CN102046190B

CN102046190B - 用于缺氧疾病的治疗剂

Info

Publication number: CN102046190B
Application number: CN2009801205843A
Authority: CN
Inventors: 佐々木贵之; 清水瞳; 嶋谷-柴田裕子; 米仓弘美
Original assignee: Anaeropharma Science Inc
Current assignee: Asusa Medical Sciences Ltd.
Priority date: 2008-04-17
Filing date: 2009-04-17
Publication date: 2013-03-13
Anticipated expiration: 2029-04-17
Also published as: WO2009128272A4; JP5735804B2; HUE033561T2; US20110110893A1; US20130122582A1; US8383398B2; WO2009128272A9; PT2274422T; JP5514735B2; HUE039768T2; KR20100134765A; ES2686080T3; CA2721653A1; EP2280717A1; PT2280717T; KR101674977B1; PL2274422T3; EP2274422B1; US8470311B2; ES2628378T3

Abstract

本发明提供了用于例如实体瘤的缺氧疾病的治疗剂，其包含以下药物组合物的组合：用于治疗缺氧疾病的药物组合物，其含有作为活性组分的转化的厌氧微生物；以及药物组合物，其含有作为活性组分的、用于增强所述厌氧微生物在缺氧疾病位置的特异性建群和增殖的厌氧微生物建群和生长增强剂。此外，本发明提供了用于增强转化的厌氧微生物在缺氧环境中的疾病位置的建群和生长的厌氧微生物建群和生长增强剂。

Description

用于缺氧疾病的治疗剂

技术领域

相关申请的交叉引用

本申请要求2008年4月17日提交的美国临时申请第61/124,528号的优先权。美国临时申请第61/124,528的全部及其继续申请通过引用并入本申请。

发明领域

本发明涉及用于缺氧疾病的治疗剂，其包含新的转化的厌氧微生物，所述治疗剂含有以下药物组合物的组合：用于治疗缺氧疾病的药物组合物，其含有作为活性组分的所述转化的厌氧微生物；以及药物组合物，其含有作为活性组分的、用于增强所述厌氧微生物在缺氧疾病位置的建群和增殖的厌氧微生物建群和生长增强剂。此外，本发明涉及用于增强所述转化的厌氧微生物在缺氧环境中的疾病位置的建群和生长的厌氧微生物建群和生长增强剂。

背景技术

发明背景

近些年，作为用于治疗例如恶性肿瘤或缺血性疾病的缺氧环境中的疾病(下文称为“缺氧疾病”)的方法，例如作为用于治疗实体瘤的方法，使用转化的厌氧微生物作为基因转运体的方法已经引起了注意。例如，已经提出了使用转化的梭菌(Clostridium)将基因转运至肿瘤位置的方法(参见例如美国专利第6416754号和第6652849号，以及美国专利申请公布第2003/0103952号)。此外，已经提出了将转化的长双歧杆菌(Bifidobacterium(B.)longum)应用于实体瘤的治疗(参见例如JP A 2002-97144，Yazawa et al.，Cancer Gene Ther.，7，269-274(2000)，Yazawa et al.，Breast Cancer Res.Treat.，66，165-170(2001))。

使用表达载体来产生这些转化的微生物，所述表达载体例如在大肠杆菌和梭菌两者中复制的穿梭质粒pNTR500F、pCD540FT等(美国专利第6416754号和第6652849号，以及美国专利申请公布第2003/0103952号)或在大肠杆菌和双歧杆菌两者中复制的穿梭质粒pBLES100-S-eCD(JP A 2002-97144)。因为所有这些质粒载体是在大肠杆菌和转化的梭菌或双歧杆菌两者中复制的穿梭载体，所以用这些质粒载体转化的细菌具有这样的风险，即引入的基因可能横向转移到除了所述转化的细菌的其他的微生物，至少是兼性厌氧的大肠杆菌，并且环境风险和实际治疗中的问题是关心的。

此外，JP A 2002-97144描述：通过将乳果糖腹膜内给予已经给予了长双歧杆菌(B.longum)的小鼠，可以选择性地使长双歧杆菌在肿瘤组织中增殖。但是，其中描述的转化体是使用可以被横向转移到其他厌氧大肠杆菌等的质粒载体进行转化的，并且仍然遗留了关于其在缺氧疾病的治疗中安全和有效的使用的问题。

发明概述

技术问题

在使用转化的厌氧微生物治疗缺氧疾病的方法中，所使用的转化的厌氧微生物必须是非致病且无毒、仅在缺氧状态中的疾病组织中建群和生长，但是不在非缺氧状态中的正常组织中建群或生长，以及被引入所述转化的厌氧微生物中的基因不会被横向转移到除了所述转化的厌氧微生物的致病细菌或者需氧或兼性厌氧细菌。

此外，为了使用转化的厌氧微生物治疗缺氧疾病的方法完全表现出其治疗效果，所使用的转化的厌氧微生物需要不仅在缺氧疾病位置特异性建群，还能增殖到治疗有效量，并且在治疗期持续存在直到治疗期完成。另一方面，因为有活力的细胞是静脉内给予或给予到疾病组织中，所以所述转化的厌氧微生物的剂量优选地为尽可能地小，从而降低血管中的影响和患者的负担，因此，转化的厌氧微生物特异性地在缺氧疾病位置增殖并且通过必需的最小剂量增殖到治疗有效量是理想的。

因此，本发明的目的是提供用于缺氧疾病的治疗剂，在使用转化的厌氧微生物治疗缺氧疾病的方法中，所述治疗剂是安全且实用的，并且能以小剂量表现出效果。

问题的解决方法

为了解决以上问题，本发明人已进行大量的研究并且已经改进了穿梭质粒pBLES100-S-eCD以构建质粒pAV001-HU-eCD-M968(参见WO 2007-136107)。本发明人通过从其中移除pUC ori进一步改进了该质粒以构建质粒pBifiCD(参见美国临时申请第61/124,528号)，pUC ori是含有大肠杆菌复制起点的片段。因为该质粒不含有大肠杆菌的复制起点，所以用该质粒转化的细菌没有在大肠杆菌中复制的风险，即使发生向大肠杆菌的横向转移。因此其是非常安全的转化的厌氧微生物，并且可以用作缺氧疾病的实用治疗剂。由该质粒转化的细菌，例如长双歧杆菌105-A/pBifiCD(技术与评价专利微生物保藏国立研究所(National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary)(下文称为NPMD，

292-0818日本千叶县木更津市かずさ鎌足2-5-8，保藏日期：2008年2月19日)登录号NITE BP-491)表现出良好的胞嘧啶脱氨酶(CD)表达活性，并且通过将其与前药5-FC联合使用，表现出非常显著的肿瘤生长抑制作用，并且其作为优良的肿瘤治疗剂是有前途的，所述前药5-FC通过所述CD转变为抗肿瘤物质5-FU。但是，本发明人已发现另一问题，即该转化的细菌在有机体组织中没有足够的建群和生长能力，并且为了将对于治疗缺氧疾病足够的量的靶基因转运到例如实体瘤的靶组织，必须给予相对大量的转化的细菌。因此，从安全性和费用的观点而言，使所述细菌有效地建群和增殖的方法也是必需的。

作为本发明人为了改进含有例如作为活性组分的长双歧杆菌105-A/pBifiCD(NPMD登录号：NITE BP-491)的药物组合物作为缺氧疾病治疗剂的实用性的大量研究的结果，已经发现该转化的厌氧微生物与含有作为活性组分的某种类型的糖类的药物组合物的联合使用显著促进所述微生物在缺氧疾病位置的特异性建群和增殖，此外，可以维持所述微生物在缺氧疾病位置的增殖并且可以显著增强治疗效果。本发明人还发现通过联合使用该糖类，即使减少剂量的用于治疗缺氧疾病的转化的厌氧微生物可以与高剂量产生相同的治疗效果，从而改进作为缺氧疾病治疗剂的安全性。此外，因为这些糖类促进本发明的用于治疗缺氧疾病的转化的厌氧微生物在缺氧疾病位置的建群和生长，所以它们可以成为优良的厌氧微生物建群和生长增强剂。作为本发明人基于上述发现的进一步研究的结果，完成了本发明。

即本发明涉及

(1)含有以下组合的缺氧疾病治疗剂

药物组合物，其包含作为活性组分的由在厌氧微生物中发挥功能的表达载体所转化的转化的厌氧微生物，所述表达载体不含有在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制单元，和

药物组合物，其包含作为活性组分的所述转化的厌氧微生物在缺氧疾病位置的建群和增殖增强剂，

(2)如(1)所述的治疗剂，其中所述表达载体包含

1)质粒复制单元，其在除了大肠杆菌的厌氧微生物中发挥功能，和

2)蛋白表达单元，其包含编码具有靶活性的蛋白的DNA和包含在所述厌氧微生物中发挥功能的启动子和终止子的DNA片段，

(3)如(2)所述的治疗剂，其中所述具有靶活性的蛋白是对缺氧环境中的疾病具有治疗活性的蛋白，

(4)如(3)所述的治疗剂，其中所述对缺氧环境中的疾病具有治疗活性的蛋白是(a)具有抗肿瘤活性的蛋白或(b)具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白，

(5)如(4)所述的治疗剂，其中所述对缺氧环境中的疾病具有治疗活性的蛋白是(b)具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白，

(6)如(1)所述的治疗剂，其中所述厌氧微生物选自双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、肠球菌(Enterococcus)、链球菌(Streptococcus)和梭菌，

(7)如(6)所述的治疗剂，其中所述厌氧微生物是双歧杆菌，

(8)如(7)所述的治疗剂，其中所述双歧杆菌选自青春双歧杆菌(B.adolescentis)、动物双歧杆菌(B.animalis)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、嗜热双歧杆菌(B.thermophilum)、假长双歧杆菌(B.pseudolongum)、双歧双歧杆菌(B.bifidum)、短双歧杆菌(B.breve)和长双歧杆菌，

(9)如(8)所述的治疗剂，其中所述双歧杆菌是长双歧杆菌，

(10)如(9)所述的治疗剂，其中所述双歧杆菌是长双歧杆菌105-A/pBifiCD(NPMD登录号NITE BP-491)，

(11)如(5)所述的治疗剂，其中所述具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白选自胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶和b-葡糖醛酸糖苷酶，

(12)如(11)所述的治疗剂，其中所述具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白是胞嘧啶脱氨酶，

(13)如(1)所述的治疗剂，其中所述厌氧微生物的建群和增殖增强剂是至少1种选自以下的：阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、松三糖、棉子糖和乳果糖，

(14)如(13)所述的治疗剂，其中所述厌氧微生物的建群和增殖增强剂是葡萄糖或麦芽糖，

(15)如(14)所述的治疗剂，其中所述厌氧微生物的建群和增殖增强剂是麦芽糖，

(16)用于治疗缺氧疾病的厌氧微生物的建群和增殖增强剂，其包含作为活性组分的至少1种选自以下的：阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、松三糖、棉子糖和乳果糖，

(17)如(16)所述的用于治疗缺氧疾病的厌氧微生物的建群和增殖增强剂，其中所述活性组分是葡萄糖或麦芽糖，

(18)如(17)所述的用于治疗缺氧疾病的厌氧微生物的建群和增殖增强剂，其中所述活性组分是麦芽糖，

(19)如(1)所述的治疗剂，其中所述包含作为活性组分的所述厌氧微生物的建群和增殖增强剂的药物组合物是用于静脉内给药的制剂，

(20)如(19)所述的治疗剂，其中所述活性组分是葡萄糖或麦芽糖，

(21)如(5)所述的治疗剂，其还包含药物组合物，所述药物组合物包含作为活性组分的抗肿瘤物质前体，所述抗肿瘤物质前体由(b)具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白转变为抗肿瘤物质，以及

(22)如(21)所述的治疗剂，其中所述抗肿瘤物质前体是5-氟胞嘧啶。

发明的有利效果

本发明的用于缺氧疾病的治疗剂没有重组基因在大肠杆菌中复制的风险，并且其在环境观点和实际治疗中是非常安全的。此外，本发明的转化的厌氧微生物的建群和增殖增强剂通过促进用于治疗缺氧疾病的转化的厌氧微生物在疾病位置的特异性建群和增殖来改善治疗效果，并且能够使所述微生物的剂量降低。缺氧疾病治疗剂中，含有作为活性组分的本发明的用于治疗缺氧疾病的转化的厌氧微生物的药物组合物和含有作为活性组分的本发明的厌氧微生物建群和增殖增强剂的药物组合物进行组合，所述缺氧疾病治疗剂作为可以显著改善转化的厌氧微生物的治疗效果并能够使所述转化的厌氧微生物的剂量降低的安全的和优良的治疗剂是有前途的。

附图简述

图1是显示质粒“pBifiCD”的图谱的图。

图2是显示来自长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD和麦芽糖的联合使用的肿瘤增殖抑制作用的图。

实施方案描述

在一实施方案中，本发明提供包含以下药物组合物的组合的缺氧疾病治疗剂

药物组合物，其包含作为活性组分的用在所述厌氧微生物中发挥功能并且不包含在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制单元的表达载体所转化的转化的厌氧微生物，和

药物组合物，其包含作为活性组分的所述转化的厌氧微生物在缺氧疾病位置的建群和增殖增强剂。

本说明书中涉及的“包含药物组合物的组合的治疗剂”表示治疗剂，其是通过混合至少两种类型的药物组合物而产生的新的药物组合物，或包含至少两种类型的在治疗中联合使用的药物组合物的疾病治疗剂。当至少两种类型的药物组合物联合使用时，所述药物组合物可以同时使用或可以以固定间隔分别使用。

本发明的用于治疗缺氧疾病的转化的厌氧微生物是用表达载体转化的厌氧微生物，所述表达载体是在厌氧细菌中发挥功能，特别是除了大肠杆菌的肠细菌中发挥功能的质粒载体，所述除了大肠杆菌的肠细菌例如双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌、链球菌或梭菌。本发明的表达载体不含有在除了所述转化的细菌的细菌中发挥功能，特别是在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制单元。

迄今报道的用于治疗缺氧疾病的转化的厌氧微生物是由在大肠杆菌和转化的细菌两者中发挥功能的穿梭载体所转化的，并且它们中没有用仅在非大肠杆菌转化体中发挥功能的表达载体转化。因此，引入的基因可以被横向转移到除了所述转化的厌氧细菌的致病细菌或者需氧或兼性厌氧细菌，并且关注环境风险和实际治疗中的风险。

另一方面，本发明的转化的厌氧微生物已经用不含有在除了所述转化体的细菌中发挥功能，特别是在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制单元的表达载体所转化，即使发生向大肠杆菌的横向转移，也没有在大肠杆菌中复制的可能性，并且在环境方面和实际治疗中是非常安全的。

更具体地，在本发明的用于治疗缺氧疾病的厌氧微生物的转化中使用的表达载体特征在于，例如所述表达载体基本上由以下组成：(1)质粒复制单元，其在除了大肠杆菌的厌氧微生物中发挥功能，和(2)蛋白表达单元，其基本上由编码具有靶活性的蛋白的DNA和含有在所述厌氧微生物中发挥功能的启动子和终止子的DNA片段所组成，并且所述表达载体不包含在除了所述转化体的细菌中发挥功能，特别是在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制单元。

作为所述表达载体具有的在除了大肠杆菌的厌氧微生物中发挥功能的质粒复制单元，可以使用任何质粒复制单元，只要其在除了大肠杆菌的厌氧微生物中发挥功能，例如在诸如双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌、链球菌或梭菌的肠细菌中发挥功能，并且不在除了所述转化的细菌的厌氧微生物中发挥功能；质粒复制单元的实例包括在除了大肠杆菌的厌氧微生物中发挥功能的质粒复制单元，例如在双歧杆菌中发挥功能的质粒复制单元，并且质粒复制单元的具体实例包括形成自在双歧杆菌中发挥功能的OriV区和RepB基因的pTB6 rep单元及其单核苷酸多态性。

此外，作为所述表达载体的蛋白表达单元的启动子和终止子，可以使用任何启动子和终止子，只要其在厌氧微生物中发挥功能，例如在诸如双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌、链球菌或梭菌的肠细菌中发挥功能；启动子和终止子的实例包括编码组蛋白样DNA-结合蛋白的基因的、在厌氧微生物中发挥功能的启动子和终止子，例如，编码双歧杆菌来源的组蛋白样DNA-结合蛋白的基因的启动子和终止子DNA或其单核苷酸多态性。

本发明的表达载体还可以包含选择标记活性基因单元。所述选择标记活性不是特别限定的，只要其能够选择由本发明的质粒载体所转化的厌氧微生物；选择标记活性的实例包括抗药性标记和营养缺陷型，所述抗药性标记例如壮观霉素抗性、氨苄西林抗性、四环素抗性、新霉素抗性或卡那霉素抗性，并且壮观霉素抗性是优选的。

选择标记活性基因单元的实例包括包含编码表现出壮观霉素抗性活性的蛋白的DNA的DNA或其单核苷酸变体，及其启动子序列，例如编码粪肠球菌(Enterococcus faecalis)来源的壮观霉素腺苷酸转移酶(adenyltransferase)的DNA(下文称为AAD9盒)及其单核苷酸多态性。

本文涉及的“单核苷酸变体”表示单核苷酸多态性，其中至少1个位点的核苷酸已被改变(下文称为SNP)，并且不仅包括仅在1个位点的SNP，还包括许多位点的SNP。

作为插入表达载体的蛋白表达单元的基因，可以使用任何基因，只要其表达对缺氧环境中的疾病的具有治疗活性的蛋白；例如，当本发明的缺氧疾病治疗剂用作恶性肿瘤治疗剂时，具有抗肿瘤活性的蛋白或具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白，并且只要所述基因不是例如巨大DNA(至少约10kb)的抑制转化的DNA或对于接受体细胞有毒的DNA。

由所述基因表达的具有抗肿瘤活性的蛋白包括，例如细胞因子，并且细胞因子的具体实例包括干扰素(IFN)-α、β和γ，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，白介素(IL)-1α、1β、2、3、4、6、7、10、12、13、15和18，肿瘤坏死因子(TNF)-α，淋巴毒素(LT)-β，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，巨噬细胞移动抑制因子(MIF)，白血病抑制因子(LIF)，T-细胞活化共刺激因子B7(CD80)和B7-2(CD86)，KIT配体以及制瘤素M。此外，实例包括血管发生抑制物质，例如内皮抑制素、血管抑制素(angiostatin)和三环(kringle)1、2、3、4和5。

这些蛋白的序列对于不同生物是已知的，并且通过利用例如基于所述序列信息的PCR方法的已知技术来获得本发明中使用的编码具有抗肿瘤活性的蛋白的DNA是可能的。

此外，具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白的实例包括：胞嘧啶脱氨酶(下文称为CD)，其是将5-氟胞嘧啶(下文称为5-FC)转变为抗肿瘤活性物质5-氟尿嘧啶(下文称为5-FU)的酶；硝基还原酶，其是将5-氮杂环丙基-2，4-二硝基苯甲酰胺(下文称为CB1945)转变为抗肿瘤活性烷化剂的酶；1型单纯疱疹病毒胸苷激酶(下文称为HSV1-TK)，其是将更昔洛韦转变为抗肿瘤活性代谢产物的酶；以及β-葡糖醛酸糖苷酶，其是将葡糖醛酸化的抗肿瘤活性物质转变为抗肿瘤活性物质的酶，并且具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白的优选实例包括CD，其是将5-FC转变为5-FU的酶。

作为编码这样的CD的DNA，可以使用例如，分离自含有编码大肠杆菌来源的CD的DNA的质粒pAdex 1 CSCD(Riken Gene Bank RDB No.1591)的DNA，或分离自类似地含有编码大肠杆菌来源的CD的DNA的质粒pMK116(D.A.Mead et al.，Protein Engineering 1：67-74(1986))的DNA。

此外，当本发明的用于缺氧疾病的治疗剂被用作缺血性疾病的治疗剂时，插入本发明的表达载体的蛋白表达单元的基因可以包括具有血管生成促进活性的蛋白，这对于缺血性疾病的治疗是有用的。具体实例包括成纤维细胞生长因子2(FGF2)、内皮细胞生长因子(ECGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF)。

类似地，这些蛋白的序列对于不同生物是已知的，并且通过利用例如基于所述序列信息的PCR方法的已知技术获得本发明中使用的编码具有血管生成促进活性的蛋白的DNA是可能的。

本发明的用于治疗缺氧疾病的厌氧微生物的转化的表达载体包括任何质粒，只要所述质粒包含，例如，质粒复制单元，其在除了大肠杆菌的厌氧微生物中发挥功能；和蛋白表达单元，其包含编码具有靶活性的蛋白的DNA和包含在所述厌氧微生物中发挥功能的启动子和终止子的DNA片段，并且当转化厌氧微生物时，所述质粒在该厌氧微生物中发挥功能，但是所述质粒不含有在除了所述转化的细菌的细菌中发挥功能，特别是在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制单元。

质粒的实例包括将包含编码具有靶活性的给定蛋白的DNA和包含在所述厌氧微生物中发挥功能的启动子和终止子的DNA片段的蛋白表达单元引入已经在公布中报道的穿梭质粒pBLES 100(Matsumura et al，，Biosci.Biotechnol.Biochem.，61，1211-1212(1997))、pAV001(WO 2006-57289)、pBRASTA101(Tanaka et al.Biosci.Biotechnol.Biochem.，69(2)：422-425(2005))、pDG7、pEBM3、pECM2、pLP825等(Alessandra Argnani et al.，Microbiology，142：109-114(1996))，并且移除在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制单元而构建的那些。

质粒的其他实例包括通过将插入例如pNTR500F、pCD540FT等(美国专利第6416754号和第6652849号，以及美国专利申请公布第2003/0103952号)、pBLES100-S-eCD(JP A 2002-97144)、pAV001-HU-eCD-M968(WO 2007-136107)的质粒的蛋白表达单元与另一给定的蛋白表达单元进行重组，并进一步从中移除在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制单元而构建的穿梭质粒。

本发明的表达载体的具体实例包括包含以下的载体：pTB6 rep单元，其包含RepB基因和OriV区，所述RepB基因和OriV区在双歧杆菌中作为在除了大肠杆菌的厌氧微生物中发挥功能的质粒复制单元而发挥功能；和作为包含在所述厌氧微生物中发挥功能的启动子和终止子的DNA片段的编码双歧杆菌来源的组蛋白样DNA-结合蛋白的基因的启动子和终止子；和作为编码具有靶活性的蛋白的DNA的编码将5-FC转变为5-FU的CD酶的DNA；以及作为选择标记活性基因单元的编码粪肠球菌来源的壮观霉素腺苷酸转移酶的DNA(AAD9盒)。

本发明的表达载体的更多具体实例包括由SEQ ID NO：1的核苷酸序列所示的pBifiCD。

可以按照例如美国临时申请第61/124,528号中的描述来构建在本发明的用于治疗缺氧疾病的厌氧微生物的转化中使用的表达载体。

因此，本发明的表达载体可以通过以下构建

(1)构建质粒，其包含例如pUC ori的大肠杆菌复制起点，以及可选的选择标记活性基因单元，例如AAD9盒(下文称为选择标记质粒)(步骤1)，

(2)制备选择标记质粒的线性质粒，将其与例如编码双歧杆菌来源的组蛋白样DNA-结合蛋白的基因的启动子和终止子的启动子和终止子以及(a)具有抗肿瘤活性的蛋白或(b)例如包含CD的片段的具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白(下文称为蛋白表达单元)连接，以构建具有选择标记活性基因单元和蛋白表达单元的质粒(下文称为选择标记活性蛋白质粒)(步骤2)，

(3)制备该选择标记活性蛋白质粒的线性质粒，将其与例如形成自在双歧杆菌中发挥功能的RepB基因和OriV区的pTB6 rep单元的DNA片段的在除了大肠杆菌的厌氧微生物中发挥功能的质粒复制单元(下文称为质粒复制单元)连接，以构建具有大肠杆菌复制起始位点和选择标记活性基因单元、蛋白表达单元和质粒复制单元的质粒(下文称为穿梭质粒)(步骤3)，以及

(4)从该穿梭质粒移除大肠杆菌复制起始位点(下文称为步骤4)。

可以按照文献中描述的已知方法进行每个步骤的操作。

本发明的表达载体还可以通过以下构建：通过标准方法将蛋白表达单元插入上文提及的各种类型的穿梭质粒，例如穿梭质粒pBLES100(Matsumura et al.，Biosci.Biotechnol.Biochem.，61，1211-1212(1997))、pAV001(WO 2006-57289)、pBRASTA101(Tanaka et al.，Biosci.Biotechnol.Biochem.，69(2)：422-425(2005))、pDG7、pEBM3、pECM2、pLP825等(Alessandra Argnani et al.，Microbiology，142：109-114(1996))和pNTR500F、pCD540FT等(美国专利第6416754号和第6652849号，以及美国专利申请公布第2003/0103952号)，然后类似地通过标准方法移除在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制单元，所述蛋白表达单元包含编码具有靶活性的给定蛋白的DNA和含有在所述厌氧微生物中发挥功能的启动子和终止子的DNA片段。

此外，以与上文的本发明的质粒pBifiCD相同的方式，其中含有大肠杆菌复制起点的片段pUC ori被从质粒pAV001-HU-eCD-M968(WO 2007-136107)移除，本发明的表达载体还可以通过以下构建：从质粒pNTR500F、pCD540FT(美国专利第6416754号和第6652849号，以及美国专利申请公布第2003/0103952号)、pBLES100-S-eCD(JP A 2002-97144)等移除在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制单元。

此外，本发明的表达载体也可以通过以下构建：将插入质粒pNTR500F、pCD540FT(美国专利第6416754号和第6652849号，以及美国专利申请公布第2003/0103952号)、pBLES100-S-eCD(JPA 2002-97144)、pAV001-HU-eCD-M968(WO 2007-136107)等的蛋白表达单元与另一给定蛋白表达单元进行重组，然后从中移除在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制单元。

本发明的用于治疗缺氧疾病的转化的厌氧微生物可以通过以下构建：按照已知遗传改造方法，使用上文提及的表达载体转化待转化的给定厌氧微生物。

因为本发明的用于治疗缺氧疾病的转化的厌氧微生物在治疗例如实体瘤的缺氧疾病的试剂中使用，所以该厌氧微生物必须是专性厌氧和非致病的；可以使用例如梭菌或沙门氏菌(Salmonella)的致病细菌，如果它们成为非致病的，并且可以使用例如乳酸杆菌的兼性厌氧细菌，如果其被突变为专性厌氧的。

优选的实例包括非致病厌氧细菌；非致病的肠细菌是更优选的，其中双歧杆菌是最优选的。

双歧杆菌的实例包括青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、假长双歧杆菌、双歧双歧杆菌、短双歧杆菌和长双歧杆菌，并且长双歧杆菌是最优选的。

这些细菌是商业上可获得的或容易地从保藏机构获得。例如，长双歧杆菌ATCC-15707、双歧双歧杆菌ATCC-11863、婴儿双歧杆菌ATCC-15697等可以容易地从ATCC(美国典型培养物保藏中心(The American Type Culture Collection))获得。

每种细菌的菌株不是特别限定的，并且长双歧杆菌的菌株的实例包括长双歧杆菌105-A菌株、长双歧杆菌aE-194b菌株、长双歧杆菌bs-601菌株和长双歧杆菌M101-2菌株，其中长双歧杆菌105-A菌株是优选的。

短双歧杆菌的菌株的实例包括短双歧杆菌标准菌株(日本微生物保藏中心 (Japan Collection of Microorganisms)(JCM)1192)、短双歧杆菌aS-1菌株和短双歧杆菌I-53-8W菌株，其中短双歧杆菌标准菌株和短双歧杆菌aS-1菌株是优选的。

婴儿双歧杆菌的菌株的实例包括婴儿双歧杆菌标准菌株(JCM1222)和婴儿双歧杆菌I-10-5菌株，其中婴儿双歧杆菌标准菌株和婴儿双歧杆菌I-10-5菌株是优选的。

此外，乳双歧杆菌(B.lactentis)的菌株的实例包括乳双歧杆菌标准菌株(JCM1220)。

本发明的转化的厌氧微生物不是特别限定的，只要其能够在缺氧环境中的组织中生长并表达具有靶活性的蛋白，而且没有保留的表达载体向除了转化的细菌的细菌的横向转移的风险，特别是横向转移到致病或需氧或兼性厌氧微生物的风险。

本发明的转化的厌氧微生物的优选的实例包括转化的厌氧微生物，所述转化的厌氧微生物能够在缺氧环境中的肿瘤组织中生长并表达具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白。本发明的转化的厌氧微生物的更优选的实例包括形成自能够在缺氧环境中的肿瘤组织中生长并表达将5-FC转变为5-FU的酶CD的双歧杆菌的基因转运体，并且本发明的转化的厌氧微生物的特别优选的实例包括由pBifiCD转化的长双歧杆菌105-A菌株(长双歧杆菌105-A/pBifiCD；NPMD登录号NITE BP-491)。

可以按照商业实验教科书中描述的方法构建本发明的基因转运体，例如Gene Manual(基因手册)(Kodansha)、Gene Manipulation Experimental Method(基因操作实验方法)，Ed.作者Yasuyuki Takagi(Kodansha)、Molecular Cloning(分子克隆)，Cold Spring Harbor Laboratory(1982)、Molecular Cloning 2nd Edition(分子克隆第2版)，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)或Methods in Enzymol.(酶学方法)，194(1991)。

本发明的转化的厌氧微生物通过将其与用于促进微生物在靶机体组织中的建群和增殖的建群和增殖增强剂联合使用，表现出更好的对于缺氧疾病的治疗效果。

本发明中可以使用任何厌氧微生物建群和增殖增强剂，只要其能改善本发明的转化的厌氧微生物在缺氧疾病位置特异性建群和增殖，只要其是安全的并可以静脉内给药。厌氧微生物建群和增殖增强剂的实例包括糖类，例如阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、松三糖、棉子糖和乳果糖。

其中，葡萄糖、乳果糖和麦芽糖是优选的，并且麦芽糖是最优选的。

包含作为活性组分的本发明的转化的厌氧微生物的药物组合物不是特别限定的，只要其包含本发明的转化的厌氧微生物。此外，包含作为活性组分的本发明的转化的厌氧微生物的药物组合物可以包含两种或更多种本发明的转化的厌氧微生物。此外，本发明的药物组合物或缺氧疾病治疗剂可以与含有除了本发明的基因转运体的、表现出对缺氧疾病的治疗效果的化合物的药物组合物或治疗剂联合使用。

用于治疗缺氧疾病的、含有作为活性组分的本发明的转化的厌氧微生物的药物组合物形式的实例包括含有所述转化的厌氧微生物的液体试剂或固体制剂。液体试剂可以通过纯化本发明的转化的厌氧微生物的培养液，按照要求向其添加适当的生理盐水、液体替换品或医药添加剂，并用其填装安瓿、小瓶等而产生。固体制剂可以通过向液体试剂添加合适的保护剂，用其填装安瓿、小瓶等，然后冻干或L-干燥而产生，或通过向液体试剂添加合适的保护剂，将其冻干或L-干燥，然后用其填装安瓿、小瓶等而产生。

对于含有作为活性组分的本发明的转化的厌氧微生物的药物组合物的给药方法，口服给药和肠胃外给药两者都是可以的，但肠胃外给药是优选的，例如可以进行静脉内注射、皮下注射、局部输注或脑室内给药，并且静脉内注射是最优选的

本发明的用于治疗缺氧疾病的转化的厌氧微生物的剂量不是特别限定的，只要其对于在缺氧疾病位置建群并生长以表达有效治疗剂量的活性蛋白是足够的量，但是从最大程度地减轻患者在给药中的负担的观点，剂量优选为尽可能地小。

当在实际治疗中使用时，用于治疗缺氧疾病的转化的厌氧微生物的剂量根据疾病的严重程度和患者的体重、年龄或性别适当选择，并且可以视情况根据改善程度增加或减少。例如，剂量根据所使用的厌氧微生物产生的活性蛋白的有效治疗剂量、所使用的厌氧微生物产生的活性蛋白的量等适当设定。

具体地，在静脉内给药的情况下，为了避免例如由于大量细菌的栓塞风险，优选使用以尽可能低浓度的注射，将注射分为多次注射或用适当的输液液体稀释注射并且通过连续输注给药。例如，在成人的情况下，每天一次至多次给予 10⁶cfu至10¹²cfu每千克体重的转化的厌氧微生物细胞，视情况连续或间隔地进行给药，并且持续1天至多天。更具体地，每成人直接给予1mL至1000mL含有10⁴cfu/mL至10¹⁰cfu/mL的转化的厌氧微生物细胞的制剂，或用适当的液体代替品稀释，并且优选地将其分为1天1次至多次、持续1天至多天连续给药。

此外，在涉及直接对疾病组织直接给药的局部给药的情况下，因为必须要使细菌细胞在整个疾病组织中尽可能多地建群和增殖，所以给予高浓度注射是理想的，理想地在疾病组织的多个位置进行给药。例如，在成人的情况下，每天一次或多次给予10⁶cfu至10¹²cfu每千克体重的本发明的厌氧微生物细胞，视情况连续或间隔地进行给药，并且按照需要持续1天至多天。更具体地，每成人每天多次直接给予1mL至1000mL含有10⁴cfu/mL至10¹⁰cfu/mL的本发明的厌氧微生物细胞的制剂，并且按照需要持续1天至连续多天。

当在治疗期间观察到疾病组织中的细菌已消失，则首先暂停治疗，然后以与上文相同的方式再次给予细菌。

包含作为活性组分的本发明的厌氧微生物建群和增殖增强剂的药物组合物的实例包括包含所述厌氧微生物建群和增殖增强剂的液体试剂或固体制剂。液体试剂可以通过以下产生：在用于注射的水中溶解所述厌氧微生物建群和增殖增强剂，视情况向其中添加例如缓冲剂、等渗剂、稳定剂或pH调整剂的适当药物添加剂，进一步灭菌，并且然后装入袋中或输液瓶中。此外，所述固体制剂可以通过将所述厌氧微生物建群和增殖增强剂与例如缓冲剂、等渗剂、稳定剂或pH调整剂的适当的药物添加剂混合来产生。当给予该固体制剂时，通过将其在用于注射的灭菌水、生理盐水等中溶解来进行给药。

作为本发明的厌氧微生物建群和增殖增强剂的药物组合物的给药方法，静脉内给药是最优选的，但是按需要可以通过皮下注射、局部输注、脑室内给药等进行，并且也可以进行口服给药。

本发明的厌氧微生物建群和增殖增强剂的剂量不是特别限定的，只要该剂量是使本发明转化的厌氧微生物能在缺氧疾病位置特异性建群、增殖为有效治疗量，并且在治疗期中持续存在直至完成的量，但是其优选地为具有对于患者或疾病组织尽可能小的影响的量。

实际治疗中使用的剂量根据患者的体重、年龄或性别适当地选择，并且可以视情况根据本发明的用于治疗缺氧疾病的转化的厌氧微生物的剂量而增加或减少。

具体地，例如，当将含有作为活性组分的麦芽糖的厌氧微生物建群和增殖增强剂用于成人时，用于静脉内给药的10％麦芽糖溶液以3mL至20mL每千克体重、每天1次进行给药，并且优选地以5mL至10mL每千克体重、每天1次进行给药。更具体地，用于静脉内给药的10％麦芽糖溶液制剂在治疗期以200mL至600mL每成人、每天1次连续给药。

本发明的厌氧微生物建群和增殖增强剂在给予本发明的转化的厌氧微生物时，可以作为用于稀释细菌的输注液体进行给药。

此外，本发明的用于缺氧疾病的药物组合物或治疗剂可以含有除了本发明的转化的厌氧微生物或厌氧微生物建群和增殖增强剂的其他组分，只要本发明的效果不受影响。这些其他组分的实例包括药学上可接受的支持物、赋形剂和稀释剂。

当本发明的转化的厌氧微生物是引入了基因的厌氧细菌，所述基因可以表达具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白时，将包含作为活性组分的用于治疗缺氧疾病的转化的厌氧微生物的用于缺氧疾病的药物组合物或治疗剂与可以由转化的厌氧微生物所表达的蛋白转变为有效量的抗肿瘤物质的一定量的抗肿瘤物质前体联合使用。

该抗肿瘤物质前体可以包含在用于缺氧疾病的药物组合物或治疗剂中，所述药物组合物或治疗剂含有作为活性组分的本发明的转化的厌氧微生物，但是优选与含有作为活性组分的本发明的用于治疗缺氧疾病的转化的厌氧微生物的用于缺氧疾病的药物组合物或治疗剂联合使用含有所述抗肿瘤物质前体的药物组合物。

在本发明中使用的抗肿瘤物质前体不是特别限定的，只要其在前体(前药)状态对于正常组织具有较少的副作用，并且在转变为抗肿瘤物质后，对于缺氧疾病的治疗靶标具有高治疗效果，该抗肿瘤物质前体的实例包括5-FC，其是5-FU的前药；CB1945，其被转变为抗肿瘤活性烷化剂；更昔洛韦，其被转变为抗肿瘤活性代谢物；以及葡糖醛酸化的抗肿瘤活性物质。

因此，当将本发明的用于缺氧疾病的药物组合物或治疗剂与抗肿瘤物质前体联合使用时，给予本发明的用于缺氧疾病的药物组合物或治疗剂的方法可以与给予含有抗肿瘤物质前体的药物组合物的方法相同或不同，并且这些给药可以同时进行或在分别的时间进行；给予含有抗肿瘤物质前体的药物组合物优选地在给予本发明的用于缺氧疾病的药物组合物或治疗剂后，允许足够的时间以使本发明的转化的厌氧微生物在肿瘤细胞上生长之后进行。

此外，当将本发明的用于缺氧疾病的药物组合物或治疗剂与抗肿瘤物质前体联合使用时，因为用于治疗缺氧疾病的转化的厌氧微生物仅在缺氧环境中的肿瘤组织中建群和增殖，并且在那里局部地产生活性蛋白，所以与使用普通抗肿瘤物质前体治疗实体瘤的方法相比，可以显著抑制副作用，并且抗肿瘤物质前体的剂量可以设定在宽范围内。

抗肿瘤物质前体的剂量可以根据联合使用的转化的厌氧微生物在肿瘤组织中的增殖速率和抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的效率适当选择。以与对于基因转运体的剂量的相同的方式，可以视情况根据疾病的严重程度和患者的体重、年龄或性别进行选择，并且可以视情况根据改善程度增加或减少。

例如，在实际治疗中，剂量是根据以下适当设定：使用的抗肿瘤物质前体和将转变为的抗肿瘤物质的类型、转变自抗肿瘤物质前体的抗肿瘤物质的有效治疗剂量、所使用的厌氧微生物产生的具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白的类型以及所使用的厌氧微生物产生的活性蛋白的量等

具体地，例如，当将表达CD的转化的厌氧微生物与抗肿瘤物质前体5-FC联合给药时，在确认细菌已在疾病组织中建群和生长，并且细菌已经在血液和正常组织消失后，以1mg/天至100mg/天每成人千克体重、每天1次或多次、在治疗期连续给予5-FC。给药方法优选为口服给药，但是可以进行例如静脉内给药或肛门给药的肠胃外给药。

本发明涉及的“X和Y的组合”包括X和Y各自在不同配置(configuration)的情况以及X和Y在单一配置的情况(例如含有X和Y的配置)。当X和Y在不同配置时，X和Y还可以各自含有另一组分。

本发明的用于缺氧疾病的药物组合物或治疗剂可以应用于具有缺氧环境的疾病，并且优选地应用于不同类型的实体癌。实体癌的实例包括大肠癌、脑瘤、头颈癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、胰腺癌、胰岛细胞癌、绒毛膜癌、结肠癌、肾细胞癌、肾上腺皮质癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌、睾丸肿瘤、卵巢癌、子宫癌、甲状腺癌、恶性类癌瘤、皮肤癌、恶性黑色素瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤、成神经细胞瘤、维尔姆斯肿瘤(Wilm’s tumor)、成视网膜细胞瘤、黑色素瘤和鳞癌。

此外，在缺氧环境中的其他疾病的实例包括缺血性疾病，例如心肌梗死或闭塞性动脉硬化，以及下肢缺血性疾病，例如伯格病(Buerger’s disease)。

实施例

结合参考实施例和实施例，本发明在下文更具体地进行解释，但是本发明的技术范围不局限于这些实施例。

长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD(NITE BP-491)冷冻制剂的产生

将2mL的通过美国临时申请第61/124,528号中所述的方法产生的长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD的培养液倒入2L的培养基(APS-2S-2.5R培养基)，并在约40℃下厌氧培养18至21小时，该APS-2S-2.5R培养基是通过添加葡萄糖、大豆肽(Hinute(商标)SMP)、盐酸半胱氨酸、泛酸钾、生物素、烟酸、核黄素、盐酸硫胺素、抗坏血酸、碳酸钠、对氨基苯甲酸、胸苷、硫酸镁、硫酸锰、氯化钠、磷酸二氢钾、氯化铁等来制备。

培养完成后，使用装有孔径为0.8微米的超滤膜(产品号FS001K05，Pall Corporation)的滤器，通过过滤来纯化细菌液体，从而得到纯化的细菌液体。

将用于注射的水添加到100g的甘油从而将总量补足为1L，并且使用装有孔径为0.2微米的滤膜将其过滤，然后在121℃下高压灭菌20分钟，从而得到10％甘油溶液。

将等量的10％甘油溶液添加到纯化的细菌液体，以得到5％甘油制剂溶液，并且每个30mL容积小瓶容器装入10mL的5％甘油制剂溶液，填入无菌过滤的氮气，然后密封。

随后，使用液氮将小瓶冷冻并在低温冰箱中保存。

长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD(NITE BP-491)的各种类型糖类的同化作用

使用API 50CH和API 20A确认长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD(NITE BP-491)的各种类型糖类的同化作用。

通过标准方法，将菌落悬浮于API 50CH或API 20A培养基中，调整混浊度，然后接种试剂盒平板，进行培养，并且培养24小时和48小时后通过颜色变化来进行评价。基于48小时后的结果进行评价。

API 50CH和API 20A测试的每个由两个测试员进行两次。

对甘油、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、甘露醇、山梨醇、水杨苷、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、松三糖和棉子糖进行了API 20A测试，但因为其他糖类没有包括为测试项，所以未对其他糖类进行测试。

基于API 50CH和API 20A最终评价，进行总体评价。

基于对于API 50CH和API 20A中每个的4个测试结果(由两个测试员中的每个进行两次测试)，进行API 50CH和API 20A最终评价。

当API 50CH和API 20A最终评价不同时，因为API 20A是为双歧杆菌设计的试剂盒，所以使用API 20A评价，并且对于除了API 20A的那些的测试项，使用API 50CH评价。

结果为是单糖的L-阿拉伯糖、D-木糖、半乳糖和葡萄糖，是二糖的麦芽糖、乳糖和蜜二糖以及是三糖的松三糖和棉子糖显示为阳性，并且是单糖的核糖和果糖以及是二糖的蔗糖显示为弱阳性。

表1中给出测试结果。在表中，(+)表示阳性，(-)表示阴性，并且(w)表示弱阳性，以及(v)和(wv)表示测试结果中的变异性。

API 20A栏中的(NT)表示未进行测试(非测试项)。

表1 各种糖类的同化作用

编号	测试物质	API 50CH	API 20A	总体评价
					1	甘油	-	-	-
2	赤藓糖醇	-	NT	-
					3	d-阿拉伯糖	-	NT	-
4	l-阿拉伯糖	+	+	+
					5	核糖	wv	NT	wv
6	d-木糖	+	+	+
					7	l-木糖	-	NT	-
8	阿东糖醇	-	NT	-
					9	β-甲基-d-木糖苷	-	NT	-
10	半乳糖	+	NT	+
					11	葡萄糖	+	+	+
12	果糖	wv	NT	wv
					13	甘露糖	-	v	v
14	山梨糖	-	NT	-
					15	鼠李糖	-	+	-
16	半乳糖醇	-	NT	-
					17	肌醇	-	NT	-
18	甘露醇	-	-	-
					19	山梨醇	-	-	-
20	α-甲基-d-甘露糖苷	-	NT	-
					21	α-甲基-d-葡糖苷	-	NT	-
22	n-乙酰葡糖胺	-	NT	-

[0146]

23	苦杏仁苷	-	NT	-
					24	熊果苷	-	NT	-
25	七叶苷	-	NT	-
					26	水杨苷	-	-	-
27	纤维二糖	-	-	-
					28	麦芽糖	+	+	+
29	乳糖	+	+	+
					30	蜜二糖	+	NT	+
31	蔗糖	-	wv	wv
					32	海藻糖	-	-	-
33	菊糖	-	NT	-
					34	松三糖	+	+	+
35	棉子糖	+	+	+
					36	淀粉	-	NT	-
37	糖原	-	NT	-
					38	木糖醇	-	NT	-
39	龙胆二糖	-	NT	-
					40	d-松二糖	-	NT	-
41	d-来苏糖	-	NT	-
					42	d-塔格糖	-	NT	-
43	d-岩藻糖	-	NT	-
					44	l-岩藻糖	-	NT	-
45	d-阿拉伯糖醇	-	NT	-
					46	l-阿拉伯糖醇	-	NT	-
47	葡糖酸	-	NT	-
					48	2-酮葡糖酸	-	NT	-
49	5-酮葡糖酸	-	NT	-

长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD和葡萄糖的联合使用

(1)荷瘤(tumor-bearing)裸小鼠的制备

以5×10⁵细胞/小鼠/0.2mL将人乳腺癌细胞系KPL-1细胞移植到裸小鼠的右前肢背侧的皮肤下。使用测径仪(Digimatic Caliper，CD-15PS，Mitutoyo，Kanagawa)测量肿瘤的尺寸(大直径、小直径、厚度)，并且根据下文的公式测定肿瘤体积。在给予长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD前那天(第-1天)和给予长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD后7天(第7天)测量肿瘤体积。

肿瘤体积(mm³)＝大直径(mm)×小直径(mm)×厚度(mm)/2

(2)长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD冷冻制剂、10％葡萄糖溶液和生理盐水的给药

从61只KPL-1荷瘤裸小鼠中选择22只具有80mm³至150mm³级别的肿瘤体积的荷瘤裸小鼠，并以相同水平的肿瘤体积作为标准分为2组(每组11只小鼠)。使用Myjector(29G×1/2，TERUMO，Tokyo)将长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD冷冻制剂静脉内给予每组的小鼠，每次0.05mL，每天4次(4次给药之间的间隔为1小时，并且在给药期间将制剂保留在室温)(第0天)。

从给予长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD之后的那天(第1天)，使用注射针(25G×1 R.B.，TERMO)将10％葡萄糖溶液腹膜内给予第一组[葡萄糖(+)组]，每次1mL，每天2次(A.M./P.M.)，并且随后每天给予相同的量，持续6天直至移除组织前的那天(第6天)。此外，通过相同方法将生理盐水给予第二组[葡萄糖(-)组]。

(3)对于长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD(NITE BP-491)的肿瘤中细菌数的测量

给予制剂后7天(第7天)，将小鼠无痛处死，移除肿瘤，并使用电子天平(AB104-S，METTLER TOLEDO，Tokyo)测量重量(g)。测量后，使用剪刀将肿瘤精细地剪为碎块状，将肿瘤置于匀浆器管(HOMOGENIZER，SANSYO，Tokyo)，以肿瘤重量(g)∶厌氧稀释剂(mL)＝1∶9的比例向其中添加厌氧稀释剂，并使用匀浆器(NZ-1300，EYELA)以300rpm将混合物破碎。用厌氧稀释剂稀释匀浆的肿瘤液，并且对于每个初始液和稀释液，用其100微升对三个BLFS平板涂板。将涂板后的BLFS平板与去氧/二氧化碳生成剂共同密封在密封容器中，并且在培养箱中于37℃下厌氧培养3天。培养后，计数平板上的菌落数，并且对于菌落数为30至300的BLFS平板，测定肿瘤中的细菌数(当没有在上述范围内的菌落数的平板时，选择菌落数最接近于该范围的平板)。根据以下公式，计算肿瘤中的细菌数。

计算肿瘤中的细菌数的方法

肿瘤中的细菌数(cfu/g)＝平均菌落数(n)×匀浆肿瘤时的稀释率(x)×涂板时稀释率(y)×10(z)。

(n)：(P1+P2+P3)/3；P1、2和3为每个平板上的菌落数

(x)：{肿瘤重量(g)+厌氧稀释剂的量(mL)}/肿瘤重量(g)

(y)：A：×1(初始液)，B：×10²(10²倍稀释)，C：×10⁴(10⁴倍稀释)，

(z)：将值转变为每克肿瘤的细菌数的常数{因为在每个平板上涂板100微升(＝0.1g)的匀浆液}

统计学分析

将由此获得的实验结果表达为平均值±标准误差。将SPSS(统计学分析软件，SPSS Inc.，Tokyo)用于检验葡萄糖(+)组和葡萄糖(-)组。对于p＜0.05认为检验结果是显著差异的。

(5)结果：葡萄糖(+)组和葡萄糖(-)组在肿瘤组织中建群和增殖的比较

在具有80mm³至150mm³的级别的肿瘤体积的KPL-1荷瘤裸小鼠中，对于葡萄糖(+)组，11只小鼠中的10例存在肿瘤中长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD的建群，而对于葡萄糖(-)组，11只小鼠中的4例存在肿瘤中长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD的建群。从该结果中，观察到葡萄糖(+)组和葡萄糖(-)组之间的肿瘤中长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD的建群的显著差异(Fisher精确概率检验：p＝0.024)。此外，观察到建群的组中小鼠肿瘤中细菌平均数，对于葡萄糖(+)组为1.8×10⁶±1.9×10⁶cfu/g(n＝10)，而对于葡萄糖(-)组为1.1×10⁴±1.6×10⁴cfu/g(n＝4)，并且观察到两组之间肿瘤中的增殖的显著差异(Mann-Whitney U检验；P＝0.008)。

从以上确认，葡萄糖表现出促进长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD在肿瘤组织中特异性建群的作用和促进在肿瘤组织中增殖的作用。

长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD和麦芽糖联合使用(1)

(1)荷瘤裸小鼠的制备和肿瘤体积的测量

以与实施例1中相同的方式进行荷瘤裸小鼠的制备和肿瘤体积的测量。

移植的细胞数为5×10⁵细胞/小鼠，移植的体积(细胞液浓度)为0.2mL(2.5×10⁶细胞/mL)，并且移植位置为右前肢背侧的皮肤下。

(2)分组

在给予细菌的前一天(第-1天)，使用一般状况和体重变化作为标准，从具有约50mm³至200mm³的肿瘤体积的荷瘤裸小鼠中选择42只没有异常的动物，并通过连续分层随机法将它们分为7组，从而使平均肿瘤体积在相同水平上。

(3)长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD冷冻制剂和10％麦芽糖溶液的给药

在即将使用前，使用恒温浴将长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD冷冻制剂在37℃下完全解冻10分钟。通过轻轻颠倒混合将解冻的细菌制剂分散，并测量预定量[0.2mL×2次(AM/PM)/天；共0.4mL/小鼠]。

上午一次和下午一次进行给药，并且下午的给药在上午的给药后间隔4小时进行(允许的时间为30分钟内)。给药顺序是从每组最年幼的个体编号，并且按从A组到H组的顺序进行给药。使用26G注射针和1mL聚丙烯注射器进行尾静脉内给药。

按照下文表2所示的组构成，腹膜内给予(ip)麦芽糖液体(Otsuka Pharmaceutical Factory，Inc.，10％麦芽糖注射)或生理盐水[1mL×2次(AM/PM)/天；共2mL/小鼠]。

第0天，在上午和下午每组6只小鼠尾静脉给药完成后1小时内，进行腹膜内给药。

从开始的第1天，上午一次和下午一次进行给药，并且下午的给药在上午的给药后间隔4小时进行(允许的时间为30分钟内)。

表2 组构成

组	给予的试剂	给药时间段^*	解剖日	动物数
					A	10％麦芽糖(ip)	第0开	第1天	6
B	10％麦芽糖(ip)	第0天至第6天	第7天	6
					C	10％麦芽糖(ip)	第0天至第13天	第14天	6
D	10％麦芽糖(ip)	第0天至第6天	第14天	6
					F	生理盐水(ip)	第0天	第1天	6
G	生理盐水(ip)	第0天至第6天	第7天	6
					H	生理盐水(ip)	第0天至第13天	第14天	6

^*细菌给药当天定义为第0天

(4)肿瘤和肝中细菌数的测量

根据上文(3)中的表2中所述的组构成，在第1天、第7天和第14天将小鼠无痛处死，移除肿瘤和肝，并使用电子天平(AB204-S，METTLER TOLEDO，Tokyo)测量重量(g)。

使用剪刀将移除的组织精细地剪为碎块状并置于匀浆器管(HOMOGENIZER，SANSYO，Tokyo)，以组织重量(g)∶厌氧稀释剂(mL)＝1∶9的比例向其中加入厌氧稀释剂，并且使用匀浆器(NZ-1300，EYELA)以300rpm 将混合物破碎。

用厌氧稀释剂稀释匀浆的组织液，并且对于每个初始液和稀释液，用其100微升对三个BLFS平板涂板。将涂板后的BLFS平板与去氧/二氧化碳生成剂共同密封在密封容器中，并且在恒温箱中于37℃下厌氧培养3天。

此外，将100微升的长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD冷冻制剂用厌氧稀释剂稀释10⁶倍，同时在密封容器中将用100微升稀释液涂板的BLFS平板作为阳性对照培养。

培养后，计数平板上的菌落数，并且从菌落数为30至300的BLFS平板，测定肿瘤和肝中的细菌数。当没有上述范围内的菌落数的平板时，选择菌落数最接近于该范围的平板。

以与实施例1(3)相同的方式，计算组织中细菌数。

(5)结果1：麦芽糖给药组和非麦芽糖给药组之间肿瘤中建群和肿瘤中细菌数的比较

细菌最后给药的后一天(第1天)、给药后7天(第7天)和给药后14天(第14天)的麦芽糖给药组和非麦芽糖给药组的肿瘤中建群和肿瘤中细菌数(平均值/中间值)显示在表3和表4中。

表3 麦芽糖给药组的肿瘤内细菌数

表4 非麦芽糖给药组(生理盐水给药组)的肿瘤内细菌数

第1天肿瘤中细菌数的比较

使用中间值作为标准，根据A组(麦芽糖给药组)和F组(非麦芽糖给药组)之间肿瘤中细菌数的比较结果，A组中多于F组，并存在统计学显著差异(Mann-Whitney U检验；P＝0.009)。

因此，确认了麦芽糖表现出促进长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD在肿瘤组织中特异性建群的作用。

第7天肿瘤中细菌数的比较

使用中间值作为标准，根据B组(麦芽糖给药组)和G组(非麦芽糖给药组)之间肿瘤中细菌数的比较结果，B组中多于G组。因此，确认了麦芽糖表现出促进长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD在肿瘤组织中增殖的作用。

第14天肿瘤中细菌数的比较

使用中间值作为标准，根据C组(麦芽糖给药组)和H组(非麦芽糖给药组)之间肿瘤中细菌数的比较结果，A组中多于F组，并存在统计学显著差异(Mann-Whitney U检验(Bonnferoni校正；如果P＜0.017则为显著)；P＝0.002)。

另一方面，D组的肿瘤中细菌数(麦芽糖给药从开始的第7天停止的组)与 H组在相同水平，并不存在统计学显著差异(Mann-Whitney U检验(Bonnferoni校正；如果P＜0.017则为显著)P＝0.589)。

因此，确认了麦芽糖表现出促进增殖的作用和保持长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD在肿瘤组织中增殖的作用，此外，确认了连续给药对于保持增殖是必需的。

(6)结果2：麦芽糖给药组和非麦芽糖给药组之间肝中建群和肝中细菌数的比较

细菌最后给药的后一天(第1天)、给药后7天(第7天)和给药后14天(第14天)的麦芽糖给药组和非麦芽糖给药组的肝中建群和肝中细菌数(平均值/中间值)显示在表5和表6中。

表5 麦芽糖给药组的肝内细菌数

表6 非麦芽糖给药组(生理盐水给药组)的肝内细菌数

第1天、第7天和第14天麦芽糖给药组和非麦芽糖给药组之间肝中细菌数的比较

第1天，对于麦芽糖给药组和非给药组都观察到肝中的细菌，但是在第7天和第14天在两组中均未观察到细菌。

因此，确认了麦芽糖不影响长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD在正常组织中建群和增殖。

长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD和麦芽糖联合使用(2)

(1)肿瘤细胞的培养和传代

使用具有5％CO₂设定为37℃的CO₂培养箱(MCO-20AIC，Sanyo Electric Co.，Ltd.)，在潮湿条件下，静置培养人胃癌细胞系MKN45细胞。此外，当细胞密度融合时，通过以下步骤进行传代。移除培养容器中的培养基，并使用无Ca²⁺，Mg²⁺的达尔伯克磷酸缓冲盐水(Dulbecco′s phosphate buffered saline)(PBS(-)，批号160708，Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd.)轻轻淋洗。吸出PBS(-)后，向其中添加足以浸没细胞的少量0.25％胰蛋白酶(批号6280J，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)和含有0.02％EDTA(批号SS054，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)的PBS(-)(胰蛋白酶/EDTA液)并使混合物保持在CO₂培养箱中。

当使用显微镜检查，确认了细胞已从培养容器的底面基本脱离后，添加生长培养基。通过吸管将细胞分散，然后转移到离心管，并以约1000rpm(180×g)离心5分钟。移除上清，添加生长培养基，并用细胞接种培养容器。每3或4天进行细胞传代。

(2)肿瘤细胞移植

使用PBS(-)洗涤(1)中收集的细胞。将细胞在适量的PBS(-)中悬浮，将其部分与0.4％台盼蓝混合，并测定细胞数和成活力。结果是成活力为93％。使用PBS(-)将成活的细胞密度调整为5×10⁷细胞/mL。将细胞悬液在冰冷下保存，直到其用于移植。

使用1mL注射器(Terumo Corp.)和26G注射针(Terumo Corp.)，在动物的右背部(dosal)区域的皮肤下进行移植。

移植的细胞数：5×10⁶细胞/0.1mL/只

(3)分组和测试组构成

分组

移植肿瘤细胞后，使用测径仪(CD-S20C，Mitutoyo)测量肿瘤的大直径和小直径，并根据下文(8)中的公式，测定肿瘤体积。首先，进行“通过单变量个体的去除(removal of individual by single variable)”，并选择将在实验中使用的动物。这些动物的平均肿瘤体积为221.5mm³。进行“通过单变量个体的区组分配(Blocked allocation by single variable)”，并进行分配，从而肿瘤体积的平均值对于每个测试组是相同的。这天设定为第0天(移植后10天)。作为软件，使用SAS系统发行(SAS System Release)8.2(SAS临床前软件包版本5.0，SAS Institute Japan)。

测试组构成

测试组构成在表7中显示。

表7.测试组构成

注意^*：对于第四组，给予生理盐水而非麦芽糖

(4)给药液的制备

细菌(长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD)的制备方法和制备频率

即将使用前，将装有10mL(2.3×10⁹cfu/mL)的小瓶在37℃的热水浴中解冻10分钟。

5-FC的制备方法和制备频率

精确测量所需量的5-FC。向其中添加用于注射的水，并使用超声装置将混合物处理20分钟，从而得到12.5mg/mL溶液。给药液的保存和使用限于制备当天，并同时配制第1至第3给药液。将给药液在室温下避光保存直至所有给药完成。

麦芽糖和生理盐水的制备方法和制备频率

通过在给药当天配制来使用麦芽糖或生理盐水。给药液的保存和使用限于制备当天，并同时配制第1和第2给药液。将给药液在室温下避光保存直至所有给药完成。

(5)给药频率、给药时间和给药周期

细菌(长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD)

第1天至第3天，对第2至第4组进行给药，每天一次(7.30至12.00)，持续3天。

5-FC

第5天至第25天，对第2至第4组进行给药，每天3次(以约4小时的间隔)，并且在第26天进行一次给药，共64次给药。

麦芽糖和生理盐水

第1天至第25天，对第2至第4组进行给药，每天2次，共50次给药。给药间隔为至少6小时。第1天至第3天，因为在细菌给药(长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD)完成后经过至少1小时后进行第一次给药，所以给药间隔为3至4小时。

(6)给药方法

细菌(长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD)

将裸大鼠固定，并使用10mL注射器(Terumo Corp.)、25G翼型(winged)静脉内注射针(Terumo Corp.)和注射器泵(TE-331S，Terumo Corp.)，将给药液连续给予到尾静脉内。

5-FC

使用5mL注射器(Terumo Corp.)和胃管(RZ-1，由特氟龙(Teflon)制造，CLEA Japan Inc.)进行口服给药。

麦芽糖和生理盐水

使用2.5mL注射器(Terumo Corp.)和27G注射针(NIPRO)进行腹膜内给药。

(7)剂量

细菌(长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD)

1×10¹⁰cfu/kg/天(第2组：1.4×10⁹至1.8×10⁹cfu/只/天)或4×10¹⁰cfu/kg/天(第3组：5.8×10⁹至7.0×10⁹cfu/只/天，第4组：6.0×10⁹至6.7×10⁹cfu/只/天)。给药速率为10mL/kg/小时。给药速率根据第1天的大鼠重量来计算，并四舍五入到小数点第一位。

5-FC

750mg/kg/天(250mg/kg/次)。给药体积为60mL/kg/天(20mL/kg/次)。给药液的量根据大鼠最近一次的重量来计算，并四舍五入到小数点第一位。

麦芽糖和生理盐水

麦芽糖的剂量为200mg/只/天(100mg/只/次)，并且生理盐水的剂量为0mg/只/天(表达为麦芽糖的量)。给药体积为2mL/只/天(1mL/只/次)。

(8)肿瘤直径的测量

肿瘤体积的计算

肿瘤细胞的移植后，使用测径仪测量肿瘤大直径和小直径，并且根据下文的公式测定肿瘤体积。从分组开始的那天，在第0天、第5天、第8天、第11天、第14天、第17天、第20天、第23天和第26天进行肿瘤直径的测量。

肿瘤体积(mm³)＝大直径(mm)×小直径(mm)×小直径(mm)/2

肿瘤生长率的计算

从5-FC给药开始的肿瘤体积起，按照下文的公式计算肿瘤生长率。

肿瘤生长率＝从第5天起的肿瘤体积/第5天的肿瘤体积

T/C(％)的计算

根据从第8天起的肿瘤生长率，按照下文的公式计算T/C(％)。

T/C(％)＝第2、第3或第4组的平均肿瘤生长率/第1组的平均肿瘤生长率×100

(9)结果

肿瘤体积

肿瘤体积的测量结果在表8和图2中给出。

第一组(未治疗组)的肿瘤体积在第0天为223.3±43.0mm³并且在第5天为505.0±125.9mm³。第26天为4002.6±661.1mm³。肿瘤体积在检查期间显著增加。

第二组(低细菌剂量，麦芽糖给药)的肿瘤体积在第0天为221.0±44.4mm³并且在第5天为496.1±108.3mm³，第5天5-FC给药开始。此外，在第26天，肿瘤体积为2370.9±487.4mm³。对于第二组，与第一组相比，从第11天起的所有时间观察到明显较低的肿瘤体积的值(第11天P＜0.05，第14天、第17天、第20天、第23天和第26天P＜0.001：Student′s t检验)。

第三组(高细菌剂量，麦芽糖给药)的肿瘤体积在第0天为219.7±41.9mm³并且在第5天为488.7±80.2mm³，第5天5-FC给药开始。此外，在第26天，肿瘤体积为2135.6±592.9mm³。对于第三组，与第一组相比，从第8天起的所有时间观察到明显较低的肿瘤体积的值(第8天P＜0.01，第11天、第14天、第17天、第20天、第23天和第26天P＜0.001：Student′s t检验)，此外，与第四组相比，第14天、第20天、第23天和第26天观察到明显较低的肿瘤体积的值(在所有天P＜0.05：Student′s t检验)。

第四组(高细菌剂量，非麦芽糖给药)的肿瘤体积在第0天为222.1±43.5mm³并且在第5天为500.3±109.3mm³，第5天5-FC给药开始。此外，在第26天，肿瘤体积为2879.3±658.4mm³。对于第四组，与第一组相比，从第11天起的所有时间观察到明显较低的肿瘤体积的值(第14天P＜0.05，第11天、第17天、第20天、第23天和第26天P＜0.01：Student′s t检验)。

表8 肿瘤体积(平均值)

肿瘤生长率

结果在表9中给出。

在第26天，第一组的肿瘤生长率为8.4±2.7。与第一组相比，从第17天起的所有时间第二组的肿瘤生长率为明显较低的值(第17天、第20天和第23天 P＜0.05，第26天P＜0.01：Student′s t检验)，并且在第26天，肿瘤生长率为4.9±1.2。与第一组和第四组相比，从第8天起的所有时间第三组的肿瘤生长率为明显较低的值(在所有时间与第一组相比P＜0.01，并且与第四组相比P＜0.05：Student′st检验)，并且在第26天，肿瘤生长率为4.4±0.8。

与第一组相比，从第17天起的所有时间第四组的肿瘤生长率为明显较低的值(所有时间P＜0.05：Student′s t检验)，并且在第26天，肿瘤生长率为5.9±1.4。

表9 肿瘤生长率(平均值)

T/C(％)

结果在表10中给出。

在第26天，第二组的T/C(％)为58.3。

在第26天，第三组的T/C(％)为52.4。

在第26天，第四组的T/C(％)为70.2。

表10 T/C(％)

从该测试结果，确认了麦芽糖表现出促进长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD在肿瘤组织中特异性建群的作用，以及在肿瘤组织中促进增殖的作用和保持增殖的作用。

此外，根据与麦芽糖的联合使用，低剂量的细菌表现出与高剂量的细菌相同水平的抗肿瘤效果是可能的，因此，降低细菌的剂量是可能的，并且已确认可以进行对患者具有低负担并造成较少副作用的安全治疗。

长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD与麦芽糖或乳果糖的联合使用

(1)荷瘤裸小鼠的制备和肿瘤体积的测量

以与实施例1和实施例2中相同的方式进行荷瘤裸小鼠的制备和肿瘤体积的测量。

(2)分组和测试药物的给药

选择32只具有60mm³至90mm³的肿瘤体积的KPL-1荷瘤小鼠并分为4组(每组8只小鼠)，并且按照下文(3)中所示的组构成和给药安排给予每种测试药物。

细菌(长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD)的给药

对于细菌(长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD)，按照(3)的组构成和给药安排，以0.3mL向每只小鼠静脉内给予长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD冷冻制剂(2.3×10⁹cfu/mL)，每天2次，持续3天(第1天至第3天)。细菌的总剂量为4.1×10⁹cfu/小鼠。

氟胞嘧啶(5-FC)的给药

按照(3)中所示的组构成和给药安排，将0.4mL的12.5mg/mL 5-FC溶液(750mg/kg/天)经口给予除对照组(A组)外的两组的小鼠，每天2次。给药期为从细菌最后给药后的那天开始的21天(第4天至第24天)。

麦芽糖的给药

按照(3)中所示的组构成和给药安排，将1mL的10％麦芽糖注射腹膜内给予小鼠，每天2次。给药期为从细菌(长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD)给药当天开始的24天(第1天至第24天)。

对于D组，按照相同安排(第1天至第24天)给予相同量的生理盐水而不是麦芽糖。

乳果糖的给药

按照(3)中所示的组构成和给药安排，将1mL的溶解在纯净水中的20％(w/v)乳果糖溶液腹膜内给予小鼠，每天一次。给药期为从细菌给药当天开始的24天(第1天至第24天)，但是因为确认了两只小鼠在给药期(第13天和第19天)死亡，所以改变了给药安排，并且从第19天起停止给药。

(3)组构成和给药安排概述

组构成和给药安排显示在表11中。

表11 组构成和给药安排

注意^*：D组给予生理盐水而非糖类(麦芽糖或者乳果糖)

(4)肿瘤中细菌数的测量

在测试观察最终日(第25天)和之后一天(第26天)经口给予5-FC，1小时后处死小鼠，移除肿瘤，测量重量(g)，然后使用厌氧稀释剂将其匀浆。

以与实施例1，(3)中相同的方式计算肿瘤中细菌数。

(5)结果

每组小鼠的肿瘤体积按照时间先后顺序进行测量，并且表达为平均值±SD。在抗肿瘤效果评价中，将相对于对照组的肿瘤体积比率[T/C(％)]用作标准。

对照组(A组)和细菌(长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD)与糖类联合给药的组中的肿瘤体积改变以及第25天的肿瘤体积相对于第4天的肿瘤体积的肿瘤生长率显示在表12中。

此外，作为抗肿瘤效果的标准的T/C(％)显示在表13中。然而，在第25天非糖类使用组(D组)的T/C为51.3(％)(Student′s t检验：p＝0.013)，麦芽糖联合使用组(B组)的T/C为38.5(％)(p＝0.003)，以及乳果糖联合使用组(C组)的T/C为35.0(％)(p＝0.002)，因而在两种情况下均表现出增强肿瘤生长抑制的作用。

表12 肿瘤体积(平均值)和肿瘤生长率

注意^*：测试中8只小鼠中的2只死亡

表13 T/C(％)

注意^*：测试中8只小鼠中的2只死亡

从该测试结果，可以确认以与麦芽糖相同的方式，乳果糖也表现出促进长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD在肿瘤组织中特异性建群的作用，以及促进增殖的作用和保持增殖的作用，并且可以增强长双歧杆菌Re-105A/pBifiCD的抗肿瘤效果。

工业应用

本发明的表达载体可以提供将具有治疗或预防用途的外源基因引入厌氧微生物的非常安全的基因转运体，而没有横向转移到例如大肠杆菌的其他致病或需氧/兼性厌氧微生物的风险，并且即使发生横向转移，所述载体不会在除了所述转化体的微生物中复制，因为所述载体不包含这些其他微生物的复制起点。

此外，用于本发明的转化的微生物的建群和增殖增强剂改善了本发明的转化的微生物的治疗效果，使得能在表现相同治疗效果的同时降低所述转化的微生物的剂量，从而减少要治疗的患者的负担。

此外，本发明的治疗剂具有作为用于缺氧疾病的治疗剂的功用，并且具有改善的治疗效果和降低的有效需要剂量，以及在环境和治疗观点中改进的安全性，所述治疗剂包含含有所述转化的厌氧微生物的药物组合物与含有所述建群和增殖增强剂的药物组合物的组合。

仅受理局用

仅国际局用

Claims

1.用于缺氧疾病的治疗剂，所述治疗剂递送到缺氧疾病位置，包含以下药物组合物的组合：药物组合物，其含有作为活性组分的、由质粒载体转化的厌氧微生物，所述质粒载体用于转化厌氧微生物，并包含有(1)在厌氧微生物中发挥功能但不在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制单元和(2)包含有编码具有靶活性的蛋白的DNA和包含在所述厌氧微生物中发挥功能的启动子和终止子的DNA片段的蛋白表达单元；以及药物组合物，其含有作为活性组分的、所述厌氧微生物建群和增殖的增强剂。

2.如权利要求1所述的治疗剂，其中所述质粒载体基本上由(1)在厌氧微生物中发挥功能但不在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制单元和(2)基本上由包含编码具有靶活性的蛋白的DNA和包含在所述厌氧微生物中发挥功能的启动子和终止子的DNA片段组成的蛋白表达单元所组成。

3.如权利要求2所述的治疗剂，其中所述具有靶活性的蛋白是对缺氧环境中的疾病具有治疗活性的蛋白。

4.如权利要求3所述的治疗剂，其中所述对缺氧环境中的疾病具有治疗活性的蛋白是(a)具有抗肿瘤活性的蛋白，或(b)具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白。

5.如权利要求4所述的治疗剂，其中所述对缺氧环境中的疾病具有治疗活性的蛋白是(b)具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白。

6.如权利要求1所述的治疗剂，其中所述厌氧微生物选自双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、肠球菌(Enterococcus)、链球菌(Streptococcus)和梭菌(Clostridium)。

7.如权利要求6所述的疾病治疗剂，其中所述厌氧微生物是双歧杆菌。

8.如权利要求7所述的疾病治疗剂，其中所述双歧杆菌选自青春双歧杆菌(B.adolescentis)、动物双歧杆菌(B.animalis)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、嗜热双歧杆菌(B.thermophilum)、假长双歧杆菌(B.pseudolongum)、双歧双歧杆菌(B.bifidum)、短双歧杆菌(B.breve)和长双歧杆菌(B.longum)。

9.如权利要求8所述的治疗剂，其中所述双歧杆菌是长双歧杆菌。

10.如权利要求9所述的疾病治疗剂，其中所述双歧杆菌是长双歧杆菌105-A/pBifiCD，保藏于专利微生物保藏中心(NPMD)，登录号NITE BP-491。

11.如权利要求5所述的治疗剂，其中所述具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白选自胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶和b-葡糖醛酸糖苷酶。

12.如权利要求11所述的疾病治疗剂，其中所述具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白是胞嘧啶脱氨酶。

13.如权利要求1所述的治疗剂，其中所述建群和增殖的增强剂是选自以下的至少一种：阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、松三糖、棉子糖和乳果糖。

14.如权利要求13所述的疾病治疗剂，其中所述建群和增殖的增强剂是葡萄糖或麦芽糖。

15.如权利要求14所述的疾病治疗剂，其中所述建群和增殖的增强剂是麦芽糖。

16.如权利要求5所述的治疗剂，还包含：包含作为活性组分的抗肿瘤物质前体的药物组合物，所述抗肿瘤物质前体由(b)具有将所述抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白转变为抗肿瘤物质。

17.如权利要求16所述的疾病治疗剂，其中所述抗肿瘤物质前体是5-氟胞嘧啶。

18.如权利要求6所述的治疗剂，其中在所述厌氧微生物中发挥功能的质粒复制单元选自双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、肠球菌(Enterococcus)、链球菌(Streptococcus)和梭菌(Clostridium)。

19.如权利要求7所述的治疗剂，其中在双歧杆菌中发挥功能的质粒复制单元是包含OriV区和RepB基因的pTB6 rep单元。