CN107513516B - 不溶血无乳链球菌WC1535△cyl及其构建和应用 - Google Patents

不溶血无乳链球菌WC1535△cyl及其构建和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种不溶血无乳链球菌WC1535△cyl及其构建和应用；本发明的鱼源无乳链球菌菌株为不溶血无乳链球菌WC1535△cyl，该菌株于2017年7月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:60210。该菌株是与野生株相比不具有溶血活性，特别是对罗非鱼的毒性大大降低；该菌株安全性高，不存在毒力返强的风险，而且具有很高的免疫原性，能够保护免疫鱼类抵抗无乳链球菌的入侵，同时该菌株易培养、生产成本低、使用简便，并且具有开发成口服弱毒活疫苗的潜力；本发明所涉及的菌株可用于制备鱼链球菌病的弱毒活疫苗，具有很高的商业应用价值。

Description

不溶血无乳链球菌WC1535△cyl及其构建和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种不溶血的鱼源无乳链球菌弱毒株，无乳链球菌WC1535△cyl及其构建和应用。
背景技术
鱼链球菌病主要是由无乳链球菌和海豚链球菌引起的。目前，在我国养殖的经济鱼类中，已报道感染链球菌病的鱼类主要有罗非鱼、卵形鲳鲹、宝石鲈、鲮鱼、齐口裂腹鱼和大菱鲆等，其中无乳链球菌是主要的致病菌，严重威胁着我国水产养殖业的健康发展。目前，鱼链球菌病的防控主要依赖抗生素、消毒剂、微生态制剂和疫苗免疫等；由于治疗过程中抗生素的大量使用，使得病原菌出现了耐药性，导致药物治疗和预防的效果显著下降。而针对鱼链球菌病的疫苗主要是灭活疫苗，灭活疫苗不仅因为需要注射、操作不便和效果不理想等原因，使用范围非常有限，目前尚无商业化的疫苗产品；而且灭活疫苗接种后在动物体内不能增殖，通常免疫剂量较大，保护周期相对较短，需要多次免疫接种，单次免疫往往不能产生较强的免疫保护效果。因此，开发有效的弱毒活疫苗对预防鱼链球菌病具有重要的现实意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种不溶血的鱼源无乳链球菌弱毒株，即无乳链球菌WC1535△cyl。该菌株不仅毒性小，而且免疫原性强等优点；其对鱼的致病性显著降低，同时通过投喂可以侵染罗非鱼，并且能够在鱼体内长时间存活，能够激活机体产生抗体，具有良好的免疫保护效果。
本发明的目的之二是提供了所述无乳链球菌WC1535△cyl的构建。
本发明的目的之三是提供了所述无乳链球菌WC1535△cyl的应用。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明所述的无乳链球菌WC1535△cyl，为不溶血的鱼源无乳链球菌弱毒株，于2017年7月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:60210，外文名称为Streptococcus agalactiae。
所述无乳链球菌WC1535△cyl的构建方法，包括如下步骤：
(1)将重组质粒pSET4s-cylCm经过电转化至鱼源无乳链球菌WC1535株感受态细胞，涂布于含有氯霉素的BHI平板，置于28±2℃倒置培养30～40h；
(2)再挑取培养所得单克隆至含有氯霉素的BHI液体培养基中，28±2℃培养至对数生长期，然后稀释10000倍，涂布于无抗性的BHI平板上，于37℃倒置培养；得到所述无乳链球菌WC1535△cyl。
挑取单克隆进行菌落PCR验证，引物为cyl-dF和cyl-dR。
cyl-dF：5′-TACCTCCTTGAAGATTGCTACG-3′
cyl-dR：5′-TGTTTCTGGCCTTTCTACTACC-3′
阳性敲除克隆可以扩增到预期大小为2960bp的PCR产物。野生株PCR产物预期大小为13316bp，由于该片段长度较长，通常的Taq酶在有限的延伸时间内不能扩增如此长度的PCR产物，因此，野生株PCR扩增产物为阴性。缺失株PCR扩增产物进行测序分析，结果发现突变株的cyl基因簇发生了缺失，这表明已经成功构建了cyl基因簇缺失突变株，命名为WC1535△cyl，于2017年7月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:60210，外文名称为Streptococcus agalactiae。野生株WC1535和缺失株WC1535△cyl样品分别涂布在脱脂绵羊血平板上于37℃培养36h，观察菌落溶血情况。结果表明野生株WC1535有明显的溶血活性，然而缺失株WC1535△cyl则完全不溶血，这表明已成功构建了不溶血无乳链球菌WC1535△cyl。
详细地，所述鱼源无乳链球菌WC1535感受态细胞的制备方法，具体步骤如下：
(1)鱼源无乳链球菌WC1535复苏于BHI(脑心浸液培养基)中，30±2℃培养过夜；
(2)取过夜培养的菌液加入80～120mL新鲜的BHI液体培养基中，30±2℃摇床扩大培养5～6h，OD600＝0.6时，收集菌体；
(3)经扩大培养的菌液在5000r/min离心8～12min，去上清液；
(4)所得菌体使用15～25mL10％～15％的甘油轻轻悬浮，离心去上清；得到所述鱼源无乳链球菌WC1535感受态细胞。
更进一步，重复步骤(4)两次；使用1mL 15％的甘油轻轻悬浮菌体，分装至1.5mL的离心管中，即为无乳链球菌感受态细胞。
较佳地，所述重组质粒pSET4s-cylCm由pSET4S质粒和cyl-up-Cm-cyl-down基因片段的无缝克隆得到，具体为：
(1)取双酶切后的pSET4S质粒与cyl-up-Cm-cyl-down基因片段，然后加入Seamless cloning kit连接体系，混匀后50±2℃处理25～35min，得到连接液；所述双酶切后的pSET4S质粒与cyl-up-Cm-cyl-down基因片段和Seamless cloning kit连接体系之间的体积比为6：3：1；
(2)取步骤(1)中所得连接液，加入10倍连接液体积的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰上孵育25～35min后，42℃热激90s，冰上孵育2～3min，然后37℃复苏25～35min，涂布于含有氯霉素的LB平板上；PCR筛选阳性克隆，阳性PCR产物进行测序验证，得到所述的重组质粒命名为pSET4s-cylCm。
较佳地，所述双酶切后的pSET4S质粒的构建：
提取pSET4S质粒，经过HindIII和EcoRI双酶切，37℃酶切3～5h，最后用0.8％琼脂糖凝胶回收产物，得到所述双酶切后的pSET4S质粒；其中所述酶切体系为：pSET4S 1μg、HindIII 1U、EcoRI 1U、10×Buffer 3μL、补ddH2O至30μL。
较佳地，所述cyl-up-Cm-cyl-down基因片段的构建：
(1)cyl-up-Cm-cyl-down基因片段全长的PCR扩增，扩增体系为：
2×PCR Master Mix 25μL、pSET4s-cylF 1μL、pSET4s-cylR 1μL、cyl-up基因片段1μL、cyl-down基因片段1μL、cyl-Cm基因片段2μL，加H2O至50μL；
(2)cyl-up-Cm-cyl-down基因片段全长的PCR扩增程序为：
a.94℃下反应4min，循环1次
b.94℃下反应30s，循环30次
c.58℃下反应30s，循环30次
d.72℃下反应3min，循环30次
e.72℃下反应10min，循环1次
f.4℃下反应停止，循环1次
最后用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，并回收纯化cyl-up-Cm-cyl-down基因片段；其中，
pSET4s-cylF:
5′-ACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCC-3′
pSET4s-cylR:
5′-AGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3′。
较佳地，所述cyl-Cm基因片段的构建为：
(1)cyl-Cm基因片段的扩增体系为：
2×PCR Master Mix 25μL、cyl-CmF 1μL、cyl-CmR 1μL、pSET5S质粒1μL、最后加H2O至50μL；
(2)cyl-Cm基因片段的扩增程序为：
a.94℃下反应4min，循环1次
b.94℃下反应30s，循环30次
c.58℃下反应30s，循环30次
d.72℃下反应70s，循环30次
e.72℃下反应10min，循环1次
f.4℃下反应停止，循环1次
最后用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，并回收纯化cyl-Cm基因片段；所述cyl-CmF和cyl-CmR是根据pSET5S质粒中氯霉素基因序列设计而得，其中，
cyl-CmF:
5′-ATTTTGAGTAGGTGTGAACAATGTAATTCGATGGGTTCCGAGG-3′
cyl-CmR:
5′-CTGATTTTCTCATAAAATGTGGCACCGAACTAGAGCTTGATG-3′。
较佳地，所述cyl-up基因片段的构建为：
(1)cyl-up基因片段的扩增体系为：
2×PCR Master Mix 25μL、cyl-upF 1μL、cyl-upR 1μL、无乳链球菌WC1535株的基因组DNA1μL、最后加H2O至50μL；
(2)cyl-up基因片段的扩增程序为：
a.94℃下反应5min，循环1次
b.94℃下反应30s，循环10次
c.63℃下反应45s，循环10次，每次循环1次，降低1℃
d.72℃下反应1min，循环10次
e.94℃下反应30s，循环24次
f.57℃下反应45s，循环24次
g.72℃下反应1min，循环24次
h.72℃下反应10min，循环1次
i.4℃下反应停止，循环1次
最后用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，并回收纯化CPS-up基因片段；其中，
cyl-upF:
5′-GCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTCTTTGCTAAGTATCCTGTCGC-3′
cyl-upR:
5′-GAGCCTCGGAACCCATCGAATTACATTGTTCACACCTACTCAAAAT-3′。
较佳地，所述cyl-down基因片段的构建为：
(1)cyl-down基因片段的扩增体系为：
2×PCR Master Mix 25μL、cyl-downF 1μL、cyl-downR 1μL、无乳链球菌WC1535株的基因组DNA1μL、最后加H2O至50μL；
(2)cyl-down基因片段的扩增程序为：
a.94℃下反应5min，循环1次
b.94℃下反应30s，循环10次
c.63℃下反应45s，循环10次，每次循环1次，降低1℃
d.72℃下反应1min，循环10次
e.94℃下反应30s，循环24次
f.57℃下反应45s，循环24次
g.72℃下反应1min，循环24次
h.72℃下反应10min，循环1次
i.4℃下反应停止，循环1次
最后用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，并回收纯化cyl-down基因片段；其中，
cyl-downF:
5′-CATCAAGCTCTAGTTCGGTGCCACATTTTATGAGAAAATCAG-3′
cyl-downR:
5′-GTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAACAGTTTCACTTTTGACAAC-3′。
所述无乳链球菌WC1535△cyl的应用，将所述无乳链球菌WC1535△cyl应用于鱼链球菌病的防控以及无乳链球菌的致病机理研究，特别是应用于鱼链球菌病的弱毒活疫苗。
本发明所述突变株WC1535△cyl由于溶血素合成相关基因簇的缺失而不能正常合成溶血素，由于溶血素是无乳链球菌重要的毒力因子，因此，这种溶血活性的缺失株会显著降低菌株本身的致病性。本发明所述不溶血无乳链球菌弱毒株的制备方法是分别PCR扩增cyl基因簇的上下游同源臂(cyl-up和cyl-down)，然后扩增pSET5S载体上的氯霉素基因(Cm)，将这3个片段连接到pSET4S载体上，得到载体pSET4s-cylCm，再将该重组质粒转化鱼源无乳链球菌WC1535株，利用同源重组原理将无乳链球菌WC1535基因组中的cyl基因簇缺失，通过温度和抗性筛选构建不溶血缺失型突变株WC1535△cyl。
本发明的主要优点：本发明将WC1535株的溶血素基因簇全部缺失，构建了不溶血缺失突变株，该缺失突变株对罗非鱼的毒力极显著下降。由于该缺失株为溶血素基因簇全部缺失，该缺失片段比较大，其大小为11411bp(cyl基因簇缺失片段)，缺失的基因为cylX-cylK(图1)。因此，该菌株的安全性高，不存在毒力返强的风险。该菌株的免疫原性高，能够保护免疫罗非鱼抵抗无乳链球菌的入侵，而且制作工艺简单，生产成本低，为有效控制我国鱼链球菌病的发生与流行奠定了坚实的基础。不溶血突变株WC1535△cyl腹腔注射感染罗非鱼，该缺失突变株在罗非鱼体内平均可以存活15d，可长时间有效地刺激罗非鱼产生免疫力。
附图说明
图1为不溶血无乳链球菌WC1535△cyl株cyl基因簇cylX-cylK基因缺失示意图，
图2为野生株WC1535的血平板培养溶血图，
图3为本发明不溶血无乳链球菌WC1535△cyl的血平板培养不溶血图。
具体的实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，以助于本领域技术人员理解本发明，但不限制本发明的保护范围。
1.材料：无乳链球菌WC1535株，由中国水产科学研究院珠江水产研究所从患病罗非鱼体内分离。质粒pSET4S和pSET5S为日本国立动物卫生研究所的Daisuke Takamatsu博士惠赠。引用文献：Takamatsu D.,Osaki M.,Sekizaki T.Thermosensitive suicidevectors for gene replacement in Streptococcus suis.Plasmid.2001,46,140–148.
2.引物的设计合成
无乳链球菌WC1535株的基因组序列参考(GenBank accession No.CP016501)，以该菌株的基因组序列为模板，使用Primer Primier 5.0软件设计扩增目的片段的引物。以引物cyl-upF和cyl-upR扩增cyl-up上游同源臂；以引物cyl-downF和cyl-downR扩增cyl-down下游同源臂。同时，设计位于cyl基因簇两侧的引物对cyl-dF和cyl-dR，用于筛选cyl基因缺失突变株。根据pSET5S质粒中氯霉素基因序列，设计引物cyl-CmF和cyl-CmR，用于扩增氯霉素基因。引物pSET4s-cylF和pSET4s-cylR用于扩增cyl-up-Cm-cyl-down基因片段的全长。
cyl-upF:
5′-GCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTCTTTGCTAAGTATCCTGTCGC-3′
cyl-upR:
5′-GAGCCTCGGAACCCATCGAATTACATTGTTCACACCTACTCAAAAT-3′
cyl-CmF:
5′-ATTTTGAGTAGGTGTGAACAATGTAATTCGATGGGTTCCGAGG-3′
cyl-CmR:
5′-CTGATTTTCTCATAAAATGTGGCACCGAACTAGAGCTTGATG-3′
cyl-downF:
5′-CATCAAGCTCTAGTTCGGTGCCACATTTTATGAGAAAATCAG-3′
cyl-downR:
5′-GTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAACAGTTTCACTTTTGACAAC-3′
pSET4s-cylF:
5′-ACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCC-3′
pSET4s-cylR:
5′-AGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3′
cyl-dF：5′-TACCTCCTTGAAGATTGCTACG-3′
cyl-dR：5′-TGTTTCTGGCCTTTCTACTACC-3′
3.PCR扩增目的基因
3.1cyl-up、cyl-down和cyl-Cm基因片段扩增体系(50μL)：
表1PCR扩增体系
Figure BDA0001376927650000091
3.2cyl-up和cyl-down基因片段PCR扩增程序(表2)：
表2cyl-up和cyl-down基因片段PCR扩增程序
Figure BDA0001376927650000092
用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，分别回收纯化cyl-up和cyl-down基因片段。
3.3cyl-Cm基因片段PCR扩增程序(表3)：
表3cyl-Cm基因片段PCR扩增程序
Figure BDA0001376927650000101
用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，并回收纯化cyl-Cm基因片段。
3.4cyl-up-Cm-cyl-down基因片段全长的PCR扩增体系(表4)：
表4cyl-up-Cm-cyl-down基因PCR扩增体系
Figure BDA0001376927650000102
3.5cyl-up-Cm-cyl-down基因片段全长的PCR扩增程序(表5)
表5cyl-up-Cm-cyl-down基因片段全长扩增程序
Figure BDA0001376927650000103
用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，并回收纯化cyl-up-Cm-cyl-down基因片段。
4.pSET4s-cylCm重组质粒的构建：
4.1pSET4S质粒的双酶切
提取pSET4S质粒，经过HindIII和EcoRI双酶切，酶切体系见表6。37℃酶切3h，胶回收酶切产物。
表6pSET4S质粒的双酶切反应体系
Figure BDA0001376927650000111
4.2pSET4S质粒和cyl-up-Cm-cyl-down基因片段的无缝克隆(Seamless cloning)
取双酶切后的pSET4S质粒6μL与cyl-up-Cm-cyl-down基因片段3μL，然后加入Seamless cloning kit连接体系1μL，混匀后50℃处理30min。
4.3pSET4s-cylCm重组质粒的转化与筛选
取10μL连接液，加入100μL的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰上孵育30min后，42℃热激90s，冰上孵育2min，然后37℃复苏30min，涂布于含有氯霉素的LB平板上。PCR筛选阳性克隆，阳性PCR产物进行测序验证，将获得的重组质粒命名为pSET4s-cylCm。
5.不溶血无乳链球菌缺失菌株的构建
一株鱼源无乳链球菌WC1535感受态细胞的制备方法，具体步骤如下：
(1)鱼源无乳链球菌WC1535复苏于BHI(脑心浸液培养基)中，30℃培养过夜；
(2)取培养过夜的菌液加入100mL新鲜的BHI液体培养基中，30℃摇床扩大培养5～6h，OD600＝0.6时，收集菌体；
(3)经扩大培养的菌液在5000r/min离心10min，去上清液；
(4)菌体使用20mL15％的甘油轻轻悬浮，离心，去上清；
(5)重复步骤(4)两次；
(6)使用1mL15％的甘油轻轻悬浮菌体，分装至1.5mL的离心管中，即为无乳链球菌感受态细胞。
重组质粒pSET4s-cylCm经过电转化至无乳链球菌WC1535株感受态细胞，涂布于含有氯霉素的BHI平板，置于28℃倒置培养36h。挑取单克隆至含有氯霉素的BHI液体培养基中，28℃培养至对数生长期，然后稀释10000倍，涂布于无抗性的BHI平板上，于37℃倒置培养。挑取单克隆进行菌落PCR验证，引物为cyl-dF(5′-TACCTCCTTGAAGATTGCTACG-3′)和cyl-dR(5′-TGTTTCTGGCCTTTCTACTACC-3′)，阳性敲除克隆可以扩增到预期大小为2960bp的PCR产物。由于野生株PCR产物预期大小为13316bp，由于该片段长度很长，通常的Taq酶不能扩增如此长度的PCR产物，因此，野生株PCR扩增产物为阴性。缺失株PCR扩增产物进行测序分析(cyl-detection基因序列)，结果发现突变株的cyl基因簇发生了缺失，这表明已经成功构建了△cyl缺失突变株，命名为不溶血无乳链球菌WC1535△cyl。
6.脱脂绵羊血平板观察菌株的溶血活性
菌株WC1535株和WC1535△cyl株样品分别涂布接种于脱脂绵羊血平板，37℃培养24h后观察菌株的溶血活性。结果表明，与野生株WC1535株有β溶血活性相比(见附图2)，突变株WC1535△cyl株的溶血活性出现缺失，为不溶血无乳链球菌(见附图3)。
7.缺失株WC1535△cyl对罗非鱼的毒力实验。
罗非鱼(体质量约为50g)随机分为4组，每组30尾。缺失株WC1535△cyl和野生株WC1535分别用无菌PBS重悬，并分别稀释到5×108、5×107、5×106和5×105CFU/mL，腹腔注射0.1mL菌悬液，30℃水温条件下饲养，观察罗非鱼存活状态，并记录罗非鱼死亡时间和数量，持续观察2周。实验结果表明，通过寇氏法计算菌株对罗非鱼的半数致死剂量(LD50)，结果发现野生株WC1535株对罗非鱼的LD50＝7.7×106CFU/mL，缺失株WC1535△cyl对罗非鱼的LD50＝1.4×108CFU/mL。这表明缺失株WC1535△cyl对罗非鱼的致病力大大降低，与野生株相比该缺失株对罗非鱼LD50上升了约18倍，这也表明无乳链球菌的溶血活性丧失后，其对罗非鱼的毒力明显降低。
缺失株WC1535△cyl在罗非鱼体内的存活实验：
缺失株WC1535△cyl用无菌PBS稀释为5×107CFU/mL，拌饲料投喂罗非鱼(30尾)，每天饲料的投喂量是罗非鱼体重的3％，连续投喂3d，并在26±1℃条件下饲养。投喂结束后每2天解剖3尾罗非鱼，取脾脏和肾脏分离细菌，连续进行20天，同时观察罗非鱼的发病死亡情况以及是否出现临床症状。实验结果表明，缺失株WC1535△cyl在罗非鱼的脾脏和肾脏可以存活10d。投喂缺失株WC1535△cyl后的罗非鱼均无发病死亡，而且投喂后罗非鱼均未有任何发病症状。这表明缺失株WC1535△cyl可以在罗非鱼长时间滞留，而且口服对罗非鱼无致病性，这也暗示该缺失株具有长时间刺激罗非鱼机体产生免疫应答的潜力，因此该缺失株作为无乳链球菌弱毒活疫苗具有重要的应用价值。
8.缺失株WC1535△cyl对罗非鱼的免疫保护实验
罗非鱼(体质量约为5g)随机分为6组，每组200尾。缺失株WC1535△cyl在液体BHI培养中传代30代，取生长特征正常、遗传稳定且无溶血活性的突变株在液体BHI培养中培养至稳定生长期，然后用无菌PBS重悬，并稀释到5×107CFU/mL。免疫组(3个重复组)罗非鱼投喂菌液+饲料，对照组(3个重复组)罗非鱼投喂PBS+饲料，26±2℃水温条件下饲养，连续饲养2个月。饲养1个月和2个月时分别进行攻毒试验，计算免疫组和对照组的相对免疫保护率(RPS)，每组试验鱼30尾，30℃水温条件下攻毒。疫苗免疫1个月时，免疫组的RPS为79.1％；该疫苗免疫2个月时，免疫组的RPS为68％。这表明缺失株WC1535△cyl对罗非鱼具有良好的免疫保护效果。同时，这也说明溶血基因簇cyl的缺失突变对罗非鱼无乳链球菌强毒株WC1535有很好的保护作用，该缺失突变株可以作为无乳链球菌的弱毒候选疫苗使用，可以开发为口服弱毒活疫苗，具有十分广阔的应用前景。
上述实施例，只是本发明的较佳实施例，并非用来限制本发明实施范围，故凡以本发明权利要求所述的特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括在本发明权利要求范围之内。
序列表
发明名称：无不溶血乳链球菌WC1535△cyl及其构建和应用
申请人：中国水产科学研究院珠江水产研究所
cyl-up基因序列:
GCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTCTTTGCTAAGTATCCTGTCGCAATATATAATAATCTATTGCGTTGGATCATTAGTTTTGTCATTCCATTTGCTTTTACAGCTTATTATCCCGCTGCTTACTTCTTACAAGATAGAAATGTCTATTTTAATATTGGTGGGGTTATCTTGATTTCCTTGATTTCTTTTATGGTATCACTAATACTTTGGCATAAAGGAGTAGAAGTATATGAGAGTGCGGGTTCTTGATTAGTAAGGCAAGCCATTAATTTTTTTGAGTGTTTAGAAGTTTTAGGCTTACTAACTTAGCTTTGTTAGTGATGATATACTCCCCTTATAGTGTCTAGTGAATTTTTGTTTTTTTACTGTCCACTATAAGGGGAGTATATCAGGTGAAGAGGGACTATTAGTGTTGAGAATAATGTCCCTCATAGAACAATAATTACCATATCTTTACCAAAATAAAGTTAAAAACGCTCTTAGATGTGCTTTCTAAGAGCGTTTTTTGGTCTATAAAAGGTAAGCAAAAAGCAGATGTCATTTATGAAAGTGTTGACAAAGATGAAATACTTTGTTACTATTTTAACATAATAATGATATTTTAATTAGAGTGTGAATTTATAATTAATTTTTATAATGTTTATTTTAAATTTAAACTAATGTTTATAGCAGTGTTTTACTCATGATTTTGTGAATTCAACACTTAAGTCATGACCTCATTTTAAAGAGTTTCAGACGACACAGAAAGGAAGAAAACATAAGAAAGGCAATGCACGGCTTGTCCATAGTAGTGTTTGAAGTAGATGTTTAGAAATATTTTATTTTCCAACAGTACTGATATCAGAGCGAAGATGATTAGTTGAAGGTGATAATATGGGACGTTCTAATATTTTGAGTAGGTGTGAACAATGTAATTCGATGGGTTCCGAGGCTC
cyl-Cm基因序列:
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cyl-down基因序列:
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cyl-up-Cm-cyl-down基因序列:
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cyl-detection基因序列:
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cyl基因簇缺失片段：
TCTGATAATCAATGTGGCTTGTATAAAACGCGGCTTAAAGACAAGTTACTATTAGTAGTCCAACTGGTTGGAAATATTAGGTATTCTGAGTTTCTTACGGAAGGTGGTGTATATCATAAGGGAGAAACCTTGTTGGAAGTTATAACCTTAGGAATTTCTTATGAATATAAAAGTTATGGGGATATCAAAGTAATCAAGAAGTACTGTGCTGATGGCAGTGTCGTTGATTATAACATGCCAATACTATTAATGGAAAGGATTGAATAATGAAAACAGTAATAATATATGGAGGACAGGGTAATGTTCAGTCAAAACACCTTTGTCAACTAGTTAAAACTCCAAAAGGTGAAATTCTTTTTTCAAAGTTACAAGCAACTGATTTAGAATCATATCAGTTAATGATGGATGTCATTAACCACAAGGTAAGTTTAGACAATGTTCATGCGTCTATGTTAGCAAATTTTTTATATAATGATTGGCTAACAAACGATGAAAAAATAGTATCTGGGATAGGATTTTCAGCTCATAGCGCCGGTATTTTCAATGTGTTATATGCTAGTGGTAGTACTAGTTTTGAAAACATTATTCACTTTATTAAACGTCGTGCCCAACTTATAGAAAATTGTCATGTGTCTGAAGAGCTTTGGCTTTTGATGGTTGAAAACATTGATATGTTTAGTAAGGATGTTTTAAAAGAACAGTCTGAGAAAGTAAAATTAGCTATTATTACTGATGATAGAGCTGGTGTAATTGCTATGGATCAAGTCAACCGTTCTTTCTTTGATGACGTGATGACTAACAAAGGTTATTTTTATAAATTAAAGCAGTTAGGCGTAAAAGCACCATATCATACTGATTTTTTAAATGAATCTAAAGAGCAGTATAAACAATTGATTGAAAGCCTAGATATTTCGCAAAATGATGACTATGACTATATTTTTCATTGTGATCAATTGGTAGATGAAATTTTATATCAGTGGACCAATCTCTTTAACTGGCGTGCGATTAAGGAAACTATCATAGAAAAGGATGCGGAGATTATTGATATTTCTCCTAATAGGTTTATTTCTAGTCAGTTGCAAAAAATGAAAAAGAGGGGGAGGAAACAGTTATGAAAGTAGCAATAGTTACTGGTGGTACCAGAGGAATTGGAAGGGCTATTACAAAAGAGTTATACAAAGAAGGTTACAAAGTCATTGCTATTTATAATAGCAATGATGCTAAGGCAAGAGCTTTACAAGAGGAGTTACCAAAATTAGACGTTTATAAATGCAATATTTCAGATGCAAAAGCAGTACAAAAATTGGTGACTAAAATTTTTAGAGAATATGGCGGTATTGATTGTTTAGTTAATAATGCTGGTATTGTTAGAGATGGCTTTTTCTTGATGATGTCTAAGGAAAAATGGATGGATGTCATTAACATAAATATTATGGGGCTAGTTAACATGAGTAAAGCCGTGTTAAAAATCATGAAGGCTAAGCGTATACAGGGAAAGGTTATCAATATTTCTTCAACTAGTGGTATAGCAGGGCAGATAGGGCAAGCGAACTATTCAGCAACGAAAGGCGCTATCATTTCCATTACTAAAACTCTAGCGAAAGAATTTGCATCAGATGGTATTACGATTAATTGTGTAAGTCCAGGATTCATTGAAACAGATATGACAAATGAATTGCAAAATAAAGAAGAGCTAAAAGAGCATCTTATTCCTCTAAAAAGGTTTGGACAACCTGAAGAGGTGGCTTGGCTCGTAAGCTTTTTAGCAAGTGAGAAGGCAAACTATATTACAGGAAAAAATATTGTGATTGATGGAGGAATGATTAATGATTAACTGGGCTGAAGAACGTAAAATAATAAAAACACGTCAAGAAGTAGTTGATGAAATTAAAGGTATTTTGATTGACTCTTTAATGTTGGATATTGATAAAGATCTGATTATGAATGATCAACCATTATTTGGTCGTGGATTAGAGCTAGACTCTATTGATGCCCTAGAACTGTCAATAGGGATTTCAACAACGTTTGGTGTTGAACTAAATGATGATGATATTTCAATATTATCATCAGTAAATAGACTAGCAGATTTTGTGATTGAAAATAGTGAGGATATAGATGACCAAGCTAAGTAGTGAAGAAATTATAAAAATGTTACCTCATCGCTATCCGTTTCTAATGGTGGATAGAGTGCAGAGTTATAAAAAAGGTATCATTGAATGTCGTAAGAATATTACTATCAACGAACCTTACTTTCAAGGACATTTTCCACAACGTCCTATAGTTCCGGGTGTTTTGATGATTGAGATGGCAGCTCAATCTGCAGCTTTACTTTATATTTTAGATGCACTTGATGGTAGCCTCCCCTCTCTTGATGAATTAACAGCAGAGAAAATAGCAGAAAAAGTAGGTTATTTAGCCAGTGTGAAGAATTTCAAATTCAAGAAAATTGTTACTCCAGGAGACCAGCTAAACATTACATGTAAATCTCAATCAAAATTGGGGCATCTTTTAGAAATTCAAGTCGTTATTAGAGATGAGAATAAAAAAGAGGTTGCCTCAGGAAGGATGTTGGTATCAGAAAATGGAAATTAAACTCAAAAATATTGGAAAAAAATATGGTTCTTTTGAAGCATTGAGAGACATTAATCTCATCTTTGAAGAGGGAAAATTTTATGGCCTTCTTGGACCTAATGGAGCTGGTAAAACAACTTTATTTAACCTTTTAATTCAAAATTTTAAGCAAACGTCAGGCGATATTAAGTGGGAGGTGGATGGAAAACCTCTATCTATTAAAGATTTTTATCGTCACATTGGTATTGTCTTCCAAAGTAATCGCTTAGATGATAATTTAACGGTTGAGGAAAATCTAATTTCTAGAGGTGCTTTGTACGGTTTATCTAAATCACAAGTACGTAATCGCCTTAAAGATCTTCAAACGTATCTAGATATCACAGCAATAAAAAAACAAAAATATGGCAGTTTATCAGGAGGTCAAAAACGAAAAGTTGATATTGCACGCGCCTTGCTGCCACAACCTTCTCTATTATTATTAGATGAACCAACGACTGGTTTAGACCCTCAATCTCGTCGCGATTTATGGGATGCTATCGCACAACTAAATCAACAATCGCAGATGACAGTTGTACTAATTACTCATTATCTTGAAGAAATGTCTGCTTGTGATGTTTTAAATGTTCTTATTGAAGGAAACATTTATTATTCGGGAGATATTAAAAGCTTTATTGAGCAACATTCCACAACAAACTTGAATGTGGTATTGAAACCAGAAAAGTCATTAGACCAACTTTCGATAGCTGATTTTGTTAATAAATGTCAAGTCCTTTCAGAAAGGGAGATAGTATTTAAGGATATTTCTGTTGAGGAAATGATGCAGGTTATCTCAGACAATCAAGATAAATCTATTATTGAGACATTTAATGTTGAATATTCGAACTTAGAGGCGGCGTATCTCAACTTGCTTAGAGAAAAAGAAAGGAAAAACAATGTTTGAACTAATTTCTAGAAATCGTAAAGTTTACACGCGAGATCGGTTAGCGTTTTTCATGTCTTTTTTATCAGTTATTATCTTAATTTTGGTCTATCAGATTTTCTTGGGAAAAATTCAATTAGATGCTATAAAAGCAGCATTGAGGAGTAATACAGTATCCAGTGATACTATTCACATGGTTAATTATTGGCTCATTGCAGGTTTGACGACTATTATTTCAATGACTAGTACATTAGGTGCCTTTGGAGTTATGGTGTCCGACAAAGAAAAAAAATTAAATGAAGATTTTAAGGTCAGTCCTATATCAAATATCAAAATTGAATTGTCCTATGCTATATTTGCCGTTTTATTTGGTATTGTCATGACGATGTTCTCTTGCATCTTTGCTATCGGTATTTTTAACGGCTTTAATTCCTTGCTAGAGTATTCAGCTATGGATTATTTAACTATTTTAGGGATCGTTTCCTTAGGGACTGTTTTATCTGCGGCGATGATTTTACCTATTTTAGCCTTTATTCATACTAGTTCAGCTTTTACGACTCTTAGCACAATTGTAGGGACTTTTATTGGTTTTATTTCAGGAGTATATCTCTCAATTGGCTCGGTAGGAAAAGCATTACAACAGGTTATGACATGGTTTCCATTGACTCAAATCAATTCTCTTTTGAAACAGGTCTTAATGAAGGGTTCTATTGCGAAGGTATTTGACAAAGCCAACGAAGCCACTGTCTCTAACTATAAAGAATCATATGGTGTTGTTTTGCGTAATGCTGATGGAGAAAGGCTGAGTAATCACTTTATGTTGATTTATATCATTGCCCTCATTCTTATTTTATTGGCAATTCATTTTATTATTAAAAAGGTTAAAAAATGAAAGATGATAATAAATTAAAGATTTCTGAAGCTTCCTTAGAAGATTATTCTGAAGTGGTTCATTTATTTAATAGGAATCATGTTTATCAATTTCCAGACGGTAGGCCTTTAACTGTTGATGACCTTGATTTAACGTTAAAAGTTAAAGAAGTGACACATTTATTTTTACTGAAAAATCATGGTGTTTTGATTGGAACATCAGCTTTCTTTAAATTTATTACCTATGGTTGTTTAGATTGGAATAGTAGCTTTAGTGGTTTTCTTTTAATTGATTCGAAAAGTCGTAGTGGACAGGCAATCACTTATCTATATAAAACTATCTTAAAGAAGATAACAAAACTGAAGTTTTCTAATATCTATACCGAAATCAGTAACTACAATAAACCCTCCTTAGCTTTATCAAAATTGAATGGCTTCAAAGAGTATGATAAGACATATGAAGACATACTGCATTGTCGATCATTGCGTAGTCACCTCCCTAAGATATTGAATACGTTTCGTATTTCGAATTATTATGGTAAAACATACGACATATCAACTTTTCAAATTATGGAGGAAATTGAAAATCCCTTGGAAGAGGAGACAGAAATTAGGACCAAAGTCTCTGATGAAGAAATAT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AGGATTTTATCAAAAGAGTAATCACTACTTATTCAACAAATGTTAAAACGTGGAATAACTATATTAAAAAATATGGTGGCAAACCTTTTAATAATGCTTTAGAATTATTTACTGGTGATCTAAACTTGGTAACAGATTACTCTTTGTTTTATGAATTTGATAAAGATTCGTCCTATAAAACGATAGGACCTATTTTGATAGATAATGTAGGTTTTTCAAAATGCAGCCAAATTAATCAAGACAATAAGACTGTACTGCTCAGCTTTGGTACTTCATTTAAACGAGATTGGGTGGAATCTTTTTTAAAGACATTACCAAGGCATTATCATTATTTACTGACAAGCTGTGGTGAGGCTATAAACATTCCAGGAAGTTATATTGAGATAGTTGATTTTATTGATTTTAAAACCATAGATAAAGAGATTTATTTCGCTATTATACACGGTGGGCAAGGAACAGTTTATGCGATGGCTGCACAAGGTATTCCCTTTATAGGTATCCCTTTCTTTAACGAACAATTTTGGAATATTAAGAAGTTCAGTAAAGAAAAGTGCGCTTATTTGGTAAAGAAACCTGATGTAAGAGAGATACGTAAAGCAATTAGCTGTCTTGAAAGAGACTATGATATCTATAAAAGTTATATGATAAGACTAAGCCAAGGAATTAAAGAAGAAGCAGAGGCATCTTTACAAAAAGCGGAGGCAGAAATTGAATCCTTTATCAGAAAAAGACAAAGTTAACTATATTATGATTTATAAAAATAGGCAGTCTACATTGGAGAATAATTTATCTGGCGATCGGTTGATGAGATATCAACAAGCAAATAGACAGGTAAGCAAAGATAAACTGTTAACAGGGAGTTATTTTGTGTACCAATGCTTAAAAAAGTTAGGTTTTACCAATAAGATTTGTCAGGAATCTTTTTCTAGTGTTAGTAGTTATTTAATTGGTTTGCCAAAGGGGAAAATTAGTTACTCTAATTCTGGTGACTATCATATTCTAACCTATGCTCCCAGTGGTTCAACTGGGGTTGATATTGAGAAATACAAAGATAGATCAGAACAAACCTACCAAAACTACCTAGGAGAATCAGTTAGTAGTGATATGGATTCTAAATTATTATTTTATAAGGCATGGTTACAAAAAGAAATTTCCTATAAATGTGGGAAATCTATAGATATTACCTATCAAACAATGATAGATGGCTATATTTATGGTTATGCTTTTGATAATACTTTTAAAGTAGAAGCGGTTTACTTAAAAGAATTATTACCAGATAACTAACTCGCAACATGTTGTTCCTACATATGCATCTATAAAAAGCACTTTGAAGTATTTCAAGGGCTTTTTATAATACCTTGGGTAGTCTTTAACAATTATGGTTAGAGTTGATATGATAAACTGATCATTT
序列表
发明名称：不溶血无乳链球菌WC1535△cyl及其构建和应用
申请人：中国水产科学研究院珠江水产研究所
cyl-up基因序列:
GCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTCTTTGCTAAGTATCCTGTCGCAATATATAATAATCTATTGCGTTGGATCATTAGTTTTGTCATTCCATTTGCTTTTACAGCTTATTATCCCGCTGCTTACTTCTTACAAGATAGAAATGTCTATTTTAATATTGGTGGGGTTATCTTGATTTCCTTGATTTCTTTTATGGTATCACTAATACTTTGGCATAAAGGAGTAGAAGTATATGAGAGTGCGGGTTCTTGATTAGTAAGGCAAGCCATTAATTTTTTTGAGTGTTTAGAAGTTTTAGGCTTACTAACTTAGCTTTGTTAGTGATGATATACTCCCCTTATAGTGTCTAGTGAATTTTTGTTTTTTTACTGTCCACTATAAGGGGAGTATATCAGGTGAAGAGGGACTATTAGTGTTGAGAATAATGTCCCTCATAGAACAATAATTACCATATCTTTACCAAAATAAAGTTAAAAACGCTCTTAGATGTGCTTTCTAAGAGCGTTTTTTGGTCTATAAAAGGTAAGCAAAAAGCAGATGTCATTTATGAAAGTGTTGACAAAGATGAAATACTTTGTTACTATTTTAACATAATAATGATATTTTAATTAGAGTGTGAATTTATAATTAATTTTTATAATGTTTATTTTAAATTTAAACTAATGTTTATAGCAGTGTTTTACTCATGATTTTGTGAATTCAACACTTAAGTCATGACCTCATTTTAAAGAGTTTCAGACGACACAGAAAGGAAGAAAACATAAGAAAGGCAATGCACGGCTTGTCCATAGTAGTGTTTGAAGTAGATGTTTAGAAATATTTTATTTTCCAACAGTACTGATATCAGAGCGAAGATGATTAGTTGAAGGTGATAATATGGGACGTTCTAATATTTTGAGTAGGTGTGAACAATGTAATTCGATGGGTTCCGAGGCTC
cyl-Cm基因序列:
ATTTTGAGTAGGTGTGAACAATGTAATTCGATGGGTTCCGAGGCTCAACGTCAATAAAGCAATTGGAATAAAGAAGCGAAAAAGGAGAAGTCGGTTCAGAAAAAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGTAATATAAAAACCTTCTTCAACTAACGGGGCAGGTTAGTGACATTAGAAAACCGACTGTAAAAAGTACAGTCGGCATTATCTCATATTATAAAAGCCAGTCATTAGGCCTATCTGACAATTCCTGAATAGAGTTCATAAACAATCCTGCATGATAACCATCACAAACAGAATGATGTACCTGTAAAGATAGCGGTAAATATATTGAATTACCTTTATTAATGAATTTTCCTGCTGTAATAATGGGTAGAAGGTAATTACTATTATTATTGATATTTAAGTTAAACCCAGTAAATGAAGTCCATGGAATAATAGAAAGAGAGAAAGCATTTTCAGGTATAGGTGTTTTGGGAAACAATTTCCCCGAACCATTATATTTCTCTACATCAGAAAGGTATAAATCATAAAACTCTTTGAAGTCATTCTTTACAGGAGTCCAAATACCAGAGAATGTTTTAGATACACCATCAAAAATTGTATAAAGTGGCTCTAACTTATCCCAATAACCTAACTCTCCGTCGCTATTGTAACCAGTTCTAAAAGCTGTATTTGAGTTTATCACCCTTGTCACTAAGAAAATAAATGCAGGGTAAAATTTATATCCTTCTTGTTTTATGTTTCGGTATAAAACACTAATATCAATTTCTGTGGTTATACTAAAAGTCGTTTGTTGGTTCAAATAATGATTAAATATCTCTTTTCTCTTCCAATTGTCTAAATCAATTTTATTAAAGTTCATTTGATATGCCTCCTAAATTTTTATCTAAAGTGAATTTAGGAGGCTTACTTGTCTGCTTTCTTCATTAGAATCAATCCTTTTTTAAAAGTCAATATTACTGTAACATAAATATATATTTTAAAAATATCCCACTTTATCCAATTTTCGTTTGTTGAACCATTATATCACATTATCCATTAAAAATCAAACAAATTTTCATCAAGCTCTAGTTCGGTGCCACATTTTATGAGAAAATCAG
cyl-down基因序列:
CATCAAGCTCTAGTTCGGTGCCACATTTTATGAGAAAATCAGAAAATAGAGGTGTTTTTTTGTGATAATAATTAGAAATAATAAAAACTGAAATATTTTCTAATGTAAAAAAAGATAAAAGAACTTATTGCTGAAAACGATTTCAACTTAACATTTGCCATTGACAAGTACTTAGAGGAGTGCTAAAATTTCGTTAGCTGGTTAACAAACCGGTTAAGTAATGTGAGGTTCTTTTATGAGTGAATTCCTTTCAGCCAAACCTATTGGTCATAATGATTCATCTAATACTATTTTAAGAATTATAGAGAATACGAAATATATTCATCACTATGATGGAAAAGTTGTTGTCGAAATTCCTCCTCAAAAAGAGCCTATCAAAGTCTTTTTTATGGATTCACGTCTTCATTATTTAGAATTTTCAGACATATGTCGGTATGTAACTGTTGTTTTGAAAAATAGTACCGTTGATAATATAACCAATTTAGGGCTAGATAATCATATTGTTTATGACAATGGTGATGATATGGTTGATCCGTTGCCGAGTATTCAGCATGGATTATTTCTTAATGATGATTAAAGATGTAGACAAAAATTTAGAAACGAGGAAGCCATGACATTTTATAAAAAGACGGACAAATTTGGATTTAGGAAAAGTAAAGTGTGCCGCAGCCTATGCGGTGCTTTATTGGGTACAGTAGCAGTTGTTAGTCTAGCTACAGCAAGTACAGAGATTCACGCTGATGAAGCAACAACCTCACCTACCACTGTAACGAAAGTACCTCAGCCAGTTCAAGCAGACACAACAGCTCTAAATACCTCTAAGACTCACAGTACACAAGCAACTACAACTCCTGTTGAAGCTAAGGAGAATAAGGTTGTCAAAAGTGAAACTGTTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAAC
cyl-up-Cm-cyl-down基因序列:
ACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTCTTTGCTAAGTATCCTGTCGCAATATATAATAATCTATTGCGTTGGATCATTAGTTTTGTCATTCCATTTGCTTTTACAGCTTATTATCCCGCTGCTTACTTCTTACAAGATAGAAATGTCTATTTTAATATTGGTGGGGTTATCTTGATTTCCTTGATTTCTTTTATGGTATCACTAATACTTTGGCATAAAGGAGTAGAAGTATATGAGAGTGCGGGTTCTTGATTAGTAAGGCAAGCCATTAATTTTTTTGAGTGTTTAGAAGTTTTAGGCTTACTAACTTAGCTTTGTTAGTGATGATATACTCCCCTTATAGTGTCTAGTGAATTTTTGTTTTTTTACTGTCCACTATAAGGGGAGTATATCAGGTGAAGAGGGACTATTAGTGTTGAGAATAATGTCCCTCATAGAACAATAATTACCATATCTTTACCAAAATAAAGTTAAAAACGCTCTTAGATGTGCTTTCTAAGAGCGTTTTTTGGTCTATAAAAGGTAAGCAAAAAGCAGATGTCATTTATGAAAGTGTTGACAAAGATGAAATACTTTGTTACTATTTTAACATAATAATGATATTTTAATTAGAGTGTGAATTTATAATTAATTTTTATAATGTTTATTTTAAATTTAAACTAATGTTTATAGCAGTGTTTTACTCATGATTTTGTGAATTCAACACTTAAGTCATGACCTCATTTTAAAGAGTTTCAGACGACACAGAAAGGAAGAAAACATAAGAAAGGCAATGCACGGCTTGTCCATAGTAGTGTTTGAAGTAGATGTTTAGAAATATTTTATTTTCCAACAGTACTGATATCAGAGCGAAGATGATTAGTTGAAGGTGATAATATGGGACGTTCTAATATTTTGAGTAGGTGTGAACAATGTAATTCGATGGGTTCCGAGGCTCAACGTCAATAAAGCAATTGGAATAAAGAAGCGAAAAAGGAGAAGTCGGTTCAGAAAAAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGTAATATAAAAACCTTCTTCAACTAACGGGGCAGGTTAGTGACATTAGAAAACCGACTGTAAAAAGTACAGTCGGCATTATCTCATATTATAAAAGCCAGTCATTAGGCCTATCTGACAATTCCTGAATAGAGTTCATAAACAATCCTGCATGATAACCATCACAAACAGAATGATGTACCTGTAAAGATAGCGGTAAATATATTGAATTACCTTTATTAATGAATTTTCCTGCTGTAATAATGGGTAGAAGGTAATTACTATTATTATTGATATTTAAGTTAAACCCAGTAAATGAAGTCCATGGAATAATAGAAAGAGAGAAAGCATTTTCAGGTATAGGTGTTTTGGGAAACAATTTCCCCGAACCATTATATTTCTCTACATCAGAAAGGTATAAATCATAAAACTCTTTGAAGTCATTCTTTACAGGAGTCCAAATACCAGAGAATGTTTTAGATACACCATCAAAAATTGTATAAAGTGGCTCTAACTTATCCCAATAACCTAACTCTCCGTCGCTATTGTAACCAGTTCTAAAAGCTGTATTTGAGTTTATCACCCTTGTCACTAAGAAAATAAATGCAGGGTAAAATTTATATCCTTCTTGTTTTATGTTTCGGTATAAAACACTAATATCAATTTCTGTGGTTATACTAAAAGTCGTTTGTTGGTTCAAATAATGATTAAATATCTCTTTTCTCTTCCAATTGTCTAAATCAATTTTATTAAAGTTCATTTGATATGCCTCCTAAATTTTTATCTAAAGTGAATTTAGGAGGCTTACTTGTCTGCTTTCTTCATTAGAATCAATCCTTTTTTAAAAGTCAATATTACTGTAACATAAATATATATTTTAAAAATATCCCACTTTATCCAATTTTCGTTTGTTGAACCATTATATCACATTATCCATTAAAAATCAAACAAATTTTCATCAAGCTCTAGTTCGGTGCCACATTTTATGAGAAAATCAGAAAATAGAGGTGTTTTTTTGTGATAATAATTAGAAATAATAAAAACTGAAATATTTTCTAATGTAAAAAAAGATAAAAGAACTTATTGCTGAAAACGATTTCAACTTAACATTTGCCATTGACAAGTACTTAGAGGAGTGCTAAAATTTCGTTAGCTGGTTAACAAACCGGTTAAGTAATGTGAGGTTCTTTTATGAGTGAATTCCTTTCAGCCAAACCTATTGGTCATAATGATTCATCTAATACTATTTTAAGAATTATAGAGAATACGAAATATATTCATCACTATGATGGAAAAGTTGTTGTCGAAATTCCTCCTCAAAAAGAGCCTATCAAAGTCTTTTTTATGGATTCACGTCTTCATTATTTAGAATTTTCAGACATATGTCGGTATGTAACTGTTGTTTTGAAAAATAGTACCGTTGATAATATAACCAATTTAGGGCTAGATAATCATATTGTTTATGACAATGGTGATGATATGGTTGATCCGTTGCCGAGTATTCAGCATGGATTATTTCTTAATGATGATTAAAGATGTAGACAAAAATTTAGAAACGAGGAAGCCATGACATTTTATAAAAAGACGGACAAATTTGGATTTAGGAAAAGTAAAGTGTGCCGCAGCCTATGCGGTGCTTTATTGGGTACAGTAGCAGTTGTTAGTCTAGCTACAGCAAGTACAGAGATTCACGCTGATGAAGCAACAACCTCACCTACCACTGTAACGAAAGTACCTCAGCCAGTTCAAGCAGACACAACAGCTCTAAATACCTCTAAGACTCACAGTACACAAGCAACTACAACTCCTGTTGAAGCTAAGGAGAATAAGGTTGTCAAAAGTGAAACTGTTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCT
cyl-detection基因序列:
TACCTCCTTGAAGATTGCTACGTCAAGTATCGCTTTTTGGACCAAACAATCTGGTGCTGTTATCTATATTTTTTATATGTTTAATGACTTTGCTAAGTATCCTGTCGCAATATATAATAATCTATTGCGTTGGATCATTAGTTTTGTCATTCCATTTGCTTTTACAGCTTATTATCCCGCTGCTTACTTCTTACAAGATAGAAATGTCTATTTTAATATTGGTGGGGTTATCTTGATTTCCTTGATTTCTTTTATGGTATCACTAATACTTTGGCATAAAGGAGTAGAAGTATATGAGAGTGCGGGTTCTTGATTAGTAAGGCAAGCCATTAATTTTTTTGAGTGTTTAGAAGTTTTAGGCTTACTAACTTAGCTTTGTTAGTGATGATATACTCCCCTTATAGTGTCTAGTGAATTTTTGTTTTTTTACTGTCCACTATAAGGGGAGTATATCAGGTGAAGAGGGACTATTAGTGTTGAGAATAATGTCCCTCATAGAACAATAATTACCATATCTTTACCAAAATAAAGTTAAAAACGCTCTTAGATGTGCTTTCTAAGAGCGTTTTTTGGTCTATAAAAGGTAAGCAAAAAGCAGATGTCATTTATGAAAGTGTTGACAAAGATGAAATACTTTGTTACTATTTTAACATAATAATGATATTTTAATTAGAGTGTGAATTTATAATTAATTTTTATAATGTTTATTTTAAATTTAAACTAATGTTTATAGCAGTGTTTTACTCATGATTTTGTGAATTCAACACTTAAGTCATGACCTCATTTTAAAGAGTTTCAGACGACACAGAAAGGAAGAAAACATAAGAAAGGCAATGCACGGCTTGTCCATAGTAGTGTTTGAAGTAGATGTTTAGAAATATTTTATTTTCCAACAGTACTGATATCAGAGCGAAGATGATTAGTTGAAGGTGATAATATGGGACGTTCTAATATTTTGAGTAGGTGTGAACAATGTAATTCGATGGGTTCCGAGGCTCAACGTCAATAAAGCAATTGGAATAAAGAAGCGAAAAAGGAGAAGTCGGTTCAGAAAAAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGTAATATAAAAACCTTCTTCAACTAACGGGGCAGGTTAGTGACATTAGAAAACCGACTGTAAAAAGTACAGTCGGCATTATCTCATATTATAAAAGCCAGTCATTAGGCCTATCTGACAATTCCTGAATAGAGTTCATAAACAATCCTGCATGATAACCATCACAAACAGAATGATGTACCTGTAAAGATAGCGGTAAATATATTGAATTACCTTTATTAATGAATTTTCCTGCTGTAATAATGGGTAGAAGGTAATTACTATTATTATTGATATTTAAGTTAAACCCAGTAAATGAAGTCCATGGAATAATAGAAAGAGAGAAAGCATTTTCAGGTATAGGTGTTTTGGGAAACAATTTCCCCGAACCATTATATTTCTCTACATCAGAAAGGTATAAATCATAAAACTCTTTGAAGTCATTCTTTACAGGAGTCCAAATACCAGAGAATGTTTTAGATACACCATCAAAAATTGTATAAAGTGGCTCTAACTTATCCCAATAACCTAACTCTCCGTCGCTATTGTAACCAGTTCTAAAAGCTGTATTTGAGTTTATCACCCTTGTCACTAAGAAAATAAATGCAGGGTAAAATTTATATCCTTCTTGTTTTATGTTTCGGTATAAAACACTAATATCAATTTCTGTGGTTATACTAAAAGTCGTTTGTTGGTTCAAATAATGATTAAATATCTCTTTTCTCTTCCAATTGTCTAAATCAATTTTATTAAAGTTCATTTGATATGCCTCCTAAATTTTTATCTAAAGTGAATTTAGGAGGCTTACTTGTCTGCTTTCTTCATTAGAATCAATCCTTTTTTAAAAGTCAATATTACTGTAACATAAATATATATTTTAAAAATATCCCACTTTATCCAATTTTCGTTTGTTGAACCATTATATCACATTATCCATTAAAAATCAAACAAATTTTCATCAAGCTCTAGTTCGGTGCCACATTTTATGAGAAAATCAGAAAATAGAGGTGTTTTTTTGTGATAATAATTAGAAATAATAAAAACTGAAATATTTTCTAATGTAAAAAAAGATAAAAGAACTTATTGCTGAAAACGATTTCAACTTAACATTTGCCATTGACAAGTACTTAGAGGAGTGCTAAAATTTCGTTAGCTGGTTAACAAACCGGTTAAGTAATGTGAGGTTCTTTTATGAGTGAATTCCTTTCAGCCAAACCTATTGGTCATAATGATTCATCTAATACTATTTTAAGAATTATAGAGAATACGAAATATATTCATCACTATGATGGAAAAGTTGTTGTCGAAATTCCTCCTCAAAAAGAGCCTATCAAAGTCTTTTTTATGGATTCACGTCTTCATTATTTAGAATTTTCAGACATATGTCGGTATGTAACTGTTGTTTTGAAAAATAGTACCGTTGATAATATAACCAATTTAGGGCTAGATAATCATATTGTTTATGACAATGGTGATGATATGGTTGATCCGTTGCCGAGTATTCAGCATGGATTATTTCTTAATGATGATTAAAGATGTAGACAAAAATTTAGAAACGAGGAAGCCATGACATTTTATAAAAAGACGGACAAATTTGGATTTAGGAAAAGTAAAGTGTGCCGCAGCCTATGCGGTGCTTTATTGGGTACAGTAGCAGTTGTTAGTCTAGCTACAGCAAGTACAGAGATTCACGCTGATGAAGCAACAACCTCACCTACCACTGTAACGAAAGTACCTCAGCCAGTTCAAGCAGACACAACAGCTCTAAATACCTCTAAGACTCACAGTACACAAGCAACTACAACTCCTGTTGAAGCTAAGGAGAATAAGGTTGTCAAAAGTGAAACTGTTCAATCTGAGAGCCGAGTAATGCCTAGAGATAAGGTAGTAGAAAGGCCAGAAACA
cyl基因簇缺失片段：
TCTGATAATCAATGTGGCTTGTATAAAACGCGGCTTAAAGACAAGTTACTATTAGTAGTCCAACTGGTTGGAAATATTAGGTATTCTGAGTTTCTTACGGAAGGTGGTGTATATCATAAGGGAGAAACCTTGTTGGAAGTTATAACCTTAGGAATTTCTTATGAATATAAAAGTTATGGGGATATCAAAGTAATCAAGAAGTACTGTGCTGATGGCAGTGTCGTTGATTATAACATGCCAATACTATTAATGGAAAGGATTGAATAATGAAAACAGTAATAATATATGGAGGACAGGGTAATGTTCAGTCAAAACACCTTTGTCAACTAGTTAAAACTCCAAAAGGTGAAATTCTTTTTTCAAAGTTACAAGCAACTGATTTAGAATCATATCAGTTAATGATGGATGTCATTAACCACAAGGTAAGTTTAGACAATGTTCATGCGTCTATGTTAGCAAATTTTTTATATAATGATTGGCTAACAAACGATGAAAAAATAGTATCTGGGATAGGATTTTCAGCTCATAGCGCCGGTATTTTCAATGTGTTATATGCTAGTGGTAGTACTAGTTTTGAAAACATTATTCACTTTATTAAACGTCGTGCCCAACTTATAGAAAATTGTCATGTGTCTGAAGAGCTTTGGCTTTTGATGGTTGAAAACATTGATATGTTTAGTAAGGATGTTTTAAAAGAACAGTCTGAGAAAGTAAAATTAGCTATTATTACTGATGATAGAGCTGGTGTAATTGCTATGGATCAAGTCAACCGTTCTTTCTTTGATGACGTGATGACTAACAAAGGTTATTTTTATAAATTAAAGCAGTTAGGCGTAAAAGCACCATATCATACTGATTTTTTAAATGAATCTAAAGAGCAGTATAAACAATTGATTGAAAGCCTAGATATTTCGCAAAATGATGACTATGACTATATTTTTCATTGTGATCAATTGGTAGATGAAATTTTATATCAGTGGACCAATCTCTTTAACTGGCGTGCGATTAAGGAAACTATCATAGAAAAGGATGCGGAGATTATTGATATTTCTCCTAATAGGTTTATTTCTAGTCAGTTGCAAAAAATGAAAAAGAGGGGGAGGAAACAGTTATGAAAGTAGCAATAGTTACTGGTGGTACCAGAGGAATTGGAAGGGCTATTACAAAAGAGTTATACAAAGAAGGTTACAAAGTCATTGCTATTTATAATAGCAATGATGCTAAGGCAAGAGCTTTACAAGAGGAGTTACCAAAATTAGACGTTTATAAATGCAATATTTCAGATGCAAAAGCAGTACAAAAATTGGTGACTAAAATTTTTAGAGAATATGGCGGTATTGATTGTTTAGTTAATAATGCTGGTATTGTTAGAGATGGCTTTTTCTTGATGATGTCTAAGGAAAAATGGATGGATGTCATTAACATAAATATTATGGGGCTAGTTAACATGAGTAAAGCCGTGTTAAAAATCATGAAGGCTAAGCGTATACAGGGAAAGGTTATCAATATTTCTTCAACTAGTGGTATAGCAGGGCAGATAGGGCAAGCGAACTATTCAGCAACGAAAGGCGCTATCATTTCCATTACTAAAACTCTAGCGAAAGAATTTGCATCAGATGGTATTACGATTAATTGTGTAAGTCCAGGATTCATTGAAACAGATATGACAAATGAATTGCAAAATAAAGAAGAGCTAAAAGAGCATCTTATTCCTCTAAAAAGGTTTGGACAACCTGAAGAGGTGGCTTGGCTCGTAAGCTTTTTAGCAAGTGAGAAGGCAAACTATATTACAGGAAAAAATATTGTGATTGATGGAGGAATGATTAATGATTAACTGGGCTGAAGAACGTAAAATAATAAAAACACGTCAAGAAGTAGTTGATGAAATTAAAGGTATTTTGATTGACTCTTTAATGTTGGATATTGATAAAGATCTGATTATGAATGATCAACCATTATTTGGTCGTGGATTAGAGCTAGACTCTATTGATGCCCTAGAACTGTCAATAGGGATTTCAACAACGTTTGGTGTTGAACTAAATGATGATGATATTTCAATATTATCATCAGTAAATAGACTAGCAGATTTTGTGATTGAAAATAGTGAGGATATAGATGACCAAGCTAAGTAGTGAAGAAATTATAAAAATGTTACCTCATCGCTATCCGTTTCTAATGGTGGATAGAGTGCAGAGTTATAAAAAAGGTATCATTGAATGTCGTAAGAATATTACTATCAACGAACCTTACTTTCAAGGACATTTTCCACAACGTCCTATAGTTCCGGGTGTTTTGATGATTGAGATGGCAGCTCAATCTGCAGCTTTACTTTATATTTTAGATGCACTTGATGGTAGCCTCCCCTCTCTTGATGAATTAACAGCAGAGAAAATAGCAGAAAAAGTAGGTTATTTAGCCAGTGTGAAGAATTTCAAATTCAAGAAAATTGTTACTCCAGGAGACCAGCTAAACATTACATGTAAATCTCAATCAAAATTGGGGCATCTTTTAGAAATTCAAGTCGTTATTAGAGATGAGAATAAAAAAGAGGTTGCCTCAGGAAGGATGTTGGTATCAGAAAATGGAAATTAAACTCAAAAATATTGGAAAAAAATATGGTTCTTTTGAAGCATTGAGAGACATTAATCTCATCTTTGAAGAGGGAAAATTTTATGGCCTTCTTGGACCTAATGGAGCTGGTAAAACAACTTTATTTAACCTTTTAATTCAAAATTTTAAGCAAACGTCAGGCGATATTAAGTGGGAGGTGGATGGAAAACCTCTATCTATTAAAGATTTTTATCGTCACATTGGTATTGTCTTCCAAAGTAATCGCTTAGATGATAATTTAACGGTTGAGGAAAATCTAATTTCTAGAGGTGCTTTGTACGGTTTATCTAAATCACAAGTACGTAATCGCCTTAAAGATCTTCAAACGTATCTAGATATCACAGCAATAAAAAAACAAAAATATGGCAGTTTATCAGGAGGTCAAAAACGAAAAGTTGATATTGCACGCGCCTTGCTGCCACAACCTTCTCTATTATTATTAGATGAACCAACGACTGGTTTAGACCCTCAATCTCGTCGCGATTTATGGGATGCTATCGCACAACTAAATCAACAATCGCAGATGACAGTTGTACTAATTACTCATTATCTTGAAGAAATGTCTGCTTGTGATGTTTTAAATGTTCTTATTGAAGGAAACATTTATTATTCGGGAGATATTAAAAGCTTTATTGAGCAACATTCCACAACAAACTTGAATGTGGTATTGAAACCAGAAAAGTCATTAGACCAACTTTCGATAGCTGATTTTGTTAATAAATGTCAAGTCCTTTCAGAAAGGGAGATAGTATTTAAGGATATTTCTGTTGAGGAAATGATGCAGGTTATCTCAGACAATCAAGATAAATCTATTATTGAGACATTTAATGTTGAATATTCGAACTTAGAGGCGGCGTATCTCAACTTGCTTAGAGAAAAAGAAAGGAAAAACAATGTTTGAACTAATTTCTAGAAATCGTAAAGTTTACACGCGAGATCGGTTAGCGTTTTTCATGTCTTTTTTATCAGTTATTATCTTAATTTTGGTCTATCAGATTTTCTTGGGAAAAATTCAATTAGATGCTATAAAAGCAGCATTGAGGAGTAATACAGTATCCAGTGATACTATTCACATGGTTAATTATTGGCTCATTGCAGGTTTGACGACTATTATTTCAATGACTAGTACATTAGGTGCCTTTGGAGTTATGGTGTCCGACAAAGAAAAAAAATTAAATGAAGATTTTAAGGTCAGTCCTATATCAAATATCAAAATTGAATTGTCCTATGCTATATTTGCCGTTTTATTTGGTATTGTCATGACGATGTTCTCTTGCATCTTTGCTATCGGTATTTTTAACGGCTTTAATTCCTTGCTAGAGTATTCAGCTATGGATTATTTAACTATTTTAGGGATCGTTTCCTTAGGGACTGTTTTATCTGCGGCGATGATTTTACCTATTTTAGCCTTTATTCATACTAGTTCAGCTTTTACGACTCTTAGCACAATTGTAGGGACTTTTATTGGTTTTATTTCAGGAGTATATCTCTCAATTGGCTCGGTAGGAAAAGCATTACAACAGGTTATGACATGGTTTCCATTGACTCAAATCAATTCTCTTTTGAAACAGGTCTTAATGAAGGGTTCTATTGCGAAGGTATTTGACAAAGCCAACGAAGCCACTGTCTCTAACTATAAAGAATCATATGGTGTTGTTTTGCGTAATGCTGATGGAGAAAGGCTGAGTAATCACTTTATGTTGATTTATATCATTGCCCTCATTCTTATTTTATTGGCAATTCATTTTATTATTAAAAAGGTTAAAAAATGAAAGATGATAATAAATTAAAGATTTCTGAAGCTTCCTTAGAAGATTATTCTGAAGTGGTTCATTTATTTAATAGGAATCATGTTTATCAATTTCCAGACGGTAGGCCTTTAACTGTTGATGACCTTGATTTAACGTTAAAAGTTAAAGAAGTGACACATTTATTTTTACTGAAAAATCATGGTGTTTTGATTGGAACATCAGCTTTCTTTAAATTTATTACCTATGGTTGTTTAGATTGGAATAGTAGCTTTAGTGGTTTTCTTTTAATTGATTCGAAAAGTCGTAGTGGACAGGCAATCACTTATCTATATAAAACTATCTTAAAGAAGATAACAAAACTGAAGTTTTCTAATATCTATACCGAAATCAGTAACTACAATAAACCCTCCTTAGCTTTATCAAAATTGAATGGCTTCAAAGAGTATGATAAGACATATGAAGACATACTGCATTGTCGATCATTGCGTAGTCACCTCCCTAAGATATTGAATACGTTTCGTATTTCGAATTATTATGGTAAAACATACGACATATCAACTTTTCAAATTATGGAGGAAATTGAAAATCCCTTGGAAGAGGAGACAGAAATTAGGACCAAAGTCTCTGATGAAGAAATATTATTTAAAGCAGAAGATAGTGCTTCACTTCCTTATTATTTAAAAATGAGCTTGTTTCAAATGGAAATTGCTAGGTTAGATAACCGTTATGTTTTACAAGTTGACTTTTTATCGGAACAAGTAAAGAGGGTTCGGGTTAAAACTGGAAAATATCACTTGGCAAACTTAACGAGGGCTCACCCTAGCCTAACTTTAAGTCGTTTTGCCAATTATTATTACATTCAAGCAACTGTGGAAACCCTTTATGGTAATATCGATGTTCAACTGGAACGTCGAAAAAAGCATTATAGAGATGCAACTATTTGTCTTAAGAGAACTTTTCAAGGTTATGATTTACTTATCTCTCCAAATGGCAGCCTTATTTTTGAAAAGCAGAAAAGAAAGATACTTGAAGATAGTTTTTTGATTTTTAGCCAACCTTTGGACAAGAAATTAGTTGTAAAAGAAGAAGAAAATCACATTACAATCAAATGTTTCTATCAAGGTGCTTTAATTGAGAAAATCATGACATTTACAAGTGACGAAGAAATCACTTGTGTTTATAAATGTAATCAAAAGGCTAAAGAGATGTTCCCAAAATTATTGAAACAGACTTTCAAGTTACACTGCCAAGAGCAGTTGATTAGAGATAGTGAAGGTTATCTTGTGAATGTTCCAGGAAGTTACCCGATTGAGCATGATGATTTTCTTCGAGCAGATAAGTTTGAAGATAGACAATTCCATTATTACCTCCCGAATGAAGATAAAATGATTTCCTATTCTCCTCCTGGCAAAGCCAGCAATCAAATGCAATTTAGACCCTTATGTCTTATTGATACAGATAGCCTTTCTTTTCCACTGACTTATCATTTTAGGATTTCACAAGCATCATCGGAGGAGGCGTTAATCAATCTAAAAAAACAGCCAATATGGGACAGCAACTACCAAGCGTCAGCAACTGACCTTTTAAAACATATCTCTAACCTAACATTAGAAGAAGAGAAGGATTATGGCATCAAGAGAATGATAGCTAACAGAAAGCATTATCCTAGTCACAAACTGGTTTTAGCCTATAATCAGATTGTTTTGCCTAAGAATGAAATTCCAAGAGACAGTGAATTATATTCTATTTCTTTTGATTATCGAATTAGAGGAAAGTTTGTCCAAATCCGCCAAGGGGAACATGTCAAATATGATAATAAATCCTATGTTTTGGAAAATAGTCAACAATTAGTATTGTATGTAGCTAGCGATGATAAATATATACTAATTTCTGCTAAAAATGGAATATTTTATTCTTACAAAGAGAACAATCATTTAAAAATAAGGTGCATGTTTAAAAGGAACTCACCTTATGCTACAAATGTGAGCATTACAGAATATAGAAAGTGTGAAGAAAAATGAATACTATTTATAATACATTGAGAACAGATAAAGGTTATAAAGTTTATGAGGGGTATTTATATGAAATTACTGGTGAAGAATGTGAAGAAGCCTTAGACCTTGTGATTCCTAAGAATATTGTATTTGCAGATACAGATACTTGTGGCTACACTTTTTTACTCAATGAAGATGGAACAGTTTATGATGATGTGACTTTCTACAAATTTGATGATAAATATTGGTTGGCTAGTCATAAAGCTTTGGATTCTTATTTAGACAACATCAATTTTGACTATACCGTAACAGATATTTCTGACGAGTATAAAATGCTGCAAATTGAAGGAAGATATTCGGGAGAAATTGCTCAGTCATTTTATGAATATGATATTTCAACACTTAATTTTCGTACTTTGATAGAGATGACTTATAAAGGTGAGAAAGGTTATCTTGCTAGATTTGGTTTTTCTGGAGAATTTGGCTATCAATTTTTCCTACCATCTTCTATTTTTGCTACTTTTGTTTCGGATGTCTGTGAAGGTATAGCAGAGTATGGGGATGAACTTGATAGATATTTAAGGTTTGAAGTGGGACAACCCATTACTGATATTTATCAACAAGAAGAATATTCTTTATATGAAATAGGTTATTCTTGGAATCTAGATTTCACAAAGGAAGAATTTAGAGGTCGCGATAGCTTGTTAGAGCACATCAGATCAGCAACAGTTAAAAGTGTTGGATTCTCAACGAAGGAAAAACTCGCTTCAGGAACACCAGTGCTATTTGATGACCAAATTGTTGGAAAGATTTTTTGGATAGCAGACGAGAAAGACTCTTCGGAAAATTACCTAGGTTTGATGATTGTTAACCAAACATATGCTCATTCAGGAGTTACTTTTGTAACAGAAGATGGCCAAATTTTGAAAACACAATCAAGCCCTTATTGTATCCCAGAAAGTTGGAACAAAGAATGAGCGTATATGTTAGTGGAATAGGAATTATTTCTTCTTTGGGAAAGAATTATAGCGAGCATAAACAGCATCTCTTCGACTTAAAAGAAGGAATTTCTAAACATTTATATAAAAATCACGACTCTATTTTAGAATCTTATACAGGAAGCATAACTAGTGACCCAGAGGTTCCTGAGCAATACAAAGATGAGACACGTAATTTTAAATTTGCTTTTACCGCTTTTGAAGAGGCTCTTGCTTCTTCAGGTGTTAATTTAAAAGCTTATCATAATATTGCTGTGTGTTTAGGGACCTCACTTGGGGGAAAGAGTGCTGGTCAAAATGCCTTGTATCAATTTGAAGAAGGAGAGCGTCAAGTAGATGCTAGTTTATTAGAAAAAGCATCTGTTTACCATATTGCTGATGAATTGATGGCTTATCATGATATTGTGGGAGCTTCGTATGTTATTTCAACCGCCTGTTCTGCAAGTAATAATGCCGTAATATTAGGAACACAATTACTTCAAGATGGCGATTGTGATTTAGCTATTTGTGGTGGCTGTGATGAGTTAAGTGATATTTCTTTAGCAGGCTTCACATCACTAGGAGCTATTAATACAGAAATGGCATGTCAGCCCTATTCTTCTGGAAAAGGAATCAATTTGGGTGAGGGCGCTGGTTTTGTTGTTCTTGTCAAAGATCAGTCCTTAGCTAAATATGGAAAAATTATCGGTGGTCTTATTACTTCAGATGGTTATCATATAACAGCACCTAAGCCAACAGGTGAAGGGGCGGCACAGATTGCAAAGCAGCTAGTGACTCAAGCAGGTATTGACTACAGTGAGATTGACTATATTAACGGTCACGGTACAGGTACTCAAGCTAATGATAAAATGGAAAAAAATATGTATGGTAAGTTTTTCCCGACAACGACATTGATCAGCAGTACCAAGGGGCAAACGGGTCATACTCTAGGGGCTGCAGGTATTATCGAATTGATTAATTGTTTAGCGGCAATAGAGGAACAGACTGTACCAGCAACTAAAAATGAGATTGGGATAGAAGGTTTTCCAGAAAATTTTGTCTATCATCAAAAGAGAGAATACCCAATAAGAAATGCTTTAAATTTTTCGTTTGCTTTTGGTGGAAATAATAGTGGTGTCTTATTGTCATCTTTAGATTCACCTCTAGAAACATTACCTGCTAGAGAAAATCTTAAAATGGCTATCTTATCATCTGTTGCTTCCATTTCTAAGAATGAATCACTTTCTATAACCTATGAAAAAGTTGCTAGTAATTTCAACGACTTTGAAGCATTACGCTTTAAAGGGGCTAGACCACCCAAAACTGTCAACCCAGCACAATTTAGGAAAATGGATGATTTTTCCAAAATGGTTGCCGTAACAACAGCTCAAGCACTAATAGAAAGCAATATTAATCTAAAAAAACAAGATACTTCAAAAGTAGGAATTGTATTTACAACACTTTCTGGACCAGTTGAGGTTGTTGAAGGTATTGAAAAGCAAATCACAACAGAAGGATATGCACATGTTTCTGCTTCACGATTCCCGTTTACAGTAATGAATGCAGCAGCTGGTATGCTTTCTATCATTTTTAAAATAACAGGTCCTTTATCTGTCATTTCGACAAATAGTGGAGCGCTTGATGGTATACAATATGCCAAGGAAATGATGCGTAACGATAATCTAGACTATGTGATTCTTGTTTCTGCTAATCAGTGGACAGACATGAGTTTTATGTGGTGGCAACAATTAAACTATGATAGTCAAATGTTTGTCGGTTCTGATTATTGTTCAGCACAAGTCCTCTCTCGTCAAGCATTGGATAATTCTCCTATAATATTAGGTAGTAAACAATTAAAATATAGCCATAAAACATTCACAGATGTGATGACTATTTTTGATGCTGCGCTTCAAAATTTATTATCAGACTTAGGACTAACCATAAAAGATATCAAAGGTTTCGTTTGGAATGAGCGGAAGAAGGCAGTTAGTTCAGATTATGATTTCTTAGCGAACTTGTCTGAGTATTATAATATGCCAAACCTTGCTTCTGGTCAGTTTGGATTTTCATCTAATGGTGCTGGTGAAGAACTGGACTATACTGTTAATGAAAGTATAGAAAAGGGCTATTATTTAGTCCTATCTTATTCGATCTTCGGTGGTATCTCTTTTGCTATTATTGAAAAAAGGTGATAAAATGAGTAAATTTTTATTTGCTCCTTTCATGATGAATTTAGGAGAGAGCCAAAGATTATCAAAACTGGCTAATTGTTTATATGAACAAGGACATGATATTCATATCCTTGGAGACAATTATTATCCATTTTTATTTAATAATGATGCTTATCGCTATCACCACTGTGTAGAAGATAAATCTGTTTATAATAGTAAGCGATATGATGCTTTCTTTTCTCTTTCAACAGACTTTAATTTTTTATCAGAAGAAGAAATTGAACGCATCTGTTCTATTGAAAGAGACTTGTTACGCCAAGAAAAATTTGATGCTGTATTGACAGGTTACCGTCTATCTATTGTTACAAGTTGTCGTTTAGAAAGCATACCATTAATTTGGATTATTTCAGGGGCAACGCATATCAGTGAAATTGTTGAAAACTCAGAAGGAATATTGCCTAATGGGAAGATAAGTAAAGCTAGTAAGCCTCAAACAAAGGATTTTATCAAAAGAGTAATCACTACTTATTCAACAAATGTTAAAACGTGGAATAACTATATTAAAAAATATGGTGGCAAACCTTTTAATAATGCTTTAGAATTATTTACTGGTGATCTAAACTTGGTAACAGATTACTCTTTGTTTTATGAATTTGATAAAGATTCGTCCTATAAAACGATAGGACCTATTTTGATAGATAATGTAGGTTTTTCAAAATGCAGCCAAATTAATCAAGACAATAAGACTGTACTGCTCAGCTTTGGTACTTCATTTAAACGAGATTGGGTGGAATCTTTTTTAAAGACATTACCAAGGCATTATCATTATTTACTGACAAGCTGTGGTGAGGCTATAAACATTCCAGGAAGTTATATTGAGATAGTTGATTTTATTGATTTTAAAACCATAGATAAAGAGATTTATTTCGCTATTATACACGGTGGGCAAGGAACAGTTTATGCGATGGCTGCACAAGGTATTCCCTTTATAGGTATCCCTTTCTTTAACGAACAATTTTGGAATATTAAGAAGTTCAGTAAAGAAAAGTGCGCTTATTTGGTAAAGAAACCTGATGTAAGAGAGATACGTAAAGCAATTAGCTGTCTTGAAAGAGACTATGATATCTATAAAAGTTATATGATAAGACTAAGCCAAGGAATTAAAGAAGAAGCAGAGGCATCTTTACAAAAAGCGGAGGCAGAAATTGAATCCTTTATCAGAAAAAGACAAAGTTAACTATATTATGATTTATAAAAATAGGCAGTCTACATTGGAGAATAATTTATCTGGCGATCGGTTGATGAGATATCAACAAGCAAATAGACAGGTAAGCAAAGATAAACTGTTAACAGGGAGTTATTTTGTGTACCAATGCTTAAAAAAGTTAGGTTTTACCAATAAGATTTGTCAGGAATCTTTTTCTAGTGTTAGTAGTTATTTAATTGGTTTGCCAAAGGGGAAAATTAGTTACTCTAATTCTGGTGACTATCATATTCTAACCTATGCTCCCAGTGGTTCAACTGGGGTTGATATTGAGAAATACAAAGATAGATCAGAACAAACCTACCAAAACTACCTAGGAGAATCAGTTAGTAGTGATATGGATTCTAAATTATTATTTTATAAGGCATGGTTACAAAAAGAAATTTCCTATAAATGTGGGAAATCTATAGATATTACCTATCAAACAATGATAGATGGCTATATTTATGGTTATGCTTTTGATAATACTTTTAAAGTAGAAGCGGTTTACTTAAAAGAATTATTACCAGATAACTAACTCGCAACATGTTGTTCCTACATATGCATCTATAAAAAGCACTTTGAAGTATTTCAAGGGCTTTTTATAATACCTTGGGTAGTCTTTAACAATTATGGTTAGAGTTGATATGATAAACTGATCATTT

Claims (10)

1.一种不溶血无乳链球菌WC1535△cyl，其特征在于，所述无乳链球菌WC1535△cyl为不溶血的鱼源无乳链球菌弱毒株，于2017年7月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:60210，外文名称为Streptococcus agalactiae。
2.如权利要求1所述不溶血无乳链球菌WC1535△cyl的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)先将重组质粒pSET4s-cylCm经过电转化至鱼源无乳链球菌WC1535株感受态细胞，再涂布于含有氯霉素的BHI平板，最后置于28±2℃倒置培养30～40h；
(2)挑取培养所得单克隆菌落至含有氯霉素的BHI液体培养基中，28±2℃培养至对数生长期，然后稀释10000倍后涂布于无抗性的BHI平板上，于37℃倒置培养；PCR检测和测序验证的阳性克隆，即得到所述无乳链球菌WC1535△cyl；
所述重组质粒pSET4s-cylCm由pSET4S质粒和cyl-up-Cm-cyl-down基因片段的无缝克隆得到；
构建所述cyl-up-Cm-cyl-down基因片段全长的PCR扩增体系为：
2×PCR Master Mix 25μL、pSET4s-cylF 1μL、pSET4s-cylR 1μL、cyl-up基因片段1μL、cyl-down基因片段1μL、cyl-Cm基因片段2μL，加H2O至50μL；其中，
pSET4s-cylF:
5′-ACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCC-3′
pSET4s-cylR:
5′-AGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3′；
构建所述cyl-Cm基因片段的扩增体系为：
2×PCR Master Mix 25μL、cyl-CmF 1μL、cyl-CmR 1μL、pSET5S质粒1μL、最后加H2O至50μL；
所述cyl-CmF和cyl-CmR是根据pSET5S质粒中氯霉素基因序列设计而得，其中，
cyl-CmF:
5′-ATTTTGAGTAGGTGTGAACAATGTAATTCGATGGGTTCCGAGG-3′
cyl-CmR:
5′-CTGATTTTCTCATAAAATGTGGCACCGAACTAGAGCTTGATG-3′；
构建所述cyl-up基因片段的扩增体系为：
2×PCR Master Mix 25μL、cyl-upF 1μL、cyl-upR 1μL、无乳链球菌WC1535株的基因组DNA 1μL、最后加H2O至50μL；其中，
cyl-upF:
5′-GCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTCTTTGCTAAGTATCCTGTCGC-3′
cyl-upR:
5′-GAGCCTCGGAACCCATCGAATTACATTGTTCACACCTACTCAAAAT-3′；
构建所述cyl-down基因片段的扩增体系为：
2×PCR Master Mix 25μL、cyl-downF 1μL、cyl-downR 1μL、无乳链球菌WC1535株的基因组DNA 1μL、最后加H2O至50μL；其中，
cyl-downF:
5′-CATCAAGCTCTAGTTCGGTGCCACATTTTATGAGAAAATCAG-3′
cyl-downR:
5′-GTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAACAGTTTCACTTTTGACAAC-3′。
3.如权利要求2所述不溶血无乳链球菌WC1535△cyl的构建方法，其特征在于，所述鱼源无乳链球菌WC1535感受态细胞的制备方法，步骤如下：
(1)鱼源无乳链球菌WC1535复苏于BHI培养基中，30℃培养过夜；
(2)取过夜培养得到的菌液加入到新鲜的BHI液体培养基中，30℃摇床扩大培养5～6h，OD600＝0.6时，收集菌体；
(3)经扩大培养的菌液在5000r/min离心10min，去除上清液；
(4)所得菌体使用体积百分含量为10％～15％的甘油轻轻悬浮，离心去上清；得到所述鱼源无乳链球菌WC1535感受态细胞。
4.如权利要求2所述不溶血无乳链球菌WC1535△cyl的构建方法，其特征在于，所述重组质粒pSET4s-cylCm的获得方法如下：
(1)取双酶切后的pSET4S质粒与cyl-up-Cm-cyl-down基因片段，然后加入Seamlesscloning kit连接体系，混匀后50±2℃处理25～35min，得到连接液；所述Seamlesscloning kit连接体系与cyl-up-Cm-cyl-down基因片段和双酶切后的pSET4S质粒三者之间的体积比为1：3：6；
(2)取步骤(1)中所得连接液，加入10倍连接液体积的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰上孵育25～35min后，42±2℃热激90s，冰上孵育2～3min，然后37℃复苏25～35min，涂布于含有氯霉素的LB平板上；PCR筛选阳性克隆，阳性PCR产物进行测序验证，得到所述的重组质粒命名为pSET4s-cylCm。
5.如权利要求4所述不溶血无乳链球菌WC1535△cyl的构建方法，其特征在于，
所述双酶切后的pSET4S质粒的构建：
提取pSET4S质粒，经过HindIII和EcoRI双酶切，37±2℃酶切2～5h，最后用0.8％琼脂糖凝胶回收产物，得到所述双酶切后的pSET4S质粒；其中所述酶切体系为：pSET4S 1μg、HindIII 1U、EcoRI 1U、10×Buffer 3μL、补ddH2O至30μL。
6.如权利要求2所述不溶血无乳链球菌WC1535△cyl的构建方法，其特征在于，所述cyl-up-Cm-cyl-down基因片段全长的PCR扩增程序为：
a.94℃下反应4min，循环1次
b.94℃下反应30s，循环30次
c.57℃下反应30s，循环30次
d.72℃下反应3min，循环30次
e.72℃下反应10min，循环1次
f.4℃下反应停止，循环1次
最后用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，并回收纯化cyl-up-Cm-cyl-down基因片段。
7.如权利要求2所述不溶血无乳链球菌WC1535△cyl的构建方法，其特征在于，所述cyl-Cm基因片段的扩增程序为：
a.94℃下反应4min，循环1次
b.94℃下反应30s，循环30次
c.58℃下反应30s，循环30次
d.72℃下反应70s，循环30次
e.72℃下反应10min，循环1次
f.4℃下反应停止，循环1次
最后用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，并回收纯化cyl-Cm基因片段。
8.如权利要求2所述不溶血无乳链球菌WC1535△cyl的构建方法，其特征在于，所述cyl-up基因片段的扩增程序为：
a.94℃下反应5min，循环1次
b.94℃下反应30s，循环10次
c.63℃下反应45s，循环10次，每次循环1次，降低1℃
d.72℃下反应1min，循环10次
e.94℃下反应30s，循环25次
f.57℃下反应45s，循环25次
g.72℃下反应1min，循环25次
h.72℃下反应10min，循环1次
i.4℃下反应停止，循环1次
最后用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，并回收纯化cyl-up基因片段。
9.如权利要求2所述不溶血无乳链球菌WC1535△cyl的构建方法，其特征在于，所述cyl-down基因片段的扩增程序为：
a.94℃下反应5min，循环1次
b.94℃下反应30s，循环10次
c.63℃下反应45s，循环10次，每次循环1次，降低1℃
d.72℃下反应1min，循环10次
e.94℃下反应30s，循环25次
f.57℃下反应45s，循环25次
g.72℃下反应1min，循环25次
h.72℃下反应10min，循环1次
i.4℃下反应停止，循环1次
最后用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，并回收纯化cyl-down基因片段。
10.如权利要求1所述的不溶血无乳链球菌WC1535△cyl的应用，其特征在于，将所述无乳链球菌WC1535△cyl用于制备防控鱼链球菌病的药物。
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