KR20220101738A - 생체자기 마이크로스피어 및 이의 제조 방법과 용도 - Google Patents

생체자기 마이크로스피어 및 이의 제조 방법과 용도 Download PDF

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KR20220101738A
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민 구오
리치옹 쉬
쉬에 위
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강마-헬스코드 (상하이) 바이오테크 컴퍼니 리미티드
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Abstract

본 발명은 자기 마이크로스피어 본체를 포함하는 생체자기 마이크로스피어를 제공하며 상기 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면은 선형 주쇄와 분지쇄를 가진 적어도 하나의 중합체를 가지며, 상기 선형 주쇄의 일단은 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 고정되며, 중합체의 타단은 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에서 유리되고, 상기 생체자기 마이크로스피어의 중합체의 분지쇄 말단에는 비오틴이 연결된다. 또한 상기 생체자기 마이크로스피어에 대한 개량, 제조 방법 및 용도를 추가로 제공한다. 상기 생체자기 마이크로스피어는 조작 및 사용이 간편하고, 용액 속에 신속하게 분산 및 침강되어, 고속 원심분리기와 같은 대형 실험 설비를 사용할 필요가 없고; 용도가 광범위하며, 비오틴을 통해 선택적 정제 매질(예를 들어, 아비딘, 친화성 단백질, 폴리펩티드/단백질 태그 등)을 연결할 수 있어, 항체 물질과 같은 표적물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 단백질의 분리 및 정제에 보편적으로 널리 사용될 수 있다.

Description

생체자기 마이크로스피어 및 이의 제조 방법과 용도
관련된 출원의 상호참조
본 출원은 2019년 11월 30일자로 출원된 출원번호가 201911209156X인 중국 특허출원, 2020년 04월 28일자로 출원된 중국 특허 출원번호가 2020103469030인 중국 특허출원의 우선권을 주장한다. 본 출원은 상기 중국 특허 출원의 전문을 인용한다.
기술분야
본 발명은 생화학 기술분야에 속하며, 구체적으로 생체자기 마이크로스피어, 이의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.
항체, 항체 단편 또는 이들의 융합 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는 단백질의 분리 및 정제는 생물학적 의약품 생산공정에서 중요한 하위 단계이며, 분리 및 정제의 효과와 효율성은 단백질 약물의 품질 및 생산비용에 직접적인 영향을 미친다. 단백질의 정제에 있어서, 현 단계에서는 정제 컬럼 또는 정제 마이크로스피어 담체로서 일반적으로 아가로스 겔과 같은 재료가 사용된다. 종래 기술에서 항체 물질(예를 들어, 항체 분자, 항체 단편 또는 이들의 융합 단백질)의 분리 및 정제를 위해, 생산 기술자는 주로 단백질 A(약칭: Protein A) 친화성 흡착 컬럼을 사용하여 발효액 또는 반응용액 중의 항체 분자를 분리 및 정제하고 있다. 단백질 A 컬럼은 담체에 고정된 단백질 A를 항체 분자 Fc 단의 특정 부위에 특이적으로 결합시킴으로써 용액으로부터 항체를 특이적이고 효율적으로 분리한다. 현 단계에서 일반적으로 사용되는 단백질 A 컬럼의 담체도 주로 아가로스 겔과 같은 재료를 사용한다.
겔 재료의 3차원 다공성 구조는 재료의 비표면적을 증가시켜 정제 매질(고정된 단백질 A 등)에 결합가능한 부위를 증가시키고 표적 단백질(항체 포함)에 대한 특이적인 결합량을 높인다. 담체 재료의 3차원 다공성 구조는 단백질(항체 포함)의 결합 부위 수량을 크게 증가시킬 수 있지만 담체 내부의 다공성 구조는 단백질이 용출될 경우 단백질의 체류 시간을 증가시키고 담체 내부의 일부 불연속적인 공간이나 사각은 단백질이 재료 내부로부터 용출되는 것을 방해하여 체류 비율을 증가시킨다. 단백질의 결합 부위를 담체의 외부 표면에만 고정시키면 단백질 생성물이 재료 내부로 들어가는 것을 방지할 수 있지만 용출될 때 단백질의 체류 시간과 체류 비율을 크게 줄일 수 있다. 그러나 담체의 외부 표면만 이용하면 담체의 비표면적이 크게 줄어들어 단백질의 결합 부위 수가 크게 줄어 정제 효율이 낮아진다.
중합체는 단량체 분자의 중합에 의해 형성될 수 있는 고분자 화합물이다. 활성 부위를 가진 단량체 분자를 사용하여 중합을 수행면 중합체 생성물이 다수의 활성 부위를 풍부히 함유하여 활성 부위의 수량을 크게 증가시킬 수 있고, 이러한 활성 부위를 통해 해당하는 결합 부위를 형성하거나 도입시킬 수 있다. 중합체의 종류와 구조는 다양하며 분자 사슬이 서로 가교되어 그물 구조를 이루는 구조, 단일 선형 분자 사슬로 이루어진 선형 구조, 또한 분지된 사슬이 많은 분지형 구조(예를 들어, 분지형, 수지 모양, 브러시 모양, 초분기 구조 등 구조)가 있고, 다양한 구조 유형의 중합체는 다양한 분야에서 광범위하게 응용되고 있다.
종래 기술에서 단백질의 분리 및 정제에 사용되는 정제 컬럼은 주로 공유결합 방식으로 정제 매질을 고정시킨다. 단백질 A를 정제 매질로 하고, 항체 물질을 정제하는 데 사용하는 단백질 A 컬럼을 예로 들면, 항체, 항체 단편 또는 이들의 융합 단백질 등의 분리 및 정제에 사용되는 단백질 A 컬럼은 주로 공유결합 방식에 의해 단백질 A를 고정하고, C단의 시스테인을 통해 담체에 공유결합된다. 공유결합 방식은 정제 매질(단백질 A 등)이 담체에 단단히 고정되도록 확보할 수 있지만, 정제 컬럼(예를 들어, 단백질 A 컬럼)을 여러 번 사용한 후에는 정제 매질(예를 들어, 단백질 A)의 결합 성능이 저하되므로 정제 효과가 떨어진다. 따라서 높은 정제 효율과 품질을 확보하기 위해, 조작원은 친화층 크로마토그래피 컬럼의 모든 충전제를 적시에 교체해야 하며, 이 과정은 재료 사용량이 많을 뿐만 아니라, 많은 노동력과 시간이 소요되어 결과적으로 정제 비용이 높아진다.
기술적 과제
본 발명은 생체자기 마이크로스피어를 제공하며, 표적물, 특히 단백질 물질(항체류 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않음)의 분리 및 정제에 사용할 수 있고 높은 처리량으로 표적물에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 용출될 때 표적물의 체류 비율을 효과적으로 감소시킬 수 있고, 또한 정체 매질(친화성 단백질 등)을 쉽게 교체할 수 있어, 신속하고, 처리량이 높고, 반복적인 이용이 가능하고, 재생 사용이 가능한 특징이 있고 표적물의 정제 비용을 크게 줄일 수 있다. 예를 들어, 친화성 단백질을 정제 매질로 사용할 경우 항체류 단백질의 정제 비용을 크게 줄일 수 있다.
1. 본 발명의 제1 측면에서, 자기 마이크로스피어 본체를 포함하는 생체자기 마이크로스피어를 제공하며, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에는 선형 주쇄 및 분지쇄를 가진 적어도 하나의 중합체가 있고, 상기 선형 주쇄의 일단이 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 고정되고, 중합체의 타단이 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에서 유리되고, 상기 생체자기 마이크로스피어의 중합체의 분지쇄 말단에는 비오틴 또는 비오틴 유사체가 연결되어 있다. 상기 비오틴 또는 비오틴 유사체는 정제 매질로 사용할 수 있고 다른 유형의 정제 매질을 추가로 연결하기 위한 연결요소로 사용할 수도 있다.
상기 생체자기 마이크로스피어는 비오틴 자기 마이크로스피어 또는 비오틴 자석 비드라고도 한다.
상기 "고정"이란 상기 선형 주쇄가 자기 마이크로스피어의 외부 표면에 공유결합 방식으로 "고정"되어 있음을 의미한다.
또한, 상기 선형 주쇄는 직접적인 방식 또는 연결기(연결요소)를 통한 간접적인 방식으로 상기 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 공유 고정된다.
또한, 상기 중합체 분지쇄의 수량은 여러 개이고, 바람직하게는 적어도 3개이다.
바람직한 일 양태에서, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 크기는 0.1 μm, 0.15 μm, 0.2 μm, 0.25 μm, 0.3 μm, 0.35 μm, 0.4 μm, 0.45 μm, 0.5 μm, 0.55 μm, 0.6 μm, 0.65 μm, 0.7 μm, 0.75 μm, 0.8 μm, 0.85 μm, 0.9 μm, 0.95 μm, 1 μm, 1.5 μm, 2 μm, 2.5 μm, 3 μm, 3.5 μm, 4 μm, 4.5 μm, 5 μm, 5.5 μm, 6 μm, 6.5 μm, 7 μm, 7.5 μm, 8 μm, 8.5 μm, 9 μm, 9.5 μm, 10 μm, 15 μm, 20 μm, 25 μm, 30 μm, 35 μm, 40 μm, 45 μm, 50 μm, 55 μm, 60 μm, 65 μm, 70 μm, 75 μm, 80 μm, 85 μm, 90 μm, 95 μm, 100 μm, 150 μm, 200 μm, 250 μm, 300 μm, 350 μm, 400 μm, 450 μm, 500 μm, 550 μm, 600 μm, 650 μm, 700 μm, 750 μm, 800 μm, 850 μm, 900 μm, 950 μm, 1000 μm중 임의의 입자 크기 척도 또는 두 개의 입자 크기 척도 사이의 범위에서 선택되고; 상기 직경 크기는 평균치이다.
바람직한 일 양태에서, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 직경은 0.1 내지 10 μm에서 선택된다.
바람직한 일 양태에서, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 직경은 0.2 내지 6 μm에서 선택된다.
바람직한 일 양태에서, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 직경은 0.4 내지 5 μm에서 선택된다.
바람직한 일 양태에서, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 직경은 0.5 내지 3 μm에서 선택된다.
바람직한 일 양태에서, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 직경은 0.2 내지 1 μm에서 선택된다.
바람직한 일 양태에서, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 직경은 0.5 내지 1 μm에서 선택된다.
바람직한 일 양태에서, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 직경은 1 μm 내지 1 mm에서 선택된다.
바람직한 일 양태에서, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 평균 직경은 200 nm, 250 nm, 300 nm, 350 nm, 400 nm, 450 nm, 500 nm, 550 nm, 600 nm, 650 nm, 700 nm, 750 nm, 800 nm, 850 nm, 900 nm, 950 nm 및 1000 nm이고, 편차는 ±20%이며, 보다 바람직하게는 ±10%이다.
바람직한 일 양태에서, 상기 중합체의 주쇄는 폴리올레핀 주쇄 또는 아크릴산계 중합체 주쇄이다. 상기 아크릴산류 중합체의 정의는 "명사 및 용어" 부분을 참조한다. 바람직한 일 양태에서, 상기 폴리올레핀 주쇄는 또한 아크릴산계 중합체 주쇄(즉, 상기 중합체의 선형 주쇄는 폴리올레핀 주쇄이며, 아크릴산계 중합체의 주쇄로부터 제공됨)이다.
바람직하게는, 상기 아크릴산계 중합체의 단량체 단위는 아크릴산, 아크릴산염, 아크릴레이트, 메타크릴산, 메타크릴산염, 메타크릴레이트와 같은 아크릴산계 단량체 분자 중 하나 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 상기 아크릴산계 중합체는 상술한 단량체 중 하나를 중합하거나 상술한 단량체의 해당 조합을 공중합하여 얻을 수 있다.
바람직한 일 양태에서, 상기 중합체의 분지쇄는 작용기의 공유결합을 통해 비오틴 또는 비오틴 유사체에 공유결합되고, 비오틴 또는 비오틴 유사체는 중합체의 분지쇄 말단에 공유결합된다. 생체자기 마이크로스피어의 외부 표면에 있는 중합체 분자의 분지쇄에 포함된 작용기를 비오틴 또는 비오틴 유사체와 공유 반응시켜 얻을 수 있다. 여기서, 바람직한 일 실시양태에서, 상기 작용기는 특이적인 결합 부위(정의는 구체적인 실시양태의 "명사 및 용어" 부분을 참조)이다.
상기 작용기를 기반으로 한 공유결합은 공유결합에 참여하는 작용기에 의해 형성된 공유결합을 의미한다. 바람직하게는, 상기 작용기는 카르복실기, 히드록실기, 아미노기, 메르캅토기, 카르복실기의 염 형태, 아미노기의 염 형태, 포르메이트기 또는 상술한 작용기들의 조합이다. 바람직한 일 양태로서, 상기 카르복실기의 염 형태는 COONa와 같은 나트륨 염 형태이다. 바람직한 양태로서, 상기 아미노기의 염 형태는 염산염, 불화수소 등 형태를 포함하나 이에 제한되지 않는 무기염 형태 또는 유기염 형태일 수 있다. 상기 "작용기의 조합"은 하나의 자기 마이크로스피어의 외부 표면에 있는 모든 중합체 분자의 모든 분지쇄를 의미하며, 다른 작용기의 참여를 기반으로 한 공유결합의 형성을 허용한다. 비오틴을 예로 들어, 즉 하나의 비오틴 자기 마이크로스피어의 외부 표면의 모든 비오틴 분자는 각각 다른 작용기와 공유결합될 수 있지만, 하나의 비오틴 분자는 하나의 작용기와만 연결될 수 있다.
바람직한 일 양태에서, 상기 중합체의 선형 주쇄는 상기 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 직접 공유결합되거나, 연결기를 통해 상기 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 간접적으로 공유결합된다.
바람직한 일 양태에서, 상기 자기 마이크로스피어 본체는 SiO2로 코팅된 자기 재료이다. 대안적으로, SiO2는 자체 활성 부위를 가진 실란 커플링제일 수 있다.
바람직한 일 양태에서, 상기 자기 재료는 철산화물, 철화합물, 철합금, 코발트 화합물, 코발트 합금, 니켈 화합물, 니켈 합금, 망간 산화물 및 망간 합금 중 하나 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
보다 바람직하게는, Fe3O4, γ-Fe2O3, 질화철, Mn3O4, FeCrMo, FeAlC, AlNiCo, FeCrCo, ReCo, ReFe, PtCo, MnAlC, CuNiFe, AlMnAg, MnBi, FeNiMo, FeSi, FeAl, FeSiAl, BaO·6Fe2O3, SrO·6Fe2O3 및 PbO·6Fe2O3, GdO 중 하나 또는 이들의 조합이다. 여기서, 상기 Re는 희토류 원소이고, 상기 M은 Ba, Sr 및 Pb이며, 즉, 상기 MO·6Fe2O3는 BaO·6Fe2O3, SrO·6Fe2O3 또는 PbO·6Fe2O3이다.
2. 본 발명의 제2 측면은, 본 발명의 제1측면에서 제공되는 상기 생체자기 마이크로스피어를 기초로하고, 상기 비오틴 또는 비오틴 유사체를 연결요소로 사용하여 정제 매질이 더 연결된 생체자기 마이크로스피어를 제공한다. 즉, 상기 중합체의 분지쇄 말단에는 정제 매질이 연결요소를 통해 연결되어 있고, 상기 연결요소는 상기 비오틴 또는 비오틴 유사체를 포함한다.
상기 정제 매질은 아비딘형 태그, 폴리펩티드형 태그, 단백질형 태그, 항체형 태그, 항원형 태그 또는 이들의 조합을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
바람직한 일 양태에서, 상기 아비딘형 태그는 아비딘, 비오틴에 결합가능한 아비딘 유사체, 비오틴 유사체에 결합가능한 아비딘 유사체 또는 이들의 조합이다.
바람직한 일 양태에서, 상기 생체자기 마이크로스피어의 중합체의 분지쇄 말단에는 비오틴이 연결되어 있고, 상기 정제 매질은 상기 비오틴과의 사이에 친화 복합체의 결합효과를 형성하는 아비딘이다.
상기 아비딘은 스트렙타비딘, 변성 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 유사체 또는 이들의 조합일 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
바람직한 일 양태에서, 상기 폴리펩티드 태그는 CBP 태그, 히스티딘 태그, C-Myc 태그, FLAG 태그, Spot 태그, C 태그, Avi 태그, Streg 태그, WRHPQFGG 서열을 포함하는 태그, WRHPQFGG의 변이체 서열를 포함하는 태그, RKAAVSHW 서열을 포함하는 태그, RKAAVSHW의 변이체 서열을 포함하는 태그 또는 이들의 조합 중 하나의 태그 또는 이들의 변이체로부터 선택된다. 상기 Streg 태그에는 WSHPQFEK 및 이의 변이체가 함유된다.
바람직한 일 양태에서, 상기 단백질 태그는 친화성 단백질, SUMO 태그, GST 태그, MBP 태그 및 이들의 조합 중 임의의 태그 또는 이들의 변이체 단백질로부터 선택된다.
바람직한 일 양태에서, 상기 친화성 단백질은 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 변성 단백질 A, 변성 단백질 G, 변성 단백질 L 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
바람직한 일 양태에서, 상기 항체형 태그는 항체, 항체의 단편, 항체의 단일 사슬, 단일 사슬의 단편, 항체 융합 단백질 및 항체 단편의 융합 단백질 중 임의의 하나, 임의의 하나의 유도체 또는 임의의 하나의 변이체이다.
바람직한 일 양태에서, 상기 항체형 태그는 항단백질 항체이다.
바람직한 일 양태에서, 상기 항체형 태그는 항형광 단백질 항체이다.
바람직한 일 양태에서, 상기 항체형 태그는 나노항체이다.
바람직한 일 양태에서, 상기 항체형 태그는 항단백질의 나노항체이다.
바람직한 일 양태에서, 상기 항체형 태그는 항형광 단백질의 나노항체이다.
바람직한 일 양태에서, 상기 항체형 태그는 항녹색 형광 단백질 또는 이의 돌연변이체인 나노항체이다.
바람직한 일 양태에서, 상기 항체형 태그는 Fc 세그먼트이다.
상기 정제 매질이 상기 비오틴 또는 상기 비오틴 유사체에 연결되는 연결방식은 공유결합, 비공유결합(초분자 상호작용 등), 연결요소 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
바람직한 일 양태에서, 상기 공유결합은 동적 공유결합이고, 보다 바람직한 일 양태에서, 상기 동적 공유결합은 이민 결합, 아실히드라존 결합, 이황화 결합 또는 이들의 조합을 포함한다.
바람직한 일 양태에서, 상기 초분자 상호작용은 배위결합, 친화 복합체 상호작용, 정전기 흡착, 수소 결합, π-π중첩 작용, 소수성 상호작용 또는 이들의 조합이다.
상기 생체자기 마이크로스피어의 바람직한 일 양태에서, 상기 정제 매질은 친화 복합체를 포함하는 연결요소를 통해 상기 중합체의 분지쇄 말단에 연결된다.
바람직한 일 양태에서, 상기 친화 복합체 상호작용은 비오틴-아비딘 상호작용, 비오틴 유사체-아비딘 상호작용, 비오틴-아비딘 유사체 상호작용, 비오틴 유사체-아비딘 유사체 상호작용으로부터 선택된다.
바람직한 일 양태에서, 상기 비오틴 또는 비오틴 유사체는 친화 복합체의 작용을 통해 아비딘 또는 아비딘 유사체와 연결되고, 상기 정제 매질은 상기 아비딘 또는 아비딘 유사체에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다.
바람직한 일 양태에서, 상기 정제 매질은 아비딘형 태그-정제 매질 공유결합 복합체를 통해 상기 중합체의 분지쇄 말단의 비오틴 또는 비오틴 유사체에 연결되고, 아비딘형 태그를 통해 상기 비오틴 또는 비오틴 유사체 사이에 친화 복합체의 연결요소를 형성한다. 또한, 바람직한 일 양태에서, 상기 정제 매질은 아비딘-정제 매질 공유결합 복합체를 통해 상기 중합체 분지쇄 말단의 비오틴 또는 비오틴 유사체와 친화 복합체의 연결요소를 형성한다.
3. 본 발명의 제3측면은, 본 발명의 제1측면에서 제공되는 상기 생체자기 마이크로스피어를 기초로하고, 또한 상기 비오틴 또는 비오틴 유사체를 연결요소로 사용하여 친화 복합체의 결합작용을 통해 아비딘 또는 아비딘 유사체가 더 연결된, 생체자기 마이크로스피어를 제공한다.
상기 생체자기 마이크로스피어는 아비딘 자기 마이크로스피어 또는 아비딘 자석 비드라고도 한다.
상기 아비딘 또는 아비딘 유사체는 정제 매질로서 사용할 수 있고 다른 유형의 정제 매질을 추가로 연결하기 위한 연결요소로 사용할 수도 있다. 여기서, 상기 비오틴 또는 비오틴 유사체는 상기 아비딘 또는 상기 아비딘 유사체 사이에 친화 복합체의 결합효과를 형성한다.
바람직한 일 양태에서, 본 발명의 제1측면에서 제공되는 상기 생체자기 마이크로스피어를 기초로하고, 상기 비오틴과 결합하는 아비딘을 추가로 포함한다. 여기서, 비오틴과 아비딘 사이에는 친화 복합체의 결합효과가 형성된다. 즉, 상기 생체자기 마이크로스피어의 중합체의 분지쇄 말단에는 비오틴이 연결되고, 상기 정제 매질은 상기 비오틴과의 사이에 친화 복합체의 결합효과를 형성하는 아비딘이다.
바람직한 일 양태에서, 상기 아비딘은 스트렙타비딘, 변성 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 유사체 중 임의의 하나 또는 이들의 조합이다.
4. 본 발명의 제4 측면은, 본 발명의 제3 측면에서 제공되는 상기 생체자기 마이크로스피어를 기초로하고, 상기 아비딘 또는 아비딘 유사체와 연결된 친화성 단백질을 추가로 포함하는 생체자기 마이크로스피어를 제공한다. 이때, 비오틴 또는 비오틴 유사체, 아비딘 또는 아비딘 유사체는 모두 연결요소로 사용되며, 양자 사이에는 친화 복합체의 결합효과가 형성되며, 상기 친화성 단백질은 정제 매질로서 사용할 수 있고 연결요소로 사용할 수도 있고, 바람직하게는 정제 매질로 사용된다.
상기 생체자기 마이크로스피어는 친화성 단백질 자기 마이크로스피어 또는 친화성 단백질 자석 비드라고도 한다.
바람직한 일 양태에서, 본 발명의 제2 측면에서 제공되는 상기 생체자기 마이크로스피어를 기초로하고, 상기 정제 매질은 친화성 단백질이고, 상기 생체자기 마이크로스피어는 상기 친화성 단백질에 연결된 아비딘 및 상기 아비딘에 결합된 비오틴을 추가로 포함하며, 상기 생체는 상기 중합체의 분지쇄에 연결된다. 여기서, 정제 매질은 연결요소를 통해 상기 중합체의 분지쇄에 연결되고, 상기 연결요소에는 비오틴과 아비딘에 의해 형성된 친화 복합체가 포함된다.
바람직한 일 양태에서, 상기 친화성 단백질은 단백질 A, 단백질 G 및 단백질 L 중 하나 또는 이들의 변성 단백질이다.
5. 본 발명의 제5 측면은, 다음 단계를 포함하는 본 발명의 제1 측면에서 제공되는 상기 생체자기 마이크로스피어의 제조 방법(도 3을 참조)을 제공한다.
(1) 자기 마이크로스피어 본체는 화학적 개질되고, 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 아미노를 도입하여, 아미노로 개질된 자기 마이크로스피어 A를 형성하는 단계, 상기 자기 마이크로스피어 본체가 SiO2로 코팅된 자기 재료인 경우, 상기 커플링제는 아민화된 실란 커플링제인 것이 바람직하다.
바람직한 일 양태에서, 자기 마이크로스피어 본체는 커플링제에 의해 화학적 개질된다.
상기 자기 마이크로스피어 본체가 SiO2로 코팅된 자기 재료인 경우, 자기 마이크로스피어 본체는 실란 커플링제에 의해 화학적 개질될 수 있다. 상기 실란 커플링제는 아민화된 실란 커플링제인 것이 바람직하다.
(2) 카르복실과 아미노 사이의 공유 반응을 이용하여 아크릴산 분자를 상기 자기 마이크로스피어 A의 외부 표면에 공유결합시키고, 탄소-탄소 이중 결합을 도입하여 탄소-탄소 이중 결합 함유 자기 마이크로스피어 B를 형성한다.
(3) 가교제를 첨가하지 않은 조건하에서, 탄소-탄소 이중 결합의 중합 반응을 이용하여 아크릴산계 단량체 분자(예를 들어, 아크릴산 나트륨)를 중합하고, 얻어진 아크릴산계 중합체는 선형 주쇄와 작용기를 함유한 분지쇄를 가지며, 중합체는 선형 주쇄의 일단을 통해 자기 마이크로스피어 B의 외부 표면에 공유결합되어 아크릴산계 중합체로 개질된 자기 마이크로스피어 C를 형성한다.
상기 아크릴산류 단량체 분자 및 중합체 분지쇄의 작용기에 대한 정의는 "명사 및 용어" 부분을 참조한다.
바람직하게는, 상기 작용기는 카르복실기, 히드록실기, 아미노기, 메르캅토기, 포름산염, 암모늄염, 카르복실기의 염 형태, 아미노기의 염 형태, 포르메이트기 또는 상술한 작용기의 조합이다. 상기 "작용기의 조합"은 하나의 자기 마이크로스피어 외부 표면에 있는 모든 중합체의 모든 분지쇄에 포함된 작용기를 의미하며, 그 종류는 하나 이상일 수 있다. 제1 측면에서 정의된 "작용기의 조합"의 의미와 같다.
또한 바람직하게는, 상기 작용기는 특이적인 결합 부위이다.
(4) 상기 중합체의 분지쇄에 함유된 작용기를 통해, 비오틴 또는 비오틴 유사체를 중합체의 분지쇄 말단에 공유결합시켜 비오틴 또는 비오틴 유사체가 결합된 생체자기 마이크로스피어(비오틴 자기 마이크로스피어)를 얻는다.
6. 본 발명의 제6 측면은, 하기 단계를 포함하는 본 발명의 제2 측면에서 제공되는 상기 생체자기 마이크로스피어의 제조 방법을 제공한다.
(i) 제5 측면의 단계 (1) 내지 (4)에 의해 제조할 수 있는 청구항1에 따른 상기 생체자기 마이크로스피어를 제공한다.
(ii) 정제 매질을 상기 생체자기 마이크로스피어의 중합체 분지쇄 말단에 있는 비오틴 또는 비오틴 유사체에 연결시켜, 정제 매질이 결합된 생체자기 마이크로스피어를 얻는다.
7. 본 발명의 제7 측면은, 하기 단계를 포함하는 본 발명의 제2 측면에서 제공되는 상기 생체자기 마이크로스피어의 제조 방법을 제공한다.
(i) 제5 측면의 단계 (1) 내지 (4)에 의해 제조할 수 있는 청구항 1에 따른 상기 생체자기 마이크로스피어를 제공한다.
(ii) 아비딘 또는 아비딘 유사체와 정제 매질의 공유결합 복합체(예를 들어, 아비딘-정제 매질 공유결합 복합체)를 정제 매질의 원료로 사용하고, 이를 중합체의 분지쇄 말단에 결합시켜, 상기 비오틴 또는 비오틴 유사체와 상기 아비딘 또는 아비딘 유사체 사이에 친화 복합체의 결합효과를 형성하여, 정제 매질을 갖는 생체자기 마이크로스피어를 얻는다.
독립적으로 선택적으로, (6) 자석으로 생체자기 마이크로스피어를 침강시킨 다음 액상을 제거하고 세척하는 단계를 포함한다.
독립적으로 선택적으로, 상기 아비딘 또는 아비딘 유사체와 정제 매질의 공유결합 복합체를 교체함으로써 구현될 수 있는 상기 정제 매질 교체 단계를 포함할 수 있다.
8. 본 발명의 제8 측면은 하기 단계를 포함하는 본 발명의 제4 측면에서 제공되는 상기 생체자기 마이크로스피어의 제조 방법(도3과 같음)을 제공한다.
(1) 자기 마이크로스피어 본체는 화학적 개질되고, 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 아미노를 도입하여, 아미노로 개질된 자기 마이크로스피어 A를 형성하고, 상기 자기 마이크로스피어 본체가 SiO2로 코팅된 자기 재료인 경우, 상기 커플링제는 아민화된 실란 커플링제인 것이 바람직하다.
바람직한 일 양태에서, 자기 마이크로스피어 본체는 커플링제에 의해 화학적 개질된다.
상기 자기 마이크로스피어 본체가 SiO2로 코팅된 자기 재료인 경우, 자기 마이크로스피어 본체는 실란 커플링제에 의해 화학적 개질될 수 있다. 이때, 상기 커플링제는 아민화된 실란 커플링제인 것이 바람직하다.
(2) 카르복실과 아미노 사이의 공유 반응을 이용하여 아크릴산 분자를 상기 자기 마이크로스피어 A의 외부 표면에 공유결합시키고, 탄소-탄소 이중 결합을 도입하여 탄소-탄소 이중 결합 함유 자기 마이크로스피어 B를 형성한다.
(3) 가교제를 첨가하지 않은 조건하에서, 탄소-탄소 이중 결합의 중합 반응을 이용하여, 아크릴산계의 단량체 분자(예를 들어, 아크릴산 나트륨 등)를 중합하여, 얻어진 아크릴산계 중합체는 선형 주쇄와 작용기를 함유한 분지쇄를 가지며, 중합체는 선형 주쇄의 일단을 통해 자기 마이크로스피어 B의 외부 표면에 공유결합되어 아크릴산계 중합체로 개질된 자기 마이크로스피어 C를 형성한다.
바람직한 일 양태로서, 상기 작용기는 특이적인 결합 부위이다.
다른 바람직한 양태로서, 상기 작용기는 상술한 제1 측면의 작용기와 같다.
(4) 상기 중합체의 분지쇄에 함유된 작용기를 통해, 비오틴을 공유결합시켜 비오틴으로 개질된 생체자기 마이크로스피어 D(비오틴 자기 마이크로스피어)를 얻는다.
(5) 비오틴과 아비딘 사이의 특이적인 결합을 통해 아비딘-친화성 단백질 공유결합 복합체 E를 중합체의 분지쇄 말단에 결합시키고, 비오틴과 아비딘 사이에 친화 복합체의 결합효과를 형성하여, 생체자기 마이크로스피어 F(상기 생체자기 마이크로스피어 F에는 친화성 단백질이 결합된 일종의 친화성 단백질 자기 마이크로스피어 임)를 얻는다.
독립적으로 선택적으로, (6) 자석으로 생체자기 마이크로스피어 F를 침강시킨 다음 액상을 제거하고 세척하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 독립적으로 선택적으로, (7) 상기 아비딘-친화성 단백질 공유결합 복합체 E를 교체하는 단계를 포함할 수 있다.
9. 본 발명의 제9 측면은, 단백질 물질의 분리 및 정제에 있어서 본 발명의 제1 내지 제4 측면에서 제공되는 상기 생체자기 마이크로스피어의 용도를 제공한다.
바람직한 일 양태에서, 상기 생체자기 마이크로스피어는 항체 물질의 분리 및 정제에 있어서의 용도이다.
상기 항체 물질은 항체, 항체 단편, 항체 융합 단백질 및 항체 단편 융합 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 항체 및 항체 단편을 함유하는 단백질 물질을 의미한다.
상기 정제 매질이 친화 복합체를 함유한 연결요소를 통해 상기 중합체의 분지쇄 말단에 연결되는 경우, 상기 용도는 또한 생체자기 마이크로스피어의 재생 사용, 즉 정제 매질을 교체한 후의 재활용도 선택적으로 포함할 수 있다.
10. 본 발명의 제10 측면은, 항체 물질의 분리 및 정제, 특히 항체, 항체 단편, 항체 융합 단백질 및 항체 단편 융합 단백질의 분리 및 정제에 있어서의 본 발명의 제1 측면 내지 제4 측면에 따른 상기 생체자기 마이크로스피어의 용도를 제공한다.
상기 정제 매질은 친화성 단백질이다.
바람직한 일 양태에서, 상기 친화성 단백질은 비오틴-아비딘-친화성 단백질의 형태로 중합체의 분지쇄에 연결된다.
상기 친화성 단백질이 친화 복합체를 함유한 연결요소를 통해 상기 중합체의 분지쇄 말단에 연결되는 경우(예를 들어, 제4 측면에 따른 생체자기 마이크로스피어), 상기 용도는 또한 생체자기 마이크로스피어의 재생 사용, 즉 친화성 단백질을 교체한 후의 재활용도 선택적으로 포함할 수 있다.
11. 본 발명의 제11 측면은 생체자기 마이크로스피어를 제공한다. 상기 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에는 선형 주쇄와 분지쇄를 갖는 적어도 하나의 중합체가 있고, 상기 선형 주쇄의 일단이 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 고정되고, 중합체의 타단이 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에서 유리되고, 상기 자기 마이크로스피어의 중합체의 분지쇄 말단에는 정제 매질이 연결되어 있고, 상기 정제 매질은 아비딘형 태그, 폴리펩티드형 태그, 단백질형 태그, 항체형 태그, 항원형 태그 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
바람직한 일 양태에서, 상기 아비딘형 태그는 아비딘, 비오틴에 결합가능한 아비딘 유사체, 비오틴 유사체에 결합가능한 아비딘 유사체 또는 이들의 조합이다.
바람직한 일 양태에서, 상기 아비딘은 스트렙타비딘, 변성 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 유사체 또는 이들의 조합이다.
바람직한 일 양태에서, 상기 폴리펩티드형 태그는 CBP 태그, 히스티딘 태그, C-Myc 태그, FLAG 태그, Spot 태그, C 태그, Avi 태그, Streg 태그, WRHPQFGG 서열을 포함하는 태그, WRHPQFGG의 변이체 서열을 포함하는 태그, RKAAVSHW 서열을 포함하는 태그, RKAAVSHW의 변이체 서열을 포함하는 태그 또는 이들의 조합 중 임의의 태그 또는 이들의 변이체로부터 선택된다. 상기 Streg 태그에는 WSHPQFEK 또는 이의 변이체가 함유된다.
바람직한 일 양태에서, 상기 단백질형 태그는 친화성 단백질, SUMO 태그, GST 태그, MBP 태그 또는 이들의 조합 중 임의의 태그 또는 이들의 변이체로부터 선택된다.
바람직한 일 양태에서, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에는 선형 주쇄와 분지쇄를 가진 적어도 하나의 중합체가 있고, 상기 선형 주쇄의 일단이 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 공유적으로 고정되고, 중합체의 타단이 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에서 유리되고, 상기 마이크로스피어의 중합체의 분지쇄 말단에는 친화성 단백질이 연결된다.
또한 바람직하게는, 상기 친화성 단백질과 중합체 선형 주쇄 사이의 분지쇄 골격에는 친화 복합체의 결합효과가 존재한다.
보다 바람직하게는, 상기 친화성 단백질은 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 변성 단백질 A, 변성 단백질 G, 변성 단백질 L 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
발명의 효과
본 발명의 주요한 이점과 긍정적인 효과는 다음을 포함한다.
본 발명의 핵심 중 하나는 생체자기 마이크로스피어 구조에 있고, 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에는 선형 주쇄를 가진 중합체 분자가 공유적으로 고정되어 있고, 이러한 중합체 분자에는 정제 매질(비오틴, 아비딘, 친화성 단백질, 폴리펩티드 태그, 단백질 태그 등을 포함하지만 이에 제한되지 않음)이 연결된 다수의 기능화된 분지쇄가 추가로 있다. 상술한 구조를 통해, 생체자기 마이크로스피어의 외부 표면에 중합체의 선형 주쇄의 측단에 부유하는 다수의 정제 매질이 제공되어, 종래의 망상 구조로 인한 높은 체류 비율을 방지할 뿐만 아니라, 비표면적의 한계를 극복하여 다수의 표적물(항체 등)의 결합 부위를 제공할 수 있다. 여기서, 정제 매질의 종류는 정제될 물질의 종류에 따라 선택할 수 있다. 정제 매질이 강한 비공유의 상호작용을 갖는 친화 복합체의 형태로 중합체의 분지쇄에 연결되는 경우, 더 나아가, 정제 매질(친화성 단백질 등)과 중합체의 선형 주쇄 사이의 분지쇄 골격에 친화 복합체의 결합효과도 존재할 수 있어, 정제 매질(친화성 단백질 등)을 쉽게 교체할 수 있다. 분리 및 정제될 표적물이 항체류 단백질인 경우, 정제 매질은 일반적으로 친화성 단백질이다. 자기 마이크로스피어의 제조 및 원리 부분에 대한 설명과 결합하여 이해한다.
본 발명의 핵심은 상술한 생체자기 마이크로스피어 구조의 구축과정(제조 방법)에 있다. 외부 표면의 화학적 개질을 통해 자석 비드의 외부 표면(생체자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면)에 여러 개의 결합 부위를 제공한 다음 자석 비드의 외부 표면에 있는 단일 결합 부위에 중합체 분자를 공유결합시키며, 중합체 분자는 선형 주쇄의 일단을 통해 자석 비드의 외부 표면에 있는 단일 결합 부위에 공유결합되고 선형 주쇄를 따라 다수의 곁사슬이 분포되어 있고 곁사슬에는 신생 결합 부위가 있고, 이로 하여, 결합 부위를 여러 배, 수십 배, 백 배 이상, 수백 배 심지어 천 배 이상으로 증폭시키며, 구체적인 정제 요구 사항에 따라 중합체 분지쇄의 신생 결합 부위에 특정된 정제 매질을 연결하여, 해당하는 특정 표적 분자(특히 항체류 단백질 분자를 포함하지만 이에 국한되지 않는 생화학 분자)의 포획을 구현한다. 또한, 생체자기 마이크로스피어의 단일 결합 부위는, 하나의 선형 중합체 주쇄에만 공유결합하거나 둘 이상의 선형 주쇄에 공유결합할 수 있으므로, 체류 비율이 높아지는 사슬 축적이 발생하지 않아서 좋다.
바람직하게는, 하나의 결합 부위에서 하나의 선형 주쇄만 인출되어, 이때 선형 주쇄를 위해 큰 활동 공간을 제공할 수 있다.
또한 바람직하게는, 하나의 결합 부위에서 2개의 선형 주쇄만 인출되어, 선형 주쇄를 위해 가능한 큰 활동 공간을 제공할 수 있다.
본 발명의 주요한 이점 및 긍정적인 효과는 다음을 더 포함한다.
(1) 본 발명의 구조적 설계는 다수의 분지쇄 특수 구조를 갖는 중합체로 자기 마이크로스피어의 표면을 코팅하는 것을 통해 비표면적의 국한성을 극복함으로써 다수의 정제 매질 결합 부위를 제공하여, 자기 마이크로스피어의 표면에 결합가능한 정제 매질의 수를 여러 배, 열 배 이상, 수십 배, 백 배 이상, 수백 배 심지어 천 배 이상으로 증폭시켜 표적물에 대한 높은 처리량 결합을 구현하며, 표적물은 단백질 물질인 것이 바람직하다. 이리 하여, 생체자기 마이크로스피어는 혼합계에서 자기 마이크로스피어로 표적물(항체, 항체 단편 또는 이의 융합 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 표적 단백질 등)을 효율적으로 포획하여 높은 처리량 결합, 즉, 높은 처리량 분리를 구현할 수 있다.
(2) 중합체 사슬 자체의 유연성을 이용하여 반응 정제 혼합계에서 중합체 사슬이 유연하게 스윙할 수 있어, 정제 매질의 활동 공간을 확장하고 단백질의 포획 속도 및 결합량을 증가시키고, 표적물의 신속하고 충분한 결합을 촉진시키고 높은 효율 및 높은 처리량을 구현한다.
(3) 본 발명의 구조적 설계는 생체자기 마이크로스피어가 용출되는 동안, 정제된 표적물(항체, 항체 단편 또는 이의 융합 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는 표적 단백질 등)의 효율적인 용출을 구현하고, 표적물의 체류 시간과 체류 비율을 효과적으로 감소시켜, 높은 효율 및 높은 수율을 구현한다. 정제 매질은 중합체의 분지쇄 말단에 연결될 수 있어, 한편으로 중합체의 구조가 망상 구조를 형성하지 않을 수 있어 분지쇄의 축적이 발생하지 않아 불연속적인 공간과 사각의 출현을 방지할 수 있어, 전통적인 망상 구조로 인한 높은 체류 시간과 높은 체류 비율을 방지할 수 있다. 다른 한편으로, 중합체의 분지쇄는 또한 스페이서로 작용하여 정제 매질이 혼합계에 완전히 분포될 수 있도록 하며 마이크로스피어의 표면과 중합체의 내부 골격으로부터 멀리 떨어져 있어, 표적물을 포획하는 효율을 높일 뿐만 아니라 이어지는 용출 단계에서도 표적물의 체류 시간과 체류 비율을 효과적으로 감소시켜, 높은 처리량, 높은 효율 및 높은 비율로 분리를 구현한다. 본 발명의 구조적 설계는, 선형 주쇄의 높은 유연성을 활용할 수 있을 뿐만 아니라 분지쇄 수량이 높은 배수로 증폭하는 이점을 겸비하므로, 고속 및 높은 처리량의 결합, 높은 효율, 높은 비율(높은 수율)의 분리를 더 잘 구현할 수 있다.
(4) 본 발명의 생체자기 마이크로스피어의 정제 매질(친화성 단백질 등)은 강한 비공유결합력을 갖는 친화 복합체의 방식으로 자석 비드의 외부 표면에 있는 중합체의 분지쇄 말단에 연결될 수 있다. 정제 매질(친화성 단백질 등)을 갱신 및 교체해야 할 경우, 마이크로스피어에서 정제 매질을 쉽고 빠르게 용출하여 새로운 정제 매질을 재결합할 수 있어, 자기 마이크로스피어의 정제 성능을 신속하게 회복하여 생체자기 마이크로스피어를 여러 번 재생 사용할 수 있기에 분리 및 정제 비용을 절감한다.
(5) 본 발명의 생체자기 마이크로스피어는 조작 및 사용이 편리하다. 표적물이 결합된 자기 마이크로스피어를 시스템에서 분리할 때, 조작이 편리하고 작은 덩어리의 자석만 이용하면 자기 마이크로스피어의 집합상태와 위치를 효율적으로 조절할 수 있어, 용액 내 자기 마이크로스피어의 신속한 분산 또는 신속한 침전을 구현하여, 고속 원심분리기와 같은 대형 실험 설비를 사용하지 않고도 표적물(항체 등)의 분리 및 정제를 간단하고 신속하게 수행하여 분리 및 정제 비용을 크게 절감할 수 있다.
(6) 본 발명에서 제공되는 생체자기 마이크로스피어는 사용이 광범위하고 정제 매질에 대한 선택성이 있다. 구체적인 정제 기질의 종류에 따라, 해당하는 정제 매질을 자기 마이크로스피어 시스템에 유연하게 탑재하여 특정 표적 분자(특히 단백질 물질)의 포획을 구현할 수 있다. 예를 들어, 친화성 단백질을 표적화된 방식으로 선택하여 사용할 수 있어, 항체, 항체 단편 또는 이의 융합 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 항체 물질의 분리 및 정제에 보편적으로 대규모로 응용된다.
도 1은 본 발명의 제1 측면에서 제공되는 생체자기 마이크로스피어 구조의 개략도이다. 여기서, 자기 마이크로스피어의 본체는 SiO2로 코팅된 Fe3O4 예로서, 비오틴을 정제 매질로 사용한 것을 제시한다. 도면에서, 중합체 분자수(4개)는 간단 명료를 위한 제시일 뿐 자기 마이크로스피어의 외부 표면의 중합체 분자 수를 4개로 제한하는 것을 의미하지 않으며, 제조 과정에서 각 원료의 함량에 따라 제어 및 조절할 수 있다. 마찬가지로, 선형 주쇄 측단에 부유되어 있는 분지쇄의 수도 제시일 뿐 본 발명의 중합체 분자의 곁사슬 수를 제한하는 것은 아니다.
도 2는 본 발명의 제4 측면에서 제공되는 생체자기 마이크로스피어 구조의 개략도이다. 단백질 A를 정제 매질로 사용한 것을 제시하며, 단백질 A는 "비오틴-아비딘-단백질 A의 방식"을 통해 브러시 구조의 분지쇄 말단에 결합된다. 여기서, 생체자기 마이크로스피어 본체는 SiO2로 코팅된 Fe3O4를 예로 한다. 도면에서, 중합체 분자 수와 주쇄 측단의 분지쇄 수는 단지 제시일 뿐 본 발명의 중합체 분자의 곁사슬 수를 제한하는 것이 아니다.
도 3은 본 발명의 제4 측면에서 제공되는 생체자기 마이크로스피어의 제조 방법의 흐름도이다. 여기서, 아미노로 개질된 자기 마이크로스피어 A로부터 생체자기 마이크로스피어 D의 제조 과정은 제5 측면에서 제공되는 생체자기 마이크로스피어의 제조 방법에 해당한다.
도 4는 생체자기 마이크로스피어 D(비오틴 자석 비드)를 단백질 A-eGFP-아비딘에 결합하기 전과 결합한 후의 실험 결과를 나타낸다. RFU 값은 1회 배양한 측정 결과이다. 체외 단백질 합성 시스템을 통해 단백질 A-eGFP-아비딘(SPA-eGFP-아비딘)을 제조하고, IVTT 반응 후의 상청액(IVTT 상청액으로 약기)을 얻어, 생체자기 마이크로스피어 D와 결합하기 전과 결합한 후 용액의 RFU값 변화를 비교한다. 두 가지 단백질 A-eGFP-아비딘에서, 번호 1에 해당하는 아비딘은 스트렙타아비딘(Streptavidin)이고, 번호 2에 대응하는 아비딘은 타마비딘(Tamvavidin)2이다. "전체(Total)"는 결합하기 전 IVTT 상청액의 RFU 값(생체자기 마이크로스피어 처리 전)에 해당하고, "상청액(Supernatant)"은 결합한 후 IVTT 상청액의 RFU 값(생체자기 마이크로스피어 처리 후)에 해당한다.
도 5는 생체자기 마이크로스피어 F(단백질 A 자석 비드)를 제조한 실험 결과인 RFU 값의 측정 결과이고, 단백질 A-eGFP-아비딘 포화 결합이다. 생체자기 마이크로스피어 D는 단백질 A-eGFP-아비딘을 발현하는 IVTT 반응 후 얻어진 용액(IVTT 상청액으로 약기)과 반복적으로 결합시켜, 단백질 A-eGFP-아비딘에 의해 포화 결합된 생체자기 마이크로스피어 F를 얻는다. 여기서, 1에 대응하는 아비딘은 스트렙타비딘이고, 2에 대응하는 아비딘은 타마비딘2이며, 상청액은 생체자기 마이크로스피어 처리되지 않은 IVTT 상청액에 해당한다. 통과1(Flow-through)(관류액 1), 통과 2(관류액 2), 통과 3(관류액 3)은 각각 자기 마이크로스피어를 아비딘-단백질 A와 함께 연속 3회 배양(포획 결합) 및 용출(탈결합 및 방출)하며, 매번 동일한 소스 및 동일한 양의 IVTT 상청액을 사용하여 순차적으로 얻은 관류액 1, 2 및 3에 해당한다.
도 6은 생체자기 마이크로스피어 F의 항체의 분리 및 정제 실험 결과를 나타내고, 생체자기 마이크로스피어 F에서 아비딘은 스트렙타비딘이다. 생체자기 마이크로스피어 F와 항체 IgG 용액을 함께 배양한 후 용출하고, 항체 IgG를 포획하여 항체 용액에서 분리하고 용출액으로 용출 및 방출하고, 정제된 항체를 함유한 해당 용출액의 상응하는 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 측정 결과이다. 여기서, 레인 1, 2, 3 및 4는 SPA-자기 마이크로스피어의 컬럼 베드 부피가 2μL, 6μL, 18μL 및 54μL일 때의 항체 용출 밴드에 해당하고, 라인 5는 양성 대조군(상업적으로 구매 가능한 생공 생물공정(상해) 유한주식회사(생공회사로 약칭함)) 단백질 A 아가로스 컬럼 베드 부피가 7.5μL인 항체 용출 밴드이다. 여기서, M은 마커 분자량 라벨에 해당한다.
도 7은 생체자기 마이크로스피어 F를 반복적으로 사용한 실험 결과를 나타내고, 생체자기 마이크로스피어 F에서 아비딘은 스트렙타비딘이다. 생체자기 마이크로스피어 F를 항체 용액과 함께 배양(항체 결합), 세척 및 용출(항체 방출)을 3회 반복하고 용출액을 SDS-PAGE 전기영동으로 측정한 결과이다. 여기서, 라인 1, 2, 3 및 4는 각각 SPA-자기 마이크로스피어의 컬럼 베드 부피가 2μL, 6μL, 18μL 및 54μL일 때의 항체 용출 밴드에 해당하고, 라인 5는 양성 대조군(상업적으로 구매 가능한 생공 생물공정(상해) 유한주식회사(생공회사로 약칭함)) 단백질 A 아가로스 컬럼 베드 부피가 7.5μL인 항체 용출 밴드이다. 여기서 M는 마커 분자량 라벨에 해당한다.
도8은 생체자기 마이크로스피어의 재생 실험 결과인 상대 형광 값 시험 결과이고, 단백질 A-eGFP- 타마비딘2를 사용였다. 생체자기 마이크로스피어 D를 단백질 A-eGFP-아비딘의 IVTT 반응 후 얻은 용액과 반복적으로 결합시켜 단백질 A-eGFP-아비딘에 의해 포화 결합된 생체자기 마이크로스피어 F(1)을 얻는다. 다음, 상기 단백질 A-eGFP-아비딘을 생체자기 마이크로스피어 D에서 용출시키고, 두 번째로 상기 생체자기 마이크로스피어 D를 신선한 단백질 A-eGFP-아비딘의 IVTT 반응 후 얻은 용액과 결합시켜, 제2차로 단백질 A-eGFP-아비딘에 의해 포화 결합된 생체자기 마이크로스피어 F(2)를 얻는다. 상술한 단계를 반복하여 제3차로 단백질 A-eGFP-아비딘에 의해 포화 결합된 생체자기 마이크로스피어 F(3)을 얻는다. 여기서, 상청액은 생체자기 마이크로스피어 처리를 거치지 않은 IVTT 상청액에 해당한다. 관류액 1(통과 1), 관류액 2(통과 2) 및 관류액 3(통과 3)은 각각 자기 마이크로스피어를 아비딘-단백질 A와 함께 연속 3회 배양하며, 매번 동일한 IVTT 상청액(새로운 흡취)을 사용하여 순차적으로 얻은 관류액 1, 2 및 3에 해당한다.
도 9는 생체자기 마이크로스피어가 재생 및 재생된 후의 항체 분리 및 정제의 실험 결과이고, 단백질 A-eGFP-타마비딘2를 사용하였다. 단백질 A-eGFP-아비딘에 의해 포화 결합된 생체자기 마이크로스피어 F를 변성 완충액으로 용출하고, 용출된 단백질 A-eGFP-아비딘을 함유한 용출액으로 SDS-PAGE 측정한다. 라인 1, 2 및 3은 각각 제1차로 포화 결합된 후의 용출, 제2차로 포화 결합된 후의 용출, 제3차로 포화 결합된 후의 용출을 나타내며, 각각 생체자기 마이크로스피어 F에서 용출된 단백질 A-eGFP-아비딘을 함유한 용출액의 밴드이다. 라인 4는 제3차로 재생된 생체자기 마이크로스피어 F와 상업적으로 구매한 신생 소 혈청을 함께 배양한 후 용출 완충액으로 용출하여 정제된 항체 단백질의 밴드이다. 여기서 M은 마커 분자량 라벨에 해당한다.
도 10은 단백질 G에 대한 생체자기 마이크로스피어 G(단백질 G 자석 비드, 단백질 G 자석 비드)의 로딩 측정 결과인 RFU 값의 측정 결과이다. 생체자기 마이크로스피어 D를 단백질 G-eGFP-아비딘의 IVTT 상청액과 함께 3회 배양하여 단백질 G-eGFP-아비딘에 의해 포화 결합된 생체자기 마이크로스피어 G를 얻는다. 여기서, 상청액은 생체자기 마이크로스피어로 처리되지 않은 IVTT 상청액에 해당한다. 3회 배양하여 해당하는 관류액 FT1(관류액1), FT 2(관류액2) 및 FT 3(관류액3)을 각각 얻는다.
도 11은 생체자기 마이크로스피어 G(단백질 G 자석 비드)로 항체를 분리 및 정제한 실험 결과를 나타낸다. 생체자기 마이크로스피어 G를 항체IgG 용액과 함께 배양한 후 용출하고, 항체 IgG를 포획하여 항체 용액에서 분리하고 용출액으로 용출 및 방출하고, 정제된 항체를 함유한 해당 용출액으로 SDS-PAGE 측정한다. 여기서 M은 마커 분자량 라벨에 해당한다.
도 12는 eGFP단백질을 결합한 생체자기 마이크로스피어 H(항EGFP나노항체가 있는 자석 비드)의 RFU 값 측정 결과를 나타낸다. 생체자기 마이크로스피어H를 eGFP단백질의 IVTT 상청액과 함께 배양하여, eGFP단백질을 결합시킨다. 여기서, 전체는 생체자기 마이크로스피어로 처리되지 않은 IVTT 상청액에 해당하고 관통은 1회 배양한 관류액에 해당한다.
도 13은 생체자기 마이크로스피어H(항EGFP 자석 비드)로 eGFP단백질을 분리 및 정제한 시험 결과를 나타낸다. 생체자기 마이크로스피어H를 eGFP단백질 용액과 함께 배양하여 용출한 다음 eGFP단백질을 포획하여 원액에서 분리 및 용출하여 용출액에 방출하고, 정제된 eGFP 단백질을 함유한 해당하는 용출액의 SDS-PAGE 측정 결과이다. 여기서, M은 마커 분자량 라벨에 해당한다.
이하, 구체적인 실시형태 및 실시예를 조합하여 첨부 도면을 참조하면서 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 이러한 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위해 사용되며 본 발명의 범위를 제한하지 않는다는 것을 이해해야 한다. 하기 실시예에서 구체적인 조건을 명시하지 않는 실험 방법은 상술한 구체적인 실시형태 지침의 조건을 우선적으로 따르고 참조한 다음 일반적인 조건, 예를 들어, "Sambrook 등, 분자 복제: 실험실 매뉴얼(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)", "무세포 단백질 합성 실험실 매뉴얼"("Edited by Alexander S. Spirin And James R. Swartz. Cell-free protein synthesis: methods And protocols[M]. 2008 ")등 문헌에 기재된 실험 조건을 따르거나 제조업체에 의해 건의된 조건을 따른다.
달리 명시되지 않는 한, 본 발명에서 언급된 백분율 및 부수는 중량 백분율 및 중량 부수이다.
달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 실시예에 사용된 재료와 시약은 모두 상업적으로 구매 가능한 제품이다.
달리 명시되지 않는 한, 본 출원에서 온도 단위는 모두 섭씨도(℃)이다.
뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 목록
서열번호 1, 단백질 A의 뉴클레오티드 서열, 873개의 염기 길이이다.
서열번호 2, 타마비딘2의 뉴클레오티드 서열, 423개의 염기 길이이다.
서열번호 3, mEGFP의 뉴클레오티드 서열, 714개의 염기 길이이다.
서열번호 4, 단백질 G항체 결합 도메인의 뉴클레오티드 서열, 585개의 염기 길이이다.
서열번호 5, 나노항체 항-eGFP의 아미노산 서열, 117개의 아미노산 길이이다.
서열번호 6, mScarlet의 뉴클레오티드 서열, 693개의 염기 길이이다.
명사 및 용어
다음은 본 발명의 보다 나은 이해를 돕기 위해 본 발명에서 사용된 일부 관련된 "명사" 및 "용어"의 의미에 대한 해석이나 설명이다. 상응하는 해석이나 설명은 본 발명 전체에 적용되며 아래 문장 및 위 문장 모두에 적용된다. 본 발명에서 참고문헌에 관련될 경우, 참고문헌에 기재된 관련 용어, 명사 및 구의 정의도 함께 인용하되, 본 발명의 정의와 상충할 경우에는 본 발명의 정의를 기준으로 한다. 인용된 문헌의 정의와 본 발명의 정의가 상충할 경우, 인용된 성분, 물질, 조성물, 재료, 시스템, 제형, 종류, 방법 및 설비 등에 영향을 미치지 않으며, 인용된 문서에서 결정된 내용을 기준으로 한다.
자석 비드는 미세 입자 크기를 갖는 강자기 마이크로스피어 또는 강자기화된 마이크로스피어이고, 자석 비드로도 설명될 수 있고, 직경 크기는 0.1 μm 내지 1000 μm인 것이 바람직하다. 본 발명의 자석 비드 실예에는 자기 마이크로스피어 A, 자기 마이크로스피어 B, 자기 마이크로스피어 C, 생체자기 마이크로스피어 D(비오틴 자석 비드), 생체자기 마이크로스피어F(단백질 A 자석 비드), 생체자기 마이크로스피어G(단백질 G 자석 비드), 생체자기 마이크로스피어H(항EGFP 나노 항체가 있는 자석 비드) 및 생체자기 마이크로스피어K(항체 자석 비드)가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
자기 마이크로스피어 본체는 개질된 부위를 가진 자석 비드(결합가능한 부위가 있는 자기 마이크로스피어)로서, 예를 들어, 이산화규소로 코팅된 자기 재료 입자, 보다 구체적으로 아민화된 이산화규소로 코팅된 자기 재료 입자이다.
자기 마이크로스피어 A는 아미노로 개질된 자기 마이크로스피어이다.
자기 마이크로스피어 B는 탄소-탄소 이중 결합을 함유한 자기 마이크로스피어이다.
자기 마이크로스피어 C는 아크릴산류 중합체로 개질된 자기 마이크로스피어이다.
비오틴 자석 비드는 비오틴 또는 비오틴 유사체가 결합된 자석 비드로서, 아비딘형 태그를 가진 물질에 특이적으로 결합할 수 있다. 이는 표적 단백질을 아비딘 또는 아비딘의 단백질 돌연변이체로 라벨링한 후, 융합 단백질의 형태로 통합적으로 발현시킬 수 있고, 응용 방식이 간단한 장점이 있다. 비오틴 자기 마이크로스피어라고도 칭한다. 여기서, 비오틴 또는 비오틴 유사체는 정제 매질 또는 연결요소로 사용할 수 있다.
생체자기 마이크로스피어 D는 비오틴 또는 비오틴 유사체가 결합된 자기 마이크로스피어로서, 일종 비오틴 자석 비드이다. 여기서 비오틴은 정제 매질 또는 연결요소로 사용할 수 있다.
아비딘 자석 비드는 아비딘 또는 아비딘 유사체가 결합된 자석 비드로서 비오틴형 태그를 가진 물질에 특이적으로 결합할 수 있다. 아비딘 자기 마이크로스피어라고도 칭한다.
생체자기 마이크로스피어F는 단백질 A가 결합된 자기 마이크로스피어로서, 일종 단백질 A 자석 비드이다. 비오틴으로 개질된 생체자기 마이크로스피어 D와 아비딘-단백질 A 공유결합 복합체 E가 결합하여 구성될 수 있다.
친화성 단백질 자석 비드는 친화성 단백질이 결합된 자기 마이크로스피어로서, 항체 물질의 분리 및 정제에 사용할 수 있다. 친화성 단백질 자기 마이크로스피어라고도 칭한다.
생체자기 마이크로스피어G는 단백질 G가 결합된 자기 마이크로스피어로서, 일종 단백질 G 자석 비드이다. 예를 들어, 비오틴으로 개질된 생체자기 마이크로스피어 D와 아비딘-단백질 G 공유결합 복합체가 결합하여 구성될 수 있다.
생체자기 마이크로스피어K는 항체형 태그에 결합한 자석 비드이다. 이와 특이적으로 결합될 수 있는 표적물을 분리 및 정제하는 데 사용할 수 있다. 항체 자기 마이크로스피어 또는 항체 자석 비드라고도 칭한다.
나노항체 자석 비드는 나노항체가 결합된 자석 비드이다. 이와 특이적으로 결합될 수 있는 표적물을 분리 및 정제하는 데 사용할 수 있다. 나노항체 자기 마이크로스피어라고도 칭한다.
생체자기 마이크로스피어H는 나노항체 자석 비드로서, 일종 나노항체 항EGFP가 결합된 자기 마이크로스피어(항EGFP 자석 비드)이다. 아비딘-항EGFP 공유결합 복합체를 결합하여 구성될 수 있다.
중합체는, 본 발명에서 올리고머 및 중합체를 광범위하게 포함하며 적어도 3개의 구조 단위를 갖고 있거나 분자량은 적어도 500 Da(상기 분자량은 수 평균 분자량, 중량 평균 분자량 및 점도 평균 분자량 등과 같은 적당한 표징 방식을 사용할 수 있음)이다.
폴리올레핀 사슬은 탄소 원자에 의해서만 공유 연결된 헤테로 원자가 포함되지 않은 중합체 사슬을 의미한다. 본 발명은 주로 아크릴산류 중합체의 선형 주쇄와 같은 브러시 구조의 폴리올레핀 주쇄에 관한 것이다.
아크릴산류 중합체는 -C(COO-)-C- 단위 구조를 갖는 호모중합체 또는 공중합체를 의미하며, 상기 공중합체의 공중합 형태는 특별히 제한되지 않으나 선형 주쇄 및 계량 측기 COO-를 제공하는 것이 적합하다. 상기 아크릴산류 중합체의 선형 주쇄에는 헤테로 원자가 함유될 수 있다. 여기서, 탄소-탄소 이중 결합에는 메틸 치환기(-CH3C(COO-)-C-에 해당)와 같은 합반응의 진행에 영향을 미치지 않는 한 다른 치환기가 추가로 존재할 수 있다. 여기서, COO-의 존재 형태는 -COOH일 수 있고, 또한 염 형태(나트륨 염 등)일 수 있고, 또한 포름에스테르 형태(바람직하게는 메틸 포르메이트-COOCH3, 포름산에틸-COOCH2CH3과 같은 알킬 포메이트, 또한 히드록시에틸 포르메이트-COOCH2CH2OH) 등일 수 있다. -C(COO-)-C- 단위 구조의 구체적인 구조 형태는 -CH(COOH)-CH2-, -CH(COONa)-CH2-, -MeC(COOH)-CH2-, -MeC(COONa)-CH2-, -CH(COOCH3)-CH2-, -CH(COOCH2CH2OH)-CH2-, -MeC(COOCH3)-CH2- 및 -MeC(COOCH2CH2OH)-CH2- 중의 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 여기서, Me은 메틸이다. 하나의 중합체 분자의 선형 주쇄에는 상술한 단위 구조(호모중합체에 해당함) 하나만 있을 수 있고, 2개 이상의 단위 구조(공중합체에 해당함)를 포함할 수도 있다.
아크릴산류 단량체 분자는 CH(COOH)=CH2, CH(COONa)=CH2, CH3C(COOH)=CH2, CH3C(COONa)=CH2, CH(COOCH3)=CH2, CH(COOCH2CH2OH)=CH2, CH3C(COOCH3)=CH2 및 CH3C(COOCH2CH2OH)=CH2 와 같은 C(COO-)=C의 기본 구조를 갖는 아크릴산류 중합체를 합성하는 데 사용할 수 있다.
분지쇄는, 본 발명에서 분기점에 연결되고 독립적인 말단을 갖는 사슬이다. 본 발명에서 분지쇄와 곁사슬은 동일한 의미를 가지며, 혼용될 수 있다. 본 발명에서, 분지쇄는 중합체 선형 주쇄에 결합된 측쇄 또는 측기를 의미하며, 분지쇄의 길이와 크기에 대해 특별한 요구 사항이 없으며, 카르복실, 히드록실 및 아미노와 같은 짧은 분지쇄일 수 있고, 비교적 많은 원자수를 포함한 긴 분지쇄일 수도 있다. 분지쇄의 구조에 대하여 특별한 요구 사항이 없으며, 선형이거나 분기 구조를 가진 분지쇄일 수 있다. 분지쇄에는 별도의 측쇄 또는 측기가 포함될 수도 있다. 분지쇄의 수, 길이, 크기 및 재분기 정도 등 구조적 특성은 가능한 망상 구조를 형성하지 않도록 하여, 분지쇄의 축적으로 인한 체류 비율의 증가를 방지하는 것이 바람직하고, 이때 선형 주쇄의 유연한 스윙을 원활하게 발휘할 수 있다.
분지쇄 골격은, 공유결합 또는 비공유결합 방식에 의해 순차적으로 연결된 골격 원자로 구성되며, 분지쇄 말단으로부터 중합체의 주쇄에 연결된다. 중합체 말단의 작용기는 분지쇄 골격을 통해 중합체의 주쇄에 연결된다. 분지쇄 골격과 주쇄의 교차점도 분지쇄의 분기점을 인출한다. 예를 들어, 정제 매질과 중합체 선형 주쇄 사이의 분지쇄 골격에서, 정제 매질로 친화성 단백질을 사용한 예로서, 중합체의 분지쇄 말단에 있는 친화성 단백질은 순차적으로 아비딘, 비오틴, 프로판디아민 잔기(-NH-CH2CH2CH2-NH-) 및 카르보닐(카르복실이 아미드화 반응한 후의 잔기)를 통해 중합체의 폴리올레핀 주쇄에 연결될 수 있다.
분지쇄 말단은 모든 분지쇄의 말단을 포함한다. 선형 주쇄의 경우, 자기 마이크로스피어 본체의 일단에 고정될 뿐만 아니라, 선형 주쇄의 타단이 반드시 일 분기점에 연결되어야 하므로, 본 발명의 "분지쇄 말단"의 범주 내에도 광범위하게 포함된다. 따라서, 본 발명의 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 연결된 중합체는 적어도 하나의 분기점을 가지고 있다.
중합체 분지쇄의 작용기는, 다른 원료의 반응기와 직접적으로 공유 반응하거나, 활성화된 후 다른 원료의 반응기와 공유 반응하여 공유결합 연결을 생성할 수 있는, 반응 활성이 있는 작용기 또는 활성화된 후 반응 활성이 있는 작용기를 의미한다. 이의 바람직한 일 양태로서, 중합체 분지쇄의 작용기는 특이적인 결합 부위이다.
직접 연결방식은 스페이서 원자의 도움 없이 상호작용이 직접 발생하는 연결방식을 의미한다. 상기 상호작용의 형태는 공유방식, 비공유 방식 또는 이의 조합방식을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
간접 연결방식은 적어도 하나의 연결요소에 의해 형성된 연결방식을 의미하며, 이때 적어도 하나의 스페이서 원자가 관련된다. 상기 연결요소는 연결 펩티드, 친화 복합체 연결 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
고정, ~에 고정되고, 고정된, ~에 고정하고 등 "고정" 방식은 공유결합 방식을 의미한다.
가진, 연결된, 연결되는, ~에 연결하는, 결합, 포착 및 포획 등 "연결"/"결합" 방식은 특별한 제한이 없이 공유방식과 비공유 방식 등 방식을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
공유방식은 공유결합으로 직접 결합하는 방식이다. 상기 공유방식에는 동적 공유방식이 포함되지만 이에 제한되지 않으며, 상기 동적 공유방식은 동적 공유결합으로 직접 결합하는 방식을 의미한다.
공유결합은 아미드 결합 및 에스테르 결합과 같은 일반적인 공유결합과, 가역적 특성을 가진 동적 공유결합도 포함한다. 상기 공유결합에는 동적 공유결합이 포함된다. 동적 공유결합은 이민 결합, 아실히드라존 결합, 이황화 결합 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 가역적 특성을 갖는 화학 결합이다. 화학분야에 속하는 기술자는 그 의미를 이해할 수 있다.
비공유 방식은 배위결합, 친화 복합체 상호작용, 정전기 흡착, 수소 결합, π-π중첩 효과 및 소수성 상호작용 등 초분자 상호작용 방식을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
초분자 상호작용은 배위결합, 친화 복합체 상호작용, 정전기 흡착, 수소결합, π-π중첩 효과, 소수성 상호작용 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
연결요소는 연결기라고도 칭되며, 적어도 하나의 원자를 포함하며 2개 이상의 인접하지 않은 라디칼을 연결하는 데 사용되는 요소를 의미한다. 상기 연결요소와 인접한 라디칼 사이의 연결방식은 특별한 제한이 없으며, 공유방식 및 비공유 방식과 같은 방식을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 연결요소의 내부 연결방식은, 특별한 제한이 없으며 공유방식 및 비공유 방식과 같은 방식을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
공유 연결요소는 연결요소의 일단으로부터 타단의 스페이서 원자 사이가 모두 공유방식으로 서로 연결된 것이다.
특이적 결합 부위: 본 발명에서 상기 특이적 결합 부위는 중합체 분지쇄에 있는 결합 기능을 갖는 라디칼 또는 구조 부위를 의미하며, 상기 라디칼 또는 구조 부위는 모종의 특정 표적물에 대하여 특이적인 식별 및 결합 기능을 가지며, 특이적 결합은 배위, 착화, 정전기력, 반데르발스 힘, 수소결합 및 공유결합과 같은 결합작용 또는 다른 상호작용을 통해 구현될 수 있다.
공유결합 복합체는 공유방식에 의해 직간접적으로 연결된 화합물로서, 공유결합체라고도 칭한다.
아비딘-정제 매질 공유결합 복합체는 공유방식으로 연결된, 일단이 아비딘이고 타단이 정제 매질이며, 양자가 공유결합을 통해 직접 연결되거나 공유 연결요소에 의해 간접적으로 연결된 화합물이다.
아비딘-친화성 단백질 공유결합 복합체 E는 친화성 단백질을 정제 매질로 사용한 아비딘-정제 매질 공유결합 복합체이다. 또한 아비딘-친화성 단백질 복합체 E라고 칭한다. 공유방식으로 연결된 화합물은 일단이 아비딘이고 타단이 친화성 단백질이며, 양자는 공유결합을 통해 직접 연결되거나 또는 공유 연결기를 통해 간접적으로 연결된다. 상기 공유결합 방식은 스트렙타비딘-단백질 A 복합체, 스트렙타비딘-단백질 A의 융합 단백질, 스트렙타비딘-강화 녹색형광 단백질-단백질 A의 융합 단백질(단백질 A-eGFP-스트렙타비딘), 단백질 A-eGFP-타마비딘2, 단백질 G-eGFP-아비딘 융합 단백질 및 단백질 G-eGFP-타마비딘2융합 단백질과 같은 공유결합, 연결 펩티드 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
친화 복합체는 2개 이상의 분자가 특이적인 결합작용에 의해, 극도로 강한 친화력에 의존하여 형성된 비공유결합 복합체로서, 예를 들어, 비오틴(또는 비오틴 유사체)과 아비딘(또는 아비딘 유사체)의 상호작용에 의해 형성된 복합체이다. 비오틴과 아비딘의 친화 복합체의 결합 방식은 당업자에게 잘 알려져 있다.
정제 기질은 표적물이라고도 칭하며, 혼합계에서 분리될 물질이다. 본 발명에서 정제 기질은 특별히 제한되지 않으나 단백질 물질(이때 표적 단백질이라고도 칭함)을 정제 기질로 사용하는 것이 바람직하다.
정제 매질은 정제 기질에 특이적으로 결합하여 정제 기질을 포획한 다음 혼합계에서 정제 기질을 분리할 수 있다. 본 발명의 중합체의 분지쇄 말단에 연결된 정제 매질은 정제 기질과 결합하는 기능을 가진 기능 요소이다. 정제 매질이 인접한 라디칼에 공유방식으로 연결되면 정제 기질에 결합하는 기능을 가진 작용기로 발현된다.
친화성 단백질은 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 변성 단백질 A, 변성 단백질 G 및 변성 단백질 L 등과 같이 표적 단백질에 특이적으로 결합하여 높은 친화력을 갖고 있다.
단백질 A는, 황색 포도상 구균의 세포벽에서 최초로 발견된 42 kDa의 표면 단백질인 Protein A이다. 이는 spa유전자에 의해 암호화 되며 그 조절은 DNA토폴로지 구조, 세포 침투압 및 하나의 ArlS-ArlR라고 불리는 2성분 시스템에 의해 제어된다. 면역글로불린에 결합하는 이의 능력으로 인해 생화학 분야의 관련 연구에 사용되고 있다. 주로 항체 정제에 사용되는 항체Fc에 특이적으로 결합할 수 있고 상업적으로 구매 가능한 제품에서 임의의로 선택할 수 있다. 본 발명에서 "단백질 A", "SPA" 및 "단백질 A"는 상용될 수 있다.
단백질 G는 그룹 C 및 그룹 G 연쇄상 구균에서 발현된 면역글로불린 결합 단백질로서 단백질 A와 유사하지만 결합 특이성이 다른 Protein G이다. 이는 65 kDa (G148단백질 G) 및 58 kDa (C40단백질 G)의 세포 표면 단백질이며, 항체 또는 일부 기능성 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 통해 주로 항체 정제에 사용되며, 상업적으로 구매 가능한 제품에서 임의로 선택할 수 있다.
단백질 L는 카파(kappa:κ) 경쇄를 함유한 항체에만 특이적으로 결합하도록 제한된 Protein L이다. 인간과 생쥐에서 카파(κ) 경쇄와 나머지 람다(λ)경쇄가 대부분 항체 분자에 포함되어 있다. 주로 항체 정제에 사용되며 상업적으로 구매 가능한 제품에서 임의로 선택할 수 있다.
비오틴(biotin)은 아비딘과 결합할 수 있고 결합력이 강하고 특이성이 우수하다.
아비딘: 비오틴에 결합가능한 아비딘은 스트렙타비딘(스트렙타비딘, SA로 약칭함), 이의 유사체(타마비딘2 등, Tam2이라고 약칭함), 이의 변성 생성물 및 이의 돌연변이체와 같이 강한 결합력과 우수한 특이성을 갖고 있다.
비오틴 유사체는 아비딘과 "아비딘-비오틴"과 유사한 특이적 결합을 형성할 수 있는 비-비오틴 분자를 의미하며, IBA회사에서 개발한 Strep-tag®시리즈에서 사용되는 WSHPQFEK 서열을 함유한 폴리펩티드(Strep®II 및 Twin-Strep-tag® 등) 및 WNHPQFEK 서열을 함유한 유사한 폴리펩티드와 같은 폴리펩티드 또는 단백질인 것이 바람직하다. WNHPQFEK는 WSHPQFEK의 돌연변이 서열로 간주될 수 있다.
아비딘 유사체는 비오틴과 "아비딘-비오틴"과 유사한 특이적 결합을 형성할 수 있는 비-아비딘 분자이며, 폴리펩티드 또는 단백질인 것이 바람직하다. 상기 아비딘 유사체는 아비딘의 유도체, 아비딘의 상동성 물질(동질 배수체) 및 아비딘의 변이체 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 아비딘 유사체는 예를 들어, 타마비딘 1 및 타마비딘2(문헌: FEBS Journal, 2009, 276,1383-1397를 참고 가능함) 등이다.
비오틴형 태그: 상기 비오틴형 태그에는 비오틴, 아비딘에 결합가능한 아비딘 유사체, 아비딘 유사체에 결합가능한 아비딘 유사체 및 이들의 조합 단위가 포함된다. 비오틴형 태그는 아비딘, 아비딘 유사체 또는 이들의 조합에 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 아비딘형 태그에 의해 라벨링된 단백질 물질을 포함하지만 이제 제한되지 않는 물질을 분리 및 정제하는 데 사용할 수 있다.
아비딘형 태그: 상기 아비딘형 태그에는 아비딘, 비오틴에 결합가능한 아비딘 유사체, 비오틴 유사체에 결합가능한 아비딘 유사체 및 이들의 조합 단위가 포함된다. 아비딘형 태그는 비오틴, 비오틴 유사체 또는 이들의 조합에 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 비오틴형 태그에 의해 라벨링된 단백질 물질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 물질을 분리 및 정제하는 데 사용할수 있다.
폴리펩티드형 태그: 본 발명의 폴리펩티드 태그는 폴리펩티드 태그 또는 폴리펩티드 태그의 유도체를 함유하는 태그를 의미한다. 상기 폴리펩티드 태그는 아미노산 단위로 구성된 폴리펩티드 구조의 태그를 의미하며, 상기 아미노산은 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산일 수 있다.
단백질형 태그: 본 발명의 단백질형 태그는 단백질 태그 또는 단백질 태그의 유도체를 함유하는 태그를 포함한다. 상기 단백질 태그는 아미노산 단위로 구성된 단백질 구조의 태그를 의미하며, 상기 아미노산은 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산일 수 있다.
항체형 태그: 본 발명의 항체형 태그는, 항원과 같은 상기 표적물에 특이적으로 결합가능한 항체 물질을 함유한 태그를 의미한다. 상기 항체형 태그의 예에는 eGFP단백질에 특이적으로 결합가능한 항EGFP나노항체가 추가로 포함된다.
항원형 태그: 본 발명의 항원형 태그는 항체 물질에 특이적으로 결합가능한 항원류 물질을 함유한 태그을 의미한다.
펩티드는 2개 이상의 아미노산이 펩티드 결합으로 연결된 화합물이다. 본 발명에서 펩티드와 펩티드 세그먼트는 동일한 의미를 가지며 상용될 수 있다.
폴리펩티드는 10 내지 50개의 아미노산으로 구성된 펩티드이다.
단백질은 50개 이상의 아미노산으로 구성된 펩티드이다. 융합 단백질도 일종의 단백질이다.
폴리펩티드의 유도체 및 단백질의 유도체: 달리 명시되지 않는 한(예를 들어, 구체적인 서열을 지정함), 본 발명에서 관련된 임의의 폴리펩티드 또는 단백질은 이의 유도체도 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 폴리펩티드의 유도체 및 단백질의 유도체는 적어도 C단을 함유한 태그, N단을 함유한 태그, C단 및 N단을 함유한 태그를 포함한다. 여기서, C단은 COOH단을 의미하고, N단은 NH2단을 의미하며, 당업자는 그 의미를 이해할 것이다. 상기 태그는 폴리펩티드 태그이거나 단백질 태그일 수 있다. 태그의 일부 예에는 히스티딘 태그(일반적으로 6×His, HHHHHH 또는 8×His 태그와 같은 적어도 5개의 히스티딘 잔기를 포함함), Glu-Glu, c-myc에피토프 (EQKLISEEDL), FLAG® 태그(DYKDDDDK), 단백질 C (EDQVDPRLIDGK), Tag-100 (EETARFQPGYRS), V5에피토프 라벨 ( GKPIPNPLLGLDST), VSV-G (YTDIEMNRLGK), Xpress (DLYDDDDK), 혈구 응집소(YPYDVPDYA), β-갈락토시다아제, 티오레독신, 히스패치 티오레독신, IgG 결합역, 인테인-키틴 결합역, T7 유전자 10, 글루타치온 S-전달효소(GST), 녹색형광 단백질(GFP), 말토오스 결합 단백질(MBP) 등이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
단백질 물질은 본 발명에서 광범위하게 폴리펩티드 또는 단백질 단편을 함유한 물질을 의미한다. 예를 들어, 폴리펩티드 유도체, 단백질 유도체 및 당단백질 등도 단백질 물질의 범주 내에 포함된다.
항체 및 항원: 달리 명시되지 않는 한, 본 발명에서 관련된 항체 및 항원은, 이의 도메인, 서브 유닛, 단편, 단일 사슬, 단일 사슬 단편 및 변이체를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, "항체"에 대한 언급은 달리 명시되지 않는 한, 이의 단편, 중쇄, 경쇄가 결여된 중쇄(나노항체 등) 및 상보성 결정 영역(CDR) 등을 추가로 포함한다. 예를 들어, "항원"에 대한 언급은 달리 명시되지 않는 한, 에피토프 및 에피토프펩티드를 추가로 포함한다.
본 발명에서 항체 물질은, 항체-항원의 특이적인 결합효과만 발생할 수 있다면 항체, 항체의 단편, 항체의 단일 사슬, 단일 사슬의 단편, 항체 융합 단백질 및 항체 단편의 융합 단백질 등, 그리고 이들의 유도체와 변이체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 항원류 물질은 당업자에게 알려진 항원 및 항원 기능을 발휘하고 항체 물질에 특이적으로 결합가능한 물질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
항단백질 항체는 단백질에 특이적으로 결합가능한 항체를 의미한다.
항형광 단백질의 나노항체는 형광 단백질과 특이적으로 결합가능한 나노항체를 의미한다.
상동성(homology)은 달리 명시되지 않는 한, 적어도 50%의 상동성, 바람직하게는 적어도 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 적어도 70%의 상동성, 보다 바람직하게는 적어도 75%의 상동성, 보다 바람직하게는 적어도 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 적어도 85%의 상동성 보다 바람직하게는 적어도 90%의 상동성을 갖는 것을 의미하며, 또한 예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 상동성을 가지는 것을 의미한다. 설명 대상은 예를 들어, 본 명세서에 언급된 Ω 서열의 동원 서열이다. 여기서 상동성은 서열 상의 유사성 및 수치적 등가 유사성(identity)을 의미한다.
상동체(homologue)는 상동성 서열을 가진 물질을 의미하며, 동질 배수체라고도 칭한다.
"변이체"( variant)는 구조(미소한 변이를 포함하지만 이에 제한되지 않음)가 다르지만 원래의 기능이나 성능을 여전히 유지하거나 실질적으로 유지하는 물질을 의미한다. 상기 변이체는 핵산 변이체, 폴리펩티드 변이체 및 단백질 변이체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 관련된 변이체를 얻는 방법은 구조 단위의 재조합, 삭제 또는 결실, 삽입, 전위 및 치환 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 변이체에는 개질된 생성물, 유전자 변형 생성물 및 융합 생성물 등이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 유전자 변형 생성물을 얻기 위해 유전자를 변형하는 방식에는 유전자 재조합(유전자 재조합 생성물에 해당함), 유전자 삭제 또는 결실, 삽입, 프레임 시프트 및 알킬기 치환 등이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 유전자 돌연변이 생성물은 유전자 변형 생성물의 한 종류에 속하며 유전자 돌연변이체라고도 칭된다. 바람직한 일 양태에서, 상기 변이체는 동질 배수체이다.
개질된 생성물은 화학적 개질된 생성물, 아미노산 개질제, 폴리펩티드 개질제 및 단백질 개질제 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 화학적 개질된 생성물은 유기화학, 무기화학 및 고분자 화학 등 화학적 합성 방법에 의해 변형된 생성물을 의미한다. 개질 방법에는 예를 들어, 이온화, 염수화, 탈염, 착화, 탈착물화, 킬레이트화, 탈킬레이트화, 부가반응, 치환반응, 제거반응, 삽입반응, 산화반응, 환원반응 및 번역 후 개질 등 개질 방법이 있고, 구체적으로 예를 들면, 산화, 환원화, 메틸화, 탈메틸화, 아민화, 카르복실화 및 황화 등 개질 방법이 있다.
"돌연변이체"(mutant)는 본 발명에서 달리 명시되지 않는 한, 원래의 기능 또는 성능을 여전히 유지하거나 실질적으로 유지할 수 있는 돌연변이체 생성물을 의미하며, 돌연변이 부위 수는 특별히 제한되지 않는다. 상기 돌연변이체는 유전자 돌연변이체, 폴리펩티드의 돌연변이체 및 단백질의 돌연변이체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 돌연변이체는 일종 변이체의 유형이다. 관련 돌연변이체를 얻는 방법에는 구조 단위의 재조합, 삭제 또는 결실, 삽입, 전위 및 치환 등이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 유전자의 구조 단위는 염기이고, 폴리펩티드 및 단백질의 구조 단위는 아미노산이다. 유전자 돌연변이 유형에는 유전자 삭제 또는 결실, 삽입, 프레임 시프트 및 염기 치환 등이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
"변성" 생성물은 본 발명의 유도체, 개질된 생성물, 유전자 변형 생성물 및 융합 생성물 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. "변성" 생성물은 원래 기능 또는 성능을 유지할 수 있거나 그 기능 또는 성능이 최적화되거나 변경될 수 있다.
용출액(표적 단백질을 예를 들면): 표적 단백질을 용출하고, 용출한 후 용출액에 표적 단백질이 존재한다.
세척액(표적 단백질을 예로 들면): 불순 단백질 등 불순물을 용출하고 용출한 다음 세척액으로 불순 단백질을 제거한다.
결합력은 자기 마이크로스피어와 단백질이 결합하는 능력과 같은 결합 능력이다.
친화 작용력은, 다양한 농도 구배의 기질 용액을 사용할 경우, 기질의 50%에만 자기 마이크로스피어이 결합할 때의 기질 농도이다.
IVTT은 시험관 내 전사 및 번역, 체외 전사 및 번역 시스템, 즉 무세포 단백질 합성 시스템이다. 무세포 단백질 합성 시스템은 외인성 표적 mRNA 또는 DNA를 단백질 합성 주형으로 사용하고, 단백질 합성에 필요한 기질과 전사 및 번역 관련 단백질 인자 등 물질의 첨가를 인위적으로 조절 제어함으로써 표적 단백질의 합성을 구현할 수 있다. 본 발명의 무세포 단백질 합성 시스템은 특별히 제한되지 않으며, 효모 세포 추출물, 대장균 세포 추출물, 포유동물 세포 추출물, 식물 세포 추출물 및 곤충 세포 추출물을 기초로한 무세포 단백질 합성 시스템의 하나 또는 임의의 조합이 될 수 있다.
본 발명에서, "번역 관련 효소"(TRENs)는 핵산 주형으로부터 단백질 생성물 합성과정에서 필요한 효소 물질을 의미하며, 번역 과정에 필요한 효소에 제한되지 않는다. 핵산 주형은 유전 주형이라고도 칭하며, DNA 주형, mRNA 주형 및 이들의 조합을 포함하는 단백질 합성을 위한 주형으로 사용되는 핵산 서열을 의미한다.
관류액은, 자석 비드를 표적 단백질 함유 시스템과 함께 배양한 후 수집한 상청액으로 여기에는 자기 비드에 포획되지 않는 잔류의 표적 단백질이 포함되어 있다. 예를 들어, 실시예 2에서, 아비딘-친화성 단백질을 함유한 복합체 용액을 친화성 컬럼에 첨가하여 컬럼을 통과시킨 후의 용액 예를 들어, 관류액1, 관류액2 및 관류액3은 각각 제1차로 통과한 용액, 제2차로 통과한 용액 및 제3차로 관통한 용액이다.
RFU는 상대 형광 단위 값이다.
eGFP는 강화 녹색 형광 단백질이다. 본 발명에서, 상기 eGFP는 야생형 및 이의 돌연변이체를 포함하나 이에 제한되지 않는 야생형 및 이의 변이체를 광범위하게 포함한다.
mEGFP는 eGFP의 A206K 돌연변이체이다.
"선택적으로"는 있을 수도 있고 없을 수도 있음을 의미하며, 선택 기준은 본 발명의 기술방안을 구현할 수 있어야 하는 것이다. 본 발명에서, "바람직한 양태"는 본 발명의 기술방안에 적용될 수 있는 한 본 발명을 실현하는 데 사용할 수 있음을 의미한다.
본 발명에서, "바람직하게는(예를 들어, 바람직한, 바람직하게는, 바람직하게, 선호되는 등)", "비교적 바람직하게는", "더 바람직하게는", "더 나은" 및 "가장 바람직하게는" 등 바람직한 실시형태는 본 발명의 포괄 범위 및 보호 범위에 대하여 어떠한 의미로서의 제한을 구성하지 않으며 본 발명의 범위와 실시형태를 제한하는 것이 아니라 예로서 일부 실시형태를 예로 제공하는 데만 사용된다.
본 발명의 설명에서 "바람직하게는", "바람직한 일 양태에서", "바람직한 일 실시형태에서", "바람직한 일 예에서", "바람직한 예", "일 바람직한 실시형태에서", "일부 바람직한 예에서", "일부 바람직한 양태에서", "선호한", "바람직한", "바람직하게는", "더 선호한", "더 바람직하게는", "보다 바람직하게는" 및 "가장 바람직하게는" 등 바람직한 양태 및 "일 실시형태", "일 양태", "예", "구체적인 예", "예로 들면", "예로서", "예를 들어", "~와 같은" 및 "등" 등에 대하여 제시한 열거 방식은, 마찬가지로 발명의 포괄 범위와 보호 범위에 대하여 어떠한 의미로서의 제한을 구성하지 않으며, 각 양태에서 설명된 구체적인 특징은 본 발명의 적어도 하나의 구체적인 실시형태에 포함된다. 본 발명에서, 각 양태에 설명된 구체적인 특징은 어느 하나 또는 여러 개의 구체적인 실시형태에서 적당한 방식으로 조합될 수 있다. 본 발명에서, 각 바람직한 양태에 대응하는 기술적 특징 또는 기술방안도 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있다.
본 발명에서, "이들의 임의의 조합"은 수량적으로 "1보다 큼"을 나타내고, 포괄 범위면에서 다음 상황으로 구성된 그룹 "이들 중 하나에서 임의의로 선택, 또는 이들 중 적어도 둘로 구성된 그룹에서 임의의로 선택"을 나타낸다.
본 발명에서, "하나 이상" 및 "한 가지 이상" 등 "하나 또는 여럿"의 설명은 "적어도 하나", "적어도 한 가지", "이들의 조합", "또는 이들의 조합", "및 이들의 조합", "또는 이들의 임의의 조합", "및 이들의 임의의 조합" 등은 동일한 의미를 가지며 상용할 수 있고 수량적으로 "1"과 같거나 "1보다 큼"을 나타낸다.
본 발명에서, "또는/및", "및/또는"의 사용은 "그 하나에서 임의로 선택 또는 그 조합에서 임의로 선택함"을 나타내며, 또한 적어도 그 하나를 표시한다.
본 발명에서 상기 "보통", "통상적인", "일반적으로", "경상적으로", "항상" 등 방식으로 설명된 종래 기술의 기술적 수단도 본 발명의 내용의 참조로 인용되며 달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 일부 기술적 특징의 바람직한 일 실시형태로 간주될 수 있다. 그러나, 본 발명의 포괄 범위 및 보호 범위를 어떠한 의미로서의 제한을 구성하지 않는다는 점에 유의해야 한다.
본 출원에 언급된 모든 문헌과 이러한 문헌에 의해 직간접적으로 인용된 문헌은, 각 문헌이 단독으로 참고로 인용된 것처럼 모두 본 출원에 참고로 인용된다.
본 발명의 범위 내에서, 상술한 본 발명의 기술적 특징과 하기(실시예를 포함하지만 이에 제한되지 않음)에서 구체적으로 설명하는 각 기술적 특징은 서로 조합되어, 본 발명을 실시하는 데 사용할 수 있는 한 새로운 또는 바람직한 기술방안을 구성할 수 있음을 이해해야 한다. 편폭에 제한되어 더 이상 일일이 서술하지 않는다.
1. 본 발명의 제1측면은 자기 마이크로스피어 본체를 포함하는 생체자기 마이크로스피어를 제공한다. 상기 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에는 선형 주쇄 및 분지쇄를 가진 적어도 하나의 중합체가 있고, 상기 선형 주쇄의 일단이 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 고정되고, 중합체의 타단이 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에서 유리되고, 상기 자기 마이크로스피어의 중합체의 분지쇄 말단에는 비오틴 또는 비오틴 유사체가 연결된다.
본 발명의 제1 측면에 따른 생체자기 마이크로스피어는 비오틴 자기 마이크로스피어 또는 비오틴 자석 비드라고도 칭한다.
도 1에 도시된 바와 같이 상기 생체자기 마이크로스피어의 전형적인 구조를 나타낸다.
상기 비오틴 또는 비오틴 유사체는 정제 매질 또는 다른 유형의 정제 매질을 추가로 연결하는 연결요소로 사용할 수 있다.
현재 일반적으로 사용되는 아가로스와 같은 겔류의 다공성 재료에 비해, 대부분 상업적으로 구매 가능한 마이크로스피어는 아가로스류의 재료를 사용한다. 다공성 재료는 풍부한 기공 구조를 가지고 있어 정제 기질에 대해 높은 결합량을 제공하기 위해 큰 비표면적을 제공지만, 상응하게, 단백질이 흡착 또는 용출될 때 단백질 분자는 다공성 물질 내부의 복잡한 기공 채널에 추가로 들어가거나 다공성 물질 내부의 복잡한 기공 채널로부터 빠져나가야 하기에 오랜 시간이 걸리고 또한 쉽게도 체류된다. 대조적으로, 본 발명에서 제공되는 표적 단백질을 포획하기 위한 결합 부위는 생체자기 마이크로스피어의 외부 표면 공간만 이용하며 흡착 및 용출시, 복잡한 망상 채널을 거치지 않고 직접 용출액 속에 방출될 수 있어 용출 시간을 크게 단축하고 용출 효율이 향상되며, 체류 비율이 낮고 정제 수율이 높아진다.
1.1. 자기 마이크로스피어 본체
본 발명에서, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 부피는 임의의 가능한 입자 크기일 수 있다.
입자 크기가 작으면 혼합계에서 자기 마이크로스피어의 현탁을 구현하고 단백질 생성물과 더 충분히 접촉하여 단백질 생성물의 포획 효율과 결합율을 향상시키는 데 도움이 된다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 직경 크기는 0.1 μm, 0.15 μm, 0.2 μm, 0.25 μm, 0.3 μm, 0.35 μm, 0.4 μm, 0.45 μm, 0.5 μm, 0.55 μm, 0.6 μm, 0.65 μm, 0.7 μm, 0.75 μm, 0.8 μm, 0.85 μm, 0.9 μm, 0.95 μm, 1 μm, 1.5 μm, 2 μm, 2.5 μm, 3 μm, 3.5 μm, 4 μm, 4.5 μm, 5 μm, 5.5 μm, 6 μm, 6.5 μm, 7 μm, 7.5 μm, 8 μm, 8.5 μm, 9 μm, 9.5 μm, 10 μm, 15 μm, 20 μm, 25 μm, 30 μm, 35 μm, 40 μm, 45 μm, 50 μm, 55 μm, 60 μm, 65 μm, 70 μm, 75 μm, 80 μm, 85 μm, 90 μm, 95 μm, 100 μm, 150 μm, 200 μm, 250 μm, 300 μm, 350 μm, 400 μm, 450 μm, 500 μm, 550 μm, 600 μm, 650 μm, 700 μm, 750 μm, 800 μm, 850 μm, 900 μm, 950 μm, 1000 μm 중 임의의 하나의 입자 크기 척도(편차는 ±25%, ±20%, ±15%, ±10%일 수 있음) 또는 임의의 2개의 입자 크기 척도 사이의 범위이다. 달리 명시되지 않는 한, 상기 직경 크기는 평균 크기를 의미한다.
상기 자기 마이크로스피어 본체의 부피는 임의의 가능한 입자 크기일 수 있다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 직경은 0.1 내지 10 μm에서 선택된다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 직경은 0.2 내지 6 μm에서 선택된다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 직경은 0.4 내지 5 μm에서 선택된다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 직경은 0.5 내지 3 μm에서 선택된다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 직경은 0.2 내지 1 μm에서 선택된다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 직경은 0.5 내지 1 μm에서 선택된다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 평균 직경은 약 200 nm, 250 nm, 300 nm, 350 nm, 400 nm, 450 nm, 500 nm, 550 nm, 600 nm, 650 nm, 700 nm, 750 nm, 800 nm, 850 nm, 900 nm, 950 nm 및 1000 nm이고, 상기 약 수는 ±25%, ±20%, ±15%, ±10%일 수 있다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 직경은 1 μm 내지 1 mm에서 선택된다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 직경은 예를 들어, 1 μm, 10 μm, 100 μm, 200 μm, 500 μm, 800 μm 및 1000 μm이고, 편차 범위는 ±25%, ±20%, ±15% 및 ±10%일 수 있다.
다양한 자기 재료는 다양한 유형의 활성화 부위를 제공하여, 정제 매질에 결합하는 방식의 차이와 자석으로 인한 분산 및 침강 능력의 차이를 발생할 수 있고 또한 정제 기질 유형에 대하여 선택성이 발생할 수 있다.
자기 마이크로스피어 본체 및 자기 마이크로스피어 본체를 포함한 자기 마이크로스피어는, 한편으로 외부 자기장의 작용하에 신속하게 위치 결정, 안내 및 분리될 수 있고, 다른 한편으로, 표면 변성 또는 화학적 중합과 같은 방법에 의해 히드록실기, 카르복실기, 알데히드기, 아미노기와 같은 다양한 활성을 갖는 작용기를 자기 마이크로스피어의 표면에 부여할 수 있다. 또한, 자기 마이크로스피어는 공유결합 또는 비공유결합 방식을 통해 항체 및 DNA와 같은 생물학적 활성 물질에 결합할 수도 있다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 자기 마이크로스피어 본체는 SiO2로 코팅된 자기 재료이다. 여기서, SiO2 코팅층은 자체 활성 부위를 갖는 실란 커플링제를 포함할 수 있다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 자기 재료는 철화합물(산화철 등), 철합금, 코발트 화합물, 코발트 합금, 니켈 화합물, 니켈 합금, 망간 산화물, 망간 합금, 아연 산화물, 가돌리늄 산화물, 크롬 산화물 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 산화철은 예를 들어, 자철광(Fe3O4), 마그헤마이트(γ-Fe2O3) 또는 상기 두 가지 산화물의 조합이고, 사산화삼철인 것이 바람직하다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 자기 재료는 Fe3O4, γ-Fe2O3, 질화철, Mn3O4, AlNi(Co), FeCrMo, FeAlC, AlNiCo, FeCrCo, ReCo, ReFe, PtCo, MnAlC, CuNiFe, AlMnAg, MnBi, FeNi(Mo), FeSi, FeAl, FeNi(Mo), FeSiAl, BaO·6Fe2O3, SrO·6Fe2O3, PbO·6Fe2O3, GdO 및 이들의 조합에서 선택된다. 여기서, 상기 Re는 희토류 원소인 레늄이다.
1.2. 다수의 분지쇄 말단을 제공하는 중합체 구조
상기 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에는 선형 주쇄 및 분지쇄를 갖는 적어도 하나의 중합체가 있고, 상기 선형 주쇄의 일단이 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 고정되고, 중합체의 타단이 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에서 유리된다.
상기 "고정된"은 공유결합 방식으로 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 "고정된" 것을 의미한다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 중합체는 상기 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 직접적으로 공유 결합되거나 연결요소를 통해 상기 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 간접적으로 공유결합된다.
상기 중합체는 선형 주쇄를 가지고 있는데 이때, 중합체는 선형 주쇄의 높은 유연성을 가질 뿐만 아니라 분지쇄 수를 고배율로 증폭하는 장점이 있어, 빠른 속도, 높은 처리량의 결합, 높은 효율, 높은 비율(높은 수율)로 분리를 더 잘 구현할 수 있다.
본 발명의 자기 마이크로스피어에 있어서, 중합체의 일단이 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 공유결합되고, 모든 분지쇄와 모든 작용기를 포함한 나머지 말단은 모두 용액 속에 용해되어 자기 마이크로스피어 본체의 외부 공간에 분포되며 분자 사슬은 완전히 확장되고 스윙할 수 있으므로, 분자 사슬이 용액 속의 다른 분자와 충분히 접촉할 수 있어 표적 단백질의 포획을 향상시킬 수 있다. 표적 단백질이 자기 마이크로스피어에서 용출할 때, 표적 단백질은 자기 마이크로스피어의 족쇄에서 직접 탈출하여 용출액 속으로 직접 들어갈 수 있다. 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 물리적으로 권취되거나 자기 마이크로스피어 본체와 일체로 형성된 중합체와 비교할 때, 이처럼 선형 주쇄의 일단에 의해 공유 고정된 중합체(일부 바람직한 양태에서는 단일의 일 중합체 선형 사슬을 공유적으로 고정하고, 다른 일부 바람직한 양태에서는 주쇄의 고정 말단이 공유적으로 2개 또는3개의 선형 주쇄를 인출함)는 분자 사슬의 적층을 효과적으로 감소시킬 수 있어, 용액 내에서 분자 사슬의 확장 및 스윙을 강화하고, 표적 단백질의 포획을 향상시켜, 용출시 표적 단백질의 체류 비율과 체류 시간을 줄인다.
1.2.1. 본 발명에서 제공되는 생체자기 마이크로스피어 중합체의 주쇄
일부 바람직한 양태에서, 상기 선형 주쇄는 폴리올레핀 주쇄 또는 아크릴산류 중합체 주쇄이다.
다른 일부 바람직한 양태에서, 상기 중합체의 선형 주쇄는 아크릴산류 중합체 주쇄이다. 폴리올레핀 주쇄(선형 주쇄에는 탄소 원자만 있음)이거나 헤테로 원자(헤테로 원자는 탄소 원자가 아님)를 함유한 선형 주쇄일 수 있다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 중합체의 주쇄는 폴리올레핀 주쇄이다. 상기 아크릴산류 중합체의 단량체 단위는 아크릴산, 아크릴산염, 아크릴레이트, 메타크릴산, 메타크릴산염, 메타크릴레이트와 같은 아크릴산류 단량체 분자 또는 이들의 조합이다. 상기 아크릴산류 중합체는 상술한 단량체 중 하나를 중합하거나 상술한 단량체의 적당한 조합을 공중합하여 얻을 수 있다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 중합체의 선형 주쇄는 폴리올레핀 주쇄이다. 구체적으로, 예를 들어, 상기 폴리올레핀 주쇄는 아크릴산, 아크릴산염, 아크릴레이트, 메타크릴산, 메타크릴산염, 메타크릴레이트류 단량체 중 하나의 중합 생성물에 의해 제공되는 주쇄이거나 이들의 조합의 중합 생성물에 의해 제공되는 주쇄(이들의 공중합 생성물에 의해 제공되는 주쇄) 또는 상술한 단량체가 중합에 참여하여 형성된 공중합 생성물의 주쇄이다. 상술한 단량체 조합의 중합생성물은 예를 들어, 아크릴산-아크릴레이트 공중합체이고, 다른 예는, 메틸 메타크릴레이트-히드록시에틸 메타크릴레이트 공중합체(MMA-HEMA공중합체) 및 아크릴산-히드록시프로필 아크릴레이트 공중합체이다. 상술한 단량체가 중합에 참여하여 형성된 공중합 생성물은 예를 들어, 말레산 무수물-아크릴산 공중합체이다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 선형 주쇄는 폴리올레핀 주쇄이고 아크릴산류 중합체의 주쇄에 의해 제공된다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 선형 주쇄는 아크릴산류 중합체 주쇄이다.
다른 일부 바람직한 양태에서, 상기 중합체의 주쇄는 아크릴산류 중합체 주쇄이다. 폴리올레핀 주쇄(주쇄에는 탄소 원자만 있음)이거나 헤테로 원자(헤테로 원자는 탄소 원자가 아님)를 함유한 주쇄일 수 있다.
다른 일부 바람직한 양태에서, 상기 중합체의 주쇄는 폴리에틸렌 글리콜-b-폴리 아크릴산 공중합체(아크릴산류 공중합체 범위에 속함)와 같은 폴리올레핀 블록을 함유한 블록 공중합체 주쇄이다. 이는, 선형 주쇄의 유연한 스윙을 원활하게 발휘하여, 분지쇄의 축적 및 체류 시간 또는/및 체류 비율의 증가를 초래하지 않아서 적합하다.
다른 일부 바람직한 양태에서, 상기 중합체의 주쇄는 중축합형 주쇄이다. 상기 중축합형 주쇄는 단량체 분자 또는 올리고머 사이의 중축합 반응에 의해 형성될 수 있는 선형 주쇄를 의미하며, 상기 중축합형 주쇄는 단독 중합형이거나 공중합형일 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 사슬 및 폴리아미노산 사슬 등이다. 구체적으로 예를 들면, ε-폴리리신사슬, α-폴리리신사슬, γ-폴리글루탐산, 폴리아스파르트산 사슬과 같은 아스파르트산/글루타메이트 공중합체 등이다.
자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 있는 하나의 결합 부위에 공유결합될 수 있는 선형 주쇄의 수는 하나 이상일 수 있다.
일부 바람직한 양태에서, 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 있는 하나의 결합 부위는 하나의 선형 주쇄만 인출하며, 이때 선형 주쇄를 위해 큰 활동 공간을 제공할 수 있다.
다른 일부 바람직한 양태에서, 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 있는 하나의 결합 부위는 2개의 선형 주쇄만 인출하여, 선형 주쇄에 가능한 큰 활동 공간을 제공한다.
중합체의 주쇄는 일단이 자석 비드의 외부 표면(생체자기 마이크로스피어의 외부 표면)에 공유결합되고, 모든 분지쇄와 모든 작용기를 포함한 나머지 말단은 모두 용액 속에 용해되어 자석 비드의 외부 공간에 분포되고, 분자 사슬은 완전히 확장하고 스윙할 수 있으므로 분자 사슬이 용액 속의 다른 분자와 충분히 접촉할 수 있어 표적 단백질의 포획을 강화할 수 있다. 표적 단백질이 자석 비드에서 용출될 때 표적 단백질이 자석 비드의 족쇄에서 직접 탈출되어 용출액에 직접 들어갈 수 있다. 자석 비드의 외부 표면에 물리적으로 권취되거나 자석 비드와 일체로 형성된 중합체와 비교할때, 여기에 제공되는 선형 주쇄의 일단에 의해 공유 고정된 중합체(가장 바람직하게는 단일의 일 중합체 선형 주쇄를 공유 고정하고, 다른 가장 바람직하게는 주쇄의 고정 말단이 2개 또는3개의 선형 주쇄를 공유적으로 인출함)는 분자 사슬의 적층을 효과적으로 감소시킬 수 있어, 용액 내에서 분자 사슬의 확장 및 스윙을 강화하고, 표적 단백질의 포획을 향상시키며, 용출시 표적 단백질의 체류 비율과 체류 시간을 줄인다.
1.2.2. 본 발명에서 제공되는 생체자기 마이크로스피어의 중합체 분지쇄
상기 분지쇄의 수는 자기 마이크로스피어 본체의 크기, 중합체의 골격 구조 유형 및 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 있는 중합체 사슬의 밀도(특히 분지쇄 밀도) 등 요인에 관련된다.
중합체 분지쇄의 수는 여러 개이고 적어도 3개이다. 곁사슬의 수는 자기 마이크로스피어의 크기, 중합체 주쇄의 길이, 중합체 주쇄에 따른 곁사슬의 선형 밀도 및 자기 마이크로스피어의 외부 표면에 있는 중합체 사슬의 밀도 등 요인에 관련된다. 중합체 분지쇄의 수는 원료의 공급 비율을 조절함으로써 제어할 수 있다.
상기 분지쇄형 중합체에는 적어도 3개의 분지쇄가 있다.
각 분지쇄 말단은 정제 매질에 각각 독립적으로 결합하거나 결합하지 않는다.
분지쇄의 말단에 정제 매질이 결합될 경우, 각 분지쇄 말단은 각각 독립적으로 정제 매질에 직접적으로 결합되거나 연결요소를 통해 정제 매질에 간접적으로 결합될 수 있다.
분지쇄 말단에 정제 매질이 결합될 경우, 정제 매질의 수는 하나 이상일 수 있다.
일부 바람직한 양태에서, 일 분자의 상기 분지쇄형 중합체에는 적어도 3개의 정제 매질이 결합된다.
1.3. 비오틴 또는 비오틴 유사체의 결합 방식
상기 비오틴 또는 비오틴 유사체가 상기 중합체의 분지쇄 말단에 연결되는 방식은 특별히 제한되지 않는다.
상기 비오틴 또는 비오틴 유사체가 상기 중합체의 분지쇄 말단에 연결되는 방식에는 공유결합, 초분자 상호작용 또는 이들의 조합이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 공유결합은 동적 공유결합이며, 보다 바람직하게는, 상기 동적 공유결합은 이민 결합, 아실히드라존 결합, 이황화 결합 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 초분자 상호작용은 배위결합, 친화 복합체 상호작용, 정전기 흡착, 수소결합, π-π중첩 작용, 소수성 상호작용 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 중합체의 분지쇄는 작용기에 기반한 공유결합을 통해 비오틴 또는 비오틴 유사체에 공유 결합되어, 비오틴 또는 비오틴 유사체를 중합체의 분지쇄 말단에 공유 결합시킨다. 생체자기 마이크로스피어의 외부 표면에 있는 중합체 분자의 분지쇄에 함유된 작용기를 비오틴 또는 비오틴 유사체와 공유 반응시켜 얻을 수 있다. 여기서, 바람직한 일 실시형태에서, 상기 작용기는 특이적 결합 부위(정의는 구체적인 실시형태의 "명사 및 용어" 부분을 참조)이다.
상기 작용기에 기반한 공유결합은 작용기가 공유결합에 참여하여 형성된 공유결합을 의미한다. 바람직하게는, 상기 작용기는 카르복실기, 히드록실기, 아미노기, 메르캅토기, 카르복실기의 염 형태, 아미노기의 염 형태, 포르메이트기 또는 상술한 작용기의 조합이다. 바람직한 일 양태에서, 상기 카르복실기의 염 형태는 COONa와 같은 나트륨 염 형태이다. 상기 아미노기의 염 형태는 염산염 및 히드로플루오라이드와 같은 형태를 포함하지만 이제 제한되지 않는 무기염 형태거나 유기염 형태인 것이 바람직하다. 상기 "작용기의 조합"은 하나의 자기 마이크로스피어의 외부 표면에 있는 모든 중합체 분자의 모든 분지쇄를 의미하며, 서로 다른 작용기의 참여를 기반으로 형성된 공유결합을 허용한다. 비오틴을 예로 들면, 즉 하나의 비오틴 자기 마이크로스피어의 외부 표면에 있는 모든 비오틴 분자는 각각 다른 작용기와 공유 연결될 수 있지만, 하나의 비오틴 분자는 하나의 작용기에만 연결될 수 있다.
2. 본 발명의 제2측면은, 본 발명의 제1 측면에서 제공되는 상기 생체자기 마이크로스피어를 기초로하고, 상기 비오틴 또는 비오틴 유사체를 연결요소로 사용하며 정제 매질이 추가로 연결된 생체자기 마이크로스피어를 제공한다. 즉, 상기 중합체의 분지쇄 말단에는 정제 매질이 연결요소에 의해 연결되어 있고, 상기 연결요소는 상기 비오틴 또는 비오틴 유사체를 포함한다.
정제 매질(purification element)
정제 매질은 혼합계으로부터 표적물을 특이적으로 포획하는 기능적 요소이고, 즉 상기 정제 매질과 분리 및 정제될 표적물 분자 사이를 특이적으로 결합하기도 한다. 포획된 표적물 분자는 분리 및 정제 목적을 구현하기 위해 적합한 조건에서 또한 용출 및 방출될 수 있다.
상기 정제 매질이 단백질 물질을 표적물로 하는 경우, 표적 단백질 자체 또는 표적 단백질에 담지된 정제 태그와 특이적 결합효과를 형성할 수 있다. 따라서, 표적 단백질의 정제 태그에 사용할 수 있는 물질 정제 매질에 대한 선택적인 방식으로도 사용할 수 있고, 정제 매질로 사용된 펩티드 또는 단백질도 표적 단백질에서 태그를 정제하는 선택적인 방식으로 사용할 수 있다.
2.1. 정제 매질의 종류
상기 정제 매질은 아비딘형 태그, 폴리펩티드형 태그, 단백질형 태그, 항체형 태그, 항원형 태그 또는 이들의 조합을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
바람직한 일 양태에서, 상기 아비딘형 태그는 아비딘, 비오틴에 결합가능한 아비딘 유사체, 비오틴 유사체에 결합가능한 아비딘 유사체 또는 이들의 조합이다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 정제 매질은 아비딘, 비오틴 또는 이의 유사체에 결합가능한 아비딘 유사체, 비오틴, 아비딘 또는 이의 유사체에 결합가능한 비오틴 유사체, 친화성 단백질, 항체, 항원, DNA 또는 이들의 조합이다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 생체자기 마이크로스피어의 중합체의 분지쇄 말단에는 비오틴이 연결된다. 상기 정제 매질은, 상기 비오틴과의 사이에 친화 복합체의 결합효과를 형성하는 아비딘이다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 아비딘은 스트렙타비딘, 변성된 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 유사체 중 임의의 하나 또는 이들의 조합이다.
상기 아비딘 유사체는 타마비딘 1, 타마비딘2 등이다. 타마비딘 1 및 타마비딘2는 2009년 야마모토(Yamamoto) 등에 의해 발견된 비오틴 결합 능력이 있는 단백질(Takakura Y et Al. Tamavidins: Novel Avidin-like biotin-binding proteins from the Tamogitake mushroom[J]. FEBS Journal, 2009, 276,1383-1397)이고, 이는 스트렙타비딘과 유사한 강한 비오틴 친화력이 있다. 타마비딘2의 열적 안정성은 스트렙타비딘보다 우수하며, 이의 아미노산 서열은 UniProt B9A0T7과 같이 관련 데이터 베이스에서 검색할 수 있거나, 코돈 전환 및 프로그램 최적화를 거쳐 DNA 서열을 얻을 수 있다.
상기 비오틴 유사체는 WSHPQFEK 서열 또는 이의 변이체 서열, WRHPQFGG 서열 또는 이의 변이체 서열 등이다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 정제 매질은 폴리펩티드 태그, 단백질 태그 또는 이들의 조합이다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 정제 매질은 친화성 단백질이다.
상기 친화성 단백질은 예를 들어, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 변성 단백질 A, 변성 단백질 G 및 변성 단백질 L 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
상기 항체 및 항원의 정의는 용어 부분을 참고한다. 상기 항체 및 항원은 이의 도메인, 서브 유닛, 단편, 중쇄, 경쇄, 단일 사슬 단편(예를 들어, 나노항체, 경쇄가 결여된 중쇄, 중쇄 가변 영역, 상보성 결정 영역 등), 에피토프, 에피토프펩티드 및 상술한 임의의 하나의 변이체 등을 포함하지만 이에 제한되지 않음을 이해해야 한다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 폴리펩티드 태그는 CBP 태그, 히스티딘 태그, C-Myc 태그, FLAG 태그, Spot 태그, C 태그, Avi 태그, WSHPQFEK 서열을 포함하는 태그, WSHPQFEK의 변이체 서열을 포함하는 태그, WRHPQFGG 서열을 포함하는 태그, WRHPQFGG의 변이체 서열을 포함하는 태그, RKAAVSHW 서열을 포함하는 태그, RKAAVSHW의 변이체 서열을 포함하는 태그 또는 이들의 조합 중 임의의 태그 또는 이들의 변이체로부터 선택된다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 단백질 태그는 친화성 단백질, SUMO 태그, GST 태그, MBP 태그 또는 이들의 조합 중 임의의 태그 또는 이들의 변이체로부터 선택되고, 보다 바람직하게는, 상기 친화성 단백질은 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 변성 단백질 A, 변성 단백질 G, 변성 단백질 L 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 항체형 태그는 항체, 항체의 단편, 항체의 단일 사슬, 단일 사슬의 단편, 항체 융합 단백질, 항체 단편의 융합 단백질 중 임의의 하나, 임의의 하나의 유도체 또는 임의의 하나의 변이체이다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 항체형 태그는 항단백질 항체이다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 항체형 태그는 항형광 단백질 항체이다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 항체형 태그는 나노항체이다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 항체형 태그는 항단백질의 나노항체이다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 항체형 태그는 항형광 단백질의 나노항체이다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 항체형 태그는 항녹색 형광 단백질 또는 이의 돌연변이체의 나노항체이다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 항체형 태그는 Fc 세그먼트이다.
2.2. 정제 매질의 로딩 방식
상기 정제 매질이 상기 비오틴 또는 비오틴 유사체에 연결되는 방식은 특별히 제한되지 않는다.
상기 정제 매질이 상기 비오틴 또는 비오틴 유사체에 연결되는 방식에는 공유결합, 비공유결합(초분자 상호작용 등), 연결요소 또는 이들의 조합이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 공유결합은 동적 공유결합이고, 보다 바람직하게는, 상기 동적 공유결합은 이민 결합, 아실히드라존 결합, 이황화 결합 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 초분자 상호작용은 배위결합, 친화 복합체 상호작용, 정전기 흡착, 수소결합, π-π중첩 효과, 소수성 상호작용 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 생체자기 마이크로스피어에 있어서 상기 정제 매질은 친화 복합체를 함유한 연결요소를 통해 상기 중합체의 분지쇄 말단에 연결된다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 비오틴 또는 비오틴 유사체는 친화 복합체 작용을 통해 아비딘 또는 아비딘 유사체에 결합되고, 상기 정제 매질은 상기 아비딘 또는 아비딘 유사체에 직간접적으로 연결된다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 친화 복합체 상호작용은 비오틴-아비딘 상호작용, 비오틴 유사체-아비딘 상호작용, 비오틴-아비딘 유사체 상호작용 및 비오틴 유사체-아비딘 유사체 상호작용으로부터 선택된다.
일부 바람직한 양태에서, 친화 복합체의 선택 기준은, 우수한 특이성, 강한 친화력이 있고, 또한 친화 복합체가 중합체의 분지쇄 말단에 공유 연결될 수 있도록 화학적 결합가능한 부위를 제공하거나, 외부 표면의 결합 부위, 선형 중합체의 주쇄 말단 및 분지쇄형 중합체의 분지쇄 말단과 같은 화학적 개질된 후 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 공유 결합될수 있어야 한다. 예를 들어, 비오틴 또는 이의 유사체와 아비딘 또는 이의 유사체, 항원 및 항체와 같은 물질의 조합이다.
로딩 방식에 동적 공유결합, 초분자 상호작용(특히는 친화 복합체 상호작용)이 포함되는 경우, 가역적 로딩 방식이 형성되고, 정제 매질은 특정 조건하에서 분지쇄 말단에서 언로딩된 다음 갱신 또는 교체될 수 있다.
정제 매질의 갱신은 자기 마이크로스피어의 재생에 해당하며, 갱신 전과 갱신 후의 정제 매질의 종류는 동일하다.
정제 매질의 교체는 자기 마이크로스피어의 변화에 해당하며 교체 전과 교체 후의 정제 매질의 종류는 다르다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 정제 매질은 아비딘이며, 또한 상기 아비딘과 결합된 비오틴을 포함하며, 여기서, 비오틴은 연결요소로 사용된다. 여기서, 비오틴과 아비딘 사이에는 친화 복합체의 결합효과가 형성된다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 정제 매질은 친화성 단백질이며, 또한 상기 친화성 단백질에 연결된 아비딘, 및 상기 아비딘에 결합된 비오틴을 포함한다. 여기서, 친화 복합체는 연결요소로 사용되며, 비오틴과 아비딘 사이에 친화 복합체의 결합효과가 형성된다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 생체자기 마이크로스피어의 중합체의 분지쇄 말단에는 비오틴, 아비딘 및 정제 매질이 순차적으로 연결된다. 보다 바람직하게는, 상기 정제 매질은 항체 또는 항원이다. 상기 아비딘과 정제 매질 사이의 결합 방식에는 공유결합, 비공유결합, 연결요소 또는 이들의 조합이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 정제 매질은 핵산, 올리고뉴클레오티드, 펩티드핵산, 핵산압타머, DNA, 리보 핵산, 류신 지퍼, 나선-회전-나선형 모티브, 징크 핑거 모티브, 비오틴, 항비오틴 단백질, 스트렙타비딘, 항합텐 항체 등, 그리고 이들의 조합을 포함하지만 이제 제한되지 않는 연결요소에 의해 생체자기 마이크로스피어의 중합체의 분지쇄 말단에 연결된다. 물론, 상기 연결요소는 이중 가닥 핵산 구축체, 이중 나선 구조, 동종 하이브리드 또는 이종 하이브리드(DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-PNA, RNA-RNA, RNA-PNA 또는 PNA-PNA에서 선택된 동종 하이브리드 또는 이종 하이브리드임) 또는 이들의 조합일 수 있다.
2.3. 정제 매질의 작용 메커니즘
상기 반응 정제 혼합계에서 표적물 분자를 포획하는 정제 매질의 작용력은 공유결합, 초분자 상호작용 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 것으로부터 선택될 수 있다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 친화 복합체 상호작용은 비오틴-아비딘 상호작용, 비오틴 유사체-아비딘 상호작용, 비오틴-아비딘 유사체 상호작용 및 비오틴 유사체-아비딘 유사체 상호작용으로부터 선택된다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 표적물은 비오틴-아비딘 결합력, Streg 태그-아비딘 결합력, 아비딘-친화성 단백질 결합력, 히스티딘 태그-금속 이온 친화력, 항체-항원 결합력 또는 이들의 조합과 같은 작용력 방식에 의해 상기 생체자기 마이크로스피어의 중합체의 분지쇄 말단에 결합된다. 상기 Streg 태그는, 일반적으로 WSHPQFEK 서열 또는 이의 변이체 서열을 포함하는, 주로 아비딘 또는 이의 유사체와 특이적 결합효과를 형성할 수 있는 펩티드 태그(IBA회사에 의해 개발됨)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
2.4. 정제 매질의 재생 및 재활용
정제 매질이 친화 복합체 및 동적 공유결합 등을 통해 본 발명의 생체자기 마이크로스피어의 중합체의 분지쇄 말단에 가역적 방식으로 연결된 경우, 적당한 조건하에서 정제 매질이 중합체의 분지쇄 말단에서 용출되어 새로운 정제 매질이 재결합할 수 있다.
친화 복합체 상호작용을 비오틴과 스트렙타비딘 사이의 친화 복합체 작용력으로 사용한 예이다.
비오틴과 스트렙타비딘 사이의 극도로 강한 친화력은 전형적인 친화 복합체의 결합효과로서, 일반적인 비공유 결합효과보다 강하고 공유 결합효과보다 약하여, 정제 매질이 자석 비드의 외부 표면에 있는 중합체의 분지쇄 말단에 견고하게 결합될 수 있을 뿐만 아니라, 정제 매질을 교체해야 할 경우, 비오틴의 특이적인 결합 위치에서 스트렙타비딘을 용출하여 정제 매질을 동시에 분리할 수 있다. 또한, 새로운 아비딘-정제 매질 공유결합 복합체(예를 들어, 스트렙타비딘 태그가 있는 정제 매질)에 재결합가능한 활성화 부위를 방출하여, 자석 비드의 정제 성능의 신속한 회복을 구현하고 표적물(항체 등)의 분리 및 정제 비용을 크게 절감한다. 정제 매질로 개질된 생체자기 마이크로스피어를 용출하여 아비딘-정제 매질 공유결합 복합체를 제거하여, 비오틴 또는 비오틴 유사체로 개질된 생체자기 마이크로스피어를 다시 얻는 과정을 비오틴 자기 마이크로스피어 재생이라고 한다. 재생된 비오틴 자기 마이크로스피어에는 방출된 비오틴 활성 부위가 있어 아비딘-정제 매질 공유결합 복합체를 재결합할 수 있어, 정제 매질로 개질된 생체자기 마이크로스피어(생체자기 마이크로스피어의 재생에 해당함)를 다시 얻음으로 하여, 신선한 정제 매질 및 신생한 표적물 결합 부위를 제공할 수 있다. 이는 본 발명의 비오틴 자기 마이크로스피어를 재생 사용할 수 있도록 하며, 즉 정제 매질이 교체된 후 재활용할 수 있도록 한다.
2.4. 정제 기질(바람직하게는 단백질 물질)
본 발명의 정제 기질은 본 발명의 자기 마이크로스피어를 이용하여 포획 분리하는 물질을 의미하며, 상기 정제 기질이 본 발명의 자기 마이크로스피어의 정제 매질에 특이적으로 결합가능한 한 특별한 제한은 없다.
상기 정제 기질이 단백질 물질인 경우, 정제 기질을 표적 단백질이라고도 칭한다.
2.4.1. 표적 단백질의 정제 태그
상기 표적 단백질에는 정제 태그가 없을 수도 있고, 이 경우, 표적 단백질 자체는 자기 마이크로스피어 내의 정제 매질에 의해 포획될 수 있어야 한다. 예를 들어, "표적 단백질 및 정제 매질"은 "항체 및 항원", "항원 및 항체", "아비딘 또는 이의 유사체, 비오틴 또는 이의 유사체" 와 같은 조합 방식이다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 표적 단백질에는 정제 태그가 있고, 상기 정제 태그는 상기 정제 매질에 특이적으로 결합할 수 있다. 하나의 표적 단백질 분자에서, 상기 정제 태그의 수는 1개, 2개 또는 여러 개이고, 2개 이상의 정제 태그를 함유할 경우, 상기 정제 태그의 종류는 한 가지, 두 가지 또는 여러 가지이다. 태그의 아미노산 서열이 다르면 서로 다른 종류의 태그로 간주된다는 점에 유의해야 한다.
상기 표적 단백질에 있는 정제 태그는 히스티딘 태그, 아비딘, 아비딘 유사체, Streg 태그(WSHPQFEK 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 태그), WRHPQFGG 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 태그, RKAAVSHW 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 태그, FLAG 태그 또는 이의 변이체, C 태그 및 이의 변이체, Spot 태그 및 이의 변이체, GST 태그 및 이의 변이체, MBP 태그 및 이의 변이체, SUMO 태그 및 이의 변이체, CBP 태그 및 이의 변이체, HA 태그 및 이의 변이체, Avi 태그 및 이의 변이체, 친화성 단백질, 항체류 태그, 항원류 태그 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 태그의 그룹에서 선택될 수 있다. 또한 US6103493B2, US10065996B2, US8735540B2 및 US20070275416A1에 개시된 Streg 태그 및 이의 변이체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 정제 태그로부터 선택될 수 있다.
상기 정제 태그는 N-단 또는 C-단을 통해 융합될 수 있다.
상기 히스티딘 태그는 일반적으로 5 × His 태그, 6 × His 태그 및 8 × His 태그와 같이 적어도 5개의 히스티딘 잔기를 포함한다.
옥타펩티드WRHPQFGG는 코어 스트렙타비딘에 특이적으로 결합할 수 있다.
Streg 태그는 아비딘 또는 이의 유사체와 특이적 결합효과를 형성할 수 있고, 상기 Streg 태그에는 WSHPQFEK 또는 이의 변이체가 포함된다. 예를 들어, WSHPQFEK-(XaaYaaWaaZaa)n-WSHPQFEK, 여기서, Xaa, Yaa, Waa, Zaa는 각각 독립적으로 임의의 아미노산이고, XaaYaaWaaZaa는 적어도 하나의 아미노산을 포함하며, (XaaYaaWaaZaa)n는 적어도 4개의 아미노산을 포함하고, 여기서, n는 1 내지 15(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15)에서 선택된다. (XaaYaaWaaZaa)n의 구체적인 예는, (G)8, (G)12, GAGA, (GAGA)2, (GAGA)3, (GGGS)2 및 (GGGS)3이다. Streg 태그는 예를 들어, WSHPQFEK, WSHPQFEK-(GGGS)n-WSHPQFEK, WSHPQFEK-GGGSGGGSGGSA-WSHPQFEK, SA-WSHPQFEK-(GGGS)2GGSA-WSHPQFEK, WSHPQFEK-GSGGG-WSHPQFEK-GL-WSHPQFEK, GGSA-WNHPQFEK-GGGSGSGGSA-WSHPQFEK-GS 및 GGGS-WSHPQFEK-GGGSGGGSGGSA-WSHPQFEK 등이다.
상기 FLAG 태그의 서열은 DYKDDDDK이다. FLAG 태그의 변이체 서열은 예를 들어, DYKDHD-G-DYKDHD-I-DYKDDDDK이다.
상기 Spot 태그의 서열은 PDRVRAVSHWSS이다.
상기 C 태그에는 EPEA 서열이 포함된다.
상기 GST 태그는 글루타치온 S-전달 효소 태그를 의미한다.
상기 MBP 태그는 말토오스 결합 단백질 태그를 의미한다.
상기 SUMO 태그는, 공지의 소분자 유비퀴틴 유사 조절제(Small ubiquitin-likemodifier)이며, 유비퀴틴류 폴리펩티드 사슬 슈퍼 패밀리의 중요한 구성원 중 하나이다. 1급 구조에서, SUMO는 유비퀴틴과 18%만의 상동성을 공유하지만, 양자의 3급 구조 및 이의 생물학적 기능은 매우 유사하다.
상기 CBP 태그의 서열은 KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL이다.
상기 HA 태그의 서열은 YPYDVPDYA이다.
상기 Avi 태그는 15개의 아미노산 잔기로 구성된 공지의 작은 태그이고, 상기 작은 태그는 비오틴 리가아제 BirA에 의해 특이적으로 식별될 수 있다.
항체류 태그는 항체의 완전한 구조(완전한 항체), 도메인, 서브 유닛, 단편, 중쇄, 경쇄, 단일 사슬 단편(예를 들어, 나노항체, 경쇄가 결여된 중쇄, 중쇄 가변 영역 및 상보성 결정 영역) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
항원류 태그는 항원의 완전한 구조(완전한 항원), 도메인, 서브 유닛, 단편, 중쇄, 경쇄, 단일 사슬 단편(예를 들어, 에피토프) 등을 포함지만 이에 제한되지 않는다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 표적 단백질의 N단 또는 C단에 정제 태그가 연결되거나 양단에 모두 연결된다.
이 부분에 설명된 다양한 정제 태그는 모두 본 발명의 자기 마이크로스피어의 정제 매질의 후보가 될 수 있다.
2.4.2. 표적 단백질의 유형
상기 표적 단백질은 천연 단백질 또는 이의 변형 생성물일 수 있고, 인공 합성 서열일 수도 있다. 상기 천연 단백질의 공급원에 대해서 특별히 제한하지 않으며 진핵세포, 원핵세포, 병원체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 여기서, 진핵세포 공급원은 포유 동물세포, 식물세포, 효모세포, 곤충세포, 선충세포 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 포유 동물세포 공급원은 쥐 공급원(쥐, 생쥐, 기니 피그, 골든 햄스터, 햄스터 등 포함), 토끼 공급원, 원숭이 공급원, 인간 공급원, 돼지 공급원, 양 공급원, 소 공급원, 개 공급원 및 말 공급원 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 병원체는 바이러스, 클라미디아 및 마이코플라스마 등을 포함한다. 상기 바이러스에는 HPV, HBV, TMV, 코로나바이러스 및 로타바이러스 등이 포함된다.
상기 표적 단백질의 유형은 폴리펩티드(본 발명에서 "표적 단백질"은 폴리펩티드를 광범위하게 포함함), 형광류 단백질, 효소 및 상응하는 자이모겐, 항체, 항원, 면역글로불린, 호르몬, 콜라겐, 폴리아미노산 및 백신 등 상술한 임의의 단백질의 부분 도메인, 상술한 임의의 단백질의 서브 유닛 또는 단편, 및 상술한 임의의 단백질의 변이체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 "상술한 임의의 단백질의 서브 유닛 또는 단편"은 "상술한 임의의 단백질의 부분 도메인"의 서브 유닛 또는 단편을 포함한다. 상기 "상술한 임의의 단백질의 변이체"는 "상술한 임의의 단백질의 부분 도메인, 상술한 임의의 단백질의 서브 유닛 또는 단편"의 변이체를 포함한다. 상기 "상술한 임의의 단백질의 변이체"는 상술한 임의의 단백질의 돌연변이체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 다른 위치에 있는 2개 이상의 "상술한"이 연속되는 경우 의미는 유사하게 해석된다.
상기 표적 단백질구조는 완전한 구조이거나 상응한 부분 도메인, 서브 유닛, 단편, 이량체, 다량체, 융합 단백질 및 당단백질 등으로부터 선택될 수 있다. 불완전한 항체 구조는 예를 들어, 나노항체(경쇄가 결여된 중쇄 항체 및 VHH는 중쇄 항체의 완전한 항원 결합 능력을 유지함), 중쇄 가변 영역, 상보성 결정 영역(CDR) 등이 있다.
예를 들어, 본 발명의 상기 체외 단백질 합성 시스템에 의해 합성된 표적 단백질은 다음 임의의 단백질, 임의의 조합 방식의 융합 단백질 및 임의의 조합 방식의 조성물 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 루시페라아제(반딧불이 루시퍼라제 등), 녹색 형광 단백질(GFP), 강화 녹색 형광 단백질(eGFP), 황색 형광 단백질(YFP), 아미노 아실 tRNA합성효소, 글리세르알데히드-3-포스페이트탈수소 효소, 카탈라아제(마우스 카탈라제 등), 액틴, 항체, 항체의 가변 영역(항체의 단일 사슬 가변 영역, scFV 등), 항체의 단일 사슬 및 이의 단편(항체의 중쇄, 나노항체, 항체의 경쇄 등), α-아밀라제, 엔테로신A, C형 간염 바이러스 E2 당단백질, 인슐린 및 이의 전구체, 글루카곤 유사 펩티드(GLP-1), 인터페론(인터페론 α A, 인터페론β, 인터페론γ 등과 같은 인터페론α를 포함하지만 이에 제한되지 않음), 인터류킨(예를 들어, 인터류킨-1β, 인터류킨2, 인터류킨12 등), 리소자임, 혈청 알부민(인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민을 포함하지만 이에 제한되지 않음), 트랜스티레틴, 티로시나제, 자일라나아제, β-갈락토시다아제(LacZ, 예를 들어, 대장균β-갈락토시다아제) 등, 그리고 상술한 임의의 단백질의 부분 도메인, 상술한 임의의 단백질의 서브 유닛 또는 단편, 또는 상술한 임의의 변이체(상술한 정의와 같이, 상기 변이체는 루시퍼라제 돌연변이체, eGFP의 돌연변이체와 같은 돌연변이체를 포함하며, 상기 변이체는 또한 동질 배수체일 수 있음). 상기 아미노 아실 tRNA 합성효소는 예를 들어, 인간 라이신-tRNA합성효소, 인간 류신-tRNA합성효소 등이다. 상기 글리세르알데히드-3-포스페이트탈수소 효소는 예를 들어, 애기장대 글리세르알데히드3-포스페이트탈수소 효소, 글리세르알데히드-3-포스페이트탈수소 효소이다. 특허 문헌 CN109423496A를 참조할 수도 있다. 상기 임의의 조합 방식의 조성물은 상술한 임의의 단백질이나 상술한 임의의 조합방식의 융합 단백질을 포함할 수 있다.
일부 바람직한 양태에서, GFP, eGFP, mScarlet 등 중 하나 또는 이들의 유사 물질 또는 이들의 돌연변이체와 같은 형광 성질을 가진 표적 단백질을 사용하여 상기 체외 단백질 합성 시스템의 단백질 합성 능력을 평가한다.
상기 표적 단백질의 응용 분야에는 생물 의학, 분자 생물학, 의학, 체외 검출, 의료 진단, 재생 의학, 생명 공학, 조직 공학, 줄기 세포 공학, 유전자 공학, 중합체 공학, 표면 공학, 나노 공학, 화장품, 식품, 식품 첨가제, 영양제, 농업, 사료, 일용품, 세탁, 환경, 화학 염색 및 형광 표시 등 영역이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
2.4.3. 표적 단백질을 함유한 혼합계
본 발명의 자기 마이크로스피어는 표적 단백질을 이의 혼합계으로부터 분리하는 데 사용할 수 있다. 상기 표적 단백질은 한 가지 물질에 제한되지 않으며, 정제하는 목적이 이런 조성물을 얻는 것이거나 이런 조성물의 형태가 정제 요구 사항을 충족시킬 수 있는 한 다양한 물질의 조합이 허용된다.
표적 단백질을 포함하는 혼합계에 대하여, 본 발명의 자기 마이크로스피어의 정제 매질이 표적 단백질에 특이적으로 결합가능한 한 특별히 제한되지 않으며, 일반적으로 상기 정제 매질은 혼합계에서 표적 단백질 이외의 다른 물질과 특이적인 결합 또는 비특이적인 결합효과가 없는 것 또한 요구된다.
본 발명의 실시예에서, 상기 표적 단백질을 포함한 혼합계은 천연 공급원일 수 있고, 인공적으로 구축되거나 얻은 혼합계일 수도 있다.
예를 들어, 특정 단백질은 상업적으로 구매 가능한 혈청에서 분리 및 정제할 수 있다.
예를 들어, 표적 단백질은 체외 단백질 합성 시스템에서 반응시킨 후 시스템에서 분리할 수 있다.
구체적인 일 실시형태에서, 상기 체외 단백질 합성 시스템은 WO2016005982A1에 기재된 대장균을 기반으로 한 무세포 단백질 합성 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 다른 인용문헌, 이의 직접 및 간접 인용문헌에 기재된 것들은 밀 배아 세포, 토끼 망상 적혈구, 사카로마이세스 세레비지애, 피치아 파스토리스 및 클루이베로마이세스 마르시아누스를 기초로한 체외 무세포 단백질 합성 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 또한 모두 본 발명의 체외 단백질 합성 시스템의 실시형태로 본 발명에 포함된다. 예를 들어, 문헌"Lu, Y. Advances in Cell-Free Biosynthetic Technology. Current Developments in Biotechnology And Bioengineering, 2019, Chapter 2, 23-45"에서 "2.1 Systems And Advantages" 부분 27-28페이지의 인용문헌에 기재된 체외 무세포 단백질 합성 시스템을 포함하지만 이제 제한되지 않으며, 모두 본 발명의 체외 단백질 합성 시스템을 실시하는 데 사용할 수 있다. 예를 들어, (본 발명과 상충되지 않는 한, 다음 문헌 및 이의 인용문헌은 전체 내용 및 전체 목적으로 인용됨), 문헌CN106978349A, CN108535489A, CN108690139A, CN108949801A, CN108642076A, CN109022478A, CN109423496A, CN109423497A, CN109423509A, CN109837293A, CN109971783A, CN109988801A, CN109971775A, CN110093284A, CN110408635A, CN110408636A, CN110551745A, CN110551700A, CN110551785A, CN110819647A, CN110845622, CN110938649A, CN110964736A, CN111378706A, CN111378707A, CN111378708A, CN111718419A, CN111748569A, CN2019107298813, CN2019112066163, CN2018112862093(CN111118065A), CN2019114181518, CN2020100693833, CN2020101796894, CN202010269333X, CN2020102693382 및 이들의 인용문헌에 기재된 체외 무세포 단백질 합성 시스템 및 DNA 주형의 구축 및 증폭 방법은 모두 본 발명의 체외 단백질 합성 시스템을 실시하고 본 발명의 DNA 주형의 구축과 증폭 방법으로 사용될 수 있다.
상기 체외 단백질 합성 시스템의 세포 추출물의 공급원 세포는 상기 표적 단백질을 체외 발현시킬 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 종래 기술에 개시된 원핵세포 추출물, 진핵세포 추출물(바람직하게는 효모세포 추출물, 보다 바람직하게는 클루이베로마이세스 락티스) 공급원의 체외 단백질 합성 시스템에 적합한 이질 단백질, 또는 세포 내 합성된 원핵세포 시스템, 진핵세포 시스템(바람직하게는 효모세포 시스템, 보다 바람직하게는 클루이베로마이세스 락티스 시스템)에 적합한 내인성 단백질은 모두 본 발명의 체외 단백질 합성 시스템을 사용하여 합성할 수 있거나 본 발명에서 제공되는 체외 단백질 합성 시스템으로 합성하도록 시도할 수 있다.
바람직한 일 양태에서, 상기 체외 단백질 합성 시스템은 IVTT시스템이다. IVTT 반응한 후의 액체(IVTT 반응용액이라고 기록함)에는 발현된 표적 단백질이 포함되어 있을 뿐만 아니라 IVTT 시스템 내의 잔류 반응 원료도 포함되어 있고, 특히 세포 추출물 유래의 다양한 인자(예를 들어, 리보솜, tRNA, 번역 관련 효소, 개시 인자, 신장 인자, 종결 인자 등)가 포함되어 있다. 상기 IVTT 반응용액은 한편으로는 자석 비드에 결합하기 위한 표적 단백질을 제공할 수 있고, 다른 한편으로는 표적 단백질 분리 효과를 측정하기 위한 혼합계를 제공할 수도 있다.
3. 본 발명의 제3 측면은, 본 발명의 제1 측면에서 제공되는 상기 생체자기 마이크로스피어를 기초로하고, 또한 상기 비오틴 또는 비오틴 유사체를 연결요소로 사용하고, 친화 복합체의 결합효과를 통해 아비딘 또는 아비딘 유사체가 연결된 생체자기 마이크로스피어를 제공한다.
본 발명의 제3 측면의 생체자기 마이크로스피어는 아비딘 자기 마이크로스피어 또는 아비딘 자석 비드라고도 칭한다.
상기 아비딘 또는 아비딘 유사체는 정제 매질로 사용할 수 있고 다른 유형의 정제 매질을 추가로 연결하는 연결요소로도 사용할 수 있다. 여기서, 상기 비오틴 또는 비오틴 유사체와 상기 아비딘 또는 아비딘 유사체 사이에 친화 복합체의 결합효과가 형성된다.
일부 바람직한 양태에서, 본 발명의 제1 측면에서 제공되는 상기 생체자기 마이크로스피어를 기초로하고, 상기 비오틴과 결합된 아비딘이 추가로 포함된다. 여기서, 비오틴과 아비딘 사이에 친화 복합체의 결합효과가 형성된다. 즉, 상기 자기 마이크로스피어의 중합체의 분지쇄 말단에는 비오틴이 연결된다. 상기 정제 매질은 상기 비오틴과의 사이에 친화 복합체의 결합효과를 형성하는 아비딘이다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 아비딘은 스트렙타비딘, 변성 스트렙타비딘 및 스트렙타비딘 유사체 중 임의의 하나 또는 이들의 조합이다.
4. 본 발명의 제4 측면은, 본 발명의 제3 측면에서 제공되는 상기 생체자기 마이크로스피어를 기초하고, 상기 아비딘 또는 아비딘 유사체와 연결되는 친화성 단백질을 추가로 포함한 생체자기 마이크로스피어를 제공한다. 이 경우, 비오틴 또는 비오틴 유사체, 아비딘 또는 아비딘 유사체는 모두 연결요소로 사용되며, 양자 사이에 친화 복합체의 결합효과가 형성된다. 상기 친화성 단백질은 정제 매질로 사용할 수 있고 연결요소로도 사용할 수 있고, 정제 매질로 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 제4 측면에 따른 생체자기 마이크로스피어는 친화성 단백질 자기 마이크로스피어 또는 친화성 단백질 자석 비드라고도 칭한다.
도 2는 상기 생체자기 마이크로스피어의 전형적인 구조를 나타낸다.
일부 바람직한 양태에서, 본 발명의 제2 측면에서 제공되는 상기 생체자기 마이크로스피어를 기초로하고, 상기 정제 매질은 친화성 단백질이며, 상기 생체자기 마이크로스피어는 상기 친화성 단백질에 연결된 아비딘 및 상기 아비딘에 결합된 비오틴을 추가로 포함하고, 여기서, 정제 매질은 연결요소를 통해 상기 중합체 분지쇄의 말단에 연결되며, 상기 연결요소에는 비오틴과 아비딘에 의해 형성된 친화 복합체가 포함된다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 친화성 단백질은 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L 중 하나이거나 이의 변성 단백질이다. 대응하는 생체자기 마이크로스피어는 단백질 A 자기 마이크로스피어 또는 단백질 A 자석 비드, 단백질 G 자기 마이크로스피어 또는 단백질 G 자석 비드, 단백질 L 자기 마이크로스피어 또는 단백질 L 자석 비드 등으로 각각 칭될 수 있다.
본 발명의 제4 측면에 제공되는 생체자기 마이크로스피어는 비오틴-아비딘-친화성 단백질의 연결 형태를 예로 들어, 친화성 단백질을 자석 비드의 외부 표면에 있는 중합체의 분지쇄 말단에 견고하게 결합시킬 수 있을 뿐만 아니라, 친화성 단백질을 교체해야 할 경우 아비딘(스트렙타비딘 등)을 비오틴의 특이적 결합 위치에서 용출하여 친화성 단백질의 동시 분리를 구현하여 새로운 아비딘-친화성 단백질 공유결합 복합체 E(예를 들어, 스트렙타비딘 태그가 있는 친화성 단백질)에 재결합가능한 활성화 부위를 방출하며, 이로 하여, 자석 비드의 정제 성능의 신속한 회복을 구현하여, 항체의 분리 및 정제 비용을 크게 절감할 수 있다. 친화성 단백질로 개질된 생체자기 마이크로스피어를 용출하여 아비딘-친화성 단백질 공유결합 복합체 E를 제거함으로써, 비오틴으로 개질된 생체자기 마이크로스피어를 다시 얻는 과정을 비오틴 자기 마이크로스피어의 재생이라고 한다. 재생된 비오틴 자기 마이크로스피어에는 방출된 비오틴 활성 부위가 있어, 아비딘-친화성 단백질 공유결합 복합체 E를 재결합할 수 있고, 친화성 단백질로 개질된 생체자기 마이크로스피어F(생체자기 마이크로스피어F의 재생에 해당함)를 다시 얻어, 신선한 친화성 단백질 및 신생 항체 결합 부위를 제공할 수 있다. 이는 본 발명의 비오틴 자기 마이크로스피어를 재생 사용할 수 있고, 즉 친화성 단백질을 교체한 후 재활용할 수 있도록 한다.
5. 본 발명의 제5 측면은, 본 발명의 제1 측면에서 제공되는 상기 생체자기 마이크로스피어의 제조 방법을 제공한다.
5.1. 제1 측면에서 제공되는 생체자기 마이크로스피어의 제조 및 원리
본 발명의 제1 측면은 비오틴 또는 비오틴 유사체로 개질된 비오틴 자기 마이크로스피어를 제공한다.
비오틴으로 개질된 예를 든다.
제1 측면에서 제공되는 생체자기 마이크로스피어는 다음 부분을 통해 제조하여 얻을 수 있다. SiO2로 코팅된 자석 비드(상업적으로 구매 또는 자체로 제조함), SiO2의 활성화 개질, SiO2(중합체는 선형 주쇄의 일단을 통해 SiO2에 공유결합되고, 중합체 주쇄를 따라 다수의 곁사슬이 분포되어 있음)에 공유결합된 중합체, 중합체의 분지쇄 말단에 공유결합된 비오틴을 제공한다. 상술한 부분은 완전히 고립될 필요가 없으며 2개 또는 3개의 부분을 1개의 부분으로 결합하는 것이 허용된다는 점에 유의해야 한다. 예를 들어, 이미 활성화된 이산화규소로 코팅된 자석 비드(상업적으로 구매 또는 자체로 제조함)를 직접 제공할 수 있다. 본 발명에서 제공되는 제5 측면 내지 제8 측면에 따른 상기 생체자기 마이크로스피어의 제조 방법의 제(1) 단계와 같이 SiO2가 활성화 개질된다. 본 발명에서 제공되는 제5 측면 내지 제8 측면에 따른 상기 생체자기 마이크로스피어의 제조 방법의 제(2), 제(3) 단계와 같이 중합체는 SiO2에 공유결합된다. 본 발명에서 제공되는 제5측면 내지 제8 측면에 따른 상기 생체자기 마이크로스피어의 제조 방법의 제(4) 단계와 같이 비오틴은 중합체의 분지쇄 말단에 공유 결합된다.
상기 생체자기 마이크로스피어는, 외부 표면에 반응성 기 R1을 갖는 자기 마이크로스피어 본체를 제공하거나 제조하는 단계(1); 상기 반응성 기 R1을 기초로하고, 일단이 상기 반응성 기 R1에 공유 연결된 선형 주쇄와 다수의 분지쇄를 갖는 중합체를 연결하는 단계(2); 상기 분지쇄의 말단에 비오틴 또는 비오틴 유사체를 연결하는 단계 (3)을 통해 제조될 수 있다.
SiO2로 코팅된 자기 재료를 자기 마이크로스피어의 본체로 사용한 예로서, 상기 생체자기 마이크로스피어는, SiO2로 코팅된 자기 마이크로스피어(상업적으로 구매 또는 자체로 제조)를 제공하고, SiO2의 활성화 개질을 수행하여 반응성 기 R1을 생성한는 단계 (1); 반응성 기 R1에 중합 반응(예를 들어, 아크릴산 또는 아크릴산 나트륨을 단량체 분자로 사용함)을 수행하여 선형 주쇄 및 말단에 작용기 F1을 갖는 다수의 분지쇄가 포함된 중합체를 생성하는 단계 (2); 비오틴 또는 비오틴 유사체를 분지쇄 말단의 작용기F1에 연결시키는 단계 (3)을 통해 제조된다. 이때, 자기 마이크로스피어 본체에 공유결합된 중합체에는 선형 주쇄가 있고, 선형 주쇄의 일단이 반응성 기 R1에 공유 고정되고, 중합체의 주쇄를 따라 다수의 곁사슬이 분포된다.
5.2. 대표적인 예
상기 생체자기 마이크로스피어의 대표적인 제조 방법(도3을 참조)은 다음 단계를 포함한다.
단계(1): 자기 마이크로스피어 본체를 제공하고, 자기 마이크로스피어 본체를 화학적 개질하고, 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 아미노를 도입하여 아미노로 개질된 자기 마이크로스피어 A를 형성한다.
일부 바람직한 양태에서, 자기 마이크로스피어 본체는 커플링제에 의해 화학적 개질된다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 커플링제는 아민화된 실란 커플링제이다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 자기 마이크로스피어 본체는 SiO2로 코팅된 자기 재료이고, 자기 마이크로스피어 본체는 실란 커플링제에 의해 화학적 개질된다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 실란 커플링제는 아민화된 실란 커플링제이다.
단계(2): 카르복실과 아미노 사이의 공유 반응을 이용하여 아크릴산 분자를 상기 자기 마이크로스피어 A의 외부 표면에 공유 결합시키고, 탄소-탄소 이중 결합을 도입하여 탄소-탄소 이중 결합 함유 자기 마이크로스피어 B를 형성한다.
단계(3): 탄소-탄소 이중 결합의 중합 반응을 이용하여, 아크릴산류 단량체 분자(아크릴산 나트륨 등)를 중합하고, 얻어진 아크릴산류 중합체는 선형 주쇄 및 작용기 F1을 갖는 분지쇄를 포함하는 분지쇄형 중합체이고, 중합체는 선형 주쇄의 일단을 통해 자기 마이크로스피어 B의 외부 표면에 공유 결합되어, 아크릴산류 중합체로 개질된 자기 마이크로스피어 C를 형성한다. 상기 단계는 가교제를 첨가하지 않은 조건에서 수행될 수 있다.
상기 아크릴산류 단량체 분자 및 중합체 분지쇄의 작용기에 대한 정의는 "명사 및 용어" 부분을 참조한다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 작용기 F1은 카르복실기, 히드록실기, 아미노기, 메르캅토기, 포름산염, 암모늄 염, 카르복실기의 염 형태, 아미노기의 염 형태, 포르메이트기 또는 상술한 작용기의 조합이다. 상기 "작용기의 조합"은 하나의 자기 마이크로스피어의 외부 표면에 있는 모든 중합체의 모든 분지쇄에 함유된 작용기를 의미하며, 그 종류는 하나 이상일 수 있다. 제1 측면에서 정의된 "작용기의 조합"의 의미와 같다.
다른 일부 바람직한 양태에서, 상기 작용기는 특이적인 결합 부위이다.
단계 (4): 상기 중합체의 분지쇄에 함유된 작용기 F1을 통해 비오틴 또는 비오틴 유사체를 중합체의 분지쇄 말단에 공유 결합시켜, 비오틴 또는 비오틴 유사체가 결합된 생체자기 마이크로스피어(비오틴 자기 마이크로스피어)를 얻는다. 제조하여 얻은 생체자기 마이크로스피어에 있어서, 비오틴에 결합가능한 다수의 부위가 아크릴산류 중합체(폴리아크릴산 골격을 포함함)에 의해 제공된다.
5.3. 구체적인 실시형태
상기 비오틴 자기 마이크로스피어를 제조하기 위한 구체적인 실시형태는 다음과 같다.
구체적으로, 선형 주쇄와 다수의 분지쇄를 제공하는 아크릴산류 중합체를 예로 들어, 본 발명은 다음과 같은 구체적인 실시형태를 제공한다. 이산화규소로 코팅된 사산화삼철 자석 비드를 생체자기 마이크로스피어의 본체로 사용된다. 먼저 이산화규소로 코팅된 사산화삼철 자석 비드는 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES, CAS: 919-30-2, 아민화된 커플링제이고, 또한 실란커플링제이며, 보다 구체적으로 아민화된 실란 커플링제임) 커플링제에 의해 화학적 개질되고, 자석 비드의 외부 표면에 아미노를 도입하여 SiO2의 활성화 개질을 완료하고, 아미노로 개질된 자기 마이크로스피어 A를 얻는다. 다음 카르복실과 아미노 사이의 공유 반응을 이용하여 고정화 분자(하나의 탄소-탄소 이중 결합과 하나의 반응성 기 카르복실기를 제공하는 아크릴산 분자)를 자석 비드의 외부 표면에 공유 결합시키고, 이로 하여, 탄소-탄소 이중 결합을 자석 비드의 외부 표면에 도입하여, 탄소-탄소 이중 결합 함유 자기 마이크로스피어 B를 얻는다. 그 다음, 탄소-탄소 이중 결합의 중합 반응을 이용하여 아크릴산류 단량체 분자(아크릴산 나트륨 등)를 중합하며, 중합 반응을 수행하는 동시에 중합 생성물을 자석 비드의 외부 표면에 공유결합시켜 SiO2에 중합체(공유 연결)를 연결하는 것을 완료함으로써, 아크릴산류 중합체로 개질된 자기 마이크로스피어 C를 얻는다. 여기서 고정화 분자는 아크릴산 분자이며, 하나의 고정화 분자는 하나의 중합체 분자만 인출하는 동시에 하나의 중합체 선형 주쇄만 인출한다. 아크릴산 나트륨을 단량체 분자로 사용한 예로, 중합 생성물은 폴리아크릴산 나트륨이고 이의 주쇄는 선형의 폴리올레핀 주쇄이며, 주쇄를 따라 다수의 곁사슬 COONa가 공유 연결되고, 분지쇄에 함유된 작용기는 COONa이다. 여기에서, 중합 반응은 N,N'-메틸렌 비스 아크릴아마이드(CAS: 110-26-9)와 같은 가교제를 사용하지 않아 분자 사슬이 가교되어 망상 중합체를 형성하는 것을 방지하고, 가교제를 첨가하지 않은 조건하에서 중합 생성물이 선형 주쇄를 생성하도록 한다. 분자 사슬이 가교되어 망상 중합체를 형성하면 다공성 구조가 형성되어 표적 단백질의 용출 효율에 영향을 준다.
일부 바람직한 양태에서, 자기 마이크로스피어 B의 제조에 사용되는 아크릴산의 량은 0.002 내지 20 mol/L이다.
일부 바람직한 양태에서, 자기 마이크로스피어 C의 제조에 사용되는 아크릴산 나트륨의 량은 0.53 내지 12.76 mol/L이다.
상기 생체자기 마이크로스피어의 외부 표면은 아민화 이외의 다른 활성화 개질 방법을 채택할 수도 있다. 예를 들어, 상술한 아민화된 생체자기 마이크로스피어(아미노로 개질된 자기마이크로스피어 A)는 산 무수물 또는 다른 개질된 분자와 추가로 반응함으로써, 카르복실화 또는 다른 활성화 방식에 의한 생체자기 마이크로스피어의 외부 표면의 화학적 개질을 구현할 수 있다.
상기 고정화 분자는 중합체의 주쇄를 자석 비드의 외부 표면에 공유 고정시키는 소분자이다. 고정화 소분자에 대하여 특별한 제한이 없으며, 이의 일단이 자석 비드의 외부 표면에 공유 결합되고, 타단이 단독중합, 공중합 또는 중축합 반응을 포함하는 중합 반응을 유발할 수 있는 한, 또한 타단에 중합체의 선형 주쇄 말단을 공중합 결합할 수 있으면 된다.
상기 고정화 분자는 하나의 단일 중합체 선형 주쇄만 인출할 수 있고, 사슬이 축적되고 및/또는 체류 비율이 증가하지 않는 한 2개 이상의 중합체 선형 주쇄를 인출할 수도 있다. 하나의 고정화 분자는 하나의 중합체 분자만 인출하고 하나의 중합체 선형 주쇄만 인출하는 것이 바람직하다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 고정화 분자는 하나의 단일 중합체 선형 주쇄만 인출하며, 사슬이 축적하지 않거나 체류 비율이 증가하지 않는 한 2개 이상의 중합체 선형 주쇄를 인출할 수도 있다. 하나의 고정화 분자는 하나의 중합체 분자만 인출하고 하나의 중합체 선형 주쇄만 인출하는 것이 바람직하다.
다른 일부 바람직한 양태에서, 상기 아크릴산류 단량체 분자는 중합된 단량체 단위로서 아크릴산, 아크릴산염, 아크릴레이트, 메타크릴산, 메타크릴산염, 메타크릴레이트류 단량체 중 하나 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태로서, 상기 아크릴산류 중합체는 다른 중합체로 대체할 수 있고, 선택 기준은 다음과 같다. 형성된 중합체에는 하나의 선형 주쇄가 있고, 주쇄에 따라 다수의 곁사슬이 분포되어 있고, 곁사슬에는 후속의 화학적 개질을 위한 작용기가 있다. 즉 자석 비드의 외부 표면에 있는 하나의 결합 부위는 중합체의 선형 주쇄 측단에 분포된 분지쇄를 통해 다수의 작용기를 제공한다. 예를 들어, ε-폴리리신 사슬, α-폴리리신 사슬, γ-폴리글루탐산, 폴리아스파르트산 사슬, 아스파르트산/글루타메이트 공중합체와 같은 구조이다.
상기 생체자기 마이크로스피어의 외부 표면에 상술한 중합체에 대한 다른 대체안의 중합체 분자를 도입하는 방법은 다음과 같다. 중합체 대체물의 화학 구조 및 이의 곁사슬의 활성기 유형에 따라, 생체자기 마이크로스피어의 외부 표면에 적합한 활성화 개질 방법, 고정화 분자의 종류 및 단량체 분자의 유형을 선택하고, 적합한 화학반응을 수행하여 분지쇄에 위치한 다수의 활성기를 생체자기 마이크로스피어의 외부 표면에 도입한다.
아크릴산류 중합체 분자(예를 들어, 폴리아크릴산 나트륨 선형 분자 사슬)를 자석 비드의 외부 표면에 공유결합한 후, 분지쇄 말단의 작용기가 활성화 부위를 제공하고, 또는 비오틴 또는 비오틴 유사체 분자를 연결하기 전에, 반응의 필요에 따라 중합체 분자의 분지쇄 작용기를 활성화하여 이로 하여금 반응 활성을 갖게하여 활성화 부위를 형성할 수 있다. 1,3-프로판디아민을 중합체 분지쇄의 활성화 부위(각 단량체 아크릴산류의 단위 구조가 하나의 활성화 부위를 제공할 수 있음)에 공유결합시켜 새로운 작용기(아미노기)를 형성한 다음, 다시 카르복실과 아미노 사이의 아미드화 공유 반응을 이용하여 비오틴 또는 비오틴 유사체 분자를 중합체 분지쇄 말단의 새로운 작용기에 공유 결합시켜, 중합체의 분지쇄 말단에 비오틴 또는 비오틴 유사체를 공유결합하는 단계를 완료한다. 비오틴을 정제 매질로 사용한 예로서, 비오틴으로 개질된 생체자기 마이크로스피어 D를 얻는다. 하나의 비오틴 분자는 하나의 특이적인 결합 부위를 제공할 수 있다. COONa를 중합체 분지쇄의 작용기로 사용한 예로서, 이 경우, 아크릴산 나트륨을 단량체 분자로 사용하고, 1,3-프로판디아민과 공유 반응하기 전에, EDC·HCl 및 NHS를 첨가하는 등 종래의 카르복실 활성화 방법을 사용하여 카르복실 활성화를 먼저 수행할수 있다.
5.3.1. 아크릴산류 중합체로 개질된 자기 마이크로스피어의 제조
자기 마이크로스피어 A의 제조: 이산화규소로 코팅된 사산화삼철 자기 마이크로스피어의 수용액은 무수 에탄올로 자기 마이크로스피어를 세척하고, 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES, 커플링제)의 에탄올 용액을 첨가하여 반응시킨 다음 세척함으로써 자기 마이크로스피어의 외부 표면에 다수의 아미노를 도입시킨다.
자기 마이크로스피어 B의 제조: 아크릴산의 수용액에 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(EDC·HCl)과 N-히드록시숙신이미드(NHS)를 첨가하여 카르복실 활성화를 수행하고, 활성화된 후 자기 마이크로스피어 A를 함유한 수용액에 첨가한다. 아크릴산의 활성화된 카르복실과 자기 마이크로스피어의 외부 표면에 있는 아미노가 공유결합(아미드 결합)을 형성하고, 자기 마이크로스피어의 외부 표면에 다수의 탄소-탄소 이중 결합이 도입된다.
자기 마이크로스피어 C의 제조: 아크릴산류 단량체 분자의 수용액을 자기 마이크로스피어 B에 첨가하고, 기폭제를 첨가하여 탄소-탄소 이중 결합의 중합 반응을 수행한다. 아크릴산류 단량체 분자의 탄소-탄소 이중 결합과 자기 마이크로스피어 표면의 탄소-탄소 이중 결합은 결합 개방 중합을 수행하여, 아크릴산류 중합체 분자를 자기 마이크로스피어의 외부 표면에 공유결합시키며, 여기서, 아크릴산류 중합체에는 카르복실류 작용기가 함유된다. 상기 카르복실류 작용기는 카르복실기, 포름산염 및 포름에스테르 등의 형태로 존재할 수 있다. 바람직한 일 양태에서, 포름산나트륨 형태로 존재하며, 이때 아크릴산 나트륨 또는 메타크릴산 나트륨 등을 단량체 분자로 사용한다. 다른 바람직한 일 양태에서, 포름에스테르 형태로 존재하며, 이때 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트 등을 단량체 분자로 사용한다. 포름산염과 포름에스테르는 카르복실기에 의해 활성화된 후 우수한 반응 활성을 얻을 수 있다.
5 .3.2. 비오틴으로 개질된 생체자기 마이크로스피어 D의 제조
자기 마이크로스피어 C 용액에 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(EDC·HCl)과 N-히드록시숙신이미드(NHS)를 첨가하여, 마이크로스피어의 외부 표면에 있는 중합체 분자 곁사슬의 카르복실류 작용기를 카르복실 활성화시킨 후, 프로판디아민 수용액을 첨가하여 커플링 반응을 수행하여, 아크릴산류 중합체 분자의 곁사슬 카르복실 위치에 프로판디아민이 접목되고, 중합체 곁사슬의 작용기가 카르복실기에서 아미노기로 전환된다.
비오틴 수용액에 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염과 N-히드록시숙신이미드를 첨가하여, 비오틴 분자의 카르복실기를 활성화시킨 다음, 자기 마이크로스피어 C를 함유한 용액에 첨가하여, 자기 마이크로스피어 C의 외부 표면에 있는 중합체 곁사슬의 신생 작용기(아미노) 위치에 비오틴을 공유 결합시켜, 아크릴산류 중합체의 다수의 곁사슬에 비오틴 분자가 각각 연결된 생체자기 마이크로스피어 D를 얻는다.
5.3.3. 바람직한 예
일부 바람직한 양태에서, 상술한 생체자기 마이크로스피어 D의 제조 방법은 다음과 같다.
먼저, 0.5 내지 1000 mL(20%, v/v)의 이산화규소로 코팅된 사산화삼철 자기마이크로스피어 수용액을 취하고 무수 에탄올로 자기 마이크로스피어를 세척하고, 10 내지 300 mL의 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES, CAS: 919-30-2)의 에탄올 용액(5% 내지 50%, v/v)을 상술한 세척 후의 자기 마이크로스피어에 첨가하여 2 내지 72시간 동안 반응시키고, 무수 에탄올과 증류수로 자기 마이크로스피어를 세척하여 아미노로 개질된 자기 마이크로스피어 A를 얻는다.
1.0×10-4 내지 1 mol의 아크릴산을 피펫팅하여 pH4~6인 X용액(X용액: 최종 농도가 0.01 내지 1 mol/L인 2-모르폴린 에탄술폰산(CAS: 4432-31-9), 0.1 내지 2 mol/L인 NaCl의 수용액)에 첨가하고, 0.001 내지 0.5 mol의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(EDC·HCl, CAS: 25952-53-8)과 0.001 내지 0.5 mol의 N-히드록시숙신이미드(NHS, CAS: 6066-82-6)를 첨가하여 3 내지 60분 동안 반응시킨다. 상술한 용액을 0.5 내지 50 mL의 자기 마이크로스피어 A가 혼합된 PBS(pH7.2 내지 7.5) 완충용액에 첨가하여 1 내지 48시간 동안 반응시킨 후 증류수로 자기 마이크로스피어를 세척하여 탄소-탄소 이중 결합으로 개질된 자기 마이크로스피어 B를 얻는다.
0.5 내지 50 mL의 자기 마이크로스피어 B를 취하고 5% 내지 30%(w/v)의 아크릴산 나트륨 용액 0.5 내지 200 mL를 첨가한 다음, 2% 내지 20%(w/v)의 과황산암모늄 용액 10μL 내지 20 mL와 테트라메틸에틸렌 아미드 1μL 내지 1 mL를 첨가하여 3 내지 60분 동안 반응시킨 후 증류수로 자기 마이크로스피어를 세척하여 폴리아크릴산 나트륨으로 개질된 자기 마이크로스피어 C를 얻는다.
0.5 내지 50 mL의 자기 마이크로스피어 C를 취하여 pH4 내지 6인 X용액에 옮기고, 0.001 내지 0.5 mol의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(EDC·HCl)과 0.001 내지 0.5 mol의 N-히드록시숙신이미드(NHS)를 첨가하여 3 내지 60 min 동안 반응시킨다. 그 다음, 0.0001내지 1 mol의 1,3-프로판디아민이 용해된 PBS(pH7.2 내지 7.5) 완충용액을 첨가하여 1 내지 48시간 동안 반응시킨다. 증류수로 세척한 다음 PBS 완충용액을 첨가하고, 자기 마이크로스피어 C에 있는 중합체 곁사슬의 COONa를 아미노 작용기로 전환시킨다. 1.0×10-6 내지 3.0×10-4 mol의 비오틴을 X용액에 칭량하여 넣고, 2.0×10-6 내지1.5×10-3 mol의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염과 2.0×10-6 내지 1.5×10-3 mol의 N-히드록시숙신이미드를 첨가하여 3 내지 60 min 반응시킨다. 그 다음 상술한 세척 후의 자기 마이크로스피어 용액에 첨가하여 1 내지 48시간 동안 반응시키고 증류수로 세척한 후 비오틴으로 개질된 자기 마이크로스피어 D를 얻는다.
5.4. 본 발명의 제3 측면에서 제공되는 생체자기 마이크로스피어는 제1 측면에서 제공되는 생체자기 마이크로스피어를 아비딘 또는 아비딘 유사물질과 직접 반응시켜 얻을 수 있다.
6. 본 발명의 제6 측면은, 본 발명의 제2 측면에서 제공되는 상기 생체자기 마이크로스피어의 제조 방법을 제공한다. 상기 제조 방법은 다음의 단계: 제5 측면의 단계(1) 내지 단계 (4)를 사용하여 제조된 청구항1에 따른 생체자기 마이크로스피어를 제공하는 단계 (i); 상기 생체자기 마이크로스피어의 중합체의 분지쇄 말단에 있는 비오틴 또는 비오틴 유사체에 정제 매질을 연결시키는 단계 (ii)를 포함한다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 생체자기 마이크로스피어는 제5 측면의 단계와 동일한 단계 (1) 내지 단계 (4); 정제 매질을 상기 생체자기 마이크로스피어의 중합체의 분지쇄 말단에 있는 비오틴에 연결시키는 단계 (5)에 의해 제조된다.
7. 본 발명의 제7 측면은, 본 발명의 제2 측면에서 제공되는 상기 생체자기 마이크로스피어의 제조 방법을 제공한다. 상기 제조 방법은 다음의 단계: 제5 측면의 단계 (1) 내지 단계 (4)를 사용하여 제조된 청구항1에 따른 생체자기 마이크로스피어를 제공하는 단계 (i); 정제 매질을 제공하는 원료로서 아비딘 또는 아비딘 유사체와 정제 매질의 공유결합 복합체(예를 들어, 아비딘-정제 매질 공유결합 복합체)를 사용하고, 이를 중합체의 분지쇄 말단에 결합시키고, 상기 비오틴 또는 비오틴 유사체와 상기 아비딘 또는 아비딘 유사체 사이에 친화 복합체의 결합효과가 형성되어 정제 매질을 가진 생체자기 마이크로스피어를 얻는 단계(ii)를 포함한다.
자석으로 생체자기 마이크로스피어를 침강시킨 다음 액상을 제거하고 세척하는 단계 (6)을 독립적 선택적으로 포함한다.
적당한 조건하에서 상기 아비딘 또는 아비딘 유사체와 정제 매질의 공유결합 복합체를 용출하여 상기 정제 매질의 교체를 구현하는 단계를 독립적 선택적으로 포함한다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 생체자기 마이크로스피어는 다음의 5개 단계: 제5 측면에서의 단계와 동일한 단계 (1) 내지 단계 (4); 상술한 단계 (ii)와 동일한 단계 (5)를 통해 제조된다.
8. 본 발명의 제8 측면은, 본 발명의 제4 측면에서 제공되는 상기 생체자기 마이크로스피어의 제조 방법(예를 들어, 도3과 같음)을 제공한다.
본 발명의 제4 측면은 친화성 단백질 자기 마이크로스피어를 제공한다.
본 발명의 제4 측면에서 제공되는 생체자기 마이크로스피어는 제1 측면에서 제공되는 생체자기 마이크로스피어를 원료로 사용하고, 비오틴 또는 이의 유사체와 아비딘 또는 이의 유사체 사이의 친화 복합체 상호작용을 통해 친화성 단백질을 상기 생체자기 마이크로스피어의 중합체 분지쇄에 로딩함으로써, 아비딘 또는 이의 유사체 및 친화성 단백질의 공유결합 복합체를 결합시켜 얻을 수 있다.
바람직한 일 양태에서, 본 발명의 제4 측면에서 제공되는 생체자기 마이크로스피어는 제1 측면에서 제공되는 생체자기 마이크로스피어를 원료로 사용하여 아비딘-친화성 단백질 공유결합 복합체 E를 결합시켜 얻을 수 있다.
아비딘-친화성 단백질 공유결합 복합체 E는 아비딘-친화성 단백질 복합체 E라고도 칭할 수 있고, 공유 방식의 연결에 의해 형성된 복합체로서, 일단이 아비딘 또는 이의 유사체이고 타단이 친화성 단백질이며, 양자는 공유결합을 통해 직접 연결되거나 공유 연결요소에 의해 간접적으로 연결된다. 상기 공유 연결기는 공유결합, 연결 펩티드 등을 포함한다. 아비딘-친화성 단백질 복합체 E는 예를 들어, 스트렙타비딘을 가진 친화성 단백질이며, 여기서, 친화성 단백질은 단백질 A, 단백질 G 또는/및 단백질 L 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 단백질로부터 선택된다. 아비딘-친화성 단백질 복합체 E의 예에는 스트렙타비딘-단백질 A 복합체, 스트렙타비딘-단백질 A의 융합 단백질, 스트렙타비딘-강화 녹색형광 단백질-단백질 A의 융합 단백질(단백질 A-eGFP-스트렙타비딘), 단백질 A-eGFP-타마비딘2, 단백질 A-eGFP-타마비딘1 등이 추가로 포함된다. 여기서, eGFP는 eGFP의 돌연변이체를 광범위하게 포함하고, Streptavidin은 스트렙타비딘이며, 타마비딘1과 타마비딘2는 모두 아비딘 유사체이다.
아비딘은 비오틴에 특이적으로 결합하여 친화 복합체를 형성한다. 상술한 아비딘과 비오틴의 친화 복합체의 결합효과는 다른 친화 복합체의 결합효과로 대체할 수도 있고, 친화성 단백질을 교체한 후 마찬가지로 재활용 효과를 구현할 수 있다. 그러나, 아비딘과 비오틴에 의해 제공된 친화 복합체 효과가 보다 바람직하다. 이는 양자 사이의 특이성이 좋고, 친화력이 강하며, 비오틴은 아비딘과의 결합 도메인 외에도 하나의 공유결합을 위한 카르복실기를 추가로 가지고 있고, 또한 아비딘은 친화성 단백질과 쉽게 융합 단백질을 제조할 수 있기 때문이다.
친화 복합체의 선택 기준은 특이성이 좋고 친화력이 강하며, 또한 중합체의 분지쇄 말단에 공유결합이 가능하거나 화학적 개질된 후 중합체의 분지쇄 말단에 공유결합할 수 있도록 하나의 화학 결합 부위를 제공할 수 있어야 한다.
8.1. 제조 과정
일부 실시형태에서, 친화성 단백질을 정제 매질로 사용하는 자기 마이크로스피어 시스템을 얻기 위해 상술한 제5 측면에서 제조된 생체자기 마이크로스피어(비오틴 자기 마이크로스피어)를 기초로하여 다음 단계 (5)를 수행한다.
단계 (5): 아비딘 또는 아비딘 유사체와 친화성 단백질의 공유결합 복합체(아비딘-친화성 단백질 공유결합 복합체 E 등)를 결합시킨다. 비오틴 또는 이의 유사체와 아비딘 또는 이의 유사체 사이의 특이적 결합효과를 통해, 상기 공유결합 복합체(아비딘-친화성 단백질 공유결합 복합체 E 등)를 중합체의 분지쇄 말단에 결합시키고, 비오틴 또는 이의 유사체와 아비딘 또는 이의 유사체 사이에 친화 복합체의 결합효과를 형성하여 친화성 단백질 자기마이크로스피어를 얻는다.
예를 들어, 아비딘-친화성 단백질 공유결합 복합체 E(예를 들어, 스트렙타비딘을 가진 친화성 단백질, 여기서, 친화성 단백질은 단백질 A, 단백질 G 또는/및 단백질 L 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 단백질로부터 선택됨)를 비오틴으로 개질된 생체자기 마이크로스피어 D의 시스템에 첨가하고 비오틴과 아비딘(스트렙타비딘 등) 사이의 극도로 강한 특이적인 친화력을 이용하여 친화성 단백질을 자석 비드의 외부 표면에 있는 중합체의 분지쇄 말단에 비공유적으로 연결시켜, 항체 물질의 분리 및 정제에 사용할 수 있는 친화성 단백질로 개질된 자석 비드를 얻을 수 있고, 친화성 단백질을 정제 매질로 사용하여 표적 단백질을 포획하기 위한 결합 부위를 제공한다.
8.2. 제조 과정의 예
본 발명의 제4 측면에서 제공되는 생체자기 마이크로스피어는, 비오틴-아비딘-친화성 단백질에 의해 상기 중합체의 분지쇄 말단에 연결되는 것을 예로, 다음의 단계에 의해 제조될 수 있다.
(1) 자기 마이크로스피어의 본체에 대하여 화학적 개질을 수행하고, 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 아미노를 도입하여 아미노로 개질된 자기 마이크로스피어 A를 형성한다. 상기 자기 마이크로스피어 본체가 SiO2로 코팅된 자기 재료인 경우, 상기 커플링제는 아미노실란 커플링제인 것이 바람직하다.
바람직한 일 양태에서, 커플링제를 사용하여 자기 마이크로스피어 본체를 화학적 개질시킨다.
상기 자기 마이크로스피어 본체가 SiO2로 코팅된 자기 재료인 경우, 실란 커플링제를 사용하여 자기 마이크로스피어 본체를 화학적 개질시킨다. 이때, 상기 커플링제는 아미노실란 커플링제인 것이 바람직하다.
(2) 카르복실과 아미노 사이의 공유 반응을 이용하여 아크릴산 분자를 상기 자기 마이크로스피어 A의 외부 표면에 공유결합시키고 탄소-탄소 이중 결합을 도입하여, 탄소-탄소 이중 결합을 함유한 자기 마이크로스피어 B를 형성한다.
(3) 가교제를 첨가하지 않은 조건하에서, 탄소-탄소 이중 결합의 중합 반응을 이용하여 아크릴산류 단량체 분자(아크릴산 나트륨 등)를 중합하고, 얻어진 아크릴산류 중합체 사슬에는 선형 주쇄와 작용기를 함유한 분지쇄가 있고, 중합체는 선형 주쇄 일단을 통해 자기 마이크로스피어 B의 외부 표면에 공유결합되어 아크릴산류 중합체로 개질된 자기 마이크로스피어 C를 형성한다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 작용기는 특이적인 결합 부위이다.
다른 바람직한 양태에서, 상기 작용기는 상술한 제1 측면의 것과 같다.
(4) 상기 중합체의 분지쇄에 함유된 작용기를 통해, 비오틴을 공유결합시켜 비오틴으로 개질된 생체자기 마이크로스피어 D를 얻는다.
(5) 비오틴과 아비딘 사이의 특이적인 결합효과를 통해 아비딘-친화성 단백질 공유결합 복합체 E를 중합체의 분지쇄 말단에 결합시키고, 비오틴과 아비딘 사이에 친화 복합체의 결합효과가 형성되어 친화성 단백질로 개질된 생체자기 마이크로스피어(친화성 단백질 자기 마이크로스피어)를 얻는다.
자석으로 친화성 단백질 자기 마이크로스피어를 침강시킨 다음 액상을 제거하고 세척하는 단계 (6)을 독립적 선택적으로 포함한다.
또한, 적당한 조건하에서 상기 아비딘-친화성 단백질 공유결합 복합체 E를 용출시킴으로써 상기 아비딘-친화성 단백질 공유결합 복합체 E의 교체를 구현하는 단계 (7)을 독립적 선택적으로 포함한다.
8.3. 생체자기 마이크로스피어: 아비딘-단백질 A가 결합된 생체자기 마이크로스피어F의 제조
(친화성 단백질이 결합된 생체자기 마이크로스피어F, 단백질 A로 개질된 생체자기 마이크로스피어F, 단백질 A로 개질된 자기 마이크로스피어)
비오틴으로 개질된 생체자기 마이크로스피어 D를 아비딘-단백질 A 결합 복합체 E(예를 들어, 단백질 A-eGFP-스트렙타비딘, 단백질 A-eGFP-타마비딘2)의 융합 단백질 용액에 첨가한 다음 혼합하여 배양한다. 아비딘(스트렙타비딘 또는타마비딘2 등)과 비오틴의 특이적 결합을 통해, 단백질 A를 생체자기 마이크로스피어 D의 외부 표면에 있는 중합체 분지쇄의 말단에 고정시켜 아비딘-단백질 A를 함유한 생체자기 마이크로스피어F를 얻는다. 얻어진 생체자기 마이크로스피어F 구조에서, 아크릴산 중합체의 곁사슬에는 비오틴-아비딘-단백질 A의 친화 복합체 구조가 함유되고, 비오틴 단을 통해 중합체의 선형 주쇄 분기점에 공유결합되고, 비오틴과 아비딘 사이에 친화 복합체의 강한 비공유의 특이적 결합효과를 형성하고, 아비딘과 단백질 A 사이는 공유 결합되며, 아비딘과 단백질 A 사이에 형광 태그를 삽입할 수 있고, 또한 다른 연결 펩티드를 삽입할 수 있다.
여기서, 단백질 A-eGFP-스트렙타비딘 융합 단백질 및 단백질 A-eGFP-타마비딘2 융합 단백질과 같은 아비딘-단백질 A의 융합 단백질은, 모두 IVTT 반응에 의해 체외 무세포 단백질 합성을 수행하여 얻을 수 있다. 이때, 상기 생체자기 마이크로스피어 D와 IVTT 반응 후 얻은 상청액을 혼합하여 생체자기 마이크로스피어 D의 외부 표면에 있는 비오틴과 용액 속의 아비딘 융합 단백질 사이의 특이적 결합효과를 통해 친화성 단백질 A의 결합을 구현한다.
8.4. 상기 생체자기 마이크로스피어의 외부 표면에 있는 친화성 단백질의 결합량은 다음의 방법으로 결정(형광 단백질 eGFP 라벨링을 예로함)할 수 있다.
먼저, 친화성 단백질 용액과 자석 비드의 결합 반응이 완료된 후, 친화성 단백질이 결합된 생체자기 마이크로스피어를 자석으로 흡착 및 침강시킨다. 그 다음, 액상을 분리 수집하여 관류액이라고 기록한다. 이때, 액상속의 친화성 단백질의 농도는 낮아진다. 생체자기 마이크로스피어에 결합하기 전과 결합한 후의 IVTT 반응에서 얻은 상청액 속의 형광 단백질 eGFP의 형광 값의 변화 값를 측정하여 생체자기 마이크로스피어에 결합된 형광 단백질 eGFP의 형광 강도를 계산하여 얻고, 환산하여 친화성 단백질의 농도를 구한다. 관류액에 있는 친화성 단백질의 농도가 생체자기 마이크로스피어를 배양하기 전의 IVTT 용액에 있는 친화성 단백질의 농도에 비하여, 실질적으로 변하지 않은 경우, 친화성 단백질에 대한 생체자기 마이크로스피어의 흡착이 포화된 상태로 향하며 해당하는 형광 단백질 eGFP의 형광 값이 더 이상 선명하게 변하지 않음을 의미한다. 순수한 eGFP단백질 제품을 사용하여 형광 값과 eGFP단백질 농도 사이의 표준 곡선을 설정하여, 생체자기 마이크로스피어에 결합된 아비딘-친화성 단백질(스트렙타비딘-단백질 A 등)의 함량 및 농도를 정량 계산할 수 있다.
단백질 A로 개질된 생체자기 마이크로스피어를 사용하여 항체를 분리 및 정제하는 경우, 항체의 결합량(소 혈청 항체를 예로함)은 다음의 방법으로 계산할 수 있다. 단백질 A로 개질된 자석 비드와 소 혈청 항체 용액(예를 들어, 체외 단백질 합성 시스템을 사용하여 항체를 발현시켜 얻거나 상업적으로 구매하여 얻음)을 함께 배양하고 반응이 완료된 후, 용출 완충액을 사용하여 자석 비드에서 소 혈청 항체를 용출 분리하여 얻은 소 혈청 항체는 용출액 속에 존재한다. 용출액 속의 소 혈청 단백질의 농도는 Bradford법으로 측정한다. 동시에, BSA를 표준 단백질로 사용하고 마이크로플레이트 리더 측정을 수행하며, 표준 단백질을 참조로 하여 정제된 항체의 단백질 농도를 계산하여 분리 및 정제의 생산량과 수율을 계산하여 얻는다.
8.5. 생체자기 마이크로스피어의 재생: 정제 매질의 교체(단백질 A이 아닌 친화성 단백질을 예로 함)
단백질 A의 용출 및 교체: 아비딘의 용출과 동시에 단백질 A의 탈착이 이루어지므로, 아비딘-단백질 A의 교체이기도 하다.
예를 들어, 단백질 A로 개질된 생체자기 마이크로스피어F에 변성 완충액(요소 및 나트륨 도데실 설페이트 포함함)을 첨가하고, 95℃의 금속 수조에서 배양하고, 생체자기 마이크로스피어 D의 비오틴에 결합된 아비딘-단백질 A 융합 단백질(예를 들어, SPA-eGFP-타마비딘2)을 용출하여, 재생된 생체자기 마이크로스피어 D(중합체의 분지쇄 말단에 있는 비오틴의 결합 부위를 방출함)를 얻은 다음, 재생된 생체자기 마이크로스피어 D에 신선한 아비딘-단백질 A 융합 단백질이 함유된 용액(예를 들어, SPA-eGFP-타마비딘2의 IVTT 반응 후의 상청액)을 첨가하여, 방출된 생체자기 마이크로스피어 D의 비오틴 결합 부위에 새로운 아비딘-단백질 A(예를 들어, SPA-eGFP-타마비딘2)가 재결합되고, 비오틴과 아비딘(타마비딘2 등) 사이에 비공유의 특이적 결합효과가 다시 형성되고, 이로 하여, 단백질 A의 교체를 구현함으로써, 재생된 생체자기 마이크로스피어F를 얻는다.
9. 자기 마이크로스피어의 위치 제어
본 발명의 제1 내지 제4 측면에 따른 상기 생체자기 마이크로스피어(생체자기 마이크로스피어 D 및 생체자기 마이크로스피어F를 포함하나 이에 제한되지 않음)를 제조하여 얻은 후, 자석을 사용하여 자기 마이크로스피어를 침강시킨 다음 액상을 제거하고 세척하여, 흡착된 불순 단백질 또는/및 다른 불순물을 쉽게 제거할 수 있다.
자기 마이크로스피어의 크기와 중합체의 화학적 매개변수 및 구조적 매개변수를 제어함으로써, 상기 자기 마이크로스피어는 액상에 안정적으로 현탁될 수 있어, 2일 심지어는 더 오랜 시간 침강하지 않는다. 또한, 지속적인 교반 없이 액체 시스템에 안정적으로 현탁될 수 있다. 한편, 자기 마이크로스피어는 수 미크론 심지어는 1 미크로미터 이하의 나노급 크기로 제어할 수 있고, 다른 한편으로는, 자기 마이크로스피어의 외부 표면에 있는 중합체의 접목 밀도를 조절할 수 있고, 중합체 자체의 친수성, 구조 유형, 유체 역학 반경, 사슬의 길이, 분지쇄 수, 분지쇄의 길이 등 특징을 조절할 수 있어, 시스템에서 자기 마이크로스피어 시스템의 현탁 성능을 더 잘 제어함으로써, 자기 마이크로스피어 시스템과 체외 단백질 합성 반응 혼합계 사이의 충분한 접촉을 구현한다. 상기 자기 마이크로스피어의 크기는 약 1μm인 것이 바람직하다.
10. 본 발명의 제9 측면은, 단백질 물질의 분리 및 정제에서 본 발명의 제1 내지 제4 측면에 따른 상기 생체자기 마이크로스피어의 응용을 제공한다.
바람직한 일 양태에서, 항체 물질의 분리 및 정제에서 상기 생체자기 마이크로스피어의 응용이다.
상기 항체 물질의 정의는 용어 부분을 참조한다.
본 발명은 특히 항체, 항체 단편, 항체 융합 단백질 및 항체 단편 융합 단백질의 분리 및 정제에서 상기 생체자기 마이크로스피어의 응용을 제공한다.
상기 정제 매질이 친화 복합체를 함유하는 연결요소를 통해 상기 중합체의 분지쇄 말단에 연결되는 경우, 상기 응용은 생체자기 마이크로스피어의 재생 사용, 즉 정제 매질을 교체한 후의 재활용을 선택적으로 포함한다.
11. 본 발명의 제10 측면은, 항체 물질의 분리 및 정체, 특히 항체, 항체 단편, 항체 융합 단백질 및 항체 단편 융합 단백질의 분리 및 정제에서 본 발명의 제2 측면 또는 제4 측면에 따른 생체자기 마이크로스피어의 응용을 제공한다.
상기 정제 매질은 친화성 단백질이다.
바람직하게는, 상기 친화성 단백질은 비오틴-아비딘-친화성 단백질의 형태로 중합체의 분지쇄에 연결된다.
상기 친화성 단백질이 친화 복합체를 함유하는 연결요소를 통해 상기 중합체의 분지쇄말단에 연결되는 경우(예를 들어, 제4 측면에 따른 상기 생체자기 마이크로스피어), 상기 응용은 또한 생체자기 마이크로스피어의 재생 사용, 즉 친화성 단백질을 교체한 후의 재활용을 선택적으로 포함한다.
상기 응용의 생체자기 마이크로스피어에 있어서, 친화성 단백질과 중합체 선형 주쇄 사이의 분지쇄 골격에는 친화 복합체의 결합효과가 존재하며, 이때, 친화성 단백질을 선택적으로 교체한 후 재활용 할 수 있고, 상기 생체자기 마이크로스피어는 재생 사용할 수 있다. 바람직하게는, 친화성 단백질과 중합체 선형 주쇄 사이의 분지쇄 골격에 비오틴-아비딘의 친화 복합체 결합효과가 존재하며, 즉 친화성 단백질이 비오틴-아비딘-친화성 단백질의 형태로 중합체 분지쇄에 연결되고, 이때, 아비딘-친화성 단백질을 용출 및 교체함으로써 상기 생체자기 마이크로스피어의 재활용을 구현할 수 있다.
12. 본 발명의 제11 측면은 생체자기 마이크로스피어를 제공한다. 상기 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에는 선형 주쇄와 분지쇄를 갖는 적어도 하나의 중합체가 있고, 상기 선형 주쇄의 일단이 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 고정되고, 중합체의 타단이 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에서 유리되며, 상기 자기 마이크로스피어의 중합체의 분지쇄 말단에는 정제 매질이 연결되고, 상기 정제 매질은 아비딘형 태그, 폴리펩티드 태그, 단백질형 태그, 항체형 태그, 항원형 태그 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
바람직한 일 양태에서, 상기 아비딘형 태그는 아비딘, 비오틴에 결합가능한 아비딘 유사체, 비오틴 유사체를 결합할 수 있는 아비딘 유사체 또는 이들의 조합이다.
바람직하게는, 상기 아비딘은 스트렙타비딘, 변성 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 유사체 또는 이들의 조합이다.
바람직한 일 양태에서, 상기 폴리펩티드 태그는 CBP 태그, 히스티딘 태그, C-Myc 태그, FLAG 태그, Spot 태그, C 태그, Avi 태그, Streg 태그, WRHPQFGG 서열을 포함한 태그, WRHPQFGG의 변이체 서열을 포함한 태그, RKAAVSHW 서열을 포함한 태그, RKAAVSHW의 변이체 서열을 포함한 태그 또는 이들의 조합 중 임의의 태그 또는 이들의 변이체로부터 선택된다. 상기 Streg 태그에는 WSHPQFEK 및 이의 변이체가 함유된다.
바람직한 일 양태에서, 상기 단백질형 태그는 친화성 단백질, SUMO 태그, GST 태그, MBP 태그 및 이들의 조합 중 임의의 태그 또는 이들의 변이체로부터 선택된다.
바람직한 일 양태에서, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에는 선형 주쇄 및 분지쇄를 갖는 적어도 하나의 중합체가 있고, 상기 선형 주쇄의 일단이 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 공유적으로 고정되고, 중합체의 타단이 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에서 유리된다. 상기 자기 마이크로스피어의 중합체의 분지쇄 말단에는 친화성 단백질이 연결된다.
또한 바람직하게는, 상기 친화성 단백질과 중합체의 선형 주쇄 사이의 분지쇄 골격에는 친화 복합체의 결합효과가 존재한다.
보다 바람직하게는, 상기 친화성 단백질은 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 변성 단백질 A, 변성 단백질 G, 변성 단백질 L 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
하기 실시예 2 내지 실시예 6의 체외 무세포 단백질 합성 방법에서 사용하는 체외 단백질 합성 시스템(IVTT 시스템)은 다음의 성분(최종 농도): 9.78 mM의 pH8.0인 트리스 염산염(Tris-HCl), 80 mM의 아세트산칼륨, 5 mM의 아세트산마그네슘, 1.8 mM의 뉴클레오사이드 트리포스페이트 혼합물(아데노신 트리포스페이트, 구아노신 트리포스페이트, 시토신 트리포스페이트 및 우리딘 트리포스페이트, 각 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 농도는 모두 1.8 mM임), 0.7 mM의 아미노산 혼합물(글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 세린, 티로신, 시스테인, 메티오닌, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 아스파르트산, 글루타민산, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘, 각 아미노산의 각 농도는 모두 0.1 mM임), 15 mM의 포도당, 320 mM의 말토덱스트린(포도당 단위의 측정몰 농도, 약 52 mg/mL에 해당함), 24 mM의 포스페이트삼칼륨, 2%(w/v)의 폴리에틸렌 글리콜8000을 포함하며, 마지막으로 50% 부피의 세포 추출물(구체적으로 효모세포 추출물, 보다 구체적으로 클루이베로마이세스 락티스세포 추출물)을 첨가한다.
여기서, 상기 클루이베로마이세스 락티스 추출물에는 내인적으로 발현된 T7 RNA 중합효소가 포함된다. 상기 클루이베로마이세스 락티스 추출물은, 클루이베로마이세스 락티스 균주 ATCC8585를 기초로한 변형 균주를 사용하고, CN109423496A에 기재된 방법으로 T7 RNA 중합효소의 암호화 유전자를 클루이베로마이세스 락티스의 게놈에 통합하여 T7 RNA중합효소를 내성적으로 발현할 수 있는 변형 균주를 얻고 변형 균주로 세포 원료를 배양한 다음, 세포 추출물을 제조한다. 클루이베로마이세스 락티스세포 추출물의 제조 과정은 일반적인 기술 수단을 사용하며 CN109593656A에 기재된 방법을 참조하여 제조된다. 일반적인 제조 단계는, 발효 배양된 클루이베로마이세스 락티스 세포를 위한 적절한 양의 원료를 제공하고, 액체 질소로 세포를 급속 냉동시킨 후 세포를 파쇄하고, 원심분리하여 상청액을 수집하여 세포 추출물을 얻는 단계를 포함한다. 얻어진 클루이베로마이세스 락티스세포 추출물의 단백질 농도는 20 내지 40 mg/mL이다.
IVTT반응: 상술한 체외 단백질 합성 시스템에 15 ng/μL의 DNA 주형(암호화된 단백질에는 형광 라벨이 포함됨)을 첨가하여 체외 단백질 합성 반응을 수행하고, 균일하게 혼합한 후 25내지30℃ 환경에 놓고 6 내지 18 h 동안 반응시킨다. 상기 DNA주형에 의해 암호화된 단백질을 합성하여, 상기 단백질을 포함한 IVTT 반응용액을 얻는다. RFU 값은 UV 흡수법으로 측정하며 단백질의 함량은 그 농도와 RFU 값 사이의 표준 곡선을 결합하여 계산할 수 있다.
실시예1 생체자기 마이크로스피어 D의 제조(비오틴 결합)
이산화규소로 코팅된 자기 마이크로스피어(자기 마이크로스피어 본체, 자석 비드, 유리 비드라고도 칭함)의 제조
20 g의 Fe3O4 마이크로스피어를 310 mL의 에탄올과 125 mL 물의 혼합 용매에 넣고, 28%(wt)의 암모니아수 45 mL를 첨가하고, 에틸 오르토실리케이트22.5 mL를 적가하고 상온에서 교반하면서 24 h 동안 반응시키고, 반응이 완료된 후 에탄올과 물로 세척한다. 다양한 입자 크기(약 1μm, 10 μm, 100 μm)의 사산화삼철 마이크로스피어를 원료로 사용하여 얻어진 유리 비드의 입자 크기를 제어한다. 상기 다양한 입자 크기의 사산화삼철 마이크로스피어는 일반적인 기술 수단에 의해 제조될 수 있다.
제조하여 얻어진 자기 마이크로스피어는 정제 매질을 개질하거나 연결요소-정제 매질을 연결하는 기초 원료로 사용되므로 자기 마이크로스피어 본체라고도 칭한다.
제조하여 얻어진 자기 마이크로스피어는 자력의 작용으로 위치를 제어할 수 있는 자기 코어가 있어, 이동, 분산, 침강 등의 조작을 구현하기 때문에 넓은 의미로서 자석 비드이다.
제조하여 얻어진 자기 마이크로스피어는 중합체, 정제 매질, 체외 단백질 합성 시스템의 각 성분, 핵산 주형 및 단백질 발현 생성물과 같은 성분 또는 구성 요소에 대한 자기 코어의 흡착을 감소시킬 수 있는 이산화규소 코팅층이 있어 유리 비드라고도 칭한다.
여러 차례의 실험을 거쳐, 자기 마이크로스피어의 입자 크기가 약 1 μm일 때, 현탁의 용이성, 현탁의 지속성 및 단백질에 대한 결합 효율이 가장 좋은 것으로 나타났다. IVTT 반응용액을 이용하여 표적 단백질의 혼합계를 제공함으로써, 자기 마이크로스피어의 입자 크기가 약 1 μm인 경우, 10 μm의 입자 크기에 비해 표적 단백질의 결합 효율이 50% 이상 증가할 수 있고, 100μm의 입자 크기에 비해 표적 단백질의 결합 효율이 80% 이상 증가할 수 있다.
다음 단계에 따라 이산화규소로 코팅된 자기 마이크로스피어로 비오틴 자석 비드를 제조한다.
먼저, 고형분이 20%(v/v)인 이산화규소로 코팅된 사산화삼철 자기 마이크로스피어(자기 마이크로스피어의 입자 크기는 1 μm임)의 수용액 50 mL를 취하여, 자석으로 자기 마이크로스피어를 침강시킨 다음 액상을 제거하고, 매번 60 mL의 무수 에탄올로 자기 마이크로스피어를 모두 5회 세척한다. 100 mL의 과량의 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES, CAS: 919-30-2)의 에탄올 용액(25%, v/v)을 상술한 세척된 자기 마이크로스피어에 첨가하고, 50℃의 수조에서 48시간 동안 기계 교반한 후, 70℃의 수조에서 2시간 동안 기계 교반하고, 자석으로 자기 마이크로스피어를 침강시킨 다음 액상을 제거하고, 매번 60 mL의 무수 에탄올로 자기 마이크로스피어를 모두 2회 세척한 다음, 매번 60 mL의 증류수로 자기 마이크로스피어를 3회 반복적으로 세척하여 자기 마이크로스피어 A를 얻는다.
다음, 0.01 mol의 아크릴산을 피펫팅하여 100 mL의 X용액(X용액: 최종 농도가 0.1 mol/L인 2-모르폴린 에탄술폰산(CAS: 4432-31-9), 0.5 mol/L의 NaCl수용액)에 첨가하고, 0.04 mol의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(CAS: 25952-53-8)과 0.04 mol의 N-히드록시숙신이미드(CAS: 6066-82-6)를 첨가하여, 상온에서 균일하게 교반 혼합하고, 15 min 동안 교반하면서 반응시킨 후, NaHCO3 고체분말로 용액을 pH7.2로 조절하고, pH가 조절된 상술한 용액을 10 mL의 자기 마이크로스피어 A가 포함된 100 mL의 PBS완충용액에 첨가하여, 30℃의 수조에서 20시간 동안 기계 교반하고, 자석으로 자기 마이크로스피어를 침강시킨 후 액상을 제거하고, 매번 60 mL의 증류수로 자기 마이크로스피어를 6회 반복적으로 세척하여 자기 마이크로스피어 B를 얻는다.
세 번째로, 자기 마이크로스피어 B를 1 mL 취한 다음 15%(w/v)의 아크릴산 나트륨 용액 12 mL를 첨가하고, 10%의 과황산암모늄 용액 450μL와 테트라메틸에틸렌디아민 45μL를 첨가하고 상온에서 30분 동안 반응시키고, 자석으로 자기 마이크로스피어를 침강시킨 다음 액상을 제거하고, 매번 10 mL의 증류수로 자기 마이크로스피어를 모두 6회 세척하여 자기 마이크로스피어 C(아크릴산류 중합체로 개질된 자기 마이크로스피어 C)를 얻는다.
네 번째로, 합성된 자기 마이크로스피어 C를 10 mL의 X용액에 옮기고, 0.004 mol의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염과 0.004 mol의 N-히드록시숙신이미드를 첨가하여, 상온에서 균일하게 교반한 후, 15 min 동안 교반하면서 반응시킨 다음, 자석으로 자기 마이크로스피어를 침강시킨 후 액상을 제거하고, 매번 10 mL의 증류수로 3회 세척한다. 4.0×10-4 mol의 1,3-프로판디아민을 피펫팅하여 10 mL의 PBS 완충용액에 용해시킨 다음, 세척한 자기 마이크로스피어에 첨가하고 30℃ 수조에서 20시간 동안 기계 교반하고, 자석으로 자기 마이크로스피어를 침강시킨 후 액상을 제거하고, 매번 10 mL의 증류수로 6회 세척하고, 10 mL의 PBS 완충용액을 첨가한다. 2.5×10-4 mol의 비오틴을 피펫팅하고, 10 mL의 X용액을 첨가한 다음, 1.0×10-3 mol의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염과 0.001 mol의 N-히드록시숙신이미드을 추가로 첨가하고, 상온에서 균일하게 교반 혼합한 다음, 15 min 동안 교반하면서 반응시킨 후, NaHCO3 고체분말로 용액을 pH7.2로 조절한 다음, 10 mL의 PBS 완충용액이 포함된 상기 세척한 자기 마이크로스피어에 첨가하고, 30℃ 수조에서 20시간 동안 기계 교반한 다음, 자석으로 자기 마이크로스피어를 침강시킨 후 액상을 제거하고 매번 10 mL의 증류수로 10회 세척하여 비오틴으로 개질된 생체자기 마이크로스피어 D를 얻는다.
실시예2 아비딘-단백질 A 가 결합된 생체자기 마이크로스피어F(친화성 단백질이 결합된 생체자기 마이크로스피어F)의 제조(단백질 A를 정제 매질로하고, 비오틴-아비딘의 친화 복합체를 연결요소로 사용함)
2.1 단백질 A-eGFP-아비딘 융합 단백질의 합성
융합 단백질인 단백질 A-eGFP-스트렙타비딘 및 단백질 A-eGFP-타마비딘2의 3개의 유전자로 구성된 DNA 서열을 각각 구축한다.
여기서, ProteinA(단백질 A)의 서열은 황색포도상구균(SPA로 약칭함)에서 유래한다. SPA의 아미노산 서열의 총 길이는 516개의 아미노산 잔기이며, SPA의 항체 결합 도메인인 융합 단백질을 구성하는 데 사용되는 유전자 서열로 37-327번 아미노산을 선택하였다. 최적화 프로그램으로 상기 서열을 최적화한 후 뉴클레오티드 서열을 얻었다(서열번호 1참조).
타마비딘2는 일종 아비딘 유사체로서 비오틴 결합능력을 가진 단백질이다. Yamamoto 등에 의해 2009년에 발견(2009_FEBS_Yamanomo T_Tamavidins--novel Avidin-like biotin-binding proteins from the Tamogitake mushroom, 번역문: Tamogitake버섯의 비오틴을 결합한 새로운 아비딘 유사체 단백질)되었으며, 이는 스트렙타비딘과 유사하게 비오틴에 대한 친화력이 강하고 열안정성이 스트렙타비딘보다 우수한다.
타마비딘2의 아미노산 서열은 UniProt B9A0T7과 같이 관련 데이터베이스에서 검색할 수 있고, 모두 141개의 아미노산 잔기를 포함하고 코돈 전환 및 최적화 프로그램의 최적화를 거쳐 DNA 서열을 얻을 수 있고, 최적화된 DNA서열은 서열번호 2와 같다.
또한, 본 실시예에 관련된 강화 형광 단백질 eGFP의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3에 표시되어 있고, eGFP의 A206K 돌연변이체이고 mEGFP로도 기록된다.
두 가지 융합 단백질인 단백질 A-eGFP-스트렙타비딘과 단백질 A-eGFP-타마비딘2의 DNA 주형은 재조합 PCR 방법으로 각각 구축한다. 그 다음 체외 무세포 단백질 합성 방법으로 두 가지 융합 단백질인 단백질 A-eGFP-스트렙타비딘 및 단백질 A-eGFP-타마비딘2를 각각 합성한다. 이미 개시된 체외 무세포 단백질 합성 방법은 특허 문헌CN 201610868691.6,
Figure pct00001
,
Figure pct00002
,
Figure pct00003
등을 참조한다. SPA-eGFP-스트렙타비딘 및 SPA-eGFP-타마비딘2는 IVTT 시스템으로 각각 발현시킨다. 일반적으로, 세포 추출물(게놈이 통합 발현된 RNA중합효소 포함), DNA주형, 에너지 시스템(포스포크레아틴-포스포크레아틴 쇼크 효소시스템 등), 마그네슘 이온, 나트륨 이온, 폴리에틸렌 글리콜 등 성분을 IVTT시스템에 첨가하고, 28내지30℃ 조건하에서 반응시킨다. 8내지12시간 후 반응이 완료된다. 얻어진 IVTT 반응용액에는 DNA 주형에 해당하는 단백질 A-eGFP-아비딘 융합 단백질이 함유되어 있다.
단백질 A-eGFP-스트렙타비딘 및 단백질 A-eGFP-타마비딘2의 IVTT 반응용액을 각각 얻는다.
IVTT 시스템을 사용하여 SPA-eGFP-스트렙타비딘(도4의 "1"에 해당함) 및 SPA-eGFP-타마비딘2(도 4의 "2"에 해당함)를 각각 발현시키고, 합성된 단백질의 RFU 값을 측정하고, 그 결과는 도 4의 "전체"에 도시된 바와 같다.
단백질 A-eGFP-스트렙타비딘 및 단백질 A-eGFP-타마비딘2의 IVTT의 반응 용약을 각각 4℃에서 4000 rpm으로 10min 동안 원심분리하여 얻은 상청액을 남기고 IVTT 상청액이라고 기록한다.
2.2 단백질 A가 결합된 생체자기 마이크로스피어F의 제조
얻어진 두 가지 융합 단백질인 단백질 A-eGFP-스트렙타비딘 및 단백질 A-eGFP-타마비딘2의 IVTT 상청액을 실시예1에서 얻은 생체자기 마이크로스피어 D와 함께 각각 배양하고, 1시간 동안 반응시킨 후, 상술한 방법에 따라 생체자기 마이크로스피어F 속의 융합 단백질의 함량을 각각 측정하여, 두 가지 융합 단백질의 결합 능력의 강약을 비교하며, 결과는 도 4의 "상청액(supernatant)"에 도시된 것을 참조한다.
10%(v/v)의 생체자기 마이크로스피어 D의 현탁액 30μL를 피펫팅하고, 결합/세척 완충액(10 mM의 Na2HPO4(pH 7.4), 2 mM의 KH2PO4, 140 mM의 NaCl, 2.6 mM의 KCl)으로 3회 세척한 후 비축(standby)한다.
아비딘-단백질 A 융합 단백질이 함유된 IVTT 상청액 2 mL를 취하여 상술한 생체자기 마이크로스피어 D와 함께 4℃ 조건하에서 회전시키면서 1시간 동안 배양하고, 결합되지 않은 상청액 즉 관류액을 수집하며, 이 단계를 3회 반복하여 3회의 다양한 관류액을 얻는다. 즉 동일한 배치의 생체자기 마이크로스피어 D를 아비딘-단백질 A와 함께 연속 3회 배양한다. 매번 단계2.1에서 설명한 IVTT 상청액 2 mL를 사용하고, 매번 얻은 해당 관류액을 순차적으로 번호 1, 2, 3으로 기록한다. 형광광도법으로 IVTT 상청액 및 상기 3회 관류액의 eGFP 형광 값을 검출하며, 그 결과는 도 5에 도시된 바와 같다. 여기 파장(Ex)은 488 nm이고, 방출 파장(Em)은 507 nm이다. 3회 관류액의 RFU 값이 IVTT 상청액의 RFU 값에 가까울수록 아비딘-친화성 단백질 A에 대한 생체자기 마이크로스피어 D의 결합이 포화상태에 가까움을 설명하며 해당하는 RFU 값은 아래 표 1에 표시된 바와 같다.
Figure pct00004
생체자기 마이크로스피어 D와 결합된 SPA-eGFP-스트렙타비딘 및 SPA-eGFP-타마비딘2의 RFU 값은 각각 아래 표 2와 표 3에 표시되었다. 여기서 스트렙타비딘의 경우, 제1 차 결합이 생체자기 마이크로스피어 D의 단백질 A 결합량을 포화 상태로 만들었다. 타마비딘2의 경우, 제2차 결합한 후, 생체자기 마이크로스피어 D의 단백질 A 결합량이 기본적으로 포화상태에 달하였다. 표 2와 표3에 나타낸 바와 같이, 제1차의 결합량은 상청액의 단백질 양에서 관류액1의 단백질 양을 감하여 계산하고, 제2차의 결합량은 상청액의 단백질 양에서 관류액2의 단백질 양을 감하여 계산하며, 제3차의 결합량은 상청액의 단백질 양에서 관류액3의 단백질 양을 감하여 계산한다. 여기서, 결합력은 단백질 A 융합 단백질/생체자기 마이크로스피어 D, 질량과 부피의 비율, 단위 mg/mL를 의미한다.
생체자기 마이크로스피어 D로 처리된 SPA-eGFP-스트렙타비딘의 관류액의 물리화학적 비교
성분 RFU 값 농도(μg/mL) 부피 (mL) 질량 (μg) 결합된 단백질 A 융합 단백질의 량(μg) 결합된 단백질의 총 질량(μg) 결합력
(mg /mL)
IVTT상청액 1324.3 239.9 2 479.9 / 144.5 48.2
관류액1 950.7 169.2 2 338.4 141.5
관류액2 1316.5 238.4 2 476.8 3.0
관류액3 1338.0 242.5 2 485.0 0.0
생체자기 마이크로스피어 D로 처리된 SPA-eGFP-타마비딘2의 관류액의 물리화학적 비교
성분 RFU 값 농도(μg/mL) 부피 (mL) 질량 (μg) 결합된 단백질의 량(μg) 결합된 단백질의 총 질량(μg) 결합력
(mg /mL)
IVTT상청액 1264.0 234.6 2 469.3 / 183.3 61.1
관류액1 915.3 167.0 2 333.9 135.4
관류액2 1158.0 214.0 2 428.0 41.3
관류액3 1247.0 231.3 2 462.6 6.6
형광 값과 단백질의 질량 농도 사이의 표준 곡선에 따라 매번 결합된 단백질의 농도를 계산하고, 배양 부피(2mL)에 따라 매번 결합된 총 단백질 량을 계산한다.
정제된 eGFP에 따라 표준 곡선을 작성하고 계산된 eGFP의 RFU 값을 단백질 농도로 환산하는 공식은 다음과 같다.
Figure pct00005
상기 식에서, X는 단백질 농도(μg/mL)이고, Y는 RFU 형광 판독 값이며, M은 eGFP의 분자량(26.7 kDa)이고, N은SPA-eGFP-스트렙타비딘의 분자량(77.3 kDa) 또는 SPA-eGFP-타마비딘2의 분자량(79.4 kDa)이다.
측정하여 얻은 RFU 형광 수치를 대입하여 목적하는 단백질 SPA-eGFP-스트렙타비딘 또는 SPA-eGFP-타마비딘2의 질량 농도(μg/mL)를 환산하여 얻을 수 있다.
여기서, 아비딘-단백질 A 융합 단백질의 IVTT상청액 및 관류액의 RFU 값은 Y이고, Y의 수치를 상술한 공식에 대입하여 얻은 X는 바로 해당하는 융합 단백질의 질량 농도이고, 단백질 A 용액의 부피를 곱하면 아비딘-단백질 A 융합 단백질의 총 단백질 량을 얻을 수 있다. IVTT 상청액 속의 아비딘-단백질 A의 단백질 량에서 관류액의 아비딘-단백질 A의 단백질 량을 빼서 얻은 차이 값이 바로 생체자기 마이크로스피어에 결합된 아비딘-단백질 A의 단백질 량 W이다. W를 자기 마이크로스피어의 컬럼 베드 부피로 나누어, 단위 부피 당 자기 마이크로스피어에 결합된 아비딘-단백질 A 융합 단백질의 질량, 즉 결합력을 계산하여 얻으며, 단위는 mg/mL이다.
본 실시예에서 10%(v/v)의 생체자기 마이크로스피어 D 현탁액 30μL 를 사용하였으므로 1 mL의 100% 생체자기 마이크로스피어 D의 결합량을 환산하면 표 2와 표 3에 표시된 바와 같다. 여기서, 타마비딘2와 생체자기 마이크로스피어 D의 결합력은 스트렙타비딘보다 조금 강하다.
실시예3 혈청 항체의 정제에 사용된 단백질 A로 개질된 생체자기 마이크로스피어F
SPA-eGFP-스트렙타비딘 융합 단백질이 결합된 다양한 부피의 생체자기 마이크로스피어와 1 mL의 신생 소 혈청을 4℃에서 회전시키면서 1시간 동안 배양한 후, 1 mL의 결합/세척 완충액으로 3회 세척하고, 매번 세척은 4℃에서 10분 동안 회전시키면서 배양한다. 항체는 0.1 M의 글리신(pH2.8) 100μL로 용출하고, 용출된 항체는 용출액 속에 존재하며, 용출액에 1 M의 Tris-HCl(pH 8.0)를 1/10 부피(10μL)로 즉시 첨가한다. 대조(제품 번호C600957-0005)로 생공 회사의 단백질 A 아가로스 컬럼을 사용한다.
40μL의 용출액을 취하고 10μL의 5×SDS 샘플로딩 완충액(환원제 없음)을 첨가하고, 95℃의 금속 욕조에서 10분 동안 방치한 후 SDS-PAGE전기영동 검출을 수행하고 검출 결과는 도 6에 도시된 바와 같다.
도 6으로부터 알수 있듯이, 6μL의 컬럼 베드 부피를 갖는 SPA-eGFP-Streptavidin 융합 단백질이 결합된 생체 자기 마이크로스피어를 사용하면 상업적으로 구매 가능한 제품보다 우수한 분리 및 정제 효과를 얻을 수 있음을 알 수 있다.
용출된 생체자기 마이크로스피어를 1 mL의 결합/세척 완충액으로 3회 세척하고, 상술한 항체 배양, 세척 및 용출 단계를 반복한다. 즉, 항체를 제1차 배양한 후, 세척 및 용출을 거쳐 결합된 항체를 방출하고, 단백질 A로 개질된 자기 마이크로스피어를 다시 얻는다. 다시 항체와 함께 배양한 후, 세척 및 용출하여, 단백질 A로 개질된 자기 마이크로스피어를 또 다시 얻는다. 그 다음, 제3차로 배양, 세척 및 용출을 수행한다. 생체자기 마이크로스피어를 항체와 함께 합계 3회 배양한 후, 제3차로 항체와 함께 배양한 후 얻은 항체 함유 용출액 40μL를 취하고, 5×샘플 로딩 완충액(환원제 없음) 10μL를 첨가하고, 95℃의 금속 욕조에서 10분 동안 방치한 후, SDS-PAGE전기영동 검출을 수행하고 검출 결과는 도 7에 도시된 바와 같다.
도 6과 도 7에서 알수 있듯이, SPA-eGFP-스트렙타비딘이 결합된 생체자기 마이크로스피어F를 반복적으로 여러번 이용할 수 있고, 항체를 배양하고 항체를 용출시킨 후, 소 혈청과 함께 제2차 및 제3차 다시 배양하여도 여전히 소 혈청의 항체를 추출할 수 있고, 전체적인 효과는 생공회사의 단백질 A 아가로스 자석 비드보다 나쁘지 않음을 알수 있다. 컬럼 베드 부피가 6μL인 경우, 본 발명은 더 좋은 효과를 갖는다. 본 발명에서 제공되는 친화성 단백질(여기서는 단백질 A)이 결합된 생체자기 마이크로스피어F는 반복적으로 여러 번 사용할 수 있다.
실시예4 친화 복합체 E(아비딘-단백질 A)에 대한 생체자기 마이크로스피어 D의 결합의 재활용 가능성
4.1 배양
SPA-eGFP-타마비딘2이 결합된 생체자기 마이크로스피어F를 제조하기 위한 배양:
10%의 생체자기 마이크로스피어 D 현탁액(부피는 5μL임) 50μL를 취하고 결합/세척 완충액 2 mL로 3회 세척한 다음, SPA-eGFP-타마비딘2의 IVTT 상청액 2 mL를 첨가하고, 4℃에서 회전시키면서 1시간 동안 배양한 후 상청액(상청액을 수집하여 관류액1을 얻음)을 버리고, SPA-eGFP-타마비딘2를 함유한 신선한 IVTT 상청액을 반복하여 첨가하여 4℃에서 회전시키면서 1시간 동안 배양한 후, 상청액(상청액을 수집하여 관류액2를 얻음)을 버리고, 제3차로 SPA-eGFP-타마비딘2를 함유한 신선한 IVTT 상청액을 첨가하여 4℃에서 회전시키면서 1시간 동안 배양한 후 상청액(상청액을 수집하여 관류액3을 얻음)을 버린다. SPA-eGFP-타마비딘2의 IVTT 상청액과 3차 관류액의 RFU값을 측정하고, 상술한 공식에 따라 용액 속의 SPA-eGFP-타마비딘2의 잔여 함량을 계산하고 결과는 도8 및 표4에 도시된 바와 같다.
정제된 eGFP에 따라 표준곡선을 작성하고, 다음 식에 의해 계산된 eGFP의 RFU 값을 단백질 농도로 환산한다.
Figure pct00006
상기 식에서, X는 단백질 농도(μg/mL)이고, Y는 RFU 형광 판독 값이며, M은 eGFP의 분자량(26.7kDa)이고, N은 SPA-eGFP-타마비딘2의 분자량(79.4kDa)이다.
측정하여 얻은 RFU 형광 값을 계산식에 대입하면 목적하는 단백질 SPA-eGFP-타마비딘2의 질량 농도(μg/mL)를 얻을 수 있다. 예를 들어, Y 값이 1330.3인 경우, 표 4에 표시된 바와 같이 해당하는 X의 값은 247.6이다.
4.2 용출 및 교체
아비딘-친화성 단백질 복합체 E: SPA-eGFP-타마비딘2를 용출하고 교체한다.
생체자기 마이크로스피어 F를 2mL의 결합/세척 완충액으로 3회 세척한 후, 200μL의 변성 완충액(1M의 Urea 및 10%의 SDS)을 첨가하고 95°C 금속 욕조에 놓고 10분 동안 배양한 후, 생체자기 마이크로스피어에 결합된 아비딘-단백질 A를 용출한다. 상기 용출액 20μL를 취하고 5×SDS 샘플 로딩 완충액 5μL를 첨가한 다음, SDS-PAGE 전기영동 측정을 수행하여 도 9에 도시된 바와 같은 레인 1의 밴드를 얻는다. 용출된 생체자기 마이크로스피어 D를 2mL의 결합/세척 완충액으로 3회 세척하여, 자기 마이크로스피어의 외부 표면에 있는 중합체 분지쇄의 비오틴의 결합 부위가 방출된 제1차로 재생된 생체자기 마이크로스피어 D를 얻었다.
4.3 제2차 배양(재생)
상술한 SPA-eGFP-타마비딘2를 배양하고 상기 아비딘-단백질 A를 용출하는 과정을 반복하여 생체자기 마이크로스피어F의 제1차 재생, 즉 아비딘-단백질 A의 제1차 교체를 구현한다. 제1차로 재생된 생체자기 마이크로스피어 D에 SPA-eGFP-타마비딘2을 결합시키고, 해당하는 IVTT 상청액 및 3차 관류액의 RFU 값을 측정하여 표 5의 데이터를 얻는다. 용출된 생체자기 마이크로스피어 D를 2 mL의 결합/세척 완충액으로 3회 세척하여 제2차로 재생된 생체자기 마이크로스피어 D를 얻는다.
4.4 제3차 배양(제2차 재생)
상술한 SPA-eGFP-타마비딘2의 배양 및 상기 아비딘-단백질 A의 용출 과정을 다시 반복하여 생체자기 마이크로스피어F의 제2차 재생, 즉 아비딘-단백질 A의 제2차 교체를 구현한다. 제2차로 재생된 생체자기 마이크로스피어 D에 SPA-eGFP-타마비딘2를 결합시키고, 해당하는 IVTT 상청액과 2차 관류액의 RFU 값을 측정하여 표 6의 데이터를 얻는다. 표 4 내지 표 6에서, 결합력은 단백질 A 융합 단백질/생체자기 마이크로스피어 D, 질량과 부피 비율, 단위 mg/mL를 의미한다.
단백질 A 융합 단백질과 결합한 최초로 제조된 생체자기 마이크로스피어 D의 로딩 계산
성분 RFU 값 농도(μg/mL) 부피 (mL) 질량(μg) 결합된 단백질 A융합 단백질의 량(μg) 결합된 단백질의 총 질량(μg) 결합력
(mg /mL)
IVTT상청액 1330.3 247.6 2 495.2 / 291.5 58.3
관류액 1 886.7 161.4 2 322.8 172.4
관류액 2 1172.3 216.8 2 433.5 61.7
관류액 3 1183.3 218.9 2 437.8 57.4
단백질 A 융합 단백질과 결합된 제1차로 재생된 생체자기 마이크로스피어 D의 로딩 계산
성분 RFU 값 농도(μg/mL) 부피 (mL) 질량 (μg) 결합된 단백질 A 융합 단백질의 량(μg) 결합된 단백질의 총 질량(μg) 결합력
(mg /mL)
IVTT상청액 1334.7 248.5 2 497.0 / 251.1 50.2
관류액 1 955.3 174.7 2 349.4 147.7
관류액 2 1211.3 224.4 2 448.7 48.3
관류액 3 1193.7 220.9 2 441.8 55.2
단백질 A 융합 단백질과 결합된 제2차로 재생된 생체자기 마이크로스피어 D의 로딩 계산
성분 RFU 값 농도(μg/mL) 부피 (mL) 질량 (μg) 결합된 단백질 A 융합 단백질의 량(μg) 결합된 단백질의 총 질량(μg) 결합력
(mg /mL)
IVTT 상청액 1534.3 287.6 2 575.3 / 355.6 71.1
관류액 1 990.0 181.4 2 362.8 212.5
관류액 2 1292.0 240.1 1.8 432.2 143.1
재생된 생체자기 마이크로스피어 D가 단백질 A-eGFP-아비딘에 재결합하는 능력을 측정한다.최초로 제조된 생체자기 마이크로스피어 D는 SPA-eGFP-타마비딘2와 제1차 포화 결합되고, 제1차로 재생된 생체자기 마이크로스피어 D는 SPA-eGFP-타마비딘2와 제2차 포화 결합되며, 제2차로 재생된 생체자기 마이크로스피어 D는 SPA-eGFP-타마비딘2와 제3차 포화 결합되고, 각각 변성 완충액으로 단백질으로 용출하고, SPA-eGFP-타마비딘2가 함유된 3차 용출액을 각각 수집하여 SDS-PAGE를 수행한다. 결과는 도9에 도시된 바와 같다. 라인 1, 2 및 3은 각각 제1차, 제2차 및 제3차로 단백질 A-eGFP-아비딘에 포화 결합된 후, 각각 최초로 제조된 생체자기 마이크로스피어F, 제1차로 재생된 생체자기 마이크로스피어F, 제2차로 재생된 생체자기 마이크로스피어F로부터 단백질을 용출하여 얻은 SPA-eGFP-타마비딘2가 함유된 3차의 용출액의 전기영동 라인을 나타낸다.
4.5 소 혈청 항체에 결합한 재생된 생체자기 마이크로스피어F의 결합 능력 검출
생체자기 마이크로스피어 D를 SPA-eGFP-타마비딘2로 제3차 포화 결합시킨 후, 제2차로 재생된 생체자기 마이크로스피어F를 얻는다. 얻어진 제2차로 재생된 생체자기 마이크로스피어F에 2 mL의 신생 소 혈청(상업적으로 구매 가능한 제품, 아래 동일함)을 첨가하고 4℃에서 회전시키면서 1시간 동안 배양하고, 상청액(상청액을 수집하여 관류액1을 얻음)을 버린 후, 2 mL의 신생 소 혈청을 다시 첨가하고 4℃에서 회전시키면서 1시간 동안 배양한 후, 상청액(상청액을 수집하여 관류액2를 얻음)을 버린다. 1 mL의 결합/세척 완충액으로 3회 세척하고, 매번 세척은 4℃에서 회전시키면서 10분 동안 배양한다. 0.1 M의 글리신(pH 2.8) 용액 100μL로 소 혈청 항체(항체가 자기 마이크로스피어의 단백질 A 단에 결합됨)를 용출하고, 용출된 소 혈청 항체 용액에 1M의 Tris-HCl용액(pH 8.0)을 1/10부피(즉 10μL)로 즉시 첨가하여, 용출액 110μL를 얻는다.
상술한 용출액 40μL를 취하여 5×SDS 샘플 로딩 완충액(환원제 없음) 10μL를 첨가하고, 균일하게 혼합한 후, 95℃의 금속 욕조에 10분 동안 방치한 다음, SDS-PAGE 전기영동 검출을 수행하고, 검출한 결과는 도 9에 도시된 바와 같다. 도 7, 도 9 및 표 6의 실험 결과로부터 알수 있듯이, 생체자기 마이크로스피어 D와 SPA-eGFP-타마비딘2의 결합은 재생 가능성이 있고, 본 발명에서 제공되는 생체자기 마이크로스피어F를 재생 사용할 수 있다. 또한, 변성 용액을 열처리에 첨가하는 단계는 생체자기 마이크로스피어의 결합 효율에 영향을 미치지 않는다.
실시예5 단백질 G를 결합한 생체자기 마이크로스피어G의 제조(단백질 G를 정제 매질로 사용하고, 비오틴-아비딘의 친화 복합체를 연결요소로 사용함)
5.1. 단백질 G-eGFP-아비딘 융합 단백질(아비딘-친화성 단백질 공유결합 복합체 E)의 합성
실시예2의 방법을 사용하여 단백질 G-eGFP-타마비딘2 융합 단백질(단백질 G 융합 단백질로도 약칭함)을 합성하고, 단백질 G-eGFP-타마비딘2 융합 단백질을 포함한 IVTT 반응용액 및 IVTT 상청액을 차례로 제조한다.
먼저 3세그먼트의 유전자 서열을 포함하는 단백질 G-eGFP-타마비딘2 융합 단백질의 DNA 서열을 구축한다. 여기서, "eGFP" 세크먼트 및 "타마비딘2" 세그먼트의 뉴클레오티드 서열은 실시예2와 동일하며, 각각 서열번호 3 및 서열번호 2를 참조한다. 여기서, "단백질 G"세그먼트의 뉴클레오티드 서열(서열번호 4)은 G류 연쇄상 구균(Streptococcus sp. group G)에서 유래되며, 이의 항체 결합 영역의 유전자 서열을 선택한다.
단백질 G-eGFP-타마비딘2 융합 단백질의 DNA 주형은 재조합 PCR방법으로 구축한다. 체외 증폭은 RCA방법으로 수행한다. 단백질 G-eGFP-타마비딘2 융합 단백질은 앞에서 지시된 체외 무세포 단백질 합성 방법(구체적으로 클루이베로마이세스 락티스를 기초로한 세포 추출물을 사용)으로 합성한다.
IVTT 반응을 수행하여 단백질 G-eGFP-타마비딘2 융합 단백질을 함유한 IVTT 반응용액 및 IVTT 상청액을 순차적으로 얻는다.
5.2. 단백질 G를 결합한 생체자기 마이크로스피어G의 제조
실시예1에서 제조된 10%(w/v)의 비오틴으로 개질된 생체자기 마이크로스피어 D 30μL를 피펫팅하고, 결합/세척 완충액(10 mM의 Na2HPO4(pH 7.4), 2 mM의 KH2PO4, 140 mM의 NaCl, 2.6 mM KCl)으로 3회 세척한 후 비축한다.
단백질 G-eGFP-타마비딘2 융합 단백질을 함유한 IVTT상청액 2 mL를 취하여 상술한 생체자기 마이크로스피어 D와 함께 4℃ 조건하에서 1시간 동안 회전시키면서 배양한 다음, 청액 즉 관류액을 수집하며, 관류액 속에는 마이크로스피어에 결합되지 않은 나머지 융합 단백질이 포함되어 있다. 이 단계를 3번 반복하고 매번 새로운 IVTT 상청액을 취하여 생체자기 마이크로스피어 D와 함께 배양하여, 3차의 다양한 관류액을 얻는다. 즉 동일한 배치의 생체자기 마이크로스피어 D를 IVTT 상청액 속의 단백질 G-eGFP-타마비딘2 융합 단백질과 함께 연속 3회 배양한다. 매번 단계 5.1.에서 얻은 IVTT 상청액 2 mL를 취하고 해당하는 3차 관류액을 차례로 관류액1(FT1), 관류액2(FT2) 및 관류액3(FT3)으로 기록한다. 형광광도법으로 IVTT 상청액 및 상기 3차 관류액의 eGFP 형광 값(RFU 값으로 측정)을 검출하고, 결과는 도 10에 도시된 바와 같다.
관류액의 RFU 값이 IVTT 상청액의 RFU 값에 가까울수록 단백질 G-eGFP-타마비딘2 융합 단백질에 대한 생체자기 마이크로스피어 D의 결합이 점점 포화상태로 향함을 설명하며, 해당하는 RFU 값은 하기 표 7에 표시된 바와 같다. 제1차 결합량은 상청액의 단백질 량에서 관류액1의 단백질 량을 빼서 계산하고, 제2차 결합량은 상청액의 단백질 량에서 관류액2의 단백질 량을 빼서 계산하며, 제3차 결합량은 상청액의 단백질 량에서 관류액3의 단백질 량을 빼서 계산한다. 단백질 G-eGFP-타마비딘2 융합 단백질의 농도는 실시예2의 방법을 사용하며, 하기 공식에 따라 계산하여 얻는다.
Figure pct00007
상기 식에서, X는 단백질 G-eGFP-타마비딘2 융합 단백질의 농도(μg/mL)이고, Y는 RFU 형광 판독 값이며, M은 eGFP의 분자량(26.7 kDa)이고, N은 단백질 G-eGFP-타마비딘2 융합 단백질의 분자량이다.
단백질 G-eGFP-타마비딘2 융합 단백질이 함유된 IVTT 상청액과 3차 관류액의 eGFP형광 값 데이터
결합
횟수		 검출 대상 RFU 값 융합 단백질의 농도(μg/mL) 부피
(mL)		 질량
(μg)		 결합된 융합단백질의 량(μg) 결합된 융합
단백질의 총 질량(μg)		 결합력
(mg/mL)
1 IVTT상청액 576 85.7 2 171.4 23.8 59.0 19.7
관류액1 502 73.8 2 147.6
2 IVTT상청액 576 85.7 2 171.4 33.6
관류액2 472 68.9 2 137.8
3 IVTT상청액 576 85.7 2 171.4 1.6
관류액3 571 84.9 2 169.8
여기서, 결합력은 자석 비드에 결합된 단백질 G 융합 단백질의 질량과 사용된 자석 비드의 부피이다.상술한 생체자기 마이크로스피어 D와 단백질 G 융합 단백질을 함유한 IVTT 상청액을 함께 배양하는 과정을 통해, 친화 복합체(비오틴-아비딘)의 연결방식에 의해 단백질 G이 결합된 생체자기 마이크로스피어G를 얻고, 단백질 G 자석 비드라고 기록한다.
5.3. 혈청 항체 정제용 단백질 G 자석 비드(IgG 항체를 표적 단백질로 사용)
단백질 G-eGFP-타마비딘2 융합 단백질이 결합된 다양한 부피의 단백질 G 자석 비드와 1 mL의 신생 소 혈청을 함께 4℃에서 회전시키면서 1시간 동안 배양한 다음, 1 mL의 결합/세척 완충액으로 세척(3회)하고, 매번 세척은 4℃에서 회전시키면서 10분 동안 배양한다. 0.1 M의 글리신(pH2.8) 100μL로 항체를 용출하고, 용출액에 1M의 Tris-HCl(pH 8.0)를 1/10부피(10μL)로 즉시 첨가한다. 용출액 속의 IgG 항체 순도는 SDS-PAGE로 검출하며, 결과는 도 11에 도시된 바와 같다. 회색 값에 따라 정량 분석하였으며 순도는 95% 이상이다.
실시예6 나노항체 항-eGFP가 결합된 생체자기 마이크로스피어H의 제조(나노항체 항-eGFP를 정제 매질로 사용하고, 비오틴-아비딘의 친화 복합체를 연결요소로 사용)
6.1. 항EGFP-mScarlet-아비딘 융합 단백질(나노항체의 융합 단백질인 항EGFP-mScarlet-타마비딘2 융합 단백질)의 합성
실시예2의 방법으로 항EGFP-mScarlet-타마비딘2 융합 단백질(항EGFP융합 단백질이라고 약기함, 분자량은 59 kDa)을 합성하고, 항EGFP-mScarlet-타마비딘2 융합 단백질을 함유한 IVTT 반응용액 및 IVTT 상청액을 순차적으로 제조한다.
먼저, 3세그먼트 유전자 서열을 포함하는 항EGFP-mScarlet-타마비딘2 융합 단백질의 DNA 서열을 구축한다.
여기서, "타마비딘2" 세그먼트의 뉴클레오티드 서열은 실시예2와 동일하며 서열번호 2를 참조한다.
여기서, 항EGFP는 아미노산 서열이 서열번호 5로 표시되는 나노항체이다.
여기서, mScarlet는 밝은 적색 형광 단백질이며, 해당 뉴클레오티드 서열은 서열번호 6이다.
항EGFP-mScarlet-타마비딘2 융합 단백질의 DNA 주형은 재조합 PCR 방법으로 구축한다. 체외 증폭은 RCA방법으로 수행한다. 항EGFP-mScarlet-타마비딘2 융합 단백질은 앞에서 지시한 체외 무세포 단백질 합성 방법으로 합성한다.
IVTT 반응을 수행하여 항EGFP-mScarlet-타마비딘2 융합 단백질이 함유된 IVTT 반응용액 및 IVTT 상청액을 순차적으로 얻는다.
6.2. 나노항체 항-eGFP가 결합된 생체자기 마이크로스피어H의 제조
실시예1에서 제조된 10%(w/v)의 비오틴으로 개질된 생체자기 마이크로스피어 D 30μL를 피펫팅하여 결합/세척 완충액(10 mM의 Na2HPO4(pH 7.4), 2 mM의 KH2PO4, 140 mM의 NaCl, 2.6 mM의 KCl)으로 3회 세척한 후 비축한다.
항EGFP-mScarlet-타마비딘2 융합 단백질을 함유한 IVTT 상청액(RFU 값이 2400임) 2 mL를 취하여 상술한 생체자기 마이크로스피어 D와 함께 4℃의 조건하에서 1시간 동안 회전시키면서 배양한 다음, 청액 즉 관류액(RFU값이 1700임)을 수집한다. 관류액 속에는 마이크로스피어에 결합되지 않은 나머지 융합 단백질이 포함되어 있다. RFU 값의 측정 조건은 여기 파장(Ex)이 569 nm이고, 방출 파장(Em)이 593 nm이다.
상술한 생체자기 마이크로스피어 D를 상기 항EGFP 융합 단백질이 함유된 IVTT 상청액과 함께 배양하는 과정을 통해, 배양된 자석 비드는 친화 복합체(비오틴-타마비딘2) 연결방식으로 나노항체 항-eGFP와 결합되고, 생체자기 마이크로스피어H로 기록하며, 항EGFP 자석 비드(나노항체 자석 비드)라고도 표기한다.
6.3. eGFP 단백질이 결합된 항EGFP 자석 비드의 로딩 측정(eGFP를 표적 단백질로 사용하고, eGFP 과량)
본 실시예6.2.에서 제조된 10%(w/v)의 항EGFP 자석 비드 30μL를 피펫팅하여 결합/세척 완충액으로 3회 세척한 다음 비축한다.
eGFP 단백질의 IVTT 반응용액(DNA 주형에서 eGFP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3과 같음) 2 mL를 취하여 형광 값을 측정하고, 전체의 형광 값으로 기록한다. 이를 상기 세척한 항EGFP 자석 비드 3μL와 혼합하여 1시간 동안 회전시키면서 배양한 후, 자석 비드에 결합되지 않은 상청액을 통과로 기록하고 이의 형광 값을 측정한다. 표 8의 형광 값 측정 결과에 따라, eGFP의 계산 공식을 이용하여 해당하는 eGFP 단백질의 양을 얻으며, 계산하여 얻은 항EGFP 자석 비드의 로딩은 17.7 mg/mL(1mm의 항EGFP 자석 비드에 결합된 eGFP단백질의 질량)이다.
eGFP 단백질이 결합된 항EGFP 자석 비드의 로딩 측정 결과
검출 대상 라벨링 RFU 평균 값 eGFP 단백질의 농도(μg/mL) 부피
(mL)		 eGFP단백질의 량(μg)
IVTT상청액 전체 2300 166.4 2 332.8
관류액 통과 1950 139.8 2 279.7
6.4. 항EGFP자석 비드로 정제한 eGFP 단백질의 결합 효율(eGFP를 표적 단백질로 사용하고, 자석 비드는 과량)본 실시예 6.2에서 제조된 항EGFP 자석 비드를 취하여 결합/세척 완충액으로 3회 세척하고 비축한다.
eGFP단백질의 IVTT 반응용액(DNA주형에서 eGFP를 암호화 하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3과 같음) 1 mL를 취하여 형광 값을 측정하고 전체라고 기록한다. 이를 과량의 항EGFP 자석 비드에 혼합하고 1시간 동안 회전시키면서 배양한 후, 청액을 수집하여 통과라고 기록하며 이의 형광 값을 측정한다. 자석 비드는 결합/세척 완충액 1 mL로 2회 세척하고, 매번 세척은 4℃에서 회전시키면서 10분 동안 배양하고 얻은 세척액은 각각 세척1 및 세척2로 기록하고, 각각 그 형광 값을 측정한다. 배양된 자석 비드에는 표적 단백질 eGFP가 결합되어 있다. 상술한 각 형광 값의 측정 결과는 도 12 및 표 9에 표시된 바와 같다. 결과는, 본 방안에 의해 제조된 항eGFP의 자석 비드는 eGFP 단백질을 효과적으로 결합하고 용출할 수 있음을 보여준다. IVTT 상청액과 관류액의 형광 값에 따르면, 상술한 1시간 동안의 배양을 거친 후 표적 단백질 eGFP에 대한 항EGFP 자석 비드의 결합 효율은 98.2%로 계산되었다.
항EGFP 자석 비드로 정제한 eGFP 단백질의 결합 효율 측정
검출 대상 라벨 RFU
평균 값		 eGFP 단백질의 농도(μg/mL) 부피(mL) eGFP단백질의 량(μg)
IVTT상청액 전체 430 27.96 1 27.96
관류액 통과 45 0.49 1 0.49
0.1M의 글리신(pH2.8) 100μL로 eGFP를 용출한 다음, 용출액에 1M의 Tris-HCl(pH 8.0)를 1/10부피(10μL)로 즉시 첨가한다. 용출액의 형광 값을 측정하여 용출(Elution)이라고 기록하고 SDS-PAGE로 순도를 검출하고, 결과는 도 13에 도시된 바와 같이 순도가 약 95%이다.이상은 본 발명의 바람직한 일부 실시예에 불과하며, 본 발명이 상술한 실시예의 내용에 제한되는 것이 아님을 이해해야 한다. 당업자는 본 발명의 기술방안의 개념 범위 내에서 또는 지침 및 계시에 따라 다양한 변경 및 수정을 진행할 수 있고, 이에 상응하는 기술적 효과를 갖는 모든 변경 및 수정은 본 발명의 보호범위 내에 속한다.
SEQUENCE LISTING <110> KANGMA-HEALTHCODE (SHANGHAI) BIOTECH CO., LTD <120> BIOMAGNETIC MICROSPHERE AND PREPARATION METHOD THEREFOR AND USE THEREOF <130> P22413053KR <140> PCT/CN2020/132171 <141> 2020-11-27 <150> CN 201911209156.X <151> 2019-11-30 <150> CN 202010346903.0 <151> 2020-04-28 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 873 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of Protein A <400> 1 gcccagcacg acgaggccca gcaaaacgcc ttttaccagg ttttgaacat gcccaacttg 60 aacgccgacc agaggaacgg cttcatccag agtttgaaag acgaccccag tcaaagtgcc 120 aacgttttgg gcgaggcaca gaaattaaat gacagccagg cccccaaggc cgacgcccag 180 cagaacaact tcaacaagga tcagcagagt gccttttacg aaatattgaa catgcccaac 240 ctaaacgagg cacagagaaa tgggttcatc cagagtttaa aagatgatcc cagtcagagt 300 accaacgttt tgggggaggc caaaaagtta aacgaaagcc aggcgcccaa agctgataac 360 aacttcaaca aggagcagca gaacgccttc tacgagattc taaacatgcc caacttgaac 420 gaggagcaga ggaacggctt catccagagt ttgaaagacg atcccagtca gagtgcaaac 480 ttgctatctg aggccaagaa gctcaacgag tcacaggccc ccaaggccga taacaagttc 540 aacaaggagc agcagaacgc tttctatgaa atccttcatt tgccaaattt gaatgaggaa 600 cagaggaacg gcttcatcca gagtttgaaa gatgacccga gtcagagtgc caacttgttg 660 gccgaagcca agaagttgaa tgatgcccag gcccccaagg ccgacaacaa gtttaacaag 720 gagcagcaga atgcctttta cgagatcttg cacttgccca acttgactga ggaacaaagg 780 aacggtttca tacagagttt gaaggacgac ccctctgtta gtaaggaaat ccttgcggag 840 gcaaagaagc taaacgatgc tcaagcacca aaa 873 <210> 2 <211> 423 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of tamavidin2 <400> 2 atgagtgatg ttcaatcttc tttgactggt acttggtata atgaattgaa ttctaaaatg 60 gaattgactg ctaataaaga tggtactttg actggtaaat atttgtctaa agttggtgat 120 gtttacgttc catatccatt gtctggtaga tataatttgc aaccaccagc tggtcaaggt 180 gttgctttgg gttgggctgt ttcttgggaa aattctaaaa ttcattctgc tactacttgg 240 tctggtcaat tcttctctga atcttctcca gttattttga ctcaatggtt attgtcttct 300 tctactgcta gaggtgatgt ttgggaatct actttggttg gtaacgattc tttcactaaa 360 actgctccaa ctgaacaaca aattgctcat gctcaattgc attgtagagc tccaagattg 420 aaa 423 <210> 3 <211> 714 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of mEGFP <400> 3 gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 60 gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgcgc ggcgagggcg agggcgatgc caccaacggc 120 aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 180 gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 240 cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catctccttc 300 aaggacgacg gcacctacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360 aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420 ctggagtaca acttcaacag ccacaacgtc tatatcacgg ccgacaagca gaagaacggc 480 atcaaggcga acttcaagat ccgccacaac gtcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 540 cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 600 ctgagcaccc agtccaagct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 660 ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caag 714 <210> 4 <211> 585 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of antibody binding region of Protein G <400> 4 acttacaaat taatccttaa tggtaaaaca ttgaaaggcg aaacaactac tgaagctgtt 60 gatgctgcta ctgcagaaaa agtcttcaaa caatacgcta acgacaacgg tgttgacggt 120 gaatggactt acgacgatgc gactaagacc tttacagtta ctgaaaaacc agaagtgatc 180 gatgcgtctg aattaacacc agccgtgaca acttacaaac ttgttattaa tggtaaaaca 240 ttgaaaggcg aaacaactac tgaagctgtt gatgctgcta ctgcagaaaa agtcttcaaa 300 caatacgcta acgacaacgg tgttgacggt gaatggactt acgacgatgc gactaagacc 360 tttacagtta ctgaaaaacc agaagtgatc gatgcgtctg aattaacacc agccgtgaca 420 acttacaaac ttgttattaa tggtaaaaca ttgaaaggcg aaacaactac taaagcagta 480 gacgcagaaa ctgcagaaaa agccttcaaa caatacgcta acgacaacgg tgttgatggt 540 gtttggactt atgatgatgc gactaagacc tttacggtaa ctgaa 585 <210> 5 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Nanobody anti-eGFP <400> 5 Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Val Asn 20 25 30 Arg Tyr Ser Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu 35 40 45 Trp Val Ala Gly Met Ser Ser Ala Gly Asp Arg Ser Ser Tyr Glu Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Arg Asn Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Asn Val Asn Val Gly Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 693 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of mScarlet <400> 6 gtttcaaagg gtgaagctgt tattaaggag tttatgagat tcaaagtgca tatggaaggt 60 tctatgaatg gtcatgaatt tgaaattgag ggtgaaggtg aaggtagacc atatgaaggt 120 actcaaactg ctaaattgaa ggttactaaa ggtggtccat tgccattctc atgggatatt 180 ttgtcaccac aattcatgta tggttctaga gctttcatta agcatccagc tgatattcca 240 gattactata agcaatcatt cccagaaggt ttcaagtggg aaagagttat gaattttgaa 300 gatggtggtg ctgttactgt tactcaagat acttcattgg aagatggtac tttgatctat 360 aaggttaagt tgagaggtac taatttccca ccagatggtc cagttatgca aaagaaaact 420 atgggttggg aagctagtac tgaaagattg tatccagaag atggtgtttt gaagggtgac 480 attaagatgg ctttgagatt gaaagatggt ggtagatatt tggctgattt caagactact 540 tataaggcta agaagccagt tcaaatgcca ggtgcttaca atgttgatag aaaattggat 600 atcacctctc ataatgaaga ttatactgtt gttgagcaat acgaaagatc tgaaggtaga 660 cattctactg gtggtatgga tgaattgtat aag 693

Claims (19)

  1. 자기 마이크로스피어 본체를 포함하는 생체자기 마이크로스피어로서,
    상기 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에는 선형 주쇄 및 분지쇄를 갖는 적어도 하나의 중합체를 가지고, 상기 선형 주쇄의 일단이 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 고정되고, 중합체의 타단이 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에서 유리되며, 상기 생체자기 마이크로스피어의 중합체의 분지쇄 말단에는 비오틴 또는 비오틴 유사체가 연결되는 것을 특징으로 하는, 생체자기 마이크로스피어.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 중합체의 분지쇄 말단은 연결요소를 통해 정제 매질에 연결되고, 상기 연결요소는 상기 비오틴 또는 비오틴 유사체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체자기 마이크로스피어.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 정제 매질에는 아비딘형 태그, 폴리펩티드형 태그, 단백질형 태그, 항체형 태그, 항원형 태그 또는 이들의 조합이 함유되고;
    바람직하게는, 상기 아비딘형 태그는 아비딘, 비오틴에 결합가능한 아비딘 유사체, 비오틴 유사체에 결합가능한 아비딘 유사체 또는 이들의 조합이고;
    보다 바람직하게는, 상기 생체자기 마이크로스피어의 중합체의 분지쇄 말단에는 비오틴이 연결되어 있고; 상기 정제 매질은 아비딘이고, 상기 비오틴과의 사이에 친화 복합체 결합효과를 형성하고;
    보다 바람직하게는, 상기 아비딘은 스트렙타비딘, 변성 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 유사체 또는 이들의 조합이고;
    바람직하게는, 상기 폴리펩티드형 태그는 CBP 태그, 히스티딘 태그, C-Myc 태그, FLAG 태그, Spot 태그, C 태그, Avi 태그, Streg 태그, WRHPQFGG 서열을 포함하는 태그, WRHPQFGG의 변이체 서열을 포함하는 태그, RKAAVSHW 서열을 포함하는 태그, RKAAVSHW의 변이체 서열을 포함하는 태그 및 이들의 조합 중 임의의 태그 또는 이들의 변이체로부터 선택되고;
    바람직하게는, 상기 단백질형 태그는 친화성 단백질, SUMO 태그, GST 태그, MBP 태그 및 이들의 조합 중 임의의 태그 또는 이들의 변이체로부터 선택되고; 보다 바람직하게는, 상기 친화성 단백질은 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 변성 단백질 A, 변성 단백질 G, 변성 단백질 L 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 생체자기 마이크로스피어.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 정제 매질은 친화 복합체를 함유하는 연결요소를 통해 상기 중합체의 분지쇄 말단에 연결되고;
    바람직하게는, 상기 비오틴 또는 비오틴 유사체는 친화 복합체의 작용을 통해 아비딘 또는 아비딘 유사체에 연결되어 있고, 상기 정제 매질은 상기 아비딘 또는 아비딘 유사체에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되고;
    보다 바람직하게는, 상기 정제 매질은 아비딘형 태그-정제 매질 공유결합 복합체를 통해 상기 중합체 분지쇄 말단의 비오틴 또는 비오틴 유사체에 연결되고, 아비딘형 태그를 통해 비오틴 또는 비오틴 유사체와의 사이에 친화 복합체의 연결요소를 형성하고;
    보다 바람직하게는, 상기 정제 매질은 아비딘-정제 매질 공유결합 복합체를 통해 상기 중합체의 분지쇄 말단의 비오틴 또는 비오틴 유사체와 친화 복합체의 연결요소를 형성하는 것을 특징으로 하는, 생체자기 마이크로스피어.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 정제 매질이 상기 중합체의 분지쇄 말단에 연결되는 방식은 공유결합, 초분자 상호작용, 연결요소 또는 이들이 조합된 방식이고;
    바람직하게는, 상기 공유결합은 동적 공유결합이고, 보다 바람직하게는, 상기 동적 공유결합은 이민 결합, 아실히드라존 결합, 이황화 결합 또는 이들의 조합을 포함하고;
    바람직하게는, 상기 초분자 상호작용은 배위결합, 친화 복합체 상호작용, 정전기 흡착, 수소 결합, π-π 중첩 효과, 소수성 상호작용 및 이들의 조합으로부터 선택되고;
    보다 바람직하게는, 상기 친화 복합체 상호작용은 비오틴-아비딘 상호작용, 비오틴 유사체-아비딘 상호작용, 비오틴-아비딘 유사체 상호작용, 비오틴 유사체-아비딘 유사체 상호작용으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 생체자기 마이크로스피어.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 비오틴 또는 비오틴 유사체와 결합하는 아비딘을 더 포함하고; 여기서, 상기 비오틴 또는 비오틴 유사체와 상기 아비딘 사이에 친화 복합체의 결합효과를 형성하고; 바람직하게는, 상기 아비딘은 스트렙타비딘, 변성 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 유사체 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는, 생체자기 마이크로스피어.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 아비딘 또는 아비딘 유사체에 연결된 친화성 단백질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체자기 마이크로스피어.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 자기 마이크로스피어 본체의 크기는 0.1 μm, 0.15 μm, 0.2 μm, 0.25 μm, 0.3 μm, 0.35 μm, 0.4 μm, 0.45 μm, 0.5 μm, 0.55 μm, 0.6 μm, 0.65 μm, 0.7 μm, 0.75 μm, 0.8 μm, 0.85 μm, 0.9 μm, 0.95 μm, 1 μm, 1.5 μm, 2 μm, 2.5 μm, 3 μm, 3.5 μm, 4 μm, 4.5 μm, 5 μm, 5.5 μm, 6 μm, 6.5 μm, 7 μm, 7.5 μm, 8 μm, 8.5 μm, 9 μm, 9.5 μm, 10 μm, 15 μm, 20 μm, 25 μm, 30 μm, 35 μm, 40 μm, 45 μm, 50 μm, 55 μm, 60 μm, 65 μm, 70 μm, 75 μm, 80 μm, 85 μm, 90 μm, 95 μm, 100 μm, 150 μm, 200 μm, 250 μm, 300 μm, 350 μm, 400 μm, 450 μm, 500 μm, 550 μm, 600 μm, 650 μm, 700 μm, 750 μm, 800 μm, 850 μm, 900 μm, 950 μm 및 1000 μm에서 선택되는 임의의 입자 크기 척도 또는 임의의 2개의 입자 크기 척도 사이의 범위이고; 상기 직경 크기는 평균치이고,
    바람직하게는, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 직경은 0.1 내지 10 μm에서 선택되고;
    바람직하게는, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 직경은 0.2 내지 6 μm에서 선택되고;
    바람직하게는, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 직경은 0.4 내지 5 μm에서 선택되고;
    바람직하게는, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 직경은 0.5 내지 3 μm에서 선택되고;
    바람직하게는, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 직경은 0.2 내지 1 μm에서 선택되고;
    바람직하게는, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 직경은 0.5 내지 1 μm에서 선택되고;
    바람직하게는, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 직경은 1 μm 내지 1 mm에서 선택되고;
    바람직하게는, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 평균 직경은 200 nm, 250 nm, 300 nm, 350 nm, 400 nm, 450 nm, 500 nm, 550 nm, 600 nm, 650 nm, 700 nm, 750 nm, 800 nm, 850 nm, 900 nm, 950 nm 또는 1000 nm이고, 편차가 ±20%이고, 보다 바람직하게는 ±10%인 것을 특징으로 하는, 생체자기 마이크로스피어.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중합체의 선형 주쇄는 폴리올레핀 주쇄 또는 아크릴산계의 중합체 주쇄이고;
    바람직하게는, 상기 중합체의 선형 주쇄는 아크릴산계 중합체의 주쇄에 의해 제공되는 폴리올레핀 주쇄이고;
    보다 바람직하게는, 상기 아크릴산계 중합체의 단량체 단위는 아크릴산, 아크릴산염, 아크릴레이트, 메타크릴산, 메타크릴산염 및 메타크릴레이트 중 하나 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는, 생체자기 마이크로스피어.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 중합체의 분지쇄는 작용기의 공유결합을 통해 비오틴 또는 비오틴 유사체에 공유결합되고;
    바람직하게는, 상기 작용기를 기반으로 한 공유결합은 작용기가 공유결합에 참여하여 형성된 공유결합을 의미하고, 여기서, 상기 작용기는 카르복실기, 히드록실기, 아미노기, 메르캅토기, 카르복실기의 염 형태, 아미노기의 염 형태, 포르메이트기 또는 이들 작용기의 조합인 것을 특징으로 하는, 생체자기 마이크로스피어.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중합체의 선형 주쇄는 상기 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 직접 공유결합되거나, 연결기를 통해 상기 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 간접적으로 공유결합되는 것을 특징으로 하는, 생체자기 마이크로스피어.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 자기 마이크로스피어 본체는 SiO2로 코팅된 자기 재료이고;
    바람직하게는, 상기 자기 재료는 철산화물, 철화합물, 철합금, 코발트 화합물, 코발트 합금, 니켈 화합물, 니켈 합금, 망간 산화물, 망간 합금 또는 이들의 조합이고;
    보다 바람직하게는, 상기 자기 재료는 Fe3O4, γ-Fe2O3, 질화철, Mn3O4, FeCrMo, FeAlC, AlNiCo, FeCrCo, ReCo, ReFe, PtCo, MnAlC, CuNiFe, AlMnAg, MnBi, FeNiMo, FeSi, FeAl, FeSiAl, BaO·6Fe2O3, SrO·6Fe2O3, PbO·6Fe2O3, GdO 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는, 생체자기 마이크로스피어.
  13. 하기 단계를 포함하는 제1항에 따른 생체자기 마이크로스피어의 제조 방법으로서,
    (1) 아미노실란 커플링제를 이용하여 자기 마이크로스피어 본체를 화학적 개질하고, 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 아미노를 도입하여 아미노로 개질된 자기 마이크로스피어 A를 형성하는 단계로서,
    상기 자기 마이크로스피어 본체는 SiO2로 코팅된 자기 재료인, 단계;
    (2) 카르복실과 아미노 사이의 공유 반응을 이용하여 아크릴산 분자를 상기 자기 마이크로스피어 A의 외부 표면에 공유 결합시키고, 탄소-탄소 이중 결합을 도입하여 탄소-탄소 이중 결합 함유 자기 마이크로스피어 B를 형성하는 단계;
    (3) 가교제를 첨가하지 않은 조건하에서, 탄소-탄소 이중 결합의 중합 반응을 이용하여 아크릴산계 단량체 분자를 중합하고, 얻어진 아크릴산계 중합체는 선형 주쇄와 작용기를 함유한 분지쇄를 갖고, 중합체는 선형 주쇄의 일단을 통해 자기 마이크로스피어 B의 외부 표면에 공유결합되고; 아크릴산계 중합체로 개질된 자기 마이크로스피어 C를 형성하는 단계;
    (4) 상기 중합체 분지쇄에 함유된 작용기를 통해, 비오틴 또는 비오틴 유사체를 중합체의 분지쇄 말단에 공유결합시켜 상기 생체자기 마이크로스피어를 얻는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체자기 마이크로스피어의 제조 방법.
  14. 하기 단계를 포함하는 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 생체자기 마이크로스피어의 제조 방법으로서,
    (1) 아미노실란 커플링제를 이용하여 자기 마이크로스피어 본체를 화학적 개질하고, 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 아미노를 도입하여 아미노로 개질된 자기 마이크로스피어 A를 형성하는 단계로서,
    상기 자기 마이크로스피어 본체는 SiO2로 코팅된 자기 재료인, 단계;
    (2) 카르복실과 아미노 사이의 공유 반응을 이용하여 아크릴산 분자를 상기 자기 마이크로스피어 A의 외부 표면에 공유결합시키고, 탄소-탄소 이중 결합을 도입하여, 탄소-탄소 이중 결합 함유 자기 마이크로스피어 B를 형성하는 단계;
    (3) 가교제를 첨가하지 않은 조건하에서, 탄소-탄소 이중 결합의 중합 반응을 이용하여 아크릴산계의 단량체 분자를 중합하고, 얻어진 아크릴산계 중합체는 선형 주쇄와 작용기를 함유한 분지쇄를 가지고, 중합체는 선형 주쇄의 일단을 통해 자기 마이크로스피어 B의 외부 표면에 공유결합되고; 아크릴산계 중합체로 개질된 자기 마이크로스피어 C를 형성하는 단계;
    (4) 상기 중합체 분지쇄에 함유된 작용기를 통해, 비오틴 또는 비오틴 유사체를 중합체의 분지쇄 말단에 공유결합시켜 비오틴 또는 비오틴 유사체로 개질된 생체자기 마이크로스피어 D를 얻는 단계;
    (5) 정제 매질을 상기 생체자기 마이크로스피어 D의 상기 중합체의 분지쇄 말단에 있는 비오틴 또는 비오틴 유사체에 연결시켜, 정제 매질이 결합된 상기 생체 마이크로스피어를 얻는 단계;
    바람직하게는, 아비딘 또는 아비딘 유사체와 정제 매질의 공유결합 복합체를 중합체의 분지쇄 말단에 결합시키고, 상기 비오틴 또는 비오틴 유사체와 상기 아비딘 또는 아비딘 유사체 사이에 친화 복합체의 결합효과를 형성하여, 정제 매질을 포함한 상기 생체자기 마이크로스피어를 얻고,
    독립적으로 선택적으로, (6) 자석으로 생체자기 마이크로스피어를 침강시킨 다음 액상을 제거하고 세척하는 단계를 포함하고;
    독립적으로 선택적으로, 상기 아비딘 또는 아비딘 유사체와 정제 매질의 공유결합 복합체를 교체하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체자기 마이크로스피어의 제조 방법.
  15. 하기 단계를 포함하는 제7항에 따른 생체자기 마이크로스피어의 제조 방법으로서:
    바람직하게는, 하기 단계를 포함하는 상기 생체자기 마이크로스피어의 제조 방법이고:
    (1) 아미노실란 커플링제를 이용하여 자기 마이크로스피어 본체를 화학적 개질하고, 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 아미노를 도입하여, 아미노로 개질된 자기 마이크로스피어 A를 형성하는 단계로서, 상기 자기 마이크로스피어 본체는 SiO2로 코팅된 자기 재료인, 단계;
    (2) 카르복실과 아미노 사이의 공유 반응을 이용하여 아크릴산 분자를 상기 자기 마이크로스피어 A의 외부 표면에 공유결합시키고, 탄소-탄소 이중 결합을 도입하여, 탄소-탄소 이중 결합 함유 자기 마이크로스피어 B를 형성하는 단계;
    (3) 가교제를 첨가하지 않은 조건하에서, 탄소-탄소 이중 결합의 중합 반응을 이용하여, 아크릴산계의 단량체 분자를 중합하고 얻어진 아크릴산계 중합체는 선형 주쇄와 작용기를 함유한 분지쇄를 가지고, 중합체는 선형 주쇄의 일단을 통해 자기 마이크로스피어 B의 외부 표면에 공유결합되고; 아크릴산계 중합체로 개질된 자기 마이크로스피어 C를 형성하는 단계;
    (4) 상기 중합체 분지쇄에 함유된 작용기를 통해, 중합체의 분지쇄 말단에 비오틴을 공유결합시켜, 비오틴으로 개질된 생체자기 마이크로스피어 D를 얻는 단계;
    (5) 아비딘-친화성 단백질 공유결합 복합체 E를 중합체의 분지쇄 말단에 공유결합시키고, 비오틴과 아비딘 사이에 친화 복합체의 결합효과를 형성하여, 친화성 단백질이 결합된 상기 생체자기 마이크로스피어를 얻는 단계;
    독립적으로 선택적으로, (6) 자석으로 상기 생체자기 마이크로스피어를 침강시킨 다음 액상을 제거하고 세척하는 단계를 포함하고;
    독립적으로 선택적으로, 상기 아비딘-친화성 단백질 공유결합 복합체 E를 교체하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체자기 마이크로스피어의 제조 방법.
  16. 단백질 물질의 분리 및 정제에 있어서의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 생체자기 마이크로스피어의 용도로서;
    바람직하게는, 항체 물질의 분리 및 정제에 있어서의 상기 생체자기 마이크로스피어의 용도이고;
    상기 정제 매질이 친화 복합체를 함유한 연결요소에 의해 상기 중합체의 분지쇄 말단에 연결되는 경우, 상기 용도는 선택적으로 생체자기 마이크로스피어의 재생 사용을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  17. 항체 물질의 분리 및 정제에 있어서의 제2항 내지 제5항 또는 제7항 중 어느 한 항에 따른 생체자기 마이크로스피어의 용도로서;
    상기 정제 매질은 친화성 단백질이고;
    바람직하게는, 상기 친화성 단백질은 비오틴-아비딘-친화성 단백질의 형태로 중합체의 분지쇄에 연결되고;
    바람직하게는, 상기 항체 물질은 항체, 항체 단편, 항체 융합 단백질, 항체 단편 융합 단백질을 포함하고;
    상기 친화성 단백질이 친화 복합체를 함유한 연결요소를 통해 상기 중합체의 분지쇄 말단에 연결되는 경우, 상기 용도는 선택적으로 생체자기 마이크로스피어의 재생 사용을 더 포함하고, 즉 친화성 단백질을 교체한 후의 재활용을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 물질의 분리 및 정제에 있어서의 생체자기 마이크로스피어의 용도.
  18. 자기 마이크로스피어 본체를 포함하는 생체자기 마이크로스피어로서,
    상기 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에는 선형 주쇄와 분지쇄를 갖는 적어도 하나의 중합체가 있고, 상기 선형 주쇄의 일단은 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 고정되고, 중합체의 타단은 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에서 유리되고, 상기 자기 마이크로스피어의 중합체의 분지쇄 말단에는 비오틴이 연결되어 있고, 또한 친화 복합체의 결합효과를 통해 아비딘과 연결되는 것을 특징으로 하는, 생체자기 마이크로스피어.
  19. 자기 마이크로스피어 본체를 포함하는 생체자기 마이크로스피어로서,
    상기 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에는 선형 주쇄와 분지쇄를 갖는 적어도 하나의 중합체가 있고, 상기 선형 주쇄의 일단은 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 고정되고, 중합체의 타단은 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에서 유리되고, 상기 자기 마이크로스피어의 중합체의 분지쇄 말단에는 정제 매질이 연결되어 있고, 상기 정제 매질은 아비딘형 태그, 폴리펩티드형 태그, 단백질형 태그, 항체형 태그, 항원형 태그 및 이들의 조합으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 상기 아비딘형 태그는 아비딘, 비오틴에 결합가능한 아비딘 유사체, 비오틴 유사체에 결합가능한 아비딘 유사체 또는 이들의 조합이고;
    보다 바람직하게는, 상기 아비딘은 스트렙타비딘, 변성 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 유사체 또는 이들의 조합이고;
    바람직하게는, 상기 폴리펩티드 태그는 CBP 태그, 히스티딘 태그, C-Myc 태그, FLAG 태그, Spot 태그, C 태그, Avi 태그, Streg 태그, WRHPQFGG 서열을 포함하는 태그, WRHPQFGG의 변이체 서열을 포함하는 태그, RKAAVSHW 서열을 포함하는 태그, RKAAVSHW의 변이체 서열을 포함하는 태그 및 이들의 조합 중 임의의 태그 또는 이들의 변이체로부터 선택되고; 상기 Streg 태그에는 WSHPQFEK 및 이의 변이체가 함유되고;
    바람직하게는, 상기 단백질 태그는 친화성 단백질, SUMO 태그, GST 태그, MBP 태그 및 이들의 조합 중 임의의 태그 또는 이들의 변이체로부터 선택되고; 보다 바람직하게는, 상기 친화성 단백질은 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 변성 단백질 A, 변성 단백질 G, 변성 단백질 L 및 이들의 조합으로부터 선택되고;
    보다 바람직하게는, 상기 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에는 선형 주쇄와 분지쇄를 가진 적어도 하나의 중합체가 있고, 상기 선형 주쇄의 일단은 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 고정되고, 중합체의 타단은 자기 마이크로스피어 본체의 외부 표면에서 유리되고; 상기 생체자기 마이크로스피어의 중합체의 분지쇄 말단에는 친화성 단백질이 연결되고; 보다 더 바람직하게는, 상기 친화성 단백질과 중합체의 선형 주쇄 사이의 분지쇄 골격에는 친화 복합체의 결합효과가 존재하고; 보다 바람직하게는, 상기 친화성 단백질은 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 변성 단백질 A, 변성 단백질 G, 변성 단백질 L 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 생체자기 마이크로스피어.
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