JP2018102313A - Ｓｅｏ−ｆ融合タンパク質を含む人工フォリソーム体、このタンパク質をコードするベクターを含む植物細胞又は酵母細胞、及びｓｅｏ−ｆ融合タンパク質をコードするベクター - Google Patents

Abstract

【課題】タンパク質化学において、特に、固定化された酵素、抗体、抗原、又は、基質に結合された生物材料又は基質に固定化されるその他のタンパク質又はペプチドの提供。【解決手段】少なくとも１つのＳＥＯ−Ｆタンパク質又は少なくとも５０のアミノ酸を含むＳＥＯ−Ｆタンパク質の少なくとも１つのセグメントと、ＧＦＰタンパク質及びビーナスタンパク質を例外として、少なくとも１つの他のタンパク質又はペプチドとから成る融合タンパク質を含む人工フォリソーム体及び植物細胞又は酵母細胞と、融合タンパク質をコードした部分を含む、酵母細胞で複製可能なベクター。【選択図】なし

Description

本発明は、タンパク質化学で利用可能な特性を有する人工フォリソーム体と、かかる人
工フォリソーム体の細胞内での形成及び分離を可能にするベクターの組み合わせを含む植
物細胞及び酵母細胞と、ＳＥＯ−Ｆ融合タンパク質をコードするベクターとに関する。

フォリソームは、マメ科植物 (Fabaceae/Leguminosen/ファバーシエ)の篩部にのみ見ら
れる植物タンパク質体（機械的タンパク質）である。フォリソームは、維管束組織の篩部
に位置する。篩部が損傷を受けると、フォリソームは、カルシウム依存性の構造変調の
影響を受け、この構造変調において、フォリソームは、液化状態から凝縮・拡散状態に移
行し、この凝縮・拡散状態によって、フォリソームは篩管を閉塞し、これによって、貴重
な糖分子の流出が防止される。フォリソームは、サイズの大きいコンパクトな束から成る
繊維状の基礎構造の中に位置する。フォリソームは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ＡＴＰに応
じて、二価カチオン、ｐＨの変化又は電気刺激によって励起され、交互に発生する収縮及
び拡張の複数回反復可能なサイクルを引き起こすことが可能である。

フォリソームは、数百万のサブユニットから構成される。ここで言うサブユニットとは
、その機能に応じて「フォリソームによる篩部閉塞」（“Ｓｉｅｖｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ Ｏ
ｃｃｌｕｓｉｏｎ ｂｙ Ｆｏｒｉｓｏｍｅｓ”＝ＳＥＯ−Ｆ）と呼ばれる同族タンパク質
である。細菌発現ベクターを用いて、上記の同族タンパク質をコードしたいくつかの遺伝
子を発現させる手順は、非特許文献１に記載されている。メディカーゴ・トルンクラータ
（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃｕｌａｔａ）には少なくとも４つのサブユニット（ＳＥ
Ｏ−Ｆ１〜ＳＥＯ−Ｆ４）が存在することは、確実視された（非特許文献２、非特許文献
３）。これら４つのサブユニットは全て、現在では配列されており、これらのサブユニッ
トの配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１〜４）を、図１〜４に示した。トンカマメ（Ｄｉｐｔｅ
ｒｙｘ ｐａｎａｍｅｎｓｉｓ）、ミヤコグサ、エンドウ及びソラマメの各種植物のＳＥ
Ｏ−Ｆ１タンパク質の配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５〜８）を、図９〜１２に示した。植物
においては、異なるＳＥＯ−Ｆタンパク質が凝集して、フォリソームタンパク質体を成す
。外部組織（タバコ植物体、酵素）にそれぞれ遺伝子を発現させることで、タルウマゴヤ
シにおいて、上記のサブユニットのうち２つのみ、すなわちＳＥＯ−Ｆ１及びＳＥＯ−Ｆ
４が、それぞれその他のサブユニットの不在時であっても合成されて、ホモマーから成る
人工フォリソームをなすことが示された。非特許文献４、非特許文献５参照。これに反し
て、サブユニットＳＥＯ−Ｆ２は、ホモマーから成る人工フォリソームに自己組織化され
ることはないが、サブユニットＳＥＯ−Ｆ１ともサブユニットＳＥＯ−Ｆ４と共に凝集し
得る。

分析の目的で、既に、ＳＥＯ−Ｆ融合タンパク質が生成された。たとえばグンドゥラ・
ノルは、非特許文献１によれば、大腸菌における抗体生成の目的で、フォリソーム遺伝子
酵素結合を行った。しかし、ここでは、フォリソーム体の生成は認められなかった。Ｈ・
Ｃ・ペリシエ（Ｈ・Ｃ・Ｐｅｌｉｓｓｉｅｒ）他は、非特許文献３において、フォリソー
ムサブユニットと緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とから成る融合タンパク質について説明
し、この緑色蛍光タンパク質を用いて、融合タンパク質が移植されるトランスジェニック
植物において、上記サブユニットとフォリソーム体との関連性を確認することが可能とな
った。Ｂ・ミュラー他は、非特許文献６において、タルウマゴヤシから得られた遺伝子Ｍ
ｔＳＥＯ１〜ＭｔＳＥＯ４の一方と、ビーナス遺伝子とから成る融合タンパク質と、黄色
蛍光タンパク質とをコードした４つのベクターについて説明している。融合タンパク質は
、ベンサミアナタバコの上皮細胞に発現することが可能である。それぞれＭｔＳＥＯ遺伝
子も同時に発現し、ＭｔＳＥＯ−Ｆ１とＭｔＳＥＯ−Ｆ４の場合には、フォリソーム体に
類似しているが、異なる表現型を有するタンパク質複合体が生成される。ＭｔＳＥＯ−Ｆ
２とＭｔＳＥＯ−Ｆ３の場合には、同一の実験手法で、細胞質局在性のタンパク質のみが
検出される。更に、このような人工フォリソーム体が大量に生成可能であることを証明す
るために、ＭｔＳＥＯ−Ｆ１／ＭｔＳＥＯ−Ｆ１ｖｅｎｕｓとＭｔＳＥＯ−Ｆ４／ＭｔＳ
ＥＯ−Ｆ１ｖｅｎｕｓの同時発現が酵素中で行われた。加えて、大量の人工フォリソーム
体は、ＭｔＳＥＯ−Ｆ１又はＭｔＳＥＯ−Ｆ４の単独発現によって生成可能である。

タンパク質生化学はここ数十年多大な進歩を遂げたが、組換産物として生成されたタン
パク質の精製は、極めて困難であった。このような状況は、たとえば、膜結合タンパク質
又は毒性タンパク質に当てはまる。まさに、酵素の場合には、酵素の量及び／又は活性が
所望の範囲にないという状況がしばしば見られるため、必要な量が原因となって、アッセ
イその他の費用が並外れて高額になる。組換えタンパク質の発現についても、それ自体と
しては、問題となり得る。それゆえ、これらのタンパク質の多くは、発現生物内で正しく
折り畳まれないか、又は不活性の形態の封止体として細胞内で析出される。生成のもう１
つの要件は、多くの場合担体（アガロース、ナイロン）への固定化によって実現される酵
素の再利用可能性である。多くの場合、かかる固定化は、酵素活性の大幅な低下を引き起
こすため、アッセイその他の費用が並外れて高額になる。特に、ポリクローナル抗体の精
製は、通常クロマトグラフ法を用いて行われ、依然として改善が必要な状況である。

Ｇ．Ｎｏｌｌ, Ｍｏｌｅｋｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅ Ｃｈ ａｒａｋｔｅｒｉｓｉｅｒｕｎｇ ｄｅｒ Ｆｏｒｉｓｏｍｅ，Ｇｉｅｓｓｅｎ, ２０ ０５． Ｇ．Ｎｏｌｌｅｔ ａｌ.,Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ ｌｏｇｙ, ６５（２００７）, ２８５−２９４ Ｈ. Ｃ．Ｐｅｌｉｓｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ.,Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｃｅ ｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ），４９（２００８）、１６９９−１７１０ Ｇ．Ｎｏｌｌ ｅｔ ａｌ.,Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｂｕｇｓ ，２：２（２０１１）, １−４ Ｇ．Ｎｏｌｌ ｅｔ ａｌ，Ｐｌａｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＆ Ｂ ｅｈａｖｉｏｒ ６：１, １５１−１５３ Ｂ．Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂ ｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８９（２０１１）：１６７５− １６８２.

以上から、本発明は、ここで是正策を創出し、タンパク質として、一方では容認される
費用で製造することが可能であり、他方、上記の目的で、上のタンパク質の使用を容易に
するか、又は、従来公知で同様の目的で使用されてきたタンパク質その他の材料の使用の
際の結果との比較で、上のタンパク質の使用の際の結果を改善する構造又は形状を有する
タンパク質を提供するという課題を設定した。

上記の課題の解決において、本発明は、改変されたフォリソームを提供することを提案
する。このフォリソームは、タンパク質化学の多くの点で、特に、このフォリソームに融
合タンパク質の形態で含有される生化学活性を有する構造の形態で、改善及び簡略化をも
たらすことを可能にする。融合を介して酵素の機能がフォリソームに導入される場合には
、フォリソームが担体として使用可能となり、この担体に酵素が固着されることで、外部
マトリックスとの結合が不必要になる。しかし、フォリソームは、たとえば、その精製が
容易となる組換えタンパク質の生成との関連で、結合される外来タンパク質の保護機能も
有する。外来タンパク質は、フォリソームの形態で容易に分離され、次いで、必要に応じ
て、適合したプロテアーゼ切断部位及び対応するタンパク質分解酵素を用いて、フォリソ
ームから分離することが可能となる。融合を介して抗原性の構造をフォリソームに導入し
た場合には、フォリソームそのものが抗体の精製に利用可能となる。更に、本発明の物体
は、その接合特性又は構造変調特性の意図的な改変によって、マイクロ工学で役割を果た
すことが可能である。

従来の研究として、上に引用された、ＳＥＯ−Ｆ遺伝子及びＳＥＯ−Ｆタンパク質の分
析との関連での文献において、ＳＥＯ−Ｆ１又はＳＥＯ−Ｆ４タンパク質から成る融合タ
ンパク質に蛍光タグを施したものは、対応する天然タンパク質と共に、フォリソーム体を
なす。しかし、本発明の発明者は、任意のタンパク質を含む任意のＳＥＯ−Ｆユニットを
含む融合タンパク質から、又はこの融合タンパク質を用いて、フォリソームを生成するこ
とは不可能であることを確認する必要があった。にもかかわらず、発明者は、外来タンパ
ク質を用いて、本発明の使用目的に適した人工フォリソーム体を生成するのに成功した。
かかるフォリソーム体は、酵素内で発現可能であり、このため、大量のフォリソーム体が
提供可能となる。特に、ＳＥＯ−Ｆタンパク質又はそのセグメント、更には、Ｃ末端及び
Ｎ末端が、多数のタンパク質、場合によってはペプチドと結合可能であり、ここで、以下
の条件の１つが満たされる限りにおいて、フォリソーム体をなすことが証明された。

それゆえ、本発明の課題は、少なくとも１つのＳＥＯ−Ｆタンパク質又は少なくとも５
０のアミノ酸を含むＳＥＯ−Ｆタンパク質の少なくとも１つのセグメントと、少なくとも
１つの他のタンパク質又はペプチドとから成る融合タンパク質を含む人工フォリソーム体
の提供によって解決され、ここで、
（ａ）他のタンパク質又はペプチドが、最大３０ｋＤａ、好ましくは２５ｋＤａの質量
を有する、及び／又は
（ｂ）フォリソーム体が、更に、非融合の、多くの場合天然のＳＥＯ−Ｆタンパク質、
又は、Ｃ末端側でアミノ酸最大約５０個分、特に最大約４５個分、好ましくは最大４３個
分が欠失した、及び／又は、Ｎ末端側でアミノ酸最大１３個分が欠失した、上記のタンパ
ク質の形態を含み、非融合ＳＥＯ−Ｆタンパク質が、他のＳＥＯ−Ｆタンパク質の不在時
に、ホモマーフォリソーム体を形成する特性を有するか、又は
（ｃ）他のタンパク質又はペプチドが、第２のＳＥＯ−Ｆタンパク質のセグメントであ
り、その条件として、２つのＳＥＯ−Ｆタンパク質のうちの１つが、非融合の形態では、
ホモマーフォリソーム体を形成することが可能であり、融合タンパク質が、Ｎ末端タンパ
ク質セグメントとＣ末端タンパク質セグメントとから成り、２つのタンパク質セグメント
の融合が、２つのＳＥＯ−Ｆタンパク質において同一又は略同一な領域に位置し、タンパ
ク質の機能に関連する領域について見ると、同一又は略同一な部位に位置することで、融
合タンパク質が、完全なＳＥＯ−Ｆタンパク質となるが、融合タンパク質は、必要に応じ
て、Ｃ末端側でアミノ酸最大約５０個分、最大約４５個分、好ましくは最大４３個分及び
／又は、Ｎ末端側でアミノ酸最大１３個分が欠失することが可能である。

もちろん、上記の条件（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のうち二以上を満たすフォリソーム体も
、本発明に含まれる。

上述の通り、融合タンパク質ＭｔＳＥＯ−Ｆ１ｖｅｎｕｓ及びＭｔＳＥＯ−Ｆ４ｖｅｎ
ｕｓと、それぞれの天然タンパク質ＭｔＳＥＯ−Ｆ１／ＭｔＳＥＯ−Ｆ１ｖｅｎｕｓ及び
ＭｔＳＥＯ−Ｆ４／ＭｔＳＥＯ−Ｆ４ｖｅｎｕｓとの組み合わせから成るフォリソーム体
は、先行技術から公知である。かかるフォリソーム体は、本特許の保護の範囲から除外さ
れるべきである。このフォリソーム体は、フォリソーム検出の目的で生成されているが、
本発明はこれを目的としておらず、タンパク質化学で発生する特定の問題の解決を目的と
している。それゆえ、必要に応じて励起光下で、融合タンパク質が蛍光体である限りにお
いて、ＳＥＯ−Ｆタンパク質又はペプチドが、ＧＦＰタンパク質（図１３及びＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．９参照）又はビーナスタンパク質（図１４及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０参照）
、若しくは、そのセグメント又はその（人工の）修飾体に融合する、融合タンパク質から
成るか又はこれを用いて生成されるフォリソーム体は、本特許の保護の範囲には含まれな
い。融合タンパク質を組み込んだ際に、蛍光性を有するか、又は、化学発光タンパク質の
ように、その他の方法で視認可能なペプチドを含む構造を有するフォリソーム体も、少な
くともこのフォリソーム体が、以下に規定の意味で生化学活性又は生化学活性化能を有す
る限りにおいて、本発明に含まれることにはならない。最も広義では、必要があれば、こ
の条件は、そのＳＥＯ−Ｆ分子に由来しないタンパク質部分が、所望の融合の存在の確認
以外の目的を達成することができないか、又は通常その必要もない融合タンパク質から成
るか又はこれを含む全てのフォリソーム体に該当する。もちろん、上記の例外は、上記の
フォリソーム体を含有するか、又はかかるフォリソーム体を用いて、本発明の生成物又は
対応する融合タンパク質が生成される全ての本発明の生成物にも適用される。

本発明は、融合タンパク質から成るフォリソームとして、フォリソームに人工的な生化
学活性又は活性化能又は変化を加えた機械的特性を付与するフォリソームを対象とする。
それゆえ、他のタンパク質又はペプチドは、人工的な生化学活性又は活性化能を有するタ
ンパク質又はペプチドか、或いは、第２のＳＥＯ−Ｆタンパク質のセグメントから選択さ
れる。

本発明によれば、「生化学活性又は活性化能を有するタンパク質又はペプチド」という
記載は、特に、その生体触媒作用のゆえに、酵素のように、物質転換に使用される全ての
タンパク質、免疫反応を引き起こすことが可能であるか、特に抗体及び抗原と同様の薬学
的効能を有する全てのタンパク質、外来タンパク質又は外部ペプチドとの結合部位を有す
る全てのタンパク質又はペプチド、更に、その他のバイオ技術の観点から利用価値のある
タンパク質又はペプチドを含む。本発明によれば、「バイオ技術の観点から利用価値のあ
る」とされるのは、たとえば、その合成が医療用の用途又は診断方法の目的で、重要性を
帯びることがある全てのタンパク質又はペプチドである。多くのタンパク質又はペプチド
が、基質に結合された生物材料又は生化学的に生成された材料との親和反応が原因で、基
質に固定化されることで、再利用可能性を達成する。これらのタンパク質又はペプチドも
、本発明によれば、「バイオ技術の観点から利用価値のある」ものに該当する。これに反
して、視認可能であり、特に蛍光タンパク質のように、生体触媒作用又は上記の特性のう
ち、生体触媒作用以外のものが、問題のタンパク質又はペプチドに欠けている場合に、（
もっぱら）融合タンパク質の形成の確認に使用されるタンパク質又はペプチドは、上の記
載には含まれない。

発明者は、通常は、融合タンパク質が他のＳＥＯ−Ｆタンパク質の不在時に、ホモマー
フォリソーム体を形成する特性を有する限りにおいて、融合タンパク質が非融合の、たと
えば天然のＳＥＯ−Ｆタンパク質と同時発現する場合には常に、フォリソーム体が酵素内
で形成されることを確認できた。これに関しては条件（ｂ）参照。これは、ホモマーを形
成するＳＥＯ−Ｆが存在することで、組立に関連する構造の数と相違が比較的大きくなる
ことに起因するとすることが可能である。

しかし、驚くべきことに、発明者は、上に規定した融合タンパク質が、上記のＳＥＯ−
Ｆタンパク質の存在がなくとも、外来タンパク質部分が一定の大きさを超えなければ、フ
ォリソーム体に自己組織化することを確認できた。発明者は、上記の目的で、非ＳＥＯ−
Ｆ部分が、最大３０ｋＤａの質量を有することになることを確認した。上記の限界を約２
５ｋＤａに設定する（条件（ａ））と一層有利である。上記の方法で得られるフォリソー
ム体は、若干薄手で繊維質であるが、それでも精製される。

人工フォリソームの定義の条件（ｃ）について、ＳＥＯ−Ｆタンパク質に必要な特性を
全て有するＳＥＯ−Ｆ融合生成物が、人工的に生成可能であることが確認されたことはす
でに述べた。この前提条件は、融合タンパク質の少なくとも一部が、ホモマーフォリソー
ム体を形成することが可能であるＳＥＯ−Ｆタンパク質に由来することにある。かかるタ
ンパク質においては、構造はいっそう顕著に特徴的なものとなり、この構造が自己組織化
、更にはフォリソーム形成に役立つと想定される。ある程度の欠失が、Ｎ末端領域よりも
Ｃ末端領域で際立って発生している可能性があるという上記の可能性は、発明者としては
必ずしも固執するつもりはないが、発明者の今のところの見解としては、自己組織化に関
連する構造がＮ末端領域には存在しないことに起因する。

発明者が発見した可能性である、（ｃ）による条件のもとで、必要に応じてホモマーと
して、すなわち、他の、たとえば非融合タンパク質の存在がなくとも、フォリソームに自
己組織化する人工的なＳＥＯ−Ｆタンパク質に想到する可能性によって、その自己組織化
能が目的に応じて制御される、たとえばこの能力を高めることが可能なフォリソームの生
成が開始される。このようにして、かかるフォリソームの機械的特性が、所望の用途に適
応可能となる。たとえば、構造変調のために条件（Ｃａ^２＋含量及び／又はｐＨ値及び／
又は電気刺激）を変動させることが可能になり、もってフォリソームが、天然のフォリソ
ームでは構造変調を引き起こすことのない条件でも使用可能となる。

本発明によれば、融合タンパク質は、Ｃ末端側、すなわち、クローニングベクター及び
「アップストリーム」領域でのＤＮＡ読み取りとの関係で、又は、Ｎ末端をなす、すなわ
ち、クローニングベクター及び「ダウンストリーム」領域でのＤＮＡ読み取りとの関係で
、他のタンパク質を含む。

特別な利点が、本発明によって、以下の分野で得られる。
ａ）酵素の固定化は、工業分野で使用される酵素において利用される。というのは、酵
素の固定化は、酵素の再利用可能性という利点と、酵素生成物の不純物の低減をもたらす
からである。しかし、酵素の安定性及び酵素活性は、可溶性の酵素の形態と比較した場合
、通常は使用される担体によって低減される。従来、酵素の固定化は、多くの場合、酵素
の担体への吸着、組み込み、架橋結合又は共有結合によって行われる。固定化法の不都合
は、たとえば、吸着及び組み込みの場合には不十分な酵素の固定であり、架橋結合の場合
には毒性を有する化学物質の使用であり、共有結合の場合にはアミノ酸の本質をなす官能
基の阻害である。担体としては、アクリル樹脂、ハイドロゲル及び珪藻土のような合成ポ
リマー、ＰＮＩＰＡＭのようなスマートポリマー、又は、アガロース、セルロース、スタ
ーチ及びキトサンのようなバイオポリマーが従来使用されてきた。それゆえ、たとえば、
アガロース１ｇ当たり１０００〜１７５０単位の活性を有するアガロース粒子に固定化さ
れたグルコース−６−リン酸脱水素酵素が商用に供給されている。酵素の精製、その後の
酵素の担体への結合は、２つの別々の作業ステップであり、酵素活性は、固定化の後に、
著しく低下させられる。
ｂ）組換えタンパク質の発現は、タンパク質の特性に応じて、問題となることがある。
たとえば、毒性タンパク質は、発現生物の生活力に影響を及ぼし、組換えタンパク質の生
成量を低下させる。その他のタンパク質は、正しく折り畳まれないか、又は非活性の形態
の封止体として、細胞内で析出される。これ以外の問題が、組換えタンパク質の精製の際
に発生することがある。それゆえ、たとえば、膜タンパク質の分離が、膜成分との相互作
用によって困難となるか、又は、タンパク質が、精製プロセス中に分解される。更に、精
製プロセスは、通常極めて費用がかさみ、多くの場合、大量の環境に有害な化学物質の使
用なしではすませられない。実際には、精製は、工業的な製法においては、複数のステッ
プに区分される。ここで、作業ステップには、沈殿、ろ過又はクロマトグラフィー法が含
まれる。上記の方法において最重要の基準は、精製効率、費用効率、かかる方法の生体内
持続性である。たとえば、沈殿は、非常に安価であるが、低い純度しか得られず、大量の
化学物質の使用を前提とするが、ろ過又はクロマトグラフィー法は著しく費用がかさむ。
この理由から、生成物の一体性を高め、費用を削減し、化学物質の使用を低減する新規の
精製方法の開発は、高まる業界の関心の的である。
ｃ）ポリクローナル抗体の獲得は、それぞれの抗原（タンパク質又はペプチド）の動物
への注射によって行われる。数週間経つと、ポリクローナル血清が動物の血管から採取可
能となる。モノクローナル抗体の獲得のために、形質細胞が脾臓又はリンパ節から分離さ
れ、がん細胞と融合され、無菌培養で培養される。複数回分離を行った後、ハイブリドー
マ培養に成功し、このハイブリドーマ培養は、単一の細胞に由来し、所望のモノクローナ
ル抗体を分泌する。特に、ポリクローナル抗体においては、モノクローナル抗体の場合よ
りもまれに、所望の抗体以外にも、有害な抗体（たとえばケラチン抗体）及び／又は検出
を妨害する物質（たとえば、使用された抗原に類似するタンパク質又は凝集し検出方法を
妨害するタンパク質）が血清中に含まれる。このような物質は、所望の抗体から分離する
必要がある。これは、従来クロマトグラフィー法によって実施されてきた。この目的で、
抗原は、コラムマトリックスに結合される。その後、マトリックスは、「不純物を含む」
抗体溶液でインキュベートされ、こうして、特異的な抗体が抗原更にはマトリックスに結
合することが可能となる。マトリックスが洗浄された後に、抗体がコラムから溶離される
（たとえば、酸性を示すｐＨ値の溶液によって）。この手間のかかる方法の単純化と、効
率の向上は、大いに必要とされる。
ｄ）しかし、本発明の利点は、外来タンパク質の生成及び特性にとどまらない。フォリ
ソームそのものの分野でも、かかる利点は、有利に利用可能である。上述した通り、フォ
リソームは、カルシウムに起因するか、又はｐＨ依存性の構造変調のために、制御モジュ
ールとしてマイクロ流体システム内で使用可能である機械的タンパク質である。それゆえ
、Ａ. Ｑ. Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ., Ｓｍａｒｔ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ）』２（２００６），２２５−２３５及びＫ. Ｕｈｌｉｇ ｅｔ ａｌ., Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ １７（２０
０８），１３２２−１３２８は、マイクロ流路中の蛍光粒子の流れが、一体化されたフォ
リソームによって制御されることを証明した。しかし、意図的且つ持続的なフォリソーム
の固定は、従来はもっぱら手動で、マイクロ操作技術を用いて、且つ極めて大量の時間及
び労力の消費のもとで可能であった。それゆえ、シェン他及びウルリッヒ他（上掲論文）
によって、天然のガラスの接着力が利用された。ここで、フォリソームは、表面に押しつ
けられた場合には、この表面に固定される。しかし、かかる接着力は、液体の流れ中での
フォリソームの固定を保証するものではない。更に、フォリソームが表面に接着した場合
には、フォリソームの反応強度が低下する（Ｇ．Ｎｏｌｌ ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｅｄ Ｂｕｇｓ，２：２（２０１１），１１１−１１４）。

その構造変調特性が、所定の刺激の影響のもとで変化する（たとえば、異なるｐＨ値又
は異なるＣａ^２＋濃度における、液化状態から拡散状態、又はその逆への移行によって）
フォリソームの提供も期待される。

本発明の発明者は、上記の領域のうち４つ全てにおける利点が得られる材料を提供する
ことに成功した。ここで、多くの場合、融合タンパク質の発現は、他のタンパク質サブユ
ニットの存在とは無関係にホモマーを形成可能であるフォリソームタンパク質の同時発現
が、同一の細胞内で発生した場合に、可能となる。これに反して、融合タンパク質の発現
は、小型の外来タンパク質の使用時に、利用価値のある生成物をもたらすが、他方、その
他の場合には、フォリソーム体が全く形成されず、可溶性の形態のタンパク質が存在する
か、又は「封止体」が細胞内に堆積する。

融合タンパク質とホモマーフォリソーム体をなすＳＥＯ−Ｆサブユニットとの同時発現
が行われる、及び／又は融合タンパク質が、小型の外来タンパク質サブユニットを伴って
発現した場合には、植物又は酵素において、安定したフォリソーム体が発現され、このフ
ォリソーム体は、外来タンパク質又はペプチドの存在にもかかわらず、略天然フォリソー
ムの形状を有する。それゆえ、本発明は、個別にモジュール化可能で、機能性の人工フォ
リソームを生成する可能性をもたらす。この点が驚くべきであるのみならず、特に、ここ
で、フォリソーム体の自己組織化が、外来タンパク質の機能効果を妨害しないという確認
も、驚くべきである。酵素と融合したＳＥＯ−Ｆサブユニットを例に、フォリソーム体が
、商用の固定化担体と比較して、外来タンパク質の活性を、低い強度で低下させることが
証明可能となったが、この点は、全ての融合タンパク質について想定可能ではあったが、
一連のそれ以外のタンパク質においては、定量的な比較の可能性がないことから、確認さ
れてはいなかった。

ＭｔＳＥＯ−Ｆ１及びＭｔＳＥＯ−Ｆ４の使用は特に好ましい。しかし、他の供給源由
来のＳＥＯ−Ｆサブユニットも同様に使用される。

それぞれの天然のＳＥＯ−Ｆサブユニットの鎖全体が、融合タンパク質内に存在するこ
とが確認可能であった。これに代えて、ＳＥＯ−Ｆサブユニットの鎖の、必要に応じて比
較的小さい一部分でも、たとえば、約６０〜２５０の長さの領域でも十分であることが、
発明者が蛍光タンパク質との融合を用いて確認可能となった。この点は、ＳＥＯ−Ｆ１又
はＳＥＯ−Ｆ４のように、ホモマーをなすタンパク質の存在が、外来タンパク質が一定量
を上回った場合にフォリソームが形成されるか否か決定する。

融合タンパク質のＳＥＯ−Ｆ成分は、全てのＳＥＯ−Ｆサブユニットに由来するとする
ことが可能である。好ましくはＳＥＯ−Ｆ１、ＳＥＯ−Ｆ２及びＳＥＯ−Ｆ４に由来し、
特に、ＭｔＳＥＯ−Ｆ１、ＭｔＳＥＯ−Ｆ２及びＭｔＳＥＯ−Ｆ４に由来する。

同時発現した非融合ＳＥＯ−Ｆタンパク質が存在する限りにおいては、フォリソームの
形成を確保するために、略完全又は少なくともその大部分が完全なものとなる必要がある
。しかし、発明者は、それぞれのサブユニットの鎖全体が存在する必要があることについ
ては確認していない。Ｎ末端の少なくとも最大１３のアミノ酸及び／又はＣ末端の少なく
とも最大４３のアミノ酸、必要に応じて最大４５のアミノ酸、可能であれば、最大５０の
アミノ酸の欠失が、本発明のフォリソーム体が影響を受けない範囲で、許容可能である。

本発明のフォリソーム体は、任意の数のサブユニットから構成可能である。通常は、融
合タンパク質１種との組み合わせでの非融合ＳＥＯ−Ｆサブユニット１種か、又は、融合
タンパク質の外来タンパク質部が上記の大きさを上回らなければ、融合タンパク質１種の
みでも十分である。フォリソーム体は、通常、約１０^６〜１０^７の個別のタンパク質鎖か
ら成り、必要に応じて、非融合ＳＥＯ−Ｆサブユニットの数と融合タンパク質の数の比が
、外来タンパク質の種類と大きさに応じて、約４：１〜１：１の範囲となる。

本発明の個々のフォリソーム体は、通常、１種類の融合タンパク質のみを含む。しかし
、このフォリソーム体は、複数の異なる融合タンパク質を含むことがある。この点につい
ての特異的且つ特に好適な例は、以下の第１）項において説明される。

各フォリソームサブユニットが天然の供給源に由来することは、本発明には何の役割も
持たない。本発明のフォリソーム体は、トンカマメ（Ｄｉｐｔｅｒｙｘ ｐａｎａｍｅｎ
ｓｉｓ）、エンドウ、ソラマメ、ナタマメ及びミヤコグサに由来するＳＥＯ−Ｆ遺伝子を
用いて生成される。ここから、本発明によれば、マメ科の全ての植物の対応する遺伝子が
使用可能であることが推論される。更に、遺伝子組換え又は合成ＳＥＯ−Ｆ遺伝子又はフ
ォリソームサブユニットも、少なくとも、上記の植物の属する科で保存されている領域が
維持されているか又は存在している限りにおいては、使用可能である。

異なるフォリソームサブユニットのアミノ酸配列における４つのシステインの順番が、
かかるフォリソームサブユニットの構造及び安定性に、多大な影響を及ぼすと、長きにわ
たって仮定されてきた。上記のシステインは、３つのフォリソームサブユニット全てにお
いて、アミノ酸配列のＣ末端部（６００位以降）、特に、ＣＰＮＰＸＣＧＲＶＭＥＶＸＳ
ＸＸＹＫＣＣ（Ｘは、変更可能なアミノ酸を示す）という高度保存モチーフに位置する。
このモチーフは、全てのＳＥＯ−Ｆ遺伝子において（すなわち、他の植物の科におけるＳ
ＥＯ−Ｆ遺伝子においても）、高度に保存される。対応するシークエンスロゴは、図５に
示した。しかし、発明者は、この部位の存在がフォリソーム形成に本質的ではないことを
証明することが可能であった。というのは、同時発現した非融合ＳＥＯ−Ｆ又は２つのＳ
ＥＯ−Ｆ成分から成る融合タンパク質として、ＳＥＯ−Ｆタンパク質を使用することが可
能であり、Ｃ末端が最大４３のアミノ酸、必要に応じて最大４５のアミノ酸、又は、最大
５０のアミノ酸分だけ短縮され、ここで本発明のタンパク質鎖の自己組織化特性は失われ
ない。ＳＥＯ−Ｆ１又はＳＥＯ−Ｆ４が、全長にわたって、又は、上記の保存モチーフの
一部又は全体が存在する配列長で使用される場合には、上記のシステインが、明らかに無
視できない役割を帯びる。特に、上記のシステインが、「部位特異的突然変異」を用いて
、一部又は全体が、ジスルフィド架橋形成を実現しないアミノ酸に置換され、このアミノ
酸は、たとえばグリシン又はアラニンのように、上記のシステインのうち最後の２つ（シ
ークエンスロゴではシステインＣ２１及びＣ２２）が変異した場合、タンパク質フィブリ
ルが他の場合にはフォリソーム体に自己組織化しないような形で、フォリソーム体の構造
状態を変化させることが証明された。それゆえ、理論の制約を受けようとするのでない限
り、２つのフォリソームサブユニットの上記のシステインの間のジスルフィド架橋がタン
パク質フィブリルの秩序立った自己組織化に起因することは想定できない。これに反して
、上記のシステインのうち最初の２つ（シークエンスロゴではシステインＣ３及びＣ８）
のうち、少なくとも１つが変異した場合、そのシステインの発現の後、典型的なフォリソ
ーム体が形成されるが、このフォリソーム体は、カルシウムイオン及びＮａＨＳＯ_３の添
加後に完全に溶解する。カルシウムがタンパク質フィブリルの反発作用を引き起こし、Ｎ
ａＨＳＯ_３の添加が、その後も残存するジスルフィド架橋を溶解する。それゆえ、システ
インＣ３及びＣ８が、個々のサブユニットの結合による繊維形成に関与していると想定さ
れ、それゆえ、タンパク質が、その変異後に、その可溶性の形状に転移することが可能に
なる。

繊維体は有利な特性を有することが可能で、本発明に含まれている。それゆえ、「人工
フォリソーム」という表現は、本発明で使用される場合には、本発明の少なくとも１つの
実施形態において、上記のファイバーネットワークも含める。

特に有利なものは、上記の可溶性のフォリソーム体である。というのは、このフォリソ
ーム体によって、以下の例に示した通り、タンパク質の精製が容易になるためである。

フォリソーム体の生成は、上述のとおり、好ましくは植物細胞又は酵母細胞で行われ、
酵母細胞の使用が特に有利である。というのは、酵母細胞の使用が大量の人工フォリソー
ム体の生成を可能にするからである。それゆえ、本発明は、これに応じて形質転換された
細胞を対象とする。そして最後に、本発明は、これを用いて本発明のフォリソーム体が生
成可能となる、新規のベクター構造体を含む。

メディカーゴ・トルンクラータのサブユニット（ＳＥＯ−Ｆ１）の配列を示 す。 メディカーゴ・トルンクラータのサブユニット（ＳＥＯ−Ｆ２）の配列を示 す。 メディカーゴ・トルンクラータのサブユニット（ＳＥＯ−Ｆ３）の配列を示 す。 メディカーゴ・トルンクラータのサブユニット（ＳＥＯ−Ｆ４）の配列を示 す。 シークエンスロゴを示す。 ＳＥＯ−Ｆ１及びＳＥＯ−Ｆ２に由来する本発明のフォリソーム体に結合さ れるグルコース−６−リン酸脱水素酵素の酵素活性試験を示す。 フォリソーム体ＳＥＯ−Ｆ１及びＳＥＯ−Ｆ４を用いたＭＳＰ１_１９の精製 を示す。 人工フォリソームの固定化のための、ＩｇＧ抗体とＢドメインとの相互作用 の利用を示す。 トンカマメのＳＥＯ−Ｆ１タンパク質の配列を示す。 ミヤコグサのＳＥＯ−Ｆ１タンパク質の配列を示す。 エンドウのＳＥＯ−Ｆ１タンパク質の配列を示す。 ソラマメのＳＥＯ−Ｆ１タンパク質の配列を示す。 ＧＦＰタンパク質の配列を示す。 ビーナスタンパク質の配列を示す。

以下において、本発明は、複数の例を用いて詳細に説明され、この例は、一方では本発
明の適用可能性の範囲を示し、他方では、これを用いれば当業者が本発明を実施すること
が可能になる、個々の措置を具体的に示している。それゆえ、上記の例が限定的なものと
理解されてはならないことは明白であるはずである。

１） 酵素結合された融合タンパク質を含むフォリソーム体
酵素とＳＥＯ−Ｆタンパク質との結合によって、人工フォリソームに、酵素の担体とし
て使用されるという形で機能が加えられる。酵素は、このようにして固定化することが可
能になる。ここで、酵素結合されたフォリソームは、酵素と融合された、必要に応じて短
縮された第１のＳＥＯ−Ｆサブユニットと、必要に応じて、必要があれば又は要請に応じ
て、上記のとおり欠失することが可能であるＳＥＯ−Ｆ１とＳＥＯ−Ｆ４とのうちから選
択される第２のＳＥＯ−Ｆユニットとから成る。融合タンパク質は、Ｃ末端又はＮ末端側
で、融合酵素を担持することが可能である。酵素結合されたフォリソームは、酵素（たと
えばサッカロマイセス・セレビシエ）、細菌（たとえば大腸菌）又は植物（たとえばタバ
コ）のような、目的に適した発現生物における同時発現によって生成される。酵素におけ
る（同時）発現が特に好ましい。発生した酵素結合されたフォリソームは、高い安定性で
際立っている。このフォリソームは、発現生物から単離され（たとえば酵母細胞の分解に
よって）、たとえば、遠心分離法／密度勾配遠心分離法によって、細胞成分から分離され
る。グルコース−６−リン酸脱水素酵素をフォリソームサブユニットのＮ末端に融合され
る酵素とすると、市販品として入手可能な固定化された酵素と比較して明らかに高い酵素
活性が測定可能となる（フォリソーム１ｇ当たり２７００単位に対して、アガロース１ｇ
当たり１０００〜１７５０単位。図４参照）。ここで、酵素が、直接固定化された形態で
、生成生物から単離可能となり、これによって、担体結合ステップの分だけ、酵素生成が
減少する。これは、作業の簡素化に相当するのみならず、明白且つ驚くべき形で外的要因
による活性の上昇をもたらす。ヘキソキナーゼとホスホグルコイソメラーゼとを用いて同
様の方法で生成された融合タンパク質は、同様の結果をもたらした。

同時発現が１種類にとどまらず、２種類以上の融合タンパク質を用いて行われ、融合パ
ートナーが、第１の酵素の反応生成物が、第２の酵素の基質として使用され、第２の酵素
の反応生成物が、必要に応じて第３の酵素の基質として使用されるか、又は反応複合体が
生成され、この反応複合体上で、一定の反応連鎖が発生する。

融合タンパク質において、酵素はＳＥＯ−Ｆタンパク質のＣ末端にも結合した状態で存
在することが可能である。

２） 組換えタンパク質の精製
上述の通り、本発明の人工フォリソーム体は、組換えタンパク質の精製系として利用さ
れる。ここで、組換えタンパク質は、ＳＥＯ−Ｆサブユニットに結合され、融合タンパク
質は、必要に応じて、第２のＳＥＯ−Ｆサブユニットと同時発現し、第２のＳＥＯ−Ｆサ
ブユニットは、上述の通り、たとえば酵母細胞又は植物細胞において、他のサブユニット
の不在時にホモマーを成すことが可能である。組換えタンパク質は、融合タンパク質のＣ
末端又はＮ末端側に存在し、必要があれば、プロテアーゼ制限部位を備えることで、精製
に続いて、外来タンパク質のフォリソーム体からの分離を確保することが可能である。得
られた人工フォリソーム体の単離と精製は、細胞分解更には、たとえば遠心分離法／密度
勾配遠心分離法を用いて行われる。この代わりに、タンパク質ポリマーが、特に、上記の
Ｃ末端側に保存されたシステインの一又は複数の変異の後に、高いＣａ^２＋濃度（＜２ｍ
Ｍ）又は高いＣａ^２＋濃度（＜２ｍＭ）と還元条件（＞１８．５μＭのＮａＨＳＯ_３）と
の組み合わせを用いて、ポリマーの固体状態から可溶状態に転移することが可能となる。
こうして、フォリソーム技術が、沈殿、ろ過及びクロマトグラフィー法という従来の方法
と完全に決別し、この代わりに遠心分離法及びタンパク質の構造状態に依拠した完全に新
規の精製系を提供する。この技術に基づいて、多数のタンパク質のタンパク質精製が容易
になり、且つ安価となることが可能となった。更に、上記の精製系は、精製されるタンパ
ク質の毒性作用又は膜相互作用が、フォリソーム結合によって軽減されるか又は阻止され
るという利点を有する。それゆえ、たとえばマラリア抗原ＭＳＰ１_１９については、その
精製がその強力な膜相互作用によって、他の方法では極めて困難であったが、このマラリ
ア抗原も本発明を用いて、首尾よく精製された。この点は、図７に示す抗原の免疫学的検
出を用いて証明された。

３） 抗体の精製
本発明は、人工フォリソームを用いてポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の精
製を実施し、もって従来のクロマトグラフィー法による分離ステップを回避することを可
能にする。この目的で、抗原は、上記の方法を用いて、フォリソーム遺伝子（上に定義さ
れた通り、ＭｔＳＥＯ−Ｆ１、ＭｔＳＥＯ−Ｆ２又はＭｔＳＥＯ−Ｆ４又はそのセグメン
ト）のアップストリーム又はダウンストリーム領域でクローニングされる。次いで、抗原
・ＭｔＳＥＯ−Ｆ間の融合が、必要に応じてＣ末端側及び／又はＮ末端側で最大１３個の
アミノ酸が欠失したＭｔＳＥＯ−Ｆ１及びＭｔＳＥＯ−Ｆ４と共に、酵素において発現す
る。ここで、酵素内で、抗原を含む人工フォリソームが形成される。

酵素は培養され、遠心分離され、分解される。ここで、抗原を担持する人工フォリソー
ムは、遊離した状態で溶液中に存在し、以下において、ポリクローナル抗体又はモノクロ
ーナル抗体の精製に利用可能となる。

抗原を含む人工フォリソームは、抗体血清によってインキュベートされる。ここで、特
異的な抗体が人工フォリソームに結合される。フォリソームは遠心分離され、洗浄され、
次いで、抗体がｐＨシフトを用いて溶離される。その後、抗体溶液は中和され、さまざま
な用途（ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ免疫沈降、抗体療法その他）に利用可能となる
。

４） フォリソーム特性の改変
本発明を用いて、フォリソームは、新規の、技術的に有益な特性を獲得するように改変
される。たとえば、フォリソームの表面への接着力は、フォリソームがタンパク質又は（
タンパク質又はペプチドの）タグと融合されたＳＥＯ−Ｆサブユニットを含有するとする
ことで改善される。こうして、フォリソームは、マイクロ流路内に配置され、固定化され
る。この例となるのは、黄色ブドウ球菌タンパク質Ａ由来Ｂドメイン、グルタチオン−Ｓ
−転移酵素ビオチン又はビオチンとの融合であって、これらによって、生成生物内で生成
され、次いで単離された人工フォリソームの表面機能の獲得が、かかる人工フォリソーム
が、共有結合を介して、ＩｇＧ、グルタチオン又はストレプトアビジンでコーティングさ
れた表面に結合することが可能となるような形で実現される。更に、他のサブユニットの
不在時にはホモマーを形成可能であるＳＥＯ−Ｆサブユニットと、融合タンパク質との同
時発現が行われるか、又は発現産物中の外来タンパク質部が過度に大きくない場合に、安
定したフォリソームが得られる。こうして、機械的タンパク質体として利用されるフォリ
ソームの表面上又はマイクロ流路中の配置に関連する問題が排除される。外来タンパク質
との融合に代えて他のＳＥＯ−Ｆタンパク質との融合が行われれば、その構造変調特性が
、Ｃａ^２＋濃度及びｐＨ値の影響下で変動する機械的タンパク質体が得られる。

以下の具体的な実施例は、本発明の理解を更に深めるためのものである。

例１−人工フォリソームでの酵素の固定化
Ｉ． フォリソーム遺伝子ＭｔＳＥＯ−Ｆ１、ＭｔＳＥＯ−Ｆ２又はＭｔＳＥＯ−Ｆ４は
、翻訳終止コドンの有無にかかわらず、以下のオリゴヌクレオチドを有するタルウマゴヤ
シｃＤＮＡに基づいて増幅された（制限部位には下線を引いた）。
MtSEO-F1 fw NcoI: 5’-AGA ACC ATG GGA TCA TTG TCC AAT GGA ACT AAA C-3’
MtSEO-F1 rev XhoI with stop codon: 5’-AGA CTC GAG TCA TAT CTT GCC ATT CTG TG
G AGC-3’
MtSEO-F1 rev XhoI without stop codon: 5’-AGA CTC GAG CAT ATC TTG CCA TTC TGT
GGA GC-3’
MtSEO-F2 fw NcoI: 5’-AGA ACC ATG GGA TCC ACT GCA TTG TCC TAT AAT G-3’
MtSEO-F2 rev XhoI with stop codon: 5’-AGA CTC GAG TCA AAT GCA GCA ACT ATC TG
G-3’
MtSEO-F2 rev XhoI without stop codon: 5’-AGA CTC GAG ATG CAG CAA CTA TCT GGA
-3’
MtSEO-F4 fw NcoI: 5’- AGA ACC ATG GGA TCC CTT TCC AAC TTA GGA AG-3’
MtSEO-F4 rev XhoI with stop codon: 5’-AGA CTC GAG TCA AAC ACC AAG ATT GTT TG
G-3’
MtSEO-F4 rev XhoI without stop codon: 5’- AGA CTC GAG ACA CCA AGA TTG TTT GG
T TC-3’

増幅産物は、制限酵素ＮｃｏＩ/ＸｈｏＩで制限され、ｐＥＮＴＲ４^ＴＭベクター（イ
ンビトロジェン社、独国）の対応する切断部位にクローニングされた。こうして、ｐＥＮ
ＴＲ４^ＴＭ−ＭｔＳＥＯ−Ｆベクターが、翻訳終止コドンの有無にかかわらず生成された
。

ＩＩ． サッカロマイセス・セレビシエ由来の酵素ヘキソキナーゼ２（ＨＸＫ２）、ホス
ホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）
の遺伝子は、以下のオリゴヌクレオチドを有するｃＤＮＡに基づいて増幅された（制限部
位には下線を引いた）。
G6PDH fw XhoI: 5’-AGA CTC GAG AAT GAG TGA AGG CCC CGT C-3’
G6PDH rev XhoI: 5’- AGACTCGAGCTAATTATCCTTCGTATCTTC
HXK2 fw XhoI: 5’-AGACTCGAGAATGGTTCATTTAGGTCCAAA
HXK2 bw XhoI: 5’-AGACTCGAGTTAAGCACCGATGATACCA
PGI XhoI fw: 5’-AGACTCGAGAATGTCCAATAACTCATTCAC
PGI XhoI rev: 5’- AGACTCGAGATCACATCCATTCCTTGAATTG
Invertase XhoI fw: 5’-AGACTCGAGAGCATCAATGACAAACGAAAC
Invertase XhoI rev: 5’- AGACTCGAGCTATTTTACTTCCCTTACTTGG

増幅産物は、制限酵素ＮｃｏＩ/ＸｈｏＩで制限され、翻訳終止コドンなしのｐＥＮＴ
Ｒ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆベクターの対応する切断部位にクローニングした（ａ）Ｉ．参照）
。こうして、ｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１−Ｇ６ＰＤＨ、ｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ
−Ｆ２−Ｇ６ＰＤＨ、ｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４−Ｇ６ＰＤＨ、ｐＥＮＴＲ４−Ｍ
ｔＳＥＯ−Ｆ１−ＨＸＫ２、ｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ２−ＨＸＫ２、ｐＥＮＴＲ４
−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４−ＨＸＫ２、ｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１−ＰＧＩ、ｐＥＮＴＲ
４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ２−ＰＧＩ及びｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４−ＰＧＩの各ベクタ
ーが得られた。

ＩＩＩ． 翻訳終止コドンを有するｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１及び翻訳終止コドン
を有するｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４の各ベクターは、酵母ベクター４２５ＧＰＤ−
ｃｃｄＢ（アドジーン、米国）に組み換えられた。結果として得られた発現構築物４２５
ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１及び４２５ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４が、酵母株ＩｎｖＳｃ１
（インビトロジェン社、独国）に形質転換された。選択のために、酵母株のロイシン栄養
要求性の相補が利用された。結果として得られた酵母が、ＭｔＳＥＯ−Ｆ１又はＭｔＳＥ
Ｏ−Ｆ４から人工フォリソームを生成し、この人工フォリソームが、酵素結合の基礎とし
て使用される。

ＩＶ． 上記のＭｔＳＥＯ−Ｆ・酵素間の融合（１．ＩＩ参照）を伴うｐＥＮＴＲ４ベク
ターは、酵母ベクター４２５ＧＰＤ−ｃｃｄＢ（アドジーン、米国）によって組み換えら
れた。結果として得られたベクター（４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１−Ｇ６ＰＤＨ、４
２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ２−Ｇ６ＰＤＨ、４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４−Ｇ６Ｐ
ＤＨ、４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１−ＨＸＫ２、４２４ＧＰＤ-ＭｔＳＥＯ−Ｆ２−
ＨＸＫ２、４２４ＧＰＤ -ＭｔＳＥＯ−Ｆ４−ＨＸＫ２、４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ
１−ＰＧＩ、４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ２−ＰＧＩ、４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ
４−ＰＧＩ）は、酵母に形質転換され、この酵母は、ＭｔＳＥＯ−Ｆ１又はＭｔＳＥＯ−
Ｆ４から成る人工フォリソームの生成のために、プラスミドを得ている（ａ）ＩＩＩ参照
）。それゆえ、結果として得られた二重変異体（たとえば、４２５ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−
Ｆ１／４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ２−Ｇ６ＰＤＨ）は、ロイシン栄養要求性又はトリ
プトファン栄養要求性との関連で相補される。

Ｖ． 酵素結合フォリソームを生成する（ａ）Ｉ〜ＩＶ参照）発現酵母は、ＯＤ６００ｎ
ｍが５〜７の範囲までは、５０ｍＬの規模で培養され、遠心分離（１０００×ｇ、１０分
間）を用いて回収される。酵母ペレットは、５０ｍＬのＶ培地（１０ ｍＭのＴＲＩＳ、
１０ ｍＭのＥＤＴＡ、 １００ ｍＭのＫＣｌ、 ｐＨ ７．４）で洗浄され、再度遠心分
離（１０００×ｇ、１０分間）を行った後、−２０℃で凍結される。凍結された酵母ペレ
ットは、１ｍＬのＶ培地で再懸濁され、約５００ｍｇ（４２５〜６００μｍ）のガラスビ
ーズで移し替える。細胞の分解は、１．５ｍＬの容器中で、ミキサーミルＭＭ４００（レ
ッチ、独国）内で３０Ｈｚの周波数で行われる。次いで、人工フォリソームが、不溶性の
細胞成分と共に遠心分離され、０．５ｍＬのＶ培地で再懸濁される。次いでこの溶液が、
スクロース又はナイコデンツによる密度勾配にかけられ、ここで、スクロース又はナイコ
デンツの濃度は、４０％〜７０％の勾配で増加する。この勾配が、ベックマン超遠心分離
機を用いて、１６３，０００×ｇ、４℃の条件で、３時間遠心分離された。

その後、勾配中のフォリソーム含有相は、ピペットを用いて収集され、Ｖ培地を用いて
１：２に希釈され、２つの等量のアリコートに分けられる。アリコートは１０分間１００
×ｇで遠心分離され、上清が除去された。第１のアリコートのフォリソームは、次いで５
０μＬのＶ培地に加えられ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）を用いた酵素結合した人工フォリソームの質量・濃度測定に使用された。第２のア
リコートは、５０μＬの酵素緩衝液に加えられた（Ｇ６ＰＤＨに結合したフォリソーム用
：２５０ｍＭグリシルグリシン緩衝液、ｐＨ７．４；ＨＸＫ２に結合したフォリソーム用
：１３．３ｍＭのＭｇＣｌ_２を加えた０．０５Ｍｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８；ＰＧ
Ｉに結合したフォリソーム用：２５０ｍＭグリシルグリシン緩衝液、ｐＨ７．４）。この
アリコートは、特異的酵素アッセイを用いた、フォリソームに結合した酵素の活性の測定
に使用された。

ＶＩ． 酵素結合した人工フォリソーム（ａ）ＩＶ参照）は、その質量及び濃度に関して
、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて検証された。ここで、酵素結合した人工フォリソームが構成
される元となるフォリソームタンパク質（たとえば、ＭｔＳＥＯ−Ｆ１及びＭｔＳＥＯ−
Ｆ２酵素融合タンパク質）が分離された。個々のタンパク質の存在は、生物情報から予測
された質量（たとえば、ＭｔＳＥＯ−Ｆ２−Ｇ６ＰＤＨ＝１２４．７キロダルトン）と、
ゲル中の実際の質量（ＭｔＳＥＯ−Ｆ２−Ｇ６ＰＤＨ＝約１３０ｋＤａ）と比較すること
で確認される。タンパク質の濃度測定は、規定されたタンパク質の量の標準系列を追加で
加えたものを用いるか、又はタンパク質マーカ、プレシジョンＰｌｕｓプロテイン未着色
スタンダード（バイオラッド社）を用いて行われる。５０ｍＬの発現培養物から、選択さ
れたフォリソームタンパク質及び酵素融合に応じて、タンパク質の総量（個々のＭｔＳＥ
Ｏ−Ｆタンパク質＋ＭｔＳＥＯ−Ｆ酵素融合）５６〜１２４μｇ分の酵素結合した人工フ
ォリソームが得られる。ここで、タンパク質の総含有量に占めるＭｔＳＥＯ−Ｆ酵素融合
の割合は、融合パートナーに応じて、１０％〜５０％となる。タンパク質総量（５０ｍＬ
の発現培養物当たり１２４μｇ）においても、酵素融合タンパク質（５０ｍＬの発現培養
物当たり３７μｇ）においても、最大量は、ＰＧＩに結合した酵素フォリソーム（ＭｔＳ
ＥＯ−Ｆ１／ＭｔＳＥＯ−Ｆ２−ＰＧＩ）の生成時に得られた。

フォリソームによって固定化された酵素の活性は、特異的分光光度測定用酵素アッセイ
を用いて測定された。グルコース−６−リン酸脱水素酵素については、シグマ・アルトリ
ッチ社（独国）の推奨プロトコルが使用された。アッセイは、Ｇ６ＰＤＨに触媒された、
グルコース−６−リン酸の６−ホスホグルコノラクトンへの変換に依拠している。この反
応の際に、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）が、以下の通り、
ＮＡＤＰＨに還元される。

３４０ｎｍの波長域におけるＮＡＤＰＨの消失は、分光光度測定によって測定可能であ
り、この消失を用いて、酵素活性が計算可能となる。アッセイのために、第２のアリコー
ト（ａ）Ｖ参照）から精製された酵素フォリソームが使用される。酵素結合されたフォリ
ソームの算出された濃度を用いて、人工フォリソーム１グラム当たりで測定された酵素活
性が計算可能である。構造物（ａ）ＩＩＩ参照）に応じて、フォリソームによって固定化
されたグルコース−６−リン酸脱水素酵素については、人工フォリソーム１グラム当たり
２０００〜２７００単位の活性が得られた。これに比較して、シグマ・アルトリッチ社（
独国）によって市販品として入手可能となった固定化されたグルコース−６−リン酸脱水
素酵素では、アガロース１グラム当たり１０００〜１７５０単位の活性しか得られなかっ
た。それゆえ、本発明のグルコース−６−リン酸脱水素酵素は、明らかにより高い特異的
酵素活性（担体の量に対する酵素活性）を有する。図６は、ＳＥＯ−Ｆ１及びＳＥＯ−Ｆ
２に由来する本発明のフォリソーム体に結合されるグルコース−６−リン酸脱水素酵素の
酵素活性試験を示す。

フォリソームによって固定化されたヘキソキナーゼ２及びホスホグルコイソメラーゼの
活性も、同様のアッセイ原理に基づいて測定された。ここでは、３４０ｎｍにおけるＮＡ
ＤＰＨの吸光増加を用いて酵素活性を測定するために、相前後して推移する２つの酵素反
応のみが利用された。ヘキソキナーゼ２については、ワーシントン社（レークウッド、ニ
ュージャージー州、米国）の推奨プロトコルが使用され、このプロトコルの基礎は、以下
に示す反応である。

２番目の反応に必要とされたグルコース−６−リン酸脱水素酵素は、本アッセイのアプ
ローチに、市販品として入手可能な、可溶性の酵素として所定の活性を有するものの形で
添加された。構造物（ａ）ＩＩＩ参照）に応じて、フォリソームによって固定化されたヘ
キソキナーゼ２については、人工フォリソーム１グラム当たり６０００〜８０００単位の
活性が得られた。これに対して、シグマ・アルトリッチ社の提供するアガロースによって
固定化されたヘキソキナーゼについては、わずか５０〜７５単位の活性しか得られなかっ
た。

ホスホグルコイソメラーゼについては、シグマ・アルトリッチ社（独国）の推奨プロト
コルが使用され、このプロトコルの基礎は、以下に示す反応である。

構造物（ａ）ＩＩＩ参照）に応じて、フォリソームによって固定化されたホスホグルコ
イソメラーゼについては、人工フォリソーム１グラム当たり６０００〜８０００単位の活
性が得られた。これに対して、シグマ・アルトリッチ社の提供するアガロースによって固
定化されたヘキソキナーゼについては、わずか３００〜６００単位の活性しか得られなか
った。

例２−タンパク質の精製
２．１ａ 未変異のフォリソーム遺伝子を用いるか、又は未変異のフォリソーム遺伝子
の不在時の組換えタンパク質の精製
Ｉ． マラリア表面抗原ＭＳＰの断片（ＭＳＰ１_１９）のコードされた配列は、以下のオ
リゴヌクレオチドを有するベクターに基づいて増幅された（制限部位には下線を引いた）
。
MSP1₁₉ NcoI fw: 5’- AGACCATGGACCTGCGTATTTCTCAG-3’
MSP1₁₉ NcoI FaXa rev: 5’- AGACCATGGTACGACCTTCGATCCTGCATATAGAAATGCC-3’
MSP1₁₉ XhoI FaXa fw: 5’- AGACTCGAGAATCGAAGGTCGTGACCTGCGTATTTCTCAG-3’
MSP1₁₉ XbaI rev: 5’- AGATCTAGATCACCTGCATATAGAAATG-3’

プライマーＭＳＰ１_１９ＮｃｏＩ ＦａＸａ ｒｅｖ及びＭＳＰ１_１９ ＸｈｏＩ ＦａＸ
ａ ｆｗは、遺伝子特異的な配列に加えて、プロテアーゼ因子Ｘａの認識部位（斜体にて
表記）を含んでいる。第１の増幅産物は、制限酵素ＮｃｏＩで処理され、終止コドンを有
するベクターｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１、終止コドンを有するベクターｐＥＮＴＲ
４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ２及び終止コドンを有するベクターｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４
それぞれのＮｃｏＩ切断部位においてクローニングされる（ａ）Ｉ参照）ことで、ベクタ
ーｐＥＮＴＲ４− ＭＳＰ１_１９−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１、 ｐＥＮＴＲ４− ＭＳＰ１_１９−
ＭｔＳＥＯ−Ｆ２及びｐＥＮＴＲ４− ＭＳＰ１_１９−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４を得る。第２の
増幅産物−Ｍｔは、制限酵素ＸｈｏＩ及びＸｂａＩで処理され、終止コドンなしのベクタ
ーｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１、終止コドンなしのベクターｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥ
Ｏ−Ｆ２及び終止コドンなしのベクターｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４それぞれのＸｈ
ｏＩ／ＸｂａＩ切断部位においてクローニングされる（ａ）Ｉ参照）ことで、ベクターｐ
ＥＮＴＲ４ＳＥＯ−Ｆ１− ＭＳＰ１_１９、 ｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ２− ＭＳＰ
１_１９及びｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４− ＭＳＰ１_１９を得る。発現ベクター４２
４ＧＰＤ−ＭＳＰ１_１９−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１、４２４ＧＰＤ−ＭＳＰ１_１９−ＭｔＳＥＯ
−Ｆ２、４２４ＧＰＤ−ＭＳＰ１_１９−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４、４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−
Ｆ１−ＭＳＰ１_１９、４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ２−ＭＳＰ１_１９及び４２４ＧＰＤ
−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４−ＭＳＰ１_１９の生成のために、生成されたベクターは、酵母ベクタ
ー４２４ＧＰＤ−ｃｃｄＢ（アドジーン、米国）によって組み換えられた。

ＩＩ． ベクター４２４ＧＰＤ−ＭＳＰ１_１９−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４及び４２４ＧＰＤ−Ｍ
ｔＳＥＯ−Ｆ４−ＭＳＰ１_１９が、酵母株ＩｎｖＳｃ１（インビトロジェン社、独国）に
形質転換された。選択のために、酵母株のトリプトファン栄養要求性の相補が利用された
。ＭＳＰ１_１９及びＭｔＳＥＯ−Ｆ４から成る融合タンパク質が、他のＭｔＳＥＯ−Ｆタ
ンパク質のこれ以上の発現を伴わずに、フォリソームを形成する。

ベクター４２４ＧＰＤ−ＭＳＰ１_１９−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１、４２４ＧＰＤ−ＭＳＰ１_１９
−ＭｔＳＥＯ−Ｆ２、 ４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１−ＭＳＰ１_１９及び４２４ＧＰ
Ｄ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ２−ＭＳＰ１_１９は、酵母に形質転換され、この酵母は、ＭｔＳＥＯ
−Ｆ１から成る人工フォリソームの生成のために、プラスミド（４２５ＧＰＤ−ＭｔＳＥ
Ｏ−Ｆ１）を得ている（ａ）ＩＩＩ参照）。それゆえ、結果として得られた酵母（たとえ
ば、４２５ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１／４２４ＧＰＤ−ＭＳＰ１_１９−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１
）は、ロイシン栄養要求性又はトリプトファン栄養要求性との関連で相補され、ＭＳＰ１
_１９タンパク質と融合する人工フォリソームを生成する。

ＭＳＰ１_１９と融合する人工フォリソームは、１．Ｖに記載した通り精製され、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット法を用いて検証され、定量化された。全ての構造物は
精製に利用可能であった。細胞培養物１Ｌ当たりの０．４９ｍｇのＭＳＰ１_１９の最適な
精製については、発明者は、４２４ＧＰＤ−ＭＳＰ１_１９−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４構造物でも
達成した。培養と精製の適応による最適化は、将来、より大量のタンパク質量の精製をも
たらすことになる。更に、プロテアーゼ因子Ｘａを用いたインキュベーションによって、
ＭＳＰ１_１９タンパク質が、人工タンパク質から分離可能になる。加えて、発明者は、い
くつかの還元性を有し、カルシウムを含有するという緩衝条件が、人工フォリソームの溶
解をもたらす可能性がある（特に、ＭｔＳＥＯ−Ｆ１タンパク質の６１５位及び６２０位
におけるシステインの変異の場合）ことを認めた。この不溶相から可溶相への転移は、タ
ンパク質精製に利用可能である。図７は、フォリソーム体ＳＥＯ−Ｆ１及びＳＥＯ−Ｆ４
を用いたＭＳＰ１_１９の精製を示す。ＭＳＰ１_１９の免疫学的検出が図示されている。

２．１ｂ システインにより変異されたフォリソーム遺伝子を用いた組換えタンパク質
の精製
ＭｔＳＥＯ−Ｆ１遺伝子において、シークエンスロゴでシステインＮｏ．３及び８（図
５）は、アジレントテクノロジー社（カリフォルニア州、米国）のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇ
ｅＩＩ部位特異的突然変異誘発キットを用いて、製造者の注意事項に従い、セリンに変異
させた。出発物質として使用されたのは、ベクターｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１とし
て、終止コドンを有するものと終止コドンなしのもの（例１）である。システインＮｏ．
３及び８は、ＭｔＳＥＯ−Ｆ１タンパク質のアミノ酸の６１５位及び６２０位に相当する
。それゆえ、結果として得られた変異ＭｔＳＥＯ−Ｆ１遺伝子は、以下においてＭｔＳＥ
Ｏ−Ｆ１（Ｃ６１５Ｓ／Ｃ６２０Ｓ）と言う。

マラリア表面抗原の断片（ＭＳＰ１_１９）のコードされた配列は、例２．１ａにおいて
記載された通り、ｐＥＮＴＲ４^ＴＭベクター（インビトロジェン社、独国）のベクターに
おいては、ＭｔＳＥＯ−Ｆ１（Ｃ６１５Ｓ／Ｃ６２０Ｓ）のアップストリーム領域及びダ
ウンストリーム領域でクローニングされる。

酵母ベクター４２５ＧＰＤ−ｃｃｄＢ（アドジーン、米国）によるベクターｐＥＮＴＲ
４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１（Ｃ６１５Ｓ／Ｃ６２０Ｓ）の組換え及び酵母ベクター４２４ＧＰ
Ｄ−ｃｃｄＢ（アドジーン、米国）によるベクターｐＥＮＴＲ４−ＭＳＰ１_１９−ＭｔＳ
ＥＯ−Ｆ１（Ｃ６１５Ｓ／Ｃ６２０Ｓ）及びｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１（Ｃ６１５
Ｓ/Ｃ６２０Ｓ）−ＭＳＰ１_１９の組換えを用いて、発現ベクター４２５ＧＰＤ− ＭｔＳ
ＥＯ−Ｆ１ （Ｃ６１５Ｓ／Ｃ６２０Ｓ）、４２４ＧＰＤ−ＭＳＰ１_１９−ＭｔＳＥＯ−
Ｆ１（Ｃ６１５Ｓ／Ｃ６２０Ｓ）、 ４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１（Ｃ６１５Ｓ／Ｃ
６２０Ｓ）−ＭＳＰ１_１９が生成される。

酵母ベクターは、以下の組み合わせ、すなわち

で、酵母株ＩｎｖＳｃ１（インビトロジェン社、独国）に形質変換される。選択のため
に、酵母株のロイシン栄養要求性及びトリプトファン栄養要求性の相補が利用された。結
果として得られた酵母は、ＭＳＰ１_１９タンパク質を含有するＭｔＳＥＯ−Ｆ１（Ｃ６１
５Ｓ／Ｃ６２０Ｓ）由来の人工フォリソームを生成する。

結果として得られた人工フォリソームは、還元性の緩衝液中で、カルシウムイオン（４
ｍＭのＣａＣｌ、２００μＭのＮａＨＳＯ_３、１０ｍＭのＴＲＩＳ、１００ｍＭのＫＣｌ
、ｐＨ ７．２）によって約１００％可溶性の形状に転移され、変異なしのバージョンで
は、わずかな部分しか可溶性の形状に転移しない。

それゆえ、精製プロセスが短縮可能となる。培養後、ＭＳＰ１_１９タンパク質を含有す
る酵母細胞は分解され、人工フォリソーム及び酵母破片は、遠心分離によって可溶性部分
から分離し、次いで、タンパク質・フォリソーム融合が可溶相に転移することが可能とな
る。

２．２ 人工フォリソーム遺伝子を用いた抗体の精製
Ｉ． ゴム小粒子結合蛋白質３（ＳＲＲＰ３）のコードされた配列は、以下のオリゴヌク
レオチドを有するベクターに基づいて増幅された（制限部位には下線を引いた）。
SRPP3 XhoI fw: 5‘-AGA CTCGAGA ATGACCGACGCTGCTTC-3‘
SRPP 3 XhoI rev: 5‘-AGA CTCGAG TCATGTTTCCTCCACAATC-3‘

増幅産物は、制限酵素ＸｈｏＩで処理され、翻訳終止コドンなしのｐＥＮＴＲ４−Ｍｔ
ＳＥＯ−Ｆ１ベクターのＸｈｏＩ切断部位にクローニングされる（ａ）Ｉ．参照）ことで
、ベクターｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１−ＳＲＰＰ３を得る。発現ベクター４２４Ｇ
ＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１−ＳＲＰＰ３の生成のために、生成されたベクターは、酵母ベク
ター４２４ＧＰＤ−ｃｃｄＢ（アドジーン、米国）によって組み換えられた。

ＩＩ． ベクター４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１−ＳＲＰＰ３は、酵母に形質転換され
、この酵母は、ＭｔＳＥＯ−Ｆ１から成る人工フォリソームの生成のために、すでにプラ
スミド（４２５ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１）を含んでいる（１．ＩＩＩ参照）。結果とし
て得られた酵母（たとえば、４２５ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１／４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥ
Ｏ−Ｆ１−ＳＲＰＰ３）は、ロイシン栄養要求性及びトリプトファン栄養要求性との関連
で相補され、ＳＲＰＰ３タンパク質と融合する人工フォリソームを生成する。酵母は、Ｏ
Ｄ６００ｎｍまでは、５０ｍＬの規模で培養され、遠心分離され、１ｍＬのＶ培地（１０
ｍＭのＴＲＩＳ、 １０ｍＭのＥＤＴＡ、 １００ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）で、ボール
ミルを用いて分解される。ここで、抗原を担持する人工フォリソームは、遊離した状態で
溶液中に存在し、以下において、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の精製に利
用可能となる。

ＩＩＩ． 抗原を含む人工フォリソームは、５００μＬのポリクローナル抗体血清を用い
て、ウサギにおいて生成されたＳＲＰＰ３との比較で、３０分間インキュベートされる。
ここで、特異的抗体は、人工フォリソームに結合する。フォリソームは遠心分離（４００
０×ｇ、４分間）され、１ｍＬのＰＢＳ（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、
１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、２ ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．４）で三度洗浄された。
次いで、抗体は、４５０μＬの０．１Ｍグリシン・ＨＣｌ溶液（ｐＨ２．７）で５分間溶
離される。その後、抗体は、４５０μＬの０．１Ｍｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．５）
で中和される。以下のブロットにおいては、精製される抗体（血清不純物のない状態）の
高い特異性が確認される。フォリソームを用いて精製された抗体は、さまざまな用途（ウ
ェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ免疫沈降、抗体療法その他）に利用可能となる。このよう
な精製の原理は、図７に示している。図８は、人工フォリソームの固定化のための、Ｉｇ
Ｇ抗体とＢドメインとの相互作用の利用を示している。Ｂドメインと結合されたＳＥＯ−
Ｆ１サブユニットから成る人工フォリソームは、蛍光ＩｇＧ抗体を形成する。

例３−人工フォリソームの技術的表面への固定（表面結合）
Ｉ． グルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＴ）のコードされた配列は、以下のオリゴヌクレ
オチドを有するｐＧｅｘ−３Ｘベクター（ＧＥヘルスケア社、米国）に基づいて増幅され
た（制限部位には下線を引いた）。
GST fw NcoI XhoI fw: 5’-AGACCA TGG GAC TCG AGA ATG TCC CCT ATA CTA GGT TA-3’
GST SalI rev: 5’-AGA GTC GAC TTA ACG ACC TTC GAT CAG ATC-3’

この断片は、制限酵素ＮｃｏＩ／ＳａｌＩで処理され、ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩで切断され
たベクターｐＥＮＴＲ４^ＴＭでクローニングされ、この結果、ベクターｐＥＮＴＲ４−Ｇ
ＳＴが生成される。以下において、終止コドンを有するＭｔＳＥＯ−Ｆ１遺伝子の増幅産
物（１．Ｉ参照）が、結果として生成されるベクターのＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ部位でクロー
ニングされることで、ベクターｐＥＮＴＲ４−ＧＳＴ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１を得る。発現ベ
クター４２４ＧＰＤ−ＧＳＴ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１の生成のために、ベクターｐＥＮＴＲ４
−ＧＳＴ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１は、酵母ベクター４２４ＧＰＤ−ｃｃｄＢ（アドジーン、米
国）によって組み換えられた。発現ベクターは、酵母に形質転換され、この酵母は、Ｍｔ
ＳＥＯ−Ｆ１から成る人工フォリソームの生成のために、すでにプラスミド（４２５ＧＰ
Ｄ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１）を含んでいる（ａ）ＩＩＩ参照）。結果として得られた酵母（４
２５ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１／４２４ＧＰＤ−ＧＳＴ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１）は、ロイシ
ン栄養要求性及びトリプトファン栄養要求性との関連で相補され、ＧＳＴタグを有する人
工フォリソームを生成する。この酵母は、ａ）Ｖに記載の通り精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅを用いて、それぞれのタンパク質（ＭｔＳＥＯ−Ｆ１及びＧＳＴ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１）
の存在が検証可能となった。更に、結果として得られた人工のＧＳＴ結合されたフォリソ
ームが、グルタチオン結合されたマトリックス（グルタチオンセファロース４Ｂ、アマシ
ャムバイオサイエンス社、米国）に接着することも証明された。

ＩＩ． 黄色ブドウ球菌タンパク質Ａ由来Ｂドメインのコードされた配列は、以下のオリ
ゴヌクレオチドを有する４２４ＧＰＤ−ｃｃｄＢ−ＴＡＰベクター（ＧＥヘルスケア社、
米国）に基づいて増幅された（制限部位には下線を引いた）。
B-Domain NcoI fw: 5’- AGACCATGGCGGATAACAAATTCAACA-3’
B-Domain NcoI rev: 5’-AGACCATGGCTTTTGGTGCTTGAGCATC-3’
B-Domain XhoI fw: 5’- AGACTCGAGAGCGGATAACAAATTCAAC-3’
B-Domain XhoI rev: 5’- AGACTCGAGTCATTTTGGTGCTTGAGCATC-3’

第１の増幅産物は、制限酵素ＮｃｏＩで処理され、終止コドンを有するベクターｐＥＮ
ＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１及び終止コドンを有するベクターｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−
Ｆ４のＮｃｏＩ切断部位でクローニングされる（ａ）Ｉ．参照）ことで、ベクターｐＥＮ
ＴＲ４−Ｂ−ｄｏｍａｉｎ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１及びｐＥＮＴＲ４−Ｂ−ｄｏｍａｉｎ−Ｍ
ｔＳＥＯ−Ｆ４を得る。第２の増幅産物は、制限酵素ＸｈｏＩで処理され、終止コドンな
しのベクターｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１及び終止コドンなしのベクターｐＥＮＴＲ
４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４のＸｈｏＩ切断部位でクローニングされる（ａ）Ｉ．参照）ことで
、ベクターｐＥＮＴＲ４− ＭｔＳＥＯ−Ｆ１−Ｂ−ｄｏｍａｉｎ及びｐＥＮＴＲ４−Ｍ
ｔＳＥＯ−Ｆ４−Ｂ−ｄｏｍａｉｎを得る。発現ベクター４２４ＧＰＤ−Ｂ−ｄｏｍａｉ
ｎ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１、４２４ＧＰＤ−Ｂ−ｄｏｍａｉｎ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４、４２４Ｇ
ＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１−Ｂ−ｄｏｍａｉｎ、４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４−Ｂ−ｄ
ｏｍａｉｎの生成のために、生成されたベクターは、酵母ベクター４２４ＧＰＤ−ｃｃｄ
Ｂ（アドジーン、米国）によって組み換えられた。

ベクター４２４ＧＰＤ−Ｂ−ｄｏｍａｉｎ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４及び４２４ＧＰＤ−Ｍｔ
ＳＥＯ−Ｆ４−Ｂ−ｄｏｍａｉｎは、酵母株ＩｎｖＳｃ１（インビトロジェン社、独国）
に形質変換された。選択のために、酵母株のトリプトファン栄養要求性の相補が利用され
た。Ｂドメイン及びＭｔＳＥＯ−Ｆ４から成る融合タンパク質が、他のＭｔＳＥＯ−Ｆタ
ンパク質のこれ以上の発現を伴わずに、フォリソーム構造を形成する。

ベクター４２４ＧＰＤ−Ｂ−ｄｏｍａｉｎ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１及び４２４ＧＰＤ−Ｍｔ
ＳＥＯ−Ｆ１−Ｂ−ｄｏｍａｉｎは、酵母に形質転換され、この酵母は、ＭｔＳＥＯ−Ｆ
１から成る人工フォリソームの生成のために、すでにプラスミド（４２５ＧＰＤ−ＭｔＳ
ＥＯ−Ｆ１）を含んでいる（１．ＩＩＩ参照）。結果として得られた酵母（たとえば、４
２５ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１／４２４ＧＰＤ−Ｂ−ｄｏｍａｉｎ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１）
は、ロイシン栄養要求性及びトリプトファン栄養要求性との関連で相補され、Ｂドメイン
と融合する人工フォリソームを生成する。以上生成されたＢドメインを含む人工フォリソ
ームは全て、ＩｇＧに結合されたセファロース（ＧＥヘルスケア社、米国）に固定化され
る。

２．３ 異なるＳＥＯ−Ｆタンパク質から成る人工ＳＥＯ−Ｆフォリソームの生成及び
精製
２．３．１ ＭｔＳＥＯ−Ｆ４のアミノ酸１〜９６とＭｔＳＥＯ−Ｆ１のアミノ酸７３
〜６４８との融合
Ｎ末端側のＭｔＳＥＯ−Ｆ４断片及びＣ末端側のＭｔＳＥＯ−Ｆ１断片は、以下のオリ
ゴヌクレオチド、すなわち
MtSEO-F4 MSLSN NcoI fw 5’-AGACCATGGGATCCCTTTCCAACTTAGGAAGTG -3’
MtSEO-F4 LISCQ NcoI rev 5‘-AGACCATGGCCTGACAAGAAATCAGCTT-3‘
MtSEO-F1 MITTR NcoI fw 5‘-AGACCATGGGAATGATAACCACCCCTC-3’
MtSEO-F1 QNGKI XhoI rev 5'-AGACTCGAGGTCATATCTTGCCATTCTGTGGAG-3'
によって増幅され、ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩによって制限されたｐＥＮＴＲ４ベクターＩＩ
クローニングされた。その後、生成されたベクターｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４（１
−２８８ｂｐ）／ＭｔＳＥＯ−Ｆ１（２１９−１９４４ｂｐ）は、植物発現ベクターｐＢ
ａｔＴＬ及び酵母発現ベクター４２５ＧＰＤ−ｃｃｄＢによって組み換えられた。生成さ
れたｐＢａｔＴＬ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４（１−２８８ｂｐ）／ＭｔＳＥＯ−Ｆ１（２１９−
１９４４ｂｐ）は、アグロバクテリウムに形質転換され、このアグロバクテリウムで、ベ
ンサミアナタバコ植物体が浸透を受けた（ミュラー他、２０１０）。生成されたベクター
４２５ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４（１−２８８ｂｐ）／ＭｔＳＥＯ−Ｆ１（２１９−１９
４４ｂｐ）は、酵母株ＩｎｖＳｃ１に形質転換された。２つの系ではいずれも、人工フォ
リソームの形成が顕微鏡で観察可能であった。精製は、上の例１．Ｖに記載した通り実施
された。

２．３．２ ＭｔＳＥＯ−Ｆ１のアミノ酸１〜５８３とＭｔＳＥＯ−Ｆ２のアミノ酸６
２０−６７０との融合
Ｎ末端側のＭｔＳＥＯ−Ｆ１断片及びＣ末端側のＭｔＳＥＯ−Ｆ２断片は、以下のオリ
ゴヌクレオチド、すなわち
MtSEO-F1 MSLNS NcoI fw 5'-AGACCATGGGATCATTGTCCAATGGAACTA-3'
MtSEO-F1 FKEYY XhoI rev 5‘-AGACTCGAGTGATAGTATTCTTTGAATGCAAT-3‘
MtSEO-F2 DTKLS XhoI fw 5‘-AGACTCGAGTGATACTAAGCTTTCAGAGAT-3‘
MtSEO-F2 DSCCI XhoI bw 5'-AAACTCGAGTCAAATGCAGCAACTATCTGGATCATC-3'
によって増幅され、ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩによって制限されたｐＥＮＴＲ４ベクターＩＩ
クローニングされた。その後、生成されたベクターｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４（１
−２８８ｂｐ）／ＭｔＳＥＯ−Ｆ１（２１９−１９４４ｂｐ）は、植物発現ベクターｐＢ
ａｔＴＬ及び酵母発現ベクター４２５ＧＰＤ−ｃｃｄＢによって組み換えられた。生成さ
れたｐＢａｔＴＬ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１（１−１７４９ｂｐ）／ＭｔＳＥＯ−Ｆ２（１８６
０−２０１０ｂｐ）は、アグロバクテリウムに形質転換され、このアグロバクテリウムで
、ベンサミアナタバコ植物体が浸透を受けた（ミュラー他、２０１０）。生成されたベク
ター４２５ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１（１−１７４９ｂｐ）／ＭｔＳＥＯ−Ｆ２（１８６
０−２０１０ｂｐ）は、酵母株ＩｎｖＳｃ１に形質転換された。２つの系ではいずれも、
人工フォリソームの形成が顕微鏡で観察可能であった。精製は、上の例１．Ｖに記載した
通り実施された。

Claims (23)

1. 少なくとも１つのＳＥＯ−Ｆタンパク質又は少なくとも５０のアミノ酸を含む前記ＳＥＯ−Ｆタンパク質の少なくとも１つのセグメントと、ＧＦＰタンパク質及びビーナスタンパク質を例外として、少なくとも１つの他のタンパク質又はペプチドとから成る融合タンパク質を含む人工フォリソーム体であって、
   （ａ）前記他のタンパク質又はペプチドは、最大３０ｋＤａの質量を有するか、
   （ｂ）フォリソーム体が、更に、非融合の、多くの場合天然のＳＥＯ−Ｆタンパク質、又は、Ｃ末端側でアミノ酸最大約４５個分が欠失した、及び／又はＮ末端側でアミノ酸最大１３個分が欠失した、前記タンパク質の形態を含み、前記非融合ＳＥＯ−Ｆタンパク質が、他のＳＥＯ−Ｆタンパク質の不在時に、ホモマーフォリソーム体を形成することが可能となる特性を有するタンパク質から選択されるか、又は
   （ｃ）前記他のタンパク質又はペプチドは、第２のＳＥＯ−Ｆタンパク質のセグメントであり、その条件として、２つのＳＥＯ−Ｆタンパク質のうちの１つが、非融合の形態では、ホモマーフォリソーム体を形成することが可能であり、前記融合タンパク質が、Ｎ末端側のタンパク質セグメントとＣ末端側のタンパク質セグメントとから成り、前記セグメントが、１つのＳＥＯ−Ｆタンパク質をなし、該ＳＥＯ−Ｆタンパク質は、完全であるか又はＣ末端側でアミノ酸最大約５０個分及び／又はアミノ酸最大１３個分のＮ末端が欠失し、
   その条件として、必要に応じて、４つのシステインのうちの任意の数で、前記天然のＳＥＯ−Ｆタンパク質において、Ｃ末端側の部分の、ＡＳ６００とＡＳ６７０との間に存在し、Ｓ−Ｓ架橋結合を形成できないアミノ酸と交換可能である、人工フォリソーム体。
2. 全体又は一部が、ＧＦＰタンパク質又はビーナスタンパク質の人工の蛍光修飾体又は蛍光セグメントを含む融合タンパク質から構成されたフォリソーム体を例外とし、好ましくは、全体又は一部が、蛍光性を有する融合タンパク質から構成されたフォリソーム体を例外とする、請求項１記載の人工フォリソーム体。
3. ＳＥＯ−Ｆ１タンパク質、好ましくはＭｔＳＥＯ−Ｆ１タンパク質のセグメントを含む、請求項１記載の人工フォリソーム体、変更形態（ｃ）。
4. 前記他のタンパク質又はペプチドは、物質転換に使用されるタンパク質と、免疫反応を引き起こすことが可能である及び／又は薬学的効能を有するタンパク質と、バイオ技術の観点から利用価値のあるタンパク質又はペプチドと、のうちから選択される、請求項１記載の人工フォリソーム体。
5. 前記他のタンパク質又はペプチドは、酵素と、抗体と、抗原と、基質に結合された生物材料又は生化学的に生成された材料との親和反応が原因で、前記基質に固定化されるその他のタンパク質又はペプチドと、のうちから選択される、請求項４記載の人工フォリソーム体。
6. 前記融合タンパク質は、前記ＳＥＯ−Ｆタンパク質又は該ＳＥＯ−Ｆタンパク質のセグメントのＮ末端側の端部に融合される酵素を含むか、又は、前記融合タンパク質は、薬学的効能を有するか、又はバイオ技術の観点から利用価値があり、前記ＳＥＯ−Ｆタンパク質又は該ＳＥＯ−Ｆタンパク質のセグメントのＣ末端側の端部に融合されるタンパク質を含む、請求項４又は５記載の人工フォリソーム体。
7. 少なくとも２つの融合タンパク質を含み、該融合タンパク質が、それぞれ酵素を含むことで、該酵素のうち第１の酵素を用いた基質の転換による生成物が、前記酵素のうち第２の酵素の基質として使用可能である、請求項４乃至６のいずれか一項記載の人工フォリソーム体。
8. 前記ＳＥＯ−Ｆタンパク質又は、該ＳＥＯ−Ｆタンパク質の少なくとも５０個のアミノ酸を有するセグメントが、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１乃至８の配列のうちいずれか１つを有するタンパク質か、又は該タンパク質の少なくとも５０個のアミノ酸を有するセグメントのうちから選択される、先行する請求項のいずれか一項記載の人工フォリソーム体。
9. 非融合ＳＥＯ−Ｆタンパク質又は、請求項１の変更形態（ｂ）に規定の通り、Ｃ末端側でアミノ酸最大約４５個分が欠失した、及び／又はＮ末端側でアミノ酸最大１３個分が欠失した、前記タンパク質の形態が、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、４、５、６、７及び８の配列のうちいずれか１つを有するタンパク質のうちから選択される、先行する請求項のいずれか一項記載の人工フォリソーム体。
10. 少なくとも１つのＳＥＯ−Ｆタンパク質又は、該ＳＥＯ−Ｆタンパク質の少なくとも５０個のアミノ酸を有するセグメントから成る融合タンパク質と、少なくとも１つの他のタンパク質又はペプチドであり、ＧＦＰタンパク質及びビーナスタンパク質、ＧＦＰタンパク質又はビーナスタンパク質の蛍光修飾体又は蛍光セグメントを除いたものとをコードした第１のベクターと、選択的に、
    ＳＥＯ−Ｆタンパク質、又は、Ｃ末端側でアミノ酸最大約４５個分が欠失した、及び／又はＮ末端側でアミノ酸最大１３個分が欠失した、前記タンパク質の形態をコードした第２のベクターとを含み、その条件として、必要に応じて、４つのシステインのうちの任意の数で、前記天然のＳＥＯ−Ｆタンパク質において、Ｃ末端側の部分の、ＡＳ６００とＡＳ６７０との間に存在し、Ｓ−Ｓ架橋結合を形成できないアミノ酸と交換可能である、
    植物細胞又は酵母細胞。
11. 前記他のタンパク質又はペプチドは、最大３０ｋＤａの質量を有する、請求項１０記載の植物細胞又は酵母細胞。
12. 前記他のタンパク質又はペプチドは、第２のＳＥＯ−Ｆタンパク質のセグメントであり、その条件として、２つのＳＥＯ−Ｆタンパク質のうちの１つが、非融合の形態では、ホモマーフォリソーム体を形成することが可能であり、前記融合タンパク質が、Ｎ末端側のタンパク質セグメントとＣ末端側のタンパク質セグメントとから成り、前記セグメントが、１つのＳＥＯ−Ｆタンパク質をなし、該ＳＥＯ−Ｆタンパク質は、完全であるか又はＣ末端側でアミノ酸最大約５０個分及び／又はアミノ酸最大１３個分のＮ末端が欠失する、請求項１０又は１１記載の植物細胞又は酵母細胞。
13. 前記他のタンパク質又はペプチドは、物質転換に使用されるタンパク質と、免疫反応を引き起こすことが可能である及び／又は薬学的効能を有するタンパク質と、バイオ技術の観点から利用価値のあるタンパク質又はペプチドと、のうちから選択される、請求項１０乃至１２のいずれか一項記載の植物細胞又は酵母細胞。
14. 前記他のタンパク質又はペプチドは、酵素と、抗体と、抗原と、基質に結合された生物材料又は生化学的に生成された材料との親和反応が原因で、前記基質に固定化されるその他のタンパク質又はペプチドと、のうちから選択される、請求項１３記載の植物細胞又は酵母細胞。
15. 前記融合タンパク質は、前記ＳＥＯ−Ｆタンパク質又は該ＳＥＯ−Ｆタンパク質のセグメントのＮ末端側の端部に融合される酵素を含むか、又は、前記融合タンパク質は、薬学的効能を有するか、又はバイオ技術の観点から利用価値があり、前記ＳＥＯ−Ｆタンパク質又は該ＳＥＯ−Ｆタンパク質のセグメントのＣ末端側の端部に融合されるタンパク質を含む、請求項１０乃至１４のいずれか一項記載の植物細胞又は酵母細胞。
16. （ａ）に記載のベクターは、第１の酵素のアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードし、前記細胞が、第２の酵素のアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードする少なくとも１つの他のベクターを含み、前記第１の酵素を用いた基質の転換による生成物は、前記第２の酵素の基質に適していることを特徴とする、請求項１０乃至１５のいずれか一項記載の植物細胞又は酵母細胞。
17. 少なくとも１つのＳＥＯ−Ｆタンパク質又は、該ＳＥＯ−Ｆタンパク質の少なくとも５０個のアミノ酸を有するセグメントから成る融合タンパク質と、ＧＦＰタンパク質及びビーナスタンパク質を除く、他のタンパク質又はペプチドとをコードした部分を含む、酵母細胞で複製可能なベクター。
18. 前記他のタンパク質又はペプチドは、物質転換に使用されるタンパク質と、免疫反応を引き起こすことが可能である及び／又は薬学的効能を有するタンパク質と、バイオ技術の観点から利用価値のあるタンパク質又はペプチドと、のうちから選択される、請求項１７記載のベクター。
19. 前記他のタンパク質又はペプチドは、酵素と、抗体と、抗原と、基質に結合された生物材料又は生化学的に生成された材料との親和反応が原因で、前記基質に固定化されるその他のタンパク質又はペプチドと、のうちから選択される、請求項１８記載のベクター。
20. 前記融合タンパク質は、前記ＳＥＯ−Ｆタンパク質又は該ＳＥＯ−Ｆタンパク質のセグメントのＮ末端側の端部に融合される酵素を含むか、又は、前記融合タンパク質は、薬学的効能を有するか、又はバイオ技術の観点から利用価値があり、前記ＳＥＯ−Ｆタンパク質又は該ＳＥＯ−Ｆタンパク質のセグメントのＣ末端側の端部に融合されるタンパク質を含む、請求項１７乃至１９のいずれか一項記載のベクター。
21. 人工フォリソーム体の生成のための、少なくとも１つのＳＥＯ−Ｆタンパク質又は、該ＳＥＯ−Ｆタンパク質の少なくとも５０個のアミノ酸を有するセグメントから成る融合タンパク質と、ＧＦＰタンパク質及びビーナスタンパク質を除く、他のタンパク質又はペプチドとから成る融合タンパク質の使用。
22. 前記融合タンパク質は、ＧＦＰタンパク質又はビーナスタンパク質の人工の蛍光修飾体又は蛍光セグメントと、更に、好ましくは、蛍光性を有するタンパク質部を含んでいない、請求項２１記載の使用。
23. 少なくとも１つのＳＥＯ−Ｆタンパク質又は少なくとも５０のアミノ酸を含む前記ＳＥＯ−Ｆタンパク質の少なくとも１つのセグメントと、ＧＦＰタンパク質及びビーナスタンパク質を例外として、少なくとも１つの他のタンパク質又はペプチドとから成る融合タンパク質を含む人工フォリソーム体の使用であって、
    （ａ）前記他のタンパク質又はペプチドは、最大３０ｋＤａの質量を有するか、
    （ｂ）フォリソーム体が、更に、非融合の、多くの場合天然のＳＥＯ−Ｆタンパク質、又は、Ｃ末端側でアミノ酸最大約４５個分が欠失した、及び／又はＮ末端側でアミノ酸最大１３個分が欠失した、前記タンパク質の形態を含み、前記非融合ＳＥＯ−Ｆタンパク質が、他のＳＥＯ−Ｆタンパク質の不在時に、ホモマーフォリソーム体を形成することが可能となる特性を有するタンパク質から選択されるか、又は
    （ｃ）前記他のタンパク質又はペプチドは、第２のＳＥＯ−Ｆタンパク質のセグメントであり、その条件として、２つのＳＥＯ−Ｆタンパク質のうちの１つが、非融合の形態では、ホモマーフォリソーム体を形成することが可能であり、前記融合タンパク質が、Ｎ末端側のタンパク質セグメントとＣ末端側のタンパク質セグメントとから成り、前記セグメントが、１つのＳＥＯ−Ｆタンパク質をなし、該ＳＥＯ−Ｆタンパク質は、完全であるか又はＣ末端側でアミノ酸最大約５０個分及び／又はアミノ酸最大１３個分のＮ末端が欠失し、
    その条件として、必要に応じて、４つのシステインのうちの任意の数で、前記天然のＳＥＯ−Ｆタンパク質において、Ｃ末端側の部分の、ＡＳ６００とＡＳ６７０との間に存在し、Ｓ−Ｓ架橋結合を形成できないアミノ酸と交換可能であり、
    タンパク質化学の目的のため、特に、固定化された酵素、抗体、抗原、又は、基質に結合された生物材料又は生化学的に生成された材料との親和反応が原因で、前記基質に固定化されるその他のタンパク質又はペプチドの提供のため、又は機械的タンパク質体としての使用。