FR2974816A1 - Methode de generation de proteines - Google Patents

Abstract

L'invention se rapporte au domaine de la génération de ligands pour une protéine d'intérêt transfert des sites de liaison d'un ligand de ladite protéine d'intérêt dans un autre squelette protéique.

Description

L'invention se rapporte au domaine de la génération de ligands utilisables pour la chromatographie d'affinité pour la purification ou l'isolement de composés 5 biologiques, et notamment d'immunoglobulines.

La chromatographie d'affinité est effectuée en utilisant une résine sur laquelle est immobilisée une molécule (ligand) ayant la propriété de se lier spécifiquement à celle qu'on veut isoler. Ce ligand peut être déjà présent dans la 10 résine, du fait de la nature de la résine utilisée. C'est le cas du dextran composant le SephadexTM, une résine normalement utilisée pour la filtration sur gel. Toutefois, on doit généralement fixer un ligand spécifique sur une résine qui ne présente pas, en tant que telle, d'affinité pour la molécule d'intérêt. Ainsi, on peut lier des anticorps sur des résines afin que celles-ci acquièrent une affinité pour les 15 antigènes correspondants. Le principe de la chromatographie d'affinité comprend les étapes de mise en présence un mélange contenant la molécule d'intérêt et la résine contenant le ligand, dans des conditions favorables à la liaison ligand-molécule spécifique. Les molécules pour lesquelles le ligand ne présente pas d'affinité ne se fixeront pas sur 20 la résine et sont alors éluées, tandis que les molécules d'intérêt restent liées à la colonne du fait de leur affinité pour le ligand. Lorsque toutes les molécules sans affinité sont complètement éluées, on libère les molécules d'intérêt restées attachées au ligand (désorption). On peut effectuer cette étape de différentes façons, notamment en modifiant les conditions 25 auxquelles est exposé le complexe résine-molécules d'intérêt, pour diminuer la stabilité de l'interaction ligand-molécule d'intérêt. Ainsi, on peut modifier la composition du solvant pour diminuer l'affinité ou ajouter un ligand compétiteur. Les molécules d'intérêt se détachent alors de la résine, et peuvent être isolées dans le solvant de désorption. 30 La demande WO 2008/068637 décrit l'utilisation d'une banque basée sur la protéine Sac7d pour obtenir des ligands présentant une affinité pour des cibles d'intérêt. Cette demande exemplifie notamment l'utilisation de cette banque pour obtenir des protéines présentant une affinité pour la protéine PuID. 35 La méthode décrite dans WO 2008/068637 comprend la génération de banques combinatoires contenant une pluralité de molécules d'ADN ayant toutes la même séquence, sauf la présence de certaines mutations aléatoires menant à la production d'une protéine mutée à certains acides aminés prédéterminés. Dans le cadre de WO 2008/068637, le squelette de base est une protéine Sac7d, telle que définie plus haut, et dans laquelle on introduit des mutations pour générer une variabilité aux acides aminés K7, Y8, K9, K21, K22, W24, V26, M29, S31, T33, T40, R42, A44, S46. On peut aussi introduire une variabilité sur d'autres acides aminés, comme V26, G27, K28, M29, S31, R42, A44, S46, E47 et K48. Ces acides aminés sont basés sur la séquence de Sac7d, telle que représentée par SEQ ID N° 1.

Les inventeurs ont démontré qu'il est possible de « porter» les mutations observées sur les polypeptides sélectionnés par la méthode de WO 2008/068637 de la protéine Sac7d vers d'autres protéines en maintenant une bonne affinité pour la cible, et qu'il est ainsi également possible d'améliorer les propriétés des ligands ainsi obtenus.

L'invention se rapporte ainsi à une méthode de génération de nouvelles protéines, lorsque l'on est en possession d'un mutant d'une protéine de la famille de Sac7d (telle que définie ci-dessus, qui comprend notamment les protéines Sac7d, Sso7d, Sac7e, Ssh7b, SSh7a, DBP7 et Sis7), présentant un site de reconnaissance d'une molécule d'intérêt. On identifie les acides aminés formant ledit site de reconnaissance par comparaison de la séquence dudit mutant avec la séquence de la protéine sauvage correspondante de la famille Sac7d, et identification des acides aminés mutés par rapport à la séquence sauvage. Ceci peut notamment être effectué par l'utilisation de logiciels adaptés tel le logiciel BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al., (1990), J Mol Biol 215 (3): 403-410), qui est adapté pour la comparaison de deux séquences, et qui est disponible notamment sur le site du NCBI.

L'étape suivante est d'intégrer ces acides aminés au sein d'une autre protéine de la famille Sac7d à la place des acides aminés sauvages localisés au même endroit que ceux de la protéine initiale. On peut utiliser pour cela l'alignement tel que présenté à la Figure 1. L'utilisation de cette méthode permet ainsi de transférer la capacité de reconnaître la molécule d'intérêt, portée par la protéine initiale, à une autre protéine, ce qui peut mener à une amélioration d'autres propriétés de la protéine nouvellement obtenue. Ainsi, les inventeurs ont montré qu'il avait été possible d'améliorer la résistance aux conditions alcalines d'un ligand des immunoglobulines en transférant le site de reconnaissance du squelette de Sac7d vers le squelette de Sso7d, tout en maintenant une affinité tout à fait satisfaisante pour les immunoglobulines. L'invention se rapporte ainsi à une méthode de génération d'un acide nucléique codant pour une protéine présentant une affinité pour une molécule d'intérêt, comprenant les étapes de : a) comparer la séquence d'un mutant initial d'une protéine de la famille de Sac7d, ledit mutant présentant une affinité pour ladite molécule d'intérêt, avec la séquence de la protéine sauvage correspondante de la famille Sac7d b) identifier les acides aminés mutés par rapport à la séquence sauvage correspondante, qui représentent le site de reconnaissance de ladite 15 molécule d'intérêt c) synthétiser un acide nucléique codant pour une autre protéine de la famille Sac7d, mais dans laquelle les acides aminés sauvages localisés à la même position que ceux mutés dans le mutant initial ont été remplacés par lesdits acides aminés mutés. 20 L'invention se rapporte aussi à une méthode de génération d'une protéine présentant une affinité pour une molécule d'intérêt, comprenant les étapes de : a) comparer la séquence d'un mutant initial d'une protéine de la famille de Sac7d, ledit mutant présentant une affinité pour ladite molécule 25 d'intérêt, avec la séquence de la protéine sauvage correspondante de la famille Sac7d b) identifier les acides aminés mutés par rapport à la séquence sauvage correspondante, qui représentent le site de reconnaissance de ladite molécule d'intérêt 30 c) synthétiser un polypeptide présentant la séquence d'une autre protéine de la famille Sac7d, dans laquelle les acides aminés sauvages localisés à la même position que ceux mutés dans le mutant initial ont été remplacés par lesdits acides aminés mutés.

35 La famille Sac7d correspond à une famille de protéines de 7 kDa liant l'ADN isolées de bactéries extrémophiles. Ces protéines et cette famille sont notamment décrites dans WO 2008/068637. Ainsi, dans le cadre de la présente invention, une protéine appartient à la famille Sac7d lorsqu'elle présente une séquence correspondant à la séquence SEQ ID N° 8. Un mutant d'une protéine de la famille de Sac7d présente une séquence basée sur SEQ ID N° 8, mais dans laquelle au moins 3, de préférence au moins 5, de façon plus préférée au moins 8, de façon encore plus préférée au moins 10 acides aminés ont été mutés par rapport à SEQ ID N° 8. La séquence d'un mutant d'une protéine de la famille de Sac7d ne présente pas plus de 16 acides aminés différents des acides aminés de SEQ ID N° 8.

De préférence, les différences sont observées dans les acides aminés choisis parmi K7, Y8, K9, K21, K22, W24, V26, M29, S31, T33, T41, R43, A45, S46, G27, K28, E48 et K49 de SEQ ID N° 8. Un mutant d'une protéine de la famille Sac7d peut être obtenu par toute méthode de mutation connue dans l'art.

De préférence, il est obtenu par la mise en oeuvre de la méthode décrite dans WO 2008/068637, ce qui permet d'assurer qu'il présente une affinité pour une cible d'intérêt.

La famille Sac7d comprend notamment les protéines Sac7d (Sulfolobus acidocaldarius), Sso7d (S. solfactaricus), Sac7e (S. acidocaldarius), Ssh7b (S. shibatae), SSh7a (S. shibatae), DBP7 (S. tokodaii) et Sis7 (S. islandicus) dont les séquences sont représentées par SEQ ID N° 1 à SEQ ID N° 7 respectivement. Dans un mode de réalisation préféré, ladite protéine de la famille Sac7d est la protéine Sac7d dont la séquence sauvage est représentée par SEQ ID N° 1.

Dans un mode de réalisation préféré, ladite autre protéine de la famille Sac7d est la protéine Sso7d dont la séquence sauvage est représentée par SEQ ID N° 2.

La comparaison effectuée à l'étape a) des méthodes selon l'invention est 30 réalisée sur la base des séquences telles qu'indiquées ci-dessus. La détermination de la séquence de l'acide nucléique ou du polypeptide à synthétiser à l'étape c) est réalisée notamment en utilisant la figure 1 qui présente l'alignement des séquences sauvages de protéines de la famille Sac7d. On peut donc aisément identifier les acides aminés que l'on doit muter dans les autres 35 protéines de la famille Sac7d.

La synthèse de l'acide nucléique ou du polypeptide est réalisée selon des méthodes connues dans l'art. Les acides nucléiques peuvent être produits par synthèse chimique. Les polypeptides selon l'invention peuvent être produits par synthèse chimique en phase solide ou par recombinaison génétique. Cette synthèse chimique peut être réalisée par exemple avec un synthétiseur automatique de peptide du type Applied Biosystems, mod. 433A. Elle peut être réalisée par exemple en chimie Fmoc qui utilise le groupement fluoremylméthyloxycarbonyle pour la protection temporaire de la fonction a-aminique des acides aminés.

Il est toutefois préféré de produire les polypeptides selon l'invention par génie génétique, en particulier en intégrant une séquence d'acide nucléique codant pour ledit polypeptide dans un vecteur d'expression. Ce vecteur d'expression est alors introduit dans une cellule hôte (les bactéries telles Escherichia coli sont particulièrement adaptées), qui est cultivée dans des conditions de culture permettant la synthèse du polypeptide (on peut notamment utiliser des promoteurs inductibles en amont du polypeptide dans le vecteur d'expression. Le polypeptide synthétisé est alors récupéré. On peut alors greffer tout type de molécules en N-ou C-terminal du polypeptide. L'homme du métier connaît les méthodes de production de polypeptides, 20 qui sont notamment décrites dans l'ouvrage de Sambrook, Fritsch et Maniatis, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nde édition.

On peut également coupler les polypeptides produits par les méthodes selon l'invention à d'autres protéines. Ce couplage peut être effectué par la 25 production d'une protéine de fusion (les polypeptides selon l'invention étant localisés en N- ou C- terminal de la protéine de fusion en un ou plusieurs exemplaires enchainés en tandem) ou par couplage chimique. On peut utiliser un peptide de liaison lorsque l'on effectue un couplage entre deux protéines, qui peut éventuellement contenir un site de reconnaissance 30 pour une protéase, telle que la protéase du Tobacco Etch Virus (TEV) qui reconnaît le site ENLYFQG (SEQ ID N° 9). On peut ainsi coupler une protéine rapporteuse (qui possède une caractéristique lui permettant d'être observé en laboratoire (fluorescence, activité enzymatique détectable). Parmi les protéines rapporteurs on peut noter la protéine 35 fluorescente verte (green fluorescent protein en anglais ou GFP), la luciférase, la protéine GUS, (bêta-glucuronidase), la protéine lacZ (13-galactosidase), la phosphatase alcaline. On peut également coupler les polypeptides produits par les méthodes selon l'invention à une ou plusieurs unités de fixation (éléments pouvant se fixer ou être fixés notamment à un support solide ou à un autre composé pour une détection ou une capture) pour obtenir un réactif multi spécifique. On peut citer le domaine de fixation à la chitine (CBD), un domaine de fixation à l'ADN ou à une hormone. De la même façon on peut citer des étiquettes peptidiques (His*6, FLAG, HA, myc, etc.) qui permettent une détection ou une capture sans modification post- traductionelle, ou des étiquettes qui nécessitent une modification posttraductionnelle telles que AviTag (biotinylation spécifique par l'enzyme BirA) ou l'étiquette de phosphorylation (phosphorylation spécifique par la créatine kinase Il). En tant qu'unité de fixation, on peut citer des protéines telles que l'avidine, la streptavidine. On peut également citer des supports solides telles que des billes magnétiques, des billes agarose ou encore de latex, des supports ELISA, des colonnes d'affinité sur lesquelles sont couplées les polypeptides selon l'invention.

Les polypeptides produits par les méthodes selon l'invention sont particulièrement intéressants pour isoler des cibles d'intérêt par chromatographie 20 d'affinité. On peut ainsi fixer de façon covalente un des polypeptides produit par une méthode selon l'invention à un support polymérique hydrophile (tel que la Sepharose 4B) utilisé en chromatographie liquide, notamment en utilisant un bras flexible fixé en N- ou C-terminal. Ce polypeptide, ainsi fixé, peut encore interagir 25 avec les immunoglobulines et est capable de retenir ces protéines sur la matrice polymérique. Elles peuvent ensuite être détachées par une acidification du milieu. Il existe des résines préparées d'avance sur lesquelles on peut coupler un ligand. Ce sont des résines spécialisées destinées uniquement à cet usage. Elles possèdent généralement un groupement chimique facilement activable localisé au 30 bout d'un bras écarteur. Diverses résines existent avec divers groupements activables selon la nature chimique du ligand qu'on veut utiliser: bromure de cyanogène ou p-nitrophényle pour coupler un ligand avec une amine, hydrazine pour un aldéhyde, un thiol pour un autre thiol, etc... Dans le cas présent, on couple les polypeptides de préférence en utilisant une résine agarose (telle que la résine 35 SepharoseTM) activée par le N-hydroxy-succinimide (NHS).

Description des figures Figure 1 : Alignement des séquences des protéines Ssh7b, Sis7, Sso7d, Ssh7a, DBP7, Sac7d et Sac7e. Figure 2 : Activité de fixation des protéines D1Sac7d et D1Sso7d contre diverses 5 IgG par ELISA Figure 3 : Test de spécificité des protéines D1Sac7d et D1Sso7d par Western Blot. Légende : 1 : IgG seule; 2 : hlgG + DMEM; 3 : DMEM; M : marqueur de taille; 4 : hlgG; 5 : hlgG + extrait d'E. coli ; 6 : extrait d'E. coli Figure 4 : Compétition pour la reconnaissance des IgG avec la Protéine A et CD64. 10 Caractérisation de l'épitope reconnu par D1Sac7d et D1Sso7d par la méthode des injections successives sur une surface recouverte d'IgG. Fig 4.A : injections successives des analytes. Fig 4.B : co-injection des analytes. Les mesures avec C3 sont données à titre indicatif pour montrer un effet significatif 15 lorsque les épitopes sont au moins chevauchants. Figure 5 : Stabilité des protéines D1Sac7d (5.A.) et D1Sso7d (5.B.) à pH alcalin Figure 6 : Chromatographie d'affinité avec une colonne sur laquelle est fixée la protéine D1Sso7d. Fig 6.A : purification d'IgG présentes dans du DMEM + sérum foetal de veau. 20 Fig 6.B : purification d'IgG présentes dans un extrait d'E. coll. Fig 6.0 : Comparaison de la purification d'IgG1 sous forme d'ascites injectées dans une colonne D1Sso7d et une colonne Protéine A. Légende : M : marqueur de taille, lnj : échantillon injecté sur la colonne, FT: fraction non retenue par la colonne, EL : fraction éluée de la colonne 25 Figure 7 : Résistance d'une colonne d'affinité D1Sso7d aux conditions de pH élevées

Exemples Les exemples ci-dessous illustrent un mode de réalisation de l'invention 30 dans lequel on porte des mutations obtenues sur un polypeptide présentant une affinité pour les immunoglobulines et obtenu par criblage d'une banque combinatoire basée sur le squelette Sac7d, vers un squelette Sso7d. Les résultats ont été obtenus en utilisant les matériels et méthodes suivants. Matériels et Méthodes 35 Immunoglobulines Les immunoglobulines utilisées dans cette étude ont été achetées chez Fluka AG (Buchs, Switzerland): hlgG (i.e., ensemble des IgG de sérum humain contenant les hIgG1, hlgG2, hlgG3, hIgG4 : référence 56834); et chez Sigma-Aldrich: hIgG1 (référence : 15029), hlgG2, hlgG3, hlgG4, IgG de souris, rat, mouton, chèvre, lapin, porc and hlgA.

Biologie moléculaire générale Les enzymes et tampons étaient de New England Biolabs (USA) ou de Fermentas (Lithuanie). Les oligonucleotides étaient de Eurofins-MWG (Allemagne).

Toutes les PCRs (reactions de polymérisation en chaîne) on été réalisées en utilisant la polymerase Vent sauf indication contraire dans le texte.

Vecteur d'expression pFP1001 Le vecteur de clonage et d'expression des protéines d'affinité (Dl Sac7d et DlSso7d) pFP1001 permet l'expression de protéines avec une étiquette N-terminale polyhistidine et est un dérivé du vecteur pQE30 (Qiagen) dans lequel le codon stop TGA a été remplacé par deux codons stop TAATGA par PCR.

Construction de la banque combinatoire La génération des banques combinatoires a été réalisée sur un squelette Sac7d, selon le principe décrit dans WO 2008/068637 A2 (pages 13 et 14). en, introduisant une diversification des résidus 26, 27, 28, 29, 31, 42, 44, 46, 47, 48 de Sac7d, selon le protocole suivant. La banque a été construite par assemblage d'oligonucléotides et par des étapes de PCR d'assemblage. Avec une PCR en une seule étape utilisant une combinaison de quatre oligonucléotides standards et de trois oligonucléotides dégénérés codant des triplets NNS (où N = A, C, T ou G, et S = C or G), un produit ADN incluant la région flanquante 5'- nécessaire pour le ribosome display et la diversification du gène de Sac7d a été obtenu. Pour cette banque, les oligonucléotides suivants ont été utilisés T7C (SEQ ID N° 13: ATACGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTC), SDA MRGS (SEQ ID N° 14: AGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAG GAGATATATCCATGAGAGGATCG), SCIib2.1 (SEQ ID N° 15: GGAGATATATCCATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGAT- CCGTCAAGGTGAAATTC), SClib3.2 (SEQ ID N° 16: GGATCCGTCAAGGTGAAATTCAAATATAAAGGCGAAGAAAAAGAAGTGGACACTAGTAAGATC), SClib3.3 (SEQ ID N° 17: CTTGCCGTTGTCGTCGTAGGTAAASNNCA- CSNNSNNSNNSNNACGCCAAACTTTCTTGATCTTACTAGTGTCCACTTC), SClib3.4 (SEQ ID N° 18: TAATAACTCTTTCGGGGCATCTTTCTCGCTCACSNNGCCSNNGCCGGTCTTGCCGTTGTCGTCGTAGG), SClib2.5 (SEQ ID N° 19: CCATATAAAGCTTTTTCTCGCGTTCCGCACGCGCTAACATATCTAATAACTCTT TCGGGGCATC). Pour améliorer l'accessibilité de la protéine exposée par le ribosome à des ligands potentiels, la protéine a été fusionnée à un espaceur. La séquence de cet espaceur, correspondant en partie à la protéine ToIA d'E. coli a d'abord été introduite dans le vecteur pFP1001 en réalisant une PCR avec la polymérse Taq à partir d'une colonie d'E. coli (souche DH5a) et les oligonucléotides tolA coli_F (SEQ ID N° 20: GAGAAAGGATCCCTTTATATGGCCTCGGGGGCCGAGTTCGAATCTGGTGGCCAGAAGCAAGCTGAAGAGGCGGC AGCG) et tolA coli_R (SEQ ID N° 21 TGCATTAAGCTTTTTTTCAGCAGCTTCAGTTGCCGCTTTCTTTC). Le produit de PCR obtenu a ensuite été cloné dans le vecteur pFP1001 en utilisant les sites de restriction BamHl et Hindlll. Un clone avec la séquence attendue a été utilisé pour obtenir le vecteur pFP1001-ToIA. Dans un second temps, pour obtenir l'espaceur en grande quantité, ce vecteur a ensuite été utilisé comme matrice pour une PCR d'amplification avec les oligonucléotides SClink (SEQ ID N° 22: GCGGAACGCGAGAAAAAGCTTTATATGGCCTCG- GGGGCC) and tolAk (SEQ ID N° 23: CCGCACACCAGTAAGGTGTGCGGTTTCAGTTGCCGCTTTCTTTCT) (ce dernier encodant la région flanquante 3'- nécessaire pour le ribosome display). Finalement, ce produit de PCR a été assemblé avec l'espaceur tolA par PCR d'assemblage en utilisant les oligonucléotides tolAk et T7B (SEQ ID N° 24: ATACGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCA- CAACGG). Le produit final d'assemblage correspond à la banque de Sac7d avec toutes les régions nécessaires en 5'- et 3'- pour son utilisation en sélection par ribosome display comme précédemment décrit (Hanes et al., 1998; Schaffitzel et al., 1999).

Tours de sélection par ribosome display Pour les expériences de sélection, la protéine cible a été biotinylée. La biotinylation a été réalisée en incubant une solution à 10 pM du fragment Fc des IgG humaines (Bethyl Iboratories) avec 20 excès molaire de sulfosuccinimidyl-6- (biotinamido) hexanoate (Sulfo-NHS-LC-LC-Biotine, Pierce) dans un tampon PBS pH7.4 sur la glace pendant 1 h. Le tampon des Fc biotinylés a ensuite été échangé en utilisant une micro colonne à centrifuger (Pierce) équilibrée avec du tampon TBS pH 7.4 (Tris-HCI 20 mM, NaCl 150 mM). Le degré de biotinylation a été déterminé en utilisant le dosage HABA (Sigma) comme étant d'environ 2 molécules de biotine par molécule de Fc. Les protéines biotinylées ont été fixées alternativement de tour en tour à de la neutravidine ou de la streptavidine immobilisées en fond de plaque ELISA Maxisorp (Nunc) et les sélections par ribosome display ont été réalisées à 4°C comme décrit par Binz et al. (Binz, H. K., P. Amstutz, et al. (2004). Nat Biotechnol 22(5): 575-582) avec les modifications suivantes : après chaque tour de sélection, l'ARNm élué a été retro-transcrit en ADNc et amplifié par PCR en utilisant les oligonucléotides SDA_MRGS et ScepRev (TCGGCCCCCGAGGCC-ATATAAAGCTTTTTCTC) (SEQ ID N° 25). Ce produit PCR a été dessalé sur une colonne Nucleospin Extractll (Macherey-Nagel) et utilisé pour une PCR d'assemblage avec le fragment d'ADN TolAlinker (voir ci-dessus). Ceci a généré la construction entière nécessaire pour le ribosome display avec des régions flanquantes 5'- et 3'- nouvellement ajoutées dans le but de minimiser la perte de clones en raison d'une dégradation des extrémités de l'ARNm durant leur manipulation. Le progrès des sélections a été vérifié en suivant les quantités de produits de RT-PCR obtenues de tour en tour.

Analyse des groupes de sélection et des clones isolés Après cinq, six et sept tours de sélection, les groupes de clones sélectionnés ont été traduits in vitro et testés par ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) en utilisant les IgG directement immobilisées en fond de plaque ELISA Maxisorp. L'albumine de sérum bovin (SAB) a été utilisée comme protéine non spécifique en tant que contrôle négatif. La détection de la fixation sur les IgG a été réalisée en utilisant l'anticorps RGS His spécifique de l'étiquette RGS-(His)*6 présent en N-terminal des protéines, conjugué à la peroxydase (Qiagen) et une solution à 1 mg/ml du substrat o-Phenylenediamine (Sigma) et l'absorbance à 450 nm a été mesurée. Toutes les étapes d'incubation ont été réalisées dans du tampon TBS pH 7.4 (Tris-HCI 20 mM, NaCl 150 mM) contenant du Tween 20 à 0.1%. Les produits de RT-PCR des groupes de séquences sélectionnées ont été clonés dans le vecteur pFP1001 en utilisant les sites de restrictions BamHl et HindIll et les vecteurs obtenus ont été utilisés pour transformer la souche d'E. coli DH5a Iq. Des clones ont ensuite été repiqués des plaques de Petri pour inoculer une plaque à 96 puits profonds de type « deep-well » contenant dans chacun de ses puits 1.4 ml de milieu de culture LB (ampicilline 100 pg/ml, kanamycine 25 pg/ml, glucose 1 %). Après une culture sur la nuit à 37°C et agitation à 250 tpm, 0.2 ml de chaque puits de cette plaque mère a été utilisé pour inoculer une autre plaque « deep-well » contenant 1.3 ml de milieu de culture 2YT (ampicilline 100 pg/ml, kanamycine 25 pg/ml, glucose 0.1 %) par puits. La plaque a ensuite été incubée à 37°C pendant 2-3h avec agitation (750 tpm). L'expression a été induite par l'addition d'IPTG à 0.5 mM et incubation pendant une nuit à 30°C avec agitation (750 tpm). Les cellules centrifugées (2000g) et les surnageants éliminés. Les protéines ont été extraites avec 50 pl de BugBuster (Novagen) contenant de la DNase I à 5 pg/ml (Sigma) par puits avec une agitation à 750 tpm pendant 30 min, puis 250 pl de TBS pH 7.4 (Tris-HCI 20 mM, NaCl 150 mM) ont été ajoutés. Les débris cellulaires ont été ensuite éliminés par centrifugation (2000g). Pour le criblage par ELISA, 100 pl de chaque surnageant a été utilisé pour tester la liaison au fragment Fc en utilisant la SAB comme contrôle négatif, selon le même protocole que celui utilisé pour les protéines traduites in vitro. Les clones positifs ont été séquencés selon les méthodes standard de séquençage.

Production des protéines affines pour le criblage par résonance plasmonipue de surface (SPR) Pour réaliser le criblage des protéines affines sur la base de leur temps de dissociation pour les IgG humaines, les clones ont été exprimés dans la souche d' E. coli DH5a Iq. Deux cent microlitres d'une préculture de la nuit (milieu LB, ampiciline 100 pg/ml, kanamycine 25 pg/ml, glucose 1%, 37°C,) dans une plaque « deep-well » ont été utilisés pour inoculer 1.3 ml de culture (2YT, ampiciline 100 pg/ml, kanamycine 25 pg/ml, glucose 0.1%, 37°C, 750 tpm) en plaque «deepwell ». L'expression a été induite à une DO 600 = 1.0 en ajoutant de l'IPTG à 0.5 mM et les cultures ont été incubées pendant une nuit à 30°C (750 tpm). Les cellules ont été récoltées par centrifugation (2000 g) et les protéines ont été extraites dans les « deep-well » par resuspension des cellules dans 1.0 ml de tampon TBS pH 7.4 (Tris-HCI 20 mM, NaCl 150 mM) contenant 25 mM d'imidazole, du BugBuster et de la DNase I à 5pg/mI. Après 1h d'agitation à température ambiante, la plaque deep-well a été centrifugée pour éliminer les débris cellulaires. Les surnageants ont été purifiés avec des colonnes microspin contenant 100 pI de résine « Ni-Fast Flow Chelating Sepharose » (GE Healthcare) équilibrée avec du tampon de charge TBS pH 7.4 (Tris-HCI 20 mM, NaCl 150 mM) contenant 25 mM d'imidazole. La résine a ensuite été lavée 4 fois avec le tampon de charge, puis les protéines ont été éluées avec 150 pI de tampon TBS pH 7.4 (Tris-HCI 20 mM, NaCl 150 mM) contenant 250 mM d'imidazole.

Production des protéines D 1 Sac7d et de D 1 Sso7d à grande échelle Les protéines d'affinité ont été exprimées dans la souche E. coli DH5a Iq E. coli comme décrit ci-après. Quinze millilitres d'une préculture de la nuit (milieu LB, ampicilline 100 pg/ml, kanamycine 25 pg/ml, glucose 1%, 37°C) ont été utilisés pour inoculer 500 ml de culture (2YT, ampiciline 100 pg/ml, kanamycine 25 pg/ml, glucose 0.1 %, 37°C). L'expression a été induite à une DO 600 = 0.8-1.1 par addition d'IPTG à 0.5 mM et les cultures ont été incubées pendant une nuit à 30°C (220 tpm). Les cellules ont été récoltées par centrifugation et resuspendues dans 30 ml de tampon TBS pH 7.4 de lyse (Tris 20 mM, NaCl 500 mM, DNAse I à 5 pg/ml, Lysozyme à 0.5 pg/ml) à température ambiante contenant de l'imidazole à 25 mM. Les cellules ont été lysées avec un sonicateur et les débris cellulaires ont été éliminés par une étape de centrifugation. Les protéines ont été purifiées sur une colonne de chélation HiTrap de 1 ml (GE Healthcare) équilibrée avec du tampon TBS pH 7.4 (Tris 20 mM, NaCl 500 mM) contenant 25 mM d'imidazole.

L'élution a été réalisée avec du TBS pH 7.4 (Tris 20 mM, NaCl 500 mM) contenant 250 mM d'imidazole. Les protéines ont ensuite été purifiées avec une station « Biologic Duoflow system » (Biorad) connectée à une colonne de chromatographie d'exclusion Superdex 75 16/60 (GE Healthcare). La colonne avait été équilibrée avec du TBS pH 7.4 (Tris 20 mM, NaCl 500 mM). La calibration de cette colonne de tamis moléculaire a été réalisée en injectant de l'Aprotinin (6.5 kDa), du Cytochrome C (12.4 kDa), de l'Anhydrase carbonique (29 kDa), de la serum albumine bovine (66 kDa), et de l'alcool déhydrogenase (150 kDa) comme standards de calibration pour les poids moléculaires.

Mesure de l'affinité de DlSac7d et DlSso7d par résonance plasmonipue de surface (SPR) Le signal SPR a été mesuré en utilisant un appareil BlAcore 3000 à 25°C. Les IgG ou IgG1 humaines (1500-2000 RU) ont été immobilisées sur les cellules de mesure d'une puce CM5. Le tampon de course était du HBSEP pH 7.4 (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, contenant 0.005% de surfactant P20). La régénération de la puce a été réalisée avec un tampon glycine à 10 mM, pH 3.0. Le criblage et le classement des clones en fonction de leur temps de dissociation des IgG ont été réalisés en utilisant les protéines purifiées sur micro colonnes IMAC (voir ci-dessus) diluées au 1/5 dans le tampon de course avant leurs injections pour les mesures cinétiques à un débit de 60 pl/min. Les mesures pour la détermination d'affinité ont été réalisées avec les protéines d'affinités purifiées par IMAC et tamis moléculaire injectées à huit dilutions de 2 en 2 en partant d'une solution à 125 nM (D1Sac7d) et d'une solution à 5 pM (D1Sso7d). Le traitement des données à été réalisée avec les logiciels Scrubber2 (Biologic software) et BlAeval (BlAcore) en utilisant le modèle de liaison « steady state » (D1Sso7d) ou le modèle cinétique de liaison 1:1 de Langmuir et un ajustement global (Karlsson and Fait, 1997, J Immunol Methods 200(1-2): 121-133).

Etude de la spécificité par ELISA Cent microlitres d'une solution à 10 pM de D1Sso7d ou de D1Sac7d purifiés ont été utilisés pour les ELISA afin de tester leur liaison aux immunoglobulines (ou à la SAB comme contrôle négatif) immobilisées en fond de plaque Maxisorp. La détection de la fixation sur le Fc des IgG a été réalisée en utilisant l'anticorps anti-RGS(His)*6 conjugué à la peroxydase (Qiagen) et une solution à 1 mg/ml du substrat o-Phenylenediamine (Sigma) et l'absorbance à 450 nm a été mesurée. Toutes les étapes d'incubation ont été réalisées avec du tampon TBS pH 7.4 contenant 0.1% de Tween 20.

Marquage de DlSac7d et DlSso7d avec l'AlexaFluor 680 Cinquante microlitres de D1Sso7d (à 2 mg/ml dans NaHCO3 0.1 M pH7.5) ont été mélangés à 3 pl d'Alexa 680 succinimidyl ester (à 10 mg/ml dans du dimethyl sulfoxide) et ont été incubés 1h à température ambiante sous agitation. Le marquage a été arrêté en dessalant le mélange réactionnel avec une micro colonne de dessalage (Pierce) équilibrée dans du tampon TBS pH 7.4 (Tris 20 mM, NaCl 150 mM).

Etude la spécificité par Western blot Dix microgrammes de hlgG ont été chargés sur une gel SDS-PAGE non réducteur 8%. Les hlgG mélangées avec des protéines exogènes ont été préparées avec du milieu de culture DMEM + 10 % de sérum de veau (i.e., 40 % de DMEM en concentration finale dans l'échantillon chargé) ou avec un extrait brut de E. coli préparé à partir de la souche DH5a Iq (i.e., équivalent à une culture initiale 5X concentrée dans l'échantillon chargé). Les protéines de chaque échantillon ont été séparées par SDS-PAGE et transférées sur membrane de nitrocellulose. La détection des hlgG a été réalisée en incubant la membrane de nitrocellulose avec les protéines D1Sac7d et D1Sso7d marquées avec l'AlexaFlor 680 à 1 pg/ml dans du tampon TBS pH 7.4 (Tris 20 mM, NaCl 150 mM) contenant 0.1% de Tween-20 et 1% de BSA pendant 1h à température ambiante. Les bandes ont été détectées en utilisant un lecteur infra rouge Odyssey (LI-COR).

Cinétique de désactivation de DlSso7d, DlSac7d et de la Protéine A par SPR Des IgG1 humaines (1600 RU) ont été immobilisées par la chimie de couplage des amines dans une cellule d'une puce CM5. Les protéines Dl Sac7d, Dl Sso7d et la Protéine A ont été incubées indépendamment avec des solutions tampon à pH 1, 2, 3, 11, 12 ou 13 aux concentration finales respectives de 10 pM, 125 pM et 4pM. Les solutions utilisées étaient pour pH 1 = HCI 0,1 M, pH 2 = NaH2PO4 50 mM, pH 3 = NaH2PO4 50 mM, pH 11 = methylamine 50 mM, pH 12 = Na2HPO4 50 mM, pH 13 = NaOH 0,1 M. La cinétique de désactivation par le pH a été arrêtée en neutralisant 5 pl de mélange protéine/tampon dans 245 pl de tampon de course SPR HBSEP pH 7.4 (Hepes 20 mM, 150 NaCl mM, et 0.005% de P20). La fraction de protéine résiduelle capable de se fixer aux hlgG, après différents temps d'exposition aux différents pH, a été mesurée par SPR en injectant Dl Sac7d à 200 nM, Dl Sso7d à 2.5 pM et la Protéine A à 80 nM à un débit de 50 pl/min. La régénération a été réalisée avec un tampon glycine à 10 mM, pH 2.5.

Chromatographie d'affinité en utilisant DlSso7d Un millilitre de DlSso7d (à 10 mg/ml) purifié par IMAC et tamis moléculaire a été dialysé sur la nuit contre un tampon PBS pH 7.4 et a été injecté sur une colonne « HiTrap NHS-activated HP » de 1 ml (GE Healthcare) préalablement équilibrée avec 6 ml de HCI 1 mM. L'immobilisation a été réalisée à température ambiante pendant l h. Après lavage de la colonne et désactivation des groupements réactifs restant avec de l'ethanolamine 0.5 M (NaCl 0.5 M, pH 8.3) et de l'acetate 0.1 M (NaCl 0.5 M, pH 4) pendant 30 min à température ambiante, la colonne a été équilibrée avec du tampon PBS pH 7.4 (NaCl 500 mM). La colonne était prête à son utilisation pour les purifications.

Environ 125 pg de chaque IgG ou IgA ont été injectés sur la colonne de Dl Sso7d. Les Ig mélangées à des protéines exogènes ont été préparées avec du milieu de culture DMEM + 10 % de serum de veau (i.e., 40 % de DMEM en concentration finale dans l'échantillon chargé) ou avec un extrait brut de E. coli préparé à partir de la souche DH5a Iq (i.e., équivalent à une culture initiale 5X concentrée dans l'échantillon chargé). Les protéines non retenues ont été lavées avec 5 ml de tampon de course PBS pH 7.4 (NaCl 500 mM) et les Ig ont été éluées avec un saut de pH acide en utilisant 5 ml d'un tampon glycine à 100 mM (pH 2.5, NaCl 150 mM). Le degré de pureté des protéines éluées à été vérifié en chargeant les fractions éluées sur un gel SDS-PAGE 12% réducteur. Pour tester la capacité à purifier les IgG1 humaines dans des conditions classiquement rencontrées, 1 ml d'une production d'IgGl humaine (soit environ 0.4 mg) produite sous forme d'ascite chez la souris a été chargé sur la colonne de Dl Sso7d préalablement équilibrée dans du tampon PBS pH 7.4. Les protéines non retenues ont été lavées avec 10 ml de tampon de course PBS pH 7.4 et les Ig ont été éluées avec un saut de pH acide en utilisant 5 ml de tampon glycine à 100 mM (pH 2.5, NaCl 150 mM). A titre de comparaison, une colonne de protéine A commerciale « HiTrap Protein A HP » (GE Healthcare, ref. 17-402-03) a été utilisée dans les mêmes conditions. Le degré de pureté des protéines éluées a été vérifié en chargeant les fractions éluées sur un gel SDS-PAGE 12% réducteur.

Recherche de l'épitope reconnu par compétition suivie par SPR Des IgG1 humaines (200 RU) ont été immobilisées par la chimie de couplage des amines dans une cellule d'une puce CM5. Le tampon de course était du HBSEP pH 7.4 (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, contenant 0.005% de surfactant P20). La régénération de la puce a été réalisée avec un tampon glycine à 10 mM, pH 2.5. Le débit fixé pour ces expériences est de 40 pL/min, l'association est mesurée pendant 3 min. Deux types d'expérience ont été réalisés par compétition de fixation avec des ligands naturel du fragment Fc : la Protéine A (Sigma), CD64 (R&D Systems). Dans une première série d'expériences les analytes ont été injectés deux à deux successivement sur la chip IgG1. Après l'injection du premier analyte (analytel) une courte période de dissociation a été observée puis le second analyte (analyte2) a été injecté sur le complexe formé et on a comparé la réponse obtenue (RU) par rapport à la RU observée après injection de l'analyte2 à la même concentration sans injection du premier analyte. Les concentrations utilisées des analytes étaient les suivantes : 500nM pour la Protéine A, C3, Dl Sso7d et Dl Sac7d, 9 nM pour CD64. Dans une deuxième série d'expériences les analytes ont été injectés successivement mais sans laisser de phase de dissociation après la fixation du premier partenaire (co-injection). Le second analyte qui a été injecté était un mélange du premier analyte (concentration identique) et du second analyte. Par exemple, si on voulait mesurer la compétition entre Dl Sso7d et la Protéine A, Dl Sso7d était injecté à 1 pM sur la puce, puis en co-injection le mélange Dl Sso7d (1 pM) et la Protéine A (500 nM). La réponse (RU) du second analyte est comparée à l'injection de ce dernier après injection de tampon de course et le résultat exprimé en pourcentage. Les concentrations utilisées des analytes étaient les suivantes : 500nM pour la Protéine A, 1 pM pour DlSso7d, DlSac7d et C3, et 45 nM pour CD64.

Résultats Exemple 1 : Isolement et caractérisation d'un polypeptide présentant une affinité pour les IgG humaines Un polypeptide (nommé DlSac7d) présentant une affinité pour les immunoglobulines (reconnaissance du fragment Fc des immunoglobulines) a été caractérisé. La séquence de cette protéine est donnée par SEQ ID N° 10.

Pour isoler des variants capables de se fixer sur des IgG humaines indépendamment de de leurs régions hypervariables, les sélections ont été réalisées en utilisant le fragment Fc préparé à partir d'un groupe anticorps humain polyclonal comme cible. Une plaque ELISA plate sensibilisée alternativement de tour en tour avec de la streptavidine ou de la neutravidine a été utilisée pour immobiliser le Fc biotinylé et sept tours de sélection ont été réalisés.

L'enrichissement en variants de sac7d affins pour le Fc a été suivi par ELISA pendant la sélection, alors qu'aucune fixation ne pouvait être détectée sur la SAB utilisée comme contrôle négatif. Après sous-clonage dans le vecteur d'expression pFP1001, 96 variants ont été testés par ELISA pour leur capacité à reconnaitre le fragment Fc. Environ 95% 25 des clones montraient un rapport signal/bruit supérieur à 10. L'ensemble de ces 96 clones a alors été soumis à un second criblage en évaluant leur vitesse de dissociation (koff) des hIgG1 résonance plasmonique de surface SPR. Le clone D1 Sac7d présentait la vitesse de dissociation la plus lente (0,0278s-1) de tous les clones testés ce qui reflétait probablement l'affinité la plus 30 élevée pour ce groupe de clones. Le clone DlSac7d (SEQ ID N° 10) présentant la vitesse de dissociation la plus lente, la constante de dissociation (KD) de ce clone purifié et monomérique pour la hIGg1 a été ensuite déterminée précisément par SPR comme étant de 3.3 10-8 M, soit 33 nM. 35 La mise en oeuvre de la méthode de sélection décrite plus haut sur une banque combinatoire telle que décrite dans WO 2008/068637 (dans laquelle les acides aminés K7, Y8, K9, K21, K22, W24, V26, M29, S31, T33, T40, R42, A44, S46 sont mutés) a permis de caractériser la protéine C3 (SEQ ID N° 12) qui présente la meilleure affinité pour les IgG pour les clones issus de cette banque. La constante de dissociation (KD) du clone C3 purifié et monomérique pour la hIGg1 a été mesurée par SPR comme étant de 7.4 10-8 M, soit 74 nM. La protéine D1 présente donc une meilleure liaison aux immunoglobulines que la protéine C3.

Exemple 2 : Transfert du site de reconnaissance du squelette Sac7d sur l'ossature de Sso7d Sso7d (SEQ ID N° 2) est un homologue de Sac7d (SEQ ID N° 1) qui est plus stable d'environ 10°C que Sac7d (Edmondson et al., (2001) Methods 15 Enzymol, 334, 129-45). Les inventeurs ont émis l'hypothèse que cette stabilité thermique pourrait mener à une meilleure stabilité à pH élevé. Les études publiées jusqu'à présent (Bedell et al., (2005). Biochemistry. 44, 915-25 ; Kahsai et al., (2005), Biochemistry, 44, 13500-9 ; McCrary et al., (1996), J Mol Biol, 264, 784-805 ; 20 McCrary et al., (1998), J Mol Biol 276, 203-24 ; Clark et al., (2007), J Mol Biol 372, 992-1008) ne se sont jamais intéressées à la stabilité de ces protéines à des pH supérieurs à 10. Sac7d et Sso7d de type sauvage (= WT) ont les séquences représentées par SEQ ID N° 1 et SEQ ID N° 2. 25 La séquence de D1Sso7d (SEQ ID N° 11) a été générée par synthèse de gène (GeneCust) en apportant les modifications suivantes à celle de D1Sac7d (SEQ ID N° 10) : 1) mutations : V2A, K3T, T171, D36E, N37G, D56Q 2) insertion : G entre G38 et K39 30 3) délétions : A59, C60, A61

Exemple 3 : Profil de spécificité par ELISA et affinité par résonance plasmonique de surface (SPR) Pour caractériser D1Sac7d et D1Sso7d, leurs activités de fixation contre 35 diverses IgG ont été testées par ELISA (Figure 2).

Les résultats montrent que DlSac7d et DlSso7d utilisés à la même concentration sont, dans ces conditions opératoires, tout deux spécifiques des IgG humaines et fixent fortement les IgG humaines d'isotypes 1 et 2, faiblement l'isotype 4 et pas l'isotype 3. Leur spécificité de reconnaissance est étroite puisque aucune IgG d'espèce autre qu'humaine n'est reconnue parmi celles testées. La SAB (sérum albumine de bovin) n'est pas reconnue non plus (contrôle négatif) quelle que soit la forme de Dl (Sac7d ou Sso7d). Cependant, on observe une meilleure reconnaissance des IgG4 pour Dl Sso7d que pour Dl Sac7d. Comparées à la protéine C3 (SEQ ID N° 12), les formes de Dl ont le même profil de reconnaissance, sauf pour les IgG de porc que seul C3 est capable de reconnaître. Dl a donc une spécificité plus stricte que C3. L'affinité de la protéine DlSso7d déterminée par SPR est de 1500 nM, une affinité suffisante pour son utilisation comme réactif de capture en chromatographie d'affinité.

Ce résultat démontre qu'il est possible de transférer un site de reconnaissance d'une protéine affine ayant un squelette Sac7d pour en créer une nouvelle sur la base d'une ossature Sso7d, en conservant la spécificité de la molécule initiale. Ce transfert de site de reconnaissance peut également être réalisé pour les autres protéines de la famille Sac7d, qui présentent toutes des similitudes de séquences et de conformation.

Exemple 4 : Spécificité déterminée par Western blot Afin de déterminer le degré de spécificité des protéines DlSac7d et Dl Sso7d, ces protéines purifiées ont été marquées avec le fluorophore Alexa680 pour être utilisées comme réactif d'immuno détection en Western blot. Les IgG humaines ont été mélangées à du milieu de culture pour cellules eucaryotes (DMEM 10% sérum de veau foetal), ou à de l'extrait brut de E. coll. Après migration sur gel SDS-PAGE et transfert sur membrane de nitrocellulose, la détection des IgG a été réalisée avec les protéines marquées.

La figure 3 montre que Dl Sac7d ne reconnaît aucune protéine contenue dans le DMEM, mais se lie à certaines protéines d'E. coll. De façon surprenante, Dl Sso7d est plus spécifique puisqu'il ne reconnaît pratiquement que les IgG.

Exemple 5 : Caractérisation de l'épitope reconnu par DlSac7d et DlSso7d La protéine A et le récepteur CD64 sont des ligands naturels du fragment Fc et pour lesquels la région du Fc qui est liée est connue. Les inventeurs ont utilisé ces ligands comme compétiteurs pour déterminer par SPR s'ils pouvaient exercer un effet inhibiteur sur la fixation de D1 Sso7d et D1 Sac7d sur les hIgG1 (Figure 4). Par injection successive des analytes (Figure 4.A), la fixation de DlSso7d ne semble pas être modifiée par la fixation de CD64 et l'est très faiblement par la fixation de la Protéine A. Ces résultats sont confirmés par les expériences de coinjection des analytes (Figure 4.B). D1 Sac7d et D1SSo7d semblent reconnaitre le même épitope sur le fragment Fc, qui est clairement différent de celui reconnu par CD64 ou par C3.

L'épitope reconnu semble aussi différent de celui reconnu par la Protéine A, la faible inhibition de fixation exercée par la Protéine A s'expliquant probablement par un léger encombrement stérique comme on l'observe entre la Protéine A et CD64 qui reconnaissent pourtant deux épitopes éloignés du fragment Fc.

Exemple 6 : Stabilité de Dl Sac7d et Dl Sso7d à pH acides et alcalins La fraction active de DlSac7d ou DlSso7d ont été étudiées par SPR après différents temps d'incubation à pH 1, 2, 3, 11, 12 et 13. On observe que D1 Sso7d est nettement plus résistant que Dl Sac7d aux pH alcalins. (Figure 5) En effet, on observe quasiment 100% d'activité après 24h à pH 13 pour D1 Sso7d, alors que dans les mêmes conditions D1 Sac7d est quasiment inactivé. DlSso7d semble aussi stable que la Protéine A dans ces conditions. On observe que C3 (ou une autre protéine identifiée par criblage de la même banque que C3) est nettement moins stable que D1 Sso7d ou D1 Sac7d à 25 pH supérieur à 11 (non montré).

Par ailleurs, DlSac7d et DlSso7d conservent les propriétés acidophiles des protéines sauvages et sont peu ou pas altérées par des traitements d'une nuit aux pH acides. La stabilité alcaline de DlSso7d semble donc permettre une utilisation en chromatographie d'affinité qui peut nécessiter des étapes de régénérations et de décontaminations à la soude 0.1 M ou plus. 30 35 Exemple 7 : Chromatographie d'affinité avec DlSso7d 20 Une colonne d'affinité a été préparée en immobilisant Dl Sso7d sur une résine d'agarose par la chimie des amines. Cette colonne a ensuite été mise en contact avec des IgG humaines d'isotypes 1, 2, 3, 4, des IgG d'espèces (chèvre, souris lapin, rat, mouton et porc), 5 et des IgA humaines, de façon indépendante. L'analyse par SDS-PAGE des fractions protéiques non retenues et retenues a permis de conclure que DlSso7d est clairement capable de retenir les sous-types IgG1, IgG2 et IgG4 humaines, et pourrait également retenir les IgG3, ce qui n'avait pas été détecté dans les conditions opératoires de I'ELISA. 10 Parmi les IgG animales, seule celle du rat est faiblement retenue sur la colonne, aucune autre n'est retenue. De même, aucune IgA humaine n'a été retenue sur la colonne. Des IgG humaines mélangées à du DMEM + sérum de veau foetal ou à de l'extrait brut d'E. coli ont été injectées sur une colonne Dl Sso7d. L'analyse par 15 SDS-PAGE a montré que la colonne permet de séparer les IgG humaines de toutes les protéines contenues dans le DMEM complété de sérum de veau foetal (Figure 6.A) Pour les IgG humaines mélangées à un extrait brut d'E. coli, les conditions de séparation optimales nécessitent une force ionique élevée dans le tampon PBS 20 de purification (500 mM NaCl final), comme c'est souvent le cas pour les purifications par chromatographie d'affinité (Figure 6.B). Le système de purification par chromatographie d'affinité avec Dl Sso7d a été comparé au système standard de purification des anticorps basé sur une chromatographie avec la Protéine A. 25 Pour évaluer la qualité de purification que l'on peut atteindre avec une colonne de Dl Sso7d dans un cas pratique, celle-ci a été utilisée pour purifier une IgG1 humaine produite chez la souris sous forme d'ascite. Le gel SDS-PAGE de la figure 6.0 montre la fraction éluée correspondante aux IgG1 contenues dans l'ascite sont au moins aussi pures que si on utilise une 30 colonne de protéine A dans les mêmes conditions. Les deux systèmes sont donc comparables.

Exemple 8 : Résistance d'une colonne d'affinité Dl Sso7d aux conditions de pH élevés Pour évaluer le gain de stabilité obtenue entre C3 et DlSso7d, les colonnes C3 et D1 Sso7d ont été soumises à des cycles de purification d'IgG1 humaines alternativement à des cycles de 15 min décontamination à la soude 0.1 M (CIP) : Après 26 cycles de 15 min de traitement (soit 6h30 en temps cumulé), la colonne C3 est quasiment désactivée par NaOH 0,1M (pH 13), alors que la colonne D1 Sso7d est encore fonctionnelle à 90% (Figure 7). Ainsi, la colonne de D1 Sso7d a une résistance à NaOH 0.1 M équivalente à celle de la Protéine A commerciale.

Les résultats présentés ci-dessus montrent donc qu'il est possible de transférer des mutations observées dans la séquence Sac7d (reconnaissant une cible d'intérêt) vers une autre protéine de la même famille, en conservant la reconnaissance de la cible d'intérêt. La protéine ainsi obtenue présente par ailleurs des propriétés un peu 15 différentes de la protéine de départ (stabilité, spécificité...).

Claims (5)

1. REVENDICATIONS1. Méthode de génération d'un acide nucléique codant pour une protéine présentant une affinité pour une molécule d'intérêt, comprenant les étapes de : a) comparer la séquence d'un mutant initial d'une protéine de la famille de Sac7d, ledit mutant présentant une affinité pour ladite molécule d'intérêt, avec la séquence de la protéine sauvage correspondante de la famille Sac7d b) identifier les acides aminés mutés par rapport à la séquence sauvage correspondante, qui représentent le site de reconnaissance de ladite molécule d'intérêt c) synthétiser un acide nucléique codant pour une autre protéine de la famille Sac7d, mais dans laquelle les acides aminés sauvages localisés à la même position que ceux mutés dans le mutant initial ont été remplacés par lesdits acides aminés mutés.
2. 2. Méthode de génération d'une protéine présentant une affinité pour une molécule d'intérêt, comprenant les étapes de : a) comparer la séquence d'un mutant initial d'une protéine de la famille de Sac7d, ledit mutant présentant une affinité pour ladite molécule d'intérêt, avec la séquence de la protéine sauvage correspondante de la famille Sac7d b) identifier les acides aminés mutés par rapport à la séquence sauvage correspondante, qui représentent le site de reconnaissance de ladite molécule d'intérêt c) synthétiser un polypeptide présentant la séquence d'une autre protéine de la famille Sac7d, dans laquelle les acides aminés sauvages localisés à la même position que ceux mutés dans le mutant initial ont été remplacés par lesdits acides aminés mutés.
3. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite protéine de la famille Sac7d présente une séquence correspondant à la séquence SEQ ID N° 8.
4. 4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite protéine de la famille Sac7d est la protéine Sac7d dont la séquence est représentée par SEQ ID N° 1.
5. 5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ladite autre protéine de la famille Sac7d est la protéine Sso7d dont la séquence est représentée par SEQ ID N° 2.10