KR20220087402A - 다중특이성 항체 및 그 제조 방법과 용도 - Google Patents

다중특이성 항체 및 그 제조 방법과 용도 Download PDF

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닐리앙 치앤
홍지에 리
쿠이마 양
푸유 왕
시우지에 판
윤후이 리우
동메이 후
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Abstract

본원은 다중특이성 항체 및 그 제조 방법과 용도를 제공한다. 상기 다중특이성 항체는:
a) 경쇄, 및 중쇄의 CH1과 가변 영역으로 구성되는, 제1 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편;
b) N 말단이 상기 중쇄와 융합되는, 제1 펩타이드 링커;
c) N 말단이 상기 경쇄와 융합되는, 제2 펩타이드 링커를 포함하며,
상기 제1 펩타이드 링커와 상기 제2 펩타이드 링커 사이에는 하나의 이황화 결합만이 형성될 수 있고, 상기 제1 펩타이드 링커 및 상기 제2 펩타이드 링커는 각각 독립적으로 서열번호 1 내지 2로 표시되는 서열 중 어느 하나를 포함하는 펩타이드 링커로부터 선택되며, 여기에서 X는 Cys를 제외한 임의의 아미노산을 나타내거나 또는 결실된다.
상기 항체는 재조합 발현에 의하여 쉽게 생성될 수 있으며, 두 개의 상이한 항원 또는 동일 항원의 상이한 에피토프, 또는 보다 많은 상이한 항원의 다수 개의 에피토프를 동시에 표적화하고 이와 결합할 수 있다.

Description

다중특이성 항체 및 그 제조 방법과 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2019년 10월 24일 출원된 중국 특허출원 제 201911015236.1호에 대한 우선권을 주장하며, 해당 출원은 전문이 참조로 본원에 통합된다.
기술분야
본원은 일반적으로 항체 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본원은 다중특이성 항체 및 그 제조 방법과 용도에 관한 것이다.
이미 잘 알려진 바와 같이, 천연 항체 분자의 대부분은 2가의 단일특이성 분자이다. 그러나 과거 반 세기 동안, 항체 공학의 발전으로 인하여, 여러 종류의 이중특이성 분자와 다중특이성 분자가 인공적으로 생산되었다. 그 형태는 매우 다양하며, 예컨대 단쇄 Fv 항체(scFv, Huston 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA，85:5879-5883(1988)), 4가 IgG-scFv 융합체(Coloma & Morrison, Nat. Biotechnol.，15:159-163(1997)), 2쇄 항체(diabody)(Holliger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA，90:6444-6448(1993)), 직렬 scFv 분자(예: Bargou 등, Science321，974-977(2008) 참조), 4가 IgF-유사 이중 가변 구조 영역 항체 ("DVD-Ig", Wu 등, Nat. Biotechnol.，25:1290-1297(2007)), 4가 Fab 직렬 면역 글로불린("FIT-Ig"), (WO 2015/103072，Epimab Biotheraupeutics), 2가 래트/마우스 하이브리드 이중특이성 IgG(Lindhofer 등, Journal of Immunology, 155: 219-225(1995)) 및 이중특이성 Crossmab 결합 단백질(예: WO 2013/026831(Roche Glycart AG)；WO 2014/167022(Engmab AG) 참조)을 포함한다. 이중특이성 또는 다중특이성 항체는 두 개 또는 다수 개의 상이한 에피토프 또는 항원 표적점과 결합할 수 있고, 일부 연합 분자에 결핍된 새로운 기능을 갖추고 있으므로(예: Sergey 등, Drug Des Devel Ther. 12: 195-208 (2018)의 총론 참조), 각종 종양의 치료에 이용되는 이중특이성 또는 다중특이성 항체, 특히 "T 세포의 리디렉션(redirection)"에 사용되는 이중특이성 항체는 점점 더 많은 주목을 받고 있다. 이러한 이중특이성 항체는 종양 세포 상의 표면항원과 T세포 수용체(TCR) 복합물의 활성 성분(예: CD3)을 동시에 표적화함으로써, 종양을 표적화하여 공격하는 세포 독성 T 림프구(CTL)의 활성화를 유도할 수 있다. 이러한 유형의 이중특이성 항체의 대표적인 형태는 "이중특이성 T세포 접합체" 또는 "BiTe" 항체로서, 예컨대, 글리신-세린(G4S) 링커로 연결된 두 개의 scFv 항체를 포함하며, 그 중 한 개의 scFv는 종양 항원(예컨대, 17-1A 종양 항원)의 결합 부위를 제공하고, 다른 한 개의 scFv는 T림프구 상의 CD3 항원의 결합 부위를 제공한다(Mack 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA，92: 7021-7025(1995)). 항 CD3×항 CD19 BiTE 항체인 Blinatumomab은 이미 희귀한 형태의 B 세포 급성 림프구성 백혈병(ALL)의 치료를 위한 사용에 대하여 미국 식품의약국(FDA)의 승인을 받은 바 있다. T 세포 재배치를 위한 다른 이중특이성 항체의 형태는 4가 직렬 이중쇄항체("TandAB", Kipriyanov 등, J. Mol. Biol., 293: 41-56(1999); Arndt 등, Blood, 94: 2562-2568(1999)) 및 이중친화성 재표적화 단백질("DART", Johnson 등, J. Mol. Biol., 399: 436-449(2010)) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
잘 알려진 바와 같이, Fc를 함유하는 전장 이중특이성 항체의 형태는 비교적 긴 반감기를 가지며, Fc 이펙터 기능을 갖추고 있다. 그러나, 전장 이중특이성 항체는 Fc 영역의 헤테로다이머 조립성과 안정성을 향상시키기 위하여, 노브인투홀(knobs-into-holes)("KIH") 기술(Ridgeway 등, Protein Eng., 9: 617-621(1996))을 사용하여야 한다. 다만, 헤테로다이머 매치성과 경쇄 미스매치 등은 여전히 목표 산물의 안정성 저하와 일련의 비목표 산물의 생성을 유도하여, 분자 발현과 정제에 어려움을 유도하는 원인이 된다. Fc가 이중특이성 항체에 비교적 긴 반감기를 부여하나, 이 또한 헤테로다이머의 형성을 방해하는 원인 중 하나이며, Fc 이펙터 기능은 일부 약물 설계에서는 필수적이지 않을 뿐 아니라 약물의 기능에 간섭할 수 있다. 따라서, Fc 이펙트를 피하기 위하여, 일부 이중특이성 항체는 BiTE, 이중쇄항체, DART 및 TandAb와 같은 단쇄 형태를 사용하여, 펩타이드 링커를 통해 상이한 가변 도메인을 연결함으로써 이중특이성을 구현한다. 전체 크기를 가지는 단일 클론 항체와 비교했을 때, 이들 분자는 크기가 보다 작고 조직과 종양에 보다 신속하게 진입할 수 있다는 장점이 있으며, 단점은, 이러한 형태들이 Fc 영역을 비포함하여 분자량이 일반적으로 60 kDa 미만이며, 신장에서 제거됨으로 인하여 매우 짧은 반감기를 갖게 될 수 있고, 물리적으로도 불안정하다는 것이다 (Spiess 등(2015), 상기 인용문헌 참조). 전장 이중특이성 항체의 Fc는 중쇄 호모다이머의 배위와 무관한 비활성 분자 부산물의 형성을 유도하며, 단쇄 이중특이성 항체는 안정성이 떨어지고 반감기도 짧으므로, 이 양자 사이의 이중쇄 Fab 항체 형태는 이러한 문제들을 동시에 극복할 가능성을 가지고 있다. 그러나, 하나의 일반적인 링커를 사용하여 두 개 또는 더 많은 개수의 Fab를 서로 융합시킨 구축체는 그 실현 가능성이 낮은데, 이는 두 가닥의 경쇄의 무작위 조합이 여전히 비활성의 불필요한 부산물을 생산할 수 있기 때문이다.
수많은 이중특이성 또는 다중특이성의 항체 형태가 신규한 치료적 항체의 가능한 형태로서 이미 존재한다. 그러나 현재까지는 그 자체로서 대부분의 질병을 치료하는 신규한 치료적 항체를 개발하는 데 사용할 수 있는 완전한 특성을 제공할 수 있는 형태가 존재하지 않는다. 이중특이성 또는 다중특이성 항체의 가능한 응용이 지속적으로 증가하고 있다는 점과 현재의 가용 형태와 관련된 다변적 결과를 고려하면, 특정 질병을 치료하는 항체의 개발과 관련된 특정 과제를 해결하기 위하여 조작할 수 있는 개선된 형태가 여전히 필요하다.
본원에서는 신규한 이중특이성 항체 및 그 제조방법을 제공하며, 상기 이중특이성 항체는 미스매치 부산물의 감소, 목표 산물의 증가로 인하여 생산이 쉬우며, 이 분야에서 공지된 이중특이성 항체 단편보다 더 높은 안정성과 더 적은 응집을 나타낸다. 또한, 이 방법은 기존의 항체에 응용 가능하며, 공통의 경쇄 또는 중쇄를 스크리닝할 필요가 없다. 또한, 많은 단쇄 이중특이성 항체 단편과 비교했을 때, 이 신규한 이중특이성 항체는 보다 높은 분자량을 가져, 신장에서의 과도한 제거를 방지하여 그 체내 반감기를 증가시킬 수 있다.
제1 양상에서, 본원은:
a) 경쇄, 및 중쇄의 CH1과 가변 영역으로 구성되는, 제1 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편;
b) N 말단이 상기 중쇄와 융합되는, 제1 펩타이드 링커;
c) N 말단이 상기 경쇄와 융합되는, 제2 펩타이드 링커를 포함하며,
상기 제1 펩타이드 링커와 상기 제2 펩타이드 링커 사이에는 하나의 이황화 결합만이 형성될 수 있고, 상기 제1 펩타이드 링커 및 상기 제2 펩타이드 링커는 각각 독립적으로 서열번호 1 내지 2로 표시되는 서열 중 어느 하나를 포함하는 펩타이드 링커로부터 선택되며, 서열번호 1 내지 2는 각각 XPPCPAPE 및 EPAPCPPX이고, 여기에서 X는 Cys를 제외한 임의의 아미노산을 나타내거나 또는 결실된 것인, 항체를 제공한다.
제2 양상에서, 본원은 제1 양상의 항체를 코딩하는 핵산을 제공한다.
제3 양상에서, 본원은 제2 양상의 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
제4 양상에서, 본원은 제2 양상의 핵산 또는 제3 양상의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
일부 구체예에서, 상기 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 포유동물 세포는 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포 및 PER.C6 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
제5 양상에서, 본원은 하기를 포함하는, 제1 양상의 항체를 제조하는 방법을 제공한다:
a) 제4 양상의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
b) 상기 숙주 세포 또는 상기 숙주 세포 배양물의 상청액으로부터 상기 항체를 회수하는 단계.
제6 양상에서, 본원은 제1 양상의 항체, 제2 양상의 핵산, 제3 양상의 발현 벡터 또는 제4 양상의 숙주 세포, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
제7 양상에서, 본원은 종양, 자가면역성 질환 또는 전염성 질환의 치료, 개선 또는 예방용 약제 제조에 있어서의, 제1 양상의 항체, 제2 양상의 핵산, 제3 양상의 발현 벡터 또는 제4 양상의 숙주 세포의 용도를 제공한다.
제8 양상에서, 본원은 제1 양상의 항체, 제2 양상의 핵산, 제3 양상의 발현 벡터 또는 제4 양상의 숙주 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 종양, 자가면역성 질환 또는 전염성 질환의 치료, 개선 또는 예방을 위한 방법을 제공한다.
제9 양상에서, 본원은 개체의 종양, 자가면역성 질환 또는 전염성 질환의 치료, 개선 또는 예방을 위한 용도에 사용하기 위한, 제1 양상의 항체, 제2 양상의 핵산, 제3 양상의 발현 벡터 또는 제4 양상의 숙주 세포를 제공한다.
도 1은 본원에서 구축된 이중특이성 또는 다중특이성 항체의 구조도를 나타내며, 여기에서 A는 항 TNFα×항 IL-17A 이중특이성 항체(E1)의 구조도를 나타내고; B는 항 CD137×PD-1 ECD 단백질 이중특이성 항체(E2)의 구조도를 나타내고; C는 항 CD3×항 CD19 이중특이성 항체(E3)의 구조도를 나타내고; D는 항 PD-L1×항 CD137 이중특이성 항체(E4)의 구조도를 나타내고; E는 항 CD3×항 CD137×PD-1 ECD 단백질 삼중특이성 항체(E5)의 구조도를 나타낸다.
도 2는 항 TNFα×항 IL-17A 이중특이성 항체(E1)의 정제 및 SDS-PAGE 전기영동 결과를 나타내며, 여기에서 A는 항체 E1의 Capto L 친화성 크로마토그램을 나타내고, B는 항체 E1의 SDS PAGE 전기영동 결과를 나타내며, 레인 M은 DNA 마커이고, 레인 1은 비환원 조건에서의 SDS-PAGE 전기영동 결과이며, 레인 3은 환원 조건에서의 SDS-PAGE 전기영동 결과이다.
도 3은 HPLC를 통하여 항체 E1의 순도를 검사한 결과를 나타낸다.
도 4는 Fortebio를 통하여 결합 친화력을 측정한 결합-해리 곡선을 나타내며, 여기에서 A는 항체 E1이 항원 TNF-α와 결합할 때의 결합-해리 곡선을 나타내고, B는 아달리무맙이 항원 TNF-α와 결합할 때의 결합-해리 곡선을 나타내며, C는 항체 E1이 항원 IL-17A와 결합할 때의 결합-해리 곡선을 나타내고, D는 세쿠키누맙이 항원 IL-17A와 결합할 때의 결합-해리 곡선을 나타낸다.
도 5는 항체 E2가 세포 표면의 항원과 결합한 유동세포계수법 결과를 나타내며, 여기에서 A는 항체 E2가 MC38-PDL-1 세포와 결합한 유동세포계수법 결과를 나타내고, B는 항체 E2가 B8-CD137 세포와 결합한 유동세포계수법 결과를 나타낸다.
도 6은 본원에서 구축된 각 특이성 항체와 이에 대응되는 항원 사이의 친화력 상수를 측정한 결과를 나타낸다.
본원의 범위를 정의하고 본원의 실시에 있어서 본 분야의 통상의 기술자들을 가이드하기 위하여, 이하의 정의와 방법이 제공된다. 달리 설명되지 않는 한, 본원의 용어는 관련 분야 통상의 기술자들의 일반적인 용법에 의하여 이해될 것이다.
정의
본원에서 사용된 용어 "약"은 기재된 숫자의 ±10%를 가리키며, 예컨대 약 1%라 함은 0.9% 내지 1.1%의 범위를 가리킨다.
본원에서 사용된 용어 "항체"는 원하는 생물학적 활성을 나타낼 수 있는 임의의 형태의 항체 또는 그 단편을 가리킨다. 따라서, 이는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는 원하는 생물학적 활성을 나타낼 수만 있다면, 단일 클론 항체(전장 단일 클론 항체 포함), 다중 클론 항체, 다중특이성 항체(예컨대 이중특이성 항체)와 항체 단편을 모두 포괄한다. 따라서, 본원에서 사용된 용어 "항체"는 또한 원하는 생물학적 활성을 나타낼 수 있는 임의의 형태의 동일 또는 상이한 항체 또는 그 단편의 융합 단백질을 지칭할 수 있고, 그에 따라 다중특이성 항체의 기능을 구현할 수 있다는 점은 당업자에 의해 또한 이해될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "항원"은 항체와 같은 선택적 결합제에 결합 가능한 분자 또는 분자의 일부로서, 이는 상기 항원의 에피토프와 결합할 수 있는 항체를 제조하기 위하여 동물에서도 사용될 수 있다. 항원은 하나 또는 여러 개의 결합 에피토프를 가질 수 있다. 본원의 항원은 대부분의 단백질, 세균, 바이러스, 세균 외독소, 다당류(폐렴구균과 같은 캡슐 다당류)와 지질 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "특이적으로 결합하다"는 본 분야 공지의 용어로서, 항체와 항원의 이러한 특이적 결합을 측정하는 방법 또한 본 분야 공지의 내용이다. 예컨대, 일부 구체예에서, "특이적으로 결합하다"라 함은 항체가 예측되는 표적과는 결합하나 다른 표적과는 유의하게 결합하지 않는 것을 의미한다. 다른 에피토프와의 결합에 비하여, 항체는 상당히 증가된 친화력 및/또는 보다 긴 지속 시간으로 예측되는 표적 에피토프와 결합한다.
본원에서 사용된 용어 "항원 결합 단편"은 그 결합 활성을 실질적으로 보유하고 있는 항체의 단편 또는 유도체를 포함한다. 따라서, 용어 "항원 결합 단편"은 전장 항체의 일부분을 가리키며, 일반적으로는 그 항원 결합 영역 또는 가변 영역이다. 항원 결합 단편의 실례는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 이중체, sc-Fv와 같은 단쇄 항체 분자 및 항체의 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 항원 결합 단편은 실질적으로 그 결합 활성을 변경시키지 않는 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다고 볼 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "Fab 단편"은 하나의 경쇄, 및 하나의 중쇄의 CH1과 가변 영역을 포함한다. Fab 분자의 중쇄는 또다른 중쇄 분자와 이황화 결합을 형성할 수 없다.
본원에서 사용된 용어 "Fab' 단편"은 하나의 경쇄, 및 하나의 중쇄의 부분 또는 단편을 포함하며, 상기 부분 또는 단편은 VH 도메인 및 CH1 도메인, 및 CH1과 CH2 도메인 사이의 영역을 포함하여, 두 개의 Fab' 단편의 두 중쇄 사이에 사슬간 이황화 결합이 형성되어 F(ab')2 분자를 형성할 수 있도록 한다.
본원에서 사용된 용어 "F(ab')2 단편"은 두 개의 경쇄와 두 개의 중쇄를 포함하며, 상기 중쇄는 CH1과 CH2 도메인 사이의 불변 영역의 일부를 포함하여 두 개의 중쇄 사이에 사슬간 이황화 결합이 형성되도록 한다. 따라서 F(ab')2 단편은 두 개의 Fab' 단편으로 구성되며, 두 개의 Fab' 단편은 두 개의 중쇄 간의 이황화 결합을 통하여 서로 연결된다.
본원에서 사용된 용어 "Fv 단편"은 중쇄 및 경쇄로부터 유래된 가변 영역을 포함하나, 불변 영역은 포함하지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "단쇄 Fv" 또는 "scFv"는 항체의 VH 도메인 및 VH 도메인을 포함하는 항체 단편을 가리키며, 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬 형태로 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩타이드는 VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 더 포함하며, 상기 링커는 scFv가 항원 결합을 위하여 원하는 구조를 형성할 수 있도록 한다.
본원에서 사용된 용어 "이중체"는 두 개의 항원결합 위치를 가지는 작은 항체 단편을 의미하며, 상기 단편은 동일한 폴리펩타이드 사슬에서 중쇄 가변 도메인(VH) 및 이와 연결되는 경쇄 가변 도메인(VL)(VH-VL 또는 VL-VH)을 포함한다. 동일 사슬 상의 두 개의 도메인 사이에서 쌍을 발생시킬 수 없는 짧은 링커를 사용함으로써, 각 도메인은 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이루며, 이로써 두 개의 항원결합위치가 생성된다.
본원에서 사용된 용어 "초가변 영역"은 항원 결합을 담당하는, 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 초가변 영역은 "상보적 결정 영역" 또는 "CDR(complementary determining region)"로부터 유래된 아미노산 잔기(예컨대, 경쇄 가변 도메인의 잔기 24 내지 34(LCDR-1), 50 내지 56(LCDR-2) 및 89 내지 97(LCDR-3)과 중쇄 가변 도메인의 잔기 31 내지 35(HCDR-1), 50 내지 65(HCDR-2) 및 95 내지 102(HCDR-3); Kabat 등, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md.), 및/또는 "초가변 고리"로부터 유래된 아미노산 잔기(즉 경쇄 도메인 중의 잔기 26 내지 32(L1), 50 내지 52(L2) 및 91 내지 96(L3)과 중쇄 가변 도메인의 잔기 26 내지 32(H1), 53 내지 55(H2) 및 96 내지 101(H3); Chothia&Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917)를 포함한다. "프레임워크 영역" 또는 "FR 잔기"란, 본원에서 CDR 잔기로 정의되는 초가변 영역 잔기 외의 가변 도메인 잔기를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "펩타이드 링커"는 두 개의 폴리펩타이드를 연결하기 위한, 상대적으로 유연한 펩타이드 분자를 의미한다. 본원에서 사용된 펩타이드 링커는 하나의 시스테인만을 함유하므로, 두 개의 펩타이드 링커 사이에서 안정된 이황화 결합이 형성될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "결합부"는 다른 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 부분을 의미하며, 항체 또는 그 항원 결합 단편, 리간드 및 수용체 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본원의 항체가 포함하는 결합부는 상기 항체가 결합부와 특이적으로 결합된 표적을 표적화할 수 있도록 한다.
본원에서 사용된 용어 "종양 연관 항원"은 종양 세포에서 단독으로 발현 또는 주로 발현되거나 또는 과다 발현되어 상기 항원을 종양과 연관시키는 임의의 분자(예컨대 단백질, 펩타이드, 지질, 탄수화물 등)을 포함한다. 종양 연관 항원은 한 가지 유형의 종양에서만 발현되어 상기 종양 항원을 한 가지 유형의 종양과만 연관시키거나 한 가지 유형의 종양 특유의 것으로 하는 항원일 수 있다. 대안적으로, 종양 항원은 다양한 유형의 종양과 연관되거나 또는 그에 특유한 종양 항원일 수 있다. 예컨대, 종양 연관 항원은 유선암 세포와 결장암 세포 모두에 의하여 발현될 수 있으나, 정상적인 비종양 또는 비암세포에 의해서는 발현되지 않는다. 예시적인 종양 연관 항원은 종양 세포 표면 항원으로서, 이러한 항원은 치료성 및 진단성 항체에 의하여 보다 쉽게 식별된다.
본원에서 사용된 용어 "단일 클론 항체"는 기본적으로 동질적인 항체 군으로부터 획득된 항체를 의미하며, 즉 상기 항체 군을 구성하는 개별 항체 간에는, 소량으로 존재할 수 있는 자연 발생 가능한 변이를 제외하고는 동일하다. 단일 클론 항체는 단일 항원 에피토프에 대해 고도로 특이적이다. 본원에서 공개된 단일 클론 항체는 항체의 유래 또는 그 제조 방식(예컨대, 하이브리도마, 박테리오파지 선택, 재조합 발현, 유전자 이식 동물 등)에 제한되지 않는다. 상기 용어는 "항체"의 정의 하에 완전한 면역 글로불린 및 그 단편 등을 포함한다.
"발현 벡터"는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 의미하며, 상기 재조합 폴리뉴클레오타이드는 발현될 뉴클레오타이드와 조작 가능하게 연결되는 발현 조절 서열을 포함한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스 작용 요소를 포함하며; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포 또는 체외 발현 시스템에 의하여 제공될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오타이드에 포함되는 코스미드, 플라스미드(예컨대, 있는 그대로이거나 또는 지질체에 포함된)와 바이러스(예컨대, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스 등)와 같은 본 분야 공지의 모든 발현 벡터를 포함한다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
일반적으로, 이중특이성 항체 단편의 구조는 항체의 VL과 VH를 (G4S)n을 통하여 펩타이드에 직렬로 연결하는 것이지만, 이는 안정성이 떨어지고 유전자 발현 수준이 낮으며, 발현 산물이 축적되기 쉽고, 체내 반감기 또한 비교적 짧은 방법이다. 잘 알려진 바와 같이, 항체 중쇄 영역에서 힌지 영역의 역할은, 한편으로는 항체의 양팔이 항원에 충분히 결합될 수 있도록 유연한 구조를 제공하는 것이고, 다른 한편으로는 안정적인 호모다이머 구조를 생성하기 위하여 두 쌍 이상의 이황화 결합을 제공하는 것이다. 그러나, 이중특이성 항체를 구성할 때, 헤테로다이머를 가능한 한 많이 생성하고 호모다이머를 감소시키는 것이 요구되며, 전통적인 방법은 CH3의 아미노산 변이를 통하여 knobs-into-holes 구조를 도입하거나, 또는 변이를 통하여 상반된 전하를 띠는 아미노산을 도입함으로써 헤테로다이머의 형성을 촉진하는 것이지만, 이 또한 경쇄의 미스매치 문제를 해결할 수는 없다. 또한 경우에 따라, Fc 이펙터 기능은 필요하지 않고, Fc 이펙트를 제거하기 위한 추가적 변이가 필요하며, 또는 Fc가 직접적으로 제거되고 F(ab)2 또는 Fab 형태가 사용된다. 이러한 경우, Fab 단편에 헤테로다이머화를 촉진하는 아미노산 변이를 도입하는 것은 매우 어렵다. 본 발명은 항체 힌지 영역 내의 이황화 결합의 안정적 작용을 진보적으로 이용하여, 변이된 항체 힌지 영역을 각각 Fab 항체의 중쇄 및 경쇄 C-말단으로 융합시킴으로써 1) 변이된 항체 힌지 영역에서만 중쇄와 경쇄 사이의 한 쌍의 이황화 결합이 형성되고, 천연 CH1과 CL 사이에 형성된 한 쌍의 이황화 결합은 변하지 않으며; 2) 동시에, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 비공유 작용은 중첩되는 안정적 요소를 제공하도록 하였다. 이를 종합하면, 제2 안정성 요소(힌지 영역에 자연적으로 존재하는 두 쌍의 이황화 결합)와 제3 안정성 요소(자연 중쇄의 Fc 단편, 특히 CH3 부분의 비공유 다이머 작용)가 존재하지 않음으로써, 중쇄 사이의 호모다이머의 안정성이 유의하게 감소하며; 그렇지만 경쇄와 중쇄 사이에 한 쌍의 이황화 결합이 증가하였으므로 안정성 또한 증가하게 되고, 이로써 생성되는 경쇄, 중쇄 헤테로다이머의 안정성은 호모다이머보다 훨씬 높으며, 발현 산물에서 헤테로다이머가 차지하는 비율이 매우 높고, 발현 산물에서 호모다이머가 차지하는 비율은 매우 낮거나 심지어 안정적인 산물을 생성하지 못할 수 있다. 미량의 중쇄 또는 경쇄 자체 호모다이머는 CH1 또는 CL의 친화 정제 매질을 이용하여 효과적으로 제거할 수 있다. 따라서, 본 발명을 통하여, 안정적이고 순도가 높은 목표 이중특이성 항체를 매우 쉽게 얻을 수 있다.
따라서, 본원은 개선된 이중특이성 또는 다중특이성 항체를 제공하며, 이는 재조합 발현을 통하여 쉽게 생성할 수 있으며 두 개의 상이한 항원 또는 동일 항원의 상이한 에피토프 또는 보다 많은 상이한 항원의 다수 개의 에피토프를 표적화할 수 있다.
제1 양상에서, 본원은:
a) 경쇄, 및 중쇄의 CH1과 가변 영역으로 구성되는, 제1 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편;
b) N 말단이 상기 중쇄와 융합되는, 제1 펩타이드 링커;
c) N 말단이 상기 경쇄와 융합되는, 제2 펩타이드 링커를 포함하며,
상기 제1 펩타이드 링커와 상기 제2 펩타이드 링커 사이에는 하나의 이황화 결합만이 형성될 수 있고, 상기 제1 펩타이드 링커 및 상기 제2 펩타이드 링커는 각각 독립적으로 서열번호 1 내지 4로 표시되는 서열 중 어느 하나를 포함하는 펩타이드 링커로부터 선택되며, 서열번호 1 내지 2는 각각 XPPCPAPE 및 EPAPCPPX이고, 여기에서 X는 Cys를 제외한 임의의 아미노산을 나타내거나 또는 결실된 것인, 항체를 제공한다.
일부 구체예에서, 상기 제1 펩타이드 링커 및/또는 상기 제2 펩타이드 링커는 천연 항체의 힌지 영역일 수 있으며, 힌지 영역에는 하나의 시스테인만을 보유하는 결실 변이가 있을 수 있다.
바람직한 구체예에서, 상기 제1 펩타이드 링커 및/또는 상기 제2 펩타이드 링커는 C229 결실 변이된 IgG1 힌지 영역일 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 제1 펩타이드 링커와 상기 제2 펩타이드 링커는 서로 동일하다.
일부 구체예에서, 상기 제1 펩타이드 링커와 상기 제2 펩타이드 링커는 상이하다.
항체의 아미노산 서열은 동등한 위치를 식별하기 위해 넘버링하며, 현재 항체에 대한 다양한 넘버링 방법이 존재한다. Kabat 방법(Kabat 등, 1991)은 동일한 도메인 유형의 서열 중 고서열 변이 영역의 위치에 기반하여 개발된 것이다. 이는 항체의 중쇄(VH)와 경쇄(Vλ와 Vκ)의 가변 도메인을 상이하게 넘버링한다. Chothia 방법(Al-Lazikani, 1997)은 Kabat 방법과 동일하지만, 제1 VH 상보적 결정 영역(CDR) 주위의 주석 삽입 위치를 교정하여 이를 구조 고리에 대응시켰다. 본원에서의 항체는 Kabat 방법에 따라 넘버링 된 것이다.
일부 구체예에서, 제1 양상의 항체는 제1 펩타이드 링커 및/또는 제2 펩타이드 링커의 C 말단을 통하여 또 다른 결합부와 융합하여 항체의 결합가가 2가 또는 3가가 되도록 할 수 있다.
예컨대, 제1 양상의 항체는 제1 펩타이드 링커 또는 제2 펩타이드 링커의 C 말단을 통하여 제1 결합부와 융합됨으로써 이중특이성 항체를 형성할 수 있다. 제1 결합부는 항체 또는 그 항원 결합 단편, 리간드 및 수용체로부터 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 양상의 항체는 각각 제1 펩타이드 링커와 제2 펩타이드 링커의 C 말단을 통하여 제1 결합부 및 제2 결합부와 융합됨으로써 이중특이성(제1 결합부와 제2 결합부가 동일한 경우) 또는 삼중특이성의 항체(제1 결합부와 제2 결합부가 상이한 경우)를 형성할 수 있다. 상기 제1 결합부와 상기 제2 결합부는 각각 독립적으로 항체 또는 그 항원 결합 단편, 리간드 및 수용체로부터 선택될 수 있다.
일부 구체예에서, 제1 양상의 항체는 제3 결합부를 더 포함하며, 상기 제3 결합부는 상기 Fab 단편의 경쇄 또는 중쇄의 N 말단과 결합한다. 바람직하게는, 상기 제3 결합부는 상기 Fab 단편의 경쇄의 N 말단과 결합한다.
일부 구체예에서, 상기 제1 결합부는 제2 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 중쇄 가변 영역(VH)이고, 상기 제2 결합부는 제2 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 경쇄 가변 영역(VL)이다.
일부 구체예에서, 상기 제1 결합부, 상기 제2 결합부 및/또는 상기 제3 결합부는 독립적으로 2가, 3가 또는 보다 다가의 항체 단편으로부터 선택되어, 최종적인 항체가 3가, 4가 또는 보다 다가의 항체가 되도록 할 수 있다. 당업자는 필요에 따라 적절한 항체 단편과 제1 펩타이드 링커 및/또는 제2 펩타이드 링커의 융합을 선택할 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 이중체 및 sc-Fv와 같은 단쇄 항체 분자로부터 선택된다.
제1 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 상기 Fab 단편, 상기 제1 결합부, 상기 제2 결합부 및 상기 제3 결합부는 각각 독립적으로 단일 클론 항체로부터 유래할 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에서 사용된 단일 클론 항체는 하기 중 1종 이상으로부터 선택될 수 있다: 아달리무맙(adalimumab), 세쿠키누맙(secukinumab), 리툭시맙(Rituximab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 젬투주맙 오조가마이신(Gemtuzumab ozogamicin), 알렘투주맙(Alemtuzumab), 베바시주맙(Bevacizumab), 세툭시맙(Cetuximab), 파니투무맙(Panitumumab), 오파투무맙(Ofatumumab), 이필리무맙(Ipilimumab), 브렌툭시맙 베도틴(Brentuximab vedotin), 데노수맙(Denosumab), 페르투주맙(Pertuzumab), 오비누투주맙(Obinutuzumab), 라무시루맙(Ramucirumab), 3F8, 아바고보맙(abagovomab), 아데카투무맙(adecatumumab), 아푸투주맙(afutuzumab), 아라시주맙 (페골)(alacizumab (pegol)), 아마툭시맙(amatuximab), 아포리주맙(apolizumab), 바비툭시맙(bavituximab), 벡투모맙(bectumomab), 벨리무맙(belimumab), 비바투주맙(bivatuzumab), 칸투주맙 메르탄신(cantuzumab mertansine), 칸투주맙 (라브탄신)(cantuzumab (ravtansine)), 카프로맙 (펜데타이드)(capromab (pendetide)), 카투막소맙(catumaxomab), 시타투주맙 (보가톡스)(citatuzumab (bogatox)), 식수투무맙(cixutumumab), 클리바투주맙 (테트락세탄)(clivatuzumab (tetraxetan)), 코나투무맙(conatumumab), 다세투주맙(dacetuzumab), 달로투주맙(dalotuzumab), 데투모맙(detumomab), 드로지투맙(drozitumab), 에크로맥시맙(ecromeximab), 에드레코로맙(edrocolomab), 엘로투주맙(elotuzumab), 에나바투주맙(enavaatuzumab), 엔시툭시맙(ensituximab), 에프라투주맙(epratuzumab), 에르투막소맙(ertumaxomab), 에타라시주맙(etaracizumab), 팔레투주맙(farletuzumab), FBTA05, 플란보투맙(flanvotumab), 갈릭시맙(galiximab), 젬투주맙(gemtuzumab), 가니투맙(ganitumab), 기렌툭시맙(girentuximab), 글렘바투무맙 (베도틴)(glembatumumab (vedotin)), 이브리투모맙 튜세탄(ibritumomab tiuxetan), 이크루쿠맙(icrucumab), 이고보맙(igovomab), 인다툭시맙 라브탄신(indatuximab ravtansine), 인테투무맙(intetumumab), 이노투주맙 오조가마이신(inotuzumab ozogamicin), 이필리무맙(ipilimumab)(MDX-101), 이라투무맙(iratumumab), 라베투주맙(labetuzumab), 렉사투무맙(lexatumumab), 린투주맙(lintuzumab), 로르보투주맙 (메르탄신)(lorvotuzumab (mertansine)), 루카투무맙(lucatumumab), 루밀릭시맙(lumiliximab), 마파투무맙(mapatumumab), 마투주맙(matuzumab), 밀라투주맙(milatuzumab), 미투모맙(mitumomab), 모가물리주맙(mogamulizumab), 목세투모맙 (파수도톡스)(moxetumomab (pasudotox)), 나콜로맙 (타페나톡스)(nacolomab (tafenatox)), 납투모맙 에스타페나톡스(naptumomab (esfatenatox)), 나르나투맙(narnatumab), 네시투무맙(necitumumab), 니모투주맙(nimotuzumab), 니볼루맙(nivolumab), NR-LU-10 항체, 올라라투맙(olaratumab), 오포르투주맙 (모나톡스)(oportuzumab (monatox)), 오레고보맙(oregovomab), 파니투무맙(panitumumab), 페르투주맙(pertuzumab), 프리투무맙(pritumumab), 라코투모맙(racotumomab), 라드레투맙(radretumab), 로바투무맙(robatumumab), 오말리주맙(omalizumab), 시브로투주맙(sibrotuzumab), 실툭시맙(siltuximab), 타플리투모맙 (팝톡스)(taplitumomab (paptox)), 테나투모맙(tenatumomab), 테프로투무맙(teprotumumab), 티실리무맙(ticilimumab), 트레멜리무맙(tremelimumab), 티가투주맙(tigatuzumab), 투코투주맙 (셀모류킨)(tucotuzumab (celmoleukin)), 유블리툭시맙(ublituximab), 우렐루맙(urelumab), 벨투주맙(veltuzumab), 보로키시맙(volociximab), 보투무맙(votumumab) 및 잘루투모맙(zalutumomab).
본원의 항체와 결합할 수 있는 항원은 세포 관련 단백질, 예컨대 세포(T 세포, 내피 세포 또는 종양 세포)막 상의 세포 표면 단백질일 수 있으며, 가용성 단백질일 수 있다. 항원은 의학적으로 연관된 임의의 단백질, 예컨대 수용체 및/또는 이에 대응되는 리간드와 같은, 질병 또는 감염 기간에 상향 조절되는 단백질일 수 있다. 세포 표면 단백질의 구체적인 예는 인터그린, E-선택 단백질, P-선택 단백질 또는 L-선택 단백질, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45, CD69, CD134, ICOS, CD137, CD27, 암 배아 항원(CEA), TCR, MHCⅠ류 및 MHCⅡ류 항원, VEGF 및 이들 단백질의 수용체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 가용성 단백질은 인터루킨(예컨대, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-16 또는 IL-17), 바이러스 항원(예컨대, 호흡기 세포융합 바이러스 또는 거대 세포 바이러스 항원), 면역 글로불린(예컨대 IgE), 인터페론(예컨대 인터페론α, 인터페론β 또는 인터페론γ), 종양 괴사 인자-α(TNFα), 종양 괴사 인자-β(TNFβ), 집락 자극 인자(예컨대, G-CSF 또는 GM-CSF) 및 혈소판유래성장인자(예컨대 PDGF-α 및 PDGF-β) 및 그 수용체(적절한 경우)를 포함한다. 기타 항원은 세균 세포 표면 항원, 세균 독소, 바이러스(예컨대 인플루엔자 바이러스, EBV, HepA, B 및 C), 생화학 테러 시약, 방사성 동위원소, 중금속 및 뱀과 지네의 독과 독소를 포함한다.
본원의 항체에 결합될 수 있는 다른 항원은 혈청 운반 단백질, 세포 매개 이펙터 기능 동원을 허용하는 폴리펩타이드, 및 핵종 킬레이팅 단백질을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원의 항체에 결합될 수 있는 항원은 종양 연관 항원이고, 이는 하기 중 어느 하나 이상을 포함한다: CD20, HER2, EGFR, CD33, CD52, VEGF, CTLA-4, CD30, RANK1, HER2, VEGF-R2, Her3, A33 항원, CD5, CD19, CD22, CD23(IgE 수용체), CA242 항원, 5T4, VEGFR-1, CD33, CD37, CD40, CD44, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CD152, CD200, CD221, CCR4, NPC-1C, 비멘틴, 인슐린 유사 성장인자-1 수용체(IGF-1R), 알파-페토프로틴, 암배아항원(Carcino-Embryonic Antigen: CEA), 인터그린 αvβ3, 인터그린 α5β1, 섬유아세포 활성화 단백질(fibroblast activation protein), FAP-α, TAG-72, MUC1, MUC16, 전립선 특이적 막 항원(Prostate-specific membrane antigen; PMSA), EGP40 범종양 항원, 당단백질 EpCAM, 프로그램된 사멸 수용체-1(Programmed death-1), 간 재생 탈인산화 효소-3(Phosphatase of regenerating liver-3; PRL-3), Lewis-Y 항원, GD2, 글리피칸-3(GPC3) 및 메소텔린.
상기 제1 결합부, 상기 제2 결합부 및 상기 제3 결합부는 각각 독립적으로 리간드와 수용체로부터 선택될 수 있다.
"수용체"란 호르몬, 신경 전달 물질, 약물 또는 세포 내 신호 분자와 결합할 수 있고 세포 기능의 변화를 야기할 수 있는 임의의 생물학적 거대분자를 가리킨다. 수용체 그 자체는 적어도 두 개의 활성 부위를 가지는데, 하나는 리간드를 식별하고 결합하는 활성 부위이고; 다른 하나는 응답 반응의 생성을 담당하는 기능 활성 부위이며, 이 부위는 리간드와 결합하여 이원 복합물을 형성하고 구조가 변형된 후에만 응답 반응을 생성할 수 있고, 이로써 일련의 생화학적 반응을 개시하고 최종적으로는 표적 세포로 하여금 생물학적 효과를 생성하도록 한다. 수용체는 그 리간드와 특이적으로 결합할 수 있다. 일반적으로, 수용체의 세포 외 영역은 본원에서의 결합부이다.
"리간드"는 그 수용체와 결합할 수 있는 임의의 분자를 가리킨다. 대다수의 리간드는 사이토카인, 단백질 폴리펩타이드류 호르몬, 수용성 호르몬, 전립선 호르몬, 친수성 신경 전달 물질 등의 친수성의 생물학적 거대 분자로서, 표적 세포막을 통하여 세포 내로 진입할 수 없으므로, 이러한 리간드 신호 분자의 수용체는 표적 세포 막 상으로 그 위치가 정해진다.
PD-1(프로그램된 사멸 수용체 1)는 중요한 면역 억제 분자로서 면역글로불린 슈퍼 패밀리에 속하며, 268개 아미노산 잔기의 막 단백질이다. PD-1을 표적점으로 하는 면역 조절은 항 종양, 항 감염, 항 자가면역성 질병 및 기관 이식 생존 등에 있어 모두 중요한 의의를 가진다. 그 리간드인 PD-L1 또한 표적점이 될 수 있으며, 이에 대응되는 항체 또한 동일한 작용을 야기할 수 있다. PD-1 또는 PD-L1은 본원 중에서의 결합부, 예컨대 제1 결합부 및/또는 제2 결합부를 담당할 수 있다. 바람직하게는, PD-1의 세포 외 영역, 즉 PD-1 ECD는 본원 중에서의 결합부를 담당할 수 있다.
본원의 항체는 그 Fab의 C-말단에 CH2-CH3 도메인을 도입할 수 있다. CH2-CH3 도메인은 펩타이드 링커와 연결될 수 있으며, 또는 제1 결합부 및/또는 제2 결합부의 C-말단과 연결될 수 있다. 상기 CH2-CH3 도메인은 선택적으로 KiH 변이, 시스테인 잔기 도입, 하나 또는 다수의 염다리 변이를 도입함으로써 헤테로다이머화를 촉진시키며, 이러한 첨가는 헤테로다이머의 안정성을 보다 향상시킨다. 본원에서의 염다리는 수소 결합 및 정전기적 상호작용, 예를 들어 글루탐산과 라이신 잔기 사이에서 발생할 수 있는 염다리를 포함한다.
천연 항체의 중쇄와 경쇄는 각각 가변 영역(즉 V영역) 및 불변 영역(즉 C영역)을 포함한다. 중쇄의 불변 영역과 경쇄의 불변 영역은 각각 CH 및 CL로 칭한다. 헤테로(κ 또는 λ)Ig의 CL 길이는 기본적으로 일치하지만, 헤테로 Ig의 CH 길이는 상이한데, 예컨대 IgG, IgA 및 IgD는 CH1, CH2 및 CH3을 포함하지만 IgM과 IgE는 CH1, CH2, CH3 및 CH4를 포함한다.
제2 양상에서, 본원은 제1 양상의 항체를 코딩하는 핵산을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 상기 핵산은 숙주 세포에서 발현되기에 적합한 코돈 최적화 핵산일 수 있다. 예컨대, 코돈의 퇴화에 따라, 여전히 동일한 단백질을 코딩하게 된다. 사용된 숙주 세포에 따라 코돈 최적화를 진행하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
제3 양상에서, 본원은 제2 양상의 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
임의의 적합한 발현 벡터를 사용할 수 있다. 예컨대, 원핵 클로닝 벡터는 대장균 유래 플라스미드, 예컨대 colE1, pCR1, pBR322, pM39, pUC, pKSM 및 RP4를 포함한다. 원핵 벡터는 M13과 같은 박테리오파지 DNA 및 기타 실 형상의 단쇄 DNA 박테리오파지 유도체도 포함한다. 효모에 사용할 수 있는 벡터의 실례로는 2μ 플라스미드가 있다. 포유동물 세포에서의 발현에 이용되는 적합한 벡터는 다음과 같은 잘 알려진 유도체를 포함한다: SV-40, 아데노바이러스, 레트로바이러스로부터 유도된 DNA 서열 및 기능성 포유동물 벡터(상기와 같음)와 기능성 플라스미드 및 박테리오파지 DNA의 조합으로부터 유래된 셔틀 벡터.
그 밖의 진핵 발현 벡터는 본 분야 공지의 것이다(예컨대, P J. Southern & P. Berg, J. Mol. Appl. Genet, 1:327-341 (1982); Subramani 등, Mol. Cell. Biol, 1: 856-864(1981); Kaufinann & Sharp, "Amplification And Expression of Sequences Cotransfected with a Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene," J. Mol. Biol, 159:601-621 (1982); Kaufhiann & Sharp, Mol. Cell. Biol, 159:601-664 (1982)；Scahill 등, "Expression And Characterization Of The Prudct of A Human Immune Interferon DNA Gene in Chinese Hamsber Ovary Cells," Proc. Nat'l Acad. Sci USA, 80:4654-4659 (1983); Urlaub & Chasin, Proc. Nat'l Acad. Sci USA, 77:4216-4220, (1980) 등으로, 모두 인용 형식으로 본원에 포함됨).
본 발명에 사용될 수 있는 발현 벡터는 적어도 하나의 발현 조절 서열을 포함하며, 이는 발현될 DNA 서열 또는 단편과 조작 가능하게 연결된다. 클로닝된 DNA 서열의 발현을 제어 및 조절하기 위하여 제어 서열을 벡터에 삽입한다. 유용한 발현 조절 서열의 실례로는 lac 시스템, trp 시스템, tac 시스템, trc 시스템, 박테리오파지 λ의 주요 오페론 및 프로모터 영역, fd 외각 단백질의 제어 영역, 효모의 해당 프로모터(예컨대, 3-포스포글리세린산 키나아제의 프로모터), 효모 산성 포스파타아제의 프로모터(예컨대 Pho5, 효모 α-교배 인자의 프로모터) 및 폴리오마바이러스, 아데노바이러스, 레트로바이러스 및 시미안바이러스의 프로모터(예컨대 SV40의 조기 및 말기 프로모터와, 원핵세포 또는 진핵세포 및 그 바이러스 또는 그 조합의 유전자 발현을 억제하는 공지의 기타 서열)가 있다.
제4 양상에서, 본원은 제2 양상의 핵산 또는 제3 양상의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
일부 구체예에 있어서, 상기 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 포유동물 세포는 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포 및 PER.C6 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 필요에 따라 적합한 숙주 세포를 선택할 수 있다.
제5 양상에서, 본원은:
a) 제4 양상의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
b) 상기 숙주 세포 또는 상기 숙주 세포 배양물의 상청액으로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 제1 양상의 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
제6 양상에서, 본원은 제1 양상의 항체, 제2 양상의 핵산, 제3 양상의 발현 벡터 또는 제4 양상의 숙주 세포, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
제6 양상의 약제학적 조성물은 제약 분야의 일반적인 방법에 따라 필요한 제형으로 제조될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 약제학적 조성물은 바람직하게는 액체 또는 현탁액 제형이다.
일부 구체예에서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 면역 세포의 활동 능력 및 기능을 약화시키지 않고, 항체 또는 그 항원 결합 단편과 항원의 특이적 결합에 영향을 미치지 않는 담체로서, 세포 배지, 완충액, 생리식염수 및 평행염용액 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 완충액의 실례로는 등삼투압성 인산염, 아세트산염, 시트르산염, 붕산염 및 탄산염 등을 포함한다. 구체적인 구체예에서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 1%의 혈청을 함유하는 인산염 완충액이다.
본원에서 공개한 항체 및 그 약제학적 조성물은 개체의 종양, 자가면역성 질환 또는 전염성 질환을 치료, 개선 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다.
제7 양상에서, 본원은 종양, 자가면역성 질환 또는 전염성 질환의 치료, 개선 또는 예방용 약제 제조에 있어서의, 제1 양상의 항체, 제2 양상의 핵산, 제3 양상의 발현 벡터 또는 제4 양상의 숙주 세포의 용도를 제공한다.
제8 양상에서, 본원은 치료에 유효한 양의 제1 양상에 따른 항체, 제2 양상에 따른 핵산, 제3 양상에 따른 발현 벡터 또는 제4 양상에 따른 숙주 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 종양, 자가면역성 질환 또는 전염성 질환을 치료, 개선 또는 예방하는 방법을 제공한다.
제9 양상에서, 본원은 개체의 종양, 자가면역성 질환 또는 전염성 질환을 치료, 개선 또는 예방 용도로 사용하기 위한, 제1 양상의 항체, 제2 양상의 핵산, 제3 양상의 발현 벡터 또는 제4 양상의 숙주 세포를 제공한다.
"치료"는 치료적인 처리를 의미함과 동시에, 예방적 또는 방지적인 조치 또한 의미하며, 그 목적은 목표 병리 상태 또는 증상의 예방 또는 완화(경감)이다. 치료를 필요로 하는 개체는 이미 상기 증상이 있는 개체를 포함하며, 상기 증상이 진행될 예정이거나 또는 상기 증상을 예방하고자 하는 개체 또한 포함한다. 따라서, 본원에서 치료받고자 하는 개체는 이미 상기 증상을 가지고 있거나 또는 상기 증상을 가지는 경향이 높거나, 또는 상기 증상을 가지기 쉬운 것으로 진단된 개체이다.
본원에서 사용된 용어 "개체"는 포유동물을 가리키며, 영장류 동물, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 및 래트와 마우스 등 설치류 동물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이 아닌 영장류 또는 인간이다. 특히 바람직한 포유동물은 인간이다.
일부 구체예에서, 상기 종양은 원발암 또는 전이성 암이다. 구체적인 구체예에서, 종양은 비소세포폐암과 같은 폐암, 결장 직장암, 방광암, 백혈병과 같은 조혈 계통의 암, 유방암, 위암, 위식도접합부암, B 림프구형 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 역형성대세포림프종, 두경부 편평상피세포암과 같은 두경부암, 교모세포종, 신장암, 흑색종, 전립선암, 골암, 골거대세포종, 췌장암, 육종, 간암, 피부편평세포암, 갑상선암, 자궁경부암, 비인두암, 자궁내막암, 또는 상기 종양의 전이암으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 상기 자가면역성 질환은 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 경피병, 전신성 혈관염, 피부염 및 자가면역성 용혈성 빈혈 등을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 전염성 질환은 호흡기 전염병, 소화기 전염병, 혈액 전염병, 체표 전염병 및 성 매개 전염병 등을 포함한다. 구체적인 구체예에서, 전염성 질환은 유행성 감기, 폐결핵, 시선염(이하선염), 홍역, 백일해, 회충증, 세균성 이질, A형 간염, B형 간염, 말라리아, 유행성 B형 뇌염, 필라리아증, 주혈흡충병, 트라코마, 광견병, 파상풍, 임질, 매독, 에이즈 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 "치료에 유효한 양"은 구체적 상황에 따라 정해질 수 있으며, 본 분야의 통상의 기술자들은 실제 필요한 약물의 양에 따라 이를 쉽게 파악하여 환자의 체중, 연령 및 질병 상황 등에 따라 결정할 수 있다.
본 명세서와 청구범위에서, "포함하다" 및 "함유하다"는 "포함하나 제한되지 아니함"을 가리키며, 기타 부분, 첨가물, 구성 성분, 또는 단계를 배제하기 위함이 아니다.
본 발명의 특정 양상, 구체예 또는 실시예에서 설명한 특징, 특성, 구성 성분 또는 단계는 모순되는 경우가 아니라면 본원에서 설명한 어떠한 다른 양상, 구체예 또는 실시예에도 응용 가능함이 이해되어야 한다.
전술한 공개 내용에서 본원을 전체적으로 기술하였으므로, 이하의 실시예를 통하여 본원에 대한 보다 자세한 예시를 제공한다. 본 실시예들을 기술하는 것은 단지 본원을 설명하기 위해서이며, 본원의 범위를 제한하지 않는다. 본원에서 특수한 용어와 수치를 사용하였으나, 이러한 용어와 수치들 또한 예시적이며 본원의 범위를 한정하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 특별히 기재하지 않는 한, 본 명세서에서의 실험 방법과 기술은 본 분야의 일반적인 방법 및 기술이다. 제조업체를 특별히 밝히지 않은 재료와 장치 등은 보통 상업적 경로를 통해 일반적으로 얻을 수 있는 것이다.
실시예
본원의 실시예와 비교예에 있어서, 특별히 밝히지 않는 한, 사용된 원료와 시약은 모두 일반적인 것으로서, 상업적 구매를 통해 얻을 수 있다.
실시예 1 내지 5에서 사용된 벡터 pQKD1101-TNFα, pQK1114-IL-17A, pUC57 IgG1 CH1-Hinge mut 및 pUC57 Kappa-Hinge mut, pUC57 인간 PD-L1 ECD, pQKZW106H IgG1 CH1-Hinge mut, pQKZW106L Kappa-Hinge mut, Triad5H, Triad5L, pUC57 PD-L1 VL-Kappa-Hinge mut, 벡터 pUC57 PD-L1 VH-IgG1 CH1 Hinge mut, pUC57 PD-L1 VL-Kappa-Hinge mut, pUC57 항 CD3 scFv는 모두 각 실시예에서 주형을 증폭시키기 위한 재조합 벡터이다.
실시예 1: 항TNFα×항IL-17A 이중특이성 항체의 제조, 발현 및 동정
재료
항 TNFα 단일클론항체인 아달리무맙의 VH와 VL 코딩 핵산 서열 및 항 IL-17A 단일클론항체인 세쿠키누맙의 VH와 VL 코딩 핵산 서열은 모두 DNA 합성 방식을 통하여 획득한 것으로서(general biol (안후이) 유한회사), 각 코딩 서열은 전체 합성된 벡터 pQKD1101(general biol (안후이) 유한회사)과 pGK1114(general biol (안후이) 유한회사)에 삽입되었고, 획득된 산물은 각각 pQKD1101-TNFα 및 pQK1114-IL-17A로 지칭한다. IgG1 CH-Hinge mut(즉, C229 결실을 포함하는 IgG1 힌지 영역)의 코딩 핵산 서열 및 Kappa-Hinge mut(C229 결실 변이를 포함하는 IgG1 힌지 영역)의 코딩 핵산 서열은 동일하게 DNA 합성 방법을 통하여 획득한 것으로서, 각각 벡터 pUC57(general biol (안후이) 유한회사)에 클로닝되었고, 획득된 산물은 각각 pUC57 IgG1 CH1-Hinge mut (229 결실 변이)와 pUC57 Kappa-HInge mut (C229 결실 변이)로 지칭한다.
IgG1 CH1-Hinge mut과 Kappa-Hinge mut의 뉴클레오타이드 서열은 다음과 같다:
Figure pct00001
1.1 항TNFα×항IL-17A 이중특이성 항체 발현 벡터의 제조
1.1.1 이중특이성 항체 중쇄 발현 벡터 pQKE1H의 구축
각각 pQKD1101-TNFα, pQK1114-IL-17A 및 pUC57 IgG1 CH1-Hinge mut를 주형으로 하고 green Mix PCR 키트(TSINGKE 사)를 사용하여, 키트의 설명서에 따라 항 TNFα항체 VH, 항 IL-17A 항체 VH 및 IgG1 CH1-Hinge mut(C229 결실 변이)를 각각 증폭시켰고, 그 증폭 산물의 크기는 각각 약 0.4 kb, 0.42 kb 및 0.4 kb이며; 동시에, 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI(NEB, R3101S)와 SapI(NEB, R0712S)를 사용하여, 완전히 합성된 벡터 pQKX1(general biol (안후이) 유한회사)에 효소 절단을 수행하였고, 획득된 세 가지의 PCR 증폭 산물(5'에서 3'까지의 연결 순서: TNFα 항체 VH-CH1-Hinge mut-항 IL-17A 항체 VH) 및 효소 절단 벡터에 대하여, BM 심리스 클로닝 키트(biomed 사)를 사용하여 키트의 설명서에 따라 재조합 연결을 수행하여 중쇄 발현 벡터 pQKE1H를 획득하였다.
PCR 증폭을 위한 프라이머 쌍은 다음과 같다:
Figure pct00002
1.1.2 이중특이성 항체 경쇄 발현 벡터 pQKE1L의 구축
각각 pQKD1101-TNFα, PQK1114-IL-17A 및 pUC57 Kappa-Hinge mut를 주형으로 하고 green Mix PCR 키트(TSINGKE 사)를 사용하여, 키트의 설명서에 따라 항 TNFα 항체 VL, 항 IL-17A 항체 VL 및 Kappa-Hinge mut(C229 결실 변이)를 각각 증폭시켰고, 그 증폭 산물의 크기는 각각 약 0.36 kb, 0.36 kb 및 0.42 kb이며; 동시에, 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI(NEB, R3101S)와 SapI(NEB, R0712S)를 사용하여, 완전히 합성된 벡터 pQKX2(general biol (안후이) 유한회사)에 효소 절단을 수행하였고, 획득된 세 가지의 PCR 증폭 산물(5'에서 3'까지의 연결 순서: TNFα 항체 VL-Kappa-Hinge mut-항 IL-17A 항체 VL) 및 효소 절단 벡터에 대하여, BM 심리스 클로닝 키트(biomed) 사를 사용하여 키트의 설명서에 따라 재조합 연결을 수행하여 중쇄 발현 벡터 pQKE1L을 획득하였다.
PCR 증폭을 위한 프라이머 쌍은 다음과 같다:
Figure pct00003
1.1.3 재조합 플라스미드의 증폭과 제조
상기와 같이 획득한 중쇄 발현 벡터 pQKE1H와 경쇄 발현 벡터 pQKE1L을 각각 대장균(E.coli) TOP10으로 형질 전환시켰다. 단일클론항체를 선별하여 동정한 후, 암피실린(최종 농도 100 mg/L)을 포함하는 LB 배지에서, 37℃, 200 rpm의 배양 조건으로 16시간 동안 진탕 배양하였다. 8000×g로 20분 동안 원심분리하여 세균을 수집하였다. NucleoBond Xtra Midi 키트(Macherey-nagel)를 사용하여 키트의 설명서에 따라 플라스미드를 분리 추출하여, 1 mL의 무균 초순수로 이를 세척하고, 마지막으로 Nanodrop 마이크로 분광 광도계로 플라스미드의 농도를 측정하였다.
1.2 항체의 발현
중쇄 발현 벡터 pQKE1H와 경쇄 발현 벡터 pQKE1L을 HEK293 세포에 공동 형질 감염시켜 발현시켰다. 형질 감염 전의 24시간 동안에, 1.5×106의 HEK293(ATCC, 번호: CRL-1573) 세포를 100 mL의 OPM-293 CD05 무혈청 배지(OPM, Cat: 81075-001)를 함유하는 500 mL의 플라스크에 접종하여, 36.5℃, 7.5%의 CO2, 120 rpm의 배양 조건에서 현탁 배양하였다. 형질 감염 시, 재조합 플라스미드 pQKE1H와 pQKE1L을 1:1의 중량비(DNA 총량 100 μg)로 10 mL의 OPM-293 CD05 배지에서 혼합한 다음, 100 μL의 PEI(농도 3 mg/mL)를 첨가하여 신속하게 소용돌이 방식으로 균일혼합하고, 실온에 방치하여 15분간 배양시켰다. 그 후, 이 혼합물을 전술한 세포 배양물에 첨가하였다. 세포를 36.5℃, 7.5%의 CO2, 120 rpm/min 조건에서 7일 동안 배양하여 발현된 항체를 수확하였다. 상기 항체는 플라스미드 pQKE1H와 pQKE1L에 의하여 발현된 항 TNFα×항 IL-17A의 이중특이성 항체를 나타내며, 항체는 E1으로 명명하였고, 그 구조는 도 1의 A에 도시된 바와 같다.
1.3 항체의 정제
수확된 세포 배양물을 3000×g에서 20분 동안 원심분리하고, 상청액을 수집하여 0.45 μm의 여과기로 여과하였다. 20 mM의 PB와 150 mM의 NaCl의 혼합 완충액(pH 7.4)으로 5 mL의 Capto L 친화성 크로마토그래피 컬럼(GE)을 평형화시켰으며, 이 때 유속은 5 mL/min였고, 부피는 5 CV보다 컸다. 여과된 샘플액을 5 mL/min의 유속으로 로드하였다. 로딩이 완성된 후, 20 mM의 PB와 150 mM의 NaCl의 혼합 완충액(pH 7.4)으로 Capto L 친화성 크로마토그래피 컬럼을 세척하였으며, 이 때 유속은 5 mL/min였다. 50 mM의 시트르산(pH 3.0) 완충액으로 용리를 진행하였으며, 유속은 5 mL/min였고, 완전한 용리 피크를 수집하는 동시에, 1 M의 Tris HCL(pH 9.0) 완충액을 사용하여, 수집된 용리액의 pH를 7.0 전후로 조절하였다(도 2A). 정제된 산물은 한외여과튜브를 통하여 한외여과하고, Tris-시트르산 완충액을 상용 PBS 완충액으로 대체하였다. 획득된 단백질을 SDS-PAGE와 쿠마시 블루 염색으로 검출하고(도 2B), Nanodrop 마이크로 분광 광도계를 사용하여 단백질 농도를 측정하였으며, 계산된 단백질 생산량은 55 mg/L이었다.
1.4 항체의 동정
1.4.1 HPLC를 사용한 항체 순도 측정
Capto L로 정제한 항체의 순도를, HPLC(Agilent 1260 II) SEC로 측정하였다. 크로마토그래피 컬럼은 Sepax 수용성 크기 배제 크로마토그래피 컬럼이며, 이동상은 50 mm PB+300 mm NaCl pH 7.0이었고, 로드 양 10 μg, 유속 1mL/min로 20분 동안 등용매 용리하였다. 그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, 그 단량체의 순도는 90% 이상이다.
1.4.2 항체 친화력에 대한 Fortebio 측정
분자 상호작용 기기인 Fortebio Octet QK(Molecular Devices 사)를 이용하여, 정제된 항체의 친화력 상수 KD를 측정하였다. Fab-Ch1 센서(sensor)로 E1 항체 및 대조 항체인 아달리무맙(AbbVie)과 세쿠키누맙(Novartis)을 고정시켰으며, 고정 부피는 모두 200 μL이고, 고정 농도는 모두 0.25 μM였다. 항원 인간 TNF-α(Sino Biological Inc., Cat: 10602-H01H)와 인간 IL-17A(Sino Biological Inc., Cat: 12047-H07Y)를 각각 600 nM, 300 nM, 150 nM 및 75 nM의 농도에 따라, 총 부피 200 μL로 로딩하였다. 결합-해리 곡선은 도 4에 도시된 바와 같고, 친화력 상수 측정 결과는 도 6에 도시된 바와 같다.
실시예 2: 항 CD137×PD-1 ECD 단백질 이중특이성 항체의 제조, 발현 및 동정
2.1. 항 CD137×PD-1 ECD 단백질 이중특이성 발현 벡터의 제조
발현 벡터 구축 및 플라스미드 증폭의 구체적인 작업 공정에 대해서는 실시예 1을 참조하며, 그 중 PD-1 ECD 단백질의 경우, 그 증폭 주형은 pUC57 인간 PD-1 ECD이고, 이는 벡터 pCU57에 삽입된, 합성된 인간 PD-1 세포 외 영역 핵산 서열을 포함한다(인간 PD-1 세포 외 영역 핵산 서열에 대해서는 NCBI 데이터베이스 NP_005009.2와 참고 문헌 Eszter Lazar-Molnar 외, “Structure-guided development of a high-affinity human Programmed Cell Death-1: Implications for tumor immunotherapy”, EbioMedicine 17(2017) 30-44를 참조함)(general biol (안후이) 유한회사). 완전히 합성된 벡터 pQKZW 106H IgG1 CH1-Hinge mut(general biol (안후이) 유한회사)는 항 CD137 항체 중쇄의 VH 부(서열 참조 특허 번호: US-2019-0284292A1) 및 IgG1 CH1-Hinge mut(힌지 영역 C229 결실 변이)를 함유하며, 이 벡터에 EcoRI 효소 절단을 수행하고, 회수된 후에는 전술한 pUC57 인간 PD-1 ECD의 PCR 산물과 재조합 효소 연결을 수행하여(5'에서 3'까지의 연결 순서: CD137 항체 VH-CH1-Hinge mut-PD-1 ECD), 획득된 최종 중쇄 발현 벡터를 pQKE2H로 명명하였고; 마찬가지로, 완전히 합성된 벡터 pQKZW106L Kappa-Hinge mut(general biol (안후이) 유한회사)는 항 CD137 항체 경쇄의 VL부(서열 참조 특허 번호: US-2019-0284292-A1) 및 Kappa-Hinge mut(힌지 영역 C229 결실 변이)를 함유하며, 상기 벡터에도 EcoRI로 효소 절단을 수행하고, 회수한 후에 전술한 pUC57 인간 PD-1 ECD의 PCR 산물에 재조합 효소 연결을 수행하여(5'에서 3'까지의 연결 순서: CD137 항체 VL-Kappa-Hinge mut-PD-1 ECD), 획득된 최종 경쇄 발현 벡터를 pQKE2L로 명명하였다.
사용된 프라이머 쌍은 다음과 같다:
Figure pct00004
2.2 항체의 발현
실시예 1에 기술한 절차에 따라 형질감염을 수행하였으며, 이 때, 형질감염 세포는 HEK293(ATCC, 번호: CRL-1573)이었고, 형질감염 부피는 100 mL였다. 형질감염 후의 세포를 500 mL의 플라스크에서 7일간 현탁 배양한 후 항체를 수확하였으며, 배양 조건은 36. 5℃, 7.5%의 CO2, 120 rpm/min였다. 수득된 항체는 플라스미드 pQKE2H와 pQKE2L에 의해 발현되는 항 CD137×PD-1 ECD 단백질의 이중특이성 항체이며, 항체는 E2로 명명되었고, 그 구조는 도 1의 B에 도시된 바와 같다.
2.3 항체의 정제
실시예 1에 기술된 절차를 참조하여 정제를 진행하였으며, 완충액 치환 후 Nanodrop 마이크로 분광 광도계를 사용하여 단백질 농도를 측정하였고, 계산된 단백질 생산량은 35 mg/L였다.
2.4 항체의 동정
2.4.1 HPLC를 사용한 항체 순도 측정
실시예 1을 참조하여 HPLC로 항체 E2의 순도를 측정하였으며, 단량체의 순도는 90% 이상이었다.
2.4.2. 항체 친화력에 대한 Fortebio 측정
구체적인 절차는 실시예 1을 참조하였다. Fab-Ch1의 센서로 E2 항체를 고정하였으며, 고정 농도는 0.25 μM였다. 항원 인간 PD-L1(Sino Biological Inc., Cat: 10084-HNAH)와 인간 CD137(Sino Biological Inc., Cat: 10041-H002H)를 각각 600 nM, 300 nM, 150 nM 및 75 nM의 농도에 따라, 총 부피 200 μL로 로딩하였다. 친화력 상수 측정 결과는 도 6에 도시된 바와 같다.
2.4.3 항체와 세포 결합 활성에 대한 유세포분석 측정
2.4.3.1 항체와 MC38-PD-L1 세포의 결합 활성
정상적으로 회수한 MC38 세포(Concord Cell Resource Center, 자원 번호: 3111C0001CCC000523)를 적어도 3세대 이상 계대 배양하였으며, 형질 감염 24시간 전에 세포를 계대 배양 시키고 6웰 플레이트에 분주하였다. 형질감염 당일, PEI(Sigma, Cat: 764647)와 합성 플라스미드 pENTER PD-L1(Sino Biological (안후이) 유한회사)를 실온으로 회수하고, 5 μg의 플라스미드를 취하여 500 μl의 DMEM 배지(gibco, REF: 11965-092)에 첨가한 다음, 다시 15 μg의 PEI를 첨가하고 즉시 소용돌이 방식으로 15분 동안 진탕한 후, 혼합물을 세포 배양액에 부드럽게 적가하고 인큐베이터에 방치하여 24 내지 48시간 동안 계속 배양하였다. 48시간 후, 2 μg/mL 의 퓨로마이신을 함유하는 10% FBS의 DMEM 배지로 교체하였다. 3일 후 많은 양의 세포가 사멸하였을 때, 플라스크 벽을 가볍게 두드려 상청액을 제거했다. 벽에 붙어 있는 양호한 세포가 사용 가능한 안정적 세포주가 된다. 8 내지 10일 후 세포의 성장 상태에 따라, 세포를 소화하여 96웰 플레이트에 분주한 후, 단일 클론 세포주를 스크리닝하였다. 이 기간 동안, 2 μg/mL의 퓨로마이신 10%의 FBS를 함유하는 DMEM 배지를 사용하여 가압 배양하였다. 최종적으로 획득된 세포주를 MC38-PD-L1로 명명하였다. 인간 PD-L1 세포 외 도메인 유전자는 본 세포주의 게놈으로 전달되었으며, 이는 인간 PD-L1 세포 외 도메인 단백질을 안정적으로 발현시키고 세포막 상에 이를 제시할 수 있다. 회수되고 3세대 이상 배양된 MC-38-PD-L1 세포를 10 mL의 PBS로 1회 세척하고, 1 mL의 0.05% 트립신으로 1분 동안 소화시키고, 10% FBS를 함유한 4 mL의 1640 배지에 첨가한 후, 균일하게 피펫팅하여 세포를 수집하고, 1000 rpm/min으로 5분 동안 원심분리하고, 다시 현탁하여 계수하여, 세포 밀도를 1×105개/mL로 조절하였다. 그룹들을 각각 블랭크(blank)군, 양성대조군, 이차항체군과 E2군으로 설정하고, 먼저 각 그룹의 튜브에 10 μl의 전술한 세포 현탁액을 첨가하였다. E2군의 튜브에 100 ng의 E2 BsAb를 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양시킨 후, 4%의 FBS를 함유하는 3 mL의 PBS 완충액으로 세척하고, 1000 rpm/min으로 5분 동안 원심분리한 후, 4%의 FBS를 함유하는 50 μl의 PBS 완충액으로 재현탁시켰고; 블랭크군에는 0.5 μl의 물을 첨가하였고; 양성대조군에는 PE 항 인간 PD-L1(Biolegend, 클론 번호: 29E-2A3) 0.5 μl을 첨가하였으며; E2군과 이차항체군에는 각각 0.5 μl의 APC 항 인간 Ig 경쇄 K(BioLegend, 클론 번호: TB28-2)를 첨가하였다. 실온에서 균일하게 혼합하고 빛을 차단하여 30분 동안 인큐베이션 하였다. 인큐베이션이 완료된 후, 4% FBS를 포함하는 PBS 완충액으로 각 그룹의 튜브를 세척하고, 1000 rpm/min으로 5분 동안 원심분리하고, 4% FBS 를 함유하는 PBS 완충액으로 재현탁시켜 유세포분석기(essense, 기계 모델명: NovoCyte)로 검출하였다. 그 결과는 도 5의 A에 도시된 바와 같다.
2.4.3.2 항체와 MC38-CD137 세포의 결합 활성
MC38-CD137 세포는 또한 안정된 형질 전환 방식을 통하여 인간 CD137을 MC38 세포(Concord Cell Resource Center, 자원 번호: 3111C0001CCC000523)에 통합한 유전자 조작된 세포주로서, 세포막 상에 인간 CD137 단백질의 발현을 나타낼 수 있다는 특징을 가진다. 상기 세포주의 구축에 대해서는 2.4.3.1의 MC38-PD-L1의 구축 절차를 참조하였으며, 그 중 플라스미드로 pENTER CD137(general biol (안후이) 유한회사)을 사용했다. 세포의 구체적인 실험 절차에 대해서는 3.4.3.1을 참조하였으며, 그룹들은 각각 블랭크군, 양성대조군, 이차항체군과 E2군으로 설정하였다. 그 중, 양성대조군에는 0.5 μl의 APC 항 인간 4-1BB를 첨가하고, 이차항체군에는 0.5 μl의 APC 항 인간 Ig 경쇄 K(BioLegent, 클론 번호: TB28-2)를 첨가하였으며, E2 군에는 먼저 100 ng의 E2 BsAb를 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양한 다음 이를 세척한 후 다시 0.5 μl의 APC 항 인간 Ig 경쇄 K를 첨가하였다. 모든 샘플은 인큐베이션 후 다시 세척되고, 4%의 FBS를 함유하는 100 μl의 PBS 완충액에 재현탁되었으며, 유세포분석기에 의해 검출되었다. 그 결과는 도 5의 B에 도시된 바와 같다.
실시예 3: 항 CD3×항 CD19 이중특이성 항체의 제조, 발현 및 동정
3.1 항 CD3×항 CD19 이중특이성 항체 발현 벡터의 제조
발현 벡터 구축 및 플라스미드 증폭의 구체적인 작업 절차에 대해서는 실시예 1을 참조하였으며, 그 중 중쇄 증폭 주형은 Triad5H와 pUC57 1gG1 CH1-Hinge mut이다. Triad5H는 사전에 완전히 합성된 플라스미드(general biol (안후이) 유한회사)이며, DNA 합성된 Blincyto(Amgen) 중의 항 CD19 VH 코딩 핵산 서열, Pasotuxizumab(Bayer)의 항 CD3 단일 클론 항체의 VH 코딩 핵산 서열(general biol (안후이) 유한회사)를 함유한다. 그 중, Triad5H를 주형으로 하여 항 CD19 VH 단편과 항 CD3 VH 단편을 증폭시키고, pUC57 IgG1 CH1-Hinge mut을 주형으로 하여 IgG1 CH-Hinge mut(C229 결실 변이) 단편을 증폭시키고, 완전히 합성된 벡터 pQKX1(general biol (안후이) 유한회사)에 SapI와 EcoRI 이중효소 절단을 수행하여, 대응되는 PCR 산물과 효소 절단 산물을 회수하고, 재조합 효소 연결(5'부터 3'까지의 연결 순서: 항 CD19 항체 VH-CH1-Hinge mut-항 CD3 항체 VH)을 수행하여, 최종적으로 획득한 재조합 플라스미드를 pQKE3H로 명명하였다. 경쇄 증폭 주형은 Triad5L과 pUC57 Kappa-Hinge mut이다. Triad5L은 사전에 완전히 합성된 플라스미드(general biol (안후이) 유한회사)이며, DNA 합성된 BiTE 이중 항체 중의 항 CD19 VL 코딩 핵산 서열, Pasotuxizumab (Bayer)의 항 CD3 단일 클론 항체의 VL 코딩 핵산 서열(general biol (안후이) 유한회사)을 함유한다. 그 중, Triad5L을 주형으로 하여 항 CD19 VL 단편과 항 CD3 VL을 증폭시키고, pUC57 Kappa-Hinge mut을 주형으로 하여 Kappa-Hinge mut(C229 결실 변이) 단편을 증폭시키고, 완전히 합성된 벡터 pQKX2에 SapI와 EcoRI 이중 효소 절단을 수행하여, 이에 대응되는 PCR 산물과 효소 절단 산물을 회수하고, 재조합 효소 연결(5'부터 3'까지의 연결 순서: 항 CD19 항체 VL-Kappa-Hinge mut-항 CD3 항체 VL)을 수행하여, 획득된 최종 재조합 플라스미드를 pQKE3L이라 명명하였다.
사용된 프라이머 쌍은 다음과 같다:
Figure pct00005
Figure pct00006
3.2 항체의 발현
실시예 1에 기술한 절차에 따라 형질감염을 수행하였으며, 이 때, 형질 감염 세포는 HEK293(ATCC, 번호: CRL-1573)이었고, 형질 감염 부피는 100 mL였다. 형질감염 후의 세포를 500 mL의 플라스크에서 7일간 현탁 배양한 후 항체를 획득하였으며, 배양 조건은 36. 5℃, 7.5%의 CO2, 120 rpm/min였다. 수득된 항체는 플라스미드 pQKE3H와 pQKE3L에 의하여 발현된 항 CD3×항 CD19 이중특이성 항체를 나타내며, 항체는 E3으로 명명하였고, 그 구조는 도 1의 C에 도시된 바와 같다.
3.3 항체의 정제
실시예 1에 기술된 절차를 참조하여 정제를 진행하였으며, 완충액 치환 후 Nanodrop 마이크로 분광 광도계를 사용하여 단백질 농도를 측정하였고, 계산된 단백질 생산량은 59 mg/L였다.
3.4 항체의 동정
3.4.1 HPLC를 사용한 항체 순도 측정
실시예 1을 참조하여 HPLC로 항체 E3의 순도를 측정하였고, 단량체의 순도는 90% 이상이었다.
3.4.2 항체 친화력에 대한 Fortebio 측정
구체적인 절차에 대해서는 실시예 1을 참조하였다. Fab-Ch1의 센서로 E3 항체를 고정하였으며, 고정 농도는 0.25 μM였다. 항원 인간 CD3(Sino Biological Inc., Cat: 10977-H02H)와 인간 CD19(Sino Biological Inc., Cat: 11880-H02H)를 각각 600 nM, 300 nM, 150 nM 및 75 nM의 농도에 따라, 총 부피 200 μl로 로딩하였다. 친화력 상수 측정 결과는 도 6에 도시된 바와 같다.
실시예 4: 항 PD-L1×항 CD137 이중특이성 항체의 제조, 발현 및 동정
4.1 항 PD-L1×항 CD137 이중특이성 항체 발현 벡터의 제조
발현 벡터 구축 및 플라스미드 증폭의 구체적인 작업 절차에 대해서는 실시예 1을 참조하였으며, 그 중 합성 벡터 pUC57 PD-L1 VH-IgG1 CH1 Hinge mut(DNA 합성된 아테졸리주맙(atezolizumab) 단일 클론 항체, Roche를 포함함)의 항PD-L1 VH 코딩 핵산 서열과 IgG1 CH1 Hinge mut(C229 결실 변이, 힌지 영역 D224-S242 반전) 코딩 핵산 서열(general biol (안후이) 유한회사)와 벡터 pQKZW106H IgG1 CH1-Hinge mut(general biol (안후이) 유한회사)는 각각 항PD-L1 VH-IgG1 CH1 Hinge mut와 항CD137 VH 단편의 증폭에 사용되었으며, pQKX1 벡터(general biol (안후이) 유한회사)에 SapI와 EcoRI의 이중 효소 절단을 수행하여, 대응되는 PCR 산물과 효소 절단 산물을 회수하고, 재조합 효소 연결을 수행하여(5'부터 3'까지의 연결 순서: 항PD-L1 항체 VH-CH1-Hinge mut-항 CD137 항체 VH), 획득된 최종 재조합 플라스미드를 pQKE4H로 명명하였다. 벡터 pUC57 PD-L1 VL-Kappa Hinge mut(DNA 합성된 아테졸리주맙 단일 클론 항체 중의 항 PD-L1 VL 코딩 핵산 서열과 Kappa-Hinge mut(C229 결실 변이, 힌지 영역 D224-S242 반전) 코딩 핵산 서열(general biol (안후이) 유한회사) 함유)와 벡터 pQKZW 106L Kappa-Hinge mut(general biol (안후이) 유한회사)는 각각 항 PD-L1 VL-Kappa-Hinge mut와 항 CD137 VL 단편의 증폭에 이용되었다. pQKX2 벡터(general biol (안후이) 유한회사)에 SapI와 EcoRI 이중 효소 절단을 수행하여, 대응되는 PCR 산물과 효소 절단 산물을 회수하고, 재조합 효소 연결을 수행하여(5'에서 3'까지의 연결 순서: 항 PD-L1 항체 VL-Kappa-Hinge mut-항 CD137 항체 VL), 획득된 최종 재조합 플라스미드를 pQKE4L로 명명하였다.
IgG1 CH1-Hinge mut와 Kappa-Hinge mut는 다음과 같다:
Figure pct00007
사용된 프라이머 쌍은 다음과 같다:
Figure pct00008
Figure pct00009
4.2 항체의 발현
실시예 1에 기술한 절차에 따라 형질감염을 수행하였으며, 이 때, 형질 감염 세포는 HEK293(ATCC, 번호: CRL-1573)이었고, 형질 감염 부피는 100 mL였다. 형질감염 후의 세포를 500 mL의 플라스크에서 7일간 현탁 배양한 후 항체를 획득하였으며, 배양 조건은 36. 5℃, 7.5%의 CO2, 120 rpm/min였다. 수득된 항체는 플라스미드 pQKE4H와 pQKE4L에 의하여 발현된 항 PD-L1×항 CD137 이중특이성 항체를 나타내며, 항체는 E4로 명명하였고, 그 구조는 도 1의 D에 도시된 바와 같다.
4.3 항체의 정제
실시예 1에 기술된 절차를 참조하여 정제를 진행하였으며, 완충액 치환 후 Nanodrop 마이크로 분광 광도계를 사용하여 단백질 농도를 측정하였고, 계산된 단백질 생산량은 38 mg/L였다.
4.4 항체의 동정
4.4.1 HPLC를 사용한 항체 순도 측정
실시예 1을 참조하여 HPLC로 항체 E4의 순도를 측정하였고, 단량체의 순도는 90% 이상이었다.
4.4.2 항체 친화력에 대한 Fortebio 측정
구체적인 공정에 대해서는 실시예 1을 참조하였다. Fab-Ch1의 센서로 E4 항체를 고정하였으며, 고정 농도는 0.25 μM였다. 항원 인간 PD-L1(Sino Biological Inc., Cat: 10084-HNAH)와 인간 CD137(Sino Biological Inc., Cat: 10041-H002H)를 각각 600 nM, 300 nM, 150 nM 및 75 nM의 농도에 따라, 총 부피 200 μL로 로딩하였다.친화력 상수 측정 결과는 도 6에 도시된 바와 같다.
실시예 5: 항 CD3×항 CD137×PD-1 ECD 단백질 삼중특이성 항체의 제조, 발현 및 동정
5.1 항 CD3×항 CD137×PD-1 ECD 단백질 삼중특이성 항체 발현 벡터의 제조
발현 벡터 구축 및 플라스미드 증폭의 구체적인 작업 절차에 대해서는 실시예 1을 참조하였다. 실시예 2의 pQKE2H를 중쇄 발현 벡터로 하고; pUC57 항 CD3 scFV(항 CD3 단일 클론 항체(Pasotuxizumab, Bayer) 함유)의 VH-VL 코딩 핵산 서열(DNA 합성 방식으로 획득된 것으로서(general biol (안후이) 유한회사), 코딩 서열은 발현 벡터 pUC57에 삽입됨)과 실시예 2의 pQKE2L을 주형으로 하여, 각각 PCR을 통하여 항 CD3 scFV 단편과 항 CD137 VL-PD-1ECD 단편을 증폭하고, 동시에 pQKX2 벡터(general biol (안후이) 유한회사)에 SapI와 EcoRI 이중 효소 절단을 수행하여, 회수된 두 가지의 PCR 산물과 효소 절단 산물에 재조합 효소 연결을 수행하고(5'에서 3'까지의 연결 순서: 항 CD3-scfV-항CD137VL-Kappa-Hinge mut-PD-1 ECD), 획득된 최종 재조합 플라스미드를 pQKE5L로 명명하였다.
사용된 프라이머 쌍은 다음과 같다:
Figure pct00010
5.2 항체의 발현
실시예 1에 기술한 절차에 따라 형질 감염을 수행하였으며, 이 때, 형질 감염 세포는 HEK293(ATCC, 번호: CRL-1573)이었고, 형질 감염 부피는 100 mL였다. 형질 감염 후의 세포를 500 mL의 플라스크에서 7일간 현탁 배양한 후 항체를 획득하였으며, 배양 조건은 36. 5℃, 7.5%의 CO2, 120 rpm/min였다. 수득된 항체는 플라스미드 pQKE5H와 pQKE5L에 의해 발현되는 항 CD3×항 CD137×PD-1 ECD 단백질 삼중특이성 항체였으며, 항체는 E5로 명명되었고, 그 구조는 도 1의 E에 도시된 바와 같다.
5.3 항체의 정제
실시예 1에 기술된 절차를 참조하여 정제를 진행하였으며, 완충액 치환 후 Nanodrop 마이크로 분광 광도계를 사용하여 단백질 농도를 측정하였고, 계산된 단백질 생산량은 11 mg/L였다.
5.4 항체의 동정
5.4.1 HPLC를 사용한 항체 순도 측정
실시예 1을 참조하여 HPLC로 항체 E5의 순도를 측정하였고, 단량체의 순도는 90% 이상이었다.
5.4.2 항체 친화력에 대한 Fortebio 측정
구체적인 공정에 대해서는 실시예 1을 참조하였다. Fab-Ch1의 센서로 E5 항체를 고정하였으며, 고정 농도는 0.25 μM였다. 항원 인간 CD3(Sino Biotechnology Inc., Cat: 10977-H02H), 인간 CD137(Sino Biotechnology Inc., Cat: 10041-H002H) 및 인간 PD-L1(Sino Biotechnology, Cat: 10084-HNAH)를 각각 600 nM, 300 nM, 150 nM 및 75 nM의 농도에 따라, 총 부피 200 μL로 로딩하였다. 친화력 상수 측정 결과는 도 6에 도시된 바와 같다.
이미 일반적인 설명과 구체적인 구체예를 이용하여 본원의 기술적 해결 방법을 구체적으로 기술하였으나, 이들 기술적 해결 방법에 기초하여 일부 수정 또는 개선이 이루어질 수 있으며, 이는 당업자에게 자명한 사실이다. 따라서, 본 발명의 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 이루어진 수정 또는 개선은 모두 본원의 보호 범위 내에 속한다.
SEQUENCE LISTING <110> GAO, Xin <120> MULTI-SPECIFIC ANTIBODY, PREPARATION METHOD THEREFOR AND APPLICATION THEREOF <130> 19C13145CN <160> 44 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> SITE <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any amino acid except Cys or not present <400> 1 Xaa Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any amino acid except Cys or not present <400> 2 Glu Pro Ala Pro Cys Pro Pro Xaa 1 5 <210> 3 <211> 363 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 3 gctagcacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacaccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 360 tca 363 <210> 4 <211> 375 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 4 cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg tgacaaaact cacacaccac cgtgcccagc acctgaactc 360 ctggggggac cgtca 375 <210> 5 <211> 43 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 5 tgtggctgag aggtgccaga tgtgaagtgc agctggtgga gtc 43 <210> 6 <211> 46 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 6 gacggatggg cccttggtgc tagcactaga cactgtgacc agggta 46 <210> 7 <211> 45 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 7 ctgaactcct ggggggaccg tcatgtgaag tgcagctggt ggaat 45 <210> 8 <211> 47 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 8 tgattatgat caatgaattc atcagctaga cactgtcacc agagtgc 47 <210> 9 <211> 44 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 9 taccctggtc acagtgtcta gtgctagcac caagggccca tccg 44 <210> 10 <211> 46 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 10 attccaccag ctgcacttca catgacggtc cccccaggag ttcagg 46 <210> 11 <211> 42 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 11 tgtggctgag aggtgccaga tgtgacattc agatgactca ga 42 <210> 12 <211> 47 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 12 acagatggtg cagccacagt tcgcttgatc tcgacttttg tgccctg 47 <210> 13 <211> 44 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 13 ctgaactcct ggggggaccg tcagaaatcg tcctcactca gagc 44 <210> 14 <211> 44 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 14 attatgatca atgaattcac tatttgatct caagccgagt gcct 44 <210> 15 <211> 44 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 15 cagggcacaa aagtcgagat caagcgaact gtggctgcac catc 44 <210> 16 <211> 47 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 16 gggctctgag tgaggacgat ttctgacggt ccccccagga gttcagg 47 <210> 17 <211> 43 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 17 ctgaactcct ggggggaccg tcaccaggat ggttcttaga ctc 43 <210> 18 <211> 48 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 18 tggctgatta tgatcaatga attctcacac cagggtttgg aactggcc 48 <210> 19 <211> 44 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 19 tgtggctgag aggtgccaga tgtcaggttc agttgcagca gtct 44 <210> 20 <211> 45 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 20 gacggatggg cccttggtgc tagcagaaga gactgtcact gtggt 45 <210> 21 <211> 45 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 21 cctgaactcc tggggggacc gtcagaggtg cagctggttg aatct 45 <210> 22 <211> 44 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 22 gattatgatc aatgaattca tcagctagaa actgtgacca gtgt 44 <210> 23 <211> 46 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 23 ggcaccacag tgacagtctc ttctgctagc accaagggcc catccg 46 <210> 24 <211> 45 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 24 gccagattca accagctgca cctctgacgg tccccccagg agttc 45 <210> 25 <211> 44 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 25 ctgtggctga gaggtgccag atgtgacatc cagctgaccc agtc 44 <210> 26 <211> 42 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 26 gacagatggt gcagccacag ttcgcttgat ttccagcttg gt 42 <210> 27 <211> 46 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 27 cctgaactcc tggggggacc gtcacagaca gtggtcaccc aagagc 46 <210> 28 <211> 43 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 28 tgattatgat caatgaattc actacaaaac tgtcagcttg gtg 43 <210> 29 <211> 44 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 29 ggaggcacca agctggaaat caagcgaact gtggctgcac catc 44 <210> 30 <211> 48 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 30 aggctcttgg gtgaccactg tctgtgacgg tccccccagg agttcagg 48 <210> 31 <211> 363 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 31 gctagcacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtt caccgggagg gctgctcgaa cctgcaccat gcccgccaac acacactaaa 360 gac 363 <210> 32 <211> 375 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 32 cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg ttcaccggga gggctgctcg aacctgcacc atgcccgcca 360 acacacacta aagac 375 <210> 33 <211> 44 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 33 ctgtggctga gaggtgccag atgtgaggtg cagctggttg aatc 44 <210> 34 <211> 60 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 34 tggcgggcat ggtgcaggtt cgagcagccc tcccggtgaa caagatttgg gctcaacttt 60 <210> 35 <211> 58 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 35 ctcgaacctg caccatgccc gccaacacac actaaagacg aagtgcagct ggttcagt 58 <210> 36 <211> 47 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 36 ctgattatga tcaatgaatt ctcaagagga cactgtgacc agggtgc 47 <210> 37 <211> 43 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 37 ctgtggctga gaggtgccag atgtgacatc cagatgaccc agt 43 <210> 38 <211> 59 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 38 tggcgggcat ggtgcaggtt cgagcagccc tcccggtgaa cactctcccc tgttgaagc 59 <210> 39 <211> 57 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 39 ctcgaacctg caccatgccc gccaacacac actaaagacg acatcgtgat gacccag 57 <210> 40 <211> 49 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 40 ctgattatga tcaatgaatt ctcacttgat ttccaccttg gtgcctccg 49 <210> 41 <211> 48 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 41 ctgtggctga gaggtgccag atgtgaggtg cagctggttg aatctggc 48 <210> 42 <211> 47 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 42 ggagactggg tcatcacgat gtccaaaact gtcagcttgg tgcctcc 47 <210> 43 <211> 47 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 43 aggcaccaag ctgacagttt tggacatcgt gatgacccag tctccag 47 <210> 44 <211> 49 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 44 ctgattatga tcaatgaatt ctcacaccag ggtttggaac tggccggct 49

Claims (16)

  1. a) 경쇄, 및 중쇄의 CH1과 가변 영역으로 구성되는, 제1 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편;
    b) N 말단이 상기 중쇄와 융합되는, 제1 펩타이드 링커;
    c) N 말단이 상기 경쇄와 융합되는, 제2 펩타이드 링커를 포함하며,
    상기 제1 펩타이드 링커와 상기 제2 펩타이드 링커 사이에는 하나의 이황화 결합만이 형성될 수 있고, 상기 제1 펩타이드 링커 및 상기 제2 펩타이드 링커는 각각 독립적으로 서열번호 1 내지 2로 표시되는 서열 중 어느 하나를 포함하는 펩타이드 링커로부터 선택되며, 여기에서 X는 Cys를 제외한 임의의 아미노산을 나타내거나 또는 결실되고, 선택적으로, 상기 제1 펩타이드 링커 및/또는 상기 제2 펩타이드 링커가 천연 항체의 힌지 영역일 수 있으며, 상기 힌지 영역에는 하나의 시스테인만을 보유하는 결실 변이가 있을 수 있고, 선택적으로, 상기 제1 펩타이드 링커 및/또는 상기 제2 펩타이드 링커는 C229 결실 변이된 IgG1 힌지 영역인, 항체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 제1 결합부를 더 포함하고, 상기 제1 결합부는 상기 제1 펩타이드 링커의 C-말단과 융합되며, 선택적으로, 상기 항체는 제2 결합부를 더 포함하고, 상기 제2 결합부는 상기 제2 펩타이드 링커의 C-말단과 융합되는 것인, 항체.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 항체는 제3 결합부를 더 포함하며, 상기 제3 결합부는 상기 Fab 단편의 경쇄 또는 중쇄의 N 말단과 결합하고, 바람직하게는, 상기 제3 결합부는 상기 Fab 단편의 경쇄의 N 말단과 결합하는 것인, 항체.
  4. 청구항 2 또는 3에 있어서, 상기 제1 결합부는 제2 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그 항원 결합 단편, 리간드 및 수용체로부터 선택되며, 선택적으로, 상기 제2 결합부는 제3 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그 항원 결합 단편, 리간드 및 수용체로부터 선택되고, 선택적으로, 상기 제3 결합부는 제4 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그 항원 결합 단편, 리간드 및 수용체로부터 선택되고, 선택적으로, 상기 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 이중체 및 sc-Fv와 같은 단쇄 항체 분자로부터 선택되며, 선택적으로, 상기 제1 펩타이드 링커와 상기 제2 펩타이드 링커는 동일하거나 상이하고, 선택적으로, 상기 제1 결합부, 상기 제2 결합부 및 상기 제3 결합부는 동일하거나 상이한 것인, 항체.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 제1 결합부는 제2 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 중쇄 가변 영역(VH)이며, 상기 제2 결합부는 제2 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 경쇄 가변 영역(VL)인 것인, 항체.
  6. 청구항 4 또는 5에 있어서, 상기 제3 결합부는 sc-Fv와 같은 단쇄 항체 분자인 것인, 항체.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 이중특이성 또는 다중특이성이고, 선택적으로, 상기 항체는 2가 또는 다가이고, 선택적으로, 상기 제1 항원, 제2 항원, 제3 항원 및 제4 항원은 독립적으로 TNFα, IL17, CD137, CD3, CD19 및 PD-L1로부터 선택되고, 선택적으로, 상기 리간드는 PD-L1, EphrinA1, VEGF 및 EGF로부터 선택되고, 선택적으로, 상기 수용체는 이에 대응되어 PD-1, EphA2, VEGFR1 및 EGFR로부터 선택되는 것인, 항체.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 핵산.
  9. 청구항 8의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  10. 청구항 8의 핵산 또는 청구항 9의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포로서, 선택적으로 상기 숙주세포는 포유동물 세포이고, 상기 포유동물 세포는 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포 및 PER.C6 세포로부터 선택되는, 숙주 세포.
  11. a) 청구항 10의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    b) 상기 숙주 세포 또는 상기 숙주 세포 배양물의 상청액으로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항의 항체를 제조하는 방법.
  12. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항의 항체, 청구항 8의 핵산, 청구항 9의 발현 벡터 또는 청구항 10의 숙주 세포, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  13. 개체의 종양, 자가면역성 질환 또는 전염성 질환의 치료, 개선, 또는 예방용 약제 제조에 있어서의, 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항의 항체, 청구항 8의 핵산, 청구항 9의 발현 벡터 또는 청구항 10의 숙주 세포의 용도.
  14. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항의 항체, 청구항 8의 핵산, 청구항 9의 발현 벡터 또는 청구항 10의 숙주 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 종양, 자가면역성 질환 또는 전염성 질환을 치료, 개선 또는 예방하는 방법.
  15. 개체의 종양, 자가면역성 질환 또는 전염성 질환의 치료, 개선 또는 예방 용도로 사용하기 위한, 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항의 항체, 청구항 8의 핵산, 청구항 9의 발현 벡터 또는 청구항 10의 숙주 세포.
  16. 청구항 13의 용도, 또는 청구항 14의 방법, 또는 청구항 15의 용도의 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항의 항체, 청구항 8의 핵산, 청구항 9의 발현 벡터, 또는 청구항 10의 숙주세포에 있어서, 상기 종양은 폐암, 결장 직장암, 방광암, 백혈병, 유방암, 위암, 위식도접합부암, B림프구형 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 역형성대세포림프종, 두경부 편평상피세포암, 교모세포종, 신장암, 흑색종, 전립선암, 골암, 췌장암, 육종, 간암, 피부편평세포암, 자궁경부암, 비인두암, 자궁내막암, 또는 상기 종양의 전이암으로부터 선택되며, 선택적으로, 상기 자가면역성 질환은 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 전신성 혈관염 및 자가면역성 용혈성 빈혈로부터 선택되고, 선택적으로, 상기 전염성 질환은 유행성 감기, B형 간염, 광견병, 매독, 에이즈로부터 선택되며, 선택적으로, 상기 개체는 포유동물이며, 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간인 것인, 청구항 13의 용도, 또는 청구항 14의 방법, 또는 청구항 15항의 용도의 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항의 항체, 청구항 8의 핵산, 청구항 9의 발현 벡터, 또는 청구항 10의 숙주세포.
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