JP2015535006A - ストレプトアビジン突然変異タンパク質およびそれらを使用する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、新規なストレプトアビジン突然変異タンパク質に関する。1つの態様において、このような突然変異タンパク質は、(a) SEQ ID NO: 15に記載の野生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列を参照して、アミノ酸115〜121位の領域内に少なくとも1つの変異を含み、かつ (b) アミノ酸配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 100) を含むペプチドリガンドに対して、(i) アミノ酸配列Val44-Thr45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 98) を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質、または (ii) アミノ酸44〜47位において、アミノ酸配列He44-Gly45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 99) を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質、または (iii) 野生型ストレプトアビジン (SEQ ID NO: 15) の各々よりも高い結合親和性を有する。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2012年11月16日に米国特許商標庁に出願された米国仮特許出願第61/727,283号、および2013年8月26日に欧州特許庁に出願された欧州特許出願第13 181 697.7号の優先権を主張するものであり、それらの全内容はすべての目的のために本明細書に組み入れられる。
本出願は、2012年11月16日に米国特許商標庁に出願された米国仮特許出願第61/727,283号、および2013年8月26日に欧州特許庁に出願された欧州特許出願第13 181 697.7号の優先権を主張するものであり、それらの全内容はすべての目的のために本明細書に組み入れられる。
発明の分野
本発明は、新規なストレプトアビジン突然変異タンパク質、組換えDNA技術によってそのような突然変異タンパク質を生成する方法、ならびに組換えタンパク質などの生体物質または細胞表面上に特異的受容体分子を有する細胞などの生物学的実体を単離する、精製する、および決定するためのこれらのストレプトアビジン突然変異タンパク質の使用に関する。
本発明は、新規なストレプトアビジン突然変異タンパク質、組換えDNA技術によってそのような突然変異タンパク質を生成する方法、ならびに組換えタンパク質などの生体物質または細胞表面上に特異的受容体分子を有する細胞などの生物学的実体を単離する、精製する、および決定するためのこれらのストレプトアビジン突然変異タンパク質の使用に関する。
背景
短いペプチドアフィニティータグは、タンパク質研究において不可欠のものとなっている。それらは、その生化学的特性のいかなる予備知識も必要とせずに、任意の融合組換えタンパク質のアフィニティー精製ばかりでなく、検出およびアッセイにも使用することができる。アフィニティータグStrep-tag（登録商標）II（Schmidt & Skerra, Nature Protocols 2 (2007), 1528-1535 （非特許文献1）；米国特許第5,506,121号（特許文献1）、配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys、SEQ ID NO: 100を有する）は、迅速な1段階プロトコールの中で生理的条件を使用することにより高い純度かつ機能性で組換えタンパク質を提供することで、特に評判がよい。Strep-tag（登録商標）IIアフィニティータグに対する現在最も効率的なストレプトアビジンベースの受容体は、結合親和性が改善されたストレプトアビジン突然変異タンパク質であり、Strep-Tactin（登録商標）と命名されている（Voss & Skerra, Protein Engineering 10 (1997), 975-982 （非特許文献2）；米国特許第6,103,493号（特許文献2）または欧州特許第0 835 934号（特許文献3））。Strep-tag（登録商標）IIは、ビオチン結合ポケットに結合し、アフィニティー樹脂の反復使用のために、ビオチン誘導体、好ましくはデスチオビオチンによる穏和な競合溶出を可能にする。Strep-tag（登録商標）II：Strep-Tactin（登録商標）システムは、組換えタンパク質（Schmidt & Skerra, Nature Protocols 2 (2007), 1528-1535 （非特許文献1）において概説されている）およびさらには細胞 (Knabel et al., Nature Medicine 8 (2002), 631-637 （非特許文献3）) の精製、検出、およびアッセイに関して、この15年間で効果的な適用を提供してきた。
短いペプチドアフィニティータグは、タンパク質研究において不可欠のものとなっている。それらは、その生化学的特性のいかなる予備知識も必要とせずに、任意の融合組換えタンパク質のアフィニティー精製ばかりでなく、検出およびアッセイにも使用することができる。アフィニティータグStrep-tag（登録商標）II（Schmidt & Skerra, Nature Protocols 2 (2007), 1528-1535 （非特許文献1）；米国特許第5,506,121号（特許文献1）、配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys、SEQ ID NO: 100を有する）は、迅速な1段階プロトコールの中で生理的条件を使用することにより高い純度かつ機能性で組換えタンパク質を提供することで、特に評判がよい。Strep-tag（登録商標）IIアフィニティータグに対する現在最も効率的なストレプトアビジンベースの受容体は、結合親和性が改善されたストレプトアビジン突然変異タンパク質であり、Strep-Tactin（登録商標）と命名されている（Voss & Skerra, Protein Engineering 10 (1997), 975-982 （非特許文献2）；米国特許第6,103,493号（特許文献2）または欧州特許第0 835 934号（特許文献3））。Strep-tag（登録商標）IIは、ビオチン結合ポケットに結合し、アフィニティー樹脂の反復使用のために、ビオチン誘導体、好ましくはデスチオビオチンによる穏和な競合溶出を可能にする。Strep-tag（登録商標）II：Strep-Tactin（登録商標）システムは、組換えタンパク質（Schmidt & Skerra, Nature Protocols 2 (2007), 1528-1535 （非特許文献1）において概説されている）およびさらには細胞 (Knabel et al., Nature Medicine 8 (2002), 631-637 （非特許文献3）) の精製、検出、およびアッセイに関して、この15年間で効果的な適用を提供してきた。
Strep-tag（登録商標）II：Strep-Tactin（登録商標）相互作用は、比較的速い結合および解離動力学ならびに中程度の結合親和性を特徴とする。速い動力学は、カラムクロマトグラフィーにおいてより高い流速を支持し、ここで速い会合動力学は効率的な結合を確実にし、早い解離動力学は効率的な競合溶出を可能にする。
一方で、結合パートナーの少なくとも一方‐Strep-tag（登録商標）II融合タンパク質またはStrep-Tactin（登録商標）‐が低濃度で適用されるかまたは存在する場合には、中程度の結合親和性および速い解離動力学は限定的である。1つ目のケースの例は、Strep-tag（登録商標）II融合タンパク質に関する希釈抽出物をもたらす発現不良、または発現後の細胞溶解に大きな緩衝液容積を使用する場合、またはStrep-tag（登録商標）II融合タンパク質が細胞培養上清中に分泌される場合である。いずれの例においても、低濃度の標的タンパク質を含む大きな試料容積をアフィニティーカラムに適用する必要があり、これはカラムブレークスルー、Strep-tag（登録商標）II融合タンパク質の著しい喪失、および収率の減少を引き起こす場合が多い。この中程度の結合親和性相互作用に関して最適以下の条件下で働く他方の別の形態は、バッチ精製の場合のようなStrep-Tactin（登録商標）反応パートナーの希釈であり、バッチ精製はカラム精製と比較して、同様にStrep-tag（登録商標）II融合タンパク質の収率の減少をもたらし得る。
これらの限定は、短いリンカーによって結合された2つ（またはそれ以上）のStrep-tag（登録商標）II部分の連続配置からなるDi-tagアフィニティータグ（同様のまたはわずかに異なる配列は、Strep-tag（登録商標）III、One-STrEP-tag、またはTwin-Strep-tag（登録商標）という名称でも知られている）を開発することによって軽減された。リンカーおよびまたストレプトアビジン結合部分は、様々なバリエーションで使用され得る。Di-tag配列の例は、di-tag3配列
、またはdi-tag2配列
である（Junttila et al., Proteomics 5 (2005), 1199-1203 （非特許文献4）；米国特許第7,981,632号（特許文献4））。結合が改善された生化学的理由は、結合力効果、すなわち四量体Strep-Tactin（登録商標）に対する2つのストレプトアビジン結合部分の組み合わせ相乗的結合である。これにより、非競合的条件下での比較的速い解離速度から、相乗効果を逆転させる競合物の添加による効率的な溶出能を維持したままでの、より安定した結合に切り替わる。実際に、Di-tagは、競合条件下での効率的な溶出を含む、Strep-tag（登録商標）IIのすべての有益な適用特性を備えているが、加えて、より安定した結合を必要とする適用における、より一般的な使用も可能にする。しかしながら、1つの欠点は、それが短いStrep-tag（登録商標）IIよりもかなり大きなサイズ（3倍）を有し、これによって融合組換えタンパク質に対する悪影響がより確実になることである。
アフィニティー精製に加えて、アッセイもまた、特に広範な洗浄が必要とされる場合に、結合親和性および解離動力学に関して非常に要求が厳しい場合がある。したがって、解析されるべきStrep-tag（登録商標）II融合タンパク質が、Strep-Tactin（登録商標）でコーティングされた固相に結合している場合、比較的速い解離動力学が原因で、洗浄中に著しい喪失が起こり、最終的にアッセイ全体の感度が低下する可能性がある。例として、組換えStrep-tag（登録商標）(II) 融合タンパク質が、それぞれStrep-Tactin（登録商標）でコーティングされたそれぞれマイクロタイタープレートまたはCM5チップまたはセンサー表面上に固定化されている場合の、ELISAまたはBiaCore（商標）またはQuarz Crystal Microbalance (QCM) 実験が挙げられる。例えば、固相上に固定化された少量のStrep-tag（登録商標）(II) 融合タンパク質が、高感度様式で標識結合Strep-Tactin（登録商標）によって検出される適用についても、同じことが当てはまる。例として、組換えStrep-tag（登録商標）(II) 融合タンパク質が、それぞれマイクロタイタープレートまたは膜（ニトロセルロース／PVDF）または細胞膜上に固定化されているかまたは結合している場合の、ELISAまたはウェスタンブロットまたは細胞ベースのアッセイ実験が挙げられる。結合しているStrep-tag（登録商標）(II) タンパク質は、例えばFACSにより標識Strep-Tactin（登録商標）によって検出され得るため、細胞膜もまた固相として見なされ得る。実際に、Strep-tag(II) 融合タンパク質に関する任意の検出方法が、Strep-tag(II) またはDi-tagに対する結合親和性が増加したストレプトアビジン突然変異タンパク質によって改善される。
これらの理由で、米国特許第6,103,493号（特許文献2）によって開示された突然変異タンパク質よりも、短いStrep-tag(II) に対するより高い結合親和性を有するストレプトアビジン突然変異タンパク質が、今もなお望ましい。このようなストレプトアビジン突然変異タンパク質を用いると、現在Di-tagを使用することによってのみ実行可能である適用が、短いStrep-tag（登録商標）IIを用いて可能になり得る。Di-tag融合タンパク質に関する精製、検出、またはアッセイのような適用もまた同様に、米国特許第6,103,493号（特許文献2）のストレプトアビジン突然変異タンパク質よりも、ストレプトアビジン結合ペプチドに対するより高い結合親和性を有するストレプトアビジン突然変異タンパク質によって強化される。そのような適用の例は、上記の精製適用、または／およびバッチ形式での希釈されたDi-tag融合タンパク質の捕捉、例えばストレプトアビジン突然変異タンパク質でコーティングされた磁気ビーズによるタンパク質複合体の捕捉、または／および広範な洗浄と組み合わせて最も高い感度が必要とされるアッセイにおける、非常に要求が厳しい状況である。増強された親和性を有するこのようなストレプトアビジン突然変異タンパク質はまた、Strep-tag（登録商標）IIまたはDi-tagなどのストレプトアビジンアフィニティータグを保有する融合タンパク質の最も安定した固定化に望ましく、この場合、これらの融合タンパク質は、該ストレプトアビジン突然変異タンパク質でコーティングされた、例えば表面プラズモン共鳴 (SPR) 用のチップのような固相上で特徴づけまたはアッセイまたは検出され、またこの場合任意に、該ストレプトアビジン突然変異タンパク質でコーティングされた該固相は、容易にかつ穏和な条件下で再生され得、このことは、最初のStrep-tag（登録商標）IIまたはDi-tag融合タンパク質から再度遊離されて、別のStrep-tag（登録商標）IIまたはDi-tag融合タンパク質の結合に対して準備することを意味する。
したがって、Strep-tag（登録商標）IIおよび／またはDi-tagアフィニティーペプチドなどのストレプトアビジン結合ペプチドに対して、米国特許第6,103,493号（特許文献2）によって開示された突然変異タンパク質よりも高い親和性を有するストレプトアビジン突然変異タンパク質を提供することが、本発明の目的である。
Schmidt & Skerra, Nature Protocols 2 (2007), 1528-1535
Voss & Skerra, Protein Engineering 10 (1997), 975-982
Knabel et al., Nature Medicine 8 (2002), 631-637
Junttila et al., Proteomics 5 (2005), 1199-1203
第1局面において、本発明は、
(a) SEQ ID NO: 15に記載の野生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列を参照して、アミノ酸44〜53位の領域内に少なくとも2つのシステイン残基を含み、かつ
(b) アミノ酸配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 100) を含むペプチドリガンドに対して、
(i) アミノ酸配列Val44-Thr45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 98) を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質、または
(ii) アミノ酸44〜47位において、アミノ酸配列Ile44-Gly45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 99) を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質、または
(iii) 野生型ストレプトアビジン (SEQ ID NO: 15)
の各々よりも高い結合親和性を有する、
ストレプトアビジン突然変異タンパク質を提供する。
(a) SEQ ID NO: 15に記載の野生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列を参照して、アミノ酸44〜53位の領域内に少なくとも2つのシステイン残基を含み、かつ
(b) アミノ酸配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 100) を含むペプチドリガンドに対して、
(i) アミノ酸配列Val44-Thr45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 98) を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質、または
(ii) アミノ酸44〜47位において、アミノ酸配列Ile44-Gly45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 99) を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質、または
(iii) 野生型ストレプトアビジン (SEQ ID NO: 15)
の各々よりも高い結合親和性を有する、
ストレプトアビジン突然変異タンパク質を提供する。
第2局面において、本発明は、
(a) SEQ ID NO: 15に記載の野生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列を参照して、アミノ酸115〜121位の領域内に少なくとも1つの変異を含み、かつ
(b) アミノ酸配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 100) を含むペプチドリガンドに対して、
(i) アミノ酸配列Val44-Thr45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 98) を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質、または
(ii) アミノ酸44〜47位において、アミノ酸配列Ile44-Gly45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 99) を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質、または
(iii) 野生型ストレプトアビジン (SEQ ID NO: 15)
の各々よりも高い結合親和性を有する、
ストレプトアビジン突然変異タンパク質を提供する。
(a) SEQ ID NO: 15に記載の野生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列を参照して、アミノ酸115〜121位の領域内に少なくとも1つの変異を含み、かつ
(b) アミノ酸配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 100) を含むペプチドリガンドに対して、
(i) アミノ酸配列Val44-Thr45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 98) を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質、または
(ii) アミノ酸44〜47位において、アミノ酸配列Ile44-Gly45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 99) を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質、または
(iii) 野生型ストレプトアビジン (SEQ ID NO: 15)
の各々よりも高い結合親和性を有する、
ストレプトアビジン突然変異タンパク質を提供する。
第3局面において、本発明は、第1または第2局面によるストレプトアビジン突然変異タンパク質をコードする配列を含む核酸分子を提供する。核酸は、有効な機能的環境中にこのような核酸分子の少なくとも1コピーを含むベクターであってよい。
第4局面において、本発明は、第3局面による核酸またはベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞を提供する。
本発明はまた、第1または第2局面によるストレプトアビジン突然変異タンパク質を生成する方法であって、
(a) ストレプトアビジン突然変異タンパク質をコードする核酸を含むベクターで適切な宿主細胞を形質転換する段階、
(b) ストレプトアビジン突然変異タンパク質の発現が起こる条件下で、該宿主細胞を培養する段階、
(c) 該突然変異タンパク質を単離する段階
を含む方法を提供する。
(a) ストレプトアビジン突然変異タンパク質をコードする核酸を含むベクターで適切な宿主細胞を形質転換する段階、
(b) ストレプトアビジン突然変異タンパク質の発現が起こる条件下で、該宿主細胞を培養する段階、
(c) 該突然変異タンパク質を単離する段階
を含む方法を提供する。
本発明はまた、a) 式Trp-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa (SEQ ID NO: 101) のペプチド配列、式中、Xaaは任意のアミノ酸を示し、YaaおよびZaaはいずれもGlyを示すか、またはYaaはGluを示しかつZaaはArgもしくはLysを示す、またはb) 少なくとも2つのストレプトアビジン結合モジュールの連続配置を含むペプチド配列、この場合、2つのモジュール間の距離は少なくとも0でかつ50アミノ酸以下であり、この場合、一方の結合モジュールは3〜8アミノ酸を有し、少なくとも配列-His-Pro-Baa-を含み、ここでBaaはグルタミン、アスパラギン、もしくはメチオニンであり、ならびにこの場合、他方の結合モジュールは、配列-Oaa-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa- (SEQ ID NO: 108) を有し、ここでOaaはTrp、Lys、もしくはArgであり、Xaaは任意のアミノ酸であり、YaaおよびZaaはいずれもGlyであるか、またはYaaはGluでありかつZaaはLysもしくはArgである、と融合されているタンパク質を単離する、精製する、または決定する方法であって、該タンパク質を含む試料を本明細書に記載されるストレプトアビジン突然変異タンパク質と、該ペプチド配列が該ストレプトアビジン突然変異タンパク質に結合するのに適した条件下で接触させる段階、および得られた複合体を該試料から分離する段階を含む方法を提供する。
本発明はまた、a) 式Trp-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa (SEQ ID NO: 101) のペプチド配列、式中、Xaaは任意のアミノ酸を示し、YaaおよびZaaはいずれもGlyを示すか、またはYaaはGluを示しかつZaaはArgもしくはLysを示す、またはb) 少なくとも2つのストレプトアビジン結合モジュールの連続配置を含むペプチド配列、この場合、2つのモジュール間の距離は少なくとも0でかつ50アミノ酸以下であり、この場合、一方の結合モジュールは3〜8アミノ酸を有し、少なくとも配列-His-Pro-Baa-を含み、ここでBaaはグルタミン、アスパラギン、もしくはメチオニンであり、ならびにこの場合、他方の結合モジュールは、配列-Oaa-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa- (SEQ ID NO: 108) を有し、ここでOaaはTrp、Lys、もしくはArgであり、Xaaは任意のアミノ酸であり、YaaおよびZaaはいずれもGlyであるか、またはYaaはGluでありかつZaaはLysもしくはArgである、と融合されているタンパク質を固定化する方法であって、該タンパク質を固定化するための条件下で、該タンパク質を、第1または第2局面によるストレプトアビジン突然変異タンパク質を保有する固相に接触させる段階を含む方法を提供する。
本発明はまた、ストレプトアビジンに結合し得る基を保有する物質を決定するまたは単離する方法であって、該物質を本明細書に記載されるストレプトアビジン突然変異タンパク質と、それに対する結合に適した条件下で接触させる段階、および該物質を決定するまたは単離する段階を含む方法を提供する。
本発明はまた、本明細書に記載されるストレプトアビジン突然変異タンパク質、ならびに従来の緩衝液、補助物質、および添加物からなる群より選択される少なくとも1つの試薬を含む試薬キットを提供する。本発明はまた、クロマトグラフィー樹脂、ELISAプレート、または表面プラズモン共鳴 (SPR) 測定用のチップなどの固体支持体上に固定化された、本明細書に記載されるストレプトアビジン突然変異タンパク質を提供する。
本発明のこれらの局面は、以下の説明、図面、および非限定的な実施例を考慮して、より十分に理解されるであろう。
詳細な説明
進化的な研究アプローチにおいて、ここで驚くべきことに、Strep-tag（登録商標）IIアフィニティーペプチド (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys) に対するストレプトアビジン突然変異タンパク質の結合親和性が様々な方法で顕著に増加し得ることが見出された。実験の第1セットでは、アミノ酸44〜53の領域内にジスルフィド架橋を導入することにより、突然変異タンパク質「1」(SEQ ID NO: 16) (44〜47=VTAR) および突然変異タンパク質「2」(SEQ ID NO: 17) (44〜47=IGAR) の、US 6,103,493によって開示された結合親和性と比較して、Strep-tag（登録商標）IIに対する結合親和性が顕著に増加したストレプトアビジン突然変異タンパク質を得ることができた。実験の第2セットでは、アミノ酸115〜121位の領域内の変異によって、Strep-tagIIに対する結合親和性を改善することができた。アミノ酸44〜53の領域においてどのストレプトアビジン突然変異タンパク質、すなわちUS 6,103,493によって開示された突然変異タンパク質「1」または本発明の最も好ましいジスルフィド含有突然変異タンパク質を出発点として用いたかにかかわらず、アミノ酸115〜121位の領域内の同様の変異／アミノ酸交換が観察され、それによって、アミノ酸115〜121位の領域内の変異によって見出される親和性増加がアミノ酸44〜53の配列に依存しないことが示される。このように、本発明のこれら2つの局面の各々によって、野生型ストレプトアビジン（wt-ストレプトアビジン）を含む任意のストレプトアビジン突然変異タンパク質のStrep-tag（登録商標）II結合親和性が改善される。
進化的な研究アプローチにおいて、ここで驚くべきことに、Strep-tag（登録商標）IIアフィニティーペプチド (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys) に対するストレプトアビジン突然変異タンパク質の結合親和性が様々な方法で顕著に増加し得ることが見出された。実験の第1セットでは、アミノ酸44〜53の領域内にジスルフィド架橋を導入することにより、突然変異タンパク質「1」(SEQ ID NO: 16) (44〜47=VTAR) および突然変異タンパク質「2」(SEQ ID NO: 17) (44〜47=IGAR) の、US 6,103,493によって開示された結合親和性と比較して、Strep-tag（登録商標）IIに対する結合親和性が顕著に増加したストレプトアビジン突然変異タンパク質を得ることができた。実験の第2セットでは、アミノ酸115〜121位の領域内の変異によって、Strep-tagIIに対する結合親和性を改善することができた。アミノ酸44〜53の領域においてどのストレプトアビジン突然変異タンパク質、すなわちUS 6,103,493によって開示された突然変異タンパク質「1」または本発明の最も好ましいジスルフィド含有突然変異タンパク質を出発点として用いたかにかかわらず、アミノ酸115〜121位の領域内の同様の変異／アミノ酸交換が観察され、それによって、アミノ酸115〜121位の領域内の変異によって見出される親和性増加がアミノ酸44〜53の配列に依存しないことが示される。このように、本発明のこれら2つの局面の各々によって、野生型ストレプトアビジン（wt-ストレプトアビジン）を含む任意のストレプトアビジン突然変異タンパク質のStrep-tag（登録商標）II結合親和性が改善される。
本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質は、アミノ酸115〜121位の領域の外側でwt-ストレプトアビジンのアミノ酸配列に相当し得る。一方、本発明によるアミノ酸配列はまた、アミノ酸115〜121の領域の外側でwt-ストレプトアビジン配列と異なってもよい。同様に、アミノ酸44〜53の領域内に2つのシステイン残基を含む本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質もまた、ストレプトアビジンの他の配列位置において変異を有し得る。ストレプトアビジン配列のこのような変種には、天然の変種および人工的に作製された変種が含まれ、改変は、アミノ酸残基の、US 6,103,493によって開示されたものを含む置換、ジスルフィド結合を含むもの、挿入、欠失、ならびにN末端または／およびC末端の欠失または付加として理解される。
本明細書で用いられる「より高い親和性」または「より高い結合親和性」という用語は、Strep-tag（登録商標）IIリガンドが、i) アミノ酸配列Val44-Thr45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 98) を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質、または (ii) アミノ酸44〜47位において、アミノ酸配列Ile44-Gly45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 99) を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質、または (iii) 野生型ストレプトアビジン (SEQ ID NO: 15) と形成する複合体の親和性と比較した、本発明によるストレプトアビジン突然変異タンパク質とStrep-tag（登録商標）II (WSHPQFEK) ペプチドリガンドから構成される複合体について測定された親和性を指す。しかしながら、本発明の突然変異タンパク質がまた、野生型 (wt) ストレプトアビジン、または米国特許第6,103,493号もしくは欧州特許第0 835 934号から公知であるストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」および「2」よりも、WRHPQFGG（Strep-tag（登録商標））またはSEQ ID NO: 103のDi-tag3などの他のストレプトアビジン結合ペプチドに対するより高い親和性を有する可能性もある。
「より高い親和性」または「より高い結合親和性」は、例えば、Sepharose（登録商標）に固定化された、比較されるべきストレプトアビジン変種（wtストレプトアビジン；米国特許第6,103,493号によるストレプトアビジン突然変異タンパク質、および本発明によるストレプトアビジン突然変異タンパク質）、および赤色タンパク質シトクロムb562とのC末端融合物としてのStrep-tag（登録商標）IIを用いて決定することができる。Sepharose（登録商標）上に固定化された様々なストレプトアビジン変種に対する該シトクロムb562‐Strep-tag（登録商標）II融合タンパク質の結合親和性は、クロマトグラフィー実験において視覚的に追跡することができ、この実験では、様々な固定化ストレプトアビジン突然変異タンパク質を有するカラムに、シトクロムb562‐Strep-tagII融合タンパク質を負荷し、その後カラムを洗浄する。大きな緩衝液容積でカラムを洗浄することにより、ストレプトアビジン（突然変異タンパク質）が固定化されているSepharoseカラムからのシトクロムb562‐Strep-tagII融合タンパク質の流出が誘導される。この効果は解離動力学よりも結合親和性により関連している、というのは、洗浄緩衝液の流速が中程度である限り、ストレプトアビジン突然変異タンパク質でコーティングされた樹脂が密に充填されたカラムマトリックス内では、効率的な再結合が可能であるからである。したがって、結合親和性がより低いと、洗浄緩衝液の適用容積に依存して、最大限に負荷されたアフィニティーカラムからタンパク質が失われるため、Strep-tag（登録商標）融合タンパク質を精製するカラムの能力は低下する。言い換えると、Strep-tag（登録商標）融合タンパク質と、カラムに固定化されたストレプトアビジン突然変異タンパク質との間の結合親和性がより高い場合に、能力減少効果はあまり明白でなくなる。このようなクロマトグラフィーベースのアッセイ形式において結合親和性を試験するためのさらなる方法は、比較的大量の、C末端Strep-tag（登録商標）IIを伴う希釈された着色シトクロムb562を、様々な固定化ストレプトアビジン突然変異タンパク質を有するカラムに適用し、カラム上のタグ化シトクロムb562の濃縮を決定することである。濃縮は、Strep-tag（登録商標）IIに対してより高い親和性を有するストレプトアビジン突然変異タンパク質を有するカラムにおいてより明白である。ある一定の流速‐比較においてはすべての場合において同様になるように制御されなければならない‐で、Strep-tag（登録商標）II融合タンパク質を、様々な固定化ストレプトアビジン突然変異タンパク質を有するカラムに適用することにより測定した場合、この様式で決定される結合親和性は、熱力学的平衡パラメータではなくむしろ動力学的パラメータを意味する会合速度定数および解離速度定数（konおよびkoff）などのパラメータによって規定される。実際にこのような流動ベースのアッセイでは、より速い結合動力学および解離動力学によって決定され、それによりカラム上でより速い平衡に達するまたは接近する、ある一定の親和性の相互作用は、匹敵する親和性であるが、より遅い動力学によって決定される相互作用に勝る。
結合親和性評価のためにこれらのクロマトグラフィーベースのシステムを使用することは、本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質の最も重要な実用的適用の1つであるアフィニティー精製に密接に匹敵する利点を有し、それによって、前述したように、性能は、全体的な親和性定数のみならず、根底にある動力学にも依存するという理由で、アフィニティークロマトグラフィーの実際の利点に転換され得ない有利な違いを示す測定法依存的な変動が回避される。アフィニティータグStrep-tag（登録商標）IIの融合パートナーとして、様々なストレプトアビジン突然変異タンパク質を選択するためのライブラリースクリーニング中に融合パートナーとして用いられた細菌アルカリホスファターゼとは関連のないシトクロムb562を使用することは、結合親和性評価に関するこれらのアッセイにおいて観察された違いが、ストレプトアビジン突然変異タンパク質とStrep-tag（登録商標）IIとの間の相互作用によるものであり、スクリーニング中に潜在的に選択されたかもしれない、ストレプトアビジン突然変異タンパク質と細菌アルカリホスファターゼとの間の非特異的相互作用によるものではないことを保証する。
結合親和性評価のためのさらなるアッセイ法は、マイクロタイタープレートのウェルに固定化された突然変異タンパク質を使用し、様々な濃度の、細菌アルカリホスファターゼのような酵素に融合されたStrep-tag（登録商標）IIを適用し、適用濃度に依存する複合体形成の程度を測定することによるELISAである。ストレプトアビジン突然変異タンパク質とStrep-tag（登録商標）IIペプチドとの間の結合親和性の解離定数 (KD)は、例えば、米国特許第6,103,493号の実施例5または本明細書における実施例10に記載されるように決定され得る。
結合親和性を決定するためのさらなる方法は、蛍光滴定（例えば、米国特許第6,103,493号の実施例6に記載される）、滴定カロリメトリー、またはBiaCore（商標）測定などの表面プラズモン共鳴 (SPR) 測定である。この様式で決定される結合親和性は、親和性定数 (KA) もしくは解離定数 (KD) などのパラメータによって、またはBiaCore（商標）などのSPR測定の場合には、親和性速度定数 (kon) もしくは解離速度定数（koff）などのパラメータによっても規定される。
非改変ストレプトアビジン（突然変異タンパク質）と比較した、アミノ酸115〜121位の領域内で本発明に従って改変された、および／またはアミノ酸44〜53位の領域内にジスルフィド架橋を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質によって得られる結合親和性の増加は、（結合親和性を決定するために用いられる方法とは無関係に）一般に少なくとも1.1倍、好ましくは少なくとも1.2倍、より好ましくは少なくとも1.5倍、より好ましくは少なくとも2倍、より好ましくは少なくとも3倍、より好ましくは少なくとも5倍、より好ましくは少なくとも10倍、およびさらにより好ましくは少なくとも20倍である。
本発明による好ましいストレプトアビジン突然変異タンパク質は、45位および52位のシステイン残基によって形成され、それによってこれらのアミノ酸45位と52位を結びつける少なくとも1つのジスルフィド架橋を含む。このような態様において、アミノ酸44は典型的にグリシンまたはアラニンであり、アミノ酸46は典型的にアラニンまたはより好ましくはグリシンであり、アミノ酸47は典型的にアルギニンである。
本発明による他の好ましいストレプトアビジン突然変異タンパク質は、アミノ酸117位、120位、および121位において少なくとも1つの変異を含み、ならびに／またはアミノ酸118および119の欠失、ならびに少なくともアミノ酸121位の置換を含む。
ループ中のアミノ酸の欠失は、許容されるのみならず、Strep-tag（登録商標）II結合親和性の改善にとってなお好ましい場合があることが、本発明から明らかであり、そのため、より高い結合親和性のために、本発明内で規定される位置における好ましい変化の外側で、付加的な欠失、置換、または付加を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質もまた、本発明の範囲内に入る。
したがって、本明細書で用いられる「変異」という用語はまた、アミノ酸残基の欠失も含む。この点において、しかしながら、ストレプトアビジンのアミノ酸114〜121のループ全体 (TTEANAWK) またはストレプトアビジンのアミノ酸115〜121のループ領域 (TEANAWK) が欠失されているストレプトアビジン突然変異タンパク質は本発明に包含されないことに留意されたい。むしろ、アミノ酸115〜121のセグメント内に1つまたは複数の変異を含む突然変異タンパク質では、少なくとも1つのアミノ酸が115〜121位の1つにおいて存在する。これらの態様のいくつかのにおいては、118位および/または119位のアミノ酸が欠失されつつ、117位、118位、119位、120位、および121位にアミノ酸が存在する。したがって、このような突然変異タンパク質において、配列位置115〜121によって形成されるセグメントは、1アミノ酸または2アミノ酸だけ短縮される。アミノ酸115〜121のセグメント全体が欠失される突然変異タンパク質が本発明に包含されないという上記開示と一致して、Fletcher et al, Journal of Biotechnology 2003に記載されるストレプトアビジンの突然変異タンパク質も本発明によって包含されない。このことは、以下のストレプトアビジン突然変異タンパク質が排除されることを意味する：1. 配列位置114〜121における野生型アミノ酸残基
が欠失されている突然変異タンパク質。この突然変異タンパク質は、Fletcher et alにおいてSAPVと命名されている。2. 欠失された9アミノ酸残基Thr-Thr-Glu-Asp-Asn-Ala-Trp-Lysがアミノ酸配列
によって置換されている、Fletcher et alにおいてSAPV-Alb5およびSAPV-84と命名された2つの突然変異タンパク質。
本発明による好ましいストレプトアビジン突然変異タンパク質は、N末端または／およびC末端において短縮されているストレプトアビジン変種に由来する。最新技術から公知である、N末端およびC末端で短縮されている最小ストレプトアビジンが、特に好ましい。本発明による好ましいポリペプチドは、変異誘発領域の外側で、N末端側がアミノ酸10〜16位の領域内で始まり、かつC末端側がアミノ酸133〜142位の領域内で終結する最小ストレプトアビジンのアミノ酸配列を含む。特に好ましいポリペプチドは、変異領域の外側で、Ala13位〜Ser139位のアミノ酸配列を含み、任意にAla13の代わりにN末端メチオニン残基を有する最小ストレプトアビジンに相当する。本出願において、アミノ酸位置の番号付けは、全体を通してwt-ストレプトアビジンの番号付け（Argarana et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986), 1871-1882、図3もまた参照されたい）を指す。
特に好ましい、本発明による、アミノ酸115〜121位の領域内に1つまたは複数の変異を保有するストレプトアビジン突然変異タンパク質は、異なるサブクラスにおいて特徴づけられる。
第1に、117位、120位、および121位に見出されるアミノ酸は、118位および119位における2つのアミノ酸の欠失の存在または非存在に応じて、別個に考慮されなければならない。これら2つの異なるケースにおいて117位、120位、および121位に見出され、したがって各ケースにおいて親和性の改善に寄与し得るアミノ酸を、図2Aに要約する。
欠失を伴わない突然変異タンパク質は、以下のように特徴づけられ得る：それらは、i) 120位における、SerもしくはAla、または最も好ましくはGlyのような小さい残基と組み合わせて、次にこれを121位における疎水性残基、最も好ましくはTrp、Tyr、もしくはPheのようなかさ高い疎水性残基と組み合わせて、またはii) Leu、Ile、Met、もしくはVal、またはより好ましくはTyrもしくはPheである、120位の疎水性残基と組み合わせて、次にこれを121位における、Gly、Ala、もしくはSerのような小さい残基、またはGln、またはLeu、Val、lle、Trp、Tyr、Phe、もしくはMetのような疎水性残基と組み合わせて、117位に、最も好ましくは、Trp、Tyr、もしくはPheのような大きな疎水性残基、またはGlu、Asp、もしくはArgのような荷電残基、またはAsnもしくはGlnのような親水性残基を保有し、またはそれほどは好ましくなく、疎水性残基Leu、Met、もしくはAla、または極性残基Thr、Ser、もしくはHisを保有する。
アミノ酸118位および119位が欠失されている突然変異タンパク質は、以下のように特徴づけられ得る：117位は任意のアミノ酸であってよく、Phe、Tyr、またはTrpのようなかさ高い疎水性残基はそれほどは好ましくなく、次に120位は最も好ましくはTrpであり、それほどは好ましくなくValであり、121位はやはり疎水性アミノ酸、最も好ましくはMet、Leu、Tyr、もしくはPheであるか、または121位は小さい親水性残基、最も好ましくはSerもしくはThrであるか、または121位はArgである。ランダム化された位置と組み合わせて同定された特定の突然変異タンパク質配列、およびフィルターサンドイッチスクリーニングアッセイにおいて得られたシグナル強度の適格性の概要を、表1〜7に示す。
いくつかの態様において、本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質は、野生型配列の配列117〜121において117位、120位、および121位の第1配列モチーフを有し、これは最も重要な特徴として配列位置120においてGly残基 (Gly120) を含む。このようなモチーフは、配列位置121において、好ましくはPheもしくはTyr残基、またはそれほどは好ましくなくMet残基を保有し、配列位置117においてGlu、Asp、Arg、His、Leu、Met、Asn、Gln、Thr、またはSer残基を保有し、したがってこのモチーフにおいて117位はより可変的である。このような突然変異タンパク質は、配列位置118および119において、野生型ストレプトアビジンアミノ酸Asn118および／またはAla119を有し得る（実験の項を参照されたく、ここではスクリーニング実験のためにAsn118もAla119も変異誘発に供されず、一定に保たれた、図2Bもまた参照されたい）。しかしながら、Asn118およびAla119が別のアミノ酸残基によって置換されることもまた、本発明の範囲内に入る。この変異は、保存的置換（Asn118の例えばGlnもしくはAspによる置換、またはAla119の例えばSer、Val、もしくはIleによる置換）、または非保存的置換（Asn118の例えば正荷電または疎水性アミノ酸残基による置換）のいずれかであってよい。このモチーフ1はしたがって、以下のコンセンサス配列1を特徴とし得る：Xaa117Gly120Yaa121、ここでXaaは任意のアミノ酸であってよく、かつYaaはPheまたはTyrまたはMetであってよい。
117〜121位の第2配列モチーフにおいて、本明細書において開示されるストレプトアビジン突然変異タンパク質は、配列位置120において疎水性または芳香族アミノ酸残基を含む。配列位置120におけるこの疎水性または芳香族アミノ酸は、好ましくはTyr、Phe、Leu、Ile、またはMetである。この第2配列モチーフにおいて、疎水性または芳香族アミノ酸はまた、配列位置121において存在し得る（120位とは独立して選択される）。121位の好ましい残基はLeu、Ile、およびMetであり、それほどは好ましくないのはGly、Gln、Trp、Ser、Ala、またはValである。加えて、このような突然変異タンパク質はまた、配列位置120および121とは独立して、配列位置117において変異を有し得る。配列位置117における好ましい変異はTyrまたはPheであり、それほどは好ましくないのはArg、Trp、またはGln残基である。またこの第2配列モチーフのこのような突然変異タンパク質は、配列位置118および119において、野生型ストレプトアビジンアミノ酸Asn118および／もしくはAla119、または変異残基のいずれかを有し得る。このモチーフ2はしたがって、以下のコンセンサス配列2を特徴とし得る：Aaa117Baa120Caa121、ここでAaaはTyr、Phe、Arg、Trp、またはGlnであってよく、BaaはTyr、Phe、Leu、Ile、またはMetであってよく、かつCaaは任意のアミノ酸であってよい。
配列位置117〜121において変異を有する、本明細書において開示されるストレプトアビジン突然変異タンパク質の第3配列モチーフにおいて、配列位置118および119における残基は欠失される。この状況において、配列位置117では、His、Glu、Gln、Thr、Arg、Asn、Lys、Ser、Ala、またはIle残基が好ましく、配列位置120において、非常に好ましいアミノ酸はTrp残基あり、またはそれほどは好ましくないのはVal残基であり、配列121では、Tyr、Leu、Met、Thr、Ser、Phe、またはArg残基が好ましい。このモチーフ3はしたがって、以下のコンセンサス配列3を特徴とし得る：Daa117Eaa118Faa119Gaa120Haa121、ここでDaaおよびHaaは任意のアミノ酸であってよく、EaaおよびFaaはいずれも欠失され、かつGaaはTrpまたはValであってよい。
表3〜7において見られ得るように、コンセンサス配列1〜3の1つに含まれない、親和性が改善されたストレプトアビジン突然変異タンパク質もまた見出され、そのためコンセンサス配列1〜3は限定的と見なされ得ない。
表1〜7によって開示されるように、本発明の例証的ストレプトアビジン突然変異タンパク質は、野生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列の配列位置44〜53および／または配列位置117〜121において、SEQ ID NO: 18〜97のいずれかの配列の1つを有する。これらのストレプトアビジン突然変異タンパク質は、他の配列位置のいずれかにおいて、野生型ストレプトアビジン配列、または任意の公知のストレプトアビジン突然変異タンパク質の配列、例えばアミノ酸44〜47位にアミノ酸配列Val44-Thr45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 98) もしくはIle44-Gly45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 99) を含む公知の突然変異タンパク質「1」もしくは「2」の配列のいずれかを含み得る。
本発明のいくつかの態様において、突然変異タンパク質は、配列位置117〜121において、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、またはSEQ ID NO: 65のアミノ酸配列を含み、任意の他の位置において、野生型ストレプトアビジン配列、突然変異タンパク質「1」または突然変異タンパク質「2」の配列のいずれかを含む。
他の例証的態様において、本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質は、図4に示される以下の突然変異タンパク質のいずれかの配列を含み得る、またはそのような配列からなり得る：m400、m402、m4001、突然変異タンパク質「1」-m36、突然変異タンパク質「1」-m23、突然変異タンパク質「1」-m41、突然変異タンパク質「1」-m4、突然変異タンパク質「1」-m12、突然変異タンパク質「1」-m22、突然変異タンパク質「1」-m31、突然変異タンパク質「1」-m32、突然変異タンパク質「1」-m35、突然変異タンパク質「1」-m38、突然変異タンパク質「1」-m40、突然変異タンパク質「1」-m42、突然変異タンパク質「1」-m45、突然変異タンパク質「1」-m46、突然変異タンパク質「1」-m47、突然変異タンパク質「1」-m7、突然変異タンパク質「1」-m10、突然変異タンパク質「1」-m17、突然変異タンパク質「1」-m21、突然変異タンパク質「1」-m24、突然変異タンパク質「1」-m27、突然変異タンパク質「1」-m28、突然変異タンパク質「1」-m30、突然変異タンパク質「1」-m33、突然変異タンパク質「1」-m1、突然変異タンパク質「1」-m3、突然変異タンパク質「1」-m8、突然変異タンパク質「1」-m15、突然変異タンパク質「1」-m6、突然変異タンパク質「1」-m9、突然変異タンパク質「1」-m20、突然変異タンパク質「1」-m34、突然変異タンパク質「1」-m14、突然変異タンパク質「1」-m18、突然変異タンパク質「1」-m19、m4001-m8、m4001-m21、m4001-m9、m4001-m1、m4001-m2、m4001-m3、m4001-m5、m4001-m13、m4001-m14、m4001-m24、m4001-m4、m4001-m6、m4001-m7、m4001-m10、m4001-m15、m4001-m23、m4001-m17、m4001-m12、m4001-m20、突然変異タンパク質「1」-m101、突然変異タンパク質「1」-m106、突然変異タンパク質「1」-m111、突然変異タンパク質「1」-m100、突然変異タンパク質「1」-m110、突然変異タンパク質「1」-m104、突然変異タンパク質「1」-m108、突然変異タンパク質「1」-m207、突然変異タンパク質「1」-m212、突然変異タンパク質「1」-m202、突然変異タンパク質「1」-m204、突然変異タンパク質「1」-m206、突然変異タンパク質「1」-m208、突然変異タンパク質「1」-m203、突然変異タンパク質「1」-m209、突然変異タンパク質「1」-m200、突然変異タンパク質「1」-m201、突然変異タンパク質「1」-m211、突然変異タンパク質「1」-m300、突然変異タンパク質「1」-m301、突然変異タンパク質「1」-m302、突然変異タンパク質「1」-m303、突然変異タンパク質「1」-m304、およびm1-9。
本発明の突然変異タンパク質の実用的使用のために（例えば、アフィニティークロマトグラフィーのために）、ストレプトアビジン結合ペプチドよりも結合親和性がより高いことにより、または／およびより高い濃度で存在することにより、本発明によるストレプトアビジン突然変異タンパク質からストレプトアビジン結合ペプチド（例えば、本明細書に記載されるStrep-tag（登録商標）(II) ペプチドまたはDi-tagペプチド）の結合を脱離させ得るリガンドを使用することが望ましいと考えられる。通常、このリガンドは、Strep-tag（登録商標）ペプチドの競合物として働く。この（競合的）リガンドは通常、遊離型で存在し、これは任意のタンパク質または他の分子に融合されていないことを意味する。このようにして、結合しているストレプトアビジン結合ペプチドリガンド、またはStrep-tag（登録商標）(II) ペプチドもしくはDi-tagペプチドなどのストレプトアビジン結合ペプチドが融合されているタンパク質を、非常に穏和な溶出条件下で放出させることが可能である（一般的に競合溶出による）。これは、例えば、ストレプトアビジン突然変異タンパク質アフィニティーカラムから結合している融合タンパク質を溶出させるのに、または本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質（多量体）の骨格を介して多量体化されている、ストレプトアビジン結合ペプチドを保有する多量体低親和性融合タンパク質の結合を逆転させるのに重要である。したがって、この局面において、本発明は、ペプチドリガンドに対するその結合親和性が、それらが、例えばビオチン、イミノビオチン、リポ酸、チオビオチン、デスチオビオチン、ジアミノビオチン、HABA（ヒドロキシアゾベンゼン‐安息香酸）、または／およびジメチル-HABAのような他のストレプトアビジンリガンドによって競合的に溶出され得るようなものである、ストレプトアビジン突然変異タンパク質に関する。HABAまたはジメチル-HABAなどの着色物質の使用は、カラムからの溶出を視覚的に確認することができるという利点を有し得る。しかしながら、これとは関係なく、ペプチドリガンドに対する、特にStrep-tag（登録商標）IIに対する本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質の結合親和性は、上記で定義されたように、根底にあるwt-ストレプトアビジンのものよりも、またはUS 6,103,493によって開示された突然変異タンパク質「m1」もしくは「m2」ものよりも高い。したがって、いくつかの態様においては、チオビオチンまたはビオチンのようなより高い親和性のリガンドが、鋭敏な溶出のために好ましい。あるいは、例えば本明細書に記載されるような、ビオチン結合ポケットに結合する単離されたペプチドリガンドを、競合溶出に使用することもできる。完全を期すために、本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質へのストレプトアビジン結合ペプチド（通常は関心対象のタンパク質に融合されているか、または複合化されている）の相互作用／結合は、競合溶出によって、またこの非共有結合複合体を破壊することができる任意の他の手段によって、必ずしも破壊され得ないことに留意されたい。例えば、そのような融合タンパク質が、表面プラズモン共鳴チップ、ELISAプレート、またはさらにはクロマトグラフィー樹脂などの、本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質でコーティングされている表面上に固定化される場合、その結合は、例えばNaOHなどの塩基の添加によるpHの変化によって破壊され得る（実施例13および14を参照されたい）。このようなアプローチは、表面プラズモン共鳴チップまたはクロマトグラフィー樹脂の再生に実に好ましい場合がある。
ある種の検出方法にとっては、本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質を標識型で使用することが好ましい場合がある。したがって、本発明のさらなる主題は、少なくとも1つの標識を保有することを特徴とする、本発明によるポリペプチドである。適切な標識基は当業者に公知であり、通常の放射標識、蛍光標識、発光標識、および発色団標識、ならびに化学反応または酵素反応において決定され得る物質を生じる物質および酵素を含む。これに関連して、wt-ストレプトアビジンについて公知である標識もすべて、本発明によるストレプトアビジン突然変異タンパク質に結合させることができる。
本発明のさらなる局面は、本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質をコードする配列を含む核酸に関する。このような核酸は任意に、シグナルペプチドをコードする配列に機能的に連結され、特定の態様においては、シグナルペプチドをコードする配列はOmpAシグナルペプチドの配列である。その上、他のシグナルペプチドを使用することも可能であり、これは特に使用される発現系または宿主細胞に応じて実に好ましい場合がある。多くのこのようなシグナルペプチドが最新技術において公知であり、本明細書では詳細に解明しない。しかしながら、細胞質発現、すなわちシグナル配列の代わりに開始メチオニンを使用するものが好ましい（Schmidt & Skerra, J. Chromatogr. A 676 (1994), 337-345を参照されたい）。
本発明のさらなる局面は、有効な機能的環境中に前述の核酸分子の少なくとも1コピーを含むベクターに関する。有効な機能的環境とは、発現、すなわちmRNAの転写または／およびその後のプロセシングを可能にする、支持する、促進する、または／および増加させるエレメントとして理解される。このようなエレメントの例は、プロモーター、エンハンサー、転写開始部位および終結部位、翻訳開始部位、ポリA部位等である。
ベクターは意図される発現系に応じて選択され、このために、単一コピープラスミド、多コピープラスミド、および宿主ゲノム中への核酸の組込みを促進する媒体が考慮される。多くのこのようなベクターが最新技術から公知であり、本明細書では詳細に説明しない。それらは任意に、耐性、選択マーカー、または／および例えば核酸の増幅もしくは発現の誘導を可能にするエレメントなどの、ベクターに用いられる標準的なエレメントを含む。
本発明のさらなる局面は、本発明によるストレプトアビジン突然変異タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも1コピーを挿入物として保有するベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞に関する。細胞の選択は特に重要ではなく、一般に、このような目的に適している任意の細胞を使用することが可能である。原核細胞ならびに真核細胞および酵母が考慮される。実用的な理由で、この場合のように非グリコシル化タンパク質の発現のためには、原核細胞が一般に好ましく、特に大腸菌 (E. coli) が好ましい。
本発明のなおさらなる局面は、以下の段階を特徴とする、本発明によるストレプトアビジン突然変異タンパク質を生成するための工程に関する：
(a) ストレプトアビジン突然変異タンパク質をコードする核酸を含むベクターで適切な宿主細胞を形質転換する段階、
(b) ストレプトアビジン突然変異タンパク質の発現が起こる条件下で、該宿主細胞を培養する段階、
(c) 該ポリペプチドを単離する段階。
(a) ストレプトアビジン突然変異タンパク質をコードする核酸を含むベクターで適切な宿主細胞を形質転換する段階、
(b) ストレプトアビジン突然変異タンパク質の発現が起こる条件下で、該宿主細胞を培養する段階、
(c) 該ポリペプチドを単離する段階。
生成工程に関して、本発明によるストレプトアビジン突然変異タンパク質は、内因性ビオチンに結合するそれらの能力に起因して、毒性効果を有し得る。したがって、宿主細胞を培養する場合には、生じる発現産物が、使用される宿主細胞の内部から、例えば適切なシグナル配列によってペリプラズム中もしくは培養液中に運搬されるか、またはそれが不溶性封入体の形態で細胞の内部で凝集するように、条件が選択されるべきである。前者の場合では、本発明によるストレプトアビジン突然変異タンパク質は、ペリプラズム細胞画分または細胞上清から単離され得るのに対して、後者の場合では、本発明による工程の段階 (c) は、宿主細胞の溶解、封入体形態のストレプトアビジン突然変異タンパク質の単離、およびストレプトアビジン突然変異タンパク質の再生を含む。この場合、宿主細胞として大腸菌が好ましい。
本発明によるストレプトアビジン突然変異タンパク質またはストレプトアビジン突然変異タンパク質／ペプチドリガンドシステムの実用的適用は本質的に、従来のストレプトアビジン／ビオチンシステムまたはストレプトアビジン／ペプチドリガンドシステムと同様である。特に、天然ストレプトアビジンもしくはUS 6,103,493によって開示された突然変異タンパク質とペプチドリガンドとの間の結合強度よりも高い結合強度が望ましい場合、または関心対象の基質をビオチン化することが不可能であるか、もしくはペプチドリガンドへの対応する結合よりも容易でない場合に、特に利点が存在する。
従来のストレプトアビジン／ビオチンシステムに勝る、またはUS 6,103,493によって開示されたシステムに勝る利点は、特に、アフィニティークロマトグラフィー、および組換えタンパク質の精製、単離、または決定方法に適用される。したがって本発明はまた、a) 式Trp-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaaのペプチド配列、式中、Xaaは任意のアミノ酸を示し、YaaおよびZaaはいずれもGlyを示すか、またはYaaはGluを示しかつZaaはArgもしくはLysを示す、またはb) 少なくとも2つのストレプトアビジン結合モジュールの連続配置を含むペプチド配列、この場合、2つのモジュール間の距離は少なくとも0でかつ50アミノ酸以下であり、この場合、一方の結合モジュールは3〜8アミノ酸を有し、少なくとも配列-His-Pro-Baa-を含み、ここでBaaはグルタミン、アスパラギン、もしくはメチオニンであり、ならびにこの場合、他方の結合モジュールは、配列-Oaa-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa- (SEQ ID NO: 108) を有し、ここでOaaはTrp、Lys、もしくはArgであり、Xaaは任意のアミノ酸であり、YaaおよびZaaはいずれもGlyであるか、またはYaaはGluでありかつZaaはLysもしくはArgである、と融合されているタンパク質を単離する、精製する、検出する、または固定化するための方法における、本発明によるストレプトアビジン突然変異タンパク質の使用に関する。そのような少なくとも2つのストレプトアビジン結合モジュールの連続配置を伴うアフィニティーペプチドは、国際特許出願第WO02/077018号または米国特許第7,981,632号から公知である。単離、精製、または検出のこの方法においては、該ペプチド配列がストレプトアビジン突然変異タンパク質に結合するのに適した条件下で、単離または精製されるタンパク質を含む液体を、任意に固定化されたストレプトアビジン突然変異タンパク質と接触させ、得られた複合体を該液体から分離し、該タンパク質を該複合体から放出させるかまたは検出する。いくつかの態様において、ペプチド配列は好ましくはStrep-tag（登録商標）IIである。他の態様において、ペプチド配列は好ましくは、国際特許出願第WO02/077018号もしくは米国特許第7,981,632号において記載されるdi-tag3配列
、di-tag2配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 109)、または配列
である。ペプチド配列は好ましくは、タンパク質のN末端または／およびC末端に融合される。ストレプトアビジン突然変異タンパク質は、固相に結合していてよく、またはそれに結合することができる。
単離または精製方法において本発明によるストレプトアビジン突然変異タンパク質／ペプチドリガンドシステムを使用する利点は、非常に穏和な条件を用いて、該ペプチドリガンドを保有する融合タンパク質を溶出させることができる点である。したがって、複合体から融合タンパク質を再度放出させるために、融合タンパク質が吸着している、例えばアフィニティークロマトグラフィーカラムなどのストレプトアビジン突然変異タンパク質結合固相を、ビオチンおよびその誘導体より選択される適切な濃度のリガンドと共にインキュベートすることが可能である。これに関連して、ビオチンの使用が特に有益であることが判明した。
本発明によるストレプトアビジン突然変異タンパク質は、従来のストレプトアビジンについて公知である対応する方法と本質的に同様の様式で、検出方法において使用することができる。さらなる適用は、a) 式Trp-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaaのペプチド配列、式中、Xaaは任意のアミノ酸を示し、YaaおよびZaaはいずれもGlyを示すか、またはYaaはGluを示しかつZaaはArgもしくはLysを示す、またはb) 少なくとも2つのストレプトアビジン結合モジュールの連続配置を含むペプチド配列、この場合、2つのモジュール間の距離は少なくとも0でかつ50アミノ酸以下であり、この場合、一方の結合モジュールは3〜8アミノ酸を有し、少なくとも配列-His-Pro-Baa-を含み、ここでBaaはグルタミン、アスパラギン、もしくはメチオニンであり、ならびにこの場合、他方の結合モジュールは、配列-Oaa-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa- (SEQ ID NO: 108) を有し、ここでOaaはTrp、Lys、もしくはArgであり、Xaaは任意のアミノ酸であり、YaaおよびZaaはいずれもGlyであるか、またはYaaはGluでありかつZaaはLysもしくはArgである、と融合されているタンパク質の定性的または定量的決定である。この方法では、該ペプチド配列をストレプトアビジン突然変異タンパク質に結合させるために、決定されるべきタンパク質を適切な条件下で標識ストレプトアビジン突然変異タンパク質と接触させ、洗浄し、標識を決定する。このような決定方法は、例えば、ウェスタンブロットにおいてタンパク質を検出するために定性的に、またはELISAのように定量的に実施することができる。適切な標識は、いずれも公知である放射標識基および非放射標識基、例えば、発光基、酵素、金属、金属錯体等である。ストレプトアビジンは、例えば共有結合によって直接標識され得る。しかしながら、標識抗ストレプトアビジン抗体またはビオチン化酵素等などの間接的標識もまた使用され得る。
従来のストレプトアビジン／ビオチンシステムに勝る、またはUS 6,103,493によって開示されたシステムに勝る利点はまた、特に、アフィニティークロマトグラフィー、および細胞、好ましくは哺乳動物細胞の精製、単離、または決定方法に適用される。この状況における好ましい使用は、式Trp-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaaのペプチド配列、式中、Xaaは任意のアミノ酸を示し、YaaおよびZaaはいずれもGlyを示すか、またはYaaはGluを示しかつZaaはArgもしくはLysを示す、に融合されている、特定の細胞表面受容体に対する低親和性リガンド（例えば、これらに限定されないがFab断片またはMHC I分子を含む）を多量体化するためのその使用である。この使用は、US 6,103,493において開示されたストレプトアビジン突然変異タンパク質について、米国特許第7,776,562号または第8,298,782号においてさらに記載されている。細胞のこの多量体化／可逆的染色または単離には、di-tag3配列
、または国際特許出願第WO02/077018号もしくは米国特許第7,981,632号において記載されているような任意の他の配列などの、連続配置されたストレプトアビジン結合モジュールに融合されているアフィニティーリガンドを、本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質と共に使用することもまた可能である。本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質のより高い親和性は、安定性および適応性が改善された多量体試薬を提供する。このような細胞精製適用において有用であるためには、本発明の突然変異タンパク質は、好ましくは多量体化され、任意に蛍光色素で直接標識されるか、または磁気ビーズもしくは任意の他の固体支持体上に固定化される。細胞精製に関して、磁気ビーズはマイクロビーズまたはナノビーズであってよく、他の固体支持体は、カラム精製アプローチを遂行するためにカラムクロマトグラフィーにおいて使用される樹脂であってよい。
本発明のさらなる有益な局面は、a) ペプチド配列Trp-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa、ここでXaaは任意のアミノ酸を示し、YaaおよびZaaはいずれもGlyを示すか、またはYaaはGluを示しかつZaaはArgもしくはLysを示す、またはb) 少なくとも2つのストレプトアビジン結合モジュールの連続配置を含むペプチド配列、この場合、2つのモジュール間の距離は少なくとも0でかつ50アミノ酸以下であり、この場合、一方の結合モジュールは3〜8アミノ酸を有し、少なくとも配列-His-Pro-Baa-を含み、ここでBaaはグルタミン、アスパラギン、もしくはメチオニンであり、ならびにこの場合、他方の結合モジュールは、配列-Oaa-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa- (SEQ ID NO: 108) を有し、ここでOaaはTrp、Lys、もしくはArgであり、Xaaは任意のアミノ酸であり、YaaおよびZaaはいずれもGlyであるか、またはYaaはGluでありかつZaaはLysもしくはArgである、と融合されているタンパク質を固定化するための、本発明によるストレプトアビジン突然変異タンパク質の使用である。1つの態様において、ペプチド配列は、配列
である。別の態様において、ペプチド配列は、配列
である。この固定化は好ましくは、マイクロタイタープレート、ビーズ（例えば、アガロース、または例えばポリメタクリル酸のような他のポリマーでできている）、有機材料もしくは常磁性材料でできたマイクロビーズ、有機材料もしくは常磁性材料でできたナノビーズ、またはBiacore（商標）チップなどのセンサーチップ、または例えば側方流動アッセイのために、もしくはタンパク質アレイを作製するために用いられるような他の支持体などの、本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質でコーティングされた固相上で実施される。
加えて、従来のストレプトアビジン／ビオチン（誘導体）システムにおいて本発明によるストレプトアビジン突然変異タンパク質を使用することも、当然ながら可能である。言い換えると、これは、ストレプトアビジンに結合し得る基を保有する物質を決定または単離するための、本発明によるストレプトアビジン突然変異タンパク質の使用を意味する。wt-ストレプトアビジンの一部のみが本発明によるストレプトアビジン突然変異タンパク質によって置換される場合、特定の効果は、混合四量体の形成を介してこれに関連して達成され得る。
本発明のなおさらなる局面はまた、本発明によるストレプトアビジン突然変異タンパク質、ならびに任意に標準的な緩衝液および補助物質および添加物を含む、試薬キットに関する。このような試薬キットは、上記の単離、精製、アッセイ、または決定方法の1つにおいて用いられることが特に意図される。しかしながら、本キットはまた、従来のストレプトアビジン／ビオチンシステムが用いられる他の方法、例えば核酸ハイブリダイゼーションアッセイまたは免疫測定法にも適している。本試薬キットは、遊離の非修飾タンパク質として、または／および固相結合型で、または／および標識型で、本発明によるストレプトアビジン突然変異タンパク質を含み得る。
本発明を、以下の表、図面、および実施例によってさらに例証する。
表の簡単な説明
表1〜7は、それぞれ異なるライブラリー1〜7のスクリーニングに由来する様々なストレプトアビジン突然変異タンパク質配列の概要を示すものであり、フィルターサンドイッチアッセイにおいてその様々なストレプトアビジン突然変異タンパク質から得られた相対シグナル強度も含めてある。ランダム化された位置はXaaで示される。比較のために、対応する位置における、wtストレプトアビジンおよびUS 6,103,493のストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」のアミノ酸配列を示してある（ライブラリー4の結果を示す表4は除くが、ここでは、これらの突然変異タンパク質は本発明のm4001に由来し、US 6,103,493の突然変異タンパク質「1」に由来するものではないという理由で、同じ配列がm4001のものと表示されている）。したがって、表3および5〜7に示される突然変異タンパク質はすべて、US 6,103,496の突然変異タンパク質「1」に由来し、したがってアミノ酸44〜53位の領域に関してこれと同一である。表4の突然変異タンパク質は、本発明の突然変異タンパク質m4001に由来し、したがってアミノ酸44〜53位の領域に関してこれと同一である。
表1〜7は、それぞれ異なるライブラリー1〜7のスクリーニングに由来する様々なストレプトアビジン突然変異タンパク質配列の概要を示すものであり、フィルターサンドイッチアッセイにおいてその様々なストレプトアビジン突然変異タンパク質から得られた相対シグナル強度も含めてある。ランダム化された位置はXaaで示される。比較のために、対応する位置における、wtストレプトアビジンおよびUS 6,103,493のストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」のアミノ酸配列を示してある（ライブラリー4の結果を示す表4は除くが、ここでは、これらの突然変異タンパク質は本発明のm4001に由来し、US 6,103,493の突然変異タンパク質「1」に由来するものではないという理由で、同じ配列がm4001のものと表示されている）。したがって、表3および5〜7に示される突然変異タンパク質はすべて、US 6,103,496の突然変異タンパク質「1」に由来し、したがってアミノ酸44〜53位の領域に関してこれと同一である。表4の突然変異タンパク質は、本発明の突然変異タンパク質m4001に由来し、したがってアミノ酸44〜53位の領域に関してこれと同一である。
表8は、上部に、米国特許第6,103,493号の突然変異タンパク質「1」、ならびにアミノ酸44〜53位の領域においてのみ変異した本発明のm402および4001と比較した、細菌アルカリホスファターゼに融合されたStrep-tag（登録商標）II (BAP-StrepII) と、いずれもアミノ酸44〜53位に関して米国特許第6,103,493号の突然変異タンパク質「1」に由来する（および表4に示される本発明のジスルフィド含有突然変異タンパク質m4001に由来するものではない）、アミノ酸117〜121の領域において変異したものである本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質の選択物との間の複合体について、実施例10に記載されるELISAによって決定された結合親和性結果を示す。灰色で強調された表8の下部には、上部に示されるm4001、m4、およびm23と比較して、突然変異タンパク質m1-9について、同じプロトコールを用いて異なるELISA実験によって決定された結合親和性結果が示される。絶対的親和性結果は、上部に示される実験において同じストレプトアビジン突然変異タンパク質について得られた結果よりもわずかに低い親和性データを示す。これはそれにもかかわらず、細菌アルカリホスファターゼに融合された場合のStrep-tag（登録商標）II (BAP-StrepII) に対する結合を特徴づけるこのELISAアッセイにおいて、m1-9の親和性もまた突然変異タンパク質「1」よりも改善されることを実証する。
表9は、US 6,103,493の突然変異タンパク質「1」、アミノ酸44〜53位の領域においてのみ変異した本発明のm402および4001、ならびにwtストレプトアビジンと比較した、いずれもアミノ酸44〜53位に関してUS 6,103,493の突然変異タンパク質「1」に由来する（および本発明のジスルフィド含有突然変異タンパク質m4001に由来するものではない）、アミノ酸117〜121の領域において変異したものである本発明の様々な固定化ストレプトアビジン突然変異タンパク質を有するSepharoseカラム上での過剰負荷およびその後の規定洗浄後の、C末端にStrep-tagIIが融合しているシトクロムb562の保持について、アフィニティークロマトグラフィー実験によって決定された結合親和性結果を示す。
表10は、US 6,103,493の突然変異タンパク質「1」、アミノ酸44〜53位の領域においてのみ変異した本発明のm402および4001、ならびにwtストレプトアビジンと比較した、いずれもアミノ酸44〜53位に関してUS 6,103,493の突然変異タンパク質「1」に由来する（および本発明のジスルフィド含有突然変異タンパク質m4001に由来するものではない）、アミノ酸117〜121の領域において変異したものである本発明の様々な固定化ストレプトアビジン突然変異タンパク質を有するSepharoseカラム上での、C末端にStrep-tagIIが融合しているシトクロムb562の希薄溶液からの捕捉について、アフィニティークロマトグラフィー実験によって決定された結合親和性結果を示す。
表11は、ストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」（この公知のストレプトアビジン突然変異タンパク質は、図4の上部、2行目（第2列）に示される配列を有する）および突然変異タンパク質m1-9に関する、BiaCore（商標）による動力学的親和性測定の結果を示す。突然変異タンパク質m1-9は、図4中に最後の突然変異タンパク質として示されており、それぞれ117位、120位、121位にアミノ酸Glu、Gly、Tyrを有し、その他の点では突然変異タンパク質「1」（第2列）の配列を有するストレプトアビジン突然変異タンパク質である。BiaCore（商標）測定のため、BiaCore（商標）S-CM5センサーチップ上のカルボキシル基を、標準的なEDC/NHS化学で活性化し、突然変異タンパク質「1」または突然変異タンパク質m1-9を、緩衝液として10 mM酢酸 pH 5.0を用いて、2つの異なる密度でアミノ基を介して結合させた。得られた相対固定化量を、RU（任意単位）で示す（第3列）。低密度の固定化を達成するため、両方の突然変異タンパク質を1μg/mlの濃度および10μl／分で適用した。高密度で固定化を達成するため、突然変異タンパク質m1-9は20μg/mlの濃度で使用し、突然変異タンパク質「1」は50μg/mlの濃度で使用した。このような固定化突然変異タンパク質「1」または突然変異タンパク質m1-9と、組換えにより発現され、Strep-Tactinアフィニティークロマトグラフィー精製された4つの異なる融合タンパク質、すなわちそれぞれのC末端でストレプトアビジン結合ペプチドStrep-tagII（GFP-StrepII、SEQ ID NO: 104）またはストレプトアビジン結合ペプチドdi-tag3（GFP-di-tag3、SEQ ID NO: 105）のいずれかを伴う緑色蛍光タンパク質 (GFP)、およびStrep-tagII（Cytb562-StrepII、SEQ ID NO: 106）またはdi-tag3（Cytb562-di-tag3、SEQ ID NO: 107）のいずれかを伴うシトクロムb562（第1列；組換え遺伝子から推定されるアミノ酸配列については付属書類1を参照されたい）との相互作用を、ランニング緩衝液として10 mM HEPES (pH 7.4)、150 mM NaCl、3.4 mM EDTA、0.005% Tween 20を用いて、Biacore T100装置上で25℃で解析した。解析の前に、融合タンパク質調製物を緩衝液W（100 mM Tris-Cl pH 8、150 mM NaCl、1 mM EDTA）に対して透析し、一価融合タンパク質と固定化ストレプトアビジン突然変異タンパク質との相互作用のみを測定することを確実にするために、分析的サイズ排除クロマトグラフィーにより凝集物を本質的に含まないことを確認した（最大5%の含有量は許容されたが、大部分の場合にこれは1%を下回った）。170または4350 RUの突然変異タンパク質m1-9の相互作用は、74、222、667、2000、および6000 nMの濃度のCytb562-StrepIIを用いて解析した；170または4350 RUの突然変異タンパク質m1-9の相互作用は、1.2、3.7、11.1、33.3、および100 nMの濃度のCytb562-di-tag3を用いて解析した；170または4350 RUの突然変異タンパク質m1-9の相互作用は、11.1、33.3、100、300、および900 nMの濃度のGFP-StrepIIを用いて解析した；170または4350 RUの突然変異タンパク質m1-9の相互作用は、3.7、11.1、33.3、100、および300 nMの濃度のGFP-di-tag3を用いて解析した；325または5567 RUの突然変異タンパク質「1」の相互作用は、それぞれ0.22、0.66、2、6、および18μMの濃度のCytb562-StrepIIまたはCytb562-di-tag3を用いて解析した；325または5567 RUの突然変異タンパク質「1」の相互作用は、それぞれ11.1、33.3、100、300、および900 nMの濃度のGFP-StrepIIまたはGFP-di-tag3を用いて解析した。動力学的全体的適合 (Langmuir 1:1 ) を用いてデータを適合させ、得られた結合速度および解離速度および推定解離定数を、それぞれ第4列、第5列、および第6列に示す。BiaCoreデータは、Biaffin GmbH & Co KG、Kassel, Germanyによって測定された。
表12は、GFP-StrepII融合タンパク質のための粗製溶解物（大腸菌）を用いたアフィニティークロマトグラフィーの反復サイクルの結果を示す。融合タンパク質の収量および純度は、緩衝液W中の10 mMビオチンの添加後のカラムの溶出液を、Bioanalyzer 2100装置 (Agilent Technologies Inc.) で解析することによって決定した。
表13は、本出願において開示されたヌクレオチド配列およびペプチド配列の各々に指定された配列識別子を示す用語索引表である。
一般的方法
DNA操作は、従来の遺伝子操作方法によって実施した（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Pressを参照されたい）。分泌型ストレプトアビジン突然変異タンパク質のライブラリー発現には大腸菌K12 TG1 (Stratagene) を使用し、クローニングおよびライブラリー発現には大腸菌K12 TOP10 (Life Technologies) を使用し、ならびにいずれもStrep-tagIIに融合された大腸菌シトクロムb562およびアルカリホスファターゼのペリプラズム発現には、大腸菌K12 JM83 (Yanisch-Peron et al., (1985), Gene 33, 103-119) を使用した。Sepharoseに結合させるため、またはマイクロタイタープレートをコーティングするための、その後のタンパク質単離のための突然変異タンパク質のサイトゾル発現は、Schmidt and Skerra (1994)、前記に従って実施した。プラスミド配列決定は、Sequence Laboratories Gottingen GmbHにより、標準的なジデオキシ技法に従って実施した。プライマーおよびオリゴヌクレオチドは、Applied Biosystems Expedite DNA合成機を使用して合成した。
DNA操作は、従来の遺伝子操作方法によって実施した（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Pressを参照されたい）。分泌型ストレプトアビジン突然変異タンパク質のライブラリー発現には大腸菌K12 TG1 (Stratagene) を使用し、クローニングおよびライブラリー発現には大腸菌K12 TOP10 (Life Technologies) を使用し、ならびにいずれもStrep-tagIIに融合された大腸菌シトクロムb562およびアルカリホスファターゼのペリプラズム発現には、大腸菌K12 JM83 (Yanisch-Peron et al., (1985), Gene 33, 103-119) を使用した。Sepharoseに結合させるため、またはマイクロタイタープレートをコーティングするための、その後のタンパク質単離のための突然変異タンパク質のサイトゾル発現は、Schmidt and Skerra (1994)、前記に従って実施した。プラスミド配列決定は、Sequence Laboratories Gottingen GmbHにより、標準的なジデオキシ技法に従って実施した。プライマーおよびオリゴヌクレオチドは、Applied Biosystems Expedite DNA合成機を使用して合成した。
実施例1：ライブラリー1の調製
アミノ酸44〜52位（wt-ストレプトアビジンを参照）の領域において変異誘発されたストレプトアビジン誘導体をコードするDNA配列を有するプラスミドバンクを、pfuポリメラーゼ (Fermentas) ならびに以下のプライマーP1およびP2を用いて、pASK-IBA2-SAm1のPCR増幅によって調製した：
、ここで3'末端のTはホスホロチオエート結合によって連結されている、および
。
アミノ酸44〜52位（wt-ストレプトアビジンを参照）の領域において変異誘発されたストレプトアビジン誘導体をコードするDNA配列を有するプラスミドバンクを、pfuポリメラーゼ (Fermentas) ならびに以下のプライマーP1およびP2を用いて、pASK-IBA2-SAm1のPCR増幅によって調製した：
このようにして、ストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」の44位、45位、および52位の各々において、20アミノ酸のすべてまたは終止コドンをコードする32倍の縮重コドンを含む、DNA配列を作製した。得られたPCR産物をゲル電気泳動によって精製し、SacIIおよびHindIIIで切断し、それに応じて切断したpASK-IBA2-SAm1のベクター断片にライゲーションした。
塩化カルシウム法 (Sambrook et al., 1989) を用いて、大腸菌TOP10細胞をこのベクターで形質転換した。
実施例2：ライブラリー2の調製
アミノ酸44〜52位（wt-ストレプトアビジンを参照）の領域において変異誘発されたストレプトアビジン誘導体をコードするDNA配列を有するプラスミドバンクを、pfuポリメラーゼ (Fermentas) ならびに以下のプライマーP2およびP3を用いて、pASK-IBA2-SAm1のPCR増幅によって調製した：
、ここで3'末端のAはホスホロチオエート結合によって連結されている、および
。
アミノ酸44〜52位（wt-ストレプトアビジンを参照）の領域において変異誘発されたストレプトアビジン誘導体をコードするDNA配列を有するプラスミドバンクを、pfuポリメラーゼ (Fermentas) ならびに以下のプライマーP2およびP3を用いて、pASK-IBA2-SAm1のPCR増幅によって調製した：
このようにして、固定された変異Thr45→CysおよびSer52→Cys、GlyまたはAlaをコードする44位における2倍の縮重コドン、ならびにストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」の46位および47位の各々における、20アミノ酸のすべてまたは終止コドンをコードする32倍の縮重コドンを含む、DNA配列を作製した。得られたPCR産物をゲル電気泳動によって精製し、KpnIおよびHindIIIで切断し、それに応じて切断したpASK-IBA2-SAm1のベクター断片にライゲーションした。
塩化カルシウム法 (Sambrook et al., 1989) を用いて、大腸菌TOP10細胞をこのベクターで形質転換した。
実施例3：ライブラリー3の調製
アミノ酸115〜121位（wt-ストレプトアビジンを参照）の領域において変異誘発されたストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」誘導体をコードするDNA配列を有するプラスミドバンクを、PfuUltraポリメラーゼ (Stratagene) ならびに以下のプライマーP4およびP5を用いて、pASK-IBA2-SAm1のPCR増幅によって調製した：
、これは5'末端でリン酸化されている、および
、同様に5'末端でリン酸化されている。
アミノ酸115〜121位（wt-ストレプトアビジンを参照）の領域において変異誘発されたストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」誘導体をコードするDNA配列を有するプラスミドバンクを、PfuUltraポリメラーゼ (Stratagene) ならびに以下のプライマーP4およびP5を用いて、pASK-IBA2-SAm1のPCR増幅によって調製した：
このようにして、117位、120位、および121位の各々において、20アミノ酸のすべてまたは終止コドンをコードする32倍の縮重コドンを有するストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」遺伝子変種を含む、ベクター全体の線状DNA配列を作製した。得られたPCR産物をゲル電気泳動によって精製し、ライゲーションした。リン酸化プライマーを用いて平滑末端作製プルーフリーデイングポリメラーゼでベクター全体を増幅するこの戦略は、制限酵素を使用する必要がない、ならびにその上、1断片のライゲーションを行うことができ、これは1分子反応であるために、濃度に依存せず、ライブラリー1および2の作製に用いられた2断片のライゲーションよりも効率的であるという利点を有する。
製造業者の標準的なプログラムEc2（0.2 cmキュベット；2.5 kV）を用いたBio-Rad MicroPulserによるエレクトロポレーションを使用して、大腸菌TOP10または／およびTG1細胞をライゲーション済みのベクター混合物で形質転換した。
実施例4：ライブラリー4の調製
アミノ酸115〜121位（wt-ストレプトアビジンを参照）の領域において変異誘発されたストレプトアビジン突然変異タンパク質m4001誘導体をコードするDNA配列を有するプラスミドバンクを、PfuUltraポリメラーゼ (Stratagene) ならびに以下のプライマーP4およびP5を用いて、pASK-IBA2-SAm4001のPCR増幅によって調製した：
、これは5'末端でリン酸化されている、および
、同様に5'末端でリン酸化されている。
アミノ酸115〜121位（wt-ストレプトアビジンを参照）の領域において変異誘発されたストレプトアビジン突然変異タンパク質m4001誘導体をコードするDNA配列を有するプラスミドバンクを、PfuUltraポリメラーゼ (Stratagene) ならびに以下のプライマーP4およびP5を用いて、pASK-IBA2-SAm4001のPCR増幅によって調製した：
このようにして、117位、120位、および121位の各々において、20アミノ酸のすべてまたは終止コドンをコードする32倍の縮重コドンを有するストレプトアビジン突然変異タンパク質m4001遺伝子変種を含む、ベクター全体の線状DNA配列を作製した。得られたPCR産物をゲル電気泳動によって精製し、ライゲーションした。
製造業者の標準的なプログラムEc2（0.2 cmキュベット；2.5 kV）を用いたBio-Rad MicroPulserによるエレクトロポレーションを使用して、大腸菌TOP10または／およびTG1細胞をライゲーション済みのベクター混合物で形質転換した。
実施例5：ライブラリー5の調製
アミノ酸115〜121位（wt-ストレプトアビジンを参照）の領域において変異誘発されたストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」誘導体をコードするDNA配列を有するプラスミドバンクを、PfuUltraポリメラーゼ (Stratagene) ならびに以下のプライマーP4およびP6を用いて、pASK-IBA2-SAm1のPCR増幅によって調製した：
、これは5'末端でリン酸化されている、および
、同様に5'末端でリン酸化されている。
アミノ酸115〜121位（wt-ストレプトアビジンを参照）の領域において変異誘発されたストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」誘導体をコードするDNA配列を有するプラスミドバンクを、PfuUltraポリメラーゼ (Stratagene) ならびに以下のプライマーP4およびP6を用いて、pASK-IBA2-SAm1のPCR増幅によって調製した：
このようにして、PheまたはTyrをコードする117位における2倍の縮重コドン、ならびに120位および121位の各々における、20アミノ酸のすべてまたは終止コドンをコードする32倍の縮重コドンを有するストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」遺伝子変種を含む、ベクター全体の線状DNA配列を作製した。得られたPCR産物をゲル電気泳動によって精製し、ライゲーションした。
製造業者の標準的なプログラムEc2（0.2 cmキュベット；2.5 kV）を用いたBio-Rad MicroPulserによるエレクトロポレーションを使用して、大腸菌TOP10または／およびTG1細胞をライゲーション済みのベクター混合物で形質転換した。
実施例6：ライブラリー6の調製
アミノ酸115〜121位（wt-ストレプトアビジンを参照）の領域において変異誘発されたストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」誘導体をコードするDNA配列を有するプラスミドバンクを、PfuUltraポリメラーゼ (Stratagene) ならびに以下のプライマーP7およびP8を用いて、pASK-IBA2-SAm1のPCR増幅によって調製した：
、これは5'末端でリン酸化されている、および
、同様に5'末端でリン酸化されている。
アミノ酸115〜121位（wt-ストレプトアビジンを参照）の領域において変異誘発されたストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」誘導体をコードするDNA配列を有するプラスミドバンクを、PfuUltraポリメラーゼ (Stratagene) ならびに以下のプライマーP7およびP8を用いて、pASK-IBA2-SAm1のPCR増幅によって調製した：
このようにして、欠失されたアミノ酸118位および119位、ならびに117位、120位、および121位の各々において、20アミノ酸のすべてまたは終止コドンをコードする32倍の縮重コドンを有するストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」遺伝子変種を含む、ベクター全体の線状DNA配列を作製した。得られたPCR産物をゲル電気泳動によって精製し、ライゲーションした。
製造業者の標準的なプログラムEc2（0.2 cmキュベット；2.5 kV）を用いたBio-Rad MicroPulserによるエレクトロポレーションを使用して、大腸菌TOP10または／およびTG1細胞をライゲーション済みのベクター混合物で形質転換した。
実施例7：ライブラリー7の調製
アミノ酸115〜121位（wt-ストレプトアビジンを参照）の領域において変異誘発されたストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」誘導体をコードするDNA配列を有するプラスミドバンクを、PfuUltraポリメラーゼ (Stratagene) ならびに以下のプライマーP9およびP10を用いて、pASK-IBA2-SAm1のPCR増幅によって調製した：
、これは5'末端でリン酸化されている、および
、同様に5'末端でリン酸化されている。
アミノ酸115〜121位（wt-ストレプトアビジンを参照）の領域において変異誘発されたストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」誘導体をコードするDNA配列を有するプラスミドバンクを、PfuUltraポリメラーゼ (Stratagene) ならびに以下のプライマーP9およびP10を用いて、pASK-IBA2-SAm1のPCR増幅によって調製した：
このようにして、欠失されたアミノ酸118位および119位、120位における固定されたTrp、ならびに117位および121位の各々において、20アミノ酸のすべてまたは終止コドンをコードする32倍の縮重コドンを有するストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」遺伝子変種を含む、ベクター全体の線状DNA配列を作製した。得られたPCR産物をゲル電気泳動によって精製し、ライゲーションした。
製造業者の標準的なプログラムEc2（0.2 cmキュベット；2.5 kV）を用いたBio-Rad MicroPulserによるエレクトロポレーションを使用して、大腸菌TOP10または／およびTG1細胞をライゲーション済みのベクター混合物で形質転換した。
実施例8：フィルターサンドイッチアッセイ（US 6,103,493を参照されたい）における、ペプチドリガンドに対する増加した結合親和性を有するストレプトアビジン突然変異タンパク質の同定
ペプチドリガンドに対する増加した結合親和性を有するストレプトアビジン突然変異タンパク質を同定するために、pASK75-phoA (SEQ ID NO. 1) によってコードされる、大腸菌のアルカリホスファターゼ (BAP)、およびそのC末端に付着したStrep-tag（登録商標）IIペプチド (WSHPQFEK) を含む融合タンパク質を調製した。このために、pASK75-phoAをJM83を用いて発現させ、Schmidt and Skerra (2007)、前記の手順によるストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィーの代わりにStrep-Tactin（登録商標）を使用し、溶出剤としてのジアミノビオチンの代わりにデスチオビオチンを使用したことのみ変更して、US 6,103,493に記載されるように組換えタンパク質を精製した。さらなるアッセイにおいてBAP-Strep-tag（登録商標）II融合タンパク質（BAP-StrepIIとしても示される）を使用する前に、デスチオビオチンを透析によって除去した。
ペプチドリガンドに対する増加した結合親和性を有するストレプトアビジン突然変異タンパク質を同定するために、pASK75-phoA (SEQ ID NO. 1) によってコードされる、大腸菌のアルカリホスファターゼ (BAP)、およびそのC末端に付着したStrep-tag（登録商標）IIペプチド (WSHPQFEK) を含む融合タンパク質を調製した。このために、pASK75-phoAをJM83を用いて発現させ、Schmidt and Skerra (2007)、前記の手順によるストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィーの代わりにStrep-Tactin（登録商標）を使用し、溶出剤としてのジアミノビオチンの代わりにデスチオビオチンを使用したことのみ変更して、US 6,103,493に記載されるように組換えタンパク質を精製した。さらなるアッセイにおいてBAP-Strep-tag（登録商標）II融合タンパク質（BAP-StrepIIとしても示される）を使用する前に、デスチオビオチンを透析によって除去した。
実施例1〜7において得られたプラスミドバンクで形質転換した大腸菌細胞（TG1またはTOP10）を、100μg/mlアンピシリン含有LB培地を含む寒天プレート上に載せた酢酸ニトロセルロース膜（タイプOE66、直径110 mm、Whatman）上にプレーティングした。コロニーが見えるようになるまで、膜を30℃で24時間インキュベートした。
このインキュベーション中に、2枚目の膜を調製した。同様のサイズのImmobilon-P膜 (Millipore) を、PBS（4 mM KH2PO4、16 mM Na2HPO4、115 mM NaCl）で1:200希釈した全量10 mlのウサギ抗ストレプトアビジン免疫グロブリン (Sigma) で室温にておよそ6時間コーティングし、その後PBS中の3% w/vウシ血清アルブミン (BSA)、0.5% v/v Tween中でおよそ2時間ブロッキングした。
この2枚目の膜をPBSで洗浄し、100μg/mlアンピシリンおよび0.2μg/mlアンヒドロテトラサイクリン含有LB培地を含む寒天プレート上に載せた。続いて、上面にコロニーを有するニトロセルロース膜を2枚目の膜上に載せ、2枚の膜の相対位置に印を付けた。室温で一晩インキュベートした後、コロニーを有する上部の膜を除去し、新鮮なLBアンピシリン寒天プレート上で4℃にて貯蔵した。2枚目の膜も寒天プレートから除去し、PBS/Tween（PBS中の0.1% v/v Tween20）中で振盪しながら、30分回、3回洗浄した。続いて、この膜を、精製BAP-Strep-tagII融合タンパク質 (2μg/ml) を含む10 mlの新鮮なPBS/Tween溶液と混合した。室温で1時間インキュベートした後、膜を再度、PBS/Tween中で2回、およびPBS緩衝液中で2回洗浄した。シグナルの発生は、30μlブロモ-クロロ-インドリルリン酸 (BCIP)（ジメチルホルムアミド中50 mg/ml）および5μlニトロブルーテトラゾリウム (NBT)（70% v/vジメチルホルムアミド中75 mg/ml）を添加した10 mlのAP緩衝液（100 mM Tris-Cl pH 8.8、100 mM NaCl、5 mM MgCl2）の存在下で、1〜2時間にわたって起こった。この工程で生じた呈色スポットを、1枚目の膜上の対応するコロニーに割り当てた。数個のシグナル発生クローンの単離および培養後、対応するプラスミドDNAを単離し、配列決定したが、ランダム化位置の推定アミノ酸配列を、上記のフィルターアッセイで得られた相対シグナル強度と共に表1〜7に示す。異なるライブラリーからのシグナル強度は、異なる非平行実験から生じたものであるため、比較することはできない。驚くべきことに、ライブラリー3からのシグナル陽性クローンの配列決定から、一部の例における118位および119位のアミノ酸の欠失が明らかになった。これらの欠失は、それぞれ5'末端において3塩基だけ短縮した、P4およびP5プライマー調製における欠損プライマーの存在によって説明することができる。
実施例9：調製規模でのストレプトアビジン突然変異タンパク質の生成
組換え最小ストレプトアビジンの公知の発現系（Schmidt and Skerra (1994)、前記）を使用して、ストレプトアビジン突然変異タンパク質を調製規模で生成した。このために、wt-ストレプトアビジンのコード領域およびT7プロモーターを含むベクターpSA1から、唯一のSacIIおよびHindIII制限部位を使用してコード領域の主要部分を除去し、変異型pASK-IBA2-SAm1プラスミドからの対応する領域によって置換した。続いて、Schmidt and Skerra (1994)、前記に記載されているように、wt-ストレプトアビジンおよびストレプトアビジン突然変異タンパク質を細胞質封入体の形態で発現させ、可溶化し、再生し、分画硫酸アンモニウム沈殿によって精製した。得られたストレプトアビジン突然変異タンパク質の純度を、Agilent 2100 Bioanalyzerによって調べた。本出願において記載されるストレプトアビジン突然変異タンパク質はそれぞれ、> 90%の純度で得られた。エルマン試薬（5,5'-ジチオビス-(2-ニトロ安息香酸)）を用いてかつ412 nmの吸光度を測定して、234μM溶液（単量体の理論的モル吸光係数ε280=42060 cm-1M-1を用いて決定）を還元型1,4-ジチオ-D-スレイトール (DTT) 標準物質の段階希釈と比較して探索することにより、精製ストレプトアビジン突然変異タンパク質m4001における45位と52位のシステインのジスルフィド形成は98.6%であると決定された。
組換え最小ストレプトアビジンの公知の発現系（Schmidt and Skerra (1994)、前記）を使用して、ストレプトアビジン突然変異タンパク質を調製規模で生成した。このために、wt-ストレプトアビジンのコード領域およびT7プロモーターを含むベクターpSA1から、唯一のSacIIおよびHindIII制限部位を使用してコード領域の主要部分を除去し、変異型pASK-IBA2-SAm1プラスミドからの対応する領域によって置換した。続いて、Schmidt and Skerra (1994)、前記に記載されているように、wt-ストレプトアビジンおよびストレプトアビジン突然変異タンパク質を細胞質封入体の形態で発現させ、可溶化し、再生し、分画硫酸アンモニウム沈殿によって精製した。得られたストレプトアビジン突然変異タンパク質の純度を、Agilent 2100 Bioanalyzerによって調べた。本出願において記載されるストレプトアビジン突然変異タンパク質はそれぞれ、> 90%の純度で得られた。エルマン試薬（5,5'-ジチオビス-(2-ニトロ安息香酸)）を用いてかつ412 nmの吸光度を測定して、234μM溶液（単量体の理論的モル吸光係数ε280=42060 cm-1M-1を用いて決定）を還元型1,4-ジチオ-D-スレイトール (DTT) 標準物質の段階希釈と比較して探索することにより、精製ストレプトアビジン突然変異タンパク質m4001における45位と52位のシステインのジスルフィド形成は98.6%であると決定された。
実施例10：ELISA
ペプチドリガンドStrep-tagIIに対するストレプトアビジン突然変異タンパク質の結合親和性を決定するために、ELISAを実施した。
ペプチドリガンドStrep-tagIIに対するストレプトアビジン突然変異タンパク質の結合親和性を決定するために、ELISAを実施した。
96ウェルマイクロタイタープレート (Costar) のウェルを、いずれの場合にも10 mM NaBO3、pH 8.5中の15μg/mlの濃度の、本発明の組換えストレプトアビジン突然変異タンパク質（ライブラリー1由来のm400；ライブラリー2由来のm4001；ライブラリー3由来のm4、m23、m36、m41、m45；ライブラリー5由来のm101、m111；ライブラリー6由来のm207、m212；およびライブラリー7由来のm301、m302）およびUS 6,103,493のストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」の溶液100μlで、4℃にて一晩コーティングした。さらに室温（23℃）で進めた。ウェルを、各200μlのTBS（100 mM Tris-Cl pH 8、115 mM NaCl）中の3% w/v BSA、0.5% v/v Tween20で2時間ブロッキングした。TBS/Tween（0.05% v/v Tween20を含むTBS）で3回洗浄した後、各ウェルに同緩衝液50μlを添加した。50μlのTBS/Tween中の0.3μM BAP-StrepII融合タンパク質（PBS中の精製かつ透析済み20μM BAP-StrepII貯蔵液をTBS/Tで67倍希釈することにより調製）を各列の第1ウェルに添加し、混合した。第1ウェルの（合計100μlからの）50μlをピペットで採取し、これを同じ列の次のウェルの内容物 (50μl) と混合し、以下同様に行うことによって、列の他のウェルにおいて希釈系列を設定した。このようにして、各列の第1ウェルにおける150 nMから第11ウェルにおける0,146484 nMまでの間の濃度の融合タンパク質を得た。
1時間インキュベートした後、溶液を除去し、ウェルをそれぞれTBS/Tweenで2回およびTBSで2回洗浄した。その後、1 mM ZnSO4、5 mM MgCl2、1 M Tris-Cl pH 8中の0.5 mg/ml p-ニトロフェニルリン酸の溶液100μlを、各ウェルにピペットで分注した。BioTekマイクロプレートリーダーel808を用いて、405 nmの吸光度を測定して595 nmの吸光度を減算することにより、各ウェルのデータを作成した。各ウェルにおける結合したBAP-StrepII融合タンパク質の活性は、振盪下における23℃での20分間のインキュベーションの前と後に得られたデータの差分値として測定され、図1においてΔ(A405-A595)のミリ光学濃度単位 (mOD) として示される。
データは、解離定数KD = [P]*[L]/[P*L] をもたらす、ストレプトアビジン突然変異タンパク質単量体 (P) とBAP-StrepII融合タンパク質 (L) との間の単一結合平衡を仮定して、評価した。[P]tot = [P]+[P*L]であり、かつ [L] は [P*L] よりもはるかに大きく、そのため [L]totは [L] とほぼ同じであるという仮定の下で、結合した融合酵素BAP-StrepIIの量は、[P*L]=[L]tot*[P]tot/(KD+[L]tot) として決定される。この式を用いて、KDおよび [P]tot（漸近活性値、(Δ(A405-A595)/Δt)max) に相当する）をパラメータとした非線形最小二乗回帰により、[L]tot（適用されたBAP-StrepII融合酵素の濃度）に対する[P*L] の測定データ（酵素活性、Δ(A405-A595)/Δtの観点）を適合させた。図1は、US 6,103,493のストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」と比較した、本発明の2つの選択されたストレプトアビジン突然変異タンパク質から得られた実験結果のグラフを示す。（ストレプトアビジン（突然変異タンパク質）を固定化せず、ウェルをブロッキングしたのみの対照のΔ(A405-A595) は、20分間のインキュベーションにおいて、BAP-StrepII濃度の各々について<1であった（グラフ中に示されていない））。表8は、US 6,103,493のストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」と比較した、本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質のより大きな選択物に関するKDおよび (Δ(A405-A595)/Δt)maxの評価結果を示す。これらのデータから、本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質が、BAPに融合されたStrep-tagIIに対して、US 6,103,493のストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」よりも顕著により高い親和性を有し、したがってこのELISAにおいて示されるように、Strep-tag(II) 融合タンパク質の固相への効率的な固定化により適していることが理解され得る。
実施例11：アフィニティークロマトグラフィー
実施例9に記載されるように、ストレプトアビジン突然変異タンパク質（ライブラリー1由来のm400；ライブラリー2由来のm4001；ライブラリー3由来のm4、m23、m36、m41、m45；ライブラリー5由来のm111；ライブラリー6由来のm207、m212；およびライブラリー7由来のm301、m302）、ならびにUS 6,103,493のストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」およびwt-ストレプトアビジンを調製した。次いで、製造業者の説明書に従って、タンパク質をNHS活性化Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare) に結合させた（Schmidt and Skerra, 1994、前記を参照されたい）。製造業者の説明書に従ってBCAアッセイ (Pierce) を用いて、各ストレプトアビジン突然変異タンパク質によるSepharoseゲルの負荷を決定した。簡潔に説明すると、50μlの緩衝液 (100 mM Tris-Cl pH 8) 中の10% v/v Sepharoseゲル懸濁液を、新たに調製したBCA試薬と混合し、37℃で30分間インキュベートした。各測定においては、平行して、同緩衝液中に溶解した様々な濃度のストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」の標準物質を用いて、参照曲線を決定した。適合させた（二次多項式）参照曲線に関して決定された、様々なストレプトアビジン突然変異タンパク質によるSepharoseゲルの負荷を、3回の独立した測定の平均値の結果として表9および10に示す。固相結合ストレプトアビジン突然変異タンパク質に対するこのBCAアッセイベースの決定方法の妥当性対照として、ストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」による公知の負荷の参照Sepharoseゲルを平行して測定した。結果として得られたBCA由来値は、参照測定値から1%未満しか逸脱しておらず、したがって、BCAアッセイが、Sepharose結合ストレプトアビジン突然変異タンパク質を決定するための信頼性のあるデータを提供することが判明した。
実施例9に記載されるように、ストレプトアビジン突然変異タンパク質（ライブラリー1由来のm400；ライブラリー2由来のm4001；ライブラリー3由来のm4、m23、m36、m41、m45；ライブラリー5由来のm111；ライブラリー6由来のm207、m212；およびライブラリー7由来のm301、m302）、ならびにUS 6,103,493のストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」およびwt-ストレプトアビジンを調製した。次いで、製造業者の説明書に従って、タンパク質をNHS活性化Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare) に結合させた（Schmidt and Skerra, 1994、前記を参照されたい）。製造業者の説明書に従ってBCAアッセイ (Pierce) を用いて、各ストレプトアビジン突然変異タンパク質によるSepharoseゲルの負荷を決定した。簡潔に説明すると、50μlの緩衝液 (100 mM Tris-Cl pH 8) 中の10% v/v Sepharoseゲル懸濁液を、新たに調製したBCA試薬と混合し、37℃で30分間インキュベートした。各測定においては、平行して、同緩衝液中に溶解した様々な濃度のストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」の標準物質を用いて、参照曲線を決定した。適合させた（二次多項式）参照曲線に関して決定された、様々なストレプトアビジン突然変異タンパク質によるSepharoseゲルの負荷を、3回の独立した測定の平均値の結果として表9および10に示す。固相結合ストレプトアビジン突然変異タンパク質に対するこのBCAアッセイベースの決定方法の妥当性対照として、ストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」による公知の負荷の参照Sepharoseゲルを平行して測定した。結果として得られたBCA由来値は、参照測定値から1%未満しか逸脱しておらず、したがって、BCAアッセイが、Sepharose結合ストレプトアビジン突然変異タンパク質を決定するための信頼性のあるデータを提供することが判明した。
Strep-tag II保有融合タンパク質のアフィニティー精製における、この様式で固定化された、US 6,103,493のストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質およびwt-ストレプトアビジンの挙動を調べるため、本質的にSchmidt & Skerra (2007)、前記に記載されているように、Strep-tagIIに融合された組換えシトクロムb562（Schmidt and Skerra 1994、前記）（またcytb562-StrepIIと示される）をtetプロモーター／オペレーター制御プラスミドpASK-IBA2-シトクロムb562 (SEQ ID NO. 2) により発現させた。簡潔に説明すると、大腸菌JM83をpASK-IBA2-シトクロムb562で形質転換し、100μg/mlアンピシリンを含むLB培地中で37℃で培養した。OD550=0.5の時点で、0.2μg/mlアンヒドロテトラサイクリンにより発現を誘導し、37℃で3時間継続した。次に細胞を遠心分離によって回収し、100分の1量（培養液量に関して）の予め冷却した緩衝液W（100 mM Tris-Cl pH 8、150 mM NaCl、1 mM EDTA）中に、例えば1リットルの培養液量に由来する場合には10 ml中に再懸濁した。細胞を超音波処理によって溶解し、細胞残屑を遠心分離（30000 g、15分、4℃）によって除去した。次に清澄化上清をStrep-Tactinアフィニティークロマトグラフィーに供して、組換えシトクロムb562‐Strep-tagII融合タンパク質を精製した。精製後、デスチオビオチンを緩衝液Wに対する透析によって除去し、このようにして調製されたシトクロムb562‐Strep-tagII融合タンパク質を次に、US 6,103,493のストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」と比較して、およびwt-ストレプトアビジンと比較して、本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質を特徴づけるための以下のアフィニティークロマトグラフィー実験に使用した。
第1のアフィニティークロマトグラフィー実験では、本発明の様々なストレプトアビジン突然変異タンパク質ならびにUS 6,103,493のストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」およびwtストレプトアビジンの各々を有する450μl Sepharoseゲル（4.5 mlの10%懸濁液に由来）を、2枚のポリエチレンフィルターディスクの間の2 mlカラム（Pierce、カタログ番号89896）に充填した。次に、3 mlの緩衝液W中の1 mg/ml精製シトクロムb562‐Strep-tagII融合タンパク質を各カラムに重力流で適用した。このような方法で、各カラムに大規模に過負荷をかけ、シトクロムb562 Strep-tagII融合タンパク質は溶出液中に出現する。次に、各カラムを2.5 ml緩衝液Wで2回洗浄した。保持されたシトクロムを緩衝液W中の10 mMビオチンで溶出させ、モル吸光係数ε280 = 8250 M-1cm-1を用いて、溶出液の280 nmにおける吸光度を測定することにより分光光度的に定量した。結果を表9に示す。本発明の突然変異タンパク質はすべて、US 6,103,493の突然変異タンパク質「1」と比較して、顕著により多くのシトクロムb562 Strep-tagII融合タンパク質を保持し（最大で3倍まで）、およびwtストレプトアビジンと比較してはるかに多くの該融合タンパク質を保持した（最大で28倍まで）。結果を、固定化ストレプトアビジン（突然変異タンパク質）の量に対して標準化した。したがって、本発明の突然変異タンパク質を用いて、Strep-tag（登録商標）II融合タンパク質結合能が顕著に改善されたアフィニティーカラムを調製することができる。
第2のアフィニティークロマトグラフィー実験では、本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質1 mg、US 6,103,493のストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」1 mg、およびwtストレプトアビジン1 mgの凝集物を有するSepharoseゲル（対応する量の10%懸濁液に由来）を、2枚のポリエチレンフィルターディスクの間の2 mlカラム（Pierce、カタログ番号89896）に充填した。次に、5 mlの緩衝液W中の10μg/ml精製シトクロムb562‐Strep-tag（登録商標）II融合タンパク質の10回分（合計500μg）を各カラムに重力流で適用した。流速は、いずれの場合にも1分当たり0.6〜0.8 mlであった。各カラムを1カラム体積 (CV) の緩衝液Wで洗浄した。捕捉されたシトクロムb562‐Strep-tagII融合タンパク質を、緩衝液W中の10 mMビオチンで溶出させ、モル吸光係数ε280 = 8250 M-1cm-1を用いて、溶出液の280 nmにおける吸光度を測定することにより分光光度的に定量した。結果を表10に示す。本発明の突然変異タンパク質はすべて、US 6,103,493の突然変異タンパク質「1」と比較して、固定化ストレプトアビジン（突然変異タンパク質）当たり、顕著により多くのシトクロムb562 Strep-tagII融合タンパク質を捕捉した（最大で3倍超まで）。したがって、本発明の突然変異タンパク質を用いて、例えば哺乳動物細胞によって細胞培養液に分泌された組換えタンパク質の場合のように、比較的希釈された形態で適用されるStrep-tag（登録商標）II融合タンパク質の顕著に改善された収率を提供するアフィニティーカラムを調製することができる。融合タンパク質（この場合はシトクロムb562）において適用されたStrep-tag（登録商標）IIリガンドの、わずかに理論的に2倍過剰の固定化Strep-tag（登録商標）II結合部位を提供するアフィニティー材料の量を使用したものの、本発明の突然変異タンパク質を用いて、適用されたStrep-tag（登録商標）II融合タンパク質の最大でほぼ70%までの回収率が得られ、これにより、樹脂に固定化された本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質を用いた、Strep-tag（登録商標）II融合タンパク質のアフィニティー捕捉の効率が実証された。
US 6,103,493のストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」とは対照的に、本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質の大部分の場合には、デスチオビオチンの使用が効率的な溶出を引き起こさなかったことに、さらに留意しなければならない。代わりにビオチンを使用した場合に、これらの突然変異タンパク質の場合にも鋭敏な溶出が達成された。
実施例12：アミノ酸115〜121の領域の変異による親和性増加は、アミノ酸領域43〜52の状況とは無関係である
突然変異タンパク質m4001-m9（図4、ストレプトアビジンアミノ酸配列の117〜121位にSEQ ID NO: 58 Glu117Asn118Ala119Gly120Tyr121のアミノ酸配列を含む）は、それぞれ44位、45位、46位、52位にアミノ酸Ala、Cys、Gly、Cysを保有するストレプトアビジン突然変異タンパク質m4001（図4）に基づき、アミノ酸117位、120位、および121位をランダム化したストレプトアビジン突然変異タンパク質のライブラリーのスクリーニングの最上位結果の1つであった。選択基準／品質決定パラメータは、フィルターサンドイッチアッセイにおいて生じたシグナル強度であった（実施例8）。これらの結果に基づき、117位、120位、および121位で同定されたアミノ酸Glu、Gly、およびTyrを、突然変異タンパク質m4001の状況から突然変異タンパク質「1」の状況に移行させて、ストレプトアビジン突然変異タンパク質m1-9を得た（突然変異タンパク質m1-9の完全なアミノ酸配列については図4を参照されたい）。したがって、アミノ酸残基43〜52によって形成されるループのためのある特定のアミノ酸配列の状況において、アミノ酸領域115〜121について得られた結果（ストレプトアビジン結合ペプチドに対する改善された結合親和性）、すなわちm4001の配列を、領域43〜52の別のアミノ酸配列、すなわちこの場合は突然変異タンパク質「1」の配列と組み合わせた。この新たな組み合わせストレプトアビジン突然変異タンパク質m1-9と、2つの異なるStrep-tagII (mono-tag) 融合タンパク質またはdi-tag3融合タンパク質との相互作用について、親和性をBiaCore（商標）により測定し、これらの融合タンパク質のストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」に対する親和性と比較した（表11）。突然変異タンパク質m1-9は、GFP-StrepII（緑色蛍光タンパク質）に対しておよそ10倍、およびCytb562-StrepIIに対しておよそ30倍の親和性増加を提供する。これは、BAP-Strep-tagII (mono-tag) 融合タンパク質との相互作用に関して、ランダムライブラリーから直接行われる本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質の選択について測定された親和性増加と同様の範囲内であり（表8）、本発明の突然変異タンパク質が公知の突然変異タンパク質「1」を上回るという利点が確認される。
突然変異タンパク質m4001-m9（図4、ストレプトアビジンアミノ酸配列の117〜121位にSEQ ID NO: 58 Glu117Asn118Ala119Gly120Tyr121のアミノ酸配列を含む）は、それぞれ44位、45位、46位、52位にアミノ酸Ala、Cys、Gly、Cysを保有するストレプトアビジン突然変異タンパク質m4001（図4）に基づき、アミノ酸117位、120位、および121位をランダム化したストレプトアビジン突然変異タンパク質のライブラリーのスクリーニングの最上位結果の1つであった。選択基準／品質決定パラメータは、フィルターサンドイッチアッセイにおいて生じたシグナル強度であった（実施例8）。これらの結果に基づき、117位、120位、および121位で同定されたアミノ酸Glu、Gly、およびTyrを、突然変異タンパク質m4001の状況から突然変異タンパク質「1」の状況に移行させて、ストレプトアビジン突然変異タンパク質m1-9を得た（突然変異タンパク質m1-9の完全なアミノ酸配列については図4を参照されたい）。したがって、アミノ酸残基43〜52によって形成されるループのためのある特定のアミノ酸配列の状況において、アミノ酸領域115〜121について得られた結果（ストレプトアビジン結合ペプチドに対する改善された結合親和性）、すなわちm4001の配列を、領域43〜52の別のアミノ酸配列、すなわちこの場合は突然変異タンパク質「1」の配列と組み合わせた。この新たな組み合わせストレプトアビジン突然変異タンパク質m1-9と、2つの異なるStrep-tagII (mono-tag) 融合タンパク質またはdi-tag3融合タンパク質との相互作用について、親和性をBiaCore（商標）により測定し、これらの融合タンパク質のストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」に対する親和性と比較した（表11）。突然変異タンパク質m1-9は、GFP-StrepII（緑色蛍光タンパク質）に対しておよそ10倍、およびCytb562-StrepIIに対しておよそ30倍の親和性増加を提供する。これは、BAP-Strep-tagII (mono-tag) 融合タンパク質との相互作用に関して、ランダムライブラリーから直接行われる本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質の選択について測定された親和性増加と同様の範囲内であり（表8）、本発明の突然変異タンパク質が公知の突然変異タンパク質「1」を上回るという利点が確認される。
突然変異タンパク質（組み合わせ産物）m1-9はまた、実施例10において、ランダムライブラリーから直接行われるストレプトアビジン突然変異タンパク質の選択に関して記載されたように、同様のアフィニティークロマトグラフィー実験において試験した。この実用的適用関連設定においても、突然変異タンパク質m1-9は、ランダムライブラリーから直接選択されたストレプトアビジン突然変異タンパク質と比較して同程度に、突然変異タンパク質「1」よりも顕著に優れていることが明らかになった。
突然変異タンパク質m1-9を用いて得られたこれらの結果は、アミノ酸43〜52位の領域におけるある特定のアミノ酸配列状況に関して、アミノ酸115〜121位の領域においてアミノ酸を置換することによって生じた親和性増加が、これらの変異の有益な特性を保ちつつ、アミノ酸43〜52位の領域における別のアミノ酸配列状況と組み合わせることができることを実証する。したがって、このことから、領域115〜121における変異に関して得られた結果が、状況には依存せず、望ましい場合には、ストレプトアビジンの他の領域における他の有益なアミノ酸配列と組み合わせることができることが確認される。したがって、本発明は、新規な有益なストレプトアビジン突然変異タンパク質を提供するのみならず、本明細書において同定された変異がまた、公知のストレプトアビジン突然変異タンパク質の特性を改善し得るという付加的な利点もまた提供する。
実施例13：粗製溶解物（大腸菌）を用いた反復アフィニティークロマトグラフィーサイクル
本質的に実施例11に記載される通りに、ストレプトアビジン突然変異タンパク質m1-9をアガロース (Superflow) 上に固定化した。得られた樹脂は、233 nmol/mlというビオチン結合能を有した（100%の活性と仮定して、樹脂1 ml当たり3.1 mgの突然変異タンパク質m1-9の負荷密度に相当する）。カラムに0.5 mlの樹脂を充填し、重力流下で粗製大腸菌抽出物からのGFP-StrepIIの反復精製に使用して、反復精製サイクルへのその適合性を試験した。各精製サイクル後に、GFP-StrepIIの収率および純度を決定した。
本質的に実施例11に記載される通りに、ストレプトアビジン突然変異タンパク質m1-9をアガロース (Superflow) 上に固定化した。得られた樹脂は、233 nmol/mlというビオチン結合能を有した（100%の活性と仮定して、樹脂1 ml当たり3.1 mgの突然変異タンパク質m1-9の負荷密度に相当する）。カラムに0.5 mlの樹脂を充填し、重力流下で粗製大腸菌抽出物からのGFP-StrepIIの反復精製に使用して、反復精製サイクルへのその適合性を試験した。各精製サイクル後に、GFP-StrepIIの収率および純度を決定した。
この目的のために、IBA GmbHのマニュアルに記載されている標準手順（例えば、http://www.iba-lifesciences.com/technical-support.htmlにおいてPDFファイルとして入手可能なManual (Twin) Strep-tag（バージョンPR02-0025））に従って、GFP-StrepIIのサイトゾル発現後の大腸菌細胞の全可溶性内容物の清澄化溶解物を、Buffer W（100 mM Tris-Cl pH 8、150 mM NaCl、1 mM EDTA）を用いて調製した。溶解物は、1 ml当たりおよそ1.2 mgのGFP-StrepIIを含んでいた。第1段階では、突然変異タンパク質m1-9を伴う樹脂0.5 mlを含むカラムに、0.25 mlの清澄化溶解物を負荷した。カラムを、0.5 mlに相当する1カラム体積 (CV) の緩衝液Wで5回洗浄し、次いで緩衝液W中の10 mMビオチンで溶出させた。カラムを5 CVの10 mM NaOHで2回洗浄することにより、再生した（ビオチンから放出させた）。次に、0.25 ml清澄化溶解物の2回目の量を適用し、再度、上記の通りに、含まれるGFP-StrepIIを単離し、カラムを再生した。次に、同じ0.5-mlカラム上での3回目の精製の試みでは、3倍量 (0.75 ml) の清澄化溶解物を適用し、含まれるGFP-StrepIIの精製およびカラム精製のための、上記と同じ工程を使用した。次に、同じ0.5-mlカラム上での4回目の精製の試みでは、再度、0.75 mlの清澄化溶解物を適用し、含まれるGFP-StrepIIの精製およびカラム精製のための、上記と同じ工程を使用した。各段階で同じカラムを使用するこの連続精製実験の結果を、表12に要約する。表12から分かるように、各段階において、Strep-Tag II融合タンパク質の適用されたのと本質的に同じ量が、90%を超える純度で精製され得た。したがって、本実験は、本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質を伴うアフィニティーカラムが、一定の高収率および高純度で、組換えタンパク質の反復精製に確実に使用できることを実証する。10 CVの10 mM NaOHを使用する代わりに、カラムはまた、緩衝液W中の10 mM HABAのより大きな容積で洗浄することによって再生することもできる。例えば、本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質でコーティングされた樹脂または他の支持体が、アルカリ性pHに対して感受性が高い場合など、ビオチンがより穏和な条件下で除去されなければならない場合に、これは賢明であり得る。
実施例14：突然変異タンパク質m1-9と2つの連続配置されたストレプトアビジン結合ペプチド部分 (di-tag3) との相互作用
本発明は、公知のストレプトアビジン突然変異タンパク質よりも、Strep-tagII融合タンパク質に対する顕著に増加した親和性を有するストレプトアビジン突然変異タンパク質を提供する。しかしながら、所与の適用において、より高い親和性が必要とされる場合には、限界が依然として存在し得る。これは、結合パートナーの少なくとも一方‐Strep-tag（登録商標）II融合タンパク質または各ストレプトアビジン突然変異タンパク質‐が非常に低濃度で存在するかまたは適用される場合の精製状況において起こり得る。このような例は、Strep-tag（登録商標）II融合タンパク質の発現不良、および／または細胞溶解に大きな緩衝液容積を使用する場合、もしくはStrep-tag（登録商標）II融合タンパク質が細胞培養液に分泌される場合である。これらのすべての場合において、低濃度の標的タンパク質を含む大きな試料容積が、アフィニティーカラムに適用される。それに対して、例えばカラム精製と対照的なバッチ精製の場合のような、ストレプトアビジン突然変異タンパク質反応パートナーの希釈もまた、最適以下の性能をもたらす。しかしながら、精製の下流の他の適用もまた、より高い親和性から恩恵を受け得る。その実例は、アッセイ開発のための、ストレプトアビジン突然変異タンパク質でコーティングされた固相上での、解析されるべき専用の標的タンパク質（またはStrep-tagIIと化学的に融合された他の分子）の指向的で、穏和で、かつ安定した固定化である。固相および対応するアッセイの例は、ELISAのためのマイクロプレート、タンパク質：タンパク質、タンパク質：ペプチド、およびタンパク質：小分子相互作用を解析するための無標識のリアルタイム測定を提供する、例えばForteBioのOctet（登録商標）もしくはGEのBiaCore（登録商標）ファミリーの装置のためのバイオセンサー、その表面上に結合している多数の分析物のハイスループット解析のためのチップ、または例えばタンパク質：タンパク質相互作用解析のための、磁気ビーズもしくはalphascreen（登録商標）ビーズもしくはluminex（登録商標）ビーズのようなビーズである。このような例のすべてにおいて、ストレプトアビジン突然変異タンパク質による各固相のコーティングは、該固相に対する任意のタンパク質の簡便で、再現性があり、穏和で、かつ安定した固定化のための一般的プラットフォームを提供すべきである。これは、さもなくば、特定の固定化手順を、固定化されるおよび解析される各タンパク質について個別に開発しなければならないため、極めて役に立つ。
本発明は、公知のストレプトアビジン突然変異タンパク質よりも、Strep-tagII融合タンパク質に対する顕著に増加した親和性を有するストレプトアビジン突然変異タンパク質を提供する。しかしながら、所与の適用において、より高い親和性が必要とされる場合には、限界が依然として存在し得る。これは、結合パートナーの少なくとも一方‐Strep-tag（登録商標）II融合タンパク質または各ストレプトアビジン突然変異タンパク質‐が非常に低濃度で存在するかまたは適用される場合の精製状況において起こり得る。このような例は、Strep-tag（登録商標）II融合タンパク質の発現不良、および／または細胞溶解に大きな緩衝液容積を使用する場合、もしくはStrep-tag（登録商標）II融合タンパク質が細胞培養液に分泌される場合である。これらのすべての場合において、低濃度の標的タンパク質を含む大きな試料容積が、アフィニティーカラムに適用される。それに対して、例えばカラム精製と対照的なバッチ精製の場合のような、ストレプトアビジン突然変異タンパク質反応パートナーの希釈もまた、最適以下の性能をもたらす。しかしながら、精製の下流の他の適用もまた、より高い親和性から恩恵を受け得る。その実例は、アッセイ開発のための、ストレプトアビジン突然変異タンパク質でコーティングされた固相上での、解析されるべき専用の標的タンパク質（またはStrep-tagIIと化学的に融合された他の分子）の指向的で、穏和で、かつ安定した固定化である。固相および対応するアッセイの例は、ELISAのためのマイクロプレート、タンパク質：タンパク質、タンパク質：ペプチド、およびタンパク質：小分子相互作用を解析するための無標識のリアルタイム測定を提供する、例えばForteBioのOctet（登録商標）もしくはGEのBiaCore（登録商標）ファミリーの装置のためのバイオセンサー、その表面上に結合している多数の分析物のハイスループット解析のためのチップ、または例えばタンパク質：タンパク質相互作用解析のための、磁気ビーズもしくはalphascreen（登録商標）ビーズもしくはluminex（登録商標）ビーズのようなビーズである。このような例のすべてにおいて、ストレプトアビジン突然変異タンパク質による各固相のコーティングは、該固相に対する任意のタンパク質の簡便で、再現性があり、穏和で、かつ安定した固定化のための一般的プラットフォームを提供すべきである。これは、さもなくば、特定の固定化手順を、固定化されるおよび解析される各タンパク質について個別に開発しなければならないため、極めて役に立つ。
その結果として、より良好な方法で、アフィニティー精製の域を超えてこれらの適用に対処するための、親和性改善のためのさらなる余地が存在し得る。したがって、本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質の結合特性を、di-tag3と命名され、かつ米国特許第7,981,632号に記載されている、短いリンカーによって結合された2つのStrep-tag（登録商標）II結合配列のタンデム配置
についても試験した。米国特許第7,981,632号はまた、Strep-tag（登録商標）アフィニティーシステムについて、そのようなタンデム配置の利点‐両方のStrep-tag（登録商標）II配列の四量体ストレプトアビジン突然変異タンパク質への同時結合をもたらし、それによって効率的な競合溶出の維持の下で、より高い結合安定性を提供する、を記載している。本実施例では、di-tag3融合タンパク質を用いてデータが作成されたが、利点はこの特定のdi-tag3ストレプトアビジン結合突然変異タンパク質の使用に限定されない。むしろ、結合力効果はまた、米国特許第7,981,632号に記載されている任意の他の連続配置されたストレプトアビジン結合モジュールを用いても達成され、それによって他の親和性特性がさらに増強される。
その結果として、一価Strep-tagIIに対するその結合親和性と比較した、突然変異タンパク質m1-9によって例証される本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質と、di-tag3によって例証される2つの連続配置されたStrep-tagII結合部分との間の相互作用の親和性増加を、BiaCore（商標） T100装置でのリアルタイム相互作用解析によって解析し、突然変異タンパク質「1」の場合の同じdi-tag3対Strep-tagIIの親和性増加と比較した（表11）。di-tag3およびStrep-tagIIは、2つの異なる組換えタンパク質、すなわちGFPおよびシトクロムb562のC末端において提示された。結果は非常に驚くべきものであった。di-tag3は、突然変異タンパク質「1」の場合には、GFPの場合に単に10倍およびシトクロムb562の場合に単に200〜400倍の親和性増加をもたらしたのに対して、本発明の突然変異タンパク質m1-9の場合の各増加は、300〜600および10,000〜40,000であった。したがって、本発明の突然変異タンパク質m1-9は、IgG抗体に匹敵する結合力効果を提供し (Roitt et al., third ed., Mosby, St Louis, pages 6.3-6.4 1993)、これは最新技術突然変異タンパク質「1」によって提供される結合力効果よりもはるかにより明白である（50〜100倍の増加）。
di-tag3の突然変異タンパク質m1-9に対する親和性 (avidic) 結合の解離速度（
0,000015 s-1）は、T1/2 = In2/koff = 46,209秒 = 770分 = > 12時間という半減期を伴う相互作用を特定する。一価の相互作用の場合には、このように遅い解離速度は、再結合が起こり得ないという仮定の下で、結合している分子のおよそ95%を放出させるのに2日を要するため、これは競合溶出によって効率的に破壊され得ない。したがって、このような一価の相互作用は、穏和な生理的条件下で達成され得るという理由で、および非特異的結合混入物が溶出中に樹脂から最小限に放出されるために高純度を提供するという理由で好ましい競合溶出を用いるアフィニティークロマトグラフィーには適していないと考えられる。しかしながら、親和性結合相互作用の解離速度は、競合条件下では、最も遅い解離速度を有する単一相互作用部分の解離速度と類似する。したがって、di-tag3融合タンパク質は、本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質を保有する（その上に固定化された）アフィニティー樹脂からなお、かなり効率的に溶出され得る。これらの融合タンパク質を溶出させるこの能力は、突然変異タンパク質「1」と相互作用するストレプトアビジン結合ペプチドdi-tag3について米国特許第7,981,632号においてなされた観察と一致する。その上に突然変異タンパク質m1-9が固定化されているカラムからの溶出挙動は、実際にGFP-StrepIIおよびGFP-di-tag3に関して類似しており、上記でなされた理論的考察が実際に適切であることが示される（データは示さず）。GFP-StrepIIの解離速度は、T1/2 = 161秒を特定し、そのため結合している分子の95%を置換するのにおよそ11分が必要である。これは、アフィニティークロマトグラフィーにおける効率的な溶出に支障を来たさない。できるだけ濃縮された標的タンパク質を得るためには、第1段階において、競合物を含む1カラム体積 (CV) の溶出緩衝液を用いてカラムを浸水させ得る。次に、流動を10〜20分間停止して、結合している標的タンパク質の置換を可能にしてから、溶出緩衝液により流動を再開することによってこれを溶出させることができる。あるいは、溶出を非常に遅い流速で行って、標的タンパク質をより高濃度で提供することもできる。
一方、非競合条件下でのdi-tag3と突然変異タンパク質m1-9との間の非常に安定した相互作用により（T1/2 = > 12時間）、この相互作用は、上記の分析設定（数例を挙げると、ELISA、alphascreen（登録商標）、luminex（登録商標）、BiaCore（登録商標）、Octet（登録商標））におけるアッセイの開発の際に、固相上での、di-tag3（または、例えば米国特許7,981,632号に記載されているような、任意の他の連続配置されたストレプトアビジン突然変異タンパク質結合部分）に融合されている（化学的または組換えによる）任意の所与の標的タンパク質の指向的で、穏和で、かつ安定した固定化のために一般的に用いられるのに非常に魅力的なものとなる。その上、競合物の存在下における相互作用の可逆性により、ある種の分析物の解析後に、結合しているdi-tag3融合タンパク質を除去し、別のdi-tag3融合タンパク質を結合させて、そのdi-tag3融合タンパク質に結合する別の分析物を解析するための、本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質でコーティングされた装置または試料の穏和な再生が可能となる。穏和な再生は、装置または試料、および本実施例では本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質である、結合しているタンパク質性受容体を保護する。
この特性が利用され得る別の実例は、BiaCore（商標）などの表面プラズモン共鳴技術によるアフィニティー決定である。適切なチップ（BiaCore（商標）の場合には例えばCM5）を、本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質でコーティングする。リガンドに対する親和性の決定を目的としたdi-tag3融合タンパク質を、固定化された本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質に対する、その融合されたdi-tag3の安定した結合を介して、チップに安定に結合させる。次に、ある濃度で適用されたリガンドの結合動力学を決定した後、別の濃度で適用しなければならないリガンドから、チップを再生しなければならない。di-tag3融合タンパク質を損なわずにこれが可能でないのであれば、競合物、例えばビオチンを添加し、さらなる段階において、例えば親和性の低い別の競合物（例えば、HABA（= 2-(4-ヒドロキシフェニルアゾ)安息香酸））を用いて、その競合物を洗浄除去し、最後に緩衝液のみでチップを洗浄することにより、同チップを複合体全体、すなわちリガンドが結合しているdi-tag3融合タンパク質から再生することができる。最終的に、チップは、新たなチップの使用を必要とせずに、別の濃度で適用されるリガンド結合の解析のために、新たな量のdi-tag3融合タンパク質を結合させるために再生される。
突然変異タンパク質m1-9などの突然変異タンパク質に対するdi-tag3融合タンパク質の高い親和性は、アフィニティークロマトグラフィーにおいて、固定化ストレプトアビジン突然変異タンパク質m1-9の結合部位の非常に効率的な利用をもたらすはずである。この仮定を試験するため、0.6 mlカラムに、上記の固定化突然変異タンパク質m1-9を充填した（1 ml当たり233 nモルビオチン結合能）。したがってこのカラムは、140 nモルビオチン結合部位の量を提供する。2.6 mgのGFP融合タンパク質の添加により、カラムにGFP-di-tag3融合タンパク質を過剰負荷した。次にカラムを5 CVの緩衝液Wで洗浄し、残存するGFP-di-tag3融合タンパク質を、緩衝液W中の10 mMビオチンで溶出させた。溶出されたGFP-di-tag3は、280 nmの吸光度を測定し、E0.1% = 1.053という理論的吸光係数を用いることによって、2.13 mgであると定量された。この2.13 mgという量は、71 nモルGFP-di-tag3融合タンパク質に相当する。したがって、化学量論 (stochiometry) は2:1である。この化学量論から、各結合ペプチドdi-tag3が突然変異タンパク質m1-9上の2つの結合部位を占有し、および各結合部位がStrep-tagII部分と複合体を形成し、それによって100%に近い能力の利用に相当することが推定され得る。この結果から、およびBiaCore（商標）データによって示される強力な結合力効果から、チップに突然変異タンパク質m1-9が低密度で負荷されたか、または高密度で負荷されたかにかかわらず（表11を参照されたい）、1つのdi-tag3結合ペプチドが、1つの四量体上の互いに近接して位置する2つの結合部位を非常に効率的に占有し（実際に、各四量体は、ごく近接して対で位置する4つの結合部位を有する；Weber et al., 1989, Science 243, 85-88）、そのため、この実験で使用された濃度では、ごく近接して位置するこのような結合部位に対して、異なるdi-tag3配列による競合はほとんどない。このことは、本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質四量体上で、di-tag3（または例えば米国特許第7,981,632号において開示されているような他の連続配置されたストレプトアビジン結合エピトープ）融合タンパク質、またはdi-tag3と複合化されたタンパク質を、明確に定義された様式で二量体化することが可能であるはずであることをさらに意味する。解離速度が非常に遅いため（T1/2 = > 12時間）、通常1時間の範囲内で達成される標準的な分析アッセイの時間枠内では、複合体形成パートナーの考慮すべき交換は存在しない。したがって、異なって標識された2つのストレプトアビジン突然変異タンパク質m1-9調製物（標識は、蛍光標識、発色団標識、酵素標識、磁気標識（磁気ビーズ）、またはalphascreenもしくはluminexアッセイプラットフォームにおいて使用される他のビーズ、または単にある特定のサイズもしくは任意の他のアドレス可能な特性のアガロースビーズであってよい）を用いた場合に、各標識変種を異なるdi-tag3融合タンパク質によって複合体化する。この場合、両方の複合体調製物は、<1時間である標準的なアッセイ持続期間において、標識ストレプトアビジン突然変異タンパク質とdi-tag3融合タンパク質との間の顕著な交換が起こることなく、混合することができる。明白な例を提供するため：調製物1は、di-tag3‐融合タンパク質Xと複合体形成された突然変異タンパク質m1-9‐標識1から構成され、調製物2は、di-tag3‐融合タンパク質Yと複合体形成された突然変異タンパク質m1-9‐標識2から構成される。次に、両方の調製物は、di-tag3‐融合タンパク質Yと複合体形成された突然変異タンパク質m1-9‐標識1、およびdi-tag3‐融合タンパク質Xと複合体形成された突然変異タンパク質m1-9‐標識2の大きな集団を形成することなく、混合することができる。この特性は、例えば、試料中もしくは標本中（例えば、免疫細胞化学における）、または細胞上もしくは任意の他の実体上で、di-tag3に融合または複合化されたある特定の標的に特異的なリガンドに対して、本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質を介して結合した専用標識によって、交換された検出複合体から人工産物を生じることなく、異なる標的が同時にアドレス指定され得る、多重アッセイを可能にする。しかし、di-tag3：ストレプトアビジン突然変異タンパク質複合体は、ビオチンのような競合物の添加によってなお効率的に逆転し得るため、この方法論は任意に付加的に、標的からの標識の効率的な除去を可能にする。これは、貴重な唯一の標本である場合がある、試料もしくは標本または細胞もしくは任意の他の生物学的実体を、さらなるアッセイにおいて再利用するのに重要であると考えられる。リガンドはこの戦略によって多量体化されるため（1つの標識ストレプトアビジン突然変異タンパク質四量体上で二量体化される、または例えば化学架橋によって多量体化された標識ストレプトアビジン突然変異タンパク質多量体上で多量体化される）、低親和性リガンドもまた、多重標識アッセイのためのこの方法論において使用することができる。この場合、リガンドはまた、di-tag3と本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質との複合体の競合的破壊による単量体化、およびそれに続く洗浄後に、試料もしくは標本または細胞もしくは任意の他の実体から容易に除去され得る（例えばStemberger et al., 2012,PLoSONE, Volume 7 | Issue 4 | e35798に記載されている、Streptamer（登録商標）技術を参照されたい）。これは本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質のさらなる利点であり、ストレプトアビジン結合ペプチドとの相互作用に用いられる公知のストレプトアビジン突然変異タンパク質に勝る、これらのストレプトアビジン突然変異タンパク質の優れた特性を示す。
本発明を、電子出願された配列プロトコールによってさらに明らかにするが、その中にはとりわけ以下のものがある。
SEQ ID NO 1は、PhoAシグナルペプチドをコードする配列（太字）、その後の大腸菌アルカリホスファターゼ (BAP) をコードする配列（下線、実線）、その後のリンカーをコードする配列（下線、点線）、その後のStrep-tag（登録商標）IIをコードする配列（下線、破線）を含む発現ベクターpASK75-phoAのヌクレオチド配列を示す。この遺伝子は、転写調節のために、テトラサイクリンプロモーター／オペレーター (tetP/O) に機能的に連結されている。このベクターは、BAP-Strep-tag（登録商標）II融合タンパク質のペリプラズム発現に適している。このtet-プロモーターベースの発現系の一般的使用は、米国特許第5,849,576号に記載されている。
SEQ ID NO 2は、OmpAシグナルペプチドをコードする配列（太字）、その後の大腸菌シトクロムb562 (Cytb562) をコードする配列（下線、実線）、その後のリンカーをコードする配列（下線、点線）、その後のStrep-tag（登録商標）IIをコードする配列（下線、破線）を含む発現ベクターpASK-IBA2-シトクロムb562のヌクレオチド配列を示す。シトクロムb562 Strep-tagII融合タンパク質（またcytb562-StrepIIと示される）のためのこの遺伝子は、転写調節のために、テトラサイクリンプロモーター／オペレーター (tetP/O) に機能的に連結されている。このベクターは、cytb562-Strep-tagII融合タンパク質のペリプラズム発現に適している。このtet-プロモーターベースの発現系の一般的使用は、米国特許第5,849,576号に記載されている。
SEQ ID NO 3は、OmpAシグナルペプチドをコードする配列（太字）、その後のUS 6,103,496によって開示されたストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」（Ala13〜Ser139）をコードする配列（下線、実線）を含む発現ベクターpASK-IBA2-SAm1のヌクレオチド配列を示す。この遺伝子は、転写調節のために、テトラサイクリンプロモーター／オペレーター (tetP/O) に機能的に連結されている。このベクターは、ストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」のペリプラズム発現に適している。このtet-プロモーターベースの発現系の一般的使用は、米国特許第5,849,576号に記載されている。
SEQ ID NO 4は、OmpAシグナルペプチドをコードする配列（太字）、その後の本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質m4001（Ala13〜Ser139）をコードする配列（下線、実線）を含む発現ベクターpASK-IBA2-SAm4001のヌクレオチド配列を示す。この遺伝子は、転写調節のために、テトラサイクリンプロモーター／オペレーター (tetP/O) に機能的に連結されている。このベクターは、ストレプトアビジン突然変異タンパク質m4001のペリプラズム発現に適している。このtet-プロモーターベースの発現系の一般的使用は、米国特許第5,849,576号に記載されている。
SEQ ID NO 5は、オリゴヌクレオチドプライマーP1のヌクレオチド配列を示す。
SEQ ID NO 6は、オリゴヌクレオチドプライマーP2のヌクレオチド配列を示す。
SEQ ID NO 7は、オリゴヌクレオチドプライマーP3のヌクレオチド配列を示す。
SEQ ID NO 8は、オリゴヌクレオチドプライマーP4のヌクレオチド配列を示す。
SEQ ID NO 9は、オリゴヌクレオチドプライマーP5のヌクレオチド配列を示す。
SEQ ID NO 10は、オリゴヌクレオチドプライマーP6のヌクレオチド配列を示す。
SEQ ID NO 11は、オリゴヌクレオチドプライマーP7のヌクレオチド配列を示す。
SEQ ID NO 12は、オリゴヌクレオチドプライマーP8のヌクレオチド配列を示す。
SEQ ID NO 13は、オリゴヌクレオチドプライマーP9のヌクレオチド配列を示す。
SEQ ID NO 14は、オリゴヌクレオチドプライマーP10のヌクレオチド配列を示す。
当業者は、本発明が、目的を実行し、言及された目標および利点、ならびにその中の固有のものを得るのに十分に適応していることを容易に認識するであろう。さらに、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書において開示される本発明に対して様々な置き換えおよび修正を行うことができることは、当業者に容易に明らかであろう。本明細書に記載される組成物、方法、手順、処理、分子、および具体的な化合物は、特定の態様の現在の代表例であり、例示であり、本発明の範囲の限定を意図するものではない。本発明の精神の範囲に包含され、特許請求の範囲によって規定される、その中での変更および他の使用が、当業者に想起されるであろう。本明細書中の以前の発行文献の列挙または考察は、その文献が最新技術の一部であるか、または共通の一般知識であることを認めるものとして必ずしも受け取られるべきではない。
本明細書で例示的に記載された本発明は、本明細書で具体的に開示されていない任意の要素または複数の要素、限定または複数の限定の非存在下で、適切に実施することができる。したがって、例えば、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「含有する（containing）」等の用語は、拡張的にかつ限定なしに読み取られるものとする。加えて、本明細書で使用される用語および表現は、限定の用語としてではなく、説明の用語として使用されており、そのような用語および表現の使用には、示されたおよび記載された特徴またはその一部の任意の均等物を排除する意図はなく、様々な修正が、特許請求される本発明の範囲内で可能であることが認識される。したがって、本発明は例示的な態様および任意の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書で具体化される本発明の修正および変更が当業者によって用いられ得ること、ならびにそのような修正および変更が本発明の範囲内であると見なされることが、理解されるべきである。
本発明は、本明細書において幅広くかつ総称的に記載されている。総称的な開示の範囲内に入るより狭い種および亜属集団の各々もまた、本発明の一部を形成する。これには、除かれた題材が本明細書において具体的に挙げられているか否かにかかわらず、任意の主題を属から除外する条件付きのまたは負の限定を用いた本発明の総称的記載も含まれる。
他の態様は、以下の特許請求の範囲内にある。加えて、本発明の特徴または局面がマーカッシュ群の観点から記載されている場合、当業者は、本発明がまたそれにより、そのマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの観点からも記載されていることを認識するであろう。
Claims (85)
- ストレプトアビジンの突然変異タンパク質より選択される突然変異タンパク質であって、
(a) SEQ ID NO: 15に記載の野生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列を参照して、アミノ酸115〜121位の領域内に少なくとも1つの変異を含み、かつ
(b) アミノ酸配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 100) を含むペプチドリガンドに対して、
(i) アミノ酸配列Val44-Thr45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 98) を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質、または
(ii) アミノ酸44〜47位において、アミノ酸配列Ile44-Gly45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 99) を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質、または
(iii) 野生型ストレプトアビジン (SEQ ID NO: 15)
の各々よりも高い結合親和性を有する、
突然変異タンパク質。 - 野生型ストレプトアビジンのアミノ酸117〜121位の領域内に少なくとも1つの変異を含む、請求項1記載の突然変異タンパク質。
- アミノ酸残基が配列位置114に存在し、該アミノ酸残基が野生型スレオニンまたは任意の他のアミノ酸のいずれかである、請求項1または2記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置117において芳香族アミノ酸残基を保有する、請求項1〜3のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置117の芳香族アミノ酸残基がTrp、Tyr、His、またはPheである、請求項4記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置117において荷電アミノ酸残基を保有する、請求項1〜3のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置117の荷電アミノ酸残基がGlu、Asp、またはArgである、請求項6記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置117において親水性残基を保有する、請求項1〜3のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- 親水性アミノ酸残基がAsn、Gln、Leu、Met、Ser、Ala、またはGlyである、請求項8記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置120において小さいアミノ酸残基を保有する、請求項3〜9のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置120の小さいアミノ酸残基がSer、Ala、またはGlyである、請求項10記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置121において疎水性アミノ酸残基を保有する、請求項3〜11のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置121において芳香族アミノ酸残基を保有する、請求項12記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置121のアミノ酸残基がTrp、Tyr、またはPheである、請求項12または13記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置120において疎水性アミノ酸残基を保有する、請求項4〜9のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置120の疎水性アミノ酸残基がLeu、Ile、Met、Val、Tyr、またはPheである、請求項15記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置121において小さいアミノ酸残基を保有する、請求項15または16記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置121の小さいアミノ酸残基がGly、Ala、Ser、またはGlnである、請求項17記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置121において疎水性アミノ酸残基を保有する、請求項15または16記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置121の疎水性アミノ酸残基がLeu、Val、Ile、Trp、Tyr、Phe、またはMetである、請求項19記載の突然変異タンパク質。
- 118位および／または119位のアミノ酸残基が欠失されている、請求項1〜3のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置117において任意のアミノ酸残基を保有する、請求項21記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置120においてかさ高い疎水性アミノ酸残基を保有する、請求項22記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置120のアミノ酸残基がPhe、Tyr、Val、またはTrpである、請求項22または23記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置121において疎水性アミノ酸残基を保有する、請求項21〜24のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置121のアミノ酸残基がMet、Leu、Tyr、またはPheである、請求項25記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置121において小さい親水性アミノ酸残基を保有する、請求項22〜23のいずれか記載の突然変異タンパク質。
- 小さい親水性残基がヒドロキシル基を有するアミノ酸である、請求項27記載の突然変異タンパク質。
- アミノ酸残基がSerまたはThrである、請求項27または28記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置121においてArgまたはAsp残基を保有する、請求項22〜24のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置120においてGly残基 (Gly120) を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置121においてPheまたはTyr残基を保有する、請求項31記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置117においてGlu、Asp、Arg、His、Asn、Gln、Thr、Ser、Leu、またはMet残基を保有する、請求項31または32記載の突然変異タンパク質。
- Aaa177はTyr、Phe、Arg、Trp、またはGlnであってよく、Baa120はTyr、Phe、Leu、Ile、またはMetであってよく、かつCaa121は任意のアミノ酸であってよく、Caa121は好ましくはLeu、Ile、Met、Gly、Gly、Trp、Ser、Ala、またはVal残基である、配列モチーフAaa117Baa120Caa121を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- Daa117およびHaa121は任意のアミノ酸であってよく、Eaa118およびFaa119はいずれも欠失され、かつGaa120はTrpまたはValであってよく、Daa117は好ましくはHis、Glu、Gln、Thr、Ala、またはIle残基であり、かつHaa121は好ましくはTyr、Leu、Met、またはArg残基である、配列モチーフDaa117Eaa118Faa119Gaa120Haa121を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- (a) SEQ ID NO: 15に記載の野生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列を参照して、アミノ酸44〜53位の領域内に少なくとも2つのシステイン残基を含み、かつ
(b) アミノ酸配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 100) を含むペプチドリガンドに対して、
(i) アミノ酸配列Val44-Thr45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 98) を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質、または
(ii) アミノ酸44〜47位において、アミノ酸配列Ile44-Gly45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 99) を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質、または
(iii) 野生型ストレプトアビジン (SEQ ID NO: 15)
の各々よりも高い結合親和性を有する、
ストレプトアビジン突然変異タンパク質。 - 2つのシステイン残基が、アミノ酸44〜53位の残基によって形成されるループ内で反対の位置に存在する、請求項36記載の突然変異タンパク質。
- 2つのシステイン残基が、野生型ストレプトアビジンのアミノ酸45位および52位に存在する、請求項36または37記載の突然変異タンパク質。
- 2つのシステイン残基が、野生型ストレプトアビジンの44位および53位に存在する、請求項36または37記載の突然変異タンパク質。
- 2つのシステイン残基が、野生型ストレプトアビジンの46位および51位に存在する、請求項36または37記載の突然変異タンパク質。
- 2つのシステイン残基が、野生型ストレプトアビジンの47位および50位に存在する、請求項36または37記載の突然変異タンパク質。
- 2つのシステイン残基が、野生型ストレプトアビジンの48位および49位に存在する、請求項36または37記載の突然変異タンパク質。
- GlyまたはAla残基が野生型ストレプトアビジンのアミノ酸44位に存在する、請求項36〜38および40〜42のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- アミノ酸残基46がグリシンである、請求項36〜39および41〜42のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- アミノ酸残基46がグリシンであり、かつアミノ酸残基47がアルギニンである、請求項36〜39および42のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置44〜53および／もしくは配列位置117〜121において、表1〜7によって開示される配列を有するか、またはSEQ ID NO: 18〜97のいずれかの配列を有する、請求項1〜45のいずれか一項記載のストレプトアビジン突然変異タンパク質。
- アミノ酸配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 100) を含むペプチドリガンドに対して、アミノ酸44〜47位においてアミノ酸配列Val44-Thr45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 98) または配列Ile44-Gly45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 99) を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質よりも少なくとも1.1倍高い（それぞれのKdの比によって表される）結合親和性を有する、請求項1〜46のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置117〜121において、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、またはSEQ ID NO: 65 のアミノ酸配列を含む、請求項1〜46のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- SEQ ID NO: 15に記載の野生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列を参照して、アミノ酸44〜53位の領域内に少なくとも2つのシステイン残基をさらに含む、請求項1〜35のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- 2つのシステイン残基が、アミノ酸44〜53位の残基によって形成されるループ内で反対の位置に存在する、請求項49記載の突然変異タンパク質。
- 2つのシステイン残基が、野生型ストレプトアビジンの44位および53位に存在する、請求項49または50記載の突然変異タンパク質。
- 2つのシステイン残基が、野生型ストレプトアビジンのアミノ酸45位および52位に存在する、請求項49または50記載の突然変異タンパク質。
- 2つのシステイン残基が、野生型ストレプトアビジンの46位および51位に存在する、請求項49または50記載の突然変異タンパク質。
- 2つのシステイン残基が、野生型ストレプトアビジンの47位および50位に存在する、請求項49または50記載の突然変異タンパク質。
- 2つのシステイン残基が、野生型ストレプトアビジンの48位および49位に存在する、請求項49または50記載の突然変異タンパク質。
- GlyまたはAla残基が野生型ストレプトアビジンのアミノ酸44位に存在する、請求項50または52〜55のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- N末端側が野生型ストレプトアビジンのアミノ酸10〜16の領域内で始まり、かつC末端側が野生型ストレプトアビジンのアミノ酸133〜142の領域内で終結する最小ストレプトアビジンの突然変異タンパク質である、前記請求項のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置44においてGluが疎水性脂肪族アミノ酸によって置換され、配列位置45において任意のアミノ酸が存在し、配列位置46において疎水性脂肪族アミノ酸が存在し、または／かつ配列位置47においてValが塩基性アミノ酸によって置換される、前記請求項のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- Alaが46位に存在する、請求項58記載の突然変異タンパク質。
- Argが47位に存在する、請求項59記載の突然変異タンパク質。
- アミノ酸44〜47位の領域内に配列Val44-Thr45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 98) が存在する、請求項60記載の突然変異タンパク質。
- アミノ酸44〜47位の領域内に配列Ile44 Gly45Ala46 Arg47 (SEQ ID NO: 99) が存在する、請求項60記載の突然変異タンパク質。
- 図4中に示される以下の突然変異タンパク質：m400 (SEQ ID NO: 114)、m402 (SEQ ID NO: 115)、m4001 (SEQ ID NO: 116)、突然変異タンパク質「1」-m36 (SEQ ID NO: 117)、突然変異タンパク質「1」-m23 (SEQ ID NO: 118)、突然変異タンパク質「1」-m41 (SEQ ID NO: 119)、突然変異タンパク質「1」-m4 (SEQ ID NO: 120)、突然変異タンパク質「1」-m12 (SEQ ID NO: 121)、突然変異タンパク質「1」-m22 (SEQ ID NO: 122)、突然変異タンパク質「1」-m31 (SEQ ID NO: 123)、突然変異タンパク質「1」-m32 (SEQ ID NO: 124)、突然変異タンパク質「1」-m35 (SEQ ID NO: 125)、突然変異タンパク質「1」-m38 (SEQ ID NO: 126)、突然変異タンパク質「1」-m40 (SEQ ID NO: 127)、突然変異タンパク質「1」-m42 (SEQ ID NO: 128)、突然変異タンパク質「1」-m45 (SEQ ID NO: 129)、突然変異タンパク質「1」-m46 (SEQ ID NO: 130)、突然変異タンパク質「1」-m47 (SEQ ID NO: 131)、突然変異タンパク質「1」-m7 (SEQ ID NO: 132)、突然変異タンパク質「1」-m10 (SEQ ID NO: 133)、突然変異タンパク質「1」-m17 (SEQ ID NO: 134)、突然変異タンパク質「1」-m21 (SEQ ID NO: 135)、突然変異タンパク質「1」-m24 (SEQ ID NO: 136)、突然変異タンパク質「1」-m27 (SEQ ID NO: 137)、突然変異タンパク質「1」-m28 (SEQ ID NO: 138)、突然変異タンパク質「1」-m30 (SEQ ID NO: 139)、突然変異タンパク質「1」-m33 (SEQ ID NO: 140)、突然変異タンパク質「1」-m1 (SEQ ID NO: 141)、突然変異タンパク質「1」-m3 (SEQ ID NO: 142)、突然変異タンパク質「1」-m8 (SEQ ID NO: 143)、突然変異タンパク質「1」-m15 (SEQ ID NO: 144)、突然変異タンパク質「1」-m6 (SEQ ID NO: 145)、突然変異タンパク質「1」-m9 (SEQ ID NO: 146)、突然変異タンパク質「1」-m20 (SEQ ID NO: 147)、突然変異タンパク質「1」-m34 (SEQ ID NO: 148)、突然変異タンパク質「1」-m14 (SEQ ID NO: 149)、突然変異タンパク質「1」-m18 (SEQ ID NO: 150)、突然変異タンパク質「1」-m19 (SEQ ID NO: 151)、m4001-m8 (SEQ ID NO: 152)、m4001-m21 (SEQ ID NO: 153)、m4001-m9 (SEQ ID NO: 154)、m4001-m1 (SEQ ID NO: 155)、m4001-m2 (SEQ ID NO: 156)、m4001-m3 (SEQ ID NO: 157)、m4001-m5 (SEQ ID NO: 158)、m4001-m13 (SEQ ID NO: 159)、m4001-m14 (SEQ ID NO: 160)、m4001-m24 (SEQ ID NO: 161)、m4001-m4 (SEQ ID NO: 162)、m4001-m6 (SEQ ID NO: 163)、m4001-m7 (SEQ ID NO: 164)、m4001-m10 (SEQ ID NO: 165)、m4001-m15 (SEQ ID NO: 166)、m4001-m23 (SEQ ID NO: 167)、m4001-m17 (SEQ ID NO: 168)、m4001-m12 (SEQ ID NO: 169)、m4001-m20 (SEQ ID NO: 170)、突然変異タンパク質「1」-m101 (SEQ ID NO: 171)、突然変異タンパク質「1」-m106 (SEQ ID NO; 172)、突然変異タンパク質「1」-m111 (SEQ ID NO: 173)、突然変異タンパク質「1」-m100 (SEQ ID NO: 174)、突然変異タンパク質「1」-m110 (SEQ ID NO: 175)、突然変異タンパク質「1」-m104 (SEQ ID NO: 176)、突然変異タンパク質「1」-m108 (SEQ ID NO: 177)、突然変異タンパク質「1」-m207 (SEQ ID NO: 178)、突然変異タンパク質「1」-m212 (SEQ ID NO: 179)、突然変異タンパク質「1」-m202 (SEQ ID NO: 180)、突然変異タンパク質「1」-m204 (SEQ ID NO: 181)、突然変異タンパク質「1」-m206 (SEQ ID NO: 182)、突然変異タンパク質「1」-m208 (SEQ ID NO: 183)、突然変異タンパク質「1」-m203 (SEQ ID NO: 184)、突然変異タンパク質「1」-m209 (SEQ ID NO: 185)、突然変異タンパク質「1」-m200 (SEQ ID NO: 186)、突然変異タンパク質「1」-m201 (SEQ ID NO: 187)、突然変異タンパク質「1」-m211 (SEQ ID NO: 188)、突然変異タンパク質「1」-m300 (SEQ ID NO: 189)、突然変異タンパク質「1」-m301 (SEQ ID NO: 190)、突然変異タンパク質「1」-m302 (SEQ ID NO:191)、突然変異タンパク質「1」-m303 (SEQ ID NO: 192)、突然変異タンパク質「1」-m304 (SEQ ID NO; 193)、およびm1-9 (SEQ ID NO: 194)
のいずれかの配列を含む、請求項1〜62のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。 - ペプチドリガンドに対する結合親和性が、競合溶出が、ビオチン、チオビオチン、イミノビオチン、リポ酸、デスチオビオチン、ジアミノビオチン、HABA、または／およびジメチル-HABAより選択されるストレプトアビジンリガンドによって起こり得る程のものである、請求項1〜63のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- 少なくとも1つの標識基を保有する、前記請求項のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- 請求項1〜65のいずれか一項記載のストレプトアビジン突然変異タンパク質をコードする配列を含む核酸分子。
- 有効な機能的環境中に、請求項66記載の核酸の少なくとも1コピーを含むベクター。
- 請求項67記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞。
- 請求項1〜65のいずれか一項記載のストレプトアビジン突然変異タンパク質を生成する方法であって、
(a) ストレプトアビジン突然変異タンパク質をコードする核酸を含むベクターで適切な宿主細胞を形質転換する段階、
(b) ストレプトアビジン突然変異タンパク質の発現が起こる条件下で、該宿主細胞を培養する段階、
(c) 該突然変異タンパク質を単離する段階
を含む、方法。 - 段階 (c) が、宿主細胞を溶解する段階、封入体の形態のストレプトアビジン突然変異タンパク質を単離する段階、および該ストレプトアビジン突然変異タンパク質を再生する段階を含む、請求項69記載の方法。
- 段階 (b) における発現が、シグナルペプチド保有ストレプトアビジンの発現、および宿主細胞のペリプラズムまたは培養液中へのその分泌を含む、請求項70記載の方法。
- 宿主細胞が大腸菌である、請求項69〜71のいずれか一項記載の方法。
- a) 式Trp-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa (SEQ ID NO: 101) のペプチド配列、式中、Xaaは任意のアミノ酸を示し、かつYaaおよびZaaはいずれもGlyを示すか、またはYaaはGluを示しかつZaaはArgもしくはLysを示す、またはb) 少なくとも2つのストレプトアビジン結合モジュールの連続配置を含むペプチド配列、この場合、2つのモジュール間の距離は少なくとも0でかつ50アミノ酸以下であり、この場合、一方の結合モジュールは3〜8アミノ酸を有しかつ少なくとも配列-His-Pro-Baa-を含み、ここでBaaはグルタミン、アスパラギン、もしくはメチオニンであり、ならびにこの場合、他方の結合モジュールは、配列-Oaa-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa- (SEQ ID NO: 108) を有し、ここでOaaはTrp、Lys、もしくはArgであり、Xaaは任意のアミノ酸であり、かつYaaおよびZaaはいずれもGlyであるか、またはYaaはGluでありかつZaaはLysもしくはArgである、と融合されているタンパク質を単離する、精製する、または決定する方法であって、該タンパク質を含む試料を請求項1〜65のいずれか一項記載のストレプトアビジン突然変異タンパク質と、該ペプチド配列が該ストレプトアビジン突然変異タンパク質に結合するのに適した条件下で接触させる段階、および得られた複合体を該試料から分離する段階を含む、方法。
- ストレプトアビジン突然変異タンパク質が固相に結合しているか、またはそれに結合することができる、請求項73記載の方法。
- 複合体から融合タンパク質を放出させるために、複合体を、ビオチンおよびその誘導体より選択される、十分な量のストレプトアビジン突然変異タンパク質のリガンドと共にインキュベートする、請求項74記載の方法。
- ビオチン誘導体がチオビオチンである、請求項75記載の方法。
- ペプチド配列が、
より選択される、請求項73〜76のいずれか一項記載の方法。 - 前記複合体から前記タンパク質を放出させる段階をさらに含む、請求項75〜77のいずれか一項記載の方法。
- 前記タンパク質を決定する段階をさらに含む、請求項78記載の方法。
- a) 式Trp-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa (SEQ ID NO: 101) のペプチド配列、式中、Xaaは任意のアミノ酸を示し、かつYaaおよびZaaはいずれもGlyを示すか、またはYaaはGluを示しかつZaaはArgもしくはLysを示す、またはb) 少なくとも2つのストレプトアビジン結合モジュールの連続配置を含むペプチド配列、この場合、2つのモジュール間の距離は少なくとも0でかつ50アミノ酸以下であり、この場合、一方の結合モジュールは3〜8アミノ酸を有しかつ少なくとも配列-His-Pro-Baa-を含み、ここでBaaはグルタミン、アスパラギン、もしくはメチオニンであり、ならびにこの場合、他方の結合モジュールは、配列-Oaa-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa- (SEQ ID NO: 108) を有し、ここでOaaはTrp、Lys、もしくはArgであり、Xaaは任意のアミノ酸であり、かつYaaおよびZaaはいずれもGlyであるか、またはYaaはGluでありかつZaaはLysもしくはArgである、と融合されているタンパク質を決定する方法であって、該タンパク質を請求項54記載のストレプトアビジン突然変異タンパク質と、該ストレプトアビジン突然変異タンパク質と結合させるための適切な条件下で接触させる段階、および標識を決定する段階を含む、方法。
- ペプチド配列が、
である、請求項80記載の方法。 - a) 式Trp-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa (SEQ ID NO: 101) のペプチド配列、式中、Xaaは任意のアミノ酸を示し、かつYaaおよびZaaはいずれもGlyを示すか、またはYaaはGluを示しかつZaaはArgもしくはLysを示す、またはb) 少なくとも2つのストレプトアビジン結合モジュールの連続配置を含むペプチド配列、この場合、2つのモジュール間の距離は少なくとも0でかつ50アミノ酸以下であり、この場合、一方の結合モジュールは3〜8アミノ酸を有しかつ少なくとも配列-His-Pro-Baa-を含み、ここでBaaはグルタミン、アスパラギン、もしくはメチオニンであり、ならびにこの場合、他方の結合モジュールは、配列-Oaa-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa- (SEQ ID NO: 108) を有し、ここでOaaはTrp、Lys、もしくはArgであり、Xaaは任意のアミノ酸であり、かつYaaおよびZaaはいずれもGlyであるか、またはYaaはGluでありかつZaaはLysもしくはArgである、と融合されているタンパク質を固定化する方法であって、該タンパク質を固定化するための条件下で、該タンパク質を、請求項1〜65のいずれか一項記載のストレプトアビジン突然変異タンパク質を保有する固相に接触させる段階を含む、方法。
- ペプチド配列が、
である、請求項82記載の方法。 - ストレプトアビジンに結合し得る基を保有する物質を決定するまたは単離する方法であって、該物質を請求項1〜65のいずれか一項記載のストレプトアビジン突然変異タンパク質と、それに対する結合に適した条件下で接触させる段階、および該物質を決定するまたは単離する段階を含む、方法。
- 請求項1〜65のいずれか一項記載のストレプトアビジン突然変異タンパク質、ならびに緩衝液、補助物質、および添加物からなる群より選択される少なくとも1つの試薬を含む試薬キット。
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