JP2023507268A - 酵素酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）の結合タンパク質及びその使用 - Google Patents

酵素酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）の結合タンパク質及びその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、タンパク質精製の分野に関し、特に酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）に特異的に結合する新規なタンパク質に関する。本発明はさらに、ＧＡＡに特異的に結合する新規なタンパク質を含む融合タンパク質に関する。さらに、本発明は、本発明のＧＡＡ結合タンパク質を含むアフィニティーマトリックスに関する。本発明はまた、ＧＡＡのアフィニティー精製用のこれらのＧＡＡ結合タンパク質又はアフィニティーマトリックスの使用及び本発明のＧＡＡ結合タンパク質を用いるＧＡＡのアフィニティー精製方法に関する。さらなる使用は、液体中のＧＡＡの決定のための分析方法に関する。【選択図】 図１

Description

本発明は、タンパク質精製の分野に関し、特に酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）に特異的に結合する新規なタンパク質に関する。本発明はさらに、ＧＡＡに特異的に結合する新規なタンパク質を含む融合タンパク質に関する。さらに、本発明は、本発明のＧＡＡ結合タンパク質を含むアフィニティーマトリックスに関する。本発明はまた、ＧＡＡのアフィニティー精製用のこれらのＧＡＡ結合タンパク質又はアフィニティーマトリックスの使用及び本発明のＧＡＡ結合タンパク質を用いるＧＡＡのアフィニティー精製方法に関する。さらなる使用は、液体中のＧＡＡの決定のための分析方法に関する。
リソソーム酵素ＧＡＡ（ＧＡＡ）は、グリコーゲンのグルコースへの分解に必須である。ＧＡＡに欠陥があると、リソソームにグリコーゲンが蓄積し、糖原病ＩＩ（ポンペ病）として知られる筋細胞及び神経細胞の損傷につながる。この代謝疾患の治療は、ＧＡＡの置換である。したがって、この酵素の精製方法を提供することは必須である。効率的なＧＡＡタンパク質精製を可能にする高度なツールに対して当該技術分野における継続しているニーズがある。
本発明は、新規なＧＡＡ結合ポリペプチドを提供することによりこのニーズを満たす。これらの新規なＧＡＡ結合ポリペプチドは、医療用の高純度ＧＡＡを提供するためにアフィニティークロマトグラフィーにおいて正確な捕捉を可能とするので、ＧＡＡのアフィニティーリガンドとして特に有利である。
上の概要は、必ずしも本発明によって解決される全ての問題を記載するわけではない。
本発明は、特にこれらに限定されることなく、以下の１～１５個の項目、
１．１つ又は複数の酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）結合ドメインを含むＧＡＡ結合タンパク質であって、少なくとも１つのドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１若しくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２若しくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６若しくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７若しくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列、又はこれらに対して少なくとも９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、ＧＡＡ結合タンパク質。
２．このタンパク質は、ＧＡＡに対して２００ｎＭ未満の結合親和性を有する（本明細書に記載される表面プラズモン共鳴法により決定した）、項目１に記載のＧＡＡ結合タンパク質。
３．このＧＡＡ結合タンパク質は、互いに結合した２、３、４、５、又は６個のドメインを含む、項目１に記載のＧＡＡ結合タンパク質。
４．このＧＡＡ結合タンパク質は、ホモ多量体である、項目３に記載のＧＡＡ結合タンパク質。
５．このＧＡＡ結合タンパク質は、ヘテロ多量体である、項目３に記載のＧＡＡ結合タンパク質。
６．１つ又は複数のドメインは、直接又は１つ若しくは複数のペプチドリンカーにより互いに結合される、項目３に記載のＧＡＡ結合タンパク質。
７．項目１～６のいずれか一項に記載のタンパク質を含む融合タンパク質。
８．項目１～６のいずれか一項に記載の結合タンパク質、又は項目７に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
９．ＧＡＡのアフィニティー精製に使用するための項目１～６のいずれか一項に記載のＧＡＡ結合タンパク質、又は項目７に記載の融合タンパク質。
１０．アフィニティー精製マトリックスに対するカップリング用の１つ又は複数のカップリング部位をさらに含み、好ましくはこのＧＡＡ結合タンパク質は、アフィニティー精製マトリックスに対するカップリング用の１つ又は複数のシステイン残基を含む、項目１～６のいずれか一項に記載のＧＡＡ結合タンパク質、又は項目７に記載の融合タンパク質。
１１．項目１～６のいずれか一項に記載のタンパク質、又は項目７に記載の融合タンパク質を含むアフィニティー精製マトリックス。
１２．ＧＡＡのアフィニティー精製用の項目１～６、１０のいずれか一項に記載のＧＡＡ結合タンパク質、若しくは項目７に記載の融合タンパク質、又は項目１１に記載のアフィニティー精製マトリックスの使用。
１３．ＧＡＡのアフィニティー精製方法であって、この方法は、（ａ）ＧＡＡを含有する液体を提供すること、（ｂ）アフィニティー精製マトリックスに結合した項目１～６、１０のいずれか一項に記載の少なくとも１つのＧＡＡ結合タンパク質、又は項目７に記載の融合タンパク質を含むこのアフィニティー精製マトリックスを提供すること、（ｃ）項目１～６、１０のいずれか一項に記載の少なくとも１つのＧＡＡ結合タンパク質のＧＡＡに対する結合を可能にする条件下でこのアフィニティー精製マトリックスをこの液体と接触させること、及び（ｄ）このＧＡＡをこのアフィニティー精製マトリックスから溶出することを含む、方法。
１４．ＧＡＡの存在を判定する方法における、項目１～６に記載のＧＡＡ結合タンパク質又は項目７に記載の融合タンパク質の使用。
１５．液体サンプル中のＧＡＡの存在を分析する方法であって、この方法は、以下のステップ、
（ｉ）ＧＡＡを含有する液体を提供するステップ、
（ｉｉ）項目１～６に記載のＧＡＡ結合タンパク質、又は項目７に記載の融合タンパク質を提供するステップ、
（ｉｉｉ）項目１に記載の少なくとも１つのＧＡＡ結合タンパク質又は項目７に記載の融合タンパク質のＧＡＡに対する結合を可能にする条件下で（ｉ）の液体を項目１～６に記載のＧＡＡ結合タンパク質と接触させるステップ、
（ｉｖ）ＧＡＡと項目１～６に記載のＧＡＡ結合タンパク質又は項目７に記載の融合タンパク質との複合体を分離するステップ、
（ｖ）（ｉ）の液体中の項目１～６に記載のＧＡＡ結合タンパク質の量を定量するステップを含む、
方法。
を提供する。
本発明のこの要約は、限定しておらず、本発明の他の態様及び実施形態は、以下の説明、実施例及び図面から明らかとなるだろう。
図１は、ＧＡＡ結合タンパク質のアミノ酸配列を示す。 図２は、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｐｒａｅｓｔｏ ８５エポキシ樹脂についてのサイクル試験を示す。図２Ａは、滞留時間６分で、Ｐｒａｅｓｔｏ ８５エポキシ樹脂上でのＳＥＤ ＩＤ ＮＯ：１（Ｎ－末端伸長を有する）についてのＤＢＣ１０％を示す。結合容量は、１９．５ｍｇ／ｍｌだった。図２Ｂは、Ｐｒａｅｓｔｏ ８５樹脂にカップリングされ、２ｍｇ／ｍｌ ＧＡＡをロードしたＧＡＡ結合タンパク質（Ｎ－末端伸長を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のＤＢＣ及び腐食安定性を示す。５０回ロード、溶出、及び０．１Ｍ ＮａＯＨ再生サイクル後の残存容量は、少なくとも９０％だった。ＤＢＣ１０％は、線上の目立つ点を打った箇所で測定した。
本発明は、ＧＡＡに対する結合親和性を有する新規なポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、タンパク質工学及び精製の分野におけるギャップを埋める高度で強力なツールである。特に、新規なポリペプチドは、ＧＡＡに対する結合親和性によってタンパク質精製に有利な効果をもたらす。したがって、本発明の新規なポリペプチドは、アフィニティークロマトグラフィーにおいてＧＡＡの正確な捕捉が可能になるので、特に有利である。本発明のＧＡＡ結合タンパク質は、次に医療目的で用いられてよいＧＡＡ精製用の非常に効率的なツールを提供する。
ＧＡＡに対する結合親和性は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１若しくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２若しくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６若しくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７若しくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８を有するポリペプチド、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１若しくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２若しくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６若しくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７若しくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に対して少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列によりもたらされる。
本発明を以下により詳細に記載する前に、本明細書に記載の方法、プロトコル及び試薬は変化してよいので、本発明は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコル及び試薬に限定されないと理解されるべきである。本明細書で用いられる用語は、特定の態様及び実施形態のみを記載する目的のためであり、本発明の範囲を制限することは意図されず、これは添付の特許請求の範囲によって表されるとも理解されるべきである。別段の定めがない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者の１人によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。これには、タンパク質工学及び精製の分野で働く当業者が含まれるが、アフィニティークロマトグラフィーなどの技術的応用、並びに治療及び診断において使用するための新規なＧＡＡ特異的結合分子を開発する分野で働く当業者も含まれる。
好ましくは、本明細書で用いられる用語は、「Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）」，Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｗ，Ｎａｇｅｌ，Ｂ．ａｎｄ Ｋｏｅｌｂｌ，Ｈ．ｅｄｓ．（１９９５），Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，ＣＨ－４０１０ Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に記載されるように定義される。
本明細書及び特許請求の範囲を通じて、文脈で別段の要求がない限り、これらは、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、述べられた整数若しくはステップ、又は整数若しくはステップの群を包含するが、任意の他の整数若しくはステップ、又は整数若しくはステップの群を除外しないことを意味すると理解されることとなる。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」又は「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、このような限定がいずれかの理由又はいずれかの程度必要であるならば、「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」又は「から成っている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」に対する限定を含むことができる。
本明細書を通していくつかの文書（例えば、特許、特許出願、科学的出版物、製造業者の仕様書、使用説明書、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号配列登録など）を引用してよい。本明細書では、本発明が先の発明によりこのような開示を前日付けにする資格を与えないという承認として解釈されるべきものはない。本明細書で引用される文書のいくつかは、「参照により援用される」ものであるとして特徴づけられてよい。このような援用された参照の定義又は教示と本明細書で列挙された定義又は教示との間に不一致がある場合には、本明細書の文言が優先する。
本明細書で参照される全ての配列は、添付の配列表の全ての内容及び開示と共に、本明細書の開示内容の部分を形成する添付の配列表に開示される。
本出願で用いられる重要な用語の一般的定義
用語「ＧＡＡ結合タンパク質」又は「酸性αグルコシダーゼ結合ポリペプチド」又は「酸性αグルコシダーゼ結合タンパク質」又は「ＧＡＡ結合ポリペプチド」は、酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ； Ｕｎｉｐｒｏｔ識別子Ｐ１０２５３）と結合する能力があるタンパク質を説明するために本明細書で互換的に用いることができる。本明細書に記載される場合、「ＧＡＡ結合タンパク質」とは、例えばＳＰＲ分析又は当業者にとって公知の他の適切な技術によって測定される、ＧＡＡとの検出可能な相互作用を行うタンパク質を指す。
用語「結合親和性」及び「結合活性」を本明細書で互換的に用いてよく、これらは、本発明のポリペプチドが別のタンパク質、ペプチド、又はこれらの断片若しくはドメインと結合する能力を指す。結合親和性は典型的には、二分子相互作用の強さを評価し、等級つけるために用いられる平衡解離定数（ＫＤ）によって測定され、報告される。この結合親和性及び解離定数は、定量的に測定することができる。結合親和性を測定する方法は、当業者にとって周知であり、例えば以下の当該技術分野で確立した方法、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、結合平衡除外分析（ＫｉｎＥｘＡ試験法）、バイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）、フローサイトメトリー、蛍光分光法技術、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、分析用超遠心システム、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ又はＩＲＭＡ）、及び増強化学発光（ＥＣＬ）から選択することができる。典型的には、解離定数ＫＤは、２０℃～３０℃の範囲の温度で測定される。特に別段の指示がない限り、本明細書で列挙されるＫＤ値は、２５℃でＳＰＲにより測定される。最も広く用いられるＳＰＲに基づくシステムは、ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢにより製造されるＢＩＡｃｏｒｅである。本発明の各種実施形態において、ＧＡＡに対する結合親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ ＳＰＲシステムにより測定してよい。各種実施形態において、分析物の濃度は１μＭである。他の各種実施形態においては、分析物の濃度は１０μＭである。本発明の他の各種実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＳＰＲによって測定された、ＧＡＡに対する結合親和性を有し、ＳＰＲアッセイにおける分析物の濃度は１０μＭであり、好ましくは、結合親和性は２５℃で測定される。
用語「融合タンパク質」とは、少なくとも第２のタンパク質に遺伝的に結合した少なくとも第１のタンパク質を含むタンパク質に関する。融合タンパク質は、本来別々のタンパク質用にコードした２個又はそれ以上の遺伝子を結合することにより作成される。したがって、融合タンパク質は、同一のタンパク質、又は単一の線状ポリペプチドとして発現する異なるタンパク質の多量体を含んでよい。
本明細書で用いられる場合、用語「リンカー」とは、最も広い意味で、少なくとも２個の異なる分子を共有結合的に結合する分子を指す。
用語「アミノ酸配列相同性」とは、２個又はそれ以上のタンパク質のアミノ酸配列の相同性（又は相違）の定量的比較を指す。参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列相同性」は、必要な場合、最大パーセント配列相同性を果たすよう配列を整列し、ギャップを導入した後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である配列中のアミノ酸残基のパーセントとして規定される。配列相同性を決定するためには、質問タンパク質の配列を、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のポリペプチドなどの、参照タンパク質又はポリペプチドの配列と整列する。配列アラインメント方法は、当該技術分野において周知である。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列に対する任意のポリペプチドのアミノ酸配列相同性の程度を決定するために、好ましくは無料で入手可能なＳＩＭ Ｌｏｃａｌ類似性プログラム（Ｘｉａｏｑｕｉｎ Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ （１９９１），Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，ｖｏｌ．１２：３３７－３５７）、を利用する。マルチプルアライメント解析については、好ましくはＣｌｕｓｔａｌＷを用いる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３－４６８０）。
用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」とは、ペプチド結合により結合した２個又はそれ以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、特定の長さの産物を指さない。したがって、「ペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は２個又はそれ以上のアミノ酸の鎖を指すために用いられる任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義の中に含まれ、用語「ポリペプチド」をこれらの用語のいずれかの代わりに、又はこれらの用語と互換的に用いてよい。用語「ポリペプチド」はまた、当該技術分野で周知である、グリコシル化などの、ポリペプチドの翻訳後修飾の産物を指すことも意図される。
用語「アルカリ安定な」若しくは「アルカリ安定性」又は「腐食安定な」若しくは「腐食安定性」とは、本発明のＧＡＡ結合タンパク質がＧＡＡに対する結合能力を著しく失うことなくアルカリ条件に耐えられる能力を指す。本分野の当業者は、ＧＡＡ結合タンパク質を、実施例に記載されるように、水酸化ナトリウムと共にインキュベートし、続けて、例えばクロマトグラフィー手法などの、当業者に公知の日常的な実験によりＧＡＡに対する結合能力を試験することにより、容易にアルカリ安定性を試験することができる。
用語「クロマトグラフィー」とは、移動相及び固定相を利用して試料中の他の分子（例えば、混入物）から一種類の分子（例えば、ＧＡＡ）を分離する分離技術を指す。液体移動相は、複数の分子の混合物を含み、これらを固定相（固体マトリックスなど）をわたり、又は通じて輸送する。移動相中の異なる分子の固定相との相互作用の相違により、移動相中の分子を分離することができる。
用語「アフィニティークロマトグラフィー」とは、固定相に結合したリガンドが移動相（試料）中の分子（すなわち、ＧＡＡ）と相互作用する、すなわち、リガンドは精製すべき分子に対する特異的結合親和性を有する、特定の型のクロマトグラフィーを指す。本発明の文脈において理解されるように、アフィニティークロマトグラフィーは、ＧＡＡを含む試料を、本発明のＧＡＡ結合タンパク質などの、クロマトグラフィーリガンドを含む固定相に添加することを含む。
用語「固体支持体」又は「固体マトリックス」は、固定相について互換的に用いられる。
本明細書で互換的に用いられる用語「アフィニティーマトリックス」又は「アフィニティー精製マトリックス」又は「アフィニティークロマトグラフィーマトリックス」とは、例えば本発明のＧＡＡ結合タンパク質などのアフィニティーリガンドが付着した、例えばクロマトグラフィーマトリックスなどの、マトリックスを指す。リガンド（例えばＧＡＡ結合タンパク質）は、精製又は混合物から除去されるべき関心のある分子（例えばＶＨ３含有タンパク質）に特異的に結合することができる。
本明細書で用いられる場合、用語「アフィニティー精製」とは、ＧＡＡをマトリックスに固定されたＧＡＡ結合タンパク質に結合することにより、液体のＧＡＡを精製する方法を指す。これにより、ＧＡＡを除いた混合物の他の成分が除去される。さらなるステップにおいては、結合したＧＡＡを精製された形状で溶出することができる。
本発明の実施形態の詳細な説明
本発明をさらに説明する。以下の一節では、本発明の他の態様をより詳細に規定する。以下に規定する各態様は、反対の明確な表示がない限り、任意の他の１つ又は複数の態様と組み合わせてよい。具体的には、好ましい又は有利であると示される任意の特徴は、好ましい又は有利であると示される任意の他の１つ又は複数の特徴と組み合わせてよい。
本発明の新規なポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、１６、１７、１８、２２、２３を含む）は、ＧＡＡに対する結合親和性を示す（本明細書ではＳＰＲにより測定した）。酸性αグルコシダーゼに対する新規な結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～９、１４～２０、２２～２３の群から選択されるいずれか１つに対して少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。新規なＧＡＡ結合タンパク質は、１つ又は複数のＧＡＡ結合ドメインを含んでいて、少なくとも１つのＧＡＡ結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１若しくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２若しくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６若しくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７若しくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列又はこれらに対して少なくとも９５％の配列相同性を有するアミノ酸を含む、から本質的に成る、又はから成る。ＧＡＡ結合タンパク質のアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８を図１及びここに示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（１９２４０３）
ＩＡＡＫＦＤＭＫＱＡＷＡＤＨＦＩＬＥＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦＲＱＳＬＳＤＤＰＳＶＳＤＬＶＬＬＱＡＱＫＬＮＱＭＱＡＰＫ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（１９２４０２）
ＩＡＡＫＦＤＭＫＱＡＷＡＤＨＦＩＬＥＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦＲＱＳＬＳＤＤＰＳＶＳＤＬＶＬＡＱＡＱＫＬＮＱＳＱＡＰＫ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６（１９２４０３ ｄｅｌ２Ｎ）
ＡＫＦＤＭＫＱＡＷＡＤＨＦＩＬＥＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦＲＱＳＬＳＤＤＰＳＶＳＤＬＶＬＬＱＡＱＫＬＮＱＭＱＡＰＫ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７（１９２４０２ ｄｅｌ２Ｎ）
ＡＫＦＤＭＫＱＡＷＡＤＨＦＩＬＥＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦＲＱＳＬＳＤＤＰＳＶＳＤＬＶＬＡＱＡＱＫＬＮＱＳＱＡＰＫ．
新規なＧＡＡ結合タンパク質は、１つ又は複数のＧＡＡ結合ドメインを含んでいて、少なくとも１つのＧＡＡ結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列又はこれに対して少なくとも９５％の配列相同性を有するアミノ酸を含む。
ＱＡＷＡＤＨＦＩＬＥＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦＲＱＳＬＳＤＤＰＳＶＳＤＬＶＬＸ１ＱＡＱＫＬＮＱＸ２
Ｘ１は、任意のアミノ酸であってよく、いくつかの実施形態においてはアラニン（Ａ）又はロイシン（Ｌ）から選択されるアミノ酸であってよい。Ｘ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２中の４６位に対応している。
Ｘ２は、任意のアミノ酸であってよく、いくつかの実施形態においてはセリン（Ｓ）又はメチオニン（Ｍ）から選択されるアミノ酸であってよい。Ｘ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２中の５４位に対応している。
いくつかの実施形態において、ＧＡＡ結合ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ配列に対して少なくとも９５％の配列相同性を有する。いくつかの実施形態において、ＧＡＡ結合ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ配列に対して少なくとも９５％の配列相同性を有する。いくつかの実施形態において、ＧＡＡ結合ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ配列に対して少なくとも９５％の配列相同性を有する。いくつかの実施形態において、ＧＡＡ結合ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ配列に対して少なくとも９５％の配列相同性を有する。いくつかの実施形態において、ＧＡＡ結合ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のアミノ配列に対して少なくとも９５％の配列相同性を有する。他の実施形態において、ＧＡＡ結合ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のアミノ配列に対して少なくとも９５％、９８％、又は１００％の配列相同性を有する。例えば、「ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸に対する少なくとも９５％の相同性」とは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸と比較して１個又は２個の置換を指し、「ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸に対する少なくとも９８％の相同性」とは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸と比較して１個の置換を指す。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１とは、２個のアミノ酸、すなわち、アミノ酸４６及びアミノ酸５４が異なり、９６％同一である。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１とは、２個のアミノ酸、すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ酸１及びアミノ酸２が欠落する。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２とは、２個のアミノ酸、すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のアミノ酸１及びアミノ酸２が欠落する。
開示されたＧＡＡ結合ドメイン及びこのドメインを含むタンパク質の１つの利点は、これらがＧＡＡに特異的に結合するという機能的特徴である。このことは、ＧＡＡの精製におけるアフィニティーリガンドとしての使用に特に有利である。本発明のＧＡＡ結合タンパク質は、２００ｎＭ未満のＧＡＡに対する結合親和性により機能的に特徴づけられる。本発明のＧＡＡ結合タンパク質は、実施例３に示されるように、２００ｎＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下、又はより好ましくは５０ｎＭ以下の解離定数ＫＤでＧＡＡと結合する。
多量体。本発明の１つの実施形態において、ＧＡＡ結合タンパク質は、互いに結合した１個、２個、３個、４個、５個、又は６個のＧＡＡ結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ＧＡＡ結合タンパク質は、例えば、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、又は六量体とすることができる。好ましいＧＡＡ結合タンパク質は、単量体又は二量体である。本発明のタンパク質の多量体は、概して当業者に周知の組換えＤＮＡ技術によって、人工的に生成された融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、多量体はホモ多量体であり、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の二量体）に示されるように、ＧＡＡ結合タンパク質のアミノ酸配列が同一である。他の実施形態において、多量体はヘテロ多量体であり、例えばＧＡＡ結合タンパク質のアミノ酸配列が異なる。
融合タンパク質。１つの実施形態によれば、本明細書には、本明細書を通して開示される１つ又は複数の、例えば２個のＧＡＡ結合ポリペプチドを含む融合タンパク質が提供される。より具体的には、融合タンパク質は、本明細書に開示される１つ又は複数のＧＡＡ結合ポリペプチド及び開示されるポリペプチドとは異なるさらなるポリペプチドを含む。各種実施形態において、本明細書に開示されるＧＡＡ結合ポリペプチドとは異なるさらなるポリペプチドは、例えば、限定しないが、免疫グロブリンのＦｃ部分に結合しないタンパク質などの、非Ｉｇ結合タンパク質であってよい。いくつかの実施形態において、非Ｉｇ結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に対して少なくとも８０％の相同性を有する。いくつかの実施形態において非Ｉｇ結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に対して少なくとも８９．５％の相同性を有する。例示的な非Ｉｇ結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１のアミノ酸配列中に示される。したがって、いくつかの実施形態は、本明細書に開示される１つ又は２つのＧＡＡ結合ポリペプチド及び１つ又は２つの非Ｉｇ結合ポリペプチドを含む融合タンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、以下の、
（ａ）ＧＡＡ結合タンパク質－非Ｉｇ結合タンパク質；
（ｂ）非Ｉｇ結合タンパク質－ＧＡＡ結合タンパク質；
（ｃ）非Ｉｇ結合タンパク質－ＧＡＡ結合タンパク質－非Ｉｇ結合タンパク質（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９を参照のこと）；
（ｄ）ＧＡＡ結合タンパク質－非Ｉｇ結合タンパク質－非Ｉｇ結合タンパク質（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を参照のこと）。
（ｅ）ＧＡＡ結合タンパク質－ＧＡＡ結合タンパク質－非Ｉｇ結合タンパク質－非Ｉｇ結合タンパク質（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５を参照のこと）；
（ｆ）非Ｉｇ結合タンパク質－非Ｉｇ結合タンパク質－ＧＡＡ結合タンパク質
の組み合わせ（Ｎ－末端からＣ－末端まで）を含んでよい。
非Ｉｇ結合タンパク質とＧＡＡ結合タンパク質ドメインの他の組み合わせも、当業者にとって実行可能である。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＧＡＡ結合タンパク質、又はこれに対して少なくとも９５％のアミノ酸相同性を有するＧＡＡ結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＧＡＡ結合タンパク質、又はこれに対して少なくとも９５％のアミノ酸相同性を有するＧＡＡ結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のＧＡＡ結合タンパク質、又はこれに対して少なくとも９５％のアミノ酸相同性を有するＧＡＡ結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のＧＡＡ結合タンパク質、又はこれに対して少なくとも９５％のアミノ酸相同性を有するＧＡＡ結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のＧＡＡ結合タンパク質、又はこれに対して少なくとも９５％のアミノ酸相同性を有するＧＡＡ結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のＧＡＡ結合タンパク質、又はこれに対して少なくとも９５％のアミノ酸相同性を有するＧＡＡ結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のＧＡＡ結合タンパク質、又はこれらに対して少なくとも９５％のアミノ酸相同性を有するＧＡＡ結合タンパク質を含む。いくつかの好ましい実施形態において、融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＧＡＡ結合タンパク質を含む。他の好ましい実施形態において、融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のＧＡＡ結合タンパク質を含む。他の好ましい実施形態において、融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のＧＡＡ結合タンパク質を含む。他の好ましい実施形態において、融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のＧＡＡ結合タンパク質を含む。他の好ましい実施形態において、融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のＧＡＡ結合タンパク質を含む。
融合タンパク質の部分は、ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌ型で互いに直接結合されてよく、又はリンカーにより結合されてよく、このリンカーは好ましくはペプチドリンカーである。各種実施形態において、ペプチドリンカーを、融合タンパク質の２つの部分を立体的に分離するアミノ酸配列とみなすことができる。典型的には、このようなリンカーは、１～１０個のアミノ酸から成る。
融合タンパク質は、本発明のＧＡＡ結合ポリペプチドをコードする遺伝子を本明細書で上述したポリペプチドと異なるポリペプチドをコードする遺伝子と遺伝的に融合又は結合することにより形成されるタンパク質として特徴づけられることができる。したがって、融合タンパク質を、同時に翻訳された（間に終止コドンがない）２個又はそれ以上の遺伝子の産物とみなすことができる。
精製用又は検出用の分子。いくつかの実施形態において、ＧＡＡ結合タンパク質又はＧＡＡ結合タンパク質を含む融合タンパク質はまた、例えば、Ｎ－末端及び／又はＣ－末端への追加の配列などの、Ｎ－末端及び／又はＣ－末端に追加のアミノ酸残基を含んでよい。追加の配列は、例えば、精製又は検出用などに導入された配列を含んでよい。このような配列の典型的な例としては、限定されないが、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２等を参照）、オリゴヒスチジンタグ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、インテイン、インテイン断片、又はプロテインＧのアルブミン結合ドメイン又は他のものが挙げられる。１つの実施形態において、追加のアミノ酸配列は、特定のクロマトグラフィーカラム材料に対する親和性を与える１つ又は複数のペプチド配列を含む。ＧＡＡ結合タンパク質又はＧＡＡ結合タンパク質を含む融合タンパク質は、好ましくはＣ－末端に、システイン又はリシンなどの、固体支持体に対して付着するための特異的付着部位を含んでよい。Ｃ－末端システインを有するＧＡＡ結合タンパク質の例はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、８に示される。Ｎ－末端追加アミノ酸を有する本発明のＧＡＡ結合タンパク質の例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示される。
ＧＡＡ結合タンパク質の生成方法。本発明はさらに、ＧＡＡに対する結合親和性を有する本明細書に開示される新規なＧＡＡ結合ポリペプチドの生成方法であって、この方法は、以下の（ｉ）ポリペプチドの母集団を提供するステップ、（ｉｉ）（ｉ）のポリペプチドの母集団をＧＡＡと接触させるステップ、（ｉｉｉ）ＧＡＡに結合したＧＡＡ結合ポリペプチドを含む複合体を同定するステップ、及び（ｉｖ）ＧＡＡと結合することができるＧＡＡ結合ポリペプチドを取得するステップである、ステップを含む、方法を提供する。
ＧＡＡに対する結合親和性を有する新規なＧＡＡ結合ポリペプチドの生成方法は、ＧＡＡに対するこのポリペプチドの結合親和性を決定する追加のステップを含んでよい。結合親和性は、本明細書の他の箇所に記載されるように決定してよい。
技術的用途における新規なＧＡＡ結合ポリペプチドの使用。本明細書にはまた、技術的用途、好ましくはアフィニティークロマトグラフィーにおけるアフィニティーリガンドとしての使用のための、融合タンパク質を含む、本発明の任意の新規なＧＡＡ結合ポリペプチドの使用も提供される。
本明細書に記載されるように、アフィニティークロマトグラフィー（アフィニティー精製とも呼ばれる）は、分子間の特異的結合相互作用を使用する。タンパク質の固定方法及びアフィニティークロマトグラフィー方法は、タンパク質精製の分野で周知であり、標準的な技術や機器を用いて当業者が容易に実行することができる。
各種実施形態において、アフィニティー精製方法はさらに、アフィニティー精製マトリックスからこれに対して特異的に結合しない一部の又は全ての分子を除去するのに充分な条件下で実行される１つ又は複数の洗浄ステップを含んでよい。開示される使用又は方法に適したアフィニティー精製マトリックスは、当業者に公知である。
固体支持体に対する結合。本発明の各種態様及び／又は実施形態において、上述した方法のいずれかにより生成又は取得された新規なポリペプチドを含む本明細書に開示される新規なポリペプチドは、固体支持体に結合する。本発明のいくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ポリペプチドが固体支持体に部位特異的に共有結合するための付着部位を含む。特異的な付着部位は、限定されないが、固相の反応基と特異的な化学反応を起こすことができる、システイン又はリシンなどの天然アミノ酸、又は固相とタンパク質との間のリンカーを含む。
アフィニティー精製マトリックス。別の実施形態において、上述した方法のいずれかによって同定されるポリペプチドを含む、ＧＡＡ結合ポリペプチドを含有するアフィニティー精製マトリックスを備える。
好ましい実施形態において、アフィニティー精製マトリックスは、固体支持体である。アフィニティー精製マトリックスは、本発明によって提供される少なくとも１つのＧＡＡ結合ポリペプチドを含む。したがって、本明細書に開示される新規なＧＡＡ結合タンパク質は、アフィニティーマトリックスによってＧＡＡを精製する使用も含む。
アフィニティークロマトグラフィー用の固体支持体は、当該技術分野において公知であり、これらに限定されないが、アガロース及びアガロースの安定化された誘導体、セルロース又はセルロースの誘導体、細孔性ガラス、モノリス、シリカ、酸化ジルコニウム、酸化チタン、又は合成ポリマー、及び様々な組成物のヒドロゲル、並びに上のものの組み合わせが挙げられる。
固体支持体マトリックスの形式は、任意の適した周知の種類のものとすることができる。本発明の新規なタンパク質又はポリペプチドを結合するためのこのような固体支持体マトリックスは、例えば、限定されないが、以下の、カラム、毛細管、粒子、膜、フィルター、モノリス、繊維、パッド、ゲル、スライドグラス、プレート、カセット、又はクロマトグラフィーで普通に用いられ、当業者に公知の任意の他の形式の１つなどを含んでよい。
１つの実施形態において、マトリックスは、例えばセファロース又はアガロースビーズなどの、ビーズとしても知られる、実質的に球形の粒子から成る。粒子形のマトリックスは、充填床として又は拡張床を含む懸濁形で用いることができる。本発明の他の実施形態において、固体支持体マトリックスは、例えばヒドロゲル膜などの、膜である。いくつかの実施形態において、アフィニティー精製は、本発明のＧＡＡ結合タンパク質が共有結合したマトリックスとしての膜を含んでよい。固体支持体はまた、カートリッジ中の膜の形とすることもできる。
いくつかの実施形態において、アフィニティー精製は、本発明の新規なタンパク質が共有結合した固体支持体マトリックスを含むクロマトグラフィーカラムを含む。本発明の新規なタンパク質又はポリペプチドは、従来の結合技術により適した固体支持体マトリックスに付着してよい。タンパク質リガンドを固体支持体に固定する方法は、タンパク質工学及び精製の分野で周知であり、標準的な技術及び機器を用いて当業者が容易に実行することができる。
ＧＡＡの製造方法。さらなる実施形態は、ＧＡＡタンパク質を特異的に結合する親和性を有するアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを使用する少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを含むこれらのＧＡＡ又はＧＡＡを含有するタンパク質の製造プロセスに関し、上述したＧＡＡに対するアフィニティーリガンド（結合タンパク質）は、このアフィニティークロマトグラフィーマトリックスに結合する、プロセスに関する。
ＧＡＡの存在の決定方法。さらにいくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＧＡＡ結合タンパク質又は本明細書に記載される融合タンパク質は、ＧＡＡの存在を決定するための方法に用いられる。いくつかの実施形態は、液体サンプル中のＧＡＡの存在を分析する方法に関し、この方法は、以下の、（ａ）ＧＡＡを含有する液体を提供するステップ、（ｂ）ＧＡＡ結合タンパク質（又は融合タンパク質）を提供するステップ、（ｃ）少なくとも１つのＧＡＡ結合タンパク質（又は融合タンパク質）のＧＡＡに対する結合を可能にする条件下ＧＡＡを含有する液体を本明細書に記載されるＧＡＡ結合タンパク質と接触させるステップ、（ｄ）ＧＡＡとＧＡＡ結合タンパク質（又は融合タンパク質）との複合体を分離するステップ、及び（ｅ）（ａ）の液体中のＧＡＡの量を示すＧＡＡ結合タンパク質（又は融合タンパク質）の量を決定するステップ、のステップを含む。
ＧＡＡの定量方法。さらなる実施形態は、ＧＡＡの定量化方法に関し、この方法は、（ａ）ＧＡＡを含有する液体を提供すること、（ｂ）本明細書に記載されるＧＡＡ結合タンパク質（又は融合タンパク質）が共有結合したマトリックスを提供すること、（ｃ）少なくとも１つのＧＡＡ結合タンパク質（又は融合タンパク質）のＧＡＡに対する結合を可能にする条件下このアフィニティー精製マトリックスを液体と接触させること、（ｄ）このＧＡＡを溶出すること、及び任意選択的に、（ｅ）溶出したＧＡＡの量を定量化することを含む。液体サンプル中のＧＡＡの存在を決定するための方法は、定量的であっても定性的であってもよい。このような方法は当業者にとって周知であり、例えば、限定されないが、以下の、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素反応、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）又はクロマトグラフィーなどの当該技術分野において確立された方法から選択することができる。
ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞。１つの実施形態は、本明細書に開示されるＧＡＡ結合ポリペプチドをコードする分離されたポリヌクレオチド又は核酸分子を含む。さらなる実施形態はまた、本明細書に開示されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む。さらに、ベクター、特に、本発明の分離されたポリヌクレオチド又は核酸分子を含む、発現ベクター、並びに分離されたポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。例えば、本明細書に開示されるポリペプチドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドは、適した宿主中で発現されてよく、産生されたタンパク質は分離することができる。ベクターとは、タンパク質をコードする情報を宿主細胞へと導入するために用いることができる任意の分子又は実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ又はウィルス）を意味する。本発明に適用されることができる適したベクターは、当該技術分野において公知である。
さらに、本明細書に開示されるポリヌクレオチド若しくは核酸又はベクターを含む分離された細胞を提供する。適した宿主細胞は、例えば、ベクターを保有する細菌性宿主細胞、酵母宿主細胞、又は非ヒト宿主細胞などの、原核生物又は真核生物を含む。適した細菌性発現宿主細胞又はシステムは、当該技術分野において公知である。当該技術分野において公知の各種哺乳又は昆虫細胞培養システムも、組み換えタンパク質を発現するために使用することができる。
本発明のタンパク質の製造方法。さらなる実施形態において、記載されるＧＡＡ結合ポリペプチドの製造方法を提供し、この方法は、（ａ）このＧＡＡ結合ポリペプチドを取得するようＧＡＡ結合ポリペプチドの発現に適した条件下で（適した）宿主細胞を培養するステップ、及び（ｂ）任意選択的にこのＧＡＡ結合ポリペプチドを分離するステップ、のステップを含む。原核生物又は真核生物宿主を培養するための適した条件は、当業者にとって周知である。
ＧＡＡ結合ポリペプチドは、簡単な有機合成戦略、固相補助合成手法などの任意の従来の周知の技術、又は市販の自動合成装置により調製してよい。これらはまた、従来の組み換え技術を単独で、又は従来の合成技術と組み合わせて調製してよい。
１つの実施形態において、上で詳述したように、ＧＡＡ結合タンパク質の調製方法を提供し、この方法は、（ａ）ＧＡＡ結合ポリペプチドをコードする核酸分子を提供するステップ、（ｂ）この核酸分子を発現ベクターに導入するステップ、（ｃ）この発現ベクターを宿主細胞に導入するステップ、（ｄ）この宿主細胞を培地で培養するステップ、（ｅ）この宿主細胞をこのＧＡＡ結合ポリペプチドの発現に適した培養条件にかけて、それによりこのＧＡＡ結合ポリペプチドを産生するステップ、任意選択的に（ｆ）ステップ（ｅ）で産生されたこのタンパク質又はポリペプチドを分離するステップ、及び（ｇ）任意選択的にこのタンパク質又はポリペプチドを上述した固体マトリックスに結合させるステップを含む。本発明の各種実施形態において、ＧＡＡ結合ポリペプチドの産生は、無細胞インビトロ転写及び翻訳により実行される。
以下の実施例は、本発明のさらなる例示を提供する。しかしながら本発明は、これに限定されず、以下の実施例は上の記載に基づいた本発明の実行可能性を示すに過ぎない。
本発明のさらなる例示のために以下の実施例を提供する。しかしながら、本発明はこれに限定されず、以下の実施例は、上の記載に基づいた本発明の実行可能性を示すに過ぎない。本発明の完全な開示のために、本出願に参照により完全に援用される本出願に引用される文献にも参照がなされる。
実施例１．本発明のＧＡＡ結合タンパク質の選択
ライブラリ構築及びライブラリのクローニング。無作為化されたアミノ酸位置を含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるタンパク質Ａ様構造を有する安定な非免疫グロブリン結合タンパク質に基づくライブラリを、バランスがとれて、同時に無作為化された位置のシステイン及び他のアミノ酸残基を排除したアミノ酸分布を達成するために合成トリヌクレオチドホスホロアミダイト（ＥＬＬＡ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により生成された無作為化されたオリゴヌクレオチドにより社内で合成した。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の、少なくともアミノ酸位置７、８、１０、１１、１４、１５、１８、２０、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５３及び５４を無作為化した。
対応するｃＤＮＡライブラリを、ＰＣＲにより増幅し、ｐＣＤ３３－ＯｍｐＡファージミドにより連結した。ライゲーション混合物のアリコートを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８（Ｌｕｃｉｇｅｎ）のエレクトロポレーション用に用いた。別段の指示がない限り、確立した組み換え遺伝子法を用いた。
ＴＡＴファージディスプレイ法による一次選択。ナイーブなライブラリを、選択システムとしてファージディスプレイ法を用いるビオチン化ＧＡＡ（マイオザイム又はアルグルコシダーゼアルファとしても知られる、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（商標））に対して濃縮した。ライブラリを保有するファージミドｐＣＤ３３－ＯｍｐＡでコンピテントバクテリアＥＲ２７３８細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎｅ）を形質転換した後、ファージ増幅及び精製を、当業者にとって公知の標準的な方法を用いて実行した。溶媒中のビオチン化ＧＡＡとファージライブラリ間の結合を可能とするために、溶液中選択法（ＳＩＳ）を利用した。ＧＡＡ－ファージ複合体をストレプトアビジン／ニュートラアビジン磁気ビーズにより捕捉した。ファージインキュベーション中のＧＡＡ濃度を、２００ｎＭ（１回目）から１００ｎＭ（２回目）へ、５０ｎＭ（３回目）へ、そして２５ｎＭ（４回目）へ薄めた。各回において空の磁気ビーズによる事前選択を実行した。各選択回後、ＧＡＡが結合したファージをトリプシンにより溶出した。標的特異的なファージプールを同定するために、溶出し、再増幅した各選択回のファージを、ファージプールＥＬＩＳＡにより分析した。中結合マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）のウェルをストレプトアビジンでプレコートし（１０μｇ／ｍｌ）、その後ビオチン化ＧＡＡでコーティングした（２．５μｇ／ｍｌ）。結合したファージをα－Ｍ１３ ＨＲＰ結合抗体（ＧＥヘルスケア）を用いて検出した。
標的結合ファージプールの発現ベクターへのクローニング。ファージプールＥＬＩＳＡにおいてＧＡＡに対する特異的結合を示した選択プールを、当該技術分野において公知の方法に従ってＰＣＲにより増幅し、適切な制限酵素により切断し、プロリン、セリン、及びアラニン並びにｓｆＧＦＰから成る１０個のアミノ酸リンカーを含む発現ベクターｐＥＴ－２８ａ（Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の誘導体に連結した。
実施例２．ＧＡＡ結合タンパク質の発現及び精製
実施例１に記載された選択により同定されたヒットをスクリーニング後に同定し、タンパク質をμ単位で産生した（Ｐｈｙｎｅｘｕｓ）。
Ｔ７プロモーターの調節下、低コピープラスミドシステムを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中に構築物を発現した。培地中に含まれるラクトースによる誘導後（自己誘導培地）、タンパク質を可溶型で産生した。ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を発現プラスミドで形質転換し、選択的寒天プレート（カナマイシン）上に広げ、３７℃で一晩インキュベートした。５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補充した３ｍｌの２ｘＹＴ培地中の単一コロニーから予備培養を植え付け、３７℃で６時間、従来のオービタルシェーカー中２００ｒｐｍで、培養試験管中で培養した。主要な培養を、１Ｌエルレンマイヤーフラスコ中５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補充した３００ｍＬ ＺＹＭ－５０５２（０．５％グリセロール、０．２％ラクトース、０．０５％グルコース、０．５％酵母抽出物、１．０％カザミノ酸、２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４及び微量元素）で３ｍＬの予備培養を植え付けた。培養物をオービタルシェーカーに移し、３０℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。組み換えタンパク質の発現は、グルコースを代謝させ、その後ラクトースを細胞に入れさせることにより誘導した。細胞を約１７時間一晩増殖させて約２～４の最終ＯＤ６００を達成した。採取する前に、ＯＤ６００を測定し、０．６／ＯＤ６００に調整した試料を取り出し、ペレット状にし、－２０℃で凍結した。バイオマスを収集するために、細胞を２２℃で１５分間、１２０００ｘｇで遠心分離機にかけた。ペレットを秤量した（湿重量）。細胞を処理する前に、－２０℃で保管した。
アフィニティータグを有するタンパク質をアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除により精製した。アフィニティークロマトグラフィー精製後、Ａｅｋｔａシステム及びＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ ＨｉＬｏａｄ １６／６００カラム（ＧＥヘルスケア）を用いてサイズ排除クロマトグラフィー（（ＳＥ ＨＰＬＣ又はＳＥＣ））を実行した。ＳＥＣカラムは、１２０ｍｌの体積を有し、２ＣＶで平衡させた。試料を流速１ｍｌ／分でかけた。分画分取は、シグナル強度が１０ｍＡＵに達する時に開始する。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の後、正の分画をためて、タンパク質濃度を測定した。さらなる分析には、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＲＰ－ＨＰＬＣが含まれた。タンパク質濃度は、モル吸収係数を用いた２８０ｎｍでの吸光度測定により決定した。逆相クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）は、Ｄｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣシステム及びＰＬＲＰ－Ｓ（５μｍ、３００Å）カラム（アジレント）を用いて実行した。
ＧＡＡ結合タンパク質及び非Ｉｇ結合タンパク質の融合タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、１５、１９、２０）は、以下の、Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ ２７５ｍｌ（ｐＨ６）（緩衝液Ａ：２０ｍＭ ＢｉｓＴｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ６；緩衝液Ｂ：２０ｍＭ ＢｉｓＴｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣＬ ｐＨ６）、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ ２３６ｍｌ（緩衝液Ａ：２０ｍＭ ＢｉｓＴｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４ ｐＨ６；緩衝液Ｂ：２０ｍＭ ＢｉｓＴｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６）、Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ５６０ｍｌの方法により精製した。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４（ＣＩＤ２０４８７０）を、細胞培地体積１Ｌあたり１ｇタンパク質の収率で首尾よく精製した。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を、細胞培地体積１Ｌあたり１０ｇタンパク質の収率で首尾よく精製した。
実施例３．表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によるタンパク質の分析
５００－１５００ＲＵのＧＡＡ（ＯＮ－リガンド）をＣＭ－５センサーチップ（ＧＥヘルスケア）上に固定し、このチップをＳＰＲランニングバッファで平衡させた。ＧＡＡをＳｕｌｆｏ－ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎ標準試薬によりビオチン化し、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００）により精製した。標的タンパク質を、ストレプトアビジンをコーティングしたセンサーチップ上へビオチン化した標的を注入することにより固定した。リガンド結合時、タンパク質分析物を表面に蓄積し、屈折率を上げた。この屈折率の変化をリアルタイムで測定し、応答又は共鳴単位対時間としてプロットした。分析物を系列希釈で流速３０μｌ／分で、チップにかけた。会合を１２０秒間実行し、解離を３６０秒間実行した。各ランの後、チップ表面を３０μｌ再生バッファ（１０ｍＭグリシン）で再生し、ランニングバッファで平衡させた。結合試験を、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００（ＧＥヘルスケア）を用いることにより実行し、データ評価を、Ｌａｎｇｍｕｉｒ１：１モデル（ＲＩ＝０）を用いることにより、製造業者により提供された、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．０ソフトウェアにより行った。評価した解離定数（ＫＤ）を、ＧＡＡに対して正規化し、表示した。リアルタイムで測定し、応答又は共鳴単位［ＲＵ］対時間［秒］としてプロットした屈折率の変化を示す。結果。本明細書に開示されるＧＡＡ結合タンパク質は、１００ｎＭ未満の親和性で、固定したＧＡＡに対する強力な特異的結合を示した（表１を参照）。本発明のＧＡＡ結合タンパク質は、ｈＩｇＧと結合しない。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９の融合タンパク質は、ｈＩｇＧと結合せず、親和性は、１００ｎＭ未満の親和性でＧＡＡに特異的である。
Figure 2023507268000002
実施例４．ＧＡＡ精製用アフィニティーリガンドとしての本発明のＧＡＡ結合タンパク質
カップリング効率：２０ｍｇの精製したＧＡＡ結合タンパク質（Ｃ－末端システインを有する）を、製造業者の使用説明書にしたがってｍＬ Ｐｒａｅｓｔｏ（商標）Ｅｐｏｘｙ ８５あたり固定した（カップリングバッファ：５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＴＣＥＰ、２．０５Ｍ Ｎａ２ＳＯ４（又はｍＬ樹脂あたり１７５ｍｇ Ｎａ２ＳＯ４）、ｐＨ９．５、カップリング条件：３５℃で３時間）。結果を表２に示す。
Figure 2023507268000003
ＤＢＣ１０％：ランニングバッファ：２０ｍＭ クエン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．２。第１溶出バッファ：１００ｍＭ クエン酸塩バッファ、２０％（ｖ／ｖ）ヘキシレングリコール、ｐＨ３．５；第２溶出バッファ：０．１Ｍ クエン酸塩、ｐＨ２．０（溶出比の決定）。動的結合容量（ＤＢＣ）を、滞留時間６分、１０％破過で注入したＧＡＡの質量により決定した。結果．結合した樹脂は、アフィニティーリガンド（Ｃ－末端Ｃｙｓを有する）の優れた動的結合容量（ＤＢＣ１０％）を示した。
●ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で少なくとも２７ｍｇ／ｍｌのＤＢＣ１０％を有する
●ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１二量体で少なくとも２４ｍｇ／ｍｌのＤＢＣ１０％を有する
●ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１融合タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）で少なくとも２２．７ｍｇ／ｍｌである
●ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で少なくとも１６ｍｇ／ｍｌのＤＢＣ１０％を有する
腐食安定性（サイクル試験）。Ｐｒａｅｓｔｏ（商標）Ｅｐｏｘｙ ８５にカップリングした試料（カップリング条件：２０ｍｇ／ｍｌ、３時間、３５ｏＣ、２．０５Ｍ Ｎａ２ＳＯ４ ｐＨ８．５）を室温で少なくとも１０時間（６１０分）、０．１Ｍ ＮａＯＨで処理した。
結果：アフィニティーリガンド（Ｃ－末端Ｃｙｓを介してカップリングした）は、サイクル試験において優れた腐食安定性を示した。
●ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（Ｎ－末端伸長）で９５％の残存容量を有する
●ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１二量体
〇６１０分（約１０時間）後９４．４％の残存容量を有する
〇１５１５分（２５時間）（１０１サイクルに等しい）後８４．４％の残存容量を有する
図２は、Ｐｒａｅｓｔｏ（商標）Ｅｐｏｘｙ ８５樹脂上のサイクル試験を示す。図２Ａは、滞留時間６分で、Ｐｒａｅｓｔｏ（商標）Ｅｐｏｘｙ ８５上でのＳＥＤ ＩＤ ＮＯ：１（Ｎ－末端伸長を有する）についてのＤＢＣ１０％を示す。結合容量は、１９．５ｍｇ／ｍｌだった。図２Ｂは、Ｐｒａｅｓｔｏ（商標）Ｅｐｏｘｙ ８５樹脂にカップリングされ、２ｍｇ／ｍｌ ＧＡＡをロードしたＧＡＡ結合タンパク質（Ｎ－末端伸長を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のＤＢＣ１０％及び腐食安定性を示す。５０回ロード、溶出、及び０．１Ｍ ＮａＯＨ再生サイクル後の残存容量は、少なくとも９０％だった。
表３は、充填カラム形式でＮａＯＨ中にインキュベートされた固定したアフィニティーリガンドについての結果を示す。
Figure 2023507268000004

Claims (15)

  1. １つ又は複数の酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）結合ドメインを含むＧＡＡ結合タンパク質であって、少なくとも１つのドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１若しくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１若しくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対して少なくとも９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、ＧＡＡ結合タンパク質。
  2. 前記ＧＡＡ結合タンパク質は、ＧＡＡに対して２００ｎＭ未満の結合親和性を有する、請求項１に記載のＧＡＡ結合タンパク質。
  3. 前記ＧＡＡ結合タンパク質は、互いに結合した２、３、４、５、又は６個のドメインを含む、請求項１に記載のＧＡＡ結合タンパク質。
  4. 前記ＧＡＡ結合タンパク質は、ホモ多量体である、請求項３に記載のＧＡＡ結合タンパク質。
  5. 前記ＧＡＡ結合タンパク質は、ヘテロ多量体である、請求項３に記載のＧＡＡ結合タンパク質。
  6. １つ又は複数のドメインは、直接又は１つ又は複数のペプチドリンカーにより互いに結合される、請求項３に記載のＧＡＡ結合タンパク質。
  7. 請求項１～６のいずれか一項に記載のＧＡＡ結合タンパク質を含む融合タンパク質。
  8. 請求項１～６のいずれか一項に記載のＧＡＡ結合タンパク質、又は請求項７に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  9. ＧＡＡのアフィニティー精製に使用するための請求項１～６のいずれか一項に記載のＧＡＡ結合タンパク質、又は請求項７に記載の融合タンパク質。
  10. アフィニティー精製マトリックスに対するカップリング用の１つ又は複数のカップリング部位をさらに含み、好ましくは前記ＧＡＡ結合タンパク質は、アフィニティー精製マトリックスに対するカップリング用の１つ又は複数のシステイン残基を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のＧＡＡ結合タンパク質、又は請求項７に記載の融合タンパク質。
  11. 請求項１～６のいずれか一項に記載のタンパク質、又は請求項７に記載の融合タンパク質を含むアフィニティー精製マトリックス。
  12. ＧＡＡのアフィニティー精製用の請求項１～６、１０のいずれか一項に記載のＧＡＡ結合タンパク質、若しくは請求項７に記載の融合タンパク質、又は請求項１１に記載のアフィニティー精製マトリックスの使用。
  13. ＧＡＡのアフィニティー精製方法であって、前記方法は、（ａ）ＧＡＡを含有する液体を提供すること、（ｂ）アフィニティー精製マトリックスに結合した請求項１～６、１０のいずれか一項に記載の少なくとも１つのＧＡＡ結合タンパク質、又は請求項７に記載の融合タンパク質を含む前記アフィニティー精製マトリックスを提供すること、（ｃ）請求項１～６、１０のいずれか一項に記載の少なくとも１つのＧＡＡ結合タンパク質のＧＡＡに対する結合を可能にする条件下で前記アフィニティー精製マトリックスを前記液体と接触させること、及び（ｄ）前記ＧＡＡを前記アフィニティー精製マトリックスから溶出することを含む、方法。
  14. ＧＡＡの存在を判定する方法における、請求項１～６に記載のＧＡＡ結合タンパク質又は請求項７に記載の融合タンパク質の使用。
  15. 液体サンプル中のＧＡＡの存在を分析する方法であって、前記方法は、以下の、
    （ｉ）ＧＡＡを含有する液体を提供するステップ、
    （ｉｉ）請求項１～６に記載のＧＡＡ結合タンパク質、又は請求項７に記載の融合タンパク質を提供するステップ、
    （ｉｉｉ）請求項１に記載の少なくとも１つのＧＡＡ結合タンパク質又は請求項７に記載の融合タンパク質のＧＡＡに対する結合を可能にする条件下で（ｉ）の液体を請求項１～６に記載のＧＡＡ結合タンパク質と接触させるステップ、
    （ｉｖ）ＧＡＡと請求項１～６に記載のＧＡＡ結合タンパク質又は請求項７に記載の融合タンパク質との複合体を分離するステップ、及び
    （ｖ）（ｉ）の液体中の請求項１～６に記載のＧＡＡ結合タンパク質又は請求項７に記載の融合タンパク質の量を定量するステップを含む、
    方法。
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