KR101283629B1 - Ｃｄ３ｚ 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 자가면역질환 진단용 조성물 및 이를 이용한 자가면역질환 진단방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 CD3Z 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 자가면역질환 진단용 조성물, 이를 이용한 진단방법 및 키트에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 CD3Z 유전자 또는 추가적으로 ADA, VHL 유전자의 메틸화 여부에 따라 자가면역질환을 진단하는 조성물 및 상기 메틸화 수준을 측정하여 자가면역질환을 진단하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 ADA, VHL 또는 CD3Z 유전자 중 하나 이상의 메틸화는 자가면역질환에서 특이적으로 나타나므로, 본 발명의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물은 자가면역질환의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＣＤ３Ｚ 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 자가면역질환 진단용 조성물 및 이를 이용한 자가면역질환 진단방법 {Composition for diagnosing autoimmune disease comprising an agent for determining level of methylation of CD3Z gene and a method for diagnosing autoimmune disease using the same}

본 발명은 CD3Z 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 자가면역질환 진단용 조성물, 이를 이용한 진단방법 및 키트에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 CD3Z, 또는 ADA, VHL 및 CD3Z 중 하나 이상의 유전자의 메틸화 여부에 따라 자가면역질환을 진단하는 조성물 및 상기 메틸화 수준을 측정하여 자가면역질환을 진단하는 방법에 관한 것이다.

자가면역질환은 체내의 면역체계가 정상적이고 건강한 조직이나 기관 또는 기타 체내 성분 등을 공격하게 되는 질환을 의미한다. 다수의 자가면역 질병은 인체의 면역이상 반응으로부터 기인하며 자가 파괴를 유발한다. 유명한 예는 류마티스 관절염 (RA), 전신경화증 (SSC), 전신홍반루푸스 (SLE), 경피증, 다발근육염, 피부근육염, 아나필락시스 자반증, 쇼그렌 증후군 등을 포함한다. 원발 쓸개관 간경화증 (PBC), 만성 활성 간염, 및 하시모토 갑상선염과 같은 기타 질병은 모두 자가면역 질병과 관련된다.

류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis, RA)은 관절을 포함한 전신에 만성 염증을 일으키는 자가 면역성 질환으로, 남성보다 여성에게 더 많이 발병하고 있고, 그 원인에 대해서는 아직까지 명확하게 밝혀진 것이 없으며, 다만 유전적 요인과 환경적 요인 등에 의해 유발되는 것으로 추측되고 있을 뿐이다. 따라서 류마티스 관절염의 발병원인을 밝히기 위한 많은 연구들이 진행되고 있으며, 최근 들어 유전적인 인자가 류마티스 관절염의 진단에 중요한 역할을 하며, 전반적인 면역 반응에 걸친 후생유전적 (epigenetic) 제어의 불균형이 류마티스 관절염을 포함한 자가면역 질환을 일으킨다는 내용이 보고된 바 있다. 현재까지 류마티스 관절염에 대한 진단은 미국 류마티스 학회의 진단 기준을 따르고 있으며 객관적인 지표로서의 류마티스 인자의 존재는 그 양성율이 3개월 이내에서 33%, 12개월 이상에 있어서도 88% 정도일 뿐, 확실하게 진단하는 데는 이르지 못하고 있다.

전신경화증 (systemic sclerosis, SSC)은 흔히 경피증으로 불리는 질환으로, 작은 혈관의 기능적, 구조적 이상, 피부와 내부 장기의 섬유화, 면역 체계 활성화, 그리고 자가면역성을 특징으로 한다. 전신경화증의 진단은 미국 류마티스 학회에서 정한 분류 기준인 1) 몸통 가까운 쪽의 경피증: 손바닥 또는 발바닥 관절보다 몸통 가까운 쪽 피부의 대칭적인 두꺼워짐, 긴장, 경화가 나타나며, 이 변화는 얼굴, 목, 흉부, 복부를 침범할 수 있음, 2) 손발가락의 경화증, 3) 손가락의 오목한 흉터 또는 손가락 지문 부위의 조직이 사라짐, 4) 양측 폐 아래쪽의 폐섬유증을 이용하여 진단한다.

전신홍반루푸스 (systemic lupus erythematosus, SLE)는 관절, 신장, 점막, 및 혈관벽에 연관된 만성적인 염증성 결체 조직 질환이며, 잠재적으로 치명적인 질환이다. 상기 질환은 줄여서 루푸스라고도 지칭된다. 관절, 신경 시스템, 혈액, 피부, 신장, 위장기관 및 다른 곳에서 증상과 증후가 발견될 수 있다. 루푸스 환자의 약 70-90%는 10대 후반에서 30대인 젊은 여성들이지만, 어린이들 (대부분 소녀들) 및 나이든 남, 녀 또한 발생될 수 있다. 루푸스는 전세계에 걸쳐 발생하나 흑인 및 아시아인들 사이에 더 일반적이다.

루푸스의 원인은 명백하지 않다. 하이드랄라진 (hydralazine) 및 프로캐인아미드 (procainamide) 그리고 이소니아지드 (isoniazid)와 같은 특정 약의 사용은 루푸스의 원인이 될 수 있으나, 약으로 인해 유도된 루푸스는 대개 약 복용을 중단하면 사라진다. 루푸스의 증상은 개개인마다 크게 차이가 있다. 증상은 열과 함께 갑자기 시작될 수도 있다. 증상은 몇 달 또는 몇 년을 거쳐 점차적으로 플레어 업 (flare-up), 신경정신 증상, 또는 루푸스와 연관된 여러 종류의 증상과 함께 발전될 수 있다.

루푸스는 종종 몇 년간 지속되는 증상이 없는 시기와 함께, 만성적이고 재발하는 경향이 있다. 플레어 업은 햇볕에 노출되거나, 감염, 수술, 또는 임신에 의해서 유발될 수 있다. 플레어 업은 폐경기 이후에 종종 발생한다. 6년간의 전향적 코호트 연구 (prospective cohort study)에서, 병의 발생은 환자당 일년에 0.2의 비율로 발생했다. 루푸스의 진행은 예측이 불가능하기 때문에, 예후가 아주 다양하다. 코호트 연구는 진단 후 7년 이내의 환자 중 61%가 임상적으로 탐지될 만한 장기 손상, 신경정신병학 (20.5%), 근골격계 (18.5), 및 신장 (15.5%)의 장기 시스템 대부분이 공통적으로 영향을 받았음을 발견했다. 그러나 초기 감염이 제어되면, 장기적인 예후는 좋다. 심혈관, 신장, 폐, 및 중추신경계의 감염 및 활동성 질환은 SLE를 가진 환자에서 가장 흔한 사망원인이다. 신장 손상의 초기 발견 및 치료는 심한 신장 질환의 발생을 감소시킨다. SLE의 정확한 진단은 특히 루푸스 신장염으로부터, 질병률 (morbidity) 및 사망률 (mortality)을 낮출 수 있기 때문에 중요하다. 그러나 현재까지 어느 한가지의 진단 마커로 상기 질환을 확진하지는 못한다. 대신에, 임상적 및 실험적 기준의 결합을 통해 확인하는 방법밖에 없는 실정이다. 실험적 기준은 ACR (American College of Rheumatology)에 의해 제시된 것이 가장 널리 사용되고 있다. 항핵항체 (antinuclear antibody, 이하 ANA)의 역가가 1:40 또는 그 이상까지의 상승은 ACR 진단 기준 중 가장 민감한 것이다. 환자 중 상당 수가 질환의 초기에 음성인 ANA 역가를 가질 수 있음에도 불구하고, SLE를 가진 환자의 99퍼센트 이상이 어떤 지점에서 상승된 ANA 역가를 가진다. 그러나, ANA 역가는 SLE 특이적인 것은 아니다. 15개의 국제적인 실험실들이 관계한 연구에서 일반 인구 중 ANA 테스트에서 1: 40 희석 시 32%가 양성이었고 1:160 희석 시 5% 가 양성이었다. 1:40 또는 그 이상의 ANA 역가는 어린이들에서 높은 ANA 역가 때문에 단지 10 퍼센트의 양성의 예상 값을 가진다.

SLE의 부재시에, ANA 테스트 양성의 가장 흔한 이유는 다른 연관된 결체조직 질환의 존재이다. 종종 ANA 테스트 양성과 관련된 다른 질환은 Sjogren's 신드롬, 경피증 (scleroderma), 류마티스 관절염, 및 소아 류마티스 관절염을 포함한다. ANA 테스트는 또한 섬유근육통을 가진 환자에서 양성일 수 있다. SLE외에 다른 질병을 가진 환자에서, ANA 역가는 낮고, 면역형광 패턴이 다르다. ANA 테스트 양성의 비율은 인구에서 SLE의 유병률 (prevalence)에 의해 영향을 받는다.

이중나선 DNA 항원 (anti-dsDNA)에 대한 항체 및 Sm 핵 항원 (anti-Sm)에 대한 항체 테스트는 ANA 테스트에서 양성이나 SLE의 진단에 대한 모든 기준에 부합하지 않는 환자들에게서 효과적일 수도 있다. 항-dsDNA 및 항-Sm의 민감성이 낮음에도 불구하고, 특히 높은 역가에서 항-dsDNA 및 항-Sm는 SLE에 대해 높은 특이성을 가진다. 그러므로, 양성 결과는 질환 진단을 증명하는데 도움이 되고, 반면 음성 결과는 질환에 대해 제외할 수 있다.

최근 들어, 많은 질환의 병인학에서 후생유전학적 변형의 역할을 증명하는 연구결과가 보고되고 있다. 예를 들어, 종양 억제 유전자의 CpG 섬의 과메틸화 및 이에 따른 전사적 침묵은 암에서 악성으로의 전환과 관련이 있다. 잘 알려진 후생유전학적 결함을 가진 다른 질환은 ICF (Imunodeficiency, Centromeric region instability, and Facial anomalies) 신드롬, Prader-Willi 및 Beckwith-Wiedemann 신드롬, 그리고 Rett 신드롬을 포함한다. 사실상, 질환의 나이 의존성 및 분량적 성향, 및 질환으로 변하는 유전적 경향을 매개하는 메커니즘을 포함하여, 후생유적학적 구성은 많은 질환의 여러 가지 특성들을 설명할 수 있다. 게다가, 최근에 후생유전학적 변형은 한 개인의 평생을 걸쳐 점차적으로 축적된다는 것을 발견하였다. 실제로 유전적으로 동일한 일란성 쌍둥이에서 후생유전학적 변형을 비교한 결과 식습관, 라이프스타일을 포함하는 환경적인 요소가 후생유전학 프로파일 변화에 의해 표현형에 유의미하게 기여한다는 것이 보고되고 있다. 민감성을 매개하는 개개의 후생유전학적 특수성은 유전의 패턴에서 복잡성을 설명할 수 있다.

SLE에 대해 잘 알려진 유전학적 민감성 이외에도, 활동성 루푸스를 가진 환자에서 T세포의 광범위하게 저메틸화된 (hypomethylated) DNA에 대한 보고에 의해 후생유전학적 요소가 최근에 주목을 받고 있다. SLE의 발달에서 DNA 메틸화 양상의 비정상적인 변화가 중요한 역할을 한다는 첫 번째 증거는 활동성 루푸스를 가진 환자의 T 세포가 광범위하게 저메틸화된 DNA를 보인다는 것에서 찾을 수 있었다. 더 최근의 연구는 SLE에서 DNA 저메틸화를 설명할 수 있는 가능한 메커니즘을 내포하는, DNA 과메틸화와 DNMTs의 효소적 활성의 감소 사이의 관계를 증명했다. SLE의 발달에서 메틸화 변화의 추가적인 역할은 DNA 탈메틸화 약에 대한 연구로부터 시작됐다. 마우스에서 SLE를 유도하기 위해 사용되는 가장 흔한 탈메틸화 약 중 하나는 5-azacytidine인데, 이는 피리미딘 고리 5번째 탄소가 질소 원자로 변환된 사이토신 유도체로 새롭게 합성된 DNA에 사이토신 대신 사용된다. 5-azacytidine을 사용한 치료는 게놈전체 저메틸화를 일으키고, 많은 유전자의 변형된 발현을 초래한다. SLE를 유도하기 위해 사용되는 다른 탈메틸화 약은 프로캐인아미드, 경쟁적인 DNMT 억제제, 및 하이드날라진으로, 이의 탈메틸화 활성은 ERK 신호 경로 억제의 간접적인 결과로부터 설명되었으며, 유사분열 동안 DNMT1 및 DNMT3 수치가 감소했다. 모든 경우에서, T 세포를 탈메틸화 약에 노출하는 것은 루푸스 유사 질환의 탈메틸화-의존적 유도를 초래하는 것으로 보고되고 있다.

SLE에서 DNA 메틸화 변화를 통해 발현이 변화되는 유전자를 확인하는 것은 질환의 경로에 대해 알 수 있게 한다. 최근에, SLE에서 여러 가지 유전자의 특이적 프로모터의 탈메틸화가 유전자의 비정상적 과발현에 기여한다는 것이 알려졌다. 이러한 비정상적인 변화는 퍼포린 (Kaplan MJ, et al., Demethylation of promoter regulatory elements contributes to perforin overexpression in CD4+ lupus T cells. J Immunol. 172(6):3652-61.(2004))과 같은 유전자에서 발생하는데, 이 유전자의 탈메틸화는 단핵세포 사멸에 기여할 수도 있다. CD70 또한 탈메틸화에 의해서 CD4+ 루푸스 T 세포에서 과발현되었다 (Lu, Q.et al., Demethylation of ITGAL (CD11a) regulatory sequences in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 46: 1282-1291. (2002). 이 경우에, CD70 과발현은 루푸스에서 B 세포 자극에 과도한 기여를 한다. 다른 예는 ITGAL 조절 서열의 탈메틸화인데, 이는 또한 루푸스의 발생에 기여할 수 있다. 또한 최근 일란성 쌍둥이 중 한명만 SLE 환자인 쌍둥이들을 대상으로 한 메틸화 어레이 연구에서 여러 가지 유전자의 프로모터 탈메틸화가 SLE의 발생 혹은 진행과 관련이 있다는 것이 보고되었다 (Javierre BM. et al., Changes in the pattern of DNA methylation associate with twin discordance in systemic lupus erythematosus. Genome Res. Feb;20(2):170-9. (2010) Epub 2009 Dec 22.). 이러한 연구결과는 후생유전학적 변화가 자가면역질환의 임상적 징후에서 중요한 역할을 할 수도 있다는 것을 의미한다.

그러나 저메틸화와 SLE 사이의 관계가 비교적 많이 보고된 것과는 대조적으로, SLE를 포함한 자가면역질환에서 과메틸화에 대한 보고는 거의 없었으며, 메틸화의 변화가 SLE를 포함한 자가면역 질환에서 어느정도 중요한 지를 알 수 있는 환자 대조군 연구도 거의 없는 실정이다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 자가면역질환에 특이적인 DNA 마커를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, CD3Z, ADL, VHL 유전자에서 자가면역질환 특이적인 메틸화 경향을 보이는 것을 확인하고, 이러한 메틸화 수준의 측정을 통해 자가면역질환을 진단할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 CD3Z (CD3 zeta, NCBI GenBank Accession No. NM_198053.2) 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 자가면역질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 자가면역질환이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 CD3Z (CD3 zeta, NCBI GenBank Accession No. NM_198053.2) 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 정상 대조군 시료의 해당 유전자의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 자가면역질환의 진단을 위하여 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 자가면역질환 진단용 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 CD3Z (CD3 zeta, NCBI GenBank Accession No. NM_198053.2) 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 자가면역질환 진단용 조성물에 관한 것이다.

CD3Z 유전자 단독의 메틸화 수준을 측정하여 자가면역질환을 진단할 수도 있으나, 바람직하게는 ADA (Adenosine deaminase, NCBI GenBank Accession No. NM_000022.2) 또는 VHL (von hippel lindau, NCBI GenBank Accession No. NM_198156.1) 유전자의 메틸화 수준을 추가로 측정하여 자가면역질환을 진단할 수 있다. 즉, 1) CD3Z, 2) CD3Z, ADA, 3) CD3Z, VHL, 또는 4) CD3Z, ADA, VHL 유전자의 메틸화 수준을 측정하여 자가면역질환의 진단을 할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 정상 대조군보다 류마티스 관절염, 전신홍반루푸스 또는 전신경화증에서 CD3Z, ADA, VHL 유전자의 과메틸화가 되는 것을 확인하였다 (도 4).

본 발명에서 용어, "CD3Z (CD3 zeta, NCBI GenBank Accession No. NM_190853.2)"는 CD247로 알려진 유전자이다. 이는 여러 세포내 신호-전달 경로의 커플링 항원의 인식에서 중요한 역할을 하는 것으로, 항원의 낮은 발현은 손상된 면역반응을 나타내는 것으로 알려져 있다. CD3Z의 단백질 산물인 TCRζ의 발현이 SLE 환자의 T 세포에서 감소되어 있다는 것은 이미 보고되어 잘 알려져 있다. 또 다른 자가면역질환인 류마티스 관절염 (RA)의 동물모델 중 하나인 SKG 생쥐에서 TCRζ와 연관되어 있는 단백질인 PTK ZAP70 단백질의 C-말단 SH2 (SRC homology) 도메인에 돌연변이가 발견되어 RA 발생 혹은 진행에서도 TCRζ의 신호 전달이 관여할 것으로 알려지게 되었다 (Sakaguchi, N. et al., Altered thymic T-cell selection due to a mutation of the Zap-70 gene causes autoimmune arthritis in mice. Nature 426, 454-460 (2003)). ZAP70 돌연변이는 다른 RA 동물모델이나 RA 환자에서는 발견되지 않았지만, RA 환자의 T 림프구 세포에서 TCRζ의 발현이 감소되어 있다는 것은 보고되었다 (Romagnoli P, et al., A potential role for protein tyrosine kinase p56(lck) in rheumatoid arthritis synovial fluid T lymphocyte hyporesponsiveness. Int Immunol. Mar;13(3):305-12 (2001). 자가면역질환 이외에도 암환자의 T 림프구 세포에서 TCRζ의 발현 감소가 보고되었다. TCRζ의 발현이 감소하면 T 세포의 기능이상을 일으켜서 암세포에 대한 환자의 면역 감시 (immune surveillance)를 회피하는 것으로 여겨진다. 이러한 설명을 하는 것은 암세포가 분비하는 인자들은 환자의 면역을 억제하는데, TCRζ의 발현감소와 T세포의 기능이상이 동시에 발견된다는 것이 그 근거이다 (Dworacki, G. et al., Decreased ζ chain expression and apoptosis in CD3+ peripheral blood T lymphocytes of patients with melanoma. Clin. Cancer Res. 7, 947S-957S (2001)). AIDS와 나병 (leprosy)과 같은 감염성 질환에서도 TCRζ의 발현감소가 보고되었는데, 이러한 TCRζ의 발현감소는 ζ와 결합하지 못한 TCR들이 세포표면으로 이동하지 못하고 리소좀 분해가 일어남으로써 T세포의 기능을 감소시키는 것으로 여겨지고 있다 (Alarcon, B. et al., Initiation of TCR signaling: regulation within CD3 dimers. Immunol. Rev. 191, 38-46 (2003)). 일부 암 환자나 SLE 환자에서는 FceRg 가 ζ대신 TCR과 결합하여 세포표면으로 이동할 수 있다는 보고가 있지만, 이런 T세포가 기능에 결함이 있다는 것이 보고되어 있다 (Mizoguchi, H. et al., Alterations in signal transduction molecules in T lymphocytes from tumor-bearing mice. Science 258, 1795-1798 (1992); Tsokos, G. C., et al., Rewiring the T-cell: signaling defects and novel prospects for the treatment of SLE. Trends Immunol. 24, 259-263 (2003)).

이상과 같이 TCRζ의 발현감소가 자가면역질환을 포함한 여러 질환에서 보고되어 있고 또한 T세포의 기능저하와 밀접하게 관련되어 있어서 자가면역질환의 치료를 위한 연구를 위해 TCRζ 발현이 감소하는 기전에 대해서도 많은 연구가 진행되었다. 암을 가진 생쥐에서의 결과에서는 대식세포 (macrophage)의 분비물이 ζ chain의 발현을 감소시키고, T 세포의 기능도 감소시킨다는 보고가 있는데 이는 대식세포를 포함한 염증세포에서 분비된 cytokine들이 T 세포의 TCRζ 발현을 감소시키는 것을 의미한다 (Otsuji et al., Oxidative stress by tumor-derived macrophages suppresses the expression of CD3 chain of T-cell receptor complex and antigen-specific T-cell responses. Proc. Natl Acad. Sci. USA 93, 13119-13124 (1996)). 사이토카인 중에서도 IFN-g와 TNF에 의한 ζ chain 발현 감소에 중요한 역할을 할 것이라는 것도 보고되었다 (Bronstein-Sitton et al., Sustained exposure to bacterial antigen induces interferon-g-dependent T cell receptor ζ down-regulation and impaired T cell function. Nature Immunol. 4, 957-964 (2003)).

또 다른 기전으로 MSC (myeloid suppressor cell) 혹은 대식세포가 분비하는 arginase-1에 의한 아르기닌을 분해하여 T세포의 TCRζ의 발현을 감소시킨다는 것이 보고되었다 (Rodriguez P. C. et al., L-Arginine consumption by macrophages modulates the expression of CD3 z chain in T lymphocytes. J. Immunol. 171, 1232-1239 (2003)). 아르기닌은 T세포의 증식과 면역기능에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며 (Serafini et al., Derangement of immune responses by myeloid suppressor cells. Cancer Immunol. Immunother. 53, 6472 (2004), Goni, O. et al., Immunosuppression during acute Trypanosoma cruzi infection: involvement of Ly6G+(Gr1+)CD11b+ immature myeloid suppressor cells. Int. Immunol. 14, 1125-1134 (2002)), 대식세포와 MSC는 암의 성장, 이식편대 숙주반응 그리고 감염성 질환과 같이 염증이 발생할 때 병변부위로 이동한다. 그런데 이들 세포가 arginase-1을 분비하여 아르기닌을 분해함으로써 아르기닌을 감소시키는데, 이로 인해 TCRζ chain의 발현이 감소되고 T 세포의 기능이 감소하는 것으로 생각된다.

또한 사이토카인들에 의해 영향을 받은 T 세포에서 TCRζ chain 발현이 어떻게 감소하는 지에 대해서도 연구가 진행되었다. 사이토카인에 영향을 받으면 T 세포 내 CD3Z mRNA의 양에는 변화가 없지만, TCRζ의 리소좀 분해가 활발하게 진행되어 양이 줄어든다는 보고와, TCRζ chain이 캐스파제-3와 같은 프로테아제의 기질로서 활성화된 T 세포의 캐스파제-3활성이 증가하면 TCRζ chain의 양이 줄어든다는 보고 등이 있다 (Takahashi, A. et al., Elevated caspase-3 activity in peripheral blood T cells coexists with increased degree of T-cell apoptosis and down-regulation of TCRζ molecules in patients with gastric cancer. Clin. Cancer Res. 7, 74-80 (2001)). 또한 이러한 번역후 수준 (posttranslational level)에서의 단백질 양의 감소 이외에 SLE 환자에서는 전사 수준의 변화에 의해서도 TCRζ의 발현에 변화가 올 수 있다는 보고도 있다 (Tsokos, G. C. et al., Activation of the Ets transcription factor Elf-1 requires phosphorylation and glycosylation: defective expression of activated Elf-1 is involved in the decreased TCRζ chain gene expression in patients with systemic lupus erythematosus. Ann. NY Acad. Sci. 987, 240-245 (2003)).

이와 같이 TCRζ의 발현 감소 기전에 대해 많은 연구가 되어 있으나, CD3Z유전자 프로모터의 CpG 섬 과메틸화 (CpG island hypermethylation)의 변화에 의해 일어났을 가능성에 대해서는 거의 보고되지 않았다. 더구나 CD3Z 유전자 프로모터의 CpG 섬 메틸화의 변화가 자가면역질환의 전혈세포에서 분리한 DNA에서 변화되어 있을 것이라는 보고는 아직까지 없었다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, SLE환자의 전혈세포에서 분리한 DNA를 사용하여 CD3Z 프로모터의 메틸화가 대조군에 비하여 현저히 증가되어 있다는 것을 확인하였으며, 이에 따라 본 발명자들은 CD3Z 프로모터의 메틸화가 SLE를 포함한 자가면역질환의 예측 마커 혹은 진단 마커가 될 수 있음을 새롭게 제시하였다. 특히 SLE환자와 대조군 각각 100여명을 한 군으로 만든 후 중앙값에 해당하는 CD3Z 프로모터 CpG 섬 메틸화 수준을 컷오프 (cutoff)로 가정하여 각 질환의 이환 OR을 구하여, SLE는 29.78이었고, RA가 20.86 정도인 것을 확인하여 (표 2), CD3Z 메틸화의 변화를 SLE를 포함한 자가면역질환의 예측 마커 혹은 진단 마커로 유용하게 사용할 수 있을 것임을 최초로 제시하였다. 이와 같이, 본 발명에서 밝힌 CD3Z 유전자의 메틸화 수준을 측정할 경우, 자가면역질환의 예측 마커 또는 진단마커로 사용될 수 있는 가능성 및 이의 확인은 본 발명자들에 의해 최초로 규명된 것이다.

본 발명에서 용어, "ADA (Adenosine deaminase, NCBI GenBank Accession No. NM_000022.2)"는 두종류의 isoenzyme (ADA1, ADA2)이 존재하는데, 혈청 ADA는 약 80%가 ADA2로 림프구, 단핵구에서 유래하는 것으로 이해하고 있다. 급성 간염에서는 발병 초기에 ADA1, 회복기에 ADA2가 증가한다. 만성간염에서도 활성이 증가하는데 간경변에서는 더욱 증가한다. 백혈병에서는 ADA1이 증가하지만 T세포성 백혈병에서는 ADA2가 증가한다. 전염성단핵구증, 풍진, 결핵에서도 활성이 증가하는데, 이들은 T세포계 림프구에서 유래하는 것이다. 신생아의 ADA 활성은 성인과 같고, 유아기는 성인의 1.5-2배이나 그 후 점차 감소하며, 검체가 용혈되면 ADA가 증가하며, 항응고제의 영향을 받지 않는 특성을 갖는다. ADA 활성이 SLE환자 혈청에서 증가하였고 두가지 isoenzyme 중 ADA2가 주로 증가되어있다고 보고된 바가 있으나 ADA 프로모터의 과메틸화와 자가면역질환과의 관련성은 현재까지 개시된 바가 없으며, 본 발명자들은 ADA의 과메틸화가 SLE를 포함한 자가면역질환과 관련되어 있다는 것을 최초로 규명하였다.

본 발명에서 용어, "VHL (Von Hippel Lindau, NCBI GenBank Accession No. NM_198156.1)"은 종양을 억제하는 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 유전자로, Von Hippel Lindau 병은 상염색체 우성으로 유전하며, VHL유전자의 배선 돌연변이 (germline mutation)의 결과로 발생한다. VHL유전자의 배선 돌연변이는 중추신경계와 내장기관의 여러 장기에 양성 및 악성 종양을 초래하는데, 이들 종양으로는 소뇌, 척수, 뇌간 및 망막의 혈관모세포종, 신세포암, 갈색세포종 및 췌도종양 등이 있다. 그러나, VHL과 자가면역질환과의 관련성은 현재까지 제시된 바가 없으며, 본 발명자들은 VHL의 과메틸화가 자가면역질환과 관련되어 있다는 것을 최초로 규명하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 메틸화 여부를 조사하기 위해 Illumina HumanMethylation27 BeadChip을 이용하여 메틸화 여부를 분석하였다. 그 결과 CD3Z, ADA, VHL 유전자가 자가면역질환에서 유의한 메틸화 수치를 보임을 확인하였다. 이에 높은 메틸화를 관찰할 수 있었던 CD3Z, ADA 및 VHL 유전자의 메틸화의 정량적 측정을 위해, 바이설파이트에 의해 변형된 염기서열을 증폭한 후 단일염기확장법 (MSBE, methylation-specific single base extension)을 수행하여서, 대조군보다 높은 프로모터 CpG 섬 메틸화를 관찰할 수 있었다 (도 2 내지 4). CD3Z 유전자의 경우 메틸화에 의해 TCRζ 발현의 조절저하를 관찰할 수 있었으며 (도 8), CD3Z, ADA 및 VHL 유전자의 경우 탈메틸화 시약인 5-AzadC를 폐암 세포주에 처리한 결과 감소하였던 CD3Z, ADA 및 VHL 발현이 증가함을 관찰할 수 있었다 (도 7A 내지 C). 이와 같은 결과는 CD3Z, ADA 및 VHL 유전자의 메틸화가 자가면역질환의 진단에 유용한 마커로 이용될 수 있음을 시사하는 것이다.

본 발명에서 용어, "메틸화"는 염기에 메틸기가 붙어 유전자 발현양상이 변하는 것을 말한다. 본 발명의 목적상 메틸화는 CD3Z 유전자, 또는 CD3Z, 및 ADA 또는 VHL 중 하나 이상의 유전자에서 일어나는 것을 포함한다. 본 발명의 메틸화는 구체적으로 ADA, VHL 또는 CD3Z 중 하나 이상의 유전자의 염기서열에 C와 G의 염기들이 연속해서 존재하는 CpG가 밀집되어 있는 CpG섬의 사이토신에서 일어나는 것을 포함하고, 그로 인하여 전사인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자의 발현이 차단되는 것을 포함한다.

본 발명에서 용어, "메틸화 수준의 측정"은 핵산서열의 메틸화 정도를 측정하는 것으로서, 본 발명의 목적상 CD3Z 유전자, 또는 CD3Z, 및 ADA 또는 VHL 중 하나 이상의 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미한다. 상기 메틸화 수준의 측정은 당업계의 메틸화 수준을 측정하는 공지의 방법을 제한 없이 사용가능하나, 그 예로 Illumina HumanMethylation27 BeadChip, Goldengate Methylation Cancer Panel Ⅰ 마이크로어레이, EpiTYPER^TM분석, 메틸화 특이적인 단일염기확장법 (MSBE, methylation-specific single base extension), 또는 메틸화 특이적인 PCR (methylation-specific polymerase chain reaction)이나 자동염기분석 등의 방법으로 검사할 수 있다. 정상 대조군 혈액에서는 ADA, VHL 또는 CD3Z 유전자에 메틸화 상태가 나타나지 않으나, 자가면역질환 환자의 혈액에서는 ADA, VHL 또는 CD3Z 유전자에서의 메틸화가 특이적으로 나타나는 것을 통해서, ADA, VHL 또는 CD3Z 유전자의 메틸화 여부에 따라 자가면역질환 여부를 진단할 수 있다.

바람직하게 CD3Z 유전자의 메틸화 수준 측정은 상기 유전자 프로모터의 CpG 섬의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 자가면역질환 진단용 조성물일 수 있다. 더욱 바람직하게는 ADA 또는 VHL 유전자 프로모터의 CpG 섬의 메틸화 수준을 추가로 측정하는 제제를 포함하는 조성물일 수 있다.

본 발명에서 용어, "CpG 섬 (CpG island)"은 CpG가 예외적으로 높은 빈도로 모여 있는 게놈 영역을 의미하며, C+G 함유량이 50%이상이고, CpG 비율이 3.75%이상인 0.2~3kb 길이의 부위를 말한다. 상기 CpG에서, C는 사이토신을, G는 구아닌을 나타내며 p는 사이토신과 구아닌과의 사이에 있는 포스포디에스테르 결합을 의미한다. 인간 게놈에는 약 45,000개의 CpG 섬이 있으며, 이들 대부분이 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위에서 발견된다. 실제로, 상기 CpG 섬은 인간 유전자의 약 50%에 달하는 하우스키핑 (housekeeping) 유전자의 프로모터에서 발견된다. 정상인의 체세포에서, 상기 하우스키핑 유전자 프로모터 부위의 CpG 섬은 비메틸화되어 있으며, 임프린티드 (imprinted) 유전자 및 비활성화 상태의 X 염색체 상의 유전자와 같이 발달과정 동안 발현되지 않는 유전자들은 메틸화되어 있다. 포유동물 세포의 게놈 DNA에서는 A, C, G 및 T에 더하여, 사이토신 링 (5-mC)의 다섯번째 탄소에 메틸 그룹이 부착된 5-메틸사이토신 (5-methylcytosine)이라는 5번째 염기가 존재한다. 5-mC는 CpG라고 불리는, CG 디뉴클레오티드 (5'-mCG-3')의 C에만 부착된다. CpG의 C는 메틸 그룹의 접촉에 의하여 대부분 메틸화된다. CpG의 메틸화는 트랜스포존과 게놈의 반복서열이 발현되는 것을 억제한다. 또한, 상기 CpG는 포유동물 세포에서 대부분의 후생유전학적 변화가 자주 일어나는 부위이다. 상기 CpG의 5-mC가 자연적으로 탈아미노화하여 티민 (T)이 되기 쉽기 때문이다. 본 발명의 목적상 상기 CD3Z 유전자의 프로모터 내의 CpG가 과메틸화 되어 있을 경우, 자가면역질환자라고 판단할 수 있다. 또한, 추가로 ADA 또는 VHL 유전자의 프로모터 내의 CpG가 과메틸화 되어 있을 경우, 더욱 정확히 자가면역질환자라고 판단할 수 있다.

본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 위미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 자가면역질환의 발병 여부를 확인하는 것이다.

본 발명의 진단 대상이 되는 자가면역질환은 인체의 면역이상 반응으로부터 기인하며 자가 파괴를 유발하는 질환을 의미하며, 이에 제한되는 것은 아니나, 그 예로 전신홍반루푸스 (SLE), 류마티스 관절염 (RA), 경피증, 전신경화증 (SSC), 다발근육염, 피부근육염, 아나필락시스 자색반증, 쇼그렌 증후군 등을 포함한다. 바람직하게는 류마티스 관절염, 전신홍반루푸스 또는 전신경화증일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 전신홍반루푸스일 수 있다.

본 발명에서, 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제는 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한 효소, 상기 유전자의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머 및 비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제는 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 화합물, 상기 유전자의 변형된 서열에 특이적인 프라이머 쌍 및 확장 프라이머 (extension primer)를 포함할 수 있다.

상기 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트 (bisulfite)일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 소듐 바이설파이트이다. 이러한 바이설파이트를 이용하여 비메틸화된 사이토신 잔기를 변형시켜 프로모터의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.

또한, 상기 메틸화 민감성 제한효소는 CpG 섬의 메틸화를 특이적으로 검출할 수 있는 제한효소로서, 바람직하게는 제한효소의 인식부위로 CG를 함유하는 제한효소이다. 예를 들면, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 상기 제한효소 인식부위의 C에서의 메틸화 또는 비메틸화에 따라 제한효소에 의한 절단 여부가 달라지고 이를 PCR 또는 서던블롯 (Southern Blot) 분석을 통해 검출할 수 있게 된다. 상기 제한효소 이외의 다른 메틸화 민감성 제한효소는 당업계에 잘 알려져 있다.

또한 CpG 섬의 메틸화를 정량적으로 검출할 수 있는 방법으로 파이로시퀀싱 (pyrosequencing)과 메틸라이트 (methyl light) 등의 방법이 당업계에 잘 알려져 있다. 파이로시퀀싱은 바이설파이트로 처리한 변형된 지놈 DNA를 서열에 특이한 프라이머를 사용하여 PCR증폭한 후 염기서열을 결정하는 방법인데, 이때 메틸화된 사이토신과 메틸화되지 않은 사이토신이 변형되어 티민으로 바뀐 염기의 상대적인 양을 비교적 정확히 측정할 수 있는 방법이다. 파이로시퀀싱은 일반적인 Sanger방법에 의한 염기서열결정 방법과는 달리 DNA 합성과정에서 방출되는 파이로포스페이트 (pyrophosphate)의 양을 측정하는 방법인데, Sanger방법을 응용하여 형광으로 표지한 didexoynucleotide terminator에 비하여 훨씬 정량적이라서 메틸화의 정량적인 측정에 응용하고 있다. 메틸라이트방법은 변형된 게놈 DNA에서 특이서열을 증폭하는 과정에서 메틸화된 사이토신으로 이루어진 서열만을 증폭하도록 프라이머를 고안하고 이 프라이머에 형광 등을 표지하여 PCR 증폭을 검출할 수 있게 한 방법이다. CpG 섬의 메틸화를 정량적으로 검출할 수 있는 방법으로는 이 두가지 방법에 국한되지 않으며 게놈 DNA를 바이설파이트 변형 후 특이서열을 PCR로 증폭하고 증폭된 서열에서 티민으로 변형된 서열과 메틸화되어 있어서 변형되지 않은 서열을 제한효소로 구별하거나 MALDI-TOF MS 방법으로 질량을 측정함으로써 상대적인 양을 측정하는 방법들이 또한 당업계에 잘 알려져 있다.

따라서, 본 발명의 제제는 자가면역질환이 의심되는 환자의 ADA, VHL 또는 CD3Z 유전자의 메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머 및 비메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 제제는 자가면역질환이 의심되는 환자의 ADA, VHL 또는 CD3Z 유전자의 변형된 유전자의 대립형질 서열에 특이적인 프라이머 쌍 및 확장 프라이머를 포함할 수 있다.

본 발명에서, 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트 (template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 프라이머는 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산으로서, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 메틸화 여부를 분석하는 대상이 되는 CpG 섬의 서열에 따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 각각 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍일 수 있다. 또한, 변형된 서열에 특이적인 프라이머 쌍 및 확장 프라이머일 수 있다. 바람직하게, 상기 유전자의 변형된 서열에 특이적인 프라이머는 ADA에 대한 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, VHL에 대한 프라이머는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 및 CD3Z에 대한 프라이머는 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍일 수 있다. 바람직하게는, 상기 유전자의 확장 프라이머는 ADA에 대한 프라이머는 서열번호 7로 표시되는 프라이머, VHL에 대한 프라이머는 서열번호 8로 표시되는 프라이머, 및 CD3Z에 대한 프라이머는 서열번호 9로 표시되는 프라이머일 수 있다.

자가면역질환의 발병 또는 예상을 위한 자가면역질환 진단용 조성물에는 상기 제제 이외에도, 중합효소, 아가로스, 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 자가면역질환이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 CD3Z (CD3 zeta, NCBI GenBank Accession No. NM_198053.2) 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 정상 대조군 시료의 해당 유전자의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 자가면역질환의 진단을 위하여 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 상기 유전자의 메틸화는 바람직하게는 ADA 또는 VHL 유전자의 메틸화 수준을 측정 및 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

바람직하게. 상기 자가면역질환은 류마티스 관절염, 전신홍반루푸스, 또는 전신경화증이며, 더욱 바람직하게는 전신홍반루푸스이다.

상기 ADA, VHL 또는 CD3Z 유전자 중 하나 이상의 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 단계는 상기 유전자 프로모터의 CpG섬의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 용어 "생물학적 시료"란 자가면역질환 발병에 의해 ADA, VHL 또는 CD3Z 유전자 중 하나 이상의 메틸화 수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 본 발명의 생물학적 시료는 환자의 혈액 세포의 게놈 DNA일 수 있다.

먼저, 자가면역질환이 의심되는 환자로부터 DNA를 수득하여 메틸화 수준을 측정하는데, 게놈 DNA의 수득은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 (Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB분리법 (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.

상기 유전자의 메틸화 수준의 측정 단계는 a) 수득된 게놈 DNA를 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계; 및 b) 상기 처리된 DNA를 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 a) 단계에서 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트 (bisulfite)일 수 있으며, 바람직하게는 소듐 바이설파이트이다. 이러한 바이설파이트를 이용하여 비메틸화된 사이토신 잔기를 변형시켜 프로모터의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 또한, 상기 a) 단계에서 메틸화 민감성 제한효소는 상기에서 설명한 바와 같이, CpG 섬의 메틸화를 특이적으로 검출할 수 있는 제한효소로서, 바람직하게는 제한효소의 인식부위로 CG를 함유하는 제한효소일 수 있으며, 예를 들면, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 b) 단계에서 증폭은 통상적인 PCR 방법에 의해 수행될 수 있다. 이때 사용되는 프라이머는 상기에서 설명한 바와 같이, 메틸화 여부를 분석하는 대상이 되는 CpG 섬의 서열에 따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 각각 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할수 있는 프라이머쌍일 수 있다. 또한, 유전자의 변형된 서열에 특이적인 프라이머 쌍 및 확장 프라이머일 수 있다.

상기 ADA, VHL 또는 CD3Z 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 단계는 c) 상기 b) 단계에서 증폭된 결과물의 존부를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 c) 단계에서 증폭된 결과물의 존부는 당업계에 공지된 방법, 예를 들면 전기영동을 수행하여 원하는 위치의 밴드의 검출 여부에 따라서 수행될 수 있다. 예를 들면, 비메틸화된 사이토신 잔기를 변형시키는 화합물을 사용한 경우 상기 a) 단계에서 사용한 두 종류의 프라이머쌍, 즉 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍에 의해 각각 증폭된 PCR 결과물의 존부에 따라 메틸화 여부를 판단할 수 있다. 또한, 변형된 서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍 및 확장프라이머에 의해 메틸화 여부를 정량적으로 판단할 수 있다.

바람직하게, 시료 게놈 DNA를 소듐 바이설파이트로 처리하고, ADA, VHL 또는 CD3Z 유전자의 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭하고, 증폭된 부위의 염기서열을 단일염기확장법에 의해 분석하는 방법을 사용하여 메틸화 여부를 정량적으로 판단할 수 있다.

또한, 제한효소를 이용한 경우에도 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 mock DNA에서 PCR 결과물이 나타난 상태에서, 제한효소로 처리된 DNA에서 PCR 결과물이 있는 경우는 프로모터가 메틸화된 것으로 판단하고, 제한효소로 처리된 DNA에서 PCR 결과물이 없는 경우는 프로모터가 비메틸화된 것으로 판단하는 것에 따라 그 메틸화 여부를 판단할 수 있으며, 이는 당업자에게 자명하다. 상기에서 mock DNA란 시료에서 분리되고 아무런 처리를 하지 않은 상태의 시료 DNA를 의미한다. 따라서, 상기 본 발명의 자가면역질환 진단을 위하여 정보를 제공하는 방법을 이용하면 ADA, VHL 또는 CD3Z 유전자의 메틸화 여부를 효과적으로 확인하여 자가면역질환 여부를 진단할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 자가면역질환 진단용 키트에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 자가면역질환 진단용 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다. 바람직하게, 상기 자가면역질환은 류마티스 관절염, 전신홍반루푸스, 또는 전신경화증이며, 더욱 바람직하게는 전신홍반루푸스이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 CD3Z, 또는 CD3Z, ADA 및 VHL 유전자중 하나의 유전자의 과메틸화는 자가면역질환에서 특이적으로 나타나므로, 본 발명의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물은 자가면역질환을 예측하거나 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 MSBE (multiple single-base extension)의 원리를 간략히 도시한 도이다.
도 2는 바이설파이트 서열분석 (sodium bisulfite sequencing)방법으로 CD3Z, ADA 및 VHL의 프로모터 부위의 메틸화 정도를 표시한 도이다. 이를 위하여 EZ DNA Methylation kit (Zymo Research)를 사용하여 환자 gDNA에 소듐바이설파이트를 처리하여 변형시켰고, 변형된 gDNA를 시료로 사용하여, 각각의 변형된 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 각각의 서열을 증폭하고 난 후, 클로닝하고 염기서열을 결정하였다. 염기서열 결정 결과에서 C로 나오면 메틸화되었고, T로 나오면 메틸화되지 않은 것으로 판정하였다. 메틸화된 CpG 핵산은 검은 원으로, 비메틸화된 CpG는 흰 원으로 표시하였다. 바이설파이트에 의해 변형된 DNA의 메틸화 서열분석은 MSBE (multiple single-base extension)의 결과에 따라 각각 메틸화 정도가 서로 다른 6명의 gDNA를 사용하여 수행하였다. 상기 3개 유전자에서 단일 염기 연장 메틸화 결과는 각각 CD3Z, ADA, VHL로 나타내었다. 이는 각각의 gDNA를 바이설파이트로 처리하여 변형시킨 후, 표 1에 기술한 프라이머 중 CD3Z, ADA및 VHL유전자에 대한 프라이머들을 사용하여 각각의 유전자에 해당하는 서열을 증폭하고 클로닝한 후 염기서열을 결정한 결과이다. 결과에서 검은 원은 메틸화되어 있는 CpG 부위이고 흰 원은 메틸화되지 않은 CpG 부위이다. ATG는 단백질의 합성 시작부위를 나타내는 염기서열의 위치다. MSBE방법과 바이설파이트 서열분석방법의 정량적 비교를 하기 위하여 6개의 시료를 사용한 MSBE 결과에서 얻은 메틸화 수준 {M/(M+U)}을 각각의 시료번호 옆에 표시하였으며, 이 결과를 검은 원 백분율과 비교하였다. CD3Z, ADA, VHL의 세가지 유전자에 대해 모두 통계적으로 유의한 연관성을 보였다 (Pearson correlation coefficient R=0.922(ADA), 0.980(CD3Z) 또는, 0.970(VHL) p=0.009(ADA), 0.001(CD3Z), 또는 0.001(VHL)).
도 3은 MSBE에 의해 CD3Z, ADA 및 VHL의 CpG 섬 메틸화를 정량적으로 측정한 것으로, SLE 환자에서 프로모터 메틸화의 증가를 나타낸 것이다. 메틸화된 피크 (M)와 비메틸화된 피크 (U)의 신호 강도로부터 M/(M+U)을 구하여 메틸화 수준으로 정의하고 후속 분석을 위해 사용하였다.
도 4는 A. CD3Z, B. ADA 및 C. VHL에 대한 프로모터 CpG 섬 메틸화 수치의 정량적인 변화를 나타낸 것이다. SLE 환자는 정상의 건강한 대조군에 비해 (NL) 3개의 다른 유전자의 프로모터 CpG 섬에서 메틸화가 유의하게 높은 수치 (모두 p<0.01 by Wilcoxon rank sum test)를 보였다. Y축은 비메틸화된 피크 (U)에 대한 메틸화된 피크 (M)의 신호비를 나타낸 것이다. CD3Z, ADA 및 VHL의 프로모터 메틸화의 수치는 정상의 건강한 대조군 보다 SLE 환자에서 유의하게 변화하였다 (p<0.001 by Wilcoxon rank sum test).
도 5는 일란성 쌍둥이 중 한명만 SLE 환자인 4쌍에서 CD3Z와 VHL의 메틸화 수준을 나타낸 도이다. 환자가 아닌 형제에 비해 SLE 환자들에서 메틸화 정도가 증가된 것을 확인하였다.
도 6은 SLE 혈액세포를 전혈 (WB)과 단핵구 (MNC) 및 다핵세포 (Gran)로 분리하였을 때 CD3Z, ADA, VHL 유전자의 프로모터 메틸화 관계를 나타낸 도이다. SLE 환자에서 단핵구 또는 다핵세포의 상대적인 프로모터 메틸화 결과는 각각 A.CD3Z B. ADA C. VHL로 나타내었다. CD3Z의 유전자의 경우 다핵세포에서 거의 모두 메틸화가 되어 있다는 것을 알 수 있었다. 이를 제외한 대부분의 경우 전혈에서의 메틸화가 단핵구 혹은 다핵세포에서 동일한 변화가 일어나 있다는 것을 알 수 있다.
도 7은 CD3Z, ADA와 VHL 유전자의 프로모터 메틸화와 유전자 발현과의 관계를 세포주에서 밝힌 결과이다. HCC-95와 HCC-1833 세포주에서 CD3Z 유전자의 프로모터 CpG 섬, HCC-95와 HCC-1588 세포주에서 ADA 유전자의 프로모터 CpG 섬, TK10과 786-O세포주에서 VHL 유전자의 프로모터 CpG 섬에 각각 메틸화가 일어나 있으며, 각각의 유전자 발현이 없다는 것을 확인하였다. 이 세포주에 탈메틸화 제제 (demethylating agent)인 5-aza deoxy cytidine을 처리하면 각각의 유전자 발현이 다시 증가한다는 것을 확인하였다. 이때 GAPDH를 대조군 유전자로 사용하였다.
도 8은 SLE 환자에서 TCRζ-체인 양성 CD3 세포의 정량적인 변화를 나타낸 것이다. TCRζ 발현 지수를 유세포분석기 (flow cytometry)로 결정하고, MFI 지수 및 TCRζ 밝고/어두운 비 변수를 기초로 수행하였다. MFI index는 A의 MFI TCRζ^positive 로 표시된 세포의 수를 MFI TCRζ^negative로 나눈 값이다. TCRζ 밝고/어두운 비 변수는 TCRζ^bright 로 표시된 세포의 수를 TCRζ^dim 으로 표시된 세포의 수로 나눈 값이다. A. 정상 대조군 (NR) 또는 SLE 환자로부터의 유세포분석 데이터를 나타낸 것이다. B. 정상 대조군 (NR) 또는 SLE 환자로부터의 TCRζ-체인 밝고/어두운 비를, C. 정상 대조군 또는 SLE 환자로부터의 MFI 지수를 나타낸 것이다. CD3Z 단백질 산물은 SLE에서 조절저하되며, TCRζ-체인을 확인하기 위해, TCRζ-체인 발현의 수치를 정상 및 SLE 환자에서 검사했다. 정상 대조군과 비교할 때, MFI index는 SLE환자와 대조군에서 차이가 없었지만, TCRζ 밝고/어두운 비는 유의하게 감소하였다 (p<0.001, by Mann-Whitney U test).
도 9는 CD3Z 유전자의 프로모터 메틸화와 T 세포 표면의 TCRζ-체인의 발현이 반비례관계가 있다는 것을 나타낸다. 대조군 21명에서 TCRζ 밝고/어두운 비를 유세포분석기로 측정한 결과와 CD3Z 메틸화 수준 즉, M/(M+U)은 반비례관계가 있었다 (p=0.0140 by Spearman correlation test).

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: SLE ( systemic lupus erythematosus )환자, 류마티스 관절염 환자, 전신경화증환자, 정상 대조군 및 쌍둥이 대조군의 혈액 DNA 샘플 준비

본 발명은 105명의 자가면역질환이 없는 건강한 대조군, 108명의 활동성 SLE환자, 6명의 비활동성 SLE 환자, 19명의 류마티스관절염환자, 18명의 전신성경화증환자, 20명의 유방암환자로부터 분리한 혈액 DNA 샘플을 대상으로 하였다. 그리고 일란성쌍둥이 중 한명만 SLE 질환을 가진 쌍둥이 4쌍의 혈액 DNA도 대상으로 하였다. 모든 SLE, 류마티스 관절염환자와 전신경화증을 가진 자가면역질환 환자는 각각에 대한 American College of Rheumatology 분류 기준을 만족하였다. 비활동성 SLE환자는 질환활성도 (disease activity index, DAI)가 2 이하였으며, 연구에 참여한 활동성 SLE환자의 경우 대부분 5이상의 SLE DAI를 보였다. 연구 프로토콜은 임상시험심사위원회 및 서울대학병원 윤리위원회 (Ethics Committee of Seoul National Hospital)에 의해서 승인받았다. 서울대학병원에 있는 SLE (18세에서 56세 사이, 평균), 건강한 정상 대조군 (23세에서 45세 사이, 평균) 및 쌍둥이로부터 말초정맥혈액을 채취하였다.

실시예 2: Illumina HumanMethylation27 BeadChip 을 이용한 메틸화 분석

6명의 SLE 환자와 6명의 대조군 환자로부터 얻은 게놈 DNA를 분석에 사용했다. Illumina HumanMethylation27 BeadChip을 이용하여 메틸화 여부를 분석하였다. 그 결과, SLE 환자 및 대조군 사이에서 CpG 섬 메틸화 수치에 유의한 차이를 보인 유전자들 중, SLE 환자에서 메틸화 수치가 상승한 CD3Z, ADA, VHL을 포함하는 3개의 유전자를 메틸화 배열 결과의 확인을 위해 선택하였다.

실시예 3: 전체 혈액으로부터의 혈액 DNA 샘플 준비

프로모터 메틸화의 정량적인 측정을 위해, 헤파린 처리한 전혈에서 게놈 DNA를 분리하여 사용했다. 게놈 DNA 분리를 위하여 Qiagen사의 DNA purification kit를 사용하였다.

실시예 4: CpG 섬 프로모터 메틸화의 정량적인 분석

SLE 환자 및 대조군 사이에 메틸화 수치의 유의미한 차이를 가지는 유전자들 가운데 대조군과 비교할 때 SLE 환자의 혈액에서 메틸화 수치가 증가한 상기 실시예 2에서 얻은 3개의 유전자를 메틸화 배열 결과의 확인을 위해 선택하였다. CD3Z, ADA 및 VHL 세개의 유전자에 대한 CpG 섬의 특정 위치는 Illumina HumanMethylation27 BeadChip array 결과에 기초하여 선택했다. 첫 번째로, CD3Z, ADA, VHL의 메틸화 상태는 종래의 방법대로 바이설파이트에 의해 변이된 게놈 서열분석으로 특정 유전자를 증폭한 후, 단일염기확장법에 의해서 결정하였다 (Hong KM, et al., Semiautomatic detection of DNA methylation at CpG islands. Biotechniques. 38(3):354, 356, 358. (2005)). 이와 같은 단일염기확장법의 간단한 원리를 도 1에 도시하였다. Zymo Research's instructions에 기재된 것처럼, 약 1㎍의 게놈 DNA를 소듐바이설파이트로 처리했다. 변성을 위해서 DNA 샘플을 M-희석 완충액과 함께 섞고, 37℃에서 15분간 방치하였다. CT 변환 시약을 변성된 DNA에 첨가하고 DNA 서열의 메틸화되지 않은 사이토신을 티민으로 전환하기 위해 12-16시간 동안 50℃의 암흑에서 방치하였다. 변형 후에, M-결합 완충액을 첨가하고, 혼합물을 Zymo-Spin I 컬럼에 내렸다. M-세척 완충액으로 세척한 후에, 변형된 DNA는 변형반응을 완성하기 위해 탈황시켰다. 추가 세척 후에, 변형된 DNA 20㎕를 M-용출 완충액으로 녹였다. 변형된 게놈 DNA를 소듐바이설파이트가 처리된 서열에 특이적인 프라이머 (표 1)와 함께 변형된 유전자 특이적 서열을 증폭하는데 이용하였다.

ADAmF	GTTGGYGTATAAAGTTGTTTTTATTTATTGAGTATTTAGTAG, Y=C/T (서열번호 1)
ADAmR	CTCAATTTCRCTATCTATCAAATAAACATCCTAACAC, R=G or A (서열번호 2)
ADA-SBE1	CTACICCIAATAAACACCTAATACTATACCCIAC, I=inosine (서열번호 7)
VHLmF	GATAGATGTAAAGATAGGAATAAGTTAGGGTTATG (서열번호 3)
VHLmR	CTCCRAAAAATACTCCTTAACTAAAACCACAC, R=G or A (서열번호 4)
VHL-E1	GATGTAAAGATAGGAATAAGTTAGGGTTATGTTGG (서열번호 8)
CD3ZmF	TTTGGGGAGGTAGTTGTAGAATAAAATTAGTAG (서열번호 5)
CD3ZmR	CACACCCACTCCCCTACACATACAC (서열번호 6)
CD3Z-E1	GGGAAAGGATAAGATGAAGTGGAAGG (서열번호 9)

PCR 증폭은 1.5 mM MgCl₂, 0.2 mM dNTPs, 10 pmol의 각 프라이머 및 50-100 ng의 바이설파이트가 처리된 게놈 DNA와 함께 1×PCR buffer II^TM 완충액 (Roche)을 포함하는 혼합물에서 95℃에서 10분간 초기 반응, 뒤이어 95℃에서 30초, 56℃에서 30초, 및 72℃에서 1분의 35 사이클, 72℃에서 30분간의 최종 연장 (final extension)을 수행하였다. 그리고 상기 증폭된 산물 (20㎕)을 QIAquick^TM PCR Purification Kit (Qiagen)를 사용해 정제하고, 최종 부피 30㎕로 녹였다. 정제 후에, 단일 염기는 SNaPshot kit (Applied Biosystems)와 함께 각 유전자에 대해 단일 염기 확장 프라이머 (표 1)를 사용해서 연장하였다.

단일 염기 연장 반응을 위한 조건은 다음에 따른다: 96℃에서 10초, 50℃에서 5초 및 60℃에서 30초의 20 사이클로, 단일 염기 연장 산물은 ABI 3100 sequencer (Applied Biosystems)로 분석하였다.

그 결과, CD3Z, ADA 및 VHL의 세 개의 유전자 모두 SLE 환자로부터 얻은 DNA를 가지고 한 스크리닝 연구에서 대조군 DNA를 사용한 결과에 비해 DNA 메틸화 수치의 유의한 변화를 나타내었다 (도 2). 염기서열 결정 결과에서 C로 나오면 메틸화되었고, T로 나오면 메틸화되지 않은 것으로 판정하였다. 메틸화된 CpG는 검은 원으로, 비메틸화된 CpG는 흰 원으로 표시하였다. MSBE 방법과 바이설파이트 서열분석방법의 정량적 비교를 하기 위하여 6개의 시료를 사용한 MSBE 결과에서 얻은 메틸화 수준 {M/(M+U)}을 각각의 시료번호 옆에 표시하였으며, 이 결과를 검은 원 백분율과 비교하였다 (M은 메틸화된 피크, U는 비멜틸화된 피크의 신호 강도를 나타내며, 상기 M/(M+U)를 메틸화 수준을 나타낸다). CD3Z, ADA, VHL의 세가지 유전자에 대해 모두 통계적으로 유의한 연관성을 보였다 (Pearson correlation coefficient R=0.922(ADA), 0.980(CD3Z) 또는, 0.970(VHL) p=0.009(ADA), 0.001(CD3Z), 또는 0.001(VHL)). CD3Z, ADA 및 VHL의 세 개의 유전자의 과메틸화의 추가적인 확인을 위해, SLE 환자 및 대조군의 바이설파이트 변형된 gDNA로부터의 CpG 섬 서열의 증폭된 산물을 클로닝하고 서열을 결정하였다. 도 2에 나타냈듯이, SLE 환자들은 대조군보다 높은 프로모터 CpG 섬 메틸화를 가지고 있었는데, 이는 MSBE 방법의 결과와 일치하는 것이다.

MSBE에 의해 CD3Z, ADA 및 VHL의 CpG 섬 메틸화를 메틸화된 피크 (M)와 비메틸화된 피크 (U)의 신호 강도로 표시하여 정량적으로 측정한 결과를 도 3에 나타냈으며, SLE 환자 (SLE1, SLE2 및 SLE3)에서 프로모터 메틸화가 증가된 것을 확인하였다.

또한, CD3Z, ADA, VHL의 메틸화 수준 즉, M/(M+U)의 값을 이용하여 SLE 이환의 OR (odds ratio)를 구하여 하기 표 2에 나타냈다. 환자군과 대조군을 한 군으로 만들어 각각 유전자에 대한 메틸화 수준의 중앙값을 구한 후, 두 군에서 각각 중앙값보다 작은 경우는 음성으로 큰 경우는 양성으로 판정하여 OR을 구하였다. 각각의 SLE 이환에 대한 OR은 CD3Z는 29.78, ADA는 3.39, VHL의 경우는 4.75이었다. SSC 이환에 대한 OR은 CD3Z는 8.74, ADA는 4.78, VHL의 경우는 4.36이었다. RA 이환에 대한 OR은 CD3Z는 20.86, ADA는 3.15, VHL의 경우는 4.73이었다.

아울러, CD3Z (도 4A), ADA (도 4B) 및 VHL (도 4C)에 대한 프로모터 CpG 섬 메틸화 수치의 정량적인 변화를 확인한 결과, SLE 환자는 정상의 건강한 대조군에 비해 (NL) 3개의 다른 유전자의 프로모터 CpG 섬에서 메틸화가 유의하게 높은 수치 (p<0.01 by Wilcoxon rank sum test)를 나타내는 것을 확인하였다. Y축은 비메틸화된 피크 (U)에 대한 메틸화된 피크 (M)의 신호비를 나타낸 것이다. SLE 뿐만 아니라, 류마티스 관절염 (RA) 및 전신경화증 (SSC)에서도 정상의 건강한 대조군에 비해 3개의 다른 유전자의 프로모터 CpG 섬에서 메틸화가 유의하게 높은 수치를 나타낸 것을 확인하였으며, 이와 같은 결과는 상기 유전자의 메틸화 여부를 측정하면 자가면역질환을 진단할 수 있다는 것을 시사하는 것이다.

일란성 쌍둥이 중 한명만 SLE환자인 4쌍에서 CD3Z와 VHL의 프로모터 메틸화정도를 측정하였는데 숫자가 적어서 통계적은 유의성을 확인할 수는 없었지만 환자가 아닌 형제에 비해 SLE환자들에서 메틸화 정도가 증가되어 있었다 (도 5). 이는 유전적으로 동일한 쌍둥이에서 SLE의 발생이 다를 수 있는데, SLE의 발생이 유전적이 아닌 경우라도 후생유전학적 변형이 SLE 발생과 관련이 있을 수 있다는 것을 의미하는 것이다.

실시예 5: 인간 혈액 세포층 분리 및 프로모터 메틸화 분석

말초혈액 세포를 얻은 후 RBC는 정맥절개 후 곧바로 헤파린을 처리한 말초혈액 세포로부터 RBC 용해 버퍼를 사용해 용해시켰다. 구체적으로, 먼저 전혈을 RBC 용해 버퍼 (Roche)를 사용하여 RBC를 용해시킨 후, 단핵세포 및 다핵세포 분획을 Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation (Sigma) 방법으로 분리하였다. 분리된 중간층은 림프구를 포함한 단핵세포가 모여있는 분획으로 사용하였고, 아래층은 RBC와 함께 분리되는 다핵세포로 사용하였다. SLE 혈액세포를 전혈 (WB)과 단핵세포 (MNC) 및 다핵세포 (Gran)로 분리하였을 때, CD3Z, ADA, VHL 유전자의 프로모터 메틸화 관계를 확인한 결과, CD3Z (도 6A), ADA (도 6B), VHL (도 6C)의 전혈에서의 메틸화가 단핵세포 혹은 다핵세포의 메틸화정도와 유의한 상관관계를 가지고 있음을 보여주었다. ADA와 VHL의 경우 전혈의 메틸화와 단핵세포 혹은 다핵세포의 메틸화는 유의수준이 Spearman test에서 p<0.0001이었으며, CD3Z의 경우 전혈과 단핵세포와는 유의수준이 p=0.001이었고, 전혈과 다핵세포의 메틸화와의 관련성은 p=0.003이었다 (도 6).

또한 SLE환자 중 활동성 SLE환자와 비활동성 SLE환자사이의 전혈, 단핵세포, 다핵세포에서의 CD3Z 메틸화가 Mann Whitney test에서 모두 유의하게 차이가 있다 (도 6A; 전혈 p=0.0075, 단핵세포의 p=0.0047, 다핵세포의 p=0.0002). 또한 VHL의 메틸화도 SLE환자의 전혈 (p=0.0225)과 단핵세포 (p=0.0002)에서 유의하게 증가되어 있었다 (도 6C). 그런데 ADA의 경우에는 오히려 비활동성 SLE환자에서 메틸화정도가 높았으며 단핵세포의 경우 그 차이가 통계적으로도 유의하였다 (도 6B; p=0.042 by Mann Whitney test). 이러한 결과는 CD3Z, VHL 그리고 ADA의 메틸화 정도를 측정하면 SLE를 포함한 자가면역질환의 활성상태까지도 알 수 있다는 것을 의미한다.

실시예 6: CD3Z, ADA, VHL 발현 및 CD3Z, ADA, VHL 프로모터 메틸화사이의 역관계 분석

CD3Z, ADA, VHL 발현이 프로모터 CpG 섬 메틸화와 연관이 있는지 테스트하기 위해, 탈메틸화 시약인 5-azadC (5-aza deoxy cytidine)를 두 개의 폐암세포주에 처리했다.

구체적으로, HCC-95와 HCC-1833 세포주에서 CD3Z 유전자의 프로모터 CpG 섬, HCC-95와 HCC-1588 세포주에서 ADA 유전자의 프로모터 CpG 섬, TK10과 786-O세포주에서 VHL 유전자의 프로모터 CpG 섬에 각각 메틸화가 일어나 있으며, 이 경우 각각의 유전자 발현이 없다는 것을 확인하였다. 그러나, 상기 세포주에 탈메틸화 제제 (demethylating agent)인 5-azadC를 48시간 처리하면 각각의 유전자 발현이 다시 증가한다는 것을 확인하였다. 이때 GAPDH를 대조군 유전자로 사용하였다 (도 7A 내지 7C).

이와 같은 결과는 상기 유전자들의 프로모터 CpG 섬의 메틸화는 유전자의 발현을 억제하는 효과가 있다는 것을 시사하는 것이다.

실시예 7: 인간 혈액 세포층 분리 및 FACS 분석 및 TCR ζ 발현분석

7-1: 인간 혈액 세포층 분리 및 FACS 분석

말초혈액 세포를 얻은 후 RBC는 정맥절개 후 곧바로 헤파린을 처리한 말초혈액 세포로부터 RBC 용해 버퍼를 사용해 용해시켰다. 구체적으로, 먼저 전혈을 RBC 용해 버퍼 (Roche)를 사용하여 RBC를 용해시킨 후, PBMC 및 다형핵 분획을 Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation (Sigma) 방법으로 분리하였다. 분리된 중간층은 림프구를 포함한 단핵구가 모여있는 분획으로 사용하였고, 아래층은 RBC와 함께 분리되는 다핵세포로 사용하였다. FACS 분석에는, 항-CD3-PerCP 및 항-TCRζ-PE를 Immunotech (Beckman Coulter)로부터 구입하여 사용하였다.

7-2: TCRζ 발현분석

TCRζ-체인은 짧은 9개 아미노산 세포외 도메인을 가지기 때문에, 고정 및 permeabilization 후에 세포 내 세포질 도메인 에피토프를 탐지하는 mAbs를 TCRζ 분석 (TIA-2; Beckman Coulter)을 하는 데 사용하였다. T 세포 subset의 표면 염색은 표준 방법에 의해 수행하였다. 동형-매치된 대조군 Abs는 발현 특이성을 입증하기 위해 사용하였다. 분석은 FACSCalbur flowcytometer (BD Biosciences) 및 CellQuest software (BD Biosciences)을 가지고 수행하였다. 분석은 두 개의 독립적인 변수를 기초로 하여 수행하였다: 1) TCRζ의 구성적 발현 (constitutive expression)은 B 세포 및 단핵세포를 포함하며, TCRζ^negative 군집의 형광강도 (MFI)에 대한 TCRζ^positive 군집의 형광강도 (MFI)에 평균의 비를 계산함으로써 결정하였다; 및 2) TCRζ 어두운 (dim) 세포에 대한 TCRζ 밝은 (bright) 세포의 순환 (circulating)의 숫자 비율을 계산하였다. TCRζ 발현 및 CD3Z 메틸화 정도 사이의 관계는 SPSS 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. MFI index는 A의 MFI TCRζ^positive 로 표시된 세포의 수를 MFI TCRζ^negative로 나눈 값이다. TCRζ 밝고/어두운 비 변수는 TCRζ^bright 로 표시된 세포의 수를 TCRζ^dim 으로 표시된 세포의 수로 나눈 값이다.

SLE 환자에서 TCRζ 발현 지수를 유세포분석기 (flow cytometry)로 결정하고, MFI 지수 및 TCRζ 밝고/어두운 비 변수를 기초로 수행하여, TCRζ-체인 양성 CD3 세포의 정량적인 변화를 확인한 결과, CD3Z 단백질 산물은 SLE에서 조절저하되는 것을 확인하였다 (도 8A). TCRζ-체인을 확인하기 위해, TCRζ-체인 발현의 수치를 정상 및 SLE 환자에서 검사했다. 정상의 건강한 대조군과 비교할 때, MFI index의 경우는 SLE환자와 대조군에서 차이가 없었지만 (도 8B), TCRζ 밝고/어두운 비를 분석한 경우에는 SLE환자에서 유의하게 감소하였다 (p<0.001, by Mann-Whitney U test) (도 8C).

또한, 건강한 대조군 21명에서 TCRζ 밝고/어두운 비를 유세포분석기로 측정한 결과와 CD3Z 메틸화 수준 즉, M/(M+U)은 반비례관계가 있었다 (p=0.0140 by Spearman correlation test) (도 9). 즉, CD3Z 유전자의 프로모터 메틸화와 TCRζ-체인의 발현이 반비례관계가 있다는 것을 시사하는 것이며, TCRζ 발현과 함께 CD3 양성 T 세포가 메틸화의 낮은 수치를 가진 환자에 비해서, CD3Z 프로모터 메틸화의 높은 수치를 가진 환자에서 낮다는 것을 시사하는 것이다.

상기와 같은 결과들은 CD3Z의 메틸화, 또는 ADA, VHL의 메틸화가 자가면역질환에서 특이적으로 일어나는 것을 의미하며, 상기 유전자의 메틸화를 측정하면 자가면역질환을 예견하거나 진단하는 데 유용하게 사용될 수 있다는 것을 의미한다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (16)

1. CD3Z (CD3 zeta, NCBI GenBank Accession No. NM_198053.2) 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 자가면역질환 진단용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, ADA (Adenosine deaminase, NCBI GenBank Accession No. NM_000022.2) 또는 VHL (von hippel lindau, NCBI GenBank Accession No. NM_198156.1) 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 자가면역질환 진단용 조성물.
   
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제는 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소, 상기 유전자의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머 및 비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머를 포함하는 것인 자가면역질환 진단용 조성물.
   
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제는 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 화합물, 상기 유전자의 변형된 서열에 특이적인 프라이머 쌍 및 확장 프라이머 (extension primer)를 포함하는 것인 자가면역질환 진단용 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 자가면역질환은 류마티스 관절염, 전신홍반루푸스 및 전신경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 자가면역질환 진단용 조성물.
   
6. 제2항에 있어서, 상기 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제는 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 화합물, 상기 유전자의 변형된 서열에 특이적인 프라이머 쌍 및 확장 프라이머를 포함하는 것으로서, 상기 유전자의 변형된 서열에 특이적인 프라이머는 ADA에 대한 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍이고, VHL에 대한 프라이머는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍이며, CD3Z에 대한 프라이머는 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍인 자가면역질환 진단용 조성물.
   
7. 제2항에 있어서, 상기 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제는 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 화합물, 상기 유전자의 변형된 서열에 특이적인 프라이머 쌍 및 확장 프라이머를 포함하는 것으로서, 상기 유전자의 확장 프라이머는 ADA에 대한 프라이머는 서열번호 7로 표시되는 프라이머이고, VHL에 대한 프라이머는 서열번호 8로 표시되는 프라이머이며, CD3Z에 대한 프라이머는 서열번호 9로 표시되는 프라이머인 자가면역질환 진단용 조성물.
   
8. 제3항에 있어서, 상기 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 소듐설파이트 (sodium bisulfite)인 자가면역질환 진단용 조성물.
   
9. 제4항에 있어서, 상기 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 소듐설파이트인 자가면역질환 진단용 조성물.
   
10. 자가면역질환이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 CD3Z (CD3 zeta, NCBI GenBank Accession No. NM_198053.2) 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 정상 대조군 시료의 해당 유전자의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 자가면역질환의 진단을 위하여 정보를 제공하는 방법.
    
11. 제10항에 있어서, ADA (Adenosine deaminase, NCBI GenBank Accession No. NM_000022.2) 또는 VHL (von hippel lindau, NCBI GenBank Accession No. NM_198156.1) 유전자의 메틸화 수준을 측정 및 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 자가면역질환의 진단을 위하여 정보를 제공하는 방법.
    
12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 유전자의 메틸화 수준의 측정 단계는
    a) 수득된 게놈 DNA를 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계; 및
    b) 상기 처리된 DNA를 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR 에 의해 증폭하는 단계를 포함하는 것인 방법.
    
13. 제12항에 있어서, 상기 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 소듐바이설파이트이고, 상기 메틸화 수준을 측정하는 방법은 메틸화 특이적 단일염기확장법 (MSBE, methylation-specific single base extension)인 방법.
    
14. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 자가면역질환은 류마티스 관절염, 전신홍반루푸스, 및 전신경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
    
15. 제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 자가면역질환 진단용 키트.
    
16. 제15항에 있어서, 상기 자가면역질환은 류마티스 관절염, 전신홍반루푸스, 및 전신경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
    
    

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