JP2011518112A - 嫌気的疾患用治療薬 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は2009年4月17日に出願された米国仮出願61/124,528号の優先権の利益を主張する。米国仮出願61/124,528号およびその継続出願は、その全体が本願において参考として援用される。
[1]
嫌気性微生物で機能する発現ベクターであって、大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを含まない発現ベクターで形質転換された形質転換嫌気性微生物を有効成分として含有する医薬組成物と、
嫌気的疾患部位における、該形質転換嫌気性微生物の生着・増殖促進剤を有効成分として含有する医薬組成物
とを組み合わせてなる、嫌気的疾患治療剤、
(1)大腸菌以外の嫌気性微生物で機能するプラスミド複製ユニット、および
(2)目的とする活性を有する蛋白質をコードするDNAと嫌気性微生物で機能するプロモーターおよびターミネーターを含むDNA断片とからなる蛋白質発現ユニット、
を含む発現ベクターである、[1]記載の疾患治療剤、
[3] 目的とする活性を有する蛋白質が、嫌気的環境下にある疾患の治療活性を有する蛋白質である、[2]記載の疾患治療剤、
[5] 嫌気的環境下にある疾患の治療活性を有する蛋白質が、(b)抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質である、[4]記載の疾患治療剤、
[6] 嫌気性微生物が、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、エンテロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌およびクロストリジウム属細菌からなる群より選択される、[1]記載の疾患治療剤。
[8] ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、およびビフィドバクテリウム・ロンガムからなる群より選択される、[7]記載の疾患治療剤、
[9] ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムである、[8]記載の疾患治療剤、
[11] 抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質が、シトシン・デアミナーゼ、ニトロリダクターゼおよびβ−グルクロニダーゼからなる群より選択される、[5]記載の疾患治療剤、
[12] 抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質がシトシン・デアミナーゼである、[11]記載の疾患治療剤、
[14] 形質転換嫌気性微生物生着・増殖促進剤が、グルコースまたはマルトースである、[13]記載の疾患治療剤、
[15] 形質転換嫌気性微生物生着・増殖促進剤が、マルトースである、[14]記載の疾患治療剤、
[17] 有効成分がグルコースまたはマルトースである、[16]記載の嫌気的疾患治療用形質転換嫌気性微生物生着・増殖促進剤、
[18] 形質転換嫌気性微生物生着・増殖促進剤がマルトースである、[17]記載の嫌気的疾患治療用形質転換嫌気性微生物生着・増殖促進剤、
[20] 有効成分が、グルコースまたはマルトースである、[19]記載の疾患治療剤、
[21] さらに、(b)抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質によって抗腫瘍物質に変換される抗腫瘍物質前駆体を有効成分として含有する医薬組成物を組合せてなる、[5]記載の疾患治療剤、
[22] 抗腫瘍物質前駆体が5−フルオロシトシンである、[21]記載の疾患治療剤、に関する。
選択マーカー活性としては、本発明のプラスミドベクターで形質転換された嫌気性微生物を選別できるものであれば特に制限されず、例えば、スペクチノマイシン耐性、アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性、ネオマイシン耐性、カナマイシン耐性などの薬剤耐性マーカーや、栄養要求性などが挙げられ、スペクチノマイシン耐性が好ましい。
これらの蛋白質の配列は様々な生物において知られており、その配列情報に基づいてPCR法等の公知の手法を利用することにより、本発明に用いる抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするDNAを入手することができる。
より具体的な例示として、例えば、配列番号1の塩基配列で示される、pBifiCDを挙げることができる。
したがって、本発明の発現ベクターは、
(1)大腸菌の複製開始点、例えばpUC oriと任意に選択マーカー活性遺伝子ユニット、例えば、AAD9カセットを含むプラスミド(以下、選択マーカープラスミドという)を作製し(工程1)、
(2)この選択マーカープラスミドの直鎖化プラスミドを調製し、これと、プロモーター及びターミネーター、例えば、ビフィドバクテリウム属細菌由来のヒストン様DNA結合蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター及びターミネーターと、(a)抗腫瘍活性を有する蛋白質または(b)抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質、例えば、CDからなる断片(以下、蛋白質発現ユニットという)をライゲーションして、選択マーカー活性遺伝子ユニットと蛋白質発現ユニットを有するプラスミド(以下、選択マーカー・活性蛋白質プラスミドという)を作製し(工程2)、
(3)この選択マーカー・活性蛋白質プラスミドの直鎖化プラスミドを調製し、これと、大腸菌以外の嫌気性微生物で機能するプラスミド複製ユニット、例えば、ビフィドバクテリウム属細菌で機能するOriV領域およびRepB遺伝子からなるpTB6 repユニットのDNA断片(以下、プラスミド複製ユニットという)をライゲーションして、大腸菌の複製開始点及び選択マーカー活性遺伝子ユニット、蛋白質発現ユニット並びにプラスミド複製ユニットを有するプラスミド(以下、シャトルプラスミドという)を作製し(工程3)、
(4)このシャトルプラスミドから大腸菌の複製開始点を除去する(工程4)ことにより作製することができる。
なお、各工程における操作は、文献記載の公知の方法に準じて行うことができる。
これらの中で、グルコース、ラクツロースまたはマルトースが好ましく、マルトースが最も好ましい。
該嫌気的疾患治療用形質転換嫌気性微生物を実際に治療に用いる際の投与量は、疾患の程度、患者の体重、年齢、性別に応じて適宜選択し、改善の度合いに応じて適宜増減する。また、例えば、用いる嫌気性微生物が産生する活性蛋白質の有効治療量、および、用いる嫌気性微生物の当該活性蛋白質の産生量などによって、適宜設定する。
実際に治療に用いる際の投与量は、患者の体重、年齢、性別に応じて適宜選択し、また、本発明の嫌気的疾患治療用形質転換嫌気性微生物の投与量に応じて、適宜増減する。
さらに、本発明の医薬組成物や嫌気的疾患治療剤は、本発明の効果を妨げない限り、本発明の形質転換嫌気性微生物または嫌気性微生物生着・増殖促進剤のほかに任意の成分を含有していてもよい。そのような任意成分として、例えば、薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤等が挙げられる。
B.longum Re-105A/pBifiCD(NITE ABP-491)凍結製剤の製造
米国仮出願61/124,528号に記載の方法によって製造した、B.longum Re-105A/pBifiCDの培養菌液2mLを、ブドウ糖、大豆ペプチド(ハイニュート(TM)SMP)、塩酸システイン、パントテン酸カルシウム、ビオチン、ニコチン酸、リボフラビン、塩酸チアミン、アスコルビン酸、炭酸ナトリウム、パラアミノ安息香酸、チミジン、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、:リン酸一カリウム、塩化第二鉄などを加えて調製した培地(APS-2S-2.5R培地)2Lに入れ、約40℃で、18〜21時間、嫌気培養した。
培養終了後の菌液を、孔径0.8μmの限外ろ過膜を付したろ過装置(日本ポール株式会社製、製品番号FS001K05)を用いてろ過、精製して、精製菌液を得た。
前記精製菌液に、同量の10%グリセリン溶液を加えて5%グリセリン製剤溶液とし、容量30mLのバイアル瓶に、10mLずつ分注し、無菌ろ過した窒素ガスを吹き込んだ後密栓した。
次いで、バイアルを液体窒素により凍結させ、超低温フリーザー内で保管した。
B.longum Re-105A/pBifiCD(NITE ABP-491)の各種糖類の資化性
B.longum Re-105A/pBifiCD(NITE ABP-491)の各種糖の資化性をAPI 50CHおよびAPI20Aを用いて確認した。
定法にしたがって、コロニーをAPI 50CHまたはAPI20A培地に懸濁し、濁度を調整した後にキットのプレートへ接種して培養し、24時間ならびに48時間培養後の色変化によって判定した。判定は48時間後の結果に基づいて行った。
API 50CHおよびAPI20Aの各試験について、試験者2名で各々2回行った。
なお、API20Aの試験は、グリセロール、アラビノース、キシロース、グルコース、マンノース、ラムノース、マンニトール、ソルビトール、サリシン、セロビオース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、メレジトース、ラフィノースについて行い、その他の糖類は試験項目に含まれていないため、実施しなかった。
また、API 50CHおよびAPI20Aの最終判定は、各4回(2名の試験者の各2回)の試験結果に基づいて行った。
API 50CHとAPI20Aの最終判定が異なる場合は、API20Aがビフィズス菌対応のキットであることから、API20Aの判定を採用し、API20Aの試験項目外のものについては、API 50CHの判定を採用した。
また、API20A欄の(NT)は試験不実施(試験項目外)を意味する。
B.longum Re-105A/pBifiCDとグルコースの併用
(1)担癌ヌードマウス作製
ヒト乳癌細胞株のKPL-1細胞5 x 105 cells/mouse/0.2 mLをヌードマウスの右前肢側の背部皮下に移植した。腫瘍径(長径, 短径, 厚み)はノギス(デジマチックキャリパー、CD-15PS、Mitutoyo、神奈川)で測定し、腫瘍体積の算出は下式から求めた。腫瘍体積の測定は、B.longum Re-105A/pBifiCD投与前日(Day -1)とB.longum Re-105A/pBifiCD投与7日後(Day 7)に実施した。
腫瘍体積(mm3)=長径(mm) x 短径(mm) x 厚み(mm)/2
KPL-1担癌ヌードマウス61匹より腫瘍体積80〜150 mm3の範囲の担癌ヌードマウス22匹を選択し、腫瘍体積が同程度を指標に2群(1群11匹)に分けた。各群のマウスに、B.longum Re-105A/pBifiCD凍結製剤を0.05 mLずつ1日4回(4回の投与間隔は1時間とし、投与期間中は室温に放置)、マイジェクター(29G x 1/2、TERUMO、東京)を用いて静脈内投与した(Day 0)。
B.longum Re-105A/pBifiCD投与翌日(Day 1)から、第1群〔グルコース(+)群〕に10%グルコース溶液を1 mLずつ1日2回(A.M./P.M.)注射針(25G x 1 R.B.、TERMO)を用いて腹腔内投与し、以後同量を組織摘出前日(Day 6)まで6日間連日投与した。また第2群〔グルコース(-)群〕には、同じ方法で生理食塩液を同量投与した。
製剤投与7日後(Day 7)にマウスを犠牲死させて腫瘍を摘出し、電子天秤(AB104-S、METTLER TOLEDO、東京)を用いて重量(g)を測定した。測定後、ハサミで細切してミンチ状にし、腫瘍をホモジナイズ管(HOMOGENIZER、SANSYO、東京)に入れ、嫌気性希釈液を、腫瘍重量(g):嫌気性希釈液(mL)=1:9の比率で加えて、ホモジナイズ機(NZ-1300、EYELA)で、300rpmで粉砕した。腫瘍ホモジナイズ液は嫌気性希釈液にて希釈し、原液及び希釈液をBLFSプレート3枚に100μLずつ塗布した。塗布したBLFSプレートは密閉容器内に脱酸素・炭酸ガス発生剤と共に密閉し、37℃の恒温器で嫌気的に3日間培養した。培養後、プレート上のコロニー数をカウントし、コロニー数が30〜300に収まるBLFSプレートから腫瘍内菌数を求めた(ただし、上記範囲にコロニー数が収まるプレートが存在しない場合は、より範囲に近いコロニー数が存在するプレートを選択した)。腫瘍内菌数の算出は下式によりおこなった。
腫瘍内菌数(cfu/g)=平均コロニー数(n) × 腫瘍ホモジネート時の希釈率(x) × プレートへの塗布時の希釈率(y) × 10(z)
(n): (P1+P2+P3)/3 、P1,2,3は各プレートのコロニー数
(x):〔腫瘍重量(g)+ 嫌気性希釈液量(mL)〕/腫瘍重量(g)
(y): A: x 1(原液)、B: x 102(102倍希釈)、C: x 104(104倍希釈)、
(z): 腫瘍1g当たりの菌数への換算値 〔1プレートあたり100 μL(=0.1gとする)のホモジネート液を塗布するため。〕
得られた実験結果は平均値±標準偏差で示した。グルコース(+)群とグルコース(−)群の検定には、SPSS(統計解析ソフト、エス・ピー・エス・エス株式会社、東京)を用いた。検定結果はp<0.05をもって有意差ありとした。
腫瘍体積80〜150 mm3のKPL-1担癌ヌードマウスにおいて、B.longum Re-105A/pBifiCDの腫瘍への生着は、グルコース(+)群では11匹中10例、グルコース(-)群では11匹中4例であった。この結果、グルコース(+)群とグルコース(-)群のB.longum Re-105A/pBifiCDの腫瘍への生着には有意な差が認められた(Fisherの直接確率法にて: p=0.024)。また、生着が認められた各群のマウスの平均腫瘍内菌数は、グルコース(+)群で1.8 x 106 ±1.9 x 106 cfu/g(n=10)、グルコース(-)群で1.1 x 104 ±1.6 x 104 cfu/g(n=4)であり、両群の腫瘍内増殖に有意な差が認められた(Mann-WhitneyのU検定にて; P=0.008)。
このことから、グルコースが、B.longum Re-105A/pBifiCDの腫瘍組織への特異的な生着促進作用及び腫瘍組織における増殖促進作用を示すことが確認された。
B.longum Re-105A/pBifiCDとマルトースの併用(1)
(1)担癌ヌードマウスの作製と腫瘍体積の測定
実施例1と同様にして担癌ヌードマウスの作製と腫瘍体積の測定を行った。
なお、移植細胞数は5 x 105 cells/mouse、移植容量(細胞液濃度)は0.2mL (2.5 x 106 cells/mL)、移植部位は右前肢背部側の皮下とした。
菌投与前日(Day-1)に、腫瘍体積がおよそ50〜200 mm3の担癌ヌードマウスから、一般状態および体重推移を指標にして、異常がみられない動物42匹選抜し、層別連続的無作為化法により平均腫瘍体積が同程度となるように7群に分けた。
B.longum Re-105A/pBifiCD凍結製剤を使用直前に恒温槽を用いて37℃、10分間完全に融解した。融解した製剤を軽く転倒混和して菌液を分散させ、所定量〔0.2mL x 2回(AM/PM)/day ; total 0.4 mL/マウス〕を分取した。
投与は午前、午後各1回とし、午後の投与は午前の投与から4時間の間隔をおいた(許容時間は30分以内とした)。投与順は群毎に個体番号の若い順とし、A群からH群へと順に投与した。26Gの注射針及び1 mLのポリプロピレン製注射筒を使用して尾静脈内に投与した。
Day0の腹腔内投与は、午前、午後のいずれも各群6匹の尾静脈内投与が終了してから1時間以内に実施した。
Day1以降は、午前、午後各1回とし、午後の投与は午前の投与から4時間の間隔をおいた(許容時間は30分以内とした)。
上記(3)、表2に示した群構成にしたがって、Day 1、Day 7及びDay 14にマウスを安楽死させて腫瘍及び肝臓を摘出し、電子天秤(AB204-S,METTLER TOLEDO,東京)を用いて重量(g)を測定した。
摘出組織はハサミで細切してミンチ状にし、ホモジナイズ管(HOMOGENIZER,SANSYO,東京)に入れ、嫌気性希釈液を、組織重量(g):嫌気性希釈液(mL)=1 : 9の比率で加えて、ホモジナイズ機(NZ-1300,EYELA)で、300 rpmで粉砕した。
組織ホモジナイズ液は嫌気性希釈液にて希釈し、原液及び各希釈液をBLFSプレート3枚に100μLずつ塗布した。塗布したBLFSプレートは密閉容器内に脱酸素・炭酸ガス発生剤と共に密閉し、37℃の恒温室で嫌気的に3日間培養した。
培養後、プレート上のコロニー数をカウントし、,コロニー数が30〜300に収まるBLFSプレートから腫瘍及び肝臓内菌数を求めた。ただし、上記範囲にコロニー数が収まる希釈率が存在しない場合は、より範囲に近いコロニー数が存在するプレートを選択した。
組織内菌数の算出は、実施例1、(3)と同様にして算出した。
マルトース投与群とマルトース非投与群の菌最終投与翌日(Day 1)、 投与後7日(Day 7)及び投与後14日 (Day 14)の腫瘍への生着及び腫瘍内菌数(平均値/メディアン値)を表3及び表4に示した。
メディアン値を指標としてA群 (マルトース投与群) とF群 (マルトース非投与群) の腫瘍内菌数を比較した結果、 A群はF群よりも多く、統計学的にも有意な差が認められた(Mann-WhitneyのU検定にて; P=0.009)。
このことから、マルトースが、B.longum Re-105A/pBifiCDの腫瘍組織への特異的な生着促進作用を示すことが確認できた。
メディアン値を指標としてB群 (マルトース投与群) とG群 (マルトース非投与群) の腫瘍内菌数を比較した結果、 B群はG群よりも多かった。このことから、マルトースは、B.longum Re-105A/pBifiCDの腫瘍組織における増殖促進作用を示すことが確認できた。
メディアン値を指標としてC群 (マルトース投与群) とH群 (マルトース非投与群) の腫瘍内菌数を比較した結果、 C群はH群よりも多く、 統計学的にも有意な差が認められた〔Mann-WhitneyのU検定(Bonnferoni補正;p<0.017で有意); P=0.002〕。
一方D群(マルトース投与をDay 7以降中断した群)の腫瘍内菌数はH群と同程度であり、統計学的にも有意な差が認められなかった〔Mann-WhitneyのU検定(Bonnferoni補正;p<0.017で有意); P=0.589〕。
このことから、マルトースが、B.longum Re-105A/pBifiCDの腫瘍組織における増殖促進作用及び増殖維持作用を示すことが確認され、さらに、増殖を維持させるためには継続的な投与が必要であることが確認できた。
マルトース投与群とマルトース非投与群の菌最終投与翌日(Day 1)、 投与後7日(Day 7)及び投与後14日 (Day 14)の肝臓への生着及び肝臓内菌数(平均値/メディアン値)を表5及び表6に示した。
Day 1では、マルトース投与群、非投与群ともに肝臓内に菌の存在が認められたが、 Day 7及びDay 14では両群ともに菌の存在は認められなかった。
このことから、マルトースが、B.longum Re-105A/pBifiCDの正常組織への生着および増殖に対して影響を与えないことが確認できた。
B.longum Re-105A/pBifiCDとマルトースの併用(2)
(1)腫瘍細胞の培養および継代
ヒト胃癌細胞株MKN45細胞を、37°C,5% CO2に設定したCO2インキュベーター(MCO-20AIC,三洋電機株式会社)を用いて加湿条件下で静置培養した。また、細胞密度がコンフルエントになった段階で以下の手順で継代操作を行った。培養容器内の培地を除去し、Ca2+、Mg2+-free Dulbecco’s phosphate buffered saline[PBS(-),Lot No. 160708,日水製薬株式会社]を用いて軽くリンスした。PBS(-)を吸引除去した後、細胞が浸る程度の少量の0.25% trypsin(Lot No. 6280J,和光純薬工業株式会社)および0.02% EDTA(Lot No. SS054,和光純薬工業株式会社)含有PBS(-)(trypsin/EDTA液)を添加しCO2インキュベーター内に静置した。
顕微鏡下で観察し、細胞が培養容器の底面からほぼ剥がれたことを確認して増殖用培地を加えた。ピペッティングにより細胞を分離させた後、遠沈管に移して約1,000 rpm(180×g)で5分間遠心分離した。上清を除去し、増殖用培地を加えて細胞を培養容器に播種した。細胞の継代は3または4日毎に実施した。
上記(1)にて回収した細胞をPBS(-)で洗浄した。細胞を適当量のPBS(-)に浮遊させ、その一部を0.4%トリパンブルーと混合し、細胞数および生存率を求めた。その結果、生存率は93%であった。PBS(-)を用いて生細胞密度を5×107 cells/mLに調整した。細胞懸濁液は、移植に用いるまで氷冷下で保存した。
動物の右背部皮下に1 mL注射筒(テルモ株式会社)および26G注射針(テルモ株式会社)を用いて移植した。
移植細胞数: 5×106 cells/0.1 mL/body
群分け
腫瘍細胞移植後、ノギス(CD-S20C,株式会社ミツトヨ)を用いて腫瘍の長径および短径を測定し、下記(9)の計算式に従って腫瘍体積を算出した。まず、「単変数による個体の除去」を行い、実験に使用する動物を選択した。これらの動物の平均腫瘍体積は221.5 mm3であった。「単変数によるブロック化割付け」を行い,各試験群の腫瘍体積の平均値が均等になるように割付けた。この日をDay 0(移植後10日)と設定した。ソフトウェアはSAS System Release 8.2(SAS前臨床パッケージ Version 5.0,SAS Institute Japan株式会社)を使用した。
菌(B.longum Re-105A/pBifiCD)の調製方法および調製頻度
10 mL(2.3×109 cfu/mL)入りバイアルを使用直前に37℃の温浴で10分間融解した。
5-FCの調製方法および調製頻度
必要量の5-FCを正確に分取した。これに注射用水を加え、超音波装置で20分間処理し、12.5 mg/mL溶液を調製した。投与液の保存および使用は調製日限りとし,1〜3回目の投与液をまとめて調製した。投与液は、すべての投与が終了するまでの間遮光下にて室温保存した。
マルトースおよび生理食塩水の調製方法および調製頻度
投与日にマルトースもしくは生理食塩水を分注して用いた。投与液の保存および使用は調製日限りとし、1回目と2回目の投与液をまとめて調製した、投与液は、すべての投与が終了するまでの間室温保存した。
菌(B.longum Re-105A/pBifiCD)
Day 1〜Day 3に、第2〜4群に1日に1回(7時30分〜12時)3日間投与した。
5-FC
Day 5〜Day 25に、第2〜4群に1日3回(約4時間間隔)、Day 26に1回の計64回投与した。
マルトースおよび生理食塩水
Day 1〜Day 25に、第2〜4群に1日2回、計50回投与した。投与間隔は6時間以上とした。ただし、Day 1〜Day 3では、菌(B.longum Re-105A/pBifiCD)の投与終了後1時間以上経過した後に1回目の投与を行ったため、投与間隔は3〜4時間であった。
菌(B.longum Re-105A/pBifiCD)
ヌードラットを保定し、10 mL注射筒(テルモ株式会社)、25G翼付静注針(テルモ株式会社)およびシリンジポンプ(TE-331S,テルモ株式会社)を用いて投与液を尾静脈内に持続投与した。
5-FC
5 mL注射筒(テルモ株式会社)および胃ゾンデ(RZ-1,テフロン(登録商標)製,日本クレア株式会社)を用いて経口投与した。
マルトースおよび生理食塩水
2.5 mL注射筒(テルモ株式会社)および27G注射針(ニプロ株式会社)を用いて腹腔内に投与した。
菌(B.longum Re-105A/pBifiCD)
1×1010 cfu/kg/day(第2群:1.4〜1.8×109 cfu/body/day)または4×1010 cfu/kg/day(第3群:5.8〜7.0×109 cfu/body/day,第4群:6.0〜6.7×109 cfu/body/day)とした。投与速度は10 mL/kg/hrとした。投与速度はDay 1におけるラットの体重から算出し、小数第2位を四捨五入して用いた。
5-FC
750 mg/kg/day(250 mg/kg/time)とした。投与容量は60 mL/kg/day(20 mL/kg/time)とした。投与液量はラットの最新体重から算出し、小数第2位を四捨五入して用いた。
マルトースおよび生理食塩水
マルトースの投与量は200 mg/body/day(100 mg/body/time)とし、生理食塩水の投与量は0 mg/body/dayとした(マルトース量として表示)。投与容量は2 mL/body/day(1 mL/body/time)とした。
腫瘍体積の算出
腫瘍細胞移植後、ノギスを用いて腫瘍の長径および短径を測定し、下記の計算式に従って腫瘍体積を算出した。群分け日以降は、Day 0、5、8、11、14、17、20、23および26に腫瘍径を測定した。
腫瘍体積(mm3)= 1/2 × 長径(mm)× 短径(mm)× 短径(mm)
腫瘍増殖率の算出
5-FC投与開始以降の腫瘍体積から下記の計算式に従って腫瘍増殖率を算出した。
腫瘍増殖率 = Day 5以降の腫瘍体積 / Day 5の腫瘍体積
T/C(%)の算出
Day 8以降の腫瘍増殖率から下記の計算式に従ってT/C(%)を算出した。
T/C(%) = 第2,3または4群の平均腫瘍増殖率 / 第1群の平均腫瘍増殖率 × 100
腫瘍体積
腫瘍体積の測定結果を表8及び図2に示した。
第1群(無処置群)の腫瘍体積はDay 0では223.3 ± 43.0 mm3であり、Day 5では505.0 ± 125.9 mm3であった。また、Day 26では4002.6 ± 661.1 mm3であった。観察期間を通じて腫瘍体積の著しい増大が認められた。
結果を表9に示した.
第1群の腫瘍増殖率はDay 26では8.4 ± 2.7であった。
第2群の腫瘍増殖率はDay 17以降のすべての時点で第1群と比較して有意な低値(Day 17,20および23ではP<0.05,Day 26ではP<0.01:Studentのt検定)であり、Day 26では4.9 ± 1.2であった。
第3群の腫瘍増殖率はDay 8以降のすべての時点で第1群および第4群と比較して有意な低値(いずれの時点でも第1群と比較してP<0.01,第4群と比較してP<0.05:Studentのt検定)であり、Day 26では4.4 ± 0.8であった。
第4群の腫瘍増殖率はDay 17以降のすべての時点で第1群と比較して有意な低値(いずれもP<0.05:Studentのt検定)であり、Day 26では5.9 ± 1.4であった。
結果を表10に示した。
第2群のDay 26におけるT/C(%)は58.3であった。
第3群のDay 26におけるT/C(%)は52.4であった。
第4群のDay 26におけるT/C(%)は70.2であった。
さらに、マルトースを併用する事により、低用量の菌の投与でも高用量の菌の投与と同等の抗腫瘍効果を発揮させることが可能であり、したがって、菌の投与量を低減することができ、よって、患者への負担および副作用の低い、安全な治療ができることが確認できた。
B.longum Re-105A/pBifiCDとマルトースまたはラクツロースとの併用
(1)担癌ヌードマウスの作製と腫瘍体積の測定
実施例1および実施例2と同様にして担癌ヌードマウスの作製と腫瘍体積の測定を行った。
KPL-1担癌ヌードマウスの腫瘍体積が60〜90 mm3のマウス32匹を選別し、4群(1群8匹)に分け、下記(3)に示した群構成と投与スケジュールに従って、それぞれの被験薬物を投与した。
菌(B.longum Re-105A/pBifiCD)は、(3)群構成と投与スケジュールに従って、B.longum Re-105A/pBifiCD凍結製剤(2.3 x 109cfu/mL)を、マウスあたり0.3 mLを1日に2回、3日間(day 1〜3)静脈内に投与した。なお、菌の総投与量は4.1 x 109cfu/マウスであった。
12.5 mg/mLの5-FC溶液を、(3)に示す群構成と投与スケジュールに従い、対照群(A群)を除く2群のマウスに0.4 mLを1日に3回、経口投与(750mg/kg/day)した。投与期間は菌の最終投与翌日から21日間(day 4〜24)とした。
(3)に示す群構成と投与スケジュールに従い、10%マルトース注射液1 mLを1日に2回、マウスに腹腔内投与した。投与期間は菌(B. longum Re-105A/pBifiCD)の投与日から24日間(day 1〜24)とした。
なお、D群では、マルトースの代わりに同量の生理食塩液を同一スケジュール(day 1〜24)で投与した。
精製水で溶解した20%(w/v)ラクツロース溶液を、(3)に示す群構成と投与スケジュールに従い、1 mLを1日に1回マウスに腹腔内投与した。投与期間は菌の投与日から24日間(day 1〜24)としたが、投与期間中(day 13とday 19)に2例のマウスの死亡を確認したため、投与スケジュールを変更して、day 19以降の投与は中止した。
群構成と投与スケジュールを表11に示した。
試験観察最終日(day 25)及び翌日(day 26)に5-FCを1回のみ経口投与し1時間後にマウスを犠牲死させて腫瘍を摘出し、重量(g)を測定後、嫌気性希釈液にてホモジナイズした。
腫瘍内菌数の算出は、実施例1、(3)と同様にして算出した。
各群のマウスの腫瘍体積を経日的に測定し、平均値±SDで表示した。また抗腫瘍効果判定の指標として対照群に対する相対腫瘍体積比率〔T/C(%)〕を用いた。
対照群(A群)及び菌(B.longum Re-105A/pBifiCD)と糖類の併用投与群の腫瘍体積変動及びDay 4の腫瘍体積に対するDay 25の腫瘍体積で計算した腫瘍増殖率を表12に示した。
また抗腫瘍効果の指標としてT/C(%)を表13に示した。
糖源非併用群(D群)のday 25でのT/Cが51.3(%)(Student's t-test: p=0.013)であるのに対し、マルトース併用群(B群)のT/Cは38.5(%)(p=0.003)、ラクツロース併用群(C群)のT/Cは35.0(%)(p=0.002)と何れも腫瘍増殖抑制作用の増強効果が見られた。
さらに、本発明の形質転換微生物の生着・増殖促進剤は、本発明の形質転換微生物の治療的効果を改善し、同等の治療的効果を有したまま形質転換微生物の投与量を低減させることが出来、それにより処置される患者の負担を軽減することが出来る。
さらに、形質転換嫌気性微生物を含む医薬組成物と、生着・増殖促進剤を含む医薬組成物とを組み合わせて含む本発明の治療剤は、改善された治療的効果および低減された有効投与量、ならびに環境的および治療的観点から改善された安全性を有する、嫌気性疾患の治療剤としての有用性を有する。
Claims (22)
- 嫌気性疾患部位に送達するための嫌気的疾患治療剤であって、
嫌気性微生物を形質転換するための、該嫌気性微生物において複製されるが大腸菌において複製されないプラスミドベクターであって、該嫌気性微生物において機能するが大腸菌において機能しないプラスミド複製ユニットを含むプラスミドベクターで形質転換された嫌気性微生物を有効成分として含有する医薬組成物と、
上記嫌気性微生物の生着・増殖促進剤を有効成分として含有する医薬組成物
とを組み合わせてなる、嫌気的疾患治療剤。 - プラスミドベクターが、さらに、
目的とする活性を有する蛋白質をコードするDNAと嫌気性微生物で機能するプロモーターおよびターミネーターを含むDNA断片とからなる蛋白質発現ユニット
を含むプラスミドベクターである、請求項1に記載の疾患治療剤。 - 目的とする活性を有する蛋白質が、嫌気的環境下にある疾患の治療活性を有する蛋白質である、請求項2に記載の疾患治療剤。
- 嫌気的環境下にある疾患の治療活性を有する蛋白質が、(a)抗腫瘍活性を有する蛋白質、または(b)抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質である、請求項3に記載の疾患治療剤。
- 嫌気的環境下にある疾患の治療活性を有する蛋白質が、(b)抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質である、請求項4に記載の疾患治療剤。
- 嫌気性微生物が、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、エンテロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌およびクロストリジウム属細菌からなる群より選択される、請求項1に記載の疾患治療剤。
- 嫌気性微生物が、ビフィドバクテリウム属細菌である、請求項6に記載の疾患治療剤。
- ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、およびビフィドバクテリウム・ロンガムからなる群より選択される、請求項7に記載の疾患治療剤。
- ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムである、請求項8に記載の疾患治療剤。
- ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガム105−A/pBifiCD(独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター受領番号:NITE ABP−491)である、請求項9に記載の疾患治療剤。
- 抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質が、シトシン・デアミナーゼ、ニトロリダクターゼおよびβ−グルクロニダーゼからなる群より選択される、請求項5に記載の疾患治療剤。
- 抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質がシトシン・デアミナーゼである、請求項11に記載の疾患治療剤。
- 生着・増殖促進剤が、アラビノース、キシロース、ガラクトース、グルコース、マルトース、ラクトース、メリビオース、メレジトース、ラフィノース、ラクツロースからなる群より選択される少なくとも一種である、請求項1に記載の疾患治療剤。
- 生着・増殖促進剤が、グルコースまたはマルトースである、請求項13に記載の疾患治療剤。
- 生着・増殖促進剤が、マルトースである、請求項14に記載の疾患治療剤。
- 有効成分として、アラビノース、キシロース、ガラクトース、グルコース、マルトース、ラクトース、メリビオース、メレジトース、ラフィノース、ラクツロースからなる群より選択される少なくとも一種を含む、嫌気性疾患部位に送達するための形質転換嫌気性微生物の生着・増殖促進剤。
- 有効成分がグルコースまたはマルトースである、請求項16に記載の生着・増殖促進剤。
- 有効成分ががマルトースである、請求項17に記載の生着・増殖促進剤。
- さらに、(b)抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質によって抗腫瘍物質に変換される抗腫瘍物質前駆体を有効成分として含有する医薬組成物を組合せてなる、請求項5に記載の疾患治療剤。
- 抗腫瘍物質前駆体が5−フルオロシトシンである、請求項19に記載の疾患治療剤。
- プラスミド複製ユニットが、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、エンテロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌およびクロストリジウム属細菌からなる群より選ばれる嫌気性微生物で機能する、請求項6に記載の疾患治療剤。
- プラスミド複製ユニットが、ビフィドバクテリウム属細菌で機能する、OriV領域およびRepB遺伝子からなるpTB6 repユニットである、請求項7に記載のプラスミドベクター。
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