CN114651009A - 针对铜绿假单胞菌OprF蛋白的抗体、其作为药物的用途和含有该抗体的药物组合物 - Google Patents
针对铜绿假单胞菌OprF蛋白的抗体、其作为药物的用途和含有该抗体的药物组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及针对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)OprF蛋白的单克隆抗体或该抗体的功能片段。该抗体或抗体片段特别可用于对铜绿假单胞菌感染的预防性或治愈性治疗。
Description
本发明涉及治疗细菌感染，特别是例如由铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)物种的细菌引起的那些的感染的领域。
更具体地，本发明涉及针对铜绿假单胞菌的OprF蛋白的单克隆抗体或该抗体的功能片段。本发明还涉及编码这种抗体或抗体片段的核酸分子、包含这种核酸分子的表达载体和包含这种核酸分子或这种表达载体的宿主细胞。本发明还涉及用于制备根据本发明的抗体或抗体片段的方法，以及该抗体或抗体片段作为药物，特别是用于预防性或治愈性治疗铜绿假单胞菌感染的用途。本发明还涉及含有这种抗体或抗体片段的药物组合物。本发明还涉及根据本发明的抗体或抗体片段用于检测从个体获得的体液中的铜绿假单胞菌细菌的用途，以及用于这种检测的试剂盒，其含有这种抗体或抗体片段。
医院获得性感染的预防和治疗是在医院部门中的主要关注点。这些感染的发生率正在稳步提高，特别是因为导致这些感染的病原体对抗生素的抗性越来越强。
在医院环境中，铜绿假单胞菌细菌尤其是医院获得性感染以及肺炎的主要原因之一。据估计，铜绿假单胞菌导致10％的医院获得性疾病。受这种病原体影响的人数非常多，而且免疫防御受损的人的相关死亡率很高。铜绿假单胞菌是机会性细菌，其尤其参与了在人工通气下的患者和患有囊性纤维化患者的急性和慢性感染，并且其导致免疫低下患者(包括移植患者和严重烧伤患者)中的败血症。
导致医院获得性感染的铜绿假单胞菌菌株的特征在于对广泛多种抗生素和常规抗生素治疗具有内在抗性。由于这种抗生素抗性及其在患者肺部形成生物膜的能力，这种细菌很难被消除。
然而，尽管这种病原体广泛传播和抗生素抗性菌株的数量不断增加，但迄今为止，制药行业针对铜绿假单胞菌感染还未有任何有效的治疗。
现有技术已经设想了不同的治疗方法来开发这种治疗。
由于最近对细菌毒力机制的研究(Chevalier et al.，2017，FEMS，41：698-722)，已在铜绿假单胞菌中鉴定出一定数量的免疫原性蛋白。这些研究表明，这些免疫原主要位于某些结构区室中，例如鞭毛、菌毛、脂多糖、外膜蛋白，或形成分泌产物的一部分，例如黏液胞外多糖、外毒素A和蛋白酶。在外膜蛋白中，孔蛋白OprF和OprI一直是实证研究的对象(Chevalier et al.，2017，FEMS，41：698-722)。已经通过融合产生了含有这些蛋白质的已知表位的杂合蛋白质，并在动物模型中进行了测试(Weimer et al.，2009，Infect.Immun.，77(6)：2356-2366)。
现有技术设想的另一种治疗方法是基于靶向所有铜绿假单胞菌菌株中保守的分子靶标的抗体的用途。因此，目前正在研究三种抗体：靶向III型分泌系统的抗PcrV(Shionogi et al.，2016，Hum Vaccin Immunother.12(11)：2833-2846)，使得可以杀伤细菌并募集先天免疫系统效应物的抗LPS抗体，以及靶向PcrV和PsI方法的双特异性抗体。
然而，虽然目前正在开发和测试数种治疗方法，但仍必须出现用于治疗铜绿假单胞菌感染的新解决方案，以解决铜绿假单胞菌感染所代表的重要公共卫生问题。
因此，本发明的目的是提供使得其可以有效地对抗细菌感染，特别是铜绿假单胞菌感染的治疗剂，其解决了与铜绿假单胞菌抗生素抗性相关的问题以及与缺乏针对这种导致医院获得性感染和作为患有囊性纤维化患者死亡的主要原因的传染源的有效治疗相关的问题。
为此，本发明人寻求开发新型抗感染抗体类型的活性剂，并为此，本发明人更具体地专注于作为分子靶标的膜蛋白OprF，其也称为孔蛋白OprF。OprF蛋白是具有大直径传导孔的高度丰富的38kDa蛋白，其参与多种不同的功能，并且在所有铜绿假单胞菌菌株中高度保守(Genbank登录号：AFM37279.1)。如现有技术所述，OprF蛋白在铜绿假单胞菌毒力中的重要作用使其成为抗感染治疗的潜在靶标。
现有技术已经提出了靶向铜绿假单胞菌的OprF蛋白的抗体，特别是通过文件WO2016/033547，Moon et al.，Investigative Ophthalmology & Visual Science，1988，29：1277-1284以及Rawling et al.，1995，Infection and Immunity，63：38-42所举例说明的。然而，这些抗体是通过接种可溶性OprF蛋白片段或使用去污剂溶解的完整OprF蛋白(即以与细菌膜中采用的蛋白质的天然构象不对应的形式)获得的。因此，这些抗体不能识别细菌中蛋白质自然暴露的构象表位。
本发明人发现，靶向OprF膜抗原的特异性抗体或这些抗体的一部分，具有对于OprF蛋白的所有其天然线性和构象表位特别高的生物中和活性，因此针对由于铜绿假单胞菌引起的细菌感染有很好的治疗效力。
为了产生与铜绿假单胞菌的OprF蛋白特异性结合的抗体，本发明人开发了创新方法，其导致发现对以其天然膜形式的该蛋白质具有特别强亲和力的抗体。
示意性地，这种方法由以下组成：从含有铜绿假单胞菌OprF蛋白的蛋白脂质体从灵长类动物中产生的免疫库中产生抗体。这也适用于铜绿假单胞菌的孔蛋白OprF以外的其他抗原。
更具体地，用于制备根据本发明的抗体或功能抗体片段的方法包括这样的步骤：产生蛋白脂质体，其中铜绿假单胞菌的OprF蛋白处于其天然和活性形式，从而暴露构象表位。该步骤可以通过在无细胞蛋白合成系统的存在下，将含有铜绿假单胞菌OprF蛋白的编码序列的表达载体与合成脂质体接触以形成反应介质来进行，该系统使蛋白质的转录和同时翻译成为可能。然后将该蛋白质插入合成脂质体的脂双层中以形成蛋白脂质体。在Maccarini et al.，Langmuir 2017，33，9988-9996的出版物中特别描述了这样的步骤。OprF蛋白以适合具有天然构象和开放通道构象的方向存在于模仿铜绿假单胞菌膜的脂质体脂双层中。更具体地，OprF蛋白有利地以其两种形式(开放的和封闭的)存在于蛋白脂质体中，这两种形式天然存在于细菌膜中或由细菌释放的囊泡中以抵消免疫应答。特别地，由本发明人进行的蛋白脂质体分析表明，OprF蛋白：在脂质体膜中以正确的方向存在于其中；以其两种膜拓扑结构(开放的和封闭的，分别以8个和16个跨膜通路为特征)存在于其中；在脂质体膜中形成在其中的孔/通道；以低聚形式存在其中。
由本发明人开发的方法然后包括用这些蛋白脂质体免疫接种非人哺乳动物，优选猕猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))，然后从经免疫接种对象的骨髓样品中产生抗体库，特别是scFv片段库的步骤。
使用表达技术，特别是使用噬菌体展示筛选此scFv库，使得本发明人能够鉴定多于11个与阳性克隆相关的序列，确定其互补决定区。因此，本发明人发现，靶向铜绿假单胞菌的OprF蛋白的抗体(其具有针对每个重链和轻链可变区的三个互补决定区的特异性序列)对该蛋白的天然表位具有特别显著的亲和力和特异性，使得它们成为治疗性治疗铜绿假单胞菌感染的所选活性物质，特别是由于其灵长类动物的性质使其在人中的耐受性十分良好。在本说明书中，术语治疗是指治愈性治疗和预防性治疗二者。支撑获得这种有利结果的现象在此将不会被预先判断。然而，如上所述，可以认为这至少部分源于蛋白脂质体技术中的OprF蛋白表达以及使用这些蛋白脂质体在猕猴中进行免疫接种的组合。现有技术中没有表明这样的组合可以导致识别引起这些抗体与铜绿假单胞菌的膜孔蛋白OprF，更具体地与其天然线性和构象表位以非常强的亲和力特异性结合的抗体区域。
因此，根据本发明的一个方面，提出了靶向铜绿假单胞菌的OprF蛋白或该抗体的功能片段(即与之特异性结合)的单克隆抗体。该抗体或功能片段包含重链可变区和轻链可变区：
-所述重链可变区具有三个互补决定区(CDR)，所述互补决定区具有以下氨基酸序列，或与这些序列具有至少80％、优选至少85％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少96％、优选至少97％、优选至少98％、且优先至少99％同一性的序列：
VH-CDR1：GYXaa1FXaa2Xaa3Xaa4G(SEQ ID NO：1)，其中Xaa1是苏氨酸残基或丝氨酸残基，Xaa2是丝氨酸残基或天冬酰胺残基，Xaa3是精氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，并且Xaa4是苯丙氨酸残基或酪氨酸残基，
VH-CDR2：INAXaa5TGKXaa6(SEQ ID NO：2)，其中Xaa5是谷氨酸残基或天冬氨酸残基，并且Xaa6是丙氨酸残基或丝氨酸残基，
VH-CDR3：VR，
-所述轻链可变区具有三个CDR，所述CDR具有以下氨基酸序列，或与这些序列具有至少80％、优选至少85％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少96％、优选至少97％、优选至少98％、并且优先至少99％同一性的序列：
VL-CDR1：SSVXaa7TXaa8Xaa9(SEQ ID NO：3)，其中Xaa7是苏氨酸残基、天冬酰胺残基、丝氨酸残基、丙氨酸残基或精氨酸残基，Xaa8是天冬酰胺残基、甘氨酸残基或丝氨酸残基，并且Xaa9是酪氨酸残基或苯丙氨酸残基，
VL-CDR2：Xaa10TS，其中Xaa10是甘氨酸残基、精氨酸残基或丙氨酸残基，
VL-CDR3：QQGXaa11Xaa12Xaa13(SEQ ID NO：4)，其中Xaa11是组氨酸残基或天冬酰胺残基，Xaa12是丝氨酸残基或苏氨酸残基，并且Xaa13是缬氨酸残基或异亮氨酸残基。
在本发明的意义上，抗体通常表示由称为重链和轻链的两种糖多肽链构成的糖蛋白，由通过二硫桥结合的两条重链和两条轻链组成的抗体。每条链由可变区和恒定区组成。重链可变区VH和轻链可变区VL各自具有三个高变区，其称为互补决定区(CDR)。因此，在本说明书中，“互补决定区”通常表示抗体的重链和轻链可变区的三个高变区的每一个，其形成了互补位的要素，并且使其可以确定抗体与抗原表位的互补性。这三个高变区的框架为四个恒定区，这些恒定区形成框架(FR区)并为可变结构域提供稳定的构型。根据本领域技术人员公知的标准，基于抗体重链和轻链的氨基酸序列限定抗体的CDR。根据本发明的抗体的CDR更具体地根据IMGT命名法确定。
此外，功能抗体片段表示保留与抗原结合的能力并因此对铜绿假单胞菌的OprF蛋白具有与原始抗体相同亲和力的任何抗体片段。这种片段尤其可以是Fv、scFv、Fab、Fab′、F(ab′)2片段、纳米抗体等。根据本发明的抗体片段还可以包含不属于原始抗体的肽序列，其对应于例如抗体部分(例如重链与轻链部分)之间的结合肽，或肽标签，例如C端，从而能够进行例如其的纯化、其的检测等，所述肽标签例如为本领域技术人员所公知的多聚组氨酸标签和c-myc标签。
“抗体片段”的表述还包括抗体片段的多价形式，特别是两个、三个或四个片段的二价、三价或四价形式，特别是scFv的多价形式，例如双抗体、三抗体和四抗体。
根据本发明的单克隆抗体可以是双特异型的，或更一般地具有任何多价形式。
单链可变片段(scFv)，其为重链可变区VH和轻链可变区VL之间的融合蛋白，在本发明范围内是特别优选的。这些scFv片段尤其可以在这些可变区之间包含连接重链可变区和轻链可变区的结合肽。该结合肽可以是scFv结构域中的任何常规肽。其优选包含至少5个氨基酸，并优选约5至20个氨基酸。例如，其可以具有序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：11)。可根据本发明使用的结合肽的另一些实例描述于Chen et al.，2013，Adv.DrugDeliv.Rev.65(10)：1357-1369的出版物中(特别是在表3中)。
结合肽可以连接重链可变区的N端和轻链可变区的C端。优选地，其连接轻链可变区的N端和重链可变区的C端。
scFv片段可以由编码重链可变区VH的互补DNA(cDNA)和编码轻链可变区VL的cDNA产生，例如根据常规蛋白质表达技术，从杂交瘤、细菌、无细胞系统或产生根据本发明抗体的任何其他重组蛋白质产生系统获得。
更一般地，根据本发明的抗体或抗体片段可以通过遗传重组或通过化学合成产生，或者通过从天然来源中纯化而分离，特别是从杂交瘤中。
符合本发明定义的抗体或抗体片段对铜绿假单胞菌的OprF蛋白具有高亲和力。这些抗体或抗体片段与抗原结合的解离常数尤其可以是200nM量级的解离常数。此外，这些抗体对于细胞中的(in cellulo)细菌具有高中和能力。
为了简化的目的，根据本发明的单克隆抗体在本说明书中将称为“抗体”，并且该抗体的功能片段将称为“抗体片段”或“该抗体的片段”。
根据本发明，与参考序列具有至少80％、优选至少85％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少96％、优选至少97％、优选至少98％，并且优先至少99％同一性的序列是这样的序列，其相对于该参考序列具有一个或更多个变异，同时提供对抗原具有亲和力的抗体或抗体片段，正如参考序列那样。这些变异可以是序列中一个或更多个氨基酸的缺失、替换和/或插入。
同一性百分比对应于比较序列之间相同氨基酸的百分比，其在最佳比对两个序列之后获得。序列的最佳比对可以以本领域技术人员的任何常规方式进行，例如使用BLAST软件。同一性百分比通过确定两个序列之间氨基酸相同的位置数，然后将其除以序列中的位置总数，将结果乘以100来计算。
当根据本发明的抗体或抗体片段的CDR序列相对于以上列出的序列之一，特别是相对于序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4之一，具有小于100％的同一性百分比时，其相对于该参考序列可以有插入、缺失和/或替换。在替换的情况下，优选由来自与原始氨基酸相同家族的氨基酸进行替换，例如碱性残基(例如精氨酸)被另一个碱性残基(例如赖氨酸残基)的替换、酸性残基(例如天冬氨酸)被另一个酸性残基(例如谷氨酸)的替换，极性残基(例如丝氨酸)被另一个极性残基(例如苏氨酸)的替换，脂肪族残基(例如亮氨酸)被另一个脂肪族残基(例如异亮氨酸)的替换等。
优选地，根据本发明的抗体或抗体片段符合以下一项或更多项特征：
-Xaa1是苏氨酸残基，
-Xaa3是精氨酸残基，
-Xaa5是谷氨酸残基，
-Xaa6是丙氨酸残基，
-和/或Xaa13是缬氨酸残基。
优选地，根据本发明的抗体或抗体片段为这样，在对应于重链VH-CDR1的CDR的序列SEQ ID NO：1中，Xaa3是精氨酸残基，并且在对应于重链VH-CDR2的CDR的序列SEQ ID NO：2中，Xaa6是丙氨酸残基。
根据本发明的抗体或抗体片段还优选为这样，在对应于重链VH-CDR1的CDR的序列SEQ ID NO：1中，Xaa1是苏氨酸残基，在对应于重链VH-CDR2的CDR的序列SEQ ID NO：2中，Xaa5是谷氨酸残基，以及在对应于轻链VL-CDR3的CDR的序列SEQ ID NO：4中，Xaa13是缬氨酸残基。
根据本发明的特别优选的序列为以下序列：
-对于VH-CDR1：
GYTFSRFG(SEQ ID NO：5)，GYSFSSYG(SEQ ID NO：6)，GYSFSTYG(SEQ ID NO：7)，GYSFSRYG(SEQ ID NO：8)，GYSFNTYG(SEQ ID NO：9)或GYSFSTFG(SEQ ID NO：10)；
-对于VH-CDR2：
INAETGKA(SEQ ID NO：12)，INADTGKS(SEQ ID NO：13)，INADTGKA(SEQ ID NO：14)或INAETGKS(SEQ ID NO：15)；
-对于VL-CDR1：
SSVTTNY(SEQ ID NO：16)，SSVTTGY(SEQ ID NO：17)，SSVNTNY(SEQ ID NO：18)，SSVSTNY(SEQ ID NO：19)，SSVATGF(SEQ ID NO：20)，SSVSTSY(SEQ ID NO：21)，SSVRTGY(SEQID NO：22)或SSVSTGY(SEQ ID NO：23)；
-对于VL-CDR2：GTS或RTS；
-对于VL-CDR3：
QQGHSV(SEQ ID NO：24)，QQGHTI(SEQ ID NO：25)，QQGNTI(SEQ ID NO：26)或QQGHSI(SEQ ID NO：27)。
根据本发明的特异性抗体或抗体片段是这样的：
-重链可变区的互补决定区(CDR)具有以下相应的氨基酸序列，或与这些序列具有至少80％、优选至少85％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少96％、优选至少97％、优选至少98％、并且优先至少99％同一性的序列：
VH-CDR1：GYTFSRFG(SEQ ID NO：5)
VH-CDR2：INAETGKA(SEQ ID NO：12)
VH-CDR3：VR
-和/或轻链可变区的互补决定区(CDR)具有以下相应的氨基酸序列，或与这些序列具有至少80％、优选至少85％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少96％、优选至少97％、优选地至少98％、并且优先至少99％同一性的序列：
VL-CDR1：SSVTTNY(SEQ ID NO：16)
VL-CDR2：GTS
VL-CDR3：QQGHSV(SEQ ID NO：24)。
根据本发明的另一些特异性抗体或抗体片段是这样的：
-重链可变区的互补决定区(CDR)具有以下相应的氨基酸序列，或与这些序列具有至少80％、优选至少85％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少96％、优选至少97％、优选至少98％、并且优先至少99％同一性的序列：
VH-CDR1：GYSFSSYG(SEQ ID NO：6)
VH-CDR2：INADTGKS(SEQ ID NO：13)
VH-CDR3：VR
-和/或轻链可变区的互补决定区(CDR)具有以下相应的氨基酸序列，或与这些序列具有至少80％、优选至少85％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少96％、优选至少97％、优选至少98％、并且优先至少99％同一性的序列：
VL-CDR1：SSVTTGY(SEQ ID NO：17)或SSVTTNY(SEQ ID NO：16)
VL-CDR2：GTS
VL-CDR3：QQGHTI(SEQ ID NO：25)或QQGNTI(SEQ ID NO：26)。
根据本发明的另一些特异性抗体或抗体片段是这样的：
-重链可变区的互补决定区(CDR)具有以下相应的氨基酸序列，或与这些序列具有至少80％、优选至少85％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少96％、优选至少97％、优选至少98％、并且优先至少99％同一性的序列：
VH-CDR1：GYSFSTYG(SEQ ID NO：7)或GYSFSRYG(SEQ ID NO：8)
VH-CDR2：INADTGKS(SEQ ID NO：13)或INADTGKA(SEQ ID NO：14)
VH-CDR3：VR
-和/或轻链可变区的互补决定区(CDR)具有以下相应的氨基酸序列，或与这些序列具有至少80％、优选至少85％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少96％、优选至少97％、优选至少98％、并且优先至少99％同一性的序列：
VL-CDR1：SSVNTNY(SEQ ID NO：18)、SSVTTGY(SEQ ID NO：17)或SSVTTNY(SEQ IDNO：16)
VL-CDR2：GTS
VL-CDR3：QQGHTI(SEQ ID NO：25)或QQGNTI(SEQ ID NO：26)。
根据本发明的特异性抗体或抗体片段具有如下表1所示序列的CDR，VH-CDR3的序列为VR：
表1
根据本发明的另一些特异性抗体或抗体片段具有如下表2所示序列的CDR，VH-CDR3的序列为VR：
表2
根据本发明的特异性抗体或抗体片段包含选自以下序列对的序列对：SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：34和SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39、SEQID NO：40和SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49，或与这些序列对之一具有至少80％、优选至少85％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少96％、优选至少97％、优选至少至少98％，并且优先至少99％同一性的序列对。这意指任何序列对，其中每个序列分别与来自以上列出的序列对的序列对的序列之一具有至少80％、优选至少85％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少96％、优选至少97％、优选至少98％，并且优先至少99％同一性。
序列对的序列可以直接相互结合，特别是通过肽键，或通过结合肽的序列相互结合。
根据本发明的特异性抗体片段，特别是scFv片段，其包含选自以下序列的序列并且优选地由选自以下序列的序列组成：SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQID NO：59和SEQ ID NO：60，或与这些序列之一具有至少80％、优选至少85％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少96％、优选至少97％、优选至少98％、并且优先至少99％同一性的序列。
特别地，在这些序列中包含的序列(G4S)3(SEQ ID NO：11)的结合肽可以被任何其他结合肽替代。
优选地，根据本发明的抗体或抗体片段的重链可变区和轻链可变区来自猕猴(食蟹猴)。这同样适用于重链恒定区和/或轻链恒定区。猕猴尤其具有与人遗传序列非常高度同源性的优势。在另一些情况下，这些区域中的一个或更多个可以来自转基因动物。
优选地，根据本发明的抗体或抗体片段不具有氨基酸序列SEQ ID NO：73。特别地，其可不包含具有序列SEQ ID NO：74的轻链可变区，或具有序列SEQ ID NO：75的轻链可变区CDR，即序列SSVXaa7TXaa8Xaa9(SEQ ID NO：3)的轻链可变区CDR，其中Xaa7、Xaa8和Xaa9如上所限定，但Xaa7和Xaa8并非同时为天冬酰胺残基(针对Xaa7)和丝氨酸残基(针对Xaa8)。
根据本发明的抗体或抗体片段可以是重组抗体或抗体片段，其包含由杂交瘤(特别是来自猕猴)产生的抗体的互补位，并且其恒定区已被修饰以使对于人的免疫原性最小化。例如，其是嵌合抗体或抗体片段或者人源化抗体或抗体片段。
嵌合抗体或抗体片段在此通常表示抗体或抗体片段，其包含源自给定物种的抗体的天然可变区，与同这种物种异源的物种抗体的恒定区缔合。这样的抗体可以例如通过遗传重组来制备。
根据本发明的嵌合抗体或抗体片段优选地为这样：重链恒定区和/或轻链恒定区(如果其包括任何的话)是人源的，可变区就其而言源自猕猴。
人源化抗体或抗体片段包含来自非人哺乳动物抗体的CDR，优选地，根据本发明，来自猕猴，以及源自人抗体的框架区FR和C。
确定可以对给定抗体进行哪些修饰以使其人源化在本领域技术人员的技能范围内。例如，这种人源化可以通过与序列SEQ ID NO：61(人IgG1，G1m1，17同种异型)的重链恒定序列融合进行。
本发明的范围还包括经过修饰同时保留其对铜绿假单胞菌的OprF蛋白的亲和力，例如为了优化其一些效应物功能的抗体或抗体片段。可以在氨基酸残基或肽键上进行修饰。这种修饰的一个实例是聚乙二醇的结合。
本发明的另一个方面涉及编码根据本发明的单克隆抗体或所述抗体的功能片段的核酸分子。
该核酸分子可以例如具有选自序列SEQ ID NO：62至SEQ ID NO：72的序列。这些序列编码根据本发明的抗体片段，其中序列(G4S)3(SEQ ID NO：11)的结合肽连接重链可变区和轻链可变区。
本发明还涉及包含根据本发明的核酸分子的表达载体。该表达载体可以是本身已知的用于基因工程的任何类型，特别是质粒、黏粒、病毒、噬菌体，其包含用于转录和翻译编码根据本发明的抗体或这种抗体的功能片段的序列所必需的元件。
本发明还涉及包含根据本发明的核酸分子或表达载体的宿主细胞。该宿主细胞可以同样良好地是原核细胞(特别是细菌，尤其是用于大量产生抗体或该抗体的功能片段)或真核细胞(其可以来自低等或高等真核生物，例如酵母、无脊椎动物或哺乳动物)。特别地，本发明的范围包括以稳定的、可诱导的或组成型的方式或者以瞬时方式表达根据本发明的抗体或该抗体的功能片段的细胞系。
根据本发明的抗体或抗体片段可以通过本领域技术人员已知的任何常规方法产生。其尤其可以通过遗传重组或化学合成获得。
根据本发明的具体实施，用于制备根据本发明的抗体或抗体片段的方法包括在能够表达所述单克隆抗体或所述抗体的功能片段的条件下培养根据本发明的宿主细胞(即，其包含编码根据本发明的抗体或抗体片段的核酸分子或者含有这种核酸分子的表达载体)，并回收由此产生的抗体或该抗体的功能片段。
用于制备根据本发明的抗体或抗体片段的替代方法也属于本发明的范围内，特别是通过任选地在用弗氏佐剂的情况下，用铜绿假单胞菌的OprF抗原来接种非人哺乳动物，并筛选产生对该抗原具有亲和力的抗体的杂交瘤，通过分析其序列来鉴定根据本发明的抗体或抗体片段。为此目的，用于接种的OprF蛋白为蛋白脂质体的形式，例如以上引用的Maccarini等的出版物中所述。
接种可以通过任何途径进行，特别是通过皮下、肌内、静脉内、腹膜内等注射。可以间隔数天施用一次或更多次注射。
根据本发明一个具体实施方案用于制备抗体或抗体片段的方法包括以下连续步骤：
-产生含有铜绿假单胞菌OprF蛋白的蛋白脂质体。该步骤可以通过在无细胞蛋白质合成系统的存在下，通过使含有铜绿假单胞菌的孔蛋白OprF的编码序列的表达载体与合成脂质体(尤其是限定的脂质组合物的合成脂质体)接触以形成反应介质来进行，该系统例如任选地从细菌裂解物或获自酵母、哺乳动物细胞、小麦胚芽或任何其他生物来源的任何其他裂解物获得，该系统使该蛋白质的转录和同时翻译成为可能，例如根据以上引用的Maccarini等的出版物中描述的方案；
-用所述蛋白脂质体接种非人哺乳动物，特别是食蟹猴物种；
-从提取自所述哺乳动物的B淋巴细胞的RNA来构建抗体或抗体片段库，特别是scFv库，
-通过表达技术，特别是例如噬菌体展示和酶联免疫吸附测定(ELISA)对于所述蛋白脂质体来筛选所述库，
-以及选择和回收针对蛋白脂质体靶标具有反应性的克隆。
根据本发明，当如通过ELISA测量的克隆对于蛋白脂质体靶标的解离常数为小于或等于10μM时，认为该克隆针对该蛋白脂质体靶标具有反应性。
优先地，对于如此选择的对于蛋白脂质体具有反应性的克隆，该方法包括分离和通过测序验证其任何冗余的步骤。
从提取自所述哺乳动物的B淋巴细胞的RNA构建抗体或抗体片段(特别是scFv)的库，例如可以包括通过编码抗体的可变结构域VLk、VLλ和VH的信使RNA(mRNA)的逆转录和聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增，通过在噬菌粒载体中顺序克隆可变结构域VLk、VLλ和VH来构建scFv库，以及在噬菌体，特别是来自
公司的噬菌体M13KO7中衣壳化和扩增该scFv库。
用于制备根据本发明的抗体或功能抗体片段的方法可包括通过将由非人哺乳动物产生的抗体或抗体片段的至少一个CDR序列移植到人抗体的框架区FR，将这种抗体或抗体片段人源化的步骤。
其还可以包括由非人哺乳动物产生的抗体或抗体片段的一个或更多个氨基酸的替换、插入和/或缺失。
根据本发明的抗体或抗体片段存在用于治疗细菌感染，特别是铜绿假单胞菌感染的特别有利的应用。
因此，根据另一个方面，本发明涉及药物组合物，特别是疫苗组合物，其用于对抗细菌感染，特别是铜绿假单胞菌感染，并且特别是急性和慢性肺部感染。该组合物在可药用载剂中包含作为活性物质的根据本发明的单克隆抗体或所述抗体的功能片段。
根据本发明的药物组合物可具有任何适合于向哺乳动物施用的剂型，特别是适合于经口或肠胃外施用的剂型。特别地，其可以以适合于静脉内、肌内、腹膜内或皮下注射的剂型，或通过鼻内途径或通过吸入用于施用的剂型呈现。
载剂可由本身已知的任何常规载剂组成，特别是在疫苗组合物领域。其尤其可以由水性载剂组成。
根据本发明的药物组合物还可以包含本身已知的任何常规添加剂，以及任选的其他活性物质。
作为可用于根据本发明的药物组合物的添加剂，可提及表面活性剂(特别是聚山梨醇酯类型的表面活性剂)、溶剂或稳定剂，例如甘氨酸、精氨酸或其他等。
本发明的另一个方面涉及单克隆抗体或该抗体的功能片段作为药物用于预防或治愈目的的用途，以及特别是用于对抗细菌感染，特别是铜绿假单胞菌感染，特别是呼吸系统感染，以及更特别地是肺部感染，特别是急性和慢性肺部感染的用途。
该用途包括以治疗有效剂量将所述抗体或抗体片段或者包含其的药物组合物施用于哺乳动物，特别是人。
这种施用可以通过任何途径进行。优选通过经口途径或通过肠胃外途径进行，特别是通过静脉内、肌内、腹膜内或皮下注射，或者通过鼻内途径或通过吸入进行。
根据本发明的抗体或抗体片段可以以单剂量或以数个剂量，特别是相隔数天，施用于被治疗的个体。
有效剂量、施用持续时间和施用次数取决于被治疗的个体，特别是取决于其年龄、体重、症状等。确定确切的治疗条件在医生的职权范围内。
例如，对于单剂量治疗，根据本发明的抗体或抗体片段的治疗有效剂量可以为1至1000mg。
根据本发明的抗体或抗体片段可用于治疗任何有此需要的个体，特别是任何经受细菌感染，特别是铜绿假单胞菌感染的个体，或者通过预防的方式，任何有风险容易感染这种感染的个体，例如在住院期间的免疫低下的患者、患有囊性纤维化的患者、在机械通气下的患者或严重烧伤患者。这种预防性治疗可以大大消除铜绿假单胞菌感染的风险。
本发明还涉及根据本发明的抗体或抗体片段的其他用途，例如用于检测和任选地纯化铜绿假单胞菌的OprF蛋白。
因此，本发明涉及根据本发明的单克隆抗体或功能抗体片段用于在体外或离体检测生物流体中，特别是从个体(特别是从人或动物个体)获得的体液中的细菌铜绿假单胞菌的用途。因此，这意味着体液已经从所述个体中提取。
该检测可以通过本领域技术人员本身已知的任何常规技术，例如通过Western印迹、流式细胞术、表面等离子体共振、ELISA等进行。
本发明的另一个方面涉及用于检测在生物体液中，特别是从个体(特别是人或动物个体)的体液中细菌铜绿假单胞菌的诊断试剂盒。该试剂盒包含根据本发明的抗体或功能抗体片段，以及用于实施用于通过该单克隆抗体或功能抗体片段在体外或离体检测从个体获得的体液中细菌铜绿假单胞菌的方法的说明书。
该试剂盒还可以包含任何本身已知的用于使用这种检测方法的常规试剂。
根据本发明的抗体或抗体片段可另外用于制备双特异性抗体。
参考图1至15，本发明的特征和优点将根据以下实施例更加清楚地呈现，提供的实施例仅用于举例说明而非限制本发明，其中：
图1表示显示对于在用含有铜绿假单胞菌OprF蛋白的蛋白脂质体免疫接种猕猴之后第0、24和38天从该猕猴采集的血清(OPRF D0，OPRF D24，OPRF D38)和在用牛血清白蛋白免疫接种猕猴之后第38天从该猕猴采集的血清(BSA D38)进行ELISA测试(相对于铜绿假单胞菌的OprF蛋白的亲和力)，在450nm处的光密度作为血清稀释率的函数的图。
图2示出了根据本发明的针对铜绿假单胞菌OprF蛋白的6个scFv片段的序列，其中对应于6个CDR的序列，以及结合重链可变区与轻链可变区的结合肽序列加了下划线-在这些序列中，通常N端在左侧，而C端在右侧。
图3示出了根据本发明的针对铜绿假单胞菌OprF蛋白的另外5个scFv片段的序列，其中对应于6个CDR的序列，以及结合重链可变区与轻链可变区的结合肽序列加了下划线-在这些序列中，通常N端在左侧，而C端在右侧。
图4表示显示对于根据本发明的scFv片段(E2)的不同稀释度和作为阴性对照的牛血清白蛋白(BSA)进行的ELISA测试(相对于铜绿假单胞菌的OprF蛋白的亲和力)，在450nm处的光密度作为稀释率的函数的图。
图5表示显示对于根据本发明的scFv片段(E5)的不同稀释度和作为阴性对照的牛血清白蛋白(BSA)进行的ELISA测试(相对于铜绿假单胞菌的OprF蛋白的亲和力)，在450nm处的光密度作为稀释率的函数的图。
图6表示显示对于根据本发明的scFv片段(F8)的不同稀释度和作为阴性对照的牛血清白蛋白(BSA)进行的ELISA测试(相对于铜绿假单胞菌的OprF蛋白的亲和力)，在450nm处的光密度作为稀释率的函数的图。
图7表示显示对于根据本发明的scFv片段(G9)的不同稀释度和作为阴性对照的牛血清白蛋白(BSA)进行的ELISA测试(相对于铜绿假单胞菌的OprF蛋白的亲和力)，在450nm处的光密度作为稀释率的函数的图。
图8表示显示对于根据本发明的scFv片段(E3)的不同稀释度和作为阴性对照的牛血清白蛋白(BSA)进行的ELISA测试(相对于铜绿假单胞菌的OprF蛋白的亲和力)，在450nm处的光密度作为稀释率的函数的图。
图9表示显示对于根据本发明的scFv片段(E7)的不同稀释度和作为阴性对照的牛血清白蛋白(BSA)进行的ELISA测试(相对于铜绿假单胞菌的OprF蛋白的亲和力)，在450nm处的光密度作为稀释率的函数的图。
图10表示显示对于根据本发明的scFv片段(F10)的不同稀释度和作为阴性对照的牛血清白蛋白(BSA)进行的ELISA测试(相对于铜绿假单胞菌的OprF蛋白的亲和力)，在450nm处的光密度作为稀释率的函数的图。
图11表示显示对于根据本发明的scFv片段(F3)的不同稀释度和作为阴性对照的牛血清白蛋白(BSA)进行的ELISA测试(相对于铜绿假单胞菌的OprF蛋白的亲和力)，在450nm处的光密度作为稀释率的函数的图。
图12表示显示对于根据本发明的scFv片段(F4)的不同稀释度和作为阴性对照的牛血清白蛋白(BSA)进行的ELISA测试(相对于铜绿假单胞菌的OprF蛋白的亲和力)，在450nm处的光密度作为稀释率的函数的图。
图13表示显示对于根据本发明的scFv片段(A1)的不同稀释度和作为阴性对照的牛血清白蛋白(BSA)进行的ELISA测试(相对于铜绿假单胞菌的OprF蛋白的亲和力)，在450nm处的光密度作为稀释率的函数的图。
图14表示显示对于根据本发明的scFv片段(A8)的不同稀释度和作为阴性对照的牛血清白蛋白(BSA)进行的ELISA测试(相对于铜绿假单胞菌的OprF蛋白的亲和力)，在450nm处的光密度作为稀释率的函数的图。
图15表示显示对于根据本发明的四个scFv片段(分别命名为E7、F8、F10和G9)进行的ELISA测试(相对于铜绿假单胞菌的OprF蛋白的亲和力)，在450nm处的光密度(opticaldensity，OD)作为浓度的函数的图。
图16示出了表示在用于确定根据本发明的scFv片段(F8、G9、E7)的针对铜绿假单胞菌(“Pa”)对巨噬细胞(“Ma”)的感染的中和能力的细胞中测试期间，通过测定乳酸脱氢酶活性，通过从490nm处的吸光度中减去在680nm处的吸光度获得的值(“A490-A680nm”)。
A/含有铜绿假单胞菌OprF蛋白的蛋白脂质体的产生。
表达OprF的重组载体的构建
重组载体pIVEX2.4-OprF(其中OprF包含N端多聚组氨酸标签)是通过以下来构建的：通过以下引物将从通过聚合酶链式反应(PCR)扩增的铜绿假单胞菌基因组DNA扩增的OprF基因克隆至表达载体pIVEX2.4d(Roche Diagnostics)中：
有义5’-GGAATTCCATATGAAACTGAAGAACACCTTAG-3’(SEQ ID NO：76)
反义5’-TAGAAGCTGAAGCCAAGTAACTCGAGTAACGC-3’(SEQ ID NO：77)。
为此，使用高保真DNA聚合酶实施30个PCR循环。然后通过QIAquick凝胶试剂盒(Qiagen)纯化由此获得的PCR产物，然后用限制酶NdeI、XhoI(Roche Diagnostics)消化，再次纯化，然后通过快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics)结合至之前被酶NdeI和XhoI消化的质粒载体pIVEX2.4d(Roche Diagnostics)中。得到的重组质粒pIVEX2.4-OprF通过测序(LGC Genomics)进行验证，以验证编码OprF的基因与载体pIVEX2.4d的多聚组氨酸标签同相插入。
脂质体制备
脂质体是通过干燥预先溶解在氯仿中的脂质组合物制备的，针对以下不同的脂质组合物(LC)：
-脂质组合物1(LC1)：胆固醇、1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DOPC)、1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸(钠盐)(DMPA)，摩尔比[2-4-2-2]；
-LC1′：LC1+1mg/mL单磷酰脂A(MPLA)；
-LC2：1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸-(1′-rac-甘油)(钠盐)(POPG)，大肠杆菌(E.coli)心磷脂(CL)，摩尔比[6-2-2]；
-LC2′：LC2+1mg/mL MPLA；
-LC3：POPE、POPG、大肠杆菌CL、DMPA，摩尔比[6-2-1-1]；
-LC 3′：LC 3+1mg/mL MPLA(Avanti Polar Lipids)。
通过在氮气下蒸发进行干燥。使用真空泵去除残留的痕量氯仿。然后通过涡旋将脂质膜在500μl Tris溶液(50mM，pH 7.5)中水合，然后在液氮中经受4次冷冻/解冻循环。使用挤出机(Avanti Polar Lipids)挤出脂质混合物以产生平均尺寸为约200nm的脂质体。如此获得的脂质体储存在4℃下。
在无细胞系统中的含有OprF蛋白脂质体的制备与纯化
在不同脂质体组合物(LC1，或LC2，或LC3或LC1′，或LC2′或LC3′)存在下，使用RTS500 ProteoMaster大肠杆菌HY无细胞蛋白合成试剂盒(来自Biotechrabbit)合成铜绿假单胞菌的OprF膜蛋白。为此，在来自6种脂质组合物LC1至LC3′之一的量为1至4mg/ml的脂质体存在下，将含有编码与多聚组氨酸标签(6×His)融合的OprF蛋白之基因的重组质粒pIVEX2.4-OprF以15μg/ml的浓度添加至试剂盒的细胞裂解物。含有OprF重组蛋白的蛋白脂质体以比例为1∶30的反应体积/容器体积在搅拌(300rpm)下在25℃下制备16小时。然后分两步纯化所得重组蛋白脂质体：
-首先在50mM pH 7.5Tris缓冲液中0至40％的蔗糖梯度下，其中反应混合物沉积在梯度顶部，然后使用TH-641转子以287.660g离心2小时。从梯度顶部收集1ml级分，并通过Western印迹使用与HRP辣根过氧化物酶(Sigma)偶联的抗组氨酸抗体进行分析，
-然后，将1ml 50mM pH 7.5Tris缓冲液添加至每个包含含有OprF之蛋白脂质体的级分，并将溶液在4℃下以30,000g离心30分钟，以形成蛋白脂质体沉淀。将沉淀在4℃下用5M NaCl溶液洗涤两次，持续30分钟，然后以所需浓度重悬在50mM pH 7.5Tris溶液中。在用考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶上分析样品的纯度。
获得含有铜绿假单胞菌OprF蛋白的蛋白脂质体。
B/scFv片段库的制备和筛选
动物的免疫接种
靶向铜绿假单胞菌OprF细菌膜抗原靶标的scFv片段是通过用从猕猴(食蟹猴)的脂质组合物LC1获得的蛋白脂质体免疫接种(在第D0、D14、D28和D50天进行)而获得的。在另一类似动物且无其他物种存在的情况下，猕猴保持在无菌条件下。在第一次注射之前，进行血液测试以确定动物的生理状态。将100μg在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的组合物LC1与弗氏佐剂按50/50混合(第一次注射完全弗氏佐剂，后续注射不完全弗氏佐剂)，根据以下谱以2点(以每点250μl的速率)皮下注射到动物体内的动物肩胛区域中：在第0、14、28、50天施用。
通过免疫酶测定(ELISA)对在第D0、D24、D38天取样的血清分析免疫应答，以对靶向OprF膜抗原靶标的抗体进行滴定。对经麻醉动物在最后一次注射(D50)之后在D53、D60、D67和D74采集骨髓样品。
血清滴定
按照在″Phage Display″，Methods and Protocols，Springer Protocols，″Construction of Macaque Immune Libraries″章，Arnaud Avril et al.，Methods MolBiol.2018；1701：83-112.doi：10.1007/978-1-4939-7447-4_5书中描述的方案，通过间接ELISA法使用免疫前和免疫血清的一系列稀释度(100、1000、10,000、1,000,000、10,000,000和100,000,000的稀释度)分析免疫后体液应答。简而言之，首先将蛋白脂质体形式的OprF膜抗原或阴性对照例如牛血清白蛋白(BSA)沉积在ELISA板的底部，并在4℃下孵育16小时。在饱和步骤(将2％的乳粉重悬在200μl PBS磷酸盐缓冲盐水中)之后，然后将每种稀释的血清(最初为1∶100，然后是1∶10，在PBS/
0.05％/BSA 0.5％中)针对OprF抗原或阴性对照(BSA)在37℃下平行测试2小时。然后使用与HRP辣根过氧化物酶缀合的抗猕猴Fc二抗并通过添加四甲基联苯胺(TMB)直到孔中出现颜色来检测针对OprF的特异性抗体。通过读取450nm处的光密度来分析结果。
图1中示出了用含有OprF的蛋白脂质体免疫接种之后第D0、D24和D38天采集的血清以及用BSA免疫接种第D38天获得的血清所获得的结果。
在D38天，观察到1∶200000的滴度，其与该方法的其余部分兼容。
骨髓样品和B淋巴细胞分离
骨髓样品取自经麻醉动物。通过Mallarme套管针在股骨转子窝处和在肱骨结节处采集样品。每个样品都收集在含有10％至15％的柠檬酸盐溶液的50ml
管中。在第D53、D60、D67和D74天获得大约5ml样品。然后将每个样品在4℃下以500g(1500rpm)离心10分钟。取出上清液并放入冷冻管中，然后储存在-20℃下。然后用Trizol/氯仿技术提取每个骨髓的总RNA，并通过使用分光光度计读取260nm和280nm处的光密度(OD)进行定量。
所得结果显示在下表3中。
表3
RT-PCR扩增编码可变部分VLκ、VLλ和VH的RNA
使用特异性引物对每个骨髓样品的编码重链和轻链G和κ/λ可变结构域的信使RNA(mRNA)进行逆向扩增，以获得互补DNA(cDNA)库，描述于由Avril et al.，2018，MethodsMol.Biol.，1701：83-112的出版物中。
扩增品质通过琼脂糖凝胶电泳控制。
根据供应商的方案，将从第D53天至第D74天获得的eDNA库中扩增的PCR产物克隆到质粒pGemT(Promega)中，以获得所保护的克隆的库。
scFv片段库的构建
根据供应商的方案，通过以下从第D53天和D60天获得的DNA来构建2个库(每天一个)：顺序克隆，通过首先将VL片段插入至噬菌粒载体pTh1(Addgene)中然后插入VH片段，以获得形式为VH-[(G4S)x3(SEQ ID NO：11)]-VL-6x组氨酸-EQKLISEEDL(SEQ ID NO：MM)的构建体，其中VH和VL片段通过结合肽GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：11)结合，所述结合肽将VH片段的C端与VL片段的N端结合，并且在其C端包含多聚组氨酸标签(SEQ ID NO：79)和c-myc标签(SEQ ID NO：78)。
对于D53天获得的DNA，获得了1.5.107CFU(75％全尺寸插入)的库。对于D60天获得的DNA，获得了1.107CFU(100％全尺寸插入)的库。
用噬菌体展示技术筛选scFv片段库-鉴定对铜绿假单胞菌的OprF蛋白具有亲和力
的片段
根据供应商的方案，该库在噬菌体M13Ko7(Nebb)中衣壳化并被扩增。
对噬菌粒中包含的scFv库进行针对固定在96孔板上的含有OprF膜抗原的蛋白脂质体的4轮选择。
筛选方案如下：在4℃下在PBS中，用浓度为10μg/ml的靶向抗原包被微量滴定板过夜。然后，用PBS中的3％BSA在37℃下封闭板2小时；在洗涤之后，库在37℃下再孵育2小时。在第一轮期间，使用含有0.1％
20的PBS将板洗涤两次，每次洗涤之间间隔5分钟。最后，用无菌PBS洗涤、清洗板，并且噬菌体在37℃下用胰蛋白酶(PBS中10mg/ml)洗脱30分钟。经洗脱的噬菌体用于大肠杆菌感染(SURE菌株，Stratagene，在补充有四环素(10μg/ml)和羧苄青霉素(50μg/ml)的SB(超级肉汤(Super Broth))培养基中培养。对于产生新的噬菌体颗粒，将受感染菌株与辅助噬菌体共感染，并在30℃下，在补充有四环素(10μg/mL)、羧苄青霉素(50μg/mL)和卡那霉素(70μg/mL)的SB培养基中培养过夜。使用PEG/NaCl(4％(w/v)PEG-8000，3％(w/v)NaCl)沉淀噬菌体颗粒并用于下一个循环。如上所述进行第二轮。第三轮的受感染菌株在Petri培养皿中的SB培养基上培养，并用于筛选。
在每一轮之后，只有与OprF相互作用的噬菌体被洗脱。在每一轮选择之后的噬菌体针对OprF靶标的反应性通过ELISA测定进行测试。噬菌体在第一轮和第四轮选择之间显示出30倍的信号提高，表明针对OprF有反应性的scFv富集。
收集从第二轮、第三轮和第四轮选择中分离的96个克隆，并用于产生可溶性scFv。从这些克隆中，选择了57个阳性克隆并保留了其中的15个。对该57个克隆的核苷酸和肽序列进行分析以确定一些序列的潜在冗余。43个序列被鉴定为非冗余和非重组。在这43个序列中，有11个是根据以下方案在大肠杆菌(Escherichia coli)细菌中产生的：在选择过程之后分离的噬菌粒DNA用于转化非抑制性大肠杆菌菌株，使其表达可溶性scFv片段。随机选择的转化体的单克隆用于接种5ml补充有羧苄青霉素的SB培养基。将培养物在剧烈搅拌(250rpm)下，在37℃下孵育过夜。然后用500μl每种培养物接种500ml补充有羧苄青霉素的SB培养基。将培养物在30℃下培养直到600nm处的光密度达到1.5。然后在22℃下添加IPTG(1mM)过夜以诱导基因表达。通过在4℃下以2500g离心15分钟收集细胞。根据制造商的说明，用多黏菌素B硫酸盐提取scFv并在镍柱(Ni-NTA柱，Qiagen)上纯化，然后针对PBS透析。
然后用ELISA方法纯化产生的相应scFv以确认其对于OprF靶标的亲和力。
这11个scFv片段包含下表4中所示的序列。
表4
| scFv | 氨基酸序列 |
| A1 | SEQ ID NO：50 |
| A8 | SEQ ID NO：51 |
| E2 | SEQ ID NO：52 |
| E3 | SEQ ID NO：53 |
| E5 | SEQ ID NO：54 |
| E7 | SEQ ID NO：55 |
| F3 | SEQ ID NO：56 |
| F4 | SEQ ID NO：57 |
| F8 | SEQ ID NO：58 |
| F10 | SEQ ID NO：59 |
| G9 | SEQ ID NO：60 |
这些序列在其中在它们的C端通过多聚组氨酸标签(SEQ ID NO：79)和c-myc标签(SEQ ID NO：78)被延长。
这些scFv片段均包含重链可变区和轻链可变区：
-所述重链可变区具有三个互补决定区(CDR)，所述CDR具有以下氨基酸序列：
VH-CDR1：GYXaa1FXaa2Xaa3Xaa4G(SEQ ID NO：1)，其中Xaa1是苏氨酸残基或丝氨酸残基，Xaa2是丝氨酸残基或天冬酰胺残基，Xaa3是精氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，并且Xaa4是苯丙氨酸残基或酪氨酸残基，
VH-CDR2：INAXaa5TGKXaa6(SEQ ID NO：2)，其中Xaa5是谷氨酸残基或天冬氨酸残基，并且Xaa6是丙氨酸残基或丝氨酸残基，
VH-CDR3：VR，
-所述轻链可变区具有三个CDR，所述CDR具有以下氨基酸序列：
VL-CDR1：SSVXaa7TXaa8Xaa9(SEQ ID NO：3)，其中Xaa7是苏氨酸残基、天冬酰胺残基、丝氨酸残基、丙氨酸残基或精氨酸残基，Xaa8是天冬酰胺残基、甘氨酸残基或丝氨酸残基，并且Xaa9是酪氨酸残基或苯丙氨酸残基，
VL-CDR2：Xaa10TS，其中Xaa10是甘氨酸残基、精氨酸残基或丙氨酸残基，
VL-CDR3：QQGXaa11Xaa12Xaa13(SEQ ID NO：4)，其中Xaa11是组氨酸残基或天冬酰胺残基，Xaa12是丝氨酸残基或苏氨酸残基，并且Xaa13是缬氨酸残基或异亮氨酸残基。
这些scFv片段都是根据本发明的。
这些scFv片段的每个序列在图2中显示为A1、A8、E2、E3、E5、E7，并在图3中显示为F3、F4、F8、F10、G9。CDR序列在其中加下划线。因此，从左到右，重链可变区的CDR的连续序列是可见的(VH-CDR1，随后是VH-CDR2，随后是VH-CDR3)，随后是轻链可变区(VL-CDR1，随后是VL-CDR2，随后是VL-CDR3)。结合肽序列也在三个CDR三联体之间加下划线。
C/分析根据本发明的scFv片段对铜绿假单胞菌的OprF蛋白的亲和力
纯化上述产生的11个scFv片段。
获得以下量的根据本发明的每个scFv片段：0.346mg/ml E2、0.401mg/ml E3、0.559mg/ml E5、0.453mg/ml E7、0.387mg/ml F4、0.436mg/ml F3、0.333mg/ml F8、0.403mg/ml F10、0.570mg/ml G9、0.385mg/ml A1和0.626mg/ml A8。
在
板上进行ELISA测定，以确认这些scFv片段对于蛋白脂质体形式的OprF靶标的亲和力，如下所述。
板用重悬在200μl PBS磷酸盐缓冲盐水中的2.5％乳粉饱和。
在PBS/
-200.05％/BSA 0.5％中以不同的稀释率孵育scFv片段：1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280。使用与辣根过氧化物酶偶联的抗c-myc标签二抗进行检测。记录450nm处的光密度。
对于根据本发明的片段和阴性对照(BSA)，获得的结果显示在图4的E2、图5的E5、图6的F8、图7的G9、图8的E3、图9的E7，图10的F10，图11的F3，图12的F4，图13的A1，和图14的A8。
可以看出，根据本发明的所有scFv片段都对铜绿假单胞菌的OprF蛋白具有高亲和力。
例如，用ELISA方法确定scFv片段E7、F8、F10和G9的解离常数Kd。
为此，在4℃和搅拌下将在固定缓冲液(0.1M碳酸钠、0.1M碳酸氢钠)中包含的100μl OprF蛋白脂质体(含有1μg/ml浓度的OprF)固定在96孔板(Thermo
)的孔底部处过夜。然后将孔在21℃下用100μl含5％乳的TBS吐温(TBST)缓冲液封闭1小时。用100μlTBST缓冲液洗涤孔之后，将100μl在TBST缓冲液中以1∶50、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600和1∶3200稀释度的scFv片段(E7、F8、F10或G9)添加至相应孔，并在37℃下搅拌孵育1小时。在洗涤孔之后，将100μl抗c-myc-过氧化物酶抗体(Roche)(在含有5％乳的TBST缓冲液中1∶10000稀释)添加至孔，并在搅拌下在37℃下孵育1小时。在洗涤孔3次之后，将50μl TMB添加至孔，并将板在环境温度下孵育且避光约15分钟。然后添加50μl 1M HCl，并在450nm处测量每个孔的吸光度。然后使用GraphPad Prism软件(非线性回归分析，“一个位点特异性结合”方程)分析这些吸光度数据，以计算每个测试的scFv片段的解离常数Kd。作为比较，也对仅缓冲液进行测量。
图15中显示了对每个片段E7、F8、F10和G9获得的结果。
由此确定的解离常数Kd值列于下表5中。
表5
| scFv片段 | E7 | F8 | F10 | G9 |
| Kd(nM) | 213.4 | 211.4 | 1493 | 295.3 |
这些结果示出了根据本发明的片段对含有铜绿假单胞菌OprF蛋白的蛋白脂质体靶标具有非常好的亲和力。
D/根据本发明的scFv片段在细胞中的中和能力的确定
在本实验中测试了片段E7、F8和G9，以确定其在MOI(感染复数)为10时对于用铜绿假单胞菌(CHA菌株)感染巨噬细胞的中和能力。
实施了以下方案：
-添加佛波醇肉豆蔻乙酸酯(PMA)后THP-1细胞(人单核细胞系)分化为巨噬细胞：将15μl PMA(0.1mg/ml储备液)添加至10ml混悬于含有10％去补体胎牛血清(dFCS)的RPMI培养基中的THP-1细胞(440,000个细胞/ml)；将培养皿T25在37℃(含5％CO2的气氛)的烘箱中孵育至少48小时，以使THP-1细胞分化为贴壁巨噬细胞；
-铜绿假单胞菌(CHA菌株)的培养和制备：从置于10ml LB培养基中的少量细菌甘油储备液开始培养铜绿假单胞菌细菌(CHA菌株)；将细菌培养物在搅拌下于37℃孵育过夜；在LB培养基中稀释培养物，直到在1ml培养物中获得在600nm处等于0.5的光密度测量值(6×108CFU/ml)；以4000g离心5分钟；去除上清液并将沉淀重悬于1ml RPMI-10％dFCS培养基中；以4000g进行第二次离心5分钟；去除上清液并将沉淀重悬于1ml RPMI-10％dFCS培养基中；在同一培养基中稀释以获得含有15,000,000个细菌/ml的混悬液；将以下在37℃下孵育2小时：35μl铜绿假单胞菌混悬液+35μl PBS中的scFv E7(0.453mg/ml)、35μl铜绿假单胞菌混悬液+35μl PBS中的scFv F8(0.333mg/ml)、35μl铜绿假单胞菌混悬液+35μl PBS中的scFv G9(0.570mg/ml)、35μl铜绿假单胞菌混悬液；
-巨噬细胞的制备：去除培养上清液；添加2ml Versene以分离贴壁细胞；在分离细胞层(tapis cellulaire)之后，添加2ml培养基并回收细胞；以400g离心5分钟；将细胞沉淀重悬于2ml培养基中并计数细胞；将细胞混悬液填充至96孔板的孔中，以获得15,000个细胞/孔，并添加必要量的RPMI-10％dFCS培养基，以获得下表6中指定的最终体积：
表6-M表示巨噬细胞
-根据乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)测定试剂盒“
LDH细胞毒性测定试剂盒”说明中限定的方案，完成用于定量培养基中细胞LDH(乳酸脱氢酶)释放的细胞毒性测试：将10μl无菌PBS添加至A、B、C排的第1至5号孔和D、E、F排的第1号孔；将10μl铜绿假单胞菌(Pa)添加至A、B、C排的第3号孔和D、E、F排的第1号孔；添加20μl以下混合物：Pa+F8至D、E、F排的第2号孔，Pa+G9至D、E、F排的第3号孔，Pa+E7至D、E、F排的第4号孔；添加10μl超纯无菌水至A、B、C排的第1和3号孔；将板在37℃的烘箱中(含5％CO2的气氛)孵育16小时；添加10μl裂解缓冲液(10×)至A、B、C排的第2号和5号孔；在37℃的烘箱中(含5％CO2的气氛)孵育45分钟；将板在250g下离心3分钟；将来自每个孔的50μl转移至新的96孔板；向每个孔添加50μl反应混合物；将板在环境温度下避光孵育30分钟；向每孔添加50μl中止溶液；测量每个孔在490和680nm处的吸光度；吸光度值相减：A490nm-A680nm。
获得的结果显示在图16中。在根据本发明的ScFv片段存在下，观察到铜绿假单胞菌对于巨噬细胞的细胞毒性降低了大约2/3。这证明了这些片段针对铜绿假单胞菌的中和作用。
E/含有铜绿假单胞菌OprF蛋白的蛋白脂质体的分析已用于获得根据本发明的 ScFv
对描述于以上A/的实验中获得的蛋白脂质体进行以下分析。
E.1/材料和方法
用胰蛋白酶消化-使用重量比为1∶10的胰蛋白酶：蛋白质在环境温度(RT)下蛋白水解通过在蔗糖梯度中离心来纯化的OprF蛋白脂质体(LC1)。在不同时间取回样品并加载至SDS-PAGE凝胶上用于随后的Western印迹分析。
负染色电子显微术-使用网格负染色(SOG)技术制备样品。将在没有DNA的反应混合物中孵育的10μL OprF蛋白脂质体(LC1，[OprF]：0.1mg/mL)或10μL脂质体(4mg/mL)(＝阴性对照)添加至涂有碳膜的辉光放电栅极3分钟，并用50μl磷钨酸(PTA，在蒸馏水中的1％)对网格染色2分钟。用滤纸吸收多余的溶液并将网格风干。使用CCD Gatan
1000相机在Tecnai 12LaB6电子显微镜上以120kV的加速电压在低剂量条件
下拍摄图像，散焦值为1.2至2.5μm。使用开源图像处理程序ImageJ确定平均孔径。
AFM尖端功能化-在0.1mM NTA-SAM(Prochimia)的乙醇溶液中孵育过夜之后，用NTA-SAM包被金色尖端(NPG-10，Bruker Nano AXS)。然后，用大量乙醇清洗尖端，在氮气下干燥并在PBS溶液中的40mM NiSO4中孵育1小时，并且在0至5℃下储存。
基于力/距离(FD)的AFM-
AFM(Bruker)用于“PeakForceTapping”模式。选择了标称弹簧常数为约0.06至0.12N.m-1且在水中共振频率为约18kHz的矩形悬臂梁。所有AFM实验均在环境温度(约24℃)下的成像缓冲溶液中进行。通过在0.25kHz、振幅为25nm和施加100pN的成像力下振荡功能化尖端获得附着图表。通过每秒0.125行数字化来执行128×128或256×256像素的拓扑形态(topographies)。回缩速度为1500nm/秒，而且尖端与样品之间的接触时间为500ms。
数据分析
每个交互识别实验的力/距离(FD)曲线以文本文件格式保存和导出。NanoScopeAnalysis v1.9和BiomecaAnalysis用于将力/时间曲线转换为显示特定附着事件的FD曲线。然后基于蠕虫状链(Worm Like Chain，WLC)模型分析获得的力/距离曲线。该模型最适合和最常用于描述多肽的延伸。大分子的延伸z与回缩力Fadh通过以下等式相关联：
其中持久长度lp是链刚度的直接测量值，lc是生物大分子的总轮廓长度，并且KB是玻尔兹曼常数。
然后，多肽链中的单体数量源自以下等式：
E.2/通过AFM(原子力显微术)测定脂质体膜中OprF蛋白的方向
将OprF蛋白脂质体样品吸附在云母表面上，并使用由结合OprF的N端多聚组氨酸标签的Tris-Ni+-NTA基团功能化的探针通过AFM分析。AFM分析在使用和不使用
X-100去污剂的情况下进行。
1×溶液用于溶解脂质体膜的OprF蛋白，从而暴露位于脂质体内部的所有多聚组氨酸标签，并使其能够被功能化探针结合。使用和不使用
X-100获得的拓扑图像显示出样品表面上的OprF蛋白脂质体。在无
存在的情况下，功能化探针与OprF的N端多聚组氨酸标签之间的特异性附着现象很少发生在蛋白脂质体的表面上，如显示80至150pN附着力的相应附着图表所示。另一方面，在存在
的情况下，检测到许多特定的附着事件。平均而言，功能化探针在没有
存在的情况下结合了六分之一的OprF的多聚组氨酸标签，在使用
的情况下结合了六分之五的OprF蛋白的多聚组氨酸标签，其表明OprF的N端多聚组氨酸标签主要位于脂质体内部。
E.3/通过胰蛋白酶消化和AFM确定脂质体膜中OprF蛋白的拓扑结构
对通过蔗糖梯度中超速离心纯化的OprF蛋白脂质体进行有限的蛋白水解实验，以确定OprF在脂质体膜中的拓扑结构。OprF蛋白的序列包含32个胰蛋白酶切割位点。在没有OprF膜保护的情况下，胰蛋白酶会生成重量范围为146至4649Da的肽(PeptideCutter程序)。OprF蛋白脂质体的胰蛋白酶消化结果通过Western印迹使用抗组氨酸抗体可视化，其表明OprF在脂质体中采用至少两种不同的膜拓扑结构：第一种拓扑结构，其中OprF完全插入膜中，并因此防止蛋白水解，因为与完整OprF蛋白的多聚组氨酸标签相对应的信号不会随着时间而消失；和第二种拓扑结构，其中大约只有一半的6×His-OprF蛋白整合在膜中，随时间生成了位于分子量为20至25kDa之间的较小的蛋白质片段。
这些最初的观察结果然后通过AFM证实和完善。对
1×溶液中显示出特定附着现象的力/距离(FD)曲线的分析表明，OprF在脂质体膜中采用两种不同的跨膜拓扑结构，其对应于其封闭和开放通道构象。基于WLC模型，64％的特定附着现象对应于8个跨膜结构域(封闭通道构象)，而36％的特定附着现象对应于16个跨膜结构域(开放通道构象)。
E.4/使用负染色电子显微术和AFM研究OprF在蛋白脂质体中的成孔活性
OprF蛋白脂质体的负染色电子显微术和AFM分析使得可以看到OprF在脂质体膜中的成孔活性。在电子显微术图像中，通过其中OprF为重构的脂质体的膜观察到对应于孔的一系列平均尺寸为9.5±4nm的“孔洞”。在对照脂质体的图像中没有观察到脂质体膜的这种穿孔，该对照脂质体与细胞裂解物和无DNA的无细胞系统的反应混合物一起孵育(阴性对照)。此外，OprF蛋白脂质体表面的拓扑AFM图像还显示存在被OprF蛋白包围且平均直径为10nm的孔。因此，孔的形成归因于脂质体膜中OprF蛋白的活性。
Claims (21)
1.针对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)OprF蛋白的单克隆抗体或所述抗体的功能片段，其特征在于其包含重链可变区和轻链可变区：
-所述重链可变区具有三个互补决定区(CDR)，所述CDR具有以下氨基酸序列，或与这些序列具有至少80％同一性的序列：
VH-CDR1：GYXaa1FXaa2Xaa3Xaa4G(SEQ ID NO：1)，其中Xaa1是苏氨酸残基或丝氨酸残基，Xaa2是丝氨酸残基或天冬酰胺残基，Xaa3是精氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，并且Xaa4是苯丙氨酸残基或酪氨酸残基，
VH-CDR2：INAXaa5TGKXaa6(SEQ ID NO：2)，其中Xaa5是谷氨酸残基或天冬氨酸残基，并且Xaa6是丙氨酸残基或丝氨酸残基，
VH-CDR3：VR，
-所述轻链可变区具有三个CDR，所述CDR具有以下氨基酸序列，或与这些序列具有至少80％同一性的序列：
VL-CDR1：SSVXaa7TXaa8Xaa9(SEQ ID NO：3)，其中Xaa7是苏氨酸残基、天冬酰胺残基、丝氨酸残基、丙氨酸残基或精氨酸残基，Xaa8是天冬酰胺残基、甘氨酸残基或丝氨酸残基，并且Xaa9是酪氨酸残基或苯丙氨酸残基，
VL-CDR2：Xaa10TS，其中Xaa10是甘氨酸残基、精氨酸残基或丙氨酸残基，
VL-CDR3：QQGXaa11Xaa12Xaa13(SEQ ID NO：4)，其中Xaa11是组氨酸残基或天冬酰胺残基，Xaa12是丝氨酸残基或苏氨酸残基，并且Xaa13是缬氨酸残基或异亮氨酸残基。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或所述抗体的功能片段，其中Xaa3是精氨酸残基并且Xaa6是丙氨酸残基。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的单克隆抗体或所述抗体的功能片段，其中Xaa1为苏氨酸残基，Xaa5为谷氨酸残基，并且Xaa13为缬氨酸残基。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的单克隆抗体或所述抗体的功能片段，其中
-所述重链可变区的互补决定区(CDR)具有以下相应的氨基酸序列，或与这些序列具有至少80％同一性的序列：
VH-CDR1：GYTFSRFG(SEQ ID NO：5)
VH-CDR2：INAETGKA(SEQ ID NO：12)
VH-CDR3：VR
-和/或所述轻链可变区的互补决定区(CDR)具有以下相应的氨基酸序列，或与这些序列具有至少80％同一性的序列：
VL-CDR1：SSVTTNY(SEQ ID NO：16)
VL-CDR2：GTS
VL-CDR3：QQGHSV(SEQ ID NO：24)。
5.根据权利要求1所述的单克隆抗体或所述抗体的功能片段，其中：
-所述重链可变区的互补决定区(CDR)具有以下相应的氨基酸序列，或与这些序列具有至少80％同一性的序列：
VH-CDR1：GYSFSSYG(SEQ ID NO：6)
VH-CDR2：INADTGKS(SEQ ID NO：13)
VH-CDR3：VR
-和/或所述轻链可变区的互补决定区(CDR)具有以下相应的氨基酸序列，或与这些序列具有至少80％同一性的序列：
VL-CDR1：SSVTTGY(SEQ ID NO：17)或SSVTTNY(SEQ ID NO：16)
VL-CDR2：GTS
VL-CDR3：QQGHTI(SEQ ID NO：25)或QQGNTI(SEQ ID NO：26)。
6.根据权利要求1所述的单克隆抗体或所述抗体的功能片段，其中：
-所述重链可变区的互补决定区(CDR)具有以下相应的氨基酸序列，或与这些序列具有至少80％同一性的序列：
VH-CDR1：GYSFSTYG(SEQ ID NO：7)或GYSFSRYG(SEQ ID NO：8)
VH-CDR2：INADTGKS(SEQ ID NO：13)或INADTGKA(SEQ ID NO：14)
VH-CDR3：VR
-和/或所述轻链可变区的互补决定区(CDR)具有以下相应的氨基酸序列，或与这些序列具有至少80％同一性的序列：
VL-CDR1：SSVNTNY(SEQ ID NO：18)或SSVTTGY(SEQ ID NO：17)或SSVTTNY(SEQ ID NO：16)
VL-CDR2：GTS
VL-CDR3：QQGHTI(SEQ ID NO：25)或QQGNTI(SEQ ID NO：26)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或所述抗体的功能片段，其由单链可变片段(scFv)组成。
8.根据权利要求7所述的单克隆抗体或所述抗体的功能片段，其中所述重链可变部分和所述轻链可变部分通过结合肽结合。
9.根据权利要求8所述的单克隆抗体或所述抗体的功能片段，其特征在于其包含选自所述以下序列对的序列对，或与这些序列对之一具有至少80％同一性的序列对：SEQ IDNO：28和SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33、SEQID NO：34和SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44和SEQ IDNO：45、SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的单克隆抗体或所述抗体的功能片段，其特征在于，其由嵌合或人源化的抗体或抗体片段组成。
11.核酸分子，其编码根据权利要求1至10中任一项所述的单克隆抗体或所述抗体的功能片段。
12.表达载体，其包含根据权利要求11所述的核酸分子。
13.宿主细胞，其包含根据权利要求11所述的核酸分子或根据权利要求12所述的表达载体。
14.用于制备根据权利要求1至10中任一项所述的单克隆抗体或所述抗体的功能片段的方法，其特征在于其包括在能够表达所述单克隆抗体或所述抗体的片段的条件下培养根据权利要求13所述的宿主细胞，以及回收由此产生的所述抗体或所述抗体的功能片段。
15.用于制备根据权利要求1至10任一项所述的单克隆抗体或所述抗体的功能片段的方法，其特征在于其包括以下连续步骤：
-产生含有铜绿假单胞菌OprF蛋白的蛋白脂质体，
-用所述蛋白脂质体接种非人哺乳动物，特别是食蟹猴(Macaca fascicularis)物种，
-从提取自所述哺乳动物的细胞的RNA构建抗体或抗体片段的库，
-通过表达技术，特别是噬菌体展示，对于所述蛋白脂质体筛选所述库，
-以及选择对于所述蛋白脂质体具有反应性的克隆。
16.用于对抗细菌感染的药物组合物，其包含在可药用载剂中作为活性物质的根据权利要求1至10中任一项所述的单克隆抗体或所述抗体的功能片段。
17.根据权利要求1至10中任一项所述的单克隆抗体或所述抗体的功能片段，其用作药物。
18.根据权利要求17所述的单克隆抗体或所述抗体的功能片段，其用于对抗细菌性铜绿假单胞菌感染。
19.根据权利要求18所述的单克隆抗体或所述抗体的功能片段，其用于对抗肺部感染。
20.根据权利要求1至10中任一项所述的单克隆抗体或所述抗体的功能片段用于在体外或离体检测来自个体体液中的细菌铜绿假单胞菌的用途。
21.用于在体外或离体检测来自个体体液中的细菌铜绿假单胞菌的试剂盒，其包含根据权利要求1至10中任一项所述的单克隆抗体或所述抗体的功能片段，以及实施用于通过所述单克隆抗体或所述抗体的功能片段在体外或离体检测来自个体体液中的细菌铜绿假单胞菌之方法的说明书。
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