CN114522184A - 工程细菌的细胞裂解液及其在肿瘤治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及工程化细菌的细胞裂解液，特别是敲除dapA基因或dapE基因的兼性厌氧细菌的细胞裂解液及其在肿瘤治疗中的应用。

Description

工程细菌的细胞裂解液及其在肿瘤治疗中的应用

技术领域

本发明涉及肿瘤靶向治疗领域，具体而言涉及工程化细菌的细胞裂解液，特别是敲除dapA基因或dapE基因的兼性厌氧细菌的细胞裂解液及其在肿瘤治疗中的应用。

背景技术

癌症是全世界范围内引起死亡的主要原因。与正常细胞比较癌细胞具有无限增殖、可转化和易转移等特点。癌细胞除了分裂失控外(能进行多极分裂)，还会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到其他器官。癌症治疗发展史表明，传统癌症治疗方法如手术治疗、化学疗法、放射线疗法、激素疗法、骨髓/干细胞移植等治疗手段，均具有一定的缺陷，如手术治疗存在易复发且部分肿瘤存在不易手术等问题；化疗和放疗会对患者产生严重的副反应而导致治疗不能有效进行；激素疗法抑制炎症，增加人体脂肪量，减少肌肉量，严重影响到血糖水平，极大的增加糖尿病和感染性疾病发生的概率；骨髓/干细胞移植配型难，容易出现免疫排斥反应等。癌症治疗难点源于其病因复杂多变，不仅存在机体基因水平的变化，外界环境的改变也是癌症发展的重要因素之一。应用传统方法治疗肿瘤过程中会对正常组织器官产生严重的毒性，且会使癌细胞产生多重耐药性、不能完全有效清除癌细胞。近年来，多项研究发现，基因治疗、无创伤射频治疗癌症方法、胰岛素增强治疗、饮食治疗和细菌治疗不仅可以阻止癌细胞产生多重耐药性，同时也增强传统疗法的疗效。其中细菌疗法是一种很有希望克服传统治疗方法缺点的癌症治疗手段。

利用活细菌治疗癌症的历史可以追溯到150多年前。1868年德国内科医生W.Bush首次应用细菌治疗无法通过手术方法治疗的肉瘤，患者在接受治疗的一周内肿瘤体积缩小一半同时颈部淋巴结体积变小。然而不幸的是该患者于9天后死于细菌感染引起的败血症。1883年德国外科医生Friedrich Fehleisen鉴定出丹毒是酿脓链球菌感染引起的。随后，Friedrich Fehleisen和来自纽约医院外科医生Willian B Coley分别独立开展实验证明酿脓链球菌可以使患者肿瘤消退。然而由于实验结果很难重复和不符合当时临床标准，因此结果备受争议。1935年Connell观测到来自梭状杆菌酶的滤液可以使转移瘤消退。1947年科学家首次注射溶组织梭菌的孢子给移植肉瘤的小鼠，观测到癌细胞溶解和肿瘤组织消退。然而由于细菌引起的急性毒性反应，小鼠存活率很低。1959年卡介苗(减毒牛结核分枝杆菌)成功用于癌症免疫治疗。2002年减毒的沙门氏菌VNP20009(msbB-,purI-)进行了Ⅰ期临床试验，结果显示该菌株可以在肿瘤组织定植，但是对于肿瘤治疗效果不明显。

虽然VNP20009并没有取得良好的临床结果，但鉴于沙门氏菌的免疫调节功能，研究者认为可以通过多种改造方式或许能使沙门氏菌适合于肿瘤治疗。沙门氏菌需要进行改造的原因在于野生型沙门氏菌具有毒性，可以引起发热、呕吐、腹泻及腹部绞痛等症状，严重可以引起菌血症危及生命。伴随着分子生物学技术飞速发展，可以通过基因改造的策略重新编辑沙门氏菌基因组使其适合应用于肿瘤治疗。

中国专利申请CN104031146A公开了将细菌裂解物与肿瘤细胞结合，灭活后制成疫苗。

中国专利申请CN111315868A公开了构建表达细胞毒素的细菌，所述细菌衍生自靶向肿瘤的细菌，从而对肿瘤进行特异性杀伤。

王志锐的论文“细菌裂解物的免疫调节作用”研究多种细菌的裂解物的免疫调节作用，证实了双歧双歧杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌的细菌裂解物具有体外免疫调节作用，并证明超声裂解的双歧杆菌裂解物对结肠癌细胞株HT-29和THC-8908有直接抑制作用。由此可见，王志锐的论文主要是部分证明了多种细菌具有免疫调节作用，具有对细胞系的抑制作用，并未有效说明该菌具有明显的肿瘤治疗效果。

本发明在改造沙门氏菌菌株基因组基础上，将改造菌株进行机械破碎获得细胞裂解液。应用改造菌株细胞裂解液进行肿瘤治疗，可以进一步提高肿瘤治疗的安全性。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明的目的是提供了通过对兼性厌氧细菌进行工程化改造的细菌的细胞裂解液，及其在肿瘤治疗中的应用。

在一个方面，本发明提供了一种细菌的细胞裂解液，所述细菌是敲除兼性厌氧菌代谢通路上必需基因的兼性厌氧细菌。

在本发明的细胞裂解液中，所述兼性厌氧细菌包括：肠杆菌科细菌(例如，大肠杆菌、肺炎杆菌、变形杆菌、肠杆菌、伤寒杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌)，葡萄球菌属，链球菌属，肺炎球菌，炭疽杆菌和白喉杆菌。

在本发明的细胞裂解液中，所述兼性厌氧细菌在敲除必需基因后进行体外培养时培养基中需要额外添加2，6-二氨基庚二酸(别名：2，6-二氨基蒲桃酸；2，6-Diaminopimelicacid)或其类似物。

在本发明的细胞裂解液中，被敲除的所述必需基因是dapA基因，或dapE基因。

在本发明的细胞裂解液中，所述兼性厌氧细菌是伤寒沙门氏菌，所述伤寒沙门氏菌的菌株来源包括人、鸡、狗或牛。

在本发明的细胞裂解液中，所述细胞裂解液用于体内肿瘤治疗时抑制肿瘤生长和减小肿瘤体积。

在本发明的细胞裂解液中，所述肿瘤包括：血癌(慢性白血病、急性白血病)，骨癌，淋巴癌(非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤)，肠癌(结肠癌、直肠癌)，肝癌，胃癌，盆腔癌(子宫颈癌、卵巢恶性肿瘤、子宫内膜癌、卵巢癌)，肺癌，乳腺癌，胰腺癌，膀胱癌，前列腺癌。

在本发明的细胞裂解液中，所述细胞裂解液通过肌肉注射、静脉注射、皮下注射、腹腔注射、经脑内施用或经鼻腔施用进行施用。

在另一个方面，本发明提供了本发明的上述细胞裂解液在肿瘤治疗中的应用，其中，所述细胞裂解液与其他癌症治疗方法联合应用，包括：

(a)所述细胞裂解液疗法联合手术疗法；

(b)所述细胞裂解液疗法联合放射治疗；

(c)所述细胞裂解液疗法联合化学药物：化疗药物包括烷化剂(尼莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺、甘磷酰芥等)，抗代谢药(去氧氟尿苷、多西氟鸟啶、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、氟鸟苷、替加氟、吉西他滨、卡莫氟、羟基脲、甲氨蝶呤、优福定、安西他滨等)，抗肿瘤抗生素(放线菌素、阿柔比星、表柔比星、丝裂霉素、培洛霉素、平阳霉素、吡柔比星等)，植物类抗癌药物(伊立替康、三尖杉酯碱、羟基喜树碱、长春瑞宾、紫杉醇、泰索帝、拓扑替康、长春新碱、长春地辛、长春碱等)，激素(阿他美坦、阿那曲唑、安鲁米特、来曲唑、福美坦、甲他孕酮、他莫昔芬等)免疫抑制剂及其他抗癌药物如门冬酰胺酶、卡铂、顺铂、达卡巴嗪、奥沙利铂、乐沙定、可铂澳杀、米托蒽醌、丙卡巴肼；

(d)所述细胞裂解液疗法联合生物治疗；和

(e)所述细胞裂解液疗法联合中医中药治疗。

本发明所述细胞裂解液是一种靶向肿瘤的工程菌的细胞裂解液，与完整活细菌相比可以在实际治疗过程中进一减毒。本发明的基因工程改造的细菌细胞裂解液，例如鼠伤寒沙门氏菌细胞裂解液具有抑制肿瘤生长的能力，同时提高了鼠伤寒沙门氏菌应用于肿瘤治疗的安全性。

附图说明

图1显示了SL7207(ΔdapA)菌株细胞裂解液体内在实验中，在施用不同试样后所示时间的实验动物的肿瘤体积。

图2显示了SL7207(ΔdapA)菌株细胞裂解液体内在实验中，在施用不同试样后所示时间的实验动物的体重情况。

图3显示了SL7207(ΔdapA)菌株细胞裂解液体内在实验中，在施用不同试样后各试样实验组的生存率曲线，其中除SL7207组生存率显著下降之外，其余各组的生存率在测试时间内都是100％，因此重合为一条线。

图4显示了SL7207(ΔdapE)菌株细胞裂解液体内在实验中，在施用不同试样后所示时间的实验动物的肿瘤体积。

图5显示了SL7207(ΔdapE)菌株细胞裂解液体内在实验中，在施用不同试样后所示时间的实验动物的体重情况。

图6显示了SL7207(ΔdapE)菌株细胞裂解液体内在实验中，在施用不同试样后各试样实验组的生存率曲线，其中除SL7207组生存率显著下降之外，其余各组的生存率在测试时间内都是100％，因此重合为一条线。

具体实施方式

尽管可以对本发明进行各种修改并且本发明可以具有各种形式，但是下面将详细说明和解释具体实例。然而，应当理解的是，这些并不旨在将本发明限制于特定的公开内容，并且本发明包括其所有修改、等同物或替代物而不脱离本发明的精神和技术范围。

在鼠伤寒沙门氏菌用于小鼠肿瘤模型治疗测试时发现，野生型沙门氏菌菌株或者营养缺陷型沙门氏菌菌株(例如：SL7207)在体内增殖速率远远大于机体清除速率，导致细菌在小鼠体内大量增殖，引起严重的菌血症，产生严重的副反应，至小鼠死亡，安全性严重缺乏。

在下文中，将更详细地解释根据本发明具体实施方式的工程化细菌的细胞裂解液，特别是敲除dapA基因或dapE基因的兼性厌氧细菌的细胞裂解液及其在肿瘤治疗中的应用。

在本发明的一个或多个实施方式中，本发明提供了一种细菌的细胞裂解液，所述细菌是敲除兼性厌氧菌代谢通路上必需基因的兼性厌氧细菌。

在本发明的一个或多个实施方式中，本发明的细胞裂解液中采用的所述兼性厌氧细菌包括：肠杆菌科细菌(例如，大肠杆菌、肺炎杆菌、变形杆菌、肠杆菌、伤寒杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌)，葡萄球菌属，链球菌属，肺炎球菌，炭疽杆菌和白喉杆菌。特别是沙门氏菌。

在本发明的一个或多个实施方式中，本发明所述的兼性厌氧细菌在敲除必需基因后进行体外培养时培养基中需要额外添加2，6-二氨基庚二酸(别名：2，6-二氨基蒲桃酸；2，6-Diaminopimelic acid)或其类似物。

在本发明的一个或多个实施方式中，被敲除的所述必需基因是dapA基因，或dapE基因。所述必需基因不局限于dapA基因或dapE基因，还包括dapB、dapD、argD、dapF、murE、murF和/或lysA等

在本发明的一个或多个实施方式中，所述兼性厌氧细菌是伤寒沙门氏菌，所述伤寒沙门氏菌的菌株来源包括人、鸡、狗或牛。

在本发明的一个或多个实施方式中，所述细胞裂解液用于体内肿瘤治疗时抑制肿瘤生长和减小肿瘤体积。

在本发明的一个或多个实施方式中，所述肿瘤包括：血癌(慢性白血病、急性白血病)，骨癌，淋巴癌(非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤)，肠癌(结肠癌、直肠癌)，肝癌，胃癌，盆腔癌(子宫颈癌、卵巢恶性肿瘤、子宫内膜癌、卵巢癌)，肺癌，乳腺癌，胰腺癌，膀胱癌，前列腺癌。优选其中的实体瘤，更优选膀胱癌。

在本发明的一个或多个实施方式中，所述细胞裂解液通过肌肉注射、静脉注射、皮下注射、腹腔注射、经脑内施用或经鼻腔施用进行施用。本领域技术人员可以考虑患者的具体情况，肿瘤的位置来选择具体的施用途径。

在本发明的一个或多个实施方式中，本发明提供了本发明的上述细胞裂解液在肿瘤治疗中的应用，其中，所述细胞裂解液与其他癌症治疗方法联合应用。

在本发明的一个或多个实施方式中，本发明所述的细胞裂解液疗法可以联合手术疗法。所述手术疗法可以是肿瘤切除手术。

在本发明的一个或多个实施方式中，本发明所述的细胞裂解液疗法可以联合放射治疗。所述放射治疗可以是医师能够具体选择和采用的放射治疗方法。

在本发明的一个或多个实施方式中，本发明所述的细胞裂解液疗法可以联合联合化学药物。所述化疗药物例如可以包括烷化剂(尼莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺、甘磷酰芥等)，抗代谢药(去氧氟尿苷、多西氟鸟啶、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、氟鸟苷、替加氟、吉西他滨、卡莫氟、羟基脲、甲氨蝶呤、优福定、安西他滨等)，抗肿瘤抗生素(放线菌素、阿柔比星、表柔比星、丝裂霉素、培洛霉素、平阳霉素、吡柔比星等)，植物类抗癌药物(伊立替康、三尖杉酯碱、羟基喜树碱、长春瑞宾、紫杉醇、泰索帝、拓扑替康、长春新碱、长春地辛、长春碱等)，激素(阿他美坦、阿那曲唑、安鲁米特、来曲唑、福美坦、甲他孕酮、他莫昔芬等)免疫抑制剂及其他抗癌药物如门冬酰胺酶、卡铂、顺铂、达卡巴嗪、奥沙利铂、乐沙定、可铂澳杀、米托蒽醌、丙卡巴肼。所述化疗药物的具体选择和剂量选择可以由医师根据患者而定具体情况来确定。

在本发明的一个或多个实施方式中，本发明所述的细胞裂解液疗法可以联合生物治疗。所述生物疗法为除本发明工程化细菌细胞裂解液之外的用于肿瘤治疗的其他生物疗法。

在本发明的一个或多个实施方式中，本发明所述的细胞裂解液疗法可以联合中医中药治疗。中医中药治疗可以由医生根据患者的具体病情和身体状况来具体制定。

在本发明的一个或多个实施方式中，本发明利用基因工程技术获得SL7207(ΔdapA)和SL7207(ΔdapE)改造菌株，通过高压破碎方法得到改造菌株细胞裂解液。

本发明对细菌细胞的高压破碎具体采用高压破碎细胞仪，所述高压例如为200-1200kpa，优选400-1000kpa，更优选600-900kpa，最优选800kpa的压力，破碎10分钟-60分钟，优选20-40分钟，最优选30min，高压破碎所用的溶液例如为平衡盐溶液PBS或生理盐水，高压破碎后的混合物经过混匀处理后，可直接用于对受试对象进行注射。

在应用现有技术鼠伤寒沙门氏菌用于小鼠肿瘤模型治疗测试时发现，野生型沙门氏菌菌株或者营养缺陷型沙门氏菌菌株(例如：SL7207)在体内增殖速率远远大于机体清除速率，从而导致细菌在小鼠体内大量增殖，引起严重的菌血症，产生严重的致死副反应，导致小鼠死亡。本发明通过尾静脉给药方式将改造菌株细胞裂解液注射到荷瘤小鼠体内。在改造菌株细胞裂解液用于肿瘤治疗时发现，其具有抑制肿瘤增长的能力，小鼠体重恢复快，且在治疗周期内并无死亡。说明本发明涉及的改造菌株细胞裂解液具有抗肿瘤能力，同时也提高了安全性。

本发明的细菌细胞裂解液通过对兼性厌氧细菌进行工程化改造，从而敲除兼性厌氧菌代谢通路上必需基因。本发明敲除兼性厌氧菌代谢通路上必需基因之后的细菌进行体外培养时培养基中需要额外添加2，6-二氨基庚二酸(别名：2，6-二氨基蒲桃酸；2，6-Diaminopimelic acid)或其类似物。被敲除的必需基因例如可以是dapA基因，和/或dapE基因。

敲除了dapA基因和/或dapE基因之后的菌体不能自己合成2，6-二氨基庚二酸，因此其培养基中包含2，6-二氨基庚二酸，其浓度为1-100μg/ml，优选10-80μg/ml，更优选30-70μg/ml，最优选50μg/ml。

实施例

提供以下非限制性实施例。

实施例1：SL7207(ΔdapA)菌株细胞裂解液用于肿瘤治疗的体内表征

购买自北京维通利华生物科技有限公司6-8周龄的C57BL/6小鼠，体重20g左右，饲养于SPF级动物间内，皮下接种1×10⁶个小鼠膀胱癌细胞(MB49)，饲养成瘤周期约14天，建立小鼠膀胱癌皮下瘤模型，待肿瘤生长至100mm³～200mm³。将实验动物分为5组，每组8只小鼠，分别接受PBS、SL7207菌体、SL7207(ΔdapA)、SL7207(ΔdapA)细胞裂解液、MG1655细胞裂解液。尾静脉一次注射1×10⁷个细菌/125μl个细菌的细胞裂解液或1×10⁷个细菌细胞。监测荷瘤小鼠肿瘤体积、体重和生存率变化情况。

其中，所述细菌细胞裂解液制备如下：

(1)将SL7207(ΔdapA)菌株在LB(DAP+)培养基中培养到对数期；

(2)5000rpm，离心5min，去掉上清液；

(3)用过滤后的PBS，pH7.2，按照1×10⁷个细菌/125μl体积重新悬浮菌体，5000rpm，离心5min。洗涤菌体三次；

(4)应用流式细胞计数仪，统计细胞数目；

(5)用高压破碎细胞仪(上海励途机械设备工程有限公司，FB-110X-PLUS)冰浴破碎细胞30min，获得细胞裂解液。

实验结果(如图1-图3)为：

(1)肿瘤体积变化(A)：与PBS组比较，SL7207(ΔdapA)细胞裂解液组别可以抑制肿瘤生长；SL7207组虽然也有较好的抑制肿瘤生长效果，但小鼠在7天后均死于败血症；而像MG1655这种细菌的细胞裂解液并没有看到明显的抑瘤效果。

(2)小鼠体重变化(B)：细胞裂解液组别小鼠体重只需要三天时间就可以恢复到PBS组水平。

(3)小鼠生存率(C)：实验周期内，PBS组与实验组小鼠均未死亡。

实验结论：实验周期内，(1)该菌株细胞裂解液具有抑制肿瘤生长效果；(2)细胞裂解液组别小鼠体重可以在短时间内恢复到对照组水平，同时实验周期内小鼠未死亡，说明细菌裂解液用于肿瘤治疗时安全性比较好。

实施例2：SL7207(ΔdapE)菌株细胞裂解液用于肿瘤治疗的体内表征

C57BL/6小鼠皮下接种1×10⁶小鼠膀胱癌细胞(MB49)，建立小鼠膀胱癌皮下瘤模型。实验分为五组，每组3只小鼠，分别接受PBS、SL7207、SL7207(ΔdapE)、SL7207(ΔdapE)细胞裂解液、MG1655细胞裂解液，每组3只小鼠。尾静脉注射1×10⁷个细菌的细胞裂解液或1×10⁷个细菌细胞。监测荷瘤小鼠肿瘤体积、体重和生存率变化情况。

其中，所述细菌细胞裂解液制备如下：

(1)将SL7207(ΔdapE)菌株在LB(DAP+)培养基中培养到对数期；

(2)5000rpm，离心5min，去掉上清液；

(3)用过滤后的PBS重新悬浮菌体，5000rpm，离心5min。洗涤菌体三次；

(4)应用流式细胞计数仪，统计细胞数目；

(5)用高压破碎细胞仪(上海励途机械设备工程有限公司，FB-110X-PLUS)冰浴破碎细胞30min破碎细胞，获得细胞裂解液。

实验结果(如图4-图6)：

(1)肿瘤体积变化(A)：与PBS组比较，SL7207(ΔdapE)细胞裂解液组别可以抑制肿瘤生长；SL7207组虽然也有较好的抑制肿瘤生长效果，但小鼠在7天后均死于败血症；而像MG1655这种细菌的细胞裂解液并没有看到明显的抑瘤效果。

(2)小鼠体重变化(B)：细胞裂解液组别小鼠体重只需要三天时间就可以恢复到PBS组水平。

(3)小鼠生存率(C)：实验周期内，PBS组与实验组小鼠均未死亡。

实验结论：实验周期内，(1)该菌株细胞裂解液具有抑制肿瘤生长效果；(2)细胞裂解液组别小鼠体重可以在短时间内恢复到对照组水平，同时实验周期内小鼠未死亡，说明细菌裂解液用于肿瘤治疗时安全性比较好。

Claims (9)

1.一种细菌的细胞裂解液，所述细菌是敲除兼性厌氧菌代谢通路上必需基因的兼性厌氧细菌。

2.如权利要求1所述的细胞裂解液，所述兼性厌氧细菌包括：肠杆菌科细菌(例如，大肠杆菌、肺炎杆菌、变形杆菌、肠杆菌、伤寒杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌)，葡萄球菌属，链球菌属，肺炎球菌，炭疽杆菌和白喉杆菌。

3.如权利要求1所述的细胞裂解液，所述兼性厌氧细菌在敲除必需基因后进行体外培养时培养基中需要额外添加2，6-二氨基庚二酸或其类似物。

4.如权利要求1或3所述的细胞裂解液，被敲除的所述必需基因是dapA基因，或dapE基因。

5.如权利要求2所述的细胞裂解液，所述兼性厌氧细菌是伤寒沙门氏菌，所述伤寒沙门氏菌的菌株来源包括人、鸡、狗或牛。

6.如权利要求1或2所述的细胞裂解液，所述细胞裂解液用于体内肿瘤治疗时抑制肿瘤生长和减小肿瘤体积。

7.如权利要求6所述的细胞裂解液，所述肿瘤包括：血癌(慢性白血病、急性白血病)，骨癌，淋巴癌(非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤)，肠癌(结肠癌、直肠癌)，肝癌，胃癌，盆腔癌(子宫颈癌、卵巢恶性肿瘤、子宫内膜癌、卵巢癌)，肺癌，乳腺癌，胰腺癌，膀胱癌，前列腺癌。

8.如权利要求6所述的细胞裂解液，所述细胞裂解液通过肌肉注射、静脉注射、皮下注射、腹腔注射、经脑内施用或经鼻腔施用进行施用。

9.权利要求1至8中任一项所述的细胞裂解液在肿瘤治疗中的应用，其中，所述细胞裂解液与其他癌症治疗方法联合应用，包括：

(a)所述细胞裂解液疗法联合手术疗法；

(b)所述细胞裂解液疗法联合放射治疗；

(c)所述细胞裂解液疗法联合化学药物：化疗药物包括烷化剂(尼莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺、甘磷酰芥等)，抗代谢药(去氧氟尿苷、多西氟鸟啶、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、氟鸟苷、替加氟、吉西他滨、卡莫氟、羟基脲、甲氨蝶呤、优福定、安西他滨等)，抗肿瘤抗生素(放线菌素、阿柔比星、表柔比星、丝裂霉素、培洛霉素、平阳霉素、吡柔比星等)，植物类抗癌药物(伊立替康、三尖杉酯碱、羟基喜树碱、长春瑞宾、紫杉醇、泰索帝、拓扑替康、长春新碱、长春地辛、长春碱等)，激素(阿他美坦、阿那曲唑、安鲁米特、来曲唑、福美坦、甲他孕酮、他莫昔芬等)免疫抑制剂及其他抗癌药物如门冬酰胺酶、卡铂、顺铂、达卡巴嗪、奥沙利铂、乐沙定、可铂澳杀、米托蒽醌、丙卡巴肼；

(d)所述细胞裂解液疗法联合生物治疗；和

(e)所述细胞裂解液疗法联合中医中药治疗。

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