KR20100134765A

KR20100134765A - 혐기성 질환을 위한 치료제

Info

Publication number: KR20100134765A
Application number: KR1020107025820A
Authority: KR
Inventors: 타카유키 사사키; 히토미 시미즈; 유코 시마타니-시바타; 히로미 요네쿠라
Original assignee: 가부시키가이샤 아네로파마·사이엔스
Priority date: 2008-04-17
Filing date: 2009-04-17
Publication date: 2010-12-23
Also published as: US8383398B2; WO2009128272A9; EP2280717A1; WO2009128272A1; PL2280717T3; CN102046190A; HUE039768T2; CA2721664A1; JP5735804B2; JP2011518112A; JP2015091243A; KR101674977B1; CA2721664C; CA2721653A1; KR101671283B1; PT2274422T; US20130122582A1; WO2009128275A1; US20090264513A1; DK2280717T3

Abstract

본 발명은 유효성분으로 형질전환된 혐기성 미생물을 포함하는 혐기성 질환의 치료를 위한 약학적 조성물 및 혐기성 질환 부위에서 혐기성 미생물의 특이적인 콜로니화 및 증식을 증진하기 위해 혐기성 미생물 콜로니화 및 성장 증진제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 조합을 포함하는, 고형종양과 같은 혐기성 질환을 위한 치료제를 제공한다. 더욱이 본 발명은 혐기성 환경인 질환 부위의 형질전환된 혐기성 미생물의 콜로니화 및 성장을 증진하기 위한 혐기성 미생물 콜로니화 및 성장 증진제를 제공한다.

Description

혐기성 질환을 위한 치료제{Therapeutic agent for anaerobic diseases}

관련된 출원의 상호 참조

본 발명의 청구범위는 2009년 04월 17일에 제출된 미국의 가출원 제 61/124,528의 우선권을 주장한다. 상기 미국의 가출원 제 61/124,528 및 이의 계속 출원의 전부는 본 발명에서 참조에 의해 통합된다.

본 발명의 분야

본 발명은 새로운 형질전환된 혐기성 미생물(anaerobic microorganism)을 포함하는 혐기성 질환(anaerobic disease)을 위한 치료제에 관한 것이며, 상기 치료제는 형질전환된 혐기성 미생물을 유효성분으로 포함하는 혐기성 질환의 치료를 위한 약학적 조성물과 혐기성 질환 부위에서 혐기성 미생물의 콜로니화(colonization) 및 성장(growth)을 증진하기 위한 혐기성 미생물 콜로니화 및 증식 증진제(enhancer)를 유효성분으로 포함하는 혐기성 질환의 치료를 위한 약학적 조성물의 조합을 포함한다. 더욱이 본 발명은 혐기성 환경에서 질환 부위의 형질전환된 혐기성 미생물의 콜로니화 및 성장을 증진하기 위한 혐기성 미생물 콜로니화 및 성장 증진제에 관한 것이다.

본 발명의 배경

최근, 악성 종양 또는 허혈성 질환과 같은 혐기성 환경에서의 질환을 치료하기 위한 방법(이하, '혐기성 질환'으로 표기), 예를 들어, 고형종양을 치료하기 위한 방법, 형질전환된 혐기성 미생물을 이용한 방법과 같은 유전자 전달체가 주목을 받고 있다. 예를 들어, 형질전환된 클로스트리디움(Clostridium)을 이용하여 종양에 유전자를 이동하는 방법이 제안되었다(미국 특허 6416754 및 6652849, 및 미국 출원 공개 2003/0103952 참조). 더욱이, 고형종양의 치료를 위해 형질전환된 비피도박테리움(Bifidobacterium)(B.) 롱검(longum)의 적용이 제안되었다(JP A 2002-97144, Yazawa et al., Cancer Gene Ther., 7, 269-274 (2000), Yazawa et al., Breast Cancer Res. Treat., 66, 165-170 (2001) 참조).

상기 형질전환된 미생물은 E. coli 및 클로스트리디움에서 복제된 셔틀 플라스미드 pNTR500F, pCD540FT 등(미국 특허 6416754 및 6652849 미국 특허 공개 2003/0103952) 또는 E. coli 및 비피도박테리움에서 복제된 셔틀 플라스미드 pBLES100-S-eCD(JP A 2002-97144)와 같은 발현 벡터를 이용하여 만들었다. 상기 모든 플라스미드 벡터는 형질전환된 클로스트리디움(Clostridium) 또는 비피도박테리움 및 E. coli에서 복제된 셔틀 벡터이기 때문에, 상기 플라스미드 벡터에 형질전환된 상기 박테리아는 도입된 유전자가 형질전환된 박테리아가 아닌 조건 혐기성 생물(facultatively anaerobic)과 같은 다른 미생물에 수평적으로 이동하는 위험, 및 실제 실험에서 환경적 위험 및 문제의 우려가 있다.

더욱이 JP A 2002-97144에서는 B. 롱검은 B. 롱검이 투여되어진 마우스에서 복막내(intraperitoneally) 락툴로오스(lactulose)를 투입함으로써 종양 조직에서 선별적으로 확산할 수 있다는 것을 설명한다. 그러나, 상기 설명된 형질전환체는 다른 혐기성 E.coli, 등에 수평적으로 이동될 수 있는 플라스미드 벡터를 이용하여 형질전환되었고, 이것들은 혐기성 질환의 치료에서 안전적이고 효과적인 이용을 위한 문제점을 여전히 가지고 있다.

형질전환된 혐기성 미생물을 이용하여 혐기성 질환을 치료하기 위한 방법에서, 사용되는 형질전환된 혐기성 미생물은 비병원성(nonpathogenic) 및 무독성(nontoxic)일 필요가 있고, 오직 혐기성 상태의 질환 조직에서 콜로니화 및 성장하고, 혐기성 상태가 아닌 정상 조직에서는 콜로니화 및 성장을 하지 않으며, 뿐만 아니라 형질전환된 혐기성 미생물 내로 도입된 유전자는 형질전환된 혐기성 미생물이 아닌 병원성(pathogenic) 박테리아 또는 호기성(aerobic) 또는 조건 혐기성 박테리아로 수평적으로 이동될 수 없는 것을 요구한다.

더욱이, 형질전환된 혐기성 미생물을 이용하여 혐기성 질환 치료하기 위한 방법은 이의 완전한 치료적 효과를 보이기 위해, 사용되는 형질전환된 혐기성 미생물은 혐기성 질환 부위에서 특이적으로 콜로니화 하는 것뿐만 아니라 치료적으로 유효한 양(effective amount)을 확산하는 것 및, 치료가 완료되기까지 치료기간 동안 계속적으로 유지되는 것이 요구된다. 반면에, 생존가능한 세포(viable cells)가 정맥 내 또는 질환 조직 안으로 투여되기 때문에, 형질전환된 혐기성 미생물의 투여량은 환자의 혈관 및 부담의 영향을 최소화하기 위해 가능한 적은 것이 바람직하므로, 특히 형질전환된 혐기성 미생물은 최소한의 필요한 투여량으로 인해 혐기성 질환 부위에서 치료적으로 유효한 양까지 특이적으로 증식하는 것이 바람직하다.

그러므로, 본 발명의 목적은 형질전환된 혐기성 미생물을 이용한 혐기성 질환을 치료하는 방법에 있어서, 안전하고 실용적이며, 적은 양으로 효과를 보일 수 있는 혐기성 질환을 위한 치료제를 제공한다.

본 발명의 발명자들은 상기 문제점들을 해결하기 위해 집중적인 연구를 실행하였고, 플라스미드 pAV001-HU-eCD-M968을 만들기 위해 셔틀 플라스미드 pBLES100-S-eCD을 개선하였다(WO 2007-136107 참조). 본 발명자들은 플라스미드 pBifiCD(미국 가출원 제 61/124,528)을 제조하기 위하여, 플라스미드로부터 E.coli 복제 개시점을 포함하는 단편인, pUC 개시점(ori)을 제거함으로써 상기 플라스미드를 더욱 개선하였다. 상기 플라스미드는 E.coli 복제 개시점을 포함하지 않기 때문에, E.coli에서 수평적 전이가 발생하더라도, 상기 플라스미드로 형질전환된 박테리아는 E.coli에서 복제되는 위험을 가지지 않는다. 상기 형질전환된 혐기성 미생물은 극히 안전하므로, 혐기성 질환을 위한 실질적인 치료제로 사용될 수 있다.

예를 들어 B. 롱검 105-A/pBifiCD(National Institute of Technology and Evaluation Patent microorganisms Depositary(하기 NPMD로 칭함, 2-5-8 Kazusakamatari Kisarazu-city Chiba 292-0818 Japan, Date of deposit: 02월 19, 2008,)Accession Number NITE BP-491)은 상기 플라스미드로 형질전환된 박테리아와 같은 좋은 싸이토신 디아미네이즈(cytosine deaminase; CD) 발현 활성을 보이고, 이를 상기 CD를 항종양 물질 5-FC 내로 전환된 프로드러그(prodrug) 5-FC의 조합으로 사용함으로써, 매우 뚜렷한 종양 성장 억제 효과가 나타나므로, 이는 탁월한 종양 치료제로 촉망된다. 그러나 본 발명자들은 상기와 같이 형질전환된 박테리아는 유기체의 조직에서 충분한 콜로니화 및 성장능력을 가지지 못하고, 또한 혐기성 질환의 치료를 위하여 충분한 양의 표적 유전자를 그것이 필요한 고형종양과 같은 표적 조직으로 이동하기 위해서는 상대적으로 많은 형질전환된 박테리아를 투여하여야 한다는 문제들을 발견하였다. 따라서, 안정 및 가격의 관점에서 보면, 박테리아를 효과적으로 콜로니화 및 증식을 하는 방법이 필요하다.

본 발명자들은 유효성분으로 예를 들어, B. 롱검 105-A/pBifiCD (NPMD Accession Number: NITE BP-491)을 포함하는 약학적 조성물의 혐기성 질환 치료제로서 유용성을 개선시키기 위한 목적으로 집중적인 연구의 결과, 형질전환된 혐기성 미생물과 특정 유형의 당류를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 조합하여 사용하는 것이 혐기성 질환 부위에서 미생물의 구체적인 콜로니화 및 증식을 현저히 증진시키고, 또한, 혐기성 질환 부위에서 상기 미생물의 증식은 지속 될 수 있으며, 치료적 효과는 현저히 증진될 수 있다. 또한, 본 발명자들은 상기 당류를 조합함으로써 이용하여, 비록 혐기성 질환의 치료를 위해 형질전환된 혐기성 미생물의 투여량을 줄이더라도 높은 투여량 일 때와 같은 치료적 효과를 주기 때문에 혐기성 질환 치료제로서 안정성을 증가시킬 수 있다. 게다가, 상기 당류들은 본 발명의 혐기성 질환의 치료를 위한 혐기성 질환 부위 콜로니화 및 성장을 증진시키기 때문에, 훌륭한 혐기성 미생물 콜로니화 및 성장 증진제가 될 수 있다. 본 발명자들은 상기 사항들을 바탕으로 더욱 연구한 결과, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 하기에 사항에 관한 것이다.

(1) E.coli에서 기능 하는 플라스미드 복제 단위(plasmid replication unit)를 포함하지 않고, 혐기성 미생물에서 기능 하는 발현 벡터에 의해 형질전환되는 형질전환된 혐기성 미생물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물, 및

혐기성 질환 부위에서 형질전환된 혐기성 미생물을 위한 콜로니화 및 증식 증진제를 유효성분으로 포함하는 혐기성 질환 치료제,

(2) (1)에 따른 치료제에 있어서, 상기 발현 벡터는

1) E.coli이외의 혐기성 미생물에서 기능 하는 플라스미드 복제 단위, 및

2) 표적 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 DNA 및 혐기성 미생물에서 기능 하는 프로모터 및 종결인자 포함하는 DNA 단편을 포함하는 단백질 발현 단위를 포함한다,

(3) (2)에 따른 치료제에 있어서, 상기 표적 활성을 가지는 단백질은 혐기성 환경인 질환의 치료적 활성을 가지는 단백질이다,

(4) (3)에 따른 치료제에 있어서, 상기 혐기성 환경인 질환의 치료적 활성을 가지는 단백질은 (a) 항종양 활성(antitumor activity)을 가지는 단백질 또는 (b) 항종양 물질 전구체를 항종양 물질로 전환할 수 있는 활성을 가지는 단백질이다,

(5) (4)에 따른 치료제에 있어서, 상기 혐기성 환경인 질환에 대한 치료적 활성을 가지는 단백질은 (b) 항종양 물질 전구체(antitumor substance precursor)를 항종양 물질로 전환할 수 있는 활성을 가지는 단백질이다,

(6) (1)에 따른 치료제에 있어서, 상기 혐기성 미생물은 비피도박테리움(Bifidobacterium), 락토바실러스(Lactobacillus), 엔테로코쿠스(Enterococcus), 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 및 클로스트리디움(Clostridium)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이다,

(7) (6)에 따른 치료제에 있어서, 상기 혐기성 미생물은 비피도박테리움이다,

(8) (7)에 따른 치료제에 있어서, 상기 비피도박테리움은 아돌레센티스(adolescentis), B.아니말리스(B.animalis), B.인판티스(B.infantis), B.써모필룸(B.thermophilum), B.프세우도롱검(B.pseudolongum), B.비피둠(B.bifidum), B.브레비(B.breve) 및 B.롱검(B.longum)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이다,

(9) (8)에 따른 치료제에 있어서, 상기 비피도박테리움은 B. 롱검이다,

(10) (9)에 따른 치료제에 있어서, 상기 비피도박테리움은 B. 롱검 105-A/pBifiCD(국제기탁기관(NPMD) 등록번호 NITE BP-491)이다,

(11) (5)에 따른 치료제에 있어서, 상기 항종양 물질 전구체를 항종양 물질로 전환할 수 있는 활성을 가지는 단백질은 싸이토신 디아미네이즈(cytosine deaminase), 니토로리덕테이즈(nitroreductase) 및 b-글루쿠로니다제(b-glucuronidase)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이다,

(12) (11)에 따른 치료제에 있어서, 상기 항종양 물질 전구체를 항종양 물질로 전환할 수 있는 활성을 가지는 단백질은 싸이토신 디아미네이즈이다,

(13) (1)에 따른 치료제에 있어서, 상기 혐기성 미생물을 위한 콜로니화 및 증식 증진제는 아라비노스(arabinose), 자일로스(xylose), 갈락토스(galactose), 글루코스(glucose), 말토오스(maltose), 락토오스(lactose), 멜리비오스(melibiose), 멜레치토스(melezitose), 라피노스(raffinose) 및 락툴로오스(lactulose)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나이다,

(14) (13)에 따른 치료제에 있어서, 상기 혐기성 미생물을 위한 콜로니화 및 증식 증진제는 글루코스 또는 말토오스이다,

(15) (14)에 따른 치료제에 있어서, 상기 혐기성 미생물을 위한 콜로니화 및 증식 증진제는 말토오스이다,

(16) 아라비노스, 자일로스, 갈락토스, 글루코스, 말토오스, 락토오스, 멜리비오스, 멜레치토스, 라피노스, 및 락툴로오스로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 혐기성 질환의 치료용 혐기성 미생물을 위한 콜로니화 및 증식 증진제,

(17) (16)에 따른 혐기성 질환의 치료용 혐기성 미생물을 위한 콜로니화 및 증식 증진제에 있어서, 상기 유효성분은 글루코스 또는 말토오스이다,

(18) (17)에 따른 혐기성 질환의 치료용 혐기성 미생물을 위한 콜로니화 및 증식 증진제에 있어서, 상기 유효성분은 말토오스이다,

(19) (1)에 따른 치료제에 있어서, 상기 혐기성 미생물을 위한 콜로니화 및 증식 증진제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 정맥주사용으로 제조한다,

(20) (19)에 따른 치료제에 있어서, 상기 유효성분은 글루코스 또는 말토오스이다,

(21) (5)에 따른 치료제에 있어서, (b) 항종양 물질 전구체를 항종양 물질로 전환하는 활성을 가지는 단백질에 의해 항종양 물질로 전환되는 항종양 물질 전구체를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 추가적으로 포함하는 치료제이다, 및

(22) (21)에 따른 치료제에 있어서, 상기 항종양 물질 전구체는 5-플루오로시토신(5-fluorocytosine)이다.

본 발명의 혐기성 질환을 위한 치료제는 재조합 유전자가 E.coli에서 복제되는 위험을 가지지 않으며, 환경적 관점 및 실제 실험에서 극히 안전하다. 게다가, 본 발명의 형질전환된 혐기성 미생물을 위한 콜로니화 및 증식 증진제는 질환 부위에서 혐기성 질환의 치료를 위한 형질전환된 혐기성 미생물의 특이적 콜로니화 및 증식을 증진함으로써 치료적 효과를 향상시키며, 미생물의 투여량을 감소시키게 할 수 있다. 본 발명의 혐기성 질환의 치료를 위한 형질전환된 혐기성 미생물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 및 본 발명의 혐기성 미생물 콜로니화 및 증식 증진제를 포함하는 약학적 조성물이 결합된 혐기성 질환 치료제는 안전하며 훌륭한 치료제로 촉망되며, 형질전환된 혐기성 미생물의 치료적 효과를 현저하게 향상시키고, 형질전환된 혐기성 미생물의 투여량을 줄일 수 있다.

도 1은 플라스미드 'pBifiCD'의 지도를 보여주는 도이다.
도 2는 롱검 Re-105A/pBifiCD 및 말토오스의 결합을 사용하여 종양 증식 억제 효과를 보여주는 도이다.

본 발명은 한가지 실시태양에서, E. coli에서 기능 하는 플라스미드 복제 단위를 포함하지 않고 혐기성 미생물에서 기능 하는 발현벡터로 형질전환된 혐기성 미생물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물, 및

혐기성 질환 부위에서 형질전환된 혐기성 미생물을 위한 콜로니화 및 증식 증진제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 조합을 포함하는 혐기성 질환 치료제를 제공한다.

본 명세서에서 나타내는 상기 "약학적 조성물의 조합을 포함하는 치료제"는 적어도 2종류의 약학적 조성물의 혼합에 의해 제조된 신규한 약학적 조성물 또는 치료에서 조합되어 사용되는 적어도 2종류의 약학적 조성물을 포함하는 질환 치료제를 의미한다. 적어도 2종류의 약학적 조성물이 조합되어 사용될 때, 상기 약학적 조성물은 동시에 사용되거나 또는 고정 간격을 두고 분리하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 혐기성 질환의 치료를 위한 형질전환된 혐기성 미생물은, 혐기성 박테리아, 특히 비피도박테리움(Bifidobacterium), 락토바실러스(Lactobacillus), 엔테로로쿠스(Enterococcus), 스테렙토코쿠스(Streptococcus) 및 클로스트리디움(Clostridium)와 같은 E.coli외에 장내 박테리아에서 기능 하는 플라스미드 벡터인 발현벡터로 형질전환된 혐기성 미생물이다. 본 발명의 발현 벡터는 형질전환된 박테리아를 제외한 박테리아, 특히 E.coli에서 기능 하는 플라스미드 복제 단위를 포함하지 않는다.

현재까지 보고된 혐기성 질환을 치료하기 위한 형질전환된 혐기성 미생물은 E.coli 및 형질전환된 박테리아 모두에서 기능 하는 셔틀(shuttle) 벡터에 의해 형질전환되어졌고, 이들 중 어느 것도 오직 비(non)-E.coli 형질전환체에서 기능 하는 발현 벡터로 형질전환된 것은 없었다. 따라서, 상기 도입된 유전자는 형질전환된 혐기성 박테리아 외에 병원성 박테리아 또는 호기성 또는 조건적 혐기성 박테리아에 수평적으로 이동될 수 있으며, 환경적 위험 및 실제 치료에서 위험이 염려된다.

이와 반대로, 본 발명의 형질전환된 혐기성 미생물은 형질전환체 외에 박테리아 특히, E.coli에서 기능 하는 플라스미드 복제 단위를 포함하지 않는 발현 벡터로 형질전환되었으며, 비록 E.coli로 수평적 전달이 발생하더라도, E.coli에서 복제될 가능성이 없으므로, 환경적 관점 및 실제 치료에서 매우 안전하다.

보다 구체적으로, 본 발명의 혐기성 질환의 치료를 위한 혐기성 미생물의 형질전환에 사용된 발현 벡터는 예를 들어, 상기 발현 벡터는 기본적으로 (1) E.coli 외에 혐기성 미생물에서 기능 하는 플라스미드 복제 단위, 및 (2) 표적 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 DNA 및 혐기성 미생물에서 기능 하는 프로모터(promoter) 및 종결인자를 포함하는 DNA 단편으로 필수적으로 구성된 단백질 발현 유닛으로 구성되고, 상기 발현 벡터는 형질전환체 외에 박테리아, 특히 E.coli에서 기능 하는 플라스미드 복제 단위를 포함하지 않는 것으로 특정된다.

발현 벡터에 포함된 E. coli외에 혐기성 미생물에서 기능 하는 플라스미드 복제 단위로서, E.coli외에 혐기성 미생물, 예를 들어 비피도박테리움, 락토바실러스, 엔테로코쿠스, 스트렙토코쿠스 또는 클로스트리디움과 같은 장내박테리아에서 기능 하는 한 어떠한 것도 플라스미드 복제 단위로 사용될 수 있고, 형질전환된 박테리아 외에 혐기성 미생물에는 기능 하지 않는다;

이의 예로는 E.coli외에 혐기성 미생물, 예를 들어 비피도박테리움에서 기능 하는 플라스미드 복제 단위를 포함하고, 이의 보다 구체적인 예로는 비피도박테리움에서 기능 하는 OriV 부위 및 RepB 유전자로부터 형성된 pTB6 rep 단위 및 이의 단일염기 다형성(single-nucleotide polymorphism)을 포함한다.

게다가, 발현 벡터의 단백질 발현 단위의 프로모터 및 종결인자로서, 혐기성 미생물, 예를 들어 비피도박테리움, 락토바실러스, 엔테로코쿠스, 스트렙토코쿠스 또는 클로스트리디움과 같은 장내박테리아에서 기능 한 어떠한 프로모터 및 종결인자도 사용될 수 있으며, 그 예로는 혐기성 미생물이 기능 하는 히스톤-유사 DNA-결합 단백질(histone-like DNA-binding protein)을 암호화하는 유전자의 프로모터 및 종결인자, 보다 구체적인 예로는 비피도박테리움-유래 히스톤-유사 DNA-결합 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터 및 종결인자 DNA 또는 이의 단일염기 다 형성할 때를 포함한다.

본 발명의 발현 벡터는 선별 마커 활성 유전자 단위를 더 포함한다. 상기 선별 마커 활성은 본 발명의 플라스미드 벡터에 의해 형질전환된 혐기성 미생물을 선별 마커 할 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다; 이의 예로는 스펙티노마이신 저항성(spectinomycin resistance), 암피실린 저항성(ampicillin resistance), 테트라사이클린 저항성(tetracycline resistance), 네오마이신 저항성(neomycin resistance) 또는 카나마이신 저항성(kanamycin resistance), 및 영양요구성과 같은 약제 저항성 마커(drug resistance marker)를 포함하며, 바람직하게는 스펙티노마이신 저항성이 바람직하다.

선별마커 활성 유전자 단위의 예로는, 엔테로코쿠스 패칼리스-유래 스펙티노마이신 아데닐트렌스퍼라제(이하, AAD9 카세트로 기재함) 및 이의 단일염기 다형성을 암호화하는 DNA와 같은 스펙티노마이신 저항성 활성 또는 이의 단일염기 변이체(single-nucleotide variant) 및 이의 프로모터 서열의 특징을 가진 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 DNA를 가진다.

본 발명에서 나타내는 상기 '단일염기 변이체'는 적어도 하나의 뉴클레오티드부위가 변형된 단일염기 다형성(이하, SNP로 기재함)을 의미하며 이는, 한 부위에서의 SNP 뿐만 아니라 다수부위의 SNP들도 포함하는 것을 의미한다.

발현 벡터의 단백질 발현 단위 내로 삽입된 유전자는 혐기성 환경인 질환을 치료하기 위한 치료적 활성을 가지는 단백질이 발현되는 한 어떠한 유전자라도 사용될 수 있으며, 예를 들어, 본 발명의 혐기성 질환 치료제를 악성 종양 치료제로 사용한다면, 상기 단백질은 항종양 활성을 가지고 또는 항종양 물질 전구체를 항종양 물질로 전환할 수 있는 활성을 가진 단백질이라면 어떠한 유전자라도 사용될 수 있으며, 거대 DNA(적어도 대략 10 kb) 또는 수용세포에 대해 유독성이 있는 DNA 같은 형질전환을 억제하는 DNA가 아닌 유전자라면 어떠한 유전자라도 사용될 수 있다.

유전자에 의해 발현되는 상기 항종양 활성을 가지는 단백질은 예를 들어, 사이토카인(cytokine)을 포함하고, 상기 사이토카인의 보다 구체적인 예로서, 인터페론(INF)-알파, 베타, 및 감마, 과랍구대식세포 집락자극인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor; GM-CSF), 인터루킨(interleukins)(IL)-1 알파, 1 베타, 2, 3, 4, 6, 7, 10, 12, 13, 15, 및 18, 종양괴사인자(tumor necrosis factor)(TNF)-알파, 림프독소(LT)-베타, 과랍구 콜로니 자극인자(granulocyte colony stimulating factor)(G-CSF), 대식세포 콜로니 자극인자(macrophage colony stimulating factor)(M-CSF), 대식세포 이동 억제인자(macrophage migration inhibition factor)(MIF), 백혈병 억제인자(leukemia inhibitory factor)(LIF), T-세포 활성 공동자극인자 B7 (CD80) 및 B7-2 (CD86), KIT 리간드(KIT ligand) 및 온코스타틴 M(oncostatin M)을 포함한다. 더욱이 상기 예들은 엔도스텐딘(endostatin), 앤지오스타틴(angiostatin) 및 크링글(kringles) 1, 2, 3, 4 및 5와 같은 혈관 신생 억제물질을 포함한다. 이런 단백질의 서열은 다양한 유기체에서 잘 알려져 있고, 상기 단백질들의 서열은 다양한 유기체에 잘 알려져 있고, 상기 서열정보를 기반으로 한 PCR 방법과 같은 공지기술을 이용함으로써 본 발명의 항종양 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 DNA를 획득할 수 있다. 더욱이, 항종양 물질 전구체를 항종양 물질로 전환하는 활성을 가지는 단백질의 예는 5-플루오로시토신(5-fluorocytosine)(하기에서, 5-FC로 기재)을 항종양 활성 물질 5-플루러유러실(5-fluorouracil)(하기에서, 5-FU로 기재)로 전환하는 효소인 싸이토신디아미네이즈(하기에서, CD로 기재), 5-아지리디오-2,4-디니트로벤즈아미드(5-aziridino-2,4-dinitrobenzamide)(하기, CB1945로 기재)를 항종양-활성 알킬화제(alkylating agent)로 전환하는 효소인 니트로리덕테이즈(nitroreductase), 강시클로비어(ganciclovir)를 항종양-활성 대사산물로 전환하는 효소인 단순 헤르페스 바이러스 제 1형 티미딘 키나제(herpes simplex virus 1 type 티민딘(thymidine) kinase)(하기에서 HSV1-TK로 기재) 및 글루큐로니드화된(glucuronidated) 항종양-활성 물질을 항종양 활성 물질로 전환하는 효소인 베타-글루큐로니다제를 포함하고, 보다 바람직한 예로는 5-FC를 5-FU로 전환하는 효소인 CD를 포함한다.

예를 들어, E.coli에서 파생된 CD를 암호화하는 DNA를 포함하는 플라스미드 pAdex 1 CSCD(Riken Gene Bank RDB No. 1591), 또는 E.coli에서 파생된 CD를 암호화하는 DNA를 유사하게 포함하는 플라스미드 pMK116로부터 분리된 CD를 암호화하는 DNA를 사용할 수 있다(D. A. Mead et al., Protein Engineering 1: 67-74 (1986)).

더욱이, 본 발명의 혐기성 질환의 치료제를 허혈성 질환(ischemic disease)을 위한 치료제로서 사용할 때, 본 발명의 발현 벡터의 단백질 발현 단위로 삽입된 유전자는 허혈성 질환의 치료에 유용한 혈관형성을 증진하는 활성을 가지는 단백질을 포함할 수 있다. 구체적인 예로는 섬유아세포 성장 인자 2(fibroblast growth factor 2)(FGF2), 내피세포 성장 인자(endothelial cell growth factor)(ECGF), 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor)(VEGF), 및 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor)(HGF)를 포함한다.

마찬가지로, 다양한 유기체에서 잘 알려진 상기 단백질의 서열은 서열정보를 기반으로 한 PCR 방법과 같은 공지기술을 이용하여 본 발명의 이용된 혈관신생 증진 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 DNA를 획득할 수 있다.

본 발명의 혐기성 질환의 치료를 위한 혐기성 미생물의 형질전환을 위해 사용된 상기 발현 벡터는 예를 들어, E.coli외에 혐기성 미생물에서 기능 하는 플라스미드 복제 단위, 표적 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 DNA 및 혐기성 미생물에서 기능 하는 프로모터 및 종결인자를 포함하는 DNA 단편을 포함하는 단백질 발현 단위, 및 상기 혐기성 미생물 내에서 플라스미드가 기능 하게 형질전환하는 혐기성 미생물을 포함하는 어떠한 플라스미드를 포함하나, 형질전환된 박테리아 외에 박테리아에서, 특히 E.coli에서 기능 하는 플라스미드 복제 단위는 포함하지 않는 한 어떠한 플라스미드를 포함한다.

이러한 예로서 혐기성 미생물에서 기능 하는 프로모터 및 종결인자를 포함하는 DNA 단편 및 표적 활성을 가지는 주어진 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 단백질 발현 단위를 셔틀 플라스미드 pBLES100pBLES100(Matsumura et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 61, 1211-1212 (1997)), pAV001 (WO 2006-57289), pBRASTA101(Tanaka et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 69(2): 422-425 (2005)), pDG7, pEBM3, pECM2, pLP825, 등. (Alessandra Argnani et al., Microbiology, 142: 109-114 (1996))에 도입함으로써 또는, E.coli에서 기능 하는 플라스 미드 복제 단위를 제거함으로써 제조된 것들을 포함한다.

다른 예로서는 pNTR500F, pCD540FT, 등. (미국 특허 Nos. 6416754 및 6652849, 및 US 특허 출원 공개 2003/0103952), pBLES100-S-eCD (JP A 2002-97144), pAV001-HU-eCD-M968 (WO 2007-136107)과 같은 플라스미드 내에 삽인 된 단백질 발현 단위를 다른 주어진 단백질 발현 단위와 재조합함으로써, 또는 E.coli에서 기능 하는 플라스미드 복제 단위를 더욱 제거함으로써 제조되는 셔틀 플라스미드를 포함한다.

본 발명의 발현 벡터의 구체적인 예는 E.coli외에 혐기성 미생물에서 기능 하는 플라스미드 복제 단위로서 비피도박테리움에서 기능 하는 RepB 유전자 및 OriV 부위를 포함하는 pTB6 rep 단위를 포함하고, 혐기성 미생물에서 기능 하는 프로모터 및 종결인자를 포함하는 DNA 단편으로서 비피도박테리움-파생된 히스톤-유사 DNA-결합 단백질을 암호화하는 유전자의 종결인자 및 프로모터를 포함하며, 표적 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 DNA로서 5-FC를 5-FU로 변환하는 CD 효소를 암호화하는 DNA를 포함하고, 선별마커 활성 유전자 단위로서, 엔테로코쿠스 패칼리스-파생된 스펙티노마이신 아데닐트렌스퍼라제를 암호화하는 DNA(AAD9 카세터(cassette))를 포함하는 벡터를 포함한다.

상기의 보다 구체적인 예로 서열 번호: 1의 염기서열로 나타낸 pBifiCD를 포함한다.

본 발명의 혐기성 질환의 치료를 위한 혐기성 미생물의 형질전환에 이용된 상기 발현 벡터는 예를 들어, 미국 가출원 번호 61/124,528에 따라 제조될 수 있다.

그래서, 본 발명의 발현 벡터는 하기에 의해 제조될 수 있다.

(1) E.coli 복제 개시 점, 예를 들어 pUC ori, 및 추가적으로 선별 마커 활성 유전자 단위, 예를 들어 AAD9 카세트를 포함하는 플라스미드를 제조하는 단계(하기에서는, 선별 마커 플라스미드로 기재)(단계 1),

(2) 상기 선별 마커 플라스미드의 선형 플라스미드를 준비하고, 선별 마커 활성 단위 및 단백질 발현 단위를 가지는 플라스미드를 만들기 위해(하기에서, 선별 마커 활성 단백질 플라스미드로 기재), 예를 들어, 비피도박테리움-파생된 히스톤-유사 DNA-결합 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터 및 종결인자와 같은 프로모터와 종결인자와, (a) 항종양 활성을 가지는 단백질 또는 (b) 항종양 물질 전구체를 항종양 물질로 전화하는 활성을 가지는 단백질 예를 들어 CD를 포함하는 단편을 라이게이션 시키는 단계,(단계 2),

(3) 상기 선택 마커의 선형 플라스미드를 준비하고, E.coli 복제 개시 부위(replication initiation site) 및 선별 마커 활성 유전자 단위, 단백질 발현 단위, 및 플라스미드 복제 단위를 가지는 플라스미드(하기에서, 셔틀 플라스미드로 기재함)를 제조하기 위해, 예를 들어 비피도박테리움에서 기능 하는 RepB 유전자 및 OriV 부위로 형성된 pTB6 rep 단위의 DNA 단편(하기에서, 플라스미드 복제 단위로 기재함)과 같은 E.coli외에 혐기성 미생물에서 기능 하는 플라스미드 복제 단위를 결합하는 단계;(단계 3), 및

(4) 상기 셔틀 플라스미드에서 E.coli 복제 개시 부위를 제거하는 단계(하기에서, 단계 4로 기재).

각각의 단계의 절차는 문헌에서 설명된 잘 알려진 방법에 따라 실행될 수 있다.

본 발명의 발현 벡터는 혐기성 미생물에서 기능 하는 프로모터와 종결인자를 포함하는 DNA 단편 및 표적 활성을 가지는 주어진 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 단백질 발현 단위를 셔틀 플라스미드 pBLES100(Matsumura et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 61, 1211-1212 (1997)), pAV001(WO 2006-57289), pBRASTA101(Tanaka et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 69(2): 422-425 (2005)), pDG7, pEBM3, pECM2, pLP825, 등. (Alessandra Argnani et al., Microbiology, 142: 109-114 (1996)) 및 pNTR500F, pCD540FT, 등. (미국 특허 Nos. 6416754 및 6652849, 및 US Patent Application Publication 2003/0103952)에 삽입함으로써, 일반적인 방법으로 E.coli에서 기능 하는 플라스미드 복제 단위를 동등하게 제거함으로써 또한 만들 수 있다.

더욱이, 상기 E.coli 복제 개시점을 포함하는 단편인, pUC ori가 플라스미드 pAV001-HU-eCD-M968 (WO 2007-136107)로부터 제거된 상기 플라스미드 pBifiCD와 같은 방식으로, 본 발명의 발현 벡터는 pNTR500F, pCD540FT (미국 특허 Nos. 6416754 and 6652849, 및 US Patent Application Publication 2003/0103952), pBLES100-S-eCD (JP A 2002-97144), 등으로부터 E.coli에서 기능 하는 플라스미드 복제 단위를 제거함으로써 또한 만들 수 있다.

게다가, 본 발명의 발현 벡터는 상기 플라스미드 pNTR500F, pCD540FT (미국 특허 Nos. 6416754 및 6652849, 및 US 특허 출원 공개 2003/0103952), pBLES100-S-eCD (JP A 2002-97144), pAV001-HU-eCD-M968 (WO 2007-136107), 등을 주어진 다른 단백질 발현 단위와 재조합하고 나서, E.coli가 기능 하는 플라스미드 복제 단위를 제거함으로써 또한 만들 수 있다.

본 발명의 혐기성 질환의 치료를 위한 형질전환된 혐기성 미생물은 상기 언급한 발현 벡터를 이용하여 잘 알려진 유전 공학 방법에 따라 형질전환된 주어진 혐기성 미생물을 형질전환함으로써 만들 수 있다.

본 발명의 혐기성 질환의 치료를 위한 형질전환된 혐기성 미생물은 고형종양 과 같은 혐기성 질환을 치료하기 위한 물질로 사용되기 때문에, 상기 혐기성 미생물은 절대성 혐기성 및 비병원성 이여야 하나, 클로스트리디움(clostridium) 또는 살모넬라(Salmonella) 같은 병원성 박테리아를 비병원성으로 만들 수 있다면 사용될 수 있고, 락토바실러스(lactobacillus)과 같은 통성(facultative) 혐기성 박테리아를 절재성 혐기성으로 변형시킬 수 있다면 사용될 수 있다.

바람직한 예로는 비병원성 혐기성 박테리아를 포함하고, 비병원성 장내세균이보다 바람직하고, 이들 중 비피도박테리아가 가장 바람직하다.

비피도박테리아의 예로는 B. 아돌레센티스(B.adolescentis), B. 아니말리스(B.animalis), B. 인판티스(B.infantis), B. 써모필룸(B.thermophilum), B. 프세우도롱검(B.pseudolongum), B. 비피둠(B.bifidum), B. 브레비(B.breve), and B. 롱검(B.longum)을 포함하고, B. 롱검이 가장 바람직하다.

이러한, 박테리아는 상업적으로 이용가능한 것 또는 보관 기관(depository institution)에서 쉽게 이용가능한 박테리아이다. 예를 들면, B. 롱검 ATCC-15707, B. 비피둠 ATCC-11863, B. 인판티스 ATCC-15697등은 ATCC(The American Type Culture Collection)에서 쉽게 획득할 수 있다.

각각의 박테리아의 종은 한정되지 않고, B. 롱검 종의 예로는 B. 롱검 105-A 종, B. 롱검 aE-194b 종, B. 롱검 bs-601 종, 및 B. 롱검 M101-2 종을 포함하고, 그 중 B. 롱검 105-A 종이 가장 바람직하다.

B. 브레비 종의 예로는 B. 브레비 표준 종(Japan Collection of Microorganisms(JCM) 1192), B. 브레비 aS-1 종 및, B. 브레비 I-53-8W 종이 포함되고, 그 중 B. 브레비 aS-1 종이 가장 바람직하다.

B. 인판티스 종의 예로는 B. 인판티스 표준 종(JCM1222), 및 B. 인판티스 I-10-5 종을 포함하고, 그 중 B. 인판티스 표준 종 및 B. 인판티스 I-10-5 종이 가장 바람직하다.

더욱이, B. 락텐티스(B. lactentis) 종의 예로는 B. 락텐티스 표준 종(JCM1220)을 포함한다.

본 발명의 형질전환된 혐기성 미생물은 혐기성 환경인 조직을 자랄 수 있거나, 표적 활성을 가지는 단백질을 발현할 수 있는 한, 특별히 한정되지 않으며, 더욱이, 형질전환된 박테리아 외에 특히, 병원성, 호기성 박테리아 또는 통성 혐기성 미생물의 유지된 발현 벡터에 수평적으로 이동될 위험이 없다.

본 발명의 형질전환된 혐기성 미생물의 바람직한 예로는 혐기성 환경인 종양 조직에서 자랄 수 있고, 항종양 물질 전구체를 항종양 물질로 전환할 수 있는 활성을 가지는 단백질을 발현할 수 있는 형질전환된 혐기성 미생물을 포함한다. 보다 바람직한 예로는 혐기성 환경인 종양 조직 내에서 자랄 수 있고, 5-FC를 5-FU로 전환할 수 있는 효소인 CD를 발현할 수 있는 비피도박테리움으로부터 형성된 유전자 전달체를 포함하고, 가장 바람직한 예로는 pBifiCD(B. 롱검 105-A/pBifiCD; NPMD Accession Number NITE BP-491)에 의해 형질전환된 B. 롱검 105-A 종을 포함한다.

본 발명의 상기 유전자 전달체는 예를 들어, Gene Manual(Kodansha), Gene Manipulation Experimental Method, Ed. by Yasuyuki Takagi(Kodansha), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory(1982), Molecular Cloning 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory(1989), 또는 Methods in Enzymol., 194(1991)과 같은 일반적인 실험 교과서에 설명된 방법에 따라 제조될 수 있다.

본 발명의 형질전환된 혐기성 미생물은 표적 몸 조직 내에서 미생물의 콜로니화 및 증식을 증진하기 위해 콜로니화 및 증식 증진제와 결합함으로써 좀 더 나은 혐기성 질환의 치료적 효과를 보일 수 있다.

본 발명에서 사용되어 진 혐기성 미생물 콜로니화 및 증식 증진제는 정맥내(intravenously)에 투여되어 안전하고, 본 발명의 형질전환된 혐기성 미생물의 콜로니화 및 증식을 개선 시킬 수 있다면 어떠한 것을 사용해도 무방하다. 이의 예로는 아라비노스(arabinose), 자일로스(xylose), 갈락토스(galactose), 글루코스(glucose), 말토오스(maltose), 락토오스(lactose), 멜리비오스(melibiose), 멜레치토스(melezitose), 라피노스(raffinose) 및 락툴로오스(lactulose)와 같은 당을 포함하고, 이 중, 글루코스, 락툴로오스 및 말토오스가 바람직하고, 말토오스가 가장 바람직하다.

본 발명의 형질전환된 혐기성 미생물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 본 발명의 형질전환된 혐기성 미생물을 포함하는 한 특별한 특별히 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 형질전환된 혐기성 미생물을 2개 이상 포함할 수 있다. 게다가, 본 발명의 약학적 조성물 또는 혐기성 질환 치료제는 본 발명의 유전자 전달체 이외에, 혐기성 질환의 치료적 효과를 나타내는 화합물을 포함하는 약학적 조성물 또는 치료제를 조합하여 사용될 수 있다.

본 발명의 형질전환된 혐기성 미생물을 유효성분으로 포함하는 혐기성 질환의 치료를 위한 약학적 조성물의 유형의 예로는 형질전환된 혐기성 미생물을 포함하는 액상제제 또는 고형제제를 포함한다. 상기 액상제제는 본 발명의 형질전환된 혐기성 미생물의 배양액을 정제하고, 이에, 필요한 적합한 생리 식염수, 유체 대체물, 또는 약학적 첨가제를 첨가하고, 이를 앰플(ampoule), 바이얼(vial) 등에, 채워서 제조될 수 있다. 상기 고형제제는 액상제제에 적합한 보호제를 첨가하고, 이에 앰플 및 바이얼 등에 채운 후, 동결건조 또는 L-건조하거나, 또는 액상제제, 동결건조 또는 L-건조에 보호제를 첨가한 후, 이에 앰플, 바이얼 등을 채워서 제조될 수 있다.

본 발명의 형질전환된 혐기성 미생물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 방법에 있어서, 경구 투여 및 비경구 투여 모두 가능하나, 비경구 투여가 바람직하며, 예를 들어, 정맥주사, 피하주사, 국소 주사 또는 뇌실 내 투여가 수행될 수 있으며, 정맥주사가 가장 바람직하다.

본 발명의 혐기성 질환의 치료를 위한 형질전환된 혐기성 미생물의 투여량은 활성 단백질의 유효한 치료적 양을 발현하기 위한 혐기성 질환 부위의 콜로니화 및 성장에 충분한 양이라면 특별히 한정되지 않으나, 가능한 많은 투여를 하는 동안 환자의 부담을 완화하기 위한 관점에서 가능한 적게 투여하는 것이 바람직하다.

실제 치료에서 혐기성 질환을 치료하기 위한 형질전환된 혐기성 미생물의 투여량은 질병의 정도, 및 환자의 몸무게, 나이 또는 성별에 따라 적절히 선택될 수 있고, 증산의 정도에 따라 적절히 증가 또는 감소시킬 수 있다. 예를 들어 상기 이용된 혐기성 미생물에 의해 생산된 활성 단백질의 유효한 치료적 양, 상기 이용된 혐기성 미생물에 의해 제조된 활성 단백질의 양, 등에 따라 적절히 결정된다.

구체적으로, 박테리아 덩어리 때문에 폐색(embolization)과 같은 위험을 피하기 위해 정맥 투여의 경우에, 가능한 낮은 농도로 주입하여 사용하고, 주입의 양을 나누어 주입하고 또는 적절한 수혈액을 희석하여 투여하고, 연속 주입에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 성인의 경우, 형질전환된 혐기성 미생물의 세포를 몸무게 kg 당 10⁶에서 10¹²cfu를 하루에 한번 또는 다수를, 하루에서 수일 동안 연속적 또는 적절한 간격으로 투여된다. 보다 구체적으로 형질전환된 혐기성 미생물의 세포의 10⁴에서 10¹⁰ cfu/mL을 포함하는 제형을 성인마다 1에서 1000 mL을 직접 또는 적절한 유체 대체물과 희석하여 투여될 수 있고, 바람직하게는 연속적으로 1일에서 수일 동안 하루에 1회에서 여러 번 나누어 투여하는 것이 바람직하다.

더욱이, 질환에 걸린 조직에 직접 투여와 관련된 국소 투여의 경우, 가능한 많이 질환에 걸린 조직 전체에서 박테리아 세포 콜로니화 및 증식이 필요하기 때문에, 상기 질환에 걸린 다수의 부위에 고농도로 투여되는 것이 요구된다. 예를 들어 성인의 경우, 본 발명의 혐기성 미생물의 세포를 몸무게 kg당 10⁶에서 10¹² cfu로 하루에 한번 또는 여러 번 투여되거나, 필요에 따라 1일에서 수일 동안 연속적 또는 적절한 간격을 두고 투여될 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명의 혐기성 미생물의 세포를 10⁴에서 10¹⁰ cfu/mL를 포함하는 제형을 성인마다 1에서 1000 mL을 필요에 따라 1일에서 수일 동안 연속적으로 하루에 여러 번 직접 투여될 수 있다.

질환에 걸린 조직 내에서 상기 박테리아가 치료기간 동안 사라지는 것이 보인다면, 상기 치료는 일단 중지하고, 그리고 나서 상기와 같은 방법으로 박테리아는 다시 투여된다.

본 발명의 혐기성 미생물 콜로니화 및 증식 증진제를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 예는 상기 혐기성 미생물 콜로니화 및 증식 증진제를 포함하는 액상제제 또는 고형제제를 포함한다. 상기 액상제제는 주입하기 위해 물에서 상기 혐기성 미생물 콜로니 화 및 증식 증진제를 용해하고, 이에 완충제, 등장화제(isotonizing agent), 안정제 또는 pH 조절제와 같은 적절한 약학적 첨가제를 필요에 따라 더하고 말균한 후, 백(bag) 또는 주입 병(infusion bottle)에 채움으로써 제조될 수 있다. 또한, 상기 고형제제는 상기 혐기성 미생물 콜로니화 및 증식 증진제와 완충제, 등장화제, 안정제, 또는 pH 조절제와 같은 적절한 약학적 첨가제와 섞음으로써 제조될 수 있다. 상기 고형제제를 투여할 때, 고형제제는 주사, 생리식염수 등으로, 투여될 때 살균된 물 내로 용해함으로써 투여된다.

본 발명의 혐기성 미생물 콜로니화 및 증식 증진제의 약학적 조성물을 투여하기 위한 방법으로는 정맥 투여가 가장 바람직하나, 피하 주사, 국소 주사, 뇌실 내 투여 등을 필요에 따라 수행될 수 있고, 경구 투여 또한 수행될 수 있다.

본 발명의 혐기성 미생물 콜로니화 및 증식 증진제의 투여량은 본 발명의 형질전환된 혐기성 미생물이 혐기성 질환 부위에서 명확하게 콜로니화 하고, 유효한 치료적 양으로 증식을 할 수 있는 양 및 치료가 완료되기까지 계속 존재는 하면 특별히 제한이 없으나, 가능한 환자 또는 질환에 걸린 부위에 작은 효과를 가지는 것이 바람직하다.

실제 치료에 있어서 상기 투여랑은 환자의 몸무게, 나이 또는 성별에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명의 혐기성 질환의 치료를 위한 형질전환된 혐기성 미생물의 투여량을 적절히 증가 또는 감소시킬 수 있다.

구체적으로, 예를 들어, 유효성분으로 말토오스를 포함하는 혐기성 미생물 콜로니화 및 증식 증진제를 성인에게 사용할 때, 정맥 투여를 위한 10% 말토오스 용액은 하루에 한번 몸무게 kg당 3에서 20 mL가 투여될 수 있으며, 바람직하게는 하루에 한번 몸무게 kg당 5에서 10 mL가 투여될 수 있다. 보다 구체적으로, 정맥 투여를 위해 10% 말토오스 용액 제제는 치료기간 동안 연속적으로 하루에 한번 성인마다 200에서 600 mL가 투여될 수 있다.

본 발명의 혐기성 미생물 콜로니화 및 증식 증진제는 본 발명의 형질전환된 혐기성 미생물이 투여될 때, 희석한 박테리아를 위해 액상 주사로서 투여될 수 있다. 게다가, 본 발명의 혐기성 질환을 위한 치료제 또는 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 한 본 발명의 상기 혐기성 미생물 콜로니화 및 증식 증진제 또는 형질전환된 혐기성 미생물 이외에 다른 추가적인 성분을 포함할 수 있다. 상기 추가적인 성분의 예로는 약학적으로 수용가능한 부양제(support), 부형제(excipient) 및 희석제(희석액)를 포함한다.

본 발명의 형질전환된 혐기성 미생물이 항종양 물질 전구체를 항종양 물질로 전환할 수 있는 활성을 가지는 단백질을 발현할 수 있는 유전자가 도입된 혐기성 박테리아인 경우, 유효성분으로 혐기성 질환의 치료하기 위한 상기 형질전환된 혐기성 미생물을 포함하는 혐기성 질환을 위한 치료제 또는 상기 약학적 조성물은 형질전환된 혐기성 미생물에 의해 발현되는 단백질에 의해 항종양 물질의 효과적 양으로 전환할 수 있는 항종양 물질 전구체의 양과 조합으로 이용될 수 있다.

이러한 항종양 물질 전구체는 본 발명의 형질전환된 혐기성 미생물을 유효성분으로 함유하는 혐기성 질환을 위한 치료제 또는 약학적 조성물에 포함될 수 있으나, 본 발명의 혐기성 질환의 치료를 위한 형질전환된 혐기성 미생물을 유효성분 포함하는 혐기성 질환의 치료제 또는 약학적 조성물과 결합하여 항종양 물질 전구체를 포함하는 약학적 조성물을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용된 항종양 물질 전구체는 전구체 상태에서 정상 조직에 거의 부적용이 없으며, 항종양 물질로 전환된 후, 혐기성 질환의 치료 표적에서 높은 치료적 효과를 가지는 한 특별히 제한되지 않고, 이러한 예로는 5-FU의 전구 물질 5-FU, 항종양-활성 알킬화제(alkylation agent)로 전환되는 CB1945, 항종양-활성 대사산물로 전환되는 강시클로비어(ganciclovir) 및 글루큐로니드화된 항종양-활성 물질을 포함한다.

그래서, 본 발명의 혐기성 질환을 위한 치료제 또는 약학적 조성물이 항종양 물질 전구체와 결합하여 사용될 때, 본 발명의 혐기성 질환을 위한 치료제 또는 약학적 조성물을 투여하는 방법은 항종양 물질 전구체를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 방법과 동일하거나 상이할 수 있으며, 이러한 투여는 동시에 또는 분리하여 수행될 수 있다; 상기 항종양 물질 전구체를 포함하는 약학적 조성물의 투여는 본 발명의 혐기성 질환을 위한 치료제 또는 약학적 조성물을 투여한 후, 종양 세포가 성장하기 위해 본 발명의 형질전환 된 혐기성 미생물을 충분한 시간이 지난 후 수행하는 것이 바람직하다.

더욱이, 본 발명의 혐기성 질환을 위한 치료제 또는 약학적 조성물이 항종양 물질 전구체와 결합하여 사용될 때, 정상 항종양 물질 전구체를 이용한 고형종양 치료 방법과 비교하여, 혐기성 질환의 치료를 위한 형질전환된 혐기성 미생물은 혐기성 환경 및 활성 단백질을 국소적으로 생산하는 종양 조직에서 오직 콜로니화 및 증식되기 때문에, 부작용은 현저하게 억제될 수 있으며, 항종양 물질 전구체의 투여량을 넓은 범위에서 선택할 수 있다.

항종양 물질 전구체의 투여량은 조합으로 사용되는 형질전환된 종양 조직 내의 증식 비율 및 항종양 물질 전구체가 항종양 물질로 전환되는 효율에 따라 적절히 선택될 수 있다. 상기 유전자 전달체의 투여량을 결정하는 동일한 방법으로, 환자의 몸무게, 나이 또는 성별 및 질환의 심각성에 따라 적절하게 선택될 수 있고, 병의 개선 정도의 따라 적절히 증가 또는 감소시킬 수 있다.

예를 들어, 실제 치료에서, 상기 투여량은 사용되는 항종양 물질 전구체 및 전환된 항종양 물질의 종류, 상기 항종양 물질 전구체로부터 전환된 항종양 물질의 유효한 치료적 투여량, 항종양 물질 전구체를 항종양 물질로 전환하는 활성을 가지는 혐기성 미생물에 의해 제조된 단백질의 종류, 및 상기 사용된 혐기성 미생물에 의해 제조된 활성 단백질의 양 등에 따라 적절히 결정될 수 있다.

구체적으로, 예를 들어, CD를 발현하는 형질전환된 혐기성 미생물과 상기 항종양 물질 전구체 5-FC가 조합으로 투여되었을 때, 질환 조직에서 상기 박테리아는 콜로니화 및 성장되고, 상기 박테리아가 혈액 및 정상 조직에서 사라진 것을 확인하였을 때, 5-FC는 성인 몸무게당 1에서 100 mg/day으로 하루에 한번 또는 다수 치료기간 동안 연속적으로 투여된다. 상기 투여 방법은 경구 투여가 바람직하나, 정맥투여 또는 항문 투여와 같은 비경구 투여도 수행될 수 있다.

본 발명에서 가르키는 'X 및 Y의 조합'은 X와 Y 가 각각 다른 구성인 경우와 X와 Y가 동일 구성(예를 들어, X 및 Y를 포함하는 구성)인 경우를 포함한다. X와 Y가 다른 구성일 때, X와 Y는 각각 추가적으로 다른 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 혐기성 질환을 위한 치료제 또는 약학적 조성물은 혐기성 환경에서 가지는 질환에 적용될 수 있으며, 다양한 종류의 고형암에 적용될 수 있다. 상기 고형암의 예로는 대장암(large bowel cancer), 뇌종양(brain tumor), 두경부암(head and neck cancer), 유방암(breast cancer), 폐암(lung cancer), 식도암(esophageal cancer), 위암(stomach cancer), 간암(liver cancer), 담낭암(gallbladder cancer), 담도암(bile duct cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 췌장섬세포암(islet cell cancer), 육모성암(chorionic cancer), 결장암(colonic cancer), 신세포암(renal cell cancer) ,부신피질암(adrenal cortex cancer), 방광암(bladder cancer), 과환암(testicular cancer), 전립선암(prostate cancer), 고환종양(testicular tumor), 난소암(ovarian cancer), 자궁암(uterine cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 악성 유암종(malignant carcinoid tumor), 피부암(skin cancer), 악성 흑색종(malignant melanoma), 골율종(osteosarcoma), 연부조직육종(soft tissue sarcoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 빌림스 종양(Wilms' tumor), 망막모세포종(retinoblastoma), 흑색종(melanoma) 및 편평암(squamous cancer)을 포함한다.

게다가, 혐기성 환경인 다른 질환의 예로는 심근경색(cardiac infarction) 또는 동맥경화성 동맥폐색증(arteriosclerosis obliterans)과 같은 허혈성 질환, 및 버거씨 병(Buerger's disease)과 같은 하지(lower limb) 허혈성 질환을 포함한다.

실시예

본 발명은 하기의 참조 실시예 및 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명되는 본 발명의 기술적 변경은 이러한 실시예에 의해 한정되지 안는다.

B. 롱검 Re -105A/ pBifiCD ( NITE BP -491) 냉동 제제( preparation )의 제조

미국 가출원 제 61/124,528에 나타낸 방법에 의해 제조된 롱검 Re-105A/pBifiCD 액체 배양 2 mL를 글루코스, 대두 펩타이드(soy peptide) (Hinute (Trademark) SMP), 시스테인 히드로글로라이드(cysteine hydrochloride), 포타슘 판토테네이트(potassium pantothenate), 비오틴(biotin), 니토틴산(nicotinic acid), 리보플라빈(riboflavin), 티아민 수화염화물(thiamine hydrochloride), 아스코르브산(ascorbic acid), 탄산나트륨(sodium carbonate), P-아미노벤조산, 티민딘(thymidine), 황산마그네슘(magnesium sulfate), 황산망간(manganese sulfate), 염화나트륨(sodium chloride), 이산 2수소칼륨(monopotassium phosphate), 염화제2철(ferric chloride) 등을 첨가하여 준비된 배지(APS-2S-2.5R medium) 2 L 내로 붓고, 배양은 18 내지 21시간 동안 대략 40℃에서 수행되었다.

배양이 완료된 후, 박테리아 리퀴드는 공경(pore size)이 0.8 마이크로미터인 한외여과막(ultrafiltration membrane)장치를 갖추 필터를 이용하여 여과하여 정제하였고, 따라서 정제된 박테리아 리퀴드를 수득하였다.

주입을 위한 물은 총 양 1 L를 만들기 위해 글리세롤(glycerol) 100 g에 첨가되고, 공경 0.2 마이크로미터의 필터 막을 이용하여 필터하여 10% 글리세롤 수용액을 수득하였다.

10% 글리세롤 수용액의 같은 양을 5% 글리세롤 제제 수용액을 수득하기 위해 정제된 박테리아 리퀴드에 첨가하고, 30 mL 용량의 바이얼(vial) 용기는 각각의 10 mL씩 채우고, 살균 필터 된 질소가스(nitrogen gas)를 채우고나서, 봉인되었다.

그 후, 상기 바이얼은 액체 질소를 이용하여 냉동되었고, 초저온 냉동고(deep freezer)에 저장되었다.

B. 롱검 Re -105A/ pBifiCD ( NITE BP -491)에 의해 다양한 유형의 당류의 동화( Assimilation )

B. 롱검 Re-105A/pBifiCD (NITE BP-491)에 의해 다양한 당류의 동화는 API 50 CH 및 API 20 A을 이용하여 확인되었다. 콜로니는 일반적인 방법에 의해 API 50 CH 또는 API 20 A 배지에 현탁하였고, 탁도가 조절되고나서, 키트 플레이트에 접종되었으며, 배양이 수행되었고, 배양 24 시간 및 48시간 후 색 변화에 의해 평가를 하였다. 상기 평가는 48시간 후 결과를 기초로 수행되었다.

상기 API 50 CH 및 API 20 A 각각의 테스트는 2번의 검사에 의해 수행되었다.

상기 API 20 A 테스트는 글리세로, 아라비노스(arabinose), 자일로스(xylose), 글루코스(glucose), 마노스(mannose), 람노스(rhamnose), 만니톨(mannitol), 소비톨(sorbitol), 살리신(salicin), 셀로비오스(cellobiose), 말토오스(maltose), 락토오스(lactose), 수크로스(sucrose), 트레할로오스(trehalose), 멜레치토스(melezitose), 및 라피노스(raffinose)를 위해 수행되었고, 다른 당류는 테스트 물질에 포함되어 있지 않기 때문에 검사되지 않았다.

종합적인 평가는 API 50 CH 및 API 20 A 최종 평가를 기초로 하여 수행되었다.

상기 API 50 CH 및 API 20 A 최종 평가는 각각 4번의 테스트 결과를 바탕으로 수행되었다(2 테스터 각각을 2번 테스트).

상기 API 50 CH 및 API 20 A 최종 평가가 다를 때에는, API 20 A은 비피도박테리움을 위해 고안된 키트이기 때문에 상기 API 20 A 평가가 사용되었고, 상기 API 20 A 평가 이외의 테스트 물질에 대해서는, 상기 API 50 CH 평가가 사용되었다.

그 결과, 단당류(monosaccharides)인 L-아라비노스(L-arabinose), D-자일로스(D-xylose), 갈락토스(galactose), 및 글루코스, 및 이당류(disaccharides)인 멜리비오스(melibiose), 및 삼당류(trisaccharides)인 멜레치토스 및 라피노스는 양성을 나타냈고, 단당류인 리보스(ribose) 및 과당(fructose), 및 이당류인 수크로스는 약한 양성을 나타냈었다.

상기 테스트 결과는 표 1에 나타내었다. 표에서, 테스트 결과 (+)는 양성을 나타내고, (-)는 음성을 나타내며, (w)는 약한 양성을 나타내고, (v)는 변동성을 나타낸다.

API 20 A 컬럼(column)에서 (NT)는 테스트를 수행하지 않은것(non-tested item)을 나타낸다.

번호	테스트 물질	API 50 CH	API 20 A	전체적인 평가
1	글리세롤(Glycerol)	-	-	-
2	에리트리톨(Erythritol)	-	NT	-
3	d-아라비노스(d-Arabinose)	-	NT	-
4	l-아라비노스(l-Arabinose)	+	+	+
5	리보스(Ribose)	wv	NT	wv
6	d-자일로스(d-Xylose)	+	+	+
7	l-자일로스(l-Xylose)	-	NT	-
8	아도니톨(Adonitol)	-	NT	-
9	β-메틸-d-크실로사이드(β-Methyl-d-xyloside)	-	NT	-
10	갈락토오스(Galactose)	+	NT	+
11	글루코오스(Glucose)	+	+	+
12	과당(Fructose)	wv	NT	wv
13	만노스(Mannose)	-	v	v
14	소르보스(Sorbose)	-	NT	-
15	람노스(Rhamnose)	-	-	-
16	덜시톨(Dulcitol)	-	NT	-
17	이노시톨(Inositol)	-	NT	-
18	만니톨(Mannitol)	-	-	-
19	소르비톨(Sorbitol)	-	-	-
20	α-메틸-d-만노사이드 (α-Methyl-d-mannoside)	-	NT	-
21	α-메틸-d-글루코사이드 (α--Methyl-d-glucoside)	-	NT	-
22	n-아세틸글루코사민 (n-Acetylglucosamine)	-	NT	-
23	아미그달린(Amygdalin)	-	NT	-
24	알부틴(Arbutin)	-	NT	-
25	에스쿨린(Esculin)	-	NT	-
26	살리신(Salicin)	-	-	-
27	셀로비오스(Cellobiose)	-	-	-
28	말토오스(Maltose)	+	+	+
29	락토오스(Lactose)	+	+	+
30	멜리비오스(Melibiose)	+	NT	+
31	슈크로스(Sucrose)	-	wv	wv
32	트레할로오스(Trehalose)	-	-	-
33	이놀린(Inulin)	-	NT	-
34	멜레치토스(Melezitose)	+	+	+
35	리피노스(Raffinose)	+	+	+
36	녹말(Starch)	-	NT	-
37	글리코겐(Glocogen)	-	NT	-
38	자일리톨(Xylitol)	-	NT	-
39	겐티모비오스(Gantiobiose)	-	NT	-
40	d-튜라노스(d-Turanose)	-	NT	-
41	d-락소오스(d-Lyxose)	-	NT	-
42	d-타가토오스(d-Tagatose)	-	NT	-
43	d-푸코스(d-Fucose)	-	NT	-
44	l-푸토스(I-Fucose)	-	NT	-
45	d-아라비톨(d-Arabitol)	-	NT	-
46	I-아라비톨(I-Arabitol)	-	NT	-
47	글루코네이트(Gluconate)	-	NT	-
48	2-케토글루코네이트 (2-Ketogluconate)	-	NT	-
49	5-케토글루코네이트 (5-Ketogluconate)	-	NT	-

B. 롱검 Re -105A/ pBifiCD 및 글루코스 결합의 이용

(1) 종양을 가진 누드 마우스의 준비

5 x 10⁵ cells/mouse/0.2 mL 사람 유방암세포 라인 KPL-1 세포를 누드 마우스 오른쪽 앞다리 뒤쪽의 피부 아래에 이식하였다. 상기 종양의 크기(긴 지름, 짧은 지름, 두께)는 캘리퍼스(calipers)((Digimatic Caliper, CD-15PS, Mitutoyo, Kanagawa)를 이용하여 측정하였고, 종양의 부피는 하기 방정식으로부터 알아내었다.

종양 부피의 측정은 B. 롱검 Re-105A/pBifiCD을 투여하기 전(-1일) 및 B. 롱검 Re-105A/pBifiCD을 투여한 후 7일에(7일) 수행하였다.

종양 부피(mm³)= 긴 지름 (mm) × 짧은 지름 (mm) × 두께 (mm)/2

(2) B. 롱검 Re-105A/pBifiCD 냉동 제제, 10% 글루코스 수용액 및 생리식염수의 투여

대략 80에서 150 mm³의 종양 부피를 가진 22개의 종양을 가진 누드마우스를 61 KPL-1 종양을 가진 누드마우스로부터 선택하고, 판단 기준으로 종양 부피 동일한 수준으로 2개의 그룹으로 나누었다. B. 롱검 Re-105A/pBifiCD 냉동 제제를 미젝터(Myjector)(29G x 1/2, TERUMO, Tokyo)를 이용하여 하루에 4번 한번에 0.05 mL를 각각의 그룹의 마우스에 투여하였고, 투여기간 동안 상기 제제는 상온에 보관하였다(0일).

B. 롱검 Re-105A/pBifiCD을 투여한 날로 부터(1일), 10% 글루코스 수용액을 첫 번째 그룹[글루코스 (+) 그룹]에 하루에 두 번 한번에 주사바늘(25G x 1 R.B., TERMO)을 이용하여 1 mL씩 복막 내 투여하였고, 그 뒤로 조직이 제거되기(6일) 전까지 6일 동안 매일 같은 양을 투여하였다. 더욱이 생리식염수는 상기 같은 방법으로 두 번째 그룹[글루코스 (-) 그룹]에 투여하였다.

(3) B. 롱검 Re-105A/pBifiCD (NITE BP-491)을 위한 종양에서 박테리아 수의 측정

제제의 투여 7일 후(7일), 상기 마우스를 안락사시키고, 상기 종양을 제거하고, 그 무게(g)를 전자저울((AB104-S, METTLER TOLEDO, Tokyo)을 이용하여 측정하였다. 측정 후, 상기 종양을 가위를 이용하여 민스(mince) 상태로 잘게 자르고, 상기 종양을 균질기 튜브(homogenizer tube)(HOMOGENIZER, SANSYO, Tokyo)에 넣고, 혐기성 희석액을 종양 무게(g):혐기성 희석액 (mL) = 1:9의 비율로 첨가하고, 상기 혼합물을 300 rpm 균질기(NZ-1300, EYELA)을 이용하여 균질화 하였다. 상기 균질화된 종양 리퀴드는 혐기성 희석액과 희석하였고, 각각의 원래 리퀴드 및 희석된 리퀴드 3개 BLFs 접시에 100 마이크로리터로 도말(smear)하였다. 상기 도말 된 BLFs 접시는 산소가 제거된/이산화 탄소를 발생시키는 물질과 함께 봉인된 용기에 봉인하였고, 3일 동안 37 ℃의 인큐베이트에서 무산소 환경으로 배양하였다. 배양 후, 플레이트에 콜로니의 수를 산출하였고, 종양 내에 박테리아의 수는 콜로니의 수가 30 내지 300(상기 언급한 콜로니의 수가 없다면, 가장 가까운 범위의 것을 선택한다) 이내의 콜로니의 수를 가진 BLFS 접시로부터 알아내었다. 종양 내 박테리아의 수는 하기의 방정식으로 계산하였다.

종양 내 박테리아의 수를 계산하는 방법

종양 내 박테리아의 수(cfu/g) = 콜로니의 평균 수(n) × 종양을 균질화할 때 희석 비율(x) × 플래팅시(plating) 희석 비율 × 10(z)

(n): (P1+P2+P3)/3; P1, 2, 및 3은 각각의 접시에 콜로니의 수이다

(x): {종양 무게 (g) + 혐기성 희석액의 양 (mL)}/종양 무게(g)

(y): A: x 1 (기존 리퀴드), B: x 10² (10² 배 희석), C: x 10⁴ (10⁴ 배 희석),

(z) 종양의 g 당 박테리아의 수로 값을 전환하기 위한 상수(호모제네이트 액체의 100 마이크로리터(= 0.1 g)은 각각의 접시에 플레이트 되어있기 때문)

통계 분석

이렇게 획득된 실험 결과는 평균값 플러스/마이너스 표준 편차로 나타내었다. 글루코스 (+) 그룹 및 글루코스 (-) 그룹 검정을 SPSS(statistical analysis software, SPSS Inc., Tokyo)를 이용하였다. 상기 결과는 p < 0.05의 유의적인 차이로써 획득하였다.

(5) 결과: 종양 조직에서 글루코스 (+) 그룹 및 글루코스 (-) 그룹의 콜로니화 및 증식의 비교

대략 80 내지 150 mm³의 종양 부피를 가지는 KPL-1 종양을 가진 누드 마우스에서 글루코스 (+) 그룹의 11마리의 마우스 중 10마리에서 글루코스 (-)그룹에서는 11마리의 마우스 중 4마리의 마우스에 B. 롱검 Re-105A/pBifiCD의 콜로니화가 되었다. 상기 결과를 바탕으로, 상기 글루코스 (+) 그룹 및 글루코스 (-) 그룹 사이에서 종양 내 B. 롱검 Re-105A/pBifiCD의 콜로니화의 유의적인 차이를 확인하였다(피셔 정확 확률 검정법(Fisher exact probability test): p = 0.024). 더욱이, 콜로니화된 그룹의 마우스의 종양 내의 박테리아의 평균 수는 글루코스 (+) 그룹에서는 1.8 x 10⁶ 플러스/마이너스 1.9 x 10⁶ cfu/g (n = 10) 및 글루코스 (-) 그룹에서는 1.1 x 10⁴ 플러스/마이너스 1.6 x 10⁴ cfu/g (n = 4)인 것을 관찰하였고, 두 그룹 사이의 종양 내에서 증식에서 유의적인 차이를 관찰하였다(맨-휘트니 U-검정(Mann-Whitney U-test); P = 0.008).

상기 사항으로부터, 글루코스는 종양 조직에서 롱검 Re-105A/pBifiCD의 특이적 콜로니화를 증진하고 종양 조직에서 증식을 증진하는 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

B. 롱검 Re -105A/ pBifiCD 및 말토오스의 조합으로서 이용 (1)

1) 종양을 가진 누드마우스의 준비 및 종양 부피의 측정

종양을 가진 누드 마우스의 준비 및 종양 부피의 측정은 실시예 1과 같은 방법으로 수행하였다.

이식된 세포의 수는 5 x 10⁵세포/마우스이고, 이식된 부피는 0.2 mL (2.5 x 10⁶ 세포/mL)이며, 오른쪽 앞다리의 뒤쪽 피부 아래 이식하였다.

(2) 그룹화

기준으로서 일반적인 상태 및 무게의 변화에 이용되는 특이사항이 없는 42개의 동물은 박테리아 투여 전(-1일) 대략 50 내지 200 mm³의종양 부피를 가지는 종양을 가진 누드 마우스로부터 선택하였고, 층화된 연속적인 무작위법(stratified continuous randomization method)을 이용하여 7개의 그룹으로 나누어서, 상기 평균 종양의 부피는 동등한 수준이다.

(3) B. 롱검 Re-105A/pBifiCD 냉동 제제 및 10% 말토오스 수용액의 투여

상기 B. 롱검 Re-105A/pBifiCD 냉동 제제는 사용 전에 즉시 10분 동안 37℃의 항온 용기를 이용하여 완전히 용해하였다. 상기 용해된 박테리아 제제는 가볍게 텀블-믹싱(tumble-mixing)법에 의해 분산하였고, 정해진 양[0.2 mL × 2 번 (AM/PM)/날 ; 총 0.4 mL/마우스]을 측정하였다.

투여는 오전에 한번 및 오후에 한번 수행하였고, 상기 오후에 투여는 오전에 투여를 한 후 4시간의 간격을 두고 난 후에 수행하였다(허용 시간은 30분 이내이다). 투여의 순서는 각각의 그룹에서 어린 것부터 개별적인 순서로 하였고, 그룹 A부터 그룹 G의 순서로 투여를 수행하였다. 투여는 26G 주사 바늘 및 1 mL 폴리프로필렌 주사기(polypropylene syringe)를 이용하여 꼬리 정맥 내로 투여하였다.

하기 표 2에 나타낸 그룹 구조에 부합하게, 말토오스 리퀴드((Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc., 10% 말토오스 주사) 또는 생리식염수 [1 mL × 2 번(AM/PM)/날(day); 총 2 mL/마우스]를 복막내 투여하였다(ip).

복강 내 투여는 각각의 그룹의 6마리의 마우스의 꼬리 정맥에 아침 및 저녁에 투여한 후 1시간 이내에 수행하였다.

1일 후부터, 투여는 아침 및 오후 1번 수행하였고, 오후의 투여는 아침 투여로부터 4시간의 간격을 가진 후 수행하였다(허용 시간은 30분 이내이다).

표 2. 그룹 구조

그룹 투여된 물질	투여 기간*	검시(Autopsy) 날	동물의 수
A 10% 말토오스(ip)	0일	1일	6
B 10% 말토오스(ip)	0일에서 6일	7일	6
C 10% 말토오스(ip)	0일에서 13일	14일	6
D 10% 말토오스(ip)	0일에서 6일	14일	6
F 생리 식염수 (ip)	0일	1일	6
G 생리 식염수 (ip)	0일에서 6일	7일	6
H 생리 식염수(ip)	0일에서 13일	14일	6

* 박테리아의 투여 날은 0일로 정의한다.

(4) 종양 및 간에서 박테리아의 수의 측정.

상기 (3)의 표 2의 설명된 그룹 구조에 부합하게, 마우스를 1일, 7일, 14일에 안락사시키고, 상기 종양 및 간을 제거하고, 전자 저울(AB204-S, METTLER TOLEDO, Tokyo)을 이용하여 무게(g)을 측정하였다.

상기 제거된 조직을 가위를 이용하여 민스(mince) 상태로 잘게 자르고 균질기 튜브(homogenizer tube)(HOMOGENIZER, SANSYO, Tokyo)에 넣고, 혐기성 희석액을 조직 무게(g):혐기성 희석액 (mL) = 1:9의 비율로 첨가하고, 상기 혼합물을 300 rpm 균질기(NZ-1300, EYELA)을 이용하여 균질화 하였다. 상기 균질환된 조직 리퀴드는 혐기성 희석액과 희석하였고, 각각의 오리지널 리퀴드 및 희석된 리퀴드 3개 BLFs 접시에 100 마이크로리터로 도말(smear)하였다. 상기 도말 된 BLFs 접시는 산소가 제거된/이산화 탄소를 발생시키는 물질과 함께 봉인된 용기에 봉인하였고, 3일 동안 37 ℃의 항온실(thermostatic chamber)에서 무산소 환경으로 배양하였다.

더욱이, B. 롱검 Re-105A/pBifiCD 냉동 제제의 100 마이크로 리터는 혐기성 희석액과 10⁶ 배 희석하였고, 봉인된 용기에서 상기 같은 시간 양성 대조군으로 희석된 리퀴드 100 마이크로 리터를 도말한 BLFs 접시를 배양하였다.

배양 후, 플레이트에 콜로니의 수를 산출하였고, 종양 및 간 내에 박테리아의 수는 콜로니의 수가 30 내지 300 이내의 콜로니의 수를 가진 BLFS 접시로부터 알아내었다. 상기 언급한 콜로니의 수가 없다면, 가장 가까운 범위의 것을 선택한다. 조직 내 박테리아의 수는 실시예 1 (3)과 같은 방법으로 계산하였다.

(5) 결과 1: 박테리아 최후 투여(1일), 투여 7일 후(7일) 및 투여 14일 후(14일)후에 말토오스를 투여한 그룹과 말토오스를 투여하지 않은 그룹의 종양 내의 박테리아의 수(평균값/중앙값) 및 종양 내 콜로니화 과 말토오스를 투여한 그룹 및 말토오스를 투여하지 않은 그룹 사이에 종양 내 박테리아의 수 및 종양 내 콜로니화의 비교는 표 3 및 표 4에 나타내었다.

표 3. 말토오스를 투여한 그룹의 종양 내의 박테리아 수

그룹	A	B	C	D
NO.	투여기간: 0일 검시기간: 1일	0일에서 6일 7일	0일에서 13일 14일	0일에서 6일 14일
1	5.3 × 10⁵	9.8 ×10¹	4.7 ×10⁷	1.2 × 10⁷
2	3.4 × 10⁵	4.3 ×10⁵	1.0 × 10⁶	2.4 × 10⁵
3	2.1 × 10⁶	4.2 ×10⁷	2.4 × 10⁷	4.1 × 10⁴
4	8.3 × 10⁵	N.D	1.4 × 10⁶	3.7 × 10⁴
5	5.1 × 10⁵	3.7 × 10⁶	3.5 × 10⁵	1.8 × 10⁵
6	4.0 × 10⁵	1.0 ×10⁷	1.6 × 10⁶	8.6 × 10⁴
평균값	7.9 × 10⁵	1.1 ×10⁷	1.3 × 10⁷	2.1 × 10⁶
중앙값	5.2 × 10⁵	3.7 × 10⁶	1.5 × 10⁶	1.3 × 10⁵

표 4. 말토오스를 투여하지 않은 그룹의 종양 내에서 박테리아의 수(생리식염수 투여 그룹)

그룹	F	G	H
NO.	투여기간: 0 검시기간: 1일	0일에서 6일 7일	0일에서 13일 14일
1	7.2 × 10³	2.0 × 10⁵	2.5 × 10⁵
2	1.4 × 10⁴	3.3 × 10¹	3.3 × 10²
3	1.5 × 10⁵	7.1 × 10⁴	6.6 × 10¹
4	1.4 × 10⁴	2.5 × 10⁵	1.6 × 10³
5	4.2 × 10⁵	2.0 × 10⁶	2.2 × 10⁵
6	8.0 × 10³	1.7 × 10⁵	2.8 × 10⁵
평균값	1.0 × 10⁵	4.5 × 10⁵	1.3 × 10⁵
중앙값	1.4 × 10⁴	1.9 × 10⁵	1.1 × 10⁵

1일째 종양 내 박테리아의 수의 비교

기준으로 중앙값을 이용하여 그룹 A(말토오스를 투여한 그룹) 및 그룹 F(말토오스를 투여하지 않은 그룹) 사이에 종양 내에 박테리아의 수를 비교한 결과, 그룹 A 내에서 그룹 F 보다 많은 박테리아 수가 있는 것을 확인하였고, 또한, 통계적으로 유의적인 차이가 있다(맨-휘트니 U-검정; P=0.009).

상기 사항으로부터 말토오스는 종양 조직에서 B. 롱검 Re-105A/pBifiCD의 특이적 콜로니화를 증진하는 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

7일째 종양 내 박테리아의 수의 비교

기준으로 중앙값을 이용하여 그룹 B(말토오스를 투여한 그룹) 및 그룹 G(말토오스를 투여하지 않은 그룹) 사이에 종양 내에 박테리아의 수를 비교한 결과, 그룹 B 내에서 그룹 G 보다 좀 더 많은 박테리아의 수가 있는 것을 확인하였다. 상기 사항으로부터 말토오스는 종양 조직에서 B. 롱검 Re-105A/pBifiCD의 증식을 증진하는 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

14일째 종양 내 박테리아의 수의 비교

기준으로 중앙값을 이용하여 그룹 C(말토오스를 투여한 그룹) 및 그룹 H(말토오스를 투여하지 않은 그룹) 사이에 종양 내에 박테리아의 수를 비교한 결과, 그룹 C 내에서 그룹 H 보다 좀 더 많은 박테리아의 수가 있는 것을 확인하였고, 또한 통계적으로 유의적인 차이가 있다(맨--휘트니 U-검정(Bonnferoni correction; significant if P < 0.017) P = 0.589).

이와 반대로, 그룹 D(7일째부터 말토오스의 투여를 중지한 그룹)의 종양 내의 박테리아의 수는 그룹 H 와 동일한 수준을 보였으며, 통계적으로 유의적인 차이를 보이지 않았다(맨--휘트니 U-검정(Bonnferoni correction; significant if P < 0.017) P = 0.589).

이런 사항으로부터 종양 조직에서 B. 롱검 Re-105A/pBifiCD의 증식을 유지하는 효과 및 증식을 증진하는 효과를 나타내는 것을 확인하였고, 더욱이 지속적인 투여가 상기 증식을 유지하기 위해 필요한 것을 확인하였다.

(6) 결과 2: 박테리아 최후 투여(1일), 투여 7일 후(7일) 및 투여 14일(14일)후에 말토오스를 투여한 그룹과 말토오스를 투여하지 않은 그룹의 간 내의 박테리아의 수(평균값/중앙값) 및 간 내 콜로니화 및 말토오스를 투여한 그룹 및 말토오스를 투여하지 않은 그룹 사이에 간 내 박테리아의 수 및 간 내 콜로니화의 비교는 표 5 및 표 6에 나타내었다.

표 5. 말토오스를 투여한 그룹의 간 내의 박테리아의 수

그룹	A	B	C	D
NO.	투여기간: 0 검시기간: 1일	0일에서 6일 7일	0일에서 13일 14일	0일에서 6일 14일
1	3.3 × 10³	N.D	N.D	N.D
2	2.9 × 10³	N.D	N.D	N.D
3	5.1 × 10²	N.D	N.D	N.D
4	3.5 × 10³	N.D	N.D	N.D
5	5.3 × 10²	N.D	N.D	N.D
6	9.4 × 10²	N.D	N.D	N.D
평균값	2.0 × 10³	N.D	N.D	N.D
중앙값	1.9 × 10³	N.D	N.D	N.D

표. 6 말토오스를 투여하지 않은 그룹(생리식염수를 투여한 그룹)의 간 내의 박테리아의 수

그룹	F	G	H
NO.	투여기간: 0 검시기간: 1일	0일에서 6일 7일	0일에서 13일 14일
1	8.0 × 10²	N.D	N.D
2	3.3 × 10¹	N.D	N.D
3	8.5 × 10²	N.D	N.D
4	2.6 × 10²	N.D	N.D
5	4.6 × 10²	N.D	N.D
6	2.6 × 10³	N.D	N.D
평균값	8.3 × 10²	N.D	N.D
중앙값	6.3 × 10²	N.D	N.D

1일째, 7일째 및 14일째 말토오스를 투여한 그룹 및 말토오스를 투여하지 않은 그룹 사이에 간에서 박테리아의 수 비교

1일째, 말토오스를 투여한 그룹 및 말토오스를 투여하지 않은 그룹 두 곳 모두에서 간에서 박테리아를 발견하였으나, 7일째 및 14일째에는 어느 그룹에서도 박테리아는 발견되지 않았다.

상기 사항으로부터 말토오스는 정상 조직에서는 B. 롱검 Re-105A/pBifiCD의 증식 및 콜로니화의 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.

B. 롱검 Re -105A/ pBifiCD 및 말토오스의 조합으로 사용 (2)

(1) 종양 세포의 배양 및 계대배양

사람 위암 세포 라인 MKN45 세포는 가습 상태에서 5% CO₂(MCO-20AIC, Sanyo Electric Co., Ltd.)의 37 ℃의 조절된 CO₂ 인큐베이터를 이용하여 정적으로 배양하였다. 더욱이, 계대배양은 세포밀도가 컨플루언트(confluent)되었을때 다음 절차에 의해 수행하였다. 배양 용기에서 배지를 제거하고, Ca² ⁺, Mg² ⁺-free Dulbecco's 인산완충식염수(PBS(-), Lot No. 160708, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.)를 이용하여 가볍게 세척하였다. PBS(-)를 제거한 후, 상기 세포가 0.25% 트립신(trypsin)(Lot No. 6280J, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 및 0.02% EDTA (Lot No. SS054, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)-포함하는 PBS(-)(trypsin/EDTA liquid)에 잠기기 위해 충분히 적은 양을 처리하고, CO₂ _{인큐베이터 안에서} 방치한다.

상기 세포가 현미경을 이용하여 조사하였을 때 배양 용기의 바닥으로부터 상당히 떨어진 것을 확인한 후, 성장 배지를 추가하였다. 상기 세포는 피펫팅으로 분리하고 나서, 원심분리용기로 옮기고 5분 동안 1,000 rpm (180 x g)로 원심분리하였다. 상층액을 제거하고, 성장 배지를 추가하고, 세포와 함께 배양 용기를 인큐베이트하였다. 세포의 계대배양은 매 3일 또는 4일 마다 실행하였다.

(2) 종양 세포의 이식(Transplanting)

상기 (1)에서 수집된 세포를 PBS(-)를 이용하여 세척하였다. 상기 세포는 적절한 양의 PBS(-)에 현탁하고, 이의 일부를 0.4% 트리판 블루(trypan blue)에 혼합하고, 세포의 수 및 생존도를 알아내었다. 그 결과 생존율은 93% 이였다. 상기 생존 세포 밀도는 PBS(-)를 이용하여 5 × 10⁷ 세포/mL로 조절하였다. 상기 세포 현택액은 이식을 위해 사용될 때까지 아이스 쿨링(ice cooling)하에서 보관하였다.

이식은 1 mL 주사기(syringe)(Terumo Corp.) 및 26G 주사 바늘(Terumo Corp.)을 이용하여 동물의 오른쪽 등 쪽의 피부 아래에 수행하였다.

이식된 세포의 수: 5 × 10⁶ 세포/0.1 mL/body

(3) 그룹화 및 테스트 그룹 구조

그룹화

상기 종양 세포를 이식한 후, 상기 종양의 긴 지름 및 짧은 지름을 캘리퍼스(CD-S20C, Mitutoyo)를 이용하여 측정하였고, 상기 종양의 부피는 하기(8)의 방정식으로부터 확인하였다. 먼저, ' 단일 변이에 의한 개체의 제거(removal of individual by single variable)'를 수행하고, 실험에 사용되는 동물을 선택하였다. 상기 동물들은 221.5 mm³의 평균 종양 부피를 가진다. '단일 변이에 의한 폐색된 분배(Blocked allocation by single variable)'를 수행하였고, 각각의 테스트 그룹의 종양 부피의 평균값을 동일하기 하기 위해서 분배를 수행하였다. 이 날은 0 일로 나타내었다(이식 후 10일). 소프트웨어로는, SAS System Release 8.2 (SAS Preclinical Package Version 5.0, SAS Institute Japan)이 사용되었다.

테스트 그룹 구조

상기 테스트 그룹 구조는 표 7에 나타내었다.

표 7. 테스트 그룹 구조

그룹	투여된 물질	투여량	투여 빈도 (/day)	투여 날(day)	동물 의 수
첫 번째 그룹	박테리아	-	-	-	8
	5-FC	-	-	-
	말토오스	-	-	-
두 번째 그룹	박테리아	1 × 10¹⁰ (cfu/kg/day)	1	1 내지 3	8
	5-FC	750 (cfu/kg/day)	3	5 내지 25,26
	말토오스	200 (cfu/kg/day)	2	1 내지 25
세 번째 그룹	박테리아	4 × 10¹⁰ (cfu/kg/day)	1	1 내지 3	8
	5-FC	750 (cfu/kg/day)	3	5 내지 25,26
	말토오스	200 (cfu/kg/day)	2	1 내지 25
네 번째 그룹	박테리아	4 × 10¹⁰ (cfu/kg/day)	1	1 내지 3	8
	5-FC	750 (cfu/kg/day)	3	5 내지 25,26
	말토오스	-	2*	1 내지 25

note) *; 네 번째 그룹에서 말토오스 대신에 생리식염수를 투여하였다.

(4) 투여 리퀴드의 준비

박테리아(B. 롱검 Re-105A/pBifiCD)를 위한 제조 방법 및 제조 빈도

10 mL (2.3 x 10⁹ cfu/mL)로 채워진 바이얼을 사용 바로 전에 10분 동안 37℃의 뜨거운 물 욕조에서 해동하였다.

5-FC를 위한 제조 방법 및 제조 빈도

5-FC의 필요한 양을 정확히 측정하였다. 주입을 위해 물을 첨가하고, 20분 동안 초음파 장치(ultrasonic device)를 이용하여 혼합물을 처리하고 나서, 12.5 mg/mL 수용액을 수득하였다. 상기 투여 리퀴드의 저장 및 사용은 제조 당일로 한정하고, 1번째 내지 3번째 리퀴드는 동시에 제조하였다. 상기 투여 리퀴드는 모든 투여가 완료되기까지 그늘의 상온에서 저장하였다.

말토오스 및 생리식염수를 위한 제조 방법 및 제조 빈도

말토오스 또는 생리식염수는 투여 당일 제조하여 사용하였다. 투여 리퀴드의 저장 및 사용은 제조 당일로 한정하고, 1번째 및 2번째 리퀴드는 동시에 제조하였다. 상기 투여 리퀴드는 모든 투여가 완료되기까지 그늘의 상온에서 저장하였다.

(5) 투여 빈도, 투여 시간 및 투여 기간

박테리아(B. 롱검 Re-105A/pBifiCD)

1에서 3일째, 3일 동안 하루에 한번(7.30에서 12.00) 2번째에서 4번째 그룹에 투여하였다.

5-FC

5에서 25일째, 하루에 3번(대략 4시간의 간격으로) 2번째에서 4번째 그룹에 투여하였고, 총 64번의 투여를 위하여 25일째 투여는 한 번만 수행하였다.

말토오스 및 생리식염수

1에서 25일째, 총 50번의 투여를 위하여 하루에 2번 2번째에서 4번째 그룹에 투여를 하였다. 상기 투여간격은 적어도 6시간이다. 1에서 3일째, 박테리아(B. 롱검 Re-105A/pBifiCD)의 투여가 완료된 후 적어도 1시간의 시간이 흐른 뒤에 첫 번째 투여가 수행되기 때문에, 상기 투여 간격은 3 내지 4시간이다.

(6) 투여 방법

박테리아(B. 롱검 Re-105A/pBifiCD)

누드 랫을 유지하고, 투여 리퀴드를 10 mL 주사기(syringe)(Terumo Corp.), 25G 윙 정맥 주사 바늘(winged intravenous injection needle)(Terumo Corp.) 및 실린지 펌프(syringe pump)(TE-331S, Terumo Corp.)를 이용하여 연속적으로 꼬리 정맥에 투여하였다.

5-FC

5 mL 주사기(syringe)(Terumo Corp.) 및 위관(stomach tube)(RZ-1, made from Teflon, CLEA Japan Inc.)을 이용하여 구강으로 투여하였다.

말토오스 및 생리식염수

2.5 mL 주사기(syringe)(Terumo Corp.) 및 27G 주사바늘(NIPRO)을 이용하여 복막내 투여하였다.

(7) 투여량(Dose)

박테리아(B. 롱검 Re-105A/pBifiCD)

1 × 10¹⁰ cfu/kg/day(두번째 그룹 : 1.4 내지 1.8 × 10⁹ cfu/body/day) 또는 4 × 10¹⁰ cfu/kg/day (세 번째 그룹: 5.8 내지 7.0 × 10⁹ cfu/body/day, 네 번째 그룹: 6.0 내지 6.7 × 10⁹ cfu/body/day). 상기 투여율(rate)은 10 mL/kg/hr이다. 상기 투여율은 1일째 랫의 무게를 통해 측정하였고, 소수 첫째 자리까지 나타내었다.

5-FC

750 mg/kg/day(250 mg/kg/time). 투여 양(volume)은 60 mL/kg/day (20 mL/kg/time)이다. 투여 리퀴드의 양은 랫의 최종 무게를 통해 측정하였고, 소수 첫째 자리까지 나타내었다.

말토오스 및 생리식염수

말토오스의 투여량(dose)은 200 mg/body/day(100 mg/body/time)이고, 생리식염수의 투여량은 0 mg/body/day(express as amount of maltose). 상기 투여양(volume)은 2 mL/body/day (1 mL/body/time)이다.

(8) 종양 지름의 측정

종양 용적(tumor volume)의 계산

종양 세포를 이식한 후, 종양의 긴 지름 및 짧은 지름을 캘리퍼스를 이용하여 측정하고, 상기 종양 용적을 하기의 방정식으로 확인하였다. 그룹화한 날로부터 종양 지름의 측정은 0, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 및 26째 수행하였다.

종양 용적(mm³) = 긴 지름(mm) × 짧은 지름(mm) × 짧은 지름(mm)/2

종양 성장률의 계산

종양 성장률은 5-FC의 투여를 시작한 이후의 종양 용적부터 하기의 방정식에 따라 계산하였다.

종양 성장률 = 5일 이후의 종양의 용적/5일째 종양의 용적

T/C(%)의 계산

T/C(%)는 8일째 이후의 종양 성장률부터 하기의 방정식에 따라 계산하였다.

T/C(%) = 2번째, 3번째 또는 4번째 그룹의 평균 종양 성장률/첫번째 그룹의 평균 종양성장률 × 100

(9) 결과

종양 용적(volume)

종양 용적을 측정한 결과를 표 8 및 도 2에 나타내었다.

첫 번째 그룹(무처리군)의 종양 용적은 0일에 223.3 플러스/마이너스 43.0 mm³이고 5일째 505.0 플러스/마이너스 125.9 mm³이다. 26일째, 4002.6 플러스/마이너스 661.1 mm³이다. 상기 종양 용적은 실험기간 동안 현저하게 상승하였다.

두 번째 그룹(적은 양은 박테리아, 말토오스를 투여한 그룹)의 종양의 용적은 0일에 221.0 플러스/마이너스 44.4 mm³이고, 5-FC가 투여되기 시작한 5일째, 496.1 플러스/마이너스 108.3 mm³이다. 더욱이, 26일째, 종양의 용적은 2370.9 플러스/마이너스 487.4 mm³이다. 두 번째 그룹을 첫 번째 그룹과 비교하여, 11일 이후로 모든 시점에서 종양 용적이 상당히 낮은 값을 나타내는 것을 확인하였다(11일째 P < 0.05, 14, 17, 20, 23, 및 26일째 P < 0.001: Student's t-test).

세 번째 그룹(높은 양의 박테리아, 말토오스를 투여한 그룹)의 종양의 용적은 0일에 219.7 플러스/마이너스 41.9 mm³이고, 5-FC가 투여되기 시작한 5일째, 488.7 플러스/마이너스 80.2 mm³이다. 더욱이, 26일째, 종양의 용적은 2135.6 플러스/마이너스 592.9 mm³이다. 세 번째 그룹을 첫 번째 그룹과 비교하여, 8일 이후로 모든 시점에서 종양 용적이 상당히 낮은 값을 나타내는 것을 확인하였다(8일째 P < 0.01, 11, 14, 17, 20, 23, 및 26 일째 P < 0.001: Student's t-test), 더욱이 네 번째 그룹과 비교하여 14, 20, 23 및 26일째(on all P < 0.05: Student's t-test) 종양의 용적이 상당히 낮은 것을 확인하였다.

네 번째 그룹(높은 양의 박테리아, 말토오스를 투여하지 않은 그룹)의 종양의 용적은 0일에 222.1 플러스/마이너스 43.5 mm³이고, 5-FC가 투여되기 시작한 5일째, 500.3 플러스/마이너스 109.3 mm³이다. 더욱이 26일째, 종양의 용적은 2879.3 플러스/마이너스 658.4 mm³이다. 네 번째 그룹을 첫 번째 그룹과 비교하여, 11일 이후로 모든 시점에서 종양 용적이 상당히 낮은 값을 나타내는 것을 확인하였다(14일째 P < 0.05, 11, 17, 20, 23, 및 26일째 P < 0.001: Student's t-test).

표 8. 종양의 용적(평균값)

그룹	동물 의 수	종양의 용적(mm³)(평균값)
그룹	동물 의 수	0일	5일	8일	11일	14일	17일	20일	23일	26일
첫 번째 그룹	8	223.3 ± 43.0	505.0 ± 125.9	736.1 ± 112.6	1006.3 ± 106.4	1370.7 ± 155.5	1860.2 ± 303.6	2547.9 ± 426.4	3288.3 ± 566.4	4002.6 ± 661.1
두 번째 그룹	8	221.0 ± 44.4	496.1 ± 108.3	683.4 ± 134.6	835.5 ± 143.8	1032.7 ± 149.0	1320.7 ± 160.4	1633.7 ± 249.8	1970.2 ± 341.0	2370.9± 487.4
세 번째 그룹	8	219.7 ± 41.9	488.7 ± 80.2	562.8 ± 113.3	673.8 ± 177.4	885.1 ± 206.0	1078.0 ± 265.3	1450.2 ± 356.1	1807.3± 488.3	2135.6 ± 592.9
네 번째 그룹	8	222.1 ± 43.5	500.3 ± 109.3	662.7 ± 129.9	827.8 ± 116.4	1117.9 ± 183.3	1334.3 ± 216.7	1884.1 ± 353.6	2388.2 ± 477.9	2879.3± 658.4

종양 성장률

상기 결과는 표 9에 나타내었다.

첫 번째 그룹의 종양 성장률은 26일째 8.4 플러스/마이너스 2.7 이였다.

첫 번째 그룹과 비교하여, 두 번째 그룹의 종양 성장률은 17일 이후부터 모든 시점에서 상당히 낮은 값을 나타내었고(17, 20 및 23일째 P < 0.05, 26일째 P < 0.01: Student's t-test), 26일째는 4.9 플러스/마이너스 1.2 이였다. 첫 번째 그룹 및 네 번째 그룹과 비교했을 때, 세 번째 그룹의 성장률은 8일째 이후부터 모든 시점에서 상당히 낮은 값을 나타내었고(모든 시점에서 첫 번째 그룹과 P < 0.01 비교 및 네 번째 그룹과 P < 0.05 비교: Student's t-test), 26일째 4.4 플러스/마이너스 0.8 이였다. 첫 번째 그룹과 비교하여, 네 번째 그룹의 종양 성장률은 17일 이후부터 상당히 낮은 값을 나타내었고(상기 모두 P < 0.05: Student's t-test), 26일째 5.9 플러스/마이너스 1.4 이였다.

표 9. 종양 성장률(평균값)

그룹	동물의 수	종양 성장률(평균값)
그룹	동물의 수	5일	8일	11일	14일	17일	20일	23일	26일
첫 번째 그룹	8	1.0 ± 0.0	1.5 ± 0.3	2.1 ± 0.5	2.9 ± 0.9	3.9 ± 1.1	5.3 ± 1.6	6.9 ± 2.3	8.4 ± 2.7
두 번째 그룹	8	1.0 ± 0.0	1.4 ± 0.2	1.7 ± 0.3	2.2 ± 0.6	2.8 ± 0.9	3.5 ± 1.2	4.2 ± 1.2	4.9 ± 1.2
세 번째 그룹	8	1.0 ± 0.0	1.2 ± 0.1	1.4 ± 0.3	1.8 ± 0.2	2.2 ± 0.3	3.0 ± 0.4	3.7 ± 0.7	4.4 ± 0.8
네 번째 그룹	8	1.0 ± 0.0	1.3 ± 0.1	1.7 ± 0.2	2.3 ± 0.4	2.7 ± 0.6	3.9 ± 0.8	4.9 ± 1.0	5.9 ± 1.4

T/C (%)

상기 결과는 표 10에 나타내었다.

26일째 두 번째 그룹의 T/C(%)는 58.3 이였다.

26일째 세 번째 그룹의 T/C(%)는 52.4 이였다.

26일째 네 번째 그룹의 T/C(%)는 70.2 이였다.

표 10. T/C(%)

그룹	동물의 수	T/C(%)
그룹	동물의 수	8일	11일	14일	17일	20일	23일	26일
첫 번째 그룹	8	-	-	-	-	-	-	-
두 번째 그룹	8	93.3	810.	75.9	71.8	66.0	60.9	58.3
세 번째 그룹	8	80.0	66.7	62.1	56.4	56.6	53.9	52.4
네 번째 그룹	8	86.7	81.0	79.3	69.2	73.6	71.0	70.2

상기 테스트의 결과를 바탕으로, 말토오스는 종양 조직에서 B. 롱검 Re-105A/pBifiCD의 특이적 콜로니화를 증진하는 효과를 나타내는 것을 확인하였고, 종양 조직에서 증식을 유지시키는 효과 및 증식을 증진하는 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

더욱이, 말토오스를 조합으로 사용함에 따라, 적은 박테리아 투여량으로 높은 박테리아 투여량과 같은 수준의 항종양 효과를 나타내는 것이 가능하며, 따라서, 박테리아 투여량을 줄일 수 있고, 환자에게 낮은 부담을 주고 적은 부작용의 안정한 치료를 수행할 수 있는 것을 확인하였다.

B. 롱검 Re -105A/ pBifiCD 및 말토오스 또는 락툴로오스를 조합으로 사용

(1) 종양을 가진 누드 마우스의 준비 및 종양 용적의 측정

종양을 가진 누드 마우스를 준비 및 종양 용적의 측정은 실시 예 1 및 실시예 2와 같은 방법으로 수행하였다.

(2) 그룹화 및 테스트 약의 투여

60 내지 90 mm³의 종양의 용적을 가진32 KPL-1 종양을 가진 마우스를 선택하고 4개의 그룹으로 나누고(각 그룹당 8 마리 마우스), 각각의 테스트 약을 하기 (3)에 나타낸 그룹 구조 및 투여 스케줄에 따라 투여하였다.

박테리아 투여(B. 롱검 Re-105A/pBifiCD)

박테리아(B. 롱검 Re-105A/pBifiCD)에 관하여, (3) 그룹 구조 및 투여 스케줄에 따라, B. 롱검 Re-105A/pBifiCD 냉동 제제 (2.3 × 10⁹ cfu/mL)를 3일 동안(1일 내지 3일) 하루에 두 번 마우스마다 0.3 mL 씩 정맥 내 투여하였다. 상기 박테리아의 총 투여량은 4.1 × 10⁹ cfu/mouse이다.

플루사이토신(flucytosine)(5-FC)의 투여

12.5 mg/mL 5-FC 수용액의 0.4 mL를 (3)에 나타낸 그룹 구조 및 투여 스케줄에 따라 대조군(그룹 A)을 포함하는 2개의 그룹의 마우스에 하루에 2번 구강을 통해 투여하였다(750 mg/kg/day). 상기 투여기간은 박테리아의 최종 투여일 후부터 21일 동안이었다(4일 내지 24일)

말토오스의 투여

(3)에 나타낸 그룹 구조 및 투여 스케줄에 따라, 10% 말토오스 주사 1 mL를 하루에 2번 마우스에 복막내 투여하였다. 상기 투여 기간은 박테리아(B. 롱검 Re-105A/pBifiCD)의 투여일로부터 24일 동안이었다(1일 내지 24일).

그룹 D의 경우, 말토오스 대신, 생리식염수 같은 양을 같은 스케줄에 따라 투여하였다(1일 내지 24일).

락툴로오스(lactulose)의 투여

(3)에 나타낸 그룹 구조 및 투여 스케줄에 따라, 정제된 물에 용해된 20% 락툴로오스 수용액 1 mL를 마우스에 하루에 한번 복막내 투여하였다. 상기 투여 기간은 박테리아 투여일로부터 24일 동안이었으나, 투여기간(13일 내지 19) 동안 2마리의 마우스가 죽은 것을 확인하여, 상기 투여 스케줄을 변경하였고, 19일 후부터 투여를 중단하였다.

(3) 그룹 구조 및 투여 스케줄의 개요

상기 그룹 구조 및 투여 스케줄은 표 11에 나타내었다.

표 11. 그룹 구조 및 투여 스케줄

그룹	투여 물질	하루 당 투여량	투여 날(day)	동물의 수
그룹 A	박테리아	-	-	8
	5-FC	-	-
	당류	-	-
그룹 B	박테리아(2.3×10⁹cfu/mL)	0.6 mL(1.38×10⁹cfu/mL)	1 내지 3	8
	5-FC(12.5 mg/mL)	1.2 mL(750 mg/kg/day)	4 내지 24
	말토오스(10%)	2 mL(200 mg/day)	1 내지 24
그룹 C	박테리아(2.3×10⁹cfu/mL)	0.6 mL(1.38×10⁹cfu/mL)	1 내지 3	8
	5-FC(12.5 mg/mL)	1.2 mL(750 mg/kg/day)	4 내지 24
	락툴로오스(20%)	1 mL(200 mg/day)	1 내지 24
그룹 D	박테리아(2.3×10⁹cfu/mL)	0.6 mL(1.38×10⁹cfu/mL)	1 내지 3	8
	5-FC(12.5 mg/mL)	1.2 mL(750 mg/kg/day)	4 내지 24
	당류	-	1 내지 24

note)-: 그룹 D는 당류(말토오스 또는 락툴로오스) 대신 생리식염수를 투여하였다.

(4) 종양 내에서 박테리아의 수 측정

5-FC를 테스트 측정 마지막날(25일) 경구적으로 투여하고 그 다음날(26일), 상기 마우스를 희생시키고 1시간 후, 종양을 제거하고, 무게를 측정하였으며, 그리고 나서 혐기성 희석액을 이용하여 균질화하였다.

종양 내의 박테리아의 수는 실시예 1, (3)과 같은 방법으로 계산하였다.

(5) 결과

각각의 그룹의 상기 종양의 용적은 연대순으로 측정하였고 평균값 플러스/마이너스 SD로서 나타내었다. 대조군에 관하여 종양 용적 비율[T/C(%)]은 항종양 효과 평가의 기준으로서 사용되었다. 종양 용적은 상기 대조군(그룹 A) 및 박테리아(B. 롱검 Re-105A/pBifiCD) 및 당류를 조합으로 투여된 그룹에서 변하고 4일째 상기 용적에 관하여 25일째 종양 용적의 비율은 표 12에 나타내었다.

게다가, 항종양 효과의 기준으로 T/C (%)는 표 13에 나타내었다.

그러나, 25일째 당류를 처리하지 않은 그룹(그룹 D)의 T/C는 51.3(%) (Student's t-test: p = 0.013)이고, 말토오스를 조합하여 처리한 그룹(그룹 B)은 38.5(%)(p = 0.003)이며, 락툴로오스를 조합하여 처리한 그룹(그룹 C)은 35.0(%)(p = 0.002)이므로, 상기 두 경우에 있어서 종양 성장의 억제를 높이는 효과를 나타내었다.

표 12. 암 용적(평균값) 및 암 성장률

그룹	동물의 수	종양 용적(mm³)(평균값)								종양 성장률(%)
그룹	동물의 수	0일	4일	7일	11일	14일	18일	21일	25일	종양 성장률(%)
그룹 A	8	74.8 ± 8.5	150.9 ± 25.2	229.6 ± 45.1	358.1 ± 107.7	575.4 ± 161.0	864.1 ± 247.5	1222.3± 413.6	1906.1± 762.0	12.8
그룹 B	8	75.0 ± 8.7	119.0 ± 35.1	158.3 ± 61.7	224.4 ± 106.4	306.0 ± 129.0	412.4 ± 202.7	546.4 ± 322.5	734.6 ± 494.0	5.9
그룹 C	6*	75.4 ± 10.7	120.2 ± 43.8	165.6 ± 96.5	280.9 ± 213.4	370.0 ± 260.6	382.6 ± 267.2	451.1 ± 296.3	667.4 ± 292.9	5.6
그룹 D	8	73.7 ± 8.7	95.3 ± 21.2	119.7 ± 23.7	245.4 ± 70.6	331.8 ± 121.7	439.5 ± 213.9	620.2 ± 254.6	978.5 ± 505.1	10.1

note)*; 8 마리 중 2마리는 테스트 중 죽었다.

표 13. T/C(%)

그룹	동물의 수	T/C(%)						Student's t-test
그룹	동물의 수	7일	11일	14일	18일	21일	25일	Student's t-test
그룹 A	8	-	-	-	-	-	-
그룹 B	8	68.9	62.7	53.2	47.7	44.7	38.5	P = 0.003
그룹 C	6*	72.1	78.4	64.3	44.3	36.9	35.0	P = 0.002
그룹 D	8	52.1	68.5	57.7	50.9	50.7	51.3	P = 0.013

note)*; 8 마리 중 2마리는 테스트 중 죽었다.

상기 테스트의 결과를 바탕으로, 말토오스의 같은 방법으로, 락툴로오스는 또한 종양조직에서 B. 롱검 Re-105A/pBifiCD의 특이적 콜로니화를 증진하는 효과를 나태 내고, 증식을 증진하는 효과 및 증식을 유지하는 효과를 나타내는 것을 확인하였고 B. 롱검 Re-105A/pBifiCD의 항종양 효과를 높일 수 있다.

본 발명의 발현 벡터는 E.coli 같은 다른 병원성 또는 호기성/조건 혐기성 미생물에 수평적 이동하는 위험 없이 치료적 또는 예방적 용도로 혐기성 미생물 외인성 유전자를 도입함으로써 극히 안전한 유전자 전달체를 제공하고, 비록 수평적 이동이 발생하더라도, 상기 벡터는 형질전환체 외에 다른 미생물에서 복제가 일어나지 않는데, 상기 벡터는 다른 미생물의 복제 개시점을 포함하지 않기 때문이다.

더욱이, 본 발명의 형질전환된 미생물의 콜로니화 및 증식 증진제는 본 발명의 형질전환된 미생물의 치료적 효과를 향상시키고, 동등한 치료적 효과를 나타내기 위해 형질전환된 미생물의 복용량을 감소시킬 수 있고, 따라서 치료시 환자의 부담을 줄일 수 있다.

또한, 상기 형질전환된 혐기성 미생물을 포함하는 약학적 조성물과 콜로니화 및 증식 증진제를 포함하는 약학적 조성물을 조합으로 포함하는 본 발명의 치료제는 향상된 치료적 효과와 감소된 유효적으로 요구되는 투여량, 뿐만 아니라 환경적 치료적 관점에서 향상된 안전성을 가진, 혐기성 질환을 위한 치료제로서 이용성을 가지고 있다.

INCORPORATED ADMINISTRATIVE AGENCY NATIONAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY AND EVALUATION PATENT MICROORGANISMS DEPOSITARY

NITEBP-491

20080219

<110> Anaeropharma Science,Inc. <120> Therapeutic Agent for Anaerobic Diseases <130> 10FPI-10-12 <150> US 61/124,528 <151> 2008-04-17 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 4476 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid pBifiCD <400> 1 agatccgtct tcctgctggc ctatgcattg ggttccgcag tgcccactcc aggcggtctg 60 ggcggtgtgg aagcggcgct gacattcgcg ttcgtggcgg tcggagtgcc gcagggcgtg 120 gcgctttccg ccactttgct gcaccgcgtg gtgttctact ggctgcgcat tccgctgggc 180 gcggcggcca tgaagtggct tgacaagcat aatcttgtct gattcgtcta ttttcatacc 240 cccttcgggg aaatagatgt gaaaaccctt ataaaacgcg ggttttcgca gaaacatgcg 300 ctagtatcat tgatgacaac atggactaag caaaagtgct tgtcccctga cccaagaagg 360 atgctttatg gcatacaaca agtctgacct cgtttcgaat aacgctttac aaacaattat 420 taacgcccgg ttaccaggcg aagaggggct gtggcagatt catctgcagg acggaaaaat 480 cagcgccatt gatgcgcaat ccggcgtgat gcccataact gaaaacagcc tggatgccga 540 acaaggttta gttataccgc cgtttgtgga gccacatatt cacctggaca ccacgcaaac 600 cgccggacaa ccgaactgga atcagtccgg cacgctgttt gaaggcattg aacgctgggc 660 cgagcgcaaa gcgttattaa cccatgacga tgtgaaacaa cgcgcatggc aaacgctgaa 720 atggcagatt gccaacggca ttcagcatgt gcgtacccat gtcgatgttt cggatgcaac 780 gctaactgcg ctgaaagcaa tgctggaagt gaagcaggaa gtcgcgccgt ggattgatct 840 gcaaatcgtc gccttccctc aggaagggat tttgtcgtat cccaacggtg aagcgttgct 900 ggaagaggcg ttacgcttag gggcagatgt agtgggggcg attccgcatt ttgaatttac 960 ccgtgaatac ggcgtggagt cgctgcataa aaccttcgcc ctggcgcaaa aatacgaccg 1020 tctcatcgac gttcactgtg atgagatcga tgacgagcag tcgcgctttg tcgaaaccgt 1080 tgctgccctg gcgcaccatg aaggcatggg cgcgcgagtc accgccagcc acaccacggc 1140 aatgcactcc tataacgggg cgtatacctc acgcctgttc cgcttgctga aaatgtccgg 1200 tattaacttt gtcgccaacc cgctggtcaa tattcatctg caaggacgtt tcgatacgta 1260 tccaaaacgt cgcggcatca cgcgcgttaa agagatgctg gagtccggca ttaacgtctg 1320 ctttggtcac gatgctgtct tcgatccgtg gtatccgctg ggaacggcga atatgctgca 1380 agtgctgcat atggggctgc atgtttgcca gttgatgggc tacgggcaga ttaacgatgg 1440 cctgaattta atcacccacc acagcgcaag gacgttgaat ttgcaggatt acggcattgc 1500 cgccggaaac agcgccaacc tgattatcct gccggctgaa aatgggtttg atgcgctgcg 1560 ccgtcaggtt ccggtacgtt attcggtacg tggcggcaag gtgattgcca gcacacaacc 1620 ggcacaaacc accgtatatc tggagcagcc agaagccatc gattacaaac gttgaccttc 1680 tgctcgtagc gattacttcg agcattactg acgacaaaga ccccgaccga gatggtcggg 1740 gtctttttgt tgtggtgctg tgacgtgttg tccaaccgta ttattccgga ctagtcctcc 1800 aggacctcgt ctacgaggcg ctgagcgagg aatggcgcaa aagggacggc gagatcagcg 1860 acccatgggc caacgacgag gcggacggat accagccgcc ctcatacgag ccggtcaacc 1920 ccgaacgcag gactccccag acgccctccg atggcctgat ctgacgtccg aaaaaaggcg 1980 ctgtgcgccc tttttaaatc ttttataaat ctttttacat tcttttagcc cctccgcagc 2040 cttactctcc caacgggttt cagccgaaac ctacaccaaa aggggagcga acctacacca 2100 aaaggggagc gaacctacac caaaagggga gcgaacctac accaaaaggg gagctatata 2160 caccttttgt tatttaaggt gcaagttgtg ctatgctgag gccatgtcca atgagatcgt 2220 gaagttcagc aaccagttca acaacgtcgc gctgaagaag ttcgacgccg tgcacctgga 2280 cgtgctcatg gcgatcgcct caagggtgag ggagaagggc acggccacgg tggagttctc 2340 gttcgaggag ctgcgcggcc tcatgcgatt gaggaagaac ctgaccaaca agcagctggc 2400 cgacaagatc gtgcagacga acgcgcgcct gctggcgctg aactacatgt tcgaggattc 2460 gggcaagatc atccagttcg cgctgttcac gaagttcgtc accgacccgc aggaggcgac 2520 tctcgcggtt ggggtcaacg aggagttcgc gttcctgctc aacgacctga ccagccagtt 2580 cacgcgcttc gagctggccg agttcgccga cctcaagagc aagtacgcca aggagttcta 2640 ccgcagggcc aagcagtacc gcagctccgg aatctggaag atcggccgcg acgagttctg 2700 ccgactgctt ggcgttccac cgtcggcaat aacccagaca cgatatctga atcagaaggt 2760 tcttcagcca attcaggagg agtgtgggcc tctccttggc ctgaagatcg agcgccagta 2820 cgtgaaacgc aggctgtcgg gcttcgtgtt cacattcgcc cgcgagaccc ctccggtgat 2880 cgacgccagg cccgtggagg cgaggaagac ggacggcgac ggcaagggcc attggacgag 2940 cgttgccggg tacggcgagg tgttcacgac cacggcgttg ttcgacgtga cggccgcccg 3000 ggctcacttc gacggcaccg ttgaagccgg ggagtgccgt ttctgcgcgt ttgacgcgcg 3060 caaccgcgaa catcatgcgc ggaacgccgg aaggctgttc tagcggccgt gtccgcgcct 3120 ctggggcggt tgcgcctgcc atgggtcgat ctgccgctgt tcggcctcac gctggtctgt 3180 gcgctgcctg atctccctga gcaggtcggc cttggtcctg ggggcgcttc gctcctcgaa 3240 cgggccgctc tcccccaggt cctcgggctc gctcaggtcc aacggctcgt caccggacgg 3300 ctcgggccgg ttctctccct gtgccgggtt ctccgcctgt gcgcgttgtt cggccatgcg 3360 cagtgcgagg gccttcacct gttcggggct tgtcgactcg attttcgttc gtgaatacat 3420 gttataataa ctataactaa taacgtaacg tgactggcaa gagatatttt taaaacaatg 3480 aataggttta cacttacttt agttttatgg aaatgaaaga tcatatcata tataatctag 3540 aataaaatta actaaaataa ttattatcta gataaaaaat ttagaagcca atgaaatcta 3600 taaataaact aaattaagtt tatttaatta acaactatgg atataaaata ggtactaatc 3660 aaaatagtga ggaggatata tttgaataca tacgaacaaa ttaataaagt gaaaaaaata 3720 cttcggaaac atttaaaaaa taaccttatt ggtacttaca tgtttggatc aggagttgag 3780 agtggactaa aaccaaatag tgatcttgac tttttagtcg tcgtatctga accattgaca 3840 gatcaaagta aagaaatact tatacaaaaa attagaccta tttcaaaaaa aataggagat 3900 aaaagcaact tacgatatat tgaattaaca attattattc agcaagaaat ggtaccgtgg 3960 aatcatcctc ccaaacaaga atttatttat ggagaatggt tacaagagct ttatgaacaa 4020 ggatacattc ctcagaagga attaaattca gatttaacca taatgcttta ccaagcaaaa 4080 cgaaaaaata aaagaatata cggaaattat gacttagagg aattactacc tgatattcca 4140 ttttctgatg tgagaagagc cattatggat tcgtcagagg aattaataga taattatcag 4200 gatgatgaaa ccaactctat attaacttta tgccgtatga ttttaactat ggacacgggt 4260 aaaatcatac caaaagatat tgcgggaaat gcagtggctg aatcttctcc attagaacat 4320 agggagagaa ttttgttagc agttcgtagt tatcttggag agaatattga atggactaat 4380 gaaaatgtaa atttaactat aaactattta aataacagat taaaaaaatt ataaaaaaat 4440 tgaaaaaatg gtggaaacac ttttttcaat tttttt 4476

Claims

혐기성 미생물에서 기능 하는, E. coli에서 기능 하는 플라스미드 복제 단위를 포함하지 않는 발현벡터에 의해 형질전환된 혐기성 미생물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물, 및 혐기성 질환 부위에서 혐기성 미생물의 콜로니화 및 증식 증진제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 조합을 포함하는 혐기성 질환용 치료제.
제 1항에 있어서, 상기 발현 벡터는
(1) E. coli 외에 혐기성 미생물에서 기능 하는 플라스미드 복제 단위, 및
(2) 표적 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 단백질 발현 단위 및 혐기성 미생물에서 기능 하는 프로모터 및 종결인자를 포함하는 DNA 단편을 포함한다.
제 2항에 있어서, 상기 표적 활성을 가지는 단백질은 혐기성 환경인 질환 치료적 활성을 가지는 단백질인 것을 특징으로 하는 치료제.
제 3항에 있어서, 상기 혐기성 환경인 질환의 치료적 활성을 가지는 단백질은 (a) 항종양 활성(antitumor activity)을 가지는 단백질 또는 (b) 항종양 물질 전구체를 항종양 물질로 전환할 수 있는 활성을 가지는 단백질인 것을 특징으로 하는 치료제.
제 4항에 있어서, 상기 혐기성 환경인 질환의 치료적 활성을 가지는 단백질은 (b) 항종양 물질 전구체를 항종양 물질로 전환할 수 있는 활성을 가지는 단백질인 것을 특징으로 하는 치료제.
제 1항에 있어서, 상기 혐기성 미생물은 비피도박테리움(Bifidobacterium), 락토바실러스(Lactobacillus), 엔테로코쿠스(Enterococcus), 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 및 클로스트리디움(Clostridium)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 치료제.
제 6항에 있어서, 상기 혐기성 미생물은 비피도박테리움인 것을 특징으로 하는 치료제.
제 7항에 있어서, 상기 비피도박테리움은 비피도박테리움(Bifidobacterium; B.) 아돌레센티스(adolescentis), B.아니말리스(B.animalis), B.인판티스(B.infantis), B.써모필룸(B.thermophilum), B.프세우도롱검(B.pseudolongum), B.비피둠(B.bifidum), B.브레비(B.breve) 및 B.롱검(B.longum)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 치료제.
제 8항에 있어서, 상기 비피도박테리움은 B.롱검인 것을 특징으로 하는 치료제.
제 9항에 있어서, 상기 비피도박테리움은 B.롱검 105-A/pBifiCD(국제기탁기관(NPMD) 등록번호 NITE BP-491)인 것을 특징으로 하는 치료제.
제 5항에 있어서, 상기 항종양 물질 전구체를 항종양 물질로 전환할 수 있는 활성을 가지는 단백질은 싸이토신 디아미네이즈(cytosine deaminase), 니토로리덕테이즈(nitroreductase) 및 b-글루쿠로니다제(b-glucuronidase)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 치료제.
제 11항에 있어서, 상기 항종양 물질 전구체를 항종양 물질로 전환할 수 있는 활성을 가지는 단백질은 싸이토신 디아미네이즈인 것을 특징으로 하는 치료제.
제 1항에 있어서, 상기 혐기성 미생물의 콜로니화 및 증식 증진제는 아라비노스(arabinose), 자일로스(xylose), 갈락토스(galactose), 글루코스(glucose), 말토오스(maltose), 락토오스(lactose), 멜리비오스(melibiose), 멜레치토스(melezitose), 라피노스(raffinose) 및 락툴로오스(lactulose)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는 치료제.
제 13항에 있어서, 상기 혐기성 미생물의 콜로니화 및 증식 증진제는 글루코스 또는 말토오스인 것을 특징으로 하는 치료제.
제 14항에 있어서, 상기 혐기성 미생물의 콜로니화 및 증식 증진제는 말토오스인 것을 특징으로 하는 치료제.
아라비노스, 자일로스, 갈락토스, 글루코스, 말토오스, 락토오스, 멜리비오스, 멜레치토스, 라피노스, 및 락툴로오스로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나를 유효성분으로 포함하는, 혐기성 미생물을 위한 콜로니화 및 증식 증진제.
제 16항에 있어서, 상기 유효성분은 글루코스 또는 말토오스인 것을 특징으로 하는 혐기성 미생물을 위한 콜로니화 및 성장 증식 증진제.
제 17항에 있어서, 상기 유효성분은 말토오스인 것을 특징으로 하는 혐기성 미생물을 위한 콜로니화 및 증식 증진제.
제 1항에 있어서, 상기 혐기성 미생물의 콜로니화 및 증식 증진제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 정맥 투여용 제제인 것을 특징으로 하는 치료제.
제 19항에 있어서, 상기 유효성분은 글루코스 또는 말토오스인 것을 특징으로 하는 치료제.
제 5항에 있어서, (b) 항종양 물질 전구체를 항종양 물질로 전환하는 활성을 가지는 단백질에 의해, 항종양 물질로 전환되는 항종양 물질 전구체를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 추가적으로 포함하는 치료제.
제 21항에 있어서, 상기 항종양 물질 전구체는 5-플루오로시토신(fluorocytosine)인 것을 특징으로 하는 치료제.