CN112877387A - 一种生物磁性微球及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明第一方面提供了一种生物磁性微球，包括磁性微球本体，所述磁性微球本体外表面具有至少一种带有线性主链和支链的聚合物，所述线性主链的一端固定于磁性微球本体外表面，聚合物的其他端游离于磁性微球本体外表面，所述生物磁性微球的聚合物的支链末端连接有生物素。本发明还提供了基于第一方面提供的生物磁性微球进行的改进，以及制备方法和应用。本发明的生物磁性微球操作使用便捷，可在溶液中的快速分散和快速沉聚，无需使用高速离心机等大型实验设备；用途广泛，还可通过生物素连接具有可选择性的纯化介质(如亲和素、亲和蛋白、多肽/蛋白标签等)，可普遍、大规模应用于蛋白包括但不限于抗体类物质等目标物的分离纯化。

Description

一种生物磁性微球及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种生物磁性微球及其制备方法和应用。
背景技术
蛋白，包括但不限于抗体、抗体片段或其融合蛋白的分离纯化是生物药生产工艺流程中的重要下游环节，分离纯化的效果和效率直接影响蛋白药物的质量和生产成本。对于蛋白纯化，现阶段常用琼脂糖凝胶等材料作为纯化柱或纯化微球载体。现有技术中，对抗体类物质(如抗体分子、抗体片段或其融合蛋白)的分离纯化，生产技术人员主要通过蛋白A(简称：Protein A)亲和吸附柱对发酵液或反应液中的抗体分子进行分离纯化。蛋白A柱中，通过载体上固定的蛋白A与抗体分子Fc端的特异位点进行特异性结合，从而实现将抗体从溶液中特异性高效分离。现阶段常用的蛋白A柱中的载体也主要采用琼脂糖凝胶等材料。
凝胶类材料的三维多孔结构有利于提高材料的比表面积，从而增加可结合纯化介质(如固定的蛋白A)的位点，提高对目标蛋白(包括抗体)的特异性结合量。载体材料的三维多孔结构虽然可以大幅度地提高蛋白(包括抗体)结合位点的数量，但是载体内部的多孔结构亦会在蛋白洗脱时增加蛋白的滞留时间，载体内部的一些不连续空间或死角还会阻碍蛋白从材料内部洗脱出来，导致增加滞留比例。如果将与蛋白结合的位点仅固定在载体的外表面，虽然可以避免蛋白产物进入材料的内部，大幅度减少洗脱时蛋白的滞留时间和滞留比例；但是如果仅仅利用载体的外表面，则会大幅度降低载体的比表面积，从而大幅度降低蛋白的结合位点数量，降低纯化效率。
聚合物是一种高分子化合物，可以通过单体分子聚合后形成。采用具有活性位点的单体分子进行聚合，聚合产物可以富含大量的活性位点，大幅提高活性位点的数量，可通过这些活性位点，进而形成或者引入相应的结合位点。聚合物的种类和结构多种多样，有分子链相互交联形成网状结构，有单一线性分子链的线型结构，也有拥有众多分支链的支化结构(例如分枝型、树状、梳状、超支化结构等结构)，不同结构类型的聚合物在不同领域各自拥有广泛的应用。
在现有技术中，用于蛋白分离纯化的纯化柱中，主要采用共价偶联方式固定纯化介质。以蛋白A作为纯化介质、用于纯化抗体类物质的蛋白A柱为例，用于抗体、抗体片段、或其融合蛋白等分离纯化的蛋白A柱中主要采用共价偶联方式固定蛋白A，通过C端的半胱氨酸将蛋白A共价偶联到载体上。共价偶联方式虽然可以保证纯化介质(如蛋白A)牢固地固定在载体上，但是，在纯化柱(如蛋白A柱)多次使用后，会导致纯化介质(如蛋白A)结合性能降低，纯化效果降低。因此，为了保证较高的纯化效率和质量，操作人员需要及时将亲和层析柱中填料全部更换，该过程不仅耗材用量大，而且消耗大量的人工和时间，导致纯化成本高。
发明内容
本发明提供了一种生物磁性微球，可用于目标物，特别是蛋白类物质(包括但不限于抗体类蛋白)的分离纯化，既能高通量地结合目标物，又能有效减少洗脱时目标物的滞留比例，还可以便捷地更换纯化介质(如亲和蛋白)，具有快速、高通量、可重复利用、可再生使用的特点，还可大幅度降低目标物的纯化成本。比如，采用亲和蛋白作为纯化介质时，可大幅度降低抗体类蛋白的纯化成本。
1.本发明第一方面提供了一种生物磁性微球，所述生物磁性微球包括磁性微球本体，所述磁性微球本体外表面具有至少一种带有线性主链和支链的聚合物，所述线性主链的一端固定于磁性微球本体外表面，聚合物的其他端游离于磁性微球本体外表面，所述生物磁性微球的聚合物的支链末端连接有生物素或生物素类似物。所述生物素或生物素类似物，既可以作为纯化介质，也可以作为连接元件进一步连接其它类型的纯化介质。
所述生物磁性微球，也称为生物素磁性微球或生物素磁珠。
所述“固定于”指所述线性主链以共价连接的方式“固定于”磁性微球本体外表面。
进一步地，所述线性主链以直接方式共价地固定于或者通过连接基(连接元件)以间接方式共价地固定于所述磁性微球本体外表面。
进一步地，所述聚合物支链的数量为多个；优选地，至少为3个。
优选方式之一，所述磁性微球本体的尺寸选自下述任一种粒径尺度或任两种粒径尺度之间的范围：0.1μm、0.15μm、0.2μm、0.25μm、0.3μm、0.35μm、0.4μm、0.45μm、0.5μm、0.55μm、0.6μm、0.65μm、0.7μm、0.75μm、0.8μm、0.85μm、0.9μm、0.95μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、5.5μm、6μm、6.5μm、7μm、7.5μm、8μm、8.5μm、9μm、9.5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm、1000μm；所述直径尺寸为平均值。
优选方式之一，所述磁性微球本体的直径选自0.1～10μm。
优选方式之一，所述磁性微球本体的直径选自0.2～6μm。
优选方式之一，所述磁性微球本体的直径选自0.4～5μm。
优选方式之一，所述磁性微球本体的直径选自0.5～3μm。
优选方式之一，所述磁性微球本体的直径选自0.2～1μm。
优选方式之一，所述磁性微球本体的直径选自0.5～1μm。
优选方式之一，所述磁性微球本体的直径选自1μm～1mm。
优选方式之一，所述磁性微球本体的平均直径为200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm、500nm、550nm、600nm、650nm、700nm、750nm、800nm、850nm、900nm、950nm、1000nm，偏差为±20％，更优选±10％。
优选方式之一，所述聚合物的主链为聚烯烃主链，或者为丙烯酸类聚合物主链。所述丙烯酸类聚合物的定义见“名词和术语”部分。优选方式之一，所述聚烯烃主链同时为丙烯酸类聚合物主链(也即，所述聚合物的线性主链为聚烯烃主链，且由丙烯酸类聚合物的主链提供)。
优选之一，所述丙烯酸类聚合物的单体单元优选地选自丙烯酸、丙烯酸盐、丙烯酸酯、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸盐、甲基丙烯酸酯等丙烯酸类单体分子之一或其组合。所述丙烯酸类聚合物可以通过上述单体之一聚合得到或者通过上述单体的相应组合共聚得到。
优选方式之一，所述聚合物的支链，通过基于功能基团的共价键共价结合生物素或生物素类似物，将生物素或生物素类似物共价键合在聚合物支链末端。可通过生物磁性微球外表面的聚合物分子的支链所含有的功能基团与生物素或生物素类似物进行共价反应而获得。其中，所述功能性基团的优选实施方式之一为特异性结合位点(定义详见具体实施方式的“名词和术语”部分)。
所述基于功能基团的共价键，指由功能基团参与共价偶联形成的共价键。优选地，所述功能基团为羧基、羟基、氨基、巯基、羧基的盐形式、氨基的盐形式、甲酸酯基，或者前述功能基团的组合。所述羧基的盐形式的优选方式之一为钠盐形式如COONa；所述氨基的盐形式的优选方式可以为无机盐形式，也可以为有机盐形式，包括但不限于盐酸盐、氢氟酸盐等形式。所述“功能基团的组合”指一个磁性微球的外表面的所有聚合物分子的所有支链，允许基于不同的功能基团参与形成共价键；以生物素为例，也即一个生物素磁性微球的外表面的所有生物素分子可以分别与不同的功能基团共价连接，不过一个生物素分子仅能与一个功能基团相连接。
优选方式之一，所述聚合物的线性主链直接共价偶联于所述磁性微球本体的外表面，或者通过连接基团间接地共价偶联于所述磁性微球本体的外表面。
优选方式之一，所述磁性微球本体为SiO2包裹的磁性材料。作为替代，SiO2可以为自带活性位点的硅烷偶联剂。
优选方式之一，所述磁性材料选自铁氧化物、铁化合物、铁合金、钴化合物、钴合金、镍化合物、镍合金、锰氧化物、锰合金之一或者组合；
进一步地，优选为Fe3O4、γ-Fe2O3、氮化铁、Mn3O4、FeCrMo、FeAlC、AlNiCo、FeCrCo、ReCo、ReFe、PtCo、MnAlC、CuNiFe、AlMnAg、MnBi、FeNiMo)、FeSi、FeAl、FeSiAl、MO·6Fe2O3、GdO之一或其组合；其中，所述Re为稀土元素；所述M为Ba、Sr、Pb，也即，所述MO·6Fe2O3为BaO·6Fe2O3、SrO·6Fe2O3或PbO·6Fe2O3。
2.本发明第二方面提供了一种生物磁性微球，在本发明第一方面提供的所述生物磁性微球基础上，所述生物素或生物素类似物作为连接元件进一步连接有纯化介质。也即：所述聚合物的支链末端通过连接元件连接有纯化介质，且所述连接元件包括所述生物素或生物素类似物。
所述纯化介质可以含有，但不限于含有，亲和素型标签、多肽型标签、蛋白型标签、抗体型标签、抗原型标签或者其组合。
优选方式之一，所述亲和素型标签为亲和素、可结合生物素的亲和素类似物、可结合生物素类似物的亲和素类似物或者其组合。
优选方式之一，所述生物磁性微球的聚合物的支链末端连接有生物素；所述纯化介质为亲和素，并与所述生物素之间形成亲和复合物的结合作用。
所述亲和素可以为，但不限于，链霉亲和素、改性链霉亲和素、链霉亲和素类似物或其组合。
优选方式之一，所述多肽型标签选自下述任一种标签或者其变体：CBP标签、组氨酸标签、C-Myc标签、FLAG标签、Spot标签、C标签、Avi标签、Streg标签、包含WRHPQFGG序列的标签、包含WRHPQFGG的变体序列的标签、包含RKAAVSHW序列的标签、包含RKAAVSHW的变体序列的标签或者其组合。所述Streg标签中含有WSHPQFEK及其变体。
优选方式之一，所述蛋白标签选自下述任一种标签或其变体蛋白：亲和蛋白、SUMO标签、GST标签、MBP标签及其组合。
优选方式之一，所述亲和蛋白选自蛋白A、蛋白G、蛋白L、改性蛋白A、改性蛋白G、改性蛋白L或其组合。
优选方式之一，所述抗体型标签为抗体、抗体的片段、抗体的单链、单链的片段、抗体融合蛋白、抗体片段的融合蛋白中任一种，任一种的衍生物或任一种的变体。
优选方式之一，所述抗体型标签为抗蛋白的抗体。
优选方式之一，所述抗体型标签为抗荧光蛋白的抗体。
优选方式之一，所述抗体型标签为纳米抗体；
优选方式之一，所述抗体型标签为抗蛋白的纳米抗体。
优选方式之一，所述抗体型标签为抗荧光蛋白的纳米抗体。
优选方式之一，所述抗体型标签为抗绿色荧光蛋白或其突变体的纳米抗体。
优选方式之一，所述抗体型标签为Fc片段。
所述纯化介质连接到所述生物素或所述生物素类似物的连接方式包括但不限于：共价键、非共价键(如超分子相互作用)、连接元件，或者其组合。
优选方式之一，所述共价键为动态共价键；更优选之一，所述动态共价键包括亚胺键、酰腙键、二硫键或者其组合。
优选方式之一，所述超分子相互作用为：配位结合、亲和复合物相互作用、静电吸附、氢键、π-π重叠作用、疏水相互作用或者其组合。
所述生物磁性微球的优选方式之一，所述纯化介质通过含有亲和复合物的连接元件连接到所述聚合物的支链末端。
优选方式之一，所述亲和复合物相互作用选自：生物素-亲和素相互作用、生物素类似物-亲和素相互作用、生物素-亲和素类似物相互作用、生物素类似物-亲和素类似物相互作用。
优选方式之一，所述生物素或生物素类似物通过亲和复合物作用连接有亲和素或亲和素类似物，所述纯化介质直接或间接地连接于所述亲和素或亲和素类似物。
优选方式之一，所述纯化介质通过亲和素型标签-纯化介质共价连接复合物连接到所述聚合物的支链末端的生物素或生物素类似物，通过亲和素型标签与所述生物素或生物素类似物之间形成亲和复合物的连接元件；进一步优选方式之一，所述纯化介质通过亲和素-纯化介质共价连接复合物，与所述聚合物的支链末端的生物素或生物素类似物形成亲和复合物的连接元件。
3.本发明第三方面提供了一种生物磁性微球，在本发明第一方面提供的所述生物磁性微球基础上，进一步地，所述生物素或者生物素类似物作为连接元件，进一步通过亲和复合物结合作用连接亲和素或亲和素类似物。
所述生物磁性微球也成为亲和素磁性微球或者亲和素磁珠。
所述亲和素或亲和素类似物既可以作为纯化介质，也可以作为连接元件进一步连接其它类型的纯化介质。其中，所述生物素或生物素类似物与所述亲和素或所述亲和素类似物之间形成亲和复合物的结合作用。
优选方式之一，在本发明第一方面提供的所述生物磁性微球基础上，进一步地，还包括与所述生物素相结合的亲和素。其中，生物素与亲和素之间形成亲和复合物的结合作用。也即：所述生物磁性微球的聚合物的支链末端连接有生物素；所述纯化介质为亲和素，并与所述生物素之间形成亲和复合物的结合作用。
优选方式之一，所述亲和素为链霉亲和素、改性链霉亲和素、链霉亲和素类似物中任一项或其组合。
4.本发明第四方面提供了一种生物磁性微球，在本发明第三方面提供的所述生物磁性微球基础上，更进一步地，还包括与所述亲和素或亲和素类似物相连接的亲和蛋白。此时生物素或生物素类似物、亲和素或亲和素类似物均作为连接元件，两者之间形成亲和复合物结合作用；所述亲和蛋白既可作为纯化介质，也可作为连接元件，优选地作为纯化介质。
所述生物磁性微球也成为亲和蛋白磁性微球或者亲和蛋白磁珠。
优选方式之一，在本发明第二方面提供的所述生物磁性微球基础上，所述纯化介质为亲和蛋白，所述生物磁性微球还包括与所述亲和蛋白相连接的亲和素，以及与所述亲和素相结合的生物素，所述生物连接在所述聚合物的支链上；其中，纯化介质通过连接元件连接到所述聚合物支链处，所述连接元件中包括生物素与亲和素形成的亲和复合物。
优选方式之一，所述亲和蛋白为蛋白A、蛋白G、蛋白L之一，或其改性蛋白。
5.本发明第五方面提供了一种本发明第一方面提供的所述生物磁性微球的制备方法(参考图3)，包括以下步骤：
(1)对磁性微球本体进行化学修饰，将氨基引入到磁性微球本体的外表面，形成氨基修饰磁性微球A；当所述磁性微球本体为SiO2包裹的磁性材料时，所述偶联剂优选为氨基化硅烷偶联剂。
优选方式之一，利用偶联剂对磁性微球本体进行化学修饰。
当所述磁性微球本体为SiO2包裹的磁性材料时，可利用硅烷偶联剂对磁性微球本体进行化学修饰。所述硅烷偶联剂优选为氨基化硅烷偶联剂。
(2)利用羧基与氨基之间的共价反应将丙烯酸分子共价偶联到所述磁性微球A的外表面，引入碳碳双键，形成含碳碳双键磁性微球B。
(3)在不加交联剂的条件下，利用碳碳双键的聚合反应，将丙烯酸类单体分子(如丙烯酸钠)进行聚合，获得的丙烯酸类聚合物具有线性主链和含有功能基团的支链，聚合物通过线性主链的一端共价偶联于磁性微球B的外表面，形成丙烯酸类聚合物修饰磁性微球C。
所述丙烯酸类单体分子、聚合物支链的功能基团的定义见“名词和术语”部分。
优选地，所述功能基团为羧基、羟基、氨基、巯基、甲酸盐、铵盐、羧基的盐形式、氨基的盐形式、甲酸酯基，或前述功能基团的组合；所述“功能基团的组合”指一个磁性微球的外表面的所有聚合物的所有支链所含有的功能基团，其种类可以为一种或一种以上。与第一方面定义的“功能基团的组合”的含义是一致的。
另优选地，所述功能基团为特异性结合位点。
(4)通过所述聚合物的支链含有的功能基团，将生物素或生物素类似物共价偶联到聚合物支链末端，得到结合有生物素或生物素类似物的生物磁性微球(一种生物素磁性微球)。
6.本发明第六方面提供了一种本发明第二方面提供的所述生物磁性微球的制备方法，包括以下步骤：
(i)提供权利要求1所述生物磁性微球；可以采用第五方面的步骤(1)～(4)进行制备。
(ii)将纯化介质与所述生物磁性微球的聚合物支链末端的生物素或生物素类似物相连接，得到结合有纯化介质的生物磁性微球。
7.本发明第七方面提供了一种本发明第二方面提供的所述生物磁性微球的制备方法，包括以下步骤：
(i)提供权利要求1所述生物磁性微球；可采用第五方面的步骤(1)～(4)进行制备。
(ii)以亲和素或亲和素类似物与纯化介质的共价连接复合物(例如亲和素-纯化介质共价连接复合物)作为提供纯化介质的原料，将其结合到聚合物支链末端，所述生物素或生物素类似物与所述亲和素或亲和素类似物之间形成亲和复合物的结合作用，获得带有纯化介质的生物磁性微球。
独立地可选地，包括(6)磁铁沉降生物磁性微球，去除液相，清洗。
独立地可选地，包括所述纯化介质的更换，可以通过更换所述亲和素或亲和素类似物与纯化介质的共价连接复合物实现。
8.本发明第八方面提供了一种本发明第四方面提供的所述生物磁性微球的制备方法(举例如图3)，包括以下步骤：
(1)对磁性微球本体进行化学修饰，将氨基引入到磁性微球本体的外表面，形成氨基修饰磁性微球A；当所述磁性微球本体为SiO2包裹的磁性材料时，所述偶联剂优选为氨基化硅烷偶联剂。
优选方式之一，利用偶联剂对磁性微球本体进行化学修饰。
当所述磁性微球本体为SiO2包裹的磁性材料时，可利用硅烷偶联剂对磁性微球本体进行化学修饰。此时，所述偶联剂优选为氨基化硅烷偶联剂。
(2)利用羧基与氨基之间的共价反应将丙烯酸分子共价偶联到所述磁性微球A的外表面，引入碳碳双键，形成含碳碳双键磁性微球B。
(3)在不加交联剂的条件下，利用碳碳双键的聚合反应，将丙烯酸类单体分子(如丙烯酸钠)进行聚合，获得的丙烯酸类聚合物具有线性主链和含有功能基团的支链，聚合物通过线性主链的一端共价偶联于磁性微球B的外表面，形成丙烯酸类聚合物修饰磁性微球C。
所述功能基团的优选实施方式之一为特异性结合位点。
所述功能基团的其他优选方式与上述第一方面一致。
(4)通过所述聚合物的支链含有的功能基团，共价地偶联生物素，得到生物素修饰的生物磁性微球D(一种生物素磁性微球)。
(5)通过生物素与亲和素之间的特异性结合作用，将亲和素-亲和蛋白共价连接复合物E结合到聚合物支链末端，生物素与亲和素之间形成亲和复合物的结合作用，获得生物磁性微球F(所述生物磁性微球F结合有亲和蛋白，是一种亲和蛋白磁性微球)。
独立地可选地包括(6)磁铁沉降生物磁性微球F，去除液相，清洗。
还独立地可选地包括步骤(7)，更换所述亲和素-亲和蛋白共价连接复合物E。
9.本发明第九方面提供了本发明第一至第四方面所述生物磁性微球在蛋白类物质分离纯化中的应用。
优选方式之一，所述生物磁性微球在抗体类物质分离纯化中的应用。
所述抗体类物质指含有抗体、抗体片段的蛋白类物质，包括但不限于抗体、抗体片段、抗体融合蛋白、抗体片段融合蛋白。
所述纯化介质通过含有亲和复合物的连接元件连接到所述聚合物的支链末端时，所述应用还可选地包括生物磁性微球的再生使用，也即包括纯化介质的更换后再利用。
10.本发明第十方面提供本发明第一方面至第四方面所述生物磁性微球在抗体类物质分离纯化中的应用，特别是在抗体、抗体片段、抗体融合蛋白、抗体片段融合蛋白分离纯化中的应用。
所述纯化介质为亲和蛋白。
优选方式之一，所述亲和蛋白以生物素-亲和素-亲和蛋白的方式连接于聚合物支链。
所述亲和蛋白通过含有亲和复合物的连接元件连接到所述聚合物的支链末端时(比如第四方面所述生物磁性微球)，所述应用还可选地包括生物磁性微球的再生使用，也即包括亲和蛋白的更换后再利用。
11.本发明第十一方面提供了一种生物磁性微球。所述磁性微球本体外表面具有至少一种带有线性主链和支链的聚合物，所述线性主链的一端固定于磁性微球本体外表面，聚合物的其他端游离于磁性微球本体外表面，所述磁性微球的聚合物的支链末端连接有纯化介质；所述纯化介质选自亲和素型标签、多肽型标签、蛋白型标签、抗体型标签、抗原型标签或者其组合。
优选方式之一，所述亲和素型标签为亲和素、可结合生物素的亲和素类似物、可结合生方式物素类似物的亲和素类似物或者其组合。
优选之一，所述亲和素为链霉亲和素、改性链霉亲和素、链霉亲和素类似物或其组合。
优选方式之一，所述多肽型标签选自下述任一种标签或者其变体：CBP标签、组氨酸标签、C-Myc标签、FLAG标签、Spot标签、C标签、Avi标签、Streg标签、包含WRHPQFGG序列的标签、包含WRHPQFGG的变体序列的标签、包含RKAAVSHW序列的标签、包含RKAAVSHW的变体序列的标签及其组合；所述Streg标签中含有WSHPQFEK或其变体。
优选方式之一，所述蛋白型标签选自下述任一种标签或者其变体：亲和蛋白、SUMO标签、GST标签、MBP标签及其组合。
优选方式之一，所述磁性微球本体外表面具有至少一种带有线性主链和支链的聚合物，所述线性主链的一端共价地固定于磁性微球本体外表面，聚合物的其他端游离于磁性微球本体外表面；所述磁性微球的聚合物的支链末端连接有亲和蛋白。
优选地，进一步，所述亲和蛋白与聚合物线性主链之间的支链骨架存在亲和复合物的结合作用。
更优选之一，所述亲和蛋白选自蛋白A、蛋白G、蛋白L、改性蛋白A、改性蛋白G、改性蛋白L或其组合。
本发明的主要优点和积极效果包括：
本发明的核心之一在于生物磁性微球结构，在磁性微球本体的外表面，共价地固定具有线性主链的聚合物分子，这些聚合物分子还带有大量功能化的支链，所述功能化的支链连接有纯化介质(包括但不限于生物素、亲和素、亲和蛋白、多肽标签、蛋白标签等)。通过上述结构，在生物磁性微球的外表面提供大量的悬挂于聚合物线性主链侧端的纯化介质，既避免因传统网状结构导致的高滞留比例，还克服比表面积的局限能够提供大量的目标物(如抗体)结合位点。其中，纯化介质的种类可根据待纯化物质的种类进行选择。当纯化介质以亲和复合物的形式，以一种非共价的强相互作用连接于聚合物的支链时；进一步地，纯化介质(如亲和蛋白)与聚合物线性主链之间的支链骨架还可以存在亲和复合物的结合作用，使得纯化介质(如亲和蛋白)可以被便捷地更换。当带分离纯化的目标物为抗体类蛋白时，纯化介质通常为亲和蛋白。结合磁性微球的制备及原理部分的阐述进行理解。
本发明的核心还在于上述生物磁性微球结构的构建过程(制备方法)：通过外表面化学修饰，在磁珠外表面(生物磁性微球本体外表面)提供若干的结合位点，然后在磁珠外表面的单个结合位点共价连接聚合物分子，聚合物分子通过线性主链的一端与磁珠外表面的单个结合位点共价连接，沿着线性主链分布有大量的侧支链，侧支链中携带有新生的结合位点，从而实现结合位点的多倍、数十倍、上百倍、数百倍、甚至上千倍地放大，再根据具体纯化需求在聚合物支链的新生结合位点处连接特定的纯化介质，以实现对应特定目标分子(特别是生物化学分子，包括但不限于抗体类蛋白分子)的捕获。此外，生物磁性微球的单个结合位点，既可以仅共价连接一条线性聚合物主链，也可以共价连接两条或更多条线性主链，以不会导致链堆积以致于滞留比例增大为宜。
优选地，一个结合位点仅引出一条线性主链，此时能够为线性主链提供较大的活动空间。
另优选地，一个结合位点仅引出两条线性主链，尽可能地为线性主链提供较大的活动空间。
本发明的主要优点和积极效果还包括：
(1)本发明的结构设计，通过携带大量支链特殊结构的聚合物包裹磁性微球表面，克服比表面积的局限提供大量的纯化介质结合位点，将磁性微球表面可结合的纯化介质的数量多倍、十多倍、数十倍、上百倍、数百倍、甚至上千倍地放大，进而实现高通量的结合目标物，优选目标物为蛋白类物质；使得生物磁性微球能高效地将目标物(如目标蛋白，包括但不限于抗体、抗体片段、或其融合蛋白)从混合体系中捕获到磁性微球上，实现高通量地结合，也即实现高通量的分离。
(2)可以利用聚合物链本身的柔顺性，聚合物链能够在反应纯化混合体系中柔性摆动，扩大纯化介质的活动空间，增大对蛋白的捕获速率和结合量，促进目标物的快速、充分结合，实现高效率、高通量。
(3)本发明的结构设计，使得生物磁性微球能在洗脱时实现被纯化的目标物(如目标蛋白，包括但不限于抗体、抗体片段、或其融合蛋白)的高效洗脱，有效减少目标物的滞留时间和滞留比例，实现高效率和高产率。纯化介质可以连接在聚合物的支链末端，一方面，聚合物的结构可以不形成网状结构，不导致支链堆积，可避免出现不连续空间和死角，避免传统网状结构导致的高滞留时间和高滞留比例；另一方面，聚合物的支链进一步起到空间间隔作用，使纯化介质能够充分分布在混合体系中，远离磁性微球表面以及聚合物的内部骨架，既增大捕获目标物的效率，还可以在后续洗脱步骤时，有效减少目标物的滞留时间和滞留比例，实现高通量、高效率、高比例的分离。本发明的结构设计既能利用线性主链的高柔顺性，又兼具支链数量的高倍数放大优势，更好地实现高速率、高通量的结合，高效率、高比例(高产率)的分离。
(4)本发明生物磁性微球的纯化介质(如亲和蛋白)可以通过亲和复合物的方式，以一种非共价的强结合力连接于磁珠外表面的聚合物支链末端；在需要更新、更换纯化介质(如亲和蛋白)时，能够方便、快捷地将纯化介质从微球上洗脱并重新结合新的纯化介质，快速恢复磁性微球纯化性能，使得生物磁性微球可以多次再生使用，从而降低分离纯化成本。
(5)本发明生物磁性微球操作使用便捷。将结合了目标物的磁性微球从体系中分离时，操作便捷，仅需利用一小块磁铁便能高效地操纵磁性微球的聚集状态和位置，实现磁性微球在溶液中的快速分散或快速沉聚，使目标物(如抗体)的分离纯化变得简单、快捷，无需使用高速离心机等大型实验设备，大大地降低分离纯化成本。
(6)本发明提供的生物磁性微球用途广泛，纯化介质具有可选择性。可根据具体的纯化底物的种类，在磁性微球系统中灵活地搭载相应的纯化介质，实现对特定目标分子(特别是蛋白类物质)的捕获。比如，可针对性的选用亲和蛋白，普遍地、大规模的应用于抗体类物质，包括但不限于抗体、抗体片段、或其融合蛋白的分离纯化。
附图说明
图1.本发明第一方面提供的生物磁性微球的结构示意图。其中，磁性微球本体以SiO2包裹的Fe3O4为例，并以生物素作为纯化介质示意。图中，聚合物分子数(4个)仅为简明示意起见，并非意味着磁性微球外表面的聚合物分子数量局限于4个，而是可以根据制备过程中各原料的含量进行控制和调节。同理，悬挂于线性主链侧端的支链的数量也仅起示意作用，并非对本发明聚合物分子侧支链数量的限定。
图2.本发明第四方面提供的生物磁性微球的结构示意图。以蛋白A作为纯化介质示意，蛋白A通过“生物素-亲和素-蛋白A的方式”结合在刷状结构的支链末端。其中，生物磁性微球本体以SiO2包裹的Fe3O4为例。图中，聚合物分子数和主链侧端的支链数量，仅为示意，并非对本发明聚合物分子侧支链数量的限定。
图3.本发明第四方面提供的生物磁性微球的制备方法流程图。其中，从氨基修饰磁性微球A至生物磁性微球D的制备过程对应第五方面提供的生物磁性微球的制备方法。
图4.生物磁性微球D(一种生物素磁珠)与蛋白A-eGFP-亲和素结合前与结合后实验结果。RFU值测试结果，孵育1次。通过体外蛋白合成体系制备蛋白A-eGFP-亲和素(SPA-eGFP-亲和素)，得到IVTT反应后的上清液(简记为IVTT上清液)，与生物磁性微球D结合前与结合后，溶液RFU值变化对比。两种蛋白A-eGFP-亲和素中，其中，编号1对应的亲和素为Streptavidin，编号2对应的亲和素为Tamvavidin2。“Total”对应结合前IVTT上清液RFU值(生物磁性微球处理前)，“Supernatant”对应结合后IVTT上清液RFU值(生物磁性微球处理后)。
图5.制备生物磁性微球F(一种蛋白A磁珠)的实验结果：RFU值测试结果；蛋白A-eGFP-亲和素饱和结合。将生物磁性微球D反复地与表达蛋白A-eGFP-亲和素的IVTT反应后所得溶液(简记为IVTT上清液)结合，得到被蛋白A-eGFP-亲和素饱和结合的生物磁性微球F。其中，1对应的亲和素为Streptavidin，2对应的亲和素为Tamvavidin2，supernatant对应未经生物磁性微球处理的IVTT上清液；Flow-through1(流穿液1)、Flow-through2(流穿液2)、Flow-through3(流穿液3)分别对应磁性微球连续与亲和素-蛋白A孵育(捕获结合)、洗脱(解结合释放)三次，每次用相同来源、相同用量的IVTT上清液，依次获得的流穿液1、2、3。
图6.生物磁性微球F分离纯化抗体的实验结果，生物磁性微球F中的亲和素为Streptavidin。生物磁性微球F与抗体IgG溶液孵育后进行洗脱，将抗体IgG从抗体溶液中捕获分离、洗脱释放到洗脱液中，相应的含纯化抗体的洗脱液的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测试结果。其中，泳道1,2,3,4分别对应SPA-磁性微球的柱床体积为2微升、6微升、18微升、54微升时的抗体洗脱条带，泳道5为阳性对照市售来源的生工生物工程(上海)股份有限公司(以下简称：生工公司)protein A琼脂糖柱床体积为7.5微升的抗体洗脱条带。其中M对应Marker分子量标记。
图7.生物磁性微球F重复使用的实验结果，生物磁性微球F中的亲和素为Streptavidin。生物磁性微球F与抗体溶液进行孵育(结合抗体)、洗涤、洗脱(释放抗体)，重复三次，对洗脱液进行SDS-PAGE电泳测试的结果。其中，泳道1,2,3,4分别对应SPA-磁性微球的柱床体积为2微升、6微升、18微升、54微升时的抗体洗脱条带，泳道5为阳性对照市售来源的生工生物工程(上海)股份有限公司(以下简称：生工公司)protein A琼脂糖柱床体积为7.5微升的抗体洗脱条带。其中M对应Marker分子量标记。
图8.生物磁性微球再生的实验结果：荧光相对值测试结果；采用蛋白A-eGFP-Tamvavidin2。将生物磁性微球D反复地与蛋白A-eGFP-亲和素的IVTT反应后所得溶液结合，得到被蛋白A-eGFP-亲和素饱和结合的生物磁性微球F(1)。而后将该蛋白A-eGFP-亲和素从生物磁性微球D上洗脱下来，第二次将该生物磁性微球D与新鲜蛋白A-eGFP-亲和素的IVTT反应后所得溶液结合，得到第二次被蛋白A-eGFP-亲和素饱和结合的生物磁性微球F(2)。重复上述步骤得到第三次被蛋白A-eGFP-亲和素饱和结合的生物磁性微球F(3)。其中，supernatant对应未经生物磁性微球处理的IVTT上清液；流穿液1(Flow-through1)、流穿液2(Flow-through2)、流穿液3(Flow-through3)分别对应磁性微球连续与亲和素-蛋白A孵育三次，每次用相同的IVTT上清液(新吸取)，依次获得的流穿液1、2、3。
图9.生物磁性微球的再生及再生后分离纯化抗体的实验结果；采用蛋白A-eGFP-Tamvavidin2。将被蛋白A-eGFP-亲和素饱和结合的生物磁性微球F用变性缓冲液洗脱，对含有被洗脱下来的蛋白A-eGFP-亲和素的洗脱液进行SDS-PAGE测试。泳道1、2、3分别代表第一次饱和结合后洗脱，第二次饱和结合后洗脱，第三次饱和结合后洗脱，分别从生物磁性微球F上洗脱下来的含蛋白A-eGFP-亲和素的洗脱液的条带。泳道4表示第三次再生的生物磁性微球F与市售新生牛血清孵育后，用洗脱缓冲液洗脱下来的纯化抗体蛋白的条带。其中M对应Marker分子量标记。
图10.生物磁性微球G(一种ProteinG磁珠、蛋白G磁珠)对蛋白G的载量测试结果：RFU值测试结果。将生物磁性微球D与蛋白G-eGFP-亲和素的IVTT上清液孵育三次，得到被蛋白G-eGFP-亲和素饱和结合的生物磁性微球G。其中，Supernatant对应未经生物磁性微球处理的IVTT上清液；三次孵育分别得到相应的流穿液：FT1(流穿液1)、FT 2(流穿液2)、FT 3(流穿液3)。
图11.生物磁性微球G(ProteinG磁珠)分离纯化抗体的实验结果：生物磁性微球G与抗体IgG溶液孵育后进行洗脱，将抗体IgG从抗体溶液中捕获分离、洗脱释放到洗脱液中，相应的含纯化抗体的洗脱液进行SDS-PAGE测试。其中M对应Marker分子量标记。
图12.生物磁性微球H(一种带有antiEGFP纳米抗体的磁珠)结合eGFP蛋白的RFU值测试结果。将生物磁性微球H与eGFP蛋白的IVTT上清液孵育，结合eGFP蛋白。其中，Total对应未经生物磁性微球处理的IVTT上清液；Flow-through对应孵育一次的流穿液。
图13.生物磁性微球H(一种antiEGFP磁珠)分离纯化eGFP蛋白的实验结果：生物磁性微球H与eGFP蛋白溶液孵育后进行洗脱，将eGFP蛋白从原液中捕获分离、洗脱释放到洗脱液中，相应的含纯化eGFP蛋白的洗脱液的SDS-PAGE测试结果。其中，M对应Marker分子量标记。
核苷酸和/或氨基酸序列表
SEQ ID No.:1，蛋白A的核苷酸序列，长度873个碱基。
SEQ ID No.:2，tamavidin2的核苷酸序列，长度423个碱基。
SEQ ID No.:3，mEGFP的核苷酸序列，长度为714个碱基。
SEQ ID No.:4，蛋白G抗体结合区域的核苷酸序列，长度为585个碱基。
SEQ ID No.:5，纳米抗体anti-eGFP的氨基酸序列，长度为117个氨基酸。
SEQ ID No.:6，mScarlet的核苷酸序列，长度为693个碱基。
具体实施方式
下面结合具体实施方式和实施例，进一步阐述本发明，请一并参阅附图。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先按照、参考上文所述的具体实施方式指引的条件，然后可按照常规条件，例如“Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)”、《无细胞蛋白合成实验手册》“Edited by Alexander S.Spirin and JamesR.Swartz.Cell-free protein synthesis:methods and protocols[M].2008”等文献中所述的实验条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另外说明，否则本发明中提及的百分比和份数是重量百分比和重量份数。
如无特别说明，则本发明实施例中所用的材料和试剂均为市售产品。
本申请中的温度单位如无特殊说明，均为摄氏度(℃)。
名词和术语
以下是针对本发明所采用的部分相关“名词”、“术语”的含义进行的解释或说明，以便于更好地理解本发明。相应的解释或说明适用于本发明的全文，既适用于下文，也适用于上文。本发明中涉及引用文献时，相关术语、名词、短语在引用文献中的定义也一并被引用，但是，与本发明中的定义相冲突时，以本发明中的定义为准。在引用文献中的定义与本发明中的定义发生冲突时，并不影响所引用的成分、物质、组合物、材料、体系、配方、种类、方法、设备等以引用文献中确定的内容为准。
磁珠：具有细小粒径的强磁性或可被强磁性化的微球，也可描述为磁珠，直径尺寸优选0.1μm～1000μm。本发明的磁珠实例包括但不限于：磁性微球A、磁性微球B、磁性微球C、生物磁性微球D(一种生物素磁珠)、生物磁性微球F(一种蛋白A磁珠)、生物磁性微球G(一种蛋白G磁珠)、生物磁性微球H(一种带有antiEGFP纳米抗体的磁珠)、生物磁性微球K(抗体磁珠)。
磁性微球本体：具有被修饰位点的磁珠(具有可结合位点的磁性微球)。例如二氧化硅包裹的磁性材料颗粒，更具体地如氨基化的二氧化硅包裹的磁性材料颗粒。
磁性微球A：氨基修饰磁性微球。
磁性微球B：含碳碳双键的磁性微球。
磁性微球C：丙烯酸类聚合物修饰磁性微球。
生物素磁珠：结合有生物素或生物素类似物的磁珠，能够特异性结合带有亲和素型标签的物质。其优点包括，目标蛋白用亲和素或亲和素的蛋白突变体进行标记后，能够以融合蛋白的方式一体化表达，应用方式简便。也称为生物素磁性微球。这里的生物素或生物素类似物可以作为一种纯化介质，也可以作为连接元件。
生物磁性微球D：一种结合有生物素或生物素类似物的磁性微球，一种生物素磁珠。这里的生物素可以作为一种纯化介质，也可以作为连接元件。
亲和素磁珠：结合有亲和素或亲和素类似物的磁珠。能够特异性结合带有生物素型标签的物质。也称为亲和素磁性微球。
生物磁性微球F：结合有蛋白A的磁性微球，一种蛋白A磁珠。可以由生物素修饰的生物磁性微球D与亲和素-蛋白A共价连接复合物E结合而成。
亲和蛋白磁珠：结合有亲和蛋白的磁性微球，可以用于分离纯化抗体类物质。也称为亲和蛋白磁性微球。
生物磁性微球G：结合有蛋白G的磁性微球，一种蛋白G磁珠。例如，可以由生物素修饰的生物磁性微球D与亲和素-蛋白G共价连接复合物结合而成。
生物磁性微球K：结合抗体型标签的磁珠。可以用于分离纯化能够与之特异性结合的目标物。也称为抗体磁性微球或抗体磁珠。
纳米抗体磁珠：结合由纳米抗体的磁珠。可以用于分离纯化能够与之特异性结合的目标物。也称为纳米抗体磁性微球。
生物磁性微球H：一种纳米抗体磁珠，一种结合有纳米抗体antiEGFP的磁性微球(一种antiEGFP磁珠)。可以由亲和素-antiEGFP共价连接复合物结合而成。
聚合物，本发明中广义地包括寡聚物和高聚物，至少具有三个结构单元或者分子量至少为500Da(所述分子量可以采用适合的表征方式，比如数均分子量、重均分子量、粘均分子量等)。
聚烯烃链：指仅由碳原子共价连接而成的不含杂原子的聚合物链。本发明中，主要涉及梳状结构中的聚烯烃主链；比如丙烯酸类聚合物的线性主链。
丙烯酸类聚合物：指具有-C(COO-)-C-单元结构的均聚物或共聚物，所述共聚物的共聚形式没有特别限制，以能够提供线性主链和计量的侧基COO-为宜；所述丙烯酸类聚合物的线性主链中允许含有杂原子。其中，碳碳双键上还允许存在其他的取代基，只要不影响聚合反应的进行即可，例如甲基取代基(对应-CH3C(COO-)-C-)。其中，COO-的存在形式可以为-COOH，也可以为盐形式(如钠盐)，还可以为甲酸酯形式(优选甲酸烷基酯，例如甲酸甲酯-COOCH3，甲酸乙酯-COOCH2CH3；还可以为甲酸羟乙酯-COOCH2CH2OH)等。-C(COO-)-C-单元结构的具体结构形式包括但不限于-CH(COOH)-CH2-、-CH(COONa)-CH2-、-MeC(COOH)-CH2-、-MeC(COONa)-CH2-、-CH(COOCH3)-CH2-、-CH(COOCH2CH2OH)-CH2-、-MeC(COOCH3)-CH2-、-MeC(COOCH2CH2OH)-CH2-等中任一种或其任意组合。其中，Me为甲基。一个聚合物分子的线性主链上，可以仅有一种上述单元结构(对应均聚物)，也可以含有两种或两种以上的单元结构(对应共聚物)。
丙烯酸类单体分子：可用于合成上述丙烯酸类聚合物的单体分子，具有C(COO-)＝C的基本结构，举例如，CH(COOH)＝CH2、CH(COONa)＝CH2、CH3C(COOH)＝CH2、CH3C(COONa)＝CH2、CH(COOCH3)＝CH2、CH(COOCH2CH2OH)＝CH2、CH3C(COOCH3)＝CH2、CH3C(COOCH2CH2OH)＝CH2等。
支链：本发明中连接于支化点且具有独立末端的链。本发明中支链、侧支链具有相同含义，可以互换使用。本发明中，支链是指聚合物线性主链上键合的侧链或侧基，对于支链的长度、大小无特殊要求，可以是羧基、羟基、氨基等短支链，也可以是包含原子数较多的长支链。支链的结构无特殊要求，可以是线型的，也可以是具有分支结构的支链。支链也可以包含另外的侧链或侧基。支链的数量、长度、大小、再分支的程度等结构特征，以尽量不形成网状结构，不导致支链堆积以致于滞留比例增大为宜，此时可以顺利发挥线性主链的柔性摆动。
支链骨架：支链骨架由骨架原子以共价键或者非共价结合方式依次相连而成，从支链末端依次连接到聚合物的主链。通过支链骨架，聚合物末端的功能性基团，被连接到聚合物的主链。支链骨架与主链的交叉点也即引出支链的支化点。比如，纯化介质与聚合物线性主链之间的支链骨架，以亲和蛋白作为纯化介质为例，聚合物支链末端的亲和蛋白可以依次通过亲和素、生物素、丙二胺残基(-NH-CH2CH2CH2-NH-)、羰基(羧基进行酰胺化反应后的残基)而连接到聚合物的聚烯烃主链。
支链末端，包括所有支链的末端。对于线性主链，除了固定在磁性微球本体的一端外，线性主链的另外一端必然连接于一个支化点，因此，也被广义地包括在本发明的“支链末端”范畴之内。因此，本发明的连接于磁性微球本体外表面的聚合物至少具有1个支化点。
聚合物支链的功能基团：是指具有反应活性，或者经活化后具有反应活性，能够直接地与其他原料的反应性基团发生共价反应，或者经活化后与其他原料的反应性基团发生共价反应，进而生成共价键连接。聚合物支链的功能基团，其优选方式之一为特异性结合位点。
直接连接方式，指不借助于间隔原子，直接发生相互作用的连接方式。所述相互作用的形式包括但不限于：共价方式、非共价方式或者其组合方式。
间接连接方式，指借助于至少一个连接元件而形成的连接方式，此时涉及至少一个间隔原子。所述连接元件包括但不限于：连接肽、亲和复合物连接等。
固定、固定于、固定有、固定在等“固定”方式，指共价的结合方式。
带有、连接有、连接于、连接在、结合、捕捉、捕获到等“连接”/“结合”方式，没有特别限定，包括但不限于共价方式、非共价方式等方式。
共价方式：以共价键直接键合的方式。所述共价方式中包括但不限于动态共价方式，所述动态共价方式指以动态共价键直接键合的方式。
共价键：包括酰胺键、酯键等常见的共价键，还包括具有可逆性质的动态共价键。所述共价键中包括动态共价键。动态共价键是一种具有可逆性质的化学键，包括但不限于亚胺键、酰腙键、二硫键或者其组合。化学领域的技术人员可以理解其含义。
非共价方式：包括但不限于配位结合、亲和复合物相互作用、静电吸附、氢键、π-π重叠作用、疏水相互作用等超分子相互作用方式。
超分子相互作用：包括但不限于配位结合、亲和复合物相互作用、静电吸附、氢键、π-π重叠作用、疏水相互作用、及其组合。
连接元件，也称为连接基团，指用于连接两个或两个以上不相邻基团的元件，至少包括一个原子。所述连接元件与相邻基团之间的连接方式，没有特别限定，包括但不限于共价方式、非共价方式等方式。所述连接元件的内部连接方式，没有特别限定，包括但不限于共价方式、非共价方式等方式。
共价连接元件：从连接元件一端到另一端的间隔原子之间均以共价方式相连接。
特异性结合位点：本发明中，所述特异性结合位点，是指聚合物支链上的具备结合功能的基团或结构部位，该基团或结构部位具备对于某种特定目标物的特异性识别、结合功能，特异性结合可以通过配位、络合、静电力、范德华力、氢键、共价键等结合作用或者其他相互作用实现。
共价连接复合物：通过共价方式直接或间接地连接而成的化合物，也称为共价连接物。
亲和素-纯化介质共价连接复合物：以共价方式连接而成的化合物，一端为亲和素，另一端为纯化介质，两者通过共价键直接连接，或者通过共价连接元件间接相连接。
亲和素-亲和蛋白共价连接复合物E：以亲和蛋白作为纯化介质的亲和素-纯化介质共价连接复合物；或称亲和素-亲和蛋白复合物E；以共价方式连接而成的化合物，一端为亲和素，另一端为亲和蛋白，两者通过共价键直接连接，或者通过共价连接基间接相连。所述共价连接方式包括但不限于共价键、连接肽，等。如：链霉亲和素-蛋白A复合物，链霉亲和素-蛋白A的融合蛋白，链霉亲和素-增强型绿色荧光蛋白-蛋白A的融合蛋白(Protein A-eGFP-Streptavidin)，Protein A-eGFP-Tamvavidin2，ProteinG-eGFP-亲和素融合蛋白，ProteinG-eGFP-Tamvavidin2融合蛋白等。
亲和复合物：由两个或两个以上的分子通过特异性结合作用，依靠极强的亲和力而形成的非共价连接的复合物，比如：生物素(或生物素类似物)与亲和素(或亲和素类物)的相互作用所形成的复合物。生物素与亲和素的亲和复合物的结合方式为本领域技术人员所熟知。
纯化底物，也称为目标物，待从混合体系中分离出来的物质。本发明中的纯化底物没有特别限制，但优选纯化底物为蛋白类物质(此时也称为目标蛋白)。
纯化介质，能够和纯化底物进行特异性结合，从而捕捉纯化底物，进而能够将纯化底物从混合体系中分离出来。连接于本发明聚合物的支链末端的纯化介质，为一种具有结合纯化底物功能的功能元件。当纯化介质以共价方式与相邻基团连接时，则表现为一种具有结合纯化底物功能的功能基。
亲和蛋白：与目标蛋白特异性结合，并具有较高亲和结合力，举例如蛋白A，蛋白G，蛋白L，改性蛋白A，改性蛋白G，改性蛋白L等等。
蛋白A：Protein A，一种42kDa的表面蛋白，最初发现于金黄色葡萄球菌的细胞壁中。它由spa基因编码，其调控由DNA拓扑结构、细胞渗透压和一个称为ArlS-ArlR的双组分系统控制。由于其结合免疫球蛋白的能力，已被用于生物化学领域相关研究。可与抗体Fc特异性结合，主要用于抗体纯化，可选自任意市售产品。本发明中所称“Protein A”、“SPA”，以及“蛋白A”可互换。
蛋白G：Protein G，一种免疫球蛋白结合蛋白，在C组和G组链球菌中表达，与蛋白A相似，但具有不同的结合特异性。它是一种65kDa(G148蛋白G)和58kDa(C40蛋白G)的细胞表面蛋白，通过与抗体或某些功能蛋白特异性结合，主要用于抗体纯化，可选自任意市售产品。
蛋白L：Protein L，仅限于特异性结合那些含有kappa(κ)轻链的抗体。在人类和老鼠，大多数抗体分子包含κ轻链和其余λ轻链。主要用于抗体纯化，可选自任意市售产品。
生物素：biotin，可与亲和素结合，且结合力强、特异性好。
亲和素：avidin，可与生物素结合，且结合力强、特异性好，如链霉亲和素(Streptavidin，简称SA)、其类似物(如Tamvavidin2，简称Tam2)、其改性产物、其突变体等。
生物素类似物，指能够与亲和素形成类似于“亲和素-生物素”特异性结合的非生物素分子，优选之一为多肽或蛋白，比如IBA公司开发的
Figure BDA0002802981900000151
系列中使用的含有WSHPQFEK序列的多肽(如
Figure BDA0002802981900000152
II、
Figure BDA0002802981900000153
等)，以及类似的含有WNHPQFEK序列的多肽。WNHPQFEK可视为WSHPQFEK的突变序列。
亲和素类似物，指能够与生物素形成类似于“亲和素-生物素”特异性结合的非亲和素分子，优选之一为多肽或蛋白。所述亲和素类似物包括但不限于亲和素的衍生物、亲和素的同源性物质(同源体)、亲和素的变体等。所述亲和素类似物，例如Tamavidin1、Tamavidin2，等(可参考文献：FEBS Journal,2009,276,1383-1397)。
生物素型标签：所述生物素型标签中含有以下单元：生物素、可结合亲和素的亲和素类似物、可结合亲和素类似物的亲和素类似物，及其组合。生物素型标签能够特异性结合亲和素、亲和素类似物或者其组合。因此可以用来分离纯化包括但不限于被亲和素型标签标记的蛋白类物质。
亲和素型标签：所述亲和素型标签中含有以下单元：亲和素、可结合生物素的亲和素类似物、可结合生物素类似物的亲和素类似物，及其组合。亲和素型标签能够特异性结合生物素、生物素类似物或者其组合。因此可以用来分离纯化包括但不限于被生物素型标签标记的蛋白类物质。
多肽型标签：本发明的多肽型标签，指含有多肽标签或多肽标签的衍生物的标签。所述多肽标签指由氨基酸单元组成的多肽结构的标签，所述氨基酸可以为天然氨基酸，也可以为非天然氨基酸。
蛋白型标签：本发明的多肽型标签，包括含有蛋白标签或蛋白标签的衍生物的标签。所述蛋白标签指由氨基酸单元组成的蛋白结构的标签，所述氨基酸可以为天然氨基酸，也可以为非天然氨基酸。
抗体型标签：本发明的抗体型标签，指含有抗体类物质的标签，其能够特异性结合相应的目标物，所述目标物如抗原。所述抗体型标签的举例还包括可以特异性结合eGFP蛋白的antiEGFP纳米抗体。
抗原型标签：本发明的抗原型标签，指含有抗原类物质的标签，其能够特异性结合抗体类物质。
肽，是两个或两个以上氨基酸以肽键相连的化合物。本发明中，肽与肽段具有同等含义，可互换使用。
多肽，10～50个氨基酸组成的肽。
蛋白，50个以上的氨基酸组成的肽。融合蛋白也是一种蛋白。
多肽的衍生物、蛋白的衍生物：本发明涉及的任一种多肽或蛋白，如无特别说明(例如指定具体序列)，应理解还包括其衍生物。所述多肽的衍生物、蛋白的衍生物，至少包括含有C端标签、含有N端标签、含有C端及N端标签。其中，C端指COOH端，N端指NH2端，本领域技术人员理解其含义。所述标签可以为多肽标签，也可以为蛋白标签。一些标签举例包括但不限于，组氨酸标签(一般含有至少5个组氨酸残基；比如6×His,HHHHHH；又比如8×His标签)、Glu-Glu、c-myc表位(EQKLISEEDL)、
Figure BDA0002802981900000161
标签(DYKDDDDK)、蛋白C(EDQVDPRLIDGK)、Tag-100(EETARFQPGYRS)、V5表位标记(V5 epitope,GKPIPNPLLGLDST)、VSV-G(YTDIEMNRLGK)、Xpress(DLYDDDDK)、血凝素(hemagglutinin,YPYDVPDYA)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、硫氧还原蛋白(thioredoxin)、组氨酸位点硫氧还原蛋白(His-patchthioredoxin)、IgG结合域(IgG-binding domain)、内含肽-几丁质结合域(intein-chitinbinding domain)、T7基因10(T7 gene 10)、谷胱甘肽S-转移酶(glutathione-S-transferase,GST)、绿色荧光蛋白(GFP)、麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)等。
蛋白类物质，本发明中，广义地指含有多肽或蛋白片段的物质。比如，多肽衍生物、蛋白衍生物、糖蛋白等也包含在蛋白类物质的范畴之内。
抗体、抗原：本发明涉及的抗体、抗原，如无特别说明，应理解还包括其结构域、亚基、片段、单链、单链片段、变体。比如，涉及“抗体”，如无特别说明，还包括其片段、重链、缺失轻链的重链(如纳米抗体)、互补决定区(CDR)等。比如，涉及“抗原”，如无特别说明，还包括抗原决定基(epitope)、表位肽。
抗体类物质，本发明中，包括但不限于抗体、抗体的片段、抗体的单链、单链的片段、抗体融合蛋白、抗体片段的融合蛋白等及其衍生物与变体，只要能够产生抗体-抗原的特异性结合作用即可。
抗原类物质，本发明中，包括但不限于，本领域技术人员所知的抗原以及能够发挥抗原功能、特异性结合抗体类物质的物质。
抗蛋白的抗体：指能够与某一蛋白进行特异性结合的抗体。
抗荧光蛋白的纳米抗体：指能够与某一荧光蛋白进行特异性结合的纳米抗体。
同源性(homology)，如没有特别说明，指具有至少50％同源性；优选至少60％同源性，更优选至少70％同源性，更优选至少75％同源性，更优选至少80％同源性，更优选至少85％同源性，更优选至少90％同源性；还比如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性。描述对象举例如本发明书提及的Ω序列的同源序列。这里的同源性指序列上的相似性，数值上可以等同相似性(identity)。
同源物，指具有同源性序列的物质，也可称为同源体。
“变体”，variant，指具有不同结构(包括但不限于进行微小变异)，但仍能保持或基本保持原有功能或性能的物质。所述变体包括但不限于核酸变体、多肽变体、蛋白变体。获得相关变体的方式包括但不限于结构单元的重组、删除或缺失、插入、移位、置换等。所述变体包括但不限于经修饰的产物、基因改造产物、融合产物等。为获得基因改造产物，进行基因改造的方式包括但不限于基因重组(对应基因重组产物)、基因删除或缺失、插入、移码、碱基置换等。基因突变产物，也称为基因突变体，属于基因改造产物的一种类型。所述变体的优选方式之一是同源体。
经修饰的产物：包括但不限于化学修饰产物、氨基酸修饰物、多肽修饰物、蛋白修饰物等。所述化学修饰产物指采用有机化学、无机化学、高分子化学等化学合成方法进行改造的产物。修饰方法举例如离子化、盐化、脱盐化、络合、解络合、螯合、解螯合、加成反应、取代反应、消除反应、插入反应、氧化反应、还原反应、翻译后修饰等修饰方法，具体举例如氧化、还原化、甲基化、去甲基化、氨基化、羧基化、硫化等修饰方法。
“突变体”，mutant，本发明中如无特别说明，指仍能保持或基本保持原有功能或性能的突变产物，对突变位点的数量没有特别限制。所述突变体包括但不限于基因突变体、多肽的突变体、蛋白的突变体。突变体是变体的一种类型。获得相关突变体的方式包括但不限于结构单元的重组、删除或缺失、插入、移位、置换等。基因的结构单位为碱基，多肽和蛋白的结构单元为氨基酸。基因突变的类型包括但不限于基因删除或缺失、插入、移码、碱基置换等。
“改性”产物，包括但不限于本发明的衍生物、经修饰的产物、基因改造产物、融合产物等，可以保持原有的功能或性能，也可以优化、改变其功能或性能。
洗脱液(以目标蛋白为例)：洗脱目标蛋白；经洗脱后，目标蛋白存在于洗脱液中。
洗涤液(以目标蛋白为例)：洗脱杂蛋白等杂质；经洗脱后，杂蛋白被洗涤液带走。
结合力：结合能力，如磁性微球与某一蛋白的结合能力。
亲和作用力：使用不同浓度梯度的底物溶液，当磁性微球只结合50％底物时的底物浓度。
IVTT：In vitro transcription and translation，体外转录与翻译系统，即为无细胞蛋白合成体系。无细胞蛋白合成体系是以外源目的mRNA或DNA为蛋白质合成模板，通过人工控制补加蛋白质合成所需的底物和转录、翻译相关蛋白因子等物质，能实现目的蛋白质的合成。本发明的无细胞蛋白合成体系无特别限制，可以是基于酵母细胞提取物、大肠杆菌细胞提取物、哺乳动物细胞提取物、植物细胞提取物、昆虫细胞提取物的无细胞蛋白合成体系的任一种或任意组合。
本发明中，“翻译相关酶”，translation-related enzymes(TRENs)，指从核酸模板到蛋白质产物合成过程中所需的酶物质，不局限于翻译过程需要的酶。核酸模板：也称为遗传模板，指作为蛋白合成模板的核酸序列，包括DNA模板、mRNA模板及其组合。
流穿液：磁珠与含目标蛋白的体系进行孵育后所收集的清液，其中含有未被磁珠捕获的残余的目标蛋白。比如，实施例2中，含亲和素-亲和蛋白的复合物的溶液，加入亲和柱，经过柱后穿出的溶液，如：流穿液1、流穿液2和流穿液3，分别表示第一次穿出的溶液，第二次穿出的溶液和第三次穿出的溶液。
RFU，相对荧光单位值(Relative Fluorescence Unit)。
eGFP：增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein)。本发明中，所述eGFP广义地包括野生型及其变体，包括但不限于野生型及其突变体。
mEGFP：eGFP的A206K突变体。
“可选地”，表示可以有，也可以无，以能够实现本发明的技术方案的为选择标准。本发明中，“可选方式”，表示只要适用于本发明的技术方案，就可以用来实施本发明。
本发明中，“优选(比如，prefer,preferable,preferably,preferred等)”、“较佳”、“更优选”、“更佳”、“最优选”等优选实施方式，不构成对发明的涵盖范围及保护范围的任何意义上的限制，并非用于限定本发明的范围和实施方式，仅用于提供一些实施方式作为举例。
本发明的描述中，对于“优选之一”、“优选方式之一”、“优选实施方式之一”、“优选例之一”、“优选例”、“在一优选的实施方式中”、“一些优选例中”、“一些优选方式中”、“优选为”、“优选”、“优选地”、“更优选”、“更优地”、“进一步优选”、“最优选”等优选方式，以及“实施方式之一”、“方式之一”、“示例”、“具体示例”、“举例如”、“作为举例”、“例如”、“比如”、“如”等示意的列举方式，同样不构成对发明的涵盖范围及保护范围的任何意义上的限制，且各方式所描述的具体特征包含于本发明的至少一个具体实施方式中。本发明中，各方式所描述的具体特征可以在任何的一个或者多个具体实施方式中以合适的方式结合。本发明中，各优选方式对应的技术特征或技术方案也可以通过任意合适的方式结合。
本发明中，“其任意组合”，在数量上表示“大于1”，在涵盖范围上表示以下情形构成的组：“任选其中一个，或者任选其中至少两个构成的组”。
本发明中，“一个或多个”、“一种或多种”等“一或多”的描述，与“至少一个”、“至少一种”、“其组合”、“或其组合”、“及其组合”、“或其任意组合”、“及其任意组合”等具有相同含义，可以互换使用，表示数量上等于“1”或“大于1”。
本发明中，采用“或/和”、“和/或”表示“任选其一或者任选其组合”，也表示至少其一。
本发明所述的“通常”、“常规”、“一般”、“经常”、“往往”等方式描述的现有技术手段，也都被引用作为本发明内容的参考，如无特别说明，可视为本发明的部分技术特征的优选方式之一，且需要注意的是，不构成对发明的涵盖范围及保护范围的任何意义上的限制。
在本发明提及的所有文献及这些文献直接引用或者间接引用的文献，都在本申请中被引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(包括但不限于实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案，只要能够用于实施本发明的即可。限于篇幅，不再一一累述。
1.本发明第一方面提供了一种生物磁性微球，所述生物磁性微球包括磁性微球本体，所述磁性微球本体外表面具有至少一种带有线性主链和支链的聚合物，所述线性主链的一端固定于磁性微球本体外表面，聚合物的其他端游离于磁性微球本体外表面，所述磁性微球的聚合物的支链末端连接有生物素或生物素类似物。
本发明第一方面的生物磁性微球，也称为生物素磁性微球或生物素磁珠。
所述生物磁性微球的一种典型结构如图1所示。
所述生物素或生物素类似物，既可以作为纯化介质，也可以作为连接元件进一步连接其它类型的纯化介质。
与目前常用的凝胶类多孔材料相比，比如琼脂糖类，大部分市售微球采用琼脂糖类材料。多孔材料拥有丰富的孔隙结构，从而提供大的比表面积，为纯化底物提供高的结合量，但是相应地，对蛋白质进行吸附或洗脱时，需要蛋白分子额外地进入或逸出多孔材料内部复杂的孔隙通道，需要花费更多的时间，也更容易滞留。相比而言，本发明提供的捕获目标蛋白的结合位点仅利用生物磁性微球的外表面空间，且进行吸附和洗脱时，不需要经过复杂的网状通道，可直接释放到洗脱液中，从而大大减少了洗脱时间，提高了洗脱效率，降低了滞留比例，提高了纯化产率。
1.1.磁性微球本体
本发明中，所述磁性微球本体的体积可以为任意可行的粒径尺寸。
较小的颗粒尺寸，有助于实现磁性微球在混合体系中悬浮，更充分地与蛋白产物相接触，提高对蛋白产物的捕获效率和结合率。一些优选方式中，所述磁性微球本体的直径尺寸为下述任一种粒径尺度(偏差可以为±25％、±20％、±15％、±10％)或任两种粒径尺度之间的范围：0.1μm、0.15μm、0.2μm、0.25μm、0.3μm、0.35μm、0.4μm、0.45μm、0.5μm、0.55μm、0.6μm、0.65μm、0.7μm、0.75μm、0.8μm、0.85μm、0.9μm、0.95μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、5.5μm、6μm、6.5μm、7μm、7.5μm、8μm、8.5μm、9μm、9.5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm、1000μm。如无特别说明，所述直径尺寸指的是平均尺寸。
所述磁性微球本体的体积可以为任意可行的粒径尺寸。
一些优选方式中，所述磁性微球本体的直径选自0.1～10μm。
一些优选方式中，所述磁性微球本体的直径选自0.2～6μm。
一些优选方式中，所述磁性微球本体的直径选自0.4～5μm。
一些优选方式中，所述磁性微球本体的直径选自0.5～3μm。
一些优选方式中，所述磁性微球本体的直径选自0.2～1μm。
一些优选方式中，所述磁性微球本体的直径选自0.5～1μm。
一些优选方式中，所述磁性微球本体的平均直径约为200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm、500nm、550nm、600nm、650nm、700nm、750nm、800nm、850nm、900nm、950nm、1000nm，所述约数可以为±25％、±20％、±15％、±10％。
一些优选方式中，所述磁性微球本体的直径选自1μm～1mm。
一些优选方式中，所述磁性微球本体的直径如1μm、10μm、100μm、200μm、500μm、800μm、1000μm，偏差范围可以为±25％、±20％、±15％、±10％。
不同的磁性材料能够提供不同类型的活化位点，可产生结合纯化介质方式的差异，并且用磁铁进行分散和沉降的能力也有所不同，还可以对纯化底物类型产生选择性。
磁性微球本体及包含磁性微球本体的磁性微球，一方面可在外加磁场的作用下快速定位、导向和分离，另一方面可通过表面改性或化学聚合等方法赋予磁性微球表面多种活性功能基团，如羟基、羧基、醛基、氨基等，此外，磁性微球还可以通过共价键或非共价键方式结合抗体、DNA等生物活性物质。
一些优选方式中，所述磁性微球本体为SiO2包裹的磁性材料。其中，SiO2包裹层可以包括自带活性位点的硅烷偶联剂。
一些优选方式中，所述磁性材料选自：铁化合物(如铁氧化物)、铁合金、钴化合物、钴合金、镍化合物、镍合金、锰氧化物、锰合金、锌的氧化物、钆的氧化物、铬的氧化物及其组合。
一些优选方式中，所述氧化铁为如磁铁矿(Fe3O4)、磁赤铁矿(γ-Fe2O3)或所述两种氧化物的组合，优选为四氧化三铁。
一些优选方式中，所述磁性材料选自：Fe3O4、γ-Fe2O3、氮化铁、Mn3O4、AlNi(Co)、FeCrMo、FeAlC、AlNiCo、FeCrCo、ReCo、ReFe、PtCo、MnAlC、CuNiFe、AlMnAg、MnBi、FeNi(Mo)、FeSi、FeAl、FeNi(Mo)、FeSiAl、BaO·6Fe2O3、SrO·6Fe2O3、PbO·6Fe2O3、GdO及其组合。其中，所述Re为一种稀土元素，铼。
1.2.提供大量支链末端的聚合物结构
所述磁性微球本体外表面具有至少一种带有线性主链和支链的聚合物，所述线性主链的一端固定于磁性微球本体外表面，聚合物的其他端游离于磁性微球本体外表面。
所述“固定于”指以共价连接的方式“固定于”磁性微球本体的外表面。
一些优选方式中，所述聚合物直接地共价偶联于所述磁性微球本体的外表面，或者通过连接元件间接地共价偶联于所述磁性微球本体的外表面。
所述聚合物具有线性主链，此时，聚合物既具有线性主链的高柔顺性，又具有支链数量的高倍数放大优点，能够更好地实现高速率、高通量的结合，高效率、高比例(高产率)的分离。
对于本发明的磁性微球，聚合物的一端共价偶联于磁性微球本体的外表面，包括所有支链和所有功能基团在内的其余端均溶于溶液中，分布在磁性微球本体的外部空间，分子链可充分伸展和摆动，使得分子链可与溶液中的其它分子充分接触，进而能够加强对目标蛋白的捕获。将目标蛋白从磁性微球上洗脱时，则能让目标蛋白直接摆脱磁性微球的束缚，直接进入到洗脱液中。相比于物理缠绕在磁性微球本体外表面或者与磁性微球本体一体形成的聚合物，这种通过线性主链一端共价固定的聚合物(一些优选方式中共价地固定单一的一条聚合物线性主链，另一些优选方式中主链固定端共价地引出2或3条线性主链)可有效减少分子链的堆叠，加强分子链在溶液中的伸展与摆动，增强对目标蛋白的捕获，减少洗脱时目标蛋白的滞留比例和滞留时间。
1.2.1.本发明提供的生物磁性微球的聚合物的主链
一些优选方式中，所述线性主链为聚烯烃主链或者丙烯酸类聚合物主链。
另一些优选方式中，所述聚合物的线性主链为丙烯酸类聚合物主链。可以为聚烯烃主链(线性主链仅为碳原子)，也可以在线性主链上含有杂原子(杂原子为非碳原子)。
一些优选方式中，所述聚合物的主链为聚烯烃主链。所述丙烯酸类聚合物的单体单元为丙烯酸、丙烯酸盐、丙烯酸酯、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸盐、甲基丙烯酸酯等丙烯酸类单体分子或其组合。所述丙烯酸类聚合物可以通过上述单体之一聚合得到或者通过上述单体的适当组合共聚得到。
一些优选方式中，所述聚合物的线性主链为聚烯烃主链。具体地，例如，所述聚烯烃主链为丙烯酸、丙烯酸盐、丙烯酸酯、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸盐、甲基丙烯酸酯类单体之一的聚合产物提供的主链，或其组合的聚合产物提供的主链(其共聚产物提供的主链)，或者上述单体参与聚合形成的共聚产物的主链。上述单体组合的聚合产物，举例如丙烯酸-丙烯酸酯共聚物，又如甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸羟乙酯共聚物(MMA-HEMA共聚物)、丙烯酸-丙烯酸羟丙酯共聚物。上述单体参与聚合形成的共聚产物，举例如马来酸酐-丙烯酸共聚物。
一些优选方式中，所述线性主链为聚烯烃主链，且由丙烯酸类聚合物的主链提供。
一些优选方式中，所述线性主链为丙烯酸类聚合物主链。
另一些优选方式中，所述聚合物的主链为丙烯酸类聚合物主链。可以为聚烯烃主链(主链仅为碳原子)，也可以在主链上含有杂原子(杂原子：非碳原子)。
另一些优选方式中，所述聚合物的主链为含有聚烯烃嵌段的嵌段共聚物主链，例如，聚乙二醇-b-聚丙烯酸共聚物(属于丙烯酸类共聚物的范围)。以顺利发挥线性主链的柔性摆动，不会导致支链堆积，不会致使滞留时间或/和比例增大为宜。
另一些优选方式中，所述聚合物的主链为缩聚型主链。所述缩聚型主链指可以通过单体分子或者低聚物之间的缩聚反应形成的线性主链；所述缩聚型主链可以是均聚型，也可以是共聚型。例如多肽链、聚氨基酸链等。具体地，例如ε-聚赖氨酸链、α-聚赖氨酸链、γ-聚谷氨酸、聚天门冬氨酸链等、天冬氨酸/谷氨酸共聚物等。
磁性微球本体外表面的一个结合位点可以共价偶联的线性主链的数量可以为1个或更多个。
一些优选方式中，磁性微球本体外表面的一个结合位点仅引出一条线性主链，此时能够为线性主链提供较大的活动空间。
另一些优选方式中，磁性微球本体外表面的一个结合位点仅引出两条线性主链，尽可能地为线性主链提供较大的活动空间。
聚合物的主链，一端共价偶联于磁珠外表面(生物磁性微球外表面)，包括所有支链和所有功能基团在内的其余端均溶解于溶液中，分布在磁珠的外部空间，分子链可充分伸展和摆动，使得分子链可与溶液中的其他分子充分接触，进而能够加强对目标蛋白的捕获。将目标蛋白从磁珠上洗脱时，则能让目标蛋白直接摆脱磁珠的束缚，直接进入洗脱液中；相比于物理缠绕在磁珠外表面或者与磁珠一体形成的聚合物，此处提供的通过线性主链一端共价固定的聚合物(最优选共价固定单一的一条聚合物线性主链，另优选主链固定端共价引出2或3条线性主链)可有效减少分子链的堆叠，加强分子链在溶液中的伸展与摆动，增强对目标蛋白的捕获，减少洗脱时目标蛋白的滞留比例和滞留时间。
1.2.2.本发明提供的生物磁性微球的聚合物支链
所述支链的数量与磁性微球本体的大小、聚合物的骨架结构类型、聚合物在磁性微球本体外表面的链密度(特别是支链密度)等因素相关。
聚合物支链的数量为多个，至少为3个。侧支链的数量与磁性微球的大小、聚合物主链的长度、沿聚合物主链的侧支链的线密度相关、聚合物在磁性微球外表面的链密度等因素相关。聚合物支链的数量可以通过控制原料的投料比进行控制。
所述支链型聚合物具有至少3个支链。
各个支链末端各自独立地结合或者未结合纯化介质。
当支链末端结合有纯化介质时，各个支链末端各自独立地直接结合纯化介质，或者通过连接元件间接地集合纯化介质。
当支链末端结合有纯化介质时，纯化介质的数量可以为1个或更多个。
一些优选方式中，一分子所述支链型聚合物至少结合3个纯化介质。
1.3.生物素或生物素类似物的结合方式
所述生物素或生物素类似物连接到所述聚合物的支链末端的方式没有特别限制。
所述生物素或生物素类似物连接于所述聚合物的支链末端的方式包括但不限于：共价键、超分子相互作用或者其组合。
一些优选方式中，所述共价键为动态共价键；更优选之一，所述动态共价键包括亚胺键、酰腙键、二硫键或者其组合。
一些优选方式中，所述超分子相互作用选自：配位结合、亲和复合物相互作用、静电吸附、氢键、π-π重叠作用、疏水相互作用、及其组合。
一些优选方式中，所述聚合物的支链，通过基于功能基团的共价键共价结合生物素或生物素类似物，将生物素或生物素类似物共价键合在聚合物支链末端。可通过生物磁性微球外表面的聚合物分子的支链所含有的功能基团与生物素或生物素类似物进行共价反应而获得。其中，所述功能性基团的优选实施方式之一为特异性结合位点(定义详见具体实施方式的“名词和术语”部分)。
所述基于功能基团的共价键，指由功能基团参与共价偶联形成的共价键。优选地，所述功能基团为羧基、羟基、氨基、巯基、羧基的盐形式、氨基的盐形式、甲酸酯基，或者前述功能基团的组合。所述羧基的盐形式的优选方式之一为钠盐形式如COONa；所述氨基的盐形式的优选方式可以为无机盐形式，也可以为有机盐形式，包括但不限于盐酸盐、氢氟酸盐等形式。所述“功能基团的组合”指一个磁性微球的外表面的所有聚合物分子的所有支链，允许基于不同的功能基团参与形成共价键；以生物素为例，也即一个生物素磁性微球的外表面的所有生物素分子可以分别与不同的功能基团共价连接，不过一个生物素分子仅能与一个功能基团相连接。
2.本发明第二方面提供了一种生物磁性微球，在本发明第一方面提供的所述生物磁性微球基础上，所述生物素或生物素类似物作为连接元件进一步连接有纯化介质。也即：所述聚合物的支链末端通过连接元件连接有纯化介质，且所述连接元件包括所述生物素或生物素类似物。
纯化介质(purification element)
纯化介质，是从混合体系中特异性地捕获目标物的功能性元件，也即所述纯化介质和待被分离纯化的目标物分子之间能够进行特异性结合。被捕获的目标物分子还能在合适条件下被洗脱释放，从而实现分离纯化的目的。
所述纯化介质以蛋白类物质为目标物时，与目标蛋白本身或者目标蛋白中携带的纯化标签，可以相互形成特异性结合作用。因此，可用于目标蛋白纯化标签的物质，均可以作为纯化介质的可选方式；用作纯化介质的肽或蛋白，也可作为目标蛋白中纯化标签的可选方式。
2.1.纯化介质的类型
所述纯化介质可以含有，但不限于含有，亲和素型标签、多肽型标签、蛋白型标签、抗体型标签、抗原型标签或者其组合。
优选方式之一，所述亲和素型标签为亲和素、可结合生物素的亲和素类似物、可结合生物素类似物的亲和素类似物或者其组合。
一些优选方式中，所述纯化介质为：亲和素、可结合生物素或其类似物的亲和素类似物、生物素、可结合亲和素或其类似物的生物素类似物、亲和蛋白、抗体、抗原、DNA、或者其组合。
一些优选方式中，所述生物磁性微球的聚合物的支链末端连接有生物素；所述纯化介质为亲和素，并与所述生物素之间形成亲和复合物的结合作用。
一些优选方式中，所述亲和素为链霉亲和素、改性的链霉亲和素、链霉亲和素类似物中任一种或其组合。
所述亲和素类似物，比如tamavidin 1、tamavidin 2等。Tamavidin 1和Tamavidin2是Yamamoto等人于2009年发现的一种具有结合生物素能力的蛋白(Takakura Yet al.Tamavidins:Novel avidin-like biotin-binding proteins from theTamogitake mushroom[J].FEBS Journal,2009,276,1383-1397)，它们具有与链霉亲和素相似的很强的生物素亲和力。Tamavidin2的热稳定性优于链霉亲和素，其氨基酸序列可以从相关数据库检索到，如UniProt B9A0T7，也可以经密码子转换，优化程序优化得到DNA序列。
所述生物素类似物，比如WSHPQFEK序列或其变体序列，WRHPQFGG序列或其变体序列，等。
一些优选方式中，所述纯化介质为：多肽标签、蛋白标签或者其组合。
一些优选方式中，所述纯化介质为亲和蛋白。
所述亲和蛋白的举例包括但不限于蛋白A，蛋白G，蛋白L，改性蛋白A，改性蛋白G，改性蛋白L等等。
所述抗体、抗原的定义参考术语部分，应理解还包括但不限于其结构域、亚基、片段、重链、轻链、单链片段(如纳米抗体，缺失轻链的重链，重链可变区、互补决定区等)、抗原决定基(epitope)、表位肽、前述任一种的变体，等。
一些优选方式中，所述多肽标签选自下述任一种标签或其变体：CBP标签、组氨酸标签、C-Myc标签、FLAG标签、Spot标签、C标签、Avi标签、包含WSHPQFEK序列的标签、包含WSHPQFEK的变体序列的标签、包含WRHPQFGG序列的标签、包含WRHPQFGG的变体序列的标签、包含RKAAVSHW序列的标签、包含RKAAVSHW的变体序列的标签或者其组合。
一些优选方式中，所述蛋白标签选自下述任一种标签或其变体：亲和蛋白、SUMO标签、GST标签、MBP标签或者其组合；更优选之一，所述亲和蛋白选自蛋白A、蛋白G、蛋白L、改性蛋白A、改性蛋白G、改性蛋白L或者其组合。
一些优选方式中，所述抗体型标签为抗体、抗体的片段、抗体的单链、单链的片段、抗体融合蛋白、抗体片段的融合蛋白中任一种，任一种的衍生物或任一种的变体。
一些优选方式中，所述抗体型标签为抗蛋白的抗体。
一些优选方式中，所述抗体型标签为抗荧光蛋白的抗体。
一些优选方式中，所述抗体型标签为纳米抗体。
一些优选方式中，所述抗体型标签为抗蛋白的纳米抗体。
一些优选方式中，所述抗体型标签为抗荧光蛋白的纳米抗体。
一些优选方式中，所述抗体型标签为抗绿色荧光蛋白或其突变体的纳米抗体。
一些优选方式中，所述抗体型标签为Fc片段。
2.2.纯化介质的负载方式
所述纯化介质连接到所述生物素或生物素类似物的方式没有特别限制。
所述纯化介质连接到所述生物素或生物素类似物的连接方式包括但不限于：共价键、非共价键(如超分子相互作用)、连接元件，或者其组合。
一些优选方式中，所述共价键为动态共价键；更优选之一，所述动态共价键包括亚胺键、酰腙键、二硫键或者其组合。
一些优选方式中，所述超分子相互作用选自：配位结合、亲和复合物相互作用、静电吸附、氢键、π-π重叠作用、疏水相互作用、及其组合。
所述生物磁性微球的一些优选方式中，所述纯化介质通过含有亲和复合物的连接元件连接到所述聚合物的支链末端。
一些优选方式中，所述生物素或生物素类似物通过亲和复合物作用结合亲和素或亲和素类似物，所述纯化介质直接或间接地连接于所述亲和素或亲和素类似物。
一些优选方式中，所述亲和复合物相互作用选自：生物素-亲和素相互作用、生物素类似物-亲和素相互作用、生物素-亲和素类似物相互作用、生物素类似物-亲和素类似物相互作用。
一些优选方式中，亲和复合物选取标准：具有特异性好、亲和力强，还提供一个可供化学键连的位点，使得亲和复合物能够共价连接到聚合物支链末端，或者经化学修饰后能够共价连接到磁性微球本体的外表面，比如外表面的结合位点、线性聚合物的主链末端、支链型聚合物的支链末端。比如以下物质的组合：生物素或其类似物与亲和素或其类似物、抗原和抗体，等等。
当加载方式中包括动态共价键、超分子相互作用(特别是亲和复合物相互作用)时，形成可逆的加载方式，纯化介质可以在一定条件下从支链末端卸载，进而进行更新或更换。
纯化介质的更新，对应磁性微球的再生，更新前后纯化介质的种类相同。
纯化介质的更换，对应磁性微球的改变，更换前后纯化介质的种类不同。
一些优选方式中，所述纯化介质为亲和素，还包括与所述亲和素相结合的生物素，其中生物素作为连接元件；其中，生物素与亲和素之间形成亲和复合物的结合作用。
一些优选方式中，所述纯化介质为亲和蛋白，还包括与所述亲和蛋白相连接的亲和素，以及与所述亲和素相结合的生物素；其中，生物素与亲和素之间形成亲和复合物的结合作用，以亲和复合物作为连接元件。
一些优选方式中，所述生物磁性微球的聚合物的支链末端依次连接有生物素、亲和素、纯化介质。更优选方式之一，所述纯化介质为抗体或抗原。所述亲和素与纯化介质之间的连接方式包括但不限于：共价键、非共价键、连接元件或者其组合。
一些优选方式中，所述纯化介质通过以下连接元件连接到生物磁性微球的聚合物支链末端：包括但不限于核酸、寡核苷酸、肽核酸、核酸适体、脱氧核糖核酸、核糖核酸、亮氨酸拉链、螺旋-转角-螺旋基序、锌指基序、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、抗半抗原抗体、等、其组合。当然，所述连接元件也可以是双链核酸构建体、双螺旋、同型杂交物或异型杂交物(从DNA-DNA、DNA-RNA、DNA-PNA、RNA-RNA、RNA-PNA或PNA-PNA中选择的同型杂交物或异型杂交物)、或者其组合。
2.3.纯化介质的作用机理
纯化介质捕获所述反应纯化混合体系中的目标物分子的作用力，可以选自：包括但不限于共价键、超分子相互作用、其组合。
一些优选方式中，所述亲和复合物相互作用选自：生物素-亲和素相互作用、生物素类似物-亲和素相互作用、生物素-亲和素类似物相互作用、生物素类似物-亲和素类似物相互作用。
一些优选方式中，所述目标物通过以下作用力方式结合到所述生物磁性微球的聚合物支链末端：生物素-亲和素结合力、Streg标签-亲和素结合力，亲和素-亲和蛋白结合力、组氨酸标签-金属离子亲和力、抗体-抗原结合力、或者其组合。所述Streg标签，主要包括但不限于IBA公司开发的可以和亲和素或其类似物形成特异性结合作用的肽标签，通常地含有WSHPQFEK序列或其变体序列。
2.4.纯化介质的再生与再利用
当纯化介质通过亲和复合物、动态共价键等可逆方式连接在本发明生物磁性微球的聚合物支链末端时，可以在适当的条件下，将纯化介质从聚合物支链末端洗脱下来，进而重新结合新的纯化介质。
以亲和复合物相互作用为生物素和链霉亲和素之间的亲和复合物作用力为例。
生物素和链霉亲和素之间极强的亲和力是一种典型的亲和复合物的结合作用，既强于一般非共价键作用，同时又弱于共价键作用，从而既能使纯化介质牢固的结合在磁珠外表面的聚合物支链末端，又能在需要更换纯化介质时通过将链霉亲和素从生物素的特异性结合位置洗脱实现纯化介质的同步脱离，进而释放出可重新结合新的亲和素-纯化介质共价连接复合物(例如带有链霉亲和素标签的纯化介质)的活化位点，从而实现磁珠纯化性能的快速恢复，大幅降低目标物(如抗体)分离纯化成本。对修饰有纯化介质的生物磁性微球进行洗脱，去除亲和素-纯化介质共价连接复合物，从而重新获得生物素或生物素类似物修饰的生物磁性微球的过程，我们称之为生物素磁性微球的再生。再生的生物素磁性微球具有被释放的生物素活性位点，能够重新结合亲和素-纯化介质共价连接复合物，再次得到纯化介质修饰的生物磁性微球(对应生物磁性微球的再生)，可提供新鲜的纯化介质，提供新生的目标物结合位点。这就使得本发明的生物素磁性微球可以再生使用，也即可以更换纯化介质后再利用。
2.4.纯化底物(优选为蛋白类物质)
本发明的纯化底物指本发明的磁性微球用来捕捉分离的物质，没有特别限制，只要所述纯化底物能够与本发明的磁性微球的纯化介质特异性地相结合即可。
所述纯化底物为蛋白类物质时，纯化底物也称为目标蛋白。
2.4.1.目标蛋白中的纯化标签
所述目标蛋白中可以不携带纯化标签，此时，目标蛋白本身应当能够被磁性微球中的纯化介质所捕获。比如，“目标蛋白、纯化介质”为“抗体、抗原”、“抗原、抗体”、“亲和素或其类似物、生物素或其类似物”等组合方式时。
一些优选方式中，所述目标蛋白带有纯化标签，所述纯化标签能够与所述纯化介质特异性地相结合。一个目标蛋白分子中，所述纯化标签的数量为一个、两个或更多个；当含有两个或两个以上纯化标签时，所述纯化标签的种类为一种、两种或者更多种。需要说明的是，只要标签的氨基酸序列不同，就视为不同种类的标签。
所述目标蛋白中的纯化标签可以选自包括但不限于以下标签的组：组氨酸标签、亲和素、亲和素类似物、Streg标签(包含WSHPQFEK序列或其变体的标签)、包含WRHPQFGG序列或其变体的标签、包含RKAAVSHW序列或其变体的标签、FLAG标签或其变体、C标签及其变体、Spot标签及其变体、GST标签及其变体、MBP标签及其变体、SUMO标签及其变体、CBP标签及其变体、HA标签及其变体、Avi标签及其变体、亲和蛋白、抗体类标签、抗原类标签、及其组合。还可以选自US6103493B2、US10065996B2、US8735540B2、US20070275416A1中公开的纯化标签，包括但不限于Streg标签及其变体。
所述纯化标签可以通过N-端或C-端融合。
所述组氨酸标签一般含有至少5个组氨酸残基，比如5×His标签、6×His标签、8×His标签等。
八肽WRHPQFGG可以特异性结合核心链霉亲和素(core streptavidin)。
Streg标签，可以与亲和素或其类似物形成特异性结合作用，所述Streg标签中包含WSHPQFEK或其变体。举例如，WSHPQFEK-(XaaYaaWaaZaa)n-WSHPQFEK，其中Xaa、Yaa、Waa、Zaa各自独立地为任一种氨基酸，XaaYaaWaaZaa至少包括一个氨基酸且(XaaYaaWaaZaa)n至少包括4个氨基酸，其中n选自1～15(比如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)；(XaaYaaWaaZaa)n的具体举例如(G)8,(G)12,GAGA,(GAGA)2,(GAGA)3,(GGGS)2、(GGGS)3。Streg标签举例如WSHPQFEK、WSHPQFEK-(GGGS)n-WSHPQFEK、WSHPQFEK-GGGSGGGSGGSA-WSHPQFEK、SA-WSHPQFEK-(GGGS)2GGSA-WSHPQFEK、WSHPQFEK-GSGGG-WSHPQFEK-GL-WSHPQFEK、GGSA-WNHPQFEK-GGGSGSGGSA-WSHPQFEK-GS、GGGS-WSHPQFEK-GGGSGGGSGGSA-WSHPQFEK等。
所述FLAG标签的序列为DYKDDDDK。FLAG标签的变体序列举例如DYKDHD-G-DYKDHD-I-DYKDDDDK。
所述Spot标签的序列为PDRVRAVSHWSS。
所述C标签中包含EPEA序列。
所述GST标签指谷胱甘肽S-转移酶标签。
所述MBP标签指麦芽糖结合蛋白标签。
所述SUMO标签，是一种已知的小分子泛素样修饰蛋白(Small ubiquitin-likemodifier)，是泛素(ubiquitin)类多肽链超家族的重要成员之一。在一级结构上，SUMO与泛素只有18％的同源性，然而两者的三级结构及其生物学功能却十分相似。
所述CBP标签的序列为KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL。
所述HA标签的序列为YPYDVPDYA。
所述Avi标签，是一种已知的由15个氨基酸残基组成的小标签，该小标签可以被生物素连接酶BirA特异性识别。
抗体类标签，包括但不限于抗体的完整结构(完整抗体)、结构域、亚基、片段、重链、轻链、单链片段(如纳米抗体，缺失轻链的重链，重链可变区、互补决定区等)，等。
抗原类标签，包括但不限于抗原的完整结构(完整抗原)、结构域、亚基、片段、重链、轻链、单链片段(如抗原决定基等)，等。
一些优选方式中，所述目标蛋白的N端或C端连接一个纯化标签，或者在两端均连接有纯化标签。
本部分所述的各种纯化标签，均可以作为本发明的磁性微球中的纯化介质的候选。
2.4.2.目标蛋白的类型
所述目标蛋白可以为天然蛋白或其改造产物，也可以为人工合成序列。所述天然蛋白的来源没有特别限制，包括但不限于：真核细胞、原核细胞、病原体；其中真核细胞来源包括但不限于：哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、线虫细胞、及其组合；所述哺乳动物细胞来源可以包括但不限于鼠源(包括大鼠、小鼠、豚鼠、金地鼠、仓鼠等)、兔源、猴源、人源、猪源、羊源、牛源、狗源、马源等。所述病原体包括病毒、衣原体、支原体等。所述病毒包括HPV、HBV、TMV、冠状病毒、轮状病毒，等。
所述目标蛋白的类型包括但不限于多肽(本发明中“目标蛋白”广义地包括多肽)、荧光类蛋白、酶及相应的酶原、抗体、抗原、免疫球蛋白、激素、胶原、聚氨基酸、疫苗等，前述任一种蛋白的部分结构域，前述任一种蛋白的亚基或片段，以及前述任一种蛋白的变体。所述“前述任一种蛋白的亚基或片段”包括“前述任一种蛋白的部分结构域”的亚基或片段。所述“前述任一种蛋白的变体”包括“前述任一种蛋白的部分结构域、前述任一种蛋白的亚基或片段”的变体。所述“前述任一种蛋白的变体”包括但不限于前述任一种蛋白的突变体。本发明中，其它位置的连续两个或两个以上“前述”的情形，含义做类似解释。
所述目标蛋白的结构，既可以为完整结构，也可以选自相应的部分结构域、亚基、片段、二聚体、多聚体、融合蛋白、糖蛋白等。不完整的抗体结构的举例如，纳米抗体(缺失轻链的重链抗体，VHH，保留了重链抗体完整的抗原结合能力)、重链可变区、互补决定区(CDR)等。
例如，本发明所述体外蛋白合成体系可合成的目标蛋白，可以选自包括但不限于以下任一种蛋白、任意组合方式的融合蛋白、任意组合方式的组合物：荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)、绿色荧光蛋白(GFP)、增强绿色荧光蛋白(eGFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、氨酰tRNA合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶(Catalase，举例如鼠过氧化氢酶)、肌动蛋白、抗体、抗体的可变区域(如抗体的单链可变区域，scFV)、抗体的单链及其片段(如抗体的重链、纳米抗体、抗体的轻链)、α-淀粉酶、肠道菌素A、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、胰岛素及其前体、胰高血糖素样肽(GLP-1)、干扰素(包括但不限于干扰素α，如干扰素αA、干扰素β、干扰素γ等)、白介素(如白细胞介素-1β、白介素2、白介素12，等)、溶菌酶素、血清白蛋白(包括但不限于人血清白蛋白、牛血清白蛋白)、甲状腺素运载蛋白、酪氨酸酶、木聚糖酶、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,LacZ，举例如大肠杆菌β-半乳糖苷酶)，等，前述任一种蛋白的部分结构域，前述任一种蛋白的亚基或片段，或前述任一种的变体(如前述定义，所述变体包括突变体，举例如萤光素酶突变体、eGFP的突变体，所述变体还可以是同源体)。所述氨酰tRNA合成酶，举例如人赖氨酸-tRNA合成酶(lysine-tRNA synthetase)、人亮氨酸-tRNA合成酶(leucine-tRNA synthetase)等。所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶，举例如拟南芥甘油醛3-磷酸脱氢酶，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase。还可参考专利文献CN109423496A。所述任意组合方式的组合物，可以包括前述任一种蛋白，也可以包括前述任意组合方式的融合蛋白。
一些优选方式中，采用GFP、eGFP、mScarlet等之一，或其类似物质、或其突变体等具有荧光性质的目标蛋白对所述体外蛋白合成体系的蛋白合成能力进行评估。
所述目标蛋白的应用领域包括但不限于生物医药、分子生物、医学、体外检测、医疗诊断、再生医学、生物工程、组织工程、干细胞工程、基因工程、聚合物工程、表面工程、纳米工程、化妆品、食品、食品添加剂、营养剂、农业、饲料、生活用品、洗涤、环境、化学染色、荧光标记等领域。
2.4.3.含有目标蛋白的混合体系
本发明的磁性微球可用于将目标蛋白从其混合体系中分离出来。所述目标蛋白不限于一种物质，允许是多种物质的组合，只要纯化的目的是为了获得这种组合物，或者这种组合物的形式可以满足纯化需求。
含有目标蛋白的混合体系没有特别限制，只要本发明的磁性微球的纯化介质能够与目标蛋白特异性结合即可；通常地，还需要所述纯化介质与混合体系中目标蛋白以外的其他物质不存在特异性结合或非特异性结合作用。
本发明的实施例中，所述含有目标蛋白的混合体系可以为天然来源，也可以为人工构建或得到的混合体系。
比如，可以从市售血清中分离纯化特定蛋白。
比如，可以从体外蛋白合成体系的反应后的体系中分离目标蛋白。
所述体外蛋白合成体系的具体实施方式之一，还包括但不限于，例如WO2016005982A1所记载的基于大肠杆菌的无细胞蛋白合成体系。本发明的其它引用文献、其直接及间接引用文献中所记载的包括但不限于基于麦胚细胞、兔网织红细胞、酿酒酵母、毕赤酵母、马克斯克鲁维酵母的体外无细胞蛋白合成体系，也均作为本发明的体外蛋白合成体系的实施方式纳入本发明。举例如，文献“Lu,Y.Advances in Cell-FreeBiosynthetic Technology.Current Developments in Biotechnology andBioengineering,2019,Chapter 2,23-45”中包括但不限于“2.1Systems and Advantages”部分第27-28页所引用文献中记载的体外无细胞蛋白合成体系，均可作为实施本发明的体外蛋白合成体系。举例如(除非和本发明相冲突，否则，下述文献及其引用文献以全部内容、全部目的被引用)，文献CN106978349A、CN108535489A、CN108690139A、CN108949801A、CN108642076A、CN109022478A、CN109423496A、CN109423497A、CN109423509A、CN109837293A、CN109971783A、CN109988801A、CN109971775A、CN110093284A、CN110408635A、CN110408636A、CN110551745A、CN110551700A、CN110551785A、CN110819647A、CN110845622、CN110938649A、CN110964736A、CN111378706A、CN111378707A、CN111378708A、CN111718419A、CN111748569A、CN2019107298813、CN2019112066163、CN2018112862093(CN111118065A)、CN2019114181518、CN2020100693833、CN2020101796894、CN202010269333X、CN2020102693382及其引用文献中记载的体外无细胞蛋白合成体系、DNA模板的构建和扩增方法，均可作为实施本发明的体外蛋白合成体系、本发明的DNA模板的构建和扩增方法。
所述体外蛋白合成体系的细胞提取物的来源细胞没有特别限制，只要能够体外表达所述目标蛋白即可。现有技术已公开的适用原核细胞提取物、真核细胞提取物(可以优选酵母细胞提取物，还可以更优先乳酸克鲁维酵母)来源的体外蛋白合成体系的外源蛋白，或者适用于细胞内合成的原核细胞体系、真核细胞体系(可以优选为酵母细胞体系，还可以更优选为乳酸克鲁维酵母体系)的内源蛋白，也均可以采用本发明的体外蛋白合成体系进行合成，或者尝试用本发明提供的体外蛋白合成体系进行合成。
所述体外蛋白合成体系的优选方式之一为IVTT体系。进行IVTT反应后的液体(记为IVTT反应液)，除了含有所表达的目标的蛋白外，还含有IVTT体系中残余反应原料，特别含有来自细胞提取物的各种因子(比如核糖体、tRNA、翻译相关酶、起始因子、延伸因子、终止因子等)。所述IVTT反应液，一方面能够提供用于与磁珠结合的目标蛋白，另一方面还可以提供用于检验目标蛋白分离效果的混合体系。
3.本发明第三方面提供了一种生物磁性微球，在本发明第一方面提供的所述生物磁性微球基础上，进一步地，所述生物素或者生物素类似物作为连接元件，进一步通过亲和复合物结合作用连接亲和素或亲和素类似物。
本发明第三方面的生物磁性微球，也称为亲和素磁性微球或亲和素磁珠。
所述亲和素或亲和素类似物既可以作为纯化介质，也可以作为连接元件进一步连接其它类型的纯化介质。其中，所述生物素或生物素类似物与所述亲和素或亲和素类似物之间形成亲和复合物的结合作用。
一些优选方式中，在本发明第一方面提供的所述生物磁性微球基础上，进一步地，还包括与所述生物素相结合的亲和素。其中，生物素与亲和素之间形成亲和复合物的结合作用。也即：所述磁性微球的聚合物的支链末端连接有生物素；所述纯化介质为亲和素，并与所述生物素之间形成亲和复合物的结合作用。
一些优选方式中，所述亲和素为链霉亲和素、改性链霉亲和素、链霉亲和素类似物中任一项或其组合。
4.本发明第四方面提供了一种生物磁性微球，在本发明第三方面提供的所述生物磁性微球基础上，更进一步地，还包括与所述亲和素或亲和素类似物相连接的亲和蛋白。此时生物素或生物素类似物、亲和素或亲和素类似物均作为连接元件，两者之间形成亲和复合物结合作用；所述亲和蛋白既可作为纯化介质，也可作为连接元件，优选地作为纯化介质。
本发明第四方面的生物磁性微球，也称为亲和蛋白磁性微球或亲和蛋白磁珠。
所述生物磁性微球的一种典型结构如图2所示。
一些优选方式中，在本发明第二方面提供的所述生物磁性微球基础上，所述纯化介质为亲和蛋白，所述生物磁性微球还包括与所述亲和蛋白相连接的亲和素，以及与所述亲和素相结合的生物素；其中，纯化介质通过连接元件连接到所述聚合物支链的末端，所述连接元件中包括生物素与亲和素形成的亲和复合物。
一些优选方式中，所述亲和蛋白为蛋白A、蛋白G、蛋白L之一，或其改性蛋白。相应的生物磁性微球可以分别称为蛋白A磁性微球或蛋白A磁珠、蛋白G磁性微球或蛋白G磁珠、蛋白L磁性微球或蛋白L磁珠，等。
本发明第四方面提供的生物磁性微球，以生物素-亲和素-亲和蛋白的连接方式为例，既能使亲和蛋白牢固的结合在磁珠外表面的聚合物支链末端，又能在需要更换亲和蛋白时通过将亲和素(如链霉亲和素)从生物素的特异性结合位置洗脱实现亲和蛋白的同步脱离，进而释放出可重新结合新的亲和素-亲和蛋白共价连接复合物E(例如带有链霉亲和素标签的亲和蛋白)的活化位点，从而实现磁珠纯化性能的快速恢复，大幅降低抗体分离纯化成本。对修饰有亲和蛋白的生物磁性微球进行洗脱，去除亲和素-亲和蛋白共价连接复合物E，从而重新获得生物素修饰的生物磁性微球的过程，我们称之为生物素磁性微球的再生。再生的生物素磁性微球具有被释放的生物素活性位点，能够重新结合亲和素-亲和蛋白共价连接复合物E，再次得到亲和蛋白修饰的生物磁性微球F(对应生物磁性微球F的再生)，可提供新鲜的亲和蛋白，提供新生的抗体结合位点。这就使得本发明的生物素磁性微球可以再生使用，也即可以更换亲和蛋白后再利用。
5.本发明第五方面提供了一种本发明第一方面提供的所述生物磁性微球的制备方法。
5.1.第一方面所提供的生物磁性微球的制备及原理
本发明第一方面提供的是生物素磁性微球，修饰有生物素或生物素类似物。
以修饰有生物素为例。
第一方面提供的生物磁性微球可通过以下环节制备得到：提供SiO2包裹的磁珠(市售或者自制)、SiO2的活化修饰、聚合物共价连接到SiO2(聚合物通过线性主链的一端共价连接到SiO2，且沿聚合物主链分布大量侧支链)、生物素共价连接到聚合物的支链末端。需要说明的是，上述环节并不要求完全孤立，允许两个或三个环节合并为一个环节，例如，可以直接提供已活化的二氧化硅包裹的磁珠(市售或者自制)。SiO2的活化修饰，例如，如本发明提供的第五～八方面所述生物磁性微球的制备方法的第(1)步。聚合物共价连接到SiO2，例如本发明提供的第五～八方面所述生物磁性微球的制备方法的第(2)、(3)步。生物素共价连接到聚合物支链末端，例如本发明提供的第五～八方面所述生物磁性微球的制备方法的第(4)步。
所述生物磁性微球可通过以下步骤制备：(1)提供或者制备磁性微球本体，所述磁性微球本体的外表面具有反应性基团R1；(2)在所述反应性基团R1的基础上连接上具有线性主链和大量支链的聚合物，所述线性主链的一端与所述反应性基团R1共价连接；(3)在所述支链的末端连接生物素或生物素类似物。
以SiO2包裹的磁性材料作为磁性微球本体为例，所述生物磁性微球的制备过程可通过以下步骤制备：(1)提供SiO2包裹的磁性微球(市售或者自制)，进行SiO2的活化修饰生成反应性基团R1；(2)在反应性基团R1进行聚合反应(比如以丙烯酸或丙烯酸钠作为单体分子)，生成具有线性主链和大量支链的聚合物，并在所述支链的末端带有功能基团F1；(3)将生物素或生物素类似物连接到支链末端的功能基团F1处。此时，在磁性微球本体共价连接的聚合物具有线性主链，线性主链的一端共价固定在反应性基团R1处，并沿聚合物主链分布大量侧支链。
5.2.典型举例
一种典型的所述生物磁性微球的制备方法(参考图3)，包括以下步骤：
步骤(1)：提供磁性微球本体，对磁性微球本体进行化学修饰，将氨基引入到磁性微球本体的外表面，形成氨基修饰磁性微球A。
一些优选方式中，利用偶联剂对磁性微球本体进行化学修饰。
一些优选方式中，所述偶联剂为氨基化硅烷偶联剂。
一些优选方式中，所述磁性微球本体为SiO2包裹的磁性材料，利用硅烷偶联剂对磁性微球本体进行化学修饰；所述硅烷偶联剂在一些优选方式中为氨基化硅烷偶联剂。
步骤(2)：利用羧基与氨基之间的共价反应将丙烯酸分子共价偶联到所述磁性微球A的外表面，引入碳碳双键，形成含碳碳双键磁性微球B。
步骤(3)：利用碳碳双键的聚合反应，将丙烯酸类单体分子(如丙烯酸钠)进行聚合，获得的丙烯酸类聚合物为支链型聚合物，具有线性主链和含有功能基团F1的支链，聚合物通过线性主链的一端共价偶联于磁性微球B的外表面，形成丙烯酸类聚合物修饰磁性微球C。该步骤可以在不加交联剂的条件下进行。
所述丙烯酸类单体分子、聚合物支链的功能基团的定义见“名词和术语”部分。
一些优选方式中，所述功能基团F1为羧基、羟基、氨基、巯基、甲酸盐、铵盐、羧基的盐形式、氨基的盐形式、甲酸酯基，或前述功能基团的组合；所述“功能基团的组合”指一个磁性微球的外表面的所有聚合物的所有支链所含有的功能基团，其种类可以为一种或一种以上。与第一方面定义的“功能基团的组合”的含义是一致的。
另一些优选方式中，所述功能基团为特异性结合位点。
步骤(4)：通过所述聚合物的支链含有的功能基团F1，将生物素或生物素类似物共价偶联到聚合物支链末端，得到结合有生物素或生物素类似物的生物磁性微球(一种生物素磁性微球)。制备得到的生物磁性微球中，通过丙烯酸类聚合物(具有聚丙烯酸骨架)提供可结合生物素的大量位点。
5.3.具体实施方式
制备所述生物素磁性微球的一种具体实施方式如下。
具体地，以丙烯酸类聚合物提供线性主链和大量支链为例，本发明提供如下一种具体实施方式：以二氧化硅包裹的四氧化三铁磁珠作为生物磁性微球的本体；先利用偶联剂3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES，CAS：919-30-2，一种氨基化偶联剂，也是一种硅烷偶联剂，更具体的为一种氨基化硅烷偶联剂)对二氧化硅包裹的四氧化三铁磁珠进行化学修饰，将氨基引入到磁珠的外表面，完成对SiO2的活化修饰，得到氨基修饰磁性微球A；然后利用羧基与氨基之间的共价反应将固定化分子(丙烯酸分子，提供一个碳碳双键和一个反应性基团羧基)共价偶联到磁珠外表面，从而将碳碳双键引入到磁珠的外表面，得到含碳碳双键磁性微球B；然后再利用碳碳双键的聚合反应进行丙烯酸类单体分子(如丙烯酸钠)的聚合，进行聚合反应的同时把聚合产物共价偶联到磁珠外表面，完成在SiO2处连接聚合物(共价连接方式)，得到丙烯酸类聚合物修饰磁性微球C；这里的固定化分子为丙烯酸分子，一个固定化分子仅引出一个聚合物分子，同时也仅引出一条聚合物线性主链；以丙烯酸钠作为单体分子为例，聚合产物为聚丙烯酸钠，其主链为线性的聚烯烃主链，并且沿着主链共价连接有大量侧支链COONa，支链含有的功能基团亦为COONa；此处的聚合反应并不使用N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(CAS：110-26-9)等交联剂，避免分子链相互交联成网状聚合物，而是在不加交联剂的条件下使聚合产物产生线状主链。如果分子链相互交联成网状聚合物，则会形成多孔结构，影响目标蛋白的洗脱效率。
一些优选方式中，制备磁性微球B时所用丙烯酸的用量为0.002～20mol/L。
一些优选方式中，制备磁性微球C时所用丙烯酸钠的用量为0.53～12.76mol/L。
所述生物磁性微球的外表面还可以采用氨基化以外的其他活化修饰方式。比如，上述氨基化的生物磁性微球(氨基修饰磁性微球A)，还可进一步与酸酐或其他修饰分子反应，从而实现对生物磁性微球外表面羧基化或其他活化方式的化学修饰。
所述固定化分子，是将聚合物的主链共价固定到磁珠外表面的小分子。固定化小分子没有特别限制，只要满足其一端共价偶联到磁珠外表面，另一端能够引发聚合反应，包括均聚反应或者共聚反应或者缩聚反应，或者另一端能够共聚偶联聚合物的线性主链末端即可。
所述固定化分子，允许仅引出单一的一条聚合物线性主链，也允许引出两条或更多条聚合物线性主链，只要不导致链堆积和/或不导致滞留比例增大即可。优选地，一个固定化分子仅引出一个聚合物分子，并仅引出一条聚合物线性主链。
一些优选方式中，所述固定化分子，允许仅引出单一的一条聚合物线性主链，也允许引出两条或更多条聚合物线性主链，只要不导致链堆积和/或不导致滞留比例增大即可。优选地，一个固定化分子仅引出一个聚合物分子，并仅引出一条聚合物线性主链。
另一些优选方式中，作为聚合的单体单元的所述丙烯酸类单体分子还可以为丙烯酸、丙烯酸盐、丙烯酸酯、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸盐、甲基丙烯酸酯类单体之一或其组合。
作为本发明的其他实施方式，所述丙烯酸类聚合物还可以用其他聚合物代替。选取的标准是：所形成的聚合物具有一条线性主链，沿着主链分布大量侧支链，并且在侧支链上携带有功能基团可供后续化学修饰；也即针对磁珠外表面的一个结合位点，通过分布于聚合物线性主链侧端的支链提供大量的功能基团。例如ε-聚赖氨酸链、α-聚赖氨酸链、γ-聚谷氨酸、聚天门冬氨酸链、天冬氨酸/谷氨酸共聚物等结构。
将上述聚合物的其他替代方式的聚合物分子引入到所述生物磁性微球外表面的方法：根据聚合物替代物的化学结构及其侧支链活性基团的类型，选择适合的生物磁性微球外表面的活化修饰方式、固定化分子的种类、单体分子类型，进行合适的化学反应将大量的位于支链的活性基团引入到生物磁性微球的外表面。
将丙烯酸类聚合物分子(如：聚丙烯酸钠线性分子链)共价偶联到磁珠外表面后，以支链末端的功能基团提供活化位点，或者在连接生物素或生物素类似物分子之前，根据反应需要，可以对聚合物分子的支链功能基团进行活化，使其具有反应活性，形成活化位点；将1,3-丙二胺共价偶联到聚合物支链的活化位点(每个单体丙烯酸类单元结构可提供一个活化位点)，形成新的功能基团(氨基)，然后再利用羧基与氨基之间的酰胺化共价反应将生物素或生物素类似物分子共价偶联到聚合物支链末端的新功能基团，完成生物素或生物素类似物共价连接到聚合物的支链末端。以生物素作为纯化介质为例，获得生物素修饰的生物磁性微球D；一个生物素分子能够提供一个特异性结合位点。以聚合物支链的功能基团为COONa为例，此时采用丙烯酸钠作为单体分子，与1,3-丙二胺进行共价反应前，可以先进行羧基活化，可采用现有的羧基活化方法，例如：加入EDC ·HCl和NHS。
5.3.1.制备丙烯酸类聚合物修饰磁性微球
制备磁性微球A：对二氧化硅包裹的四氧化三铁磁性微球的水溶液，用无水乙醇清洗磁性微球，加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES，偶联剂)的乙醇溶液，反应，清洗，在磁性微球外表面引入大量氨基。
制备磁性微球B：向丙烯酸的水溶液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行羧基活化，活化后加入至含磁性微球A的水溶液中。丙烯酸上活化的羧基和磁性微球外表面的氨基形成共价键连(酰胺键)，在磁性微球外表面引入大量碳碳双键。
制备磁性微球C：将丙烯酸类单体分子的水溶液加入到磁性微球B中，添加引发剂，进行碳碳双键的聚合反应。丙烯酸类单体分子中的碳碳双键和磁性微球表面的碳碳双键进行开键聚合，丙烯酸类聚合物分子共价键连至磁性微球外表面，其中，丙烯酸类聚合物含有羧基类功能基团；所述羧基类功能基团可以以羧基、甲酸盐、甲酸酯等形式存在。优选方式之一，以甲酸钠方式存在，此时采用如丙烯酸钠或甲基丙烯酸钠作为单体分子。另优选方式之一，以甲酸酯方式存在，此时采用如丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯作为单体分子。甲酸盐和甲酸酯可以在经羧基活化后获得较好的反应活性。
5.3.2.制备生物素修饰的生物磁性微球D
磁性微球C的溶液：加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，对微球外表面的聚合物分子侧支链的羧基类功能基团进行羧基活化，然后加入丙二胺的水溶液，进行偶合反应，在丙烯酸类聚合物分子的侧支链羧基位置接枝丙二胺，将聚合物侧支链的功能基团由羧基转化为氨基。
生物素的水溶液：加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，对生物素分子中的羧基进行活化，然后加入到含有磁性微球C的水溶液中，在磁性微球C外表面的聚合物的侧支链的新生功能基团(氨基)位置共价结合生物素，得到在丙烯酸类聚合物的大量侧支链分别连接有生物素分子的生物磁性微球D。
5.3.3.优选例
一些优选方式中，制备上述生物磁性微球D的方法如下：
首先，量取0.5～1000mL(20％，v/v)二氧化硅包裹的四氧化三铁磁性微球的水溶液，用无水乙醇清洗磁性微球，将10～300mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES，CAS：919-30-2)的乙醇溶液(5％～50％，v/v)加入到上述清洗后的磁性微球中，反应2～72小时，用无水乙醇和蒸馏水清洗磁性微球，获得氨基修饰磁性微球A。
移取1.0×10-4～1mol丙烯酸，加入到pH4～6溶液X中(溶液X：终浓度为0.01～1mol/L 2-吗啉乙磺酸(CAS：4432-31-9)、0.1～2mol/L NaCl的水溶液)，加入0.001～0.5mol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl，CAS：25952-53-8)和0.001～0.5mol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,CAS：6066-82-6)，反应3～60min。将上述溶液加入到混有0.5～50mL磁性微球A的pH7.2～7.5PBS缓冲溶液中，反应1～48小时，用蒸馏水清洗磁性微球，获得碳碳双键修饰的磁性微球B。
取0.5～50mL磁性微球B，加入0.5～200mL 5％～30％(w/v)丙烯酸钠溶液，再加入10μL～20mL 2％～20％(w/v)过硫酸铵溶液和1μL～1mL四甲基乙二胺，反应3～60分钟后用蒸馏水清洗磁性微球，获得聚丙烯酸钠修饰的磁性微球C。
取0.5～50mL磁性微球C转移至pH4～6溶液X中，加入0.001～0.5mol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和0.001～0.5mol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，反应3～60min。然后加入溶有0.0001～1mol 1,3-丙二胺的pH7.2～7.5PBS缓冲溶液，反应1～48小时。用蒸馏水清洗后加入PBS缓冲溶液，将磁性微球C中聚合物侧支链的COONa转化为氨基功能基团；称取1.0×10-6～3.0×10-4mol生物素至溶液X中，加入2.0×10-6～1.5×10- 3mol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和2.0×10-6～1.5×10-3mol N-羟基琥珀酰亚胺，反应3～60min。然后加入至上述清洗后的磁性微球溶液中，反应1～48小时，蒸馏水清洗后得到生物素修饰的磁性微球D。
5.4.本发明第三方面提供的生物磁性微球，可以通过将第一方面提供的生物磁性微球直接与亲和素或亲和素类物反应而获得。
6.本发明第六方面提供了一种本发明第二方面提供的所述生物磁性微球的制备方法，包括以下步骤：(i)提供权利要求1所述生物磁性微球；可采用第五方面的步骤(1)～(4)进行制备。(ii)将纯化介质与所述生物磁性微球的聚合物支链末端的生物素或生物素类似物相连接。
一些优选方式中，所述生物磁性微球通过以下步骤制备：步骤(1)～(4)与第五方面相同；步骤(5)将纯化介质与所述生物磁性微球的聚合物支链末端的生物素相连接。
7.本发明第七方面提供了一种本发明第二方面提供的所述生物磁性微球的制备方法，包括以下步骤：(i)提供权利要求1所述生物磁性微球；可采用第五方面的步骤(1)～(4)进行制备。(ii)以亲和素或亲和素类似物与纯化介质的共价连接复合物(例如亲和素-纯化介质共价连接复合物)作为提供纯化介质的原料，将其结合到聚合物支链末端，所述生物素或生物素类似物与所述亲和素或亲和素类似物之间形成亲和复合物的结合作用，获得带有纯化介质的生物磁性微球。
独立地可选地，包括(6)磁铁沉降生物磁性微球，去除液相，清洗；
独立地可选地，包括所述纯化介质的更换，可以通过适当条件下洗脱所述亲和素或亲和素类似物与纯化介质的共价连接复合物实现。
一些优选方式中，所述生物磁性微球通过以下五个步骤制备：步骤(1)～(4)与第五方面相同；步骤(5)与上述步骤(ii)相同。
8.本发明第八方面提供了一种本发明第四方面提供的所述生物磁性微球的制备方法(举例如图3)。
本发明第四方面提供的是一种亲和蛋白磁性微球。
本发明第四方面提供的生物磁性微球，可以以第一方面提供的生物磁性微球为原料，再结合亲和素或其类似物与亲和蛋白的共价连接复合物而获得，通过生物素或其类似物与亲和素或其类似物之间的亲和复合物作用，把亲和蛋白负载到所述生物磁性微球的聚合物支链上。
优选方式之一，本发明第四方面提供的生物磁性微球，可以以第一方面提供的生物磁性微球为原料，再结合亲和素-亲和蛋白共价连接复合物E而获得。
亲和素-亲和蛋白共价连接复合物E：也可称为亲和素-亲和蛋白复合物E，以共价方式连接而成的复合物，一端为亲和素或其类似物，另一端为亲和蛋白，两者通过共价键直接连接，或者通过共价连接元件间接相连。所述共价连接基包括共价键、连接肽，等。亲和素-亲和蛋白复合物E的举例如带有链霉亲和素的亲和蛋白，其中，亲和蛋白选自包括但不限于蛋白A、蛋白G或/和蛋白L，等等。亲和素-亲和蛋白复合物E的举例还包括：链霉亲和素-蛋白A复合物，链霉亲和素-蛋白A的融合蛋白，链霉亲和素-增强型绿色荧光蛋白-蛋白A的融合蛋白(Protein A-eGFP-Streptavidin)，Protein A-eGFP-Tamavidin2，Protein A-eGFP-Tamavidin1，等；其中，eGFP广义地包括eGFP的突变体，Streptavidin为链霉亲和素，Tamavidin1与Tamavidin2均为亲和素类似物。
亲和素与生物素进行特异性结合，形成亲和复合物。上述亲和素与生物素的亲和复合物的结合作用也可以用其他亲和复合物的结合作用替代，同样可以实现更换亲和蛋白后再利用的效果。但更优选亲和素和生物素提供的亲和复合物作用；这是因为两者之间的特异性好、亲和力强，而且生物素除了与亲和素的结合结构域，还额外多出一个可供键连的羧基，另外亲和素也容易与亲和蛋白制备为融合蛋白。
亲和复合物选取标准：具有特异性好、亲和力强，还提供一个可供化学键连的位点，使得能够共价连接到聚合物支链末端，或者经化学修饰后能够共价连接到聚合物支链末端。
8.1.制备过程
一些实施方式中，在上述第五方面制备的生物磁性微球(一种生物素磁性微球)的基础上进行以下步骤(5)，获得以亲和蛋白作为纯化介质的磁性微球系统。
步骤(5)：结合亲和素或亲和素类似物与亲和蛋白的共价连接复合物(如亲和素-亲和蛋白共价连接复合物E)。通过生物素或其类似物与亲和素或其类似物之间的特异性结合作用，将所述共价连接复合物(如亲和素-亲和蛋白共价连接复合物E)结合到聚合物支链末端，生物素或其类似物与亲和素或其类似物之间形成亲和复合物的结合作用，获得亲和蛋白磁性微球。
举例如：将亲和素-亲和蛋白共价连接复合物E(例如，带有链霉亲和素的亲和蛋白，其中，亲和蛋白选自包括但不限于蛋白A、蛋白G或/和蛋白L，等等)，加入到生物素修饰的生物磁性微球D的体系中，利用生物素与亲和素(如链霉亲和素)之间极强的特异性亲和力，将亲和蛋白非共价地连接到磁珠外表面的聚合物支链末端，获得可用于抗体类物质分离纯化的亲和蛋白修饰的磁珠，由亲和蛋白作为纯化介质，提供用于捕获目的蛋白的结合位点。
8.2.制备过程举例
本发明第四方面提供的生物磁性微球，以通过生物素-亲和素-亲和蛋白方式连接到所述聚合物支链末端为例，可通过以下步骤进行制备：
(1)对磁性微球本体进行化学修饰，将氨基引入到磁性微球本体的外表面，形成氨基修饰磁性微球A；当所述磁性微球本体为SiO2包裹的磁性材料时，所述偶联剂优选为氨基化硅烷偶联剂。
优选方式之一，利用偶联剂对磁性微球本体进行化学修饰。
当所述磁性微球本体为SiO2包裹的磁性材料时，可利用硅烷偶联剂对磁性微球本体进行化学修饰。此时，所述偶联剂优选为氨基化硅烷偶联剂。
(2)利用羧基与氨基之间的共价反应将丙烯酸分子共价偶联到所述磁性微球A的外表面，引入碳碳双键，形成含碳碳双键磁性微球B。
(3)在不加交联剂的条件下，利用碳碳双键的聚合反应，将丙烯酸类单体分子(如丙烯酸钠)进行聚合，获得的丙烯酸类聚合物链具有线性主链和含有功能基团的支链，聚合物通过线性主链的一端共价偶联于磁性微球B的外表面，形成丙烯酸类聚合物修饰磁性微球C。
所述功能基团的优选实施方式之一为特异性结合位点。
所述功能基团的其他优选方式与上述第一方面一致。
(4)通过所述聚合物的支链含有的功能基团，共价地偶联生物素，得到生物素修饰的生物磁性微球D。
(5)通过生物素与亲和素之间的特异性结合作用，将亲和素-亲和蛋白共价连接复合物E结合到聚合物支链末端，生物素与亲和素之间形成亲和复合物的结合作用，获得亲和蛋白修饰的生物磁性微球(亲和蛋白磁性微球)。
独立地可选地包括(6)磁铁沉降亲和蛋白磁性微球，去除液相，清洗。
还独立地可选地包括步骤(7)，更换所述亲和素-亲和蛋白共价连接复合物E，可以通过适当条件下洗脱所述亲和素-亲和蛋白共价连接复合物E实现。
8.3.生物磁性微球：制备结合有亲和素-蛋白A的生物磁性微球F
(结合有亲和蛋白的生物磁性微球F，蛋白A修饰的生物磁性微球F，蛋白A修饰的磁性微球)
将生物素修饰的生物磁性微球D加入到亲和素-蛋白A连接复合物E(例如，ProteinA-eGFP-Streptavidin、ProteinA-eGFP-Tamvavidin2)的融合蛋白溶液中，混合孵育。通过亲和素(如Streptavidin或Tamvavidin2)与生物素特异性结合，将ProteinA固定到生物磁性微球D的外表面的聚合物支链的端基，得到结合有亲和素-蛋白A的生物磁性微球F。所得到的生物磁性微球F结构中，丙烯酸聚合物的侧支链含有生物素-亲和素-蛋白A的亲和复合物结构，通过生物素端共价连接到聚合物的线性主链支化点，生物素与亲和素之间形成亲和复合物的非共价的强特异性结合作用，亲和素与蛋白A之间为共价连接，亲和素与蛋白A之间可插入荧光标签，还可插入其他的连接肽。
其中，亲和素-蛋白A的融合蛋白，例如ProteinA-eGFP-Streptavidin融合蛋白和ProteinA-eGFP-Tamvavidin2融合蛋白，均可通过IVTT反应进行体外无细胞蛋白合成获得。此时，所述生物磁性微球D与IVTT反应后所得上清液混合，通过生物磁性微球D外表面的生物素与溶液中的亲和素融合蛋白之间的特异性结合作用，实现亲和蛋白A的结合。
8.4.所述生物磁性微球外表面的亲和蛋白结合量可以通过以下方法确定(以荧光蛋白eGFP标记为例)：
首先，亲和蛋白的溶液与磁珠的结合反应结束后，用磁铁将结合了亲和蛋白的生物磁性微球吸附、沉降。然后，分离收集液相，记为流穿液。此时，液相中的亲和蛋白浓度减少。通过测定结合生物磁性微球前后IVTT反应所得上清液中荧光蛋白eGFP荧光值的变化值，计算得到结合在生物磁性微球上的荧光蛋白蛋eGFP的荧光强度，换算得出亲和蛋白浓度。当流穿液中的亲和蛋白浓度，与生物磁性微球孵育前的IVTT溶液中的亲和蛋白浓度相比，基本不再变化时，意味着生物磁性微球对亲和蛋白的吸附趋于饱和，相应的荧光蛋白eGFP的荧光值不再有明显改变。可以采用eGFP蛋白的纯品，建立荧光值与eGFP蛋白浓度的标准曲线，从而定量计算结合在生物磁性微球上的亲和素-亲和蛋白(如：链霉亲和素-蛋白A)的含量、浓度。
采用蛋白A修饰的生物磁性微球进行抗体的分离纯化，可通过以下方法计算抗体结合量(以牛血清抗体为例)：将蛋白A修饰的磁珠与牛血清抗体的溶液(比如采用体外蛋白合成体系表达抗体获得或者市售获得)进行孵育，反应结束后，使用洗脱缓冲液将牛血清抗体从磁珠上洗脱下来，分离得到的牛血清抗体存在于洗脱液中。采用Bradford法测定洗脱液中牛血清蛋白的浓度。同时采用BSA作为标准蛋白，进行酶标仪测试，以标准蛋白为参照，可以计算得到纯化抗体的蛋白浓度，进而计算得到分离纯化的产量、产率。
8.5.生物磁性微球的再生：纯化介质的更换(以亲和蛋白未为蛋白A为例)
洗脱更换蛋白A：洗脱亲和素的同时实现蛋白A的同步脱离，因此，也是亲和素-蛋白A的更换。
举例如：向蛋白A修饰的生物磁性微球F中加入变性缓冲液(含有尿素和十二烷基硫酸钠)，95℃金属浴孵育，洗脱掉与生物磁性微球D上的生物素相结合的亲和素-蛋白A的融合蛋白(如，SPA-eGFP-Tamvavidin2)，得到再生的生物磁性微球D(释放出聚合物支链末端的生物素的结合位点)，然后向再生的生物磁性微球D中加入新鲜的含有亲和素-蛋白A的融合蛋白的溶液(如SPA-eGFP-Tamvavidin2的IVTT反应后的上清液)，使被释放的生物磁性微球D的生物素结合位点重新结合新的亲和素-蛋白A(如，SPA-eGFP-Tamvavidin2)，重新在生物素与亲和素(如Tamvavidin2)之间形成非共价的特异性结合作用，从而实现蛋白A的更换，得到再生的生物磁性微球F。
9.磁性微球的位置控制
在制得本发明第一至第四方面所述生物磁性微球(包括但不限于生物磁性微球D和生物磁性微球F)后，可以简便地利用磁铁沉降磁性微球，去除液相，清洗去除吸附的杂蛋白或/和其它杂质。
通过控制磁性微球的尺寸和聚合物的化学参数与结构参数，所述磁性微球可以稳定地悬浮在液相中，能够在两天甚至更久的时间内不沉降。而且可以实现在不进行持续搅拌的条件下，稳定地悬浮在液态体系中。一方面，磁性微球可以控制在几微米甚至1微米以下的纳米级尺寸，另一方面，可以调节磁性微球外表面的聚合物的接枝密度，还可以调节聚合物本身的亲水性、结构类型、流体力学半径、链长度、支链数量、支链长度等特征，从而更好地控制磁性微球系统在体系中的悬浮性能，实现磁性微球系统与体外蛋白合成反应混合体系的充分接触。一种优选的所述磁性微球的尺寸为约1微米。
10.本发明第九方面提供了本发明第一至第四方面所述生物磁性微球在蛋白类物质分离纯化中的应用。
优选方式之一，所述生物磁性微球在抗体类物质分离纯化中的应用。
所述抗体类物质定义参阅术语部分。
本发明特别地提供了所述生物磁性微球在抗体、抗体片段、抗体融合蛋白、抗体片段融合蛋白分离纯化中的应用。
所述纯化介质通过含有亲和复合物的连接元件连接到所述聚合物的支链末端时，所述应用还可选地包括生物磁性微球的再生使用，也即包括纯化介质的更换后再利用。
11.本发明第十方面提供本发明第二方面或第四方面所述生物磁性微球在抗体类物质分离纯化中的应用，特别是在抗体、抗体片段、抗体融合蛋白、抗体片段融合蛋白分离纯化中的应用。
所述纯化介质为亲和蛋白。
优选地，所述亲和蛋白以生物素-亲和素-亲和蛋白的方式连接于聚合物支链。
所述亲和蛋白通过含有亲和复合物的连接元件连接到所述聚合物的支链末端时(比如第四方面所述生物磁性微球)，所述应用还可选地包括生物磁性微球的再生使用，也即包括亲和蛋白的更换后再利用。
在该应用的生物磁性微球中，亲和蛋白与聚合物线性主链之间的支链骨架中存在亲和复合物的结合作用，此时能够可选地进行亲和蛋白的更换后再利用，所述生物磁性微球可以再生使用。优选地，亲和蛋白与聚合物线性主链之间的支链骨架中存在生物素-亲和素的亲和复合物结合作用，也即亲和蛋白以生物素-亲和素-亲和蛋白的方式连接于聚合物支链，此时还可以通过对亲和素-亲和蛋白的洗脱更换实现对所述生物磁性微球的再利用。
12.本发明第十一方面提供了一种生物磁性微球。所述磁性微球本体外表面具有至少一种带有线性主链和支链的聚合物，所述线性主链的一端固定于磁性微球本体外表面，聚合物的其他端游离于磁性微球本体外表面，所述磁性微球的聚合物的支链末端连接有纯化介质，所述纯化介质选自亲和素型标签、多肽型标签、蛋白型标签、抗体型标签、抗原型标签或者其组合。
优选方式之一，所述亲和素型标签为亲和素、可结合生物素的亲和素类似物、可结合生方式物素类似物的亲和素类似物或者其组合。
优选之一，所述亲和素为链霉亲和素、改性链霉亲和素、链霉亲和素类似物或其组合。
优选方式之一，所述多肽型标签选自下述任一种标签或者其变体：CBP标签、组氨酸标签、C-Myc标签、FLAG标签、Spot标签、C标签、Avi标签、Streg标签、包含WRHPQFGG序列的标签、包含WRHPQFGG的变体序列的标签、包含RKAAVSHW序列的标签、包含RKAAVSHW的变体序列的标签或者其组合；所述Streg标签中含有WSHPQFEK及其变体。
优选方式之一，所述蛋白型标签选自下述任一种标签或者其变体：亲和蛋白、SUMO标签、GST标签、MBP标签及其组合。
优选方式之一，所述磁性微球本体外表面具有至少一种带有线性主链和支链的聚合物，所述线性主链的一端共价地固定于磁性微球本体外表面，聚合物的其他端游离于磁性微球本体外表面；所述磁性微球的聚合物的支链末端连接有亲和蛋白。
优选地，进一步，所述亲和蛋白与聚合物线性主链之间的支链骨架存在亲和复合物的结合作用。
更优选之一，所述亲和蛋白选自蛋白A、蛋白G、蛋白L、改性蛋白A、改性蛋白G、改性蛋白L或其组合。
下列实施例2-6中采用了基于体外无细胞蛋白合成方法(D2P技术)的proteinfactory系统。下述实施例2-6的体外无细胞蛋白合成方法中使用的体外蛋白合成体系(IVTT体系)包括以下组分(终浓度)：9.78mM的pH8.0三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)，80mM醋酸钾，5mM醋酸镁，1.8mM核苷三磷酸混合物(腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸，每种核苷三磷酸的浓度均为1.8mM)，0.7mM的氨基酸混合物(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，每种氨基酸各自浓度均为0.1mM)，15mM葡萄糖，320mM麦芽糊精(以葡萄糖单元计量摩尔浓度，对应约52mg/mL)，24mM磷酸三钾，2％(w/v)聚乙二醇8000，最后加入50％体积的细胞提取物(具体为酵母细胞提取物，更具体地为乳酸克鲁维酵母细胞提取物)。
其中，所述乳酸克鲁维酵母提取物中包括内源性表达的T7 RNA聚合酶。所述乳酸克鲁维酵母提取物经过以下方式改造：采用基于乳酸克鲁维酵母菌株ATCC8585的改造菌株；采用CN109423496A所记载的方法，将T7 RNA聚合酶的编码基因整合到乳酸克鲁维酵母的基因组中，获得改造菌株，使其可以内源性表达T7 RNA聚合酶；以改造菌株培养出细胞原料，然后制备细胞提取物。乳酸克鲁维酵母细胞提取物的制备过程采用常规技术手段，参考CN109593656A记载的方法制备。制备步骤概括而言，包括：提供经发酵培养的乳酸克鲁维酵母细胞的适量原料，用液氮将细胞速冻，将细胞打碎，离心收集上清液，即可得到细胞提取物。所得乳酸克鲁维酵母细胞提取物中的蛋白浓度为20～40mg/mL。
IVTT反应：向上述体外蛋白合成体系中加入15ng/μL DNA模板(所编码的蛋白中含有荧光标记)，进行体外蛋白质合成反应，混匀后放置在25～30℃环境中反应，反应时间为6～18h。合成所述DNA模板编码的蛋白，得到含有所述蛋白的IVTT反应液。采用紫外吸收法测量RFU值，结合其浓度与RFU值的标准曲线，可计算所述蛋白的含量。
实施例1生物磁性微球D的制备(结合生物素)
制备二氧化硅包裹的磁性微球(也称为磁性微球本体、磁珠、玻璃珠)
将20g Fe3O4微球置入310mL乙醇和125mL水的混合溶剂中，加入45mL 28％(wt)氨水，逐滴加入22.5mL正硅酸乙酯，室温下搅拌反应24h，反应后用乙醇和水进行清洗。使用不同粒径(约1μm、10μm、100μm)的四氧化三铁微球作为原料，控制所得玻璃珠的粒径大小。所述不同粒径的四氧化三铁微球可通过常规技术手段制备。
所制得的磁性微球用作修饰纯化介质或连接元件-纯化介质的基础原料，因此也称为磁性微球本体。
所制得的磁性微球具有磁性核心，能够通过磁力作用进行位置控制，实现移动、分散、沉降等操作，因此是一种广义的磁珠。
所制得的磁性微球具有二氧化硅的包裹层，因此也称为玻璃珠，可以降低磁性核心对以下成分或组分的吸附：聚合物、纯化介质、体外蛋白合成体系各组分、核酸模板、蛋白表达产物等。
经过多次实验表明，磁性微球粒径约1μm时，易悬浮性，悬浮的持久性，以及对蛋白的结合效率都最好。用IVTT反应液提供目标蛋白的混合体系，对于目标蛋白的结合效率，磁性微球粒径约1μm时，相较于粒径10μm可提高50％以上，相较于粒径10 0μm可提高80％以上。
以二氧化硅包裹的磁性微球通过以下步骤制备生物素磁珠。
首先，量取50mL二氧化硅包裹的四氧化三铁磁性微球(磁性微球的粒径约为1μm)的水溶液，其固含量20％(v/v)，用磁铁沉降磁性微球，去除液相，每次用60mL无水乙醇清洗磁性微球，总共清洗5次。将100mL过量的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES，CAS：919-30-2)的乙醇溶液(25％，v/v)加入到上述清洗后的磁性微球中，在50℃水浴下机械搅拌48小时，之后在70℃水浴下机械搅拌2小时，用磁铁沉降磁性微球，去除液相，每次用60mL无水乙醇清洗磁性微球，总共清洗2次，然后每次用60mL蒸馏水清洗磁性微球，重复清洗3次，得磁性微球A。
其次，移取0.01mol丙烯酸加入100mL溶液X中(溶液X：终浓度为0.1mol/L 2-吗啉乙磺酸(CAS：4432-31-9)、0.5mol/L NaCl的水溶液)，加入0.04mol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(CAS：25952-53-8)和0.04mol N-羟基琥珀酰亚胺(CAS：6066-82-6)，室温下搅拌混匀，搅拌反应15min，用NaHCO3固体粉末将溶液的pH调至7.2，将调好pH的上述溶液加入到加有10mL磁性微球A的100mL PBS缓冲溶液中，在30℃水浴下机械搅拌20小时，用磁铁沉降磁性微球，去除液相，每次用60mL蒸馏水清洗磁性微球，重复清洗6次，得磁性微球B。
第三，取1mL磁性微球B，加入12mL 15％(w/v)的丙烯酸钠溶液，加入450μL 10％的过硫酸铵溶液和45μL的四甲基乙二胺，室温下反应30分钟，用磁铁沉降磁性微球，去除液相，每次用10mL蒸馏水清洗磁性微球，总共清洗6次，得磁性微球C(丙烯酸类聚合物修饰的磁性微球C)。
第四，将所合成的磁性微球C转移至10mL的溶液X中，加入0.004mol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.004mol N-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌混匀，搅拌反应15min，用磁铁沉降磁性微球，去除液相，每次用10mL蒸馏水清洗3次；移取4.0×10-4mol1,3-丙二胺溶于10mL的PBS缓冲溶液中，加入至清洗后的磁性微球中，在30℃水浴下机械搅拌20小时，用磁铁沉降磁性微球，去除液相，每次用10mL蒸馏水清洗6次，加入10mL PBS缓冲溶液；称取2.5×10-4mol生物素，加入10mL溶液X，再加入1.0×10-3mol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.001mol N-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌混匀，搅拌反应15min，用NaHCO3固体粉末将溶液的调至pH7.2，加入至上述清洗后的含有10mL PBS缓冲溶液的磁性微球中，在30℃水浴下机械搅拌20小时，用磁铁沉降磁性微球，去除液相，每次用10mL蒸馏水清洗10次，得到生物素修饰的生物磁性微球D。
实施例2结合亲和素-蛋白A的生物磁性微球F(一种结合亲和蛋白的生物磁性微球F)的制备(以蛋白A为纯化介质，以生物素-亲和素的亲和复合物作为连接元件)
2.1合成ProteinA-eGFP-亲和素融合蛋白
分别构建融合蛋白ProteinA-eGFP-Streptavidin和Protein A-eGFP-Tamvavidin2的由三段基因构成的DNA序列。
其中，ProteinA(蛋白A)的序列来自于Staphylococcus Aureus，简称SPA。SPA的氨基酸序列总长为516氨基酸残基，选取了它的37-327位氨基酸作为构建融合蛋白时用到的基因序列，即SPA的抗体结合结构域。将该序列用优化程序进行优化后，得到核苷酸序列，见SEQ ID NO.:1。
Tamvavidin2，一种亲和素类似物，是一种具有结合生物素能力的蛋白。Yamamoto等人于2009年发现(2009_FEBS_Yamanomo T_Tamavidins--novel avidin-like biotin-binding proteins from the Tamogitake mushroom，译文：一种来自Tamogitake菌菇的结合生物素的新型亲和素类似物蛋白)，它具有与链霉亲和素相似的很强的生物素亲和力，另外，其热稳定性优于链霉亲和素。
Tamavidin2的氨基酸序列可从相关数据库检索到，如UniProt B9A0T7，共含有141个氨基酸残基，经密码子转换，优化程序优化得到DNA序列，优化后的核苷酸序列如SEQ IDNO.:2。
此外，本实施例所涉及的增强型荧光蛋白eGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO.:3所示，是eGFP的A206K突变体，也记为mEGFP。
采用重组PCR方法分别构建ProteinA-eGFP-Streptavidin和Protein A-eGFP-Tamvavidin2两种融合蛋白的DNA模板。然后采用体外无细胞蛋白合成方法(采用基于体外无细胞蛋白合成方法(D2P技术)的proteinfactory系统)分别合成两种融合蛋白ProteinA-eGFP-Streptavidin和Protein A-eGFP-Tamvavidin2。采用已公开的体外无细胞蛋白合成方法，参照专利文献CN 201610868691.6、WO2018161374A1、KR20190108180A、CN108535489B等。用IVTT体系分别表达SPA-eGFP-Streptavidin、SPA-eGFP-Tamavidin2。概括地，IVTT体系中加入细胞提取物(含基因组整合表达的RNA聚合酶)、DNA模板、能量体系(如：磷酸肌酸-磷酸肌酸激酶体系)、镁离子、钠离子、聚乙二醇等组分，28～30℃条件下进行反应。8～12小时后结束反应。所得到的IVTT反应液中含有与DNA模板相对应的ProteinA-eGFP-亲和素融合蛋白。
分别得到ProteinA-eGFP-Streptavidin和Protein A-eGFP-Tamvavidin2的IVTT反应液。
用IVTT体系分别表达SPA-eGFP-Streptavidin(对应图4“1”)、SPA-eGFP-Tamavidin2(对应图4“2”)，所合成的蛋白测定RFU值，其结果如图4的“total”所示。
将ProteinA-eGFP-Streptavidin、ProteinA-eGFP-Tamavidin2的IVTT的反应液分别经过4000rpm，4℃，离心10min，保留上清液。记为IVTT上清液。
2.2制备结合蛋白A的生物磁性微球F
将所获得的ProteinA-eGFP-Streptavidin和ProteinA-eGFP-Tamavidin2两种融合蛋白的IVTT上清液分别与实施例1所获得的生物磁性微球D共同孵育，反应1小时，根据上述给出的方法分别测定生物磁性微球F中融合蛋白的含量，并比较两种融合蛋白的结合能力强弱，结果参阅图4“supernatant”所示。
吸取30μL 10％(v/v)生物磁性微球D的悬液，用结合/洗涤缓冲液(10mM Na2HPO4pH7.4，2mM KH2PO4，140mM NaCl，2.6mM KCl)洗涤3次后备用。
取2mL含有亲和素-蛋白A融合蛋白的IVTT上清液与上述生物磁性微球D在4℃条件下旋转孵育1小时，收集未结合的清液，即为流穿液，重复这一步骤三次，获得三次不同的流穿液。也即同一批生物磁性微球D连续与亲和素-蛋白A孵育三次。每次用2mL步骤2.1所述的IVTT上清液，对应的每次获得流穿液按顺序编号记为1、2、3。采用荧光光度法检测IVTT上清液以及所述三次流穿液的eGFP荧光值，结果如图5所示，激发波长(Ex)为488nm，发射波长(Em)为507nm，。三次流穿液的RFU值与IVTT上清液的RFU值越接近，说明生物磁性微球D对亲和素-亲和蛋白A的结合越趋于饱和，相应的RFU值如下表1所示：
表1 IVTT上清液未经生物磁性微球D处理与进行处理所得的三次流穿液的eGFP荧光值对比
Figure BDA0002802981900000431
与生物磁性微球D结合的SPA-eGFP-Streptavidin、SPA-eGFP-Tamvavidin2的RFU值分别如下表2、表3所示。其中对于Streptavidin来说，第一次的结合就已经使生物磁性微球D的蛋白A结合量饱和。对于Tamvavidin2来说，第二次结合后，生物磁性微球D的蛋白A结合量基本上达到饱和。第一次的结合量用上清液中的蛋白质量减去流穿液1中的蛋白质量计算得到，第二次的结合量用上清液中的蛋白质量减去流穿液2中的蛋白质量计算得到，第三次的结合量用上清液中的蛋白质量减去流穿液3中的蛋白质量计算得到，如下表2、表3。其中，结合力是指ProteinA融合蛋白/生物磁性微球D，质量与体积比，单位(mg/mL)。
表2 SPA-eGFP-Streptavidin进行生物磁性微球D处理的流穿液理化对比
Figure BDA0002802981900000432
表3 SPA-eGFP-Tamvavidin2进行生物磁性微球D处理的流穿液理化对比
Figure BDA0002802981900000433
根据荧光值与蛋白的质量浓度的标准曲线计算得到每次结合的蛋白浓度，并根据孵育体积(2mL)计算得到每次结合的总蛋白量。
根据纯化的eGFP拟定标准曲线，推算出的eGFP的RFU值换算成蛋白质量浓度的公式为：
Figure BDA0002802981900000441
其中，X为蛋白质量浓度(μg/mL)，Y为RFU荧光读数，M为eGFP的分子量(26.7kDa)，N为SPA-eGFP-Streptavidin的分子量(77.3kDa)或SPA-eGFP-Tamvavidin2的分子量(79.4kDa)。
通过代入测得的RFU荧光数值，即可换算得到目的蛋白SPA-eGFP-Streptavidin或SPA-eGFP-Tamvavidin2的质量浓度(μg/mL)。
其中，亲和素-蛋白A融合蛋白的IVTT上清液、流穿液的RFU值为Y，将Y的数值代入上述公式，得到的X即为相应的融合蛋白的质量浓度，乘以蛋白A溶液体积，就可得到亲和素-蛋白A融合蛋白的总蛋白量。IVTT上清液中的亲和素-蛋白A的蛋白量减去流穿液的亲和素-蛋白A的蛋白量，得到的差值即为被生物磁性微球结合的亲和素-蛋白A的蛋白量W。将W除以磁性微球的柱床体积，计算得出单位体积磁性微球结合的亲和素-蛋白A融合蛋白的质量，即为结合力，单位为mg/mL。
本实施例所使用的是30μL 10％(v/v)的生物磁性微球D悬液，所以换算成1mL100％生物磁性微球D的结合量如表2、表3所示。其中Tamvavidin2与生物磁性微球D的结合力稍强于Streptavidin。
实施例3蛋白A修饰的生物磁性微球F用于血清抗体纯化
将不同体积的结合有SPA-eGFP-Streptavidin融合蛋白的生物磁性微球与1mL新生牛血清4℃旋转孵育1小时，而后用结合/洗涤缓冲液1mL洗涤3次，每次洗涤4℃孵育旋转10分钟。用100μL 0.1M pH2.8的甘氨酸洗脱抗体，洗脱下来的抗体存在于洗脱液中，向洗脱液中立即加入十分之一体积(10μL)的1M pH 8.0的Tris-HCl。以生工的Protein A琼脂糖柱为对照(货号C600957-0005)。
取40μL洗脱液加入10μL 5×SDS上样缓冲液(不含还原剂)，95℃金属浴10分钟后，进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果如图6所示。
由图6可知，采用6微升柱床体积的结合有SPA-eGFP-Streptavidin融合蛋白的生物磁性微球，就可得到优于市售产品的分离纯化效果。
将洗脱后的生物磁性微球用结合/洗涤缓冲液1mL洗涤3次，重复上述抗体孵育、洗涤、洗脱步骤；也即经第一次抗体孵育后，经洗涤、洗脱，释放结合的抗体，重新得到蛋白A修饰的磁性微球，再次与抗体孵育、洗涤、洗脱，再次重新得到蛋白A饰的磁性微球，然后第三次进行孵育、洗涤、洗脱。将生物磁性微球总计与抗体孵育3次后，取第三次与抗体孵育后得到的含抗体的洗脱液40μL，加入10μL 5×上样缓冲液(不含还原剂)，95℃金属浴10分钟后，进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果如图7所示。
由图6和图7可知，结合有SPA-eGFP-Streptavidin的生物磁性微球F可反复多次利用，经抗体孵育、洗脱抗体后，第二次、第三次重新与牛血清孵育，都仍可以将牛血清中的抗体提取出来，且总体效果不比生工公司的ProteinA琼脂糖磁珠差。对于6微升柱床体积时，本发明还具有更好效果)。本发明提供的结合了亲和蛋白(这里为蛋白A)的生物磁性微球F可以反复多次使用。
实施例4将生物磁性微球D与亲和复合物E(亲和素-蛋白A)的结合的可循环利用性
4.1孵育
孵育制备结合SPA-eGFP-Tamvavidin2的生物磁性微球F：
取50μL 10％的生物磁性微球D悬液(体积为5μL)用结合/洗涤缓冲液2mL洗涤3次后，加入2mL SPA-eGFP-Tamvavidin2的IVTT上清液4℃旋转孵育1小时，弃去上清液(收集上清液得到流穿液1)，重复加入含SPA-eGFP-Tamvavidin2的新鲜IVTT上清液，4℃旋转孵育1小时，弃去上清液(收集上清液得到流穿液2)，第三次加入含SPA-eGFP-Tamvavidin2的新鲜IVTT上清液，4℃旋转孵育1小时，弃去上清液(收集上清液得到流穿液3)。测量SPA-eGFP-Tamvavidin2的IVTT上清液和三次流穿液的RFU值，并根据上述公式计算溶液中SPA-eGFP-Tamvavidin2的剩余含量，结果如图8和表4所示。
根据纯化的eGFP拟定标准曲线，推算出的eGFP的RFU值换算成蛋白质量浓度的计算式为：
Figure BDA0002802981900000451
其中，X为蛋白质量浓度(μg/mL)，Y为RFU荧光读数，M为eGFP的分子量(26.7kDa)，N为SPA-eGFP-Tamvavidin2的分子量(79.4kDa)。
通过将测得的RFU荧光值代入计算式，即可得到目的蛋白SPA-eGFP-Tamvavidin2的质量浓度(μg/mL)。例如：当Y的值为1330.3时，通过上述计算式计算出对应的X值为247.6，如表4所示。
4.2洗脱和更换
洗脱并更换亲和素-亲和蛋白复合物E：SPA-eGFP-Tamvavidin2。
将生物磁性微球F用结合/洗涤缓冲液2mL洗涤3次后，加入200μL变性缓冲液(1MUrea和10％SDS)，置于95℃金属浴孵育10分钟，洗脱生物磁性微球上结合的亲和素-蛋白A。该洗脱液取20μL加入5μL 5×SDS上样缓冲液以后，进行SDS-PAGE电泳测试，得到如图9中所示的泳道1的条带。洗脱后的生物磁性微球D用结合/洗涤缓冲液2mL洗涤3次，得到第一次再生的生物磁性微球D，磁性微球外表面的聚合物支链的生物素的结合位点被释放出来。
4.3第二次孵育(再生)
重复上述孵育SPA-eGFP-Tamvavidin2和洗脱该亲和素-蛋白A的过程，实现生物磁性微球F的第一次再生，也即亲和素-蛋白A的第一次更换。第一次再生的生物磁性微球D结合SPA-eGFP-Tamvavidin2，测量相应的IVTT上清液和三次流穿液的RFU值，得到表5的数据。洗脱后的生物磁性微球D用结合/洗涤缓冲液2mL洗涤3次，得到第二次再生的生物磁性微球D。
4.4第三次孵育(第二次再生)
再次重复上述孵育SPA-eGFP-Tamvavidin2和洗脱该亲和素-蛋白A过程，实现生物磁性微球F的第二次再生，也即亲和素-蛋白A的第二次更换。第二次再生的生物磁性微球D结合SPA-eGFP-Tamvavidin2，测量相应的IVTT上清液和两次流穿液的RFU值，得到表6的数据。表4-6中，结合力是指ProteinA融合蛋白/生物磁性微球D，质量与体积比，单位(mg/mL)。
表4首次制备的生物磁性微球D结合Protein A融合蛋白的载量计算
Figure BDA0002802981900000461
表5第一次再生的生物磁性微球D结合Protein A融合蛋白的载量计算
Figure BDA0002802981900000462
表6第二次再生的生物磁性微球D结合Protein A融合蛋白的载量计算
Figure BDA0002802981900000463
测试再生的生物磁性微球D重新结合蛋白A-eGFP-亲和素的能力。
首次制备的生物磁性微球D第一次饱和结合SPA-eGFP-Tamvavidin2、第一次再生的生物磁性微球D第二次饱和结合SPA-eGFP-Tamvavidin2、第二次再生的生物磁性微球D第三次饱和结合SPA-eGFP-Tamvavidin2，分别用变性缓冲液洗脱蛋白，分别收集到含有SPA-eGFP-Tamvavidin2的三次洗脱液，进行SDS-PAGE。结果入图9所示。泳道1,2,3分别代表第一次，第二次，第三次饱和结合蛋白A-eGFP-亲和素后，分别从首次制备的生物磁性微球F、第一次再生的生物磁性微球F、第二次再生的生物磁性微球F上洗脱蛋白，得到的含有SPA-eGFP-Tamvavidin2的三次洗脱液的电泳条带。
4.5再生的生物磁性微球F结合牛血清抗体能力检测
当第三次将生物磁性微球D用SPA-eGFP-Tamvavidin2结合饱和后，获得第二次再生的生物磁性微球F。向所得第二次再生的生物磁性微球F中加入2mL新生牛血清(市售产品，下同)4℃旋转孵育1小时，弃去上清液(收集上清液得到流穿液1)后，再次加入2mL新生牛血清4℃旋转孵育1小时，弃去上清液(收集上清液得到流穿液2)。用结合/洗涤缓冲液1mL洗涤3次，每次洗涤4℃孵育旋转10分钟。用100μL 0.1M pH 2.8的甘氨酸溶液洗脱牛血清抗体(抗体与磁性微球中的蛋白A端相结合)，立即向洗脱下来的牛血清抗体溶液中加入1/10体积(即10μL)的1M pH 8.0的Tris-HCl溶液，获得洗脱液110μL。
取40μL上述洗脱液，加入10μL 5×SDS上样缓冲液(无还原剂)，混匀，95℃金属浴10分钟后，进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果如图9所示。根据图7、图9和表6实验结果可知，生物磁性微球D与SPA-eGFP-Tamvavidin2的结合具有可再生性，本发明提供的生物磁性微球F可再生使用。并且，加入变性液加热处理的步骤，不影响生物磁性微球的结合效力。
实施例5结合蛋白G的生物磁性微球G的制备(以蛋白G为纯化介质，以生物素-亲和素的亲和复合物作为连接元件)
5.1.合成ProteinG-eGFP-亲和素融合蛋白(一种亲和素-亲和蛋白共价连接复合物E)
使用实施例2的方法，合成ProteinG-eGFP-Tamvavidin2融合蛋白(也简记为ProteinG融合蛋白)，依次制备含有ProteinG-eGFP-Tamvavidin2融合蛋白的IVTT反应液、IVTT上清液。
首先构建包括三段基因序列的ProteinG-eGFP-Tamvavidin2融合蛋白的DNA序列。其中，“eGFP”段和“Tamvavidin2”段的核苷酸序列与实施例2相同，分别见SEQ ID No.:3、SEQ ID No.:2。其中，“ProteinG”段的核苷酸序列(SEQ ID No.:4)来自于G类链球菌属(Streptococcus sp.group G)，选取的是其抗体结合区域的基因序列。
采用重组PCR方法构建ProteinG-eGFP-Tamvavidin2融合蛋白的DNA模板。采用RCA法进行体外扩增。采用前述指示的体外无细胞蛋白合成方法(采用基于体外无细胞蛋白合成方法(D2P技术)的proteinfactory系统，具体采用基于乳酸克鲁酵母的细胞提取物)合成ProteinG-eGFP-Tamvavidin2融合蛋白。
进行IVTT反应，依次得到含有Protein G-eGFP-Tamvavidin2融合蛋白的IVTT反应液、IVTT上清液。
5.2.制备结合蛋白G的生物磁性微球G
吸取30μL 10％(w/v)实施例1制备的生物素修饰的生物磁性微球D，用结合/洗涤缓冲液(10mM Na2HPO4 pH 7.4，2mM KH2PO4，140mM NaCl，2.6mM KCl)洗涤3次后备用。
取2mL含有ProteinG-eGFP-Tamvavidin2融合蛋白的IVTT上清液与上述生物磁性微球D在4℃条件下旋转孵育1小时，收集清液，即为流穿液，流穿液中含有未被微球结合的剩余融合蛋白；重复这一步骤三次，每次取新的IVTT上清液与生物磁性微球D进行孵育，获得三次不同的流穿液。也即同一批生物磁性微球D连续与IVTT上清液中的ProteinG-eGFP-Tamvavidin2融合蛋白孵育三次。每次取用2mL步骤5.1.中得到的IVTT上清液，对应的三次流穿液按顺序依次记为流穿液1(FT1)、流穿液2(FT2)、流穿液3(FT3)。采用荧光光度法检测IVTT上清液以及所述三次流穿液的eGFP荧光值(以RFU值计量)，结果如图10所示。
流穿液的RFU值与IVTT上清液的RFU值越接近，说明生物磁性微球D对ProteinG-eGFP-Tamvavidin2融合蛋白的结合越趋于饱和，相应的RFU值如下表6所示。第一次的结合量用上清液中的蛋白质量减去流穿液1中的蛋白质量计算得到，第二次的结合量用上清液中的蛋白质量减去流穿液2中的蛋白质量计算得到，第三次的结合量用上清液中的蛋白质量减去流穿液3中的蛋白质量计算得到。ProteinG-eGFP-Tamvavidin2融合蛋白的浓度采用实施例2的方法，根据以下的公式计算得到。
Figure BDA0002802981900000482
其中，X为ProteinG-eGFP-Tamvavidin2融合蛋白质量浓度(μg/mL)，Y为RFU荧光读数，M为eGFP的分子量(26.7kDa)，N为ProteinG-eGFP-Tamvavidin2融合蛋白的分子量。
表6含有ProteinG-eGFP-Tamvavidin2融合蛋白的IVTT上清液与三次流穿液的eGFP荧光值数据
Figure BDA0002802981900000481
Figure BDA0002802981900000491
其中，结合力为磁珠结合的ProteinG融合蛋白的质量与所使用的磁珠体积。
通过上述将生物磁性微球D与含有ProteinG融合蛋白的IVTT上清液进行孵育的过程，得到通过亲和复合物(生物素-亲和素)连接方式结合有ProteinG的生物磁性微球G，也记为ProteinG磁珠。
5.3.ProteinG磁珠纯化血清抗体(以IgG抗体作为目标蛋白)
将不同体积的结合有ProteinG-eGFP-Tamvavidin2融合蛋白的ProteinG磁珠与1mL新生牛血清4℃旋转孵育1小时，然后用结合/洗涤缓冲液1mL洗涤(3次)，每次洗涤4℃孵育旋转10分钟。用100μL 0.1M pH2.8的甘氨酸洗脱抗体，并立即向洗脱液中加入十分之一体积(10μL)的1M pH 8.0的Tris-HCl。洗脱液中的IgG抗体纯度采用SDS-PAGE检测，结果如图11所示。根据灰度值进行定量分析，纯度大于95％。
实施例6结合纳米抗体anti-eGFP的生物磁性微球H的制备(以纳米抗体anti-eGFP为纯化介质，以生物素-亲和素的亲和复合物作为连接元件)
6.1.合成antiEGFP-mScarlet-亲和素融合蛋白(antiEGFP-mScarlet-Tamvavidin2融合蛋白，一种纳米抗体的融合蛋白)
使用实施例2的方法，合成antiEGFP-mScarlet-Tamvavidin2融合蛋白(也简记为antiEGFP融合蛋白，分子量59kDa)，依次制备含有antiEGFP-mScarlet-Tamvavidin2融合蛋白的IVTT反应液、IVTT上清液。
首先构建包括三段基因序列的antiEGFP-mScarlet-Tamvavidin2融合蛋白的DNA序列。
其中，“Tamvavidin2”段的核苷酸序列与实施例2相同，参考SEQ ID No.:2。
其中，antiEGFP为氨基酸序列如SEQ ID No.:5所示的纳米抗体。
其中，mScarlet是一种明亮的红色荧光蛋白，相应核苷酸序列为SEQ ID No.:6.
采用重组PCR方法构建antiEGFP-mScarlet-Tamvavidin2融合蛋白的DNA模板。采用RCA法进行体外扩增。采用前述指示的体外无细胞蛋白合成方法(采用基于体外无细胞蛋白合成方法(D2P技术)的proteinfactory系统)合成antiEGFP-mScarlet-Tamvavidin2融合蛋白。
进行IVTT反应，依次得到含有antiEGFP-mScarlet-Tamvavidin2融合蛋白的IVTT反应液、IVTT上清液。
6.2.制备结合纳米抗体anti-eGFP的生物磁性微球H
吸取30μL 10％(w/v)实施例1制备的生物素修饰的生物磁性微球D，用结合/洗涤缓冲液(10mM Na2HPO4 pH 7.4，2mM KH2PO4，140mM NaCl，2.6mM KCl)洗涤3次后备用。
取2mL含有antiEGFP-mScarlet-Tamvavidin2融合蛋白的IVTT上清液(RFU值为2400)与上述生物磁性微球D在4℃条件下旋转孵育1小时，收集清液，即为流穿液(RFU值为1700)。流穿液中含有未被微球结合的剩余融合蛋白。RFU值的测试条件为：激发波长(Ex)为569nm，发射波长(Em)为593nm。
通过上述将生物磁性微球D与含有所述antiEGFP融合蛋白的IVTT上清液进行孵育的过程，被孵育的磁珠通过亲和复合物(生物素-Tamvavidin2)连接方式结合有纳米抗体anti-eGFP，记为生物磁性微球H，也记为antiEGFP磁珠(一种纳米抗体磁珠)。
6.3.antiEGFP磁珠结合eGFP蛋白的载量测试(以eGFP作为目标蛋白，eGFP过量)
吸取30μL 10％(w/v)本实施例6.2.制备的antiEGFP磁珠，用结合/洗涤缓冲液洗涤3次，备用。
取2mL eGFP蛋白的IVTT反应液(DNA模板中编码eGFP的核苷酸序列如SEQ ID No.:3)，测量其荧光值，记为Total的荧光值。将其与前述洗涤过的3μL antiEGFP磁珠混合，旋转孵育1小时，未与磁珠结合的上清液记为Flow-through，测量其荧光值。根据表7的荧光值测试结果，利用eGFP的计算公式得到相应的eGFP蛋白的量，计算得到antiEGFP磁珠的载量为17.7mg/mL(每毫升antiEGFP磁珠结合的eGFP蛋白的质量)。
表7 antiEGFP磁珠结合eGFP蛋白的载量测试结果
Figure BDA0002802981900000501
6.4.antiEGFP磁珠纯化eGFP蛋白的结合效率(以eGFP作为目标蛋白，磁珠过量)
取本实施例6.2制备的antiEGFP磁珠，用结合/洗涤缓冲液洗涤3次，备用。
取1mL eGFP蛋白的IVTT反应液(DNA模板中编码eGFP的核苷酸序列如SEQ ID No.:3)，测量其荧光值，记为Total。将其与过量的antiEGFP磁珠混合，旋转孵育1小时，收集清夜，记为Flow-through，测量其荧光值。磁珠用结合/洗涤缓冲液1mL洗涤2次，每次洗涤4℃孵育旋转10分钟，所得洗涤液分别记为Washing1、Washing2，并分别测量其荧光值。经孵育的磁珠结合了目标蛋白eGFP。上述各荧光值的测量结果如图12和表8所示。结果表明，用本方案制备的抗eGFP的磁珠可以有效结合并洗脱得到eGFP蛋白。根据IVTT上清液及流穿液的荧光值，计算得到上述孵育1小时后，antiEGFP磁珠对目标蛋白eGFP的结合效率为98.2％。
表8 antiEGFP磁珠纯化eGFP蛋白的结合效率测试
Figure BDA0002802981900000502
用100μL 0.1M pH2.8的甘氨酸洗脱甘氨酸洗脱eGFP，并立即向洗脱液中加入十分之一体积(10μL)的1M pH 8.0的Tris-HCl。测量洗脱液的荧光值，记为Elution，并用SDS-PAGE检测纯度，结果如图13所示，纯度约为95％。
应当理解，上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于上述实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内或指导、启示下，可以有各种变化和更改，所作的任何具有等同技术效果的变化和更改，均在本发明保护范围之内。
序列表
<110> 康码（上海）生物科技有限公司
<120> 一种生物磁性微球及其制备方法和应用
<130> 2020
<141> 2020-11-27
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 873
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
gcccagcacg acgaggccca gcaaaacgcc ttttaccagg ttttgaacat gcccaacttg 60
aacgccgacc agaggaacgg cttcatccag agtttgaaag acgaccccag tcaaagtgcc 120
aacgttttgg gcgaggcaca gaaattaaat gacagccagg cccccaaggc cgacgcccag 180
cagaacaact tcaacaagga tcagcagagt gccttttacg aaatattgaa catgcccaac 240
ctaaacgagg cacagagaaa tgggttcatc cagagtttaa aagatgatcc cagtcagagt 300
accaacgttt tgggggaggc caaaaagtta aacgaaagcc aggcgcccaa agctgataac 360
aacttcaaca aggagcagca gaacgccttc tacgagattc taaacatgcc caacttgaac 420
gaggagcaga ggaacggctt catccagagt ttgaaagacg atcccagtca gagtgcaaac 480
ttgctatctg aggccaagaa gctcaacgag tcacaggccc ccaaggccga taacaagttc 540
aacaaggagc agcagaacgc tttctatgaa atccttcatt tgccaaattt gaatgaggaa 600
cagaggaacg gcttcatcca gagtttgaaa gatgacccga gtcagagtgc caacttgttg 660
gccgaagcca agaagttgaa tgatgcccag gcccccaagg ccgacaacaa gtttaacaag 720
gagcagcaga atgcctttta cgagatcttg cacttgccca acttgactga ggaacaaagg 780
aacggtttca tacagagttt gaaggacgac ccctctgtta gtaaggaaat ccttgcggag 840
gcaaagaagc taaacgatgc tcaagcacca aaa 873
<210> 2
<211> 423
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
atgagtgatg ttcaatcttc tttgactggt acttggtata atgaattgaa ttctaaaatg 60
gaattgactg ctaataaaga tggtactttg actggtaaat atttgtctaa agttggtgat 120
gtttacgttc catatccatt gtctggtaga tataatttgc aaccaccagc tggtcaaggt 180
gttgctttgg gttgggctgt ttcttgggaa aattctaaaa ttcattctgc tactacttgg 240
tctggtcaat tcttctctga atcttctcca gttattttga ctcaatggtt attgtcttct 300
tctactgcta gaggtgatgt ttgggaatct actttggttg gtaacgattc tttcactaaa 360
actgctccaa ctgaacaaca aattgctcat gctcaattgc attgtagagc tccaagattg 420
aaa 423
<210> 3
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 60
gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgcgc ggcgagggcg agggcgatgc caccaacggc 120
aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 180
gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 240
cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catctccttc 300
aaggacgacg gcacctacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360
aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420
ctggagtaca acttcaacag ccacaacgtc tatatcacgg ccgacaagca gaagaacggc 480
atcaaggcga acttcaagat ccgccacaac gtcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 540
cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 600
ctgagcaccc agtccaagct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 660
ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caag 714
<210> 4
<211> 585
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
acttacaaat taatccttaa tggtaaaaca ttgaaaggcg aaacaactac tgaagctgtt 60
gatgctgcta ctgcagaaaa agtcttcaaa caatacgcta acgacaacgg tgttgacggt 120
gaatggactt acgacgatgc gactaagacc tttacagtta ctgaaaaacc agaagtgatc 180
gatgcgtctg aattaacacc agccgtgaca acttacaaac ttgttattaa tggtaaaaca 240
ttgaaaggcg aaacaactac tgaagctgtt gatgctgcta ctgcagaaaa agtcttcaaa 300
caatacgcta acgacaacgg tgttgacggt gaatggactt acgacgatgc gactaagacc 360
tttacagtta ctgaaaaacc agaagtgatc gatgcgtctg aattaacacc agccgtgaca 420
acttacaaac ttgttattaa tggtaaaaca ttgaaaggcg aaacaactac taaagcagta 480
gacgcagaaa ctgcagaaaa agccttcaaa caatacgcta acgacaacgg tgttgatggt 540
gtttggactt atgatgatgc gactaagacc tttacggtaa ctgaa 585
<210> 5
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Val Asn
20 25 30
Arg Tyr Ser Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Trp Val Ala Gly Met Ser Ser Ala Gly Asp Arg Ser Ser Tyr Glu Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Arg Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Asn Val Asn Val Gly Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
gtttcaaagg gtgaagctgt tattaaggag tttatgagat tcaaagtgca tatggaaggt 60
tctatgaatg gtcatgaatt tgaaattgag ggtgaaggtg aaggtagacc atatgaaggt 120
actcaaactg ctaaattgaa ggttactaaa ggtggtccat tgccattctc atgggatatt 180
ttgtcaccac aattcatgta tggttctaga gctttcatta agcatccagc tgatattcca 240
gattactata agcaatcatt cccagaaggt ttcaagtggg aaagagttat gaattttgaa 300
gatggtggtg ctgttactgt tactcaagat acttcattgg aagatggtac tttgatctat 360
aaggttaagt tgagaggtac taatttccca ccagatggtc cagttatgca aaagaaaact 420
atgggttggg aagctagtac tgaaagattg tatccagaag atggtgtttt gaagggtgac 480
attaagatgg ctttgagatt gaaagatggt ggtagatatt tggctgattt caagactact 540
tataaggcta agaagccagt tcaaatgcca ggtgcttaca atgttgatag aaaattggat 600
atcacctctc ataatgaaga ttatactgtt gttgagcaat acgaaagatc tgaaggtaga 660
cattctactg gtggtatgga tgaattgtat aag 693

Claims (19)

1.一种生物磁性微球，包括磁性微球本体，其特征在于：所述磁性微球本体外表面具有至少一种带有线性主链和支链的聚合物，所述线性主链的一端固定于磁性微球本体外表面，聚合物的其他端游离于磁性微球本体外表面，所述生物磁性微球的聚合物的支链末端连接有生物素或生物素类似物。
2.根据权利要求1所述生物磁性微球，其特征在于：所述聚合物的支链末端通过连接元件连接有纯化介质，且所述连接元件包括所述生物素或生物素类似物。
3.根据权利要求2所述生物磁性微球，其特征在于：所述纯化介质中含有亲和素型标签、多肽型标签、蛋白型标签、抗体型标签、抗原型标签或者其组合；
优选之一，所述亲和素型标签为亲和素、可结合生物素的亲和素类似物、可结合生物素类似物的亲和素类似物或者其组合；
更优选之一，所述生物磁性微球的聚合物的支链末端连接有生物素；所述纯化介质为亲和素，并与所述生物素之间形成亲和复合物的结合作用；
更优选之一，所述亲和素为链霉亲和素、改性链霉亲和素、链霉亲和素类似物或其组合；
优选之一，所述多肽型标签选自下述任一种标签或者其变体：CBP标签、组氨酸标签、C-Myc标签、FLAG标签、Spot标签、C标签、Avi标签、Streg标签、包含WRHPQFGG序列的标签、包含WRHPQFGG的变体序列的标签、包含RKAAVSHW序列的标签、包含RKAAVSHW的变体序列的标签，及其组合；
优选之一，所述蛋白型标签选自下述任一种标签或者其变体：亲和蛋白、SUMO标签、GST标签、MBP标签或者其组合；更优选之一，所述亲和蛋白选自：蛋白A、蛋白G、蛋白L、改性蛋白A、改性蛋白G、改性蛋白L，及其组合。
4.根据权利要求2或3中任一项所述生物磁性微球，其特征在于：所述纯化介质通过含有亲和复合物的连接元件连接到所述聚合物的支链末端；
优选之一，所述生物素或生物素类似物通过亲和复合物作用连接有亲和素或亲和素类似物，所述纯化介质直接或间接地连接于所述亲和素或亲和素类似物；
更优选之一，所述纯化介质通过亲和素型标签-纯化介质共价连接复合物连接到所述聚合物的支链末端的生物素或生物素类似物，通过亲和素型标签与生物素或生物素类似物之间形成亲和复合物的连接元件；
进一步优选方式之一，所述纯化介质通过亲和素-纯化介质共价连接复合物，与所述聚合物的支链末端的生物素或生物素类似物形成亲和复合物的连接元件。
5.根据权利要求2-4中任一项所述生物磁性微球，其特征在于：所述纯化介质与所述聚合物的支链末端的连接方式为：共价键、超分子相互作用、连接元件，或者其组合。
优选之一，所述共价键为动态共价键；更优选之一，所述动态共价键包括亚胺键、酰腙键、二硫键或者其组合；
优选之一，所述超分子相互作用选自：配位结合、亲和复合物相互作用、静电吸附、氢键、π-π重叠作用、疏水相互作用及其组合；
更优选之一，所述亲和复合物相互作用选自：生物素-亲和素相互作用、生物素类似物-亲和素相互作用、生物素-亲和素类似物相互作用、生物素类似物-亲和素类似物相互作用。
6.根据权利要求1所述生物磁性微球，其特征在于：还包括与所述生物素或生物素类似物相结合的亲和素；其中，所述生物素或生物素类似物与所述亲和素之间形成亲和复合物的结合作用；优选之一，所述亲和素为链霉亲和素、改性链霉亲和素、链霉亲和素类似物或者其组合。
7.根据权利要求6所述的生物磁性微球，其特征在于：还包括与所述亲和素或者亲和素类似物相连接的亲和蛋白。
8.根据权利要求1-7中任一项所述生物磁性微球，其特征在于：所述磁性微球本体的尺寸选自下述任一种粒径尺度或任两种粒径尺度之间的范围：0.1μm、0.15μm、0.2μm、0.25μm、0.3μm、0.35μm、0.4μm、0.45μm、0.5μm、0.55μm、0.6μm、0.65μm、0.7μm、0.75μm、0.8μm、0.85μm、0.9μm、0.95μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、5.5μm、6μm、6.5μm、7μm、7.5μm、8μm、8.5μm、9μm、9.5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm、1000μm；所述直径尺寸为平均值；
优选方式之一，所述磁性微球本体的直径选自0.1～10μm；
优选方式之一，所述磁性微球本体的直径选自0.2～6μm；
优选方式之一，所述磁性微球本体的直径选自0.4～5μm；
优选方式之一，所述磁性微球本体的直径选自0.5～3μm；
优选方式之一，所述磁性微球本体的直径选自0.2～1μm；
优选方式之一，所述磁性微球本体的直径选自0.5～1μm；
优选方式之一，所述磁性微球本体的直径选自1μm～1mm；
优选方式之一，所述磁性微球本体的平均直径为200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm、500nm、550nm、600nm、650nm、700nm、750nm、800nm、850nm、900nm、950nm、1000nm，偏差为±20％，更优选±10％。
9.根据权利要求1-8中任一项所述生物磁性微球，其特征在于：所述聚合物的线性主链为聚烯烃主链或者丙烯酸类聚合物主链；
优选之一，所述聚合物的线性主链为聚烯烃主链，且由丙烯酸类聚合物的主链提供；
更优选之一，所述丙烯酸类聚合物的单体单元为丙烯酸、丙烯酸盐、丙烯酸酯、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸盐、甲基丙烯酸酯之一或者其组合。
10.根据权利要求1所述生物磁性微球，其特征在于：所述聚合物的支链通过基于功能基团的共价键共价结合生物素或生物素类似物；
优选地，所述基于功能基团的共价键，指由功能基团参与共价偶联形成的共价键，其中，所述功能基团为羧基、羟基、氨基、巯基、羧基的盐形式、氨基的盐形式、甲酸酯基，或前述功能基团的组合。
11.根据权利要求1-10中任一项所述生物磁性微球，其特征在于：所述聚合物的线性主链直接地共价偶联于所述磁性微球本体的外表面，或者通过连接基团间接地共价偶联于所述磁性微球本体的外表面。
12.根据权利要求1-11中任一项所述生物磁性微球，其特征在于：所述磁性微球本体为SiO2包裹的磁性材料；
优选地，所述磁性材料为铁氧化物、铁化合物、铁合金、钴化合物、钴合金、镍化合物、镍合金、锰氧化物、锰合金或者其组合；
更优选地，所述磁性材料为Fe3O4、γ-Fe2O3、氮化铁、Mn3O4、FeCrMo、FeAlC、AlNiCo、FeCrCo、ReCo、ReFe、PtCo、MnAlC、CuNiFe、AlMnAg、MnBi、FeNiMo、FeSi、FeAl、FeSiAl、BaO·6Fe2O3、SrO·6Fe2O3、PbO·6Fe2O3、GdO或者其组合。
13.如权利要求1所述生物磁性微球的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)利用氨基化硅烷偶联剂对磁性微球本体进行化学修饰，将氨基引入到磁性微球本体的外表面，形成氨基修饰磁性微球A；
所述磁性微球本体为SiO2包裹的磁性材料；
(2)利用羧基与氨基之间的共价反应将丙烯酸分子共价偶联到所述磁性微球A的外表面，引入碳碳双键，形成含碳碳双键磁性微球B；
(3)在不加交联剂的条件下，利用碳碳双键的聚合反应，将丙烯酸类单体分子进行聚合，获得的丙烯酸类聚合物具有线性主链和含有功能基团的支链，聚合物通过线性主链的一端共价偶联于磁性微球B的外表面；形成丙烯酸类聚合物修饰磁性微球C；
(4)通过所述聚合物支链含有的功能基团，将生物素或生物素类似物共价偶联到聚合物支链末端，得到所述生物磁性微球。
14.如权利要求2-5中任一项所述生物磁性微球的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)利用氨基化硅烷偶联剂对磁性微球本体进行化学修饰，将氨基引入到磁性微球本体的外表面，形成氨基修饰磁性微球A；
所述磁性微球本体为SiO2包裹的磁性材料；
(2)利用羧基与氨基之间的共价反应将丙烯酸分子共价偶联到所述磁性微球A的外表面，引入碳碳双键，形成含碳碳双键磁性微球B；
(3)在不加交联剂的条件下，利用碳碳双键的聚合反应，将丙烯酸类单体分子进行聚合，获得的丙烯酸类聚合物具有线性主链和含有功能基团的支链，聚合物通过线性主链的一端共价偶联于磁性微球B的外表面；形成丙烯酸类聚合物修饰磁性微球C；
(4)通过所述聚合物支链含有的功能基团，将生物素或生物素类似物共价偶联到聚合物支链末端，得到生物素或生物素类似物修饰的生物磁性微球D；
(5)将纯化介质与所述生物磁性微球D中所述聚合物支链末端的生物素或生物素类似物相连接，得到结合有纯化介质的所述生物微球微球；
优选地，将亲和素或亲和素类似物与纯化介质的共价连接复合物结合到聚合物支链末端，所述生物素或生物素类似物与所述亲和素或亲和素类似物之间形成亲和复合物的结合作用，获得带有纯化介质的所述生物磁性微球；
独立地可选地，包括(6)磁铁沉降生物磁性微球，去除液相，清洗；
独立地可选地，包括所述亲和素或亲和素类似物与纯化介质的共价连接复合物的更换。
15.如权利要求7所述生物磁性微球的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
优选地，所述生物磁性微球的制备方法包括以下步骤：
(1)利用氨基化硅烷偶联剂对磁性微球本体进行化学修饰，将氨基引入到磁性微球本体的外表面，形成氨基修饰磁性微球A；所述磁性微球本体为SiO2包裹的磁性材料；
(2)利用羧基与氨基之间的共价反应将丙烯酸分子共价偶联到所述磁性微球A的外表面，引入碳碳双键，形成含碳碳双键磁性微球B；
(3)在不加交联剂的条件下，利用碳碳双键的聚合反应，将丙烯酸类单体分子进行聚合，获得的丙烯酸类聚合物具有线性主链和含有功能基团的支链，聚合物通过线性主链的一端共价偶联于磁性微球B的外表面；形成丙烯酸类聚合物修饰磁性微球C；
(4)通过所述聚合物支链含有的功能基团，将生物素共价偶联到聚合物支链末端，得到生物素修饰的生物磁性微球D；
(5)将亲和素-亲和蛋白共价连接复合物E结合到聚合物支链末端，生物素与亲和素之间形成亲和复合物的结合作用，获得结合有亲和蛋白的所述生物磁性微球；
独立地可选地，包括(6)磁铁沉降所述生物磁性微球，去除液相，清洗；
独立地可选地，包括所述亲和素-亲和蛋白共价连接复合物E的更换。
16.根据权利要求1-12中任一项所述生物磁性微球在蛋白类物质分离纯化中的应用；
优选方式之一，所述生物磁性微球在抗体类物质分离纯化中的应用；
所述纯化介质通过含有亲和复合物的连接元件连接到所述聚合物的支链末端时，所述应用还可选地包括生物磁性微球的再生使用。
17.根据权利要求2-5或7中任一项所述生物磁性微球在抗体类物质分离纯化中的应用，其特征在于：所述纯化介质为亲和蛋白；
优选地，所述亲和蛋白以生物素-亲和素-亲和蛋白的方式连接于聚合物支链；
优选地，所述抗体类物质包括抗体、抗体片段、抗体融合蛋白、抗体片段融合蛋白；
所述亲和蛋白通过含有亲和复合物的连接元件连接到所述聚合物的支链末端时，所述应用还可选地包括生物磁性微球的再生使用，也即包括亲和蛋白的更换后再利用。
18.一种生物磁性微球，包括磁性微球本体，其特征在于：所述磁性微球本体外表面具有至少一种带有线性主链和支链的聚合物，所述线性主链的一端固定于磁性微球本体外表面，聚合物的其他端游离于磁性微球本体外表面，所述磁性微球的聚合物的支链末端连接有生物素，进一步通过亲和复合物结合作用连接亲和素。
19.一种生物磁性微球，包括磁性微球本体，其特征在于：所述磁性微球本体外表面具有至少一种带有线性主链和支链的聚合物，所述线性主链的一端固定于磁性微球本体外表面，聚合物的其他端游离于磁性微球本体外表面，所述磁性微球的聚合物的支链末端连接有纯化介质，所述纯化介质选自：亲和素型标签、多肽型标签、蛋白型标签、抗体型标签、抗原型标签及其组合；
优选之一，所述亲和素型标签为亲和素、可结合生物素的亲和素类似物、可结合生物素类似物的亲和素类似物或者其组合；
更优选之一，所述亲和素为链霉亲和素、改性链霉亲和素、链霉亲和素类似物或其组合；
优选之一，所述多肽型标签选自下述任一种标签或者其变体：CBP标签、组氨酸标签、C-Myc标签、FLAG标签、Spot标签、C标签、Avi标签、Streg标签、包含WRHPQFGG序列的标签、包含WRHPQFGG的变体序列的标签、包含RKAAVSHW序列的标签、包含RKAAVSHW的变体序列的标签或者其组合；所述Streg标签中含有WSHPQFEK及其变体；
优选方式之一，所述蛋白型标签选自下述任一种标签或者其变体：亲和蛋白、SUMO标签、GST标签、MBP标签或者其组合；更优选之一，所述亲和蛋白选自蛋白A、蛋白G、蛋白L、改性蛋白A、改性蛋白G、改性蛋白L及其组合；
更优选方式之一，所述磁性微球本体外表面具有至少一种带有线性主链和支链的聚合物，所述线性主链的一端共价地固定于磁性微球本体外表面，聚合物的其他端游离于磁性微球本体外表面；所述生物磁性微球的聚合物的支链末端连接有亲和蛋白；进一步优选地，所述亲和蛋白与聚合物线性主链之间的支链骨架中存在亲和复合物的结合作用；更优选之一，所述亲和蛋白选自蛋白A、蛋白G、蛋白L、改性蛋白A、改性蛋白G、改性蛋白L及其组合。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022111661A1 (zh) * 2020-04-28 2022-06-02 康码（上海）生物科技有限公司 一种抗体型生物磁性微球及其制备方法和应用
CN115193419A (zh) * 2022-09-13 2022-10-18 苏州纳微生命科技有限公司 磁性微球及其制备方法、应用和诊断试剂盒
CN115301212A (zh) * 2022-05-31 2022-11-08 康码（上海）生物科技有限公司 一种生物磁性微球及其制备方法和应用
CN115445657A (zh) * 2022-10-08 2022-12-09 安徽泓泽新材料科技有限公司 一种用于呔哔克合成的催化剂及其制备方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20230093123A1 (en) * 2021-09-10 2023-03-23 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods relating to structural determination of small proteins
CN115856297B (zh) * 2023-01-04 2024-05-28 吉林大学 一种检测鼠伤寒沙门氏菌的试剂盒的制备方法及试剂盒
CN117607463B (zh) * 2024-01-23 2024-04-09 杭州华得森生物技术有限公司 一种循环肿瘤细胞egfr免疫显色检测试剂

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19641876B4 (de) 1996-10-10 2011-09-29 Iba Gmbh Streptavidinmuteine
DE10113776B4 (de) 2001-03-21 2012-08-09 "Iba Gmbh" Isoliertes streptavidinbindendes, kompetitiv eluierbares Peptid, dieses umfassendes Fusionspeptid, dafür codierende Nukleinsäure, Expressionsvektor, Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Fusionsproteins und Verfahren zum Nachweis und/oder zur Gewinnung des Fusionsproteins
CN100334105C (zh) * 2003-12-12 2007-08-29 上海交通大学 纳米磁性颗粒分离纯化链酶亲合素的方法
CN1667413A (zh) * 2004-03-09 2005-09-14 中国科学院过程工程研究所 一种免疫磁性微球及其制备方法和用途
US8399055B2 (en) * 2005-07-21 2013-03-19 Rania Bakry Open channel solid phase extraction systems and methods
US20070275416A1 (en) 2006-05-16 2007-11-29 Gsf-Forschungszentrum Fuer Umwelt Und Gesundheit Gmbh Affinity marker for purification of proteins
DE102009058769A1 (de) * 2009-12-16 2011-06-22 MagForce Nanotechnologies AG, 10589 Temperaturabhängige Aktivierung von katalytischen Nukleinsäuren zur kontrollierten Wirkstofffreisetzung
CN102617810B (zh) * 2012-02-27 2014-09-24 重庆医科大学 用两端带羧基的直链亲水聚合物包被纳米磁芯制备微纳米磁性材料的方法及其应用
CA2891820A1 (en) 2012-11-16 2014-05-22 Iba Gmbh Streptavidin muteins and methods of using them
US9279810B2 (en) * 2013-10-25 2016-03-08 Affinergy, Llc Cell binding peptides for diagnosis and detection
WO2016005982A1 (en) 2014-07-08 2016-01-14 Technion Research & Development Foundation Limited Methods and kits for cell-free transcription and translation
CN105126714B (zh) * 2015-08-05 2020-04-14 浙江东方基因生物制品股份有限公司 一种功能性纳米颗粒复合微球及其制备与应用
US11280789B2 (en) * 2016-04-19 2022-03-22 Regents Of The University Of Minnesota Compositions, kits, and methods for cell separation
CN106978349B (zh) 2016-09-30 2018-06-22 康码（上海）生物科技有限公司 一种体外蛋白质合成的试剂盒及其制备方法
CN108535489B (zh) 2017-03-04 2019-04-19 康码（上海）生物科技有限公司 一种用于体外蛋白质合成的蛋白合成体系、试剂盒及其制备方法
WO2018171747A1 (zh) 2017-03-23 2018-09-27 康码（上海）生物科技有限公司 一种体外DNA-to-Protein(D2P)的合成体系、制剂、试剂盒及制备方法
CN109022478A (zh) 2017-06-09 2018-12-18 康码（上海）生物科技有限公司 一种用于高通量体外蛋白质合成的dna元件
EP3425064B1 (en) * 2017-07-03 2020-08-12 Numen Sensorics ApS Method and electronic device for determining the concentration of an analyte
CN108690139B (zh) 2017-07-31 2019-03-15 康码（上海）生物科技有限公司 新型融合蛋白的制备及其在提高蛋白质合成的应用
CN109423509B (zh) 2017-08-27 2023-11-21 康码（上海）生物科技有限公司 一种葡萄糖检测方法、试剂盒及其应用
CN109423496B (zh) 2017-08-31 2023-09-15 康码（上海）生物科技有限公司 一种细胞中内源性表达rna聚合酶的核酸构建物
CN109423497A (zh) 2017-08-31 2019-03-05 康码（上海）生物科技有限公司 增强蛋白质合成效率的rna元件
CN109593656B (zh) 2017-09-30 2021-01-05 康码（上海）生物科技有限公司 一种新型细胞提取液的制备方法
CN109837293A (zh) 2017-11-24 2019-06-04 康码（上海）生物科技有限公司 一种能够增强蛋白质合成效率的串联dna元件
CN108949801B (zh) 2017-11-24 2019-06-14 康码（上海）生物科技有限公司 一种通过对核酸酶系统敲除以调控体外生物合成活性的方法
CN108084252B (zh) * 2017-12-26 2021-06-18 常州天地人和生物科技有限公司 一种新型链霉亲和素纯化填料及其制备方法
CN109971775B (zh) 2017-12-27 2021-12-28 康码（上海）生物科技有限公司 一种核酸构建物及其调控蛋白合成的方法
CN109971783A (zh) 2017-12-28 2019-07-05 康码（上海）生物科技有限公司 一种体外蛋白合成体系、试剂盒及其制备方法
CN109988801A (zh) 2017-12-29 2019-07-09 康码（上海）生物科技有限公司 一种用于体外生物反应体系的新型的高效的能源再生体系(bes)、试剂盒及制备方法
CN110093284B (zh) 2018-01-31 2020-08-18 康码（上海）生物科技有限公司 一种在细胞中提高蛋白合成效率的方法
CN110408635B (zh) 2018-04-28 2021-07-30 康码（上海）生物科技有限公司 一种含有链霉亲和素元件的核酸构建物在蛋白质表达、纯化中的应用
CN110408636B (zh) 2018-04-28 2021-07-30 康码（上海）生物科技有限公司 多重标签串联的dna序列及其在蛋白质表达纯化系统的应用
CN110551700B (zh) 2018-05-31 2022-06-21 康码（上海）生物科技有限公司 Adh蛋白家族突变体及其应用
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CN110551785B (zh) 2018-06-01 2022-08-30 康码（上海）生物科技有限公司 一种用于体外蛋白质合成的无细胞冻干制剂、其制法和用途
CN113584058B (zh) 2018-08-07 2023-02-10 康码（上海）生物科技有限公司 信号肽相关序列及其在蛋白质合成中的应用
CN110845622B (zh) 2018-08-21 2021-10-26 康码（上海）生物科技有限公司 不同结构域缺失融合蛋白的制备及其在提高蛋白质合成的应用
CN110938649A (zh) 2018-09-25 2020-03-31 康码（上海）生物科技有限公司 一种提高外源蛋白表达量的蛋白合成体系及其应用方法
CN110964736A (zh) 2018-09-28 2020-04-07 康码（上海）生物科技有限公司 一种体外蛋白合成体系及其用于提高蛋白合成效率的方法、试剂盒
CN111118065A (zh) 2018-10-31 2020-05-08 康码（上海）生物科技有限公司 一种真核生物的基因改造方法及其相应的基因工程细胞及应用
CN111378706B (zh) 2018-12-27 2022-07-19 康码（上海）生物科技有限公司 通过Edc3基因敲除改变体外蛋白合成能力的方法及其应用
CN111378707B (zh) 2018-12-28 2022-06-21 康码（上海）生物科技有限公司 一种体外无细胞蛋白合成体系及其应用
CN111378708B (zh) 2018-12-28 2022-07-19 康码（上海）生物科技有限公司 一种体外无细胞蛋白合成体系及其应用
CN111718419B (zh) 2019-03-20 2022-04-12 康码（上海）生物科技有限公司 含有rna结合蛋白的融合蛋白及其配合使用的表达载体
CN111748569A (zh) 2019-03-27 2020-10-09 康码（上海）生物科技有限公司 含咪唑的体外无细胞蛋白合成体系及其应用

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022111661A1 (zh) * 2020-04-28 2022-06-02 康码（上海）生物科技有限公司 一种抗体型生物磁性微球及其制备方法和应用
CN115301212A (zh) * 2022-05-31 2022-11-08 康码（上海）生物科技有限公司 一种生物磁性微球及其制备方法和应用
CN115193419A (zh) * 2022-09-13 2022-10-18 苏州纳微生命科技有限公司 磁性微球及其制备方法、应用和诊断试剂盒
CN115193419B (zh) * 2022-09-13 2022-11-22 苏州纳微生命科技有限公司 磁性微球及其制备方法、应用和诊断试剂盒
CN115445657A (zh) * 2022-10-08 2022-12-09 安徽泓泽新材料科技有限公司 一种用于呔哔克合成的催化剂及其制备方法
CN115445657B (zh) * 2022-10-08 2023-08-15 安徽泓泽新材料科技有限公司 一种用于呔哔克合成的催化剂及其制备方法

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JP2023504477A (ja) 2023-02-03
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