步骤：

(a)培养已转化有所述遗传构建体和抗体互补序列的细胞，

(b)收集细胞；和

(c)破坏细胞以获得含有所述多肽的粗提物。

本发明中还包括用于生产所述多肽的遗传构建体的生产方法，所述方法包括以下步骤：将编码OB-折叠结构域变体的序列遗传融合至抗体重链或轻链的至少5'或3'端，并回收由此获得的遗传构建体。

本发明还涉及由通过OB-折叠变体或抗体结合位点与至少一个靶标结合的本文公开的多肽组成的复合物。因此，这样的靶标是抗体的抗原或OB-折叠变体结合的靶标。

本发明特别令人感兴趣，因为它使得可以通过一种非常简单的方法获得双特异性或多特异性分子(由抗体序列(轻链或重链编码序列)与OB-折叠编码序列融合而组成的简单遗传修饰)。

在优选的实施方案中，该方法可以确保在转化有合适遗传载体的细胞中生产后回收的100％蛋白是相同类型的，从而解决了上面提到的双特异性抗体的纯化问题，其中在溶液中双特异性分子的统计量(和回收)通常约为12.5％。此外，本文公开的方法使得可以获得与抗体(嵌合的、人的、来自小鼠、大鼠或任何独特型的)一样多样性的多特异性分子。还要注意的是，由于抗体的整体结构没有被修饰，因此分子保留了抗体的所有特征和特性(包括通过非Fab片段(例如通过Fc片段)进行的任何作用)。同样令人惊讶的是，尽管对抗体进行了修饰，但是本文公开的分子能够结合抗体和OB-折叠结构域结合位点。因此，这种双特异性结合能力表明多肽片段分子(抗体部分和OB-折叠结构域部分)的正确折叠得以维持。最后，还令人惊讶地注意到，与抗体产量相比，分子的产量得以保持、或甚至提高。

发明详述

OB-折叠结构域

如上所述，可通过在结合位点内引入突变，将OB-折叠结构域工程化成与特定靶标结合的变体。

在本申请的上下文中，术语“OB-折叠(OB-fold)结构域”(或“OB-折叠蛋白”)是指天然的OB-折叠蛋白，但也指具有OB-折叠的结构域，其可以从更复杂的蛋白分离。这些OB-折叠结构域特别在WO2007/139397和WO2008/068637中更详细地得以描述。该术语还包括可通过遗传工程在N-或C-端位置将OB-折叠蛋白或具有OB-折叠的结构域融合至感兴趣的蛋白或结构域(例如，允许更好地进行纯化的标签)而获得的多肽。

然而，在本发明的上下文中，优选的是，仅使用具有OB-折叠拓扑结构的结构域，而非包含不在OB-折叠结构域之内的其他序列的完整蛋白。实际上，优选使用尽可能小的蛋白，并且优选地，在本发明的上下文中使用的OB-折叠结构域的变体包含最多300个氨基酸，优选最多200个氨基酸，优选最多175个氨基酸，更优选最多150个氨基酸，更优选最多100个氨基酸。在一个具体的实施方案中，其包含最多80个或最多70个氨基酸。

OB-折叠结构域的结合位点

OB-折叠蛋白是本领域已知的。它们在上面引用的文件中以及在Arcus(Curr OpinStruct Biol.2002Dec；12(6)：794-801)中都有特别的描述。OB-折叠为具有五个beta(β)片层的圆柱体形式。大多数OB-折叠蛋白使用其天然配体的相同结合界面，配体可以是寡糖、寡核苷酸、蛋白、金属离子或催化底物。该结合界面主要包括位于β片层中的残基。位于环中的某些残基也可能参与OB-折叠蛋白与其天然配体的结合。因此，申请WO2007/139397和WO2008/068637以及Arcus文件(2002，同上引文)描述了用于结合其天然配体的OB-折叠蛋白结构域。

具体而言，文件WO2008/068637精确地描述了如何鉴定OB-折叠蛋白的结合结构域。

使用网站WU-Blast2(http://www.ebi.ac.uk/blast2/index.html)(Lopez等人.,2003,Nucleic Acids Res 31,3795-3798)、T-COFFEE(http://www.ch.embnet.org/software/TCoffee.html)(Notredame等人.,2000,J Mol Biol 302,205-217)和DALI lite(http://www.ebi.ac.uk/DaliLite/)(Holm和Park，2000，Bioinformatics 16，566-567)，通过叠加具有OB-折叠结构域的蛋白的几个序列和3D结构，则可以鉴定结合结构域的位置，尤其是可以对氨基酸进行修饰。以Sac7d(SEQ ID NO：1)的序列为参考，它们是残基V2、K3、K5、K7、Y8、K9、G10、E11、K13、E14、T17、K21、K22、W24、V26、G27、K28、M29、S31、T33、Y34、D36、N37、G38、K39、T40、R42、A44、S46、E47、K48、D49、A50和P51。

可以如WO2008/068637中所述，鉴定其他OB-折叠蛋白的结合结构域。此申请表明，可以使用DALI网站(http://www.ebi.ac.uk/dali/interactive.html)(Holm和Sander,1998,Nucleic Acids Res 26,316-319)执行OB-折叠蛋白或结构域(该申请中使用了10个结构域，包括Sac7d)的3D结构叠加。因此，对于任何OB-折叠蛋白(或任何OB-折叠结构域)，很容易识别参与结合位点的氨基酸，并对应于上述Sac7d氨基酸。因此，提供可在这些蛋白之一中发生突变的氨基酸，使得可以针对任何其他OB-折叠结构域鉴定相应的氨基酸。

也可以从OB-折叠支架中删除一些氨基酸。仍以该Sac7d序列为参考，可以删除的残基为：A59、R60、A61、E62、R63、E64和/或K66。

WO2008/068637的教导还表明，可以任选地将氨基酸插入OB-折叠蛋白的环中，特别是Sac7d家族的蛋白；具体而言，可以在环3中插入1至15个氨基酸残基(如WO2008/068637的图1b和图2所定义)，例如在Sac7d的残基25至30的区域中，优选在残基27和28之间，可以在环4中插入1至15个氨基酸残基(如WO2008/068637的图1b和图2所定义)，例如在Sac7d的残基35-40的区域中，优选在残基37和38之间，并且可以在环1中插入1至20个残基(如WO2008/068637的图1b和图2所定义)，例如在Sac7d的残基7至12的区域中，优选在残基9至10之间。

获取OB-折叠结构域的突变体

WO2007/139397描述了对OB-折叠蛋白文库的使用，其中通过将突变引入到该结构域中来修饰OB结构域，以使蛋白与其天然配体结合。具体而言，并且如本文所预期的，修饰的OB-折叠结构域包含：a)与天然存在的OB-折叠结构域相比，OB-折叠结构域结合面的β链中至少一个修饰的氨基酸残基，或b)OB-折叠结构域结合面的β链中至少一个修饰的氨基酸残基以及OB-折叠结构域环区的链中至少一个修饰的氨基酸残基，或c)OB-折叠结构域环区的链中至少一个修饰的氨基酸残基。通常，与天然存在的OB-折叠结构域相比，修饰的OB-折叠结构域具有改变的结合特性。

WO2008/068637描述了基于Sac7d蛋白的文库用于获得对兴趣靶标具有亲和性的配体的用途。WO2008/068637中描述的方法包括生成包含多个DNA分子的组合文库，这些DNA分子均具有相同的序列，除了存在某些导致产生野生型蛋白变体的随机突变外，在该野生型OB-折叠蛋白结合位点的某些氨基酸处表现出突变。特别是，在WO2008/068637上下文中，野生型OB-折叠蛋白是Sac7d蛋白，其中引入了突变以产生变异，特别是在选自以下的氨基酸处：K7、Y8、K9、K21、K22、W24、V26、M29、S31、T33、T40、R42、A44、S46或其他氨基酸，例如V26、G27、K28、M29、S31、R42、A44、S46、E47和K48。这些氨基酸基于SEQ ID NO：1所示的Sac7d序列。

WO2012/150314显示，来自Sac7d家族的一个蛋白的突变，可以被带入同一家族的另一个蛋白上。这种可移植性相当于从所述家族一个蛋白的突变体开始，而产生了Sac7d家族另一蛋白的突变体。第一突变体可以特别地通过进行WO2008/068637的方法获得。

已经显示有可能获得针对给定靶标的这种突变体(尤其是当靶标是蛋白或肽时)。可以引用与免疫球蛋白结合的变体(Behar等人,Protein Engineering,Design&Selectionvol.26No.4pp.267–275,2013)、或与其他蛋白结合的变体(WO2008/068637)。Gera等人(JMol Biol.2011Jun 17；409(4)：601-16)也显示了从Sso7d开始获得这种蛋白的可能性。Gocha等人(Scientific Reports 7,Article number：12021(2017))也报道了从Sso7d获得突变体的能力。

OB-折叠结构域的示例

可以根据本发明使用的OB-折叠蛋白的非限制性示例是Sac7d、Sso7d、SEB的N端结构域(Papageorgiou等人，1998)、志贺样毒素IIe的链A(PDB 2bosa)、人嗜中性白细胞激活素肽2(NAP-2，PDB 1tvxA)、棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)(PDB 1h9j)的钼结合蛋白(modg)、SPE-C的N端结构域(Roussel等人，1997)、大肠杆菌志贺样毒素的B₅亚基(Kitov等人，2000)、Cdc13(Mitton-Fry等人，2002)、人Y盒蛋白YB-1的冷休克DNA结合结构域(Kloks等人，2002)、大肠杆菌无机焦磷酸酶EPPase(Samygina等人，2001)或(Arcus，2002)文章表3中列出的任何蛋白，例如1krs(赖氨酰-tRNA合成酶LysS，大肠杆菌)、1c0aA(Asp-tRNA合成酶，大肠杆菌)、1b8aA(Asp-tRNA合成酶，P.kodakaraensis)、1lylA(赖氨酰-tRNA合成酶LysU，大肠杆菌)、1quqA(复制蛋白A，32kDa亚基，人)、1quqB(复制蛋白A，14kDa亚基，人)、1jmcA(复制蛋白A，70kDa亚基(RPA70)片段，人)、lotc(端粒-末端-结合蛋白，O.nova)、3ullA(线粒体ssDNA-结合蛋白，人)、1prtF(百日咳毒素S5亚基，百日咳杆菌(B.pertussis))、1bcpD(百日咳毒素S5亚基(ATP结合型)，百日咳杆菌)、3chbD(霍乱毒素，霍乱弧菌(V.Cholerae))、1tiiD(热不稳定毒素，大肠杆菌)、2bosA(Verotoxin-1/志贺毒素，B-五聚体，大肠杆菌)、1br9(TIMP-2，人)、1an8(超抗原SPE-C，化脓性链球菌(S.pyogenes))、3seb(超抗原SPE，金黄色葡萄球菌(S.aureus))、1aw7A(中毒休克综合征毒素，金黄色葡萄球菌)、1jmc(主要冷休克蛋白，大肠杆菌)、1bkb(起始翻译因子5a，P.aerophylum)、1sro(PNP酶的S1 RNA结合结构域，大肠杆菌)、1d7qA(起始翻译因子1，e1F1a，人)、1ah9(起始翻译因子1，IF1，大肠杆菌)、1b9mA(Mo-依赖性转录调控物ModE，大肠杆菌)、1ckmA(RNA鸟苷酸转移酶，小球藻病毒，PBCV-1)、1a0i(ATP-依赖性DNA连接酶，噬菌体T7)、1snc(葡萄球菌核酶，金黄色葡萄球菌)、1hjp(DNA解旋酶RuvA亚基，N端结构域，大肠杆菌)、1pfsA(基因V蛋白，假单胞菌噬菌体pf3)、1gvp(基因V蛋白，丝状噬菌体(f1，M13))、1gpc(基因32蛋白(gp32)核心，噬菌体T4)、1wgjA(无机焦磷酸酶，酿酒酵母(S.cerevisiae))和2prd(无机焦磷酸酶，极端嗜热菌(T.thermophilus))。

OB-折叠结构域的特定和优选示例

Sac7d家族被定义为与Sac7d蛋白有关，并且对应于从极端细菌中分离的7kDaDNA结合蛋白家族。

在WO2008/068637中特别描述了这些蛋白和该家族。因此，在本发明的上下文中，当蛋白具有序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：14之一时，或者当其具有与序列SEQ ID NO：15相对应的序列时，则该蛋白属于Sac7d家族，其中序列SEQID NO：15是共有序列(获自SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12至SEQ ID NO：14。在该共有序列中，破折号–表示无氨基酸，蛋白不具有相同的大小)。该Sac7d家族尤其包括源自嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobusacidocaldarius)的Sac7d或Sac7e蛋白、源自硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的Sso7d蛋白、源自极端嗜热古菌(Sulfolobus tokodaii)的DBP7(也被称为Sto7)蛋白、源自希氏硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)的Ssh7b蛋白、源自希氏硫化叶菌(Sulfolobusshibatae)的Ssh7a蛋白、源自勤奋金属球菌(Metallosphaera sedula)的Mse7、源自嗜铜金属球菌(Metallosphaera cuprina)的Mcu7、源自好客嗜酸两面菌(Acidianus hospitalis)的Aho7a或Aho7b或Aho7c、源自冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus)的Sis7a或Sis7b、以及源自硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的p7ss蛋白。鉴于Sac7d家族蛋白序列的广泛相似性，可以直接和容易地鉴定出对应于Sac7d给定氨基酸的Sac7d以外另一种蛋白的氨基酸。

应注意的是，所述变体中突变残基的数量(相对于野生型蛋白)优选5至25个。优选，与野生型OB-折叠蛋白(或结构域)相比，可以用具有至少5个、更优选至少7个或8个、甚至更优选至少10个、但通常小于25个、更优选小于24个、甚至更优选小于20个或小于15个或14个取代氨基酸的变体来实施本发明。相对于野生型OB-折叠结构域，优选在OB-折叠结构域的结合位点处，突变7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸。将这些突变引入对应于Sac7d(SEQ ID NO：1)的V2、K3、K5、K7、Y8、K9、G10、E11、K13、E14、T17、K21、K22、W24、V26、G27、K28、M29、S31、T33、Y34、D36、N37、G38、K39、T40、R42、A44、S46、E47、K48、D49、A50和P51的氨基酸处。

在一个具体的实施方案中，突变的氨基酸数量是7至14(包括端值)。

在一个具体的实施方案中，这些变体还可包含如上所述的氨基酸插入。

如所示，Sac7d家族的蛋白是源自嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的Sac7d或Sac7e蛋白、源自硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的Sso7d蛋白、源自极端嗜热古菌(Sulfolobus tokodaii)的DBP7(也被称为Sto7)、源自希氏硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)的Ssh7b、源自希氏硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)的Ssh7a、源自勤奋金属球菌(Metallosphaera sedula)的Mse7、源自嗜铜金属球菌(Metallosphaeracuprina)的Mcu7、源自好客嗜酸两面菌(Acidianus hospitalis)的Aho7a或Aho7b或Aho7c、源自冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus)的Sis7a或Sis7b、以及源自硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的p7ss。Sac7d、Sso7d、Sac7e、Ssh7b、Ssh7a、DBP7、Sis7a(3个等位基因)、Mse7、Mcu7、Aho7a、Aho7b和Aho7c蛋白的各种序列分别由SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：14所示。

该Sac7d家族的蛋白的变体可以称为nanofitin。因此，优选在SEQ ID NO：1至SEQID NO：14中任何一个所示蛋白的变体上或具有序列SEQ ID NO：15的蛋白上实施本发明，特别是在Sac7d的变体上实施。

在优选的实施方案中，突变的氨基酸选自V2、K3、K5、K7、Y8、K9、G10、E11、K13、E14、T17、K21、K22、W24、V26、G27、K28、M29、S31、T33、Y34、D36、N37、G38、K39、T40、R42、A44、S46、E47、K48、D49、A50和P51(参考SEQ ID NO：1和图2的比对)。根据图2的比对，可以在任何其他蛋白中鉴定与上述Sac7d氨基酸相对应的氨基酸。应当注意的是，变体应包括选自这些氨基酸的突变氨基酸(优选如上所述的7至12个)，并且在其他区域中还可以包含其他突变氨基酸(优选0至5个)(即在Sa7d的其他残基中选择)。如上所述，可以删除A59、R60、A61、E62、R63、E64和/或K66。

在优选的实施方案中，突变的氨基酸选自K7、Y8、K9、K21、K22、W24、V26、M29、S31、T33、T40、R42、A44和S46。

本文公开的变体可以通过WO2008/068637中描述的方法获得(组合文库的多轮富集，特别是使用核糖体展示)。

因此，OB-折叠结构域的变体优选是Sac7d家族的蛋白的变体(Sac7d变体)，其在蛋白的结合位点包含5至20个(优选7至14个)突变的氨基酸。优选地，Sac7d变体的突变氨基酸选自V2、K3、K5、K7、Y8、K9、G10、E11、K13、E14、T17、K21、K22、W24、V26、G27、K28、M29、S31、T33、Y34、D36、N37、G38、K39、T40、R42、A44、S46、E47、K48、D49、A50和P51(参考SEQ ID NO：1和图2的比对)。优选地，Sac7d变体包含选自K7、Y8、K9、K21、K22、W24、V26、M29、S31、T33、T40、R42、A44和S46的7至14个突变氨基酸。

在WO2008/068637中描述的方法的优点在于，通过筛选包含或表达多种变体的组合文库，使得可以获得OB-折叠蛋白的变体，在所述多种变体中一定数量的氨基酸已被“随机化”，即被随机氨基酸取代。通过筛选这些文库，可以鉴定通常以强亲和性特异性结合兴趣靶标的这些蛋白的变体(申请WO2008/068637实际上描述了一个纳摩尔量级的亲和性)，而不是野生型蛋白的天然配体，其中组合文库产生自所述野生型蛋白。

如上所述，申请人能够证明，通过将结合给定靶标的OB-折叠结构域与结合同一靶标(从而提高特异性和亲和性)或另一靶标(从而获得多特异性结合蛋白)的抗体重链或轻链融合，可以形成特异性结合蛋白。

可以在抗体链(重链和/或轻链)的N-端和/或C-端进行融合。值得注意的是，尤其是当使用较小的OB-折叠结构域(约70个氨基酸)时(例如Sac7d家族的蛋白)，就有可能获得具有抗体结构的分子(两条轻链配对两条重链，这种二聚体配对在一起)，具有抗体区域以及由修饰的OB-折叠结构域组成的其他结合区域。

抗体

抗体是大的Y型蛋白，可通过Fab’可变区识别抗原。它们通常由四条多肽链组成；由二硫键连接的两条相同的重链(约400至500个氨基酸)和两条相同的轻链(约211至217个氨基酸)。每条链由称为免疫球蛋白结构域的结构域构成。

抗体重链有几种不同的类型，它们定义了可能与抗原结合片段连接的五种不同类型的片段(Fc)，并允许将抗体分为五种同种型(IgA，IgD，IgE，IgG和IgM)。每条重链具有恒定区和可变区，恒定区在相同同种型的所有抗体中相同，但是在不同同种型的抗体中不同。

在具体的实施方案中，本文公开的蛋白的抗体部分是IgG分子。

在另一个实施方案中，本文公开的蛋白的抗体部分是IgA分子。

在另一个实施方案中，本文公开的蛋白的抗体部分是IgM分子。

在另一个实施方案中，本文公开的蛋白的抗体部分是IgD分子。

在另一个实施方案中，本文公开的蛋白的抗体部分是IgE分子。

抗体可以是人类抗体、啮齿动物抗体(例如小鼠抗体或大鼠抗体)、猫抗体、狗抗体、鸡抗体、山羊抗体、骆驼科动物抗体(例如骆驼抗体、美洲驼抗体、羊驼抗体或纳米抗体)、鲨鱼抗体或来自任何其他物种的抗体。它可以是嵌合或人源化抗体。如Wikipedia所提醒，人源化抗体是来自非人类物种的抗体，其蛋白序列已被修饰以增加其与人类天然产生的抗体变体的相似性。嵌合抗体包含来自不同物种的序列。

当抗体作为本文公开分子的一部分时，其包含两条相同的重链(约400至500个氨基酸，通常约450个氨基酸)和两条相同的轻链，是优选的。因此，抗体包含相同的Fab可变区。因此，该抗体是单特异性抗体，其中抗体的两个部分(轻链和重链的组合)都与相同的抗原表位结合。

然而，抗体可以呈现不同的重链和/或轻链。具体而言，在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体。因此，术语“抗体”既包括具有相同重链和轻链的上述“经典抗体”，也包括具有多于一种特异性的工程化抗体。

在具体的实施方案中，抗体呈现来自一个抗体的一条重链和轻链，以及来自另一抗体的另一条重链和轻链。

具体而言，可用于本文公开分子中的抗体可以是triomab(Trion Pharma)、KIH(旋钮入孔)IgG(Xu等人，MAbs.2015；7(1)：231-242，Dillon等人，MABS 2017，9(2)，213-230)(可能具有常见的轻链，如Klein等人MAbs.2012年11月1日；4(6)：653-663所示)、cross-Mab(Roche Technology,Klein等人,MAbs.2016Aug-Sep；8(6)：1010-1020,Cain,Chris.(2011)Crossing over to bispecificity.Science-Business eXchange)、Ortho-Fab IgG(Lewis等人，Nat Biotechnol.2014；32(2)：191-8)、DVD(双可变结构域)IgG(由AbbVie开发)、二合一IgG(由Genetech开发)、IgG-scFv(Orcutt等人，Protein Eng Des Sel.2010Apr；23(4)：221-8)或DNL-Fab3。所有这些抗体均已在Kontermann和Brinkmann的图2(Drug DiscoveryToday，20(7)，2015，838-847)或Brinkmann和Kontermann(MABS，2017，9(2)，182-212)中公开。Fan等人(Journal of Hematology&Oncology(2015)8：130)也描述了双特异性抗体及其应用。

保持IgG样形状的

家族的三功能双特异性抗体是嵌合体，由两个半抗体组成，每个半抗各带有一条轻链和一条重链，分别来自亲本小鼠IgG2a和大鼠IgG2b同种型。

在具体的实施方案中，该抗体是治疗性抗体。这样的治疗性抗体可以用于人类以治愈疾病、延缓疾病的发展或减轻疾病的症状。

优选，治疗性抗体选自：3F8、8H9、阿巴伏单抗(Abagovomab)、阿昔单抗(Abciximab)、阿比珠单抗(Abituzumab)、阿布利单抗(Abrilumab)、阿西妥单抗(Actoxumab)、阿达木单抗(Adalimumab)、阿德木单抗(Adecatumumab)、阿杜卡单抗(Aducanumab)、阿伐斯单抗(Afasevikumab)、阿非莫单抗(Afelimomab)、阿夫土珠单抗(Afutuzumab)、PEG化阿拉西单抗(Alacizumab pegol)、ALD518、阿仑单抗(Alemtuzumab)、阿利若单抗(Alirocumab)、喷替酸阿托玛单抗(Altumomab pentetate)、阿马妥昔单抗(Amatuximab)、安那妥莫单抗(Anatumomab mafenatox)、安妥单抗(Anetumabravtansine)、阿尼弗洛单抗(Anifrolumab)、安鲁金珠单抗(Anrukinzumab)、阿波立珠单抗(Apolizumab)、阿西莫单抗(Arcitumomab)、阿斯万卡单抗(Ascrinvacumab)、阿赛珠单抗(Aselizumab)、阿特珠单抗(Atezolizumab)、阿丁努单抗(Atinumab)、阿托若单抗(Atorolimumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)、巴平纽珠单抗(Bapineuzumab)、巴斯利昔单抗(Basiliximab)、巴维妥昔单抗(Bavituximab)、贝妥莫单抗(Bectumomab)、贝格罗单抗(Begelomab)、贝利木单抗(Belimumab)、本瑞珠单抗(Benralizumab)、柏替木单抗(Bertilimumab)、贝索单抗(Besilesomab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、贝兹罗妥单抗(Bezlotoxumab)、比西单抗(Biciromab)、比马古单抗(Bimagrumab)、比麦克珠单抗(Bimekizumab)、比伐妥珠单抗(Bivatuzumab 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具体而言，这样的治疗性抗体选自：阿达木单抗(抗TNFa，以

的名称出售)；英夫利昔单抗(抗TNFa，以

的名称出售)；西妥昔单抗(抗EGFR，以

的名称出售)；苏金单抗(Secukinumab)(抗IL17，以

的名称出售)；派姆单抗(抗PD1，以

的名称出售)；贝伐单抗(抗VEGF-A以

的名称出售)；埃托里珠单抗(抗a4b7)；万多丽珠单抗(vedolizumab)(抗a4b7)；曲美单抗(抗CTLA4)；伊匹单抗(抗CTLA4以

的名称出售)；奈昔木单抗(抗EGFR以

的名称出售)；帕尼单抗(抗EGFR，以

的名称出售)；勒布立克珠单抗(抗IL13)；曲罗金努单抗(抗IL13)；伊赛克珠单抗(抗IL17，以

的名称出售)；布罗达鲁单抗(抗IL17R，以

的名称出售)；度匹鲁单抗(抗IL4R，以

的名称出售)；古赛尔库单抗(Guselkumab)(抗IL23)；替尔达珠单抗(Tildrakizumab)(抗IL23)；利散珠单抗(Risankizumab)(抗IL23)；布利埃克单抗(Briakinumab)(抗IL12和IL23)；优特克单抗(Ustekinumab)(抗IL12和IL23)；尼韦单抗(抗PD1，以

的名称出售)；阿特珠单抗(抗PD-L1，以

的名称出售)；阿维鲁单抗(Avelumab)(抗PD-L1)；兰尼单抗(Ranibizumab)(抗VEGF-A，以

的名称出售)；布罗路西珠单抗(Brolucizumab)(抗VEGF-A)；曲妥珠单抗(抗Her2，

)；阿马妥昔单抗(Amatuximab)(抗间皮素)；他佛利珠单抗(Tavolixizumab)(抗OX40)；泊咖丽珠单抗(Pogalizumab)(抗OX40)；乌鲁单抗(抗4-1BB)；乌托米鲁单抗(Utomilumab)(抗4-1BB)；BMS 986016(抗LAG3)；利鲁单抗(抗KIR)；MEDI 570(抗ICOS)；LY3321367(抗TIM3)；鲁立珠单抗(抗CD28)；TAB08(抗CD28)；以及奥纳妥珠单抗(Onartuzumab)(抗cMet，MetMab)。

靶标

本发明的多特异性分子的靶标可以是任何感兴趣的分子或抗原。具体而言，多特异性分子靶向癌症或过度增殖性疾病，例如淋巴瘤(例如非霍奇金淋巴瘤)、肾细胞癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠直肠癌、神经内分泌癌、子宫内膜癌、胰腺癌、白血病、肺癌、多形性胶质母细胞瘤、胃癌、肝癌、肉瘤、膀胱癌、睾丸癌、食道癌、头颈癌和软脑膜癌。

在优选的实施方案中，OB-折叠结构域结合如下文所公开的靶标。

它可以选自：

细胞表面受体：胰岛素受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白1、转铁蛋白受体、表皮生长因子受体、表皮生长因子受体变体III、血管内皮生长因子受体1、血管内皮生长因子受体2、Her2、Her3、Her4、PMSA、IGF-1R、GITR、RAGE、CD28。

细胞表面蛋白：间皮素、EpCam、CD19、CD20、CD38、CD3、TIM-3、CEA、cMet、ICAM1、ICAM3、MadCam、a4b7、CD7、CD4、CD138。

血管生成或生长因子：VEGF、血管生成素2、HGF、PDGF、EGF、GM-CSF、HB-EGF、TGF。

免疫检查点抑制剂或激活剂：PD-1、PD-L1、CTLA4、CD28、B7-1、B7-2、ICOS、ICOSL、B7-H3、B7-H4、LAG3、KIR、4-1BB、OX40、CD27、CD40L、TIM3、A2aR。

循环蛋白：TNFα、IL23、IL12、IL33、IL4、IL13、IL5、IL6、IL4、IFNg、IL17、RANKL、Bace1、α突触核蛋白、Tau、淀粉样蛋白。

在一个优选的实施方案中，分子的抗体部分与选自以下的靶标结合：

细胞表面受体：胰岛素受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白1、转铁蛋白受体、表皮生长因子受体、表皮生长因子受体变体III、血管内皮生长因子受体1、血管内皮生长因子受体2、Her2、Her3、Her4、PMSA、IGF-1R、GITR、RAGE、CD28。

细胞表面蛋白：间皮素、EpCam、CD19、CD20、CD38、CD3、TIM-3、CEA、cMet、ICAM1、ICAM3、MadCam、a4b7、CD7、CD4、CD138。

血管生成因子或生长因子：VEGF、血管生成素2、HGF、PDGF、EGF、GM-CSF、HB-EGF、TGF。

免疫检查点抑制剂或激活剂：PD-1、PD-L1、CTLA4、CD28、B7-1、B7-2、ICOS、ICOSL、B7-H3、B7-H4、LAG3、KIR、4-1BB、OX40、CD27、CD40L、TIM3、A2aR。

循环蛋白：TNFα、IL23、IL12、IL33、IL4、IL13、IL5、IL6、IL4、IFNg、IL17、RANKL、Bace1、α突触核蛋白、Tau、淀粉样蛋白。

在优选的实施方案中，分子结合以下几对靶标(这样列出的靶标之一可以是OB-折叠结构域的靶标，而另一个可以是抗体部分的靶标)。

-EGFR/EGFRvIII

-EGFR/Her2

-VEGFR2/PD1

-EGFR/PD1

-VEGF/PD-L1

-PD1/OX40

-PD1/CTLA4

-EGFR/CD3

-TNFα/IL17

-IL13/IL4。

抗体与TNFα结合且OB-折叠结构域与IL17结合(反之亦然)的复合物，是特别令人感兴趣和优选的。

靶标对的其他示例在下面公开。要注意的是，分子的抗体部分可以结合任何一个列出的靶标，而OB-折叠变体结合另一个靶标。因此，以上列出的任何一个靶标对于分子的抗体部分或OB-折叠变体部分均有效。

人工分子的生产

通过常规分子遗传方法制备允许生产本文公开的分子的载体。

总之，通过本领域已知的任何方法，将编码Sca7d变体的遗传序列连接至编码抗体重链或轻链的遗传序列5'或3'端。只要不引入移码或终止密码子，就可以在两个遗传序列之间引入接头，从而获得融合蛋白。

因此，表达的融合蛋白应为(从N端到C端)：

(a)抗体的重链-(接头，如果存在的话)–OB-折叠结构域变体

(b)OB-折叠结构域变体-(接头，如果存在的话)-抗体的重链

(c)抗体的轻链-(接头，如果存在的话)–OB-折叠结构域变体

(d)OB-折叠结构域变体-(接头，如果存在的话)-抗体的轻链。

显然，可以预期进一步的遗传修饰，例如在C或N端进一步引入“标签”分子，以改善纯化，或强迫OB-折叠的方向，或允许蛋白酶介导的OB-折叠的释放，或修饰化合物的药代动力学，或靶向特定类型的组织，或螯合镧系元素或放射性核素，或与有效载荷(可以是美登素或澳瑞他汀衍生物)缀合。

要注意的是，取决于用于这种生产的细胞，可以进一步优化遗传序列的密码子(例如，参见GenSript的OptimumGene^TM密码子优化技术，美国NJ，Piscataway)以用于进一步的生产。

如下所示，可以获得其他核酸分子，例如编码以下的核酸分子：

(a)OB-折叠结构域变体-(接头，如果存在的话)-抗体的重链-(接头，如果存在的话)-OB-折叠结构域变体

(b)OB-折叠结构域变体-(接头，如果存在的话)-抗体轻链-(接头，如果存在的话)-OB-折叠结构域变体。

包含上述一个或多个核苷酸序列的这些重组DNA构建体与载体(例如质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体)结合使用。

可以通过Sambrook等人，1989(Sambrook J，Fritschi EF和Maniatis T(1989)，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室出版社，纽约)中描述的技术生产这些重组核酸分子。或者，可以使用例如合成仪化学合成DNA序列。

本发明的重组构建体包含表达载体，所述表达载体能够表达RNA并因此从上述遗传序列中生产出蛋白。因此，载体可以进一步包含调控序列，包括与本文公开的遗传序列开放阅读框(ORF)可操作地连接的合适的启动子。载体可以进一步包含选择标记序列，例如抗生素抗性基因。当细菌用作表达宿主时，可能还需要具体的起始信号和细菌分泌信号来有效翻译编码序列。

分子的生产

用含有编码抗体重链和轻链的序列的载体转染或转化细胞。如上所述，序列中的至少一个包括OB-折叠蛋白的变体。

在表达和有利地分泌蛋白的条件下培养细胞。细胞的培养条件是通常用于重组抗体生产的条件，并且是本领域已知的。如果需要，本领域技术人员还可以优化本领域已知的这种条件。Kunert和Reinhart(Appl Microbiol Biotechnol.2016；100：3451-3461)回顾了这些方法并提供了充足的参考。

可以使用细菌、噬菌体(Shukra等人，Eur J Microbiol Immunol(Bp).2014；4(2)：91-98)或真核生产系统。

应该更优选使用真核细胞以获得适当的翻译后修饰，例如糖基化。

具体而言，可以使用CHO(中国仓鼠卵巢)细胞、PER.C6细胞(人细胞系，Pau等人,Vaccine.2001 21；19(17-19)：2716-21)、HEK 293b细胞(人胚胎肾细胞293)、NS0细胞(非分泌型鼠骨髓瘤来源的细胞系)或EB66细胞(鸭细胞系Valneva，法国里昂)。

本公开还提供了包含至少一种上述DNA构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是可适用于表达载体的任何细胞。如上所述，它可以是高等真核宿主细胞(例如哺乳动物细胞)，低等真核宿主细胞(例如酵母细胞)，或原核细胞(例如细菌细胞)。

通过本领域已知的任何方法(例如磷酸钙转染、脂质转染、DEAE、葡聚糖介导的转染、电穿孔或噬菌体感染)将重组构建体引入宿主细胞。这些载体可以插入宿主细胞的基因组中，也可以保持为基因组外载体(例如细菌人工染色体或酵母人工染色体)。当引入细胞基因组中时，使用本领域已知的方法，这种引入可以是随机的或靶向的(同源重组等)。

细菌宿主和表达

通过将重组DNA序列与合适的翻译起始和终止信号一起插入具有功能性启动子的可操作阅读框(reading phase)，来构建用于细菌的有用表达载体。载体将包含一种或多种表型选择标记和复制起点，以确保载体的维持，并且如果需要，允许在宿主内扩增。

用于转化的合适的原核宿主包括大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)内的各种物种。

真核宿主和表达

真核宿主细胞的示例包括脊椎动物细胞、昆虫细胞和酵母细胞。具体而言，可以使用上述细胞。

按照本领域已知的方法来培养经转化的或转染的细胞，并(根据是否分泌)从细胞内或细胞外馏分中回收多肽。

分子的分离

可以通过各种已知分离方法中的任何一种，利用蛋白的物理或化学性质从细胞内或细胞外馏分中分离和纯化产生的重组多特异性蛋白。

具体而言，可以使用方法，例如沉淀、超滤、各种液相色谱法，如分子筛色谱(凝胶过滤)、吸附色谱、离子交换色谱、和亲和色谱、透析及其组合。

通常，任何已知的和用于纯化重组抗体的方法都适用于本文公开的分子的纯化。

如果在重组序列中引入了标签(例如聚组氨酸标签)，则可以使用该标签纯化分子。但是，优选利用亲和性来纯化分子。

如果分子的抗体部分是IgG类型，则可以使用Protein A的亲和色谱法(尤其参见Fahrner等人Biotechnol Appl Biochem.1999年10月；30(Pt2)：121-8)。

或者，可以使用Jiang等人(Protein Expression and Purification,第76卷,第1期,2011年3月,7-14页)中公开的方法，该方法公开了在糖工程化的毕赤酵母中表达的重组单克隆抗体的纯化方法。

也可以使用Maria等人的方法(J Chromatogr A.2015年5月8日；1393：57-64)，该方法涉及用混合模式色谱法进行重组单克隆抗体的纯化方法；或Liu等人(MAbs.2010年9月-10月；2(5)：480-499)的方法，其涉及单克隆抗体生产的回收和纯化方法。

具体而言，可以利用以下事实：此处生产的分子与特定靶标(抗体的抗原和OB-折叠变体的靶标)结合，并使用任何亲和性方法(亲和柱、FACS、珠)分离出这样的分子。

本发明方法的一个具体优点是，由细胞生产的所有所得分子都是多特异性分子。

双特异性分子的生产

具体而言，应该在细胞内引入：

-编码抗体轻链的遗传序列

-编码抗体重链的遗传序列，并在该重链的5'端引入了OB-折叠结构域的变体。

在重链和轻链结合后，所得分子将是双特异性分子，其结合抗体的抗原和OB-折叠结构域变体的靶标，所述OB-折叠结构域的变体位于重链的N端。

应当注意，所得分子是对称的，并且应具有四个结合位点(两个抗体Fab结合位点，以及在重链N端的OB-折叠结构域的两个变体的结合位点)，如图1A所示。

在另一实施方案中，应在细胞内引入：

-编码抗体轻链的遗传序列

-编码抗体重链的遗传序列，并在该重链的3'端引入OB-折叠结构域的变体。

在重链和轻链结合后，所得分子将是双特异性分子，其结合抗体的抗原和OB-折叠结构域变体的靶标，所述OB-折叠结构域的变体位于重链的C端。

应当注意，所得分子是对称的，并且应具有四个结合位点(两个抗体Fab结合位点，以及在重链C端的OB-折叠结构域的两个变体的结合位点)，如图1B所示。

在另一实施方案中，应在细胞内引入：

-编码抗体轻链的遗传序列，并在该轻链的5'端引入了OB-折叠结构域的变体，

-编码抗体重链的遗传序列。

在重链和轻链结合后，所得分子将是双特异性分子，其结合抗体的抗原和OB-折叠结构域变体的靶标，所述OB-折叠结构域的变体位于轻链的N端。

应当注意，所得分子是对称的，并且应具有四个结合位点(两个抗体Fab结合位点，以及在轻链N端的OB-折叠结构域的两个变体的结合位点)，如图1C所示。

在另一实施方案中，应在细胞内引入：

-编码抗体轻链的遗传序列，并在该轻链的3'端引入OB-折叠结构域的变体，

-编码抗体重链的遗传序列。

在重链和轻链结合后，所得分子将是双特异性分子，其结合抗体的抗原和OB-折叠结构域变体的靶标，所述OB-折叠结构域的变体位于轻链的C端。

应当注意，所得分子是对称的，并且应具有四个结合位点(两个抗体Fab结合位点，以及在轻链C端的OB-折叠结构域的两个变体的结合位点)，如图1D所示。

在另一实施方案中，应在细胞内引入：

-编码抗体轻链的遗传序列，并在该轻链的3'端引入OB-折叠结构域的变体，

-编码抗体重链的遗传序列，

-编码抗体轻链的遗传序列。

在重链和轻链结合后，所得产物将是：

-对称的双特异性分子，其结合抗体的抗原和OB-折叠结构域变体的靶标，所述OB-折叠结构域的变体位于轻链的C端(预期的百分比为25％)。

-非对称的双特异性分子，其结合抗体的抗原和OB-折叠结构域变体的靶标，所述OB-折叠结构域的变体位于唯一一条轻链的C端(预期的百分比为50％)。

-对称的抗体(预期的百分比为25％)。

应当注意，所得分子是对称的，并且应具有四个结合位点(两个抗体Fab结合位点，以及在轻链C端的OB-折叠结构域的两个变体的结合位点)。

当用以下转化细胞时，可以进行其他组合

-编码抗体轻链的遗传序列，并在该轻链的5'端引入OB-折叠结构域的变体，

-编码抗体重链的遗传序列，

-编码抗体轻链的遗传序列。

或者，用以下：

-编码抗体重链的遗传序列，并在该轻链的3'端引入OB-折叠结构域的变体，

-编码抗体重链的遗传序列，

-编码抗体轻链的遗传序列。

或者，用以下：

-编码抗体重链的遗传序列，并在该轻链的5'端引入OB-折叠结构域的变体，

-编码抗体重链的遗传序列，

-编码抗体轻链的遗传序列。

多特异性分子的生产

在另一实施方案中，应在细胞内引入：

-编码抗体轻链的遗传序列，在该轻链的5'端引入OB-折叠结构域的变体。

-编码抗体重链的遗传序列，在该重链的5'端引入OB-折叠结构域的变体。

在重链和轻链结合后，所得分子将是多特异性分子，其结合抗体的抗原和OB-折叠结构域变体的靶标，所述OB-折叠结构域的变体位于轻链的N端和重链的N端。

应当注意，所得分子应具有六个结合位点(两个抗体Fab结合位点，以及在轻链N端和轻链N端的OB-折叠结构域的四个变体中的每一个的结合位点)，如图1G所示。

在另一实施方案中，应在细胞内引入：

-编码抗体轻链的遗传序列，在该轻链的3'端引入OB-折叠结构域的变体。

-编码抗体重链的遗传序列，在该重链的5'端引入OB-折叠结构域的变体。

在重链和轻链结合后，所得分子将是多特异性分子，其结合抗体的抗原和OB-折叠结构域变体的靶标，所述OB-折叠结构域的变体位于轻链的C端和重链的N端。

应当注意，所得分子应具有六个结合位点(两个抗体Fab结合位点，以及在轻链C端和轻链N端的OB-折叠结构域的四个变体中的每一个的结合位点)，如图1E所示。

在另一实施方案中，应在细胞内引入：

-编码抗体轻链的遗传序列，在该轻链的5'端引入OB-折叠结构域的变体。

-编码抗体重链的遗传序列，在该重链的3'端引入OB-折叠结构域的变体。

在重链和轻链结合后，所得分子将是多特异性分子，其结合抗体的抗原和OB-折叠结构域变体的靶标，所述OB-折叠结构域的变体位于轻链的N端和重链的C端。

应当注意，所得分子应具有六个结合位点(两个抗体Fab结合位点，以及在轻链N端和轻链C端的OB-折叠结构域的四个变体中的每一个的结合位点)，如图1I所示。

在另一实施方案中，应在细胞内引入：

-编码抗体轻链的遗传序列，在该轻链的3'端引入OB-折叠结构域的变体。

-编码抗体重链的遗传序列，在该重链的3'端引入OB-折叠结构域的变体。

在重链和轻链结合后，所得分子将是多特异性分子，其结合抗体的抗原和OB-折叠结构域变体的靶标，所述OB-折叠结构域的变体位于轻链的C端和重链的C端。

应当注意，所得分子应具有六个结合位点(两个抗体Fab结合位点，以及在轻链C端和轻链C端的OB-折叠结构域的四个变体中的每一个的结合位点)，如图1K所示。

在另一实施方案中，应在细胞内引入：

-编码抗体轻链的遗传序列，在该轻链编码序列的5'端引入OB-折叠结构域的变体以及在该轻链编码序列的3'端引入OB-折叠结构域的变体(相同或不同)，

-编码抗体重链的遗传序列。

在重链和轻链结合后，所得分子将是多特异性分子，其结合抗体的抗原和OB-折叠结构域变体的靶标，所述OB-折叠结构域的变体位于轻链的N端和C端。

应当注意，所得分子应具有六个结合位点(两个抗体Fab结合位点，以及在轻链N端和C端的OB-折叠结构域的四个变体中的每一个的结合位点)，如图1J所示。

在另一实施方案中，应在细胞内引入：

-编码抗体重链的遗传序列，在该重链编码序列的5'端引入OB-折叠结构域的变体以及在该重链编码序列的3'端引入OB-折叠结构域的变体(相同或不同)，

-编码抗体轻链的遗传序列。

在重链和轻链结合后，所得分子将是多特异性分子，其结合抗体的抗原和OB-折叠结构域变体的靶标，所述OB-折叠结构域的变体位于重链的N端和C端。

应当注意，所得分子应具有六个结合位点(两个抗体Fab结合位点，以及在重链N端和C端的OB-折叠结构域的四个变体中的每一个的结合位点)，如图1F所示。

在上述实施方案中，在重链和轻链末端引入的OB-折叠结构域的变体是相同的或不同的。

当变体不同时，它们可以：

-基于不同的OB-折叠结构域并结合相同的靶标

-基于不同的OB-折叠结构域并结合不同的靶标

-基于相同的OB-折叠结构域并结合不同的靶标

-基于相同的OB-折叠结构域并结合相同的靶标(具有不同的突变)。

也可以用其他编码序列转化或转染细胞，以获得不对称分子。

用于生产多特异性分子的其他实施方案

三种遗传序列

在其他实施方案中，用三种遗传序列转化或转染细胞：

(i)编码抗体轻链的遗传序列，

(ii)编码抗体重链的遗传序列，(在3'或5'端)与编码OB-折叠结构域变体(A)的遗传序列融合，

(iii)编码抗体重链的遗传序列，(在3'或5'端)与编码另一个OB-折叠结构域变体(B)的遗传序列融合。

在另一实施方案中，三种遗传序列是：

(i)编码抗体重链的遗传序列，

(ii)编码抗体轻链的遗传序列，(在3'或5'端)与编码OB-折叠结构域变体(A)的遗传序列融合，

(iii)编码抗体轻链的遗传序列，(在3'或5'端)与编码另一个OB-折叠结构域变体(B)的遗传序列融合。

因此，细胞将产生三种不同类型的多特异性蛋白，其理论上的比例如下：

-双特异性蛋白(与抗体的抗原和变体(A)的靶标结合)：25％

-双特异性蛋白(与抗体的抗原和变体(B)的靶标结合)：25％

-三特异性蛋白(与抗体的抗原以及变体(A)和(B)的靶标结合)：25％。

如上所述，OB-折叠结构域的变体(A)和(B)可以相同或不同。

当变体不同时，它们可以是：

-基于不同的OB-折叠结构域并结合相同的靶标，

-基于不同的OB-折叠结构域并结合不同的靶标，

-基于相同的OB-折叠结构域并结合不同的靶标，

-基于相同的OB-折叠结构域并结合相同的靶标(具有不同的突变)。

多融合遗传序列

也可以在编码抗体轻链或重链的遗传序列的5′和3′端融合编码OB-折叠结构域变体的遗传序列。

如上所述，其中融合的遗传序列可以编码相同或不同的变体。

具体的实施方案为：

要生产具有六个结合位点的蛋白(如果对称，当OB-折叠变体不同时，则这些蛋白将具有四重特异性)。

-编码抗体重链的遗传序列，在该重链编码序列的5'端引入OB-折叠结构域的变体以及在该重链编码序列的3'端引入OB-折叠结构域的变体(相同或不同)，

-编码抗体轻链的遗传序列，在该轻链编码序列的5'端引入OB-折叠结构域的变体，从而产生如图1N所示的蛋白。

-编码抗体轻链的遗传序列，在该轻链编码序列的5'端引入OB-折叠结构域的变体以及在该轻链编码序列的3'端引入OB-折叠结构域的变体(相同或不同)，

-编码抗体重链的遗传序列，在该重链编码序列的5'端引入OB-折叠结构域的变体，从而产生如图1O所示的蛋白。

-编码抗体重链的遗传序列，在该重链编码序列的5'端引入OB-折叠结构域的变体以及在该重链编码序列的3'端引入OB-折叠结构域的变体(相同或不同)，

-编码抗体轻链的遗传序列，在该轻链编码序列的3'端引入OB-折叠结构域的变体，从而产生如图1M所示的蛋白。

-编码抗体轻链的遗传序列，在该轻链编码序列的5'端引入OB-折叠结构域的变体以及在该轻链编码序列的3'端引入OB-折叠结构域的变体(相同或不同)，

-编码抗体重链的遗传序列，在该重链编码序列的3'端引入OB-折叠结构域的变体，从而产生如图1L所示的蛋白。

用这些遗传序列转化或转染细胞，会导致呈现八个结合位点(两个抗体Fab结合位点以及OB-折叠结构域变体的六个结合位点)的多特异性蛋白。

还可以通过用以下转化或转染细胞，来获得具有十个结合位点的蛋白：

-编码抗体重链的遗传序列，在该重链编码序列的5'端引入OB-折叠结构域的变体以及在该重链编码序列的3'端引入OB-折叠结构域的变体(相同或不同)，

-编码抗体轻链的遗传序列，在该轻链编码序列的5'端引入OB-折叠结构域的变体以及在该轻链编码序列的3'端引入OB-折叠结构域的变体(相同或不同)，从而产生如图1H所示的蛋白。

如上所述，在所有实施方案中，OB-折叠结构域的变体可以相同或不同。

当变体不同时，它们可以是：

-基于不同的OB-折叠结构域并结合相同的靶标，

-基于不同的OB-折叠结构域并结合不同的靶标，

-基于相同的OB-折叠结构域并结合不同的靶标，

-基于相同的OB-折叠结构域并结合相同的靶标(具有不同的突变)。

进一步预期，如上所述，用多个遗传序列转化或转染细胞，从而产生各种多特异性蛋白的混合物(其中一些是非对称的)。

分子的用途

可在Fan等人Journal of Hematology&Oncology(2015)8：130的表I中可以发现靶标和用途，其通过引用并入本文。该表中列出的双特异性抗体的靶标的任何组合可用于本文公开的多特异性分子。Yang等人(Int J Mol Sci.2017Jan；18(1)：48)也描述了靶标和用途，该文献也通过引用并入本文。具体地，下面描述靶标的组合和潜在用途。

由于细胞毒性T淋巴细胞在针对癌症的免疫反应中起重要作用，并且肿瘤细胞可能逃避免疫反应，因此一种策略是使用双特异性分子在肿瘤细胞附近募集T细胞。T细胞的活化和增殖导致肿瘤细胞裂解。

多特异性分子的一个靶标是肿瘤相关抗原，第二个靶标是T细胞上的CD3。还可以在辅助细胞(如巨噬细胞、树突状细胞和NK细胞)上结合I型(CD64)、IIα(CD32a)、III型Fcγ(CD16)受体(FcγR)，以改善免疫反应。

癌症免疫疗法

改变宿主对抗药性的反应/代谢通路

双特异性抗体是最佳选择，因为它们可以同时抑制两个相关的信号传导分子，尤其是抑制检查点分子，这是阻碍免疫疗法的主要抑制因素。

HER2是多种癌症的有效靶标。HER3信号传导是抗HER2抑制剂抗药性的重要机制。双重靶向HER2/HER3可以导致更有效的反应。

依赖EGFR和HER3的信号传导失调与人类癌症(如头颈癌和结肠直肠癌)的发病机制有关。

靶向HER2和HER3恢复了对GDC-0941的敏感性，并使GDC-0941再次停止前列腺癌的生长(Poovassery等人Int.J.Cancer.2015；137：267–277)。

抗血管生成

肿瘤血管生成涉及多种血管生成因子(包括内皮生长因子受体2(VEGFR2)、VEGFR3、内皮生长因子A(VEGFA)、血管生成素、和血小板衍生的生长因子(PDGF))。许多癌症疗法通过消耗这些蛋白来破坏血管生成。双重靶向血管生成因子可导致更好的预后(Biel和Siemann Cancer Lett.2016年10月1日；380(2)：525-33)。

过继性T细胞转移用于癌症免疫疗法

靶标是PD-1、肿瘤抗原、在T淋巴细胞表面表达的分子。

在体外存在双特异性分子与癌细胞和T淋巴细胞，将允许有效地引发T淋巴细胞，然后可以将其注射到患者体内。

可以使用双特异性PD-1/CD3、肿瘤抗原/CD3、HER2/CD3。也可以遵循Urbanska等人的教导(J.Transl.Med.2014；12：347)，其使用双特异性抗体(CD20/CD3或HER2/CD3)和工程化的T细胞。

结合细胞因子

几种细胞因子已被确定为炎症和自身免疫性疾病的关键介质。因此，阻断这些细胞因子具有治疗潜力。例如，TNF-α的抑制作用对牛皮癣、牛皮癣关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、青少年关节炎和许多其他疾病具有深远的治疗作用。其他验证的细胞因子包括IL-6、IL-17、IL-1、IL-12、TGF-β、IL-4和IL-13。

有效荷载的递送

一个感兴趣的应用是有效载荷(如药物、放射性标记和纳米颗粒)的递送。一旦未结合的双特异性分子从血流中清除，就进行有效载荷的施用。双特异性分子可用于富集肿瘤部位的有效载荷。该策略显著延长了血清保留时间并改善了肿瘤/血液比率。人们可以援引用于肿瘤成像和放射免疫疗法的双特异性TF2，它与CEA和^99mT标记的半抗原组胺-琥珀酰-甘氨酸(HSG)特异性结合。在临床前试验中，首先注射TF2，然后在从血液中清除bsAb之后再施用^99mT标记的HSG。观察到高的肿瘤/血液比率和高的^99mT肿瘤摄取。TF2正在结直肠癌患者的I期研究中。TF2的其他应用包括靶向^177LuHSG/^111InHSG和CEA用于结直肠肿瘤患者的放射免疫疗法，以及靶向^68GaHSG和CEA用于免疫正电子发射断层扫描(来自Fan等人.Journal of Hematology&Oncology(2015)8：130)。

异羟基洋地黄毒苷(作为半抗原，Dig)可用作有效载荷的支架，以装载某些细胞毒性部分(例如荧光团、螯合剂、化学治疗剂、核酸、脂质、纳米颗粒或肽和蛋白)，最后形成化合物，例如Dig-Cy5、Dig-阿霉素和Dig-GFP。还显示了基于半抗原的双特异性抗体也是有效的siRNA递送系统，尤其是对于3'端异羟基洋地黄毒苷化的siRNA，其被制备到纳米颗粒中与双特异性抗体结合，从而结合肿瘤抗原(例如HER2、IGF1-R、CD22和LeY)，它们将siRNA特异地递送到表达相应抗原的细胞中，并导致其内在化并进入内体并从双特异性抗体中分离Dig-siRNA(Schneider等人，Mol.Ther.Nucleic Acids.2012；1：e45)。

细菌小细胞(minicell)是通过使得控制正常细菌细胞分裂的基因失活而产生的无核纳米颗粒。化疗药物可以包装到小细胞中，然后小细胞与双特异性分子连接，并与细胞膜(例如癌细胞)上的抗原结合，导致内吞、细胞内降解和药物释放(Solomon等人,PLoSONE.2015；10：e0144559)。

穿越血脑屏障

Couch等人和Yu等人设计了与转铁蛋白受体(TfR)和β位点APP裂解酶1(BACE1)结合并穿过血脑屏障的bsAb。

诊断分析

感染性疾病的治疗

其他用途

治疗方法

本发明还涉及如上所述的多特异性分子作为药物，和/或其用于治疗或预防需要抑制靶标的疾病的用途。显然，如上所述，靶标的选择取决于希望治疗或预防的疾病。

治疗方法也是本发明的一部分。本发明还包括治疗有此需要的患者的方法，包括施用治疗有效量的本文公开的分子的步骤。在此，“治疗有效量”定义为足以获得临床效果(减轻不良状况)的量。它可以通过II期临床试验确定。它可以作为单剂量或根据多剂量方案单独施用或与另一种药物联合施用。考虑到对患者健康的好处，优选是无毒的或具有可接受的毒性。受试者可以是人或非人动物(例如，兔子、大鼠、小鼠、猴或其他低级灵长动物)。

应使用本领域已知的一种或多种生理上可接受的载体或赋形剂配制本文公开的分子，并通过任何合适的方式和通过任何合适的途径施用。因此，可以预期肠胃外(例如，肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下)、肺内和鼻内、如果需要局部免疫抑制治疗、病灶内施用。注射剂(具体而言是静脉注射剂)是优选的。施用途径可根据要治疗的疾病而变化。

抗TNF-α的分子通常用于治疗炎性疾病(关节炎、类风湿关节炎、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、鼻炎、牛皮癣、克罗恩病)以及某些癌症(结直肠癌、乳腺癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤、其他实体癌)或其他免疫系统疾病。

抗IL17的分子通常也用于治疗相同类型的炎性疾病(关节炎、类风湿关节炎、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、鼻炎、牛皮癣、克罗恩病、强直性脊柱炎)以及某些癌症(结直肠癌、乳腺癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤、其他实体癌)或其他免疫疾病(包括多发性硬化症)。

因此，包含与TNF-α结合的抗体和与IL17结合的OB-折叠变体(或Dac7d家族的蛋白)的复合物(反之亦然)可用于治疗此类疾病。

具体的组合物

具体而言，本发明涉及如上所述的多肽，其中Sac7d家族蛋白的变体结合至TNFα的亚基。优选地，当这样的亚基蛋白以其天然状态参与完整形成的多聚蛋白时，它不结合至该蛋白的亚基。

发明人确实已经确定，有可能鉴定与TNF-α可溶性亚基结合的Sac7d家族蛋白的变体，这将导致避免形成生物学活性的多聚蛋白或向单体(或多聚体非活性)亚基的平衡转移。

具体而言，这样的变体包括序列：

具体而言，1至13，优选1至11，更优选1至10，更优选1至8，更优选1至6，更优选1至5，更优选1至4，更优选1至3，更优选2，更优选1个选自V7、M8、F9、K11、V21、H22、M24、Q26、L29、E35、D41、F44和P46的氨基酸，更优选地选自V7、M8、F9、K11、V21、Q26、L29、E35、D41、F44和P46的氨基酸已被SEQ ID NO：41中的另一个氨基酸取代。

在该实施方案中，优选抗体与选自以下的蛋白结合：IL17、CD20、IL24、IL12、IL4、IL13、IL6、IL31或其受体和肿瘤特异性抗原，具体而言与Her2、PDL1(程序性死亡-配体1，CD274)或CTLA4结合。

具体而言，抗体与IL17结合(具体而言，是英夫利昔单抗、阿达木单抗、PEG化西妥珠单抗、奥戈木单抗、苏金单抗、阿伐斯单抗、比麦克珠单抗或伏那珠单抗(Vunakizumab))。

具体而言，抗体与CD20结合(具体而言，布朗土维单抗、FBTA05、替坦异贝莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)、莫司妥单抗、欧滨妥珠单抗(Obinutuzumab)、欧卡妥珠单抗(Ocaratuzumab)、欧克里珠单抗(Ocrelizumab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、利妥昔单抗、托西莫单抗(Tositumomab)或维妥珠单抗)。

具体而言，抗体结合IL24。

具体而言，抗体结合IL12。

具体而言，抗体结合IL4(具体而言度匹鲁单抗)。

具体而言，抗体结合IL13。

具体而言，抗体结合IL6(具体而言斯妥昔单抗、欧罗克珠单抗(Olokizumab)或沃巴丽珠单抗(Vobarilizumab))。

具体而言，抗体结合IL31或其受体。

具体而言，抗体与上述肿瘤特异性抗原结合。

具体而言，抗体结合Her2(具体而言，DS-8201、厄妥索单抗(Ertumaxomab)、甘那他单抗(Gancotamab)、马戈妥昔单抗(Margetuximab)、帕妥珠单抗、替米古珠单抗(Timigutuzumab)、曲妥珠单抗或曲妥珠单抗-美坦新偶联物)。

具体而言，抗体结合PDL1(程序性死亡配体1，CD274)。

具体而言，抗体结合CTLA4(具体而言，曲美单抗)。

在另一个实施方案中，Sac7d家族蛋白的变体结合IL17。

在该实施方案中，当Sac7d家族的蛋白的变体包含以下序列之一时，是优选的：

在这个实施方案中，优选抗体与选自以下的蛋白结合：TNFα(具体而言，英夫利昔单抗、阿达木单抗、PEG化西妥珠单抗、奥戈木单抗)、IL23(具体而言布拉兹库单抗(Brazikumab)、古赛尔库单抗(Guselkumab)、米立单抗(Mirikizumab)、利散珠单抗(Risankizumab)、或替尔达珠单抗(Tildrakizumab))、IL12(具体而言，布利埃克单抗(Briakinumab)、优特克单抗(Ustekinumab))、IL4(具体而言，度匹鲁单抗(Dupilumab))、IL13(具体而言，安鲁金珠单抗(Anrukinzumab))、IL31或其受体和肿瘤特异性抗原，具体而言，Her2(具体而言，DS-8201、厄妥索单抗(Ertumaxomab)、甘那他单抗(Gancotamab)、马戈妥昔单抗(Margetuximab)、帕妥珠单抗、替米古珠单抗(Timigutuzumab)、曲妥珠单抗或曲妥珠单抗-美坦新偶联物))、PDL1(程序性死亡配体1，CD274)或CTLA4(具体而言，曲美单抗)。

具体而言，抗体结合TNFα(具体而言，英夫利昔单抗、阿达木单抗，PEG化西妥珠单抗或奥格木单抗)。

具体而言，抗体结合IL23(具体而言布拉兹库单抗(Brazikumab)、古赛尔库单抗(Guselkumab)、米立单抗(Mirikizumab)、利散珠单抗(Risankizumab)、或替尔达珠单抗(Tildrakizumab))。

具体而言，抗体结合IL12(具体而言，布利埃克单抗(Briakinumab)或优特克单抗(Ustekinumab))。

具体而言，抗体结合IL4(具体而言，度匹鲁单抗(Dupilumab))。

具体而言，抗体结合IL13(具体而言，安鲁金珠单抗(Anrukinzumab))。

具体而言，抗体结合IL31或其受体。

具体而言，抗体与上述肿瘤特异性抗原结合。

具体而言，抗体结合Her2(具体而言，DS-8201、厄妥索单抗(Ertumaxomab)、甘那他单抗(Gancotamab)、马戈妥昔单抗(Margetuximab)、帕妥珠单抗、替米古珠单抗(Timigutuzumab)、曲妥珠单抗或曲妥珠单抗-美坦新偶联物))。

具体而言，抗体结合PDL1(程序性死亡配体1，CD274)。

具体而言，抗体结合CTLA4(具体而言，曲美单抗)。

Sac7d的特定变体与IL17结合

本发明还涉及包含Sac7d家族蛋白的变体的多肽，该变体在结合IL17的Sac7d家族蛋白的结合位点中包含4至22个突变的氨基酸，具体而言如本文所公开的，如此改善或稳定抗体的生产。需提示，Sac7d的序列为：

可能获得上述多肽，其中所述Sac7d变体的突变氨基酸选自Sac7d的V2、K3、K5、K7、Y8、K9、G10、E11、K13、E14、T17、K21、K22、W24、V26、G27、K28、M29、S31、T33、Y34、D35、D36、N37、G38、K39、T40、G41、R42、A44、S46、E47、K48、D49、A50和P51。

可能获得上述多肽，其中所述Sac7d变体包含4至17个突变的氨基酸，其选自Sac7d的K7、Y8、K9、E11、K21、K22、W24、V26、M29、S31、T33、D35、T40、G41、R42、A44和S46。

在该实施方案中，优选Sac7d家族蛋白的变体包含以下序列之一：

具体而言，这样的多肽包含序列SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：38，其中1至10，更优选1至8，更优选1至6，更优选1至5，更优选1至4，更优选1至3个，更优选2个，更优选1个选自V7、M8、F9、K11、Q26、L29、E35、D41、F44和P46的氨基酸被另一氨基酸取代。实际上，申请人已经表明可以修饰这些残基而不改变观察到的结合。通过用丙氨酸替换这些残基并检查结合来进行。由于没有结合损失，这表明这些残基对于与IL17的结合并不重要。

在具体的实施方案中，所述具体的Sac7d变体与另一蛋白或多肽连接或融合。具体而言，所述其他蛋白或多肽包含Sac7d家族蛋白的另一变体。如上所述，还可以预期其他蛋白或多肽是抗体时，优选是与TNF-α或Her2/neu结合的抗体。

在另一个实施方案中，Sac7d家族的变体缀合至有机分子。这可以通过本领域已知的任何方法来完成。具体而言，可以将分子化学连接至蛋白。作为分子，可以列举出抗增殖剂(细胞毒性和细胞抑制剂)，包括细胞毒性化合物(例如，广谱的)、血管生成抑制剂、细胞周期进程抑制剂、PBK/m-TOR/AKT通路抑制剂、MAPK信号传导通路抑制剂、激酶抑制剂、蛋白伴侣抑制剂、HDAC抑制剂、PARP抑制剂、Wnt/Hedgehog信号传导通路抑制剂、RNA聚合酶抑制剂和蛋白酶体抑制剂。也可以使用抗炎分子。

可以特别提及DNA结合或烷基化药物，例如蒽环类药物(阿霉素、表柔比星、伊达比星、柔红霉素)及其类似物、烷基化剂，例如加利车霉素、放线菌素、mitromycine、吡咯并苯二氮杂卓等。也可以列举细胞周期进展抑制剂，例如CDK抑制剂、Rho激酶抑制剂、检查点激酶抑制剂、极光激酶抑制剂、PLK抑制剂和KSP抑制剂。也可以列举沙利度胺及其衍生物来那度胺和泊马度胺。为了治疗炎症疾病，还可以使用环氧合酶-2抑制剂、5-脂氧合酶抑制剂、槲皮素和/或白藜芦醇作为分子，使其与包含变体的多肽缀合。

本发明还涉及包含DNA序列的遗传构建体，所述DNA序列编码本文公开的多肽(Sac7d家族的蛋白的变体，其与IL17结合)。

本发明还涉及包含上述遗传构建体的载体、在基因组中包含该遗传构建体的宿主细胞、以及生产这种与IL17结合的Sac7d家族蛋白的变体的方法，包括以下步骤：

a.培养细胞培养物，其中细胞已转化有所公开的遗传构建体，

和

b.回收所述多肽。

可以通过本领域已知的任何分子遗传方法，将鉴定的变体的序列克隆到任何合适的载体中。

包含核苷酸序列的这些重组DNA构建体与载体(例如质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体)组合使用，其中所述核苷酸序列编码包含上述变体的多肽。

可以通过Sambrook等人，1989(Sambrook J,Fritschi EF and Maniatis T(1989)Molecular cloning：laboratorymanual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NewYork)中描述的技术生产这些重组核酸分子。或者，可以使用例如合成仪化学合成DNA序列。

本发明的重组构建体包含表达载体，所述表达载体能够表达RNA并因此从上述遗传序列中生产出蛋白。因此，载体可以进一步包含调控序列，包括与本文公开的遗传序列开放阅读框(ORF)可操作地连接的合适的启动子。载体可以进一步包含选择标记序列，例如抗生素抗性基因。当细菌用作表达宿主时，可能还需要具体的起始信号和细菌分泌信号来有效翻译编码序列。

分子的生产

用载体来转染或转化细胞，所述载体含有编码包含上述公开的变体的多肽的序列。

在表达和有利地分泌蛋白的条件下培养细胞。细胞的培养条件是通常用于重组抗体生产的条件，并且是本领域已知的。如果需要，本领域技术人员还可以优化本领域已知的这种条件。Kunert和Reinhart(Appl Microbiol Biotechnol.2016；100：3451-3461)回顾了这些方法并提供了充足的参考。

可以使用细菌、噬菌体(Shukra等人，Eur J Microbiol Immunol(Bp).2014；4(2)：91-98)或真核生产系统。

应该更优选使用真核细胞以获得适当的翻译后修饰，例如糖基化。

具体而言，可以使用CHO(中国仓鼠卵巢)细胞、PER.C6细胞(人细胞系，Pau等人,Vaccine.2001 21；19(17-19)：2716-21)、HEK 293b细胞(人胚胎肾细胞293)、NS0细胞(非分泌型鼠骨髓瘤来源的细胞系)或EB66细胞(鸭细胞系Valneva，法国里昂)。

本公开还提供了包含至少一种DNA构建体的宿主细胞，所述DNA构建体编码包含本文公开的变体的多肽。宿主细胞可以是可适用于表达载体的任何细胞。如上所述，它可以是高等真核宿主细胞(例如哺乳动物细胞)，低等真核宿主细胞(例如酵母细胞)，或原核细胞(例如细菌细胞)。

通过本领域已知的任何方法(例如磷酸钙转染、脂质转染、DEAE、葡聚糖介导的转染、电穿孔或噬菌体感染)将重组构建体引入宿主细胞。这些载体可以插入宿主细胞的基因组中，也可以保持为基因组外载体(例如细菌人工染色体或酵母人工染色体)。当引入细胞基因组中时，使用本领域已知的方法，这种引入可以是随机的或靶向的(同源重组等)。

细菌宿主和表达

通过将重组DNA序列与合适的翻译起始和终止信号一起插入具有功能性启动子的可操作阅读框(reading phase)，来构建用于细菌的有用表达载体。载体将包含一种或多种表型选择标记和复制起点，以确保载体的维持，并且如果需要，允许在宿主内扩增。

用于转化的合适的原核宿主包括大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)内的各种物种。

真核宿主和表达

真核宿主细胞的示例包括脊椎动物细胞、昆虫细胞和酵母细胞。具体而言，可以使用上述细胞。

按照本领域已知的方法来培养经转化的或转染的细胞，并(根据是否分泌)从细胞内或细胞外馏分中回收多肽。

分子的分离

可以通过各种已知分离方法中的任何一种，利用蛋白的物理或化学性质从细胞内或细胞外馏分中分离和纯化产生的重组多特异性蛋白。

具体而言，可以使用方法，例如沉淀、超滤、各种液相色谱法，如分子筛色谱(凝胶过滤)、吸附色谱、离子交换色谱、和亲和色谱、透析及其组合。

通常，任何已知的和用于纯化重组多肽的方法都适用于纯化本文公开的分子。

如果在重组序列中引入了标签(例如聚组氨酸标签)，则可以使用该标签纯化分子。但是，优选利用亲和性来纯化分子。

具体而言，可以利用以下事实：此处生产的分子与特定靶标结合，并使用任何亲和性方法(亲和柱、FACS、珠)分离出这样的分子。

本文公开的分子的一个具体优点是：它们不需要糖基化即可具有活性，因此可以在任何类型的细胞中生产，而不必在真核细胞中生产。它们尤其易于在细菌细胞中生产。

本发明还涉及这种结合IL17的Sac7d家族蛋白的变体作为药物。

附图说明

图1：根据本发明的15种蛋白的示意图。这些蛋白是对称的。A.重链N端的OB-折叠变体。A.重链C端的OB-折叠变体。C.轻链N端的OB-折叠变体。D.轻链C端的OB-折叠变体。E.重链N端和轻链C端的OB-折叠变体。F.重链N和C端的OB-折叠变体。G.重链N端和轻链N端的OB-折叠变体。H.重链和轻链N端和C端的OB-折叠变体。I.重链N端和轻链N端的OB-折叠变体。J.轻链N和C端的OB-折叠变体。K.重链C端和轻链C端的OB-折叠变体。L.重链C端和轻链N和C端的OB-折叠变体。M.重链N和C端和轻链C端的OB-折叠变体。N.重链N和C端和轻链N端的OB-折叠变体。O.重链N端和轻链N和C端的OB-折叠变体。

图2：Sac7d家族蛋白的比对。

图3：将Protein A生物传感器加载到带有抗体-Sac7d变体构建体的octet RD96上。A5-HC：重链N端的Sac7D变体。HC-A5：重链C端的Sac7D变体。A5-LC：轻链N端的Sac7D变体。LC-A5：轻链C端的Sac7D变体。裸抗体：对照抗体。

图4：当在重链(HC)或轻链(LC)的N端或C端与Sac7d变体(H4)融合时，抗体功能示意图。HC-H4：重链C端的Sac7D变体。H4-LC：轻链N端的Sac7D变体。LC-H4：轻链C端的Sac7D变体。

图5：当在重链(HC)或轻链(LC)的N端或C端与抗体融合时，Sac7d(H4)变体的功能示意图。HC-H4：重链C端的Sac7D变体。H4-LC：轻链N端的Sac7D变体。LC-H4：轻链C端的Sac7D变体。

图6：在octet RED96上通过生物层干扰量度法，说明了不同双特异性结构的双重结合能力。HC-H4：重链C端的Sac7D变体。H4-LC：轻链N端的Sac7D变体。LC-H4：轻链C端的Sac7D变体。

图7：各种构建体的最终产量(总产量)的说明。H4-HC：重链N端的Sac7D变体。HC-H4：重链C端的Sac7D变体。H4-LC：轻链N端的Sac7D变体。LC-H4：轻链C端的Sac7D变体。HC-LC对照：对照抗体。

图8：与裸抗体(A)阿达木单抗和(B)英夫利昔单抗相比，不同抗体嵌合体(带有抗IL17的Sac7d变体)的相对蛋白生产。

具体实施方式

实施例

当OB-折叠插入重链或轻链的N端或C端时，通过与OB-折叠的遗传融合而产生的双特异性抗体，可导致四种不同的双特异性构建体。以下实验举例说明了Sac7d变体的变体与IgG1 kappa抗体的融合。这些实验是为了展示对概念的证明，并且可以维持抗体片段与OB-折叠变体的结合特异性，以及融合蛋白的生产水平(与没有融合OB-折叠变体的抗体产量相比，这种生产是相似的，或者甚至是提高的)。

重链和轻链的恒定片段分别通过商业编码载体pFUSE-CHIg-hIG1(InvivoGen)和pFUSE2ss-CLIg-hk(InvivoGen)获得。

通过基因合成(Eurofins)获得相应的可变结构域。

通过PCR，从源自pQE30(Qiagen)的表达载体亚克隆产物中，直接扩增出Sac7d变体的DNA编码序列。

应用时，然后通过Gibson Assembly组装恒定片段、可变结构域和Sac7d变体的序列，以产生6种不同的载体，其中三种衍生自pFUSE-CHIg-hIG1载体，另外三种衍生自pFUSE2ss-CLIg-hk载体。在所有情况下，载体的区别在于Sac7d变体序列位于抗体链序列的上游(融合在N-端)或下游(融合在C-端)，或不存在(无融合)。

总而言之，六种载体编码：

-仅抗体的轻链

-在N端与Sac7d变体融合的抗体的轻链

-在C端与Sac7d变体融合的抗体的轻链

-仅抗体的重链

-在N端与Sac7d变体融合的抗体的重链

-在C端与Sac7d变体融合的抗体的重链。

以下实施例说明了本文预期的多肽的构建。

使用其他Sac7d变体和抗体一起获得其他此类多肽，对其进行分析得出的结果与以下报道的结果相似(易于生产，既与Sac7d变体的靶标结合，又与抗体的靶标结合)。

根据WO 2008/068637中公开的方法产生Sac7d变体，使用核糖体展示从具有多达14个突变氨基酸的文库中分离出针对给定靶标的变体。

总之，在各种实验中使用了超过7个Sac7d变体。每个变体结合至不同靶标或同一靶标的不同表位。与Sac7d相比，这些变体有14(残基7、8、9、21、22、24、26、29、31、33、40、42、44、46)，11(残基7、22、24、26、29、31、33、38、42、44、46)，10(残基21、22、24、26、29、31、33、42、44、46)，10(残基21、22、24、26、29、31、33、40、44、46)，9(残基21、22、24、26、31、33、42、44、46)个突变氨基酸。

3种抗体，每种结合不同的靶标或同一靶标(循环蛋白)的不同表位。

使用如下所述的相似方法制备融合多肽的28种组合，并且结果均相似。

具体而言，所用的Sac7d变体针对与抗TNF-α融合的IL17(特别是SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38)。使用了其他Sac7d变体(特别是与TNF-α结合的SEQ ID NO：41或与称为H4的溶菌酶结合的SEQ ID NO：42)。还使用了针对其他靶标的其他Sac7d变体。如上所述，回收的多肽抗体-Sac7d变体的产量始终等于或高于没有Sac7d变体的抗体的产量，并且每次检查都确认了双重亲和性。

如上所述，假设可以通过添加Sac7d变体来稳定复合物的整体结构(因此导致产量提高)。由于抗体和Sac7d变体均保持其结构(如通过双重结合试验所显示，它们保留了其功能)，因此可以认为实施例中针对各物种提供的结果可以概括为整个属。

实施例1.融合至重链(N或C端)

提供了完整重链的构建描述。

Sac7d变体序列在全重链N端的融合包括通过Gibson Assembly对pFUSE-CHIg-hIG1载体进行的DNA再工程改造，这涉及通过PCR扩增两个片段和线性化载体来制备。

根据PCR程序1，用正向寡核苷酸oligoCH-1(

SEQ IDNO：16)和反向寡核苷酸VHfuse_Rev(

SEQ ID NO：17)，通过PCR扩增将pFUSE-CHIg-hIG1线性化。

根据PCR程序2，用正向寡核苷酸OligoCH-2(

SEQ ID NO：18)和反向寡核苷酸OligoCH-3(

SEQ ID NO：19)，通过PCR扩增编码可变结构域的DNA序列。

根据PCR程序2，用正向寡核苷酸VH_NF_For(

SEQ ID NO：20)和反向寡核苷酸Glink15.1_Rev(

SEQ ID NO：21)，通过PCR扩增Sac7d变体的DNA序列。

Sac7d变体序列在全重链C端的融合涉及通过PCR扩增三个片段和线性化载体来制备。根据PCR程序1，用正向寡核苷酸OligoCH-4(

SEQ ID NO：22)和反向寡核苷酸IL2ss_Rev(

SEQ ID NO：23)通过PCR扩增将pFUSE-CHIg-hIG1线性化。

根据PCR程序2，用正向寡核苷酸oligoCH-1(SEQ ID NO：16)和反向寡核苷酸OligoCH-5(

SEQ ID NO：24)通过PCR扩增恒定结构域的DNA序列。

根据PCR程序2，用正向寡核苷酸OligoCH-6(

SEQ ID NO：25)和反向寡核苷酸OligoCH-3(SEQ ID NO：19)通过PCR扩增编码可变结构域的DNA序列。

根据PCR程序2，用正向寡核苷酸Glink15.1_For(

SEQ ID NO：26)和反向寡核苷酸OligoCH-7(

SEQ ID NO：27)通过PCR扩增Sac7d变体的DNA序列。

构建不与Sac7d变体编码序列融合的全重链，这涉及PCR扩增一个片段和线性化载体。根据PCR程序3，用正向寡核苷酸oligoCH-1(SEQ ID NO：16)和反向寡核苷酸IL2ss_Rev(SEQ ID NO：23)通过PCR扩增将pFUSE-CHIg-hIG1线性化。根据PCR程序2，用正向寡核苷酸OligoCH-6(SEQ ID NO：25)和反向寡核苷酸OligoCH-3(SEQ ID NO：19)通过PCR扩增编码可变结构域的DNA序列。

然后在含有Gel Green核酸染料(1×)的1.5％(可变片段扩增序列和Sac7d变体扩增序列)和0.8％(线性化质粒)琼脂糖凝胶上，验证PCR产物，并在紫外光下切割感兴趣的条带，并使用Wizard SV凝胶和PCR纯化系统试剂盒(Promega)纯化。为了增加所产生的插入片段的数量，使用相同的PCR混合物和程序，对5ng纯化的可变片段PCR产物(4个重复)进行第二PCR。在1.5％琼脂糖凝胶上，验证条带的大小后，合并相同的反应物并使用Wizard SV凝胶和PCR纯化系统试剂盒(Promega)纯化。

PCR程序1：98℃30秒；25个变性(98℃10秒)、退火(60℃30秒)和延伸(72℃2分钟)的循环；然后72℃5分钟，使其冷却至14℃；

PCR程序2：98℃30秒；25个变性(98℃10秒)、退火(60℃30秒)和延伸(72℃30秒)的循环；然后72℃5分钟，使其冷却至14℃；

PCR程序3：98℃30秒；25个变性(98℃10秒)、退火(69℃30秒)和延伸(72℃2分钟)的循环；然后72℃5分钟，使其冷却至14℃。

这些PCR允许形成末端重叠的双链DNA，从而通过Gibson Assembly对其进行定向退火。在ISO 1×缓冲液中制备20μL的Gibson Assembly混合物，其包含125ng DNA片段(插入片段/线性质粒的摩尔比为5)、T5核酸外切酶(0,08U，New England Biolabs)、DNAPhusion聚合酶(0,5U，New England Biolabs)和Taq DNA连接酶(80U，New EnglandBiolabs)。在50℃下孵育一小时，使Gibson Assembly发生(Gibson等人，2009)。

将得到的连接载体转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS中。通过热休克，将上述10μL的Gibson Assembly反应物和对照转化到BL21(DE3)pLysS感受态细胞(Coger)的指数细胞培养物(OD_600nm 0.5)。将细胞接种在pH 7.5的2YT琼脂介质上，该介质含有氯霉素(10μg/mL，Sigma-Aldrich)和Zeocin(25μg/mL，InvivoGen)。使用Pure Yield PlasmidMiniprep System(Promega)进行微量制备，并将每个克隆的样品在-80℃的20％甘油中保存。然后通过Sanger测序验证序列。

实施例2.融合至轻链(N或C端)

提供了完整轻链的构建描述。

完整轻链的制备策略遵循制备重链的描述，区别在于命名为oligoCH-1至7的寡核苷酸被相应的称为oligoCL-1至7的寡核苷酸替代：oligoCL-1

，以及使用pFUSE2ss-CLIg-hk而非pFUSE-CHIg-hIG1。

此外，通过以下修饰在大肠杆菌DH5αF'Iq菌株中进行转化：通过热休克，用10μL的Gibson Assembly反应物转化DH5αF'Iq感受态细胞(Life technologies)的指数细胞培养物(OD_600nm 0.5)。将细胞接种在含有卡那霉素(25μg/mL，VWR)和杀稻瘟菌素(Blasticidin)(100μg/mL，InvivoGen)的pH 8的2YT琼脂介质上。

实施例3.一种NF与抗体的融合(+双特异性)

在37℃和110rpm下，具有5％CO2的潮湿气氛中，在1125ml FreeStyle F17介质(补充有4mM Glutamax和0.1％Pluronic F-68)中培养HEK293-E6细胞。转染如下进行：当细胞密度达到1.5×106至2×106细胞/ml时，按照DNA：PEI为1：2的比以及HC：LC为2：3的比，以总共1mg DNA/L的不同质粒对复合聚乙烯亚胺(PEI，polysciences ref 23966)，来转染细胞。转染后6小时，每种培养物均补充有超低IgG胎牛血清和丙戊酸。转染后第5天，于4℃在2.000g离心20分钟而收获培养上清液。通过0.2μm过滤培养上清液，然后装入(预先用PBS+500mM NaCl pH 7.2结合缓冲液平衡的)Hitrap Protein A HP 5ml柱(GE Healthcare)中。用0.1M pH 3.0的柠檬酸缓冲液进行洗脱，馏分用pH 9.0的TRIS缓冲液中和，将含有馏分的产物合并在一起，然后注入Superdex 200 2660凝胶过滤柱中。将保留体积为150至160ml的含有馏分的产物合并在一起，并使用具有50kDa膜截留值的vivapsin离心装置浓缩至1-2mg/ml。

完整IgG抗体的下游纯化是已建立的过程，通常涉及在Protein A柱上进行亲和层析的步骤。

通过在octet RED96上进行生物层干扰量度法证明了捕获不同双特异性抗体的可能性，所述抗体是由Sac7d变体在重链或轻链N端或C端融合生产的。

用四种25nM的双特异性构建体中的任一个，在Protein A生物传感器上加载300秒。所有步骤均在30℃的TBS(Tris 20mM、NaCl 150mM，pH 7.4)中进行，TBS补充有0.01％BSA和0.002％tween 20，并以1000rpm的速度摇动。在所有情况下，观察到快速捕获，而没有解离的痕迹，这反映了结合的稳定性(图3)。

实施例4.一种NF与抗体的融合：与抗体或Sac7d变体的靶标结合

当涉及到在抗体重链或轻链的N端或C端遗传融合Sac7d变体而进行双特异性构建时，通过在octet RED96(Fortebio)上进行生物层干扰量度来证明抗体和Sac7d变体结合各自靶标的能力。

双特异性构建体被加载在Protein A传感器(Fortebio)上。在基线180秒后，允许结合和解离分别发生300秒和900秒。所有步骤均在30℃的TBS(Tris 20mM、NaCl 150mM，pH7.4)中进行，TBS补充有0.01％BSA和0.002％tween 20，并以1000rpm的速度摇动。150nM、125nM、100nM、75nM和50nM的浓度范围用于Sac7d变体靶标。600nM、200nM、66.66nM、22.22nM、7.40nM、2.46nM和0.82nM的浓度范围用于抗体靶标。每次运行后，通过3个甘氨酸10mM pH2(10秒)和TBS(10秒)的循环来再生传感器。

抗体和Sac7d变体连接在一起时，无论融合的位置如何，都保持完整的功能(图4和图5)。

实施例5.一种NF与抗体的融合：双特异性

双特异性分子的优点之一在于：它们同时结合两个不同靶标的能力。

通过在octet RED96上的生物层干扰量度法证明Sac7d变体和抗体同时结合其各自靶标的能力。

双特异性构建体被加载在Protein A传感器(Fortebio)上。在基线180秒后，与抗体靶标(200nM)的结合时间为300秒，然后与Sac7d变体靶标(300nM)的结合时间为300秒。所有步骤均在30℃的TBS(Tris 20mM、NaCl 150mM，pH 7.4)中进行，TBS补充有0.01％BSA和0.002％tween 20，并以1000rpm的速度摇动。

图6显示Sac7d变体和抗体同时结合各自的靶标。

实施例6.与不含NF的抗体相比，产量增加或产量相同

测量了最终产量(对应于所有纯化步骤后获得的产物的量)。

图7显示回收的产物量是相似的，甚至优于从仅为抗体获得的产物量。

实施例7.多于一种的NF与抗体的融合(获得多于两种的特异性)

根据以上针对双特异性分子描述的策略进行多特异性分子的构建。

每增加一种特异性，就多用一次PCR扩增的编码Sac7d变体片段的DNA，从而将其添加到Gibson Assembly混合物的最终分子中。

Gibson Assembly所需的接头和重叠匹配端，被携带到正向和反向寡核苷酸上，并在PCR扩增步骤中添加到Sac7d变体编码序列中。如实施例3中所述纯化多特异性分子。

实施例8.在CHO-K1(AFG)细胞中生产复合物

在含有1％L-谷氨酰胺并补充10％(v/v)失活的超低IgG胎牛血清和1％(v/v)青霉素－链霉素的F-12K介质中，培养中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1，ATCCCCL-61)。将细胞在组织培养皿中扩增，并在95％空气和5％CO2的潮湿恒定气氛中保持在37℃。

转染前一天，将细胞用胰蛋白酶消化，并用0.2％的1：1(v/v)赤藓红B计数。以126.4×10⁶个细胞/每10层Cell Culture Factory进行细胞接种，在转染时达到70-90％汇合度。

对于每个细胞工厂(Cell Factory)，在200

还原血清介质中稀释2mg DNA(1.2mg LC和0.8mg HC)。然后加入2mL、2mg/mL的聚乙烯亚胺(PEI，线性MW 25,000)，并将混合物在室温下孵育25分钟。通过将DNA/PEI复合物添加到新鲜的完全生长介质中来转染细胞。

转染后24h，将介质更换为F-12K完全生长介质，其中添加了抗生素(杀稻瘟菌素(10μg/ml)和zeocin(300μg/ml))和丙戊酸(最终0.5mM)。转染后7天，收集上清液，并根据裸抗体建立的标准，通过生物层干扰量度技术在Protein-A生物传感器上定量蛋白浓度。

将产量与两种商业和治疗性抗体(阿达木单抗和英夫利昔单抗)进行比较。为了产生这些抗体重链与Sac7d蛋白的变体的融合，而制备遗传构建体，Sac7d蛋白的变体在该蛋白的结合结构域中具有12个突变。该变体存在于阿达木单抗重链的N-端或C-端和英夫利昔单抗重链的N-端。

图8显示，对于(A)阿达木单抗和(B)英夫利昔单抗而言，含有融合在重链N-端或C-端的变体的嵌合体，回收多肽的产量得以维持或提高。

实施例9.SHuffle(AFG)技术的用途

长期以来，仅在真核表达宿主(例如哺乳动物细胞系HEK293、CHO和酵母)中生产了复合蛋白(例如对氧化应激敏感的抗体，以及为了其效应功能，需要进行翻译后修饰的抗体)。最近，工程化菌株(如SHuffle)也被证明可用于细胞内生产功能性抗体，也被称为“Cyclonnals”。

如Robinson等人(Nature Comm.,2015；6:8072)所述，使用双顺反子载体在SHuffle表达宿主中研究了抗体(阿达木单抗)和Sac7d蛋白变体(Nanofitin)形成的嵌合体的制备。

构建裸抗体和三种不同的抗体-Nanofitin嵌合体，其中Nanofitin融合在轻链的N端、轻链的C端或重链的C端。

对于所有抗体-Nanofitin嵌合体，将编码15-mer接头的序列插入Nanofitin和抗体DNA序列之间。

感受态T7 SHuffle Express pLysY在37℃在添加了氯霉素(10μg/mL)的2YT介质中生长。将OD 600nm在0.4-0.5之间的培养物等分成1mL馏分，并在4500g下离心5分钟。用200μL冷TSS缓冲液重悬沉淀，然后加入0.5μL待转化的表达载体，在冰上孵育30分钟。将悬浮液在42℃下热休克30秒，然后在冰上5分钟。悬浮液中加入800μL 2YT介质，并在37℃下以200rpm的速度连续摇动孵育。1小时后，将悬浮液以4500g离心5分钟。将沉淀重悬于20μL2YT介质中，并将细菌铺在装有2YT琼脂的平板上，琼脂中添加氯霉素(10μg/mL)和氨苄青霉素(100μg/mL)。将该板在37℃下孵育过夜。

10mL补充有氯霉素(10μg/mL)、氨苄青霉素(100μg/mL)和1％葡萄糖的2YT介质中接种单个菌落。将预培养物在37℃下以200rpm连续摇动孵育过夜。然后在200mL添加有氯霉素(10μg/mL)、氨苄青霉素(100μg/mL)和0.1％的葡萄糖的2YT介质中，接种10mL预培养物。将培养物在30℃下以200rpm连续摇动孵育，直到OD 600nm达到0.7-0.8。然后通过加入IPTG(最终浓度为1mM)来触发蛋白的生产，并将培养保持在30℃并以200rpm的速度再摇动16小时。通过在4℃下以3214g离心30分钟来终止培养。用裂解缓冲液(PBS 1×、5mMEDTA、

1×、5μg/mL DNA酶I)重悬沉淀，并在200rpm摇动下孵育1小时。然后通过在4℃下以3220g离心45分钟沉淀细胞碎片。收集裂解上清。

在Protein A树脂(Pierce Protein A琼脂糖，ThermoFisher Scientific)上通过亲和色谱法，分离表达的抗体嵌合体。将200μL的50％树脂浆液施加到10mL一次性聚丙烯柱上。用10倍柱体积的水洗涤树脂，并用10倍柱体积的PBS(磷酸盐缓冲液，sigma-aldrich，P4417)平衡。将裂解上清加到柱子上，然后用10柱体积的补充有5mM EDTA的PBS洗涤。使用0.1M甘氨酸pH 2-3进行洗脱。收集100μL馏分的洗脱液，然后通过添加10μL Tris 1M(pH 8,8)立即中和。然后通过分光光度法在280nm下评估回收材料的量。在还原条件下，在10％SDS-PAGE凝胶上评估样品的纯度。

在这种生产系统中，嵌合体的产量与裸抗体的产量明显相似(获得的产量之间没有显著差异)。

此外，通过生物层干扰量度法，对Nanafitin-抗体嵌合体的双重结合的评估表明，抗体和Sac7d变体保持其亲和性结合。为此，将Protein A生物传感器以1.5nm加载不同的Nanofitin-抗体嵌合体，然后依次与TNFα(20nM)和IL17(125nM)孵育420秒，然后进行解离阶段(900秒)。

序列表

<110> 艾菲洛之克公司

<120> 多特异性分子

<130> BRV 137 - WO

<150> EP17306580.6

<151> 2017-11-14

<160> 42

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 66

<212> PRT

<213> 嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius

<400> 1

Met Val Lys Val Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Glu Glu Lys Glu Val Asp

1 5 10 15

Thr Ser Lys Ile Lys Lys Val Trp Arg Val Gly Lys Met Val Ser Phe

20 25 30

Thr Tyr Asp Asp Asn Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala Val Ser Glu Lys

35 40 45

Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Asp Met Leu Ala Arg Ala Glu Arg Glu

50 55 60

Lys Lys

65

<210> 2

<211> 64

<212> PRT

<213> 硫磺矿硫化叶菌Sulfolobus solfataricus

<400> 2

Met Ala Thr Val Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Glu Glu Lys Glu Val Asp

1 5 10 15

Ile Ser Lys Ile Lys Lys Val Trp Arg Val Gly Lys Met Ile Ser Phe

20 25 30

Thr Tyr Asp Glu Gly Gly Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala Val Ser Glu

35 40 45

Lys Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu Glu Lys Gln Lys Lys

50 55 60

<210> 3

<211> 65

<212> PRT

<213> 嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius

<400> 3

Met Ala Lys Val Arg Phe Lys Tyr Lys Gly Glu Glu Lys Glu Val Asp

1 5 10 15

Thr Ser Lys Ile Lys Lys Val Trp Arg Val Gly Lys Met Val Ser Phe

20 25 30

Thr Tyr Asp Asp Asn Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala Val Ser Glu Lys

35 40 45

Asp Ala Pro Lys Glu Leu Met Asp Met Leu Ala Arg Ala Glu Lys Lys

50 55 60

Lys

65

<210> 4

<211> 64

<212> PRT

<213> 希氏硫化叶菌Sulfolobus shibatae

<400> 4

Met Val Thr Val Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Glu Glu Lys Glu Val Asp

1 5 10 15

Thr Ser Lys Ile Lys Lys Val Trp Arg Val Gly Lys Met Ile Ser Phe

20 25 30

Thr Tyr Asp Glu Gly Gly Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala Val Ser Glu

35 40 45

Lys Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu Glu Lys Gln Lys Lys

50 55 60

<210> 5

<211> 64

<212> PRT

<213> 希氏硫化叶菌Sulfolobus shibatae

<400> 5

Met Ala Thr Val Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Glu Glu Lys Gln Val Asp

1 5 10 15

Ile Ser Lys Ile Lys Lys Val Trp Arg Val Gly Lys Met Ile Ser Phe

20 25 30

Thr Tyr Asp Glu Gly Gly Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala Val Ser Glu

35 40 45

Lys Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu Glu Lys Gln Lys Lys

50 55 60

<210> 6

<211> 64

<212> PRT

<213> 极端嗜热古菌Sulfolobus tokodaii

<400> 6

Met Val Thr Val Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Glu Glu Lys Glu Val Asp

1 5 10 15

Ile Ser Lys Ile Lys Lys Val Trp Arg Val Gly Lys Met Ile Ser Phe

20 25 30

Thr Tyr Asp Asp Asn Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala Val Ser Glu Lys

35 40 45

Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu Glu Lys Ser Gly Lys Lys

50 55 60

<210> 7

<211> 64

<212> PRT

<213> 冰岛硫化叶菌Sulfolobus islandicus

<400> 7

Met Val Thr Val Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Glu Glu Lys Gln Val Asp

1 5 10 15

Thr Ser Lys Ile Lys Lys Val Trp Arg Val Gly Lys Met Ile Ser Phe

20 25 30

Thr Tyr Asp Glu Gly Gly Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala Val Ser Glu

35 40 45

Lys Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu Glu Lys Gln Lys Lys

50 55 60

<210> 8

<211> 64

<212> PRT

<213> 冰岛硫化叶菌Sulfolobus islandicus

<400> 8

Met Thr Thr Val Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Glu Glu Lys Gln Val Asp

1 5 10 15

Thr Ser Lys Ile Lys Lys Val Trp Arg Val Gly Lys Met Ile Ser Phe

20 25 30

Thr Tyr Asp Glu Gly Gly Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala Val Ser Glu

35 40 45

Lys Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu Glu Lys Gln Lys Lys

50 55 60

<210> 9

<211> 64

<212> PRT

<213> 冰岛硫化叶菌Sulfolobus islandicus

<400> 9

Met Thr Thr Val Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Glu Glu Lys Gln Val Asp

1 5 10 15

Ile Ser Lys Ile Lys Lys Val Trp Arg Val Gly Lys Met Ile Ser Phe

20 25 30

Thr Tyr Asp Glu Gly Gly Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala Val Ser Glu

35 40 45

Lys Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu Glu Lys Gln Lys Lys

50 55 60

<210> 10

<211> 62

<212> PRT

<213> 勤奋金属球菌Metallosphaera sedula.

<400> 10

Met Ala Thr Lys Ile Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Gln Asp Leu Glu Val

1 5 10 15

Asp Ile Ser Lys Val Lys Lys Val Trp Lys Val Gly Lys Met Val Ser

20 25 30

Phe Thr Tyr Asp Asp Asn Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala Val Ser Glu

35 40 45

Lys Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Asn Met Ile Gly Lys Lys

50 55 60

<210> 11

<211> 62

<212> PRT

<213> 嗜铜金属球菌Metallosphaera cuprina

<400> 11

Met Ala Thr Lys Ile Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Gln Asp Leu Glu Val

1 5 10 15

Asp Ile Ser Lys Val Lys Lys Val Trp Lys Val Gly Lys Met Val Ser

20 25 30

Phe Thr Tyr Asp Asp Asn Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala Val Ser Glu

35 40 45

Lys Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Ser Met Ile Gly Lys Lys

50 55 60

<210> 12

<211> 61

<212> PRT

<213> 好客嗜酸两面菌Acidianus hospitalis

<400> 12

Met Thr Thr Val Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Glu Glu Lys Glu Val Asp

1 5 10 15

Ile Ser Lys Ile Lys Lys Val Trp Arg Val Gly Lys Met Ile Ser Phe

20 25 30

Thr Tyr Asp Asp Asn Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala Val Ser Glu Lys

35 40 45

Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Glu Lys Leu Glu Lys Lys

50 55 60

<210> 13

<211> 62

<212> PRT

<213> 好客嗜酸两面菌Acidianus hospitalis

<400> 13

Met Ala Thr Lys Val Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Glu Glu Lys Glu Val

1 5 10 15

Asp Ile Ser Lys Ile Lys Lys Val Trp Arg Val Gly Lys Met Ile Ser

20 25 30

Phe Thr Tyr Asp Asp Asn Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala Val Ser Glu

35 40 45

Lys Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Asp Lys Leu Glu Lys Lys

50 55 60

<210> 14

<211> 60

<212> PRT

<213> 好客嗜酸两面菌Acidianus hospitalis

<400> 14

Met Ala Thr Lys Val Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Glu Glu Lys Glu Val

1 5 10 15

Asp Ile Ser Lys Ile Lys Lys Val Trp Arg Val Gly Lys Met Ile Ser

20 25 30

Phe Thr Tyr Asp Asp Asn Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala Val Ser Glu

35 40 45

Lys Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Glu Lys Leu Lys

50 55 60

<210> 15

<211> 68

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 一致序列

<220>

<221> VARIANT

<222> (2)..(2)

<223> Xaa是V, A或T

<220>

<221> VARIANT

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是T或K

<220>

<221> VARIANT

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是-或K

<220>

<221> VARIANT

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是R或K

<220>

<221> VARIANT

<222> (15)..(15)

<223> Xaa是E或Q

<220>

<221> VARIANT

<222> (18)..(18)

<223> Xaa是T或I

<220>

<221> VARIANT

<222> (31)..(31)

<223> Xaa是V或I

<220>

<221> VARIANT

<222> (37)..(39)

<223> Xaa Xaa Xaa是EGG或DN-

<220>

<221> VARIANT

<222> (57)..(57)

<223> Xaa是M或L

<220>

<221> VARIANT

<222> (58)..(58)

<223> Xaa是Q, D或E

<220>

<221> VARIANT

<222> (59)..(59)

<223> Xaa是M或K

<220>

<221> VARIANT

<222> (61)..(67)

<223> Xaa是-------, EKS--GK, EK---QK, ARAEREK, ARA-EKK, E-----K,

EKS--G, ACAEREK或ACA-EKK

<400> 15

Met Xaa Xaa Xaa Val Xaa Phe Lys Tyr Lys Gly Glu Glu Lys Xaa Val

1 5 10 15

Asp Xaa Ser Lys Ile Lys Lys Val Trp Arg Val Gly Lys Met Xaa Ser

20 25 30

Phe Thr Tyr Asp Xaa Xaa Xaa Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala Val Ser

35 40 45

Glu Lys Asp Ala Pro Lys Glu Leu Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa

50 55 60

Xaa Xaa Xaa Lys

65

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸oligoCH-1

<400> 16

gctagcacca agggccca 18

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸VHfuse_反向

<400> 17

tgaattcgtg acaagtgcaa gact 24

<210> 18

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸OligoCH-2

<400> 18

ggtagtgcag gctccggcag tggcggtagc gaggtgcagt tggtagagt 49

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> OligoCH-3

<400> 19

gcccttggtg ctagcact 18

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸VH_NF_正向

<400> 20

cttgtcacga attcagtcaa ggtgaaattc 30

<210> 21

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸Glink15.1_反向

<400> 21

ggagcctgca ctaccggaac cgcctgaacc tttctcgcgt tccgc 45

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸OligoCH-4

<400> 22

tgagtcctag ctggccaga 19

<210> 23

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸IL2ss_反向

<400> 23

tgaattcgtg acaagtgcaa gacttagtgc a 31

<210> 24

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸OligoCH-5

<400> 24

ggagcctgca ctaccggaac cgcctgaacc tttacccgga gacagggaga 50

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸OligoCH-6

<400> 25

cttgtcacga attcagaggt g 21

<210> 26

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸Glink15.1_正向

<400> 26

ggtagtgcag gctccggcag tggcggtagc gtcaaggtga aattc 45

<210> 27

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸OligoCH-7

<400> 27

gccagctagg actcatttct cgcgttccgc 30

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> oligoCL-1

<400> 28

aaacgtacgg tggctgcacc a 21

<210> 29

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> oligoCL-2

<400> 29

ggtagtgcag gctccggcag tggcggtagc gacatccaga tgacacagtc 50

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> oligoCL-3

<400> 30

agccaccgta cgttttatct 20

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> oligoCL-4

<400> 31

tagagggagc tagctcgaca tg 22

<210> 32

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> oligoCL-5

<400> 32

ggagcctgca ctaccggaac cgcctgaacc acactctccc ctgttgaag 49

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> oligoCL-6

<400> 33

cttgtcacga attcagacat ccaga 25

<210> 34

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> oligoCL-7

<400> 34

agctagctcc ctctatttct cgcgttccgc 30

<210> 35

<211> 66

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 结合IL17的序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(9)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(29)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (44)..(44)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (46)..(46)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 35

Met Val Lys Val Lys Phe Xaa Xaa Xaa Gly Glu Glu Lys Glu Val Asp

1 5 10 15

Thr Ser Lys Ile Phe Asn Val Trp Arg Xaa Gly Lys Xaa Val Asn Phe

20 25 30

Met Tyr Asp Asp Asn Gly Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Val Xaa Glu Lys

35 40 45

Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Asp Met Leu Ala Arg Ala Glu Arg Glu

50 55 60

Lys Lys

65

<210> 36

<211> 66

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 结合IL17的序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(9)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (44)..(44)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (46)..(46)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 36

Met Val Lys Val Lys Phe Xaa Xaa Xaa Gly Glu Glu Lys Glu Val Asp

1 5 10 15

Thr Ser Lys Ile Phe Asn Val Trp Arg Xaa Gly Lys Ser Val Asn Phe

20 25 30

Met Tyr Asp Asp Asn Gly Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Val Xaa Glu Lys

35 40 45

Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Asp Met Leu Ala Arg Ala Glu Arg Glu

50 55 60

Lys Lys

65

<210> 37

<211> 66

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 结合IL17的序列

<400> 37

Met Val Lys Val Lys Phe His Ala Lys Gly Glu Glu Lys Glu Val Asp

1 5 10 15

Thr Ser Lys Ile Phe Asn Val Trp Arg Ser Gly Lys Ser Val Asn Phe

20 25 30

Met Tyr Asp Asp Asn Gly Lys Ile Gly Ile Gly His Val Asp Glu Lys

35 40 45

Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Asp Met Leu Ala Arg Ala Glu Arg Glu

50 55 60

Lys Lys

65

<210> 38

<211> 66

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 结合IL17的序列

<400> 38

Met Val Lys Val Lys Phe Ser Arg Phe Gly Glu Glu Lys Glu Val Asp

1 5 10 15

Thr Ser Lys Ile Phe Asn Val Trp Arg Ile Gly Lys Thr Val Asn Phe

20 25 30

Met Tyr Asp Asp Asn Gly Lys Ile Gly Ile Gly Ala Val Asp Glu Lys

35 40 45

Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Asp Met Leu Ala Arg Ala Glu Arg Glu

50 55 60

Lys Lys

65

<210> 39

<211> 65

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 结合TNF-alpha的序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(9)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(22)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(29)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (44)..(44)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (46)..(46)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 39

Met Val Lys Val Lys Phe Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Glu Lys Glu Val Asp

1 5 10 15

Thr Ser Lys Ile Xaa Xaa Val Xaa Arg Xaa Gly Lys Xaa Val His Phe

20 25 30

Trp Tyr Glu Asp Asn Gly Lys Ile Asp Lys Gly Xaa Val Xaa Glu Lys

35 40 45

Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Asp Met Leu Ala Arg Ala Glu Arg Glu

50 55 60

Lys

65

<210> 40

<211> 65

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 结合TNF-alpha的序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(9)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(29)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (44)..(44)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (46)..(46)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 40

Met Val Lys Val Lys Phe Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Glu Lys Glu Val Asp

1 5 10 15

Thr Ser Lys Ile Xaa His Val Met Arg Xaa Gly Lys Xaa Val His Phe

20 25 30

Trp Tyr Glu Asp Asn Gly Lys Ile Asp Lys Gly Xaa Val Xaa Glu Lys

35 40 45

Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Asp Met Leu Ala Arg Ala Glu Arg Glu

50 55 60

Lys

65

<210> 41

<211> 65

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 结合TNF-alpha的序列

<400> 41

Met Val Lys Val Lys Phe Val Met Phe Gly Lys Glu Lys Glu Val Asp

1 5 10 15

Thr Ser Lys Ile Val His Val Met Arg Gln Gly Lys Leu Val His Phe

20 25 30

Trp Tyr Glu Asp Asn Gly Lys Ile Asp Lys Gly Phe Val Pro Glu Lys

35 40 45

Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Asp Met Leu Ala Arg Ala Glu Arg Glu

50 55 60

Lys

65

<210> 42

<211> 66

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 结合溶菌酶的序列

<400> 42

Met Val Lys Val Lys Phe Phe Trp Asn Gly Glu Glu Lys Glu Val Asp

1 5 10 15

Thr Ser Lys Ile Val Trp Val Lys Arg Ala Gly Lys Ser Val Leu Phe

20 25 30

Ile Tyr Asp Asp Asn Gly Lys Asn Gly Tyr Gly Asp Val Thr Glu Lys

35 40 45

Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Asp Met Leu Ala Arg Ala Glu Arg Glu

50 55 60

Lys Lys

65

Claims (38)

1.一种多肽，其包含修饰的抗体，其中Sac7d家族的蛋白的至少一个变体融合至抗体的重链或轻链中的至少一个，其中所述变体在Sac7d家族的蛋白的结合位点中包含4至20或5至20个突变残基。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述变体的突变氨基酸选自：参照SEQ ID NO：1，对应于Sac7d的V2、K3、K5、K7、Y8、K9、G10、E11、K13、E14、T17、K21、K22、W24、V26、G27、K28、M29、S31、T33、Y34、D36、N37、G38、K39、T40、R42、A44、S46、E47、K48、D49、A50和P51的氨基酸。

3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中所述变体包含7至14个突变氨基酸，所述突变氨基酸选自：对应于Sac7d的K7、Y8、K9、K21、K22、W24、V26、M29、S31、T33、T40、R42、A44和S46的氨基酸。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述Sac7d家族的蛋白的至少一个变体融合至所述抗体的两条重链或两条轻链。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中所述Sac7d家族的蛋白的至少一个变体融合至一条重链，并且所述Sac7d家族的蛋白的至少一个变体融合至所述抗体的一条轻链。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中所述抗体的至少一条重链或一条轻链融合至所述Sac7d家族的蛋白的两个变体。

7.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中所述Sac7d家族的蛋白的至少两个不同变体融合至所述抗体的重链和/或轻链。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的多肽，其中所述Sac7d家族的蛋白的八个变体融合至所述抗体的重链和轻链。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的多肽，其中所述抗体是治疗性抗体。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的多肽，其与选自以下的蛋白结合：EGFR、VEGFR2、TfR、Her2、间皮素、EpCam、CD38、CD3、CD7、PD1、PD-L1、CTLA4、OX40、VEGF、TNFα、IL17、IL4、IL13、IL23、IL12、MAdCam和a4b7。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的多肽，其中所述Sac7d家族的蛋白的变体结合IL17。

12.根据权利要求11所述的多肽，其中所述Sac7d家族的蛋白的变体包含序列SEQ IDNO：35或SEQ ID NO：36。

13.根据权利要求11或12中任一项所述的多肽，其包含SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：38。

14.根据权利要求11至13中任一项所述的多肽，其中所述抗体结合选自以下的蛋白：TNFα、IL23、IL12、IL4、IL13、IL31或其受体、和肿瘤特异性抗原，具体是Her2、PDL1(程序性死亡配体1，CD274)或CTLA4。

15.根据权利要求1至10中任一项所述的多肽，其中所述Sac7d家族的蛋白的变体与TNFα的亚基结合，并且当这种亚基蛋白以天然状态参与完全形成的多聚体蛋白时，优选地所述Sac7d家族的蛋白的变体不结合所述蛋白的亚基。

16.根据权利要求15所述的多肽，其包含序列SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：40。

17.根据权利要求15或16中任一项所述的多肽，其包含序列SEQ ID NO：41。

18.根据权利要求15至17中任一项所述的多肽，其中所述抗体结合选自以下的蛋白：IL17、CD20、IL24、IL12、IL4、IL13、IL31或其受体、和肿瘤特异性抗原，具体是Her2、PDL1(程序性死亡配体1，CD274)或CTLA4。

19.一种遗传构建体，其包含选自以下的DNA序列：

a.编码抗体重链的序列，在其3'端与编码Sac7d家族的蛋白的变体的序列融合；

b.编码抗体重链的序列，在其5'端与编码Sac7d家族的蛋白的变体的序列融合；

c.编码抗体轻链的序列，在其3'端与编码Sac7d家族的蛋白的变体的序列融合；

d.编码抗体轻链的序列，在其5'端与编码Sac7d家族的蛋白的变体的序列融合。

20.一种载体，其包含权利要求19所述的遗传构建体。

21.一种宿主细胞，其在基因组中包含权利要求19所述的遗传构建体。

22.一种生产权利要求1至18中任一项所述多肽的方法，包括以下步骤：

a.培养细胞培养物，其中细胞已转化有权利要求19所述的遗传构建体和编码抗体互补链的遗传构建体，

和

b.回收所述多肽。

23.一种用于维持或提高修饰抗体产量的方法，包括以下步骤：

a.培养细胞培养物，其中细胞已转化有权利要求19所述的遗传构建体和编码抗体互补链的遗传构建体，

和

b.在表达步骤a的遗传构建体之后，回收生产的修饰抗体，

其中在步骤b中回收的所述修饰抗体包含Sac7d家族的蛋白的至少一个变体，所述变体在所述蛋白的结合位点中包含5至20个突变残基，并且回收的修饰抗体的产量等于或高于相同条件下生产的未修饰抗体的产量。

24.一种多肽，其包含Sac7d家族的蛋白的变体，所述变体在结合IL17的Sac7d家族的蛋白的结合位点中包含4至22个突变氨基酸。

25.根据权利要求24所述的多肽，其中所述突变氨基酸对应于选自以下的氨基酸：Sac7d的V2、K3、K5、K7、Y8、K9、G10、E11、K13、E14、T17、K21、K22、W24、V26、G27、K28、M29、S31、T33、Y34、D35、D36、N37、G38、K39、T40、G41、R42、A44、S46、E47、K48、D49、A50和P51。

26.根据权利要求24或25所述的多肽，其中所述Sac7d变体包含4至17个突变氨基酸，所述突变氨基酸选自对应于Sac7d的K7、Y8、K9、E11、K21、K22、W24、V26、M29、S31、T33、D35、T40、G41、R42、A44和S46的氨基酸。

27.根据权利要求24至26中任一项所述的多肽，其包含序列SEQ ID NO：35或SEQ IDNO：36。

28.根据权利要求24至27中任一项所述的多肽，其包含序列SEQ ID NO：37或SEQ IDNO：38。

29.根据权利要求24至27中任一项所述的多肽，其包含序列SEQ ID NO：37或SEQ IDNO：38，其中选自V7、M8、F9、K11、Q26、L29、E35、D41、F44和P46的1至8个氨基酸已被另一氨基酸取代。

30.根据权利要求24至29中任一项所述的多肽，其中与IL17结合的所述Sac7d家族的蛋白的变体连接至或融合至另一蛋白或多肽。

31.根据权利要求30所述的多肽，其中所述另一蛋白或多肽包含所述Sac7d家族的蛋白的另一变体。

32.根据权利要求30所述的多肽，其中所述另一蛋白或多肽是抗体，优选结合至TNF-α或Her2/neu的抗体。

33.根据权利要求24至32中任一项所述的多肽，其缀合至有机分子。

34.一种遗传构建体，其包含编码权利要求24至32中任一项所述多肽的DNA序列。

35.一种载体，其包含权利要求34所述的遗传构建体。

36.一种宿主细胞，其在基因组中包含权利要求34所述的遗传构建体。

37.一种生产权利要求24至32中任一项所述多肽的方法，包括以下步骤：

a.培养细胞培养物，其中细胞已转化有权利要求34所述的遗传构建体，和

b.回收所述多肽。

38.权利要求24至32中任一项所述的多肽，作为药物。

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