NO322135B1 - Termostabilt DNA polymerase-enzym, nukleinsyresekvens som koder for enzymet, vektor og vertscelle som omfatter nukleinsyresekvensen, fremgangsmate for fremstilling av, og anvendelse av termostabilt DNA-polymerase-enzym, samt blanding, fremgangsmate og testsett hvor enzymet inngar. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører termostabilt DNA polymerase-enzym, nukleinsyresekvens som koder for enzymet, vektor og vertscelle som omfatter nukleinsyresekvensen, fremgangsmåte for fremstilling av, og anvendelse av termostabilt DNA-polymerase-enzym, samt blanding, fremgangsmåte og testsett hvor enzymet inngår.

DNA polymerasene ifølge oppfinnelsen har forbedret evne ti! inkorporering av ribonukleosid-trifosfater. Oppfinnelsen tilveiebringer fremgangsmåter og anordninger for isolering av slike polymerasen Enzymene ifølge oppfinnelsen er egnet for mange anvendelser og spesielt for nukleinsyresekvensering. Oppfinnelsen tilveiebringer således også forbedrede metoder for sekvensanaiyse av nukleinsyrer.

DNA-sekvensering innebærer i alminnelighet utvikling av fire populasjoner av enkeltkjedede DNA-fragmenter som har en fastlagt terminal og en variabel terminal. Den variable terminal avsluttes i alminnelighet ved bestemte nukleotidbaser (enten guanin (G), adenin (A), tymidin (T) eller cytosin (C)). De fire ulike fragmentsett separeres på grunnlag av deres lengde. I en slik prosedyre benyttes en høy-oppløsende polyakrylamidgel. Hvert bånd på en slik gel tilsvarer et bestemt nukleotid i DNA-sekvensen og angir således posisjonene i sekvensen.

En hyppig anvendt DNA-sekvenseringsmetode er dideoksymetoden eller kjede-termineringssekvenseringsmetoden, som innebærer enzymatisk syntese av en DNA-kjede (Sanger et al., 1977, Proe. Nati. Acad Sei. 74:5463/ Det foretas i alminnelighet fire separate synteser, hvorunder hver reaksjon bringes til avslutning ved en bestemt base (G, A, T eller C) gjennom inkorporering av et passende kjede-terminerende nukleotid, så som et dideoksynukleotid. Reaksjonsproduktene er lette å tolke siden hver bane bare tilsvarer enten G, A, T eller C.

I dideoksy-kjedetermineringsmetoden hybridiseres en kort enkeltkjedet primer

til et enkeltkjedet templat. Primeren forlenges i 3'-enden ved inkorporering av deoksynukleotider (dNTPs) inntil det inkorporeres et dideoksynukleotid (ddNTP). Når et ddNTP inkorporeres opphører forlengelsen ved denne basen. For å sikre pålitelig DNA-replikasjon har imidlertid DNA-polymerase en sterk tilbøyelighet til inkorporering

av deres normale substrater, dvs. dNTPs, og mot å inkorporere nukleotidanaloger, omtalt her som ukonvensjonelle nukleotider. Når det gjelder DNA-syntese ansees

ribonukleotider (rNTP) som ukonvensjonelle nukleotider, fordi rNTP i likhet med ddNTPs ikke er det normale in vivo substrat for en DNA polymerase. I cellen svekker

denne egenskap inkorporering av unormale baser, så som deoksy-inosintrifosfat (dITP) eller rNTP i en voksende DNA-kjede.

To hyppig anvendte automatiserte sekvenseringsmetodikker er farvestoff-primer og farvestoff-terminatorsekvensering. Disse metodene er egnet for bruk med fluorescensmerkede deler. Selv om sekvensering også kan foretas ved å benytte radioaktivt merkede deler, foretrekkes fluorescensbasert sekvensering i økende grad. I korthet benyttes ved farvestoff-primersekvensering en fluorescensmerket primer i kombinasjon med umerkede ddNTPs. Fremgangsmåten fordrer fire syntesereaksjoner og opptil fire baner på en gel for hvert templat som skal sekvenseres (en for hver av de base-spesifikke termineringsproduktene). Etter primerekstensjon analyseres sekvenseringsreaksjonsblandingen som inneholder dideoksynukleotid-inkorporerte termineringsprodukter, rutinemessig ved elektroforese på en DNA-sekvenseringsgel. Etter separasjon ved elektroforese eksiteres de fluorescensmerkede produktene med en laser i bunnen av gelen og fluorescensen påvises med en passende monitor. I automatiserte systemer sveiper en detektor over bunnen av gelen under elektroforese for å påvise hvilken merket del som har vært benyttet, etterhvert som reaksjonsblandingen passerer gjennom gelmatriksen (Smith et al. 1986, Nature 321:674-679). I en modifikasjon av denne metode er hver av fire primere merket med ulike fluorescensmarkører. Etter at de fire separate sekvenseringsreaksjonene er fullført, kombineres reaksjons-blandingene, hvorpå de kombinerte reaksjonsblandingene underkastes gelanalyse på en enkelt bane, hvorved de ulike fluorescensmerkingene (en for hver av de fire ulike basespesifikke termineringsproduktene) påvises individuelt.

Alternativt benyttes farvestoff-terminatorsekvenseringsmetoden. For denne metode benyttes en DNA polymerase for å inkorporere dNTPs og fluorescensmerkede ddNTPs på den voksende ende av DNA-primer (Lee era/. 1992, Nucleic Acid Research 20:2471). Denne prosess har den fordel at farvestoffmerkede primere ikke trenger å syntetiseres. Dessuten er farvestoff-terminatorreaksjoner mer lettvinte ved at alle fire reaksjonene kan foretas i samme rør. S. Tabor et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, vol. 92,1995, s. 6339-6343 beskriver en bakteriofag T7 DNA polymerase som effektivt inkorporerer et kjedeterminerende dideoksynukleotid inn i DNA. Modifiserte termostabile DNA polymeraser som har redusert evne til å skjelne mellom ddNTPs har vært beskrevet (se europeisk patentsøknad, publikasjonsnr. EP-A-655.506 og US-patentsøknad serienr. 08/448.223). Et eksempel på modifisert termostabil DNA polymerase er den muterte form av DNA polymerasen fra T. aquaticus som i posisjon 667 har en tyrosinrest (i stedet for en fenylalaninrest), dvs. en såkalt F667Y-mutert form av Taq DNA polymerase, AmpliTaq® FS, fremstillet av Hoffmann-La Roche og markedsført gjennom Perkin Eimer, som reduserer den ddNTP-mengde som fordres for effektiv nukleinsyresekvensering av et mål hundre til tusen ganger. AmpliTaq® FS er en mutert form av DNA polymerasen fra T. aquaticus som har F667Y-mutasjonen og dessuten en asparaginsyrerest i posisjon 46 (i stedet for en glycinrest; G46D-mutasjon). Problemet som løses ved den foreliggende oppfinnelse er tilveiebringelse av ytteligere termostabile DNA polymerase-enzymer som utviser redusert diskriminering mot inkorporering av ukonvensjonelle nukleotider.

Det er behov for termostabile DNA polymeraser som muliggjør alternative nukleinsyresyntesemetoder for nøyaktig og kostnadseffektiv nukleinsyre DNA-sekvensanalyse. Fluorescensbaserte metoder som ikke fordrer bruk av dideoksynukleotider ville være ønskelig. Foreliggende oppfinnelse retter seg mot disse behov.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer templat-avhengige termostabile, DNA polymerase-enzymer som omfatter aminosyresekvensen Ser Gin Ile Xaa Leu Arg Xaa (SEKV. ID. NR:1), hvor «Xaa» i posisjon 4 av denne sekvens er en hvilken som helst aminosyrerest, men ikke en glutaminsyrerest (Glu) og hvor «Xaa» i posisjon 7 av denne sekvens er en valinrest (Val) eller en isoleucinrest (Ile) som utviser redusert diskriminering mot inkorporering av et ukonvensjonelt nukleotid sammenlignet med en naturlig forekommende termostabil DNA-polymerase, hvor nevnte reduserte diskriminering er evnen til nevnte polymerase til å inkorporere et ukonvensjonelt nukleotid, relativt til evnen til nevnte korresponderende native form av polymerase til å inkorporere nevnte ukonvensjonelle nukleotid, er øket minst 20 ganger. Angitt med enkeltbokstavskode for aminosyrer kan dette sekvensmotiv gjengis som S QIX L R V/l, hvor «X» i posisjon 4 av denne sekvens, er en hvilken som helst aminosyrerest utenom en glutaminsyrerest. Termostabile DNA polymerase-enzymer som har en aminosyresekvens som omfatter det nevnte sekvensmotiv, hvor «X» i posisjon 4 av dette sekvensmotiv ikke er en glutaminsyrerest, har redusert diskriminering mot inkorporering av ribonukleotider sammenlignet med tidligere kjente termostabile polymeraser. I en voksende DNA-kjede er ribonukleotider ukonvensjonelle nukleotider. I henhold til et første aspekt inkorporerer de nye enzymene ifølge oppfinnelsen, ukonvensjonelle baseanaloger, så som ribonukleotider, i en voksende DNA-kjede, flere størrelsesordner mer effektivt enn tidligere påviste termostabile DNA-syntetiserende enzymer. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også nukleinsyresekvenser som koder for enzymene ifølge oppfinnelsen, så vel som rekombinante ekspresjonsvektorer og vertsceller som omfatter slike vektorer. Med slike transformerte vertsceller kan det frembringes store mengder rensede termostabile polymeraseenzymer. Et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse er således en fremgangsmåte for fremstilling av et termostabilt DNA polymerase-enzym, kjennetegnet ved at den omfatter: . (a) dyrkning av en vertscelle ifølge krav 10, under betingelser som fremmer ekspresjon av det termostabile DNA polymerase-enzym; og (b) isolering av det termostabile DNA polymerase-enzym fra vertscellen eller fra kulturmediet.

Ved hjelp av foreliggende oppfinnelse identifiseres en region eller et sekvensmotiv innen aminosyresekvensen av termostabile DNA polymeraser, som øker effektiviteten av polymerasens evne til å inkorporere ribonukleotider samtidig som evnen til pålitelig å inkorporere deoksyribonukieotider bibeholdes. Endringer i denne region, f.eks. utskiftning av én eller flere aminosyrer (f.eks. innført ved stedsspesifikk mutagenese) fører til et termostabilt polymeraseenzym som er i stand til å syntetisere en RNA elter RNA/DNA kimær eller hybridkjede på et DNA-templat.

I henhold til et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen anvendelse av et termostabilt DNA polymerase-enzym ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, i en nukleinsyre-amplifikasjon eller sekvenseringsreaksjon. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for sekvensering av et nukleinsyre-mål kjennetegnet ved at den omfatter trinnene: (a) frembringelse av et ukonvensjonelt nukleotid og et tilsvarende konvensjonelt nukleotid i en DNA-sekvenseringsreaksjon, hvor de nevnte ukonvensjonelle og tilsvarende konvensjonelle nukleotider forekommer i et forhold på mindre enn omtrent 1:1; (b) behandling av reaksjonen fra trinn (a) i nærvær av en termostabil DNA polymerase ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, under betingelser for primerekstensjon, for å tilveiebringe primerekstensjonsprodukter som omfatter nevnte ukonvensjonelle nukleotid; (c) behandling av primerekstensjonsproduktene fra trinn (b) under

betingelser for å hydrolysere de nevnte primerekstensjonsproduktene;

(d) spaltning av reaksjonsprodukter fra trinn (c); og

(e) bestemmelse av sekvensen av nukleinsyre-målet. Behovet for kjede-terminerende ddNTPs er eliminert. Ved hjelp av de herved frembragte metoder inkorporeres ribonukleotider (rNTPs) i primer-ekstensjonsprodukter. Siden de angjeldende enzymer nøyaktig og effektivt inkorporerer både rNTPs eller dNTPs, kan sekvenseringsreaksjoner utnytte blandinger av begge nukleotider. Etter primerekstensjon kan nylig syntetiserte oligonukleotidprodukter spaltes ved den inkorporerte rNTP etter kjente fremgangsmåter, f.eks. ved hydrolyse, hvorved det oppnås en populasjon av fragmenter som egner seg for fraksjonering og sekvensanalyse på konvensjonell måte, som for eksempel ved gelelektroforese. Disse metodene gjør bruk av de nye termostabile polymeraseenzymer som her tilveiebringes. I henhold til dette aspekt tilveiebringer oppfinnelsen derfor termostabile DNA polymerase-enzymer som kjennetegnes ved at polymerasen omfatter det kritiske motiv SerGlnlleXaaLeuArgXaa (SEKV. ID. NR:1), hvor «Xaa» i posisjon 4 kan være en hvilken som helst aminosyrerest, unntatt en glutaminsyrerest (Glu) og «Xaa» i posisjon 7 er en valinrest (Val) eller en isoleucinrest (Ile) som utviser redusert diskriminering mot inkorporering av et ukonvensjonelt nukleotid sammenlignet med en naturlig forekommende termostabil DNA-polymerase, hvor nevnte reduserte diskriminering er evnen til nevnte polymerase til å inkorporere et ukonvensjonelt nukleotid, relativt til evnen til nevnte korresponderende native form av polymerase til å inkorporere nevnte ukonvensjonelle nukleotid, er øket minst 20 ganger.

I henhold til et annet aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringer de her beskrevne modifiserte polymeraser hjelpemidler for inkorporering av ribonukleotider eller analoger som inneholder en hydroksylgruppe, eller en annen substituent i 2'-stillingen som til forskjell fra konvensjonelle deoksyribonukleotider, mangler. Disse nukleotidene kan merkes på forskjellig måte, og således gi alternativer til den konvensjonelle bruk av dideoksynukleotider for anvendelse ved DNA-sekvensering.

De mutante termostabile polymeraseenzymene ifølge oppfinnelsen kjennetegnes ved evnen til mer effektivt å inkorporere ukonvensjonelle nukleotider, særlig ribonukleotider, enn de tilsvarende villtype-enzymene. I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen kan det ukonvensjonelle nukleotid som skal inkorporeres være en kjede-terminerende baseanalog, så som 2'-hydroksy-3'-deoksy-ATP (cordycepin-trifosfat) en «riboterminator»-analog av ATP eller et ikke-kjede-terminerende nukleotid, så som et rNTP.

I henhold til et aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringes mutante termostabile polymeraseenzymer ifølge oppfinnelsen som kjennetegnes ved evnen til mer effektivt å inkorporere ukonvensjonelle nukleotider, særlig ribonukleotider, enn de tilsvarende vtlltype-enzymer. Ifølge dette aspekt tilveiebringer oppfinnelsen således termostabilt DNA polymerase-enzym som kjennetegnes ved at det er et rekombinant derivat av en naturlig forekommende termostabil DNA polymerase, hvor nevnte naturlig forekommende termostabile DNA polymerase omfatter aminosyresekvensmotivet Ser Gin Ile Glu Leu Arg Xaa (SEKV. ID. NR:2), hvor «Xaa» i posisjon 7 av denne sekvens er en valinrest (Val) eller en isoleucinrest (Ile), hvor nevnte rekombinante derivat har blitt modifisert til å oppnå en aminosyre annen enn glutaminsyre (Glu) i posisjon 4 av nevnte motivsekvens, og hvor nevnte rekombinante derivat utviser redusert diskriminering mot inkorporering av et ukonvensjonelt nukleotid sammenlignet med nevnte naturlig forekommende termostabile DNA-polymerase, hvor nevnte reduserte diskriminering er kjennetegnet av at evnen til nevnte polymerase til å inkorporere et ukonvensjonelt nukleotid, relativt til evnen til nevnte korresponderende native form av polymerase til å inkorporere nevnte ukonvensjonelle nukleotid, er øket minst 20 ganger.

I henhold til et annet aspekt ved oppfinnelsen gir polymerasene ifølge oppfinnelsen en lettvint måte for fragmentering av amplifikasjonsprodukter og primerekstensjonsprodukter, hvor slike fragmenterte produkter kan være nyttige for hybridiseringsbasert metodikk og en rekke strategier for sekvenspåvisning.

Enzymene ifølge foreliggende oppfinnelse kan benyttes til å frembringe blandinger for bruk ved DNA-sekvenseringsreaksjoner som omfatter et nukleinsyre-templat, en oligonukleotid-primer som er komplementær til nevnte templat; en termostabil DNA polymerase ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, en blanding av konvensjonelle dNTPs, og minst ett ukonvensjonelt nukleotid, hvor forholdet mellom nevnte ukonvensjonelle nukleotid og nevnte tilsvarende konvensjonelle nukleotid er 1:1 eller mindre. I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er det ukonvensjonelle nukleotid et ribonukleotid, og ribonukleotidkonsentrasjonen er mindre enn konsentrasjonen av det tilsvarende deoksyribonukleotid, dvs. rNTP:dNTP-forholdet er 1:1 eller mindre. Enzymene ifølge oppfinnelsen egner seg også for markedsføring i form av testsett ifølge krav 20, hvor settet også kan innbefatte en hvilken som helst av følgende ytterligere elementer som er nødvendige for en nukleinsyre-sekvenseringsreaksjon, som f.eks. dNTPs, rNTPs, buffere og/eller primere.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nye og forbedrede modifiserte termostabile DNA polymerase-enzymer, blandinger og analysesett som definert i patentkravene. Enzymene ifølge oppfinnelsen inkorporerer ukonvensjonelle nukleosid-trifosfater mer effektivt enn de tidligere kjente polymeraser eller de tilsvarende villtype-polymeraseenzymer som disse nye polymerasene er avledet fra. DNA-sekvenser som koder for disse modifiserte enzymene, vektorer for å uttrykke de modifiserte enzymer og celler overført med slike vektorer, tilveiebringes også. Enzymene ifølge oppfinnelsen gjør det mulig å ta i bruk nye DNA-sekvenseringsmetoder som har fordeler fremfor tidligere kjente DNA-sekvenseringsprosedyrer.

For å lette forståelsen av oppfinnelsen er en rekke betegnelser definert nedenfor. Betegnelsen «konvensjonell» når det er tale om nukleinsyrebaser, nukleosid-trifosfater eller nukleotider, refererer seg til slike som naturlig forekommer i det polynukleotid som beskrives (dvs. for DNA er disse dATP, dGTP, dCTP og dTTP). I tillegg benyttes ofte c7dGTP og dITP i stedet for dGTP (selv om det inkorporeres med lavere effektivitet) i in vitro DNA-syntesereaksjoner, så som sekvensering. Disse kan kollektivt betegnes deoksyribonukleosid-trifosfater (dNTPs).

Betegnelsen «ekspresjonssystem» refererer seg til DNA-sekvenser som inneholder en ønsket kodende sekvens og kontrollsekvenser som er koblet sammen operativt slik at verter transformert med disse sekvensene er i stand til å produsere de kodede proteiner. For å bevirke transformasjon kan ekspresjonssystemet være inkludert i en vektor, men den relevante DNA kan også være integrert i vertskromosomet.

Betegnelsen «gen» refererer seg til en DNA-sekvens som omfatter kontroll- og kodende sekvenser som er nødvendige for produksjonen av et bioaktivt polypeptid eller en forløper som kan gjenvinnes. Polypeptidet kan kodes av en gensekvens i full lengde eller av en hvilken som helst del av den kodende sekvens så lenge den enzymatiske aktivitet opprettholdes.

Betegnelsen «vertscelle» refererer seg både til enkeltcellede prokaryoter og til eukaryote organismer som bakterier, gjær og actinomycetes og enkeltceller fra planter eller dyr av høyere orden, når de dyrkes i cellekultur.

I denne sammenheng refererer betegnelsen «DNA-sekvenseringsreaksjonsblanding» seg til en reaksjonsblanding som omfatter elementer nødvendige foren DNA-sekvenseringsreaksjon. En DNA-sekvenseringsreaksjonsblanding er således egnet for bruk i en DNA-sekvenseringsmetode for bestemmelse av nukleinsyresekvensen i et mål, selv om reaksjonsblandingen opprinnelig kan være ufullstendig slik at initieringen av sekvenseringsreaksjonen kontrolleres av brukeren. På denne måte kan reaksjonen initieres etter at et avsluttende element, så som enzymet er tilsatt, for derved å oppnå en fullstendig DNA-sekvenseringsreaksjonsblanding. En typisk DNA-sekvenseringsreaksjon vil inneholde en buffer, egnet for polymeriseringsaktivitet, nukleosid-trifosfater og minst ett ukonvensjonelt nukleotid. Reaksjonsblandingen kan også inneholde en primer, egnet til ekstensjon av et mål ved hjelp av et polymeraseenzym, en polymerase og en mål-nukleinsyre. I alminnelighet er enten primeren eller én av nukleotidene merket med en påviselig del, som f.eks. en fluorescerende merking. Generelt er reaksjonsblandingen en blanding som omfatter fire konvensjonelle nukleotider og minst ett ukonvensjonelt nukleotid. I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er polymerasen en termostabil DNA polymerase og det ukonvensjonelle nukleotid et ribonukleotid.

Betegnelsen «oligonukleotid» er her definert som et molekyl som består av to eller flere, fortrinnsvis mer enn tre og vanligvis mer enn ti, deoksyribonukleotider elter ribonukleotider. Den eksakte størrelse av et oligonukleotid vil avhenge av mange faktorer, inklusivt oligonukleotidets endelige funksjon eller anvendelse.

Oligonukleotider kan fremstilles på en hvilken som helst egnet måte, inklusivt for eksempel kloning og restriksjon av passende sekvenser og direkte kjemisk syntese ved en metode som for eksempel fosfotriestermetoden til Narang et al. 1979, Meth. Enzymol. 68:90-99; fosfodiestermetoden til Brown et al. 1979, Meth. Enzymol. 68:109-151; dietylfosforamidittmetoden tit Beaucage er ai 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862; triestermetoden til Matteucci et al. 1981, J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191; automatiserte syntesemetoder; eller metoden på fast bærer ifølge US-patent 4.458.066.

Betegnelsen «primer» refererer seg i denne sammenheng til et naturlig eller syntetisk oligonukleotid som er i stand til å virke som initieringspunkt for syntese når det anbringes under betingelser hvor primer-forlengelse innledes. En primer er fortrinnsvis et enkeltkjedet oligodeoksyribonukleotid. Den riktige primerlengde avhenger av primerens tiltenkte anvendelse, men utgjør i alminnelighet fra 15 til 35 nukleotider. Korte primermolekyler fordrer i alminnelighet lavere temperaturer for å danne tilstrekkelig stabile hybridkomplekser med templatet. En primer behøver ikke reflektere templatets nøyaktige sekvens, men må være tilstrekkelig komplementær til å hybridisere med et templat for primer-forlengelse.

En primer kan eventuelt være merket, ved å inkorporere en merking som kan påvises ved hjelp av spektroskopiske, fotokjemiske, biokjemiske, immunkjemiske eller kjemiske måter. For eksempel kan egnede merkinger innbefatte ^P, fluorescerende farvestoffer, reagenser med høy elektrontetthet, enzymer (som vanligvis benyttet for ELISA-teknikker), biotin eller haptener og proteiner som det finnes antisera eller monoklonale antistoffer for.

Betegnelsen «termostabil polymerase» refererer seg til et enzym som er

stabilt overfor varme, er varmeresistént og beholder tilstrekkelig aktivitet til å bevirke etterfølgende primer-fortengelsesreaksjoner når det utsettes for de høyere temperaturer i det tidsrom som er nødvendig for å bevirke denaturering av de dobbeltkjedede nukleinsyrene. I denne sammenheng er en termostabil polymerase egnet for anvendelse i en temperatur-cykliseringsreaksjon som PCR (polymerase kjedereaksjon). For en termostabil polymerase refererer enzymatisk aktivitet seg til katalysen av kombinasjonen av nukleotidene på riktig måte til å danne primer-ekstensjonsprodukter som er komplementære til en templat-nukleinsyrekjede.

De nødvendige oppvarmingsbetingelser for nukleinsyre-denaturering vil avhenge, f.eks. av buffersaltkonsentrasjonen og sammensetningen og léngden av de nukleinsyrer som denatureres, men vil i alminnelighet variere fra ca. 90°C til ca. 105°C, fortrinnsvis 90°C til 100°C, i et tidsrom som hovedsakelig avhenger av temperaturen og nukleinsyrelengden, typisk fra noen få sekunder opp til 4 minutter.

Betegnelsen «ukonvensjonell» eller «modifisert» når det refereres til en nukleinsyrebase, et nukleosid-trifosfat eller nukleotid, inkluderer modifisering, derivatiseringer eller analoger av konvensjonelle baser eller nukleotider som naturlig forekommer i DNA. I denne sammenheng modifiseres ukonvensjonelle nukleotider i 2'-stillingen av ribosesukkeret i motsetning til konvensjonelle dNTPs. Selv om de naturlig forekommende nukleotider i RNA er ribonukleotider (dvs. ATP, GTP, CTP, UTP, kollektivt betegnet rNTPs) er ribonukleotider siden disse har en hydroksylgruppe i sukkerets 2'-stilling som mangler i dNTPs, ukonvensjonelle nukleotider. Ribonukleotidanaloger som inneholder substituenter i 2'-stillingen, så som 2<*->f1uor- eller 2'-amino-substituerte analoger, faller inn under oppfinnelsen. Dessuten kan ribonukleotidanaloger modifiseres i 3'-stillingen, for eksempel ved erstatning av den normale hydroksylgruppe med en hydrogengruppe (3'-deoksy), hvilket fører til en ribonukleotidanalog-terminator. Slike nukleotider faller også inn under begrepet «ukonvensjonelle nukleotider».

Siden DNA konvensjonelt er sammensatt av dNTPs, vil inkorporering av en rNTP være ukonvensjonell og en rNTP således en ukonvensjonell base. I henhold til en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen inneholder nukleinsyreprodukter for DNA primer-forlengelsesmetoder, inklusivt DNA-sekvenseringsmetoder, både konvensjonelle og ukonvensjonelle nukleotider, hvor konvensjonelle nukleotider, som dNTPs, dominerer.

Konvensjonelle baser kan være fluorescensmerket med for eksempel fluorescein eller rhodamin; ikke-fluorescensmerket med for eksempel biotin; isotopisk merket med for eksempel 32P, MP eller <35>S; eller være umerket.

For ytterligere å lette forståelsen av oppfinnelsen, er det gjennom hele beskrivelsen referert til spesifikke termostabile DNA polymerase-enzymer for eksemplifisering av oppfinnelsen. Disse referansene er imidlertid ikke ment å begrense oppfinnelsens ramme. I henhold til en foretrukket utførelsesform benyttes de termostabile enzymene ifølge oppfinnelsen i en rekke nukleinsyre-sekvenseringsmetoder, selv om de nye termostabile polymerasene som her er beskrevet, kan benyttes for et hvilket som helst formål hvor slik enzymaktivitet er nødvendig eller ønsket. Enzymet kan også benyttes i amplifikasjonsreaksjoner, så som PCR.

De termostabile polymerasene ifølge oppfinnelsen kjennetegnes ved at de inneholder det kritiske motiv SerGlnlleXaaLeuArgXaa (SEKV. ID. NR:1), hvor «Xaa»

i posisjon 4 av denne sekvens er en hvilken som helst aminosyrerest bortsett fra en glutaminsyrerest (Glu) og «Xaa» i posisjon 7 av denne sekvens er en valinrest (Val) eller en isoleucinrest (Ile). Gener som koder for termostabile polymeraser som har en glutaminsyrerest i posisjon 4 av det nevnte motiv, kan modifiseres som. her beskrevet for å oppnå passende modifiserte polymeraseenzymer. De modifiserte termostabile polymeraseenzymene kjennetegnes ved at de i forhold til de tilsvarende native eller

villtype enzymer, har en modifikasjon i aminosyresekvensmotivet SerGlnlleGluLeuArgXaa (SEKV. ID. NR:2), hvor «Xaa» i posisjon 7 av denne sekvens er en valinrest (Val) eller en isoleucinrest (Ile), dvs. nevnte motiv er modifisert ved en erstatning av glutaminsyreresten i posisjon 4 med en annen aminosyrerest. Det kritiske motiv for en termostabil DNA polymerase ifølge foreliggende oppfinnelse er vist nedenfor ved å benytte den konvensjonelle enkeltbokstavs aminosyrekode (Lehninger, Biochemistry, New York, New York, Worth Publishers Inc., 1970, side 67).

SEKV ID NR: 1 SerGlnlleXaaLeuArgXaa,

hvor «Xaa» i posisjon 4 er en hvilken som helst aminosyrerest, men ikke en glutaminsyrerest (Glu) og «Xaa» i posisjon 7 er en valinrest (Val) eller isoleucinrest (Ile).

Både gensekvenser som koder for og proteiner som inneholder, denne kritiske aminosyresekvens, hvor Xaa i posisjon 4 ikke er en glutaminsyrerest (Glu), fører til en polymerase som har nedsatt diskriminering mot rNTPs og som faller inn under rammen for oppfinnelsen. Innenfor det kritiske motiv kan det gjøres ytterligere modifikasjoner med hensyn til andre aminosyrerester, fortrinnsvis med hensyn til en aminosyrerest valgt fra gruppen av glutamin (Gin eller Q), leucin (Leu eller L) eller arginin (Arg eller R).

Foreliggende oppfinnelse egner seg for fremstilling av termostabile DNA polymeraseenzymer med fordelaktige egenskaper ved bestemt modifisering av den gensekvens som koder for en termostabil DNA polymerase. I henhold til en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen tas gensekvensen og det kodede enzym fra en art av slekten Thermus, selv om ikke-The/mi/s eubacteria også faller inn under rammen for oppfinnelsen slik den er beskrevet nedenfor. I betraktning av den sterkt konserverte natur av det nå identifiserte kritiske motiv, kan nye termostabile DNA polymeraser identifiseres ut fra deres homologi med for eksempel Taq-polymerase. Slike termostabile polymeraser faller inn under oppfinnelsen så lenge som. deres aminosyresekvens omfatter S Q IX L R V/l-motivet, hvor X er en hvilken som helst aminosyrerest utenom glutaminsyreresten og hvor aminosyresekvensen oppviser minst ca. 39%, fortrinnsvis minst ca. 60%, mer foretrukket minst 80%, total homologi

(sekvensidentitet) sammenlignet med aminosyresekvensen av den native Taq-polymerase. Den fulle lengde av sekvensen av nevnte Taq-polymerase finnes i

WO 89/06691 og er tilgjengelig under tilgangsnummer P90556 i GENESEQ patentsekvensdatabanken eller under tilgangsnummer M26480 i EMBL-sekvensdatabanken og under tilgangsnummer A33530 i PIR-sekvensdatabanken.

Eksempler på termostabile DNA polymeraser ifølge foreliggende oppfinnelse er rekombinant-derivater av de native polymeraser fra organismer angitt i Tabell 1 nedenfor. Tabell 1 angir den bestemte sekvens av det kritiske motiv og posisjonen av «X-resten» for hver av disse native polymerasene. Siden hver termostabile DNA polymerase er unik, er aminosyreposisjonén av det kritiské motiv forskjellig for hvert enzym. For de nedenfor angitte polymeraser står aminosyrerestene i «X»-posisjon av det kritiske S QIX L R V/l-motiv for glutaminsyre. Foretrukne polymeraser ifølge foreliggende oppfinnelse har en molekylvekt i området 85.000 og 105.000, mer foretrukket mellom 90.000 og 95.000. Aminosyresekvensen av disse polymerasene består av ca. 750 til 950 aminosyrerester, fortrinnsvis mellom 800 og 850 aminosyrerester. Polymerasene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også bestå av ca. 540 eller flere aminosyrer og i det minste omfatte polymerase-domenet og en del som tilsvarer 3* til 5'-eksonuklease-domenet (den resulterende polymerase kan ha 3' til 5' eksonukleaseaktivitet eller ikke) og eventuelle deler av 5' til 3' eksonuklease-domenet, som inngår i den første tredjedel av aminosyresekvensen av mange full-lengde termostabile polymeraseenzymer.

For termostabile DNA polymeraser som ikke er vist i Tabell 1, er påvisning av den riktige glutaminsyre for modifisering enkel så snart det kritiske motiv eller konsensusmotivet i aminosyresekvensen er identifisert.

Uansett den nøyaktige posisjon innen en termostabil DNA polymerase tjener erstatningen av glutaminsyre (Glu-resten) med en annen aminosyrerest innen sekvensmotivet Ser Gin Ile Glu Leu Arg Xaa (SEKV. ID. NR:2) hvor «Xaa» i posisjon 7 av denne sekvens er en valinrest (Val) eller en isoleucinrest (Ile) av polymerase-domenet, til å tilveiebringe termostabile polymeraser som har evne til effektivt å inkorporere ukonvensjonelle nukleotider. I en foretrukket utførelsesform erstattes gtutaminsyren med én aminosyre som har en uladet polar R-gruppe, så som glycin, serin, cystein, treonin, eller med en aminosyre som har en liten upolar R-gruppe, som f.eks. alanin. I en særlig foretrukket utførelsesform er glutaminsyrerestene erstattet med en glycinrest (G). Programmer for tilpasningsforskyvning av aminosyrer og nukleinsyresekvenser er tilgjengelige fra the Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin. Ut fra det særlige motiv som her er identifisert

tjener disse programmene, inklusivt for eksempel «GAP», «BESTFIT» og «PILEUP»

til å bidra til identifiseringen av den eksakte sekvensregion som skal modifiseres.

Som det tydelig fremgår fra Tabell 1 nedenfor, er det i det vesentlige to former av det konserverte sekvensmotiv Ser Gin Ile Glu Leu Arg Xaa (SEKV. ID. NR:2) innen polymerase-domenet av termostabile DNA polymeraseenzymer fra termofile organismer. Sekvensmotivet Ser Gin Ile Glu Leu Arg Val (SEKV. ID. NR:3) forekommer i de native termostabile polymeraser fra Thermus- atXer som Thermus aquaticus, Thermus caldophitus, Thermus thermophiius, Thermus flavus og f ra Thermus filifonriis så vel som fra Thermus- axtene spsl 7 og Z05. Sekvensmotivet Ser Gin Ile Glu Leu Arg Val (SEKV. ID. NR:3) forekommer også i polymerase-domenet til andre termostabile DNA polymeraseenzymer, f.eks. fra Thermosipho africanus og fra forskjellige Bacillus- sXammer, så som Bacillus caldotenax og Baciiius stearothermophilus. Sekvensmotivet Ser Gin Ile Glu Leu Arg Ile (SEKV. ID. NR:4) forekommer i de native termostabile polymerasene fra Thermotoga maritima, Thermotoga neapoiitanaog Anaerocellum thermophilum.

Den fulle aminosyresekvens for hver av Taq, Tth, Z05, spsl 7, Tma og Taf

polymeraser har vært publisert i US-patent 5.466.591 og inkorporeres herved som referanse. Sekvensene for DNA polymerasen fra Tea, Tfl, Tne, Ath, Bca og Bst har vært publisert som følger: Tea i EMBL-sekvensdatabanken under tilgangsnummer U62584 (se også Kwon, 1997, Mol. Cells 7(2):264-271); Tfl i Akhmetzjanov & Vakhitov, 1992, Nucleic Acids Research 20(21 ):5839; Tne i WO 97/09451 og WO 96/41014; Ath i EMBL-sekvens-databanken under tilgangsnummer X98575 (angående detaljer for Ath-stammen, se Rainey et al., 1993, J. Bacteriol. 175(15):4772-2779; Bst i Uemori et al., 1993, J. Biochem. 113:401 -410 og under EMBL sekvensdatabanken tilgangsnummer U23149 (se også Phang et al,. 1995, Gene 163:65-68). Bst-polymerase aminosyresekvenser som omfatter en E i det kritiske motiv i posisjon 658 tilveiebringes også i japansk patentpublikasjon

JP 05/304964A, europeisk patentpublikasjon nr. EP-A-699.760 og Aliotta et al.,

1996, Genet. Anal. 12:185-195; sekvensen er også tilgjengelig fra EMBL sekvensdatabanken under tilgangsnummer U33536. Sekvensen som publisert i Gene 163:65-68 (1995), inneholder «E» av det kritiske motiv i rest nummer 661. Bca

i Uemori et al., 1993, J. Biochem. 113:401-410 og under EMBL sekvensdatabank tilgangsnummer D12982. Den termostabile DNA polymerase fra Thermus filiformis (se FEMS Microbiol. Lett. 22:149-153,1994; som også er tilgjengelig fra ATCC deponeringsnummer 43280) kan gjenvinnes ved å benytte fremgangsmåtene angitt i US-patent 4.889.818 så vél som på grunnlag av sekvensinformasjonen gitt i Tabell 1. Hver enkelt av de ovenfor angitte sekvenser og publikasjoner inkorporeres herved med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse. Sekvenshomologien.

(sekvensidentitetén) mellom aminosyresekvensen av den native form av Taq-polymerase, som angitt i WO 89/06691 og Tf l-polymerasen nevnt ovenfor, er 87,4%. De tilsvarende homologier med hensyn til Tth-polymerasen er 87,4%, med hensyn til Tca-polymerasen 86,6%, med hensyn til Bst-potymerasen (tilgangsnummer U23149) er 42,0%, med hensyn til Bca-polymerasen 42,6% og med hensyn til Ath-polymerasen 39,7%.

Som Tabell I viser, er det kritiske motiv bemerkelsesverdig konservert blant de termostabile DNA polymerasene. Når «X» er en glutaminsyrerest, fører endring av genet som koder for polymerasen til enzymet ifølge oppfinnelsen som lett inkorporerer rNTPs sammenlignet med for eksempel Taq-polymerase, hvor det kritiske motiv ikke er modifisert..Oppfinnelsen vedrører følgelig en klasse av enzymer som også inkluderer for eksempel den termostabile DNA polymerase og tilsvarende gen- og ekspresjons-vektorerfra Thermus oshimai(Williams era/., 1996, Int. J. Syst. Bacteriol. 46(2):403-408); Thermus silvanus og Thermus chliarophilus (Tenreiro et

al., 1995, Int. J. Syst. Bacteriol. 45(4}:633-639); Thermus scotoductus (Tenreiro et al., 1995, Res. Microbiol 146(4):315-324); Thermus brockianus (Munster, 1986, Gen. Microbiol. 132:1677) og Thermus ruber, Loginov et al., 1984, Int. J. Syst. Bacteriol. 34:498-499; også tilgjengelig fra ATCC deponerings-nummer 35948.1 tillegg innbefatter oppfinnelsen for eksempel de modifiserte former av de termostabile DNA polymerasene og tilsvarende gen- og ekspresjons-vektorer fra Thermotoga elfii (Ravot et al., 1995, Int. J. Syst. Bacteriol. 45:312; som også er tilgjengelig fra DSM deponeringsnummer 9442) og Thermotoga thermarum (Windberger et al., 1992, Int.

j. Syst. Bacteriol. 42:327; som også er tilgjengelig fra DSM deponeringsnummer

5069). Hver av ovennevnte sekvenser og publikasjoner inkorporeres herved med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse.

I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen finnes det kritiske motiv som skal modifiseres innen aminosyresekvensen Leu Asp Tyr Ser Gin ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser (SEKV. ID. NR:5). Ett aspekt åv oppfinnelsen involverer således utviklingen av termostabile DNA polymerase-mutanter som oppviser betydelig øket effektivitet for inkorporering av ukonvensjonelle nukleotider på en templat-avhengig måte. I en særlig foretrukket utførelsesform omfatter polymerasesekvensen Leu Asp Tyr Ser Gin Ile Gly Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser (SEKV. ID. NR:6). Slike termostabile DNA polymeraser er særlig egnet i prosesser som DNA-sekvensering, DNA-styrt RNA-syntese og in vitro syntese av rNTP-substituert DNA. Produksjonen av termostabile DNA polymeraser med mer effektiv inkorporering av ukonvensjonelle baser, kan skje ved hjelp av prosesser som stedsrettet mutagenese. Se for eksempel Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989, 2. utg. kapittel 15.51, «Oligonucleotide-Mediated Mutagenesis», som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. For eksempel resulterer en mutasjon av «A» til «G» i den andre posisjon av det kodon som koder for glutaminsyre i rest 615 i Thermus aquaticus (Taq) DNA polymerase gensekvensen (se SEKV. ID. NR:7), i mer enn en 500-gangers økning i inkorporeringseffektiviteten av ukonvensjonelle nukleotider, slik som her definert, mens enzymets evne til å mediere PCR i nærvær av konvensjonelle nukleotider, dvs. dNTPs, bibeholdes. I Taq DNA polymerase resulterer denne bestemte, mutasjon i en aminosyreendring av E (glutaminsyre) til G (glycin). Selv om denne bestemte aminosyreendring i vesentlig grad endrer enzymets evne til å inkorporere ukonvensjonelle nukleotider, kan det forventes at erstatningen av glutaminsyreresten med en hvilken som helst annen aminosyrerest, som f.eks. en serin-, cystein-, treonin-, alanin-, valin- eller leucin-rest har den samme effekt. Andre aminosyresubstitusjoner som erstatter E615 ligger derfor innenfor rammen av oppfinnelsen, selv om E615G representerer en foretrukket utførelsesform. Et avgjørende aspekt ved oppfinnelsen er således at den fjerde aminosyrerest i motivet SEKV. ID. NR:1 ikke er en glutaminsyrerest.

Stedsrettet mutagenese kan også skje gjennom stedsspesifikk primer-rettet mutagenese. Denne teknikk er nå standard på området og utføres ved å benytte en syntetisk oligonukleotidprimer som er komplementær til en enkeltkjedet fag-DNA som skal mutageniseres, bortsett fra en begrenset mistilpasning som representerer den ønskede mutasjon. I korte trekk benyttes det syntetiske oligonukleotid som en primer for å styre syntesen av en kjede som er komplementær til plasmidet eller fagen, hvoretter den resulterende dobbeltkjedede DNA transformeres inn i en fag-bærende vertsbakterie. Den resulterende bakterie kan bestemmes for eksempel ved DNA-sekvensanalyse eller probe-hybridisering for å identifisere de plakk som er bærere av den ønskede muterte gensekvens. Alternativt kan «rekombinante PCR» metoder som er beskrevet i PCR-Protocols, San Diego, Academic Press, Innis et al., red. 1990, kapittel 22, med tittel «Recombinant PCR» av Higuchi, sidene 177-183, benyttes.

Som vist i Tabell I er glutaminsyren innen det kritiske motiv av Taq polymerase konservert i andre termostabile DNA polymeraser, men kan være lokalisert i en annen, men nærliggende, posisjon i aminosyresekvensen. En mutasjon av den konserverte glutaminsyre innen SEKV. ID. NR:2 av termostabile DNA polymeraser av r/rø/mus-arter og DNA polymeraser av de beslektede Thermotoga, Thermosipho og AnaeroceHum arter, vil ha en lignende forbedrende effekt på polymerasens evne til effektivt å inkorporere ukonvensjonelle nukleotider i forhold til Taq-polymerase som omfatter SEKV. ID. NR:2. Mutasjoner av glutaminsyreresten innen det kritiske motiv i andre termostabile DNA polymeraser, kan oppnås ved å gjøre bruk av de prinsipper og teknikker som anvendes for stedsrettet mutagenese. Det foreligger flere sekvens-innleveringer for Bacillus stearothermophilus DNA polymerase i databaser i GeneBank etler SwissProt/PIR. Disse sekvensene er nær beslektet, men noe forskjellige fra hverandre, men alle inneholder den identiske kritiske motivsekvens Ser Gin Ile Glu Leu Arg Xaa (SEKV. ID. NR:2), hvor «Xaa» i posisjon 7 av denne sekvens er en valinrest (Val) eller en isoleucinrest (Ile), om enn i en annen posisjon i sekvensen.

På grunnlag av den her beskrevne, offentlig tilgjengelige, aminosyre- og nukleinsyre-sekvensinformasjon for termostabile DNA polymeraser, er det også mulig gjennom konvensjonell rekombinant metodikk, å konstruere kimære polymeraser som er sammensatt av domener avledet fra ulike termostabile DNA polymeraser. US-patent 5.466.591 og 5.374.553 beskriver fremgangsmåter for utveksling av de forskjellige funksjonelle segmenter av termostabile polymeraser, så som 5'- til 3'-eksonuklease-domenet, 3'- til 5'-eksonukléase-domenet og polymerasedomenet, for å komme frem til nye enzymer. De foretrukne kimære termostabile polymeraseenzymene omfatter et 5'- til 3'-eksonuklease-domene, et 3'-til <5->eksonuklease-domene og et polymerase-domene, hvor ett domene er avledet fra en forskjellig polymerase og hvor polymerase-domenet omfatter den kritiske motivsekvens Ser Gin Ile Xaa Leu Arg Xaa (SEKV. ID. NR:1), hvor «Xaa» i posisjon 4 av denne sekvens er en hvilken som helst aminosyrerest unntatt glutaminsyreresten (Glu) og «Xaa» i posisjon 7 av denne sekvens er en valinrest

(Val) eller en isoleucinrest (Ile). Eksempler på et slikt kimært molekyl er Taq/Tma-kimær-enzymer som er sammensatt som angitt i Tabell 2. Som det fremgår av denne tabell inneholder polymerase-domenet av disse Taq/Tma-kimære enzymer mutasjonen i det ovenfor angitte kritiske motiv.

Plasmid pC1 er i henhold til Budapestavtalen deponert hos ATCC 17. juli, 1996 og gitt tilgangsnummer 98107. Plasmidet pC1 inneholder et gen som koder for en termostabil DNA polymerase som.er mutert i det kodon som koder for glutaminsyreresten i posisjon 615 av aminosyresekvensen av nativ Taq-polymerase, hvilket resulterer i en mutert form av Taq-polymerase som har en glycinrest i posisjon 615 (E615G-mutert Taq-polymerase). Denne deponering byr på alternative måter å frembringe termostabile DNA polymeraser som har en forbedret evne til inkorporering av ukonvensjonelle nukleotidanaloger. Eksempel I illustrerer anvendelsen av flankerende restriksjonsseter som er egnet for subkloning av É615G-mutasjonen for å frembringe andre termostabile DNA polymeraseenzymer. Siden hele gensekvensen for en rekke termostabile DNA polymeraser er kjent, er andre måter for innføring av en mutasjon i kodonet som koder for E615, som f.eks. restriksjonskutting og fragment-erstatning eller setespesifikk in vitro mutagense, lett tilgjengelige for fagmannen ut fra den her gitte sekvensinformasjon om det kritiske motiv.

Det modifiserte gen eller genfragment fremstillet ved stedsspesifikk mutagenese, kan på konvensjonell måte isoleres fra plasmidet eller fagen og ligeres inn i en ekspresjonsvektor for senere dyrkning og rensing av det resulterende enzym. Mange klonings- og ekspresjons-vektorer, inklusivt pattedyr- og bakterielle systemer, er egnet for gjennomføring av oppfinnelsen og er beskrevet for eksempel i Sambrook et al., Molecular Ctoning: A Laboratory Manual, 2. utg. Cold Spring Harbor, 1989. For enkelhets skyld er eksempler på foreliggende oppfinnelse foretatt ved å gjøre bruk av den lambda-avledede PL-promotor (Shimatake etat., 1981, Nature 292:128). Bruk av denne promotor er spesifikt beskrevet i US-patent 4.711.845 og 5.079.352.

De termostabile DNA polymerasene ifølge foreliggende oppfinnelse renses generelt fra mikroorganismer som f.eks. E coli, som er blitt transformert med en ekspresjonsvektor som operativt er koblet til et gen som koder for en villtype eller modifisert termostabil DNA polymerase. Et eksempel på en egnet vérts-mikroorganisme er £ colt stammen DG116 beskrevet av Lavyyer et ai, 1993, PCR Methods and Applications 2:275-287, en stamme som også er tilgjengelig fra the American Type Culture Collection under tilgangsnummer ATCC 53601.. Fremgangsmåter for rensing av den termostabile polymerase er også beskrevet, for eksempel i Lawyer et ai, 1993, PCR Methods and Applications 2:275-287.

For fagmannen vil det være klart at de ovenfor omtalte termostabile DNA polymeraser med forbedret effektivitet for inkorporering av ukonvensjonelle nukleotider lettest fremstilles ved å benytte rekombinant DNA-teknologi. Når man ønsker å produsere ett av enzymene ifølge foreliggende oppfinnelse, eller et derivat eller homolog av slike enzymer, involverer produksjonen av en rekombinant form av enzymet i alminnelighet konstruksjon av en ekspresjonsvektor, transformasjon av en vertscelle med vektoren og dyrkning av den transformerte vertscelle under slike betingelser at ekspresjon vil finne sted. Måter å fremstille ekspresjonsvektorer, transformere og dyrke transformerte vertsceller på, er velkjent på området og er beskrevet utførlig, for eksempel i Sambrook et al, 1989 supra.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer termostabile DNA polymeraser som er egnet for bruk med ribonukleosid-trifosfater for en rekke anvendelser, inklusivt nukleinsyre-amplifiserings-, påvisnings- og DNA-sekvenseringsmetoder. Ved bruk av ribonukleotider for sekvensering unngås de høye omkostningene til kjede-terminerende anajoger, så som ddNTPs og ikke minst, forenkles fremstillingen av

nye amplifiseringsprodukter som ikke bare er egnet for DNA-sekvensanalyse, men også for andre typer analyser, så som elektroforese eller hybridisering uten behovet

for å foreta påfølgende DNA-sekvenseringsreaksjoner.

Pyrofosfatase har vist seg å forbedre sekvenseringsresultater ved å benytte både mesofile polymeraser og termostabil DNA polymerase, ved å minske graden av pyrofosforolyse etter hvert som ekstensjonsprodukter akkumuleres. Tidligere cyklus-sekvenseringsmetoder fordret faktisk at det ytterligere enzym ble inkludert i sekvenseringsreaksjonen. Et meget nyttig og fordelaktig aspekt ved foreliggende oppfinnelse er imidlertid at pyrofosfatase ikke fordres for DNA-sekvensering. Anvendelsen av de nye enzymer som her tilveiebringes, eliminerer således behovet for den tilleggsutgift som tilsetning av et andre enzym til sekvenserings-reaksjonsblandingén, medfører.

Ved å benytte enzymene ifølge foreliggende oppfinnelse kombineres amplifiserings- og sekvenseringsreaksjoner, hvilket sparer tid og materialer i tillegg til å forenkle analysen i sin alminnelighet. Disse og andre fordeler skyldes primært at inkorporeringen av både konvensjonelle nukleotider og ribonukleotider og ribonukleotidanaloger i et primer-ekstensjonsprodukt, fører til en RNA/DNA-kimær kjede som er følsom for hydrolyse av RNA. Behandlingen påvirker ikke DNA-

skjelettet og fører til en populasjon av nukleinsyref ragmenter som alle avsluttes i den posisjon hvor det ble innskutt et ribonukleotid i stedet for det tilsvarende dNTP. Hydrolyse foretas lett på forskjellige måter som innbefatter, men ikke er begrenset til, alkali (f.eks. behandling med NaOH, f.eks. ved en sluttkonsentrasjon på 0,2 M, som vist i Eksempel VI nedenfor), varme eller enzymatisk behandling med RNase (Vogel et al., red. Informational Macromolecular, New York, Academic Press, 1963, kapittel av Berg et al., med tittel «The Synthesis of Mixed Polynucleotides Containing Ribo-and Deoxyribonucleotide by Purified Preparation of DNA Polymerase from E. coli», side 467-483).

I en foretrukket utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse nye og forbedrede blandinger som er særlig egnet for DNA-sekvenseringsmetoder. De nye enzymene som her beskrives er fordelaktige i nukleinsyresekvenseringmetoder, ved å benytte enten farvestoff-terminatorer eller farvestoff-primere, så vel som andre sekvenseringsmetoder. Som tidligere beskrevet fordrer kjede-termineringsmetoder i alminnelighet templat-åvhengig primerekstensjon i nærvær av kjede-terminerende nukleotider, hvilket resulterer i en fordeling av partielle fragmenter som senere separeres etter størrelse. Standard dideoksy-sekvensering gjør bruk av dideoksynuklosid-trifosfat for kjede-terminering og en DNA polymerase, så som . Klenow-fragmentet av £ coil Pol I (se Sanger et al., supra).

Prosedyren som ligger til grunn for dideoksy-sekvensering involverer (i) hybridisering av en oligonukleotid-primer til et templat; (H) forlengelse av primeren med DNA polymerase i fire separate reaksjoner som hver inneholder et merket nukleotid eller en merket primer, en blanding av umerkede dNTPs og en kjede-terminerende ddNTP; (iii) spaltning av de fire sett av reaksjonsprodukter for eksempel ved hjelp av høy-oppløsende denaturerende polyakrylamid/urea-gelelektroforese, kapillær separasjon eller ved hjelp av andre spaltningsmetoder; og (iv) autoradiografisk fremstilling av et bilde av gelen som kan undersøkes slik at sekvensen kan utledes. Som et alternativ kan massespektrometriske metoder eller hybridiserings-baserte metoder, ved å benytte fluorescensmerkede primere eller nukleotider, benyttes for å frembringe DNA-sekvensinformasjon.

Tilgjengeligheten av termo-resistente polymeraser,. som f.eks. Taq-polymerase, har resultert i forbedrede sekvenseringsmetoder (se US-patent 5.075.216) og modifikasjon av disse betegnet «syklus-sekvensering». Ved syklus-sekvensering gjentas runder av oppvarming og avkjøling, slik at det kan utvikles mange ekstensjonsprodukter fra hvert mål-molekyl (Murray, 1989, Nucleic Acids Research 17:8889). Denne asymmetriske amplifisering av målsekvenser, komplementære til templatsekvensen, i nærvær av dideoksy-kjedeterminatorer, fører til en familie av ekstensjonsprodukter av alle mulige lengder.

Etter denaturering av ekstensjons-reaksjonsproduktet fra DNA-terriplatet, foretas mange runder med primerhybridisering og primerekstensjon i nærvær av dideoksy-terminatorer. Termostabile DNA polymeraser har flere fordeler ved cyklus-sekvensering; de tåler de stringente hybridiseringstemperaturene som fordres for spesifikk hybridisering åv primer tii nukleinsyre-mål og tåler også de mange runder av høy temperatur-denaturering som forekommer for hver runde, dvs. 90-95X. Det er derfor inkludert forskjellige former av AmpliTaq® DNA polymerase i Taq-cyklus-sekvenserings-sett som markedsføres av Perkin Eimer, Norwålk, CT.

Ikke desto mindre utgjør den egenskap ved Taq DNA polymerase at den diskriminerer mot inkorporering av ukonvensjonelle nukleotider, så som ddNTPs, et problem når den benyttes for syklus-sekvensering, hvor ddNTPs eller fluorescensmerkede ddNTPs må inkorporeres som kjede-terminatorer. Fø r foreliggende oppfinnelse fordret DNA-sekvensering med termostabile DNA polymeraser i alminnelighet en blanding av kjede-terminerende nukleotider, i alminnelighet dideoksynukleotider, i høye konsentrasjoner, for å sikre at en populasjon av ekstensjonsprodukter som representerte alle mulige fragmentlengder over en distanse på flere hundre baser, ville bli utviklet. For å gjøre noe med omkostningene ved dette, ble det ofte benyttet meget lave konsentrasjoner av konvensjonelle dNTP, noe som gjorde reaksjonene ineffektive. Disse réaksjonsblandihgene som har en lav dNTP-konsentrasjon og en høy ddNTP-konsentrasjon, skaper et miljø hvor den termostabile polymerase nærmest sultefdres på nukleotidsubstrater.

Selv ved innføringen av modifisetre enzymer, som f.eks. AmpliTaq®

DNA polymerase FS, som muliggjør økning av konsentrasjonen av dNTPs til mer

. optimale nivåer, baserer de tidligere enzymene seg fremdeles på nærvær av de kostbare ddNTPs for DNA-sekvensering. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer derimot enzymer som ikke bare tillater at konsentrasjonen av dNTPs kan økes, men unngår bruken av kostbare ddNTPs ved i stedet å benytte rNTPs for inkorporering i den voksende kjede. De nye enzymenes evne til effektivt å bevirke partiell ribonukleotid-substitusjon forenkler utviklingen av DNA-sek<y>enseirngs-stiger når en separat reaksjon for inkorporering av et terminerings-nukleotid mangler.

Valget av ukonvensjonelle nukleotidanaloger som er egnet for bruk i DNA-sekvenseringsmetoder var tidligere diktert av den termostabile DNA polymerases evne til å inkorporere vedkommende analoger. Uheldigvis er de nevnte nukleotidanalogene ganske kostbare. For eksempel er prisen for ddNTPs ca. 25 ganger høyere enn prisen for både rNTPs eller for dNTPs. Siden tidligere kjente termostabile DNA polymeraser ved templat-styring, ikke effektivt kunne inkorporera rNTPs i en voksende DNA-kjede, har slike ribonukleotider som er lett tilgjengelige og billige, ikke kunnet velges for anvendelse ved DNA-sekvensering med en termostabil DNA polymerase. Foreliggende oppfinnelse eliminerer behovet for ddNTPs ved DNA-sekvenseringsreaksjoner. I henhold til et aspekt tilveiebringer oppfinnelsen således fremgangsmåter for DNÅ-sekvenseringsanalyse som er vesentlig mindre kostbare enn tidligere kjente kjede-termineirngsmetoder.

Nærværet av mangan i en primer-ekstensjonsreaksjonsblanding kan påvirke polymerasens evne til nøyaktig å skyte inn det korrekt base-parede nukleotid. Mangan kan benyttes til å påtvinge ukorrekt base-paring eller til å lette diskriminering mot insersjon av en nukleotidanalog. Mangan har av enkelte forskere vært benyttet til å indusere mutagense i DNA-replikasjons- eller amplifikasjons-prosedyrer. Mangan kan således påvirke påliteligheten av en polymerisasjons-reaksjon så vel som reaksjonsutbyttet. Den resulterende sekvens kan være ukorrekt, eller den resulterende informasjon fra en DNA-sekvenseringsmetode være tvetydig. De foreliggende metoder fprdrer ikke at mangan inkluderes som divalent kation i sekvenseringsreaksjonsblandingen for å tvinge polymerasen til å skyte inn et ukonvensjonelt nukleotid. I motsetning til tidligere DNA polymeraser identifiserer foreliggende oppfinnelse det kritiske motiv innen polymerase-domenet for å kontrollere enzymets evne til å skjelne mellom 2'-subst'rtuerte og usubstituerte nukleotider, uten behovet for mangan.

Enzymene ifølge foreliggende oppfinnelse fordrer ikke høye konsentrasjoner av de ukonvensjonelle baseanaloger for sekvensering. Før foreliggende oppfinnelse ble ukonvensjonelle baseanaloger og de tilsvarende konvensjonelle baser, i alminnelighet benyttet i forhold (f.eks. ddATP:dATP) som varierte fra ca. 1,3:1 til 24:1 for kjede-terminerende DNA-sekvenseringsmetoder (se også US-patent 5.075.216 til Innis et ai). Til sammenligning gjør de termostabile polymerasene som tilveiebringes gjennom foreliggende oppfinnelse, det mulig å redusere forholdet mellom ukonvensjonelle baseanaloger og konvensjonelle baser fra hundre ganger til flere tusen ganger. Et rNTP:dNTP-forhold på 1:1 eller mindre, i kombinasjon med de her frembragte nye enzymer, er tilstrekkelig for DNA-sekvensanalyse. Ifølge en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen reduseres rNTP:dNTP-forholdet til mindre enn 1:8. Forholdet mellom 2'-substituert nukleotid og det.tilsvarende naturlige dNTP, kan være så lavt som 1:80 eller 1:200, avhengig av det bestemte forsøksopplegg og de ønskede fragmentlengder.

I og med at foreliggende enzymer lett inkorporerer ukonvensjonelle nukleotider, så som 2'-substituerte nukleotider, er det således ikke nødvendig å påtvinge inkorporering av rNTP ved å benytte en høy konsentrasjon av rNTP og en begrenset konsentrasjon av det tilsvarende dNTP. Foreliggende metoder muliggjør følgelig bruk av optimale konsentrasjoner av dNTPs i kombinasjon med lave mengder av rNTPs.

Når modifiserte polymeraseenzymer i henhold til foreliggende oppfinnelse benyttes for en passende sekvenseringsmetode, som f.eks. farvestoff-primersekvensering, oppnås gode DNA-sekvenseringsresultater med en dNTP-konsentrasjon i området 50-500 \ iM av hver dNTP. Fortrinnsvis er dNTP-konsentrasjonen mellom 100-300 jxM. I disse områdene kan den tilsvarende rNTP forekomme i omtrent samme konsentrasjon som dNTP, eller mindre. Fortrinnsvis foreligger rNTP som ca. 0,1 u,M-100 uM, og helst foreligger rNTP som 2,5 uM til 25 u.M.

Den rNTPs-konsentrasjon som egner seg for bruk med de modifiserte enzymene kan av fagmannen lett bestemmes ved titrerings- og optimaliserings-forsøk. Den mengde av rNTP eller analog som trengs vil påvirkes av forsøkstype og kan influeres av størrelsen av målet og av renhet, så vel som av valget av buffer og de bestemte enzymarter. Forholdet rNTP:dNTP vil bestemme hyppigheten som rNTPs innskytes med i det voksende oligonukleotid. Siden hydrolyse vil inntre ved hvert inkorporert rNTP, kan forholdet rNTP:dNTP justeres for å gi brukeren frihet til å øke eller minske størrelsen av de resulterende fragmenter.

Det skulle fremgå klart at DNA er en polymer syntetisert fra dNTPs. Hvert deoksynuklebsid-trifosfat omfatter et ribosesukker som inneholder en hydroksylgruppe i 3'-stillingen og et hydrogen i 2'-stillingen. Ribonukleotider inneholder også en hydroksylgruppe i sukkerets 3'-del. rNTPs skiller seg fra dNTPs ved 2'-stillingen i sukkeret, hvor en andre hydroksylgruppe erstatter hydrogenatomet.

I foreliggende sammenheng eksemplifiserer rNTPs den evne enzymer ifølge foreliggende oppfinnelse har til nøyaktig å inkorporere 2-substituerte nukleotider. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er imidlertid ikke begrenset til bruken av ukonvensjonelle nukleotider som er ribonukleotider. Modifikasjon av den termostabile polymerasesekvens i det kritiske domenet som her er påvist, muliggjør templat-styrt inkorporering av alternative 2'-substituerte nukleotider, så som 2'-hydroksyl, 3'-deoksynukleotider og substituerte 2-fluor- eller amino-nukleotider.

Som beskrevet i de her gitte eksempler, lettes inkorporeringen av 3'-deoksy, 2'-hydroksy ATP, her omtalt som cordycepin-trifosfat, gjennom forekomsten av en andre mutasjon i den termostabile polymerase som reduserer diskrimineringen mot inkorporering av et nukleotid som inneholder en deoksygruppe i ribosens 3-stilling. Slike enzymer er tidligere beskrevet, for eksempel i EP-A-655506 og i

USSN 08/448.223 av 23. mai, 1995, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. ATCC deponeringsnummer 69820, deponert 10. mai, 1995, i henhold til Budapestavtalen, gir genet som koder foren modifisert termostabil DNA polymerase av Thermus aquaticus som har redusert diskriminering mot inkorporering av analoger som f.eks. ddNTPs. Dideoksynukleotider har en substituert 3'-stilling sammenlignet med konvensjonelle dNTPs. I kombinasjon med foreliggende oppfinnelse tilveiebringer dobbeltmutasjonen, her eksemplifisert gjennom en E615G, F667Y Taq-polymerasemutant, således anordninger for å utnytte nukleotidanaloger som i forhold til dNTPs (se Eksempel III og V) er substituert i ribosens 3'- og 2'-stillinger.

En særlig anvendelse av oppfinnelsen er en rNTP-sekvenseringsmetode, hvor sekvenseringsprimeren har en fluorescerende eller radioaktiv merking som kan påvises. Til forskjell fra ddNTPs, resulterer inkorporering av et umodifisert rNTP ikke i en kjede-terminering. DNA-sekvenseirngsreaksjonen som omfatter både rNTPs og

dNTPs i kombinasjon med et enzym ifølge oppfinnelsen, produserer en blanding av tilfeldig substituerte primer-ekstensjonsprodukter som er følsomme for spaltning i 3'-5'-fosfodiesterbindingen mellom et ribb- og et tilstøtende deoksyribo-nukleotid. Etter primer-ekstensjon ved for eksempel PCR-amplifikasjon eller cyklus-sekvensering, og før spaltning av primer-ekstensjonsproduktene, for eksempel ved gelelektroforese, behandles reaksjonsblandingen enten med alkali, varme eller ribonuklease eller på annen måte for hydrolysering av ekstensjonsproduktene ved hver forekomst av et ribonukleotid. For hvert merket primer-ekstensjonsprodukt er kun det mest 5'-fragment, som er det umiddelbare ekstensjonsprodukt av den merkede primer, påvisbart på en sekvenseringsgel. For et gitt mål fører analyse av den resulterende sekvensgel til en sekvenserings-stige, dvs. rekker av identifiserbare signaler i de G-, A-, T- og C-baner som tilsvarer målets nukleinsyresekvens. Den resulterende sekvenseirngs-stige gir den samme informasjon enten metoden gjør bruk av ddNTPs på konvensjonelle måter eller rNTPs og de nye termostabile polymerasene som her er beskrevet. Ved anvendelsen av foreliggende oppfinnelse fordres således ikke lenger kostbare ddNTPs for DNA-sekvensering (se Eksempel

VI).

Ved en alternativ sekvenseirngsmetode benyttes kjede-terminerende ribonukleotider. I denne utførelsesform av oppfinnelsen benyttes 2'-hydroksy, 3'-deoksynukleotider, så som cordycepin-trifosfat, som terminatorer. Disse rNTP-analogene kan fluorescensmerkes og benyttes for DNA-sekvensering. Lee et al.

( supra.) har beskrevet anvendelsen av farvestoff-terminator ddNTPs. EP-A-655.506 og USSN 08/448.223 av 23. mai, 1995, beskriver modifiserte enzymer for bruk med ddNTPs. En termostabil DNA polymerase som omfatter både modifikasjonen som forekommer i AmpliTaq® DNA polymerase FS (se ovenfor) og de som er angitt i SEKV. ID. NR:1, hvor X ikke er glutaminsyre (E), som her beskrevet, kan benyttes for effektiv inkorporering av de merkede rNTP-analoger i en kjede-terminerende sekvenseringsreaksjon. Denne prosess kan automatiseres og fordrer ikke syntese av farvestoff-merkede primere. Siden farvestoff-terminator-reaksjoner lar alle fire reaksjoner utføres i det samme rør, er de dessuten mer hensiktsmessige enn farvestoff-pirmermetoder. 2'-hydroksy, 3-deoksynukleotider kan syntetiseres fra kommersielt tilgjengelige 3'-nukleotider (3<*> dA, 3' dC, 3' dG og 3' dT, f.eks. tilgjengelig fra Sigma Chemical Corporation, St. Louis, MO) og addering av et 5'-trifosfat som beskrevet i Ludwig, Biophosphates and Their Synthesis Structure, Metabolism and Activity, red. Bruzik & Stec, Amsterdam, Elsevier Science Publishers, 1987, s. 201-204.

I tillegg til anvendeligheten av enzymene ifølge foreliggende oppfinnelse i nye sekvenseringsmetoder, er de modifiserte enzymene som her er beskrevet anvendelige ved én rekke molekylærbiologiske anvendelser. I henhold til en utførelsesform benyttes det modifiserte enzym i en amplifiseringsreaksjonsblanding som omfatter både konvensjonelle og ukonvensjonelle nukleotider, for eksempel dNTPs og minst ett påvisbart merket rNTP, hvor merkingene innbefatter for eksempel fluorescensmerkinger eller radioisotoper. Templat-styrt syntese av en komplementær kjede frembringer et DNA-produkt som inneholder ribonukleosid-monofosfater i forskjellige posisjoner langs dens kjede. Varme- og/eller alkali-behandling hydrolyserer nukleinsyré-ekstensjonsproduktet ved hvert ribonukleotid. Det tilveiebringes, således en familie av DNA-segmenter hvor hvert fragment inneholder én merket del i dens 3'-ende. Størrelsen av de resulterende nukleinsyrefragmenter kan modifiseres ved å justere forholdet og mengden av det rNTP som inkluderes i reaksjonen.

Amplifiseringen av et mål ved å benytte rNTPs og foreliggende enzymer medfører en rekke fordeler som avhenger av den aktuelle anvendelse. I den ovenfor beskrevne metode hvor det benyttes et merket rNTP, er resulterende fragmentfamilier alle merket med lik intensitet: én merking per otigonukleotid-fragment. Fremgangsmåter som f.eks. nukleinsyrepåvisning ved å benytte en oligonukleotid-proberad festet til en silisiumbrikke, fordrer optimalt at det amplifiserte mål er tilfeldig fragmentert innen et fastlagt reproduserbart størrelsesområde for å begrense dannelse av sekundære strukturer, for å kontrollere hybridiserings-kinetiske forhold. For dessuten å påvise hybridisering til en rad på tusener av prober på en brikke, kan det være fordelaktig at nukleinsyrefragmentene er merket med lik intensitet. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer hjelpemidler for å produsere fragmentfamilier som fyller dette krav, og som således forenkler anvendelsen av alternative påvisningsformater, som f.eks. de brikkke-baserte metoder som er beskrevet for eksempel av Cronin et al., 1996, Human Mutation 7:244-255.

I en annen utførelsesform fører anvendelsen av en merket primer og en umerket primer i en amplifikasjonsreaksjon som omfatter en termostabil polymerase ifølge oppfinnelsen og både rNTPs og dNTPs, til et middel til samtidig å foreta amplifiserings- og sekvensérings-reaksjoner. Denne metode fordrer at fire separate amplifikasjonsreaksjoner foretas, én for h<y>er rNTP. Siden enzymet ifølge oppfinnelsen egner seg for målrettet amplifikasjon, for eksempel ved PCR eller andre amplifikasjonsmåter, kan det resulterende produkt, dersom dét forekommer, påvises etter konvensjonelle metoder så som gelelektroforese eller probe-hybridisering ved å benytte en del av reaksjonsproduktet. Disse påvisningsmetodene vil ikke resultere i hydrolyse av de inkorporerte ribonukleotidene, og den RNA/DNA-kimære kjede vil oppføre seg som forventet for et konvensjonelt nukleinsyre-amplifikasjonsprodukt. Dersom det påvises et ønsket produkt, kan en gjenværende del av den samme reaksjonsblandingen deretter behandles med alkali og analyseres ved gelelektroforese for nukleinsyresekvensbestemmelse. Etter påvisning av produktet er dermed en påfølgende sekvenseringsreaksjon unødvendig. Denne forenklede prosedyre sparer tid og materialer og gir øket nøyaktighet ved å fjerne trinn. Det påviste produkt er det sekvenserte produkt. En lignende fremgangsmåte med fire merkede rNTPs og én biotinylert primer, ville også kunne benyttes. Etter amplifisering spaltes produktet med alkali, hvoretter de primerassosierte produktene fjernes ved reaksjon med streptavidin-dekkede kuler. De oppfangede produktene analyseres senere på en sekvenseringsgel. Denne modifikasjon tillater at sekvenseringsreaksjonen foretas i ett rør, hvorved behovet for fire separate amplifikasjoner elimineres. I henhold til et annét aspekt ved oppfinnelsen er de beskrevne enzymer egnet for fremstilling av RNA fra et DNA-templat eller for å fremstille substituert DNA for alkali-mediert sterilisering uten anvendelse av konvensjonelle steriliseringsmidler som uracil-N-glykosylase (UNG), som beskrevet i internasjonal patentpublikasjon WO 92/01814.

I en eksemplifisert utførelsesform inneholder den termostabile polymerase også en mutasjon i 5'-3'-eksonuklease-domenet som tjener til i vesentlig grad å svekke denne eksonukleaseaktivitet. Modifiserte former av Taq-polymerase er beskrevet i US-patent 5.466.591.1 én utførelsesform av vedkommende oppfinnelse er det kodon som koder for glycinresten (G) i amiriosyreposisjon 46, erstattet med et kodon som koder for asparaginsyre (D). Det resulterende enzym er bedre egnet for syklus-sekvenseringsreaksjoner som følge av den nedsatte 5'-3'-eksonukleaseaktivitet og er en foretrukket bakgrunn for anvendelse ifølge foreliggende oppfinnelse. Polymerase-domenets aminosyresekvens og polymeråseaktivitet påvirkes ikke av nærværet av (G46D)-mutanten i forhold til villtype-enzymet.

I en kommersiell utførelsesform av oppfinnelsen representerer analysesett for nukleinsyresekvensering som omfatter en termostabil polymerase i henhold til. foreliggende oppfinnelse, en kommersiell utførelsesform av oppfinnelsen/Slike sett innbefatter i alminnelighet ytterligere reagenser for DNA-sekvensering, så som f.eks. rNTPs, dNTPs og passende buffere. Der hvor rNTPs er umerkede, kan det også inkluderes en merket primer.

De etterfølgende eksempler er gitt som illustrasjon.

Eksempel I

Ekspresjon av et modifisert Taq-polymerasegen som har redusert diskriminering av ukonvensjonelle nukleotider Den C-terminale aminosyredel av Taq DNA polymerase koder for domenet for polymerasens aktive sete (Lawyer et ai, 1993, PCR Methods and Applications 2:275-287, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse). Et DNA-fragment som inneholder denne region ble isolert fra full-lengde Taq-genet og mutagenisert ved PCR-amplifisering i nærvær av mangan (Leung et

a/., 1989, Technique 1 (1):i 1 -15). Alle restriksjonsenzymer for dette eksempel ble anskaffet fra New England Biolabs, Beveriy, MA. De mutageniserte fragmentene ble kuttet med Pstl og Bglll og klonet inn i et Taq-ekspresjonsplasmid, i dette tilfellet plasmid pLK102, som var kuttet med Pstl og Bglll. Plasmid pLK102 er en modifisert form av Taq<->ekspresjonsplasmid pSYCl578 (Lawyer et sd, supra). Hincll/EcoRV-fragmentet lokalisert 3' til den polymerase-kodende region, ble deletert for å frembringe plasmid pLK101. Et 898 basepårs Pstl-Bglll-fragment ble deretter deletert fra pLK101 og erstattet med et kort Pstl-EcoRV-Bglll-oligonukleotid-dupleks for å frembringe plasmid pLK102. Denne delesjon fjerner derfor 900 basepar fra 3'-enden av Taq DNA pol-genet og erstatter det med en kort bit av DNA.

De resulterende ekspresjonsplasmidene ble transformert inn i E. coli stamme Ni 624 (beskrevet av G ottes man, 1973, J. Mol. Biol. 77:531; som også er tilgjengelig fra E coli Genetic Stock Center ved Yale University, under tilgangsnummer CGSC#5066), og de resulterende transformanter ble underkastet screening med henblikk på evnen til effektivt å inkorporere rNTPs i forhold til villtype-enzymet. Ved å benytte denne fremgangsmåte ble mutant Cl påvist å ha evnen tii mer effektivt å inkorporere rNTPs.

For å bestemme hvilken del av Taq polymerase-genet som var ansvarlig for den endrede fenotype, ble det mutageniserte Taq-ekspresjonsplasmid, betegnet pC1, isolert fra mutant C1, kuttet med forskjellige restriksjonsenzymer, hvoretter de resulterende restriksjonsfragmentene ble subklonet inn i villtype

Taq DNA polymerase-genet til pLK101 under erstatning av de ikke-mutageniserte restriksjonsfragmentene. Analyse av de resulterende subkloner tydet på at mutasjonen som var ansvarlig for fenotypen, inngikk i et 265 basepars Nhel til BamHI-restriksjonsfragment.

DNA-sekvensanalyse ble foretatt på denne region av pC1 ved å benytte ABI PRISM<8> Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit med AmpliTaq® DNA polymerase FS fra Applied Biosystems, Foster City, CA, og Applied Biosystems Model 373A DNA Sequencing System. Sekvensanalysen identifiserte to missense mutasjoner i Taq polymerase-genet mellom Nhel og BamHI-setene. En mutasjon i aminosyreposisjon 615 forårsaket at en glutaminsyrerest (E) ble erstattet med en glycinrest (G), og en annen mutasjon i posisjon 653 erstattet en alariinrest (A) med treonin (T). Nummereringen innledes ved det kodon som koder for den første metioninrest i det modne protein, som i US-patent 5.079.352. E615G-mutasjonen ble ble forårsaket av en endring av GAG til GGG i kodon 615. Mutasjonen A653T ble forårsaket av en endring av GCC til ACC i kodon 653. Plasmid Cl \ E. coli vertsstamme N1624 ble deponert i henhold til Budapestavtalen hos ATCC 17. juli, 1996 og gitt tilgangsnummer 98107.

De to punktmutasjonene ble analysert hver for seg ved å subklones hver for seg inn i et Taq polymerase villtype-gen ved å benytte rekombinant PCR (Innis et al., red., PCR Protocols, San Diego,. Academic Press, 1990, kapittel 22, med tittelen «Recombinant PCR», Higuchi, s. 177-183). De resulterende ekspresjonsproduktene ble analysert for å bestemme hvorvidt E615G eller A653T eller begge mutasjoner var ansvarlige for den ribonukleotid-inkorporerende fenotype. Resultatene åv dette forsøk tydet på E615G-mutasjonen alene var ansvarlig for den mutanté fenotype.

For videre analyse og kvantifisering av inkorporeringseffektiviteten av nukleotidanaloger, ble det 265 basepars BamHI-Nhel-PCR-fragment som inneholdt E615G, klonet inn i én Taq-ekspresjonsvektor, pRDA3-2. Ekspresjonsvektor pRDA3-2 inneholder full-lengde Taq-genet operativt koblet til fag lamba PL-promotoren. Eksonuklease-domenet av Taq-genet i denne vektor inneholder en punktmutasjon i det kodon som koder for glycin, aminosyrerest 46, som reduserer 5'-3'-eksonukleaseaktivitet. Gensekvensen innen polymerase-domenet av ekspresjonsvektoren pRDA3-2 er imidlertid identisk med villtype Taq-gensekvensen. Plasmid RDA3-2 er fullstendig beskrevet i US-patent 5.466.591, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse, hvor plasmidet omtales som «klon 3-2». Plasmid pRDA3-2 ble kuttet med BamHI og Nhel og det 265 basepars PCR-fragment ligert inn i vektoren på konvensjonell måte.

Det resulterende plasmid, pLK108, ble transformert inn i £ coli stamme DG116 (Lawyer et al., 1993, supra, som også er tilgjengelig fra the American Type Culture Collection under ATCC nr. 53606). Plasmidet pLK108 koder for en termostabil DNA polymerase som her omtales som G46D, E615G Taq. En mutant, G46D, E615G, F667Y Taq, ble frembragt ved å kombinere E615G- og F667Y-mutasjoner ved hjelp av rekombinant PCR inn i et BamHI-Nhl-fragment. Dette fragmentet ble klonet inn i plasmid pRDA3-2 for å frembringe plasmid pLK109. Det uttrykte termostabile DNA polymerase-protein fra plasmidene pLK108 og pLK109 ble renset i henhold til fremgangsmåten beskrevet av Lawyer ef al., 1993, supra, hvor imidlertid kromatografitrinnet ble utelatt. Sekvensen av innskuddene ble bekreftet ved DNA-sekvensanalyse. En ytterligere mutasjon i sekvensen ble påvist i pLK108-innskuddet, men denne mutasjon endret imidlertid ikke aminosyresekvensen av proteinet.

Etter partiell rensing ble aktiviteten av det modifiserte enzym bestemt ved hjelp av aktivitetstesten beskrevet av Lawyer et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:6427-6437, som herved med hela sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Aktiviteten av det modifiserte enzym ble beregnet som følger: en enhet enzym tilsvarer 10 nmol produkt syntetisert i løpet av 30 minutter. DNA polymeraser aktiviteten av villtype-enzymet er lineært proporsjonal med enzymkonsentrasjon opp til 80-100 pmol inkorporert dCMP (fortynnet enzym ved 0,12-0,15 enheter per reaksjon). Aktiviteten av E615G, G46D- og E615G, F667Y, G46D-mutantene er lineært proporsjonal med enzymkonsentrasjoner opp til 0,25-3 pmol inkorporert dCMP (fortynnet enzym ved 6 x 10"<4> til 5 x 10"<3> enheter per reaksjon). Dette enzympreparat ble benyttet i de inkorporerings- og sekvenserings-reaksjoner som er beskrevet i Eksempel 11 I-V. For Eksempel II og VI, ble enzymet renset som beskrevet av Lawyer et al. ( supra).

Eksempel II

Test for å sammenligne inkorporeringseffektivitet

Den relative evne til G46D og G46D, E615G Taq til å inkorporere rNTPs ble bestemt ved å måle den mengde av [a-^PJrNTP hvert enzym ved begrensende enzymkonsentrasjon kunne inkorporere i et aktivert laksespermie DNA-templat. For å . måle inkorporeringen av rATP, ble det fremstillet en reaksjonsblanding slik åt sluttkonsentrasjonen i en SCfuL reaksjonsblanding, var: 12,5 jxg aktivert laksespermie DNA, fremstillet som beskrevet nedenfor, 200 u-M av hver av dCTP, dGTP og dTTP (Perkin Eimer, Norwalk, CT), 100 \ iM [cc-^PjrATP, 1 mM B-merkaptoetanol, 25 mM N-tris[hydroksymetyl]metyl-3-amino-propansulfonsyre (TAPS), pH 9,5,20°C, 50 mM KCI og 2,25 mM MgCI2.

Lignende testblandinger ble fremstillet for å måle inkorporeringen av rCTP, rGTP og rUTP. I hvert tilfelle var rNTP radioaktivt merket og tilstede som 100 jiM, mens de tre øvrige dNTPs {dATP, dGTP og dTTP for rCTP, dATP, dCTP og dTTP for rGTP og dATP, dCTP og dGTP for rUTP) forekom hver som 200 jiM. Som en standard ble også inkorporering av det tilsvarende [a-^PjdNTP av hvert enzym, målt. Testblandingen for disse bestemmelsene var omtrent som rNTP inkorporeringstesten ovenfor, bortsett fra at hver [a-<32>P]rNTP ble erstattet med

100 u.M av det tilsvarende [o>32PJdNTP. Rå laksespermie DNA, 1 g/L, fra Worthington Biochemical, (Freehold, NJ) ble aktivert ved inkubering i 10 mM Tris-HCI, pH 7,2, 5 mM MgCI2, ved 2°C-8°C i 96 timer. EDTA og NaCI ble deretter tilsatt til henholdsvis 12,5 mM og 0,1 M. DNA ble deretter ekstrahert med fenol/kloroform og deretter etanol-presipitert og resuspendert i 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5. Det aktiverte DNA-preparat ble deretter dialysert mot den samme buffer.

Av hver reaksjonsblanding ble 45 uL fordelt på alikvoter i fem 0,5 mL rør (f.eks. Eppendorf) for hver av de 5'-merkede nukleotid-forløpeme. Hver av G46D Taq og G46D, E615G Taq, ble således dobbeltbestemt, mens et rør ble holdt igjen som en negativ kontroll. Polymeriseringsreaksjonen i to rør for hver testblanding ble initiert med 5 uL av enten G46D Taq polymerase (0,02 enheter) eller G46D, E615G Taq (0,002 enheter). Som kontroll for bakgrunnsnivået ble 5 uL enzymfortynningsbuffer tilsatt i stedet for enzym til den negative kontrollreaksjonsblanding.

Hver reaksjonsblanding ble gitt en kort omvirvling (vortex) og inkubert i 10 minutter ved 75°C. Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 10 jxL 60 mM EDTA og oppbevart på is. For hver prøve ble 50 uL alikvoter av 60 u,L reaksjonsblandingen fortynnet med 1 mL 2 mM EDTA, 50 ug/mL «shéared» laksespermie DNA. DNA ble utfelt med TCA ved å benytte standardprosedyrer og oppsamlet på GF/C filterskiver (Whatman, Kent, England). Mengden av inkorporert [o^P] merket nukleotid eller ribonukleotid, ble kvantifisert ved væskescintillasjonsspektrometri og antall pmol inkorporet rderetter beregnet. Antall inkorporerte pmol av hver rNTP av hvert enzym, ble normalisert til antall pmol av det tilsvarende [a^PjdNTP inkorporert av hvert enzym. De resulterende data er vist nedenfor.

Inkorporeringsforhold mellom rNTP og dNTP for G46D og G46D, E615G Taq

Disse resultatene tyder på at G46D, E615G inkorporerer ribonukleotider mer enn 500 ganger mer effektivt enn hva G46D kan gjøre (f.eks. for rGTP 181:0,36=502 ganger, for rCTP 189:0,22=859 ganger og for rATP 210:0,18=1166 ganger mer effektivt). En missense mutasjon i polymerase-genet i kodon 615 førte dermed til en ny fenotype: en termostabil DNA polymerase som effektivt kunne inkorporere ribonukleotider i tillegg til deoksyribonukleotider.

Eksempel III

Test for å sammenligne inkorporeringseffektiviteten av 3'deoksy ATP (Cordycepin)

Den relative evne G46D; G46D, E615G; G46D, E615G, F667Y og G46D, F667Y Taq har til å inkorporere 3'-deoksyadenosin-5'-trifosfat (cordycepin-trifosfat) ble bestemt ved å måle den mengde [ot-^PJcordycepin-trifosfat hvert enzym ved begrenset.enzymkonsentrasjpn kunne inkorporere i et aktivert laksespermie DNA-templat. For å måle inkorporeringen av [a-^Pjcordycepin-trifosfat var testen innrettet slik at sluttkonsentrasjonene i en 50 jiL reaksjonsblanding var: 12,5 ug aktivert laksespermie DNA, 200 uM hver av dCTP, dGTP og dTTP, 50 u.M dATP (Perkin Eimer), 50 u.M [a-^Pl-S'dATP/3'dATP (New England Nuclear, Sigma), 1 mM B-merkaptoetanol, 25 mM N-Tris[hydroksymetyl]metyl-3-amtno-propansulfonsyre (TAPS), pH 9,5, 20°C, 55 mM KCI og 2,25 mM MgCI2.

En alikvot av 45 u.L av hver reaksjonsblanding ble overført tjl ni 0,5 ml_ rør slik at hver reaksjon kunne foretas enten med G46D; G46D, E615G; G46D, E615G, F667Y eller med G46D, F667Y Taq som parallellbestemmelse, hvor det tiloversblevne rør ble benyttet som kontroll uten enzym. Polymeriseringsreaksjonen i to rør med testblanding ble utløst med 5 uL (0,058 enheter) G46D Taq polymerase. Det samme bie gjort for G46D, E615G Taq (0,0025 enheter), G46D, E615G, F667Y Taq (0,0034 enheter) eller G46D, F667Y Taq (0,083 enheter). Som kontroll for bakgrunnsnivået ble det tiloversblevne rør tilsatt érizym-fortynningsbuffer i stedet for enzym: Hver reaksjonsblanding ble kort omvirvlet (vortex) og inkubert i 10 minutter ved 75°C. Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 10 uL 60 mM EDTA og oppbevart på is. Av hver prøve ble 50 uL alikvotér av 60 uL reaksjonsblanding fortynnet med 1 mL 2 mM EDTA, 50 ug/mL «sheared» laksespermie DNA. DNA ble utfelt med TCA ved å benytte standardmetoder og oppsamlet på GF/C-filterskiver (Whatman, Kent, England). Mengden av inkorporert [a-^P] merket nukleotid ble kvantifisert ved væskescintillasjonsspektrometri og antall inkorporert pmol deretter beregnet. Antall pmol [a-32P]cordycepin-trifosfat inkorporert for hvert enzym, ble dividert med antall enheter enzym benyttet i testen, for å gi inkorporert pmol per enhet enzym. En tabell over disse data er vist nedenfor.

Inkorporering av [a-^Pjcordycepin med G46D; G46D, E615G;

G46D, E615G, F667Y og G46D, F667Y Taq

Disse resultatene tyder på at både E615G og F667Y-mutasjonene er nødvendige for effektiv inkorporering av cordycepin-molekylet i DNA.

Eksempel IV

DNA-sekvensering ved alkalisk spaltning under bruk av

G46D, E615G Taq DNA polymerase

Dette eksempel demonstrerer anvendelsen av den modifiserte polymerase ifølge oppfinnelsen til sekvensering ved alkalisk spaltning under bruk av partielt rNTP-substituert DNA. Forholdet mellom rNTP og dNTP i reaksjonsblandingene var mellom 1:80 og 1:8. Ekstensjonsreaksjonene for primerne ble foretatt i en buffer bestående av 50 mM Bidne (N,N-bis-(2-hydroksyetyl)glycin; pH 8,3), 25 mM KOAc og 2,5 mM MgCI2. Fire individuelle reaksjoner, en for hver av de fire rNTPs, ble foretatt. Hver reaksjonsblanding (50 uL) inneholdt 200 jiM av hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP (Perkin-Elmer) og 0,09 pmol M13mp18 enkeltkjedet DNA-templat

(Perkin-Elmer) hybridisert til SH^Pj-merket DG48 (Lawyer er a/., 1993, PCR

Methods and Applications 2:275-287). Reaksjonsblandingene inneholdt også 2,5, 2,5,2,5 eller 25 p.M av henholdsvis rATP, rCTP, rGTP eller rUTP.

De fire reaksjonene ble hver initiert ved tilsetning av 7 enheter G46D,

É615G Taq DNA polymerase og inkubert ved 75°C i 10 minutter. Reaksjonene ble avbrutt ved tilsetning av 10 uL 60 mM EDTA og ånbragt på is. Av hver reaksjonsblanding ble 20 jiL tilsatt til 80 uL 50 mM Bicine (pH 8,3), 25 mM KOAc og 2,5 mM MgCI2. Spaltningsproduktet ble produsert ved tilsetning av 7 uL 1N NaOH og inkubering i 15 minutter ved 98°C. Reaksjonsblandingene ble nøytralisert ved tilsetning av 7 uL 1N HCI. Hver reaksjonsblanding ble utfelt ved tilsetning av 312 \ iL 95% etanol og 10 uL 3M natriumacetat (pH 4,8). Blandingene ble mikrosentrifugert i

15 minutter for å oppsamle bunnfallet, supematanten ble fjernet, cellepelletene vasket med 50 uL 70% etanol og tørket. Hver pellet ble resuspendert i 5 u.L 0,5X

Stop Buffer (tilgjengelig fra Perkin Eimer, Norwalk CT, som inneholder 95%

formamid, 20 mM EDTA og 0,05% bromfenol-blått), oppvarmet til 98°C i 3 minutter og direkte anbragt på en på forhånd elektroforese-behandlet 6% polyakrylamid/8M urea DNA-sekvenseringsgel, og underkastet elektroforese. Gelen ble tørket og eksponert for røntgenfilm. Den resulterende film oppviste en klar sekvenserings-stige som ga mer enn 100 baser med riktig sekvens.

Eksempel V

DNA-sekvensering ved å benytte G46D, E615G, F667Y

Taq DNA polymerase og 3'-deoksy-nukleotid-trifosfater

Dette eksempel demonstrerer anvendelsen av den modifiserte polymerase, G46D, E615G, F667Y Taq for DNA-sekvensering ved å benytte 3'-déoksy-nukleotid-trifosfater. Forsøket ble utført ved å benytte 3'-deoksy ATP, men kunne imidlertid utvides til anvendelse med de øvrige 3'-deoksy-nukleotidene. Primer-ekstensjonsreaksjonene ble foretatt i en buffer bestående av 50 mM Bicine (pH 8,3), 25 mM KOAc og. 2,5 mM MgCI2: Hver reaksjonsblanding (50 uL) inneholdt 200 jiM hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP (Perkin-Elmer) og 0,09 pmol M13mp18 enkeltkjedet DNA-templat (Perkin-Elmer) hybridisert til S-I^Pj-merket DG48 (Lawyer et a/.,. 1993, PCR Methods and Applications 2:275-287). Reaksjonsblandingene inneholdt også 0, 0,1, 0,25, 0,5,1 eller 5 uM 3'-deoksy ATP.

Hver reaksjon bie initiert ved tilsetning av 7 enheter G46D, E615G,

F667Y Taq DNA polymerase og inkubert ved 75°C i 10 minutter. Reaksjonene ble avbrutt ved tilsetning av 10 |iL 60 mM EDTA og anbragt på is. Av hver reaksjonsblanding ble 30 uL etanol-presipitert og resuspendert i Stop Buffer, oppvarmet til 98°C i 3 minutter, og direkte anbragt på en forut elektroforese-

behandlet 6% polyakrylamid/8 M urea DNA-sekvenseringsgel og underkastet elektroforese. Gelen ble tørket og eksponert for røntgenfilm. De banene som inneholdt reaksjoner foretatt i nærvær av cordycepin, inneholdt klart adskillelige terminerings-stiger. De banene som inneholdt mest cordycepin, dvs. 5 jiM, viste en terminerings-stige hvor båndene gjennomsnittlig hadde kortere lengde enn baner hvor cordycepin-nivåene var lavere. Banen som inneholdt reaksjonen foretatt uten

cordycepin, viste for det meste full-lengde produkt og ingen terminerings-stige. Disse resultatene tyder på at det mutante enzym er i stand til å inkorporere cordycepin, og inkorporering av dette molekyl i et primer-ekstensjonsprodukt forårsaker terminering. Metoden kan også benyttes for å frembringe en DNA-sekvenserings-stige med 3-deoksy CTP, 3'-deoksy GTP og 3'-deoksy UTP.

Eksempel VI Farvestoff-primer PCR-sekvensering med G46D E615G taq DNA polymerase

Dette eksempel demonstrerer anvendelsen av den modifiserte polymerase ifølge oppfinnelsen til farvestoff-primersekvensering, ved å benytte ribonukleosid-trifosfatene (rNTPs) for PCR og et rNTP:dNTP-forhold på maksimalt 1:30. Fire enkeltreaksjoner, én for hver rNTP, ble foretatt. PCR-sekvenseringsreaksjoner ble foretatt i en buffer bestående av 25 mM Tris-HCI (pH 9), 5,0 mM MgCl2 og 10% glycerol (volumdeler). Hver reaksjonsblanding inneholdt også 500 u.M hver av dATP, dCTP, dGTP, dTTP (Perkin-Elmer), 5 x 10<6> kopier/uL pBSM13+plasmid (Stratagene) templat lineårisert méd Xrnnl-restriksjonsendonuklease og 0,05 enheter/^L G46D E615G Taq DNA polymerase. Ribo-ATP reaksjonsblandinger (10 uL) inneholdt 2,5 u.M ATP (Pharmacia Biotech), 0,1 u.M JOE M13 revers fårvestoff-primér (Perkih-Elmer) og 0,1 u.M primer ASC46 (5'-CGCCATTCGCCATTCAG). Ribo-CTP reaksjonsblandinger (10 jil_) inneholdt. 2,5 u.M CTP (Pharmacia Biotech), 0,1 uM FAM M13 revers farvestoff-primer (Perkin-Elmer) og 0,1 uM ASC46. Ribo-GTP reaksjoner (20 |iL) inneholdt 2,5 uM GTP (Pharmacia Biotech), 0,1 u.M TAMRA Mi 3 revers farvestoff-primer (Perkin Eimer) og 0,1 jiM primer ASC46. Ribo-UTP reaksjonsblandinger (20 jllL) inneholdt 16 ^M UTP (Pharmacia Biotech), 0,1 \ iM ROX M13 revers farvestoff-primer (Perkin Eimer) og 0,1 u.M primer ASC46.

Hver av de firé reaksjonsblandingene ble anbragt i en forvarmet (75°C) Perkin Eimer GeneAmp® PCR-System 9600 thermal cycler og underkastet 30 runder ved 95°C i 10 sekunder, 55°C i 10 sekunder, 1 minutt stigning tii 65°C, og deretter 65°C i 5 minutter. rATP- og rCTP-reaksjonene utviklet 6 x 1011 kopier åv farvestoff-merket amplifisert 300 basepar-produkt, og rGTP- og UTP-reaksjonene frembragte hver 1,2 x 10<12> kopier farvestoff-merket amplifisert 300 basepar-produkt.

For å bestemme DNA-sekvensen av de amplifiserte PCR-produktene uten behov for en egen enzymatisk DNA-sekvenseringsreaksjon, ble reaksjonsblandingene slått sammen, behandlet med base og varme, nøytralisert og utfelt som følger. 4 uL av hver av ATP- og CTP-reaksjonsblandingene og 8 uL hver av GTP- og UTP-reaksjonéne ble slått sammen. 2 uL 0,25 M EDTA (pH 8,0) (10 mM sluttkonsentrasjon), 10 uL 1 M NaOH (200 mM sluttkonsentrasjon) og 14 uL H20 ble tilsatt til den sammenslåtte reaksjonsblanding som så ble inkubert ved 95°C i 5 minutter i en GeneAmp® PCR System 9600 thermal cycler og nøytralisert med 10 uL 1 M HCI. Den samlede reaksjonsblanding ble deretter utfelt ved tilsetning av 150 uL 95% etanol etterfulgt av en inkubering ved 4°C i 15 minutter. Den ble deretter mikrosentrifugert i 15 minutter ved 4°C for å oppsamle bunnfallet og supematanten fjernet ved avsugning. Pelleten ble vasket med 300 \ iL 70% etanol, mikrosentrifugert i 5 minutter, supematanten fjernet ved avsugning og pelleten tørket. Pelleten ble resuspendert i 6 \ ± formamid, 50 mg/mL Blue dextran (i 25 mM EDTA) 5:1

(volumdeler) og oppvarmet til 90°C i 3 minutter. Av den resuspenderte pellet ble 1,5 ilL anbragt direkte på en forut elektroforese-behandlet 5% Long Ranger (FMC BioProducts), 6 M urea-sekvenseringsgel. Den ble deretter underkastet elektroforese og analysert på en Perkin Eimer ABI Prism™ 377 DNA Sequencer i henhold til produsentens instruksjoner. Automatisert «base-calling» ved hjelp av Perkin Eimer ABI Prism™ Sequencing Analysis programvare resulterte i mer enn 99% nøyaktighet av DNA-sekvensbestemmelsen av det PCR amplifiserte 300 basepar-produktet.

Claims (20)

1. Termostabilt DNA polymerase-enzym, karakterisert ved at det omfatter aminosyresekvensen Ser Gin Ile Xaa Leu Arg Xaa (SEKV. ID. NR:1), hvor «Xaa» i posisjon 4 av denne sekvens er en hvilken som helst aminosyrerest, men ikke en glutaminsyrerest (Glu) og hvor «Xaa» i posisjon 7 av denne sekvens er en valinrest (Val) eller en isoleucinrest (Ile) som utviser redusert diskriminering mot inkorporering av et ukonvensjonelt nukleotid sammenlignet med en naturlig forekommende termostabil DNA-polymerase, hvor nevnte reduserte diskriminering er evnen til nevnte polymerase til å inkorporere et ukonvensjonelt nukleotid, relativt til evnen til nevnte korresponderende native form av polymerase til å inkorporere nevnte ukonvensjonelle nukleotid, er øket minst 20 ganger.

2. Termostabilt DNA polymerase-enzym, karakterisert ved at det er et rekombinant derivat av en naturlig forekommende termostabil DNA polymerase, hvor nevnte naturlig forekommende termostabile DNA polymerase omfatter aminosyresekvensmotivet Ser Gin Ile Glu Leu Arg Xaa (SEKV. ID. NR:2), . hvor «Xaa» i posisjon 7 av denne sekvens er en valinrest (Val) eller en isoleucinrest (Ile), hvor nevnte rekombinante derivat har blitt modifisert til å oppnå en aminosyre annen enn glutaminsyre (Glu) i posisjon 4 av nevnte motivsekvens, og hvor nevnte rekombinante derivat utviser redusert diskriminering mot inkorporering av et ukonvensjonelt nukleotid sammenlignet med nevnte naturlig forekommende termostabile DNA-polymerase, hvor nevnte reduserte diskriminering er kjennetegnet av at evnen til nevnte polymerase til å inkorporere et ukonvensjonelt nukleotid, relativt til evnen til nevnte korresponderende native form av polymerase til å inkorporere nevnte ukonvensjonelle nukleotid, er øket minst 20 ganger.

3. Termostabilt DNA polymerase-enzym ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at aminosyren i posisjon 4 er glycin (Gly).

4. Termostabil DNA polymerase ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at polymerasen har aktivitet for anvendelse i en DNA-sekvenseringsreaksjon ved å unngå anvendelse av dideoksynukleotider, nevnte reaksjon omfatter et ukonvensjonelt nukleotid, som fortrinnsvis er et ribonukleosid-trifosfat og et tilsvarende konvensjonelt nukleotid i et forhold på 1:1 eller mindre.

5. Termostabil DNA polymerase ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at polymerasen har aktivitet for anvendelse i en DNA-sekvenseringsreaksjon ved å unngå anvendelse av dideoksynukleotider, nevnte reaksjon omfatter et ukonvensjonelt nukleotid som er et ribonukleosid-trifosfat som forekommer i en konsentrasjon på mindre enn omtrent 100 u,M og et tilsvarende konvensjonelt nukleotid som forekommer i en konsentrasjon på mer enn omtrent 100 U.M.

6. Termostabilt DNA polymerase-enzym ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, karakterisert ved at det er et rekombinant derivat av et naturlig forekommende termostabilt DNA polymerase-enzym fra en organisme valgt fra gruppen bestående av Thermus aquaticus, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus- an Z05, Thermus- art sps17, Thermus thermophiius, Thermotoga maritima, Thermotoga neopolitana, Thermosipho africanus, Anaerocelium thermophilum, Baciltus caldotenax og Bacillus stearothermophiius.

7. Termostabilt DNA polymerase-enzym ifølge et hvilket som helst av kravene 2 til 5, karakterisert ved at det er et rekombinant derivat av en naturlig forekommende termostabil 7/rermus-art-DNA polymerase, fortrinnsvis Taq DNA polymerase eller en homolog polymerase derav, helst fortrinnsvis en termostabil DNA polymerase som omfatter aminosyresekvensen Leu Asp Tyr Ser Gin Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser (SEKV. ID. NR:5), mest fortrinnsvis en termostabil DNA-polymerase som har aminosyresekvensen av SEKV. ID. NR:8 og modifiserte former derav, slik som G46D og/eller F667Y mutante former.

8. Nukleinsyresekvens, karakterisert ved at den koder for et termostabilt DNA polymerase-enzym ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7.

9. Vektor, karakterisert ved at den omfatter en nukleinsyresekvens som koder for et termostabilt DNA polymerase-enzym ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7.

10. Vertscelle, karakterisert ved at den omfatter en nukleinsyresekvens som koder for et termostabilt DNA polymerase-enzym ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7.

11. Fremgangsmåte for fremstilling av et termostabilt DNA polymerase-enzym, karakterisert ved at den omfatter: (a) dyrkning av en vertscelle ifølge krav 10, under betingelser som fremmer ekspresjon av det termostabile DNA polymerase-enzym; og (b) isolering av det termostabile DNA polymerase-enzym fra vertscellen eller fra kulturmediet.

12. Termostabilt DNA polymerase-enzym, karakterisert ved at det fremstilles etter fremgangsmåten ifølge krav 11.

13. Anvendelse av et termostabilt DNA polymerase-enzym ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, i en nukleinsyre-amplifikasjon eller sekvenseringsreaksjon.

14. Blanding for anvendelse i en DNA-sekvenseringsreaksjon, karakterisert ved at den omfatter: et nukleinsyre-templat; en oligonukleotid-primer som er komplementær til nevnte templat; en termostabil DNA polymerase ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, en blanding av konvensjonelle dNTPs, og minst ett ukonvensjonelt nukleotid, hvor forholdet mellom nevnte ukonvensjonelle nukleotid og nevnte tilsvarende konvensjonelle nukleotid er 1:1 eller mindre.

15. Blanding ifølge krav 14, karakterisert ved at nevnte i il/AiMiAn^iAnallA ni Ar a+ ril^AAi kiiAr nai/nia nkAniil/l&A4i/l forekommer i en konsentrasjon på mindre enn omtrent 100 jllM og det tilsvarende konvensjonelle nukleotid forekommer i en konsentrasjon på mer enn omtrent 100 uM.

16. Blanding ifølge krav 15, ytterligere karakterisert ved at nevnte ukonvensjonelle nukleotid er umerket.

17. Fremgangsmåte for sekvensering av et nukleinsyre-mål, karakterisert ved at den omfatter trinnene: (a) frembringelse av et ukonvensjonelt nukleotid og et tilsvarende konvensjonelt nukleotid i en DNA-sekvenseringsreaksjon, hvor de nevnte ukonvensjonelle og tilsvarende konvensjonelle nukleotider forekommer i et forhold på mindre enn omtrent 1:1; (b) behandling av reaksjonen fra trinn (a) i nærvær av en termostabil DNA polymerase ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, under betingelser for primerekstensjon, for å tilveiebringe primerekstensjonsprodukter som omfatter nevnte ukonvensjonelle nukleotid; (c) behandling av primerekstensjonsproduktene fra trinn (b) under betingelser for å hydrolysere de nevnte primerekstensjonsproduktene; (d) spaltning av reaksjonsprodukter fra trinn (c); og (e) bestemmelse av sekvensen av nukleinsyre-målet.

18. Fremgangsmåte for sekvensering ifølge krav 17, karakterisert ved a t nevnte ukonvensjonelle nukleotid er et ribonukleotid, som fortrinnsvis forekommer i en konsentrasjon på omtrent 0,1 [iM -100 u.M.

19. Fremgangsmåte for sekvensering ifølge krav 17, karakterisert ved a t nevnte tilsvarende konvensjonelle nukleotid forekommer i en konsentrasjon på omtrent 50 u.M - 500 u,M.

20. Testsett for sekvensering av en nukleinsyre, karakterisert ved at det omfatter en termostabil DNA polymerase ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, og eventuelt ytterligere reagenser som er egnet for slik sekvensering, som f.eks. én eller flere oligonukleotidprimere, en blanding av konvensjonelle dNTPs, og minst ett ukonvensjonelt nukleotid, hvor forholdet mellom nevnte ukonvensjonelle nukleotid og nevnte tilsvarende konvensjonelle nukleotid fortrinnsvis er mindre enn én.