JP2022553464A - 多重特異性抗体とその製造方法および使用 - Google Patents

多重特異性抗体とその製造方法および使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、多重特異性抗体とその製造方法および使用を提供する。前記多重特異性抗体は、（ａ）第１の抗原に特異的に結合することができるＦａｂ断片であって、１本の軽鎖および１本の重鎖のＣＨ１および可変領域からなるＦａｂ断片と、（ｂ）Ｎ末端が前記重鎖と融合する第１のペプチドリンカーと、（ｃ）Ｎ末端が前記軽鎖と融合する第２のペプチドリンカーとを含み、前記第１のペプチドリンカーと前記第２のペプチドリンカーとの間には、１つのジスルフィド結合のみが形成でき、前記第１のペプチドリンカーと前記第２のペプチドリンカーは、それぞれ独立して、Ｓｅｑ ＩＤ ＮＯ．１～２で示される配列（そのうち、ＸはＣｙｓを除く任意のアミノ酸を表すか、または欠失している）のいずれかを含むペプチドリンカーから選ばれる。前記抗体は組換え発現により容易に産生することができ、同時に２つの異なる抗原または同一の抗原の異なるエピトープ、またはそれ以上の異なる抗原の複数のエピトープに標的に結合することができる。

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１９年１０月２４日に提出された中国特許出願番号２０１９１１０１５２３６．１の優先権を主張しており、本出願の全文を引用により本明細書に組み込む。
本発明は、通常、抗体の分野に関する。より具体的には、本発明は、多重特異性抗体とその製造方法および使用に関する。
天然抗体分子の多くは２価の一重特異性分子であることが知られている。しかしながら、過去半世紀以来、抗体工学の進展により、多種類の二重特異性と多重特異性の抗体分子が人工的に生成されてきた。その形態は、様々であり、例えば、一本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ，Ｈｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９－５８８３（１９８８））、４価ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合体（ＣｏｌｏｍａとＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：１５ ９－１６３（１９９７））、二本鎖抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３））、タンデムｓｃＦｖ分子（例えば、Ｂａｒｇｏｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ３２１，９７４－９７７（２００８）を参照）、４価ＩｇＧ様二重可変ドメイン抗体（「ＤＶＤ－Ｉｇ」、Ｗｕら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２５：１２９０－１２９７（２００７））、４価Ｆａｂタンデム免疫グロブリン（「ＦＩＴ－Ｉｇ」），（ＷＯ ２０１５／１０３０７２，Ｅｐｉｍａｂ Ｂｉｏｔｈｅｒａｕｐｅｕｔｉｃｓ）、２価ラット／マウスヘテロ二重特異性ＩｇＧ（Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５５：２１９－２２５（１９９５））および二重特異性Ｃｒｏｓｓｍａｂ結合タンパク質（例えばＷＯ２０１３／０２６８３１（Ｒｏｃｈｅ Ｇｌｙｃａｒｔ ＡＧ）；ＷＯ２０１４／１６７０２２（Ｅｎｇｍａｂ ＡＧ）を参照）などを含む。二重特異性または多重特異性の抗体は、２つ以上の異なるエピトープまたは抗原標的に結合することができ、また、結合分子に備えない一部の新しい機能を備えている（例えば、Ｓｅｒｇｅｙら，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ Ｄｅｖｅｌ Ｔｈｅｒ．１２：１９５－２０８（２０１８）の総説を参照）ため、様々な腫瘍の治療に用いられる二重特異性または多重特異性の抗体、特に「Ｔ細胞リダイレクション」に用いられる二重特異性抗体はますます注目されている。このような二重特異性抗体は、腫瘍細胞上の表面抗原と、Ｔ細胞表面受容体（ＴＣＲ）複合体の活性化成分（たとえば、ＣＤ３）との両方に標的化することができ、その結果、腫瘍を標的に攻撃する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が活性化される。このような二重特異性抗体の代表的な形態は、「二重特異性Ｔ細胞接合体」または「ＢｉＴＥ」抗体であり、例えば、グリシン－セリン（Ｇ４Ｓ）リンカーを介して連結された２つのｓｃＦｖ抗体を含み、一方のｓｃＦｖは腫瘍抗原（例えば、１７－１Ａ腫瘍抗原）の結合部位を提供し、他方のｓｃＦｖはＴ細胞上のＣＤ３抗原の結合部位を提供する（Ｍａｃｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：７０２１－７０２５（１９９５））。抗ＣＤ３×抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ抗体Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂは、まれな形態のＢ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の治療に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されている。Ｔ細胞リダイレクションに用いられる他の二重特異性抗体形態には、４価タンデム二本鎖抗体（「ＴａｎｄＡｂ」，Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９３：４１－５６（１９９９）；Ａｒｎｄｔら，Ｂｌｏｏｄ，９４：２５６２－２５６８（１９９９））と両親媒性再標的化タンパク質（「ＤＡＲＴ」，Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３９９：４３６－４４９（２０１０））が含まれるが、これらに制限されない。
Ｆｃを含む全長二重特異性抗体形態は、より長い半減期を持ち、Ｆｃエフェクター機能を有することが知られている。しかしながら、全長二重特異性抗体はｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ（「ＫｉＨ」）技術（Ｒｉｄｇｗａｙら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，９：６１７－６２１（１９９６））を用いてＦｃ領域のヘテロ二量体化の集合や安定性を高める必要があるが、ヘテロ二量体の整合性の悪さや軽鎖ミスマッチなどにより、目標産物の安定性の劣化や一連の非目標産物の生成を招き、分子の発現と精製が困難になる。Ｆｃは二重特異性抗体に長い半減期を与えるが、ヘテロ二量体の形成を妨害する原因の一つであり、またＦｃエフェクター機能は一部の薬物設計において必要でないだけでなく、薬物機能に妨害的な影響を与える。したがって、Ｆｃエフェクターを回避するために、ＢｉＴＥ、二本鎖抗体、ＤＡＲＴやＴａｎｄＡｂなどの二重特異性抗体は、一本鎖形態を取り、ペプチドリンカーを介して異なる可変ドメインを連結することで二重特異性を実現する。フルサイズモノクローナル抗体と比較して、これらの分子の利点は、より小さくなり、組織や腫瘍に迅速にアクセスすることであり、欠点は、これらの形態はＦｃ領域を含まず、分子量が通常６０ｋＤａ未満であり、腎クリアランスのためにインビボ半減期が非常に短くなり、また、物理的に不安定であることである（Ｓｐｉｅｓｓら（２０１５）、前述の引用文献）。全長二重特異抗体Ｆｃは、非相関重鎖と二量体とのペアリングによる不活性分子副生成物を形成し、一方、一本鎖二重特異抗体は安定性が悪く、半減期が短く、このため、両者の中間にある二本鎖Ｆａｂ抗体の形態は、これらの問題を同時に解決することが期待される。しかしながら、２本の軽鎖をランダムに会合する場合にも、不活性で望ましくない副産物をもたらすため、２つ以上のＦａｂを通常のリンカーを介して直接融合させた構築物は実行可能性が低くなっている。
多くの二重特異性または多重特異性抗体の形態は新しい治療性抗体を研究開発するための可能な形態とされている。しかしながら、これまでのところ、ほとんどの疾患を治療するための新しい治療抗体の開発に使用できるようにする包括的な特性を提供できる形態はまだなかった。二重特異性または多重特異性抗体の使用可能性の増加や、現在の利用可能な形態に関連するさまざまな結果を考慮すると、特定の疾患を治療する抗体の研究開発に関連する特定の課題に対処するために、工程的になる可能な改良形態が求められている。
本明細書は、ミスマッチ副産物の減少、目標産物の増加により容易に産生される、本分野で知られている二重特異性抗体断片よりも高い安定性と少ない凝集を示す新規な二重特異性抗体、およびその製造方法を提供する。また、このような方法は、共通の軽鎖または重鎖をスクリーニングすることなく、既存の抗体に適用することができる。さらに、この新規な二重特異性抗体は、多くの一本鎖二重特異性抗体断片と比較して、分子量が高く、過度の腎クリアランスを防止して、インビボ半減期を増加させることができる。
第１の態様によれば、本発明は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合することができるＦａｂ断片であって、１本の軽鎖および１本の重鎖のＣＨ１および可変領域からなるＦａｂ断片と、
（ｂ）Ｎ末端が前記重鎖と融合する第１のペプチドリンカーと、
（ｃ）Ｎ末端が前記軽鎖と融合する第２のペプチドリンカーとを含む抗体であって、
前記第１のペプチドリンカーと前記第２のペプチドリンカーとの間には、１つのジスルフィド結合のみが形成でき、前記第１のペプチドリンカーと前記第２のペプチドリンカーは、それぞれ独立して、Ｓｅｑ ＩＤ ＮＯ．１～２で示される配列（そのうち、Ｘは、Ｃｙｓを除く任意のアミノ酸を表す、または欠失している）のいずれかを含むペプチドリンカーから選ばれる、抗体を提供する。
第２の態様によれば、本発明は、第１の態様に記載の抗体をコードする核酸を提供する。
第３の態様によれば、本発明は、第２の態様に記載の核酸を含む発現ベクターを提供する。
第４の態様によれば、本発明は、第２の態様に記載の核酸または第３の態様に記載の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞およびＰＥＲ．Ｃ６細胞を含むことができるが、これらに限定されない。
第５の態様によれば、本発明は、
第４の態様に記載の宿主細胞を培養するステップ（ａ）と、
前記宿主細胞または前記宿主細胞の培養物の上清から前記抗体を回収するステップ（ｂ）とを含む、第１の態様に記載の抗体の製造方法を提供する。
第６の態様によれば、本発明は、第１の態様に記載の抗体、第２の態様に記載の核酸、第３の態様に記載の発現ベクター、または第４の態様に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
第７の態様によれば、本発明は、腫瘍、自己免疫疾患または伝染性疾患を治療、改善または予防するための薬物の製造における、第１の態様に記載の抗体、第２の態様に記載の核酸、第３の態様に記載の発現ベクター、または第４の態様に記載の宿主細胞の使用を提供する。
第８の態様によれば、本発明は、第１の態様に記載の抗体、第２の態様に記載の核酸、第３の態様に記載の発現ベクター、または第４の態様に記載の宿主細胞を個体に投与することを含む、個体の腫瘍、自己免疫疾患または伝染性疾患を治療、改善または予防するための方法を提供する。
第９の態様によれば、本発明は、個体の腫瘍、自己免疫疾患または伝染性疾患を治療、改善または予防するための使用における、第１の態様に記載の抗体、第２の態様に記載の核酸、第３の態様に記載の発現ベクター、または第４の態様に記載の宿主細胞を提供する。
本発明で構築された二重特異性または多重特異性抗体の構造模式図を示し、図１のＡは抗ＴＮＦα×抗ＩＬ－１７Ａ二重特異性抗体（Ｅ１）の構造模式図を示し、図１のＢは抗ＣＤ１３７×ＰＤ－１ ＥＣＤタンパク質二重特異性抗体（Ｅ２）の構造模式図を示し、図１のＣは抗ＣＤ３×抗ＣＤ１９二重特異性抗体（Ｅ３）の構造模式図を示す。 図１のＤは抗ＰＤ－Ｌ１×抗ＣＤ１３７二重特異性抗体（Ｅ４）の構造模式図を示し、図１のＥは抗ＣＤ３×抗ＣＤ１３７×ＰＤ－１ ＥＣＤタンパク質三重特異性抗体（Ｅ５）の構造模式図を示す。 抗ＴＮＦα×抗ＩＬ－１７Ａ二重特異性抗体（Ｅ１）の精製およびＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動の結果を示し、図２のＡは抗体Ｅ１のＣａｐｔｏ Ｌアフィニティークロマトグラムを示し、図２のＢは抗体Ｅ１のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動の結果を示し、レーンＭはＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ、レーン１は非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動の結果、レーン３は還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動の結果を示す。 ＨＰＬＣによる抗体Ｅ１の純度の検出結果を示す。 Ｆｏｒｔｅｂｉｏによる結合親和性の結合－解離曲線を示し、図４のＡは抗体Ｅ１が抗原ＴＮＦ－αに結合した場合の結合－解離曲線を示し、図４のＢはアダリムマブが抗原ＴＮＦ－αに結合した場合の結合－解離曲線を示し、図４のＣは抗体Ｅ１が抗原ＩＬ－１７Ａに結合した場合の結合－解離曲線を示し、図４のＤはセクキヌマブが抗原ＩＬ－１７Ａに結合した場合の結合－解離曲線を示す。 抗体Ｅ２が細胞表面抗原に結合したフローサイトメトリーの結果を示し、図５のＡは抗体Ｅ２がＭＣ３８－ＰＤＬ－１細胞に結合したフローサイトメトリーの結果を示し、図５のＢは抗体Ｅ２がＢ８－ＣＤ１３７細胞に結合したフローサイトメトリーの結果を示す。 本発明で構築された各特異的抗体とそれに対応する抗原との親和性定数の測定結果を示す。
〔発明の詳細な説明〕
以下の定義および方法は、本発明をよりよく定義し、本発明の実施において当業者を指導するために提供される。特に断らない限り、本発明の用語は、当業者による常法に従って理解される。
＜定義＞
本明細書で使用される用語「約」は、記載された数字の±１０％を指し、例えば、約１％は０．９％～１．１％の範囲を指す。
本明細書で使用される用語「抗体」とは、所望の生物学的活性を示すことができる任意の形態の抗体またはその断片を指す。したがって、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片をカバーする最も広義の意味で使用され、それらが所望の生物学的活性を示すことができればよい。したがって、当業者が理解できるように、本明細書で使用される用語「抗体」は、所望の生物学的活性を示すことができる任意の形態の同一若しくは異なる抗体またはそれらの断片の融合タンパク質を意味することもでき、それによって、多重特異性抗体の機能を達成する。
本明細書で使用される用語「抗原」とは、抗体などの選択的結合剤に結合することができる分子または分子部分を指し、また、この抗原のエピトープに結合することができる抗体を製造するために動物で使用することもできる。抗原は、１つまたは複数の結合エピトープを有することができる。本明細書に記載の抗原には、ほとんどのタンパク質、細菌、ウイルス、細菌外毒素、多糖類（たとえば、肺炎球菌の莢膜多糖類など）、類脂質などが含まれ得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用される用語「特異的結合」は、当業者によく知られた用語であり、抗体と抗原とのような特異的結合を測定する方法も当業者によく知られている。例えば、いくつかの実施形態において、「特異的結合」とは、抗体が意図された標的に結合するが、他の標的には有意に結合しないことを意味する。抗体は、他のエピトープとの結合と比較して、明らかに増加した親和性および／またはより長い持続時間で、意図された標的エピトープに結合する。
本明細書で使用される用語「抗原結合断片」は、実質的にその結合活性を保持する抗体の断片または誘導体を含む。したがって、用語「抗原結合断片」は、全長抗体の一部、通常、その抗原結合領域または可変領域を指す。抗原結合断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ｓｃ－Ｆｖのような一本鎖抗体分子、および抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。また、抗原結合断片は、その結合活性を実質的に変化させない保存的アミノ酸置換を含んでもよいと考えられる。
本明細書で使用される用語「Ｆａｂ断片」は、１本の軽鎖および１本の重鎖のＣＨ１および可変領域を含む。Ｆａｂ分子の重鎖は、他の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
本明細書で使用される用語「Ｆａｂ’断片」は、１本の軽鎖および１本の重鎖の一部または断片を含有し、前記一部または断片は、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメイン、ならびにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の領域を含有し、これにより、２つのＦａｂ’断片の２本の重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成されてＦ（ａｂ’）２分子を形成することができる。
本明細書で使用される用語「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２本の軽鎖および２本の重鎖を含有し、前記重鎖は、２本の重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成されるようにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の定常領域の一部を含有する。したがって、Ｆ（ａｂ’）２断片は、２本の重鎖の間のジスルフィド結合を介して互いに連結された２つのＦａｂ’断片から構成される。
本明細書で使用される用語「Ｆｖ断片」は、重鎖および軽鎖からの可変領域を含むが、定常領域を欠いている。
本明細書で使用される用語「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む抗体断片を指し、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖の形態で存在する。通常、Ｆｖポリペプチドは、またｓｃＦｖが抗原結合のために所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーを含む。
本明細書で使用される用語「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」は２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、前記断片は、同一ポリペプチド鎖内に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）およびそれに連結された軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）（ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨ）を含む。同一鎖上の２つのドメイン間でペアリングができないほど短いリンカーを使用することにより、各ドメインは他の鎖の相補ドメインとペアリングを余儀なくされ、２つの抗原結合部位が生成される。
本明細書で使用される用語「超可変領域」は、抗原結合を担当する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変領域の残基２４－３４（ＬＣＤＲ－１）、５０－５６（ＬＣＤＲ－２）および８９－９７（ＬＣＤＲ－３）、並びに重鎖可変領域の残基３１－３５（ＨＣＤＲ－１）、５０－６５（ＨＣＤＲ－２）および９５－１０２（ＨＣＤＲ－３）、「Ｋａｂａｔら，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．」）、および／または「超可変環」に由来するアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）および９１－９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインの残基２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）および９６－１０１（Ｈ３）、「ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，（１９８７）Ｊ．Ｍｏｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７」）を含む。「フレーム領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書でＣＤＲ残基として定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基を指す。
本明細書で使用される用語「ペプチドリンカー」は、２つのポリペプチドを連結するために使用される比較的柔軟なペプチド分子を指す。本発明で使用されるペプチドリンカーは、１つのシステインのみを含むので、２つのペプチドリンカー間に安定なジスルフィド結合を形成することができる。
本明細書で使用される用語「結合部分」は、他の物質に特異的に結合することができる部分を指し、抗体またはその抗原結合断片、リガンドおよび受容体などを含むことができるが、これらに限定されない。本発明の抗体に含まれる結合部分により、この抗体は、結合部分が特異的に結合する標的に標的化することができる。
本明細書で使用される用語「腫瘍関連抗原」は、前記抗原を腫瘍に関連させるために、腫瘍細胞が単独でまたは主にまたは過剰に発現する任意の分子（例えば、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物など）を指す。腫瘍関連抗原は、前記腫瘍抗原が１つのタイプの腫瘍にのみ関連するか、または１つのタイプの腫瘍にのみ特有であるようにするために、１つのタイプの腫瘍によってのみ発現される抗原であってもよい。任意選択的に、腫瘍抗原は、複数のタイプの腫瘍に関連するか、または特有の腫瘍抗原であってもよい。例えば、腫瘍関連抗原は乳癌細胞と結腸癌細胞の両方で発現することができるが、正常な、非腫瘍または非癌細胞では発現しない。例示的な腫瘍関連抗原は腫瘍細胞表面抗原であり、このような抗原は治療用および診断用抗体によってより認識されやすい。
本明細書に記載の「モノクローナル抗体」とは、実質的に同質の抗体群から得られる抗体を指し、すなわち、天然に発生する可能性のある少数の変異を除き、その抗体群を構成する抗体はそれぞれ同一である。モノクローナル抗体は単一抗原エピトープに対して高度に特異的である。本明細書に開示されたモノクローナル抗体は、抗体由来またはその製造方法（例えば、ハイブリドーマ、ファージによる選別、組換え発現、トランスジェニック動物など）に限定されない。この用語には、「抗体」の定義に属する完全な免疫グロブリンおよびその断片などが含まれる。
「発現ベクター」とは、発現対象のヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用要素を含み、発現のための他の要素は、宿主細胞またはインビトロ発現系によって提供することができる。発現ベクターは、組換えポリヌクレオチドに組み込まれたコスミド、プラスミド（例えば、露出しているか、またはリポソームに含まれている）、およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）のような、当技術分野で知られているすべてのものを含む。
通常の二重特異性抗体断片の構造は、抗体のＶＬとＶＨを（Ｇ４Ｓ）ｎ連結ペプチドを介して直列に連結しているが、その安定性が悪く、遺伝子発現レベルが低く、発現産物が凝集しやすく、インビボ半減期が短い。抗体の重鎖におけるヒンジ領域の役割は、一方では、抗体の両腕が抗原に十分に結合できることを保証する柔軟な構造を提供することであり、他方では安定なホモ二量体構造を生成するために２対以上のジスルフィド結合を提供することであることが知られている。しかしながら、二重特異性抗体を構築する際には、ヘテロ二量体をできるだけ生成させてホモ二量体を減少させることが望まれており、従来の方法では、ＣＨ３のアミノ酸突然変異によりｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ構造を導入したり、突然変異により逆電荷のアミノ酸を導入したりすることでヘテロ二量体の形成を促進していたが、軽鎖ミスマッチの問題は解決できなかった。また、Ｆｃエフェクター機能を必要とせず、Ｆｃエフェクターを除去するために別途突然変異を必要としたり、Ｆｃを直接除去してＦ（ａｂ）２やＦａｂの形態を採用したりする場合があり、このため、Ｆａｂセグメントにヘテロ二量化を促進するアミノ酸突然変異を導入することは困難である。本発明は、抗体ヒンジ領域におけるジスルフィド結合の安定化作用を創造的に利用して、突然変異した抗体ヒンジ領域をそれぞれＦａｂ抗体の重鎖と軽鎖のＣ－末端と融合させ、そして（１）重鎖と軽鎖の間に突然変異した抗体ヒンジ領域のみで一対のジスルフィド結合を形成し、天然ＣＨ１とＣＬの間に形成された一対のジスルフィド結合は変化しないようにさせ、（２）重鎖可変領域と軽鎖可変領域の非共有結合作用が重畳的な安定因子を提供するようにさせる。総合的に言えば、第２の安定因子（ヒンジ領域に天然に存在する二対のジスルフィド結合）と第３の安定因子（天然重鎖のＦｃセグメント、特にＣＨ３部分の非共有結合の二量体化作用）の欠如により、重鎖間のホモ二量体の安定性が著しく低下し、一方、軽鎖と重鎖の間に一対のジスルフィド結合が増加するため、安定性が増加し、そのため、産生した軽、重鎖ヘテロ二量体の安定性はホモ二量体より大幅に高くなり、ヘテロ二量体は発現産物に占める割合が極めて高く、ホモ二量体は発現産物に占める割合が極めて低く、さらに安定産物を産生しない。微量の重鎖または軽鎖自体のホモ二量体は、ＣＨ１またはＣＬに対する親和性精製媒体を用いて効果的に除去することができる。したがって、本発明によれば、目標二重特異性抗体を高純度で安定的に容易に得ることができる。
したがって、本発明は、組換え発現により容易に産生することができ、同時に２つの異なる抗原または同一抗原の異なるエピトープ、またはそれ以上の異なる抗原の複数のエピトープに標的に結合することができる改良二重特異性または多重特異性抗体を提供する。
第１の態様によれば、本発明は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合することができるＦａｂ断片であって、１本の軽鎖および１本の重鎖のＣＨ１および可変領域からなるＦａｂ断片と、
（ｂ）Ｎ末端が前記重鎖と融合する第１のペプチドリンカーと、
（ｃ）Ｎ末端が前記軽鎖と融合する第２のペプチドリンカーとを含む抗体であって、
前記第１のペプチドリンカーと前記第２のペプチドリンカーとの間には、１つのジスルフィド結合のみが形成でき、前記第１のペプチドリンカーと前記第２のペプチドリンカーは、それぞれ独立して、Ｓｅｑ ＩＤ ＮＯ．１～２で示される配列のいずれか（ただし、Ｓｅｑ ＩＤ ＮＯ．１～２は、それぞれＸＰＰＣＰＡＰＥおよびＥＰＡＰＣＰＰＸであり、ここでＸはＣｙｓを除く任意のアミノ酸を表すか、または欠失している）を含むペプチドリンカーからなる群より選れる、抗体を提供する。
いくつかの実施形態において、前記第１のペプチドリンカーおよび／または前記第２のペプチドリンカーは、１つのシステインのみを保持する欠失突然変異を施すことができる天然抗体のヒンジ領域であってもよい。
好ましい実施形態において、前記第１のペプチドリンカーおよび／または前記第２のペプチドリンカーは、Ｃ２２９欠失突然変異のＩｇＧ１ヒンジ領域であってもよい。
いくつかの実施形態において、前記第１のペプチドリンカーと前記第２のペプチドリンカーは同じである。
いくつかの実施形態において、前記第１のペプチドリンカーと前記第２のペプチドリンカーは異なっている。
同一位置を同定するために抗体のアミノ酸配列に番号を付け、現在、抗体に対して複数の異なる番号付け方法が存在する。Ｋａｂａｔ方法（Ｋａｂａｔら、１９９１）は、同じドメインタイプの配列間における高配列変異領域の位置に基づいて開発されたものである。抗体の重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶλとＶκ）の可変ドメインに付ける番号が異なる。Ｃｈｏｔｈｉａ方法（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ、１９９７）は、第１のＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）の周囲に注釈を挿入する位置が構造環に対応するように修正されている以外、Ｋａｂａｔ方法と同じである。本発明に係る抗体は、Ｋａｂａｔ方法に従って番号が付けられている。
いくつかの実施形態において、第１の態様に記載の抗体は、その第１のペプチドリンカーおよび／または第２のペプチドリンカーのＣ－末端を介して他の結合部分を融合し、抗体の結合価を２価または３価にすることができる。
例えば、第１の態様に記載の抗体は、その第１のペプチドリンカーまたは第２のペプチドリンカーのＣ－末端を介して第１の結合部分を融合し、二重特異性抗体を形成することができる。前記第１の結合部分は、抗体またはその抗原結合断片、リガンドおよび受容体から選択され得る。いくつかの実施形態において、第１の態様に記載の抗体は、その第１のペプチドリンカーと第２のペプチドリンカーのＣ－末端を介して、それぞれ第１の結合部と第２の結合部とを融合し、二重特異性（第１の結合部と第２の結合部とが同一の場合）または三重特異性（第１の結合部と第２の結合部とが異なっている場合）の抗体を形成することができる。前記第１の結合部分および前記第２の結合部分は、それぞれ独立して、抗体またはその抗原結合断片、リガンドおよび受容体から選択され得る。
いくつかの実施形態において、第１の態様に記載の抗体は、前記Ｆａｂ断片の軽鎖または重鎖のＮ末端に結合する第３の結合部分をさらに含む。好ましくは、前記第３の結合部は、前記Ｆａｂ断片の軽鎖のＮ末端に結合する。
いくつかの実施形態において、前記第１の結合部分は、第２の抗原の抗体に特異的に結合することができる重鎖可変領域（ＶＨ）であり、前記第２の結合部分は、第２の抗原の抗体に特異的に結合することができる軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
いくつかの実施形態において、前記第１の結合部分、前記第２の結合部分および／または前記第３の結合部分は、最終的な抗体が３価、４価以上となるように、２価、３価以上の抗体断片から独立して選択され得る。当業者は、必要に応じて、前記第１のペプチドリンカーおよび／または第２のペプチドリンカーと融合する適切な抗体断片を選択することができる。
いくつかの実施形態において、前記抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、およびｓｃ－Ｆｖのような一本鎖抗体分子から選ばれる。
第１の抗原に特異的に結合することができる前記Ｆａｂ断片、前記第１の結合部分、前記第２の結合部分および前記第３の結合部分は、それぞれ独立してモノクローナル抗体に由来することができる。
いくつかの実施形態において、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、アダリムマブ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、セクキヌマブ（ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ゲムツズマブ－オゾガマイシン（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、ブレンツキシマブ－ベドチン（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ Ｖｅｄｏｔｉｎ）、デノスマブ（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、オビヌツズマブ（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、３Ｆ８、アバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、アフツズマブ（ａｆｕｔｕｚｕｍａｂ）、アラシズマブ（ブペゴール）（ａｌａｃｉｚｕｍａｂ（ｐｅｇｏｌ））、アマツキシマブ（ａｍａｔｕｘｉｍａｂ）、アポリズマブ（ａｐｏｌｉｚｕｍａｂ）、バビツキシマブ（ｂａｖｉｔｕｘｉｍａｂ）、ベクツモマブ（ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ベリムマブ（ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、カンツズマブ－メルタンシン（ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、カンツズマブ（ラブタンシン）（ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ（ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ））、カプロマブ（ペンデチド）（ｃａｐｒｏｍａｂ（ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ））、カツマキソマブ（ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）、シタツズマブ（ボダトックス）（ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ（ｂｏｇａｔｏｘ））、シクスツムマブ（ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）、クリバツズマブ（テトラキセタン）（ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ（ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ））、コナツムマブ（ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）、ダセツズマブ（ｄａｃｅｔｕｚｕｍａｂ）、ダロツズマブ（ｄａｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、デツモマブ（Ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、ドロジツマブ（Ｄｒｏｚｉｔｕｍａｂ）、エクロメキシマブ（ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）、エドレコロマブ（ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）、エロツズマブ（ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、エナバツズマブ（Ｅｎａｖａｔｕｚｕｍａｂ）、エンシツキシマブ（ｅｎｓｉｔｕｘｉｍａｂ）、エプラツズマブ（ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ）、エルツマキソマブ（ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エタラシズマブ（ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）、ファレツズマブ（ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）、ＦＢＴＡ０５、フランボツマブ（Ｆｌａｎｖｏｔｕｍａｂ）、ガリキシマブ（ｇａｌｉｘｉｍａｂ）、ゲムツズマブ（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、ガニツマブ（ｇａｎｉｔｕｍａｂ）、ギレンツキシマブ（ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、グレムバツムマブ（ベドチン）（ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ（ｖｅｄｏｔｉｎ））、イブリツモマブ－チウキセタン（ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ ｔｉｕｘｅｔａｎ）、イクルクマブ（ｉｃｒｕｃｕｍａｂ）、イゴボマブ（ｉｇｏｖｏｍａｂ）、インダツキシマブ－ラブタンシン（ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、インテツムマブ（ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）、イノツズマブ－オゾガマイシン（ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）（ＭＤＸ－１０１）、イラツムマブ（ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）、ラベツズマブ（ｌａｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、レクサツムマブ（ｌｅｘａｔｕｍｕｍａｂ）、リンツズマブ（ｌｉｎｔｕｚｕｍａｂ）、ロルボツズマブ（メルタンシン）（ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ（ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ））、ルカツムマブ（ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）、ルミリキシマブ（ｌｕｍｉｌｉｘｉｍａｂ）、マパツズマブ（ｍａｐａｔｕｍｕｍａｂ）、マツズマブ（ｍａｔｕｚｕｍａｂ）、ミラツズマブ（ｍｉｌａｔｕｚｕｍａｂ）、ミツモマブ（ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）、モガムリズマブ（ｍｏｇａｍｕｌｉｚｕｍａｂ）、モキセツモマブ（パスドトックス）（ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ（ｐａｓｕｄｏｔｏｘ））、ナコロマブタ（フェナトクス（ｎａｃｏｌｏｍａｂ（ｔａｆｅｎａｔｏｘ））、ナプツモマブ（エスタフェナトックス）（ｎａｐｔｕｍｏｍａｂ（ｅｓｔａｆｅｎａｔｏｘ））、ナルナツマブ（ｎａｒｎａｔｕｍａｂ）、ネシツムマブ（ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、ニモツズマブ（ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ＮＲ－ＬＵ－１０、オララツマブ（ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）、オポルツズマブ（モナトクス）（ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ（ｍｏｎａｔｏｘ））、オレゴボマブ（ｏｒｅｇｏｖｏｍａｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、ペルツズマブ（ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、プリツムマブ（ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）、ラコツモマブ（ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）、ラドレツマブ（ｒａｄｒｅｔｕｍａｂ）、ロバツムマブ（ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）、オマリズマブ（ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）、シブロツマブ（ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、シルツキシマブ（ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）、タプリツモマブ（パプトクス）（ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ（ｐａｐｔｏｘ））、テナツモマブ（ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）、テプロツムマブ（ｔｅｐｒｏｔｕｍｕｍａｂ）、チシリムマブ（ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ）、トレメリムマブ（ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）、ティガツズマブ（ｔｉｇａｔｕｚｕｍａｂ）、ツコツズマブ（セルモロイキン）（ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ（ｃｅｌｍｏｌｅｕｋｉｎ））、ウブリツキシマブ（Ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）、ウレルマブ（ｕｒｅｌｕｍａｂ）、ベルツズマブ（ｖｅｌｔｕｚｕｍａｂ）、ボロキシマブ（ｖｏｌｏｃｉｘｉｍａｂ）、ボツムマブ（ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）、およびザルツムマブ（ｚａｌｕｔｕｍｕｍａｂ）から選ばれる１種または複数種であってもよい。
本発明の抗体によって結合され得る抗原は、細胞（Ｔ細胞、内皮細胞または腫瘍細胞）膜上の細胞表面タンパク質などの細胞関連タンパク質であってもよく、可溶性タンパク質であってもよい。抗原は、また疾患または感染の間にアップレギュレートされる任意の医学的に関連するタンパク質、たとえば、受容体および／またはそれらの対応するリガンドであってもよい。細胞表面タンパク質の具体例には、インテグリン、Ｅ－セレクチン、Ｐ－セレクチンまたはＬ－セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ１３４、ＩＣＯＳ、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＴＣＲ、クラスＭＨＣＩおよびクラスＭＨＣＩＩ抗原、ＶＥＧＦ、およびこれらのタンパク質の受容体などの接着分子が含まれるが、これらに限定されない。可溶性タンパク質は、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１６またはＩＬ－１７）、ウイルス抗原（例えば、呼吸器合胞体ウイルスまたはサイトメガロウイルス抗原）、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＥ）、インターフェロン（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγ）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子－β、コロニー刺激因子（例えば、Ｇ－ＣＳＦまたはＧＭ－ＣＳＦ）および血小板由来成長因子（例えば、ＰＤＧＦ－αおよびＰＤＧＦ－β）、ならびにそれらの受容体（適切な場合）を含む。その他の抗原には、細菌細胞表面抗原、細菌毒素、ウイルス（たとえば、インフルエンザウイルス、ＥＢＶ、ＨｅｐＡ、Ｂ、およびＣ）、生物テロ試薬、放射性核種や重金属、ヘビとクモの毒や毒素が含まれる。
本発明の抗体によって結合され得る他の抗原には、血清キャリアタンパク質、細胞媒介エフェクター機能のリクルートを可能にするポリペプチド、および核種キレート化タンパク質が含まれる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体によって結合され得る抗原は、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＶＥＧＦ、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ３０、ＲＡＮＫＬ、ＨＥＲ２、ＶＥＧＦ－Ｒ２、Ｈｅｒ３、Ａ３３抗原、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＡ２４２抗原、５Ｔ４、ＶＥＧＦＲ－１、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１５２、ＣＤ２００、ＣＤ２２１、ＣＣＲ４、ＮＰＣ－１Ｃ、ビメンチン、インスリン様成長因子－１受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）、αフェトプロテイン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、インテグリンαvβ3、インテグリンα5β1、線維芽細胞活性化蛋白、ＦＡＰ－α、ＴＡＧ－７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）、ＥＧＰ４０汎癌抗原、糖タンパク質ＥｐＣＡＭ、プログラム死－１、肝再生ホスファターゼ３（ＰＲＬ－３）、Ｌｅｗｉｓ－Ｙ抗原、ＧＤ２、グリピカン－３（ＧＰＣ３）およびメソセリンのいずれか１種または複数種を含む腫瘍関連抗原である。
前記第１の結合部分、前記第２の結合部分および前記第３の結合部分は、それぞれ独立してリガンドおよび受容体から選ばれてもよい。
「受容体」とは、ホルモン、神経伝達物質、薬物または細胞内シグナル分子と結合し、細胞機能の変化を引き起こすことができる生体高分子を指す。受容体自体には少なくとも２つの活性部位が含有されており、１つはリガンドを認識し結合する活性部位であり、もう１つは応答反応を発生させる機能活性部位であり、この部位はリガンドと結合して二元複合体を形成し、アロステリック化した後にのみ応答反応を発生させることができ、これによって一連の生化学反応を開始し、最終的に標的細胞に生物効果を発生させる。受容体はそのリガンドに特異的に結合することができる。通常、受容体の細胞外領域を本発明における結合部分とする
「リガンド」とは、その受容体に結合することができる任意の分子を指す。大多数のリガンドは親水性の生体高分子であり、例えばサイトカイン、蛋白質ポリペプチド類ホルモン、水溶性ホルモン、プロスタグランジン、親水性神経伝達物質などであり、標的細胞膜を透過して細胞内に入ることができないため、このようなリガンドシグナル分子の受容体は標的細胞膜上に局在する。
重要な免疫抑制分子であるＰＤ－１（プログラム死受容体－１）は、免疫グロブリンスーパーファミリーであり、２６８アミノ酸残基の膜タンパク質である。ＰＤ－１を標的とした免疫調節は抗腫瘍、抗感染、抗自己免疫疾患および臓器移植生存などに重要な意義がある。そのリガンドＰＤ－Ｌ１も標的とすることができ、対応する抗体も同様の役割を果たすことができる。ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１は、本発明における結合部分、例えば、第１の結合部分および／または第２の結合部分として機能することができる。好ましくは、ＰＤ－１の細胞外領域、すなわちＰＤ－１ ＥＣＤは、本発明における結合部分として機能する。
本発明の抗体は、そのＦａｂのＣ－末端にＣＨ２－ＣＨ３ドメインを導入することができる。ＣＨ２－ＣＨ３ドメインは、ペプチドリンカーに連結されていてもよく、第１の結合部分および／または第２の結合部分のＣ－末端に連結されてもよい。前記ＣＨ２－ＣＨ３ドメインは、任意選択的に、ＫｉＨで突然変異し、システイン残基を導入し、１つ以上の塩橋突然変異を導入することでヘテロ二量体化を促進し、そのような添加はヘテロ二量体の安定性を向上させる。本明細書における塩橋は、水素結合や静電的相互作用を含み、たとえば、グルタミン酸とリジン残基との間に塩架橋が生じ得る。
天然抗体の重鎖および軽鎖は、それぞれ可変領域（すなわちＶ領域）および定常領域（すなわちＣ領域）を含む。重鎖の定常領域はＣＨ、軽鎖の定常領域はＣＬと呼ばれる。異なる型（κまたはλ）のＩｇのＣＬ長はほぼ一致しているが、異なる種類のＩｇのＣＨ長は異なっており、例えばＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤはＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含み、一方、ＩｇＭとＩｇＥはＣＨｌ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４を含む。
第２の態様によれば、本発明は、第１の態様に記載の抗体をコードする核酸を提供する。
好ましい実施形態において、前記核酸は、宿主細胞内での発現に適したコドン最適化核酸であり得る。例えばコドンの縮重度に応じて、コドンは依然として同じタンパク質をコードしている。使用する宿主細胞に基づいてコドンを最適化する方法は、当業者には公知である。
第３の態様によれば、本発明は、第２の態様に記載の核酸を含む発現ベクターを提供する。
任意の適切な発現ベクターを使用することができる。例えば、原核クローニングベクターは、ｃｏｌＥｌ、ｐＣＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ｐＵＣ、ｐＫＳＭおよびＲＰ４などの大腸菌由来のプラスミドを含む。原核ベクターは、またＭ１３などのファージＤＮＡおよび他の糸状一本鎖ＤＮＡファージの誘導体を含む。酵母に使用可能なベクターの例は２μプラスミドである。哺乳動物細胞における発現のための適切なベクターは、ＳＶ－４０、アデノウイルス、レトロウイルス由来ＤＮＡ配列および機能性哺乳動物ベクター（上記したようなもの）と機能性プラスミドおよびファージＤＮＡとの組み合わせから誘導されたシャトルベクターのようなよく知られた誘導体を含む。
他の真核発現ベクターは、当技術分野で知られている（例えば、ＰＪ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ＆Ｐ．Ｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ， １：３２７－３４１（１９８２）；Ｓｕｂｒａｍａｎｉら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ， １： ８５４－８６４（１９８１）；Ｋａｕｆｉｎａｎｎ＆Ｓｈａｒｐ，「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ Ｍｏｄｕｌａｒ Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ Ｇｅｎｅ，）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ， １５９：６０１－６２１（１９８２）；Ｋａｕｆｈｉａｎｎ＆Ｓｈａｒｐ， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ， １５９：６０１－６６４（１９８２）；Ｓｃａｈｉｌｌら，「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ Ａ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ＤＮＡ Ｇｅｎｅ Ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ Ｃｅｌｌｓ，」 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ， ８０：４６５４－４６５９（１９８３）；Ｕｒｌａｕｂ＆Ｃｈａｓｉｎ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ， ７７：４２１６－４２２０（１９８０）、これらはすべて引用により本明細書に組み込まれる）。
本発明に使用可能な発現ベクターは、発現すべきＤＮＡ配列または断片に作動可能に連結された少なくとも１つの発現制御配列を含有する。制御配列をベクターに挿入し、クローニングされたＤＮＡ配列の発現を制御して調節する。有用な発現制御配列の例として、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージλの主なオペロンとプロモーター領域、ｆｄ外殻タンパク質の制御領域、酵母の解糖プロモーター、例えば３－ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酵母酸性ホスファターゼのプロモーター、例えばＰｈｏ５、酵母α－交配因子のプロモーター、およびポリオーマウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、およびサルウイルス由来のプロモーター、例えばＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ならびに原核細胞または真核細胞およびそれらのウイルスまたはそれらの組み合わせの遺伝子発現を制御することが知られている他の配列がある。
第４の態様によれば、本発明は、第２の態様に記載の核酸または第３の態様に記載の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、およびＰＥＲ．Ｃ６細胞を含むことができるが、これらに限定されない。当業者は、必要に応じて適切な宿主細胞を選択することができる。
第５の態様によれば、本発明は、
（ａ）第４の態様に記載する宿主細胞を培養するステップと、
（ｂ）前記宿主細胞または前記宿主細胞の培養物の上清から前記抗体を回収するステップとを含む第１の態様に記載の抗体の製造方法を提供する。
第６の態様によれば、本発明は、第１の態様に記載の抗体、第２の態様に記載の核酸、第３の態様に記載の発現ベクター、または第４の態様に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
第６の態様の医薬組成物は、製薬分野における常法で所望の剤形に製造することができる。いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、好ましくは液体剤形または懸濁液剤形である。
いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容される担体は、免疫細胞の活力および機能を弱めず、抗体またはその抗原結合断片と抗原との特異的な結合に影響を与えない担体であり、細胞培地、緩衝液、生理食塩水および平衡塩溶液などを含むが、これらに限定されない。緩衝液の例としては、等張リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩などが含まれる。特定の実施形態において、前記薬学的に許容される担体は、１％血清を含むリン酸緩衝液である。
本明細書に開示される抗体およびその医薬組成物は、個体の腫瘍、自己免疫疾患または伝染性疾患の治療、改善または予防に使用することができる。
第７の態様によれば、本発明は、腫瘍、自己免疫疾患または伝染性疾患を治療、改善または予防するための薬物の製造における、第１の態様に記載の抗体、第２の態様に記載の核酸、第３の態様に記載の発現ベクター、または第４の態様に記載の宿主細胞の使用を提供する。
第８の態様によれば、本発明は、第１の態様に記載の抗体、第２の態様に記載の核酸、第３の態様に記載の発現ベクター、または第４の態様に記載の宿主細胞を治療有効量で個体に投与することを含む、個体の腫瘍、自己免疫疾患または伝染性疾患を治療、改善または予防するための方法を提供する。
第９の態様によれば、本発明は、個体の腫瘍、自己免疫疾患または伝染性疾患を治療、改善または予防する使用における、第１の態様に記載の抗体、第２の態様に記載の核酸、第３の態様に記載の発現ベクター、または第４の態様に記載の宿主細胞を提供する。
「治療」は治療的処置を指すだけでなく、予防的または防止的な措置も指し、その目的は目標の病理状態や病症を予防または緩和（軽減）することである。治療を必要とする個体には、前記病症が既に存在している個体、およびその病症に発展しようとしている個体、またはその病症を予防しようとしている個体が含まれる。したがって、本明細書で治療を受けようとする個体は、すでにこの病症に罹患しているか、この病症に罹患する傾向があるか、罹患しやすいと診断されている。
本明細書で使用される用語「個体」は哺乳動物を指し、霊長類、牛、馬、豚、羊、ヤギ、犬、猫、およびラットやマウスのようなげっ歯類を含むが、これらに限定されない。哺乳動物は、非ヒト霊長類またはヒトであることが好ましい。特に好ましい哺乳動物はヒトである。
いくつかの実施形態において、前記腫瘍は原発性癌または転移性癌である。特定の実施形態において、腫瘍は、肺癌、例えば非小細胞肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、造血系癌、例えば白血病、乳癌、胃癌、胃食道接合部腺癌、Ｂリンパ球型非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、頭頸部癌、例えば頭頸部扁平上皮癌、悪性神経膠腫、腎臓癌、黒色腫、前立腺癌、骨癌、骨巨細胞腫、膵臓癌、肉腫、肝臓癌、皮膚扁平上皮癌、甲状腺癌、子宮頸部癌、鼻咽頭癌、子宮内膜癌、または上記腫瘍の転移癌から選ばれる。
いくつかの実施形態において、前記自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、強皮症、全身性血管炎、皮膚筋炎、および自己免疫性溶血性貧血などを含むことができる。
特定の実施形態において、前記伝染性疾患は、呼吸器感染症、消化器感染症、血液感染症、体表感染症、および性感染症などを含む。特定の実施形態において、伝染性疾患は、インフルエンザ、肺結核、おたふくかぜ、麻疹、百日咳、回虫症、細菌性赤痢、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、マラリア、流行性Ｂ型脳炎、フィラリア症、住血吸虫症、トラコーマ、狂犬病、破傷風、淋病、梅毒、エイズなどを含むことができるが、これらに限定されない。
本明細で使用される「治療有効量」は具体的な状況に基づいて決定することができ、当業者は実際に必要な薬量に基づいて容易に把握することができ、例えば患者の体重、年齢および病態状況に基づいて決定することができる。
本明細書および特許請求の範囲において、「含む」、「含み」、および「含有する」という用語は、「含むが、これらに限定されない」ことを意味し、他の部分、添加物、成分、またはステップを除外することを意図していない。
なお、本発明の特定の態様、実施形態、または実施例で説明された特徴、特性、成分、またはステップは、矛盾しない限り、本明細書で説明された他の任意の態様、実施形態、または実施例に適用可能である。
上記の開示内容は、本発明を概して説明しており、以下の実施例によって本発明をさらに例示する。これらの実施例は、本発明を説明するためだけに使用され、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書では特別な用語および値が使用されているが、これらの用語および値も同様に例示的であり、本発明の範囲を限定するものではないと理解される。特に明記されていない限り、本明細書における実験方法および技術は、当該技術分野における常法および技術である。メーカーを特に明記していないその他の材料や設備等については、通常、通常市販品として入手することができるものである。
＜実施例＞
本発明の実施例および比較例において、特に明記されていない限り、使用される原料および試薬はいずれも通常のものであり、市販品として入手することができる。
実施例１～５で使用されるベクターｐＱＫＤ１１０１－ＴＮＦα、ｐＱＫ１１１４－ＩＬ－１７Ａ、ｐＵＣ５７ ＩｇＧ１ ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔとｐＵＣ５７ Ｋａｐｐａ－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ、ｐＵＣ５７ ヒトＰＤ－Ｌ１ ＥＣＤ、ｐＱＫＺＷ１０６Ｈ ＩｇＧ１ ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ、ｐＱＫＺＷ１０６Ｌ Ｋａｐｐａ－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ、Ｔｒｉａｄ５Ｈ、Ｔｒｉａｄ５Ｌ、ｐＵＣ５７ ＰＤ－Ｌ１ ＶＬ－Ｋａｐｐａ－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ、ベクターｐＵＣ５７ ＰＤ－Ｌ１ ＶＨ－ＩｇＧ１ ＣＨ１ Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ、ｐＵＣ５７ ＰＤ－Ｌ１ ＶＬ－Ｋａｐｐａ－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ、ｐＵＣ５７ 抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、すべて、各実施例において増幅テンプレートとして使用される組換えベクターである。
実施例１：抗ＴＮＦα×抗ＩＬ－１７Ａ二重特異性抗体の製造、発現および同定
材料
抗ＴＮＦαモノクローナル抗体であるアダリムマブのＶＨおよびＶＬコード核酸配列、ならびに抗ＩＬ－１７Ａモノクローナル抗体であるセクキヌマブのＶＨおよびＶＬコード核酸配列は、すべてＤＮＡ合成により得られ（通用生物系統（安徽）有限公司）、各コード配列を全合成発現ベクターｐＱＫＤ１１０１（通用生物系統（安徽）有限公司）とｐＱＫ１１１４（通用生物系統（安徽）有限公司）にそれぞれ挿入し、得られた産物をそれぞれｐＱＫＤ１１０１－ＴＮＦαとｐＱＫ１１１４－ＩＬ－１７Ａとした。ＩｇＧ１ ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ（すなわち、Ｃ２２９欠失ＩｇＧ１ヒンジ領域を含む）のコード核酸配列およびＫａｐｐａ－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ（Ｃ２２９欠失突然変異ＩｇＧ１ヒンジ領域を含む）のコード核酸配列も同様にＤＮＡ合成により得られ、それぞれベクターｐＵＣ５７（通用生物系統（安徽）有限公司）にクローニングされ、得られた産物はそれぞれｐＵＣ５７ ＩｇＧ１ ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ（Ｃ２２９欠失突然変異）およびｐＵＣ５７ Ｋａｐｐａ－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ（Ｃ２２９欠失突然変異）とされた。
ＩｇＧ１ ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔおよびＫａｐｐａ－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔのヌクレオチド配列は以下の通りである
Figure 2022553464000001
 １．１ 抗ＴＮＦα×抗ＩＬ－１７Ａ二重特異性抗体の発現ベクターの製造
１．１．１ 二重特異性抗体の重鎖発現ベクターｐＱＫＥ１Ｈの構築
それぞれｐＱＫＤ１１０１－ＴＮＦα、ｐＱＫ１１１４－ＩＬ－１７Ａ、およびｐＵＣ５７ ＩｇＧ１ ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔをテンプレートとし、ゴールドＭｉｘ ＰＣＲキット（ＴＳＩＮＧＫＥ社）を使用し、キットの説明書に従い、抗ＴＮＦα抗体ＶＨ、抗ＩＬ－１７Ａ抗体ＶＨ、およびＩｇＧ１ ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ（Ｃ２２９欠失突然変異）をそれぞれ増幅し、その増幅産物の大きさはそれぞれ約０．４ｋｂ、０．４２ｋｂ、および０．４ｋｂであり、また、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ、Ｒ３１０１Ｓ）とＳａｐＩ（ＮＥＢ、Ｒ０７１２Ｓ）を用いて全合成ベクターｐＱＫＸ１（通用生物系統（安徽）有限公司）を酵素切断し、得られた３種類のＰＣＲ増幅産物（連結順番は５’から３’まで、ＴＮＦα抗体ＶＨ－ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ－抗ＩＬ－１７Ａ抗体ＶＨ）と酵素切断ベクターを、ＢＭシームレスクローニングキット（ＢｉｏＭｅｄ社）を用いて、キットの説明書に従って、組換え連結し、重鎖発現ベクターｐＱＫＥ１Ｈを得た。
ＰＣＲ増幅プライマー対は以下の通りである。
Figure 2022553464000002
 １．１．２ 二重特異性抗体の軽鎖発現ベクターｐＱＫＥ１Ｌの構築
それぞれｐＱＫＤ１１０１－ＴＮＦα、ｐＱＫ１１１４－ＩＬ－１７Ａ、およびｐＵＣ５７ Ｋａｐｐａ－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔをテンプレートとし、ゴールドＭｉｘ ＰＣＲキット（ＴＳＩＮＧＫＥ社）を使用し、キットの説明書に従い、抗ＴＮＦα抗体ＶＬ、抗ＩＬ－１７Ａ抗体ＶＬ、およびＫａｐｐａ－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ（Ｃ２２９欠失突然変異）をそれぞれ増幅し、その増幅産物の大きさはそれぞれ約０．３６ｋｂ、０．３６ｋｂ、および０．４２ｋｂであり、また、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ、Ｒ３１０１Ｓ）とＳａｐＩ（ＮＥＢ、Ｒ０７１２Ｓ）を用いて全合成ベクターｐＱＫＸ２（通用生物系統（安徽）有限公司）を酵素切断し、得られた３種類のＰＣＲ増幅産物（連結順番は５’から３’まで、ＴＮＦα抗体ＶＬ－Ｋａｐｐａ－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ－抗ＩＬ－１７Ａ抗体ＶＬ）と酵素切断ベクターを、ＢＭシームレスクローニングキット（ＢｉｏＭｅｄ社）を用いて、キットの説明書に従って組換え連結し、軽鎖発現ベクターｐＱＫＥ１Ｌを得た。
ＰＣＲ増幅プライマー対は以下の通りである。
Figure 2022553464000003
 １．１．３ 組換えプラスミドの増幅および製造
上記のように得られた重鎖発現ベクターｐＱＫＥ１Ｈおよび軽鎖発現ベクターｐＱＫＥ１Ｌを、それぞれ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０に導入した。モノクローナルを選別して同定した後、アンピシリン（最終濃度１００ｍｇ／Ｌ）を含有するＬＢ培地において、３７℃、２００ｒｐｍの培養条件で１６時間振とう培養した。８０００×ｇで２０分間遠心分離して細菌を収集した。ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍｉｄｉキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－ｎａｇｅｌ）を用い、キットの説明書に従い、プラスミドを分離抽出し、１ｍＬの無菌超純水で溶出させ、最後にＮａｎｏｄｒｏｐ微量分光光度計を用いてプラスミド濃度を測定した。
１．２ 抗体の発現
重鎖発現ベクターｐＱＫＥ１Ｈと軽鎖発現ベクターｐＱＫＥ１Ｌを共にＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションして発現させた。トランスフェクションの２４時間前に１．５×１０6のＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ、番号：ＣＲＬ－１５７３）細胞をＯＰＭ－２９３ ＣＤ０５無血清培地（奥浦邁社、Ｃａｔ：８１０７５－００１）１００ｍＬを含有する５００ｍＬフラスコに接種し、３６．５℃、７．５％ＣＯ2、１２０ｒｐｍの培養条件で懸濁培養した。トランスフェクションに際しては、組換えプラスミドｐＱＫＥ１ＨとｐＱＫＥ１Ｌを重量比１：１（ＤＮＡ総量１００μｇ）でＯＰＭ－２９３ ＣＤ０５培地１０ｍＬに混合した後、ＰＥＩ（濃度３ｍｇ／ｍＬ）１００μＬを加えて、急速に均一にボデックス混合し、室温で１５分間静置してインキュベートした。そして、この混合物を上記細胞培養物に添加した。細胞を、３６．５℃、７．５％ＣＯ2、１２０ｒｐｍ／ｍｉｎの条件で７日間培養を継続し、発現した抗体を取得した。この抗体はプラスミドｐＱＫＥ１ＨとｐＱＫＥ１Ｌで発現された抗ＴＮＦα×抗ＩＬ－１７Ａ二重特異性抗体であり、Ｅ１と命名し、構造を図１のＡに示した。
１．３ 抗体の精製
取得した細胞培養物を３０００×ｇで２０ｍｉｎ遠心分離し、上清を収集し、０．４５μｍフィルターで濾過した。５ｍＬ Ｃａｐｔｏ Ｌアフィニティークロマトカラム（ＧＥ）を２０ｍＭ ＰＢと１５０ｍＭ ＮａＣｌの混合緩衝液（ｐＨ ７．４）を用いて、５ｍＬ／ｍｉｎの流速、５ＣＶより大きい体積で平衡化した。濾過した試料液を５ｍＬ／ｍｉｎの流速で注入した。注入終了後、Ｃａｐｔｏ Ｌアフィニティーカラムを２０ｍＭ ＰＢと１５０ｍＭ ＮａＣｌの混合緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて、５ｍＬ／ｍｉｎの流速で洗浄した。５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を用いて、５ｍＬ／ｍｉｎの流速で溶出し、完全な溶出ピークを収集し、同時に１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ９．０）緩衝液で収集した溶出液のｐＨを約７．０に調整した（図２Ａ）。精製産物を限外ろ過管で限外ろ過し、Ｔｒｉｓ－クエン酸緩衝液を市販のＰＢＳ緩衝液に置換した。得られたタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥとクマシーブリリアントブルー染色で検出し（図２Ｂ）、Ｎａｎｏｄｒｏｐ微量分光光度計を用いてタンパク質濃度を測定して計算したところ、タンパク質の産量は５５ｍｇ／Ｌであった。
１．４ 抗体の同定
１．４．１ ＨＰＬＣによる抗体純度の測定
Ｃａｐｔｏ Ｌにより精製された抗体を、ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＩＩ）ＳＥＣに通して純度を検出した。カラムはＳｅｐａｘ水溶性サイズ排除カラムであり、移動相が５０ｍｍ ＰＢ＋３００ｍｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．０、注入量が１０μｇ、流速が１ｍｌ／ｍｉｎ、アイソクラティック溶出時間が２０ｍｉｎであった。図３に示す結果から、モノマー純度は≧９０％であった。
１．４．２ Ｆｏｒｔｅｂｉｏによる抗体親和性の測定
精製した抗体について、分子相互作用計Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＱＫ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて親和性定数ＫDを測定した。Ｆａｂ－Ｃｈ１のセンサ（ｓｅｎｓｏｒ）によりＥ１抗体および対照抗体であるアダリムマブ（ＡｂｂＶｉｅ）とセクキヌマブ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を、いずれも体積２００μＬ、濃度０．２５μＭで固定化した。抗原ヒトＴＮＦ－α（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、Ｃａｔ：１０６０２－Ｈ０１Ｈ）とヒトＩＬ－１７Ａ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、Ｃａｔ：１２０４７－Ｈ０７Ｙ）を、それぞれ濃度６００ｎＭ、３００ｎＭ、１５０ｎＭ、および７５ｎＭ、総容積２００μＬで注入した。結合－解離曲線を図４に、親和性定数の測定結果を図６に示した。
実施例２：抗ＣＤ１３７×ＰＤ－１ ＥＣＤタンパク質二重特異性抗体の製造、発現および同定
２．１ 抗ＣＤ１３７×ＰＤ－１ ＥＣＤタンパク質二重特異性抗体の発現ベクターの製造
発現ベクターの構築およびプラスミドの増幅の具体的な操作手順は実施例１を参照し、ここで、ＰＤ－１ ＥＣＤタンパク質の場合、その増幅テンプレートはｐＵＣ５７ ヒトＰＤ－１ ＥＣＤであり、ベクターｐＵＣ５７に挿入された合成ヒトＰＤ－１細胞外領域核酸配列を含有する（ヒトＰＤ－１細胞外領域核酸配列はＮＣＢＩデータベースＮＰ＿００５００９．２および参考文献Ｅｓｚｔｅｒ Ｌａｚａｒ－Ｍｏｌｎａｒ ｅｔａｌ．， “Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｇｕｉｄｅｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ－１： Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ”， ＥｂｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ １７（２０１７）３０－４４を参照）（通用生物系統（安徽）有限公司）。全合成ベクターｐＱＫＺＷ１０６Ｈ ＩｇＧ１ ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ（通用生物系統（安徽）有限公司）は抗ＣＤ１３７抗体重鎖のＶＨ部分（配列は特許番号：ＵＳ－２０１９－０２８４２９２－Ａ１を参照）およびＩｇＧ１ ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ（ヒンジ領域Ｃ２２９欠失突然変異）を含有し、このベクターに対してＥｃｏＲＩ酵素切断を行い、回収後に上記のｐＵＣ５７ヒトＰＤ－１ ＥＣＤのＰＣＲ産物と組換え酵素結合（連結順番は５’から３’まで、ＣＤ１３７抗体ＶＨ－ＣＨ１Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ－ＰＤ－１ ＥＣＤ）を行い、最終的な重鎖発現ベクターを取得し、ｐＱＫＥ２Ｈと命名し、同様に、全合成ベクターｐＱＫＺＷ１０６Ｌ Ｋａｐｐａ－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ（通用生物系統（安徽）有限公司）は、抗ＣＤ１３７抗体軽鎖のＶＬ部分（配列は特許番号ＵＳ－２０１９－０２８４２９２－Ａ１参照）およびＫａｐｐａ－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ（ヒンジ領域Ｃ２２９欠失突然変異）を含有し、このベクターに対しても、ＥｃｏＲＩ酵素で切断し、回収後に上記ｐＵＣ５７ヒトＰＤ－１ ＥＣＤのＰＣＲ産物と組換え酵素結合（連結順番５’から３’まで、ＣＤ１３７抗体ＶＬ－Ｋａｐｐａ－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ－ＰＤ－１ ＥＣＤを行い、最終的な軽鎖発現ベクターを取得し、ｐＱＫＥ２Ｌと命名した。
使用されるプライマー対は以下の通りである。
Figure 2022553464000004
 ２．２ 抗体の発現
トランスフェクション細胞をＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ、番号：ＣＲＬ－１５７３）、トランスフェクション体積を１００ｍＬとして、実施例１に記載の手順を参照してトランスフェクションを行った。トランスフェクション後の細胞を５００ｍＬフラスコに、３６．５℃、７．５％ＣＯ2、１２０ｒｐｍ／ｍｉｎの培養条件で、７日間懸濁培養して、抗体を取得した。得られた抗体は、プラスミドｐＱＫＥ２ＨおよびｐＱＫＥ２Ｌで発現された抗ＣＤ１３７×ＰＤ－１ ＥＣＤタンパク質二重特異性抗体であり、Ｅ２と命名し、構造を図１のＢに示した。
２．３ 抗体の精製
実施例１に記載の手順を参照して精製を行い、緩衝液置換後にＮａｎｏｄｒｏｐ微量分光光度計を用いてタンパク質濃度を測定して計算したところ、タンパク質の産量は３５ｍｇ／Ｌであった。
２．４ 抗体の同定
２．４．１ ＨＰＬＣによる抗体純度の測定
実施例１を参照して、抗体Ｅ２の純度をＨＰＬＣで測定したところ、モノマー純度は≧９０％であった。
２．４．２ Ｆｏｒｔｅｂｉｏによる抗体親和性の測定
具体的な手順は実施例１を参照した。Ｆａｂ－Ｃｈ１のセンサによりＥ２抗体を、０．２５μＭの濃度で固定化した。抗原ヒトＰＤ－Ｌ１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、Ｃａｔ：１００８４－ＨＮＡＨ）とヒトＣＤ１３７（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、Ｃａｔ：１００４１－Ｈ００２Ｈ）を、それぞれ濃度６００ｎＭ、３００ｎＭ、１５０ｎＭ、および７５ｎＭ、総体積２００μＬで注入した。親和性定数の測定結果を図６に示した。
２．４．３ フローサイトメトリーによる、細胞に対する抗体の結合活性の検出
２．４．３．１ ＭＣ３８－ＰＤ－Ｌ１細胞に対する抗体の結合活性
正常に蘇生したＭＣ３８細胞（協和細胞資源センター、資源番号：３１１１Ｃ０００１ＣＣＣ０００５２３）を、少なくとも３世代以上継代培養し、トランスフェクションの２４ｈ前に細胞を継代し、６ウェルプレートに接種した。トランスフェクション当日にＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ：７６４６４７）と合成プラスミドｐＥＮＴＥＲ ＰＤ－Ｌ１（通用生物系統（安徽）有限公司）を室温まで蘇生し、プラスミド５μｇをＤＭＥＭ培地（ｇｉｂｃｏ、ＲＥＦ：１１９６５－０９２）５００μＬに加え、さらにＰＥＩ １５μｇを加えた直後、１５ｍｉｎボルテックス振とうさせ、その後、混合物を細胞培養液に軽く滴下し、インキュベータに入れて２４～４８ｈ培養を続けた。４８ｈ後に２μｇ／ｍＬのプリンマイシン１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地に交換した。３日後に細胞の大規模な死亡が現れて、フラスコの壁を軽く叩いて、上清を捨て、壁へ良好に接着した細胞は安定的にトランスフェクト可能な細胞株である。８～１０日後に細胞の成長状態に応じて、細胞を消化して９６ウェルプレートに敷き、モノクローナル細胞株をスクリーニングした。この間、２μｇ／ｍＬのプリンマイシン１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地で加圧培養した。最終的に得られた細胞株をＭＣ３８－ＰＤ－Ｌ１と命名した。この細胞株は、ゲノムにヒトＰＤ－Ｌ１細胞外領域遺伝子が導入されており、ヒトＰＤ－Ｌ１細胞外領域タンパク質を安定に発現させ、細胞膜上に提示することができる。蘇生し３世代以上培養したＭＣ－３８－ＰＤ－Ｌ１細胞をＰＢＳ １０ｍＬで１回洗浄し、０．０５％パンクレアチン１ｍＬで１ｍｉｎ消化し、１０％ＦＢＳを含有する１６４０培地４ｍＬを加え、均一にピペッティングした後、細胞を収集し、１０００ｒｐｍ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、重懸濁させてカウントし、細胞密度を１×１０5個細胞／ｍＬに調整した。群別は空白群、陽性対照群、二次抗体群、Ｅ２群とし、まず、各群のチューブに上記細胞懸濁液１０μＬを加えた。Ｅ２群のチューブにＥ２ ＢｓＡｂを１００ｎｇ加え、室温で３０ｍｉｎインキュベートし、４％ＦＢＳを含有するＰＢＳ緩衝液３ｍＬで洗浄し、１０００ｒｐｍ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心し、４％ＦＢＳを含有するＰＢＳ緩衝液５０μＬで重懸濁させ、空白群には水０．５μＬを加え、陽性対照群にはＰＥ抗ヒトＰＤ－Ｌ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン番号：２９Ｅ－２Ａ３）０．５μＬを加え、Ｅ２群と二次抗体群にはそれぞれＡＰＣ抗ヒトＩｇ軽鎖Ｋ ０．５μＬ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン番号：ＴＢ２８－２）を加えた。均一に混ぜて室温、遮光下、３０ｍｉｎインキュベートした。培養完了後、４％ＦＢＳを含有するＰＢＳ緩衝液で各群のチューブを洗浄し、１０００ｒｐｍ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、４％ＦＢＳを含有するＰＢＳ緩衝液１００μＬで重懸濁させ、フローサイトメーター（ＡＣＥＡ社、機器型番：ＮｏｖｏＣｙｔｅ）に注入して検出した。結果を図５のＡに示した。
２．４．３．２ ＭＣ３８－ＣＤ１３７細胞に対する抗体の結合活性
ＭＣ３８－ＣＤ１３７細胞は、ＭＣ３８細胞（協和細胞資源センター、資源番号：３１１１Ｃ０００１ＣＣＣ０００５２３）のゲノムにヒトＣＤ１３７を安定トランスフェクションにより組み込んだ細胞株であり、細胞膜上にヒトＣＤ１３７タンパク質を提示して発現させることを特徴とする。この細胞株の構築は２．４．３．１におけるＭＣ３８－ＰＤ－Ｌ１の構築手順を参照し、プラスミドはｐＥＮＴＥＲ ＣＤ１３７（通用生物系統（安徽）有限公司）である。細胞の具体的な実験手順は３．４．３．１を参照し、群別は空白群、陽性対照群、二次抗体群、およびＥ２群とした。そのうち、陽性対照群はＡＰＣ抗ヒト４－１ＢＢ ０．５μＬを加え、二次抗体群はＡＰＣ抗ヒトＩｇ軽鎖Ｋ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン番号：ＴＢ２８－２）を０．５μＬ加え、Ｅ２群はまずＥ２ ＢｓＡｂ １００ｎｇを加えて室温で３０ｍｉｎインキュベートし、洗浄した後にＡＰＣ抗ヒトＩｇ軽鎖Ｋ ０．５μＬを加えた。すべての試料をインキュベートしてから洗浄し、４％ＦＢＳを含有するＰＢＳ緩衝液１００μＬで重懸濁させ、フローサイトメーターに注入して検出した。結果を図５のＢに示した。
実施例３：抗ＣＤ３×抗ＣＤ１９二重特異性抗体の製造、発現および同定
３．１ 抗ＣＤ３×抗ＣＤ１９二重特異性抗体の発現ベクターの製造
発現ベクターの構築およびプラスミドの増幅の具体的な操作手順は実施例１を参照し、ここで、重鎖増幅テンプレートはＴｒｉａｄ５ＨとｐＵＣ５７ ＩｇＧ１ ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔである。Ｔｒｉａｄ５Ｈは、ＤＮＡにより合成されたＢｌｉｎｃｙｔｏ（Ａｍｇｅｎ）の抗ＣＤ１９ ＶＨコード核酸配列、Ｐａｓｏｔｕｘｉｚｕｍａｂ（Ｂａｙｅｒ）の抗ＣＤ３モノクローナル抗体のＶＨコード核酸配列（通用生物系統（安徽）有限公司）を含有する前期全合成プラスミドである。Ｔｒｉａｄ５Ｈをテンプレートとして抗ＣＤ１９ ＶＨ断片と抗ＣＤ３ ＶＨ断片を増幅し、ｐＵＣ５７ ＩｇＧ１ ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔをテンプレートとしてＩｇＧ１ ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ（Ｃ２２９欠失突然変異）断片を増幅し、全合成ベクターｐＱＫＸ１（通用生物系統（安徽）有限公司）に対してＳａｐＩとＥｃｏＲＩの二重酵素切断を行い、対応するＰＣＲ産物と酵素切断産物を回収し、組換え酵素結合（連結順番は５’から３’まで、抗ＣＤ１９抗体ＶＨ－ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ－抗ＣＤ３抗体ＶＨ）を行い、最終的な組換えプラスミドを取得し、ｐＱＫＥ３Ｈと命名した。軽鎖増幅テンプレートはＴｒｉａｄ５ＬとｐＵＣ５７ Ｋａｐｐａ－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔである。Ｔｒｉａｄ５Ｌは、ＤＮＡにより合成されたＢｉＴＥ二重抗体の抗ＣＤ１９ ＶＬコード核酸配列、Ｐａｓｏｔｕｘｉｚｕｍａｂ（Ｂａｙｅｒ）の抗ＣＤ３モノクローナル抗体のＶＬコード核酸配列（通用生物系統（安徽）有限公司）を含有する前期全合成プラスミドである。Ｔｒｉａｄ５Ｌをテンプレートとして抗ＣＤ１９ ＶＬ断片と抗ＣＤ３ ＶＬ断片を増幅し、ｐＵＣ５７ Ｋａｐｐａ－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔをテンプレートとしてＫａｐｐａ－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ（Ｃ２２９欠失突然変異）断片を増幅し、全合成ベクターｐＱＫＸ２に対してＳａｐＩとＥｃｏＲＩの二重酵素切断を行い、対応するＰＣＲ産物と酵素切断産物を回収し、組換え酵素結合（連結順番は、５’から３’まで、抗ＣＤ１９抗体ＶＬ－Ｋａｐｐａ－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ－抗ＣＤ３抗体ＶＬ）を行い、最終的な組換えプラスミドを取得し、ｐＱＫＥ３Ｌと命名した。
使用されるプライマー対は以下の通りである。
Figure 2022553464000005
Figure 2022553464000006
 ３．２ 抗体の発現
トランスフェクション細胞をＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ、番号：ＣＲＬ－１５７３）であり、トランスフェクション体積を１００ｍＬとして、実施例１に記載の手順を参照してトランスフェクションを行った。トランスフェクション後の細胞を５００ｍＬフラスコに、３６．５℃、７．５％ＣＯ2、１２０ｒｐｍ／ｍｉｎの培養条件で７日間懸濁培養して、抗体を取得した。得られた抗体は、プラスミドｐＱＫＥ３ＨとｐＱＫＥ３Ｌで発現された抗ＣＤ３×抗ＣＤ１９二重特異抗体であり、Ｅ３と命名し、構造を図１のＣに示した。
３．３ 抗体の精製
実施例１に記載の手順を参照して精製を行い、緩衝液置換後にＮａｎｏｄｒｏｐ微量分光光度計を用いてタンパク質濃度を測定して計算したところ、タンパク質の産量は５９ｍｇ／Ｌであった。
３．４ 抗体の同定
３．４．１ ＨＰＬＣによる抗体純度の測定
実施例１を参照して、抗体Ｅ３の純度をＨＰＬＣで測定したところ、モノマー純度は≧９０％であった。
３．４．２ Ｆｏｒｔｅｂｉｏによる抗体親和性の測定
具体的な手順は実施例１を参照した。Ｅ３抗体をＦａｂ－Ｃｈ１のセンサにより０．２５μＭの濃度で固定化した。抗原ヒトＣＤ３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、Ｃａｔ：１０９７７－Ｈ０２Ｈ）とヒトＣＤ１９（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、Ｃａｔ：１１８８０－Ｈ０２Ｈ）を、それぞれ濃度６００ｎＭ、３００ｎＭ、１５０ｎＭ、および７５ｎＭで注入し、体積はいずれも２００μＬであった。親和性定数の測定結果を図６に示した。
実施例４：抗ＰＤ－Ｌ１×抗ＣＤ１３７二重特異性抗体の製造、発現および同定
４．１ 抗ＰＤ－Ｌ１×抗ＣＤ１３７二重特異性抗体の発現ベクターの製造
発現ベクターの構築およびプラスミドの増幅の具体的な操作手順は実施例１を参照し、合成ベクターｐＵＣ５７ ＰＤ－Ｌ１ ＶＨ－ＩｇＧ１ ＣＨ１ Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ（それは、ＤＮＡにより合成されたアテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、Ｒｏｃｈｅ社）の抗ＰＤ－Ｌ１ ＶＨコード核酸配列、およびＩｇＧ１ ＣＨ１ Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ（Ｃ２２９欠失突然変異、且つヒンジ領域Ｄ２２４－Ｓ２４２逆転）のコード核酸配列（通用生物系統（安徽）有限公司）を含み）、およびベクターｐＱＫＺＷ１０６Ｈ ＩｇＧ１ ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ（通用生物系統（安徽）有限公司）を用い、抗ＰＤ－Ｌ１ ＶＨ－ＩｇＧ１ ＣＨ１ Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔおよび抗ＣＤ１３７ ＶＨ断片をそれぞれ増幅し、ｐＱＫＸ１ベクター（通用生物系統（安徽）有限公司）に対してＳａｐＩとＥｃｏＲＩの二重酵素切断を行い、対応するＰＣＲ産物と酵素切断産物を回収し、組換え酵素結合（連結順番は５’から３’まで、抗ＰＤ－Ｌ１抗体ＶＨ－ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ－抗ＣＤ１３７抗体ＶＨ）を行い、最終的な組換えプラスミドを取得し、ｐＱＫＥ４Ｈと命名した。ベクターｐＵＣ５７ ＰＤ－Ｌ１ ＶＬ－Ｋａｐｐａ－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ（それは、ＤＮＡにより合成されたアテゾリズマブの抗ＰＤ－Ｌ１ ＶＬコード核酸配列、およびＫａｐｐａ－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ（Ｃ２２９欠失突然変異、且つヒンジ領域Ｄ２２４－Ｓ２４２逆転）のコード核酸配列（通用生物系統（安徽）有限公司）を含み）、およびベクターｐＱＫＺＷ１０６Ｌ Ｋａｐｐａ－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔを用い、抗ＰＤ－Ｌ１ ＶＬ－Ｋａｐｐａ－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔとａｎｔｉ－ＣＤ１３７ ＶＬ断片をそれぞれ増幅した。ｐＱＫＸ２ベクター（通用生物系統（安徽）有限公司）に対してＳａｐＩとＥｃｏＲＩの二重酵素切断を行い、対応するＰＣＲ産物と酵素切断産物を回収し、組換え酵素結合（連結順番：５’から３’まで、抗ＰＤ－Ｌ１抗体ＶＬ－Ｋａｐｐａ－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ－抗ＣＤ１３７抗体ＶＬ）を行い、最終的な組換えプラスミドを取得し、ｐＱＫＥ４Ｌと命名した。
ＩｇＧ１ ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔとＫａｐｐａ－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔは以下の通りである。
Figure 2022553464000007
 使用されるプライマー対は以下の通りである。
Figure 2022553464000008
Figure 2022553464000009
 ４．２ 抗体の発現
トランスフェクション細胞をＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ、番号：ＣＲＬ－１５７３）、トランスフェクション体積を１００ｍＬとして、実施例１に記載の手順を参照してトランスフェクションを行った。トランスフェクション後の細胞を、５００ｍＬフラスコに、３６．５℃、７．５％ＣＯ2、１２０ｒｐｍ／ｍｉｎの培養条件で７日間懸濁培養して、抗体を取得した。得られた抗体は、プラスミドｐＱＫＥ４ＨおよびｐＱＫＥ４Ｌで発現された抗ＰＤ－Ｌ１×抗ＣＤ１３７二重特異性抗体であり、Ｅ４と命名し、構造を図１のＤに示した。
４．３ 抗体の精製
実施例１に記載の手順を参照して精製を行い、緩衝液置換後にＮａｎｏｄｒｏｐ微量分光光度計を用いてタンパク質濃度を測定して計算したところ、タンパク質の産量は３８ｍｇ／Ｌであった。
４．４ 抗体の同定
４．４．１ ＨＰＬＣによる抗体純度の測定
実施例１を参照して、抗体Ｅ４の純度をＨＰＬＣで測定したところ、モノマー純度は≧９０％であった。
４．４．２ Ｆｏｒｔｅｂｉｏによる抗体親和性の測定
具体的な手順は実施例１を参照した。Ｅ４抗体をＦａｂ－Ｃｈ１のセンサにより０．２５μＭの濃度で固定化した。抗原ヒトＰＤ－Ｌ１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、Ｃａｔ：１００８４－ＨＮＡＨ）とヒトＣＤ１３７（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、Ｃａｔ：１００４１－Ｈ００２Ｈ）を、それぞれ濃度６００ｎＭ、３００ｎＭ、１５０ｎＭ、および７５ｎＭ、総体積２００μＬで注入した。親和性定数の測定結果を図６に示した。
実施例５：抗ＣＤ３×抗ＣＤ１３７×ＰＤ－１ ＥＣＤタンパク質三重特異性抗体の製造、発現および同定
５．１ 抗ＣＤ３×抗ＣＤ１３７×ＰＤ－１ ＥＣＤタンパク質三重特異性抗体の発現ベクターの製造
発現ベクターの構築およびプラスミドの増幅の具体的な操作手順は実施例１を参照した。実施例２におけるｐＱＫＥ２Ｈを重鎖発現ベクターとし、ｐＵＣ５７抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Ｐａｓｏｔｕｘｉｚｕｍａｂ、Ｂａｙｅｒ）のＶＨ－ＶＬコード核酸配列を含有し、ＤＮＡ合成によって得られ（通用生物系統（安徽）有限公司）、コード配列は発現ベクターｐＵＣ５７に挿入され）、および実施例２のｐＱＫＥ２Ｌをテンプレートとして、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ断片と抗ＣＤ１３７ ＶＬ－ＰＤ－１ ＥＣＤ断片をそれぞれＰＣＲにより増幅し、同時にｐＱＫＸ２ベクター（通用生物系統（安徽）有限公司）に対してＳａｐＩとＥｃｏＲＩの二重酵素切断を行い、２種類のＰＣＲ産物と酵素切断産物を回収し、組換え酵素結合（連結順番は、５’から３’まで、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－抗ＣＤ１３７ＶＬ－Ｋａｐｐａ－Ｈｉｎｇｅ ｍｕｔ－ＰＤ－１ ＥＣＤ）を行い、最終的な組換えプラスミドを取得し、ｐＱＫＥ５Ｌと命名した。
使用されるプライマー対は以下の通りである。
Figure 2022553464000010
 ５．２ 抗体の発現
トランスフェクション細胞をＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ、番号：ＣＲＬ－１５７３）、トランスフェクション体積を１００ｍＬとして、実施例１に記載の手順を参照してトランスフェクションを行った。トランスフェクション後の細胞を、５００ｍＬフラスコに、３６．５℃、７．５％ＣＯ2、１２０ｒｐｍ／ｍｉｎの培養条件で７日間懸濁培養して、抗体を取得した。得られた抗体は、プラスミドｐＱＫＥ５ＨおよびｐＱＫＥ５Ｌで発現された抗ＣＤ３×抗ＣＤ１３７×ＰＤ－１ ＥＣＤタンパク質三重特異性抗体であり、Ｅ５と命名し、構造を図１のＥに示した。
５．３ 抗体の精製
実施例１に記載の手順を参照して精製を行い、緩衝液置換後にＮａｎｏｄｒｏｐ微量分光光度計を用いてタンパク質濃度を測定して計算したところ、タンパク質の産量は１１ｍｇ／Ｌであった。
５．４ 抗体の同定
５．４．１ ＨＰＬＣによる抗体純度の測定
実施例１を参照して、抗体Ｅ５の純度をＨＰＬＣで測定したところ、モノマー純度は≧９０％であった。
５．４．２ Ｆｏｒｔｅｂｉｏによる抗体親和性の測定
具体的な手順は実施例１を参照した。Ｅ５抗体をＦａｂ－Ｃｈ１のセンサにより０．２５μＭの濃度で固定化した。抗原ヒトＣＤ３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、Ｃａｔ：１０９７７－Ｈ０２Ｈ）、ヒトＣＤ１３７（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、Ｃａｔ：１００４１－Ｈ００２Ｈ）、およびヒトＰＤ－Ｌ１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、Ｃａｔ：１００８４－ＨＮＡＨ）を、それぞれ濃度６００ｎＭ、３００ｎＭ、１５０ｎＭ、および７５ｎＭ、総体積２００μＬで注入した。親和性定数の測定結果を図６に示した。
本発明の技術案は、一般的な説明および特定の実施形態を用いて上記で詳細に説明されたが、これらの技術案に基づいて、何らかの修正または改良を行うことができ、これは当業者には自明である。したがって、本発明の趣旨から逸脱することなく行われたこれらの修正または改良は、すべての本発明の保護範囲に属する。

Claims (16)

  1. （ａ）第１の抗原に特異的に結合することができるＦａｂ断片であって、１本の軽鎖および１本の重鎖のＣＨ１および可変領域からなるＦａｂ断片と、
    （ｂ）Ｎ末端が前記重鎖と融合する第１のペプチドリンカーと、
    （ｃ）Ｎ末端が前記軽鎖と融合する第２のペプチドリンカーとを含む抗体であって、
    前記第１のペプチドリンカーと前記第２のペプチドリンカーとの間には、１つのジスルフィド結合のみが形成でき、前記第１のペプチドリンカーと前記第２のペプチドリンカーは、それぞれ独立して、Ｓｅｑ ＩＤ ＮＯ．１～２で示される配列（そのうち、Ｘは、Ｃｙｓを除く任意のアミノ酸を表す、または欠失している）のいずれかを含むペプチドリンカーからなる群より選れ、任意選択的に、前記第１のペプチドリンカーおよび／または前記第２のペプチドリンカーは、１つのシステインのみを保持する欠失突然変異を施すことができる天然抗体のヒンジ領域であり、任意選択的に、前記第１のペプチドリンカーおよび／または第２のペプチドリンカーは、Ｃ２２９欠失突然変異のＩｇＧ１ヒンジ領域である、抗体。
  2. 前記第１のペプチドリンカーのＣ－末端と融合する第１の結合部分をさらに含み、任意選択的に、前記第２のペプチドリンカーのＣ－末端と融合する第２の結合部分をさらに含む、請求項１に記載の抗体。
  3. 前記Ｆａｂ断片の軽鎖または重鎖のＮ末端に結合する第３の結合部分をさらに含み、好ましくは、前記第３の結合部分は、前記Ｆａｂ断片の軽鎖のＮ末端に結合する、請求項２に記載の抗体。
  4. 前記第１の結合部分は、第２の抗原に特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片、リガンドおよび受容体からなる群より選れ、任意選択的に、前記第２の結合部分は、第３の抗原に特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片、リガンドおよび受容体からなる群より選れ、任意選択的に、前記第３の結合部分は、第４の抗原に特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片、リガンドおよび受容体からなる群より選れ、任意選択的に、前記抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、およびｓｃ－Ｆｖのような一本鎖抗体分子からなる群より選れ、任意選択的に、前記第１のペプチドリンカーおよび第２のペプチドリンカーは同一または異なっており、任意選択的に、前記第１の結合部分、前記第２の結合部分および前記第３の結合部分は同一または異なっている、請求項２または３に記載の抗体。
  5. 前記第１の結合部分は、前記第２の抗原に特異的に結合することができる抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）であり、前記第２の結合部分は、前記第２の抗原に特異的に結合することができる抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である、請求項４に記載の抗体。
  6. 前記第３の結合部分は、ｓｃ－Ｆｖのような一本鎖抗体分子である、請求項４または５に記載の抗体。
  7. 二重特異性または多重特異性であり、任意選択的に、前記抗体は２価または多価であり、任意選択的に、前記第１の抗原、第２の抗原、第３の抗原および第４の抗原は、独立してＴＮＦα、ＩＬ１７、ＣＤ１３７、ＣＤ３、ＣＤ１９およびＰＤ－Ｌ１からなる群より選れ、任意選択的に、前記リガンドは、ＰＤ－Ｌ１、ＥｐｈｒｉｎＡ１、ＶＥＧＦおよびＥＧＦからなる群より選れ、任意選択的に、前記受容体は、対応してＰＤ－１、ＥｐｈＡ２、ＶＥＧＦＲ１およびＥＧＦＲから選ばれる、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体。
  8. 請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体をコードする核酸。
  9. 請求項８に記載の核酸を含む発現ベクター。
  10. 請求項８に記載の核酸または請求項９に記載の発現ベクターを含む宿主細胞であって、任意選択的に、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、およびＰＥＲ．Ｃ６細胞からなる群より選ばれる哺乳動物細胞である、宿主細胞。
  11. 請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体の製造方法であって、
    請求項１０に記載の宿主細胞を培養するステップ（ａ）と、
    前記宿主細胞または前記宿主細胞の培養物の上清から前記抗体を回収するステップ（ｂ）とを含む、抗体の製造方法。
  12. 請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体、請求項８に記載の核酸、請求項９に記載の発現ベクターまたは請求項１０に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  13. 個体の腫瘍、自己免疫疾患または伝染性疾患を治療、改善または予防するための薬物の製造における、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体、請求項８に記載の核酸、請求項９に記載の発現ベクターまたは請求項１０に記載の宿主細胞の使用。
  14. 個体の腫瘍、自己免疫疾患または感染性疾患を治療、改善または予防するための方法であって、個体に請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体、請求項８に記載の核酸、請求項９に記載の発現ベクター、または請求項１０に記載の宿主細胞を投与することを含む、方法。
  15. 個体の腫瘍、自己免疫疾患または伝染性疾患を治療、改善または予防するための使用における、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体、請求項８に記載の核酸、請求項９に記載の発現ベクターまたは請求項１０に記載の宿主細胞。
  16. 前記腫瘍は、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、白血病、乳癌、胃癌、胃食道接合部腺癌、Ｂリンパ球型非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、頭頸部癌、悪性神経膠腫、腎臓癌、黒色腫、前立腺癌、骨癌、膵臓癌、肉腫、肝臓癌、皮膚扁平上皮癌、子宮頸癌、鼻咽頭癌、子宮内膜癌、または上記の腫瘍の転移癌からなる群より選れ、任意選択的に、前記自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、全身性血管炎、および自己免疫性溶血性貧血からなる群より選れ、任意選択的に、前記伝染性疾患は、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、狂犬病、梅毒、エイズからなる群より選れ、任意選択的に、前記個体は哺乳動物であり、好ましくは、前記哺乳動物はヒトである、請求項１３に記載の使用、或いは請求項１４に記載の方法、或いは請求項１５に記載の使用における請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体、請求項８に記載の核酸、請求項９に記載の発現ベクターまたは請求項１０に記載の宿主細胞。
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