CN109423497A - 增强蛋白质合成效率的rna元件 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种增强蛋白质合成效率的RNA元件，具体地，本发明发现了由任选的启动子、酵母来源的IRES增强子（如ScGPR1、ScFLO8、ScNCE102、ScMSN1、KlFLO8、KlNCE102、KlMSN1）以及外源蛋白的编码序列构成的核酸构建物，在酵母体外蛋白质合成体系中应用本发明的核酸构建物，所合成的荧光素酶活性的相对光单位值(RLU)非常高。

Description

增强蛋白质合成效率的RNA元件
技术领域
本发明涉及生物技术领域，较佳地，涉及一种增强蛋白质合成效率的RNA元件。
背景技术
蛋白质是细胞中的重要分子，几乎参与了细胞所有功能的执行。蛋白的序列和结构不同，决定了其功能的不同。在细胞内，蛋白可以作为酶类催化各种生化反应，可以作为信号分子协调生物体的各种活动，可以支持生物形态，储存能量，运输分子，并使生物体运动。在生物医学领域，蛋白质抗体作为靶向药物，是治疗癌症等疾病的重要手段。
在细胞中，蛋白质翻译的调节在应对营养缺失等外界压力，细胞发育与分化等很多过程中发挥重要作用。蛋白质翻译的四个过程包括翻译起始、翻译延伸、翻译终止和核糖体再循环，其中翻译起始是受调控最多的一个过程。真核细胞的翻译起始可以分为两大类：“帽子结构”依赖的传统途径和“帽子结构”非依赖的途径。
“帽子结构”依赖的翻译起始是一个非常复杂的过程，涉及十几种翻译起始因子和核糖体的40S小亚基。“帽子结构”非依赖的翻译起始则多是由位于mRNA 5’ 端非翻译区的内部核糖体进入序列(internal ribosome entry sites, IRESs)介导的。IRESs最早是在上世纪八十年代在病毒mRNA中第一次被发现的，后来细胞内来源的IRESs也被广泛报道。不同的病毒IRESs在宿主细胞内起始蛋白质翻译通常需要宿主细胞翻译起始因子的不同组合，在一些极端情况下，病毒IRES能够直接招募宿主细胞的核糖体，不需要其他任何翻译起始因子的辅助。病毒IRESs通常具有复杂的二级和三级结构，作为招募蛋白质因子的平台。除了传统的翻译起始因子外，另外一大类因子-ITAFs(IRES trans-acting factors)也能够增强IRES起始翻译的效率。
在从酵母到人类的细胞内都发现了IRESs，而针对细胞内源的IRESs的研究远没有病毒IRESs透彻，主要是因为细胞内源性的IRESs起始蛋白质翻译的效率通常较低，而且被多种不具有共性的复杂机制所调控。不同于病毒IRESs,不同的细胞内源性的IRESs不具有序列和结构上的共性，通常很难进行预测。
除了以上人们对于细胞内蛋白质合成的了解之外，蛋白质合成也可以在细胞外进行。蛋白质体外合成系统一般是指在细菌、真菌、植物细胞或动物细胞的裂解体系中，加入mRNA或者DNA模板、RNA聚合酶及氨基酸和ATP等组分，完成外源蛋白的快速高效翻译。目前，经常实验的商业化体外蛋白表达系统包括大肠杆菌系统(E.coli extract，ECE)、兔网织红细胞(Rabbit reticulocyte lysate，RRL)、麦胚(Wheat germ extract, WGE)、昆虫(Insect cell extract, ICE)和人源系统。
在体外合成的mRNA通常不具有“帽子结构”，而对mRNA进行加“帽子结构”修饰即耗时又昂贵，因此体外蛋白质合成体系一般采用“帽子结构”非依赖的翻译起始方法进行蛋白质的合成。而目前使用真核细胞内源性IRES在体外起始蛋白质翻译的还比较少。
因此，本领域迫切需要开发一种能够增强蛋白质翻译效率的含有酵母来源的IRES的新的核酸构建物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够增强蛋白质翻译效率的含有酵母来源的IRES的新的核酸构建物。
本发明第一方面提供了一种核酸构建物，所述的构建物具有从5’至3’的式I结构：
Z1-Z2 (I)
式中，
Z1、Z2分别为用于构成所述构建物的元件；
各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；
Z1为增强子元件，所述增强子元件包括IRES元件；
Z2为外源蛋白的编码序列；
并且，所述Z1来源于酵母。
在另一优选例中，所述IRES元件选自下组：ScGPR1、ScFLO8、ScNCE102、ScMSN1、KlFLO8、KlNCE102、KlMSN1、或其组合。
在另一优选例中，所述酵母选自下组：酿酒酵母、克鲁维酵母属酵母、或其组合。
在另一优选例中，所述克鲁维酵母属酵母选自下组：乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、多布克鲁维酵母 (Kluyveromyces dobzhanskii)、或其组合。
在另一优选例中，所述核酸构建物的序列如SEQ ID NO.:1-7所示。
在另一优选例中，所述外源蛋白的编码序列来自原核生物、真核生物。
在另一优选例中，所述外源蛋白的编码序列来自动物、植物、病原体。
在另一优选例中，所述外源蛋白的编码序列来自哺乳动物，较佳地灵长动物，啮齿动物，包括人、小鼠、大鼠。
在另一优选例中，所述的外源蛋白的编码序列编码选自下组的外源蛋白：荧光素蛋白、或荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、氨酰tRNA合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶、肌动蛋白、抗体的可变区域、萤光素酶突变体、α-淀粉酶、肠道菌素A、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、胰岛素前体、干扰素α A、白细胞介素-1β、溶菌酶素、血清白蛋白、单链抗体段(scFV)、甲状腺素运载蛋白、酪氨酸酶、木聚糖酶、或其组合。
在另一优选例中，所述外源蛋白选自下组：荧光素蛋白、或荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、氨酰tRNA合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶、肌动蛋白、抗体的可变区域、萤光素酶突变、α-淀粉酶、肠道菌素A、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、胰岛素前体、干扰素α A、白细胞介素-1β、溶菌酶素、血清白蛋白、单链抗体段(scFV)、甲状腺素运载蛋白、酪氨酸酶、木聚糖酶、或其组合。
本发明第二方面提供了一种核酸构建物，所述的构建物具有从5’至3’的式II结构：
Z0-Z1-Z2 (II)
式中，
Z0、Z1、Z2分别为用于构成所述构建物的元件；
各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；
Z0为启动子元件，所述启动子元件选自下组：T7启动子、T3启动子、SP6启动子、或其组合；
Z1为增强子元件，所述增强子元件包括IRES元件；
Z2为外源蛋白的编码序列；
并且，所述Z1来源于酵母。
本发明第三方面提供了一种载体或载体组合，所述的载体或载体组合含有本发明第一方面或本发明第二方面所述的核酸构建物。
本发明第四方面提供了一种基因工程细胞，所述基因工程细胞的基因组的一个或多个位点整合有本发明第一方面或本发明第二方面所述的构建物，或者所述基因工程细胞中含有本发明第三方面所述的载体或载体组合。
在另一优选例中，所述基因工程细胞为酵母细胞。
在另一优选例中，所述酵母细胞选自下组：酿酒酵母、克鲁维酵母属酵母、或其组合。
在另一优选例中，所述克鲁维酵母属酵母选自下组：乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、多布克鲁维酵母 (Kluyveromyces dobzhanskii)、或其组合。
本发明第五方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包含的试剂选自下组中的一种或多种：
(a) 本发明第一方面或本发明第二方面所述的构建物；
(b) 本发明第三方面所述的载体或载体组合；和
(c) 本发明第四方面所述的基因工程细胞；
在另一优选例中，所述试剂盒还包括(d)酵母体外蛋白合成体系。
在另一优选例中，所述酵母体外蛋白合成体系为克鲁维酵母体外蛋白合成体系(优选乳酸克鲁维酵母体外蛋白合成体系)。
本发明第六方面提供了一种如本发明第一方面或本发明第二方面所述的构建物、本发明第三方面所述的载体或载体组合、本发明第四方面所述的基因工程细胞或本发明第五方面所述试剂盒的用途，用于进行高通量的体外蛋白合成。
本发明第七方面提供了一种体外高通量的外源蛋白合成方法，包括步骤：
(i) 在酵母体外蛋白合成体系存在下，提供本发明第一方面或本发明第二方面所述的核酸构建物；
(ii) 在适合的条件下，孵育步骤(i)的酵母体外蛋白合成体系一段时间T1，从而合成所述外源蛋白。
在另一优选例中，所述方法还包括：(iii) 任选地从所述酵母体外蛋白合成体系中，分离或检测所述外源蛋白。
在另一优选例中，所述酵母体外蛋白合成体系为克鲁维酵母体外蛋白合成体系(优选乳酸克鲁维酵母体外蛋白合成体系)。
在另一优选例中，所述外源蛋白的编码序列来自原核生物、真核生物。
在另一优选例中，所述外源蛋白的编码序列来自动物、植物、病原体。
在另一优选例中，所述外源蛋白的编码序列来自哺乳动物，较佳地灵长动物，啮齿动物，包括人、小鼠、大鼠。
在另一优选例中，所述的外源蛋白的编码序列编码选自下组的外源蛋白：荧光素蛋白、或荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、氨酰tRNA合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶、肌动蛋白、抗体的可变区域、萤光素酶突变体、α-淀粉酶、肠道菌素A、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、胰岛素前体、干扰素α A、白细胞介素-1β、溶菌酶素、血清白蛋白、单链抗体段(scFV)、甲状腺素运载蛋白、酪氨酸酶、木聚糖酶、或其组合。
在另一优选例中，所述外源蛋白选自下组：荧光素蛋白、或荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、氨酰tRNA合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶、肌动蛋白、抗体的可变区域、萤光素酶突变、α-淀粉酶、肠道菌素A、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、胰岛素前体、干扰素α A、白细胞介素-1β、溶菌酶素、血清白蛋白、单链抗体段(scFV)、甲状腺素运载蛋白、酪氨酸酶、木聚糖酶、或其组合。
在另一优选例中，所述步骤(ii)中，反应温度为20-37 ℃，较佳地，22-35 ℃。
在另一优选例中，所述步骤(ii)中，反应时间为1-10 h，较佳地，2-8 h。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1 显示了7个真核细胞内源性IRESs与Omega序列在酵母体外蛋白质合成体系中起始合成的萤火虫荧光素酶 (Firefly luciferase, Fluc) 的相对光单位值 (RelativeLight Units, RLUs)；这7个IRESs (ScMSN1、ScNCE102、ScGPR1、ScFLO8、KlNCE102、KlMSN1和KlFLO8) 的相对光单位值均达到或者超过了Omega序列，其中，ScNCE102和KlNCE102的相对光单位值分别是Omega序列的10.4倍和4.7倍。
具体实施方式
经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和摸索，首次意外地发现了一种可大幅度增强蛋白质翻译效率的新型核酸构建物，本发明的核酸构建物由任选的启动子、酵母来源的IRES增强子（如ScGPR1、ScFLO8、ScNCE102、ScMSN1、KlFLO8、KlNCE102、KlMSN1）以及外源蛋白的编码序列构成，在酵母体外蛋白质合成体系中应用本发明的核酸构建物，所合成的荧光素酶活性的相对光单位值(RLU)非常高，其中，IRES（如ScNCE102和KlNCE102）的相对光单位值可达到Omega序列的10.4倍和4.7倍。在此基础上，本发明人完成了本发明。
酵母体外蛋白质合成体系
酵母(yeast)兼具培养简单、高效蛋白质折叠、和翻译后修饰的优势。其中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕氏酵母(Pichia pastoris)是表达复杂真核蛋白质和膜蛋白的模式生物，酵母也可作为制备体外翻译系统的原料。
克鲁维酵母(Kluyveromyces)是一种子囊孢子酵母，其中的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis) 是工业上 广泛使用的酵母。与其他酵母相比，乳酸克鲁维酵母具有许多优点,如超强的分泌能力,更好的大规模发酵特性、食品安全的级别、以及同时具有蛋白翻译后修饰的能力等。
在本发明中，酵母体外蛋白质合成体系不受特别限制，一种优选的酵母体外蛋白质合成体系为克鲁维酵母表达系统(更佳地，乳酸克鲁维酵母表达系统)。
在本发明中，所述酵母体外蛋白质合成体系包括：
(a) 酵母细胞提取物；
(b) 聚乙二醇；
(c) 任选的外源蔗糖；和
(d) 任选的溶剂，所述溶剂为水或水性溶剂。
在一特别优选的实施方式中，本发明提供的体外蛋白合成体系包括：酵母细胞提取物，4-羟乙基哌嗪乙磺酸，醋酸钾，醋酸镁，腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)，鸟嘌呤核苷三磷酸(GTP)，胞嘧啶核苷三磷酸(CTP)，胸腺嘧啶核苷三磷酸(TTP)，氨基酸混合物，磷酸肌酸，二硫苏糖醇(DTT)，磷酸肌酸激酶，RNA酶抑制剂，荧光素，萤光素酶DNA，RNA聚合酶。
在本发明中，RNA聚合酶没有特别限制，可以选自一种或多种RNA聚合酶，典型的RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶。
在本发明中，所述酵母细胞提取物在体外蛋白合成体系中的比例不受特别限制，通常所述酵母细胞提取物在体外蛋白质合成蛋白合成体系中所占体系为20-70%，较佳地，30-60%，更佳地，40-50%。
在本发明中，所述的酵母细胞提取物不含完整的细胞，典型的酵母细胞提取物包括用于蛋白翻译的核糖体、转运RNA、氨酰tRNA合成酶、蛋白质合成需要的起始因子和延伸因子以及终止释放因子。此外，酵母提取物中还含有一些源自酵母细胞的细胞质中的其他蛋白，尤其是可溶性蛋白。
在本发明中，所述的酵母细胞提取物所含蛋白含量为20-100mg/ml, 较佳为50-100mg/ml。所述的测定蛋白含量方法为考马斯亮蓝测定方法。
在本发明中，所述的酵母细胞提取物的制备方法不受限制，一种优选的制备方法包括以下步骤：
(i)提供酵母细胞；
(ii)对酵母细胞进行洗涤处理，获得经洗涤的酵母细胞；
(iii)对经洗涤的酵母细胞进行破细胞处理，从而获得酵母粗提物；
(iv)对所述酵母粗提物进行固液分离，获得液体部分，即为酵母细胞提取物。
在本发明中，所述的固液分离方式不受特别限制，一种优选的方式为离心。
在一优选实施方式中，所述离心在液态下进行。
在本发明中，所述离心条件不受特别限制，一种优选的离心条件为5000-100000×g，较佳地，8000-30000×g。
在本发明中，所述离心时间不受特别限制，一种优选的离心时间为0.5 min-2 h，较佳地，20 min-50 min。
在本发明中，所述离心的温度不受特别限制，优选的，所述离心在1-10 ℃下进行，较佳地，在2-6 ℃下进行。
在本发明中，所述的洗涤处理方式不受特别限制，一种优选的洗涤处理方式为采用洗涤液在pH为7-8(较佳地，7.4)下进行处理，所述洗涤液没有特别限制，典型的所述洗涤液选自下组：4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾、醋酸钾、醋酸镁、或其组合。
在本发明中，所述破细胞处理的方式不受特别限制，一种优选的所述的破细胞处理包括高压破碎、冻融(如液氮低温)破碎。
所述体外蛋白质合成体系中的核苷三磷酸混合物为腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸。在本发明中，各种单核苷酸的浓度没有特别限制，通常每种单核苷酸的浓度为0.5-5 mM，较佳地为1.0-2.0 mM。
所述体外蛋白质合成体系中的氨基酸混合物可包括天然或非天然氨基酸，可包括D型或L型氨基酸。代表性的氨基酸包括(但并不限于) 20种天然氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸。每种氨基酸的浓度通常为0.01-0.5mM，较佳地0.02-0.2mM，如0.05、0.06、0.07、0.08 mM。
在优选例中，所述体外蛋白质合成体系还含有聚乙二醇或其类似物。聚乙二醇或其类似物的浓度没有特别限制，通常，聚乙二醇或其类似物的浓度 (w/v)为0.1-8%，较佳地，0.5-4%，更佳地，1-2%，以所述蛋白合成体系的总重量计。代表性的PEG例子包括(但并不限于)：PEG3000，PEG8000，PEG6000和PEG3350。应理解，本发明的体系还可包括其他各种分子量的聚乙二醇(如PEG200、400、1500、2000、4000、6000、8000、10000等)。
在优选例中，所述体外蛋白质合成体系还含有蔗糖。蔗糖的浓度没有特别限制，通常，蔗糖的浓度为0.03-40wt%，较佳地，0.08-10wt%，更佳地，0.1-5wt%，以所述蛋白合成体系的总重量计。
一种特别优选的体外蛋白质合成体系，除了酵母提取物之外，还含有以下组分：22mM，pH为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，30-150 mM醋酸钾，1.0-5.0 mM醋酸镁，1.5-4 mM核苷三磷酸混合物，0.08-0.24 mM的氨基酸混合物，25 mM磷酸肌酸，1.7 mM二硫苏糖醇，0.27mg/mL磷酸肌酸激酶， 1%-4%聚乙二醇，0.5%-2%蔗糖，8-20ng/µl萤火虫荧光素酶的DNA，0.027-0.054 mg/mL T7 RNA聚合酶。
外源蛋白的编码序列(外源DNA)
如本文所用，术语“外源蛋白的编码序列”与“外源DNA”可互换使用，均指外源的用于指导蛋白质合成的DNA分子。通常，所述的DNA分子为线性的或环状的。所述的DNA分子含有编码外源蛋白的序列。
在本发明中，所述的编码外源蛋白的序列的例子包括(但并不限于)：基因组序列、cDNA序列。所述的编码外源蛋白的序列还含有启动子序列、5’非翻译序列、3’非翻译序列。
在本发明中，所述外源DNA的选择没有特别限制，通常，外源DNA选自下组：编码荧光素蛋白、或荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、氨酰tRNA合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶、肌动蛋白、抗体的可变区域的外源DNA、萤光素酶突变体的DNA、或其组合。
外源DNA还可以选自下组：编码α-淀粉酶、肠道菌素A、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、胰岛素前体、干扰素α A、白细胞介素-1β、溶菌酶素、血清白蛋白、单链抗体段(scFV)、甲状腺素运载蛋白、酪氨酸酶、木聚糖酶的外源DNA、或其组合。
在一优选实施方式中，所述外源DNA编码选自下组的蛋白：绿色荧光蛋白(enhanced GFP, eGFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、大肠杆菌β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,LacZ)、人赖氨酸-tRNA合成酶 (Lysine-tRNA synthetase)、人亮氨酸-tRNA合成酶(Leucine-tRNA synthetase)、拟南芥甘油醛3-磷酸脱氢酶 (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、鼠过氧化氢酶 (Catalase)、或其组合。
核酸构建物
本发明提供了一种核酸构建物，所述核酸构建物含有结构如式I所示的核酸序列：
Z1-Z2 (I)
式中，
Z1、Z2分别为用于构成所述构建物的元件；
各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；
Z1为增强子元件，所述增强子元件包括IRES元件；
Z2为外源蛋白的编码序列；
并且，所述Z1来源于酵母。
本发明还提供了一种核酸构建物，所述的构建物具有从5’至3’的式II结构：
Z0-Z1-Z2 (II)
式中，
Z0、Z1、Z2分别为用于构成所述构建物的元件；
各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；
Z0为启动子元件，所述启动子元件选自下组：T7启动子、T3启动子、SP6启动子、或其组合；
Z1为增强子元件，所述增强子元件包括IRES元件；
Z2为外源蛋白的编码序列；
并且，所述Z1来源于酵母。
在本发明中，所述外源蛋白的编码序列的选择没有特别限制，通常，外源蛋白的编码序列选自下组：编码荧光素蛋白、或荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、氨酰tRNA合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶、肌动蛋白、抗体的可变区域的外源DNA、萤光素酶突变体的DNA、或其组合。
外源蛋白的编码序列还可以编码选自下组的蛋白：α-淀粉酶、肠道菌素A、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、胰岛素前体、干扰素α A、白细胞介素-1β、溶菌酶素、血清白蛋白、单链抗体段(scFV)、甲状腺素运载蛋白、酪氨酸酶、木聚糖酶、或其组合。
此外，本发明的所述核酸构建物可以是线性的，也可以是环状的。本发明的所述核酸构建物可以是单链的，也可以是双链的。本发明的所述核酸构建物可以是DNA，也可以是RNA，或DNA/RNA杂合。
在一优选实施方式中，本发明的核酸构建物的序列如SEQ ID NO.:1－7所示。
在另一优选例中，所述的构建物还包括选自下组的元件或其组合：启动子、终止子、poly(A)元件、转运元件、基因靶向元件、筛选标记基因、增强子、抗性基因、转座酶编码基因。
多种选择性标志基因均可应用于本发明，包括但不限于：营养缺陷型标记，抗性标记，报告基因标记。选择性标志的应用对于重组细胞(重组子)的筛选起到作用，使得受体细胞能够与未转化的细胞进行显著区分。营养缺陷型标记是通过转入的标记基因与受体细胞突变基因互补，从而使受体细胞表现野生型生长。抗性标记是指将抗性基因转入受体细胞中，转入的基因使受体细胞在一定的药物浓度下表现抗药性。作为本发明的优选方式，应用抗性标记来实现重组细胞的便捷筛选。
在本发明中，在本发明的酵母体外蛋白质合成体系中应用本发明的核酸构建物，可显著提高蛋白翻译的效率，具体地，应用本发明的核酸构建物所合成的荧光素酶活性的相对光单位值非常高，其中，IRES（如ScNCE102和KlNCE102）的相对光单位值分别是Omega序列的10.4倍和4.7倍。
载体，基因工程细胞
本发明还提供了一种载体或载体组合，所述载体含有本发明的核酸构建物。优选地，所述载体选自：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、或动物细胞载体、穿梭载体；所述的载体为转座子载体。用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。
本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。
本发明还提供了一种基因工程细胞，所述的基因工程细胞含有所述的构建物或载体或载体组合，或所述的基因工程细胞染色体整合有所述的构建物或载体。在另一优选例中，所述的基因工程细胞还包括含有编码转座酶基因的载体或其染色体上整合有转座酶基因。
优选地，所述的基因工程细胞为真核细胞。
在另一优选例中，所述真核细胞，包括(但不限于)：酵母细胞(优选，克鲁维酵母细胞，更优选乳酸克鲁维酵母细胞)。
本发明的构建物或载体，可以用于转化适当的基因工程细胞。基因工程细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等动物细胞，如昆虫细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和基因工程细胞。用重组DNA转化基因工程细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl2法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。
体外高通量的蛋白合成方法
本发明提供了一种体外高通量的蛋白合成方法，包括步骤：
(i) 在酵母体外蛋白合成体系存在下，提供本发明第一方面或第二方面所述的核酸构建物；
(ii) 在适合的条件下，孵育步骤(i)的酵母体外蛋白合成体系一段时间T1，从而合成所述外源蛋白。
在另一优选例中，所述方法还包括：(iii) 任选地从所述酵母体外蛋白合成体系中，分离或检测所述外源蛋白。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次发现，将任选的启动子、酵母来源的IRES和外源蛋白的编码序列作为核酸构建物，应用于本发明的酵母体外蛋白质合成体系中，可显著提高蛋白翻译的效率。
(2)本发明的真核细胞内源性IRESs能够增强酵母体外蛋白质合成体系的翻译起始效率。这些IRESs增强翻译起始的效率不仅超过传统的翻译增强子Omega序列，而且可以应用于乳酸克鲁维酵母来源的体外蛋白质合成体系。其中，ScNCE102和KlNCE102在乳酸克鲁维酵母体外合成体系中起始合成的萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase, Fluc)的相对光单位值(Relative light unit, RLU)分别达到4.41 × 106和1.99 × 106，分别是Omega序列的10.3倍和4.7倍。
(3)与酿酒酵母相比，乳酸克鲁维酵母因其安全性和高效性可以被应用于食品和药品领域蛋白质的生产，加上体外蛋白质合成体系的优点，如适应于高通量的蛋白质合成筛选，合成毒性蛋白质和时间短成本低等，所以乳酸克鲁维酵母细胞来源的体外蛋白质合成体系在相关领域也能够得到广泛的应用。
(4)本发明提供的真核细胞内源性IRESs不仅能够增强酵母体外蛋白质合成体系起始翻译的效率，更主要的是能够增加乳酸克鲁维酵母体外蛋白质合成体系的针对不同蛋白质合成的可能性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人， 分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
如无特别说明，则本发明实施例中所用的材料和试剂均为市售产品。
实施例1: 真核细胞内源性IRESs序列确定
1.1酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中内源性IRESs序列的确定：在酿酒酵母基因组中找出相关的9个基因（表 1）起始密码子(ATG)上游的60个碱基，并作为对应的IRESs的序列，分别命名为ScYMR181c、ScGPR1、ScBOI1、ScFLO8、ScNCE102、ScMSN1、ScGIC1、SceIF4G2和ScPab1。
1.2乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)中内源性IRESs序列的确定：使用Blast从乳酸克鲁维酵母基因组中找出1.1中9个基因的同源基因（表 1），然后确定其起始密码子(ATG)上游的60个碱基，并作为对应的IRESs序列，分别命名为KlYMR181c、KlGPR1、KlBOI1、KlFLO8、KlNCE102、KlMSN1、KlGIC1、KleIF4G和KlPab1。因为乳酸克鲁维酵母基因组中只找到了一个SceIF4G2的同源基因，所以只能使用该基因的起始密码子(ATG)上游的60个碱基作为KleIF4G的序列。
表 1. 酿酒酵母和乳酸克鲁维酵母中的相关基因
基因名称 开放阅读框(ORFs)
ScYMR181c YMR181c
ScGPR1 YDL035c
ScBOI1 YBL085w
ScFLO8 YER109c
ScNCE102 YPR149w
ScMSN1 YOL116w
ScGIC1 YHR061c
SceIF4G2 YGL049c
ScPab1 YER165w
KlYMR181c KLLA0C16027g
KlGPR1 KLLA0F24750g
KlBOI1 KLLA0E20879g
KlFLO8 KLLA0E20725g
KlNCE102 KLLA0D16280g
KlMSN1 KLLA0A07337g
KlGIC1 KLLA0C14762g
KleIF4G KLLA0A04730g
KlPab1 KLLA0C17600g
实施例2:含有真核细胞内源性IRESs的体外蛋白质合成体系质粒的构建
2.1 全基因合成：将乳酸克鲁维酵母来源的9个IRESs的序列串联起来，并使用全基因合成的方法进行合成。
2.2 质粒的构建：对于酿酒酵母来源的9个IRESs (ScIRESs)使用一对长引物，通过PCR的方法将IRESs的序列插入已有质粒Omega-Fluc (SEQ ID NO. 19)，替换Omega序列，分别构建含有酿酒酵母IRESs的质粒，名称及序列号都列在表2中。
对于乳酸克鲁维酵母来源的9个IRESs (KlIRESs)则使用两对引物，后缀为1f和1b的引物从合成的DNA片段上分别扩增相应IRESs片段，后缀为2f和2b的引物则用于对Omega-Fluc质粒的PCR扩增。在最终构建的质粒中，9个IRESs代替了Omega序列。质粒名称分别为：pScYMR181c-Fluc、pScGPR1-Fluc、pScBOI1-Fluc、pScFLO8-Fluc、pScNCE102-Fluc、pScMSN1-Fluc、pScGIC1-Fluc、pSceIF4G2-Fluc、pScPab1-Fluc、pKlYMR181c-Fluc、pKlGPR1-Fluc、pKlBOI1-Fluc、pKlFLO8-Fluc、pKlNCE102-Fluc、pKlMSN1-Fluc、pKlGIC1-Fluc、pKleIF4G-Fluc、pKlPab1-Fluc。
具体构建过程如下：
对于ScIRESs质粒，使用一对引物（表2）进行PCR扩增，然后取20 µL扩增产物；对于KlIRESs，使用两对引物分别进行PCR扩增，并各取10 µL扩增产物进行混合；向20 µL 扩增产物中加入1 µL Dpn I，37℃孵育6 h；将DpnI 处理后产物4 µL加入50 µL DH5α感受态细胞中，冰上放置30 min，42℃热激45 s后，冰上放置3 min，加入200 µL LB 液体培养基 37℃ 振荡培养4 h，涂布于含有Amp抗生素的LB固体培养基上过夜培养；挑取6个单克隆进行扩大培养后，进行测序确认正确后，提取质粒保存。
表2. 引物序列
实施例3:真核细胞内源性IRESs在酵母体外蛋白质合成体系中的应用
3.1 利用PCR的方法，并使用引物T7_pET21a_F: CGCGAAATTAATACGACTCACTATAGG(SEQID NO.:62)和T7ter_pET21a_R: TCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG(SEQ ID NO.:63)将所有质粒中位于T7转录起始序列和终止序列之间包含内源性IRESs的片段和Omega-Fluc片段进行扩增。
并将扩增得到的DNA片段用乙醇沉淀的方法进行纯化和富集：向PCR产物中加入1/10体积的3 M醋酸钠 (pH5.2)，然后再加入2.5-3倍体积(该体积为加入醋酸钠之后的体积)的95% 的乙醇，置于冰上孵育15 min；室温条件下以高于14000 g的速度离心30 min，弃掉上清；使用70% 乙醇进行清洗，然后再离心15 min，弃掉上清，并用超纯水将沉淀溶解，测定DNA浓度。
3.2 按照使用说明，将纯化的DNA片段加入到自制的乳酸克鲁维酵母体外蛋白质合成体系中。并将上述反应体系置于25-30 ℃的环境中，静置孵育约2-6 h。反应结束后，在96孔白板或者384孔白板中加入等体积的Fluc底物荧光素(luciferin)，立即放置于Envision 2120多功能酶标仪(Perkin Elmer)，读数，检测Fluc活性，相对光单位值(Relative Light Unit, RLU) 作为活性单位，如图1所示。
3.3 使用不含有真核细胞内源性IRESs序列的DNA片段(Omega-Fluc)作为对照，每个样品均设计三组独立实验。
实验结果
1.真核细胞内源性IRESs序列的确定
9个ScIRESs和9个KlIRESs如实施例2所示。考虑到这些IRESs的序列都是A-rich的，而且A-rich的序列对于翻译起始是关键的，为了保留尽可能多的A，选取的序列长度都大于60bp，进一步筛选了7个IRESs序列，具体的长度和相对于Omega的比例列在表3中。
表 3. ScIRESs和KlIRESs的序列长度和相对于Omega的比例
IRESs 序列长度(bp) 相对于Omega的比例
ScGPR1 65 2.55
ScFLO8 61 1.88
ScNCE102 61 10.42
ScMSN1 61 1.07
KlFLO8 61 1.94
KlNCE102 61 4.70
KlMSN1 62 2.71
2.体外蛋白质合成体系质粒的构建
经过多次尝试，最终构建成功14个体外蛋白质合成体系质粒，包括所有9个含有ScIRESs的质粒和5个含有KlIRESs的质粒。
3.真核细胞内源性IRESs在酵母体外蛋白质合成体系中的应用
如图1所示，筛选的7个真核细胞内源性IRESs在酵母体外蛋白质合成体系中引起萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase, Fluc)发出的相对光单位值(Relative Light Units,RLU)均达到或者超过Omega序列，包括ScMSN1、ScNCE102、ScGPR1、ScFLO8、KlNCE102、KlMSN1和KlFLO8（表3），其中最高的为ScNCE102，相对光单位值达到了4.41 × 106，是Omega序列的10.4倍（Omega序列的相对光单位值为422，939）。KlNCE102的相对光单位值也达到了1.99× 106，是Omega序列的4.7倍。
因为处于检测仪器相对光单位值RLU与蛋白质浓度关系的线性范围内，活性最高的ScNCE102的相对光单位值是Ω序列的10.4 倍，表明ScNCE102能够增强大约10.4 倍的蛋白质合成。
本发明结果表明：真核细胞内源性的IRESs可以增强蛋白质合成效率，并能够应用于酵母体外蛋白质合成体系中，起始蛋白质合成的效率能够达到或者超过常用的Omega序列。其中ScNCE102和KlNCE102起始蛋白质合成的量是Omega序列的10.4倍和4.7倍，增强了酵母体外蛋白质合成体系翻译蛋白质的效率，增加了乳酸克鲁维酵母体外合成体系进行蛋白质合成起始翻译元件的选择性，极大增强了乳酸克鲁维酵母体外蛋白质合成体系的可用性。
并且，本发明的研究还发现，将结构简单、效率很高的强启动子（如T7启动子、T3启动子、SP6启动子）与本发明的IRES元件（如ScNCE102）组合，也可获得非常高的蛋白合成效率。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (11)

1.一种核酸构建物，其特征在于，所述的构建物具有从5’至3’的式I结构：
Z1-Z2 (I)
式中，
Z1、Z2分别为用于构成所述构建物的元件；
各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；
Z1为增强子元件，所述增强子元件包括IRES元件；
Z2为外源蛋白的编码序列；
并且，所述Z1来源于酵母。
2.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述IRES元件选自下组：ScGPR1、ScFLO8、ScNCE102、ScMSN1、KlFLO8、KlNCE102、KlMSN1、或其组合。
3.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述酵母选自下组：酿酒酵母、克鲁维酵母属酵母、或其组合。
4.一种核酸构建物，其特征在于，所述的构建物具有从5’至3’的式II结构：
Z0-Z1-Z2 (II)
式中，
Z0、Z1、Z2分别为用于构成所述构建物的元件；
各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；
Z0为启动子元件，所述启动子元件选自下组：T7启动子、T3启动子、SP6启动子、或其组合；
Z1为增强子元件，所述增强子元件包括IRES元件；
Z2为外源蛋白的编码序列；
并且，所述Z1来源于酵母。
5.一种载体或载体组合，其特征在于，所述的载体或载体组合含有权利要求1或权利要求4所述的核酸构建物。
6.一种基因工程细胞，其特征在于，所述基因工程细胞的基因组的一个或多个位点整合有本权利要求1或权利要求4所述的构建物，或者所述基因工程细胞中含有权利要求5所述的载体或载体组合。
7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含的试剂选自下组中的一种或多种：
(a) 权利要求1或权利要求4所述的构建物；
(b) 权利要求5所述的载体或载体组合；和
(c) 权利要求6所述的基因工程细胞。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括(d)酵母体外蛋白合成体系。
9.一种如权利要求1或权利要求4所述的构建物、权利要求5所述的载体或载体组合、权利要求6所述的基因工程细胞或权利要求7所述试剂盒的用途，其特征在于，用于进行高通量的体外蛋白合成。
10.一种体外高通量的外源蛋白合成方法，其特征在于，包括步骤：
(i) 在酵母体外蛋白合成体系存在下，提供权利要求1或4所述的核酸构建物；
(ii) 在适合的条件下，孵育步骤(i)的酵母体外蛋白合成体系一段时间T1，从而合成所述外源蛋白。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：(iii) 任选地从所述酵母体外蛋白合成体系中，分离或检测所述外源蛋白。
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