KR102180731B1 - 탄저독소 중화 항체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 탄저균 방어항원의 도메인 4에 대하여 높은 결합 특이성을 갖고, 탄저독소에 대해 중화능이 우수하며, 경쇄 셔플링을 통해 생산성이 크게 향상된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 항체를 포함하는 탄저병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

탄저독소 중화 항체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 {Antibodies for neutralizing anthrax toxin and pharmaceutical composition comprising the same}

본 발명은 탄저병(anthrax)의 원인균인 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis, 이하 “탄저균”)의 방어항원(protective antigen, “PA”로 약칭)의 도메인 4에 대한 결합 특이성 및 독소 중화능이 우수하고, 경쇄 셔플링(light chain shuffling)을 통해 생산성이 향상된 항체에 관한 것이다. 또한, 상기 항체를 포함하는 탄저병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

탄저균은 그람 양성균이고, 막대 모양이며, 캡슐화되고 포자를 형성하는 박테리아로서, 탄저병의 원인균이다. 탄저균 감염에 의해 발생하는 급성질환인 탄저병은 감염초기에는 독감과 비슷한 증상을 나타내나, 2~5일이 지나면서 고열, 오한, 볼과 목부위의 부종, 격막 확장, 흉막 삼출, 출혈성 수막염 등의 급성 증상들이 나타나고, 곧이어 심한 균혈증, 뇌척수막하 출혈과 함께 호흡기능의 상실로 일반적으로 24시간 이내에 사망하게 된다.

피부접촉, 오염된 음식물 섭취, 및 호흡기를 통한 흡입 등으로 감염될 수 있으며, 탄저포자의 흡입에 의한 호흡기 감염이 가장 치명적인 감염형태이다. 호흡기 감염시, 탄저포자는 폐의 대식세포에 의해 섭취되어 대식세포에서 발아하여 영양세포로 발생하고 세포 밖으로 나와 활발하게 증식하면서 많은 양의 외독소를 분비하며 혈류를 통해 전신으로 감염시킨다. 탄저포자 호흡기 감염시 즉각적인 치료를 받지 않을 경우 80% 이상의 높은 치사율을 나타낸다.

탄저균에 의한 질병 유발에 중요한 역할을 하는 독성인자에는 2가지가 있으며, 그 중 하나는 pXO1 플라스미드에서 만들어지는 독소 단백질이고, 다른 하나는 pXO2 플라스미드에 존재하는 유전자들에 의해 합성되는 탄저 캡슐의 주요 구성물인 poly-γ-D-glutamic acid(PGA)이다.

pXO1 플라스미드에서 만들어지는 독소 단백질은 방어항원, 치사요소(lethal factor, “LF”로 약칭) 및 부종요소(edema factor, “EF”로 약칭)로 구성되어 있으며, 치사요소 및 부종요소는 방어항원에 경쟁적으로 결합한다. 방어항원은 4개의 폴딩 도메인(folding domain) 즉, 도메인 1, 도메인 2, 도메인 3 및 도메인 4로 구성되어 있다. 도메인 1(PD1)은 치사요소 또는 부종요소의 결합을 위한 프로테아제 절단 부위를 포함하고, 도메인 2(PD2) 및 도메인 3(PD3)은 방어항원의 올리고머화에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 도메인 4(PD4)는 숙주 세포 수용체 결합 부위이다.

방어항원은 도메인 4를 통해 세포 표면에 존재하는 탄저독소의 수용체에 결합하며, 그 후 세포 표면에 존재하는 퓨린 유사 프로테아제에 의해 도메인 1의 N 말단이 잘려나가면서 PA₆₃ 형태로 활성화된다. 활성화된 PA₆₃은 7량체화(heptamerization)되어, 부종요소 및 치사요소가 결합할 수 있는 부위를 갖게 된다. 방어항원과 치사요소가 결합한 것을 치사독소(lethal toxin, “LT”)라 하고, 방원항원과 부종요소가 결합한 것을 부종독소(edema toxin, “ET”)라 한다. 방어항원과 결합한 치사요소 또는 부종요소는 방어항원과 결합한 복합체 상태로 세포 내부로 엔도사이토시스(endocytosis)되어, 세포 내로 전달된다.

이러한 탄저병의 예방 또는 치료를 위해 탄저백신 및 항생제가 사용되고 있다.

탄저백신은 탄저생물무기에 대한 대비책의 일환으로 1940년대부터 연구되어 왔으며, 미국의 경우 AVA 또는 Biothrax라 불리는 방어항원을 주성분으로 한 무세포 성분백신이 1970년에 허가 받아 사용되고 있다. Biothrax는 독소는 분비하나 캡슐은 생산하지 않는 비병원성 탄저균 V770-NR1-R의 배양여과액을 수산화알루미늄(aluminum hydroxide)에 흡착시켜 제조한 것이다. 그러나, 일부 동물에서 탄저균 중 일부에 제한된 예방 효과를 제공하고 있으며, 탄저병의 중요한 요소인 영양세포의 증식을 억제하지 못하는 문제점을 가지고, 백신 접종 횟수가 18개월 동안 5회 내지 6회나 이루어져야 하고, 면역을 유지하기 위하여 매년 계속적인 추가 접종이 필요한 단점을 갖는다. 또한, 백신제조 과정에서 다른 독소인 부종요소와 치사요소 등의 불순물이 포함될 수 있고, 품질이 일정하게 유지되지 못하여 면역유도 효과 및 부작용 발생에 많은 편차가 발생하는 문제점이 있다. 따라서 현재 미국에서는 방어항원을 주성분으로 하는 차세대 백신을 개발하여 시험 중에 있다.

영국에서도 비병원성 탄저균 스턴(Sterne) 균주의 배양 여과액을 백반(alum)으로 침전시켜 얻은 Biothrax와 유사한 백신을 개발하였으나 Biothrax 보다 더 많은 양의 치사요소와 부종요소가 포함되어 있는 것으로 알려져 있다.

현재 탄저균 감염에 대한 항생제 치료법으로 시프로플록사신(ciprofloxacin), 독시사이클린(doxycycline) 및 페니실린(penicillin)과 같은 여러 항생제들이 사용되고 있다. 그러나, 이는 60일 이상 장기간 투여해야 하는 어려움이 있고, 영양세포 증식과 함께 분비되는 탄저독소에 대해서는 효과를 나타내지 않는다는 한계점이 존재한다. 또한, 항생제에 내성을 가진 탄저균일 경우, 이들 항생제조차도 효과를 보이지 않으며, 항생제는 탄저 독소의 작용을 억제하는 것은 아니므로, 감염 초기에 투여되지 않는 이상 치료 효과를 나타내기 어렵다는 제한도 있다.

따라서 최근에는 중화능을 가진 항체의 수동 면역법이 탄저병 치료법으로 제안되었다. Human Genome Sciences사의 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리(human antibody phage display library)로부터 얻은 방어항원에 대한 인간유래 단일클론 항체인 Raxibacumab의 경우, 2012년 미국 FDA 승인을 받은 탄저균 치료용 항체이다. 최근 FDA의 승인을 얻은 Obiltoxaximab(Anthim)은 방어항원에 대한 인간화 마우스 단일클론 항체이다.

선행기술인 한국 공개특허공보 제10-2006-0097526호는 탄저균 치사요소의 도메인 Ⅲ을 특이적으로 인지하고, 치사요소 및 치사독소에 결합 가능한 단일클론 항체를 개시하고 있다. 다른 선행기술인 한국 등록특허 제10-0974485호는 탄저균 방어항원과 복합체를 형성하는 분자에 관한 것으로서, 특히 방어항원의 C-말단 도메인에 특이적으로 반응하는 방어항원 항체, 치사요소의 도메인 Ⅲ에 특이적인 치사인자 항체 및 이를 포함하는 조성물에 대하여 개시하고 있다. 그러나, 탄저독소의 숙주세포로의 침입을 저해하기 위한 가장 효율적인 타겟으로 여겨지는 방어항원의 도메인 4(PD4)에 대한 단일클론 항체에 대한 것은 아니다.

따라서, 본 발명자들은 탄저독소의 항원 결정기가 도메인 4에 위치하고 있어, PD4가 탄저병 치료제의 가장 유망한 표적으로, 이에 대한 항체를 발견하기 위하여 지속적으로 연구를 거듭하여 본 발명을 완성하게 되었다. 또한, 최근 연구 및 결과에서는 탄저병을 비롯한 많은 전염병에서 단일클론 항체들의 칵테일 요법이 단일클론 항체의 개별 요법보다 더 나은 치료 효과를 제공할 수 있음을 시사하고 있다. 따라서, 이미 개발된 단일클론 항체들과 더불어 칵테일 요법에 사용되거나 또는 단독으로 사용될 수 있고, 탄저균의 방어항원도메인 4(PD4)에 대한 결합 특이성 및 독소 중화능이 모두 우수하면서도, 생산성이 향상된 탄저병 치료용 단일클론 항체를 개발하게 되었다.

(선행문헌 1) 대한민국 공개특허공보 제10-2006-0097526호 (선행문헌 2) 대한민국 등록특허 제10-0974485호

탄저균은 포자의 형태로 열, 소독제 등 불리한 환경에서도 생존력이 강하며, 높은 감염성 및 치사율로 인하여 생물테러에 사용될 가능성이 높은 고위험 병원체이다. 현재 탄저균 감염에 일차적으로 처방되는 치료제는 항생제이지만, 감염 과정에서 이미 체내에 퍼진 탄저독소는 항생제로 치료할 수 없다. 따라서, 탄저균에 노출되었을 때 탄저독소를 신속하게 중화할 수 있는 치료제가 필요하다.

따라서 본 발명은 탄저독소를 중화시킬 수 있는 신규한 단일클론 항체를 제공하고자 한다.

구체적으로 본 발명의 항체는 탄저균 방어항원의 도메인 4(PD4)에 대하여 특이적으로 결합하고, 높은 독소 중화능을 가지며, 매우 향상된 생산성을 갖는다.

또한 본 발명은 상기 항체를 포함하는 탄저병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하고자 한다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명자는 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 이용하여 탄저균의 독소를 중화하는 인간 항체를 개발하였다.

탄저독소를 구성하는 단백질 중 하나인 방어항원에 특이적으로 결합하는 scFv 항체를 바이오패닝(biopanning)을 통해 선별하였으며, 이를 인간 면역글로불린(IgG)으로 전환한 항체를 제조하였다. 또한 경쇄 셔플링을 통하여 항체의 생산성을 크게 향상시킬 수 있음을 발견하였고, 이러한 항체가 탄저독소 및 포자 공격에 대한 중화능도 우수함을 확인하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

구체적으로, 본 발명은 서열번호 1의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 4의 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는, 탄저독소 중화 활성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

본 발명은 서열번호 2의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 4의 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는, 탄저독소 중화 활성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

본 발명은 서열번호 3의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 4의 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는, 탄저독소 중화 활성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 5의 서열을 갖는 CDRL1, 서열번호 6의 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호 7의 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 8의 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호 9의 서열을 갖는 CDRH2, 및 서열번호 10의 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는, 탄저독소에 중화 활성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

본 발명은 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다.

본 발명은 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 상기 발현 벡터로 형질 전환된 분리된 세포를 제공한다.

본 발명은 상기 항체를 포함하는 탄저병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 탄저병 치료용 항체는 탄저균 방어항원의 도메인 4에 대하여 높은 결합 특이성을 갖고 탄저독소에 대한 중화능이 우수하며, 생산성이 뛰어나므로 탄저병의 예방 또는 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 선별된 항체들의 독소 중화능을 나타낸 것이다.
도 2는 7A3 및 7B1 항체에 의한 PA와 세포의 결합 억제효과 측정치의 평균값을 나타낸 것이다.
도 3은 7B1 및 경쇄 셔플링된 항체의 독소 중화능을 나타낸 것이다.
도 4는 7B1 및 그것의 경쇄 셔플링된 항체들의 의한 PA와 세포의 결합 억제효과 측정치의 평균값을 나타낸 것이다.
도 5는 동물 모델에서 항체의 탄저 독소 중화능을 나타낸 것이다.
도 6은 동물 모델에서 항체의 탄저 포자 중화능을 나타낸 것이다.

본 명세서에서 “항체”는 탄저균의 방어항원 도메인과 같은 항원에 특이적으로 결합하고 인식하는 폴리펩티드를 의미한다. 본 발명은 탄저균의 방어항원 도메인에 결합하는 완전한 항체 형태뿐만 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함한다.

본 명세서에서 “항원 결합 단편”은 항체 분자, 또는 이의 일부분 또는 부위, 또는 이의 파생물이며, 상응하는 전장 항체의 항원 결합의 모든 또는 중요한 부분을 보유하고 있다. 항원 결합 단편은 중쇄 가변영역(V_H), 경쇄 가변영역(V_L), 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 중쇄 및 경쇄의 가변영역(V_H 및 V_L)은 "상보성 결정 부위(complementarity-determining region, CDR)"라고 하는 매우 가변적인 3개의 영역을 포함한다. CDR은 항원의 에피토프(epitope)에 결합하며, 경쇄 및 중쇄의 CDR은 전형적으로 3개의 영역(CDR1, CDR2, 및 CDR3)을 갖는다.

본 명세서에서 “항체 또는 이의 항원 결합 단편”은 전장 또는 원래 그대로의 다클론(polyclonal) 또는 단일클론(monoclonal) 항체뿐만 아니라, 이의 항원 결합 단편들, 하나 이상의 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화 항체, 키메라 항체, 미니바디, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일 체인 항체, 다중특이적 항체(예컨대, 이중특이적 항체), 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역 글로불린 분자의 다른 변형된 배열형태로서 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체 및 공유결합으로 변형된 항체를 포함한다. 상기 “항원 결합 단편”은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab′)₂ 단편, Fv 단편, scFv 단편, (scFv)₂ 단편 및 도메인 항체를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 "전장 항체"는 2개의 "전장 항체 중쇄" 및 2개의 "전장 항체 경쇄"로 이루어지는 항체를 의미한다. "전장 항체 중쇄"는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항체 중쇄 가변 영역(V_H), 항체 불변 중쇄 영역1(C_H1), 항체 힌지 영역(HR), 항체 중쇄 불변 영역 2(C_H2) 및 항체 중쇄 불변 영역 3(C_H3)으로 이루어지는 폴리펩티드이다. "전장 항체 경쇄"는 N-말단에서 C-말단 방향으로 항체 경쇄 가변 영역(V_L) 및 항체 경쇄 불변 영역(C_L)로 이루어지는 폴리펩티드이다. 전형적인 전장 항체 클래스는 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM 및 IgY의 6종류이다. 이들 중 몇 개는 서브클래스(sub class)로 더 나누어질 수 있는데, 예컨대 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂가 있다.

본 명세서에서 “단일클론 항체”는 1가의 친화성(결합성)을 가지는 항체를 나타내며, 단일클론 항체의 샘플 내에 있는 각 항체 분자가 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 것을 의미하는 것이며, 특유의 모세포(예를 들어 하이브리도마 세포주)의 클론인 동일한 면역 세포를 이용하여 만들 수 있다. 참고적으로 “다클론 항체”는 특정 항원에 대해 반응하는 항체들의 집합을 의미하며, 집합 내에서 그들은 다른 항체 분자, 예컨대 항원의 서로 다른 에피토프에 반응하는 항체 분자일 수 있다.

본 명세서에서 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩티드 결정인자를 포함하고, 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역이다. 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐과 같은 분자들의 화학적 활성 표면군들을 포함할 수 있고, 또한 특정한 3차원 구조 특징 및/또는 특정한 전하 특징을 가질 수 있다.

본 명세서에서 “인간 항체”는 인간으로부터 얻어지거나 기원하는 항체에 실질적으로 상응하는 가변 및 불변영역을 가지는 항체를 의미한다.

본 명세서에서 “파지 디스플레이”는 1985년 G. Smith에 의해 처음 도입된 개념으로, 1990년 영국 MRC에 의해 처음으로 항체의 제조에 응용된 기술이다. “박테리오파지(bacteriophage)”란 대장균(Escherichia coli)에 기생하는 바이러스의 일종으로, 주로 실사형 박테리오파지(filamentous bacteriophage)인 M13이 사용되고 있다. “항체의 파지 디스플레이”는 인체 내에 존재하는 수많은 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 각각 PCR로 증폭시켜 phagemid vector 안에 들어있는 파지 표면 단백질에 융합시킨 형태로 클로닝하여 대장균에서 발현시킨 후 헬퍼(helper) 파지를 감염시키면, 파지의 표면에 디스플레이된 다양한 조합의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 항체 라이브러리를 제작할 수 있는 기술을 의미한다. 이때 사용하는 항체의 형태는 scFv나 Fab일 수 있다. 상기 라이브러리로부터 패닝 과정에 의해 특정 항원에 결합하는 인간 단일클론 항체를 분리 및 제조할 수 있다.

본 명세서에서 “패닝(panning)”은 타겟 항원(target antigen)에 파지를 결합시키고 결합하지 않은 파지를 제거한 후, 결합된 파지를 회수하여 대장균에 감염시킴으로써 파지 수를 증폭하고, 이 과정을 2-4회 반복하는 과정이다. 상기 기술을 이용하면 단 몇 주만에 인간 단일클론 항체를 분리할 수 있다.

본 명세서에서 "핵산(nucleic acids)"은 DNA(gDNA 및 cDNA) 또는 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다.

본 명세서에서 “클로닝(cloning)”은 동일한 유전자를 대량 생산하는 유전 공학기술로, 유전자 또는 DNA 절편을 대량 생산하기 위하여 벡터(vector)로 작용하는 플라스미드 또는 바이러스에 도입하여 세포분열을 통하여 유전적으로 동일한 클론을 복제하는 기술을 의미한다.

본 명세서에서 "클론(clone)”은 동일한 복제물을 의미하는 것으로, 동일한 세포집단 또는 특정 유전자 절편의 동일한 복제물을 뜻한다.

본 발명에서 "벡터"는 적당한 숙주세포로 외래 유전자를 도입하여 외래 유전자가 발현될 수 있게 하는 수단으로써, 스스로 자신을 복제할 수 있는 플라스미드(plasmid) 벡터, 코즈미드(cosmid) 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 등을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 "형질전환(transformation)"은 외래 유전자를 숙주 세포로 도입하여 숙주 세포의 유전적인 성질이 변하는 것을 의미하고, 숙주가 진핵세포인 경우에는 “형질주입(transfection)”이라는 용어를 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 형질전환은 외래 유전자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 모든 방법을 포함할 수 있고, 바람직하게는 외래 유전자를 대장균에 도입하는 것을 의미하는 것일 수 있다. 형질전환하는 방법으로는 전기천공법, 리포좀을 이용한 방법, Ca⁺⁺을 이용한 DNA 운반 방법 등 당업계에서 일반적으로 쓰이는 방법을 사용할 수 있다.

본 명세서에서 “중화능(neutralizing capacity)”은 항체가 특정한 항원에 결합하여 원인균의 감염능력을 억제하는 능력을 의미한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다.

[실시예 1]

균주 및 방어항원의 준비

탄저균 스턴 균주를 뇌-심장침출(BHI) 배지(Difco)에서 배양하였고, 정제된 방어항원(PA)은 한국 녹십자사로부터 제공받았다. 탄저균 치사요소(LF)는 'List Biological Laboratories'로부터 구입하였다. 마우스 마이크로파지 유사 세포주인 J774A.1는 'American Type Culture Collection (ATCC, USA)'에서 구입하였고, 문헌(J. Jang, The poly-gamma-D-glutamic acid capsule of Bacillus anthracis enhances lethal toxin activity, Infect Immun, 79 (2011) 3846-3854)에 기재된 방법에 따라 배양하였다.

[실시예 2]

스크리닝 및 경쇄 셔플링

PA(한국 녹십자사)에 대한 파지-scFv 바이오 패닝 과정에서 Ymax-ABL Library(Y-Biologics, 한국)를 사용하였다. 이 라이브러리를 3 라운드의 패닝 과정에 적용하였고, 각 라운드마다 효소결합면역흡착분석(ELISA)으로 결합 특이성을 확인하여 선별하였다. 선별된 단일클론 파지-scFv 클론을 N293F 벡터(Y-Biologics, 한국)를 사용하여 인간 IgG 유전자로 전환시키고, HEK293F 세포에서 발현시켜 전장 인간 IgG를 생성시켰다. 재조합 항체는 단백질 A 친화 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 항체의 농도를 280nm에서의 흡광도를 이용하여 측정하였다(NanoDrop, Thermo Fisher Scientific).

독소 중화능이 가장 뛰어난 것으로 확인된 항체 7B1의 결합성 및 생산성을 향상시키기 위하여 경쇄 셔플링(light chain shuffling)을 수행하였다. 인간 시토졸 단백질(Y-Biologics, 한국)에 대하여 생성된 다른 파지-scFv 라이브러리의 DNA 단편을 BstXI로 절단하고 동일한 제한 효소로 절단된 7B1의 경쇄 DNA backbone에 연결하여 7B1의 경쇄 셔플링 라이브러리를 생성하였다.

3 라운드의 바이오 패닝 과정을 통해 PA에 대한 높은 결합성을 갖는 단일클론 파지-scFv 클론을 선별하였고, 인간 IgG 형태로 전환하였다. PA에 대한 항체의 결합 친화성을 Bio-Layer 간섭측정기(Octet QKe, ForteBio Inc.)로 분석했다.

[실시예 3]

PA 도메인에 대한 항체 특이성의 결정

PD1은 'List Biological Laboratories'에서 구입하였고, PD3 및 PD4는 문헌(D.A. Sarkes, Cloning and Expressing Recombinant Protective Antigen Domains of B. anthracis, Army Research Laboratory, 2011)에 기재된 방법에 따라 개별적으로 발현시키고 정제하였다. 각 PA 도메인에 대한 항체의 특이성을 ELISA로 확인하였다.

[실시예 4]

독소 중화능 분석 (Toxin neutralization assay, TNA)

시험관 내에서 치사독소(LT)(0.8μg/ml의 PA 및 0.1μg/ml의 LF)에 대한 PA 특이적 hMAbs(human monoclonal antibodies)의 중화능을 평가하기 위해, J774A.1 세포에 의한 LT 매개(LT-mediated) 세포 독성 실험을 hMAbs를 첨가하면서 수행하였으며 세포 생존능을 문헌(J.H. Chun, Serological Correlate of Protection in Guinea Pigs for a Recombinant Protective Antigen Anthrax Vaccine Produced from Bacillus brevis, Osong Public Health Res Perspect, 3 (2012) 170-176)에 기재된 방법에 따라 측정하였다.

96-well flat bottom 조직 배양 플레이트(SPL Plastic Labware, 한국)에서 J774A.1 세포(1.5×10⁵ cells/well)를 10%의 FBS(fetal bovine serum, GIBCO Life Technologies, 독일)가 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, GIBCO Life Technologies, 독일)에서 2시간 동안 37℃ 조건 하에 배양하였다. LT는 37℃에서 1시간 동안 2배 희석한 hMAbs와 예비 배양하였다. LT-hMAbs 혼합물을 세포 배양 배지에 첨가하고 5% CO₂ 조건, 37℃에서 4시간 동안 추가로 배양하였다.

배양 후, 각 웰에 50㎕의 MTT(3-[4,5-dimethylthylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide, Sigma-Aldrich)를 최종 농도 0.5mg/ml로 첨가했다. 37℃에서 1시간 후, 상기 세포를 추출 완충액에 용해시켰다. 각 웰의 흡광도를 570-690nm에서 측정하였다. 투여 개체수의 50%에 대한 중화 유효 투여량(ED₅₀)은 SoftMax Pro 5.3(Molecular Device, USA)을 사용하여 4-parameter logistic equation algorithm으로 구하였다.

[실시예 5]

항-PA hMAbs에 의한 PA와 세포의 결합 억제 분석

항-PA hMAbs(5μg/ml)을 1μg/ml의 FITC(fluorescein isothiocyanate)로 컨쥬게이트된(conjugated) PA₆₃(C-terminal fragment of PA, 63 kDa, List Biological Laboratories, CA, USA)과 함께 무혈청의 DMEM 배지에서 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 이 혼합물을 12-well 플레이트에 있는 J774A.1 세포(1 × 10⁶ cells/ml/well)에 첨가한 후, 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 결합되지 않은 PA63-FITC 또는 hMAbs를 제거하기 위해 2% FBS를 함유하는 냉각된 PBS로 세포를 세척하였다. 분리된 세포를 2% FBS를 함유하는 PBS에 재현탁시켰다. PA₆₃-FITC 결합된 세포의 형광 수준을 FACSverse 유동 세포 계측기(BD Biosciences, San Diego, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 유동 세포 계측 데이터는 Flow Jo 소프트웨어(Tree Star, San Carlos, CA, USA)를 사용하여 분석하였다.

[실시예 6]

동물 실험

6주령의 암컷 BALB/c 마우스(Central Lab. Animal Inc.)에 LT(40μg의 PA 및 20μg의 LF)와 함께 hMAbs(40μg)를 꼬리 정맥 주사하였다. 수동 전달된(passively transferred) hMAbs를 가진 6주령의 암컷 A/J 마우스(Central Lab. Animal Inc.)에 3×LD₅₀의 탄저균 스턴 포자(B. Ivins, Experimental anthrax vaccines: efficacy of adjuvants combined with protective antigen against an aerosol Bacillus anthracis spore challenge in guinea pigs, Vaccine, 13 (1995) 1779-1784에 따라 준비)를 피하 주사에 의해 감염시켰다. 마우스의 생존율을 14일 동안 추적하였으며, Reed-Muench법에 따라 측정한 A/J 마우스 모델의 피하 경로의 LD₅₀값은 1795 포자였다.

동물 연구 프로토콜(KCDC-052-17-2A)은 한국 질병관리본부의 동물실험윤리위원회의 승인을 받은 것이다. 마우스의 사육 및 관리와 관련된 절차는 한국 질병관리본부의 동물실험윤리위원회의 모든 지침과 요구 사항을 충족시켰다.

[시험예 1]

scFv-파지 라이브러리의 스크리닝 및 선별된 항체의 특성 시험

정제된 PA를 항원으로 하여 3라운드의 패닝 과정을 수행하였고, PA 코팅 플레이트 상에서 ELISA를 이용하여, PA에 대한 결합에 기초하여 5종의 클론(7A3, 7B1, 15A10, 15B3 및 15D8)을 선별하였다. 선별된 5종의 파지 클론을 scFv 형태에서 인간 IgG 형태로 전환시켰다.

5종의 hMAbs의 특성을 표 1에 나타냈다. 선별된 IgG 클론의 염기서열을 IGBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast)에 의하여 분석하였다. 모든 hMAbs는 IgG₁ 서브 클래스에 속하였고, ELISA 분석은 5종의 항체 모두가 PA 단백질을 특이적으로 인식한다는 것을 나타내었다.

PA 도메인 특이성은 재조합 PD1, PD3 및 PD4를 갖는 ELISA로 확인하였다. 7A3은 PD3에 특이적으로 결합하였고, 다른 모든 4종의 항체(7B1, 15A10, 15B3 및 15D8)는 PD4에 결합하는 것을 확인하였다.

^a중쇄의 V gene 사용.

^b중쇄의 D gene 사용.

^c경쇄의 J gene 사용.

^d경쇄의 V gene 사용.

^e경쇄의 J gene 사용.

^f중쇄 및 경쇄의 CDR3의 아미노산 서열.

^g세포 배양 배지당 재조합 항체의 최종량. 단백질 농도는 280nm에서의 흡광도로 측정함.

^h인간항체의 방어항원 도메인 특이성(subunit ELISA를 기반으로 판단함).

[시험예 2]

PA-특이 hMAbs의 LT에 대한 시험관 내 중화능 시험

LT 매개의 세포독성 활성에 대해 선별된 PA 특이 hMAbs의 독소 중화능을 평가하기 위하여, hMAbs로 예비 배양된 LT를 J774A.1 세포에 처리하였다. 세포 생존능은 4시간 처리 후 MTT 분석을 통해 평가하여 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 확인되는 바와 같이, 5종의 항체 중 7B1은 농도 의존적 독소 중화능을 나타냈다. 7A3은 저농도(0.195 및 0.390 μg/ml)에서 23~25%의 독소 중화능을 보인 반면, 고농도에서 독소 중화능이 감소하였다. 다른 모든 항체는 100μg/ml의 농도까지도 유의미한 중화 효능을 나타내지 않았다.

[시험예 3]

항-PA hMAbs에 의한 PA와 세포의 결합 억제 분석 시험

7B1 및 7A3가 세포 수용체에 대한 PA 결합을 억제하는지 여부를 결정하기 위하여, 유동세포 계측기로 세포 결합을 결정하기 전에, FITC로 컨쥬게이트된 PA₆₃(PA₆₃-FITC)을 각 항체와 함께 예비 배양하고, 실시예 5와 동일한 실험 방법으로 시험하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, PA₆₃-FITC 1μg/ml 처리군에서 PA₆₃-FITC 결합된 J774A.1 세포는 95.1%로 나타났고, 대조군인 PA₆₃-FITC 1μg/ml 및 5μg/ml IgG 처리군에서도 93.6%로 나타난 반면, 7B1 및 7A3를 처리한 군은 모두 J774A.1 세포에 대한 PA의 결합 활성도를 현저히 감소시킨 것을 확인하였다.

따라서, 가장 뛰어난 독소 중화능을 보이는 항체 7B1은 J774A.1 세포에 대한 PA 결합 억제 분석 결과에서도 약 44%의 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였으며, 이는 항체 7B1이 PD4에 결합하여 세포에 대한 PA의 결합을 억제함으로써 LT 중화 활성을 매개하는 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다.

[시험예 4]

경쇄 셔플링에 의한 항체의 제조

항체 7B1이 LT에 대해 우수한 중화능을 보였지만, 생산성은 매우 낮았다(1.8mg/L, 표 1). 따라서, 7B1의 결합 친화성 및 생산성을 향상시키기 위해 경쇄 셔플링 방식을 사용하였다.

7B1 가변 영역의 경쇄의 DNA 서열을 인간 시토졸 단백질의 항체를 위해 생성된 다른 라이브러리의 가변 영역으로 대체하고, PA-바이오패닝을 위해 발현시켰다.

3종의 항체를 PA-바이오패닝으로부터 선별하였고, 추가 분석을 위해 IgG 형태로 전환시켰다. IGBLAST로 모든 유사체(derivatives)가 원래의 항체와 동일한 V 영역 및 J 영역을 공유한다는 것을 확인하였으며, 셔플링된 항체의 특성은 하기 표 2와 같다.

^a중쇄의 V gene 사용.

^b중쇄의 D gene 사용.

^c경쇄의 J gene 사용.

^d경쇄의 V gene 사용.

^e경쇄의 J gene 사용.

^f세포 생존력 분석에 의해 측정한 50% 효과용량(ED₅₀).

^gbiolayer interferometry로 측정한 해리 상수.

^h세포 배양 배지당 재조합 항체의 최종량. 단백질 농도는 280nm에서의 흡광도로 측정함.

상기 3종의 셔플링된 항체 7B1_2D10, 7B1_2G4 및 7B1_3B4의 경쇄 및 중쇄 가변영역의 아미노산 서열과 CDR 서열을 하기 표 3 내지 6에 나타내었다.

상기 표 3 및 4에 나타낸 바와 같이, 셔플링된 항체들의 전체 서열이 7B1의 원래 서열과 다르더라도, 셔플링된 항체 7B1_2D10, 7B1_2G4 및 7B1_3B4의 경쇄 및 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 완전히 동일한 것을 알 수 있다. 상기 셔플링된 항체들의 결합력(K_D값)은 7B1과 비교하여 큰 차이는 없었으나, 생산성은 약 7 내지 25배로 증가한 것을 확인하였다.

[시험예 5]

경쇄 셔플링된 항체에 대한 시험관 내 중화능 시험

7B1 항체에 대한 시험 방법과 동일하게, 경쇄 셔플링된 항체의 독소 중화능을 평가하였다. 표 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 3종의 항체는 모두 7B1과 비교하여 13 내지 30% 감소된 ED₅₀ 값을 나타내어, 7B1 항체와 비교하여 독소 중화능이 더욱 증가한 것을 확인하였다.

[시험예 6]

경쇄 셔플링된 항체에 의한 PA와 세포의 결합 억제 분석 결과

7B1 항체에 대한 시험 방법과 동일하게, 경쇄 셔플링된 항체에 의한 PA와 세포의 결합 억제를 분석하여 도 4에 평균값을 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 경쇄 셔플링된 항체 7B1_2D10, 7B1_2G4 및 7B1_3B4의 숙주 세포 수용체에 대한 PA 결합 억제 효과는 각각 49%, 43% 및 29%로 나타났다. 또한 ELISA 분석은 3종의 경쇄 셔플링된 항체 모두가 7B1과 동일하게 재조합 PD4에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.

[시험예 7]

경쇄 셔플링한 항체 7B1_3B4의 독소 중화능 (in vivo 실험)

경쇄 셔플링된 항체들 중, 시험관 내 테스트에서 가장 높은 생산성을 나타낸 7B1_3B4에 대하여, 암컷 BALB/c 마우스(6주령, n=10) 모델에서 LT에 대한 중화능을 시험하였다.

항체(40g) 및 LT(40g의 PA 및 20g의 LF)를 꼬리 정맥 주사를 통해 마우스에 주입하고, 생존율을 2주 동안 추적하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 7B1_3B4 없이 LT를 처리한 그룹 내의 모든 마우스는 주사 후 3-4일 이내에 죽은 반면, 항체와 함께 수동 면역된 그룹은 90%(7B1_3B4 항체 주입 그룹)의 생존율을 나타내어, 항체 7B1_B4가 생체 내에서 독소 중화능을 가진다는 것을 알 수 있다.

또한, 항체 7B1_3B4의 포자에 대한 중화능을 평가하기 위해, 암컷 A/J 마우스(6주령, n=6)를 꼬리 정맥 주사를 통해 40㎍의 각 항체로 수동 면역시킨 후, 3×LD₅₀의 정제된 탄저균 포자를 피하 감염시켜, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 인간 IgG 대조군의 모든 마우스가 4일 이내에 죽었지만, 7B1_3B4로 면역된 마우스의 생존율은 33.3%였다.

결국, 본 발명은 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 탄저 독소에 대한 신규한 항체 후보 물질을 선별하고, 경쇄 셔플링을 통해 생산성을 향상시켰다. 선별된 항체들은 시험관 분석 및 동물 시험을 통하여, 우수한 독소 중화능을 갖는 것을 확인하였다.

<110> Korea Center for Disease Control and Prevention <120> ANTIBODIES FOR NEUTRALIZING ANTHRAX TOXIN AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE SAME <130> P180064 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of 7B1_2D10 <400> 1 Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu 35 40 45 Ile Ile Tyr Asp Val Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Phe Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 2 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of 7B1_2G4 <400> 2 Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Ala Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu 35 40 45 Ile Ile Tyr Asp Val Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Phe Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 3 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of 7B1_3B4 <400> 3 Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Asn Gly Ser Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu 35 40 45 Ile Ile Tyr Asp Val Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Phe Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 4 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region of 7B1_2D10, 7B1_2G4, and 7B1_3B4 <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Ile Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ala Asn Ser Tyr Ala Ala Gly Tyr Ala Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Met 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Tyr Gly Gly Leu Tyr Asp Arg Ala Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of 7B1_2D10, 7B1_2G4, and 7B1_3B4 <400> 5 Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 1 5 <210> 6 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 of 7B1_2D10, 7B1_2G4, and 7B1_3B4 <400> 6 Asp Val Thr 1 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of 7B1_2D10, 7B1_2G4, and 7B1_3B4 <400> 7 Ser Ser Tyr Ser Ser Ser Thr Phe Tyr Val 1 5 10 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of 7B1_2D10, 7B1_2G4, and 7B1_3B4 <400> 8 Gly Phe Ala Phe Ser Asp Ser Thr 1 5 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of 7B1_2D10, 7B1_2G4, and 7B1_3B4 <400> 9 Ile Arg Ser Lys Ala Asn Ser Tyr Ala Ala 1 5 10 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of 7B1_2D10, 7B1_2G4, and 7B1_3B4 <400> 10 Ala Arg Tyr Gly Gly Leu Tyr Asp Arg Ala Phe Asp Val 1 5 10

Claims (8)

1. 삭제
2. 서열번호 1의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 4의 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는, 탄저독소 중화 활성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
   
3. 서열번호 2의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 4의 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는, 탄저독소 중화활성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
   
4. 서열번호 3의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 4의 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는, 탄저독소 중화활성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
   
5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산.
   
6. 제5항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
   
7. 제6항의 발현 벡터로 형질전환된 분리된 세포.
   
8. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 탄저병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   

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