CN115193419A - 磁性微球及其制备方法、应用和诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种磁性微球及其制备方法、应用和诊断试剂盒，其中的磁性微球包括磁性聚合物基球；聚合物包覆层，包覆在所述磁性聚合物基球的表面，所述聚合物包覆层的表面连接有主链长度不同的第一碳链和第二碳链，所述第一碳链的主链末端含有磺酰系基团，所述第二碳链的主链末端含有羟基。通过将磺酰系基团和羟基在磁性微球表明形成错层结构分布，可有利于磺酰系基团和羟基在磁性微球表面的均匀分布，提高磁性微球表面的亲水性；并且磺酰系基团在磁性微球表面的分布更均匀，可提高磺酰系基团对特异性蛋白和抗体的吸附效率，降低对非目标蛋白或抗体的非特异性吸附。

Description

磁性微球及其制备方法、应用和诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及聚合物合成技术领域，特别是涉及一种磁性微球及其制备方法、应用和诊断试剂盒。

背景技术

磁性微球广泛应用于生物医学领域，如药物载体、蛋白纯化、细胞分离、免疫沉淀以及化学发光免疫检测等方面。磁性微球表面的功能基团可通过吸附结合与共价结合两种形式与抗原或者抗体结合，吸附结合依靠磁性微球表面对抗体的非特异性吸附力，而共价结合依靠磁性微球表面的功能基团与抗体共价反应。

目前，磺酰系基团是常用的磁性微球基团，但是，磁性微球表面的磺酰系基团易对非目标抗原或抗体产生非特异性吸附，影响蛋白的分离纯化或者化学发光检测的本底值偏高。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够降低磺酰系基团对非目标蛋白或抗体的吸附的磁性微球及其制备方法、应用和诊断试剂盒。

本申请的第一方面提供了一种磁性微球，包括：

磁性聚合物基球；

聚合物包覆层，包覆在所述磁性聚合物基球的表面，所述聚合物包覆层的表面连接有主链长度不同的第一碳链和第二碳链，所述第一碳链的主链末端含有磺酰系基团，所述第二碳链的主链末端含有羟基。

在一些实施例中，所述第一碳链的主链中含有的碳原子数记为a，则所述第一碳链的主链中含有的碳原子数满足：a＞100；

所述第二碳链的主链中含有的碳原子数记为b，则所述第二碳链的主链中含有的碳原子数满足：2≤b≤100。

在一些实施例中，所述第一碳链的支链末端和所述第二碳链的支链末端各自独立地含有羟基。

在一些实施例中，所述聚合物包覆层包括丙烯酸酯类单体单元和缩水甘油醚类单体单元中的一种或多种。

在一些实施例中，所述丙烯酸酯类单体单元对应的单体包括丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯、丙烯酸异辛酯、甲基丙烯酸异辛酯、丙烯酸环氧丙酯、丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、二乙二醇二甲基丙烯酸酯、3-(二甲氨基)丙烯酸丙酯、3-(二甲氨基)丙烯酸甲酯、和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯中的一种或多种。

在一些实施例中，所述缩水甘油醚类单体单元对应的单体包括间苯二酚二缩水甘油醚、正丁基缩水甘油醚、叔丁基缩水甘油基醚、烯丙基缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、1,6-已二醇二缩水甘油醚、二缩水甘油醚、甘油二缩水甘油基醚中的一种或多种。

在一些实施例中，所述磁性聚合物基球包括聚合物内核以及包覆在所述聚合物内核的表面的聚合物中间层，所述磁性聚合物基球带有磁性材料。

在一些实施例中，所述磁性聚合物基球具有超顺磁性。

在一些实施例中，所述磁性材料位于所述聚合物内核的表面或位于所述聚合物中间层内。

在一些实施例中，所述磁性材料包括Fe₃O₄、γ-Fe₂O₃或MFe₂O₄中的一种或多种，所述MFe₂O₄中的M为Co、Mg、Ni、Mn或Zn中的一种或多种。

在一些实施例中，所述聚合物中间层带有功能基团，所述聚合物中间层带有的功能基团包括羟基、氨基、羧基、巯基、醛基、环氧基和对甲苯磺酰基中的一种或多种。

在一些实施例中，所述聚合物内核包括聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球、聚乳酸微球和聚苯乙烯-二乙烯基苯微球中的一种或多种。

在一些实施例中，所述磁性聚合物基球还包括包覆在所述聚合物中间层的表面的聚合物外层。

在一些实施例中，所述聚合物外层带有功能基团，所述聚合物外层带有的功能基团包括羟基、氨基、羧基、巯基、醛基、环氧基和对甲苯磺酰基中的一种或多种。

本申请的第二方面提供了一种磁性微球的制备方法，包括如下步骤：

将磁性聚合物基球与包覆层单体发生第一反应，生成第一中间体；

将所述第一中间体与第一碳链长度的二醇类单体和第二碳链长度的二醇类单体发生第二反应，生成第二中间体；

将所述第二中间体与磺酰氯类单体发生第三反应，生成磁性微球。

在一些实施例中，进行所述第一反应时，包括如下条件中的至少一项：

（1）所述磁性聚合物基球与所述包覆层单体的用量比为1:(1~10);

（2）所述包覆层单体包括丙烯酸酯类单体和缩水甘油醚类单体中的一种或多种；

（3）采用引发剂引发所述第一反应，所述引发剂与所述磁性聚合物基球的用量比为(0.5~7):100；

其中，所述引发剂包括过氧化二苯甲酰、过氧化二异丙苯、过氧化十二酰、过氧化二叔丁基、偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈和偶氮二异丁酸二甲酯中的一种或多种；

（4）进行所述第一反应时采用的反应溶剂包括无水乙醇、四氢呋喃、乙酸乙酯、异丙醇、甲醇、正己烷和二氧六环中的一种或多种；

（5）进行所述第一反应时的反应温度为60~75℃，反应时间为10~24h。

在一些实施例中，进行所述第二反应时，包括如下条件中的至少一项：

（1）所述第二碳链长度的二醇类单体与所述磁性聚合物基球的用量比为(1~10):1，所述第二碳链长度的二醇类单体与所述第一碳链长度的二醇类单体的用量比为(0.1~10):1;

（2）所述第一碳链长度的二醇类单体包括聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000和聚乙二醇6000中的一种或多种；

（3）所述第二碳链长度的二醇类单体包括乙二醇、二乙二醇、四乙二醇、六乙二醇、甘露醇、2,5-己二醇、1,6己二醇和1,10-癸二醇中的一种或多种；

（4）采用催化剂催化所述第二反应；

所述催化剂与所述磁性聚合物基球的用量比为(0.2~3):1;

所述催化剂包括三氟化硼甲醇、三氟化硼二丁基醚、三氟化硼二甲醚、三氟化硼哌啶、三氟化硼异丙醇、三氟化硼丙醇和三氟化硼乙醚中的一种或多种；

（5）所述第二反应在含有有机碱的反应溶剂中进行，所述有机碱与所述磁性聚合物基球的用量比为(0.1~3):1；

所述有机碱包括乙胺、三乙胺、二异丙基胺、三乙醇胺、吡啶、甲醇钾、甲醇钠、乙醇钠、乙醇钾和叔丁醇钾中的一种或多种；

进行所述第二反应时采用的反应溶剂包括无水乙醇、四氢呋喃、乙酸乙酯、异丙醇、甲醇、正己烷和二氧六环中的一种或多种；

（6）进行所述第二反应时的反应温度为50~80℃，反应时间为8~20h。

在一些实施例中，进行所述第三反应时，包括如下条件中的至少一项：

（1）所述磺酰氯类单体与所述磁性聚合物基球的用量比为(0.5~5):1；

（2）所述磺酰氯类单体包括甲基磺酰氯、对甲苯磺酰氯、对甲氧基苯磺酰氯、3-甲氧基苯磺酰氯、苯磺酰氯、4-氟苯基磺酰氯、环己基甲烷磺酰氯、2,2,2-三氟乙基磺酰氯中的一种或多种；

（3）采用反应促进剂促进所述第三反应的进行；

所述反应促进剂与所述磁性聚合物基球的用量比为(0.5~5):1；

所述反应促进剂包括三乙胺、乙二胺、苯胺、二苯胺、三苯胺、二甲基胺、吡啶和甲基吡啶中的一种或多种；

（4）进行所述第三反应时采用的反应溶剂包括丙酮、四氢呋喃、乙腈和丁酮中的一种或多种；

（5）进行所述第三反应时的反应温度为30~50℃，反应时间为12~36h。

在一些实施例中，所述磁性聚合物基球的表面带有双键基团。

本申请的第三方面提供了一种本申请第一方面的磁性微球在制备诊断试剂盒中的应用。

本申请的第四方面提供了一种诊断试剂盒，包括本申请第一方面的磁性微球或如本申请第二方面的方法制备的磁性微球。

上述提及的磁性微球及其制备方法、应用和诊断试剂盒，通过在聚合物包覆层的表面设置主链长度不同的第一碳链和第二碳链，第一碳链的主链末端含有疏水性的磺酰系基团，第二碳链的主链末端含有亲水性的羟基，且由于第一碳链的主链长度和第二碳链的主链长度不同，磺酰系基团和羟基形成错层结构分布，可有利于磺酰系基团和羟基在磁性微球表面的均匀分布，提高磁性微球表面的亲水性；并且磺酰系基团在磁性微球表面的分布更均匀，可提高磺酰系基团对特异性蛋白和抗体的吸附效率，即可有更多的磺酰系基团用于吸附特异性蛋白或抗体，则能降低后续应用中对非目标蛋白或抗体的非特异性吸附。

附图说明

图1为实施例1制得的磁性微球的SEM扫描电镜图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本文中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本文中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。

在本文中，涉及数据范围的单位，如果仅在右端点后带有单位，则表示左端点和右端点的单位是相同的。比如，12~36 h表示左端点“12”和右端点“36”的单位都是h（小时）。

本文仅具体地公开了一些数值范围。然而，任意下限可以与任意上限组合形成未明确记载的范围；以及任意下限可以与其它下限组合形成未明确记载的范围，同样任意上限可以与任意其它上限组合形成未明确记载的范围。此外，每个单独公开的点或单个数值自身可以作为下限或上限与任意其它点或单个数值组合或与其它下限或上限组合形成未明确记载的范围。

本文中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。

本文中，“第一”、“第二”、“第三”等仅起到非穷举式的列举描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。

本文中，“多种”的含义是至少两种，例如两种，三种等，除非另有明确具体的限定。

如果没有特别的说明，本文的所有实施方式以及可选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。

磁性微球广泛应用于生物医学领域，如药物载体、蛋白纯化、细胞分离、免疫沉淀以及化学发光免疫检测等方面。磁性微球是全自动化学发光检测试剂必不可少的原料，磁性微球表面的功能基团可通过吸附结合与共价结合两种形式与抗原或者抗体结合，吸附结合依靠磁性微球表面对抗体的非特异性吸附力，而共价结合依靠磁性微球表面的功能基团与抗体共价反应。

目前，磺酰系基团是常用的磁性微球基团，但是，磁性微球表面的磺酰系基团易对非目标抗原或抗体产生非特异性吸附，影响蛋白的分离纯化或者化学发光检测的本底值偏高。本申请发明人创新性地发现，相关技术中，磺酰系基团属于相对疏水性基团，即使磁性微球表面含有除了磺酰系基团之外的其他亲水性基团，但是由于磺酰系基团和亲水性基团位于同一层面，很难控制磁性微球表面的磺酰系基团和亲水性基团均匀分布，磁性微球表面可能整体呈现疏水性；并且可能出现磁性微球表面部分区域的磺酰系基团含量高于其他区域的磺酰系基团含量，由于空间位阻作用导致含量高的区域内的磺酰系基团对目标抗原或抗体的吸附效率低，在后续应用中，未吸附目标抗原或抗体的磺酰系基团易对非目标抗原或抗体产生非特异性吸附。

相关技术中，制备磁性微球时，反应条件较为苛刻，对生产设备要求较高，制备难度大。

此外，公开号为CN108129614A的中国专利申请中制备的磁性微球，由于微球表面的功能基团均处于同一层面，当微球表面带有疏水性的磺酰系基团时，亦会出现由于微球表面的磺酰系基团分布不均匀而引起的对于非目标抗体或抗原的非特异性吸附问题，本申请也可用于解决该专利申请中存在的问题。

为了解决上述问题，本申请提供了一种磁性微球，包括：磁性聚合物基球和聚合物包覆层；聚合物包覆层包覆在磁性聚合物基球的表面，聚合物包覆层的表面连接有主链长度不同的第一碳链和第二碳链，第一碳链的主链末端含有磺酰系基团，第二碳链的主链末端含有羟基。

需要说明的是，磺酰系基团具有疏水性，羟基具有亲水性，磁性微球携带的磺酰系基团和羟基可提高磁性微球表面整体的亲水性。

可理解，通过在聚合物包覆层的表面设置主链长度不同的第一碳链和第二碳链，第一碳链的主链末端含有疏水性的磺酰系基团，第二碳链的主链末端含有亲水性的羟基，且由于第一碳链的主链长度和第二碳链的主链长度不同，磺酰系基团和羟基形成错层结构分布，可有利于磺酰系基团和羟基在磁性微球表面的均匀分布，提高磁性微球表面的亲水性；并且磺酰系基团在磁性微球表面的分布更均匀，可提高磺酰系基团对特异性蛋白和抗体的吸附效率，即可有更多的磺酰系基团用于吸附特异性蛋白或抗体，则能降低后续应用中对非目标蛋白或抗体的吸附。

在一些实施方式中，第一碳链的主链中含有的碳原子数记为a，则第一碳链的主链中含有的碳原子数满足：a＞100；例如，a可以为150、200、400、600、800、1000或1200等，具体不做限定。第二碳链的主链中含有的碳原子数记为b，则第二碳链的主链中含有的碳原子数满足：2≤b≤100；例如，b可以但不限定为2、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100等。

在一些实施方式中，第一碳链的支链末端和第二碳链的支链末端各自独立地含有羟基。

在一些实施方式中，聚合物包覆层包括丙烯酸酯类单体单元和缩水甘油醚类单体单元中的一种或多种。

在其中的一些实施方式中，丙烯酸酯类单体单元对应的单体包括丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯、丙烯酸异辛酯、甲基丙烯酸异辛酯、丙烯酸环氧丙酯、丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、二乙二醇二甲基丙烯酸酯、3-(二甲氨基)丙烯酸丙酯、3-(二甲氨基)丙烯酸甲酯、和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯中的一种或多种。进一步地，丙烯酸酯类单体单元对应的单体包括丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸环氧丙酯、丙烯酸环氧丙酯、丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和二乙二醇二甲基丙烯酸酯中的一种或多种。

在其中的一些实施方式中，缩水甘油醚类单体单元对应的单体包括间苯二酚二缩水甘油醚、正丁基缩水甘油醚、叔丁基缩水甘油基醚、烯丙基缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、1,6-已二醇二缩水甘油醚、二缩水甘油醚、甘油二缩水甘油基醚中的一种或多种。进一步地，缩水甘油醚类单体单元对应的单体包括烯丙基缩水甘油醚。

在一些实施方式中，磁性聚合物基球包括聚合物内核以及包覆在聚合物内核的表面的聚合物中间层，磁性聚合物基球带有磁性材料。

在一些实施方式中，磁性聚合物基球具有超顺磁性；当磁性聚合物基球具有超顺磁性时，则基于磁性聚合物基球制备得到的磁性微球也具有超顺磁性，便于在外加磁场的作用下，实现吸附特异性蛋白或抗体后的磁性微球的分离，从而实现蛋白或抗体的分离。

在一些实施方式中，磁性材料位于聚合物内核的表面或位于聚合物中间层内。当磁性材料位于聚合物内核的表面时，在制备磁性聚合物基球时，可通过物理作用、络合作用或电荷作用实现将磁性材料加载在聚合物内核的表面。当磁性材料位于聚合物中间层内时，在制备磁性聚合物基球时，可首先在聚合物内核的表面形成聚合物中间层，然后在聚合物中间层的表面沉积磁性材料。

在一些实施方式中，磁性材料包括Fe₃O₄、γ-Fe₂O₃或MFe₂O₄中的一种或多种，MFe₂O₄中的M为Co、Mg、Ni、Mn或Zn中的一种或多种。

在一些实施方式中，聚合物中间层带有功能基团，聚合物中间层带有的功能基团包括羟基、氨基、羧基、巯基、醛基、环氧基和对甲苯磺酰基中的一种或多种。

在一些实施方式中，聚合物内核包括聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球、聚乳酸微球和聚苯乙烯-二乙烯基苯微球中的一种或多种。

在一些实施方式中，磁性聚合物基球还包括包覆在聚合物中间层的表面的聚合物外层。进一步地，聚合物外层带有功能基团，聚合物外层带有的功能基团包括羟基、氨基、羧基、巯基、醛基、环氧基和对甲苯磺酰基中的一种或多种。

本申请还提供了一种磁性微球的制备方法，包括如下步骤：将磁性聚合物基球与包覆层单体发生第一反应，生成第一中间体；将第一中间体与第一碳链长度的二醇类单体和第二碳链长度的二醇类单体发生第二反应，生成第二中间体；将第二中间体与磺酰氯类单体发生第三反应，生成磁性微球。

需要说明的是，用于制备磁性微球的磁性聚合物基球可以为带有磁性材料的聚合物内核；也可以由聚合物内核及包覆在聚合物内核表面的聚合物中间层形成，磁性材料位于聚合物内核表面或聚合物中间层内；还可以由聚合物内核、包覆在聚合物内核表面的聚合物中间层以及包覆在聚合物中间层表面的聚合物外层形成。

在制备磁性微球之前，需要首先获得磁性聚合物基球，若采用带有磁性材料的聚合物内核作为磁性微球，可采用物理作用、络合作用或电荷作用实现将磁性材料加载在聚合物内核的表面，具体不做限定。

若采用聚合物内核以及包覆在聚合物内核表面的聚合物中间层形成的微球结构作为磁性聚合物基球，可以在前述得到的带有磁性材料的聚合物内核的表面上直接形成聚合物中间层，制得聚合物基球；也可以首先在聚合物内核的表面上形成聚合物中间层，然后在聚合物中间层的表面上沉积磁性材料，形成聚合物基球，具体不做限定。

若采用聚合物内核、包覆在聚合物内核表面的聚合物中间层以及包覆在聚合物中间层表面的聚合物外层形成的微球结构作为磁性聚合物基球，可以在前述得到的聚合物中间层的表面上直接聚合形成包覆聚合物中间层的聚合物外层，具体不做限定。

在一些实施方式中，磁性聚合物基球的表面带有双键基团；进一步地，磁性聚合物基球的表面带有悬挂的双键基团；需要说明的是，悬挂的双键基团是指伸展出磁性聚合物基球的表层外部的双键，磁性聚合物基球的表面带有悬挂的双键基团，可降低在磁性聚合物基球的表面形成带有环氧基团的聚合物包覆层的难度。

获得磁性聚合物基球后，首先在磁性聚合物基球的表面形成带有环氧基团的聚合物包覆层，磁性聚合物基球以及包覆在其表面的带有环氧基团的聚合物包覆层即为第一中间体。

进行第一反应时，磁性聚合物基球与包覆层单体的用量比为1:(1~10);例如，可以为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10等，具体不做限定。进一步地，包覆层单体包括丙烯酸酯类单体和缩水甘油醚类单体中的一种或多种；可选地，丙烯酸酯类单体包括丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯、丙烯酸异辛酯、甲基丙烯酸异辛酯、丙烯酸环氧丙酯、丙烯酸环氧丙酯、丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、二乙二醇二甲基丙烯酸酯、3-(二甲氨基)丙烯酸丙酯、3-(二甲氨基)丙烯酸甲酯、和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯中的一种或多种；可选地，缩水甘油醚类单体包括间苯二酚二缩水甘油醚、正丁基缩水甘油醚、叔丁基缩水甘油基醚、烯丙基缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、1,6-已二醇二缩水甘油醚、二缩水甘油醚、甘油二缩水甘油基醚中的一种或多种。

采用包覆层单体在磁性聚合物基球的表面形成聚合物包覆层时，需要引发剂引发包覆层单体之间发生聚合；在一些实施方式中，采用引发剂引发第一反应，引发剂与磁性聚合物基球的用量比为(0.5~7):100；例如，可以为0.5:100、1:100、2:100、3:100、4:100、5:100、6:100或7:100等，具体不做限定。进一步地，引发剂包括过氧化二苯甲酰、过氧化二异丙苯、过氧化十二酰、过氧化二叔丁基、偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈和偶氮二异丁酸二甲酯中的一种或多种。更进一步地，引发剂包括过氧化二苯甲酰、偶氮二异丁腈和偶氮二异庚腈中的一种或多种。

在一些实施方式中，进行第一反应时采用的反应溶剂包括无水乙醇、四氢呋喃、乙酸乙酯、异丙醇、甲醇、正己烷和二氧六环中的一种或多种。

进行第一反应时的反应温度为60~75℃，例如，可以为60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃或75℃等，具体不做限定。反应时间为10~24h，例如，可以为10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h或24h等，具体不做限定。

作为示例，进行第一反应时，取磁性聚合物基球，采用反应溶剂将磁性聚合物基球分散，把磁性聚合物基球转移到反应容器中，加入引发剂，加入包覆层单体，通入氮气保护，在60~75℃下反应10~24h。

第一反应结束后，采用无水乙醇、四氢呋喃、乙酸乙酯、异丙醇、甲醇、正己烷和二氧六环中的一种溶剂或多种溶剂的混合液，多次清洗第一中间体，清洗结束后，采用第一中间体进行第二反应。

进行第二反应时，第二碳链长度的二醇类单体与磁性聚合物基球的用量比为(1~10):1，例如，可以为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10等，具体不做限定。第二碳链长度的二醇类单体与第一碳链长度的二醇类单体的用量比为(0.1~10):1，例如，可以为0.1:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10等，具体不做限定。

进行第二反应时，第一碳链长度的二醇类单体包括聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000和聚乙二醇6000中的一种或多种；较佳地，第一碳链长度的二醇类单体的中的两个羟基分别位于碳链的首端和末端；进一步地，第一碳链长度的二醇类单体包括聚乙二醇600和聚乙二醇2000中的一种或多种。

进行第二反应时，第二碳链长度的二醇类单体包括乙二醇、二乙二醇、四乙二醇、六乙二醇、甘露醇、2,5-己二醇、1,6己二醇和1,10-癸二醇中的一种或多种；较佳地，第二碳链长度的二醇类单体中的两个羟基分别位于碳链的首端和末端；进一步地，第二碳链长度的二醇类单体包括二乙二醇和四乙二醇中的一种或多种。

需要说明的是，进行第二反应时，第一碳链长度的二醇类单体和第二碳链长度的二醇类单体与第一中间体的聚合物包覆层表面的环氧基团发生反应，二醇类单体化学键合到第一中间体表面，从而在聚合物包覆层表面衍生出羟基，形成第二中间体；并且由于第一碳链长度的二醇类单体和第二碳链长度的二醇类单体的碳链长度不同，则在聚合物包覆层表面形成错层结构的羟基，再后续加入磺酰氯类单体后可由于空间位阻作用，只有远离聚合物包覆层表面的羟基与磺酰氯类单体发生反应生成磺酰系基团，从而实现磺酰系基团的均匀分布。

为了降低反应的难度或加快反应的进行，可采用催化剂催化第二反应的进行。在一些实施方式中，采用催化剂催化第二反应，催化剂与磁性聚合物基球的用量比为(0.2~3):1，例如，可以为0.2:1、0.5:1、0.7:1、1:1、1.3:1、1.5:1、1.8:1、2:1、2.2:1、2.5:1、2.7:1或3:1等，具体不做限定。

在一些实施方式中，催化剂包括三氟化硼甲醇、三氟化硼二丁基醚、三氟化硼二甲醚、三氟化硼哌啶、三氟化硼异丙醇、三氟化硼丙醇和三氟化硼乙醚中的一种或多种；进一步地，催化剂包括三氟化硼二甲醚和三氟化硼乙醚中的一种或多种。

需要在碱性环境下进行二醇类单体与第一中间体表面的环氧基团之间的反应。在一些实施方式中，第二反应在含有有机碱的反应溶剂中进行，有机碱与磁性聚合物基球的用量比为(0.1~3):1，例如，可以为0.1:1、0.3:1、0.5:1、0.8:1、1:1、1.2:1、1.5:1、1.7:1、2:1、2.3:1、2.5:1、2.8:1或3:1等，具体不做限定。在其中一些实施方式中，有机碱包括乙胺、三乙胺、二异丙基胺、三乙醇胺、吡啶、甲醇钾、甲醇钠、乙醇钠、乙醇钾和叔丁醇钾中的一种或多种。进一步地，有机碱包括三乙胺和吡啶中的一种或多种。可选地，进行第二反应时采用的反应溶剂包括无水乙醇、四氢呋喃、乙酸乙酯、异丙醇、甲醇、正己烷和二氧六环中的一种或多种。

在一些实施方式中，进行第二反应时的反应温度为50~80℃，例如，可以为50℃、52℃、55℃、57℃、60℃、63℃、65℃、68℃、70℃、73℃、75℃、77℃或80℃等，具体不做限定。反应时间为8~20h，例如，可以为8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h或20h等，具体不做限定。

第二反应结束后，获得第二中间体，并采用无水乙醇、甲醇、异丙醇、四氢呋喃和乙酸乙酯中的一种溶剂或多种溶剂的混合液对第二中间体进行多次清洗，再用水对第二中间体进行多次清洗。若第二中间体未立即用于后续反应，可采用水分散第二中间体，放入2~8℃的冰箱保存。

需要说明的是，第二中间体具有主链长度不同的第一碳链和第二碳链，第一碳链和第二碳链的主链末端均含有羟基，且第一碳链的主链末端的羟基与第二碳链的主链末端的羟基形成错层结构，利于后续磺酰氯类单体与第二中间体中携带的羟基进行选择性反应。并且第一碳链和第二碳链分别可具有支链。

作为示例，进行第二反应时，首先采用溶剂分散第一中间体，分散后加入反应容器中，再加入有机碱，加入第二碳链长度的二醇类单体，加入第一碳链长度的二醇类单体，在氮气气氛下，于50~80℃采用恒压滴液漏斗缓慢滴加反应催化剂，滴加时间在30~60min，反应时间为8~20h，反应结束后获得第二中间体，并对第二中间体进行清洗。

采用第二中间体进行第三反应前，首先采用无水乙醇、甲醇和异丙醇中的一种对第二中间体进行分散置换三次，然后再采用丙酮、四氢呋喃、乙腈和丁酮中的一种分散置换三次后，进行第三反应。

在一些实施方式中，进行第三反应时，磺酰氯类单体与所述磁性聚合物基球的用量比为(0.5~5):1；例如，可以为0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1或5:1等，具体不做限定。

在一些实施方式中，进行第三反应时，磺酰氯类单体包括甲基磺酰氯、对甲苯磺酰氯、对甲氧基苯磺酰氯、3-甲氧基苯磺酰氯、苯磺酰氯、4-氟苯基磺酰氯、环己基甲烷磺酰氯和2,2,2-三氟乙基磺酰氯中的一种或多种；进一步地，磺酰氯类单体包括对甲苯磺酰氯和对甲氧基苯磺酰氯中的一种或多种。

为了降低第三反应的进行或加快第三反应的速率，可采用催化剂或促进剂促进反应的进行。在一些实施方式中，采用反应促进剂促进第三反应的进行；反应促进剂包括三乙胺、乙二胺、苯胺、二苯胺、三苯胺、二甲基胺、吡啶和甲基吡啶中的一种或多种；进一步地，反应促进剂包括三乙胺和吡啶中的一种或多种。反应促进剂与所述磁性聚合物基球的用量比为(0.5~5):1；例如，可以为0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1或5:1等，具体不做限定。

在一些实施方式中，进行第三反应时采用的反应溶剂包括丙酮、四氢呋喃、乙腈和丁酮中的一种或多种。

在一些实施方式中，进行所述第三反应时的反应温度为30~50℃，例如，可以为30℃、32℃、35℃、37℃、40℃、43℃、45℃、47℃或50℃等，具体不做限定。反应时间为12~36h，例如，可以为12h、15h、18h、20h、23h、25h、27h、30h、33h或36h等，具体不做限定。

第三反应结束后，得到磁性微珠，可采用乙醇、甲醇、异丙醇和丁醇中的一种溶剂对磁性微珠进行涡旋振荡洗涤三次，然后用磁力架分离除去上清液，用蒸馏水对磁性微珠进行涡旋振荡洗涤三次，去除上清液后，加入蒸馏水分散磁性微珠，放入2~8℃冰箱保存备用。

需要说明的是，与所有羟基均处于相同层面相比，进行第三反应时，由于第二中间体中第一碳链的主链末端的羟基与第二碳链的主链末端的羟基形成错层结构，在空间位阻的作用，第二中间体中远离聚合物包覆层的羟基与磺酰氯类单体发生反应生成磺酰系基团，使得磺酰系基团在磁性微球表面的分布更均匀，同时可提高未反应的羟基的含量，因此提高了制得的磁性微球表面的亲水性。

作为示例，进行第三反应时，首先对第二中间体进行多次分散置换，然后采用反应溶剂对磁性微珠进行分散，置于反应容器中，然后将反应容器中加入磺酰氯类单体，加入反应促进剂，于30~50℃下反应12~36h，制得磁性微球。反应结束后，对磁性微球进行振荡洗涤多次，然后采用蒸馏水分散，放入2~8℃冰箱保存备用。

本申请提供的磁性微珠的制备方法，操作简单，便于工艺放大。

本申请还提供了磁性微球在制备诊断制剂盒中的应用。

本申请还提供了一种诊断试剂盒，包括上述的磁性微球或根据上述的方法制备的磁性微球。

下述结合具体实施例对本申请的技术方案进行详细说明。

一．磁性微球制备

需要说明的是，下述各实施例和对比例中采用的磁性聚合物基球仅为示例性的，并不限定该制备方法仅能适用下述各实施例和对比例中提及的磁性聚合物基球。

实施例1

实施例1中采用的磁性聚合物基球按照公开号为CN108129614A的中国专利申请中公开的制备磁性微球的方法制备得到，表面带有羟基和对甲苯磺酰基；磁性聚合物基球的制备方法包括：(1) 取苯乙烯5g，二乙烯基苯10g，环己醇18mL加入反应容器中，再加入偶氮二异丁腈0.2g和十八烷基硫酸钠0.2g，开启机械搅拌，转速为300rpm；待固体全部溶解后，开始通入氮气一小时；结束后，反应容器密闭，开始加热，当容器内温度升至80℃后，反应24小时；待反应液温度降至室温后，用300目无妨滤布过滤反应液，反应液离心分离，用100mL蒸馏水洗涤置换3次后，再用100mL异丙醇置换3次，加入250mL分散后，得到聚苯乙烯微球；测定分散液固含量，放入2~8℃冰箱保存，备用；(2) 取甲基丙烯酸缩水甘油酯2mL，异丙醇14mL加入反应容器中，开启机械搅拌，并通入氮气；通入氮气一小时后，在依次加入氯化铜、氯化亚铜、3(2-二甲氨基乙基)分别为0.5g、0.1g、1g。取(1)中分散液50mL超声30分钟，再加入反应容器中，通入氮气一小时；在60℃下反应24小时；结束后，反应液离心分离，用异丙醇100mL洗涤置换3次后，用无水乙醇100mL洗涤置换3次后放入真空干燥箱中干燥24小时；(3)将步骤(2)中微球加入100mL无水乙醇后，超声分散，转入到反应容器中，加入10mL乙二胺，开启机械搅拌，室温下，反应8小时；结束后，反应液离心分离，用蒸馏水100mL洗涤置换3次后，加入100mL蒸馏水分散，备用；(4) 将上述步骤溶液加入反应容器中，取六水三氯化铁13.5g，四水氯化亚铁6.5g，分别用50mL蒸馏水溶解后，加入反应容器中，开启机械搅拌分散，并放入冰水浴中，通入氮气一小时；一小时后，开始滴加50mL氨水；滴加结束后，撤掉冰水浴，室温下反应24小时；结束后，反应液离心分离，用蒸馏水100mL洗涤6次后，除去上清后，加入100mL蒸馏水分散保存；(5) 步骤(4)中微球离心分离，用适量无水乙醇置换3次，加入100mL无水乙醇分散后转入反应容器中，再加入0.5g过氧化(2-乙基己酸)叔丁酯，5g苯乙烯，5g甲基丙烯酸缩水甘油酯。氮气保护下，85℃反应10小时。反应液冷却至室温后，反应液用100mL无水乙醇洗涤3次后，加入100mL乙醇分散备用；(6) 将步骤(5)微球离心分离，用100mL蒸馏水置换3次，加入1mol/L氢氧化钠100mL，分散后转入反应容器中，通入氮气保护，80℃反应5小时。结束后，反应液分离，用100mL蒸馏水洗涤3次，100mL无水乙醇洗涤3次，备用；(7) 将上述步骤中磁球分离，去除上清，加入100mL二氧六环分散转入反应容器中，加入对甲苯磺酰氯20g和20mL吡啶，开启机械搅拌，50℃反应24小时；结束后，反应液分离后去除，用100mL无水乙醇洗涤3次后，100mL蒸馏水洗涤3次，最后加入100mL蒸馏水分散保存，得到表面含有羟基和对甲苯磺酰基的磁性聚合物基球分散液，备用。

取1g上述制备的磁性聚合物基球，将磁性聚合物基球加入100mL体积比为1:1的乙酸乙酯和无水乙醇的混合溶剂中，然后将磁性聚合物基球和混合溶剂加入250mL的三口烧瓶中，200rpm下机械搅拌，加入0.05g偶氮二异丁腈，然后加入2g丙烯酸羟乙酯、2g丙烯酸缩水甘油酯和0.2g二乙二醇二甲基丙烯酸酯，通入氮气保护，于75℃下反应15h。反应结束后，将反应液磁分离，采用50mL体积比为1:1的乙酸乙酯和无水乙醇的混合溶剂涡旋分散，洗涤3次，去除上清液，得到第一中间体备用。

采用50mL二氧六环溶剂对第一中间体进行分散置换3次，除去上清，采用二氧六环分散第一中间体后移入反应容器中，加入1g三乙胺后，在加入6g质量比为1:2的聚乙二醇600和乙二醇的混合溶液；取2g三氟化硼二丁基醚溶液加入恒压滴液漏斗，反应容器密封后，通入氮气30min，用氮气气球置换反应溶液内空气后，加热至70℃，开始滴加三氟化硼二丁基醚溶液，滴加时间为30min。结束后，继续反应16h，制得第二中间体。反应结束后，反应液取出，磁分离除去上清，用50mL体积比为1:1无水乙醇和四氢呋喃混合溶剂洗涤4次后，用纯化水洗涤4次，每次50mL，最后加入100mL纯化水分散第二中间体，备用。

将上述第二中间体分散液磁分离除去上清，用50mL无水乙醇洗涤置换3次，再用50mL四氢呋喃置换3次后，加入50mL四氢呋喃，再加入2g环己基甲烷磺酰氯，加入1g吡啶，于30℃反应36h，制得磁性微球。反应结束后，反应液磁分离，除去上清，用无水乙醇清洗3次后，再用纯化水洗涤3次，加入适量水分散，放入2~8℃冰箱保存。

实施例2

采用的磁性聚合物基球同实施例1。

取1g磁性聚合物基球，将磁性聚合物基球加入100mL体积比为1:1的正己烷和无水乙醇的混合溶剂中，然后将磁性聚合物基球和混合溶剂加入250mL的三口烧瓶中，200rpm下机械搅拌，加入0.01g偶氮二异丁腈，然后加入2g甲基丙烯酸羟乙酯、1g甲基丙烯酸甲酯、1g乙二醇二缩水甘油醚和0.2g二乙二醇二甲基丙烯酸酯，通入氮气保护，于70℃下反应20h。反应结束后，将反应液磁分离，采用50mL体积比为1:1的正己烷和无水乙醇的混合溶剂涡旋分散，洗涤3次，去除上清液，得到第一中间体备用。

采用50mL四氢呋喃对第一中间体进行分散置换3次，除去上清，采用四氢呋喃分散第一中间体后移入反应容器中，加入1g三乙胺后，再加入7g质量比为1:2的聚乙二醇2000和三缩四乙二醇的混合溶液；取2g三氟化硼乙醚溶液加入恒压滴液漏斗，反应容器密封后，通入氮气30min，用氮气气球置换反应溶液内空气后，加热至60℃，开始滴加三氟化硼乙醚溶液，滴加时间为30min。结束后，继续反应16h，制得第二中间体。反应结束后，反应液取出，磁分离除去上清，用50mL体积比为1:1无水乙醇和四氢呋喃混合溶剂洗涤4次后，用纯化水洗涤4次，每次50mL，最后加入100mL纯化水分散第二中间体，备用。

将上述第二中间体分散液磁分离除去上清，用50mL无水乙醇洗涤置换3次，再用50mL丙酮置换3次后，加入50mL丙酮，再加入2g对甲苯磺酰氯，加入1g三乙胺，于40℃反应24h，制得磁性微球。反应结束后，反应液磁分离，除去上清，用无水乙醇清洗3次后，再用纯化水洗涤3次，加入适量水分散，放入2~8℃冰箱保存。

实施例3

实施例3中采用的磁性聚合物基球为聚合物内核以及包覆在聚合物内核表面的聚合物中间层形成的微球结构，磁性材料位于聚合物内核表面；磁性聚合物基球的制备方法为：(1) 称取苯乙烯(减压蒸馏后)4.5g、二乙烯基苯0.5g、过氧化二苯甲酰0.1g依次加入反应容器，开启机械搅拌，转速为300rpm；待固体全部溶解后，称取聚乙烯吡咯烷酮(K90)1g用无水乙醇90mL溶解后，加入反应容器；再加入去离子水10mL，开始通入氮气一小时；当容器内温度升至70℃后，反应20小时；结束后，待反应液温度降至室温后，用200目无妨滤布过滤反应液，反应液离心分离，用适量蒸馏水洗涤置换6次后，加入适量蒸馏水分散后，得到聚苯乙烯-二乙烯基苯微球；测定分散液固含量，放入2-8℃冰箱保存，备用；(2) 移取上述聚苯乙烯-二乙烯基苯微球分散液加入离心瓶，其中含有1g聚苯乙烯-二乙烯基苯微球，离心分离除去上清液；用适量无水乙醇分散置换离心瓶中聚苯乙烯-二乙烯基苯微球3次后，再用适量二氯甲烷分散置换3次后，用30mL二氯甲烷分散聚苯乙烯-二乙烯基苯微球，加入反应容器中，开启机械搅拌，放入冰水浴中，保持容器内温度在0~5℃；取氯甲基甲醚3mL加入反应容器中，搅拌30分钟后，取1.5mL无水四氯化锡溶液，缓慢滴加到容器中，滴加过程中容器内温度仍保持在0-5℃；滴加结束后，升温至30℃，再反应2小时；结束后，反应液离心分离，依次用二氯甲烷洗涤置换3次，再用无水乙醇洗涤置换3次后，用30mL无水乙醇分散后，转入反应容器中，用机械搅拌分散；将4mL乙二胺加入容器中，密闭后，在60℃下反应16小时；反应结束后，反应液离心分离，分别用无水乙醇洗涤置换3次，蒸馏水洗涤置换3次，备用；(3)将上述聚苯乙烯-二乙烯基苯微球用20mL蒸馏水分散后，加入反应容器中，取六水三氯化铁0.21g，四水氯化亚铁0.10g，分别用5mL蒸馏水溶解后，加入反应容器中，通入氮气一小时后，用注射泵开始缓慢滴加4mL氨水，滴加结束后，升温至80℃，反应1小时；结束后，反应液离心分离，用蒸馏水适量洗涤6次后，得到磁性聚苯乙烯-二乙烯基苯微球，加入适量蒸馏水分散保存，备用；(4) 上述步骤中磁性聚苯乙烯-二乙烯基苯微球离心分离，用适量无水乙醇置换3次，再用乙酸乙酯置换3次，加入40mL乙酸乙酯分散后转入反应容器中，再加入0.02g过氧化(2-乙基己酸)叔丁酯，0.10g苯乙烯，0.01g二乙烯基苯，0.10g甲基丙烯酸缩水甘油酯；氮气保护下，80℃反应20小时；反应液冷却至室温后，反应液用适量乙酸乙酯洗涤3次，再用无水乙醇洗涤3次后，加入适量乙醇分散，得到磁性聚合物基球，备用。

取1g上述制备的磁性聚合物基球，将磁性聚合物基球加入100mL体积比为1:1的乙酸乙酯和无水乙醇的混合溶剂中，然后将磁性聚合物基球和混合溶剂加入250mL的三口烧瓶中，200rpm下机械搅拌，加入0.07g过氧化二苯甲酰，然后加入4.76g丙烯酸羟乙酯、4.76g丙烯酸缩水甘油酯和0.476g二乙二醇二甲基丙烯酸酯，通入氮气保护，于75℃下反应24h。反应结束后，将反应液磁分离，采用50mL体积比为1:1的乙酸乙酯和无水乙醇的混合溶剂涡旋分散，洗涤3次，去除上清液，得到第一中间体备用。

采用50mL正己烷对第一中间体进行分散置换3次，除去上清，采用正己烷分散第一中间体后移入反应容器中，加入3g吡啶后，在加入11g质量比为1:10的聚乙二醇6000和1,10-癸二醇的混合溶液；取3g三氟化硼二甲醚溶液加入恒压滴液漏斗，反应容器密封后，通入氮气30min，用氮气气球置换反应溶液内空气后，加热至80℃，开始滴加三氟化硼二甲醚溶液，滴加时间为60min。结束后，继续反应7h，制得第二中间体。反应结束后，反应液取出，磁分离除去上清，用50mL体积比为1:1无水乙醇和四氢呋喃混合溶剂洗涤4次后，用纯化水洗涤4次，每次50mL，最后加入100mL纯化水分散第二中间体，备用。

将上述第二中间体分散液磁分离除去上清，用50mL无水乙醇洗涤置换3次，再用50mL丙酮置换3次后，加入50mL丙酮，再加入5g 4-氟苯基磺酰氯，加入10g三苯胺，于50℃反应12h，制得磁性微球。反应结束后，反应液磁分离，除去上清，用无水乙醇清洗3次后，再用纯化水洗涤3次，加入适量水分散，放入2~8℃冰箱保存。

实施例4

实施例4中采用的磁性聚合物基球为聚合物内核以及包覆在聚合物内核表面的聚合物中间层形成的微球结构，磁性材料位于聚合物中间层内；磁性聚合物基球的制备方法为：(1) 称取甲基丙烯酸甲酯4g，1,6-己二醇二甲基丙烯酸酯1g，偶氮二异丁腈0.1g依次加入反应容器，开启机械搅拌，转速为300rpm；待固体全部溶解后，称取聚乙烯吡咯烷酮(K30)1g用无水乙醇90mL溶解后，加入反应容器；再加入去离子水10mL，开始通入氮气一小时。当容器内温度升至75℃后，反应20小时；结束后，待反应液温度降至室温后，用200目无妨滤布过滤反应液，反应液离心分离，用30mL蒸馏水洗涤置换3次后，再用适量无水乙醇置换3次，加入30mL无水乙醇分散后，得到聚甲基丙烯酸甲酯微球分散液；测定分散液固含量，放入2-8℃冰箱保存，备用；(2) 取六水三氯化铁0.21g，四水氯化亚铁0.10g，分别用10mL蒸馏水溶解后，加入反应容器中，通入氮气一小时后，用注射泵开始缓慢滴加2mL氨水，滴加结束后，升温至60℃，反应1小时；结束后，反应液离心分离，用蒸馏水适量洗涤3次，再用适量无水乙醇洗涤3次，加入30mL无水乙醇分散保存，得到磁性纳米颗粒分散液，备用；(3)将步骤(1)中聚甲基丙烯酸甲酯微球离心分离，加入30mL乙酸乙酯分散后转入反应容器中，再加入0.02g过氧化(2-乙基己酸)叔丁酯，0.10g甲基丙烯酸羟乙酯，0.01g乙二醇二甲基丙烯酸酯，0.10g烯丙基缩水甘油醚，再将步骤(2)中30mL磁性纳米颗粒加入反应容器中；氮气保护下，80℃反应24小时；反应液冷却至室温后，反应液用乙酸乙酯洗涤3次，每次60mL，再用无水乙醇洗涤3次后，每次60mL，加入30mL无水乙醇分散，得到磁性聚合物基球，备用。

取1g上述制备的磁性聚合物基球，将磁性聚合物基球加入100mL体积比为1:1的乙酸乙酯和无水乙醇的混合溶剂中，然后将磁性聚合物基球和混合溶剂加入250mL的三口烧瓶中，200rpm下机械搅拌，加入0.005g偶氮二异庚腈，然后加入0.475g甲基丙烯酸羟乙酯、0.476g甲基丙烯酸甲酯、0.476g烯丙基缩水甘油醚和0.048g二乙二醇二甲基丙烯酸酯，通入氮气保护，于60℃下反应10h。反应结束后，将反应液磁分离，采用50mL体积比为1:1的乙酸乙酯和无水乙醇的混合溶剂涡旋分散，洗涤3次，去除上清液，得到第一中间体备用。

采用50mL正己烷对第一中间体进行分散置换3次，除去上清，采用正己烷分散第一中间体后移入反应容器中，加入3g吡啶后，在加入11g质量比为1:0.1的聚乙二醇4000和1,6己二醇的混合溶液；取0.2g三氟化硼乙醚溶液加入恒压滴液漏斗，反应容器密封后，通入氮气30min，用氮气气球置换反应溶液内空气后，加热至70℃，开始滴加三氟化硼乙醚溶液，滴加时间为60min。结束后，继续反应14h，制得第二中间体。反应结束后，反应液取出，磁分离除去上清，用50mL体积比为1:1无水乙醇和四氢呋喃混合溶剂洗涤4次后，用纯化水洗涤4次，每次50mL，最后加入100mL纯化水分散第二中间体，备用。

将上述第二中间体分散液磁分离除去上清，用50mL无水乙醇洗涤置换3次，再用50mL乙腈置换3次后，加入50mL乙腈，再加入5g对甲氧基苯磺酰氯，加入0.5g二甲基胺，于40℃反应24h，制得磁性微球。反应结束后，反应液磁分离，除去上清，用无水乙醇清洗3次后，再用纯化水洗涤3次，加入适量水分散，放入2~8℃冰箱保存。

对比例1

对比例1和实施例1的区别在于，对比例1制备磁性微球时，未采用乙二醇，采用6g的聚乙二醇600，其他均相同。

对比例2

对比例2和实施例1的区别在于，对比例2中制备磁性微球时，未采用聚乙二醇600，采用6g的乙二醇，其他均相同。

对比例3

对比例3中的磁性微球与实施例1中的磁性聚合物基球相同，未对磁性微球进行与实施例1中相同的后续操作；即按照公开号为CN108129614A的中国专利申请中公开的制备磁性微球的方法，制备的表面带有羟基和对甲苯磺酰基的磁性微球作为对比例3。

二、性能测试

1、采用扫描电子显微镜扫描实施例1中制备的磁性微球，扫描电子显微镜的扫描 参数包括：加速电压为5.0kv、工作距离为8.7mm、放大倍数为10000倍；结果如1所示。由图1 可知，磁性微球粒径为2.4μm

0.1μm，具有近似球形的结构特点，磁性微球存在小幅度的突 起和凹陷的表面形貌特征，对比光滑表面的微球，具有相对更大的比表面积，更合理的基团 分布，在后续应用中能够提高对特异性蛋白或抗体的吸附效率，降低对非目标蛋白或抗体 的非特异性吸附。

2、吸附测试在相同偶联条件下，将PCT单克隆抗体结合到上述各实施例和对比例中的磁性微球上。分别取50μg 结合了抗体的磁性微球，在化学发光免疫分析仪上，通过双抗夹心法，检测PCT抗原。测试结果如表1所示。

表1

由表1中实施例1~4的结果可知，在抗原浓度为0

时，实施例1~4中磁性微球 的本底值均明显较低，表明采用本申请的技术方案制备的磁性微珠对非目标蛋白或抗体的 吸附显著降低。

由实施例1和对比例1~3的结果可知，通过将磺酰系基团和羟基在磁性微球表明形成错层结构分布，可有利于磺酰系基团和羟基在磁性微球表面的均匀分布，提高磁性微球表面的亲水性；并且磺酰系基团在磁性微球表面的分布更均匀，可提高磺酰系基团对特异性蛋白或抗体的吸附效率，降低对非目标蛋白或抗体的非特异性吸附。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (21)

1.一种磁性微球，其特征在于，包括：

磁性聚合物基球；

聚合物包覆层，包覆在所述磁性聚合物基球的表面，所述聚合物包覆层的表面连接有主链长度不同的第一碳链和第二碳链，所述第一碳链的主链末端含有磺酰系基团，所述第二碳链的主链末端含有羟基。

2.如权利要求1所述的磁性微球，其特征在于，所述第一碳链的主链中含有的碳原子数记为a，则所述第一碳链的主链中含有的碳原子数满足：a＞100；

所述第二碳链的主链中含有的碳原子数记为b，则所述第二碳链的主链中含有的碳原子数满足：2≤b≤100。

3.如权利要求1所述的磁性微球，其特征在于，所述第一碳链的支链末端和所述第二碳链的支链末端各自独立地含有羟基。

4.如权利要求1所述的磁性微球，其特征在于，所述聚合物包覆层包括丙烯酸酯类单体单元和缩水甘油醚类单体单元中的一种或多种。

5.如权利要求4所述的磁性微球，其特征在于，所述丙烯酸酯类单体单元对应的单体包括丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯、丙烯酸异辛酯、甲基丙烯酸异辛酯、丙烯酸环氧丙酯、丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、二乙二醇二甲基丙烯酸酯、3-(二甲氨基)丙烯酸丙酯、3-(二甲氨基)丙烯酸甲酯、和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯中的一种或多种。

6.如权利要求4所述的磁性微球，其特征在于，所述缩水甘油醚类单体单元对应的单体包括间苯二酚二缩水甘油醚、正丁基缩水甘油醚、叔丁基缩水甘油基醚、烯丙基缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、1,6-已二醇二缩水甘油醚、二缩水甘油醚、甘油二缩水甘油基醚中的一种或多种。

7.如权利要求1~6中任一项所述的磁性微球，其特征在于，所述磁性聚合物基球包括聚合物内核以及包覆在所述聚合物内核的表面的聚合物中间层，所述磁性聚合物基球带有磁性材料。

8.如权利要求7所述的磁性微球，其特征在于，所述磁性聚合物基球具有超顺磁性。

9.如权利要求7所述的磁性微球，其特征在于，所述磁性材料位于所述聚合物内核的表面或位于所述聚合物中间层内。

10.如权利要求7所述的磁性微球，其特征在于，所述磁性材料包括Fe₃O₄、γ-Fe₂O₃或MFe₂O₄中的一种或多种，所述MFe₂O₄中的M为Co、Mg、Ni、Mn或Zn中的一种或多种。

11.如权利要求8~10中任一项所述的磁性微球，其特征在于，所述聚合物中间层带有功能基团，所述聚合物中间层带有的功能基团包括羟基、氨基、羧基、巯基、醛基、环氧基和对甲苯磺酰基中的一种或多种。

12.如权利要求8~10中任一项所述的磁性微球，其特征在于，所述聚合物内核包括聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球、聚乳酸微球和聚苯乙烯-二乙烯基苯微球中的一种或多种。

13.如权利要求8~10中任一项所述的磁性微球，其特征在于，所述磁性聚合物基球还包括包覆在所述聚合物中间层的表面的聚合物外层。

14.如权利要求13所述的磁性微球，其特征在于，所述聚合物外层带有功能基团，所述聚合物外层带有的功能基团包括羟基、氨基、羧基、巯基、醛基、环氧基和对甲苯磺酰基中的一种或多种。

15.一种如权利要求1~14中任一项所述的磁性微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将磁性聚合物基球与包覆层单体发生第一反应，生成第一中间体；

将所述第一中间体与第一碳链长度的二醇类单体和第二碳链长度的二醇类单体发生第二反应，生成第二中间体；

将所述第二中间体与磺酰氯类单体发生第三反应，生成磁性微球。

16.如权利要求15所述的磁性微球的制备方法，其特征在于，进行所述第一反应时，包括如下条件中的至少一项：

（1）所述磁性聚合物基球与所述包覆层单体的用量比为1:(1~10);

（2）所述包覆层单体包括丙烯酸酯类单体和缩水甘油醚类单体中的一种或多种；

（3）采用引发剂引发所述第一反应，所述引发剂与所述磁性聚合物基球的用量比为(0.5~7):100；

其中，所述引发剂包括过氧化二苯甲酰、过氧化二异丙苯、过氧化十二酰、过氧化二叔丁基、偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈和偶氮二异丁酸二甲酯中的一种或多种；

（4）进行所述第一反应时采用的反应溶剂包括无水乙醇、四氢呋喃、乙酸乙酯、异丙醇、甲醇、正己烷和二氧六环中的一种或多种；

（5）进行所述第一反应时的反应温度为60~75℃，反应时间为10~24h。

17.如权利要求15所述的磁性微球的制备方法，其特征在于，进行所述第二反应时，包括如下条件中的至少一项：

（1）所述第二碳链长度的二醇类单体与所述磁性聚合物基球的用量比为(1~10):1，所述第二碳链长度的二醇类单体与所述第一碳链长度的二醇类单体的用量比为(0.1~10):1;

（2）所述第一碳链长度的二醇类单体包括聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000和聚乙二醇6000中的一种或多种；

（3）所述第二碳链长度的二醇类单体包括乙二醇、二乙二醇、四乙二醇、六乙二醇、甘露醇、2,5-己二醇、1,6己二醇和1,10-癸二醇中的一种或多种；

（4）采用催化剂催化所述第二反应；

所述催化剂与所述磁性聚合物基球的用量比为(0.2~3):1;

所述催化剂包括三氟化硼甲醇、三氟化硼二丁基醚、三氟化硼二甲醚、三氟化硼哌啶、三氟化硼异丙醇、三氟化硼丙醇和三氟化硼乙醚中的一种或多种；

（5）所述第二反应在含有有机碱的反应溶剂中进行，所述有机碱与所述磁性聚合物基球的用量比为(0.1~3):1；

所述有机碱包括乙胺、三乙胺、二异丙基胺、三乙醇胺、吡啶、甲醇钾、甲醇钠、乙醇钠、乙醇钾和叔丁醇钾中的一种或多种；

进行所述第二反应时采用的反应溶剂包括无水乙醇、四氢呋喃、乙酸乙酯、异丙醇、甲醇、正己烷和二氧六环中的一种或多种；

（6）进行所述第二反应时的反应温度为50~80℃，反应时间为8~20h。

18.如权利要求15所述的磁性微球的制备方法，其特征在于，进行所述第三反应时，包括如下条件中的至少一项：

（1）所述磺酰氯类单体与所述磁性聚合物基球的用量比为(0.5~5):1；

（2）所述磺酰氯类单体包括甲基磺酰氯、对甲苯磺酰氯、对甲氧基苯磺酰氯、3-甲氧基苯磺酰氯、苯磺酰氯、4-氟苯基磺酰氯、环己基甲烷磺酰氯和2,2,2-三氟乙基磺酰氯中的一种或多种；

（3）采用反应促进剂促进所述第三反应的进行；

所述反应促进剂包括三乙胺、乙二胺、苯胺、二苯胺、三苯胺、二甲基胺、吡啶和甲基吡啶中的一种或多种；

所述反应促进剂与所述磁性聚合物基球的用量比为(0.5~5):1；

（4）进行所述第三反应时采用的反应溶剂包括丙酮、四氢呋喃、乙腈和丁酮中的一种或多种；

（5）进行所述第三反应时的反应温度为30~50℃，反应时间为12~36h。

19.如权利要求15~18中任一项所述的磁性微球的制备方法，其特征在于，所述磁性聚合物基球的表面带有双键基团。

20.如权利要求1~14中任一项所述的磁性微球在制备诊断试剂盒中的应用。

21.一种诊断试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1~14中任一项所述的磁性微球或如权利要求15~19中任一项所述的方法制备的磁性微球。

Images